MXPA99010169A - Esteres de etilenglicol de derivados de monohidrobenzoporfirina como agentes fotoactivos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a:Los compuestos novedososútiles en la terapia fotodinámica son de la fórmula (Ver Fórmula) y las formas metaladas y/o etiquetadas y/o conjugadas del mismo en donde R1 es independientemente alquilo (1-6C);cada n es independientemente un entero de 0-6;y R2 es vinilo o una forma derivada del mismo.

Description

ESTERES DE ETILENGLICOL DE DERIVADOS DE MONOHIDROBENZOPORFIRINA COMO AGENTES FOTOACTIVOS CAMPO TÉCNICO La invención se refiere a compuestos útiles en la terapia fotodinámica (PDT) y a las aplicaciones relacionadas. En particular, concierne a esteres de etilenglicol de monohidrobenzoporf irinas . ANTECEDENTE DE LA TÉCNICA La terapia fotodinámica (PDT) involucra generalmente la administración de compuestos que son capaces de absorber luz, típicamente en el rango visible, pero también en el ultravioleta próximo, seguido de irradiación de lugares en el sujeto para los cuales se desea un efecto tóxico o inhibitorio. La PDT se desarrolló inicialmente utilizando hermatoporf irina y compuestos relacionados en el tratamiento de tumores, como parecía que estos compuestos "se alojarían" en lugares que contienen células rápidamente divisoras. El tumor puede entonces irradiarse con luz absorbida por la hermatoporfirina y puede resultar en la destrucción del tejido circundante. PDT ha mostrado desde entonces ser útil en el tratamiento de placas ateroscieróticas, restenosis, infecciones en el torrente sanguíneo, artritis reumatoide, psoriasis y en el tratamiento de condiciones oculares no necesariamente limitadas a tumores. La Patente de E.U. No. 5,171,749 y las patentes que se expiden en las aplicaciones relacionadas, las Patentes de E.U. Nos. 5,283,255; 5,399,583; 4,883,790; 4,920,143; y 5,095,030; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia, describen y reivindican una clase de compuestos fotoactivos útiles en PDT designadas las monohidrobenzoporf irinas , o "BPDs'd Esta clase se obtiene mediante la reacción de Diels-Alder de un mono alquino o desubst i tuyente con protoporf irina- IX y los compuestos resultantes pueden además isomerizarse , reducirse y/o derivarse para obtener una amplia clase de BPDs . Como se expone en estas /patentes, una subclase particularmente útil resulta de la hidrólisis o de la hidrólisis parcial de los grupos de éster de las cadenas laterales de 2-carboxietilo en los anillos C y D. La esterificación como protección de estos grupos durante la reacción de Diels-Alder resulta en productos iniciales los cuales contienen grupos de 2 - carboxietilo . Se encontró que la hidrólisis fácil de estos esteres puede conducirse fácilmente, - dejando cualquiera de los grupos de carbaloxy asociados con el producto Diels-Alder obtenido de un dicarbaloxialquino virtualmente completamente deshidrolizado . Esto resultó en cuatro especies de compuestos, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA y BPD-DB como se representa en la Figura 1; esta figura tomada de la Patente de E.U. No. 5,171,749. En esta representación, R1 y R2 son grupos carbaloxy, típicamente carbometpxy o carboetoxy, y R es alquilo (1-6C) . Se encontró que BPD-MA tiene propiedades útiles para PDT y se encuentra actualmente en desarrollo clínico. Sin embargo, permanece ahí una necesidad para formas específicas adicionales de agentes fotoactivos los cuales expanden el repertorio de compuestos fotoactivos para la variedad de indicaciones a las cuales se aplica PDT, como se mencionó previamente. La presente invención proporciona compuestos en los cuales los anillos C y D contienen esteres de etilenglicol de los substituyentes del esterificación. Estos compuestos tienen propiedades farmacocinét icos las cuales son ventajosas en algunos casos donde se emplee PDT. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los compuestos de la invención son nuevas - adiciones útiles al repertorio de compuestos que encuentran aplicación en la terapia fotodinámica y las metodologías relacionadas que emplean los compuestos fotoactivos. La presencia de esteres de etilenglicol en estas moléculas les proporciona características que permiten la expansión del alcance de las condiciones bajo las cuales los compuestos fotoactivos se emplean para ajustar el tratamiento . Así, en un aspecto, la invención se dirige a los compuestos de la fórmula y las formas metaladas y/o etiquetadas y o conjugadas del mismo donde R1 es alquilo (1-6C) , preferentemente metilo, n es un entero de 0-6, preferentemente 2, y R2 es vinilo o un derivado de él, preferentemente vinilo. La invención también se dirige a los compuestos de la fórmula y las formas metaladas y/o etiquetadas y o conjugadas del mismo donde R1 , n y R2 se definen como se describió previamente . Estas analogías se derivan de la protoporfirina III y de la protoporfirina XIII respectivamente, en una manera similar a aquella en la cual los compuestos de las fórmulas 1 y 2 se derivan de la protoporfirina IX. La invención incluye también isómeros de las diversas formas de las fórmulas 1-4 las cuales resultan provenientes de los productos de condensación de Diels-Alder no reorganizados (es decir 1,4-dienos) como se describió en la Patente de E.U. No. 4,883,790 incorporados ahí para referencia. En otros aspectos, la invención relacionada con los métodos de diagnóstico y tratamiento utilizando los compuestos de la fórmula 1, 2, 3 o 4 o sus isómeros 1,4-dienos o mezclas del mismo.

- BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los compuestos de la técnica anterior, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA y BPD-DB. La Figura 2 muestra la cinética de toma de B-EA6 mediante las células L1210. La Figura 3 muestra la cinética de liberación de B-EA6 mediante las células L1210. La Figura 4 muestra una representación gráfica de la farmacocinét icos de B-EA6 in vi vo . La Figura 5 muestra una comparación de la cinética de toma de B-EA6 mediante esplenocitos normal y las células L1210. La Figura 6 muestra el curso del tiempo de PDT utilizando B-A6 en ratones comparado con ratones tratados con BPD-MA y BPD-MB. La Figura 7 muestra el efecto de B-EA6 sobre la microvasculatura en los ratones. La Figura 8 muestra una comparación de los espectros en el plasma de BPD-MA y B-EA6. Las Figuras 9A y 9B muestran el efecto citotóxico del tratamiento fotodinámico utilizando A-EA6 en comparación con BPD-MA en las células L1210 y en las células dendítricas. La Figura 10 muestra los efectos comparativos de A-EA6 y BPD-MA al disminuir la expresión de superficie de los receptores de MHC1. La Figura 11 muestra el efecto de la terapia fotodinámica utilizando A-EA6 y BPD-MA sobre las quinasas de trayectoria de estrés y mitogénica en las células H60. La Figura 12 muestra el efecto comparativo de PDT utilizando A-EA6 y BPD-MA en la activación caspase en las células HL60. La Figura 13 muestra el efecto comparativo de PDT utilizando A-EA6 y BPD-MA en la fragmentación del DNA en las células HL60. MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los compuestos de la invención se relacionan con aquellos expuestos en las patentes de BPD citados previamente, pero difieren en que contienen esteres de etilenglicol en los substituyentes en los anillos C y D. Estos compuestos pueden prepararse mediante hidrólisis simple de los substituyentes del carboxialquilo o carboxilo y la reesterif icación de los grupos carboxy resultantes en los anillos C y D de las benzoporfirinas , o puede obtenerse directamente mediante la transesterificación. Se observará que los compuestos 1 y 2 son especies individuales del género, descritas en las patentes de E.U. previamente referenciadas , obtenidas por medio de un proceso el cual comprende una reacción de Diels-Alder con protoporfirina IX. Los compuestos 3 y 4 se preparan de una manera completamente análoga pero utilizando protoporfirina III o protoporfirina XIII como substratos para la reacción de Diels-Alder. Debido a que la protoporfirina IX no es simétrica con respecto a los anillos A y B, resultan dos posibles productos dependiendo de si ocurre o no la adición de Diels-Alder en el anillo A o B. Por otra parte, las protoporf irinas III y XIII son simétricas con respecto a estos anillos, y además solamente resulta un producto en cada caso independientemente del sitio de la adición. En los compuestos de la invención, R2 es preferentemente vinilo, pero puede ser también un derivado del mismo. El grupo de vinilo en el anillo A o B se deriva fácilmente hacia otras modalidades de R2 mediante la adición u oxidación. Los productos de la adición u oxidación pueden substituirse además si los substituyen es agregados son funcionales como los grupos de salida, por ejemplo, -Br puede substituirse por -OH.- OR" , -NH2, -NHR" , -NR, etc donde R' es un radical - hidrocarburo. Por ejemplo, uno de los substituyentes agregados puede ser el hidrógeno y el otro el halo, hidroxia, alcoxi baja, amino, o una amida, sulfhidrilo, o un organosulfuro, o un hidrógeno adicional . Los compuestos de la invención incluyen diversos grupos como R2 que incluye substituyentes los cuales proporcionan sistemas de anillo de porfirina adicional o relacionados con la porfirina . De esta manera, R2 puede ser un vinilo, CHORd -CHO, -COORd -CH(OR')CH3, - CH (OR ') CH20R -CH(SR')CH3, -CH (NR' ) 2CH3, -CH(CN)CH3, - CH ( COOR ') CH3 , -CH (OOCR' ) CH3, -CH (NR' COR') CH3 , - CH ( CONR ' 2 ) CH3 , CH(halo)CH3, o -CH (halo) CH2 (halo) en donde R1 es H, o un radical hidrocarburo (1-6C) substituido de manera opcional con un substituto heteroátomo o donde R2 es un grupo orgánico menor a 12C que resulta de la derivación directa o indirecta del grupo de vinilo, o donde R2 es un grupo que contiene los núcleos 1-3 de tipo tetrapirrol. Como se ha utilizado en la presente, el término "alquilo" ("alkyl") se refiere a una cadena de hidrocarburo saturada recta o ramificada la cual puede ser, si contiene un número suficiente de átomos de carbono, cíclica o contener una porción - cíclica. Los ejemplos típicos son el metilo, etilo, t-butilo, cíclohexilo y similares. Un "radical hidrocarburo" se refiere a un substituto monovalente que contiene solamente carbono e hidrógeno el cual puede ser una cadena recta o ramificada, saturada o no saturada, aromática o no aromática o ambas, y