MXPA99002029A - Metodo de sintesis de proteinas in vivo - Google Patents

Abstract

Un método de superproducción de proteínas que se inician con un aminoácido distinto de metionina, en donde se sobreexpresan la metionil-ARNt transformilasa y, eventualmente, la ARNt sintetasa apropiada en una célula huésped.

Description

MÉTODO DE SÍNTESIS DE PROTEÍNAS IN VIVO Antecedentes de la Invención La metionina es el único aminoácido natural que se sabe que inicia la sintesis de proteinas (Lucas-Lenard, J. y F. Lipmann, Ann. Rev. Biochem., 40: 409-448 (1971) ) . En procariontes, el aminoácido es primeramente unido al ARNt de la metionina iniciadora por la metionil-ARNt sintetasa y posteriormente formilado por la metionil-ARNt transformilasa. El f-Met-ARNtfMet resultante inicia la sintesis de proteinas en una reacción dependiente del factor 2 de iniciación (FI-2) . La aminoacilación de los ARNt de metionina de E. coli depende del reconocimiento del anticodon de la metionina CAU por la metionil-ARNt sintetasa de E. coli (Schulmanh, L.H. y H. Pelka, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:6755-6759 (1983)). Las mutaciones en esta secuencia llevan a actividad aceptora de la metionina y, en algunos casos, a adquisición de una nueva actividad aceptora de aminoácidos correspondiente a la de la secuencia anticodon alterada (Schulman, L.H. y H. Pelka, Biochemistry, 24 : 7309-7314 (1985); Schulman, L.H. y H. Pelka, Science, 242:765-768 (1988); Schulman, L.H. y H. Pelka, Science. 246:1595-1597 (1989); Schulman, L.H. y H. Pelka, Nucleic Acids Res., en imprenta (1990) .

Compendio de la Invención La presente invención se relaciona con un método in vivo de superproducción, en una célula huésped apropiada (por ejemplo, una bacteria, tal como E. coli ) , de una proteina que se inicia con un aminoácido distinto de la metionina (una proteina en la que el aminoácido amino-terminal es distinto de metionina) . En el método, se modifica una célula huésped mediante la introducción, usando métodos conocidos (por ejemplo, transformación, transfección, infección), de: a) ADN que codifica para la proteina que ha de ser producida y que consiste en un codon iniciador para un aminoácido distinto de la metionina; b) ADN que codifica para un ARNt iniciador mutante que contiene el correspondiente anti-codon (para el codon de iniciación del ADN que codifica para la proteina que ha de ser producida) , y c) ADN codificante de la metionil-ARNt transformilasa. Las células huésped modificadas resultantes son mantenidas en condiciones apropiadas para la superproducción de la metionil-ARNt transformilasa (MTF) y la expresión del ADN que codifica para la proteina que ha de ser producida (la proteina en la que el aminoácido amino-terminal es distinto de metionina) . Como resultado, se produce la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina. Eventualmente, también se introduce ADN codificante de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada (que está determinada por el aminoácido con el que se inicia la proteina) y se produce (superproduce) en la célula huésped. En una realización particular de la invención, la proteina producida se inicia con valina, isoleucina o fenilalanina. El presente método puede ser usado para producir proteinas con aplicaciones terapéuticas y diagnósticas, tales como hemoglobina y somatotropina. Las proteinas producidas por el método reivindicado son también objeto de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura ÍA muestra los plásmidos usados para la expresión del gen informador CAT y el gen del ARNt iniciador. Los sitios para la clonación del gen CAT y el gen del ARNt están indicados con flechas. La Figura IB muestra los plásmidos usados para la expresión de los genes IF2, FMT o FMS-FMT (codificantes de FMT) y del gen ValRS. Las flechas verticales indican los sitios en el vector pACD usados para la clonación de los diversos genes. La Figura 2A muestra los sitios de mutación en el ARNt2fMet. Los dos ARNt mutantes usados son G34C36 y G34, tienen la secuencia anticodon GAC y GAU, respectivamente, y son aminoacilados con valina e isoleucina, respectivamente. La Figura 2B muestra la región de iniciación de los genes CAT usados. El gen CAT2. 5, al que se hace referencia como el gen de tipo salvaje, tiene AUG como codon de iniciación y los cambios en los codones segundo y quinto que fueron previamente introducidos para eliminar los sitios secundarios débiles de iniciación. Los dos mutantes generados para este trabajo son denominados CATV1 .2. 5 y CAT11 .2. 5. Estos genes CAT mutantes llevan los mismos cambios en los codones segundo y quinto que el gen CAT2. 5 y tienen GUC y AUC, respectivamente, como codones de iniciación.

Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con un método in vivo de producción de proteinas que se inician con (que tienen como su aminoácido amino-terminal) un aminoácido distinto de metionina. Se ha visto ahora que las proteinas que incluyen un aminoácido distinto de metionina pueden ser producidas en células huésped que contienen ADN que codifica para una proteina que ha de ser producida y tiene un codon de iniciación para un aminoácido distinto de metionina (un codon iniciador no-metionina) ; un ARNt iniciador mutante que contiene la correspondiente secuencia anticodon; ADN codificante de la metionil-ARNt transformilasa (MTF) , que se sobreexpresa en las células huésped, y, eventualmente, ADN codificante de la apropiada aminoacil-ARNt sintetasa para la proteina que se está produciendo. El trabajo aqui descrito muestra que, en las células huésped en las que se sobreexpresa la MTF (en las que se produce a mayores niveles que lo que se produce en la célula huésped normal, que contiene un sola copia del gen codificante de la MTF) , se sobreexpresa una proteina iniciada con un aminoácido distinto de metionina. Concretamente, se ha visto que se superproduce proteina iniciada con valina o isoleucina en las células huésped (por ejemplo, E. coli) en las que se sobreexpresa MTF y que, en el caso de la proteina iniciada con valina, la producción es aún aumentada cuando se expresa también la aminoacil-ARNt sintetasa (ValRS) apropiada en las células huésped. Se describe aqui una valoración de si los ARNt iniciadores mutantes que leen codones de iniciación distintos del codon de iniciación de la metionina producen más de una proteina seleccionada iniciada con un aminoácido distinto de metionina in vivo que la combinación del ARNt iniciador de tipo salvaje y el correspondiente gen de tipo salvaje y da lugar a este trabajo. También se describen dos ARNt iniciadores mutantes con los anticodones GAC y GAU y dos correspondientes mutantes génicos con los codones de iniciación GUC y AUC, respectivamente. Según se describe aqui, estas combinaciones de ARNt iniciadores mutantes/ge-nes seleccionados mutantes producen más de la proteina codificada que la combinación de ARNt iniciadores de tipo salvaje/genes de tipo salvaje. En particular, el Solicitante ha mostrado que se produce una proteina iniciada con valina o isoleucina a mayores niveles en E. coli , en donde se sobreexpresa MTF, sola o en combinación con la expresión de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada. La presente invención se relaciona con un método de iniciación de la sintesis de proteinas con un aminoácido distinto de metionina y con un método in vivo de mayor producción (a la que se hace referencia como superproducción) de proteinas, en el que se inicia la sintesis de proteinas con un aminoácido distinto de metionina, con el resultado de que el producto proteico tiene, en su extremo amino-terminal, un aminoácido distinto de la metionina. El aminoácido amino-terminal puede ser cualquiera de los otros 19 aminoácidos naturales. En realizaciones especificas, se aumenta la producción de proteinas que se inician con isoleucina, valina o fenilalanina, dando lugar a proteinas que contienen, respectivamente, una isoleucina, valina o fenilalanina amino-terminal. La presente invención se relaciona además con las proteinas superproducidas, que contienen un aminoácido distinto de metionina (por ejemplo, isoleucina, valina o fenilalanina) en el extremo amino-terminal. Además, la invención se relaciona con un método in vivo de producción de proteinas que son normalmente tóxicas para las células huésped en las que se producen. En realizaciones especificas, el método de la presente invención puede ser usado para producir hemoglobina (en donde el aminoácido amino-terminal es valina) , somatotropina humana o porcina (en donde el aminoácido amino-terminal valina) o cualquier proteina que se inicie con valina, isoleucina o fenilalanina. El método in vivo de mayor producción de una proteina con un aminoácido amino-terminal distinto de metionina es llevado a cabo como se describe a continua-ción: se introduce lo siguiente en una célula