MXPA99003054A - Metodos para tratar la pigmentacion de la piel - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a métodos y composiciones para llevar a cabo cambios en la pigmentación de la piel;más particularmente, esta invención se refiere a compuestos que afectan la melanogénesis y pueden usarse como agentes despigmentadores o como agentes para oscurecer la piel utilizando la ruta de PAR-2.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR LA PIGMENTACIÓN DE LA PIEL CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos y composiciones para producir pigmentación de la piel y/o causar despigmentación de la misma. Más particularmente, esta invención se refiere a compuestos que afectan la melanogénesis, y que se pueden usar como agentes de despigmentación o como agentes para obscurecer la piel.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coloración de la piel ha sido de interés para los seres humanos durante muchos años. En particular, la capacidad para remover la hiperpigmentación, tal como la que se encuentra en manchas por edad, pecas o envejecimiento de la piel generalmente, es de interés para los individuos que desean una complexión uniforme. En ciertas áreas del mundo, el blanqueo general del cuerpo es conveniente. Existen también trastornos de hipopigmentación y de hiperpigmentación que es conveniente tratar. Del mismo modo, la capacidad para generar una apariencia bronceada sin incurrir en fotodaño debido a la radiación solar, es importante para muchos individuos. Han habido muchos métodos propuestos para lograr la despigmentación, así como también para lograr el obscurecimiento de la piel. Por ejemplo, se han usado para lograr la despigmentación ácido cójico, hidroquinona, retinoides y otros compuestos químicos. La dihidroxiacetona y compuestos químicos similares se han utilizado por su capacidad para "broncear" la piel sin exposición al sol.

Se ha encontrado que muchas de estas soluciones previas no son aceptables. Existe con frecuencia una línea distinta de demarcación entre las áreas de la piel a las cuales dichas composiciones anteriores han sido aplicadas. Por lo tanto, la aplicación precisa de todos estos compuestos es necesaria para lograr el resultado deseado. Se ha encontrado que muchos de estos compuestos son bastante irritantes para la piel y, por lo tanto, inconvenientes para su uso., El conocimiento de la base química y enzimática de la melanogénesis está ampliamente documentado. Los melanocitos migran desde la cresta neural embrionaria en la piel para producir granulos secretorios, melanosomas, los cuales producen melanina. La melanogénesis ocurre dentro del melanosoma, y la melanina es distribuida después a los queratinocitos mediante las dendritas del melanocito. La enzima clave de la melanogénesis es la tirosinasa, que inicia una cascada de reacciones que convierten la tirosina en el biopolímero melanina. Se conocen dos proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP's), TRP-1 y TRP-2. Estas proteínas comparten con la tirosinasa aproximadamente 40% de homología, y tienen actividades catalíticas así como también funciones reguladoras en la melanogénesis. La TRP-1 es la glicoproteína más abundante en los melanocitos. A pesar del hecho de que la base química y enzimática de la melanogénesis está bien documentada, su regulación a nivel celular es apenas parcialmente entendida. La tirosinasa y las TRP's comparten propiedades estructurales y biológicas con la familia de genes para proteína de membrana asociada a Hsosomas (LAMP); por lo tanto, su envío a la membrana melanosómica podría inducir su activación. Una reacción de fosforilación/desfosforilación en las colas citoplásmicas de estas proteínas podría intervenir en la regulación de la melanogénesis. Se ha demostrado que la isoforma beta de la familia de la proteína cinasa C (PCC) regula la melanogénesis humana mediante la activación de la tirosinasa. La expresión génica de la tirosinasa, TRP-1 y TRP-2, es coordinada. Estas tres enzimas se expresan en la epidermis humana. En melanocitos cocultivados con queratinocitos, estos transcritos se expresan a una relación de 45:45:10, respectivamente. En melanocitos cultivados solos, sólo los transcritos de TRP-1 están presentes, indicando que una señal derivada de queratinocitos interviene en la expresión coordinada de estos genes. Aún no se han entendido la regulación de las interacciones entre queratinocitos y melanocitos y el mecanismo de transferencia de melanosomas en queratinocitos. El receptor 2 activado por proteasa (PAR-2) es un receptor acoplado a 7 proteínas G de transmembrana, es decir, relacionado a, pero distinto de, los receptores de trombina (TR, denominados también PAR-1 y PAR-3) en su secuencia. Ambos receptores son activados proteolíticamente por un corte de arginina-serina en el dominio extracelular. Los extremos N-terminales recién creados activan entonces a estos receptores como ligandos unidos. Ambos receptores pueden ser activados por la tripsina, pero sólo los TRs son activados por la trombina. Sólo el PAR-2 es activado por la triptasa de células cebadas. Ambos receptores pueden ser activados también por los péptidos que corresponden a sus nuevos extremos N-terminales, independientes del corte del receptor. SLIGRL, el péptido activador de PAR-2 de ratón, es equipotente en la activación del receptor de humano. Aunque la función del TR está bien documentada, la biología del PAR-2 aún no ha sido totalmente identificada. Recientemente se ha descrito una función para la activación de PAR-2 en la inhibición del crecimiento y diferenciación de queratinocitos (Derian y otros, "Differential Regulation of Human Ceratinocyte Growt and Differentiation by a Novel Family of Protease- actívate Receptors", Cell Growt & Differentiation, Vol. 8, pp. 743-749, Julio de 1997).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con esta invención, se ha encontrado un método para afectar cambios en la pigmentación de la piel de mamíferos, que comprende aplicar tópicamente a la piel de un mamífero un compuesto que afecte la vía de PAR-2. Las composiciones de esta invención pueden contener uno o más compuestos que actúan como tripsina, como triptasa, como serina proteasa o como agonistas de PAR-2 para aumentar la pigmentación. Alternativamente, pueden contener uno o más compuestos que actúen como inhibidores de serina proteasa, inhibidores de tripsina, inhibidores de trombina, inhibidores de triptasa, como inhibidores de la vía de PAR-2, o como un antagonista de PAR-2 para disminuir la pigmentación, o causar "despigmentación". Como se usa en la presente "mamífero" significa cualquier miembro "de los animales vertebrados superiores que comprenden la clase "Mammalia", como se define en el diccionario médico de Webster 407 (1986) e incluye, pero no está limitado a, humanos. Como se usa en la presente "receptor" debe incluir receptores tanto intracelulares como extracelulares, y debe significar aquellas moléculas capaces de recibir y transducir una señal. El término PAR-2 se refiere al receptor 2 activado por proteasa o un receptor relacionado activado por la misma. El receptor 2 activado por proteasa (más adelante en la presente "PAR-2"), es un receptor activado por serina proteasa que se expresa en numerosos tejidos, incluyendo queratinocitos y fibroblastos. El receptor de trombina (denominado también PAR-1 , más adelante en la presente, "TR"), es un receptor activado por serina proteasa que se expresa en numerosos tejidos, incluyendo queratinocitos. Las funciones biológicas de PAR-2 y TR en la piel no se conocen del todo bien. Sin embargo, se ha encontrado que las interacciones entre queratinocitos y melanocitos, mediante la vía de PAR-2, afecta la melanogénesis. Se ha encontrado que los inhibidores de trombina y/o los inhibidores de triptasa y/o los inhibidores de tripsina y los antagonistas de PAR-2, se pueden usar como agentes de despigmentación sin irritar la piel. Los agonistas de PAR-2 y las serina proteasas tales como tripsina y triptasa se pueden usar como agentes obscurecedores. Además, el PAR-2 puede ser útil como un objetivo para agentes de blanqueo y obscurecedores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A es una gráfica que muestra ei aumento o disminución de la pigmentación relativa de melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos tratados con agentes de pigmentación y de despigmentación conocidos, de conformidad con los métodos de esta invención. La figura 1 B es una gráfica que muestra el aumento o disminución de la pigmentación relativa en melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos, tratados de conformidad con los métodos y composiciones de esta invención. La figura 2 es un grupo de imágenes de melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos tratados con agonistas de PAR-2 y el compuesto I. La figura 3 es una gráfica que muestra el aumento o disminución de la pigmentación relativa en melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos, y tratados de conformidad con los métodos y composiciones de esta invención. La figura 4A es una gráfica que muestra la dosis/respuesta con respecto a la pigmentación de melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos, cuando son tratados con composiciones de esta invención. La figura 4B es una gráfica que muestra la respuesta de melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos, después de ser expuestos a luz ultravioleta, seguido por tratamiento con las composiciones de esta invención. La figura 5A es una fotografía que muestra geles que muestran la expresión de TR y PAR-2 en la piel, células de melanona y melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos. La figura 5B es una fotografía que muestra geles que muestran la expresión de TR y PAR-2 por melanocitos humanos primarios. Las figuras 6A y 6B son fotografías que muestran geles que muestran la expresión de varios genes después del tratamiento con diferentes concentraciones del compuesto I y SLIGRL. La figura 7 es una gráfica que muestra los efectos de diferentes composiciones de esta invención sobre la brillantez de la pigmentación del pezón de conejillos de Indias. La figura 8 es una fotografía de la piel de cerdos de Yucatán que ha sido tratada con composiciones de esta invención para lograr la despigmentación de la misma. La figura 9 es una gráfica que muestra la brillantez de la piel de cerdos de Yucatán durante el curso del tratamiento de conformidad con los métodos y las composiciones de esta invención.

Las figuras 10A, 10B, 10C y 10D son fotografías de secciones histológicas de piel de cerdos de Yucatán teñidas con F&M y tratadas con las composiciones que contienen el compuesto I de conformidad con los métodos de esta invención a concentraciones de 0, 10 µM, 50 µM y 250 µM, respectivamente. Las figuras 11 A, 11B y 11C son fotografías de vistas micrográficas electrónicas de melanocitos que contienen equivalentes epidérmicos, tratados con composiciones de esta invención. Las figuras 11 E, 11F y 11H son fotografías de vistas micrográficas electrónicas de la piel de cerdos de Yucatán, tratada con las composiciones de esta invención. Las figuras 11D y 11G son fotografías de vistas micrográficas electrónicas de sitios no tratados de la piel de cerdos de Yucatán. Las figuras 12A, 12B, 12C, 12D y 12E son fotografías de secciones histológicas de piel de cerdos de Yucatán teñidas con F&M, como sigue: 12A muestra piel sin tratar; 12B muestra piel tratada con las composiciones de esta invención después de 8 semanas de tratamiento; 12C muestra piel una semana después de interrumpir el tratamiento; 12D muestra piel dos semanas después de interrumpir el tratamiento, y 12E muestra piel cuatro semanas después de interrumpir el tratamiento. La figura 13 es una fotografía de secciones histológicas teñidas con F&M tomadas de piel de cerdos de Yucatán y tratadas con las composiciones de esta invención.