cíclico o no cíclico. De esta manera, un radical hidrocarburo de 1-10C podría incluir c iclopentaeti lo , 2-pentenilo, 3-butienilo, 2 , 4 - dimet ilhexilo , y similares. En algunas modalidades de la invención, el radical hidrocarburo puede ser substituido con un substituto que contiene heteroátomo. Los substituyentes incluyen -OR, -NR2, -SR, -COOR, CONR2, -OOCR, -NRCOR, -SOR, -S02R, -S03R, halo, -CN, y similares, donde R es H o alquilo (1-6C) . Las aminas cíclicas incluyen piridilo, pirimidil, tiazolil, quinolil, y demás. De esta manera, pueden incluir sistemas de anillo sencillo o de anillo combinado y pueden contener heteroátomos adicionales . Se observará que los compuestos de la invención contienen por lo menos un centro quiral y de esta manera pueden existir en diversas formas estereoisoméricas. Si se desea, los estereoisómeros, que incluyen a los enantiómeros, pueden separarse utilizando técnicas estándar en la materia: sin embargo, pueden utilizarse las mezclas por racimo o las mezclas que contienen más de un diastereómero. Los compuestos como se indica en las fórmulas 1-4, además, son representativos de los isómeros ópticos individuales, enantiómeros, o diastereómeros como puede ser el caso, así como mezclas de estos isómeros quiral individuales. Si se desea, los compuestos de la invención pueden prepararse en formas metaladas al tratar el núcleo de tipo tetrapirrol con un ion apropiado tal como el ion de magnesio, el ion de zinc, el ion de estaño y similares, para obtener un compuesto metálico. El ion de metal puede ser también una etiqueta radioactiva. Generalmente, el ion de metal se inserta utilizando las sales apropiadas bajo condiciones estándar en la materia. Por ejemplo, el ion de zinc puede introducirse al tratar el compuesto con acetato de zinc en 1 : 1 cloruro de metileno : metanol . Los compuestos pueden contener también etiqueta, incluyendo radioisótopos, cromóforos, y etiquetas fluorescentes. El etiquetado de radioisótopos es generalmente útil cuando los compuestos se siguen in vi vo o se utilizan para los residuos específicos de etiqueta. Los residuos catiónicas útiles que son los radioisótopos incluyen tecnecio, galio e indio. Además, pueden utilizarse los radioisótopos de los heteroátomos, tales como 131I o el 32P, en la molécula misma, o la inclusión de 14C para etiquetar la molécula. Como se describió de manera detallada en las patentes relacionadas con BPD publicadas anteriormente, los compuestos de la invención pueden acoplarse, si se desea, hacia un agente objetivo el cual dirigirá la molécula hacia un tejido o agente específico. Los agentes objetivo incluyen anticuerpos, receptores, receptores - ligantes y similares. La vinculación del agente objetivo con el componente se conduce utilizando técnicas estándar. Por "forma conjugada" se entiende un compuesto de las fórmulas 1-4 acopladas hacia un agente objetivo, como se describió anteriormente. Las modalidades preferidas de los compuestos de las fórmulas 1-4 incluyen aquellos donde ambas n son iguales a 2, o aquellos en donde ambos R1 son etilo o metilo, preferentemente metilo, y aquellos en donde R2 es vinilo Son particularmente los compuestos de la fórmula ß-EAß Se ha preparado a ambos A-EA6 y B-EA6. Ambos son fotosintet izadores eficaces; parece que A-EA6 es lo más fácil para formular. Las diversas formas de los compuestos de la invención pueden utilizarse en las técnicas deterapia fotodinámica generalmente conocidas en la materia. Como se estableció en la sección de Antecedentes previamente, la terapia fotodinámica puede conducirse utilizando una plétora de protocolos y para una variedad de indicaciones. Además, los compuestos de este tipo exhiben actividad farmacológica en ausencia de luz en algunos casos. Las composiciones farmacéuticas estándar, que incluyen composiciones liposomales según se prefiera, se utilizan en las aplicaciones. Los siguientes ejemplos intentan ilustrar pero no limitar la invención. Mientras los Ejemplos ilustran y demuestran las sorprendentes propiedades f rmacocinét icos de dos miembros de las especies de la invención, A-EA6 y B-EA6, se espera que los compuestos restantes descritos por las fórmulas 1-4 tendrán variaciones similares en estas propiedades. Por consiguiente, la clase pequeña de compuestos contenidos en la presente invención ofrece adiciones valiosas al repertorio de agentes fotodinámicos útiles en el tratamiento de las diversas condiciones a las cuales se ha dirigido esta terapia. Ei emplo 1 Preparación de dos formas de EA6 A. Para preparar B-EA6, el material de inicio es BPD-DB como el éster de dimetilo -i.e., BPD-DB como se muestra en la Figura 1 donde R1 y R2 son ambos COOMe un R" es vinilo. A 2.0 gr. (2.7 mM) BPD-DB en 50 ml de etilenglicol y 100 ml . de diclorometano se le añadió 1.0 ml . de ácido sulfúrico. La reacción fue agitada durante 18 hr . a temperatura ambiente. Luego la reacción se agregó a una mezcla agitada de 100 ml . 