MXPA99004392A - Soluciones acuosas estabilizadas de trifosfato de nucleosido - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a soluciones acuosas estables que contienen uno o varios trifosfatos de nucleosidos en donde la solución respectiva tiene un valor pH de más de 7.5 y no contiene sustancias adicionales con un efecto estabilizante. Las soluciones de trifosfatos de nucleosidos son usadas en particular para reacciones de sintetización del DNA tal como por ejemplo, RT-PCR, ciclos de secuencias, preparación aleatoria y translación por flexión o translación nick. Una de las aplicaciones más importantes de tales soluciones contienen trifosfatos de desoxinucleosidos (d-NTP) es su uso en la reacción en la cadena polimerasa (PCR).

Description

SOLUCIONES ACUOSAS ESTABILIZADAS DE TRIFOSFATO DE N CLEOSIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a soluciones acuosas estables que contienen trifosfatos de nucleosidos en los cuales la solución tiene un valor de pH superior a 7.5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los trifosfatos de nucleósidos (NTP) tales como trifosfatos de ribonucleosido, desoxinucleosido y didesoxinucleosido tienen una variedad de usos en el campo de la bioquímica y la biología molecular. La mayoría de las aplicaciones se refieren a las reacciones las cuales sintetizan o replican el DNA y RNA tal como la reacción de cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) , la secuenciación del ciclo y la translación por flexión. En el caso del RT-PCR, las cadenas DNA están sintetizadas en la dirección 5' -3' en por ejemplo la transcriptasa inversa en donde una hebra de RNA sirve como la plantilla. Pueden usarse ciertos NTPs tales como los trifosfatos de REF.: 30158 didesoxinucleosidos como cadenas terminadoras en la secuencia del ADN. Una de las aplicaciones más importantes de trifosfatos de desoxinucleosidos (d-NTP) es su uso en la reacción de cadena polimerasa (PCR) . En esta aplicación cs absolutamente esencial quo las soluciones de NTP anteriores sean todas estables durante el almacenaje. Los d-NTPs (d-ATP, d-CTP, d-GTP, d-TTP, d-UTP entre otros), son almacenados usualmente como sales de Na (sodio) o Li (litio) y están conercialmente disponibles en esta forma típicamente a concentraciones de 0.1 mol/1. Como una regla, los valores de pH son valores pH fisiológicos es decir, entre aproximadamente 7.0 y 7.5.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una desventaja de lo actual, es decir, de las soluciones NTP comercialmente disponibles está en particular en la inestabilidad del NTPs durante el almacenamiento o estrés térmico. El NTPs tiene una tendencia a descomponerse con cl tiempo para formar los monofosfatos y difosfatos correspondientes. El contenido de trifosfato disminuye especialmente a elevadas temperaturas. El contenido de trifosfato disminuye por aproximadamente 2-3% dentro de diez dias a un valor de pH de aproximadamente 7.5 y a una temperatura de 35°C. En contraste a temperatura ambiente, el contenido de trifosfato se observa por disminuir solamente aproximadamente 1% después de siete semanas. Por lo tanto, la descomposición de los trifosfatos en soluciones acuosas limitan la vida de anaquel de las soluciones de NTP. Consecuentemente los suministradores de d-NTPs por ejemplo solamente garantizan una vida de anaquel de 12 meses para las soluciones dNTP. Sin embargo, hay una necesidad para soluciones acuosas las cuales solamente contienen dNTP y estén a concentraciones elevadas y las cuales tengan una estabilidad mayor de largo término que las soluciones actualmente disponibles.

Procurando mejorar la estabilidad de los trifosfatos se han relatado ahora solamente soluciones de trifosfatos de adenosina correspondientes. Se examinó la estabilidad del trifosfato de adenosina en relación al valor de pH. La presencia do estabilizadores se describió por ser absolutamente esencial de conformidad con el estado de la técnica. Asi, la estabilidad del trifosfato de adenosina en la solución acuosa a un valor pH de preferiblemente 8.3 a 9.2 se describe por ser óptimo en la presencia de EDTA (JP 64/003444/DERWENT 66-11664F) . Se describen en la presencia de estabilizadores tales como •guanidina/amino-güanidina o creatinina un valor pH de 9 a 10 (JP 71/038270/DERWENT 71-722169 y JP 71/033592/DERWENT 71-631879), en la presencia de metionina como estabilizador un valor pH de preferiblemente 9 a 10.5 (JP 67/019115/DERWENT 66-29019F) , en la presencia del fosfato estabilizador y sorbitol/ anitol/glicerol/alcohol benoilico/PEG un valor de pH de 8 a 11 (JP 67/015115/DERWENT 6-28392F) y en la presencia de glicerol/H3P04 un valor pH de 3.7 (FR4078/DERWENT 66- 22085F) . Sin embargo, la presencia de estabilizadores en las soluciones d-NTP pueden ser críticos por muchas aplicaciones u ocasionar interferencia.