La figura 14 contiene fotografías digitales de luz visible y ultravioleta de piel humana antes del tratamiento y subsecuente al tratamiento con las composiciones de esta invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se ha descubierto que la tripsina, triptasa y agonistas de PAR-2 se pueden usar para aumentar la pigmentación, y que los inhibidores de tripsina y/o inhibidores de triptasa y/o inhibidores de trombina y antagonistas de PAR-2 actúan para disminuir la pigmentación de la piel de mamíferos. En opinión de los autores, algunos de los compuestos descritos en la patente de E.U.A. número 5,523,308, la cual se incorpora en la presente como referencia, y que se comportan como inhibidores de trombina y/o tripsina y/o triptasa, serán útiles en los métodos de esta invención. Algunos de estos compuestos se describen también en Costanzo y otros, "Potent Trombin Inhibitors Tat Probé te S1' Subsite: Tripeptide Transition State Analogues Based on a Heterocycle-Activated Carbonil Group", J. Med. Chem.. 1996 Vol. 39, pp. 3039-3043, y tienen la siguiente fórmula estructural: en donde: A se selecciona del grupo que consiste de alquilo de C?-8, carboxialquilo de C 4, alcoxilcarbonilo de C?-4-alquilo de C?-4, fenilalquilo de O 4, fenilalquilo de C?-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), formilo, alcoxicarbonilo de C1-4, alquilcarbonilo de C1-2, fenilalcoxicarbonilo de C1-4, cicloalquilcarbonilo de C3-7, fenilcarbonilo, fenilcarbonilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C?-4) perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C?-4), alquilsulfonilo de C1-4, alcoxisulfonilo de C-?-4, perfluoroalquilsulfonilo de C1-4» fenilsulfonilo, fenilsufonilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C-?-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C?-4, dialquilamino de C-?- , carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de C1-4, fenilalquilsulfonilo de C1-4 substituido, alquilsulfinilo de C-1-4, perfluoroquilsulfinilo de C-T4, fenilsulfiniio, fenilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), fenilalquilsulfinilo de Cr 4, fenilalquilsulfinilo de C-1-4 substituido, 1-naftilsulfonilo, 2- naftilsulfonilo o naftilsulfonilo substituido (donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-naftilsulfinilo, 2-naftilsulfinilo o naftilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C-?-4); un aminoácido D o L que está unido en su extremo carboxi terminal al nitrógeno mostrado en la figura I, y se selecciona del grupo que consiste de alanina, asparagina, ácido 2-azetidincarboxílico, glicina, N-alquilglicina de C?-8, prolina, ácido 1-amino-1-c¡cloalquilcarboxíl¡co de C -8, ácido tiazolidin-4-caboxílico, ácido 5,5-dimetiltiazolidin-4-carboxílico, ácido oxazolidin-4-carboxílico, ácido pipecolínico, valina, metionina, cisteína, serina, treonina, norleucina, leucina, ter-leucina, ¡soleucina, fenilalanina, 1-naftalanina, 2-naftalanina, 2-tienilalanina, 3-tienilalanina, ácido [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-1 -carboxílico y ácido [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-2-carboxíl¡xo, en donde el grupo amino terminal de dicho aminoácido está unido a un miembro seleccionado del grupo que consiste de alquilo de C1-4, tetrazol-5-il-alquilo de C-r 2, carboxialquilo de C1-4, alcoxicarbonilalquilo de C1-4, fenilalquilo de C-?-4, fenilalquilo de C1-4 susbtituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de Ci-4, 3-fenii-2-hidroxipropionilo, 2,2-difenil-1-hidroxietilcarbonilo, [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-1 -carbonilo, [1 , 2, 3, 4] -tetrahidroisoquinolin-3-carbonilo, 1-metilamino-1 -ciclohexanocarbonilo, 1 -hidroxi-1 -ciclohexanocarbonilo, 1 -hidrox¡-1 -feniiacetilo, 1-ciclohexil-1-hidroxiacet¡lo, 3-fenil-2-hidroxipropionilo, 3,3-difenil-2-hidroxipropionilo, 3-ciclohexil-2-hidroxipropionilo, formilo, alcoxicarbonilo de C1-4, alquilcarbonilo de C1-12, perfluoroalquilo de C1-4, alquilcarbonilo de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C1-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilcarbonilo de C1-4, 1 ,1-difenilalquilcarbonilo de C1-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), perfluoroalquilsulfonilo de C1-4, alquilsulfonilo de C1-4, alcoxisulfonilo de C1-4, fenilsulfonilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4. carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de C1-4, fenilalquilsulfonilo de C1-4 substituido, perfluoroalquilsulfinilo de C1-4, alquilsulfinilo de C1-4, fenilsulfinilo, fenilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-?-4, dialquilamino de C-?-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-naftilsulfonilo, 2-naftilsulfonilo, naftilsulfonilo substituido (donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de ^-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C 4), 1-naftilsulfinilo, 2-naftilsulfinilo, y naftilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de naftílo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4); o un polipéptido formado por dos aminoácidos, en donde el primer aminoácido es un aminoácido D o L, unido mediante su extremo carboxi terminal, al nitrógeno mostrado en la fórmula I, y se selecciona del grupo que consiste de glicina, N-alquilglicina de C1-8, alanina, ácido 2-azetidincarboxílico, prolina, ácido tiazolidin-4-carboxílico, ácido 5,5-dimetiltiazolidin-4-carboxílico, ácido oxazolidin-4-carboxílico, ácido 1-amino-1-cicloalquilcarboxíl¡co de C3-8, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, 3-(alcoxi de C ) prolina, 4-(alcoxi de C1-4) prolina, 3,4-dehidroxiprolina, ácido 2,2-dimetil-4-tiazolidin carboxílico, ácido 2,2-dimetil-4-oxazolidin carboxílico, ácido pipecolínico, valina, metionina, cisteína, asparagina, serina, treonina, leucina, ter-leucina, isoleucina, fenilalanina, 1-naftalanina, 2-naftalanina, 2-tienilalanina, 3-tienilalanina, ácido [1 ,2,3,4]-tetrahidroisoquinolin-2-carboxílico, éster 4-alquílico de C1-4 de ácido aspártico y éster 5-alquílico de C-?-4 de ácido glutámico, y el segundo aminoácido D o L está unido al grupo amino terminal de dicho primer aminoácido, y se selecciona del grupo que consiste de fenilalanina, 4-benzoilfenilalanína, 4-carboxifenilalanina, 4-(carboxialquilo de C1-2)fenilalanina, fenilalanina substituida (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 3-benzotienilalanina, 4-bifenilalanina, homofenilalalnina, ácido octahidroindol-2-carboxíiíco, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-tiazolialanina, 2-tienilalanina, 3-(3-benzotienil)alanina, 3-tienilalanina, triptófano, tirosina, asparagina, 3-trialquilsililalanina de C?-4, ciclohexilglicina, difenilglicina, fenilglicina, sulfóxido de metionina, metionina sulfona, 2,2-diciclohexilalanina, 2-(1-naftilalanina), 2-(2-naftilalanina), fenilalanina substituida con fenilo (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), ácido aspártico, 4-alquilo de C- de ácido aspártico, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C- , hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1- , dialquilamino de C-M, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4, ácido aspártico, éster 4-alquílico de C1-4 de ácido aspártico, ácido glutámico, éster 5-alquílico de C1-4 de ácido glutámico, cicloalquilalanina de C3-8, cicloalquilalanina de C3-8 substituida (donde los substituyentes de anillo son carboxi, éster alquílico de C- , cicloalquilalanina de C3.8, cicloalquilalanina de C3.8 substituida (donde los substituyentes de anillo son carboxi, alquilcarboxi de C1-4, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo de C- , 2,2-difenilalanina y alquilo de C-?-5 todo alfa de todos los derivados de aminoácidos del mismo, en donde el grupo amino terminal de dicho segundo aminoácido es no substituido o monosubstituido con un miembro del grupo que consiste de formilo, alquilo de C-M2, tetrazol-5-ilalquilo de C-?.2, carboxialquilo de C-?-8, carboalcoxialquilo de C1-4, fenilaquilo de C-1.4, fenilalquilo de C-?-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de C- , alcoxicarbonilo de C-uß, fenilalcoxicarbonilo de C-I-T, alquilcarbonilo de C?-2, perfluoroalquilo de de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C?-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C-1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de C- , perfluoroalquilo de C?-4, alcoxicarbonilo de C-1-4, 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de d-4, fenilalquilsulfonilo de C-?-4 substituido, alquilsulfinilo de C1-4, perfluoroalquilsulfinilo de C1-4, fenilsulfinilo, fenilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), fenilalquilsulfinilo de C-i. , fenilalquilsulfinilo de C- substituido, 1-naftilsuIfonilo, 2-naftilsulfonilo, naftilsulfonilo substituido (donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-haftilsulfinilo, 2-haftilsulfinilo y naftilsulfinilo substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C-?-4, alcoxi de C?- , hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C?- , dialquílamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C^); R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste de aminoalquilo de C2.8, guanidinoalquilo de C2-5, alquilguanidino de C- -alquilo de C2-5, dialquilguanidino de C?-4-alquilo de C2-5, amidinoalquilo de C2-5, alquilamidino de C1-4-alquilo de C2-5, dialquilamidino de C?-4-alquilo de C2-5, alcoxi de C-?.3-alquilo de C2-5, fenilo, fenilo substituido (donde los substituyentes se seleccionan independientemente de uno o más de amino, amidino, guanidino, alquilamino de C- , dialquilamino de C1-4, halógeno, perfluoralquilo de C1-4, alquilo de C1-4, alcoxi de C-1.3 o nitro), bencilo, bencilo substituido con fenilo (donde los substituyentes se seleccionan independientemente de uno o más de amino, amidino, guanidino, alquilamino de C?-4, dialquilamino de C-1-4, halógeno, perfluoroalquilo de C1-4, alquilo de C-1-4, alcoxi de C-?-3 o nitro), hidroxialquilo de C2.5, alquilamino de C-?_5-alqu¡lo de C2-5, dialquilamino de C?-5-alquilo de C2-5, 4-aminociclohexilalquilo de C0-2 y alquilo de C1-5; p es 0 o 1 ; B es en donde n es de 0 a 3, R3 es H o alquilo de C-?-5, y la porción carbonilo de B está unida a E; E es un heterociclo seleccionado del grupo que consiste de oxazolin-2-ilo, oxazol-2-ilo, tiazol-2-ilo, tiazol-5-ilo, tiazol-4-ilo, tiazolin-2-ilo, imidazol-2-ilo, 4-oxo-2-quinoxalin-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, benzo[b]tiofen-2-ilo, tiazol-4-ilo, tiazol-6-ilo, pirazol-2-ilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazol-2ilo, nafto[2,1-d]tiazol-2-ilo, nafto[1-2-d]tiazol-2-ilo, quinoxalin-2-ilo, isoquinolin-1-ilo, isoquinolin-3-ilo, benzo[b]furan-2-ilo, pirazin-2-ilo, quinazolin-2-ilo, isotiazol-5-ilo, isotiazol-3-ilo, purin-8-ilo y un heterociclo substituido, en donde los substituyent.es se seleccionan de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C- , alcoxi de C- , hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-?-4, dialquilamino de C1-4, carboxi, alcoxicarbonilo de C1-4, hidroxi o fenilalquiloaminocarbonilo de C- ; O sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Más particularmente, en opinión de los autores, algunos de los compuestos de la fórmula anterior que contienen un motivo de d-fenilalanina-prolina-arginina deben ser efectivos para inhibir la vía de PAR-2 y causar despigmentación. Un compuesto particularmente preferido que actúa como inhibidor de trombina y tripsina y es activo en la despigmentación de la piel de mamífero es (S)-N-metil-D-fenilalanil-N-[4-[(aminoim¡nometil)am¡no]-1 -(2-benzotiazolilcarbon¡l)butil]-L-prolinam¡da (nombre de Chemical Abstraéis) (referido más adelante como "Compuesto I"). Se sugiere que otros compuestos que son análogos o que funcionan del mismo modo que el compuesto I y se describen en la patente de E.U.A. No. 5,523,308, pueden ser activos en los métodos y composiciones de esta invención. Otros compuestos que inhiben a la tripsina, tales como inhibidores de serina proteasa, y en particular, inhibidor de tripsina de soya (STI), serán también útiles en los métodos de esta invención. Extractos de soya, haba y frijol negro, y otros productos naturales hechos de estas plantas de frijol tales como, pero no limitados a, leche de frijol, pasta de frijol, miso y similares, sirven también para reducir la pigmentación mediante este mecanismo. Otras fuentes de inhibidores de serina proteasa se pueden extraer de las especies que pertenecen a las siguientes familias de plantas: Solanaceae (por ejemplo, papa, tomate, tomatillo, y similares); Gramineae (por ejemplo, arroz, trigo sarraceno, sorgo, trigo, cebada, avena, y similares); Cucurbitaceae (por ejemplo, pepinos, calabaza, calabacín, estropajo y similares); y, preferiblemente, Leguminosae (por ejemplo, frijoles, chícharos, lentejas, cacahuates, y similares). Aunque no se desee que sea limitado por la teoría siguiente, se especula que los compuestos capaces de afectar la pigmentación de la piel lo hacen interactuando directa o indirectamente con el PAR-2 de queratinocitos o con su proteasa activante, y afectan así la melanogénesis, directa o indirectamente. Posiblemente, los compuestos de esta invención inducen, en el caso de pigmentación incrementada, o reducen, en el caso de pigmentación reducida, la señal para transportar melanosomas por melanocitos, o para recibir melanosomas por queratinocitos en la piel. Los compuestos que son activos en las composiciones y métodos de esta invención puede ser liberados tópicamente por cualquier medio conocido por el experto en la materia. Si los parámetros de liberación del agente farmacéutico o cosmético tópicamente activo así lo requieren, la composición tópicamente activa de esta invención puede estar compuesta adicionalmente de preferencia de un vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable capaz de funcionar como un sistema de liberación para permitir la penetración del agente tópicamente activo en la piel. Un vehículo aceptable para la liberación tópica de algunas de las composiciones de esta invención, particularmente proteínas tales como tripsina y STI, pueden contener liposomas. Los liposomas son muy preferiblemente no iónicos y contienen a) dilaurato de glicerol (preferiblemente en una cantidad de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 70% en peso; b) compuestos que tienen el esqueleto esteroide encontrado en el colesterol (preferiblemente en una cantidad de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 45% en peso); y c) uno o más éteres de ácido graso que tienen de aproximadamente 12 a aproximadamente 18 átomos de carbono (preferiblemente en una cantidad de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 70% en peso colectivamente), en donde los compuestos constituyentes de los liposomas están preferiblemente en una relación de aproximadamente 37.5:12.5:33.3:16.7. Los más preferidos son los liposomas comprendidos de dilaurato de glicerol/colesterol/eter 10-estearílico de polioxitileno/eter 9-laurílico de polioxietileno (liposomas GDL). Preferiblemente, los liposomas están presentes en una cantidad, en base al volumen total de la composición, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, y de preferencia de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. Se prefiere una relación de 37.5:12.5:33.3:16.7. Los liposomas adecuados pueden prepararse preferiblemente de acuerdo con el protocolo indicado en el ejemplo 1 , aunque también son aceptables otros métodos usados comúnmente en la técnica. La composición descrita anteriormente se puede preparar combinando los componentes deseados en un contenedor adecuado y mezclándolos bajo condiciones ambientales en cualquier medio convencional de mezclado de alto esfuerzo cortante bien conocido en la técnica para preparaciones de liposomas no iónicos, tales como los que se describen en Niemiec y otros, "Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivey of Petide Drugs Into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hámster Ear Model," 12 Pharm. Res. 1184-88 (1995) ("Niemiec"), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los autores de la presente han encontrado que la presencia de estos liposomas en las composiciones de esta invención puede incrementar las capacidades de despigmentación de algunas de las composiciones de esta invención.