5% de acetato de amonio acuoso y 100 ml . de diclorometano. La capa orgánica se aisló y luego se lavó dos veces con 50 ml . de agua. Se retiró el solvente mediante evaporación rotativa. El residuo verde oscuro fue luego cromatograf iado en 75 gr . de alúmina (desactivada con 5% agua) y extraída con solventes con un gradiente de 0.5% -5.0% de metanol en diclorometano. El solvente de las fracciones que contienen el producto fue luego retirado mediante evaporación rotativa. El residuo fue secado in vacuo durante la noche para proporcionar 2.02 gr. (89%) del compuesto verde analíticamente puro inicialmente convertido sold title. B. De manera similar a la establecida en el párrafo A, pero substituyendo BDP-DA por BPD-DB, se preparó la forma isomérica, A-EA6. Ei emplo 2 Comparación de la Toma y Liberación de B-EAß y BPD- MA mediante células L1210. BPD-MA o B-EA6 fueron incubados a 3 µg/ml en presencia de 10% de suero bovino fetal con ld/ml de células L1210, una línea celular de leucemia de ratón. El contenido intracelular de los fotosintet izadores se midió mediante la fluorescencia de los lisatos celulares en diversas ocasiones. La máxima concentración alcanzada fue 145.9 ng/106 células para B-EA6 y 149.5 ng/106 para BPD-MA. El plazo de toma se muestra en la Figura 2 como un porcentaje del contenido celular en 60 min mediante el cual la toma de tiempo ha alcanzado un máximo en ambos casos. Como se muestra, B-EA6 se toma más rápidamente y alcanza 80% de su concentración máxima después de solamente 5 min. y alcanzó su toma máxima dentro de 15 min. La cinética de liberación de estas drogas provenientes de las células L1210 se midió mediante la precarga de las células a 3µg/ml por 1 hr y luego colocar las células en un medio libre de drogas que contiene 10% de suero bovino fetal. El resto del contenido de la droga intracelular se midió a diversas puntos de tiempo al ocasionar lisis en las células y medir la fluorescencia. Como se muestra en la Figura 3 (nuevamente como un porcentaje de contenido intracelular de inicio) , BPD-MA y B-EA6 mostraron diferentes cinéticas de liberación. La liberación inicial de B-EA6 fue mucho más rápida, pero la liberación fue más completa en el caso de BPD-MA. No se esperaba que los farmacocinét icos in vi tro de B-EA6 fueran más rápidos que aquellos de BPD-MA. Mientras la retención más alta de B-EA6 podría atribuirse a su tamaño incrementado comparado con BPD-MA, no se esperaba la transferencia más rápida a través de la membrana celular.

Ei emplo 3 Comparación de los farmacocinét icos in vi tro . Cualquiera de los dos BPD-MA o B-EA6 se administró mediante una inyección intravenosa a los ratones DBA/2 a una dosis de 4 mg/kg utilizando 3 ratones por punto de tiempo. El contenido de la droga del plasma, la piel, el hígado y el riñon se determinó mediante la fluorescencia en los extractos de tejido. La Figura 4 muestra el resultado graficado como un porcentaje de la concentración en el tejido relevante 15 min después de la inyección. Como se ve en la Fig. 4, ni BPD-MA ni B-EA6 se acumularon en el plasma, el hígado o el riñon; sin embargo, BPD-MA se acumuló en la piel dentro de las primeras 3 hr; B-EA6 no. La acumulación más rápida de B-EA6 como se comparó con BPD-MA, como aquí se confirmó in vi vo mediante una limpieza más rápida de todos los tejidos, constituye una ventaja. El tratamiento con luz puede llevarse a cabo poco después de la inyección del fotosintet izador y debido a la limpieza rápida, no se exhibirá una fotosensibilidad prolongada de ojos o piel. De esta manera, los sujetos tratados pueden continuar vidas normales sin precauciones especiales tales como evitar la luz - brillante y utilizar anteojos oscuros. La vida media de B-EA6 y BPD-MA en diversos tejidos se calculó luego en el plazo de 15 min - 3 hr y los resultados se muestran en la Tabla 1 : Tabla 1 : Vidas medias del tejido de B-EA6 y BPD-MA T \4 * (15 min - 3 hr) Tej ido B-EA6 BPD-MA Hígado 0.6 2.4 Bazo 0.8 10.9 Riñon 0.8 5.6 Piel 1.9 0 * * Músculo 11.1 NDT Plasma 0.6 2.0 * no mostrada en horas **concentración de BPD-MA en la piel incrementada más de 3 hr . ND= no determinado La media vida de BPD-MA en este plazo podría no calcularse en la piel debido a su concen ración incrementada durante el periodo de 3 hr . Como se muestra en la Tabla 1, generalmente, B- EA6 tiene una media vida mucho más corta que BPD-MA en la mayoría de los tejidos. No se esperaba la falta de acumulación de B-EA6 en piel normal comparado con BPD-MA e indica una limpieza más rápida que aquella de BPD-MA. Como se estableció previamente, esto es ventajoso mientras la fotosensibilidad de piel sea el único efecto lateral reconocido de la terapia fotodinámica utilizando fotosintet i zadores .