huésped apropiada, que puede ser un procarionte o un eucarionte: a) ADN que codifica para la proteina y que tiene un codon iniciador distinto que para la metionina (un codon iniciador no-metionina) , b) ADN codificante de un ARNt iniciador mutante que contiene la correspondiente secuencia anti-codon y c) un ADN codificante de la metionil-ARNt transformilasa (MTF). En una realización, además de los a)-c) anteriores, se introduce ADN codificante de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada en las células huésped. Se introduce ADN codificante de MTF en las células huésped en un vector que da lugar a sobreexpresión de MTF en los receptores. En la realización en la que se expresan MTF y la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada en las células huésped, se introducen el ADN codificante de MTF y el ADN codificante de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada en las células huésped en un vector o vectores que da(n) lugar a suficientes niveles de expresión tanto de la MTF como de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada. Las células huésped modificadas resultantes (que ahora contienen el ADN de a) y b) anteriores, el ARNt iniciador mutante y, eventualmente, el ADN codificante de la aminoácido-ARNt sintetasa apropiada) son mantenidas en condiciones apropiadas para la superproducción de la MTF y, eventualmente la superproducción de la ARNt sintetasa apropiada y la sintesis de la proteina que ha de ser producida. La proteina resultante es obtenida de las células usando métodos conocidos. Como resultado del método aqui descrito, no sólo es posible producir proteinas que se inician con un aminoácido distinto de metionina, sino que es también posible aumentar su producción (es decir, conseguir la producción de mayores cantidades de la proteina deseada de lo posible cuando no se sobreexpresan MTF o MTF y la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada) . Tal como se utiliza aqui, mayor producción de una proteina se refiere a la producción de la proteina a niveles al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces e, incluso preferiblemente, 5 ó 6 veces, mayores que los niveles producidos por las células control. Las células control son del mismo tipo celular. Llevan el gen de tipo salvaje, que tiene un codon iniciador de metionina codificante de la proteina deseada. En una realización especifica aqui descrita, se superproduce una proteina de interés, que se inicia con valina, en una célula huésped apropiada (por ejemplo, E. coli ) cuando se superproduce MTF, sola o en combinación con la sobreexpresión de valil-ARNt sintetasa (ValRS) . En una realización, la proteina de interés es la hemoglobina. En otra realización, la proteina de interés que se superproduce se inicia con isoleucina, que se superproduce en una célula huésped apropiada (por ejemplo, E. coli ) cuando se superproduce MTF. La presente invención es ilustrada mediante la siguiente ejemplificación, que no pretende ser limitante en modo alguno. Ejemplificación Materiales y métodos Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en el trabajo que se describe a continuación. Plásmidos y cepas Se clonaron los genes informadores CAT de tipo salvaje y los diversos mutantes y los genes ARNtfMet en el plásmido pRSVp (Li y col., J. Biol. Chem., 271:1022-1028 (1996), Figura 1). Se utilizó el plásmido pACD (Mangroo y RajBhandary, J. Biol. Chem., 270:12203-12209 (1995)) para la superproducción de ValRS, IF2 y MTF. Se clonaron los genes ValRS, 1F2, MTF (codificantes de los genes MTF y FMS-FMT) (codificantes de la peptidil desformilasa, que elimina el grupo formilo del extremo N de las proteinas y MTF; Guillon y col., J. Mol. Biol., 234:359-367 (1992)) en los sitios EcoRI , Notl , Ncol y Espl , respectivamente (Mangroo y RajBhandary, J. Biol. Chem., 270:12203-12209 (1995)). El gen FMS-FMT superproducia MTF en mayor medida que el gen FMT solo y se utilizó para la superproducción de MTF en combinación con la superproducción de ValRS . Se utilizó la cepa de E. coli CA274 (hfrH LacZ125am trpEa ) como célula huésped para la transformación con estos plásmidos (Smith y Cells, Nature