MXPA96004199A - Agente biologico para el control de insectos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un baculovirus recombinante para utilizarse como un agente para el control de insectos, que tienen un genoma el cual comprende un gen de polihedrina y un gen heterólogo, el cual expresa una proteína insecticida, en el que el gen de la polihedrina y el gen heterólogo no están bajo el control del mismo promotor y están ubicados en el genoma, de tal manera que la progenie viral producida por un evento recombinante con el baculovirus de tipo silvestre los cuales son viables, no retienen la expresión de ambos del gen de polihedrina y el gen heterólogo.

Description

AGENTE BIOLÓGICO PARA EL CONTROL DE INSECTOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un baculovirus para utilizarse como un agente para el control biológico de insectos y más particularmente con un baculovirus, que comprende un gen heterólogo capaz de expresar una proteína insecticida, el uso del baculovirus para reducir al mínimo la producción de cierta progenie viral y un método para controlar plagas de insectos . Por agente de control biológico de insectos, se entiende un agente el cual cuando se pone en asociación con un insecto, es capaz de infectar el insecto e interferir con los procesos bioquímicos y fisiológicos normales y llevar finalmente a la incapacidad o muerte del insecto. Los baculovirus constituyen uno de los grupos más grandes y más diversos de virus patogénicos de insectos y son utilizados comúnmente como sistemas de expresión poderoso par proteínas heterólogas. Ahora hay gran interés en los baculovirus como agentes para el control biológico de insectos. En particular, el trabajo se está llevando a cabo en mejor el tiempo que el virus toma para destruir a su insecto huésped, por la combinación de la patogenicidad del baculovirus con la acción insecticida de una toxina, hormona, o enzima la cual es activa en los insectos. Un asunto sobre el uso de los baculovirus recombinantes capaces de expresar un producto de gen insecticida heterólogo, para producir niveles aumentados y comercialmente viables de la actividad insecticida, es que los baculovirus recombinantes deben competir con los virus de tipo silvestre y por lo tanto llegan a establecerse dentro del medio ambiente, aún quizá tomando más de las poblaciones del virus de tipo silvestre. Por baculovirus de tipo silvestre, se entienden un baculovirus no recombinante. Por lo tanto se hace énfasis que poniendo los baculovirus recombinantes en desarrollo los cuales no necesitan persistir en el medio ambiente para suministrar un efecto insecticida. Con el objetivo • de reducir a capacidad de supervivencia de los baculovirus recombinantes utilizados como diversos insecticidas, se han propuesto sistemas más o menos complejos. Cada una de estas propuestas tiene desventajas potenciales. Por ejemplo, Miller et al (Biotechnology for Crop Protection, 1988, Ed. Hedin et al, pp 405) propusieron que los baculovirus recombinantes seguros, efectivos pueden ser producidos por el método de co-oclusión. En este método, los baculovirus recombinantes, los cuales por sí mismos carecen de la capacidad para expresar el gen de la polihedrina necesario para la producción de los cuerpos de oclusión requeridos para proporcionar estabilidad ambiental, son propagados en infecciones mezcladas con virus de tipo silvestre, los cuales proporcionan la proteína de polihedrina. Se producen polihedras que contienen ambas de las partículas del virus recombinante y del virus del tipo silvestre. La idea detrás de esta propuesta fue que el proceso de oclusión proporcionaría un método para suministrar un baculovirus polihedrina menos (pol~) es decir carece del gen de la polihedrina funcional, para el campo en una forma infecciosa. La persistencia de los baculovirus pol~ coocluidos en una población de virus, está determinada por la probabilidad de la co-infección de larvas y células individuales con ambos tipos de virus a medida que el virus se pasa de insecto a insecto: Las pruebas de campo limitadas de las características de supervivencia de las poblaciones de virus co-ocluidos han sido reportadas por Wood et al (véase la revisión general - Annu. Rev. Microbiol. (1991), 45, p69-87, en particular la página 83) . Quizá los más sorprendente que se encontró fue la velocidad de disminución lenta de los genomas deficientes de polihedrina de la población de baculovirus . Desde un punto de vista de producción, la preparación de las poblaciones de virus co-ocluidos, también serán demandas técnicamente, que requieren métodos de infección dobles controlados muy cuidadosamente, y el desecho esencialmente, como una proporción significativa del producto, es inútil con respecto al suministro de un efecto insecticidamente mejorado. Un enfoque alternativo para el uso de la manipulación genética para proporcionar poblaciones de baculovirus, los cuales son genéticamente deficientes en la capacidad para formar polihedra, es para replicar baculovirus los cuales carezcan del gen polihedra funcional en una línea celular/huésped, la cual ha sido manipulada por ingeniería genética para expresar la polihedrina que se pierde. En el uso de las partículas de virus resultantes son activas per os, pero después de la propagación el virus de tipo silvestre no puede producir -la polihedrina o los cuerpos de oclusión. La progenie de tales infecciones tiene muy baja estabilidad y/o poca capacidad infectiva. Las desventajas con este enfoque son (i) que los niveles de polihedrina durante la infecciones de baculovirus natural son muy grandes en el momento de la producción del cuerpo de oclusión y reproducir tales niveles de expresión en líneas celulares, será muy difícil y (ii) que la línea celular/huésped debe llevar el gen de la polihedrina funcional. De esta forma hay una probabilidad significativa de que los eventos de recombinación resultarían en la f* producción de genomas virales, los cuales han retenido la capacidad para producir la proteína insecticida y adquirido la capacidad para fabricar la polihedrina. Una vez liberados en el medio ambiente, tales baculovirus se comportarán como 5 un virus polihedrina más (pol+) manipulado genéticamente, es decir, contiene el gen de la polihedrina funcional. Wood et al (Publicación de Patente Internacional No. 93/22442) sugiere que el suministro de la polihedrina y la capacidad para producir virus ocluidos no siempre es necesaria para producir baculovirus con un alto nivel de actividad per os. Los llamados virus "pre-ocluidos" generados en el núcleo de las células infectadas con virus deficientes en polihedrina se reportan que son oralmente activos y se espera que tengan propiedades de supervivencia limitada de virus no ocluidos. Sin embargo, la realización de este enfoque será dependiente del desarrollo de las técnicas de formulación, las cuales pueden proteger a los viriones "pre- ocluidos" durante un período de tiempo suficiente, que haya una alta probabilidad del insecto de la plaga objetivo encuentre e ingiera el virus en el campo antes de haya sido inactivado. En los cuerpos de oclusión naturales la polihedrina cumple esta función, por lo menos en parte. El genoma del baculovirus es una molécula esférica circular, cerrada de ADN de doble cadena. Las variaciones de la estructura del genoma se han observado dentro de una cepa.

La diferencia en la secuencia de ADN puede ser como resultado de la reduplicación de porciones del genoma, eliminaciones de las secuencias y sustituciones de bases. Las secuencias de ADN reiteradas también se han encontrado dentro de los genomas, por ejemplo se reporta que el genoma de AcMNPV posee cinco regiones las cuales muestra homología del ADN. Ha habido varios reportes de homología intergénica entre los baculovirus. Por ejemplo, el gen de la polihedrina y una región que abarca el gen plO son altamente conservados entre los Virus de la Polihedrosis Nuclear (NPV) que infectan al género Lepidoptera. También se han reportado casos de inserción de secuencias del ADN de la célula huésped dentro del genoma viral. En particular, el ADN celular también se ha reportado que se incorpora en el genoma de dos virus íntimamente relacionados, AcMNPV y Galeria melonela NPV (GmMNPV) . Sin desear unirse a ninguna teoría, se cree que las regiones homologas pueden estar asociadas con tales mutaciones del genoma. Más recientemente, cinco regiones las cuales pueden estar asociadas con la inserción del ADN celular en el genoma de SeMNPV se identificaron. Para una revisión general véase Arif BM "The Structure of the Viral Genome", pg 26-27, en "Current Topics in Microbiology and I munology" - The Molecular Biology of Baculoviruses" , Ed. Doerfler and Bohm.

"- Se contempla que así como también la competición con los virus de tipo silvestre, un problema con la liberación de los baculovirus recombinantes, pueden ser que podrían interactuar con tipos silvestres en casos de 5 recombinación homologa que llevan a baculovirus nuevos. En tales casos de recombinación homologa una región del ADN que ocurre entre dos regiones del genoma, las cuales son homologas con las regiones de un genoma de un segundo virus '""" son transferidas, o intercambiados entre los virus. Aunque cualquiera de los riesgos implicados en la liberación del baculovirus recombinante, podría haberse' evaluado antes de la liberación, la progenie de tales combinaciones con tipos silvestre pueden haber alterado los rangos de huésped del insecto y/o cambiado la virulencia por las plagas objetivo.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un baculovirus recombinante para utilizarse r""-^ como un agente para el control biológico de insectos, que tienen un genoma el cual comprende un gen heterólogo y un gen de la polihedrina, el cual expresa una proteína insecticida, en el que el gen heterólogo y el gen de la polihedrina no están bajo el control del mismo promotor y el gen heterólogo y el gen de la polihedrina están suficientemente separados como para reducir al mínimo la producción de la progenie viral viable de eventos o casos recombinantes con baculovirus ' *" de caso silvestre, el cual retiene la expresión de ambos del gen de la polihedrina y el gen heterólogo. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un baculovirus recombinante para 5 utilizarse como un agente para el control de insectos que tiene un genoma, el cual comprende un gen de la polihedrina y un gen heterólogo, el cual expresa una proteína insecticida, en el que el gen de la polihedrina y el gen heterólogo no están bajo el control del mismo promotor y están ubicados en 10 el genoma de tal manera que la progenie viral producida por un evento recombinante con baculovirus de tipo silvestre, los cuales son viables no retienen la expresión de ambos del gen de la polihedrina y el gen heterólogo. Por viable, se entiende que la progenie no carece 15 de un gen esencial. La presente invención puede describirse mejor con referencia a los siguientes dibujos anexos: La Figura 1 muestra una representación esquemática de un evento recombinante, que implica un virus recombinante 20 de acuerdo con la técnica anterior, en el que F es el virus recombinante de la técnica anterior, B es el virus de tipo silvestre con el cual se recombina, las cruces indican regiones de homología y por lo tanto definen la región de cotransferencia, wh+ indica el gen heterólogo y pol+ indica 25 el gen de la polihedrina.