Los farmacocinét icos se determinaron también utilizando un modelo de tumor de ratón in vi vo . Los grupos de 10 ratones DBA/2 que contienen tumores de rabdomiosarcoma Ml se inyectaron de manera intravenosa con una formulación liposomal de BPD-MA a diversas dosis de 0.75 - 1.5mg/kg . Los tumores se irradiaron con una luz láser de 690 nm a 50 o 150 J/cm2 en diversas ocasiones después de la inyección. Los resultados, como se muestra en la Tabla 2, se determinaron en términos del porcentaje de ratones en cada grupo que estuvieron libres -de tumores en el día 7 después de la inyección. Como se muestra en la Tabla 2, los ratones tratados con BPD-MA mostraron tasas de supervivencia substanciales cuando los tiempos de post inyección oscilaron de 15-180 min. Por otra parte, los ratones tratados con B-EA6 no mostraron respuesta en 30 min o 180 min; sin embargo, se obtuvieron respuestas significativas cuando la irradiación se suministró después de sólo 15 min. Estos datos demuestran que PDT utilizando B-EA6 será eficaz en el tratamiento temprano con luz. La falta de efecto de las post inyecciones en ocasiones posteriores indica, nuevamente, la limpieza rápida de B-EA6 la cual es ventajosa por - las razones previamente establecidas Tabla 2 : Resultados del bioensayo Condiciones PDT Porcentaj e Libre de tumor en e 1 Día 7 * Dosis de Tiempo Dosis de BPD-MA B-EA6 Droga ** post IV luz *** (mg/kg) (min) (J/cm2) 0.75 15 50 (4/5) 50% 30 50 70% 0% 1.0 15 50 100% 90% 30 50 90% 0% 1.5 180 150 70% 0% * modelo de tumor = tumor MI en ratones DBA/2 - cada condición PDT se probó en 10 animales ** las drogas se formularon de manera liposomática e inyectaron de manera intravenosa. *** Luz láser de 690 nm Como se muestra en la Tabla 2, el ratón tratado con BPD-MA mostró un porcentaje de sobrevivencia substancial cuando varió el porcentaje de los tiempo de post inyección de 15-180 min. Por otro lado el ratón tratado con B-EA6 no mostró respuesta a los 30 min o a los 180 min. ; sin embargo la respuesta significante se obtuvo cuando se suministró radiación después de solo 15 min. Estos datos demuestran que el PDT que utiliza B-EA6 será efectivo en tratamientos tempranos con luz. La carencia de efecto de la post inyección en tiempos posteriores indica, de nuevo, el rápido desvanecimiento del B-EA6 en desventaja por las razones antes establecidas Ei emplo 4 De erminación de LD50 con y sin suero Cualquiera de los dos B-EA6 o BPD-MA se incubó durante 1 hr con células L1210 en un rango de concentraciones y expuso a luz de espectro amplio 9 /cm2. Esta determinación se hizo en ausencia de suero y en presencia de 10% de suero. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 : Valores LDC Sin suero 10% de suero BPD-MA 3.7 ng/ml 54.0 ng/ml B-EA6 4.7 ng/ml 19.7 ng/ml Como se muestra, BPD-MA y B-EA6 tienen valores de B-EA6 comparables en ausencia de suero; sin embargo, en presencia de suero, B-EA6 muestra una substancialmente mejor retención de eficacia. En la mayoría de los casos, la presencia de suero reduce en gran medida la fotoact ividad de los agentes utilizados en PDT, tales como BPD-MA. De manera sorprendente, B-EA6 muestra más afinidad para las membranas celulares que para los compuestos de plasma y es de esta manera afectado de manera muy ligera por la presencia de suero en el ambiente celular. De esta manera, in vi vo , su actividad - - puede ser más alta que aquella de BPD-MA y otros compuestos de esta familia. Ei emplo 5 Eficacia in vi tro de B-EA6 La capacidad de B-EA6 para ejercer un efecto citotóxico en células L1210 in vi tro se probó de manera detallada al incubar las células con B-EA6 en diversas concentraciones durante 1 hr en ausencia de suero. Después de que se retiró el exceso de droga, las células se expusieron a luz de espectro amplio 9J/cm2 (380-750nm) y se determinó la supervivencia de la célula mediante el ensayo MTT (Mosmann, T. et al J Immunol Me th (1983) 65:55-63) .

El porcentaje de células muertas se calculó con referencia a la supervivencia de las células expuestas solamente a luz. A una concentración de aproximadamente 7 ng/ml, el 80% de las células murieron; a 15 ng/ml, casi el 100% de las células no sobrevivieron. Como se estableció anteriormente, el LDS0 para B-EA6 es aproximadamente 4.7 ng/ml. El efecto algo más bajo de B-EA6 en comparación con BPD-MA in vi tro hace aún más inesperado la actividad comparativamente más alta de B-EA6 en comparación con BPD-MA in vi vo en presencia de suero como se demostró en el Ejemplo 4.