Otras formulaciones preferibles pueden contener, por ejemplo, leche de soya u otras formulaciones líquidas derivadas directamente de leguminosas u otro vegetal adecuado. Por ejemplo, dicha formulación puede contener una gran proporción de leche de soya, un emulsificador que mantenga la estabilidad física de la leche de soya, y opcionalmente un agente quelatador, conservadores, emolientes, humectantes y/o espesantes o agentes de gelificación. También se pueden utilizar emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, formulaciones a base de solvente y geles acuosos conocidos para el experto en la materia, como vehículos para la liberación de las composiciones de esta invención. La fuente de compuesto activo a formular dependerá generalmente de la forma particular del compuesto. Las moléculas orgánicas pequeñas y los fragmentos peptídicos pueden ser sintetizados químicamente y proveerse en una forma pura adecuada para uso farmacéutico/cosmético. Los productos de extractos naturales se pueden purificar de acuerdo con las técnicas conocidas. También están disponibles para el experto en la materia fuentes recombinantes de los compuestos. En modalidades alternativas, la composición farmacéutica o cosmética tópicamente activa puede ser combinada opcionalmente con otros ingredientes tales como humectantes, adyuvantes cosméticos, antioxidantes, agentes blanqueadores, inhibidores de tirosinasa y otros agentes conocidos de pigmentación, agentes tensioactivos, agentes espumantes, acondicionadores, humectantes, fragancias, incrementadores de viscosidad, agentes amortiguadores, conservadores, filtros solares y similares. Las composiciones de esta invención también pueden contener cantidades activas de retinoides (esto es, compuestos que se unen a cualquier miembro de la familia de los receptores retinoides), e incluyen por ejemplo, tretinoina, retinol, esteres de tretinoina o retinol, y similares. La composición farmacéutica o cosmética tópicamente activa debe aplicarse en una cantidad efectiva para efectuar cambios en la pigmentación de la piel de mamífero. Según se usa en la presente, "cantidad efectiva" significa una cantidad suficiente para cubrir la región de la superficie de la piel en la cual se desea un cambio de pigmentación. Preferiblemente, la composición se aplica en forma libre a la superficie de la piel, de tal manera que en base a 1 cm2 de superficie de la piel, esté presente de aproximadamente 2 µl/cm2 a aproximadamente 200 µl/cm2 de agente tópicamente activo cuando se desee un cambio de pigmentación. Cuando se utiliza un inhibidor de trombina y tripsina, tal como el compuesto I o sus análogos, una formulación sintética o de origen natural tal como un compuesto activo debe estar presente en la cantidad de alrededor de 0.0001% a aproximadamente 15% en peso/volumen de la composición. De preferencia, debe estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.0005% a aproximadamente 5% de la composición; más preferiblemente, debe estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1% de la composición. Desde luego, estas escalas son sugeridas para los componentes anteriores. Se pretende que el grupo más bajo de escalas sea eficaz para agonistas/antagonistas de la vía de PAR-2, y/o inhibidores que tengan altos índices terapéuticos y que no requieran concentraciones o dosis significativamente más grandes para ser efectivas en los métodos de esta invención. Estos compuestos pueden ser de origen natural o sintético. Los derivados líquidos y extractos naturales obtenidos directamente de fuentes vegetales o botánicas se pueden emplear en las composiciones de esta invención en una concentración (p/v) de aproximadamente 1 a aproximadamente 99%. Las fracciones de extractos naturales e inhibidores de proteasa de origen natural tales como STI, pueden tener una escala preferida diferente, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 20%, y de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% de la composición. Desde luego, se pueden preparar mezclas de los agentes activos de esta invención y usarse juntas en la misma formulación, o en aplicaciones en serie de diferentes formulaciones. Los autores de la presente han encontrado inesperadamente que cuando agentes tópicamente activos tales como agonistas y/o inhibidores de PAR-2 y tripsina y/o trombina y/o triptasa y/o sus ihibidores, se aplican tópicamente a la piel de un animal, se logra un cambio significativo en la pigmentación. Preferiblemente, los agentes despigmentadores (así como otros agentes de esta invención que afectan la pigmentación) se aplican a la piel de un mamífero a una concentración y dosis relativamente altas (de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 1% para compuestos que tienen altos índices terapéuticos, tales como el compuesto I y compuestos relacionados; de aproximadamente 20% a aproximadamente 99% para derivados líquidos y extractos de materiales botánicos; y de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% para facciones de extractos naturales e inhibidores de proteasa de origen natural, tales como STI o mezclas de los mismos) entre una y dos veces al día durante un período hasta que la piel presente un cambio de pigmentación. Esto puede ser aproximadamente de 4 a aproximadamente 10 semanas o más. Después, una vez logrado el cambio de pigmentación, se puede aplicar en un horario de tiempo menos frecuente, por ejemplo aproximadamente una vez por día a aproximadamente dos veces por semana, una concentración y dosis más bajas (de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 0.005% para compuestos que tienen altos índices terapéuticos, tales como el compuesto I y compuestos relacionados; de aproximadamente 10% a aproximadamente 90% para derivados líquidos y extractos de materiales botánicos; y de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% para fracciones de extractos naturales e inibidores de proteasa de origen natural, tales como STI o mezclas de los mismos) de ingrediente activo. Los efectos de los agentes activos de esta invención son reversibles; por lo tanto, para mantener estos efectos, debe realizarse aplicación o administración continua. La invención descrita ilustrativamente en la presente puede practicase de manera conveniente en ausencia de cualquier componente, ingrediente, o paso que no se describa específicamente en la presente.

A continuación se dan varios ejemplos para ilustrar mejor la naturaleza de la invención y la manera de llevarla a cabo, si bien no sirven para limitar el alcance de los métodos y composiciones de la misma.

