MX2014013118A

MX2014013118A - Composiciones de celulas t deficientes del receptor de celulas t.

Info

Publication number: MX2014013118A
Application number: MX2014013118A
Authority: MX
Inventors: Charles L Sentman
Original assignee: Dartmouth College
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2015-07-14
Also published as: JP2018157824A; JP6805204B2; AU2018253624B2; US20160312182A1; EP2844742A1; CN104395463A; BR112014027155A2; JP6411328B2; MX386776B; ES2711629T3; JP2015516818A; RU2653761C2; WO2013166051A1; CN108795875B; US20120302466A1; CN108384758A; EP2844742A4; RU2018111729A3; EP3447125B1; HK1207882A1

Abstract

La invención se dirige a linfocitos T modificados, métodos para elaborar y utilizar linfocitos T modificados y aislados para tratar enfermedades y trastornos. En una modalidad, esta invención se relaciona ampliamente con los linfocitos T con deficiencia de TCR, poblaciones aisladas de estos, y composiciones que los comprenden. En otra modalidad de la invención, estos linfocitos T con deficiencia de TCR se diseñan para expresar un receptor funcional que no es TCR. La invención también se refiere a métodos para elaborar dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, y métodos para reducir o mejorar, o prevenir o tratar, enfermedades y trastornos utilizando dichos linfocitos T deficiencia de TCR, poblaciones de estos, o composiciones que las comprenden.

Description

COMPOSICIONES DE CÉLULAS T DEFICIENTES DEL RECEPTOR DE CÉLULAS T Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno conforme 5 al contrato número CA 130911 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene determinados derechos con respecto a la invención.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS 10 Esta solicitud es una solicitud de continuación en parte de la solicitud de patente estadunidense n.° 13/502,978, presentada el 19 de abril de 2012, que es una solicitud de etapa nacional de la Solicitud de Patente Internacional n.° 15 PCT/US2010/54846, presentada el 29 de octubre de 2010, que reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/255,980, presentada el 29 de octubre de 2009, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad. 20 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Caupo de la invención 25 La invención se dirige a linfocitos T con deficiencia de TCR, métodos para elaborar y utilizar linfocitos T con deficiencia de TCR y métodos para utilizar estos linfocitos T con deficiencia de TCR para tratar enfermedades y trastornos. En una modalidad, la invención se relaciona ampliamente con los linfocitos T con deficiencia de TCR, poblaciones aisladas de estos, y composiciones que las comprenden. En otra modalidad de la invención, dichos linfocitos T con deficiencia de TCR se modifican genéticamente de forma adicional para expresar un receptor funcional que no es TCR. La invención también se refiere a métodos para elaborar dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, y métodos para reducir o mejorar, o prevenir o tratar, enfermedades y trastornos utilizando dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, poblaciones de estos, o composiciones que los comprenden.

Descripción de la técnica relacionada La carga global de cáncer se duplicó entre 1975 y 2000, y se espera que el cáncer se vuelva la causa principal de muerte mundial para el 2010. De acuerdo con la Sociedad Americana del Cáncer, se prevé que se duplique nuevamente para el 2020 y que se triplique para el 2030. Por lo tanto, existe una necesidad de terapias más eficaces para tratar varias formas de cáncer. Idealmente, cualquier terapia contra el cáncer debería ser eficaz (para matar células cancerosas), dirigida (es decir, selectiva, para evitar matar células sanas) permanente (para evitar recaídas y metástasis), y económica. Los estándares de cuidado actuales para la mayoría de los cánceres no cumplen las expectativas de algunos o todos estos criterios.