Eiemplo 6 Selectividad de B-EA6 para células de tumor La capacidad de las células L1210 para acumular B-EA6 se comparó con la capacidad de los esplenocitos para hacer eso. Se incubó B-EA6 a 3µg/ml con cada tipo de célula y el contenido de la célula de B-EA6 se determinó mediante la fluorescencia en los lisatos de la célula. La figura 5 muestra una comparación de la toma para los dos tipos de célula en ng/10s células. Como se muestra, las células L1210 pudieron tomar aproximadamente 140 ng/106 células alcanzando este valor después de aproximadamente 20 min. Por otra parte, los esplenocitos, acumularon menos de 20 ng/106 células después de una hora de incubación. Los ratones DBA/2 que padecen tumor Ml (rabdomiosarcoma) , crecidos subcutáneamente en sus costados, se utilizaron como un modelo para mostrar que B-EA6 demostró selectividad para los tumores. A los ratones se les administró 0.75 ng/kg de B-EA6 en una formulación liposomal de manera intravenosa. Después de 15 min, un área de 1 cm la cual incluyó un tumor de 5 mm de diámetro se expuso a una luz con longitud de onda de 690 mm a 50 J/cm2 a 70 mW proveniente de un láser de boquilla de bomba de 4 argón . Ei emplo 7 Inmunomodulación mediante B-EA6 Se probaron los ratones Balb/C (5-8 ratones por grupo) utilizando el ensayo pospuesto de fotosensibilidad de piel también llamado el ensayo de hipersensibilidad de contacto (CHS) . Los ratones se pintaron en el costado con el agente sensibilizador dinitrofluorobenceno (DNFB) y 5 días después, se estimula una oreja con DNFB, mientras que la otra sirve como un control. La hinchazón es un indicador de respuesta inmune. Los ratones se inyectaron de manera intravenosa con 1 mg/kg B-EA6 liposomal y también irradiados con 15 J/cm2 de luz sobre el cuerpo entero o expuestos a luz ambiental . Se demostró la capacidad de este tratamiento para evitar la respuesta inmune como se demostró mediante la inhibición de la hinchazón de oreja. Los resultados mostraron que administrando B-EA6 combinado con cualquiera de los dos después de la irradiación con 15 J/cm2 de luz sobre el cuerpo entero o con luz ambiental disminuyó la hinchazón en la oreja de prueba en comparación con los ratones no tratados . La hinchazón en ambos casos fue de sólo aproximadamente 60% de aquella mostrada en ratones - sin el tratamiento. En un ensayo adicional para determinar la inmunomodulación, los macrofags perifonéales de ratones se aislaron, purificaron y activaron por medio del interferon-? recombinante (100 U/ml) . Las células activadas se incubaron durante 1 hr a 37°C con B-EA6 en un rango de combinaciones y luego se expusieron a luz de LED de 690 nm a 5 J/cm2. Los niveles de expresión de MHC I, MHC II, CD54, CD80 y CD86 se determinaron 24 hr después utilizando anticuerpos conjugados FITC y un clasificador celular. Los resultados se muestran en la Tabla 4 para B-EA6 a 0.5 ng/ml en comparación con los experimentos similares utilizando BPD-MA a 2.5 ng/ml . Tabla 4: Efecto de dosis baja de PDT con B-EA6 en niveles de expresión de antígenos de superficie celular mediante macrofags perifonéales de ratones Compuesto MHC MHC CD54 CD80 CD86 Clase I Clase (ICAM- (B7-1) (B7-2) II 1) BPD-MA 99.1 79.3 105.4 93.5% 99.2% (2.5 ± 4.3% ± 10.1 % ± 3.0 % ng/ml ) BPD-B-EA6 100.4% 71.8% 106.9% 102.3% 92.2% (0.5 ng/ml ) Los resultados en la tabla se dan como porcentaje de expresión en comparación con las - células tratadas solamente con luz. Como se muestra, ambos BPD-MA y B-EA6 pudieron reducir la expresión de MHC II, pero no el resto de los et iquetadores de superficie. De esta manera, aunque B-EA6 tiene farmacocinét icos ventajosos, retiene la actividad inmunomoduladora de BPD-MA y de otros compuestos de este grupo. Ei emplo 8 Efecto de B-EA6 en un modelo de artritis Los ratones MRL-I desarrollaron espontáneamente artritis; esto se acentuó por la inyección intradérmica de adyuvante de Freund' s. Diversos números de ratones de MRL-Ipr se trataron con PDT en los días 0, 10 y 20 después de la inyección del adyuvante. PDT consistió de 0.5 mg/kg de B-EA6 liposomal inyectado de manera intravenosa seguido por la exposición de la parte ventral de los ratones a luz roja (560-900 nm) a 80 J/cm2 en una post inyección de B-EA6 de 1 hr . Se observó a los ratones y se anotaron los síntomas cada 5 días de 30 días. Los resultados se muestran en la Figura 6 en comparación con los ratones tratados de manera similar con BPD-MA y BPD-MB. Como se muestra en la figura 6, ya sea medidos por la incidencia de los síntomas clínicos (i.e., el porcentaje de ratones que