EJEMPLO 1 Los inhibidores de proteasa afectan la pigmentación Para estudiar las posibles funciones de la vía de PAR-2 en la pigmentación, se utilizó . un sistema equivalente epidérmico in vitro. El sistema equivalente epidérmico utilizado contenía melanocitos. Un sistema equivalente epidérmico que es útil para desarrollar este estudio es el sistema MelanoDerm, disponible comercialmente de MatTek Co.. Este sistema contiene melanocitos normales humanos, junto con queratinocitos epidérmicos normales derivados de humano, que han sido cultivados para formar un modelo multiestratificado altamente diferenciado de la epidermis humana. En los siguientes ejemplos, los equivalentes se trataron con los compuestos de prueba durante 3 días, y las muestras se cultivaron el cuarto día después de comenzar el tratamiento. Los equivalentes cosechados se tiñeron con DOPA (un substrato para tirosinasa) y H&E (una tinción histológica estándar) o como tinción de Fontana-Masón (F&M), otra tinción conocida por el experto en la materia. La tinción de F&M es una técnica de tinción con plata que marca de manera notable y limpia las melaninas que tienen alta actividad reductora de nitrato de plata. Se utilizaron equivalentes epidérmicos humanos de capas múltiples que contienen melanocitos como un sistema de modelo in vitro para estudiar el efecto de los inhibidores de proteasa sobre la melanogénesis. Los equivalente epidérmicos utilizados estuvieron disponibles comercialmente como MelanoDerm de MatTek de Ashland, MA.. Se sabe que estos equivalentes responden a la irradiacción de luz ultravioleta ("UVB"), y se sabe que agentes de blanqueo tales como benzaldehído e hidroquinona aumentan y reducen la pigmentación, respectivamente. Los equivalentes epidérmicos de MelanoDerm se expusieron al benzaldehído (disponible de Sigma de St. Louis, Mo), hidroquinona (disponible de Sigma) e irradiación UVB. La irradiación UV sé efectuó con una fuente de luz UVB FS en una cámara de exposición, con las cubiertas de placa retiradas y solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS, de Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) presente en la cámara inferior. La intensidad de la luz UVB se midió con un radiómetro UVX (UVP Inc., San Gabriel, CA). Los equivalentes se trataron con 0.1-0.12 J/cm2. No se observó pérdida de viabilidad en los equivalentes tratados con hasta 0.3 J/cm2. En el cuarto día de exposición a los compuestos de prueba/irradiación ultravioleta, los equivalentes fueron fijados, seccionados y teñidos, o teñidos como un todo sin seccionamiento. Los equivalentes de MelanoDerm fueron fijados en formalina y puestos en bloques de parafina, y se tiñeron secciones de los equivalentes de MelanoDerm de conformidad con los siguientes procedimientos estándar: (1) H&E, (2) DOPA + H&E y (3) Fontana-Masón ("F&M") usando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. Alternativamente, se tiñeron equivalentes completos de MelanoDerm, y sus imágenes se capturaron para análisis de imágenes. Se procesaron tres secciones por equivalente, tres equivalentes por experimento. Cada experimento se repitió tres veces. DOPA es un substrato para tirosinasa. F&M identifica moléculas reductoras de nitrato de plata, lo cual identifica principalmente melaninas. Las secciones teñidas con F&M se usaron para análisis de imágenes usando sistemas de análisis de imágenes Optomax, de Optomax Inc., Hollis, NH. Alternativamente, se usó la base de datos de imágenes 1.1 de Empire en una computadora P5-100 Gateway 2000 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) para la captura de imágenes. Se usó la versión 4.0 de Image Pro Plus para análisis de imágenes. Los parámetros medidos fueron los siguientes: (1) nivel de pigmentación dentro de melanocitos individuales, y (2) número de melanocitos pigmentados por campo, para el sistema Optomax, o (1 ) el área de superficie de depósitos de plata dentro de melanocitos, y (2) el número de melanocitos pigmentados para el sistema Image Pro. Usando el sistema Optomax, se midió el área de superficie de depósitos de plata dentro de melanocitos individuales en 60 melanocitos, usando secciones múltiples de equivalentes por triplicado por tratamiento. Se calculó el número de melanocitos por campo en estas secciones. El "factor de pigmentación" se definió como el área de superficie promedio de depósitos de plata dentro de un melanocito individual, multiplicado por el número de melanocitos pigmentados por campo. Un valor de 1 se asignó a controles sin tratar, y los valores de los grupos de tratamiento se normalizaron respecto a sus controles relevantes. Usando el sistema Image Pro, se midió el área de superficie de depósitos de nitrato de plata y el número de melanocitos por equivalentes completos. Se asignó un valor de 1 a los controles sin tratar, y los valores de los grupos de tratamiento se normalizaron respecto a sus controles relevantes. La figura 1 A es una gráfica que muestra ei aumento o disminución en la pigmentación relativa, medida y calculada mediante el equivalente completo/sistema Image Pro, como se describió anteriormente, mediante exposición a benzaldehído (50µM), hidroquinona (50µM) e irradiación UVB (0.12 J/cm2). Los equivalentes de epidermis humana se expusieron también a mezclas inhibidores de proteasa, los cuales se describen en el cuadro A siguiente. Los inhibidores de proteasa están disponibles de Boehringer Mannheim de Indianapolis, IN. Se usaron tabletas de un coctel de inhibidor de proteasa completa disponible de Boehringer Mannheim, conteniendo inhibidores de quimotripsina, termolisina, papaína, pronasa, extracto pancreático y tripsina. El inhibidor de tripsina de soya ("STI") se obtuvo de Sigma, y se disolvió en 50 mg/ml de vehículo de liposomas o en 1xPBS. Todos los demás inibidores de proteasa usados en este ejemplo in vitro se disolvieron en 1xPBS. Los liposomas de GDL se prepararon como se describe en Niemic y otros, citado anteriormente, con excepción de las siguientes variantes: la formulación liposómica no iónica contenía dilaurato de glicerol (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk)/ colesterol (Croda)/éter 10-estearílico de polioxietileno (Brij76, ICI)/éter 9-laurílico de polioxietileno, a una relación de 37.5:12.5:33.3:16.7. Se usó regulador de pH Hepes, 0.05M, pH 7.4 (Gibco-BRL de Gaithersburg, MD) como la fase acuosa en la preparación de los liposomas. Estas mezclas de inhibidores de proteasa y diferentes combinaciones de inhibidores de serina proteasa, se pusieron a prueba en cuanto a su capacidad para afectar la meianogénesis. Como se describe en la figura 1B, algunos de los inhibidores de serina proteasa, en particular STI (inhibidor de tripsina de soya), fueron muy eficaces para inhibir la melanogénesis.

CUADRO A EJEMPLO 2 Un receptor activado por proteasa interviene en la pigmentación El ejemplo 1 demuestra que STI reduce la pigmentación. STI inhibe a la tripsina. Debido a que se sabe que la tripsina activa a TR y PAR-2, se puso prueba la participación posible de TR y PAR-2 en la pigmentación. Se trataron equivalentes epidérmicos de MelanoDerm de humano con los agonistas y antagonistas de TR y PAR-2 descritos en el cuadro B siguiente, diariamente durante tres días. En el cuarto día, las muestras fueron cosechadas, fijadas y se realizó tinción con DOPA, H&E o F&M. El examen histológico y de equivalentes completos reveló cambios en la pigmentación después de los tratamientos. La figura 2 muestra los resultados de este ejemplo. Como se muestra en la presente, el agonista peptídico de PAR-2, SLIGRL, indujo la pigmentación en melanocitos individuales. El tratamiento con el compuesto I, un inhibidor de trombina y tripsina, dio como resultado una pigmentación reducida. La figura 3 muestra los resultados de los estudios descritos en este ejemplo, que representan el nivel de pigmentación en equivalentes de MelanoDerm tratados con reactivos de TR y PAR-2. SLIGRL, un agonista de PAR-2, aumentó dramáticamente la pigmentación, indicando que PAR-2 podría intervenir en la pigmentación. La hirudina, un inhibidor específico de trombina, y TFLLRNPNDK, un agonista selectivo de TR, no tuvieron efecto alguno sobre la pigmentación. Sin embargo, SFLLRN, un agonista de TR menos específico, mostró una tendencia de aclaramiento o de reducción de la pigmentación. Esto indica que es menos probable que TR intervenga en la pigmentación.

CUADRO B EJEMPLO 3 Relación de respuesta a la dosis entre la señalización de receptores activados por proteasa, y melanogénesis Se trataron equivalentes de MelanoDerm con concentraciones crecientes de SLIGRL, el agonista peptídico de PAR-2, a 0, 10 y 50 µM, de la misma manera como se describe en el ejemplo 2. La tinción con F&M se llevó a cabo al cuarto día. Como se muestra en la figura 4A, las concentraciones crecientes de SLIGRL, el activador de PAR-2, da como resultado una pigmentación incrementada. La tripsina, un activador de PAR-2, tiene el mismo efecto. El tratamiento con concentraciones crecientes del compuesto I, el inhibidor de trombina y tripsina, de 0.1 µM a 1µM, dio como resultado una pigmentación decreciente (véase la figura 4A). El pretratamiento de los equivalentes con irradiación UVB incrementó la melanogénesis respecto a los controles sin tratar. El compuesto I redujo también esta pigmentación inducida por la luz UVB (Fig. 4B). Este ejemplo demuestra una relación de respuesta a la dosis para aumentar y disminuir la pigmentación, con la modulación de la señalización de PAR-2. Este ejemplo demuestra también que el compuesto I puede inhibir la pigmentación y evitar la pigmentación inducida por la luz UV.

EJEMPLO 4 PAR-2 se expresa en queratinocitos, pero no en meianocitos La expresión de PAR-2 y TR se ha demostrado previamente en queratinocitos y fibroblastos. Este ejemplo demuestra que PAR-2 se expresa en queratinocitos, pero no en melanocitos. Además, demuestra queTR se expresa tanto en queratinocitos como en melanocitos. Para demostrar esto, equivalentes epidérmicos de MelanoDerm de humano, cultivos de melanocitos primarios de humano (neonatales y de adulto, de Clonetics de San Diego, CA) y células de melanoma de ratón Cloudman S91 de ATCC de Rockville, MD, fueron desarrollados en cultivo, y se extrajo el número total de moléculas de ARN usando reactivo "RNA Stat-60", disponible de "Tel-Test B" Incorporated como se describe en Chomczymski, "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction," 162 Anal. Biochem. 156-69 (1987). Una cantidad suficiente de ADNasa libre de ARNasa, disponible de Promega Corporation bajo el nombre comercial de "RQ1 Rnase-free DNase", se añadió entonces al ARN extraído de cada muestra, de modo que cada producto respectivo diera 200 ng de ARN tratado con ADNasa usando los procedimientos descritos en ""RNase-free DNase", protocolo publicado por Promega Corporation (Mayo de 1995). Los 220 ng resultantes de ARN tratado con ADNasa fueron transcritos en forma inversa ("RT") mediante el procedimiento descrito en "Superscript II Reverse Transcriptase", un protocolo publicado por Gibco-BRL (ahora Life Technologies, Incorporated) (Abril dé 1992), usando hexámeros aleatorios tales como ios iniciadores aleatorios que están disponibles comercialmente de Life Technologies, Incorporated.

• Los productos de RT resultantes fueron amplificados entonces mediante reacción de cadena de polimerasa ("PCR") usando aproximadamente 0.5 unidades (por 100 µl de reacción) de una ADN polimerasa termoestable que es disponible comercialmente de Perkin-Elmer-Cetus Corporation bajo el nombre comercial de "Taq polymerase", y aproximadamente 0.1 µmoles/reacción de iniciadores específicos de TR y PAR-2, como se describe en el cuadro C y en Marthinuss y otros 1995, incorporado en la presente como referencia, o de iniciadores de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (G3PDH), disponible de Clontech Laboratories, Inc., de Palo Alto, CA de conformidad con los procedimientos descritos en Marthinuss y otros 1995, o en el protocolo que acompaña a los iniciadores de Clontech Laboratories. Los productos de PCR se analizaron entonces usando geles de bromuro de etidio/agarosa a 2% de conformidad con métodos bien conocidos en la • técnica, para comparar el nivel de expresión de ciertos genes en queratinocitos y melanocitos. Cuando fue necesario lograr una mejor visualización, los productos de PCR resultantes se precipitaron con etanol de conformidad con procedimientos bien conocidos. Cuando se usaron iniciadores para G3PDH, sólo se usó el 10% de los productos de reacción de PCR. Una muestra de ARN de equivalentes epidérmicos que no fue transcrita en forma inversa se usó como control negativo para cada amplificación de PCR. La falta de contaminantes de ADN genómico fue indicada por la falta de una banda en las bandas relevantes en los geles. Como control positivo, se usó una muestra de ARN de piel humana la cual fue transcrita en forma inversa cuando no se contó con controles positivos comerciales. La migración de los productos de RT-PCR sobre los geles siempre fue idéntica a la de los controles positivos, y a los de los tamaños de amplificador reportados. La calidad relativa de cada producto de reacción de RT-PCR respectivo se comparó entonces analizando el nivel de ARNm de G3PDH, un gen "doméstico", en cada producto respectivo. Como se ilustra en las figuras 5 y 6, se encontró que la expresión del gen para G3PDH es similar en todos los puntos de tiempo examinados, lo cual permitió así la comparación de los niveles relativos de la expresión génica para los genes deseados. La figura 5A muestra que, como era de esperarse, TR y PAR-2 se expresan en la piel total y los equivalentes de MelanoDerm ("DM"). Sin embargo, las células de melanoma S91 ("S91") no expresaron a PAR-2 o TR. Para investigar mejor esto, se pusieron a prueba melanocitos primarios de recién nacido ("mel-NB") y de adulto ("mel-A") para la expresión de TR y PAR-2. Como se muestra en la figura 5B, los melanocitos primarios de humano expresan a TR, pero no a PAR-2. Por lo tanto, se sugiere que los agonistas y antagonistas de PAR-2 pueden interactuar con los queratinocitos, pero no con los melanocitos, en los equivalentes de MelanoDerm, y que los agonistas y antagonistas de TR pueden interactuar tanto con queratinocitos como con melanocitos. Se sugiere, por lo tanto, una interacción entre queratinocitos y melanocitos, durante la cual la señal de PAR-2 en queratinocitos es convertida en un punto final de la pigmentación. El cuadro C ilustra algunos de los iniciadores de ADN usados, la cantidad de MgCI2 que se requiere para la reacción de PCR, y la duración del ciclo de PCR.