Un asi llamado, estuche ya preparado (Pharmacia) es conocido para el etiquetado de las preparaciones aleatorias radiactivas. En este estuche, todos los componentes de la reacción están pre-mezclados y ya con pre-alicuotas para mezclas de pruebas individuales y estabilizados en seco (cristalizados) . Sin embargo, una desventaja de esta forma es que no hay flexibilidad con respecto al tamaño de la mezcla de prueba, además, el tiempo requerido para disolver los componentes "cristalizados" en el cual el proceso se completa, es lento y lo hace menos reproducible.

En la Patente Europea EP 0 049 909, el objeto es proporcionar todos los componentes de la reacción de un estuche para el etiquetado de ácidos nucleicos ya mezclados "en una forma liquida. Sin embargo, la estabilidad en almacenamiento de la mezcla cs solamente realizada por la adición de glicerol como un estabilizador.

En consecuencia, el objeto de la presente invención es proporcionar una solución estabilizada acuosa que contiene NTPs sin la adición de algún estabilizador.

El objeto se realizó de conformidad con la invención por las soluciones acuosas de NTP que tienen un valor pH de aproximadamente arriba de 7.5. Estos trifosfatos de nucleósidos incluyen trifosfatos de ribonucleosidos, desoxinucleotidos y trifosfatos de didesoxinucleotido en donde los cinco ocurren de manera natural asi también como bases modificadas tales como isoguanina, compuestos de desaza y derivados del mismo considerándolos como bases. Además, los trifosfatos de nucleósidos pueden ser etiquetados con grupos relatores. Como una regla, las soluciones de conformidad con la invención tienen un valor de pH en el rango de más de 7.5 a un máximo de 11. Un valor de pH de aproximadamente 8 a 10 se proporcionará por ser particularmente ventajoso. El valor de pH puede ser regulado al agregar una base (por ejemplo, NaOH, KOH, LiOH) asi también como por la adición de un amortiguador (por ejemplo amortiguador Tris, amortiguador Na, amortiguador fosfato) .

La concentración de la solución NTP es preferiblemente de aproximadamente 2 mmol/l y 200 mmol/l. Se prefiere particularmente una concentración de los NTPs de aproximadamente 100 a 150 mmol/l.

Las soluciones estables de d-NTP son una característica particularmente importante de esta invención. La estabilidad de estas soluciones parece ser especialmente ventajosa con respecto a un aplicación en la reacción de la cadena polimerasa. Como una regla, el valor de pH de la solución de d-NTP esté arriba de aproximadamente 7.5 y abajo de aproximadamente 11. Se proporciona por ser particularmente ventajoso, un valor de pH entre aproximadamente 8 y 10. La concentración de la solución estable está entre 2 mmol/l y 200 mmol/l. Una concentración particularmente preferida de los d-NTPs es de 100 a 150 mmol/l.

Se ha turnado sorprendente, que la estabilidad del NTPs en una solución acuosa a valores pH de más de 7.5 y sin la adición de cualquier estabilizador es superior que en las soluciones previamente conocidas las cuales tienen un valor de pH de aproximadamente 7.0 a 7.5. La estabilidad del d-NTPs en la solución acuosa alcanza un óptimo a un vapor pH de aproximadamente 8 a 10. El incremento del valor pH no causa alguna reacción de degradación adicional es decir, el modelo de los productos de degradación permanece sin cambio a los valores pH de conformidad con la invención. Sorprendentemente las reacciones de degradación proceden considerablemente más lentamente a valores de pH superiores tales como por ejemplo 8.3 que a valores fisiológicos tales como por ejemplo 7.5.