En F, los genes wh+ y pol+ están en sus posiciones convencionales, es decir los genes son extremadamente juntos. Hay muy poca secuencia entre los genes y por lo tanto muy poca oportunidad de que serán homólogos para otros virus y por lo tanto capaces de actuar como un sustrato para la recombinación. Se apreciará que hay una oportunidad mucho más grande de secuencias homologas que ocurren en cualquier lado de ambos de los genes y de esta forma correspondientemente mucho mayor oportunidad de que ambos genes se moverán juntos como una unidad durante la recombinación. Las Figuras 2 y 3 muestran cada una una representación esquemática de un evento de recombinación que implica un virus recombinante de acuerdo con un aspecto de la presente invención, representado por A y un virus del tipo silvestre C y D respectivamente. Se apreciará que la probabilidad de cotransferencia de ambos de los genes wh+ y pol+ a otro virus por recombinación homologa es mucho menor con el recombinante de la presente invención que con el recombinante de la técnica anterior. La separación de los genes wh+ y pol+ de acuerdo con la presente invención, significa que hay mucho más sustrato entre los genes por los cuales los eventos de recombinación podrían ocurrir y por lo tanto una mayor oportunidad correspondientemente que ambos de los genes wh+ y pol+ no serán transferidos juntos. y.,- Si ocurre la recombinación alrededor de la posición ocupada por el gen wh+ en A, como ee ilustró por la Figura 2, entonces A resultante tendrá dos genes pol+, pero no peligrosos y C resultante tendrá h+, pero su falta del gen 5 pol+ significa que será inválido. Si ocurre la recombinación alrededor de la posición ocupada por el gen pol+ en A como se ilustró por la Figura 3, A resultante tendrá wh+, pero será inválido debido a la falta del gen pol+ y la progenie resultante del virus D no tendrá efectividad. Otra característica de la presente invención, es que si wh+ pol+ son cotransferidos, hay mayor probabilidad de que con la técnica anterior, ese virus al cual son transferidos perderán por lo menos un gen esencial en el proceso y de esta forma estarán menos deshabilitados o aún no viables. Esta situación es particularmente verdadera para la . cotransferencia entre virus relacionados distantemente. Esta situación se muestra esquemáticamente en la Figura 4, en la cual X representa la posición del gen esencial. X está ubicado en diferentes posiciones en el genoma en A y E, de tal manera que la recombinación como se muestra, resultará en la pérdida de X del virus E de tipo silvestre. Intrínsecamente, un virus de acuerdo con la presente invención es: más seguro que un constructo basado en más constructos del tipo silvestre; más seguro con respecto a probables eventos de recombinación; y - directo de producir. De preferencia, por lo menos 10% del genoma del baculovirus debe separar el gen heterólogo y el gen de la polihedrina. Aún de mayor preferencia aproximadamente 12% del genoma separa los dos genes. Esto está ilustrado para facilidad de referencia solamente por la Figura 6. En la Figura 6, la ubicación de la secuencia está reportada con referencia a la escala de unidades de mapa de 0-100. El AcMNPV tiene un genoma de aproximadamente 130/131 kilopares de bases en tamaño. Por lo tanto, de ac erdo con la presente invención, el gen heterólogo y el gen de la polihedrina son de preferencia por lo menos 13 kb, aún de mayor preferencia de aproximadamente 15 kb a aproximadamente 15 kb, separados. Generalmente, los genomas de los baculovirus en el rango de aproximadamente 90 a 200 kb. Por lo tanto se apreciará que las distancias de separación apropiada entre los genes dependerá del baculovirus empleado en la presente invención. De preferencia, el gen de la polihedrina está bajo el control del promotor plO y el gen heterólogo está bajo el control de cualquier otro promotor, por ejemplo el promotor de la polihedrina. Aunque esta es una modalidad preferida, para evitar la duda se podría mencionar que el gen de la polihedrina podría estar en cualquier otra posición en el genoma a parte de su sitio natural y donde no interrumpe un gen esencial. Lo mismo es cierto para el gen heterólogo. También se propone que un recombinante el cual tiene un gen de la polihedrina en la ubicación ocupada normalmente por el gen plO, el cual gen plO está incapacitado o eliminado y puede ser manipulado genéticamente para alojar genes que codifican para proteínas insecticidas en la posición, la cual usualmente podría haber estado ocupada por el gen de la polihedrina, proporciona un solución sencilla para la generación de virus con estabilidad disminuida. Tales virus deficientes plO tienen muchas características las cuales los hacen ambos insecticidas efectivos mientras que aún están genéticamente incapacitados con respecto a los virus del tipo silvestre. De esta forma, de acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, el genoma ha sido modificado para incapacitar o eliminar el gen plO. Los baculovirus de acuerdo con la presente invención, los cuales también carecen del gen plO también se encuentra que tienen las siguientes características: los insectos los cuales están infectados con tal virus producen bajos rendimientos de progenie viral en el momento de la muerte comparado con los insectos infectados en la misma etapa de desarrollo con el virus de tipo silvestre; - la polihedra producida son pequeñas de forma perdida cuando se comparan con la polihedra de tipo silvestre. Son virus que probablemente tengan capacidad de supervivencia reducida; las polihedras sin embargo son tan infecciosas como las polihedras de tipo silvestre significando que la producción aún será correcta. Esta característica de la invención está ilustrada en la Figura 5 (donde Magn = amplificación) . La Figura 5a muestra un baculovirus AcUWl, el cual carece del gen plO. Por comparación con el baculovirus AcUWl pl0+ de la Figura 5b, se verá fácilmente que el polihedrón del baculovirus pl0~ está incompleto. Un racimo de baculovirus AcUWl plO" incapacitados se muestran en la Figura 5c. Esta Figura 5c ilustra que no solamente son las polihedras incompletas, sino que estos baculovirus también pierden los viriones. Nuevamente, los baculovirus incapacitados en la Figura 5c pueden ser comparados con baculovirus no incapacitados, más sanos mostrados en la Figura 5d. Para preparar estas fotografías, las polihedras se fijan en 30% de glutaraldehído en amortiguador de fosfato 0.05 M durante 90 minutos a 4°C, se lavan 3 veces en amortiguador y se posfijan en tetróxido de osmio al 1% en amortiguador de fosfato 0.05 M. Después de la deshidratación e infiltración las muestras se intercalan en resina Spurr (Spurr, 1969) , seccionadas y teñidas en 2% de acetato de uranilo alcohólico durante 15 minutos, seguido por citrato de plomo al 0.2% en hidróxido de sodio 0.1 N durante 5 minutos. Una modalidad preferida de la presente invención está ilustrada en mayor detalle por la Figura 6b, cuya construcción se describe en los siguientes ejemplos. Esta Figura puede ser comparada instructivamente con las características de los baculovirus recombinantes ilustrados en la Figura 6a. La Figura 6a ilustra la ubicación convencional del gen heterólogo, a saber en proximidad cercana al gen de la polihedrina. Varias características preferidas y modalidades de la presente invención, se describirán ahora en mayor detalle. La presente invención se describirá para facilidad de referencia en relación con el uso de una conotoxina como el gen heterólogo, en particular, la conotoxina "King Kong" activa de moluscos y crustáceos (Hillyard et al. (1989) Biochemistry) , esta última designada KK-0 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 16] (Woodward et al. (1990) EMBO J. 9 1015-1020) y dos péptidos relacionados KK-1 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 17] y KK-2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 18] reportado en Conferences Jacques Monod on Toxines Animales (Aussois, Francia) el 24-28 de octubre de 1988. Como se detalla en el Ejemplo 1 siguiente, los péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias reportadas de KK-0, KK-1 y KK-2 (véase la Figura 12) se prepararon y evaluaron por inyección en muestras de Periplanata americana adulta (Orden: Dictyoptera) y larvas de Heliothis virescens y Trichoplusia ni (Orden: Lepidoptera) . Ambas de las preparaciones de KK-0 y KK-1 mostraron actividad que induce la parálisis y/o insecticida distintas en cada una de las especies probadas. También se observa que se hace uso de un gen sintético [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 1] diseñado para codificar una molécula de ARNm, la cual a su vez podría codificar al precursor natural supuesto de la conotoxina "King Kong" (KK-0) : una proteína de 78 aminoácidos, la cual probablemente entre a la ruta de secreción durante la síntesis y pueda ser producida inicialmente como una protoxina, la cual es procesada subsiguientemente para producir KK-0 madura, por lo menos en Conus textile (Woodward et al. (1990) EMBO J. 9 1015-1020) . El gen sintético utilizado para este trabajo, se diseñó sin considerar la secuencia de nucleótidos natural del gen KK-0 de Conus textile. Por el contrario, el gen se diseñó para asegurar que aunque codificó al precursor KK-0 natural, probablemente ambos sean excresados eficientemente en los sistemas de células de ":" insectos y fue conveniente manipular (véanse los detalles en el Ejemplo 2) . Aunque por lo tanto no se utilizó un gen KK-0 natural o ADNc de Conus textile, sin embargo, no hay bases para anticipar que tal secuencia, u otro gen sintético capaz de codificar al precursor KK-0, no podría ser igualmente efectivo en aumentar la velocidad de acción de un huésped baculovirus. El gen sintético (sKK-0) empleado realmente tiene solo 77% de identidad de la secuencia de nucleótidos "*"*" con la secuencia de codificación del ARNm de KK-0 natural.