La inmunoterapia celular ha demostrado que tiene como resultado la eliminación de tumores específicos y tiene el potencial de proporcionar una terapia contra el cáncer específica y eficaz (Ho, W.Y. et ál. 2003. Cáncer Cell 3:1318-1328; Morris, E.C. et ál. 2003. Clin. Exp. Immunol . 131:1-7; Rosenberg, S.A.2001. Nature 411:380-384; Boon, T. y P. van der Bruggen. 1996. J. Exp. Med. 183:725-729). Los linfocitos T han sido generalmente las células efectoras de preferencia para la inmunoterapia contra el cáncer por su reconocimiento selectivo y sus poderosos mecanismos efectores. Los linfocitos T reconocen péptidos específicos derivados de proteínas celulares internas en el contexto del autocomplejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) utilizando sus receptores de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés).

Se reconoce en la téenica que el complejo TCR se asocia de forma precisa mediante la formación de dímeros y la asociación de estos dímeros (dímeros TCR-alfa/beta, CD3- gamma/épsiIon, CD3-delta/épsilon, y CD3-zeta) en un complejo TCR que se puede exportar a la superficie celular. La incapacidad de cualquiera de estos complejos para formarse apropiadamente inhibirá la reunión y expresión de los TCR (Cali, M.E. et ál., (2007) Nature Rev. Immunol., 7:841-850; Cali, M.E. et ál., (2005) Annu. Rev. Immunol., 23:101-125).

Los residuos de aminoácidos particulares en las cadenas de TCR respectivas han sido identificados como importantes para la formación apropiada de los dimeros y la reunión de los TCR. En particular, para TCR-alfa, estos aminoácidos claves en la parte transmembrana son arginina (para la asociación con CD3-zeta) y lisina (para la asociación con el dimero CD3-épsilon/delta). Para TCR-beta, el aminoácido clave en la parte transmembrana es una lisina (para la asociación con el dimero CD3-épsilon/gamma). Para CD3-gamma, el aminoácido clave en la parte transmembrana es un ácido glutámico. Para CD3-delta, el aminoácido clave en la parte transmembrana es un ácido aspártico. Para CD3-épsilon, el aminoácido clave en la parte transmembrana es un ácido aspártico. Para CD3-zeta, el aminoácido clave en la parte transmembrana es un ácido aspártico (Cali, M.E. et ál., (2007) Nature Rev. Immunol., 7:841-850; Cali, M.E. et ál., (2005) Annu. Rev. Immunol., 23:101-125).

Los péptidos derivados de proteínas mutadas o alteradas en tumores se pueden reconocer por sus TCR específicos. Varios estudios clave han llevado a la identificación de antígenos asociados con tumores específicos que han sido capaces de inducir respuestas eficaces de los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) en los pacientes (Ribas, A. et ál. 2003. J. Clin. Oncol . 21:2415-2432). Los mecanismos efectores de los linfocitos T incluyen la capacidad de matar células tumorales directamente y la producción de las citocinas que activan otras células inmunitarias hospedadoras y cambian el microambiente del tumor local. Teoréticamente, los linfocitos T podrían identificar y destruir una célula tumoral que expresa un único péptido mutado. La inmunoterapia adoptiva con clones de CTL específicos para MARTI O gplOO con IL-2 de dosis baja ha sido eficaz en la reducción o estabilización de la carga tumoral en algunos pacientes (Yee, C. et ál.2002. Proa. Nati . Acad. Sci . USA 99:16168-16173). Otros enfoques utilizan linfocitos T con un receptor antitumoral definido. Estos enfoques incluyen CTL que modifican genéticamente con nuevos receptores de linfocitos T específicos del antígeno que reconocen péptidos tumorales y MHC, receptores de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) derivados de fragmentos de anticuerpo de cadena simple (scFv) acoplados a un elemento de señalización apropiada, o el uso de receptores de células NK quiméricas (Ho, W.Y. et ál.2003. Cáncer Cell 3:431-437; Eshhar, Z. et ál. 1993. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:720-724; Maher, J. y E.T. Davies.2004. Br. J. Cáncer 91:817-821; Zhang, T. et ál. 2005. Blood 106:1544-1551).