En consecuencia, se ha tornado que en un valor de pH incrementado no se forman sub-productos o derivados en los cuales todos podrán deteriorar el uso de los d-NTPs por ejemplo, para la reacción PCR. Aún después de aproximadamente 90 dias a una temperatura de aproximadamente 35°C la prueba de función PCR es positiva. El valor pH superior no es critico para el prueba misma PCR puesto que se realizan más amplificaciones en algunos casos a valores de pH de más de 8.0. Sin embargo, por ejemplo, las soluciones acuosas d-NTP las cuales tienen un valor pH de más de aproximadamente 7.5 y menos que/igual a aproximadamente 11 se proporcionan por ser estables de una manera y ventajosas para usarse en la reacción PCR. En este caso, se proporciona por ser particularmente ventajoso un valor de pH de la solución d-NTP entre 8 y 10.

Las soluciones NTP estables de conformidad con la invención pueden usarse para todas las síntesis de DNA y RNA y reacciones replicantes DNA y RNA. En particular la solución NTP estable de conformidad con la invención puede usarse para RT-PCR, para translación por flexión o translación nick:, preparación aleatoria y para las secuencias (ciclo de secuencias) . Además las soluciones estables NTP de conformidad con la invención se proporcionan por ser ventajosas con respecto a una mayor duración de uso del NTPs. Lo que sugiere que las soluciones estables de conformidad con la invención puedan almacenarse por un periodo considerablemente largo que las soluciones d-NTP previamente usadas.

Leyenda de las Figuras Figura 1: Disminución del contenido de D-GTP. La disminución de la concentración d-GTP a una temperatura de 35°C se monitoreó durante un periodo de 140 dias a valores pH de 7.5, 7.9, y 8.4.

Figura 2 : Disminución del contenido de d-CTP La disminución de la concentración d-CTP a una temperatura de 35 °C se monitoreó durante un periodo de 90 dias a valores pH de 7.5, 7.9 y 8.3.

Figura 3: Disminución del contenido de d-TTP La disminución de la concentración d-TTP a una temperatura de 35°C se monitoreó durante un periodo de 90 dias a valores pH de 7.5, 7.9 y 8.3.

Figura : Disminución del contenido de d-UTP La disminución de la concentración d-UTP a una temperatura de 35°C se monitoreó durante un periodo de 65 dias a valores pH de 7.5, 7.9 y Figura 5: Disminución del contenido de d-ATP La disminución de la concentración d-ATP ' a una temperatura de 35°C se monitoreó durante un periodo de 65 dias a valores pH de 7.5, 7.9 y 8.3.

Figura 6: Contenido de trifosfato en relación al valor pH Figura 7: dependencia del pH de la estabilidad de UTP Figura 8: dependencia del pH de la estabilidad de UDP Figura 9: dependencia del pH de la estabilidad de ATP Figura 10: dependencia del pH de la estabilidad de ADP Figura 11: dependencia del pH de la estabilidad de 7- desaza-desoxy-GTP Figura 12: dependencia del pH de la estabilidad de 7- desaza-desoxi-GTP Figura 13: dependencia del pH de la estabilidad de dATP en la concentración de la solución a pH 8.3, en la cual c=100 mmol/l, 10 mmol/l y 2 mmol/l.

Figura 14: dependencia del pH de la estabilidad de dATP en la concentración de la solución a pH 8.3, en la cual c=100 mmol/l, 10 mmol/l y 2 mmol/l.

Figura 15: dependencia del pH de la estabilidad de dCTP en la concentración de la solución a pH 8.3, en la cual c=100 mmol/l, 10 mmol/l y 2 mmol/l.

Figura 16: dependencia del pH de la estabilidad de dCTP en la concentración de la solución a pH 8.3, en la cual c=100 mmol/l, 10 mmol/l y 2 mmol/l.

La invención está además demostrada por los siguientes ejemplos: Ejemplo 1: Producción de una solución d-NTP estable de conformidad con la invención.

Se purificaron los d-NTPs por cromatografía por anión con la ayuda de un gradiente de sal y desalado por osmosis inversa. Esto se siguió por una ultrafiltración (limite de exclusión 1000-5000 D) para remover DNAses/RNAses. La concentración de la solución se ajustó entonces con agua estéril a típicamente 100 mM. El valor de pH se ajustó al valor de pH correspondiente (> 7.5) por la adición de bases (álcali/alcalinotérreo/hidróxido de amonio; aminas) usualmente NaOH.

