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MX2015002848A - Compuesto novedoso con efectos de trombolisis, depuracion de radical libre y direccionamiento de trombo asi como su metodo de preparacion y uso. - Google Patents

Compuesto novedoso con efectos de trombolisis, depuracion de radical libre y direccionamiento de trombo asi como su metodo de preparacion y uso.

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MX2015002848A
MX2015002848A MX2015002848A MX2015002848A MX2015002848A MX 2015002848 A MX2015002848 A MX 2015002848A MX 2015002848 A MX2015002848 A MX 2015002848A MX 2015002848 A MX2015002848 A MX 2015002848A MX 2015002848 A MX2015002848 A MX 2015002848A
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MX
Mexico
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lys
ala
peptide
compound
binding
Prior art date
Application number
MX2015002848A
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English (en)
Inventor
Ming Zhao
Shiqi Peng
Jiang Xueyun
Original Assignee
Shanghai Lumosa Therapeutics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CN2012103238506A external-priority patent/CN102898505A/zh
Priority claimed from CN2012103238493A external-priority patent/CN102875644A/zh
Priority claimed from CN 201210323951 external-priority patent/CN102898506A/zh
Priority claimed from CN2012103238489A external-priority patent/CN102887941A/zh
Application filed by Shanghai Lumosa Therapeutics Co Ltd filed Critical Shanghai Lumosa Therapeutics Co Ltd
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Abstract

La presente invención describe un compuesto novedoso con efectos de trombólisis, depuración de radicales libres y direccionamiento de trombo, así como un método de preparación y uso de los mismos; el compuesto es un conjugado ternario formado por la conjugación de un péptido trombolítico, un depurador de radical libre y un direccionamiento de trombo/péptido antitrombótico juntos mediante un brazo de unión; la presente invención también describe una composición farmacéutica que contiene los compuestos, en donde los compuestos forman una estructura nanoesférica.

Description

COMPUESTO NOVEDOSO CON EFECTOS DE TROMBÓLISIS, DEPURACIÓN DE RADICAL LIBRE Y DIRECCIONAMIENTO DE TROMBO ASÍ COMO SU MÉTODO DE PREPARACIÓN Y USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un novedoso compuesto simultáneamente teniendo efectos de trombólisis, depuración de radicales libres y direccionamiento de trombos, así como un método de preparación y uso. Además la presente invención se refiere a un conjugado ternario novedoso de "un péptido que comprende una secuencia de PAK/imidazolina/un péptido que comprende una secuencia de RGD" formado al unir un oligopéptido trombolítico formado por una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), l-(4-oxiacetil-fenil)-3,3,4,4-tetrametilimidazolina y un péptido de direccionamiento de trombo/oligopéptido anti-trombo que comprende una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp) mediante un brazo unión que contiene grupos amino y carboxilo. Además la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto anterior para el uso en la depuración de radicales libres NO, trombólisis, direccionamiento de trombo/terapia antitrombo y tratamiento de apoplejía/infarto cerebral. Además la presente invención se refiere a un método para la preparación del compuesto.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Las enfermedades trombóticas ocupan el primer lugar de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Los resultados de trombosis de la arteria coronaria en el infarto de miocardio. La trombosis vascular cerebral conduce al infarto cerebral, es decir, la apoplejía isquémica clínica. Los pacientes con infarto de miocardio pueden ser inyectados por vía intravenosa con los agentes trombolíticos o tienen cirugías de derivación. Cabe señalar que el resultado positivo de la inyección intravenosa de agentes trombolíticos en pacientes con infarto de miocardio es isquemia/reperfusión. Puesto que una gran cantidad de radicales libres NO son generados durante el procedimiento de isquemia/reperfusión, el procedimiento de trombólisis se asocia con daño miocárdico y muerte del paciente. Esto es un grave problema en el tratamiento de trombólisis actual del infarto del miocardio. En la actualidad, el tratamiento del infarto cerebral se enfrenta a problemas más complicados. Por ejemplo, los agentes trombolíticos actuales no todos son capaces de cruzar la barrera hemato-encefálica, y por lo tanto la eficacia de la inyección intravenosa de agentes trombolíticos en pacientes con infarto cerebral es bastante limitada. También, por ejemplo, ningún procedimiento quirúrgico apropiado que podría salvar a los pacientes con infarto cerebral está disponible actualmente. Del mismo modo, incluso si hay un resultado positivo de inyectar por vía intravenosa los agentes trombolíticos en pacientes con infarto cerebral, una enorme cantidad de radicales libres NO puede todavía generarse en el procedimiento de isquemia/reperfusión tal que el procedimiento de trombólisis es asociado con el daño de los tejidos del cerebro y la muerte de paciente. Esto es un grave problema en el tratamiento actual de trombólisis del infarto cerebral. Por otra parte, cuatro graves problemas están presentes en el tratamiento clínico de pacientes con accidente cerebrovascular: 1) ningún medicamento aparte de tPA (activador del plasminógeno de tipo tisular) demuestra eficacia en pacientes con accidente cerebrovascular; 2) tratamiento tPA sólo es eficaz en 3 horas desde el inicio de la apolplejía, es decir, hay sólo una ventana de 3 horas para el tratamiento de tPA; 3) tratamiento de tPA a menudo provoca sangrado sistémico; 4) daño de tejido cerebral en pacientes y muerte del paciente relacionada con la enorme cantidad de radicales libres NO producidos en el procedimiento de isquemia/reperfusión no puede evitarse por el tratamiento de tPA. Por lo tanto es imperativo solucionar estos cuatro problemas para lograr un avance sustancial en el tratamiento clínico de pacientes con accidente cerebrovascular.
Dos compuestos, NQ-(1,3-d¡oxo-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-2-fen¡l-4'-ox¡acetil)-n“-acilo graso-Lys-Arg-Gly-Asp-Val y Na-(l,3-dioxo-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-2-fenil-4'- oxiacetil)-n“-acilo graso-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe, se describen la Publicación de Patente China CN102807604 y CN102807605. Ambos compuestos se derivan de una conjugación de una imidazolina con la actividad de depuración de radicales libres NO con un oligopéptido anti-trombo formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp) través de lisina. A diferencia de los compuestos de la presente invención, estos dos compuestos no tienen un péptido trombolítico unido en el mismo. Estos dos compuestos no tienen una función en la trombólisis y por lo tanto no son adecuados para la fabricación de medicamentos trombolíticos y no es adecuado en el tratamiento de pacientes con accidente cerebrovascular isquémico.
Para solucionar los problemas mencionados, hay una necesidad de un nuevo compuesto simultáneamente con los efectos de trombólisis, depuración de radicales libres y direccionamiento de trombo. Además, es necesario que un nuevo compuesto sea capaz de ser eficaz incluso si se administra después de 3 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular en pacientes, es decir, no está restringido por la ventana de 3 horas como en el tratamiento con tPA; no provoca una respuesta sistémica de sangrado como en el tratamiento de tPA; y puede despejar la tremenda cantidad de radicales libres NO generados durante la isquemia/reperfusión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un conjugado ternario simultáneamente con actividades de cruzado de la barrera sangre-cerebro, trombólisis, anti-trombo y depuración de radicales libres NO, en donde los tres miembros en el conjugado ternario se refieren a una imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO, un péptido con actividad trombolítica y un péptido de direccionamiento de trombo, en donde los tres miembros se unen mediante un brazo de unión adecuado.
Específicamente, el conjugado ternario de la presente invención puede ser representado por el compuesto de la fórmula I: en donde, NN representa un imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO; AAi representa un brazo de unión con al menos tres grupos para la unión; AA2 representa un péptido con actividad trombolítica; y AA3 representa un péptido de direccionamiento de trombo.
La imidazolina utilizada en la presente invención puede incluir radicales ¡midazol nitróxido de nitroxilo (NN), que pueden eliminar el NO y funcionar para eliminar los radicales libres de oxígeno, proporcionando una una protección fuerte para las células dañadas por radicales libres de oxígeno. La imidazolina con actividad de depuración de radical libre NO de acuerdo con la presente invención es preferentemente 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]- 4, 4,5,5-tetrametilimidazolina, que tiene excelente estabilidad química y física y no sólo es adecuado para cualquier reacción química de conjugar un péptido con actividad trombolítica con un péptido de direccionamiento de trombo, pero también no es susceptible a la descomposición durante el almacenamiento, satisfaciendo así los requisitos para las formulaciones.
El brazo de unión utilizado en la presente invención puede componerse de ai menos tres grupos para la unión, por ejemplo, carboxilo y grupos amino, que se utiliza para unir la imidazolina, los péptidos con actividad trombolítica y el péptido de direccionamiento de trombo en conjunto. El brazo de unión según la presente invención puede ser aminoácidos naturales, por ejemplo, L-Lys, L-Asp y L-Glu. Cuando el brazo de unión (AA^ utilizado en la presente invención tiene tres o más grupos para unión, uno o más NN, AA2 o AA3 puede estar unido de tal modo, en donde dos o más NN, AA2 o AA3 pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, cuando AAi tiene cuatro grupos para la unión, un NN, dos AA2 y un AA3 pueden ser unidos de este modo mientras los dos AA2 pueden ser los mismos o diferentes péptidos con actividad trombolítica.
El péptido con actividad trombolítica utilizado en la presente invención puede ser un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia de AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia de KAP (Lys-Ala-Pro), o un péptido con unidades de repetición de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP. Un oligopéptido se refiere a un péptido de moléculas pequeñas con un peso molecular de 1000 Dalton (D) o menos, que se compone generalmente de 3 a 8 aminoácidos. El oligopéptido con actividad trombolítica según la presente invención pueden ser un tripéptido a octopéptido que comprende una secuencia PAK, una secuencia de AKP o una secuencia de KAP, preferiblemente un tripéptido a pentapéptido que comprende una secuencia de PAK, una secuencia AKP o una secuencia KAP. Por ejemplo, puede ser el oligopéptido utilizado para la presente Invención que consta de una secuencia de PAK, una secuencia de AKP o una secuencia de KAP puede ser AKP, RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pro-Ala-Lys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro), AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys) o PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala). Por ejemplo, el péptido que tiene unidades de repetición de la secuencia de PAK, la secuencia de AKP o la secuencia de KAP utilizada en la presente invención puede ser cualquiera de los péptidos descritos en la Publicación de Patente China CN101190941 tal como un péptido con actividad trombolítica, incluyendo un péptido que tiene unidades de repetición de la secuencia de PAK, tal como (PAK)2, (PAK)3, (PAK)4, (PAK)5 y (PAK)6; un péptido con unidades de repetición de la secuencia de AKP, tales como (AKP)2, (AKP)3, (AKP)4, (AKP)5 y (AKP)6; y un péptido con unidades de repetición de la secuencia de KPA, tales como (KPA)2, (KPA)3, (KPA)4, (KPA)S y (KPA)6.
El péptido de direccionamiento de trombo/anti-trombo utilizado en la presente invención puede ser un oligopéptido que contiene una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). Los oligopéptidos que contiene una secuencia de RGD pueden ser un tetrapéptido basado en RGD, como RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV (Arg-Gly-Asp-Val) y RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe). La unión específica de fibrinógeno (Fg) a receptor de glicoproteína de membrana de plaquetas activadas (GP) Hb/IIIa es la vía final común que conduce a la agregación plaquetaria desencadenada por diversos inductores fisiológicas y desempeña un papel importante en la formación del trombo. Además, las secuencias de RGD sirven como sitios activos para la unión de ligandos Fg y los receptores de GPIIb/IIIa activados y tienen una propiedad de direccionamiento de plaquetas activada. Las estructuras que comprenden una secuencia de RGD pueden inhibir competitivamente y bloquear la unión de Fg y receptores de GPIIb/IIIa, evitando así la agregación de plaquetas y formación de trombos, para permitir que un oligopéptido que contiene RGD se convierta en una molécula de direccionamiento de trombo y agente anti-trombo eficaces.
Además, el péptido de direccionamiento de trombo utilizado en la presente invención puede ser cualquiera de los polipéptidos descritos en la Publicación de Patente China CN101190940 como un polipéptido que tiene actividad de direccionamiento y anti-trombo, incluidos los polipéptidos obtenidos de la modificación de la conjugación de un péptido de RGD con un péptido YIGS (Tyr-Gly-Ile-Ser). Los polipéptidos obtenidos por modificación incluyen YIGSRRGDS, YIGSRRGDV, YIGSRRGDF, YIGSRYIGSK, YIGSRYIGSR, YIGSKRGDS, YIGSKRGDF, YIGSKRGDV, YIGSKYIGSK, YIGSKYIGSR, RGDSRGDS, RGDVRGDV, RGDFRGDF, RGDSYIGSR, RGDSYIGSK, RGDVYIGSR, RGDVYIGSK, RGDFYIGSR, o RGDFYIGSK.
En un modalidad preferida, en el compuesto según la presente invención, la ¡midazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetramet¡limidazol¡na, los péptidos con actividad trombolítica es un oligopéptido que comprende una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido que comprende una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). Así, la presente invención proporciona un conjugado ternario de "un péptido que comprende una secuencia de PAK/imidazolina/un péptido que comprende una secuencia de RGD" simultáneamente con actividades en cruzar la barrera sangre-barrera, trombólisis, anti-trombo y depuración de radicales libres NO.
En un modalidad preferida, en el compuesto según la presente invención, la imidazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es l,3-dioxo-2-[(4-oxiacetox¡) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Lys, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido que comprende una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys), y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido que comprende una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). En este caso, el oligopéptido formado por una secuencia PAK puede ser un pentapéptido ARPAK, un pentapéptido GRPAK, un tetrapéptido RPAK o un tripéptido PAK; el oligopéptido que comprende una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp) puede ser un tetrapéptido basado en RGD, tal como RGDS, RGDV o RGDF. Cuando L-Lys se utiliza como el brazo de unión, el compuesto según la invención presente puede ser de la siguiente fórmula general 1-1 o 1-2: - en donde, aaj, y aa2 pueden estar presentes o ausentes, o aaj está presente pero aa2 está ausente; cuando están presentes ambos aax y aa2, aax es R (Arg) y aa2 es G(Gly), A(Ala) o Q(Gln); Cuando aai está presente pero aa2 está ausente, aai es R(Arg); aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe).
Para ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-1, en un ejemplo preferido, el compuesto según la presente invención puede ser un conjugado ternario de ARPAK/imidazolina/RGD representado por la siguiente fórmula 1-1-1; en otro ejemplo preferido, el compuesto según la presente invención puede ser un conjugado ternario de GRPAK/imidazolina/RGD representado por la siguiente fórmula 1-1-2; en todavía otro ejemplo preferido, el compuesto según la presente invención puede ser un conjugado ternario de RPAK/imidazolina/RGD representado por la siguiente fórmula 1-1-3; y aún otro ejemplo preferido, el compuesto según la presente invención puede ser un conjugado ternario de PAK/imjdazolina/RGD representado por la siguiente fórmula 1-1- 4: en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-2, el compuesto según la presente invención puede ser preferentemente de la siguiente fórmula general 1-2-1, 1-2-2, 1-2-3 o 1-2-4: - en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
En otra modalidad, en el compuesto según la presente invención, la ¡midazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es 1,3-d¡oxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Asp, el péptldo con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptldo de dlrecclonamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). Cuando L-Asp se utiliza como el brazo de unión, el compuesto según la presente invención puede ser de la siguiente fórmula general 1-3 o 1-4: En donde aai y aa2 pueden estar presentes o ausentes, o aai está presente pero aa2 está ausente; cuando están presentes aai y aa2, aa! es R(Arg) y aa2 es G (Gly), A (Ala) o Q (Gln); cuando aai está presente pero aa2 está ausente, aa! es R (Arg); aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe). aai es preferentemente R (Arg), aa2 preferentemente es G (Gly) y aa3 es preferentemente V (Val).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-3, el compuesto según la presente invención puede ser preferentemente de la siguiente fórmula general 1-3-1, 1-3-2, 1-3-3 o 1-3-4: . - ' - - en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-4, el compuesto según la presente Invención puede ser preferentemente de la siguiente fórmula general 1-4-1, 1-4-2, RPAK H PAK en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
En otra modalidad, en el compuesto según la presente invención, la imidazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Glu, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). Cuando L-Glu se utiliza como el brazo de unión, el compuesto según la presente invención puede ser de la siguiente fórmula general 1-5 o 1-6: En donde aai y aa2 pueden estar presentes o ausentes, o aai está presente pero aa2 está ausente; cuando están presentes aai y aa2, aax es R(Arg) y aa2 es G (Gly), A (Ala) o Q (Gln); cuando aa! está presente pero aa2 está ausente, aax es R (Arg); aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe). aa! es preferentemente R (Arg), aa2 preferentemente es G (Gly) y aa3 es preferentemente V (Val).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-5, el compuesto según la presente invención puede ser preferentemente de la siguiente fórmula general 1-5-1, 1-5-2, 1-5-3 o 1-5-4: - - en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
Para ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-6, el compuesto según la presente invención puede ser preferentemente de la siguiente fórmula general 1-6-1, 1-6-2, 1-6-3 o 1-6-4: en donde aa3 puede ser S (SRE), V (Val) o F (Phe), preferiblemente V (Val).