Las terapias a base de células se utilizan en pacientes que no han tenido éxito con los tratamientos de radiación o quimioterapia, o que han reincidido, usualmente luego de haber intentado más de un tipo de terapia. Las células inmunitarias de pacientes con cáncer avanzado, que pueden haber pasado por sesiones de quimioterapia, no responden tan reciamente como los individuos sanos. Además, los pacientes con cáncer generalmente son ancianos y puede que padezcan otras enfermedades que pueden limitar el potencial de sus células inmunitarias de volverse células efectoras cebadas, incluso luego de la expansión y activación in vitro. Además, cada paciente con cáncer debe proporcionar un número suficiente de sus propias células inmunitarias para que sean modificadas genéticamente para expresar un nuevo receptor inmunitario. Dado que cada terapia debe ser personalizada para el paciente, este proceso requiere de semanas desde el momento en que toma la decisión de comenzar tal terapia; mientras tanto, el cáncer sigue creciendo. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2002/0039576 describe un método para modular la actividad de los linfocitos T, donde los linfocitos T utilizados tienen un fenotipo de La publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2006/0166314 describe el uso de linfocitos T mutados para tratar el cáncer donde los linfocitos T son aquellos con un receptor de linfocito ab-T especifico a la proteina MDM2 que media la respuesta del linfocito T.

El cáncer no es la única enfermedad donde la manipulación de los linfocitos T podria ser una terapia eficaz. Es sabido que los receptores de linfocitos T activos en los linfocitos T son de crucial importancia para que la respuesta del cuerpo estimule la actividad del sistema inmunitario. Por ejemplo, se ha demostrado que la diversidad de los receptores de los linfocitos T juegan un papel en la enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD, por sus siglas en inglés), en particular GVHD crónica (Anderson et ál. (2004) Blood 104:1565-1573). De hecho, la administración de los anticuerpos receptores de los linfocitos T ha demostrado que reduce los síntomas de GVHD aguda (Maeda et ál. (2005) Blood 106:749-755).

Aun existe la necesidad de terapias a base de linfocitos T más eficaces para el tratamiento de determinadas enfermedades y trastornos, y métodos de tratamiento basándose en la modificación genética de nuevos tipos de linfocitos T.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, esta invención se refiere ampliamente a linfocitos T aislados y modificados que no expresan un receptor de linfocito T funcional (TCR). En esta modalidad, los linfocitos T tienen deficiencia de TCR en la expresión de un TCR funcional. En otra modalidad de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR están modificados para expresar un receptor funcional que no es TCR, tal como, por ejemplo, un receptor quimérico. Estas células también funcionan como una plataforma para permitir la expresión de otros receptores de direccionamiento, por ejemplo, los receptores que pueden ser útiles en enfermedades especificas, mientras que retienen las funciones efectoras de los linfocitos T, aunque sin un TCR en funcionamiento.

La invención contempla las poblaciones de los linfocitos T con deficiencia de TCR, y composiciones que las comprenden. La invención también contempla métodos para elaborar dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, y métodos para reducir o mejorar, o prevenir o tratar, enfermedades y trastornos utilizando dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, poblaciones de estos, o composiciones terapéuticas que los comprenden. En una modalidad, esta composición se püede utilizar para tratar cáncer, infecciones, uno o más trastornos autoinmuntarios, malestar por radiación, o para prevenir o tratar la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) o el rechazo a trasplante en un sujeto que se somete a una cirugía de trasplante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La Figura 1 ilustra los receptores de NK quiméricos descritos en la presente. Se indican las partes extracelulares (EC), transmembrana (TM) y citoplásmicas (Cyp). Se indican las formas de tipo salvaje (WT) y quiméricas (CH) de los receptores, donde N¾ denota el extremo N y COOH denota el extremo C.