Otros detalles de esta toxina se dan en la Publicación de Patente Internacional No. WO 94/23047, copendiente. Se apreciará fácilmente por una persona con habilidad en la técnica, que la presente invención es aplicable a otros genes heterólogos que expresan proteínas insecticidas, las cuales están disponibles o las cuales están en desarrollo. Ejemplos de tales genes son los genes que '^" expresan la toxina del escorpión de África del Norte Androctonus australis Héctor (AaIT) y genes que expresan la toxina Tox 34 del acaro picador de la paja Pyemotes tritici (Tomalski MD y Miller LK, Nature, (1991), 352, 82-85). El baculovirus puede ser el virus de la Polihedrosis Nuclear de Envoltura Múltiple de Autoqrapha californica (AcMNPV) o cualquier otra especie viral disponible o desarrollada, la cual es capaz para las técnicas de manipulación o de ingeniería genética. Otros ejemplos incluyen Bo byx mori NPV, Spodoptera exigua MNPV, Galeria mellonella MNPV, Trichoplusia ni MNPV, Choristoneura fumiferana MNPV, Orqyia pseudotsuqata MNPV, Spodoptera frugiperda MNPV, Mamestra brassicae MNPV, el llamado virus del Saltamontes Celery, designado HPV-85-CLMEV, mencionado en la Publicación de Patente Internacional No. WO 90/10387, el llamado virus NC-1 mencionado en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB94/02438 copendiente y Heliothis zea SNPV (Virus de la Polihedrosis Nuclear de una Sola Envoltura) . Cualquier vector de transmisión pol" adecuado para utilizarse junto con la modificación del genoma del baculovirus puede ser utilizada en preparar el agente para el control de insectos de la presente invención. Los ejemplos incluyen pVL1392 y pVL1393. Otros vectores adecuados son conocidos en la técnica. Un plásmido basado en pVL1392 que incorpora la secuencia del ADN de la Figura 7 y la Figura 8 ha sido introducido en Escherichia coli y depositado en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas, Aberdeen UK, bajo el número NCIMB 40540, el 12 de marzo de 1993. Un baculovirus recombinante de acuerdo con la presente invención, puede ser construido de acuerdo con técnicas conocidas. En términos generales un vector de transferencia apropiado se construyó, como se mencionó en lo anterior. Este vector de transferencia contiene secuencias homologas apropiadas para las secuencias de ADN en el genoma viral de tipo silvestre. Por la cotransfección del ADN viral y el vector plásmido, la progenie recombinante se produzcan probablemente debido a la recombinación homologa. Los virus recombinantes entonces pueden ser separados de los virus padres utilizando técnicas convencionales. Varios aspectos preferidos de la invención, se ilustrarán ahora por medio de los siguientes Ejemplos.

EJEMPLO 1 Evaluación Biológica de las Preparaciones Sintéticas de los Péptidos KK-1 v KK-2 "Ring Kong" (KK-0) Las evaluaciones preliminares de la actividad biológica de las preparaciones sintéticas de los péptidos KK-0, KK-1 y KK-2 se preparan en una serie de estudios de inyección utilizando cucarachas adultas (Periplaneta americana : Blattidae: Dictyoptera) y larvas del gusano del brote del tabaco en quinto estadio (Heliothis virescens: Noctuidae : Lepidoptera) . Las proteínas probaron ser insolubles en agua destilada y los amortiguadores acuosos estándar utilizados normalmente para la inyección. KK-0 y KK-1 fueron suspendidos a una concentración de 10 mg/ml en bicarbonato de amonio 0.1 M. Después de la agitación suave durante 1 hora, las suspensiones se filtraron a través de un filtro de 0.2 µm. Una evaluación visual indicó que aproximadamente 50% del producto KK-0 fue solubilizado, mientras que sustancialmente menos del producto KK-1 se disolvió. Esto hace difícil de cuantificar con precisión y comparar los índices de dosis directamente para las proteínas diferentes. Sin embargo, es posible calcular la dosis máxima suministrada. KK-2 fue extremadamente hidrofóbica y se disolvió en DMSO a una concentración de 10 mg del producto sin purificar por ml . Las larvas del gusano del brote del tabaco (TBW) se inyectaron utilizando una jeringa Hamilton de 10 µl adaptada con una aguja de 15 ml calibre 33. Larvas en el inicio del quinto estadio con una . masa corporal promedio de aproximadamente 300 mg, se inyectaron con 1-4 µl de cada tratamiento. Típicamente, hubo por lo menos 5 replicados de cada tratamiento. Las cucarachas macho adultas se inyectaron utilizando una jeringa Hamilton de 50 µl adaptada con una aguja de 15 mm calibre 27. Cada animal recibió una dosis de 1-10 µl de la solución de prueba; la masa corporal promedio fue de aproximadamente 840 mg . Los insectos control se inyectaron con un volumen equivalente del solvente apropiado. Después de la inyección, los insectos tratados fueron mantenidos individualmente en recipientes con un suministro de alimento bajo condiciones controladas. (25°C, 65% de HR) durante hasta 72 horas. Lae observaciones se hicieron periódicamente para checar cualquier sintomatología inusual .

Gusano del brote del tabaco La inyección de ambos de KK-0 y KK-1 en larvas de H. virescene resultó en una "parálisis flácida" característica (Tabla I) . Típicamente, los síntomas se observaron casi inmediatamente después de la inyección con larvas que parecen llegar a estar "narcotizadas". Las larvas afectadas fueron incapaces de estar de pie y/o tomar una etapa coordinada. Además, fueron incapaces de reinvertirse cuando se colocaron sobre su lomo y fueron capaces solamente de movimientos débiles limitados de las partes de la boca y tenazas en respuesta a la estimulación (empujadas suavemente con un palillo de coctel de madera) . En el máximo de la "narcosis", las larvas afectadas fueron limpias y flexibles. Estos efectos fueron relativamente cortos, sin embargo, y la recuperación completa había ocurrido normalmente durante 5-10 minutos después de la inyección. Todas las larvas estuvieron vivas y bien a las 24 horas después del tratamiento (24 HAT) . La inyección de dosis más altas llevan a un aumento en ambas de la severi ad y duración de los síntomas. La sintomatología pareció ser más pronunciada con KK-0. Los efectos anormales no se observaron después de la inyección de la proteína KK-2 en larvas de H. virescens a un solo índice equivalente a una dosis máxima de aproximadamente 10 µg de proteína por larva (es decir, 33 µg de proteína/mg de larva) .

Cucarachas Todas las tres proteínas produjeron efectos distintos y debilitantes en las cucarachas (Tabla II) . En cada caso, la severidad de los efectos aumentó con el volumen de suspensión de proteína inyectada. La inyección de la suspensión de proteína KK-0 en las cucarachas, provocó inicialmente temblor severo seguido por pérdida de coordinación, parálisis y caída. Los efectos se observaron inicialmente en las patas traseras, pero se extendieron rápidamente a la parte media y finalmente a las patas delanteras llevando al colapso del insecto. Otros síntomas incluyeron arqueo dorsal. Los insectos afectados fallaron en recuperarse y fueron sacrificados por 22 HAT. Los insectos inyectados con la proteína KK-1 mostraron sintomatología similar, aunque los efectos parecieron ser ligeramente menos severos a la dosis más baja de 1 µl de suspensión de proteína. Los efectos anormales también se observaron brevemente en insectos inyectados con 2 y 5 µl del péptido KK-2. Los síntomas incluyen arqueo del lomo, aplanamiento de las alas y pérdida del movimiento coordinado y ocurrió a unos pocos minutos de la inyección. Los efectos parecen ser transitorios y los insectos afectados parecen haberse recuperado totalmente a los 20 minutos post -inyección. Sin embargo, todos los animales en esos tratamientos fueron sacrificadoe a 72 HAT. No se registraron síntomas inusuales en insectos tratados con la cantidad más baja (1 µl en volumen) y todos los insectos sobrevivieron y estuvieron bien a 72 HAT. Estas observaciones se confirmaron en experimentos subsiguientes y demostraron que las .proteínas conotoxina tienen actividad insecticida contra las cucarachas y larvas TBW.