En otro aspecto, la presente invención además se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto anterior según la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica según la presente invención comprende el compuesto de la fórmula general anterior 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 o 1-6. Más preferentemente, la composición farmacéutica según la presente invención comprende el compuesto de fórmula general anterior 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 o 1-1-4. Cuando la composición farmacéutica según la presente invención comprende el compuesto del fórmula general 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 o 1-1-4, el compuesto puede estar en forma de una estructura en la composición farmacéutica de dímero, trímero o tetrámero y puede estar en forma de una nanoesfera que tiene un diámetro de 2 a 300 nm. En la composición farmacéutica según la presente invención, la estructura nanoesférica preferentemente puede tener un diámetro de 2 a 100 nm. Es un hecho bien conocido en la nanofarmacología que las nanoesferas con un diámetro de menos de 100 nm son menos propensas a ser engullidas por los macrófagos durante el transporte en la sangre y puede cruzar fácilmente la pared capilar de sangre. Estas propiedades permiten que el compuesto según la presente invención cruce la barrera hemato-encefálica. La composición farmacéutica según la presente invención puede ser utilizada como un fármaco trombolítico en el tratamiento de enfermedades tal como el infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico, trombosis venosa profunda, embolismo pulmonar, enfermedad arterial periférica oclusiva, dispositivos de acceso vascular central ocluida, fístula arteriovenosa coagulada y derivaciones y estenosis carotídea. La composición farmacéutica según la presente invención también puede usarse como un fármaco de depuración de radicales libres NO en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedades de la neurona motora, esclerosis lateral amiotrófica, perdida de audiencia debido al ruido, enfermedad de Lou Gehrig o enfermedad de Huntington; en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, tales como la aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria o infarto de miocardio; en el tratamiento de enfermedades mentales, tales como el trastorno bipolar, la esquizofrenia o autismo; y en el tratamiento de enfermedades como el mal de altura, diabetes, artritis reumatoide, lesión cerebral traumática, cáncer, síndrome X frágil, enfermedad de células falciformes, liquen plano, vitÍligo, síndrome de fatiga crónica y así sucesivamente. La composición farmacéutica según la presente invención además puede ser utilizada como un direccionamiento de trombo/fármaco anti-trombo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades mieloproliferativas, trombocitosis, policitemia vera o síndrome de Budd-Chiari. La composición farmacéutica según la presente invención puede usarse también como un fármaco en el tratamiento del accidente cerebrovascular o infarto cerebral, preferentemente en el tratamiento de apoplejía o infarto cerebral más allá de 3, 4, 6 y 24 horas desde el inicio de los síntomas con sucesivas administraciones. La composición farmacéutico/compuesto según la presente invención simultáneamente tiene funciones de depuración de radicales libres NO, trombolisis y anti-trombo/direccionamiento de trombo y por lo tanto demuestra eficacia incluso cuando se administra después de 3 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular en pacientes; es decir, no está restringido por la ventana de 3 horas como en el tratamiento con tPA, no provoca una respuesta sistémica de sangrado como tPA y puede eliminar la enorme cantidad de radicales libres NO generados durante la isquemia/reperfusión, prevención del daño a los tejidos del nervio craneal en pacientes durante el tratamiento. En la composición farmacéutica según la presente invención, las estructuras nanoesféricas de los compuestos son capaces de maximizar los efectos del cruce de la barrera hemato-encefálica, trombolisis, direccionamiento de trombo/anti-trombo, así como el efecto de la eliminación de radicales libres NO generados durante la isquemia/reperfusión.
La composición farmacéutica según la presente invención puede ser cualquier formulación clínicamente aceptable, por ejemplo, una formulación inyectable (polvo para inyección, polvo liofilizado para inyección, líquido para la inyección, infusión, etc.), tabletas, líquidos orales, un gránulo, una cápsula, una cápsula suave, gotas y así sucesivamente, en donde los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser uno o más de xilitol, manitol, lactosa, fructosa, dextrano, glucosa, polivinilpirrolidona, dextrano de bajo peso molecular, cloruro de sodio, gluconato de calcio o fosfato de calcio. Además, la composición farmacéutica según la presente invención además puede abarcar un excipiente que puede ser un agente complejante antioxidante, un relleno, un material de marco y así sucesivamente.
En otro aspecto, la presente invención además se refiere a un método de preparación del mencionado compuesto de fórmula I, que comprende los pasos de: (1) proporcionar un imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO (NN), un brazo de unión con al menos tres grupos para la unión (AAX), un péptido que tiene actividad trombolítica (AA2) y un péptido de direccionamiento de trombo (AA3), en donde el brazo de unión tiene un primer grupo para la unión, un segundo grupo para unión y un tercer grupo para la unión; (2) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión de la imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO (NN) con el primer grupo para la unión en el brazo de unión (AAi), para formar un compuesto de fórmula general IM-1: NN-AAt (IM-1); (3) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión del péptido con actividad trombolítica (AA2) para el compuesto de fórmula general IM-1, en donde uno de los extremos del péptido que tiene actividad trombolítica se une al segundo grupo para unirse en el brazo de unión, para formar un compuesto de fórmula general IM-2: NN-AArAA2 (IM-2); y (4) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión del péptido de direccionamiento de trombo (AA3) para el compuesto de fórmula general IM-2, en donde uno de los extremos del péptido de direccionamiento de trombo está unido al tercer grupo para la unión en el brazo de unión, para formar el compuesto de fórmula I; en donde el paso (3) y (4) son intercambiables en orden.
En el método de preparación según la presente invención, el paso (1) además comprende proteger el segundo y tercer grupos para la unión en el brazo de unión (AAi) con los grupos de protección y grupos activos de protección de los péptidos con actividad trombolítica (AA2) y del péptido de direccionamiento de trombo (AA3), que no sea el extremo a ser utilizado para la unión, con los grupos de protección; el paso (3) además comprende la desprotección del segundo grupo protegido para la unión primero y luego la unión del péptido con actividad trombolítica al segundo grupo desprotegido para la unión; el paso (4) comprende la desprotección del tercer grupo protegido para la unión primero y luego la unión del péptido de direccionamiento de trombo al tercer grupo desprotegido para la unión; y después el paso (4), además hay un paso de desprotección de los grupos activos protegidos de los péptidos con actividad trombolítica (AA2) y del péptido de direccionamiento de trombo (AA3). Aplicando téenicas de agregar y quitar grupos de protección, el orden en donde NN, AA2 y AA3 están unidos al brazo de unión y la posición de unión del mismo son controlables. Los grupos de protección en otros grupos activos entonces se retiran después de la terminación del acoplamiento. Las condiciones de reacción apropiada se refieren a condiciones convencionales empleadas en la síntesis de péptidos. La imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO (NN), el brazo de unión con al menos tres grupos para la unión (AAX), los péptidos con actividad trombolítica (AA2) y el péptido de direccionamiento de trombo (AA3) son los mismos según lo definido anteriormente para el compuesto de fórmula I según la presente invención.
El método de preparación de la presente invención puede entenderse más allá de la descripción más detallada como sigue.
En una modalidad, el primer grupo para la unión en el brazo de unión en el método de preparación según la presente invención es un grupo amino, mientras que el segundo y el tercer grupo para la unión se seleccionan del grupo formado por un grupo carboxilo y un grupo amino.
En un modalidad preferida del método de preparación según la presente invención, la imidazolina con actividad de depuración del radical libre NO es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Lys, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp). Cuando el brazo de unión es L-Lys, pueden existir las siguientes dos maneras para conjugar: (1) l,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina está unida a un grupo amino en el brazo de unión L-Lys, un grupo carboxilo en el oligopéptido formado por una secuencia de PAK está unido a otro grupo amino en el brazo de unión L-Lys y un grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia de RGD está unido a un grupo carboxilo en el brazo de unión L-Lys (como se muestra en el compuesto anterior de fórmula 1-1); o (2) l,3-dioxo-2-[(4-oxiacetox¡) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina está unida a un grupo amino en el brazo unión L-Lys, un grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia de PAK está unido a un grupo carboxilo en el brazo de unión L-Lys y un grupo carboxilo en el oligopéptido formado por una secuencia de RGD está unido a otro grupo amino en el brazo de unión L-Lys (como se muestra en el compuesto anterior de fórmula 1-2).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-1, cuando el compuesto de fórmula general 1-1-1, 1-1-2, 1-1-3 o 1-1-4 está preparado, el método de preparación de la presente invención podrá realizarse según los esquemas de síntesis mostrados en los Esquemas de Síntesis A a D. El Esquema de Síntesis A muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-1-1. El Esquema de Síntesis B muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-1-2. El Esquema de Síntesis C muestra un esquema de síntesis para ei compuesto de fórmula general 1-1-3. El Esquema de Síntesis D muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-1-4. En los Esquemas de Síntesis A a D, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe antes. Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula general 1-1-2, el método de preparación según la presente invención se describe como sigue: (1) preparación de 1,3-d¡oxo-2-(4-oxiacetox¡-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina; (2) preparación de l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe) fenil]-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina (el grupo carboxilo del brazo de unión Lys está protegido con un grupo de protección;) (3) preparación de HCI'Arg NO^-Gly-AspíOBzO-Se Bz -Obzl, HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-VaI-Obzl or HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl; (4) preparación de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z); (5) unión de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z) a la iisina de l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetramet¡limldazolina para proveer 1,3- dioxo -2-{4'- oxiacetil -{N“- [Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina; (6) respectivamente la conjugación de HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl, HCI-Arg(N02)-Gly-Asp (OBzl)-Val-Obzl, or HCI'Arg (N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl a l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys>fenil>- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina para dar l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc- Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, o 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg(N02)- Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzi>fenil>- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina, respectivamente; (7) desprotección de compuestos resultando del paso (6) para dar l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg- Gly-Asp-Val>fenil>-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina o l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“- [Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-Lys-Arg-Gly-Asp-Phe>fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina.
ESQUEMA DE SÍNTESIS A Esquema de síntesis i una modalidad del compuesto seqún la invención (el ó - - - - - - - - - - . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ | - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - .
- - - ESQUEMA DE SÍNTESIS B Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención fe I compuesto de fórmula general I-1-2? - - - | - - ~ - - - - - - - - - - - | - - - - - - - - - - - - - - ESQUEMA DE SÍNTESIS C Esquema de síntesis i una modalidad del compuesto seqún la invención (el compuesto de fórmula general 1-1-31 ' - - - - - - - - - - - - - zl - - - zl | - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - g y p j ESQUEMA PE SINTESIS D Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-1-41 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - .
- - - - - - - - - - - En el caso que los compuestos de fórmula general 1-1-1, 1-1-3 y 1-1-4 se preparen, el procedimiento de fabricación anterior se repite pero se reemplaza por "Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)" en el paso (4) con "Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)", "Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)" y "Boc-Pro-Ala-Lys(Z)".
Los grupos activos en posiciones apropiadas en el oligopéptido formado por una secuencia de PAK y el oligopéptido formado por una secuencia de RGD puede estar protegido por necesidad de diseño de conjugación, así que un extremo de las secuencias seleccionadas (compuesto por un grupo activo que se unirá al brazo de unión) se utiliza para acoplarse a un grupo activo en el brazo de unión. El paso de acoplamiento del oligopéptido formado por una secuencia de PAK y el paso de acoplamiento del oligopéptido formado por una secuencia de RGD son cambiables en orden. Por ejemplo, el oligopéptido que comprende una secuencia de RGD se acopla al brazo de unión primero, y luego el oligopéptido formado por una secuencia de PAK está acoplado al mismo.
Los grupos activos incluyen grupos que pueden ser sometidos a la reacción de condensación, como un grupo amino o un grupo carboxilo. Los grupos amino-protección pueden ser carboxibencilo (CBz), t-butoxi carbonilo (Boc), 9-florenil metoxi carbonilo (Fmoc), bencilo (Bn) o p-metoxifenilo (PMP). Los grupos carboxilo- protección pueden ser éster metílico (OMe), éster bencílico (OBn), éster metílico de bencilo (Obzl), éster de t-butilo (OBUT) o silll éster (OS¡(CH3)3).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-2, cuando se prepara el compuesto de fórmula general 1-2-1, 1-2-2, 1-2-3 o 1-2-4, el método de preparación de la presente invención podrá realizarse según los esquemas de síntesis que se muestran en los Esquemas de Síntesis E a H. El Esquema de Síntesis E muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-2-1. El Esquema de Síntesis F muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-2-2. El Esquema de Síntesis G muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-2-3. El Esquema de Síntesis H muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-2-4. En los Esquemas de Síntesis E a H, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe arriba. Cuando el compuesto de fórmula general 1-2-1, 1-2-2, 1-2-3 o 1-2-4 es preparado, 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina puede prepararse primero, y luego la terminal C del oligopéptido que comprende una secuencia de RGD se une al grupo armiño en el brazo de unión Lys; y finalmente, la terminal N del oligopéptido que comprende una secuencia de PAK se une al grupo carboxilo desprotegido en el brazo de unión.
ESQUEMA DE SÍNTESIS E Esquema de síntesis i una modalidad del compuesto seqún la invención (el compuesto de fórmula general 1-2-1) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - y( )- - - y ( )- - ESQUEMA DE SÍNTESIS F Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención fel ó I - - - - - - - - - - - .
- - - | ^V Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl H Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl - I - - I - - - — - - - - - - - ys ESQUEMA DE SINTESIS G Esquema de síntesis para una modalidad del com uesto seqún la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-2-3^ ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - I y( ) — - y( ) - - - ESQUEMA DE SINTESIS H Esguema de síntesis i una modalidad del compuesto seqún la invención (el compuesto de fórmula general 1-2-41 - ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - .
- - - - - - - - - - - - - - - - I - - - y En otra modalidad, en el método de preparación según la presente Invención, la ¡midazollna con actividad de depuración de radical libre es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]- 4, 4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Asp, el péptido con actividad trombolítica es un ollgopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp), en donde l,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina está unido al grupo amino en el brazo de unión L-Asp, el grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia PAK está unido a un grupo carboxilo en el brazo de unión L-Asp, y el grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia de RGD está unido a otro grupo carboxilo en el brazo unión L-Asp (como se muestra en el compuesto anterior de fórmula 1-3 o 1-4).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-3, cuando se prepara el compuesto de fórmula general 1-3-1, 1-3-2, 1-3-3 o 1-3-4, el método de preparación de la presente invención puede llevarse a cabo según los esquemas de síntesis que se muestran en los Esquemas de Síntesis I a L. El Esquema de Síntesis I muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-3-1. El Esquema de Síntesis J muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-3-2. El Esquema de Síntesis K muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-3-3. El Esquema de Síntesis L muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-3-4. En los Esquemas de Síntesis I a L, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe arriba. Cuando el compuesto de fórmula general 1-3-1, 1-3-2, 1-3-3 o 1-3-4 es preparado, l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Asp-OMe) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina puede prepararse primero, y luego el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia PAK se une a un grupo carboxilo en el brazo de unión Asp; y finalmente, el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia RGD se une a otro grupo carboxilo desprotegido en el brazo de unión de Asp.
ESQUEMA DE SINTESIS I Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general I-3-3 - - - - - - - - - - - - - - - — - - - - - - - , - - , - - - _ _ - - - - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS 3 Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto seqún la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-3-21 - - · - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Boc-A]a l Lys(Z)-OBzl· Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl ^rL 0V Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl O^LN^*O H OH P Giy-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl ArgfNO->)-Gly-Asp(OBzl)-aa3-OBzl =o l¾yJ o Boc-Arg(N02)-G1y-A tsp(OBzl)-aa3-OBzl ?? A frg(N02)-01y-Asp(0Bz])-aa3-0Bz] Boc-Arg(NO;) üly_Asp(üB7.l)-aa:r0B7.l Boc-Gly-Asp(OBil)-aa3-OBzl |BOO-OI)' P - -Lys Boc-Asp(OBzl)-aa3-OBzl - *-Asp(OBz])-aa3-OBzl Boc-Asp(OBzl) + aa3-OBzl - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS K Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-3-31 i - - - - - - - - Arg-Gly Asp aa3 Boc-Asp(OBzl) t + aa3-OBzl ESQUEMA DE SINTESIS L Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto seqún la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-3-4) - - - - - - - - - - - - - - Boc-Aig(N02)- tGly-Asp(OBzl)-aa3-OBzl B Arg(N 02)-G ly-Asp(OBzl)-aa3-OBzl Boc-Aig(N02)| Gly-Asp(OBzl)-aa3-OBzl Boc-Gly-Asp(O IBzl)-aa3-OBzl Boc-Gly| - la-Lys Asp(OB l)- -OB l Boc-Asp - - ly-Asp-aa3 Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-4, cuando se prepara el compuesto de fórmula general 1-4-1, 1-4-2, 1-4-3 o 1-4-4, el método de preparación de la presente invención puede realizarse según los esquemas de síntesis que se muestran en los Esquemas de Síntesis M a P. El Esquema de Síntesis M muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-4-1. El Esquema de Síntesis N muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-4-2. El Esquema de Síntesis O muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-4-3. El Esquema de Síntesis P muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-4-4. En los Esquemas de Síntesis M a P, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe arriba. Cuando el compuesto de fórmula general 1-4-1, 1-4-2, 1-4-3 o 1-4-4 es preparado, 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Asp-OMe) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina puede prepararse primero, y luego el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia RGD se une a un grupo carboxilo en el brazo de unión Asp; y finalmente, el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia de PAK se une a otro grupo carboxilo desprotegido en el brazo de unión de Asp.
ESQUEMA DE SINTESIS M Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-4-11 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - | Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl H Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl :5ocAI;| Arg(N02)-Pro-A]a-Lys(Z)-OBzl HCltt HCI Boc-Arg(N02) - Pro-Ala-Ly s(Z)-OBzl o -Gly-Asp-aa3 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl Boc-Ala l Lys(Z)-OBzl 0 Boc-Proj | Ala-Lys(Z)-OBzl - HCI Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl ÁlaArg-Pro-Ala-Lys ESQUEMA DE SINTESIS N Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-4-21 - l - - - - - - - - - - - - - - - - - - Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl Q G=0 |HC1 O^J^A^O Boc-Gly-Arg(NO,)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl ^ Gly-Arg(NO,)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl Boc-Gly| Arg(NO,)-Pro-Ala- -TLys(Z 7L).-POTBIz»!l HC1¾ HC1 | Boc-Arg(N02) - Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl P - - - Boc-Pro-Ala-Lya(Z)-OBzl Boc-Ala i Lys(Z)-OBzl Boc-Pro] I Ala-Lys(Z)-OBzl ·*— HW - Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl - - Lys ESQUEMA DE SÍNTESIS O Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-4-31 - - - - - - - - - - - I PV (NO)-Gl - l- - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS P Esauema de síntesis para una modalidad del compuesto según a presente invención fel compuesto de fórmula general 1-4-4) - - - - - - - - - - - - l - - - - - - l - - - - - - l - l - - oV% Arg-Gly-Asp-aa3 -r o r^0 O^ N^ O M 4 P Pro-Ala-Lys En otra modalidad todavía, en el método de preparación según la presente invención, la imidazolina con actividad de depuración de radical libre NO es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Glu, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp), en donde l,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina está unido al grupo amino en el brazo de unión L-Glu, el grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia PAK está unido a un grupo carboxilo en el brazo de unión L-Glu, y el grupo amino en el oligopéptido formado por una secuencia de RGD está unido a otro grupo carboxilo en el brazo unión L-Glu (como se muestra en el compuesto anterior de fórmula 1-5 o 1-6).
Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-5, cuando se prepara el compuesto de fórmula general 1-5-1, 1-5-2, 1-5-3 o 1-5-4, el método de preparación de la presente invención puede realizarse según los esquemas de síntesis que se muestran en los Esquemas de Síntesis Q a T. El Esquema de Síntesis Q muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-5-1. El Esquema de Síntesis R muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-5-2. El Esquema de Síntesis S muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-5-3. El Esquema de Síntesis T muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-5-4. En los Esquemas de Síntesis Q a T, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe arriba. Cuando el compuesto de fórmula general 1-5-1, 1-5-2, 1-5-3 o 1-5-4 es preparado, l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Glu-OMe) fenilj-4,4,5,5 - tetrametilimidazolina puede prepararse primero, y luego el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia RGD se une a un grupo carboxilo en el brazo de unión Glu; y finalmente, el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia PAK se une a otro grupo carboxilo desprotegido en el brazo de unión Glu.
ESQUEMA DE SINTESIS O Esauema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-5-1) HO -4N.4.NO-H 44 - I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - i - - - - Boc-Ala y( )- - - - - ESQUEMA DE SINTESIS R Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto seaún la presente invención fel compuesto de fórmula general 1-5-21 - - — - - - - - - - - - - - - P'N Í> N^Q o Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-aa3-0Bzl - - .
- - - - - - - — -' - - - - - BocAla y( ) - - - - ESQUEMA DE SÍNTESIS S Esquema de síntesis 1 una modalidad del comDuesto seqún la invención fe! compuesto de fórmula general 1-5-3 I - - - - - - - .
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS T Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-5-4^ - - - GluOMe Arg(NO2)-Gly-Asp( - _ - Bzl)-aa3-OBz1 -Arg(N02) Gly-Asp(OBzl)-aa3-OBzl Boc-Gly-Asp(O tBzl)-aa3-OBzl A (N0)-Gl -A (0B l) 0B l c-Gly - 3-OBzl Boc-Asp(OBzl)-aa3-OBzl H OMc Boc-Asp(OBzl) i aa3-OBzl P'N ' N ) 0 , Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-aa3-0Bzl - - - - - - - - - - - l - - - - Ejemplos relacionados con el compuesto de fórmula 1-6, cuando se prepara el compuesto de fórmula general 1-6-1, 1-6-2, 1-6-3 o 1-6-4, el método de preparación de la presente invención puede realizarse según los esquemas de síntesis que se muestran en los Esquemas de Síntesis U a X. El Esquema de Síntesis U muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-6-1. El Esquema de Síntesis V muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-6-2. El Esquema de Síntesis W muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-6-3. El Esquema de Síntesis X muestra un esquema de síntesis para el compuesto de fórmula general 1-6-4. En los Esquemas de Síntesis U a X, aa3 puede ser S (Ser), V (Val) o F (Phe), tal como se describe arriba. Cuando el compuesto de fórmula general 1-6-1, 1-6-2, 1-6-3 o 1-6-4 es preparado, 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Glu-OMe) fenilj-4,4,5,5 - tetrametilimidazolina puede prepararse primero, y luego el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia PAK se une a un grupo carboxilo en el brazo de unión Glu; y finalmente, el N terminal del oligopéptido que comprende una secuencia RGD se une a otro grupo carboxilo desprotegido en el brazo de unión Glu.
ESQUEMA DE SINTESIS U Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-6-1) - - l - - - - - - - - - - - | . - - . - - - - - - - - - - - Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl H 011 y -Arg(NÜ2)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl Arg(NO,)-Gly-Asp(OBzl)-aa,-OBzl Boc-Aig(N02)-Gly-A tsp(OBzl)-aa3-OBzl II Arg(N03)-Gly-Asp(0Bzl)-aa3-0Bzl - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS V Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-6-21 . , - - - - - - - - - - - - - . · - - - - - - , - - - - - - - l , - - - - - - l - - - - - - - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS W Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto seqún la presente invención (el compuesto de fórmula general 1-6-31 - Arg(N02)-Pro-Ala-Lys c-Arg(NQ2) Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl - a-Lys(Z)-OBzl Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl Boc-ProT Ala-Lys(Z)-OBzl “-V Boc-Ala + Lys(Z)-0Bzl· HCl Boc-Ala 1-Lys(Z)-OBzl H OMc NaOH - - - - - - - - - - - - _ - - - - - - - - - - - - - ESQUEMA DE SINTESIS X Esquema de síntesis para una modalidad del compuesto según la presente invención fel compuesto de fórmula general 1-6-41 I - - I - - - - - - - - - - - - i - - , - - - - - - - - - - - - - 1 I— - - __ - - - - .
| - - - - - - - - - - En el método de preparación descrito anteriormente, el oligopéptido que comprende una secuencia PAK puede ser ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys) o PAK(Pro-Ala-Lys), y el oligopéptido que comprende una secuencia de RGD puede ser RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val) o RGDF(Arg-Gly-Asp-Phe).
Para el compuesto o la composición farmacéutica según la presente invención, la actividad de depuración de radicales libres NO es demostrada por modelos de ratón en vivo de depuración de radical libre NO; la trombólisis superior y actividades anti-trombos son demostradas por experimentos in vivo e in vitro de la trombólisis y anti-trombo; la eficacia neuroprotectora y actividad anti-apoplejía superior están demostradas por modelos de apoplejía de rata in viva, y eficacia en la reducción de volumen del infarto cerebral es demostrada por modelos de apoplejía de ratón..
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra las nanoestructuras del compuesto la según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y 1 x 1012 M soluciones acuosas; La figura 2 muestra las nanoestructuras del compuesto Ib según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y 1 x 1012 M soluciones acuosas; La figura 3 muestra las nanoestructuras del compuesto Ic según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y 1 x 1012 M soluciones acuosas; La figura 4 muestra las nanoestructuras del compuesto Id según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 5 muestra las nanoestructuras del compuesto le según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 6 muestra las nanoestructuras del compuesto If según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 7 muestra las nanoestructuras del compuesto Ig según la presente invención en lxlO 6 M, 1 c 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 8 muestra las nanoestructuras del compuesto Ih según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 9 muestra las nanoestructuras del compuesto Ii según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 10 muestra las nanoestructuras del compuesto Ij según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 1012 M soluciones acuosas; La figura 11 muestra las nanoestructuras del compuesto Ik según la presente invención en IcIO 6 M, 1 x 109 M y l x 10 12 M soluciones acuosas; La figura 12 muestra las nanoestructuras del compuesto II según la presente invención en lxlO 6 M, 1 x 109 M y l x 10 12 M soluciones acuosas; La figura 13 muestra el espectro de alta resolución de FT-EM del compuesto le según la presente invención en una concentración de 0.01 pm; La figura 14 muestra el espectro de alta resolución de FT-EM del compuesto le según la presente invención en una concentración de 0.1 pm; La figura 15 muestra el espectro de alta resolución de FT-EM del compuesto le según la presente Invención en una concentración de 1 pm; La figura 16 muestra el espectro de alta resolución de FT-EM del compuesto le según la presente invención en una concentración de 10 pM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ahora se describe en relación con los siguientes ejemplos específicos, y las ventajas y características de los mismos serán evidentes a la vista de ia descripción. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y en ninguna manera limitan el alcance de la presente invención. Una persona experta en la téenica puede entender que la modificación o sustitución podrá hacerse en los detalles y formalidad de las soluciones técnicas de la presente invención sin desviarse del espíritu y ámbito de la presente invención, y estas modificaciones o sustituciones pretenden estar dentro del ámbito de la protección de la presente invención.
Preparación de imidazolinas con actividad de depuración de radical libre NO: 1,3-dioxo- 2-rf4-oxiacetoxflfenin-4,4.5,5-tetrametilimidazolina EJEMPLO 1 Preparación de 2,3-dimetil-2.3-d¡nitrobutano 69 g (0.78 mol) 2-nitropropano se añadió a una solución acuosa 130 mi de NaOH (6N). 20 mi (0.38 mol) Br2 se añadió a gotas con agitación en un baño de sal con hielo en 1 hora. Después de la terminación de la adición de Br2, 240 mi de etanol fueron añadidos al mismo y se refluyó a 90°C durante 3 horas. La solución de reacción, mientras estaba todavía caliente, fue vertida al instante en 800 mi de agua helada y luego se filtró para dar 55 g del compuesto del título (81%) como un cristal escamoso incoloro, pf 110-112°C.
EJEMPLO 2 Preparación de 2,3-dimetil-2.3-dinitrobutano 7 g (40 mmol) de 2,3-dimetil-2,3-dinitrobutano y 4 g NH^CI se mezclaron y suspendieron en una solución acuosa de 80 mi de etanol (50%) y se agitaron en un baño de hielo, en donde 16 g de polvo de zinc fueron agregados dentro de 3 horas. Después de la adición de zinc en polvo, el baño de hielo fue quitado, y la reacción continuó durante 3 horas a temperatura ambiente (RT) bajo agitación luego la mezcla de reacción se filtró al vacío. La torta de filtración se lavó repetidamente con solución acuosa de etanol (50%). El filtrado y el líquido de lavado se combinaron, ajustado a pH = 2 con ácido clorhídrico concentrado y luego se destiló bajo presión reducida en una mezcla. Después de la adición de una cantidad adecuada de carbonato de potasio, la suspensión uniformemente se mezcló y extrajo por 6 horas utilizando un extractor Soxhlet con cloroformo como el solvente de extracción. El extracto se concentró a presión reducida en una pequeña cantidad, en donde el éter de petróleo fue agregado para precipitar 2.60 g del compuesto del título (44%) como un cristal incoloro, pf 157-159°C.
EJEMPLO 3 Preparación de 1.3-d¡hidroxi-2-(4'-h¡droxifenin-4,4,5.5- tetrametilimidizolidina 1.22 g (10 mmol) de p-hldroxi benzaldehído y 1.48 g (10 mmol) de 2,3-dimetil-2,3-dihidroxiaminobutano fueron disueltos en 10 mi de metanol y se agitó a RT durante 8 horas, hasta que el punto de material inicial desapareció como se muestra por el TLC. Durante la filtración a vacío, 1.29 g (51%) del compuesto del título se obtuvo como un cristal incoloro. EI-EM ( m/z ) 252 [M]+. ^-RMN (DMSO-cfe) 5(ppm) = 1.03 (s, 6H), 1.05 (s, 6H), 4.39 (s, 1H), 6.70 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.23 (d, J - 6.9 Hz, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.85(s, 2H).
EJEMPLO 4 Preparación de 1,3-dihidrox¡-2-(4 -hidroxifenin-4.4.5.5- tetrametilimidazolina 504 mg (2 mmol) l,3-dihidroxi-2-(4'-hidroxifenil)-4,4,5,5-imidizolidina se disolvieron en 30 mi de metanol seguido por la adición de 3 g de Pb02, y se agitó a RT por 40 min hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Después de la remoción de sólidos por filtración de vacío, el filtrado se destiló hasta que se secó bajo presión reducida a RT y el residuo se purificó por cromatografía en columna (con cloroformo como eluyente) para dar 260 mg (52%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 134-135°C, EI-EM (m/z) 249 [M]+. IR (KBr) 3250,1610,1500,1490, 840.
EJEMPLO 5 Preparación de 1.3-dioxo-2-f4,-roxiacetato etil ésterVfenin-4,4,5,5- tetrametilimidazolma 250 mg (1 mmol) de 1,3-dihidroxi-2-(4'-hidroxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 0.32 mi de bromoacetato de etilo y 32 mg de NaH se disolvieron en 5 mi de THF anhidro. La mezcla se agitó a 60°C durante 5 horas hasta que la mancha del material de partida desapareció como se muestra por TLC. Después de la filtración bajo presión reducida a RT, el filtrado se concentró bajo presión reducida hasta secarse y el residuo se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo: éter de petróleo = 1:5) para dar 300 mg (90%) del compuesto objetivo, pf 107-109°C.
EJEMPLO 6 Preparación de 1,3-dioxo-2- oxiacetoxi-fenilV4.4,5,5- tetrametilimidazolina (TMMZ? 7 gotas de una solución acuosa NaOH (2N) se añadió en una solución de 33 mg (0.1 mmol) de l,3-dioxo-2-(4'-(oxlacetato etil éster)-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina en 3 mi de metanol, seguido por agitación a RT durante 30 min hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo se diluyó por la adición de solución salina 2 mi saturada, ajustada a pH 6 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (3 mi x 3). Las capas de fase de acetato de etilo fueron combinadas y secadas sobre sulfato de sodio anhidro y luego se filtraron. El filtrado se concentró bajo presión reducida a temperatura ambiente hasta que secó para dar 30 mg (99%) del compuesto del título como un cristal azul, pf 155-157°C. EI-EM {m/z) 307 [M]+.
Acoplamiento de las imidazolinas con actividad de depuración de radicales libres NO con un brazo de unión: l,3-dioxo-2-rf4'-oxiacetil-Lvs-OMeJfenill-4.4.5.5- tetrametilimidazolina EJEMPLO 7 Preparación de l.B-dioxo-Z-rf^-oxiacetil-N^Boc-Lvs-OMe'ifenin-^.S.S- tetrametilimidazolina Una solución de 307 mg (1 mmol) l,3-dioxo-2-(4'-oxiacetil-fenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina en 30 mi THF anhidro se agitó en un baño de hielo, en donde 250 mg (1.2 mmol) DCC y 135 mg (1 mmol) HOBt se añadieron y agitaron en un baño de hielo durante 10 min. Después una solución preparada con 300 mg (1 mmol) HCI-Lys(Boc)-Ome, 122 mg (1 mmol) N-metilmorfolina y 6 mi THF anhidro se añadió a esto, y la mezcla de reacción reaccionó a RT durante 24 horas. TLC (acetato de etilo:éter de petróleo = 2:1) mostró desaparición de HCI'Lys(Boc)-Ome. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida hasta que se secó, el residuo se disolvió en acetato de etilo y material ¡nsoluble fue removido por filtración. El filtrado se lavó consecutivamente con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y con una solución acuosa saturada de NaCI, la fase separada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró y el filtrado se concentró entonces a presión reducida a 37°C (estas operaciones se denominarán en lo sucesivo como un "procedimiento de rutina"). El residuo se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo: éter de petróleo = 2:1) para dar 433 mg (65%) del compuesto del título como un sólido azul. ESI-EM(m/z) 550 [M + H]+.
EJEMPLO 8 Preparación de 1,3-dioxo-2-rf4'-oxiacetil-Lvs-OMe)fen¡n-4.4,5,5- tetrametilimidazolina 625 mg (1 mmol) 1,3^?oco-2-[(4'-oc?3qq?I-Nw-Boo-?g5-OMq)?qhN]-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina se disolvieron en 15 mi de cloruro de hidrógeno anhidro- acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 h hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió entonces al procedimiento de la rutina. El residuo se cristalizó en el éter etílico anhidro para dar el compuesto del título.
Preparación del péptido con actividad trombolítica: debidamente protegido ARPAR EJEMPLO 9 Preparación de Boc-Ala-LvsfZVOBzl 473 mg (2.5 mmol) Boc-Ala se disolvió en 10 mi de THF anhidro. Una solución preparada con 338 mg (2.5 mmol) TOHB, 619 mg (3 mmol) DCC y 10 mi de THF anhidro se añadió al mismo en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó en el baño de hielo durante 20 minutos antes que una solución preparada con 936 mg (2,3 mmol) HCLLys (Z)-Obzl, 232 mg (2.3 mmol) N-metil morfolina y 6 mi de THF anhidro se agregara a la misma. La mezcla de reacción resultante reaccionó a temperatura ambiente durante 24 horas hasta que HCI-Lys(Z)-Obzl desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH = 30:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.204 g (97%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 88-90°C. [Q¾0 =-29.2 (c - 0.1, MeOH). ESI-EM(m/z) 565 [M + Na]+.
EJEMPLO 10 Preparación de HCl'Ala-LvsfZVOBzl 1.354 g (2.5 mmol) Boc-Ala-Lys(Z)-Obzl se disolvió en aproximadamente 10 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 h hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 30:1). La solución de la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida a RT y el residuo se disolvió en acetato de etilo y luego se concentró a RT; el procedimiento anterior se repitió varias veces hasta que fue removido todo el cloruro de hidrógeno libre (estas operaciones en lo sucesivo se denominaron como un "procedimiento de rutina"). El residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 11 Preparación de Boc-Pro-Ala-Lvs(ZVOBzl 538 mg (2.5 mmol) Boc-Pro se disolvió en una cantidad apropiada de THF anhidro seguido por la adición de 338 mg (2.5 mmol) HOBt y 619 mg (3 mmol) DCC en THF anhidro en un baño de hielo, y luego reaccionó por 20 minutos. A esta solución, una solución preparada con 1.099 g (2.3 mmol) HCI-Ala-Lys(Z)-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metil morfolina en 10 mi de THF anhidro se añadió, y la reacción se llevo a cabo a RT durante 24 horas. TLC (CHCI3:MeOH, 20:1) mostró desaparición de la mancha del material de inicio. Los compuestos de reacción fueron sometidos al procedimiento de rutina para dar 2.847 g (98%) del compuesto del título, pf 82-83°C. [a]“ =-46.4 (c - 0.11, MeOH). ESI-EM(m/z) 661 [M + Na] +.
EJEMPLO 12 Preparación de HCI'Pro-Ala-LvsfZ OBzl 1.596 g (2.5 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Obzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 13 Preparación de Boc-ArafNO^VPro-Ala-LvsfZI-OBzl En un baño de hielo, una solución de 798 mg (2.5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, en donde una solución preparada con 1.322 g (2.3 mmol) HCI,Pro-Ala-Lys(Z)-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió y la reacción se llevo a cabo a RT durante 24 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). El procedimiento de rutina se realizó para dar 1.642 g (85%) del compuesto del título pf 84-85°C. [a]“ =-65.0 (c = 0.13, MeOH). ESI-EM (m/z) 864 [M + Na] +.
EJEMPLO 14 Preparación de HCI· ArafNO^VPro-Ala-LvsfZI-OBzl 2.099 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl se disolvió en 20 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 15 Preparación de Boc-Ala-ArqfNO^-Pro-Ala-LvsfZVOBzl En un baño de hielo, una solución de 473 mg (2.5 mmol) Boc-Ala, 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, en donde una solución preparada con 1.785 g (2.3 mmol) HCI'Arg NC^-Pro-Ala-Lys Z^Obzl, 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió y la reacción se realizó durante 24 horas para dar 1.802 g (86%) del compuesto del título, pf 87 - 89°C. [af» =-63.9 (c = 0.12, MeOH). ESI-EM (m/e) 934 [M + Na] +.