CUADRO C Iniciadores de ADN utilizados en la prueba de RT-PCR EJEMPLO 5 ¡ —Se i-p —m . —ii "e —re f?mntapfn p ~.iierat.nnnitO-melanO t •n— n . ara e —l eferito despigmentador del compuesto I Los resultados del ejemplo 4 sugieren que los melanocitos solos podrían no responder al efecto despigmentador de los antagonistas del PAR-2. En realidad, el nivel de pigmentación de los melanocitos primarios humanos o células S91 inducidas por coleratoxina, que es reducido por hidroquinona y benzaldehído, no fue afectado por el compuesto I. Puesto que el PAR-2 no es expresado en melanocitos, los autores de la presente probaron el posible requerimiento de interacciones queratinocito-melanocito para el efecto despigmentador del compuesto I. Se compararon cultivos primarios de melanocito con cultivos idénticos sembrados en placa bajo equivalentes epidérmicos (EpiDerm, que carecen de melanocitos) para crear un cultivo asociado sin contacto entre queratinocitos y melanocitos. Estos también se compararon con los equivalentes MelanoDerm, en donde los melanocitos están presentes en la capa basal del equivalente. Los cultivos se trataron durante 3 días con el compuesto I, con el agonista SLIGRL de PAR-2, y con el agonista TFLLRNPNDK de TR según se indica en el cuadro D, y se tiñeron con DOPA el cuarto día. En el cuadro D, los queratinocitos están indicados con "K", los melanocitos están indicados con "M" y la falta de contacto queratinocito-melanocito está indicada como "sin contacto K-M". Como se muestra en el cuadro D, no se observó efecto de pigmentación entre melanocitos primarios y en cultivos asociados tratados con estos agentes. En los equivalentes MeianoDerm, se redujo el compuesto I y SLIGRL indujo pigmentación, mientras que TFLLRNPNDK no tuvo efecto. Estos resultados muestran que se requiere el contacto queratinocito-melanocito para el efecto de PAR-2 sobre la pigmentación.

CUADRO D EJEMPLO 6 El compuesto I afecta la expresión del gen de melanocito Se trataron equivalentes de MelanoDerm con concentraciones crecientes del inhibidor de trombina y tripsina, compuesto I, o con concentraciones crecientes del agonista de PAR-2 SLIGRL. Se extrajo ARNs de los no tratados, y equivalentes tratados con el compuesto I se analizaron para determinar la expresión del gen por medio de RT-PCR de la manera indicada anteriormente en el ejemplo 4. Se diseñaron iniciadores específicos de gen como se indica en el cuadro C anterior, y se utilizaron iniciadores de Clontech para G3PDH humano como en el ejemplo 4. Los genes melanogénicos probados para nivel de expresión fueron tirosinasa, TRP-1 y TRP-2. Se observó una reducción dependiente de la dosis en los niveles de ARNm de TRP-1 y un incremento dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de TRP-2 en las muestras tratadas con el compuesto I, como.se muestra en la figura 6A. Sin embargo, no fue afectada la expresión de tirosinasa. Estos cambios se correlacionan con el efecto emblanquecedor dependiente de la dosis de este inhibidor. Ambos patrones de expresión genética dieron como resultado un efecto de aclaramiento. La enzima TRP-2 procesa la dopaquinona en ácido 5,6-dihidroxindolcarboxílico (DHICA), en lugar de 5,6-dihidroxiindol (DHI). Este proceso da como resultado eumelanina café finamente dispersada, a diferencia de la eumelanina negra insoluble, y da como resultado un tono de piel más claro. La TRP-1 estabiliza el complejo melanogénico permitiendo la producción de pigmento. Los niveles reducidos de TRP-1 dan como resultado actividad reducida de tirosinasa y pigmentación reducida. La carencia de esta proteína da como resultado albinismo. Sin embargo, las concentraciones crecientes de SLIGRL, no afectan la expresión del gen melanogénico (figura 6B). TRP-1 y TRP-2 son específicas de melanocito. El compuesto I inhibe tripsina y trombina. La hirudina, un inhibidor específico de trombina, no tiene efectos sobre la pigmentación, como se observó anteriormente en el ejemplo 2. De esta manera, los autores de la presente decidieron probar si la tripsina y la trombina se expresan en la piel. Una sonda diseñada para detectar tripsinas tanto de cerebro como gástricas, como se describe en el cuadro C, detectó la expresión de ambos ARNm's en una muestra de ARNm total de la piel disponible de Invitrogen de Carlsbad, California E.U., así como también en equivalentes de MelanoDerm. Se detectó el mismo patrón de expresión para la trombina. Ni la tripsina ni la trombina fueron expresadas en melanocitos normales (figuras 5A, B). Estos datos sugieren que si la tripsina activa a PAR-2, podría ser producida por los queratinocitos solamente. Como se muestra en la figura 6A, el tratamiento con el compuesto I, dio como resultado el incremento de expresión de tripsina. SLIGRL, que no afecta la expresión genética de melanogénesis (figura 6B) también aumentó la expresión de tripsina en los equivalentes. Los autores de la presente concluyeron que mientras que la tripsina es un posible activador natural de PAR-2 en la piel, y afecta posiblemente la pigmentación, sus niveles de ARNm no se correlacionan con la pigmentación. Esto sugiere que otra serina proteasa aún no identificada, que es inhibida por el compuesto I, STI y similares, es el activador natural de PAR-2 en la epidermis. Los compuestos que inducen o inhiben esta proteasa pudieran servir como agentes de obscurecimiento y aclaramiento respectivamente.

EJEMPLO 7 Los inhibidores de trombina y tripsina y los agonistas de PAR-2 afectan la pigmentación In vivo Se trataron dos conejillos de indias dos veces diariamente, cinco días a la semana durante siete semanas, con el compuesto I en una concentración de 1 y 10 µM en vehículo de etanol : propilenglicol, 70:30 sobre un pezón pigmentado. El otro pezón de cada animal se trató con vehículos solamente y sirvió como un control. La medición en Cromámetro después de siete semanas de tratamiento, reveló un efecto de aclaramiento dependiente de la dosis de +9.6 L* y casi 18 unidades L*, respectivamente. No se observaron signos visibles de irritación en ese momento. Cuatro grupos de tres conejillos de indias cada uno se trataron respectivamente con el compuesto I, SFLLRN, FSLLRN y SLIGRL en una concentración de 10 µM, dos veces diariamente cinco días por semana durante ocho semanas. La medición del cromámetro después de seis semanas, demuestra un efecto de aclaramiento por parte del compuesto I y un efecto de obscurecimiento por parte de SLIGRL, el agonista de PAR-2. Los resultados de este ejemplo se indican en la figura 7.

EJEMPLO 8 Los inhibidores de trombina y tripsina y los agonistas de PAR-2 afectan la pigmentación In Vivo.

Un cerdo enano de Yucatán se trató con el compuesto I, SFLLRN, FSLLRN y SLIGRL, en una concentración de 10 µM. Cada compuesto se aplicó en dos sitios sobre el cerdo dos veces diariamente, cinco días a la semana durante ocho semanas. Después de ocho semanas de tratamiento, se tomaron mediciones de cromámetro. La aplicación del compuesto I dio como resultado un efecto de aclaramiento visible. El agonista de PAR-2, SLIGRL, ocasionó un efecto de obscurecimiento según se midió por el cromámetro. SFLLRN y FSLLRN no tuvieron efectos significativos. Se trataron dos cerdos de Yucatán durante siete semanas y media, o durante diez semanas, dos veces diariamente cinco días a la semana, con concentraciones crecientes del compuesto I. Se utilizaron cuatro concentraciones de compuesto activo, como sigue: 0, 10, 50 y 250 µM. Se colocaron dos sitios por concentración en lados opuestos del dorso del cerdo. Se tomaron mediciones de cromámetro antes de iniciar el tratamiento y después cada dos semanas. Se tomaron fotografías periódicamente y al final del experimento. Se observó un efecto de aclaramiento visible durante la cuarta, quinta y sexta semanas de tratamiento, para los tratamientos de 250, 50 y 10 µM, respectivamente. A la octava semana, el efecto emblanquecedor de las dos dosis más altas fueron similares. Estos resultados se ilustran en la figura 8. Las lecturas del cromámetro (L*, que miden brillantez) durante el transcurso del tratamiento de un cerdo, se muestran en la figura 9. Se observó un efecto de saturación, que es dependiente del tiempo y. la concentración. Este ejemplo demuestra un efecto despigmentador visual por parte del compuesto I, en el sistema del modelo animal que más se asemeja a la piel humana pigmentada. Al final de estos experimentos, se tomaron biopsias para análisis histológicos y de microscopía electrónica (EM). Se tiñeron muestras histológicas con H&E y F&M. La tinción con H&E mostró que no había irritación, respuesta inflamatoria ni cambios en la arquitectura de la piel, demostrando la seguridad del uso del compuesto I durante largos períodos. La tinción con F&M demostró que hay una pigmentación reducida en las muestras tratadas, tanto en la capa basal como en toda la epidermis. Estos resultados se ilustran en la figura 10. La muestra no tratada y tratada con vehículo (figura 10A) fueron idénticas y más obscuras. El tratamiento con 10 µM (figura 10B) mostró pigmentación reducida y los tratamientos de 50 y 250 µM (figura 10C, 10D, respectivamente) fueron las más claras. Los resultados de este ejemplo sugieren que el efecto emblanquecedor máximo del compuesto I podría ser alcanzado con una concentración más alta durante un período más corto o con una concentración más baja durante un período más largo. De esta manera, por lo menos dos regímenes diferentes se pueden utilizar para lograr los resultados deseados de enblanquecimiento de la piel.

EJEMPLO 9 Los estudios ultraestructurales demuestran el efecto del compuesto I sobre la piel in vitro e in vivo Se desarrolló un análisis ultraestructural sobre equivalentes de MelanoDerm y sitios de la piel de cerdo tratados con el compuesto I. Los equivalentes de MelanoDerm tratados con el compuesto I se analizaron para determinar la formación y distribución de melanosoma utilizando microscopía electrónica. Las muestras tratadas contenían más melanosomas, pero menos melanosomas maduros, esto es, melanosomas que presentan producción reducida de melanina dentro de los melanocitos, en relación con los controles no tratados (figuras 11 A, 11 B). Los melanosomas que contienen dendritas se identificaron fácilmente dentro de los queratinocitos tratados (figura 11C), pero fue difícil encontrarlos dentro de los queratinocitos de control. Esto sugiere formación anormal de melanosoma y transferencia retardada o deteriorada de melanosoma hacia los queratinocitos en las muestras tratadas. También se analizaron por microscopía electrónica muestras de piel de cerdos de Yucatán tratados con el compuesto I durante 8 semanas como se describió en el ejemplo 8. Los melanosomas dentro de los queratinocitos de sitios tratados fueron más pequeños y menos pigmentados, en comparación con los controles (figura 11 D, 11E y 11F). Además, la distribución de los melanosomas dentro de las pieles tratadas fue anormal. Los melanosomas se detectaron principalmente en el límite epidermis-dermis, en comparación con una distribución aleatoria en los controles no tratados (figura 11G, 11 H). Aunque los autores de la presente no pueden descartar otros mecanismos, sugieren que los queratinocitos tratados con el compuesto I fueron incapaces de tomar o recibir activamente melanosomas de las dendritas presentes.