La Figura 2 ilustra que las TIM reducen el reconocimiento de los TCR y funcionan en los linfocitos T humanos durante el cultivo de PBMC alogénicas. El panel (A) muestra que los linfocitos T transducidos por TIM cultivadas con PBMC alogénicas tienen una reducción en la producción de IFN-g. Se muestra la producción de IFN-g total. El panel (B) muestra las cantidades de IFN-g luego de la sustracción de la cantidad de IFN-g autóloga. Este valor representa la IFN-g específica producida mediante reconocimiento de las PBMC alogénicas .

La Figura 3 ilustra la activación de linfocitos T que expresan TIM utilizando un receptor de direccionamiento recombinante para el cáncer. Los linfocitos T que expresan TIM que expresaron conjuntamente un receptor NKG2D quimérico (chNKG2D), que reconoce ligandos específicos de varios tipos de células tumorales, produjeron una cantidad aumentada de IFN-g luego del cocultivo con células tumorales de mieloma RPMI8226. En algunos pocilios, se incluyó un mAb de NKG2D bloquedor para prevenir que chNKG2D reconociera sus ligandos en las células tumorales, y esto demuestra la respuesta específica del receptor de chNKG2D en estos linfocitos T.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Definiciones Se ha de entender que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, y reactivos particulares descritos, ya que los mismos pueden variar. También ha de entenderse que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Como se usan en la presente, las formas en singular "un/a", "y" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la téenica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por el experto en la técnica a la que pertenece la presente invención a menos que se indique de otra manera.

En el contexto de la presente invención, un "linfocito T con deficiencia de TCR" o una frase similar se refiere a un linfocito T aislado que no tiene una expresión de TCR funcional, es internamente capaz de inhibir su propia producción de TCR, y además donde también se puede esperar que la progenie de dicho linfocito T sea capaz internamente de inhibir su propia producción de TCR. La capacidad interna es importante en el contexto de la terapia donde los períodos de tiempo de movimiento de TCR (~ horas) son mucho más rápidos que los períodos de tiempo de eficacia demostrables (días-meses), es decir, se requiere capacidad interna para mantener el fenotipo deseado durante el período terapéutico. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante diferentes medios tal como se describe anteriormente, por ejemplo, al modificar genéticamente un linfocito T de modo que no exprese ningún TCR funcional en sus superficie celular, o al modificar genéticamente el linfocito T para que no exprese una o más de las subunidades que comprenden un TCR funcional y por lo tanto no produce un TCR funcional o al modificar genéticamente un linfocito T de modo que produzca muy poco TCR funcional sobre su superficie, o que exprese un TCR sustancialmente dañado, por ejemplo, al modificar el linfocito T para que exprese formas mutadas o truncadas de una o más de las subunidades que comprenden el TCR, volviendo de esta forma el linfocito T incapaz de expresar un TCR funcional o teniendo como resultado una célula que expresa un TCR sustancialmente dañado. Las subunidades diferentes que comprenden un TCR funcional se describen anteriormente. Se puede determinar si una célula expresa un TCR funcional utilizando métodos de ensayo conocidos tales como se conocen en la téenica descrita en la presente. Por un "TCR sustancialmente dañado" los solicitantes se refieren a que este TCR no provocará sustancialmente una reacción inmunitaria adversa en un hospedador, por ejemplo, una reacción GVHD.

Tal como se describe en detalle anteriormente, opcionalmente estas células con deficiencia de TCR se pueden modificar genéticamente para comprender otras mutaciones o transgenes, por ejemplo, mutaciones o transgenes que afectan el crecimiento o proliferación de los linfocitos T, que tienen como resultado la expresión o ausencia de expresión de un gen o construcción génica deseada, por ejemplo, otro receptor o una citocina u otro polipéptido terapéutico o inmunomodulatorio o un marcador seleccionable tal como un marcador génico seleccionable dominante, por ejemplo, DHFR o neomicina transferasa.