EJEMPLO 16 Preparación de Boc-Ala-ArqfNO^VPro-Ala-LvsfZ) 921 mg (1 mmol) Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl se disolvió en 3 mi de metanol, en donde una solución acuosa de NaOH (2N) se añadió en un baño de hielo y se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en un baño de hielo durante 10 min hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC. El pH se ajustó a 7 con 2N HCI, y la reacción líquida se concentró bajo presión reducida. El residuo fue diluido con solución salina 2 mi saturada y se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). Las capas de fase de acetato de etilo se combinaron y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y concentraron bajo presión reducida a RT para dar 767 mg (80%) del compuesto del título como un sólido incoloro. EI-EM ( m/z ) 830 [M - H]~.
Preparación de direccionamiento de trombo /peptido anti-trombo: RGDS, RGDV, RGDF apropiadamente protegidos EJEMPLO 17 Preparación de Boc-Asp SerfBzO-OBzl En un baño de hielo, una solución de 808 mg (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó y reaccionó durante 20 min, y luego una solución preparada con 740 mg (2.3 mmol) HCI-Ser(Bzl)-Obzl, 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio despareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). Los compuestos de reacción se sometieron al procedimiento de rutina para dar 1.29 g (95%) del compuesto del título como materia aceitosa incolora. ESI-EM(m/z) 591 [M + H] +.
EJEMPLO 18 Preparación de HCi'AspfOBzn-SerfBzn-OBzl 1.477 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4I\I) y se agitó a RT durante 3 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 19 Preparación de Boc-Glv-Asp(OBzl)-Ser(BzO-OBzl En un baño de hielo, una solución de 438 mg (2.5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.212 g (2.3 mmol) HCI-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) de N-metilmorfollna en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.461 g (98%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 53 - 55°C 23.7 (c = 0.13, MeOH). ESI-EM (m/z) 649 [M + H]+.
EJEMPLO 20 Preparación de HCl· Glv-Asp(OBzO-Ser(BzO-OBzl 1.619 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó aRT durante 3 h hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 21 Preparación de Boc-ArqfNOo -GIv-AspfOBzO-SerfBzn-OBzl En un baño de hielo, una solución de 798 mg (2.5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.343 g (2.3 mmol) HCI-Gly-AspíOBzO-Ser Bz -Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metlImorfollna en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). Después del procedimiento de rutina, 1.66 g (85%) del compuesto del título se obtuvo como un sólido incoloro, pf 74 - 75°C. [a]“ = -26.2 (c = 0.12, MeOH). ESI-EM(m/z) 872 [M + Na]+.
EJEMPLO 22 Preparación de HCI-ArqfN(M-Glv-Asp(OBzO-Ser(Bzn-OBzl Una mezcla de 2.122 g (2.5 mmol) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl y 20 mi de solución de cloruro de hidrógeno en acetato de etilo (4N) se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3: MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para producir el compuesto del título.
EJEMPLO 23 Preparación de Boc-Aspf OBzP-Val-QBzl En un baño de hielo, una solución de 808 mg (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 558 mg (2.3 mmol) HCI'Val-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.129 g (96%) del compuesto del título como un líquido aceitoso. ESI-EM(m/z) 512 [M + H]+.
EJEMPLO 24 Preparación de HCI-AspfOBzn-Val-OBzl 1.278 g (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 25 Preparación de Boc-GIv-AspfOBzn-Val-OBzl En un baño de hielo, una solución de 438 mg (2.5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.03 g (2.3 mmol) HCI-Asp(OBzl)-Val-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N- metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.242 g (95%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 66 - 68°C. [a] y =-43.8 (c= 0.11, MeOH). ESI-EM(m/z) 592 [M + Na]+.
EJEMPLO 26 Preparación de HCI-GIv-AspfOBzn-Val-OBzl 1.421 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 27 Preparación de Boc-ArafNC -GIv-AspfOBzn-Val-OBzl En un baño de hielo, una solución de 798 mg (2.5 mmol) Boc-Arg(N02), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.162 g (2.3 mmol) HCI-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N~ metilmorfolina en 5 mi THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.523 g (86%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 107 - 109°C. [a]“ =-38.0 (c= 0.12, MeOH). ESI-EM(m/z) 793 [M + Na]+.
EJEMPLO 28 Preparación de HCI'Glv-AspfOBzO-Val-OBzl 1.925 g (2.5 mmol) de Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl se disolvieron en 20 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de Inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para producir el compuesto del título.
EJEMPLO 29 Preparación de Boc-AspfOBzlVPhe-OBzl En un baño de hielo, una solución de 808 mg (2.5 mmol) Boc-Asp(OBzl), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 668 mg (2.3 mmol) HCPPhe-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). Después del procedimiento de rutina, 1.222 g (95%) del compuesto del título se obtuvo como un sólido incoloro. pf 79 - 80°c. [a];° =-24.2 (c = 0.13, MeOH), ESI-EM(m/z) 561 [M + H]+.
EJEMPLO 30 Preparación de HCI'AspfOBzn-Phe-OBzl 1.398 g (2.5 mmol) de Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl se disolvieron en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 31 Preparación de Boc-GIv-AspfOBzlVPhe-OBzl En un baño de hielo, una solución de 438 mg (2.5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.141 g (2.3 mmol) HCI-Asp(OBzl)-Phe-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 ml de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.29 g (91%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 70 - 71°C. [af° =-22.5 (c = 0.14, MeOH). ESI-EM(m/z) 640 [M + Na] +.
EJEMPLO 32 Preparación de HCI'GIv-AspfOBzn-Phe-OBzl 1.541 g (2.5 mmol) Boc-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl se disolvió en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a RT durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para dar el compuesto del título que fue utilizado directamente en la reacción del próximo paso.
EJEMPLO 33 Boc-ArafNC -GIv-AspfOBzn-Phe-OBzl En un baño de hielo, una solución de 798 g (2.5 mmol) Boc-Arg(IM02), 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.272 g (2.3 mmol) HCI'Gly-AspíOBz -Phe-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 1.637g (87%) del compuesto del título como un sólido incoloro, pf 77 - 79°C. [cr]^0 =-22.6 (c = 0.09, MeOH). ESI-EM(m/z) 841 [M + Na]+.
EJEMPLO 34 Preparación de HCI'ArqfNC -GIv-AspfOBzn-Phe-OBzl 2.045 g (2.5 mmol) de Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl se disolvieron en 15 mi de solución de cloruro de hidrógeno anhidro en acetato de etilo (4N) y se agitó a R.T durante 3 horas hasta que la mancha del material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina, y el residuo se cristalizó en éter etílico anhidro para producir el compuesto del título.
Preparación de conjugados ternarios de ARPAK/imidazolina/RGD (compuestos de fórmula general 1-1-11: la. Ib, Ic EJEMPLO 35 Preparación de l.B-dioxo- -f^-oxiacetil-fN^rBoc-Ala-ArqíNO^^-Pro-Ala- LvsfZ)1-Lvs- OMe>fenilV4.4.5, 5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 821 mg (1 mmol) Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) HOBt y 250 mg (1 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 480 mg (1 mmol) 1,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4, 4, 5, 5-tetrametilimidazolina y 100 mg (1 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 40:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 925 mg (83%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 179 - 182°C. [a]^° =- 34.3 (c = 0.14, MeOH), ESI-EM(m/z) 1275 [M + Na]+. IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 enT1.
EJEMPLO 36 Preparación de 1.3-dioxo-2-f 4'-oxiacetil-f NM-rBoc-Ala-Arq(N02y ro-Ala- LvsfZII- LvsIfenilV 4,4,5.5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, 1260 mg (1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Ala-Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4, 4, 5, 5-tetrametilimidazolina se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa de NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró bajo presión reducida a RT para dar 945 mg (82%) del compuesto del título como un azul sólido. EI-EM {m/z) 1238 [M - H] .
EJEMPLO 37 Preparación de l.B-dioxo-Z-^'-oxiacetil-fNrc-rBoc-Ala-Arqf O^yPro-Ala- LysfZ^I-Lys- Arq-fN07VGIv-Aspf0BzlVSerfBzn-QBzl>fenil -4,4,5.5-tetrametil- imidazolina En un baño de hielo, una solución de 618 mg (0.5 mmoi) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Ala- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 442 mg (0.5 mmol) HCI,Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)- Ser(Bzl)-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 300 mg (31%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 138 - 140°C. [a]y =-39.4 (c = 0.13, MeOH). ESI-EM(m/z) 1991 [M + H]+. IR(KBr) 3309, 2936, 1656, 1531, 1449, 1363, 1256, 836, 743, 697, 601 cm 1.
EJEMPLO 38 Preparación de 1.3-d8oxo-2-r4f-oxiacetil-^Nt,1-rBoc-Ala-Arq(N02VPro-Ala- LvsfZ)l-Lvs- Arq-fNO?VGIv-AspfOBzn-Val-OBzl>fenilV4,4,5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 618 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{tT-DBoc-Ala- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 421 mg (0.5 mmol) HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzI)-Val-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) N: metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 389 mg (36%) del compuesto del título como un sólido beige. Mpll7 - 120°C. [a]2» =-14.8 (c = 0.01, IMeOH). ESI-EM(m/z) 1913 [M + H]+. IR(KBr) 3312, 2937, 1655, 1530, 1448, 1362, 1257, 835, 744, 697, 592 cm 1.
EJEMPLO 39 Preparación de l,3-dioxo-2-f4,-oxiacet¡l-TN<a-rBoc-Ala-ArqfN02)-Pro-Ala- LvsfZll-Lvs- Arq- AspíOBzn-Phe-OBzl>fenilV4.4,5.5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 618 mg (0.5 mmol) l,3-d¡oxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc- Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fen¡l}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 445 mg (0.5 mmol) de HCLArg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 320 mg (36%) del compuesto del título como un sólido beige. Mpll5 - 118°C. [a]y° =-21.5 (c = 0.16, MeOH). ESI-EM (m/z) 1961 [M + H]+. IR(KBr) 3316, 2936, 1654, 1529, 1448, 1362, 1256, 1169, 742, 698, 593 cm 1.
EJEMPLO 40 Preparación de l.B-dioxo-Z-^'-oxiacetil-rN^fAla-Ara-Pro-Ala-LvsVLvs-Arq- GIV-ASP- Ser1fenilV4.4,5.5-tetrametilimidazolina flal En un baño de hielo, 199 mg (0.1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Ala-Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametil-imidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 hora hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, ajustado a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, desalado con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 109 mg (85%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 134 - 135°C. [a] y =-39.7 (c = 0.12, MeOH). FT- EM(m/z) 1374.7290 [M + H]+, 2748.4580 [2M + H]+, 4122.1870 [3M + H]+, 5495.9160 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3346, 3180, 2920, 1665, 1537, 1449, 1252, 1179, 1030, 837, 801, 720, 639, 518 cm 1.
EJEMPLO 41 Preparación de l.S-dioxo-l-f^-oxiacetil-rN^fAla-Ara-Pro-Ala-LvsVLvs-Arq- Glv-Asp- Val1fenilV4.4.5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, 190 mg (0.1 mmol) l,3-d¡oxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl}fenil}-4,4,5,5- tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 hora hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liof ¡lizadas para dar 96 mg (82%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 143 - 144°C. [cr]^0 =-31.8 (c = 0.01, MeOH). FT-EM(m/z) 1386.7654 [M + H]+, 2772.5308, [2M + H]+, 4158.2962 [3M + H]+, 5544.0616 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3349, 2942, 1659, 1539, 1394, 1250, 1030, 639 crrf1.
EJEMPLO 42 Preparación de 1.3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN<J-fAla-Ara-Pro-Ala-LvsVLvs-Ara- GIV-ASP- Phelfenil>-4,4,5.5-tetrametilimidazolina fiel En un baño de hielo, 194 mg (0.1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Aia-Lys(Z)]-Lys-Arg-(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-0Bzl)fen¡l}-4,4,5,5-tetrametil¡midazol¡na se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 106 mg (81%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 96 - 97°C. =-44.4 (c = 0.15, MeOH). FT-EM (m/z) ESI-EM (m/z) 1444.7654 [M + H]+, ESI-EM(m/z) 2888.5308 [2M + H]+, 4332.2962 [3M + H]+, 5776.0616 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3363, 1665, 1538, 1448, 1256, 1173, 1031, 640, 577, 518 cm \ Preparación del péptido que tiene actividad trombolítica: GRPAK apropiadamente protegido EJEMPLO 43 Preparación de Boc-GIv-ArqfNO^VPro-Ala-LvsfZVOBzl En un baño de hielo, una solución de 438 mg (2.5 mmol) Boc-Gly, 338 mg (2.5 mmol) HOBt, 619 mg (3 mmol) DCC en 10 mi THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 1.785 g (2.3 mmol) HCI-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-Obzl y 232 mg (2.3 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas para dar 1.857 g (90%) del compuesto del título, pf 85 - 87°C. [a]“ =-38.5 (c = 0.11, MeOH). ESI-EM (m/e) 920 [M + Na] +.
EJEMPLO 44 Preparación de Boc-Glv-ArqfNOTI-Pro-Ala-LvsfZ) 907 mg (1 mmol) de Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa NaOH (2N) en un baño de hielo, y luego se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HC1 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y luego se concentró bajo presión reducida a RT para dar 785 mg (82%) del compuesto del título como un sólido incoloro. EI-EM ( m/z ) 816 [M - H]~.
Preparación de conjugados ternarios de GRPAK/imidazolina/RGD (compuestos de fórmula general I-1-2J: Id, le, If EJEMPLO 45 Preparación de 1,3-dioxo-2-f4'-oxiacetil-fNtJ-rBoc-Glv-ArqfNQ2>Pro-Ala- LvsfZJl-Lvs- OMe fenilV4,4,5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 817 mg (1 mmol) Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) HOBt y 250 mg (1 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 480 mg (1 mmol) de l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina y 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHC iMeOH, 40:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 680 mg (52%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 79 - 82°C. [«]„ =-12.3 (c = 0.14, MeOH), ESI-EM(m/z) 1261 [M + Na]+. IR (KBr) 3319, 2935, 1658, 1531, 1448, 1363, 1254, 1168, 1053, 835, 749, 540 cm 1.
EJEMPLO 46 Preparación de l,3-d¡oxo-2-f4,-oxiacetil-fN<0-rBoc-Glv-ArqfNO2VPro-Ala- LvsfZJI- Lvs enin-4.4.5.5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, 1260 mg (1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-ox¡acet¡l-{N“-[Boc-Gly- Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa de NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. Con pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró bajo presión reducida a RT para dar 945 mg (82%) del compuesto del título como un sólido incoloro. EI-EM ( m/z ) 1223 [M - H]~.
EJEMPLO 47 Preparación de l.S-dioxo- -^'-oxiacetil-fN^rBoc-GIv-ArqfNC -Pro-Ala- LvsfZ)l-Lvs- Arq-fN02>Glv-AspfOBzn-Ser(Bzn-OBzl fenil -4,4,5,5-tetrametil- imidazolina En un baño de hielo, una solución de 611 mg (0.5 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacet¡l-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5- tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 442 mg (0.5 mmol) de HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzi)-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 500 mg (48%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 127 - 129°C, [a]„ =-49.4 (c = 0.13, MeOH). ESI-EM(m/z) 1956 [M + H]+. IR(KBr) 3306, 2936, 1652, 1531, 1449, 1362, 1255, 1166, 742, 697, 592 cm 1.
EJEMPLO 48 Preparación de l S-dioxo^-^-oxiacetil-fN^rBoc-Glv-ArqfNO^-Pro-Ala- LvsfZJl-Lvs- Arq-fNO^VGIv-AspfOBzn-Val-OBzITfenilJ-^^.S.S-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 611 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 421 mg (0.5 mmol) de HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl, 50 mg (0.5 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCl3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 392 mg (35%) del compuesto del título como unsólidobeige.pf147-150°C. =-34.6(c= 0.16,MeOH).ESI-EM(m/z)1899 [M + Na]+.IR(KBr)3311,3068,2937,1661,1531,1451,1395,1254,1163,839,743,697,596cm1.
EJEMPLO 49 Preparación de 1,3-d¡oxo-2-f4,-oxiacetil-fNt,i-rBoc-Glv-ArqfNOzJ-Pro-Ala- LvsfZJI-Lvs- Arg-fNC -GIv-AspfOBzn-Phe-OBzITfenilVA^S.S-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 611 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacet¡l-{N“-[Boc-Gly- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys>fenil}-4,4,5,5-tetramet¡limidazolina, 69 mg (0.5 mmol) de HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 445 mg (0.5 mmol) de HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 336 mg (31%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 125 - 128°C. [a]b =-31.3 (c = 0.18, MeOH). ESI-EM (m/z) 1925 [M + H]+. IR(KBr) 3315, 2935, 1657, 1529, 1448, 1361, 1257, 1173, 834, 742, 698, 541 cm 1.
EJEMPLO 50 Preparación de l.B-dioxo-Z-f^-oxiacetil-rir-fGIv-Ara-Pro-Ala-LvsV Lvs-Ara-GIv-Asp- Ser1fenilV4,4,5,5-tetrametilimidazolina fldJ En un baño de hielo, 195 mg (0.1 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl}fenil}-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanesulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 102 mg (82%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 142 - 145°C. [ajo =-29.7 (c = 0.14, MeOH). FT-EM(m/z) 1360.7133 [M + H]+, 2720.4266 [2M + H]+, 4080.1399 [3M + H]+, 5439.8532 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3348, 3180, 2940, 1670, 1539, 1447, 1199, 1134, 1034, 836, 801, 721, 638 cm 1.
EJEMPLO 51 Preparación de l.B-dioxo-Z- '-oxiacetil-rr^-ÍGIv-Arq-Pro-Ala-LvsVLvs-Arq- Glv-Asp- En un baño de hielo, 190 mg (0.1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{l\l“-[Boc-Gly-Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametil- imidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 99 mg (84%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 147 - 149°C. [a] ° =-31.1 (c = 0.17, MeOH). FT-EM(m/z) 1372.7497 [M + H]+, 2744.4994 [2M + H]+, 4116.2491 [3M + H]+, 5487.9988 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3338, 2960, 1662, 1539, 1451, 1392, 1251, 1170, 1030, 639, 519 crrf1.