New Biol., 243:66-71 (1973)). Mutagénesis La caracterización por mutagénesis y la subclonación de los ADN mutantes en el vector pRSVp fueron todas como se ha descrito con anterioridad (Seong y RajBhandary, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 4:3343-338 (1987); Varshney y RajBhandary, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 87:1586-1590 (1990)). Preparación de los extractos celulares para los ensayos de actividad CAT y ß-lactamasa Se hicieron crecer transformantes de E. coli durante la noche a 37°C en medio YT 2X con ampicilina (100 µg/ml) . Se diluyó el cultivo de la noche 50 a 100 veces en 4 ml de YT 2X fresco que contenia los mismos antibióticos y se hizo crecer durante otras 4-6 h. Los extractos celulares fueron preparados como se ha descrito (Varshney y col., J. Biol. Chem., 266:18018-18024 (1991)) y utilizados para las mediciones de las actividades CT y ß-lactamasa. Para minimizar el efecto de cualquier posible variación en el número de copias pRSVpCAT en diferentes transformantes, se normalizó la actividad especifica de CAT a la actividad especifica de la ß-lactamasa en el mismo extracto (Varshney y col., 1991b). Análisis de inmunomanchas de CAT y ß-lactamasa Se utilizó una alícuota de los extractos celulares que contenia 0,2 U de ß-lactamasa para la electroforesis en DSS-gel de poliacrilamida. La electroforesis y la transferencia de proteinas del gel a la membrana Immobilon fueron como se ha descrito (Varshney y col., J. Biol. Chem., 1991b). Para el análisis de inmunomanchas, se utilizó el kit ECL de Amersham Corp. Aislamiento y clonación del gen ValRS de E. coli El gen ValRS fue amplificado a partir del ADN cromosómico de E. coli TGI por RCP, Los cebadores utiliza-dos se basan en la secuencia génica publicada de ValRS (Hartlein y col., 1987) y son CGGAATTCTGCGAAACAAGCTTTGCAGA y ATGAATTCTTTACCATTTTGTATAAGAGA. Se preparó el ADN cromosómico como se ha descrito (Wilson, 1992) . La mezcla (50 µl) para la RCP contenia 0,5 µg de ADN genómico, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, 0,1% de Tritón X-100, MgCl2 2,5 mM, dNTP 0,32 mM, 50 pmol de cada cebador y 1 U de Taq ADN polimerasa. Se hizo la amplificación en un termorregulador Perkin-Elmer a través de 1 ciclo de incubación a 95°C durante 5 min, 55°C durante 40 seg y 72°C durante 4 min, seguido de 30 ciclos de incubación a 94°C durante 1 min, 55°C durante 40 seg y 72°C durante 4 min. Se incubó finalmente la mezcla durante 10 min a 72°C. Se digirió el producto de RCP de ~3,2 kpb con -EcoRI (la secuencia codificante ValRS no tiene un sitio -EcoRI) y se clonó en el sitio -EcoRI del plásmido pACD (Figura 1) . Actividad CAT en células que expresan el ARNt mutante G34C36: efecto de la superproducción de IF2, ValRS, MTF y ValRS y MTE La Tabla muestra la actividad CAT relativa en células que llevan los genes de ARNt iniciador mutante y los genes de CAT mutante. Es interesante el hecho de que la actividad CAT en células portadoras del gen de ARNt iniciador mutante G34G36 y el gen CATV1 .2. 5 es superior (aproximadamente 1,6 veces) a la de las células portadoras del gen CAT de tipo salvaje. La actividad CAT en células portadoras del gen CATV1 .2. 5 y el gen de ARNt iniciador de tipo salvaje en el mismo plásmido era <2% (datos no mostrados). Por lo tanto, la traducción del ARNm CATV1 . 2. 5 depende de la presencia del correspondiente ARNt iniciador mutante G34G36.

La superproducción de valil-ARNt sintetasa (ValRS), metionil-ARNt transformilasa (MTF) o tanto de ValRS como de MTF, lleva a mayores aumentos en la actividad CAT en células portadoras del ARNt iniciador mutante G34G36 (Tabla) . En células superproductoras de ValRS sola, la actividad CAT sube ligeramente. En células superproductoras de MTF sola, la actividad CAT sube aproximadamente 2 veces. En células superproductoras tanto de ValRS como de MTF, la actividad CAT aumenta aún más, de tal forma que la actividad CAT relativa es ahora de cinco a seis veces mayor que en células portadoras del gen CAT de tipo salvaje. La superproducción de IF2 tenia poco efecto sobre la actividad CAT en células portadoras del ARNt iniciador mutante G34G36.