exhiben esos síntomas) o por el cambio en el ancho del tobillo bimaleolar en milímetros, B-EA6 (mostrado como círculos sólidos) fue eficaz para prevenir la secuela de inyección adyuvante. Nuevamente, se demostró la retención de la actividad inmunomoduladora de B-EA6. Ei emplo 9 Efecto de B-EA6 en la microvasculatura . Se utilizó el modelo del músculo suspensor de los testículos. Se administró B-EA6 de manera intravenosa a 2 mg/kg y empezando en una post inyección a 5 y 15 min, las arterias y venas chicas expuestas de manera quirúrgica se irradiaron con luz a una intensidad de 25 J/cm2 por 5 min empezando en 5 min y 15 min después de la inyección de el B-EA6. Los vasos se midieron tanto en el diámetro de la columna de sangre roja como un porcentaje de los controles. Los resultados se muestran en la Figura 7. Mientras el cierre del vaso transitorio podría obtenerse cuando la irradiación ha comenzado a los 5 min, el cierre permanente se obtuvo cuando la irradiación empezó después de 15 min. La capacidad mejorada de B-EA6 para apretar o ocluir la vasculatura, como se demostró en este Ejemplo, en combinación con farmacocinéticos más rápidos, hace a B-EA6 particularmente ventajosa al tratar enfermedades neovasculares en el ojo. Eiemplo 10 Espectro de Absorción de B-EA6 BPD-MA y B-EA6 tienen espectros de absorción similar en el plasma antes y después de una exposición de 4 hr a luz fluorescente (380-750 nm) . Una comparación de estos espectros se muestra en la figura 8. La similitud de los espectros de B-EA6 con el espectro de BPD-MA es ventajoso debido a que el uso de BPD-MA como un agente terapéutico útil en PDT se encuentra bien desarrollado. La similitud en sus espectros indica que se pueden utilizar las mismas fuentes de luz para B-EA6 mientras sean exitosas en el tratamiento con BPD-MA. Eiemplo 11 Citotoxicidad in vitro de A-EA6. De manera similar a aquella establecida en el Ejemplo 5, se probó y comparó con BPD-MA la citotoxícidad de A-EA6 in vi tro en dos líneas celulares diferentes. Cualquiera de las dos células L1210 o de la línea celular dendítrica D2SC/1 se incubó durante una hora a 37°C con cualquiera de los dos A-EA6 o BPD-MA. Después de retirar el exceso de - - droga, las células se expusieron a luz de 690 nm a 5 J/cm2 para las células dendítricas y a luz de 9 J/cm2 para las células L1210. La supervivencia celular se determinó 18-24 hr después utilizando el ensayo colorimétrico MTT descrito en el Ejemplo 5. El porcentaje de células muertas se calculó mediante referencia a las células expuestas solamente a luz. Como se muestra en la Figura 9A, A-EA6 mostró una citotoxicidad comparable a la de BPD-MA con respecto a las células L1210 en ausencia de suero pero fue et iquetadamente más tóxica en presencia del suero que de BPD-MA. Los círculos abiertos representan A-EA6 más suero; los círculos cerrados representan BPD-MA más suero; los cuadrados abiertos representan A-EA6 en ausencia de suero; y los cuadrados cerrados representan BPD-MA en ausencia de suero. Como se muestra en la Figura 9B, en las células dendítricas donde BPD-MA tiene un LDS0 de 6 ng/ml y A-EA6 tiene un LDS0 de 2.7 ng/ml, A-EA6 fue tóxico a concentraciones menores que BPD-MA en presencia de 5% de suero fetal de ternera. En la figura 9B, los círculos cerrados representan BPD-MA y los cuadrados abiertos representan A-EA6. En una determinación similar, pero midiendo los receptores MHC I antes que la citotoxicidad, A- - - EA6 fue eficaz al disminuir la expresión de estos receptores a concentraciones más bajas. En esta determinación, las células dendítricas se incubaron durante 1 hora a una concentración de droga menor que su LD50; 2.5 ng/ml y 5 ng/ml para BPD-MA y 1 ng/ml y 2.5 ng/ml para A-EA6. Las células se trataron con luz de 690 nm a 5 J/cm2 y luego se etiquetaron con el anticuerpo apropiado durante un postratamiento de 3 horas y evaluado mediante citometría de flujo. Los resultados se midieron como el porcentaje de la intensidad media de fluorescencia del canal para las células de control tratadas con luz. Estos resultados se muestran en la figura 10; BPD-MA dio una reducción de 18% y 29%, respectivamente, a 2.5 ng/ml y 5 ng/ml; A-EA6 redujo la intensidad de la fluorescencia del canal por aproximadamente 25% en ambas concentraciones de 1 ng/ml y 2,5 ng/ml . Ei emplo 12 Efecto de A-EA6 en señalización intracelular. Las condiciones del estudio establecidas en el Ejemplo 11 se repitieron utilizando células HL-60 como el objetivo y comparando los efectos de A-EA6 y BPD-MA en la citotoxicidad, en la quinasa de la trayectoria