EJEMPLO 52 Preparación de 1,3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN{>-fGlv-Arq-Pro-Ala-LvsVLvs- Ara-GIv-Asp- Phelfen¡IV4,4.5.5-tetrametilimidazolina fifi En un baño de hielo, 192 mg (0.1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly- Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 106 mg (81%) del compuesto del título como un sólido azul pf 84 - 85°C. [ a ]„ =-54.1 (c = 0.15, MeOH). FT-EM (m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, ESI-EM FT-EM(m/z) 1420.7497 [M + H]+, 2840.4994 [2M + H]+, 4260.2491 [3M + H]+, 5679.9976 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181, 1030, 835, 800, 719, 638 crn 1.
Preparación del peptido que tiene actividad trombolítica: RPAK apropiadamente protegido EJEMPLO 53 Preparación de Boc-ArqfNCM-Pro-Ala-LvsfZ) En un baño de hielo, 850 mg (1 mmol) de Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa de NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y luego el filtrado se concentró bajo presión reducida a RT para dar 742 mg (92%) del compuesto del título como un sólido incoloro. EI-EM (m/z) 849 [M - H]~.
Preparación de conjugados ternarios de RPAK/imidazolina/RGD (compuestos de fórmula general 1-1-31: Iq, Ih. Ii EJEMPLO 54 Preparación de 1,3-dioxo-2~f4,-ox¡acetil-fNtl)-rBoc-Arq(N02>Pro-Ala- LvsfZJl-Lvs- OMe>fenilV4.4.5.5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 760 mg (1 mmol) Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) HOBt y 250 mg (1 mmol) DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 480 mg (1 mmol) de l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]- 4,4,5,5-tetrametilimidazolina y 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 40:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 920 mg (83%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 72 - 76°C. [a ° =-32.7 (c = 0.13, MeOH), ESI-EM(m/z) 1204 [M + Na]+. IR (KBr) 3317, 2937, 1658, 1531, 1447, 1362, 1254, 1168, 1055, 835, 746, 697, 541, 460 crn 1.
EJEMPLO 55 Preparación de j B-dioxo-Z-^-oxiacetil-fN Boc-AraflN^VPro-Ala- LvsfZll- Lvs fenilV4,4.5,5-tetrametilim¡dazolina En un baño de hielo, 1200 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4'-ox¡acet¡l-{N“-[Boc-Arg(N02)- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys-OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró bajo presión reducida a RT para dar 899 mg (80%) del compuesto del título como un azul sólido. EI-EM ( m/z ) 1116 [M - H] .
EJEMPLO 56 Preparación de 1.3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN<>-rBoc-ArqfN02)-Pro-Ala- LvsíZ l-Lvs-Arq- fNQ2VGIv-AspfOBzn-SerfBzn-OBzl fenilV4,4,5,5-tetrametil- imidazolina En un baño de hielo, una solución de 583 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacet¡l-{N“-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametlllm¡dazol¡na, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 442 mg (0.5 mmol) de HCI-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)~Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 421 mg (40%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 77 - 79°C -45.4 (c = 0.15, MeOH). ESI-EM(m/z) 1897 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2934, 1658, 1530, 1449, 1361, 1256, 834, 741, 698, 542 cm 1.
EJEMPLO 57 Preparación de l,3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-fNt0-rBoc-ArafNO2l-Pro-Ala- LvsfZJI-Lvs-Ara- (N07)-Glv-Asp(OBzn-Val-OBzl>fenilV4.4.5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 583 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 421 mg (0.5 mmol) de HCI,Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCi3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 472 mg (42%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 107 - 109°C. [cr]y0 =-28.8 (c = 0.11, MeOH). ESI-EM(m/z) 1820 [M + H]+. IR(KBr) 3314, 2938, 1658, 1531, 1448, 1362, 1258, 742, 698, 594 enY1.
EJEMPLO 58 Preparación de 1,3-dioxo-2- 4,-oxiacetil--fNti-rBoc-Arq(N02,)-Pro-Ala- LvsfZJl-Lvs-Arq- Glv-AspfOBzO-Phe-OBzl>fenil>-4.4,5,5-tetrametil¡midazolina En un baño de hielo, una solución de 583 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacet¡l-{N“-[Boc- Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fen¡l}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 445 mg (0.5 mmol) de HCI'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 420 mg (47%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 141 - 144°C. [a]“ =-35.7 (c = 0.12, MeOH). ESI-EM(m/z) 1867 [M + H]+. IR(KBr) 3319, 2936, 1656, 1529, 1448, 1362, 1257, 1169, 834, 743, 698, 541 cm 1.
EJEMPLO 59 Preparación de l,3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN<J-fArq-Pro-Ala-Lvs)-Lvs-Arq-Glv- ASP- Serlfenil>-4.4.5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, 170 mg (0.1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Ser(Bzl)-0Bzl>fenil}-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 102 mg (82%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 148 - 150°C. [af° =-22A (c = 0.14, MeOH). FT-EM(m/z) 1303.6919 [M + H]+, 2606.3838, [2M + H]+, 3909.0757 [3M + H]+, 5211.7676 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3344, 3080, 2930, 1666, 1535, 1392, 1250, 1181, 1030, 835, 800, 719, 638.
EJEMPLO 60 Preparación de l.B-dioxo- -^'-oxiacetil-rN^fArq-Pro-Ala-LvsVLvs-Arq-Glv- Asp- Vallfenil i-4,4,5,5-tetrametilimidazolina flhl En un baño de hielo, 182 mg (0.1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 99 mg (84%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 137 - 139°C. [a]“ =-34.3 (c = 0.18, MeOH). FT- EM(m/z) ESI-EM(m/z) 1315.7282 [M + H]+, 2630.4564 [2M + H]+, 3945.1846 [3M + H]+, 5259.9128 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3329, 2953, 1665, 1533, 1391, 1198, 1134, 834, 801, 720, 599 crrf 1 EJEMPLO 61 Preparación de l.S-dioxo-Z-^'-oxiacetH-rN^fArq-Pro-Ala-LvsVLvs-Ara-Glv- ASP- Phelfenil>-4,4,5.5-tetrametilimidazolina fin En un baño de hielo, 187 mg (0.1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Arg(N02)-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys-Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl}fen¡l}-4,4,5,5-tetrametilim¡dazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 96 mg (81%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 99 - 100°C 24.7 (c = 0.14, MeOH). FT-EM (m/z) 1363.7282 [M + H]\ 2726.4564 [2M + H]\ 4089.1846 [3M + H]+, 5451.9128 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3322, 3060, 2928, 1661, 1530, 1391, 1303, 1247, 641 cm 1.
Preparación del peptido con actividad trombolítica: PAK apropiadamente protegido EJEMPLO 62 Preparación de Boc-Pro-Ala-LvsíZ) En un baño de hielo, 638 mg (1 mmol) de Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl se disolvió en 3 mi metanol seguido por la adición de una solución acuosa NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. con el pH mantenido a 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró entonces bajo presión reducida a RT para dar 509 mg (91.6%) del compuesto del título como un sólido incoloro. EI-EM (m/z) 547 [M - H]~.
Preparación de conjugados ternarios de PAK/imidazolina/RGD (compuestos de fórmula general I-1-4J: Ii, Ik, II EJEMPLO 63 Preparación de 1,3-dioxo-2-f4'-oxiacetil-fNCl>-rBoc-Pro-Ala-LvsfZn- Lvs-OMe>fenilV 4,4,5.5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 548 mg (1 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z), 135 mg (1 mmol) de HOBt y 250 mg (1 mmol) de DCC en 10 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 480 mg (1 mmol) de l,3-dioxo-2-[(4'-oxiacetil-Lys-OMe)fenil]-4, 4, 5, 5- tetrametilimidazolina y 100 mg (1 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCl3:MeOH, 40:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 876 mg (87%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 77 - 80°C. [a]„ =- 12.6(c = 0.16, MeOH). ESI-EM(m/z) 1003 [M + Na]+. IR (KBr): 3315, 3069, 2937, 1671, 1531, 1449, 1394, 1364, 1302, 1167, 1132, 1054, 836, 743, 698, 596, 541, 458 enV1.
EJEMPLO 64 Preparación de l^-dioxo^- '-oxiacetil-T N^rBoc-Pro-Ala-LvsfZJI- Lvs>fenill-4.4,5,5- tetrametilímidazolina En un baño de hielo, 980 mg (1 mmol) de 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- OMe}fenil}-4,4,5,5-tetrametil¡m¡dazolina se disolvió en 3 mi de metanol seguido por la adición de una solución acuosa de NaOH (2N), y luego se agitó a RT durante 30 min. Con el pH mantenido en 12, la reacción se agitó en el baño de hielo durante 10 min hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC. Con pH ajustado a 7 con HCI 2N, se concentró el líquido de reacción bajo presión reducida y el residuo fue diluido en solución salina 2 mi saturada, se ajustó a pH 2 con HCI 2N y luego se extrajo 3 veces con acetato de etilo (5 mi x 3). La fase combinada de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró, y el filtrado se concentró bajo presión reducida a RT para dar 867 mg (80%) del compuesto del título como un azul sólido. EI-EM {m/z) 965 [M - H]~.
EJEMPLO 65 Preparación de l.S-dioxo-I-f^-oxiacetil-fN Boc-Pro-Ala-LvsfZ^I-Lvs- Arq-fNO^VGIv- Asp(OBzn-Ser(BzlVOBzl>fenilV4,4,5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 483 mg (0.5 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro- Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametil¡midazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 442 mg (0.5 mmol) de HCI'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 421 mg (42%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 97 - 100°C. [ a ]“ =-42.5 (c = 0.14, MeOH). ESI-EM(m/z) 1697 [M + H]+. IR(KBr) 3298, 3070, 2935, 2869, 1642, 1534, 1450, 1369, 1253, 741, 697, 596 at?1.
EJEMPLO 66 Preparación de l,3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN(J-rBoc-Pro-Ala-LvsfZJ1-Lvs- Arq-(NQ2VGIv- Asp Val-OBzlTfenin-4,4,5,5-tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 483 mg (0.5 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc- Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 432 mg (0.5 mmol) de HCI,Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Obzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 357 mg (37%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 117 - 120°C. [a]) “ =-22.3 (c = 0.17, MeOH). ESI-EM(m/z) 1620 [M + H]+. IR(KBr) 3303, 3072, 2935, 1644, 1533, 1451, 1394, 1364, 1255, 1167, 745, 697, 597 enV1.
EJEMPLO 67 Preparación de 1.3-d¡oxo-2~f4'-ox¡acetil-f N^rBoc-Pro-Ala-LvsfZll-Lvs- Arq-fNO l-GIv- AspfOBzh-Phe- tetrametilimidazolina En un baño de hielo, una solución de 483 mg (0.5 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro-Ala- Lys(Z)]-Lys}fenil}-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, 69 mg (0.5 mmol) de HOBt y 126 mg (0.6 mmol) de DCC en 20 mi de THF anhidro se agitó durante 20 min, y luego una solución preparada con 439 mg (0.5 mmol) de HCFArg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0bzl y 50 mg (0.5 mmol) de N-metilmorfolina en 5 mi de THF anhidro se añadió a esto y reaccionó a RT durante 24 horas hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 20:1). La mezcla de reacción se sometió al procedimiento de rutina para dar 472 mg (48%) del compuesto del título como un sólido beige. pf 111 - 114°C. [a]“ =-15.3 (c = 0.13, MeOH). ESI-EM(m/z) 1667 [M + H]+. IR(KBr) 3296, 3071, 2935, 1641, 1534, 1394, 1253, 1170, 834, 745, 697, 594 atG1.
EJEMPLO 68 Preparación de l.S-dioxo-Z-fA'-oxÍacetil-rN^fPro-Ala-LvsyLvs-Arq-GIv-Asp- SerlfenilV 4,4.5, 5-tetrametilimidazolina fli En un baño de hielo, 169 mg (0.1 mmol) l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Ser(Bzl)-0Bzl}fenil>-4, 4, 5, 5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 98 mg (80%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 127 - 128°C. [a]2° =-22.4 (c = 0.13, MeOH). FT-EM(m/z) 1147.5907 [M + H]+, 2294.1814 [2M + H]+, 3440.7721 [3M + H]+, 4587.3628 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3204, 1672, 1543, 1436,1199, 1133, 837, 801, 722, 598 crrf1.
EJEMPLO 69 Preparación de l^-dioxo- -f^-oxiacetil-rN^fPro-Ala-LvsVLvs-Arq-Glv-Asp- VallfenilV 4.4.5.5-tetrametilimidazolina (Ik) En un baño de hielo, 162 mg (0.1 mmol) 1,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl}fen¡l}-4,4,5í5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 96 mg (81%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 123 - 124°C. [a]“ =-24.6 (c = 0.13, MeOH). FT-EM(m/z) 1159.6271 [M + H]+, 2318.2542 [2M + H]+, 3476.8813 [3M + H]+, 4635.5084 [4M + H]+. g = 2.00779. IR(KBr) 3388, 2959, 1666, 1540, 1494, 1198, 1134, 835, 801, 720, 598 cm 1.
EJEMPLO 70 Preparación de 1,3-dioxo-2-f4,-oxiacetil-rN<l)-fPro-Ala-Lvs)-Lvs-Arq-Glv-Asp- PhelfenilV 4.4.5.5-tetrametilimidazolina GIP En un baño de hielo, 169 mg (0.1 mmol) de l,3-dioxo-2-{4'-oxiacetil-{N“-[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-Lys- Arg-(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0Bzl}fenil}-4, 4, 5, 5-tetrametilimidazolina se mezcló con 6 mi de ácido trifluoroacético y 1.5 mi de ácido trifluorometanosulfónico, y se agitó durante 1 h hasta que el material de inicio desapareció como se muestra por TLC (CHCI3:MeOH, 1:1). La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo en varias ocasiones se lavó con éter etílico anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua, se ajustó a pH = 8 con 25% de agua de amoníaco, se desaló con Sephadex G10 y luego se purificó en una columna C18. Las fracciones recolectadas fueron liofilizadas para dar 96 mg (81%) del compuesto del título como un sólido azul, pf 153 - 154°C. [a]2» =-12.6 (c = 0.16, MeOH). FT-EM (m/z) 1207.6271 [M + H]+, 2414.2542 [2M + H]+, 3620.8813 [3M + H]+, 4827.5084 [4M + H]+. g = 2.00789. IR(KBr) 3385, 2938, 1659, 1541, 1450, 1391, 1251, 1126, 963, 841, 599, 456 cm 1.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 1 Experimentos en la depuración del radical NO por compuestos la a II de la presente invención Ratas macho Wistar de 250-300 g de peso se dejaron sin alimentos 12 h antes de la operación con libre acceso al agua potable y sacrificadas por dislocación cervical. Inmediatamente se realizó una toracotomía aorta torácica, los tejidos conectivos unidos a la misma fueron disecados y los vasos fueron cortados en anillos de aorta con una longitud de 3 a 5 milímetros y colocados en un baño de perfusión. El baño contiene 15 mi de solución de Krebs-Henseleit y se mantuvo a una temperatura constante de 37°C, en donde el 95% de gas de 02-5%CO2 se cargó. El ancla a la cual fueron inmovilizados los anillos de aorta fue conectada a un transductor de tensión y las curvas de vasomoción fueron registradas en una grabadora dual-traza a una velocidad de papel de 1 mm/min. Con la tensión estática ajustada a 1.0 g y 30 min de equilibrio, norepinefrina en una concentración final de 108 M fue dosificada para permitir que la aorta se contrajera para pre-excitación. La norepinefrina fue lavada, seguido por 30 min de equilibrio, y norepinefrina se añadió en el baño a una concentración final de 108 M. Cuando la tensión de la contracción fue estable en un nivel de meseta, solución salina normal 20 ml (en blanco), una solución de 20 pl de cualquiera de los compuestos la a II en solución salina normal (en una concentración final de 5xl06 M), o una solución 20 pl de depurador de radical libre NO (1,3-dioxo-2-(4'-oxiacetoxil-fenil)-4, 4,5,5-tetrametilimidazolina, TMMZ) en solución salina normal (en una concentración final de 5xl06 M) se añadió en el baño. Cuando se estabilizó, fue agregada una solución salina normal de acetilcolina 20 pl (en una concentración final de 106 M). La capacidad de depuración NO de los fármacos fue expresada como un porcentaje de inhibición de la vasodilatación inducida por la acetilcolina. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 1.
Como se muestra en los resultados experimentales, la a II fueron capaces de inhibir el efecto vasodilatador de acetilcolina en las piezas del vaso mediante depuración de NO. Como tal, mediante la unión de un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido de direccionamiento RGDS, RGDV o RGDF a un depurador del radical libre (l,3-dioxo-2-(4'-oxiacetoxil-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, TMMZ) via Lys, 9 compuestos tenían actividad substancialmente más alta en la inhibición de la vasodilatación inducida por la acetilcolina que TMMZ, 2 compuestos tenían la misma actividad en la inhibición de la vasodilatación inducida por la acetilcolina como TMMZ y uno compuesto era menos activo en la inhibición de la vasodilatación inducida por la acetilcolina que TMMZ. Entre los 12 compuestos sometidas a evaluación, 4 compuestos tenían un porcentaje de inhibición superior al 30%, y estos 4 compuestos fueron clasificados por actividad de inhibición de la vasodilatación inducida por la acetilcolina como le > Ih > Ib > If. Esto demuestra que la actividad del radical de TMMZ en la depuración de radicales libres NO generalmente fue mejorada por la unión del péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y el péptido de direccionamiento RGDS, RGDV o RGDF el depuardor del radical libre TMMZ vía Lys.