EJEMPLO 10 El efecto despigmentador del compuesto I in vivo es reversible Se trató un cerdo de Yucatán con el compuesto I, 250 µM, durante 8 semanas, 2 veces al día, 5 veces a la semana sobre ocho sitios. Todos los sitios mostraron despigmentación visible al final del período de tratamiento, como se indica en la figura 12B. Durante las siguientes 4 semanas (comenzando la semana 9 del experimento), se monitoreó el color de los sitios tratados, y se tomaron dos biopsias cada semana de los dos sitios tratados. También se tomó biopsia de los sitios no tratados. El efecto despigmentador pudo ser visualizado en una y dos semanas después del tratamiento, y se observó una reversión completa en la cuarta semana. El examen histológico de las secciones de piel teñida con F&M confirmaron la repigmentación observada visualmente (como se indicó en la figura 12). Tan pronto como una semana después del tratamiento, se demostró histológicamente la repigmentación. Las observaciones visuales se correlacionan con la demostración histológica de la pigmentación del estrato córneo. Este ejemplo demuestra que el compuesto I no induce un daño permanente a la maquinaria de pigmentación, y que su efecto es reversible in vivo. La figura 12A muestra dos secciones histológicas teñidas con F&M de sitios que no fueron tratados con el compuesto I. La figura 12B muestra dos secciones histológicas teñidas con F&M de sitios que fueron tratados con el compuesto I durante 8 semanas. La figura 12C muestra secciones de sitios que fueron tratados durante 8 semanas con el compuesto I, una semana después de suspender el tratamiento. La figura 12D muestra secciones de sitios que fueron tratados durante 8 semanas con el compuesto I, dos semanas después de suspender el tratamiento. La figura 12E muestra secciones de sitios que fueron tratados durante 8 semanas con el compuesto I, cuatro semanas después de suspender el tratamiento. Como se indica en la figura 12E, las secciones fueron completamente repigmentadas cuatro semanas después del final del tratamiento.

EJEMPLO 11 Preparación de productos de origen natural gue contienen STI El ejemplo 1 demuestra que la presencia de inhibidor de tripsina de soya en cualquier formulación aclaradora es conveniente para su actividad despigmentadora. En base a la prueba analítica, se ha determinado que la leche de soya y la pasta de soya son fuentes ricas de inhibidor de tripsina de soya. Para hacer la pasta la soya, primero se remojaron granos de soya en agua desionizada o purificada durante varias horas. Las soyas se molieron después de estar completamente hidratadas con la adición de pequeñas cantidades de agua si fuera necesario, para ablandar la pasta. Para hacer la leche de soya, se desarrolló el mismo procedimiento con la adición de más agua (el procedimiento de molienda permite extraer la leche de soya). Después de la recolección, se filtró la leche de soya para retirar cualquier parte residual de la cascara de soya. Se preparó leche de soya, pasta de soya y mijo para ser utilizados como materiales de origen natural que contienen STI y son capaces de aclarar el color de la piel.

EJEMPLO 12 El tratamiento con materiales de origen natural que afectan la ruta de PAR- 2 induce despigmentación Se trataron dos cerdos de Yucatán durante 8 y 10 semanas, dos veces al día, cinco veces a la semana, con diferentes productos derivados de soya y haba. Estos productos naturales incluyen pasta de soya, hidrolizado ácido de proteína de soya, mijo, leche de soya natural y hervida, y un extracto de soya disponible comercialmente (Actiphyte™ de Active Organic, Dallas Texas), así como también STI purificado y diferentes preparaciones de inhibidores de tripsina a partir de soyas y habas. A las siete semanas de tratamiento, todos los sitios fueron visualmente más claros que la piel circundante, excepto para los sitios tratados con leche de soya hervida y con hidrolizado ácido de proteína de soya. El análisis histológico de las biopsias de los sitios tratados después de tinción con F&M, confirmaron el efecto despigmentador de los productos de soya y haba. Un ejemplo de dichos datos histológicos se da en la figura 13. La falta de actividad despigmentadora en la leche de soya hervida y en el hidrolizado de ácido de proteína de soya, se explica por ia desnaturalización o degradación de las proteínas de soya en estas preparaciones, respectivamente. Los autores de la presente consideran teóricamente que los agentes despigmentadores activos en los productos de soya y haba son inhibidor de tripsina de soya (STI) e inhibidor de tripsina de haba, respectivamente. (El ejemplo 1 muestra el efecto despigmentador de STI in vitro). Este ejemplo demuestra que los extractos naturales que contienen actividad inhibidora de tripsina se puede usar como agentes enblanquecedores que afectan la ruta de PAR-2.

EJEMPLO 13 Una STI en formulación de liposoma puede aclarar manchas de la edad en humanos Se trató un individuo con tres manchas de edad en el dorso de su mano durante ocho semanas, dos veces al día, con lo siguiente: la mancha de edad localizada más cercana al brazo se trató con placebo conteniendo 20 mg/ml de liposomas. La parte media de la mancha de edad no se trató. La tercera mancha de edad se trató con STI, 1%, en liposomas (20 mg/ml). Los liposomas GDL se prepararon como se indica en Niemiec, y otros, citado anteriormente, con la excepción de los siguientes cambios: la formulación liposómica no iónica contenía dilaurato de glicerol (Emulsynt GDL, ISP Van Dyk/colesterol (Croda)/éter polioxietilen-10-estearílico, en relación de 37.5:12.5:33.3:16.7. Se utilizó amortiguador Hepes 0.05M, pH 7.4 (Gibco-BRL of Gaithersburg, MD) como la fase acuosa en la preparación de los liposomas. Se tomaron fotografías digitales en UV y luz visible al tiempo 0, 4 y 8 semanas de tratamiento. Se calcularon valores L* (brillantez) a partir de las imágenes utilizando Adobe Photoshop. Como se muestra en la figura 14, la mancha de edad tratada con STI se hizo más clara después de 8 semanas de tratamiento. La figura 14 es una combinación de cuatro fotografías. El cuadro de la izquierda es la fotografía de luz visible de la mano, antes (superior) y después (inferior) de 8 semanas de tratamiento. En esta orientación, la mancha superior es la tratada con placebo, la mancha media es sin tratamiento, y la mancha inferior es la tratada con STI. El cuadro derecho muestra la misma mano en los mismos puntos de tiempo, utilizando fotografía UV. La luz UV permite la visualización del pigmento más profundo en la piel, demostrando que el efecto de emblanquecimiento de STI no fue superficial. La figura 14 demuestra claramente que la formulación de STI fue capaz de aclarar la mancha inferior. Se calculó incremento de 15 unidades L* para este sitio tratado con STI, demostrando además la capacidad de este tratamiento para aclarar manchas de la edad.

EJEMPLO 14 Formulaciones despigmentadoras con leche de soya En la preparación de leche de soya, se descubrió que la rica emoliencia de la leche sería conveniente en una formulación para el cuidado de la piel. Como se utiliza agua como el ingrediente predominante de cualquier emulsión de aceite en agua y en muchas otras formulaciones para el cuidado de la piel, los autores de la presente consideran que la leche de soya puede ser usada para substituir el agua desionizada en dichas formulaciones. Sin embargo, se esperaría que este tipo de formulación no fuera físicamente estable debido a la inmiscibilidad de los componentes de aceite y agua de la leche de soya. Sorprendentemente, encontraron que esta substitución de leche de soya por agua es físicamente estable. Las formulaciones que utilizan leche de soya deben contener entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 99% de leche de soya, de preferencia aproximadamente de 80% a aproximadamente 95% de leche de soya. Preferiblemente, esta formulación y formulaciones similares deben incluir un incrementador de viscosidad en una cantidad aproximadamente de 0% a aproximadamente 5% (de preferencia 0.1 a aproximadamente 2%), uno o más emolientes en una cantidad de hasta aproximadamente 20% y/o emulsionantes en una cantidad de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% (preferiblemente de alrededor de 3 a aproximadamente 5%), y opcionalmente un agente de extensión en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 5% (de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 2%), un conservador, un agente quelatante o humectante. El conservador debe estar presente en una cantidad efectiva para conservar la integridad de la leche y mantener la actividad de la composición. Debe estar presente suficiente espesante para impartir cuerpo a la formulación sin hacer que se convierta en demasiado viscosa que pudiera impedir su extensión, por ejemplo aproximadamente de 0 a aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 5%. También se pueden incorporar en las composiciones de esta invención filtros solares, antioxidantes, vitaminas, otros agentes despigmentadores y otros ingredientes tópicos para el cuidado de la piel. Un ejemplo particularmente preferido de la formulación despigmentadora que substituye agua con leche de soya, se muestra en el cuadro E siguiente.

CUADRO E Se pueden incorporar en tales formulaciones STI, pasta de soya y otros extractos naturales que contienen inhibidor de tripsina para proveer concentraciones crecientes del inhibidor de serina proteasa. Los niveles de uso del ingrediente activo agregado pueden variar entre 0.01% a 15% en una formulación. También se pueden incorporar en esta formulación otros agentes despigmentadores, incluyendo inhibidores de PAR-2, inhibidores de tirosinasa, hidroquinonas, productos de soya, ácido ascórbico y sus derivados, así como también otros ingredientes con beneficios para el cuidado de la piel.

EJEMPLO 15 Una formulación despigmentadora de emulsión aceite en agua En el cuadro F se presentan dos ejemplos de una formulación despigmentadora con emulsión de aceite en agua. En la columna 4 del cuadro F se describe una formulación con STI, en donde el STI pudo ser reemplazado con cualquier inhibidor de serina proteasa de origen natural, o con cualquier extracto de origen natural o fracción del mismo que contiene inhibidores de serina proteasa. En la columna 5 del cuadro F se presenta una formulación similar con el compuesto I. El compuesto I en esta composición pudo ser reemplazado con compuestos similares, o con inhibidores de serina proteasa o con cualquier material inhibidor de PAR-2 que tiene índices terapéuticos altos, ya sea de origen sintético o natural, como el ingrediente activo. Las escalas sugeridas para los ingredientes en estas formulaciones se presentan también en el cuadro F. El contenido de agua desionizada de estas formulaciones puede ser reemplazado con leche de soya.

CUADRO F Para preparar esta formulación, los ingredientes de la fase líquida se combinaron y mezclaron a 85°C, y después se enfriaron a 60°C. En un recipiente separado, se agregó lentamente el carbopol al agua o a la leche de soya. Después de mezclar durante 10 minutos, el resto de los ingredientes de la fase acuosa se agregaron y la mezcla se calentó hasta 60°C. Después se combinaron las dos fases, se mezcló durante 10 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Desde luego, se pueden combinar uno o más agentes de despigmentación dentro de la misma formulación en este ejemplo y en los ejemplos siguientes y otras modalidades de los métodos y composiciones de esta invención.

EJEMPLO 16 Composición despigmentadora (emulsión aceite en agua) En el cuadro G se presentan dos ejemplos adicionales de una formulación despigmentadora en emulsión de aceite en agua. En la columna 3 del cuadro G se describe una formulación con STI, en donde el STI pudo ser reemplazado con cualquier inhibidor de serina proteasa de origen natural o con cualquier extracto de origen natural o ¿fracción del mismo que contiene inhibidores de serina proteasa. En la columna 4 del cuadro G se presenta una formulación similar con el compuesto I. El compuesto I en esta composición pudo ser reemplazado con compuestos similares o con inhibidor de serina proteasa o con cualquier material inhibidor de PAR-2 que tenga altos índices terapéuticos, ya sea de origen natural o sintético, como el ingrediente activo. También se indican en el cuadro G las escalas sugeridas para los ingredientes en dichas formulaciones. El contenido de agua desionizada de estas formulaciones podría ser reemplazado con leche de soya. CUADRO G Para preparar esta formulación, se agregó lentamente la hidroxietilcelulosa al agua o a la leche de soya y se agitó hasta disolución completa. En un contenedor separado, se agregaron el polímero entrelazado de acrilatos/acrilato de alquilo de C10-30 y se agitó hasta disolverse completamente. Se combinó el contenido de los dos contenedores y se mezcló durante 20 minutos. Después se le agregó acetato de vitamina E y se mezcló, seguido por la adición de isohexadecano y pantenol (98%). Después de mezclar durante 5 minutos, se le agregó el STI, o el extracto natural, o el compuesto I, junto con propilenglicol, y se agitó durante 5 minutos. Enseguida se le agregó glicerina y la formulación se agitó durante 20 minutos. Finalmente, se ajustó el pH con hidróxido de sodio a 8 para STI (la escala es 6-8.5) o a 7 para el compuesto I (la escala es 5.5-8.5).