EJEMPLO 2 Diseño del Gen Conotoxina King Kong (sKK-0) Sintético Ya que no hay una razón a priori para creer que el uso de codón del gen KK-0 natural sería particularmente ventajoeo para la expresión en células de insectos, se decidió diseñar un gen sintético nuevo (sKK-0) . Esto se lleva a cabo con la ayuda de tal PCGeneMR ( Intelligenetics, 700 East Camino Real, Mountain Vie , California) programas como TRANSL, RESTRI y MUTSITE. Las características del gen sKK-0 fueron que: Se codificó precisamente la secuencia de aminoácidos [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 2] para el propéptido KK-0 descrito por Woodward et al. a través de estudios de clonación de ADNc ((1990) EMBO J. 9 1015-1020) . Los codones utilizados para codificar el propéptido KK-0 se seleccionaron debido a que son favorecidos o, al menos, encontrados frecuentemente en insectos (Drosophila melanogaster) y levadura (Caccharomyces cerevisiae) ya que se anticipó que los estudios de expresión también debían llevarse a cabo posteriormente en un organismo (Ashburner et al. (1984) Develop. Genetics 4 295-312; Ikemura (1985) Mol .Biol.Evol. 2 13-34; Sharp (1986) Nucleic Acids Research 14 5125-5143) . La secuencia de nucleótidos que precede inmediatamente el codón de inicio de la traducción (ATG) acopla íntimamente la secuencia preferida para los ARNm de animales definidos por Kozak ( (Kozak (1981) Nucleic Acids Research 9 5233-5252; Kozak (1984) Nucleic Acids Research 12 857-873; Kozak (1986) Cell 44 283-292; Kozak (1987) J. Mol. Biol. 196 947-950). Sin tomar en cuenta ninguno de los codones utilizados por Conus textile para codificar al propéptido KK-0. (Como resultado la homología total de sKK-0 y los genes KK-0 naturales es solamente del 77.2%). Los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción de flanqueo (hacia arriba de BglII y hacia abajo de XmalII y BamHI) se incorporaron en el diseño para facilitar la clonación directa en el vector de transferencia de baculovirus elegido inicialmente pVL1392 (Invitrogen Corporation, 3985 Sorrento Valley Boulevard, San Diego, California) . La clonación con estas enzimas se espera que resulte en el potencial para transcribir el gen directamente del promotor de la polihedrina AcMNPV llevado por este vector de transferencia (véase la Figura 10) . Varios sitios de la secuencia de reconocimiento de hexanucleótido única, adicional se incoporaron en la secuencia sKK-0 en las posiciones en todo el gen, pero sin afectar la secuencia de aminoácidos codificada. Estos sitios estuvieron incluidos para facilitar la caracterización recombinante y las subsiguientes manipulaciones posibles del gen (véase el Ejemplo 14) . Ninguno de los sitios incorporados pudo resultar en la inclusión de codones desfavorables particularmente.

La secuencia sKK-0 resultante [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 1] se muestra en la Figura 7, subrayando la secuencia de codificación para el propéptido KK-0 y en la Figura 8, subrayando la posición de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción.

EJEMPLO 3 Síntesis de un Gen sKK-0 La estrategia seleccionada para el montaje del gen sKK-0 implicado en la síntesis de traslapar oligonucleótidos complementarios que codifican para el fragmento de ADN mostrado en las Figuras 7 y 8 seguido por la ADN polimerasa mediada por el término de las regiones de una sola cadena y de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar cantidades abundantes del fragmento del gen completo (véase la Figura 9) . De esta forma los 4 oligonucleótidos (ConoA, ConoB, ConoC, ConoD) [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 3, 4, 5, 6], los cuales juntos codifican al fragmento de ADN sKK-0 completo, se sintetizaron por métodos estándar en un Sintetizador de ADN 380B de Applied Biosystems. Dos oligonucleótidos más cortos adicionales, ConoPCRl & ConóPCR2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 7, 8] los cuales son idénticos a los 2(> nucleótidos 30 y 28 5' de ConoA y ConoD también se sintetizaron para utilizarse como iniciadores de la PCR. Cada oligonucleótido estuvo desprotegido por incubación durante aproximadamente 8 horas a 55° seguido por secado bajo vacío. Entonces se disuelven en 200 µl de amortiguador TE (Tris/HCl 10 mM (pH 8.0), EDTA 1 mM) , las concentraciones se midieron por espectroscopia de UV (1 E^gg unidad/ml equivalente a aproximadamente 20 µg/ml) y se diluye con TE para dar aproximadamente provisiones de 10 µM. Estos se almacenaron a -20°C hasta que se utilizan. Las reacciones de síntesis de sKK-0 consistieron entonces de: 1) Mezclar 5 µl de cada ConoA y ConoB de 10 µM en un tubo de icrocentrífuga de polipropileno cónico de 500 µl junto con 5 µl de dGTP 10 mM, dATP 10 mM, dCTP 10 mM, TTP 10 mM y 5 µl de Kcl 500 mM,- Tris-HCl 100 mM (pH 8.5), MgCl2 15 mM, 0.1% de gelatina, formando hasta 49 µl con agua y agregando 1 µl (5 unidades) de la Taq ADN polimerasa (Perkin/Elmer Cetus) antes de cubrir con una capa con 2 gotas de aceite de parafina ligero (Sigma) . • Entonces el tubo se tapa, se coloca en un Techne PHC-1 Programmable Dri-BlockR y se somete al siguiente ciclo de temperatura: 1.1' @ 94°C 1' @ 55°C 4' @ 73°C 5 veces, seguido por un período de incubación final de 7' @ 73°C. 2) Mezclar 5 µl de cada uno de ConoC y ConoD 10 µM y tratar exactamente como en (1) anterior. 3) Tomando 0.5 µl de los productos de la reacción (1) mezclando con 0.5 µl de los productos de la reacción (2) y 5 µl de los productos de la reacción (1) mezclados con los productos de la reacción (2) . Entonces a cada mezcla se agregan 10 µl de ConoPCRl 10 µM; 10 µl de ConoPCR2 10 µM; 10 µl de KCl 500 mM, Tris-HCl (pH 8.5) 100 mM, MgCl2 15 mM, 0.1% de gelatina; 10 µl de dGTP 10 mM, dATP 10 mM, dCTP 10 mM, TTP 10 mM y luego se forman 99 µl con agua antes de agregar 1 µl (5 unidades) de la .Taq ADN polimerasa (Perkin/Elmer Cetus) y finalmente se cubre con una capa de dos gotas de aceite de parafina ligero. En paralelo, las reacciones control se preparan las cuales carecen de los iniciadores de PCR, productos de la reacción 1 o la reacción 2. Entonces las reacciones se someten al siguiente ciclo de temperatura en el Techne Programmable Dri-BlockR: 1.1' @ 94°C 1' @ 68°C 4 ' @ 73°C 25 veces, seguido por un período de incubación final de 7' @ 73°C. La electroforesis en gel de agarosa, analítica en alícuotas de 10 µl de los productos de la reacción 3 confirmaron entonces que solo en estas reacciones, las cuales habían contenido todos los fragmentos de ADN necesarios y oligonucleótidos habían producido un fragmento de aproximadamente 270 pb. El resto de cada fragmento de ADN entonces se trabaja por extracción con fenol con un volumen igual de fenol saturado con agua (dos veces) y luego un volumen igual de n-butanol saturado con agua (dos veces) antes de la recuperación por precipitación con etanol.

EJEMPLO 4 Montaje de los Vectores de Transferencia Recombinanteß Después de la recuperación, cada uno de los productos de la PCR anterior se somete a la digestión con las enzimas de restricción BglII y EclXI (un isosquisómero de X alII) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. En paralelo aproximadamente 5 µg de un alícuota de pVL1392, un vector de transferencia (AcMNPV) (InVitrogen) baculovirus disponible comercialmente, se trata en forma similar. Los digeridos de restricción entonces se corre en un gel de electroforesis de Tris-acetato/agarosa a 0.8% preparativa, que contiene 0.5 µg/ml de bromuro de etidio. Los productos de la PCR y los fragmentos del ADN vector linearizados, se cortan del gel bajo iluminación de luz UV. Entonces se recuperan por centrifugación a través de lana de vidrio siliconizada y precipitación con etanol. Entonces se mezclan alícuotas del inserto aislado y loe fragmentos del ADN vector, junto con la T4 ligasa en las condiciones amortiguadoras apropiadas (Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Press.) . Las mezclas de ligación entonces se utilizan para transformar las células DH5a competentes por métodos estándar (Sambrook et al. ibid.) . La progenie de las transformantes se seleccionaron por crecimiento durante la noche en placas de agar L que contiene 100 µg/ml de ampicilina. Entonces las transformantes se tamizan para la presencia de secuencias complementarias para el gen sKK-0 por hibridación de colonia en filtros HyBond-N (Amersham International) por procedimientos estándar (Sambrook et al. ibid.) . La sonda de hibridación utilizada fue el oligonucleótido ConoB, el cual había sido 5' fosforilado por tratamiento con g32P-ATP (Amersham International) y la T4 polinucleótido cinasa (Northumbria Biologicals Ltd.) . El ADN plásmido se preparó a partir de seis colonias fuertemente hibridantes. El análisis de restricción de estos ADN sugirió que tres fueron derivados de pVL1392 que contienen insertos con aproximadamente el tamaño y características esperadas para sKK-0. La secuencia de los insertos presentes en los recombinantes pVL1392 seleccionados (#2.2, #5.2 & #6.1) se verifica entonces utilizando el equipo SequenaseMR (USB, Cleveland, Ohio) y dos iniciadores oligonucleótidos (pVL1392FOR y pVL1392REV) [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 13, 14] diseñada para hibridar a las regiones de flanqueo pVL1392 de los sitios de reconocimiento BglII y XmalII y para permitir la secuenciación de cualquier inserto introducido entre estos sitios (véase la Figura 10) . La secuencia del inserto [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 15] en una de las tres recombinantes (#2.2) acopló precisamente con aquella esperada par sKK-0 clonada en la forma esperada (véase la Figura 11) . Los otros plásmidos tuvieron insertos con variaciones de la secuencia menores (mutaciones) . El recombinante #2.2, un derivado del vector de transferencia pVL1392 que contiene el gen sKK-0 bajo el control transcripcional del promotor, de la polihedrina AcMNPV, por lo tanto se seleccionó para todos los estudios subsiguientes. Un cultivo de E. col i DH5a que lleva el plásmido recombinante pVL1392/sKK- 0 #2.2 ha sido depositado 3] en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas, Aberdeen, UK como el número de depósito NCIMB 40540.