CUADRO 1 Porcentaje de inhibición de la a II de la vasodilatador» inducida por acetilcolina n = 6 ; a) p<0.01 vs. TMMZ ; b) p > 0.05 vs. TMMZ ; c) p<0.05 vs. TMMZ EJEMPLO EXPERIMENTAL 2 Experimentos de lisis de coágulo de eualobulina por los compuestos la a II de la presente Invención La sangre de cerdo fue tomada y mezclada con citrato de sodio 3.8% en una proporción del volumen de 9:1, inmediatamente se centrifugaron a 3000 r/min por 10 min, y plasma pobre en plaquetas fue separado. Se agregaron 2 mi de plasma de cerdo pobre en plaquetas y 36 mi de agua ultrapura en un tubo de centrífuga de 50 mi. En cada tubo, 0.4 mi de ácido acético (1%) fue agregado y mezclado completamente, y el tubo fue colocado en un refrigerador a 4°C durante 10 minutos y luego se centrifugaron a 3000 rpm por 10 min. Los tubos de centrífuga fueron invertidos, y luego se secó la pared interna de los tubos usando un filtro de papel después que el líquido fue drenado. Las pellas de euglobulina resultantes de la centrifugación fueron liofilizadas durante unos 40 minutos y se rasparon. Cerca de 35 mg de euglobulina se agitaron y disolvieron en 7 mi de regulador de pH de bórax (pH 9.28). La euglobulina fue disuelta en su mayoría después de 1 hora, en donde 0.7 mi de solución de CaCI2 fue agregada y colocada inmediatamente en una placa de vidrio de 10 x 10 cm con un espesor de aproximadamente 1 mm. Después de la formación de coágulos, la solución salina normal 10 mI o 10 ml de una solución de uno de los compuestos la a II en solución salina normal (1 m ) o 10 mI de una solución de uroquinasa en solución salina normal (0.8 mg/ml) se pipetea y se coloca sobre la placa de coágulo, con un intervalo entre cada dos gotas más de 1.5 cm y cada muestra fue colocada 3 veces. Se midió el diámetro del círculo de lisis del coágulo después de 4 horas, y las lecturas se enumeran en el cuadro 2.
Como se muestra en los resultados experimentales, al unir un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido de direccionamiento RGDS, RGDV o RGDF a un depurador del radical libre TMMZ via Lys, todos los compuestos exhibieron actividad de lisis de coágulo de euglobulina sustancial.
CUADRO 2 El diámetro de lisis de coágulo de eualobulina 4 horas de tratamiento Ia-II n=3 ; a) p < 0.01, vs. Ia-I EJEMPLO EXPERIMENTAL 3 Experimentos in vitroáe trombólisis para compuestos la a II de la presente invención Las ratas SD (macho, 350 a 400 g) fueron anestesiadas por inyección intraperitoneal de una solución de uretano en una dosis del200 mg/kg. Las ratas anestesiadas se fijaron en una posición supina, y la arteria carótida común derecha fue diseccionada, afianzada en el extremo proximal con un clip arterial y penetrada con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente. La sutura en el extremo distal se recorta firmemente por una pinza hemostática en el pelaje. La canulación se realizó en el extremo distal, la pinza de la arteria se quita, y la sangre arterial total se descarga en un contenedor de 50 mi previamente tratado con aceite de silicona. 0.8 mi de sangre arterial de rata se inyecta en un tubo de vidrio fijado verticalmente (20 mm en longitud, con un diámetro interno de 4 mm y un diámetro exterior de 5 mm, sellado con un tapón de caucho en la parte inferior), en que se insertó inmediatamente un tornillo de inmovilización de trombo hecho de acero inoxidable. El tornillo de inmovilización de trombo, formado por espirales de un alambre de acero inoxidable que tiene un diámetro de 0.2 mm, tiene una parte espiral de 18 mm de longitud, 15 bobinas cada una que tiene un diámetro de 1.8 mm, y un vástago de 7.0 mm de longitud que es conectado con la parte espiral y tiene una forma tipo signo de interrogación. 40 Minutos después de que la sangre se coagula, el tapón de caucho en la parte inferior del tubo de cristal se remueve, el vástago del tornillo de inmovilización de trombo se corta por fórceps, y el tornillo de inmovilización de trombo envuelto de trombo cuidadosamente se toma cuidadosamente en el tubo de vidrio. El tornillo después se suspendió y sumergió en agua triple destilada para eliminar el exceso de sangre, y se pesó con exactitud después de 1 hora. El trombo se suspendió en 8 mi de solución salina normal, o una solución de compuestos Ia-II en solución salina normal (en una concentración de 100 nM), o una solución de ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK en solución salina normal (en una concentración de 100 nM), o una solución de uroquinasa en solución salina normal (100 IU/ml), entonces se agitó a 37°C en un agitador termostático (63 r/min)y se eliminó después de 2 h y se pesó exactamente para determinar el peso del trombo. La diferencia en masa del trombo antes y después de la administración se calculó, y los resultados se enlistan en el cuadro 3.
Como se muestra en los resultados experimentales, al enlazar un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido objetivo RGDS, RGDV o RGDF a un depurador de radical libre TMMZ vía Lys, todos los compuestos exhiben actividad trombolítica in vitro sustancial. Puesto que la actividad de la a Ic es comparable a la de ARPAK, la actividad de Id a If es comparable a la de GRPAK, la actividad de Ig a Ii es comparable a la de RPAK, y la actividad de Ij a Ii es comparable a la de PAK, por un lado la actividad in vitro trombolítica la a II podría atribuirse a la actividad del péptido de trombolítico, y por otro lado en enlace del péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y el péptido objetivo RGDS, RGDV o RGDF para el depurador de radical libre TMMZ vía Lys no reduce la actividad del péptido trombolítico.
CUADRO 3 Actividad trombolítica in vitro por 2 horas de tratamiento de Ia-II n=6 ; a) p < 0.01, vs. Ia-II EJEMPLO EXPERIMENTAL 4 Experimentos de trombólisis ¡n vivo para compuestos la a II de la presente invención Las ratas SD (macho, 220 a 230 g) se anestesiaron por inyección intraperitoneal de una solución de uretano en una dosificación del200 mg/kg. Las ratas anestesiadas se fijaron en una posición supina, y la arteria carótida común derecha fue diseccionada, afianzada en el extremo proximal con un clip arterial y penetrada con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente. La sutura en el extremo distal se sujeta firmemente por un sujetador hemostático en el pelaje. La canulación se realizó en el extremo distal, el sujetador arterial se quitó y aproximadamente 1 mi de sangre arterial se descargó en un Eppendorf de 1 mi. 0.1 mi de sangre arterial de rata se inyecta en un tubo de vidrio fijado verticalmente (15 mm en longitud, con un diámetro interno de 2.5 mm y un diámetro exterior de 5.0 mm, sellado con un tapón de caucho en la parte inferior), en que se insertó inmediatamente un tornillo de inmovilización de trombo hecho de acero inoxidable. El tornillo de inmovilización de trombo, formado por espirales de un alambre de acero inoxidable que tiene un diámetro de 0.2 mm, tiene una parte espiral de 12 mm de longitud, 15 bobinas cada una que tiene un diámetro de 1.8 mm, y un vástago de 1.0 mm de longitud que es conectado con la parte espiral y tiene una forma tipo signo de interrogación. 15 minutos después de que la sangre se coaguló, el tapón de caucho en la parte inferior del tubo de vidrio se removió, el vastago del tornillo de inmovilización de trombo se sujetó por fórceps, y el tornillo de inmovilización de trombo envuelto con trombo se tomó cuidadosamente con el tubo de vidrio y después se pesó exactamente.
Una cánula de derivación está compuesta de 3 segmentos. El segmento medio es una tubería de polietileno que tiene una longitud de 60.0 mm y un diámetro interno de 3.5 milímetros. Los segmentos en ambos extremos son similares a los tubos de polietileno que tienen una longitud de 100.0 mm, un diámetro interno de 1.0 mm y un diámetro exterior de 2.0 mm, uno de cuyos extremos se tiró para formar una punta, con un diámetro exterior de 1.0 mm, que puede insertarse en la arteria carótida o vena de rata, y el otro extremo del cual se forró por un tubo de polietileno que tiene una longitud de 7.0 mm y un diámetro exterior de 3.5 mm (engrosada para insertarse en la tubería de polietileno del segmento medio). La pared interna de la cánula del segmento 3 es completamente sililada (con 1% de aceite de silicona en éter etílico). El tornillo de inmovilización de trombo envuelto con trombo se colocó en la tubería de polietileno del segmento medio, y ambos extremos de la tubería forran los extremos engrosados de los dos tubos de polietileno. La cánula se llenó con una solución de heparina en solución salina normal (50 IU/kg) a través del extremo con punta mediante el uso de un inyector y está lista para su uso. La tráquea de la rata anestesiada entonces se diseccionó y se realizó la canulación traqueal. La vena carótida externa izquierda de la rata se diseccionó, y penetró con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente. Una incisión abierta irregular se hizo cuidadosamente en la vena carótida externa izquierda expuesta, y la punta de la cánula de derivación preparada como se describió anteriormente se insertó en el extremo proximal de la incisión abierta en la vena carótida externa izquierda, lejos del vástago del tornillo de inmovilización del trombo en el segmento medio de la cánula de derivación (que acomodó el tornillo de inmovilización de trombo pesado exactamente). Una cantidad precisa de heparina en solución salina (50 IU/kg) se inyectó a través de la punta en el otro extremo al usar un inyector. En este momento, sin remover el inyector del tubo del etileno, la tubería entre el inyector y el tubo de polietileno se sujetó con fórceps. El flujo de sangre se detuvo por la sujeción del extremo proximal de la arteria carótida común derecha con un sujetador arterial, y una incisión abierta desigual se cortó cuidadosamente a través de la arteria carótida común cerca del sujetador. El inyector se sacó de la punta del tubo de polietileno, y la punta del tubo de polietileno entonces se insertó en el extremo proximal de la incisión abierta de arteria. Ambos extremos de la cánula de derivación se fijaron a la arteria o vena con suturas #4.
La solución salina normal (3 ml/kg), o una solución de uroquinasa en solución salina normal (en una dosis de 20000 IU/kg), o una solución de uno de los compuestos Ia-II en solución salina normal (en una dosis de 0.1 pmol/kg), o una solución de ARPAK, GRPAK, RPAK or PAK en solución normal (en una dosis de 1 pmol/kg), se conectó a una posición cercana a la vena lejos del tornillo de inmovilización de trombo utilizando una aguja del cuero cabelludo para punción del segmento medio de la cánula de derivación (que acomodó el tornillo de inmovilización de trombo pesado exactamente). El sujetador de arteria entonces se removió para permitir que la sangre fluya desde la arteria a la vena a través de la cánula de derivación. Un modelo de trombosis de derivación arteriovenosa de rata entonces se estableció. La solución en el inyector se inyectó lentamente en la sangre, que permite la solución salina normal (control en blanco), uroquinasa (control positivo), ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK (control de componente), o Ia-II actuar en el trombo a través de la circulación de sangre en el orden de vena-corazón-arteria. El procedimiento estaba programado en el comienzo de la inyección, y el tornillo de inmovilización de trombo se removió de la cánula de derivación después de 1 h y se pesó exactamente. La diferencia en la masa del tornillo de inmovilización de trombo en la cánula de derivación de rata antes y después de la administración se determinó, y los resultados experimentales se muestran en el cuadro 4.
Como se muestra en los resultados experimentales, no sólo los compuestos Ia-Ic, obtenidos mediante la unión de un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido objetivo RGDS, RGDV o RGDF con un depurador del radical libre TMMZ vía Lys, mostraron actividad trombolítica en una dosificación de 0.1 pmol/kg, la potencia de su actividad también es comparable a la del péptido trombolítico correspondiente ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK en una dosificación de 1 pmol/kg. Como tal, al enlazar el péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y el péptido objetivo RGDS, RGDV o RGDF con el depurador del radical libre TMMZ vía Lys, la dosificación efectiva podría reducirse 10 veces.
CUADRO 4 Actividad trombolítica in vivo de Ia-II n = 10 ; a) p < 0.01 vs. Ia-II EJEMPLO EXPERIMENTAL 5 Experimentos anti-trombos in vivo para compuestos la a II de la presente invención Las ratas SD (macho, 220 a 230 g) se dividieron aleatoriamente en grupos con 11 ratas en cada grupo. Las ratas se alimentaron en un estado de descanso por 1 día y ayunaron durante la noche. Las ratas recibieron solución salina normal (en una dosis de 3 ml/kg), una solución de uno de los compuestos Ia-II en solución salina normal (en una dosis de 0.1 pmol/kg), una solución del péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF en solución salina normal (en una dosis de 10 pmol/kg), o aspirina (en una dosis de 33 mg/kg) en promedio. Después de 30 min, las ratas se anestesiaron con 20% de solución de uretano, y la arteria carótida derecha y la vena carótida izquierda se diseccionaron. Una cánula se llenó con heparina de sodio en solución salina normal, y uno de sus extremos se insertó en la vena izquierda, mientras que el otro extremo se inyectó con una cierta cantidad de heparina de sodio para la anticoagulación con un inyector y entonces se insertó en la arteria derecha. La sangre fluyó desde la arteria derecha a la vena izquierda a través de la tubería de polietileno, y el hilo atado con trombo se tomó después de 15 minutos y se registró su peso. Se determinó el peso de trombo húmedo al sustraer el peso del hilo del peso total. Los resultados se muestran en el cuadro 5. Los resultados se muestran en el Cuadro 5.
Como se muestra en los resultados experimentales, no sólo compuestos Ia-Ic, obtenidos mediante el enlace de un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF a un depurador de radical libre TMMZ vía Lys, mostró actividad antitrombo en una dosificación oral de 0.1 pmol/kg, la potencia de su actividad también es comparable a la del péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF a una dosificación de 10 pmol/kg. Como tal, al enlazar el péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y el péptido objetivo RGDS, RGDV o RGDF con el depurador del radical libre TMMZ vía Lys, la dosificación efectiva podría reducirse 100 veces.
CUADRO 5 Actividad anti-trombolítica in vivo de Ia- n=ll ; a) p < 0.01 vs. Ia-II Establecimiento de modelos animales para la evaluación de la eficacia de los compuestos de acuerdo con la presente invención en el tratamiento de pacientes con apoplejía (1) El protocolo experimental de rata descrito aquí es de acuerdo con la dirección de Geneva en experimentos con animales y se aprobó por el Comité de ética del colegio. Las ratas SD macho saludables de grado limpio, que pesan 280 a 305 g, se adquirieron de Laboratorios Vital River de animales experimentales. Estas ratas se utilizaron al azar para la preparación del trombo o establecimiento de modelos de apoplejía. (2) Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. La arteria carótida se diseccionó, 15 mi de sangre arterial fresca se extrajo y alícuotas de 10 ml de cada uno entonces se agregó en viales EP de 1.5 mi. El trombo formado se mantuvo a RT por 2 h y luego en un refrigerador a -20°C durante 22 horas. Cuando se utiliza, la solución salina de 0.5 mi se ha añadido al trombo que se disolvió mediante el uso de una varilla de vidrio, con el fin de preparar una solución de suspensión de homogenado de trombo, con un volumen de aproximadamente 0.1 mm3 para cada una de las piezas de trombo. (3) Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. La arteria carótida se diseccionó, 15 mi de sangre arterial fresca se extrajo y alícuotas de 10 pl de cáda uno entonces se agregó en viales EP de 1.5 mi. El trombo formado se mantuvo en primer lugar a temperatura ambiente durante 24 horas. Cuando se utiliza, 0.5 mi de solución salina se añadieron al trombo que se disolvió mediante el uso de una varilla de vidrio, con el fin de preparar una solución de suspensión de homogenado de trombo, con un volumen de aproximadamente 0.1 mm3 para cada una de las piezas de trombo. (4) Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas SD macho en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria interna carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. La vena externa yugular principal se diseccionó, y solución salina normal (control en blanco) o una solución de los compuestos de la presente invención en solución salina normal se infundió a través de la vena externa yugular. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. El modelo del tratamiento inmediato después del inicio de la apoplejía se estableció así. (5) Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó ¡ntraperltonealmente en ratas SD macho en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 4 horas, 6 horas o 24 horas, solución salina normal (control en blanco) o una solución de los compuestos de la presente invención en solución salina normal se infundió a través de la vena de la cola. Los modelos de rata de 4 horas, 6 horas o 24 horas post-comienzo del tratamiento de apoplejía así se establecieron.
Establecimiento de modelos animales para la evaluación de la eficacia de los compuestos de acuerdo con la presente invención después de 4 horas. 6 horas v 24 horas de apoplejía (1) La eficacia después de un tratamiento, post-comienzo 4 horas, inmediato, y tratamiento post-comienzo de 6h de ratas con apoplejía con los compuestos de acuerdo con la presente invención significa que el resultado de la puntuación de los comportamientos en las ratas 24 horas después de que las ratas recuperaron la conciencia. Los comportamientos incluyen la manera de caminar, el grado de caída del parpado del ojo derecho, el grado de rigidez de la cola, tensión de los músculos, el grado de cabeceo, la fuerza del apoyo de las extremidades y el estado de muerte. (2) La eficacia en el tratamiento post-comienzo de 24 horas de la apoplejía en ratas con los compuestos de acuerdo con la presente invención significa el resultado de la observación de comportamientos ratas 24 horas después de que las ratas recuperaron la conciencia. Los comportamientos incluyen la manera de caminar, el grado de caída del parpado del ojo derecho, el grado de rigidez de la cola, tensión de los músculos, el grado de cabeceo, la fuerza del apoyo de las extremidades y el estado de muerte. (3) La eficacia en ratas con apoplejía tratados una vez con el compuesto de la presente invención se comparó con la eficacia en las ratas con apoplejía tratadas una vez con una solución salina. (4) Las ratas con apoplejía con tratamiento continuo se inyectaron con los compuestos de la presente invención en solución salina normal cada 24 horas a través de la vena de la cola. Al día siguiente, los videos se registraron, y se hizo una comparación entre los resultados registrados.