Tabla Efecto de la superproducción de IF2 y MTF sobre las actividades CAT relativas3 en células portadoras de los ARNt iniciadores mutantes G34G36 y G34 a Las actividades CAT relativas mostradas son los valores medios en extractos de diferentes clones y/o diferentes extractos celulares del mismo clon. La actividad CAT relativa en extractos de células portadoras del gen CAT de tipo salvaje ( CAT2. 5) y superproductoras del ARNt iniciador de tipo salvaje es establecida en el 100%.

Los análisis de inmunomanchas en extractos celulares confirman los anteriores resultados y muestran que la mayor actividad CAT en los diversos extractos es debida a mayores cantidades de proteina CAT. Por ejemplo, mientras que los niveles de ß-lactamasa, otra proteina codificada en el mismo plásmido, son aproximadamente los mismos a través de todas las bandas, hay mucha más proteina CAT en algunos de los extractos en comparación con los otros y la intensidad relativa de las bandas corresponde a las actividades CAT relativas en la Tabla. Efecto de la superproducción de ValRS, MTF y tanto ValRS como MTF sobre la aminoacrilación y la formilación del ARNt iniciador mutante G34G36 in vivo Se separó el ARNt total aislado de transformantes CA274 que expresaban el ARNt iniciador mutante G34G36 en un gel ácido de urea-poliacrilamida. Se detectaron las diversas formas del ARNt mutante correspondientes al ARNt desacilado, al aminoacril-ARNt y al formilaminoacril-ARNt por hibridación de "Northern blot" (Varshney y col., J. Biol. Chem., 266:24712-24718 (1991)). Se utilizó una sonda del ARNtTyr endógeno como control interno. En células no superproductoras de ValRS o de MTF, aproximadamente un 50% del ARNt iniciador mutante G34G36 está presente como Val-ARNt (57%) y sólo aproximadamente un 20% está presente como fAal-ARNt (basado en el análisis de fosforoimagen de los datos) . La superproducción de MTF da lugar a conversión de todo el Val-ARNt a fVal-ARNt, mientras que la superproducción tanto de ValRS como de MT da lugar a una conversión esencialmente completa del ARNt iniciador mutante G34G36 en fVal-ARNt . Por lo tanto, existe una correlación directa entre los efectos de la superproducción de ValRS, MTF y tanto ValRS como MTF sobre la actividad CAT en las células por una parte y los niveles de fVal-ARNt por la otra.

Tal como se ha indicado antes, el ARNtTyr endógeno es esencialmente todo aminoacilado en todas las condiciones (Varshney y col., J. Biol. Chem. , 266:24712-24718 (1991)). Actividad CAT en células que expresan el ARNtmutante G34 Se realizaron experimentos similares con el ARNt iniciador mutante G34 y el gen informador CAT11 .2. 5. La tabla muestra que la actividad CAT, en extractos de células que expresaban este ARNt y el gen CAT1 . 1 .2. 5 es aproximadamente la misma que en células que expresan el gen CAT de tipo salvaje. Sin embargo, la superproducción de IF2 o MTF lleva a un aumento de 2 ó 3 veces, respectivamente, en la actividad CAT. Asi, como para los ARNt iniciadores mutantes U35A36 y G34G36, la combinación del ARNt iniciador mutante G34 y el gen CAT1 . 1 .2. 5 produce más proteina CAT que la combinación del gen CAT de tipo salvaje y el gen de ARNt iniciador de tipo salvaje. Los resultados de los análisis de inmunomanchas de los extractos celulares también están de acuerdo con los resultados de los ensayos de actividad CAT. Los resultados del análisis electroforético en gel ácido de urea del ARNt iniciador mutante G34 muestran que, en células superproductoras de MtF, existe un substancial aumento en los niveles de flle-ARNt. Esto está de acuerdo con los datos de la Tabla, que muestran un aumento en la actividad CAT en células portadoras del ARNt iniciador mutante G34 y superproductoras de MTF. Sin embargo, una fracción substancial (aproximadamente un 60%) del ARNt iniciador mutante G34 está aún sin cargar in vivo (en base al análisis de fosforoimagen de un Northern blot; datos no mostrados), lo que sugiere que este ARNt es un substrato pobre para la