Ejemplo 2: Degradación del trifosfato a varios valores de pH Se ajustaron las soluciones d-NTP a valores pH entre 7.5 y 8.3 con una solución de hidróxido de sodio a una concentración de 100 a 110 mmol/l. La muestra se almacenó a 35°C, 22°C, 4°C y -20°C. Las alícuotas se eliminaron a varios puntos de tiempo y la pureza se examinó por medio de HPLC. Se determinó por la integración de las áreas, la cantidad relativa de los tri, di y monofosfatos asi también como de las bases libres.

La disminución del contenido de trifosfato es dependiente del pH. La disminución fue lentamente a aproximadamente pH 8.3 para todos los nucleótidos examinados (fig. 1-5) .

Es decir, aún a valores pH elevados tales como 8.3 no se observan picos adicionales en el crornatograma de HPLC el cual puede indicar productos de descomposición.

Ejemplo 3: Determinación del pH óptimo del d-NTPs Las soluciones d-NTP (dCTP, d TTP, dUTP) ajustaron a valores pH entre 7.5 y 12 (d-ATP, d-GTO sin pH 7.9 y 8.3) a una concentración de 100 a 110 mmol/l. La muestra se sometió a estrés por 35 dias a 35°C y se examinó subsecuentemente la pureza por medio de HPLC. Se determinó por la integración de áreas, la cantidad relativa del tri, di y monofosfato asi también como de la base libre.

Pata todos los d-NTP examinados el óptimo estuvo en el rango entre pH 9.0 y 11.0. Hasta pH 12 hubo solamente una ligera degradación (excepto para d-CTP el cual se desaminó a pH 12 para formar d-UTP) (ver figura 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12) .

Ejemplo 4: Calculo de la estabilización de d-NTPs a pH 8.3 comparado a un pH 7.5 La estabilización se estimó por la siguiente formula a partir de tres experimentos independientes sometidos a estrés, del d-NTPs a pH 8.3 y 7.5 a 35°C en el cual las muestras se tomaron a intervalos entre 7 y 89 dias. contenido ? (pH 8.3) - contenido ? (7.5) x 100 contenido ? (pH 7.5) en el cual, el contendió ? (pH = contenido (t=0)-contenido (t) Esto resulta en las siguientes estabilizaciones para los nucleótidos individuales en por ciento a un valor pH de 7.5 comparado a un valor pH de 8.3 (tabla 1): Tabla 1: Ejemplo 5: Estabilización a temperatura ambiente Después de 204 dias (20°C) la diferencia en la estabilización del pH llegó a ser aparente (en el modelo de tiempo real) . En el caso de las soluciones d-ATP el contenido de trifosfato por ejemplo disminuyó por aproximadamente 7.6 % a pH 7.5, por aproximadamente 6.3 % a pH 8.3 (17% de diferencia). En el caso de las soluciones d-GTP el contenido de trifosfato disminuyó por ejemplo por aproximadamente 6.8 % a pH 7.5 y por aproximadamente 5.2% a pH 8.3 (23% de diferencia).

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la manufactura de los objetos a los que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Solución acuosa estable, que contiene trifosfatos" de nucleosidos, caracterizada porque el valor de pH de la solución está arriba de aproximadamente 7.5, la solución está libre de agentes de estabilización adicionales y la prueba de función PCR es positiva después de aproximadamente 90 dias a una temperatura de 35°C.

2. Solución acuosa estable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los trifosfatos de nucleósidos son trifosfatos de nucleosidos modificados.

3. Solución acuosa estable de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el valor pH está en el rango entre 7.5 y 11.

4. Solución acuosa estable de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizada porque la concentración del trifosfato de nucleósido es de aproximadamente 2 a 200 mmol/l.

5. Solución acuosa estable de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la solución contiene trifosfatos de desoxinucleosidos .

6. Solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque contiene una substancia la cual amortigua a o sobre un pH 7.5

7. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6, para una reacción de sintetización de DNA y/o RNA.

8. Uso de una solución acuosa estable como se reivindicó en las reivindicaciones 1 a 6, para replicar fragmentos o secuencias DNA y/o RNA.

9. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 7 para replicar específicamente fragmentos de ácido nucleico en la presencia de una enzima con actividad de transcriptasa inversa.

10. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6 para la secuencia del ciclo de los ácidos nucleicos.

11. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en as reivindicaciones 1 a 6 para la replicación especifica de secuencias o fragmentos de ácido desoxinucleico.

12. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación aleatoria.

13. Uso de una solución acuosa estable como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 6 para la translación por flexión o translación nick.