Resultados de la prueba de los compuestos la a II de acuerdo con la presente invención en los modelos animales anteriores son los siguientes: EJEMPLO EXPERIMENTAL 6 Experimentos en ratas que recibieron tratamiento inmediato después del comienzo de apoplejía con compuestos la a II de la presente invención La actividad in vivo anti-apoplejia de la presente invención se representó por las puntuaciones de la función neural, con una puntuación inferior que Indica mayor actividad. Una solución de hidrato de doral al 10% (400 mg/kg) se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD (250-300g) para la anestesia. Una incisión abierta de 2 cm de longitud se hizo longitudinalmente ligeramente de la derecha al centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha, arteria externa carótida y arteria interna carótida se diseccionaron en el margen de la parte interior de los músculos esternocleidomastoideos. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos. Una pequeña incisión abierta se hizo a través de la arteria externa carótida, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. El sujetador arterial en el extremo proximal de la arteria externa carótida se liberó, y 10 ml de sangre se extrajo antes de que el extremo proximal de la arteria carótida común es ocluido otra vez con el sujetador arterial no invasivo. 10 pl De sangre extraída se colocó en un vial EP de 1 mi y se mantiene a temperatura ambiente durante 30 min para la coagulación de la sangre, y luego son transferidos a un refrigerador a -20°C durante 1 hora para permitir la coagulación. Después de 1 hora, los coágulos de sangre se tomaron, en que 1 mi de solución salina se añadió, y luego entraron en el microtrombo uniforme usando una espátula de acero. La suspensión del microtrombo entonces se trasfirió a un inyector de 1 mi hasta su uso. Al mismo tiempo, cuando el sujetador en la arteria interna carótida de la rata se liberó, 1 mi de suspensión de trombo en el inyector se inyectó lentamente desde la arteria externa carótida de la rata hasta su extremo proximal, y la suspensión se inyectó en el cerebro de la rata a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria externa carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y flujo sanguíneo se restableció. La vena yugular común de las ratas se diseccionó. La vena se ligó Inmediatamente, 3 gotas de penicilina se dejaron caer en el sitio de la herida, la herida se cosió, y los animales se dejaron venir alrededor, como el grupo de operación simulado. O la inyección de uroquinasa en solución salina normal (grupo control positivo, en una dosificación de 20000 Ul/kg), solución salina normal (grupo control en blanco, en una dosificación de 3 ml/kg), TMMZ en solución salina normal (grupo de control componente, en una dosificación de 1 pmol/kg), un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK en solución salina normal (grupo de control de componente, en una dosificación de 1 pmol/kg) o uno de los compuestos Ia-II en solución salina normal (en una dosificación de 0.1 pmol/kg) se lleva a cabo. 24 horas después de que las ratas se despiertan, el grado de daño en la función neural se evaluó por el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 índica muerte. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 6.
Como se muestra en los resultados experimentales, los compuestos Ia-Ic, obtenidos mediante el enlace de un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF con un depurador del radical libre TMMZ vía Lys, muestran actividad antiapoplejía en una dosificación de 0.1 pmol/kg, mientras que uroquinasa no exhibe actividad antiapoplejía en una dosis de 20000 IU/kg. Del mismo modo, el péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK no exhiben actividad anti-apoplejía en una dosificación de 1 pmol/kg. Como tal, al enlazar el péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y el péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF para el depurador del radical libre TMMZ vía Lys, los compuestos se proporcionaron con la función anti-apoplejía. Especialmente, en la dosificación de 1 pmol/kg, 4 compuestos tienen actividad antiapoplejía comparable a la de la uroquinasa en una dosificación de 20000 IU/kg, y 8 compuestos tienen actividad anti-apoplejía más alta notablemente que la de uroquinasa en una dosificación de 20000 IU/kg.
CUADRO 6 Actividad anti-apopleiía in vivo de Ia-Ic n = 10 ; a) p > 0.05 vs. solución salina normal; b) p > 0.05 vs. uroquinasa; p< 0.01 vs. solución salina normal; c) p< 0.01 vs. solución salina normal o uroquinasa EJEMPLO EXPERIMENTAL 7 Experimentos sobre el volumen de infarto cerebral en ratas que recibieron un tratamiento inmediato con compuestos la a II de la presente invención despues del comienzo de la apoplejía Después de que las ratas se despiertan durante 24 horas y se evalúan por su grado de daño en la fundón neural en el ejemplo experimental 6, son anestesiadas con uretano seguido por decapitación inmediata y eliminación del cerebro. Los tejidos del cerebro se mantuvieron en un refrigerador a -20°C durante 2 horas, y las secciones coronales de aproximadamente 2 mm se rebanaron sucesivamente desde el extremo prefrontal para un total de 6 secciones, y luego se colocaron en una solución de TTC de 2% para incubar en la oscuridad a 37°C durante 30 min. Se observó el cambio de color en secciones del cerebro: tejidos cerebrales normales se tiñeron de rojo por TTC, mientras que los tejidos cerebrales isquémicos, es decir, tejidos cerebrales infartos, aparecen en un color blanco. Las fotografías se tomaron usando una cámara digital y se procesaron con el software estadístico SPSS, y el volumen de infarto en los tejidos cerebrales y el volumen de los tejidos cerebrales normales en las secciones coronales se calcularon. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 7.
Como se muestra en los resultados experimentales, no sólo los compuestos Ia-Ic, obtenidos mediante el enlace de un péptido trombolítico ARPAK, GRPAK, RPAK o PAK y un péptido dirigido RGDS, RGDV o RGDF a un depurador de radical libre TMMZ vía Lys, exhibió un efecto en la reducción del volumen de Infarto cerebral en ratas con apoplejía en una dosificación de 0.1 pmol/kg, tal efecto es sustancialmente más potente que el de uroquinasa en una dosificación de 20000 IU/kg.
CUADRO 7 Volumen del infarto cerebral en ratas con apoplejía con Ia-Ic n = 10 ; a) p > 0.05, vs. solución salina normal; b) p<0.01 vs. solución salina normal y Ia-Ic EJEMPLO EXPERIMENTAL 8 Experimentos en ratas que recibieron tratamiento inmediato con diferentes dosificaciones del compuesto le de la presente invención despues del comienzo de la apoplejía Después del análisis y la comparación de todos los resultados experimentales en la presente invención, el compuesto le se utilizó como el representante, con el fin de demostrar el efecto terapéutico dependiente de dosis exhibido por los compuestos la a II en los experimentos anteriores. Cabe señalar que otros compuestos de la a II podrían alcanzar el efecto terapéutico dependiente de dosis similar como el compuesto le, ya que los otros compuestos de la a II han logrado el mismo efecto que el compuesto le en la depuración de radical libre NO, lisis de coagulo de euglobulina, trombólisis, acción anti-trombo y tratamiento de apoplejía en ratas.
Una solución de hidrato de doral al 10% (400 mg/kg) se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD (250 a 300 g) para la anestesia. Una incisión de aproximadamente 2 cm de longitud se hizo longitudinalmente ligeramente de la derecha al centro del cuello, y la arteria común carótida derecha, arteria externa carótida y arteria interna carótida se diseccionaron en el margen del lado interior de los músculos esternocleidomastoideos. La incisión abierta en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidos respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos. Se hace una pequeña incisión en la arteria externa carótida, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. El sujetador arterial en el extremo proximal de la arteria externa carótida se liberó, y 10 ml de sangre se extrajeron antes de que el extremo proximal de la arteria carótida común sea ocluido otra vez con un sujetador arterial no invasivo. 10 pl de sangre extraída se colocaron en un vial EP de 1 mi y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min hasta la coagulación de la sangre, y luego se transfirió a un refrigerador a -20°C durante 1 hora para permitir la coagulación sólida. Después de 1 hora, los coágulos de sangre se tomaron, se añadieron en 1 mi de solución salina, y luego se rompieron en microtrombo relativamente uniforme al usar una espátula de acero. La suspensión de microtrombo entonces se transfirió en un inyector de 1 mi hasta su uso. Al mismo tiempo, cuando el sujetador en la arteria interna carótida de la rata se liberó, 1 mi de la suspensión de trombo en el inyector se inyectó lentamente desde la arteria externa carótida de la rata a su extremo proximal, y luego se inyectó en el cerebro de la rata a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria externa carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. La inyección de uroquinasa en solución salina normal (grupo de control positivo, en una dosificación de 20000 Ul/kg), tPA en solución salina normal (grupo de control positivo, en una dosificación de 3 mg/kg), solución salina normal (grupo de control blanco, en una dosificación de 3 ml/kg) o compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 1 pmol/kg, 0.1 pmol/kg ó 0.01 pmol/kg) se llevó a cabo. 24 horas después de que las ratas se despiertan, el grado de daño en la función neural se evaluó por el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 8. Como se muestra en los resultados, en ratas que reciben tratamiento inmediato después del comienzo de la apoplejía con 1 pnmol/kg, 0.1 pnmol/kg y 0.01 pnmol/kg de compuesto le, el porcentaje de ratas con una puntiación de la función neural de 0 es 60%, 30% y 0%, respectivamente; y el porcentaje de ratas con una puntuación de la función neural de 1 es 20%, 30% y 10%, respectivamente. Así, muestra que la actividad anti-apoplejía del compuesto le es dependiente de la dosis. Además, en ratas con apoplejía tratadas con 20000 Ul/kg de uroquinasa y 3 mg/kg de tPA, el porcentaje de ratas con una puntuación de la función neural de 0 10% y 40%, respectivamente, y el porcentaje de ratas con una puntuación de la función neural de 1 es 50% y 10%, respectivamente; en comparación, la eficacia de 1 pnmol/kg y 0.1 pnmol/kg de compuesto le es obviamente superior.
CUADRO 8 Actividad anti-apopleiía in vivo del compuesto le de la presente invención diferentes dosis n = 10 ; a) p< 0.01 vs. solución salina normal EJEMPLO EXPERIMENTAL 9 Experimentos con ratas que reciben 6 tratamientos sucesivos con 1 umol/kq del compuesto le de la presente invención 4 horas despues del comienzo de la apoplejía La eficacia se representó por la puntuación de la función neural, y una puntuación baja indica mayor eficacia. Una solución de hidrato de clora! al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de arteria común carótida derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 4 horas, el compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 1 pmol/kg, n = 11), uroquinasa en solución salina normal (en una dosificación de 20000 IU/kg, n =6) o tPA en solución salina normal (en una dosificación de 3 mg/kg, n =6) es infundida a través de la vena de la cola. La infusión del compuesto le en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante 6 días consecutivos, se observó por 7 días. Las ratas se compararon entre sí cada día, y se evaluó para el grado de daño en la función neural por el método Zealonga. Alternativamente, la infusión de uroquinasa en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante dos días consecutivos, las ratas se compararon entre sí cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neuronal mediante el método Zealonga. Alternativamente, la infusión de tPA en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante dos días consecutivos, las ratas se compararon entre sí cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neuronal mediante el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en los cuadros 9-1, 9-2 y 9-3.
Los datos en el cuadro 9-1 demostraron que, en las ratas que recibieron el tratamiento 4h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de lpmol/kg compuesto le cada día durante 6 días consecutivos, excepto uno que murió accidentalmente en el día 2, 8 de las restantes 10 ratas recuperadas no tienen ninguna señal de pérdida en función neural mientras que las demás 2 ratas tienen sólo la señal de pérdida leve en la función neuronal. Por lo tanto, el compuesto le exhibió un efecto terapéutico en una dosificación de 1 pmol/kg en apoplejía más allá de la ventana de tratamiento dorada.
CUADRO 9-1 La eficacia en ratas que reciben tratamiento con 1 umol/kq del compuesto le de la presente invención 4 h después del inicio de apoplejía Los datos en el cuadro 9-2 demostraron que, en las ratas que recibieron el tratamiento 4 h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 20000 IU/kg uroquinasa cada día, 2 de cada 6 ratas murieron dentro de 48 horas, En la autopsia de las ratas muertas, ambos muestran hemorragia en órganos internos, particularmente severa hemorragia en los pulmones. Por lo tanto, el régimen de dosificación se suspendió después de dos dosis. No hay ratas después que reciben dos dosis recuperadas que tengan señales de pérdida de función neural o que tengan sólo la señal de pérdida leve en la función neuronal.
CUADRO 9-2 Eficacia en las ratas que reciben el tratamiento con 20000 IU/kg de uroaumasa 4h despues del comienzo de la apoplejía Los datos en el cuadro 9-3, demostraron que, en ratas que recibieron el tratamiento 4h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 3 mg/kg tPA cada día, 1 de cada 6 ratas murieron dentro de 24 horas. En la autopsia de la rata muerta, se mostró hemorragia en los órganos internos, particularmente severa hemorragia en los pulmones. Por lo tanto, el régimen de dosificación se suspendió después de dos dosis. No hay ratas después de recibir dos dosis recuperadas que tengan señal de pérdida en la función neural, y 2 ratas recuperadas que tengan sólo el signo de pérdida leve en la función neural.
CUADRO 9-3 Eficacia en ratas que reciben tratamiento con 3 ma/ka tPA 4 h después del inicio de apoplejía En el resumen de los datos en el cuadro 9-1, 9-2 y 9-3, incluso para las ratas que recibieron tratamiento de 4h después del comienzo de la apoplejía durante dos días consecutivos, el compuesto le en una dosificación de 1 pmol/kg muestra mucha mayor eficacia que la uroquinasa en una dosificación de 20000 IU/kg y tPA en una dosificación de 3 mg/kg.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 10 Experimentos en ratas que recibieron 6 tratamiento sucesivos con 1 umol/kq del compuesto le de la presente invención 6h despues del inicio de la apoplejía La eficacia se representó por la puntuación de la función neural, y una puntuación baja indica mayor eficacia. Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 6 horas, el compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 1 pmol/kg, n = 11), uroquinasa en solución salina normal (en una dosificación de 20000 IU/kg, n =6) o tPA en solución salina normal (en una dosificación de 3 mg/kg, n =6) es infundida a través de la vena de la cola. La infusión del compuesto le en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante 6 días consecutivos, se observó por 7 días. Las ratas se compararon entre ellas cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neural por el método Zealonga. Alternativamente, la infusión de uroquinasa en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante dos días consecutivos, las ratas se compararon entre sí cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neuronal mediante el método Zealonga. Alternativamente, la infusión de tPA en solución salina normal a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante dos días consecutivos, las ratas se compararon entre sí cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neuronal mediante el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hada el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en los cuadros 10-1, 10-2 y 10-3.
Los datos en el cuadro 10-1 demostraron que, en las ratas que recibieron tratamiento 6 h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de lpmol/kg de compuesto le cada día durante 6 días consecutivos, que excluyen dos que accidentalmente murieron en el día 2, 2 de las 9 ratas restantes recuperadas que no tienen una señal de pérdida de función neuronal, una rata recuperada que tiene sólo la señal de pérdida leve en la función neuronal, y 6 mostraron el signo de que caminan dando pequeñas vueltas en círculos hacia el lado no dañado. Por lo tanto, el compuesto le exhibió un efecto terapéutico en una dosificación de 1 pmol/kg en apoplejía más allá de la ventana de tratamiento dorada.
CUADRO 10-1 Eficacia en ratas que reciben tratamiento con 1 umol/kq del compuesto le de la presente invención 6 h después dei inicio de apoplejía Los datos en el cuadro 10-2 demostraron que, en las ratas que recibieron el tratamiento 6h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 20000 IU/kg uroquinasa cada día, 4 de 6 ratas murieron dentro de 24 horas. En la autopsia de las ratas muertas, todas mostraron hemorragia en órganos internos, particularmente severa hemorragia en los pulmones. Por lo tanto, el régimen de dosificación se suspendió después de dos dosis. Una rata después de recibir dos dosis recuperada que no tiene ninguna señal de pérdida de función neuronal, y una rata mostró la señal de que camina involuntaria con alteración de la conciencia.
CUADRO 10-2 Eficacia en ratas oue reciben el tratamiento con 20000 IU/kq de uroaumasa 4h despues del comienzo de la apoplejía Los datos en el cuadro 10-3, mostraron que, en ratas que recibieron el tratamiento 6h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 3mg/kg tPA cada día, 2 de cada 6 ratas murieron dentro de 24 horas. En la autopsia de las ratas muertas, ambas mostraron hemorragia en órganos internos, particularmente severa hemorragia en los pulmones. Por lo tanto, el régimen de dosificación se suspendió después de dos dosis. No hay ratas después de recibir dos dosis recuperadas que no tienen ninguna señal de pérdida de la función neuronal, 2 ratas recuperadas que tienen sólo la señal de pérdida leve en la función neuronal, y una rata mostró el signo de perseguir la cola caminando en círculos hacia el lado intacto, y una rata demostró el signo de caminar de forma involuntaria con alteración de la conciencia.
CUADRO 10-3 Eficacia en ratas que reciben tratamiento con 3mq/kg tPA 6 h después del inicio de apoplejía En resumen de los datos en el cuadro 10-1, 10-2 y 10-3, Incluso para las ratas que recibieron tratamiento 6 h después del comienzo de la apoplejía durante dos días consecutivos, el compuesto le en una dosificación de 1 pmol/kg mostró mucha mayor eficacia que la uroqulnasa en una dosis de 20000 IU/kg y tPA en una dosis de 3 mg/kg.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 11 Experimentos con ratas que reciben tratamientos 6h despues del comienzo de la apoplejía con el compuesto le de la presente invención en una dosificación inicial de 5 umol/ko v 5 dosificaciones subsecuentes de 2 umol/kq cada una La eficacia se representó por la puntuación de la función neural, y una puntuación baja indica mayor eficacia. Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 6 horas, el compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 5 pmol/kg, n = 12), es infundido a través de la vena de la cola. La infusión del compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 2 pmol/kg, n = 12) a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante 6 días consecutivos, se observó por 7 días. Las ratas se compararon entre ellas cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neural por el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 11.
Los datos en el cuadro 11 demostraron que, la eficacia se mostró en las ratas que recibieron tratamiento 6 h después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 5 pmol/kg de compuesto le en el día 1 y una dosis de 2 pmol/kg de compuesto le en el día 1 durante los 5 días siguientes. Entre las 12 ratas que recibieron el tratamiento, dos murieron, mientras que 6 de las restantes 10 ratas recuperadas no tienen ninguna señal de pérdida de función neuronal, dos tienen solamente la señal de la leve pérdida de la función neuronal, una mostró la señal de caminar hacia el lado no dañado, y una mostró la señal de que camina dando pequeñas vueltas en círculos hacia el lado no dañado. Por lo tanto, el tratamiento continuo con el compuesto le mostró efecto terapéutico en la apoplejía más allá de la ventana de tratamiento dorado.
CUADRO 11 Eficacia en ratas que reciben tratamiento con el compuesto le de la presente invención 6 h después del inicio de la apoplejía EJEMPLO EXPERIMENTAL 12 Experimentos con ratas que reciben tratamientos 24 horas después del comienzo de la apoplejía con el compuesto le de la presente invención en una dosificación inicial de 5 umol/ka v 5 dosificaciones subsecuentes de 2 umol/kq cada una La eficacia se representa por las puntuaciones de la función neuronal, y una puntuación baja indica mayor eficacia. Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 24 horas, el compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 5 pmol/kg, n = 12), es infundido a través de la vena de la cola. La infusión del compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 2 pmol/kg, n = 12) a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante 6 días consecutivos, se observó por 7 días. Las ratas se compararon entre ellas cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la función neural por el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 Indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 12.