isoleucil-ARNt sintetasa (IleRS) . Estos resultados implican que la actividad CAT relativa de un 325% en células que expresan el ARNt iniciador mutante G34 y que superproducen MTF (la Tabla) podria estar aumentada incluso más si el ARNt pudiera ser completamente convertido en flle-ARNt por superproducción tanto de IleRS como de MTF. El trabajo descrito en esta Ejemplificación muestra que los genes CAT mutantes con codones de iniciación GUC y AUC producen más proteina CAT en E. coli en presencia de los correspondientes ARNt iniciadores mutantes que el gen CAT con un codon de iniciación AUG (la Tabla) . Estos resultados demuestran que la mayor producción de proteina CAT de una combinación de ARNm CAT mutante y un ARNt iniciador mutante, en comparación con una combinación ARNm CAT de tipo salvaje/ARNt iniciador de tipo salvaje es un fenómeno general y que las proteinas portadoras de aminoácidos distintos de la metionina en su extremo N pueden ser superproducidas en E. coli . Las condiciones necesarias para una mayor producción de proteina CAT in vivo dependen del ARNt iniciador mutante utilizado, (i) con el mutante G34G36, que está aminoacilado con valina, la superproducción de IF2 no tenia efecto. Sin embargo, la superproducción de ValRS y MtF aumenta grandemente la sintesis de proteina CAT (la Tabla) . Esto es debido a que el ARNt mutante G34G36 es un substrato pobre para ValRS . Además, el ARNt aminoacilado con valina es un substrato pobre para MTF en comparación con el ARNt amioacilado con metionina (Giege y col., FEBS Lett., 30:291-295 (1973); Guillon y col., J^ Bacteriol., 174:4294-4301 (1992)). En consecuencia, los niveles de fVal-ARNt in vivo para el mutante G34G36 son bastante bajos, aproximadamente de un 20%. La superproducción de ValRS y MTF convertía todo el ARNt G34G36 en fVal-ARNt y esto explica los mayores niveles de actividad CAT. (ii) Con el ARNt iniciador mutante G34, que está aminoacilado con isoleucina, la actividad CAT en células portadoras de este ARNt mutante aumenta por superproducción de IF2 o MTF. Gran parte de este ARNt está aún sin cargar. Por lo tanto, la superproducción de IleRS, junto con MTF, podria dar lugar a mayores aumentos substanciales en los niveles de CT in vivo , (iii) Con el ARNt mutante U35A36, que está esencialmente todo él aminoacilado con glutamina y formilado in vivo, es necesario superproducir MetRS o IF2 para una mayor sintesis de proteina CAT. Nuestra interpretación del efecto de superproducción de MetRS era que fGln-ARNt era menos activo en la iniciación que fMet-ARNt y que la superproducción de MetRS daba lugar a una aminoacilación parcial de este ARNt con metionina, convirtiéndolo asi en un ARNt iniciador "más activo". De forma similar, el efecto de superproducción de IF2 fue atribuido a que fGln-ARNt era un substrato pobre para la unión a IF2. La superproducción de IF2 probablemente da lugar a una mayor unión de fGln-ARNt a IF2 y, por lo tanto, a su mayor utilización en la iniciación. De este modo, varios factores afectan a la sintesis en E. coli de la proteina CAT utilizando el ARNt iniciador mutante. Éstos incluyen: (i) el grado de aminoacilación y formilación del ARNt, (ii) la actividad del ARNt de formilaminoacilación en la unión a IF2 y/o al ribosima y (iii) el grado de superproducción del ARNt iniciador mutante. La importancia del tercer factor está infravalorada por el hecho de que los dos ARNt mutantes usados en este trabajo producían mucha menor cantidad de otra proteina informadora, la dihidrofolato reductasa, cuando se clonaban en un vector de bajas copias (Pallanck y Schulman, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:3872-3876 (1991)). La dependencia de los niveles de proteina CAT con respecto a los niveles de formilaminoacil-ARNt en las células indica fuertemente que la iniciación es la etapa limitante de velocidad en la traducción del ARNm CAT (Hershey, "Protein Synthesis", En Neidhart y col. (Eds.), Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Amer. Soc.