"Linfocito T alogénico" se refiere a un linfocito T de un donante que tiene un tejido de tipo HLA que coincide con el recipiente. Típicamente, la coincidencia se realiza sobre la base de la variabilidad en tres o más locus del gen HLA, y se prefiere una coincidencia perfecta en estos lugares. En algunos casos, los donantes de trasplantes alogénicos pueden estar relacionados (generalmente un hermano con una coincidencia de HLA estrecha), singénico (un gemelo "idéntico" monocigótico del paciente) o pueden no estar relacionados (donante que no está relacionado y que tiene un alto grado de coincidencia de HLA). Los genes de HLA caen en dos categorías (Tipo I y Tipo II). En general, los malos emparejamientos de genes de Tipo I (es decir, HLA-A, HLA-B, o HLA-C) aumentan el riesgo de rechazo de injerto. Un mal emparejamiento de un gen HLA de tipo II (es decir, HLA-DR, o HLA-DQBl) aumenta el riesgo de la enfermedad de injerto contra huésped.

En el contexto de la presente invención, un "banco de tejido coincidió con linfocitos T con deficiencia de TCR" se refiere a diferentes composiciones donde cada una contiene linfocitos T de un alotipo HLA especifico que pasan a tener deficiencia de TCR de acuerdo con la invención. Idealmente este banco comprenderá composiciones que contienen linfocitos T de una amplia variedad de diferentes tipos de HLA que son representativos de la población humana. Dicho banco de linfocitos T con deficiencia de TCR modificados genéticamente será útil ya que facilitará la disponibilidad de linfocitos T adecuados para utilizar en diferentes recipientes tales como, por ejemplo, pacientes con cáncer. La invención proporciona métodos para producir un banco de linfocitos T con deficiencia de TCR que tienen diferentes haplotipos de HLA. Los métodos comprenden obtener un grupo de linfocitos T aislados que tienen un haplotipo de HLA definido, que se determina por procedimientos de clasificación por tipos estándares (por ejemplo, anticuerpos, PCR o secuencia iento de ADN), y al expresar una molécula inhibidora de TCR (TIM, por sus siglas en inglés) en estos linfocitos T que desestabiliza el complejo TCR al reducir o bloquear la expresión de los componentes del complejo TCR. Esto se realiza para los linfocitos T obtenidos a partir de una variedad de diferentes individuos con diferentes halotipos de HLA. Esta recopilación de diferentes linfocitos T donantes que expresan TIM comprende el banco de linfocitos T con deficiencia de TCR. El banco de linfocitos T comprende diferentes grupos de linfocitos T, que cada uno contiene linfocitos T con deficiencia de TCR de un tipo de HLA especifico. Preferentemente, el banco de linfocitos T comprende una variedad de diferentes tipos de tejido de HLA, por ejemplo, al menos 10 tipos de tejido de HLA diferentes, al menos 50 tipos de tejido de HLA diferentes, al menos 100 tipos de tejido de HLA diferentes. En una modalidad, el banco de linfocitos T comprende los linfocitos T de al menos 10 tipos de tejido de HLA diferentes. En otra modalidad, el banco de linfocitos T comprende los linfocitos T de al menos 100 tipos de tejido de HLA diferentes.

En el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es identificada por un experto en la téenica con una cantidad de linfocitos T con deficiencia de TCR que, cuando se administran a un paciente, alivia los signos y/o síntomas de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, infección o GVHD). La cantidad real que se va a administrar se puede determinar basándose en estudios in vitro o in vivo donde los linfocitos T con deficiencia de TCR funcional exhiben actividad farmacológica contra la enfermedad. Por ejemplo, los linfocitos T con deficiencia de TCR funcionales pueden inhibir el crecimiento celular tumoral in vitro o in vivo y la cantidad de linfocitos T con deficiencia de TCR funcionales que inhibe tal crecimiento se identifica como una cantidad terapéuticamente eficaz.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para la administración mediante una o más de una cantidad de vías, que incluyen, de modo no taxativo, bucal, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradermal, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal mediante un enema o supositorio, subcutánea, subdermal, sublingual, transdermal y transmucosal. Además, la administración puede ocurrir por medio de inyección, líquido, gel, gotas u otros medios de administración.