Los datos en el cuadro 12 demostraron que, la eficacia se mostró en las ratas que recibieron tratamiento 24 horas después del comienzo de la apoplejía con una dosis de 5 pmol/kg de compuesto le en el día 1 y una dosis de 2 pmol/kg de compuesto le por día durante los 5 días siguientes. Entre las 12 ratas que recibieron el tratamiento, tres murieron, mientras que 8 de las restantes 9 ratas recuperadas no tienen ninguna señal de pérdida de función neuronal, y una tiene solamente la señal de leve pérdida de la función neuronal. Por lo tanto, el tratamiento continuo con el compuesto le mostró efecto terapéutico en la apoplejía más allá de la ventana de tratamiento dorado.
CUADRO 12 Eficacia en ratas reciben tratamiento con el con le de la invención 24 horas despues del inicio de la apoplejía EJEMPLO EXPERIMENTAL 13 Experimentos con ratas que reciben tratamientos con 6 administraciones sucesivas de 2 umol/ka del compuesto le de la presente invención 6 h después del comienzo de la apoplejía La eficacia se representa por las puntuaciones de la función neuronal, y una puntuación baja indica mayor eficacia. Una solución de hidrato de doral al 10% se inyectó intraperitonealmente en ratas macho SD en una dosificación de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se hizo una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello, y el tronco de la arteria carótida común derecha se diseccionó (aproximadamente 3 cm de longitud). Las ramificaciones de la arteria externa carótida son cada una diseccionada y ligada a nivel hioideo, y la arteria interna carótida se diseccionó en la parte hinchada del cuello. Las incisiones abiertas en la arteria interna carótida y el extremo proximal de la arteria carótida común son ocluidas respectivamente con sujetadores arteriales no invasivos, y el extremo distal de la arteria externa carótida se ligó. Un catéter que contiene 0.5 mi de suspensión de trombo en solución salina norma se insertó en el tronco de la arteria externa carótida. Al mismo tiempo cuando el sujetador en la arteria interna carótida se liberó, 0.5 mi de la suspensión de trombo en solución salina normal en el catéter lentamente fluyó de la arteria externa carótida a su extremo proximal, y luego se inyectó en las arterias en el cerebro a través de la arteria interna carótida. A diferencia de los ejemplos experimentales previos, los coágulos del trombo usados en este ejemplo experimental son una suspensión de trombo sólida marcablemente en solución salina normal preparada mediante el uso del trombo de más edad que ha sido almacenado a temperatura ambiente durante 24 horas, en vez de la suspensión del trombo en solución salina normal preparada mediante el uso de trombo almacenada a -24°C. Posteriormente, el extremo proximal de la arteria carótida se ligó, los sujetadores arteriales en la arteria interna carótida y la arteria carótida común se liberaron, y el flujo sanguíneo se restableció. Después de que la herida se suturó, 20,000 IU de penicilina se inyectó intramuscularmente para la prevención de la infección. Después de 6 horas, el compuesto le en solución salina normal (en una dosificación inicial de 5 pmol/kg, n = 12) es infundido a través de la vena de la cola. Después, la infusión del compuesto le en solución salina normal (en una dosificación de 2 pmol/kg, n = 12) a través de vena de cola de rata se llevó a cabo una vez al día durante 6 días consecutivos, se observó por 7 días. Las ratas se compararon entre ellas cada día, y se evaluaron para el grado de daño en la fundón neural por el método Zealonga. Una puntuación de 0 indica ninguna señal de pérdida de la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado no dañado no se pueden estirar, 2 indica que caminan hacia el lado no dañado, 3 indica que caminan dando vueltas en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica que caminan de manera involuntaria con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados experimentales se muestran en el cuadro 13.
CUADRO 13 Eficacia en ratas que reciben tratamiento con 2 umol/kq del compuesto le de la presente invención 6 h después del inicio de apoplejía Los datos en el cuadro 13 demostraron que, en modelos de rata 6 h después del comienzo de la apoplejía inducida por el trombo envejecido, la eficacia se mostró después de 6 tratamientos sucesivos con una dosis de 2 mitioI/kg de compuesto le por día durante 6 días consecutivos. Entre las 12 ratas que recibieron el tratamiento, seis se murieron, mientras que 1 de las 6 ratas restantes recuperadas no tienen señales de pérdida de función neuronal, y cinco tienen sólo la señal de pérdida leve en la función neuronal. Por lo tanto, el tratamiento continuo con el compuesto le mostró efecto terapéutico en apoplejía antigua.
Cabe señalar que, debido a que los compuestos la a II excepto le en los ejemplos experimentales 1 a 7 logran los efectos de captación de radical libre NO, lisis de coagulo de euglobulina, trombólisis, acción anti-trombo, y tratamiento en ratas con apoplejía similar a aquellas del compuesto le, los otros compuestos de la a II pueden lograr los mismos efectos terapéuticos en apoplejía antigua como el compuesto le.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 14 Experimentos en nanoestructuras de compuestos la a II de la presente invención a una concentración de 1X10~6 M, 1X10 9 M v 1 10~12 M Los compuestos la a II de acuerdo con la presente invención se prepararon en soluciones de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, respectivamente. 10 mI de solución se tomó y se dejó caer en una rejilla de cobre con un papel filtro colocado por debajo, se secó con aire y luego se observó bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (JEOL, JEM-1230). Las fotografías se tomaron con el fin de registrar la morfología y tamaño de partícula. 1. Prueba compuesto: compuestos la a II de la presente invención 2. Método de la prueba: el compuesto de prueba (la a II) se preparó en soluciones de lxlO 6 M, lxlO9 M y lxlO 12 M con agua destilada tres veces, respectivamente. Una pequeña cantidad (aproximadamente 10 mI) y se tomó y se dejó caer sobre la superficie de una rejilla de cobre con un papel filtro colocado por debajo, se secó con aire, y luego se observaron bajo TEM (JEOL, JEM-1230) para la morfología y tamaño de partícula que se registraron en las fotografías. 3. Resultados de prueba: los resultados se muestran en las figuras 1 a 12. La figura 1 muestra las nanoestructuras del compuesto la de acuerdo con la presente invención en soluciones de llxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de la en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 3.1 a 86.1 nm; la figura 2 muestra las nanoestructuras del compuesto Ib de acuerdo con la presente invención en soluciones de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Ib en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 4.3 a 297.9 nm; la figura 3 muestra las nanoestructuras del compuesto Ic de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Ic en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 2.2 a 165.7 nm; la figura 4 muestra las nanoestructuras del compuesto Id de acuerdo con la presente Invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Id en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 16.2 a 201.2 nm; la figura 5 muestra las nanoestructuras del compuesto le de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de le en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 3.3 a 138.9 nm; la figura 6 muestra las nanoestructuras del compuesto If de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de If en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 3.6 a 82.4 nm; la figura 7 muestra las nanoestructuras del compuesto Ig de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 , lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Ig en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 6.3 a 264.5 nm; la figura 8 muestra las nanoestructuras del compuesto Ih de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Ih en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 5.1 a 149.8 nm; la figura 9 muestra las nanoestructuras del compuesto Ii de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M,y las nanoestructuras de Ii en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 4.7 a 107.7 nm; la figura 10 muestra las nanoestructuras del compuesto Ij de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO-12 M, y las nanoestructuras de Ij en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 9.1 a 73.7 nm; la figura 11 muestra las nanoestructuras del compuesto Ik de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de Ik en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 10.1 a 66.7 nm; la figura 12 muestra las nanoestructuras del compuesto II de acuerdo con la presente invención en soluciones acuosas de lxlO 6 M, lxlO 9 M y lxlO 12 M, y las nanoestructuras de II en las soluciones acuosas son nanoesferas que tienen un diámetro de 6.1 a 153.3 nm.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 15 Experimentos de FT-EM de alta resolución de los compuestos la a II de la presente invención en concentraciones de 1x10 6 M. lxlO 9 M v 1x10 12 M Los compuestos la a II se preparan en una solución de 12.5 mM con agua triple destilada, y una muestra de 10 ml se cargó en una espectrometría de masas de FT-ICR de solariX (Bruker Daltonik). El estado de asociación intermolecular se observó y los datos se adquirieron. Los resultados se enlistan en el cuadro 14 a 16.
CUADRO 14 Datos de FT-EM de alta resolución de dímeros formados por los compuestos Ia-II deja presente invención en tres diferentes concentraciones CUADRO 15 Datos de FT-EM de alta resolución de trímeros formados por los Ia-II de la presente invención en tres diferentes concentraciones CUADRO 16 Datos de FT-EM de alta resolución de tetrámeros formados por los compuestos Ia-II de la presente invención en tres diferentes concentraciones Los cuadros 14 a 16 muestran los números de masa exactos medidos por EM de alta resolución de FT. Estos números de masa indican que dímeros, trímeros y tetrámeros se detectaron todos en tres diferentes concentraciones de compuestos Ia-II de la presente invención. Por lo tanto, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden formar dímeros, trímeros y tetrámeros en una solución acuosa al mismo tiempo.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 16 Experimentos de FT-EM de alta resolución del compuesto le de la presente invención en concentraciones de 10.0 uM. 1.0 uM, 0.1 uM v 0.01 uM Para la visualización de EM, los compuestos le se prepararon en soluciones de 10.0 mM, 1.0 mM, 0.1 pM y 0.01 pM con agua triple destilada, y una muestra de 10 ml se cargó en una espectrometría de masas FT-ICR de solariX (Bruker Daltonik). El estado de asociación intermolecular se observó y los datos se adquirieron. Los resultados se muestran en las figuras 13 a 16. La figura 13 es el espectro de FT-EM de alta resolución del compuesto le de acuerdo con la presente invención en una concentración de 0.01 pM: 915.84146 es el ion triple cargado del dímero, 1030.32114 es el ion cuádruple cargado del trímero, y 1099.00914 es el ion quíntuple cargado del tetrámero; la figura 14 es el espectro de FT-EM de alta resolución del compuesto le de acuerdo con la presente invención en una concentración de 0.1 pM: 915.84124 es el ion triple cargado del dímero, 1030.32208 es el ion cuádruple cargado del trímero y 1099.00829 es el ion quíntuple cargado del tetrámero; la figura 15 es el espectro de FT-EM de alta resolución del compuesto le de acuerdo con la presente invención en una concentración de 1 pM: 915.84095 es el Ion triple cargado del dímero, 1030.32067 es el ion cuádruple cargado del trímero y 1099.00914 es el ion quíntuple cargado del tetrámero; la figura 16 es el espectro de FT-EM de alta resolución del compuesto le de acuerdo con la presente invención en una concentración de 10 mM: 915.84163 es el ion triple cargado del dímero, 1030.32067 es el ion cuádruple cargado del trímero y 1099.00914 es el ion quíntuple cargado del tetrámero.
Los dímeros, trímeros y tetrámeros formados por los compuestos de la presente invención se montan adicionalmente en nanoesferas que tienen un diámetro de 2 a 300 nm. Entre las nanoesferas de dichas dimensiones, las nanoesferas que tienen un diámetro menor de 100 nm son superiores a 99%. Es bien conocido el hecho de que en nanofarmacología estas nanoesferas que tienen un diámetro de menos de 100 nm tienen pocas probabilidades de ser fagocltadas por los macrófagos durante el transporte en la sangre y pueden cruzar fácilmente la pared capilar. Estas propiedades permiten que los compuestos de acuerdo con la presente invención crucen la barrera sangre-cerebro. Es la propiedad de atravesar la barrera sangre-cerebro de los compuestos de acuerdo con la presente invención que permite que los productos metabólicos de los compuestos de acuerdo con la presente invención sean detectables en los tejidos cerebrales en ratas que reciben el tratamiento de la apoplejía.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 17 Experimentos en FT-EN de alta resolución que monitorean los productos metabólicos en los tejidos cerebrales en ratas tratadas con el compuesto le de acuerdo con la presente invención El cerebro entero de la rata se sacó y colocó en un tubo de centrífuga de 50 mi, en el cual 10 mi de 0.9% de NaCI se agregó, y se homogeneizó para obtener una suspensión uniforme que luego se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos. 5 mi de sobrenadante se agregó en 10 mi de metanol y se mezcló uniformemente al agitar, y se centrifuga a 3000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se concentró bajo presión reducida hasta secar, seguido por la adición de 1 mi de metanol, y nuevamente se centrifugó a 12000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante resultante se utilizó para el monitoreo del contenido de productos metabólicos en los tejidos cerebrales en ratas tratadas con el compuesto le.
Los resultados experimentales de FT-EM de alta resolución mostraron dos productos metabólicos MI y M2 en el cerebro. Entre ellos, MI tiene un [M+l]+ de 291.06971 y una fórmula molecular de C15H19O5N2; y M2 tiene un a [M+l]+ de 307.04350 y una fórmula molecular de C15H19O4N2. (Condiciones de EM: carga: 10 mI; modo de ionización: ES+; voltaje de cono: 30 V; caudal de fase móvil: 0.2 ml/min). De acuerdo con los datos anteriores, los productos metabólicos MI y M2 se asumieron como los siguientes compuestos: - Esto demostró que el compuesto le de la presente Invención efectivamente cruzó la barrera sangre-cerebro, permitiendo el efecto de captación de radical libre NO, trombólisls y el efecto anti-trombo en el cerebro.

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un conjugado ternario que comprende una imidazolina con actividad de depuración de radical libre NO, un péptido con actividad trombolítica, y un péptido de direccionamiento de trombo, que se unen mediante un brazo de unión adecuado.
2.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque es representado por la fórmula I: en donde, NN representa un imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO; AAi representa un brazo de unión con al menos tres grupos para la unión; AA2 representa un péptido con actividad trombolítica; y AA3 representa un péptido de direccionamiento de trombo.
3.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque la imidazolina con actividad de depuración de radical libre es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi)fenil]-4,4,5,5-tetrametillmidazolina.
4.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque se seleccionan los grupos de unión del grupo que consiste de un grupo carboxilo y un grupo amino.
5.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el brazo de unión es un aminoácido natural, particularmente L-Lys, L-Asp o L-Glu.
6.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia de AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia de KAP (Lys-Ala-Pro), o un péptido con unidades de repetición de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
7.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp).
8.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el péptido de direccionamiento de trombo es un polipéptido obtenido de la modificación de conjugación de un péptido RGD (Arg-Gly-Asp) con un péptido YIGS (Tyr-Gly-Ile-Ser).
9.- El conjugado ternario de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque la imidazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es l,3-dioxo-2- [(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetramet¡l¡m¡dazol¡na, el brazo de unión es L-Lys, L-Asp o L-Glu, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp).
10.- Una composición farmacéutica que comprende un conjugado ternario de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un portador farmacéuticamente aceptable.
11.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el conjugado ternario está en forma de una estructura nanoesférica.
12.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, para usarse como un fármaco trombolítico, un fármaco de depuración de radicales libres NO o un fármaco antl-trombo.
13.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, para usarse como un fármaco en el tratamiento de accidente cerebrovascular o infarto cerebral.
14.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en el tratamiento de accidente cerebrovascular o infarto cerebral más allá de 3 horas desde el Inicio de los síntomas.
15.- Un método para la preparación del conjugado ternario de la reivindicación 1, en donde el conjugado ternario está representado por la fórmula I, en donde, NN representa una imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO; AAi representa un brazo de unión con al menos tres grupos para la unión; AA2 representa un péptido con actividad trombolítica; y AA3 representa un péptido de direccionamiento de trombo; dicho método que comprende los pasos de: (1) proporcionar la imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO (NN), un brazo de unión con al menos tres grupos para la unión (AAi), un péptido que tiene actividad trombolítica (AA2) y el péptido de direccionamiento de trombo (AA3), en donde el brazo de unión tiene un primer grupo para la unión, un segundo grupo para la unión y un tercer grupo para la unión; (2) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión de la imidazolina con actividad de depuración de radicales libres NO (NN) con el primer grupo para la unión en el brazo de unión (AAi), para formar un compuesto de fórmula general IM-1: NN-AA! (IM-1); (3) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión del péptido con actividad trombolítica (AA2) para el compuesto de fórmula general IM-1, en donde uno de los extremos del péptido que tiene actividad trombolítica se une al segundo grupo para unirse en el brazo de unión, para formar un compuesto de fórmula general IM-2: NN-AArAA2 (IM-2); y (4) bajo condiciones de reacción apropiadas, la unión del péptido de direccionamiento de trombo (AA3) para el compuesto de fórmula general I -2, en donde uno de los extremos del péptido de direccionamiento de trombo está unido al tercer grupo para la unión en el brazo de unión, para formar el compuesto de fórmula I; en donde los pasos (3) y (4) son intercambiables en orden.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el paso (1) además comprende proteger el segundo y tercer grupos para la unión en el brazo de unión (AAc) con los grupos de protección y grupos activos de protección de los péptidos con actividad trombolítica (AA2) y del péptido de direccionamiento de trombo (AA3), que no sea el extremo a ser utilizado para la unión, con los grupos de protección; el paso (3) además comprende la desprotección del segundo grupo protegido para la unión primero y luego la unión del péptido con actividad trombolítica al segundo grupo desprotegido para la unión; el paso (4) comprende además la desprotección del tercer grupo protegido para la unión primero y luego la unión del péptido de direccionamiento de trombo al tercer grupo desprotegido para la unión; y después el paso (4), además hay un paso de desprotección de los grupos activos protegidos de los péptidos con actividad trombolítica (AA2) y del péptido de direccionamiento de trombo (AA3).
17.- El método de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizado además porque el primer grupo para la unión es un grupo amino y el segundo y el tercer grupos para la unión son seleccionados del grupo que consiste de un grupo carboxilo y un grupo amino.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el brazo de unión es un aminoácido natural, particularmente L-Lys, L-Asp o L-Glu.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia de AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia de KAP (Lys-Ala-Pro), o un péptido con unidades de repetición de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
20.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido que comprende una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp).
21.- El método de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizado además porque la imidazolina que tiene actividad de depuración de radical libre NO es 1,3-dioxo-2-[(4-oxiacetoxi) fenil]-4,4,5,5-tetrametilimidazolina, el brazo de unión es L-Lys, L-Asp o L-Glu, el péptido con actividad trombolítica es un oligopéptido formado por una secuencia de PAK (Pro-Ala-Lys) y el péptido de direccionamiento de trombo es un oligopéptido formado por una secuencia de RGD (Arg-Gly-Asp).
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