EJEMPLO 17 Composición despigmentadora (emulsión agua en aceite) En el cuadro H se presenta un ejemplo de una formulación despigmentadora con emulsión de agua en aceite. En la columna 4 del cuadro H se describe una formulación con STI, en donde el STI podría ser reemplazado con cualquier inhibidor de serina proteasa de origen natural, o con cualquier extracto de origen natural o fracción del mismo que contiene inhibidores de serina proteasa. En la columna 5 del cuadro H se presenta una formulación similar con el compuesto I. El compuesto I en esta composición podría ser reemplazado con compuestos similares o con inhibidor de serina proteasa o con cualquier material inhibidor de PAR-2 que tenga altos índices terapéuticos, ya sea de origen natural o sintético, como el ingrediente activo. Las escalas sugeridas para los ingredientes en dichas formulaciones también se presentan en el cuadro H. El contenido de agua desionizada de estas formulaciones podría ser reemplazado con leche de soya. CUADRO H Para preparar esta formulación, se fundieron el alcohol estearílico y el aceite mineral a 70°C. Se le agregaron los otros ingredientes de la fase oleosa y se calentó la mezcla a 75°C. Se le agregaron entonces los ingredientes de la fase acuosa, que se habían disuelto previamente en la mayor parte de la fase acuosa o leche de soya y se calentaron a 70°C, y la mezcla se agitó hasta congelarse.

EJEMPLO 18 Composición despigmentadora (gel acuoso) En el cuadro J se presentan dos ejemplos de una formulación despigmentadora con gel acuoso. En la columna 3 del cuadro J se describe una formulación con STI, en donde el STI podría ser reemplazado con cualquier inhibidor de serina proteasa de origen natural, o cualquier extracto de origen natural o fracción del mismo que contiene inhibidores de serina proteasa. En la columna 4 del cuadro J se presenta una formulación similar con el compuesto I. El compuesto I en esta composición podría ser reemplazado como el ingrediente activo con compuestos similares o con inhibidor de serina proteasa o con cualquier material inhibidor de PAR-2 que tenga altos índices terapéuticos, ya sea de origen natural o sintético. Las escalas sugeridas para los ingredientes en estas formulaciones se presentan también en el cuadro J. El contenido de agua desionizada de estas formulaciones podría ser reemplazado con leche de soya.

CUADRO J Composición despigmentadora a base de solvente En el cuadro K se presenta un ejemplo de una formulación despigmentadora que contiene solvente. En la columna 3 del cuadro K se describe una formulación con STI, en donde el STI podría ser reemplazado con cualquier inhibidor de serina proteasa de origen natural, o cualquier extracto de origen natural o fracción del mismo que contiene inhibidores de serina proteasa. En la columna 4 del cuadro K se presenta una formulación similar con el compuesto I. El compuesto I en esta composición podría ser reemplazado como el ingrediente activo con compuestos similares o con inhibidor de serina proteasa o con cualquier material inhibidor de PAR-2 que tenga altos índices terapéuticos, ya sea de origen natural o sintético. Las escalas sugeridas para los ingredientes en estas formulaciones se presentan también en el cuadro K. El contenido de agua desionizada de estas formulaciones podría ser reemplazado con leche de soya.

CUADRO K Para 'preparar esta formulación, se disolvió el compuesto I en agua. Se mezclaron y combinaron el etanol y propilenglicol con la solución acuosa conteniendo el compuesto I. En resumen, los autores de la presente han demostrado que la activación del receptor de queratinocito PAR-2 da como resultado pigmentación incrementada. Preferiblemente, dicha activación puede ser lograda mediante el uso de tripsina o SLIGRL o SLIGKVD, u otros derivados de SLIGRL o SLIGKVD. También han demostrado que el emblanquecimiento se puede lograr mediante el uso de inhibidores de serina proteasa o antagonistas de PAR-2, así como también por medio de bloqueadores de transferencia de melanosoma. Otros compuestos conocidos para el experto en la materia que inhiban la transferencia de melanosoma hacia los queratinocitos podrían ser utilizados también como agentes despigmentadores. El compuesto I, un inhibidor de tripsina y trombina, por ejemplo, inhibe la transferencia de melanosoma a los queratinocitos. El STI funciona mediante el mismo mecanismo. La acumulación de melanosomas no liberados en los melanocitos podría inducir un mecanismo de retroalimentación negativa que retarde la formación de melanosoma nuevo. La producción de TRP-1 , la mayor licoproteína en los melanocitos, es regulada negativamente lo cual conduce a la desestabilización de tirosinasa. Esto da como resultado formación reducida de melanina, y un cambio de color a un café más claro, con forme se reduce la relación de TRP-1;TRP-2. La a'cumulación de melanosomas en el melanocito después de tratamiento con el compuesto I, o después de tratamiento con STI, por lo tanto, ha reducido y alterado el contenido de melanina, lo cual se agrega al efecto emblanquecedor del compuesto I o STI.

Claims (68)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para efectuar cambios en la pigmentación de la piel de mamífero, que comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva para cambiar la pigmentación, de un compuesto que afecta la ruta de PAR-2. 2.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto inhibe la ruta de PAR-

2.

3.- Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto es un antagonista de PAR-2.

4.- Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho compuesto se une a PAR-2, o lo bloquea, pero no lo activa.

5.- Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de antagonistas basados en SLIGRL, que se unen a PAR-2 o lo bloquean, pero no lo activan, antagonistas basados en SLIGKVD que se unen a PAR-2 o lo bloquean, pero no lo activan, y mezclas de los mismo.

6.- Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto es un inhibidor de proteasa.

7.- Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho compuesto es un inhibidor de serina proteasa.

8.- Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicho compuesto es un inhibidor de trombina y/o triptasa y/o tripsina.

9.- Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque dicho compuesto es un compuesto de fórmula I: ^fe en donde: A se selecciona del grupo que consiste de alquilo de C?.s, ?o carboxilaquilo de C-?- , alcoxicarbonilo de dValquilo de C1-4, fenilalquilo de C1-4, fenilalquilo de C1-4 substituido (donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), formilo, alcoxicarbonilo ^^ 15 de C-1-4, alquilcarbonilo de Cr2, fenilalcoxicarbonilo de C1-4, cicloalquilcarbonilo de C3-7, fenilcarbonilo, fenilcarbonilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 20 alquilsulfonilo de C1-4, alcoxisulfonilo de C-1-4, perfluoroalquilsulfonilo de C1-4, fenilsulfonilo, fenilsufonilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de C-1-4, fenilalquilsulfonilo de C1-4 substituido, alquilsulfinilo de C1-4, perfluoroquilsulfinilo de C1-4, fenilsulfinilo, fenilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4. dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C-1-4), fenilalquilsulfinilo de C-i-4, fenilalquilsulfinilo de C1-4 substituido, 1-naftilsulfonilo, 2- naftilsulfonilo o naftilsulfonilo substituido (en donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C-1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-naftilsulfinilo, 2-naftilsulfinilo o naftilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C-1-4); un aminoácido D o L que está unido en su extremo carboxilo terminal al nitrógeno mostrado en la figura I, y se selecciona del grupo que consiste de alanina, asparagina, ácido 2-azetidincarboxílico, glicina, N-alquilglicina de C?-8, prolina, ácido 1-amino-1-cicloalqu¡lcarboxílico de C3-8, ácido tiazolidin-4-caboxílico, ácido 5,5-dimetiltiazolidin-4-carboxílico, ácido oxazolidin-4-carboxílico, ácido pipecolínico, valina, metionina, cisteína, serina, treonina, norleucina, leucina, ter-leucina, isoleucina, fenilalanina, 1-naftalanina, 2- naftalanina, 2-tienilalanina, 3-tienilalanina, ácido [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-1 -carboxílico y ácido [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-2-carboxílixo, en donde el grupo amino terminal de dicho aminoácido está unido a un miembro seleccionado del grupo que consiste de alquilo de C1-4, tetrazol-5-il-alquilo de d-2, carboxialquilo de C1-4, alcoxicarbonilalquilo de C1-4, fenilalquilo de C-1-4, fenilalquilo de C1-4 susbtituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C?-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de C-1-4, 3-fenil-2-hidroxipropionilo, 2,2-difenil-1-hidroxietilcarbonilo, [1 , 2, 3, 4]-tetrahidroisoquinolin-1 -carbonilo, [1 , 2, 3, 4] -tetrahidroisoquinolin-3-carbonilo, 1-metilamino-1-ciclohexanocarbonilo, 1-hidroxi-1-ciclohexanocarbonilo, 1-hidroxi-1-fenilacetilo, 1-ciclohexil-1-hidroxiacetilo, 3-fenil-2-hidroxipropionilo, 3,3-difenil-2-hidroxipropionilo, 3-ciclohexil-2-hidroxipropionilo, formilo, alcoxicarbonilo de C-1-4, alquilcarbonilo de C1-12, perfluoroalquilo de C1-4, alquilcarbonilo de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C1-4, fenilalquilcarbonilo de C1-4 substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilcarbonilo de C1-4, 1 ,1-difenilalquilcarbonilo de C1-4 substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), perfluoroalquilsulfonilo de C1-4, alquilsulfonilo de C1-4, alcoxisulfonilo de C1-4, fenilsuifonilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C-1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C-1-4), 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de C1-4, fenilalquilsulfonilo de C1-4 substituido, perfluoroalquilsulfinilo de C1-4, alquilsulfinilo de C1-4, fenilsulfinilo, fenilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C-1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-naftiIsulfonilo, 2-naftilsulfonilo, naftilsulfonilo substituido (en donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-?-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1-naftilsulfinilo, 2-naftilsulfinilo, y naftilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4); o un polipéptido formado por dos aminoácidos, en donde el primer aminoácido es un aminoácido D o L, unido mediante su extremo carboxilo terminal al nitrógeno mostrado en la fórmula I, y se selecciona del grupo que consiste de glicina, N-alquilglicina de C?-8, alanina, ácido 2-azetidincarboxílico, prolina, ácido tiazolidin-4-carboxílico, ácido 5,5-dimetiltiazolidin-4-carboxílico, ácido oxazolidin-4-carboxílico, ácido 1-amino-1-cicloalquilcarboxílico de C3-8, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, 3-(alcoxi de C1-4) prolina, 4-(alcoxi de C1-4) prolina, 3,4-dehidroxiprolina, ácido 2,2-dimetil-4-tiazolidin carboxílico, ácido 2,2-dimetil-4-oxazolidin carboxílico, ácido pipecolínico, valina, metionina, cisteína, asparagina, serina, treonina, leucina, ter-leucina, isoleucina, fenilalanina, 1-naftalanina, 2-naftalanina, 2-tienilalanina, 3-tienilalanina, ácido [1 ,2,3,4]-tetrahidroisoquinolin-2-carboxílico, éster 4-alquílíco de C?-4 de ácido aspártico y éster 5-alquílico de C?-4 de ácido glutámico, y el segundo aminoácido D o L está unido al grupo amino terminal de dicho primer aminoácido, y se selecciona del grupo que consiste de fenilalanina, 4-benzoilfenilalanina, 4-carboxifenilalanina, 4-(carboxialquilo de C1-2)fenilalanina, fenilalanina substituida (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C-1-4), 3-benzotienilalanina, 4-bifenilalanina, homofenilalalnina, ácido octahidroindol-2-carboxílico, 2-piridilalanina, 3-piridilalanina, 4-tiazolialanina, 2-tienilalanina, 3-(3-benzotienil)alanina, 3-tienilalanina, triptófano, tirosina, asparagina, 3-trialquilsililalanina de C1-4, ciclohexilglicina, difenilglicina, fenilglicina, sulfóxido de metionina, metionina sulfona, 2,2-diciclohexilalanina, 2-(1-naftilalanina), 2-(2-naftilalanina), fenilalanina substituida con fenilo (en donde los substituyentes se seleccionan independientemente de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), ácido aspártico, 4-alquilo de C1-4 de ácido aspártico, perfluoroalquilo de C-M, alcoxi de CM, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-M, dialquilamino de C-M, carboxi o alcoxicarbonilo de C-M, ácido aspártico, éster 4-alquílico de CM de ácido aspártico, ácido glutámico, éster 5-alquílico de CM de ácido glutámico, cicloalquilalanina de C3-8, cicloalquilalanina de C3-8 substituida (en donde los substituyentes de anillo son carboxi, éster alquílico de CM, cicloalquilalanina de C3.8, cicloalquilalanina de C3-8 substituida (en donde los substituyentes de anillo son carboxi, alquilcarboxilo de C?-4, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo de C-M, 2,2-difenilalanina y alquilo de C-?-5 todo alfa de todos los derivados de aminoácidos del mismo, en donde el grupo amino terminal de dicho segundo aminoácido es no substituido o monosubstituido con un miembro del grupo que consiste de formilo, alquilo de C1--12, tetrazol-5-ilalquilo de C1.2, carboxialquilo de C-?.8> carboalcoxialquilo de CM, fenilaquilo de CM, fenilalquilo de C1-4 substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de O1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de CM, alcoxicarbonilo de C?-6, fenilalcoxicarbonilo de d-ß, alquilcarbonilo de C?_2, perfluoroalquilo de C1-4-alquilcarbonilo de C , fenilalquilcarbonilo de CM, fenilalquilcarbonilo de C-M substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de d-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 ,1-difenilalquilo de C?-4, perfluoroalquilo de CM, alcoxicarbonilo de C-M, 10-alcanforsulfonilo, fenilalquilsulfonilo de C-M, fenilalquilsulfonilo de C-M substituido, alquilsulfinilo de CM, perfluoroalquilsulfinilo de CM, fenilsulfinilo, fenilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C-1-4, perfluoroalquilo de C-1-4, alcoxi de C-1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), fenilalquilsulfinilo de C?-4, fenilalquilsulfinilo de C-M substituido, 1-naftilsulfonilo, 2-naftilsulfonilo, naftilsulfonilo substituido (donde los substituyentes de naftilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C1-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4), 1 -haftiisulfinilo, 2-haftiisulfinilo y naftilsulfinilo substituido (en donde los substituyentes de fenilo se seleccionan independientemente de uno o más de alquilo de C1-4, perfluoroalquilo de C1-4, alcoxi de C1-4, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C1-4, dialquilamino de C-?-4, carboxi o alcoxicarbonilo de C1-4); R-i se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste de aminoalquilo de C2.8, guanidinoalquilo de C2-5, alquilguanidino de C-M-alquilo de C2-5, dialquilguanidino de C-M-alquilo de C2-5, amidinoalquilo de C2-5, alquilamidino de C?-4-alquilo de C2-5, dialquilamidino de C?-4-alquilo de C2-5, alcoxi de C?-3-alquilo de C2-5, fenilo, fenilo substituido (en donde los substituyentes se seleccionan independientemente de uno o más de amino, amidino, guanidino, alquilamino de C -4, dialquilamino de C-M, halógeno, perfluoralquilo de C , alquilo de C-M, alcoxi de C-?.3 o nitro), bencilo, bencilo substituido con fenilo (en donde los substituyentes se seleccionan independientemente de uno o más de amino, amidino, guanidino, alquilamino de C-M, dialquilamino de C-M, halógeno, perfluoroalquilo de C-M, alquilo de C-M, alcoxi de C-?.3 o nitro), hidroxialquilo de C2..5, alquilamino de C?-5-alquilo de C2-5, dialquilamino de C-t-5-alqu¡lo de C2-5, 4-aminociclohexilalquilo de Co-2 y alquilo de C1-5; p es 0 o 1 ; B es en donde n es de 0 a 3, R3 es H o alquilo de C1-5, y la porción carboniio de B está unida a E; E es un heterociclo seleccionado del grupo que consiste de oxazolin-2-¡!o, oxazol-2-ilo, tiazol-2-ilo, tiazol-5-ilo, tiazol-4-ilo, tiazolin-2-ilo, imidazol-2-ilo, 4-oxo-2-quinoxalin-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, benzo[b]tiofen-2-ilo, tiazol-4-ilo, tiazol-6-ilo, pirazol-2-ilo, 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazol-2ilo, nafto[2,1-d]tiazol-2-ilo, nafto[1-2-d]tiazol-2-ilo, quinoxalin-2-ilo, isoquinolin-1-ilo, isoquinolin-3-ilo, benzo[b]furan-2-ilo, pirazin-2-ilo, quinazolin-2-ilo, isotiazol-5-ilo, isotiazol-3-ilo, purin-8-ilo y un heterociclo substituido, en donde los substituyentes se seleccionan de alquilo de C-M, perfluoroalquilo de C-M, alcoxi de CM, hidroxi, halógeno, amido, nitro, amino, alquilamino de C-M, dialquilamino de C-M, carboxi, alcoxicarbonilo de CM, hidroxi o fenilalquiloaminocarbonilo de C-M; O sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