EJEMPLO 5 Generación del AcMNPV Recombinante (Polihedrina Menos) que Lleva sKK-0 Utilizando técnicas de baculovirus estándar, como se describió por ejemplo en King & Possee (1992) "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide" (Chapman & Hall) , el virus AcMNPV recombinante que lleva sKK-0 bajo control transcripcional del promotor de la polihedrina, pero parece de un gen de polihedrina funcional, se generaron por co-transfección de células Sf21 con aproximadamente 200 ng. Saúl (Boehringer, Mannheim) linearizó AcMNPV. lacZ (Possee & Howard (1987) Nucleic Acids Research 15 10233-10248) y 1 µg de pVL13992/sKK-0 #2.2 ADN. La selección del virus recombinante inicialmente se basó en la incapacidad del virus lacZ- recombinante para metabolizar X-gal (GIBCO/BRL, Grand Island, New York) en placas generadas en un cultivo de monocapa de células Sf21. Seis de tales virus lacZ- ("CONO-A", "CONO-B", "CONO-C", "CONO-D", "CONO-D" y "CONO-E") se cosechan y se replaquean en células Sf21 para purificar hasta homogeneidad y confirmar su incapacidad para sintetizar la ß galactosidasa. Un cultivo a pequeña escala (aproximadamente 4 ml) de cada virus purificado se prepara entonces sembrando 1.5 x 106 células Sf21 en 4 ml . Medios de suero de cernerá fetal de TC100/7.5% (ambos de GIBCO/BRL) en un matraz de cultivo de tejido de 25 cm2 (Bibby, Stone, Staffs.)), incubación durante la noche a 28°C, la adición de 50% del virus recuperado por recolección de una sola placa purificada y que continúa la incubación a 28 °C durante otros 6 días. Se tomaron alícuotas de cada uno de estos depósitos de virus para el bioensayo (véase el Ejemplo 6) . Se utilizaron alícuotas en paralelo para separar muestras pequeñas de ADN viral para el análisis físico (King & Possee (1992) ibid.). Los análisis físicos de diagnóstico llevados a cabo con los recombinantes AcMNPV con los esperados sKK-0, fueron: a) Estudios PCR con sKK-0 y, en paralelo, los iniciadores específicos del gen ß galactosidasa. b) El análisis de inmunotransferencia Southern en ADN viral tratado con Clal y BglII, fraccionado por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, se transfiere a filtros HyBond-N y se hibridan con una sonda sKK-0, marcada con a32P-dCTP iniciada aleatoriamente, aislada. Estos estudios confirmaron que el virus "CONO-C" tuvo un gen sKK-0 con todas las características físicas esperadas y careció del gen ß-qalactosidas . Los otros esperado» vLti i recombinantes careo Le fon del en ;?KK-0. 3 EJEMPLO 6 Bioensavo de los Esperados Virus Recombinantes AcMNPV/pVL1392/sKK-0 La actividad biológica de los virus AcMNPV/pVL1392/sKK-0 supuestos se evaluaron en una serie de estudios de inyección utilizando larvas en la última etapa Heliothis virescens. Las alícuotas de los virus no ocluidos purificados se inyectaron en larvas de H. virescens en el cuarto o quinto estadio utilizando una jeringa Hamilton de 10 µl adaptada con una aguja de 15 mm calibre 33. Típicamente, por lo menos 5 larvas se inyectaron por tratamiento con un volumen estándar de 1 µl de volumen de suspensión del virus. Los insectos control se inyectaron con un volumen equivalente del virus AcMNPV/pVL1392/lacZ, el virus de tipo silvestre AcMNPV o agua estéril. Despuée de la inyección, las larvas se mantienen individualmente con una dieta artificial y se examina a intervalos de 24 horas durante otros 7 días. En cada ocasión de evaluación, el número de larvas vivas y muertas se registró. Las larvas que sobreviven se examinan para cualquier sintomatología inusual y/o respuestas del comportamiento. Inicialmente, las alícuotas de seis clonas AcMNPV/pVL1392/sKK-0 supuestas generadas como se describen en el Ejemplo 5 se probaron. Solamente una, AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C presentó efectos inusuales. Lae observaciones biológicas confirmaron los análisie físicos descritos en el Ejemplo 5, lo cual indica que solamente el virus CONO-C portó el gen sKK-0 con todas las características físicas esperadas. Otros ensayos de inyección para caracterizar las propiedades biológicas de AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C se llevaron a cabo utilizando provisiones tituladas del virus. Comparando los datos de la eficacia biológica de los virus AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C y AcMNPV/pVL1392/lacZ contra larvas en el inicio del cuarto estadio de H. virescens se presentan en la Tabla III. A las 72 horas después del tratamiento (72 HAT) , 4/11 larvas tratadas con el AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C mostraron' ya sea parálisis completa o parálisis flácida .parcial . Las larvas clasificadas como "totalmente paralizadas" estuvieron moribundas: incapaces de pararse, de voltearse o caminar y capaces solamente de movimientos muy débiles de las partes de la boca y las tenazas en respuesta a la estimulación. Las larvas "parcialmente paralizadas" mostraron parálisis local de las regiones media y posterior del cuerpo, aunque la región anterior que incluye la cabeza y las partes de la boca pudieron responder normalmente a la estimulación. Estas larvas pueden voltearse cuando se colocan sobre sus lomos y fueron capaces de locomoción limitada aunque los movimientos fueron muy lentos y poco coordinados. A 96 HAT, todas las larvas tratadas con el virus AcMNPV/pVL1392/eKK-0 CONO-C estuvieron ya sea muertas o mostraron sintomatología anormal. Por el contrario, todas las larvas inyectadas con el virus control AcMNPV/pVL1392/lacZ estuvieron vivas y se comportaron normalmente a 96 HAT; 1/10 de estas larvas habían muerto a 120 HAT y 6/10 larvas habían muerto a 144 HAT. Los derivados de AcMNPV/pVL1392 que llevan el gen lacZ tienen velocidad más lenta de muerte que el virus de tipo silvestre. Típicamente, AcMNPV de tipo silvestre comienza a provocar mortalidad significativa a 120 HAT y más. De esta forma, se puede concluir que el constructo AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO-C tiene una velocidad más rápida de acción y por lo tanto un efecto insecticida aumentado que ambos de los virus del tipo silvestre AcMNPV y el virus control AcMNPV/pVL1392/lacZ .

EJEMPLO 7 Montaje de los Vectores de Transferencia Recombinantes pAcUW21/sKK-0 Con el objetivo de preparar derivados AcMNPV/sKK-0 recombinantes (ocluidos) polihedrina+, los cuales podrían ser infecciosos per os y por lo tanto capaces de una evaluación realista para los efectos dosis-respuesta y para la 3(. "*" evaluación paia los efectos esperados de los cultivos, se eligió inicialmente emplear el vector de transferencia pAcUW21 (AMS Biotechnology (UK) Ltd.). Este vector de transferencia es un derivado sencillo (Possee R.D., 5 comunicación personal) del vector de transferencia pAcUW2b utilizado previamente con éxito para preparar los virus recombinantes capaces de suministrar un efecto biológico acelerado, debido a la expresión de los genes de la toxina selectivos del insecto bajo el control del promotor tardío plO poderoso (Stewart et al. (1991) Nature 352 85-88; McCutchen et al. (1991) Biotechnology 9 848-852). Para liberar un insecto sKK-0 adecuado para la introducción en pAcUW21 una alícuota de 20 µg del ADN plásmido pVL1392/sKK-0 #2.2 se somete a digestión con las enzimas de restricción EcoRI y BglII. En paralelo, una alícuota de 10 µg del ADN vector de transferencia pAcUW21 se trató en forma similar. Los digeridos por restricción entonces se corren en gel de electroforesis de 1% de agarosa/Tris-acetato preparativo, que contiene 0.5 µg/ml de bromuro de etidio. El inserto sKK-0 liberado (aproximadamente 282 pares de bases) y luego el ADN vector linearizado se corta del gel bajo iluminación de luz UV. Entonces se recuperaron por centrifugación a través de lana de vidrio siliconizada y precipitación con etanol.