Microbiology, Washington, DC, Capitulo 40, pp. 613-647 (1987) ) . Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar empleando tan sólo una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones especificas de la invención aqui descrita. Dichos equivalentes pretenden quedar abarcadas por las reivindicaciones siguientes.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE/INVENTOR: (A) NOMBRE: Massachusetts Institute of Techno- logy (B) CALLE: 77 Massachusetts Avenue (C) CIUDAD: Cambridge (D) ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02139 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método de sintesis de proteinas in vivo (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Rey- nolds, P.C. (B) CALLE: Two Militia Drive (C) CIUDAD: Lexington (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: EE.uu. (F) ZIP: 02173 (v) FORMA LEÍBLE DEL ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flotante (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/15204 (B) FECHA DE SOLICITUD: 28 DE AGOSTO DE 1997 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/705.196 (B) FECHA DE SOLICITUD: 29 DE AGOSTO DE 1996 (viii) INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Granahan, Patricia (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32.227 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: MIT-7352 PCT (ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (781) 861-6240 (B) TELEFAX: (781) 861-9540 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 73 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ARNt (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N°: 1: CGCGGGGGGA GCAGCCUGGA GCUCGUCGGG CUCAUAACCC GAAGAUCGUC GGCAAAUCCG 60 GCCCCCGCAA CCA 73 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N°: 2 UUUCAGGAGC UAAGGAAGCU AAAAUGGACA AAAAAACCAC U 41 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N°: 3: UUUCAGGAGC UAAGGAAGCU AAAGUCGACA AAAAAACCAC U 41 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N°: 4: UUUCAGGAGC UAAGGAAGCU AAAAUCGACA AAAAAACCAC U 41 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 5: CGGAATTCTG CGAAACAAGC TTTGCAGA 28 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 6: ATGAATTCTT TACCATTTTG TATAACAGA 29

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de superproducción, en una célula huésped, de una proteina, que se inicia con un aminoácido distinto de metionina, consistente en las siguientes etapas: a) introducción en la célula huésped de: 1) un ADN que codifica para la proteina y que tiene un codon iniciador para un aminoácido distinto de metionina, 2) ADN que codifica para un ARNt iniciador mutante que contiene el correspondiente anti-codon y 3) ADN codificante de metionil-ARNt transformilasa, produciendo asi células huésped modificadas, y b) mantener las células huésped modificadas en condiciones apropiadas para la superproducción de la metionil-ARNt transfor milasa y la expresión del ADN que codifica para la proteina y tiene un codon iniciador para un aminoácido distinto de la metionina, superproduciendo de este modo la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina.
2. 2. El método de la Reivindicación 1, donde la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina se inicia con valina, isoleucina o fenilalanina.
3. 3. El método de la Reivindicación 2, donde la célula huésped es E. coli .
4. 4. El método de la Reivindicación 2, donde la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina es hemoglobina o somatotropina.
5. 5. El método de la Reivindicación 1, que además incluye en (a) la introducción en la célula huésped de ADN codificante de la ami?oacil-ARNt sintetasa apropiada y en (b) el mantenimiento de la célula huésped modificada en condiciones apropiadas para la producción de la ARNt sintetasa apropiada.
6. 6. Un método de superproducción, en una célula huésped, de una proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina, 'consistente en las siguientes etapas: a) introducir en la célula huésped: 1) ADN que codifica para la proteina y que tiene un codon iniciador para un aminoácido distinto de la metionina, 2) ADN que codifica para un ARNt iniciador mutante que contiene el correspondiente anticodon, 3) ADN codificante de metionil-ARNt transformilasa, produciendo asi células huésped modificadas, y 4) ADN codificante de la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada, produciendo asi células huésped modificadas, y b) mantener las células huésped modificadas en condiciones apropiadas para la superproducción de la metionil-ARNt transfor milasa y la aminoacil-ARNt sintetasa apropiada y la expresión del ADN que codifica para la proteina y tiene un codon iniciador para un aminoácido distinto de metionina, superproduciendo asi la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de la metionina.
7. 7. El método de la Reivindicación 6, donde la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina se inicia con valina, isoleucina o fenilalanina.
8. 8. El método de la Reivindicación 7, donde la célula huésped es E. coli .
9. 9. El método de la Reivindicación 7, donde la proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina es hemoglobina o somatotropina.
10. 10. Una proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina producida por el método de la Reivindicación 1.
11. 11. Una proteina que se inicia con un aminoácido distinto de metionina producida por el método de la Reivindicación 6.