10.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho compuesto contiene una secuencia de d-fenilalanina-prolina-arginina.

11.- Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho compuesto es (S)-N-metil-D-fenilalanil-N-[4-[(aminoiminometil)amino]-1-(2-benzotiazolilcarbonil)butil]-L-prolinamida.

12.- Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho compuesto es un producto natural que afecta la ruta de PAR-2.

13.- Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque dicho compuesto deriva de una o más de las familias botánicas de leguminosas, solanáceas, gramináceas y cucurbitáceas.

14.- Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho compuesto deriva de leguminosas.

15.- Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de: extracto de soya desnaturalizada, extracto de haba, extracto de frijol negro o mezclas de los mismos.

16.- Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de: fracciones de extracto de soya desnaturalizada, extracto de haba, extracto de frijol negro y mezclas de los mismos.

17.- Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de leche de soya, leche de haba, leche de frijol negro, extracto de soya, extracto de haba, extracto de frijol negro, pasta de soya, pasta de haba y pasta de frijol negro, y mezclas de los mismos.

18.- Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho compuesto es un inhibidor de la transferencia de melanosoma.

19.- Un método dé conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto activa la ruta de PAR-2.

20.- Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque dicho compuesto es un agonista de PAR-2 que se une a PAR-2 y lo activa.

21.- Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de SLIGRL, SLIGKVD, y derivados de SLIGRL y SLIGKVD, que se unen a PAR-2 y lo activan, y mezclas de los mismos.

22.- Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque dicho compuesto es una proteasa que activa a PAR-2.

23.- Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho compuesto es una serina proteasa que activa a PAR-2.

24.- Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de tripsina, triptasa, trombina y proteasas de origen natural en la piel que activan a PAR-2.

25.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto es un incrementador de la transferencia de melanosoma.

26.- Una composición para efectuar cambios en la pigmentación de la piel de mamífero, que comprende una cantidad efectiva para cambiar la pigmentación de un compuesto que afecta la ruta de PAR-2.

27.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto es un inhibidor de la ruta de PAR-2.

28.- Una composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque dicho compuesto es un antagonista de PAR-2.

29.- Una composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque dicho compuesto se une a PAR-2 o lo bloquea, pero no lo activa.

30.- Una composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de antagonistas basados en SLIGRL, que se unen a PAR-2 o lo bloquean, pero no activan, antagonistas basados en SLIGKVD que se unen a PAR-2 o lo bloquean, pero no lo activan, y mezclas de los mismos.

31.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto es un inhibidor de proteasa.

32.- Una composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque dicho compuesto es un inhibidor de serina proteasa.

33.- Una composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque dicho compuesto es un inhibidor de trombina y/o tripsina y/o triptasa, o un inhibidor de las serina proteasas de origen natural en la piel, que activa a PAR-2.

34.- Una composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque dicho compuesto contiene un motivo d-fenilalanina-prolina-arginina.

35.- Una composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque dicho compuesto es (S)-N-metil-D-fenilalanil-N-[4-[(aminoiminometil)amino]-1-(2-benzotiazolilcarbonil)but¡l]-L-prol¡namida.

36.- Una composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada porque dicho compuesto es un producto de origen natural que afecta la ruta de PAR-2.

37.- Una composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque dicho compuesto deriva de una o más de las familias botánicas de leguminosas, solanáceas, gramináceas y cucurbitáceas.

38.- Una composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque dicho compuesto deriva de leguminosas.

39.- Una composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque dicho compuesto deriva de soya, haba y/o frijol negro.

40.- Una composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona de un grupo que consiste de extracto de soya desnaturalizada, extracto de haba, extracto de frijol negro o mezclas de los mismos.

41.- Una composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de leche de soya, leche de haba, leche de frijol negro, extracto de soya, extracto de haba, extracto de frijol negro, pasta de soya, pasta de haba y pasta de frijol negro y mezclas de los mismos.

42.- Una composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque dicho compuesto es una fracción de leche de soya, extracto de soya, pasta de soya, leche de haba, extracto de haba, pasta de haba, leche de frijol negro, extracto de frijol negro, pasta de frijol negro y mezclas de los mismos.

43.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto es un inhibidor de la transferencia de melanosoma.

44.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto activa la ruta de PAR-2.

45.- Una composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque dicho compuesto es un agonista de PAR-2 que se une a PAR-2 y lo activa.

46.- Una composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de SLIGRL, SLIGKVD, y derivados de SLIGRL y SLIGKVD, que se unen a PAR-2 y lo activan, y mezclas de los mismos.

47.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto es una proteasa que activa a PAR-2.

48.- Una composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque dicho compuesto es una serina proteasa que activa a PAR-2.

49.- Una composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de tripsina, triptasa, trombina. y proteasas de origen natural en la piel, que activan a PAR-2.

50.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dicho compuesto es un incrementador de la transferencia de melanosoma.

51.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque dicho compuesto que afecta a PAR-2 está presente en una cantidad aproximadamente de 0.0001% a aproximadamente 15% en peso/volumen de dicha composición.

52.- Una composición de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizada porque dicho compuesto está presente en una cantidad aproximadamente de 0.001 a aproximadamente 5% de dicha composición.

53.- Una composición de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque dicho compuesto está presente en una cantidad aproximadamente de 0.005 a aproximadamente 1% de dicha composición.

54.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende leche de soya en una cantidad aproximadamente de 1 a aproximadamente 99% en peso.

55.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende inhibidor de tripsina de soya, inhibidor de tripsina de haba o inhibidor de tripsina de frijol negro en una cantidad aproximadamente de 0.01 a aproximadamente 20% en peso.

56.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha composición se aplica dos veces al día durante por lo menos 8 semanas.

57.- Un método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque dicha composición se aplica en una dosificación relativamente alta durante por lo menos aproximadamente 4 a aproximadamente 10 semanas y después se aplica a una dosificación relativamente más baja en una base continua para mantener el efecto aclarador de la piel.

58.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha composición se administra oralmente.

59.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha composición se administra parenteralmente.

60. Una composición cosmética de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende dicho compuesto que afecta la pigmentación, y un vehículo cosméticamente aceptable.

61.- Una composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada además porque dicha composición comprende agentes despigmentadores adicionales.

62.- Una composición de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizada además porque dicha composición comprende inhibidores de tirosinasa.

63.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha composición comprende liposomas.

64.- Una composición de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque dicha composición comprende dilaurato de glicerol, colesterol, éter polioxietilen-10-estearílico y éter polioxietilen-9-laurílico.

65.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha composición comprende antioxidantes.

66.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha composición comprende un filtro solar.

67.- Una composición de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada porque dicha composición comprende aproximadamente de 1 a aproximadamente 99% de leche de soya, aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 20% de emulsionante y un conservador en una cantidad efectiva.

68.- Una composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha composición comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: antioxidantes, filtros solares, humectantes, agentes blanqueadores, agentes de despigmentación, agentes tensioactivos, agentes espumantes, acondicionadores, humectantes, fragancias, agentes viscosantes, agentes amortiguadores, conservadores y una mezcla de los mismos.