Las alícuotas del inserto sKK-0 aislado y los fragmentos del ADN vector pAcUW21 se mezclaron, junto con la T4 ligasa en condiciones amortiguadoras apropiadas (Sambrook et al. (1989) en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press) ) . Las mezclas de ligación se utilizaron entonces para transformar células DH5a competentes por métodos estándar (Sambrook et al. ibid.) . Las transformantes progenie se seleccionaron por crecimiento durante la noche en placas de agar L que contienen 100 µg/ml de ampicilina. El ADN plásmido se preparó a partir de seis colonias recombinante supuestas. El análisis de restricción de estos ADN sugirió que todos los seis derivados fueron pAcUW21 que contienen insertos con el tamaño y características esperadas para sKK-0. La secuencia de los insertos presentes en dos de las seis recombinantes anteriores (#A1 & #A2) se checan entonces utilizando un equipo SequenaseMR (USB, Cleveland, Ohio) y dos iniciadores oligonucleótidos sintéticos diseñados para hibridar al inserto sKK-0. La secuencia de los insertos de ambas clonas se acoplaron precisamente como se esperaba para sKK-0 clonado en la forma destinada. El recombinante #A1 , un derivado del vector de transferencia pAcUW21 que contiene el gen sKK-0 bajo el control transcripcional del promotor AcMNPV plO, por lo tanto ¡ seleccionó para estudios tiubs Lquientes . Kn e vector de •v-- ti ansferencia recombinante también posee el gen de la polihedrina AcMNPV intacto bajo el control del promotor de la polihedrina natural.

EJEMPLO 8 Generación de AcMNPV Reco binante (Polihedrina Más) gue Lleva un Promotor plO/Unidad de Expresión del Gen sKK-0 Las técnicas de baculovirus estándar (King & Possee (1992) "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide" (Chapman & Hall)) se utilizaron para generar derivados de AcMNPV (ocluidos) polihedrina+ que llevan el gen sKK-0 bajo el control transcripcional del promotor plO. Esto se realizó por cotransfección de las células Sf21 con 200 ng. Saúl (Boehringer Mannheim) linearizó a AcMNPV. lacZ (Possee & Howard (1987) Nucleic Acids Research 15 10233-10248) y 1 µg pAcUW2l/sKK-0 recombinante #A1 ADN. Los virus AcMNPV/sKK-0 recombinantes candidatos se seleccionan entonces por purificación en placa en monocapas de células Sf21 (King & Possee (1992) ibid.) tamizando inicialmente para la incapacidad de los virus para metabolizar X-gal (GIBCO/BRL, Grand Island, New York) y la capacidad para producir polihedra (cuerpos de oclusión viral) como se estima por microscopía. Seis de tales virus lacZ (AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1, AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #2, AcMNPV/pAcUW2l/sKK- O #3, AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #4, AcMNPV/pAcUW2l/sKK- O #5 y AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #6) se cosechan. Un segundo ensayo en placa se realiza entonces con lae seie clonae anteriores en monocapas de células Sf21 para purificarlos hasta homogeneidad y confirmar su incapacidad para sintetizar ßgalactosidasa y su capacidad para producir polihedra. Cultivos a pequeña escala de cada virus purificado se preparan entonces como se describe en el Ejemplo 5. Alícuotas de cada uno de estos depósitos de virus se toman para el bioeneayo (véase el Ejemplo 9) . Se utilizaron alícuotas paralelas para preparar muestras pequeñas del ADN viral para el análisis físico. Los análisis de inmunotransferencia Southern se realizaron en los ADN virales AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 esperados. Estos ADN se tratan con: (a) HindIII y (b) EcoRI y BamHI, fraccionados por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, se transfieren a filtros Hybond-N y se hibridan con una sonda sKK-0 marcada con ar32P-dCTP, iniciada aleatoriamente, aislada. Estos estudios confirmaron que los virus AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #1, AcMNPV/pAcUW2l/eKK-0 #4 y AcMNPV/pAcUW21/eKK-0 #5 contienen cada uno un gen sKK-0, con todas las características físicas anticipadas, carecieron del gen de ß-galactosidasa y produjeron partículas de virus polihedrina+ . El virus AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1 ee eeleccionó para todos los estudios subsiguientes.

EJEMPLO 9 Bioensayo del Virus Recombinante AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 Esperado Las propiedades biológicas de los virus AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 supuestos, se evaluaron en una serie de estudios de dosificación por inyección y oral contra H. virescens. Los ensayos de inyección utilizaron depósitos o provisiones de virus no ocluidos, purificados se llevaron a cabo utilizando el método descrito en el Ejemplo 6. Las pruebas de dosis oral con polihedra purificada se llevan a cabo utilizando una versión modificada del método de alimentación por gota para larvas recién nacidas desarrollado por Hughes and Wood ((1981) J. Invertebr. Pathol. 37, 54).

Estudios de inyección preliminares en los seis virus AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 supuestos generados como se describió en el Ejemplo 8, indicaron que solamente tres clonas (AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #1, #4 y #5) llevaron el gen sKK-0. Algunas de las larvas tratadas con estos virus presentaron .síntomas anoi ales, loe cuales paiecieron inicialmente ser análogos para aquellos observados en insectos tratados con el virus AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 CONO-C. Estudios subsiguientes en AcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #1, sin embargo confirmaron que estos efectos "anormales" fueron generalmente poco definidos y no debilitantee particularmente y queAcMNPV/pAcUW2l/sKK-0 #1 no mostró ventaja notable sobre AcMNPV de tipo silvestre en términos de velocidad de acción o efecto insecticida. Los estudios de dosis oral comparando la eficacia biológica de AcMNPV/pAcUW21/sKK-0 #1 y AcMNPV de tipo silvestre confirmaron estas observaciones.

EJEMPLO 10 Preparación de AcUWl-PH ADN para la Generación de AcMNPV Recombinante En luz del diferente comportamiento de los derivados de AcMNPV polihedrina menos, en los cuales el gen sKK-0 se expresó a partir del promotor de la polihedrina (Ejemplos 4, 5 y 6) cuando se comparan con los derivados AcMNPV polihedrina más, en los cuales el gen sKK-0 se expresó a partir del promotor plO (Ejemplos 7, 8 y 9) , se decidió construir un derivado polihedrina más en el cual el gen sKK-0 se expresó a partir del promotor de polihedrina para establecer si la eficacia insecticida mejorada podría ser lograda con el promotor de polihedrina/unidad de expresión sKK-0 pero no con el promotor plO/unidad de expresión sKK-0. El virus seleccionado como un recipiente para el promotor de polihedrina/unidad de expresión sKK-0 fue AcUWl -PH (véase Weyer et al. (1990) J. Gen. Virol. 71 1525-1534 y la Figura 6) . Este virus porta un promotor plO/unidad de expresión del gen de la polihedrina en el sitio ocupado por el gen plO en AcMNPV de tipo silvestre y un promotor de polihedrina/unidad de expresión del gen indicador lacZ en la ubicación normalmente ocupada por el gen de la polihedrina. Por lo tanto, formaran placas en una monocapa de células Sf21, las cuales contienen las células que portan los cuerpos de oclusión AcMNPV y con tinción azul en presencia del indicador X-Gal (GIBCO/BRL,. Grand Island, New York) . El reemplazamiento del promotor de la polihedrina/unidad de expresión lacZ con el promotor de la polihedrina/unidad de expresión sKK-0 del vector de transferencia recombinante pVL1392/sKK-0 #2.2 fue por lo tanto anticipada para ser un medio conveniente de preparación de un derivado de AcMNPV polihedrina más que porta un promotor de polihedrina/unidad de expresión del gen sKK-0. Una provisión de virus AcUWl -PH de título desconocido fue proporcionada amablemente por el Dr. R. D. Possee (NERC Institute of Virology and Environmental Microbiology , Mansfield Road, Oxíord) . Lo;; cultivos de amplificación a pequeña escala de este virus entonces se prepararon sembrando 3 lotes de 1.5 x 106 células Sf21 en 4 ml . TClOO/medio de suero de ternera fetal al 10% (ambos de GIBCO/BRL) en matraces de cultivo de tejido de 25 cm2 (Bibby, Stone, Staffs.), incubación durante la noche a 28°C, seguido por la adición de 50 µl, 5 µl y 5 µl de alícuotas de una dilución 1/10 del virus de provisión a un matraz y se continúa la incubación a 28°C durante otros 6 días. Estas amplificaciones a escala pequeña se titularon utilizando la técnica de ensayo de placa estándar (King & Possee (1992) "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide" (Chapman & Hall) ) . Todas las placas obtenidas tuvieron los cuerpos de inclusión y se tiñeron de azul en presencia de X-Gal. La provisión de virus producida a partir de 50 µl iniciales de cultivo de entrada tuvieron un título de 2.3 x 107 pfu/ml y se utilizaron para producir cultivos de provisión giratorios de 200 ml, más grandes de AcUWl-PH, a partir de los cuales las provisiones purificadas del virus y el subsiguiente ADN viral se prepararon por métodos estándar (King & Possee (1992) ibid. & Possee & Howard (1987) Nucleic Acids Research 15 10233-10248) . Una provisión del ADN AcUWl- PH linearizado se prepara entonces por digestión de 3 µg de ADN viral con Saúl (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, ya que esta enzima desdobla solamente dentro del gen ß-galactosidasa, como con AcMNPV. lacZ, esto fue anticipado que es un procedimiento el cual podría facilitar la producción y detección de la progenie AcMNPV recombinante (King & Possee (1992) ibid.).