citogénica p70 S6K, y en las quinasas de trayectoria de estrés c-jun y HSP27. Los resultados se muestran en la Figura 11. En concentraciones subletales, A-EA6 mostró una activación más fuerte de las quinasas de trayectoria de estrés y una inhibición más fuerte de las quinasas de trayectoria mitogénica . Se midió el efecto en la activación caspase en células HL60 también. A-EA6 mostró una activación más fuerte en las caspases que lo que BPD-MA mostró. El efecto es deseable según se asoció con apoptosis. Utilizar la apoptosis para retirar las células no deseadas ocasiona el mínimo efecto en las células y tejidos normales circundantes. La comparación de A-EA6 con BPD-MA se muestra en la Figura 12. La Figura 13 muestra una comparación similar cuando la fragmentación de porcentaje de ADN se midió en células HL60. Nuevamente, A-EA6 fue eficaz a concentraciones más bajas que BPD-MA. Ejemplo 13 Terapia Fotodinámica in vivo utilizando A-EA6. En un protocolo similar a aquel establecido en el Ejemplo 3, cualquiera de los dos A-EA6 o BPD-MA se inyectó de manera intravenosa en los ratones que albergan tumores Ml a una dosis de 1 mg/kg. A esto siguió una irradiación de cuerpo entero con 50 J/cm2 de luz láser de 690 nm en diversas ocasiones después de la administración de la droga. El número de animales libres de tumor se determinó el día 7 y los resultados se muestran en la Tabla 5.

Estos resultados muestran que A-EA6 es por lo menos tan eficaz como BPD-MA en este ensayo. Eiemplo 14 Actividad Inmunomoduladora Los costados de control y los ratones de prueba se pintaron con el antígeno DMFB y sus orejas se estimularon 5 días después pegándoles el mismo compuesto. Los animales de prueba se trataron con PDT de cuerpo entero utilizando BPD-MA o A-EA6, al inyectar el sintetizador de manera intravenosa y luego exponer los animales a la luz de LED roja de 15 J/cm2. El porcentaje de supresión de la hinchazón de oreja se calculó en comparación con los controles. Los resultados se muestran en la Tabla 6 e indican que A-EA6 tuvo un efecto inmunomodulador - - más fuerte en este ensayo que BPD-MA

Claims (11)

1. - -
2. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones . 1 . Un compuesto de la fórmula
3. -NH N-v .y- ° * C '° B,C-~ d N HN c — Kj (CHA ÍCH? •0000^0^0-1 CQGCHjC^GH 1 Z y las formas metaladas y/o etiquetadas y/o conjugadas del mismo caracterizadas porque cada R1 es independientemente alquilo (1-6C) ; cada n es independientemente un entero de 0-6; y R2 es vinilo o una forma derivada del mismo. 2. El compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque R2 es vinilo, -CHOR', -CHO, COOR', -CH(OR')CH3, -CH (OR ' ) CH2OR ' , -CH(SR')CH3, -CH (NR')2CH3, -CH(CN)CH3, - CH ( COOR ' ) CH3 , - CH (OOCR ' ) CH3 , -CH (NR' COR' ) CH3, - CH ( CONR ' 2 ) CH3 , - CH (halo ) CH3 , o CH (halo) CH2 (halo) en donde R' es H, o un radical hidrocarburo (1-6C) substituido de manera opcional con un substituto de heteroátomo o en donde R2 es un grupo orgánico de menos de 12 átomos de carbono que resultan de la derivación directa o indirecta de un substituto de vinilo, o en donde R2 es un grupo que contiene 1-3 núcleos del tipo tetrapirrol. 3. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 caracterizado porque se encuentra en una forma metalada, y/o el cual se encuentra en la forma conjugada, y/o se encuentra etiquetada.
4. 4. El compuesto según la reivindicación 1 o 2 caracterizado porque no contiene un ion de metal .
5. 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque R2 es vinilo, y/o en donde cada R1 es metilo, y/o en donde ambas n son 2.
6. 6. El compuesto según la reivindicación 5 - - caracterizado porque R2 es vinilo y ambas R1 son metilo .
7. 7. El compuesto según la reivindicación 6 caracterizado porque es de la fórmula Ü-CAÍ y las formas metaladas y/o etiquetadas y/o conjugadas del mismo.
8. 8. El compuesto según la reivindicación 7 el cual se encuentra en una forma metalada, y/o el cual se encuentra en forma conjugada, y/o el cual se encuentra etiquetado.
9. 9. El compuesto según la reivindicación 7 caracterizado porque no contiene un ion de metal.
10. 10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en mezcla con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. 11. Un método mejorado para conducir la terapia o diagnosis fotodinámica caracterizado porque el método comprende administrar un compuesto fotoactivo a un sujeto con necesidad de terapia o diagnosis en donde la mejora comprenda el uso del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 como el agente fotoactivo.