EJEMPLO 11 Generación de AcMNPV Recombinante (Polihedrina Más) que Porta un Promotor de la Polihedrina/Unidad de Expresión del Gen sKK-0 Utilizando las técnicas de baculovirus estándar (King & Possee (1992) ibid.), los virus AcMNPV que portan sKK-0 bajo el control transcripcional del promotor de la polihedrina, con un gen de la polihedrina activo, entonces se genera utilizando el ADN del virus AcUWl -PH linearizado con Saúl como un recipiente para el promotor de la polihedrina/módulo de expresión sKK-0 a partir de pVL1392/sKK-0 #2.2. Esto se realizó por cotransfección de las células Sf21 con 200 ng. El ADN AcUWl-PH linearizado con Saúl preparado como se describió en el Ejemplo 10 y 1 µg de pVL1392/sKK-0 #2.2 ADN. Utilizando la técnica de ensayo en placa, donde los virus generan placas en el cultivo de monocapa de células Sf21, los virus recombinantes se seleccionaron tamizando inicialmente los virus los cuales carecen de la capacidad para metabolizar X-gal (GIBCO/BRL, Grand Island, New York) pero retuvieron la capacidad para producir cuerpos de inclusión (polihedra) . Seis de tales virus lacZ- (AcUWl-PH/KKO #1, AcUWl-PH/KKO #2, AcUWl-PH/KKO #3, AcUWl-PH/KKO #4, AcUWl-PH/KKO #5, AcUWl-PH/KKO #6) se cosechan. Entonces se realiza un segundo ensayo en placa con cada una de las seis clonas anteriores en Sf21 para purificarlos hasta homogeneidad y confirmar su incapacidad para sintetizar ßgalactosidasa y su capacidad para producir polihedra. Los cultivos a escala pequeña de cada virus purificado se preparan entonces por los métodos descritos en el Ejemplo 5. Las alícuotas de cada uno de estos depósitos de virus se toman entonces para el bioensayo (véase el Ejemplo 12) . En alícuotas en paralelo de los depósitos de virus a pequeña escala se utilizaron- para preparar muestras pequeñas del ADN viral para el análisis físico. El análisis de inmunotransferencia Southern se realizó en los ADN virales AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 esperados. Estos ADN se tratan con BglII y Bscl (un isosquisómero de Clal) , se fracciona por electroforesis en un gel de agarosa al 1.4%, se transfiere a filtros Hybond-N y se hibridan con una sonda sKK-0 marcada con a32P-dCTP, iniciada aleatoriamente, aislada. Estos estudios confirmaron que los virus AcUWl -PH/sKK-0 #2, AcUWl-PH/eKK-0 #4, AcUWl -PH/sKK-0 #5 y AcUWl -PH/sKK-0 #6 contienen cada uno un gen sKK-0, con 4 b todas lae características físicas anticipadas, carecieron del gen de ß-galactosidasa y produjeron partículas de virus polihedrina+ . El virus AcUWl-PH/sKKO #2 se seleccionó para los estudios subsiguientes.

EJEMPLO 12 Bioensayo del Virus Recombinante AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 Esperado La eficacia biológica de los virus recombinantes AcUWl-PH/pVL1292/sKK-0 supuestos, se evaluaron en una serie de estudios de dosis de inyección y oral contra larvas de Heliothis virescens. Los ensayos de inyección con depósitos del virus no ocluidos, purificados se llevan a cabo purificando los métodos descritos en el Ejemplo 6. Los estudios de dosis oral con polihedra purificada se llevan a cabo utilizando una versión modificada del ensayo de alimentación con gota descrito en el Ejemplo 9. Los estudios de inyección preliminares comparando la actividad biológica de seis virus AcUWl-PH/pVL1292/sKK-0 supuestos, generados como se describió en el Ejemplo 11, indicaron que solamente los virus AcUWl-PH/sKK-0 #2, AcUWl-PH/sKK-0 #4, AcUWl -PH/sKK-0 #5 y AcUWl - PH/sKK- 0 #6 deben tener un efecto insecticida aumentado comparado con el virus del tipo silvestre. El AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 #2 se seleccionó para ampliación a escala y otra caracterización. Los datos del ensayo de inyección indicaron que las larvas tratadas con el virus AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 #2 demostraron sintomatología normal de adelantada de 72 HAT (Tabla IV) . Por 96 HAT la mayoría de las larvas murieron y solamente el sobreviviente estuvo paralizado. Todas las larvas murieron por 144 HAT. Por el contrario, no se observaron efectos anormales en las larvas tratadas con AcMNPV de tipo silvestre hasta 120 HAT cuando 50% de las larvas murieron; 100% de mortalidad se registró para AcMNPV de tipo silvestre a 144 HAT. Una serie de estudios de dosis oral se llevó a cabo para comparar la eficacia biológica de AcUWl -PH/pVL1392/sKK-0 y AcMNPV de tipo silvestre utilizando polihedra purificada. En todos los casos, el AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 #2 mostró tener una velocidad significativamente más rápida de destrucción que el tipo silvestre y por lo tanto un efecto insecticida mejorado. Las larvas tratadas con el virus AcUWl-PH/pVL1392/sKK-0 empezaron a mostrar síntomas de parálisis y muerte desde antes de 72 HAT (Tabla V) . El análisis probit de los datos de dosis-respuesta confirmaron que la velocidad de muerte de AclJW1 - PH/pVLl ? li2/sKK -0 \\ ? fue :; Lqn i t ica¡r Lvamente m. i:¡ rápida qu» • aqueLla de AcMNl'V t ipn s i I ve t re a 72 y ')(> HAT pero que por 120 HAT el virus de tipo silvestre las había atrapado. El baculovirus de la presente invención, puede ser aplicado al insecto o al sitio del insecto de acuerdo con 5 técnicas conocidas o desarrolladas en el arte. De preferencia, el baculovirus se formuló. Cualquiera de la formulación conocida desarrollada puede ser utilizada según sea apropiado. Las formulaciones deben de ser optimizadas para aumentar al máximo, la velocidad de destrucción y de 0 preferencia proteger al baculovirus de la radiación de luz UV. Los baculovirus pueden ser aplicados por aire (particularmente contra plagas en bosques) , por un aspersor de tipo de estallido para cultivos agrícolas o por un equipo 5 de alta presión principalmente para cultivos de frutas y vegetalee. Generalmente se aplican por aspersión en lugar de la formulación en polvo o granulo, los polvos humectables son un medio preferido de aplicación. Los adyuvantes, por ejemplo los agentes activos de superficie tales como diseminadores, 0 agentes para la pegajosidad y emulsificadores, bloqueadores de la luz del sol, amortiguadores y también estimulantes del gusto, pueden agregarse. El hecho de que la recombinación homologa haya ocurrido de acuerdo con la pn ente invención, puede .jer '.'» evaLuada ut i L izando métodos convencionales. n p.u t~ Leu Lar , d -*<-» cambio preciso en el genoma viral puede ser investigado utilizando, por ejemplo restricción con endonucleasa o secuenciación. Cualquiera de los cambios en el rango del huésped también pueden ser evaluados utilizando los métodos 5 de bioensayo conocidos. También es posible seguir la preparación genética del virus que utilizan un marcador genómico. Las investigaciones iniciales en el intercambio genético entre los virus tratados por ingeniería genética y otros virus, o aún la adquisición del ADN de la célula huésped, deben mantenerse en el laboratorio en el cual un grupo de larvas es infectado con ambos virus de tipo silvestre y virus recombinante. Las larvas adicionales pueden ser agregadas como representativas de generaciones sucesivas.

Otras investigaciones pueden hacerse utilizando pruebas de campo contenidas. En tales pruebas, las larvas son infectadas en el laboratorio antes de ser introducidas en el campo, donde la población del virus se verifica con el tiempo. 20 Tabla I: Evaluación preliminar de la actividad biológicas de las Reparaciones sintéticas de las proteínas KK-0, KK-1 y KK-2 por inyección en larvas de Heliothis virescens1 Seis larvas en el quinto estadio inyectadas por tratamiento; masa corporal promedio: 300 mg Control: 2 µl de bicarbonato de amonio 0.1 M Tabla II: Evaluación preliminar de la actividad biológica de las preparaciones sintéticas de las proteínas KK-0, KK-1 y KK-2 *>. contra Periplaneta americana1 por inyección.

Cucarachas macho adultas con una masa de cuerpo promedio d? 840 mg. 2 Control: 10 µl, solución de bicarbonato de sodio 0.1M.

Tabla III Evaluación de la eficacia biológica de AcMNPV/pVL1392/sKK-0 CONO C del gen por inyección en laravas de Heliothis virescens6 Ul índice de la dosis = 1.5x104 pfu/larva. 2 3 Control = Agua estéril. FP - Parálisis flacida completa: el insecto está moribundo, no puede permanecer de pie, ni caminar o voltearse y es capaz solamente de movimientos débiles de las partes de la boca y las tenazas en respuesta a la estimulación; cojo y flexible. PP - Parálisis parcial: la parte media/ posterior del cuerpo está parausada parcialmente; la larva aún es capaz de alguna actividad locomotora y puede voltearse pero los movimientos son poco coordinados. 5AF - Afectado: la larva responde lentamente a la estimulación, pero es incapaz/involuntariamente de caminar o alimentarse. 6 Larvas en el cuarto estadio; masa corporal promedio = 100 mg.

Tabla IV: Evaluación de la eficacia biológica de los virus AcU v-PH/pVL1392/ sKK-0 #2 y AcMNPV del tipo silvestre por inyección en larvas6 de Heliothis virescens Ui Dosis ß~ 1x104 pf u/larva Control: Agua estéril FP - parálisis flacida; momoribundos y no permanecen en pie, no se voltean, caminan o responden normalmente a la estimulación; solamente signos de vida indicados por movimientos muy débiles de la s partes de la boca tenazas en respuesta a la estimulación. PP -parálisis parcial; no pueden voltearse o caminar; la parte media y posterior del cuerpo esta completamente inmovilizado pero la porción anterior del cuerpo aún puede moverse y las pro-patas y patas falsas aún pueden ser retiradas en respuesta al estimulo AF - afectada; el insecto puede pararse voltearse y responder normalmente a la estimulación pero es incapaz de la locomoción coordinada Larvas del quinto estadio, masa corporal promedio = 300 mg Tabla V: Evaluación de la eficacia biológica de los virus AcUWl -PH-P /pVL1392/ sKK-0 #2 y AcMNPV de tipo silvestre contra larvas de H. virescens por dosificación oral1.

Tiempo después AcMNPV de tipo silvestre del tratamiento AcUWl -PH/pVL1392/sKK-0#2 (hora) CLa,1 95% C.I . C sa 95% C.I. 96 _ m 6.1x10* 3.3xlO*-1.7xlOr 120 7.6x10* 4.4xl? .9xl07 5.2x10* 2.7?l? .6xl07 144 6.6x10* 3.9x10*- 1.5xl07 4.3x10* 2.3xl? .2xl07 16S 6.6x10* 3.9xl0*-1.5xl0* 4.0x10* 2.2?l0*-1.0xl07 1 Larvas recien nacidas dosificadas utilizando la versión modificada del ensayo alimentación por gotas(Hughes & Wood, 1981); 30 larvas/dosis. 2 ( ) % de larvas paralizadas 3 valores CLM (PIBs/ml de suspensión del virus) calculados utilizando un proceso dosis- respuesta togrt estándar (Ashton, 1972) LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: ZENECA Limited (B) CALLE: 15 Stanhope Gate (C) CIUDAD: Londres (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : WIY 6LN (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: UN AGENTE DE CONTROL BIOLÓGICO (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 18 (iv) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible con una PC IBM (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.25 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 269 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: culona :>onrLUa (i)) TOPOLOGÍA: 1 L na l (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 17..250 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1 TTAGAT ZAA TTCACC ATCAM OOACATX_TATG ATCATCGTGGCC GTG 49 Met Lys Leu Thr Cys Met Met He Val Ala Val 1 5 10 CTGTTCCTCACCGCCtaGAa:trcGCCACTGC^ 97 Leu Phe Leu Thr Ala Trp Thr Phe Ala Uir Ala Asp Asp Pro Arg Asn 15 20 25 GAGGCATCCAftG CTTAACAM CGC TGSTGTAM CñG TCr GGA 193 Glu Ala Ser Lys Leu Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met 45 50 55 TGTAA CTG CTGCACCAGAACTGT TGír GACGGCTACTGTA^ 241 Cys Asn Leu Leu Asp Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys He Val Leu 60 65 70 75 GTG TCC ACC TRGIGACGGC CGGATCCTT 269 Val Cys T r (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 aminoácidos (R) TIPO: aminoácido ([ ) TOPOLOGÍA: 1 Lnßal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2 Met Lys Leu Thr Cys Met Met Le Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Ala 1 5 10 15 Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Pro Arg Asn Gly Leu Gly Asn Leu 20 25 30 Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu 35 40 45 Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp 50 55 60 Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys He Val Leu Val Cys Thr 65 70 75 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 84 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 3 : TTfiGAT TAA TICACCATGA AGCTGACATG TATGATGATC GTOGCCGTGC TGTTCCTGAC 60 CGCCT3GACC TrOGCCACTO C?GA 64 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 89 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 4: GGATGCCTCG GÜGT1 TICA T?U?MJLXi GG GTIGGñG AACAGGTTGC aSGGCCGTT 60 GCGGGGATCG TCTGCAGIGG CGAAGGTCC 89 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 89 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCREPCION DE LA SECUENCIA: SEC. DE EDKNT. NO: ', : CACGAAftTGA AGAACCCCGA GSCATCCAflß CTIAACASGC GCTGGTGTAA GOGrCCGGA 60 GSGAT3IGTA ACCTGCIGGft OTGAACTG 89 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 73 pares de base' (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 6 ABGGATCCGG GCpTCACTAG GTGCSCACCA GCACGATACA GISGCTACfiß TAGCCGTCTG 60 GTCACTAGGT TAC 73 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal iL) Ttí'O DE MOL CULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 7: mw . Tip iaA AritacwG 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 8 AAGGATCCGG CCGTCACTftG GT3CAC 26 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Li) [PO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 9: GATCBGATCT GOGCGGCCG CIOOGAATT CTAGAAGTA CCCGG 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 45 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA. CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 10 GATCCCGGGT ACCTTCiaGA ATTCCGGSGC G<XXECTGCA GATCT 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Li) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 11 : TATAAATATG CCEGATTAT 19 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA. CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC . DE IDENT . NO : 12 TA3AAATATT CCGGATGATT CATaCCGTCC CACCATCGG3 CGCXATCC 49 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ( i i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 13 aüi nu T AAC?S 15 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena' sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 14 aiKi i i' TGAAG " (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 282 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA: cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (LU TLPO DE MOL CULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 15 G3CGCGGATC AGA3CTAKIT OCOTGMG CTGAC TCIA T?ATGATCGr GBS SllSZti *u TTCCTCaCCG CCT33ñCCTr arO GCA G?CGAICCCC GCAACGSCCT G3QCAACC1G 120 TTCICCñACG CTCACCSCGA AATCMGftAC CCCGAGGCAT CCfiAGCrTAA CMGCGCTGG 180 TGEtíGCAGT CCGGñGRGAT GT3XAACCIG OOGACCAGA ACTGTIGTGA GXCTACTGT 240 AT0GIGCT3G TGTGCñCCT? GIGRCGGCCG CTCCfiGAATT CT 282 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 16 Met Lys Leu Tnr Cys Met Met He Val Ala Val Leu Pha Leu Thr Ala 1 5 10 15 Trp Thr Phe Ala Ttir Ala Asp Asp Pro Arg Asn Gly Leu Gly Asn Leu 20 25 30 Phe Ser Asn Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu 35 40 45 Asn Lys Arg Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp 50 55 60 Gln Asn Cys Cys Asp Gly Tyr Cys He Val Leu Val Cys Thr (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 77 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 17 Met Lys Leu Thr Cys Met Met He Val Ala Val'Leu Phe Leu Thr Ala 1 5 10 15 Trp Thr Phe Ala Thr Ala Asp Asp Ser .Ser Asn Gly Leu Glu Asn Leu 20 25 30 Phe Ser Lys Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Lys Leu 35 40 45 Asn Lys Arg Cys He Glu Gln Phe Asp Pro Cys Glu Met He Arg His 50 55 60 Thr Cys Cys Val Gly Val Cys Phe Leu Met Ala Cys He 65 70 75 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 77 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (LL) TIPO DE MOLÉCULA: pépt i-do (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 18 Met Lys Leu Thr Cys Met Met He Val Ala Val Leu Phe Leu Thr Ala 1 5 10 15 Trp Thr Phe Val Thr Ala Aso Asp Ser Gly Asn Gly Leu Glu Asn Leu 20 * 25 30 Phe Ser Lys Ala His His Glu Met Lys Asn Pro Glu Ala Ser Asn Leu 35 40 45 Asn Lys Arg Cys Ala Pro Phe Leu His Pro Cys Thr Phe Phe Phe Pro 50 55 60 Asn Cys Cys Asn Ser Tyr Cys Val Gln Phe He Cys Leu

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un baculovirus recombinante para utilizarse como un agente para el control de insectos que tienen un genoma el cual está caracterizado porque comprende un gen de polihedrina y un gen heterólogo, el cual expresa una proteína insecticida, en el que el gen de la polihedrina y el gen heterólogo no están bajo el control del mismo promotor y por lo menos 10% del genoma .del baculovirus separa al gen de la polihedrina y al gen heterólogo, de tal manera que la progenie viral producida por un evento recombinante con el baculovirus de tipo silvestre, los cuales son viables no retienen la expresión del gen de la polihedrina y el gen heterólogo.

2. El baculovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos una región del genoma, el cual es homólogo a una región del genoma del virus de tipo silvestre, ocurre entre el gen de la polihedrina y el gen heterólogo.

3. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- y 2, caracterizado potque el qen le la pol Lhedr Lúa y o l qen het róLoqo están ubicados <>nt~?e do reqLou» >s do l q?»??eu?a, Las cuales t e Lunes son homologas a las regiones del genoma del virus de tipo silvestre y esta ubicación carece de un gen esencial, el cual está presente entre las regiones homologas en el virus de tipo silvestre.

4. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1' a 3, caracterizado porque el gen de la polihedrina está bajo el control del promotor plO.

5. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el gen heterólogo está bajo el control del promotor de la polihedrina .

6. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el genoma ha sido modificado para incapacitar o eliminar al gen plO.

7. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la separación es de aproximadamente 12°- del qenoma .

8. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el gen de la polihedrina y el gen heterólogo están separados por al menos 13 kilo pares de bases.

9. El baculovirus recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la separación es de aproximadamente 15 kilo pares de bases.

10. El baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque tiene una organización y características genómicas comparables al recombinante mostrado en la Figura 6b.

11. La progenie del baculovirus el cual se deriva de un baculovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

12. El uso de un baculovirus recombinante de conformidad con cualquier reivindicación precedente, para evitar o reducir al mínimo la producción, por eventos de recombinación entre un virus recombinante y un virus de tipo silvestre, de la progenie viral los cuales son viables y retienen la expresión de ambos e Los qenes de la poLihedrina y hetero Luqu .

13. Un método para combatir plagas de insectos en un sitio caracterizado porque se trata las plagas o el sitio con un baculovirus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.