Tal como se usa en la presente, se pretende que una construcción de ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico signifique una molécula de ADN que se puede transformar o introducir en un linfocito T y transcribirse y traducirse para producir un producto (por ejemplo, un receptor quimérico o una proteína suicida).

Los ácidos nucleicos están "operativamente enlazados" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia de señal está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "unido de forma operativa" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de una líder secretora, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser necesariamente contiguos. El enlace se logra mediante la ligadura en sitios de restricción convenientes o, de manera alternativa, mediante un método de PCR/recombinación conocido por aquellos expertos en la téenica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlaces de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.

La invención contempla composiciones y métodos para reducir o mejorar, o prevenir y tratar, enfermedades o afecciones tales como cáncer, enfermedades infecciosas, GVHD, rechazo de trasplantes, uno o más trastornos autoinmuntarios, o malestar por radiación. En una modalidad no taxativa, las composiciones se basan en el concepto de proporcionar una fuente alogénica de linfocitos T humanos aislados, a saber, linfocitos T con deficiencia de TCR, que se pueden elaborar de antemano según la necesidad del paciente y de forma económica. La capacidad de crear un único producto terapéutico en un solo sitio utilizando procesos que están bien controlados es deseable en términos de costos y de calidad. El cambio de una fuente autóloga a una alogénica para los linfocitos T ofrece ventajas considerables. Por ejemplo, se ha estimado que un único donante saludable podría suministrar suficientes linfocitos T para tratar docenas de pacientes luego de la transducción y la expansión.

De acuerdo con la presente invención, se producen los linfocitos T alogénicos modificados que no expresan receptores de linfocitos T funcionales (TCR). Se debe entender que algunos, o incluso todos los dímeros/subunidades de TCR se pueden expresar sobre la superficie celular, pero que el linfocito T no expresa suficiente TCR funcional para inducir una reacción indeseable en el hospedador. Sin TCR funcionales en su superficie, los linfocitos T alogénicos no llegan a desarrollar una respuesta inmunitaria indeseada para las células hospedadoras. Como resultado, estos linfocitos T con deficiencia de TCR, no logran causar GVHD, por ejemplo, dado que no pueden reconocer las moléculas de MHC hospedadoras. Adicionalmente, estos linfocitos T con deficiencia de TCR se pueden modificar para expresar de forma simultánea receptores específicos a la enfermedad, no TCR y funcionales.

Como es sabido por los expertos en la téenica, existen varios métodos disponibles para aislar los linfocitos T alogénicos de un sujeto. Por ejemplo, utilizar la expresión del marcador de superficie celular o utilizar kits comercialmente disponibles (por ejemplo, ISOCELL™ de Pierce, Rockford, 111.).

Para la terapia contra el cáncer, el enfoque abarca producir un grupo aislado de células efectoras T con deficiencia de TCR, por ejemplo, de un alotipo de tejido deseado que no expresa una forma funcional de su TCR endógeno o que expresa niveles sustancialmente reducidos de TCR endógeno en comparación con los linfocitos T de tipo salvaje de modo que no provoquen una respuesta inmunitaria al ser administrados (tal como GVHD), pero en vez de expresar un receptor funcional, el receptor que no es TCR que reconoce las células tumorales, o que expresa otro polipéptido que no ataca o ataca de forma poco apreciable las células asociadas, por ejemplo, las células normales (no tumorigénicas) que no expresan el antígeno o el ligando reconocido por el receptor específico del tumor o que expresa dicho antígeno o ligando a niveles reducidos relativos a celulas tumorales. Los expertos en la téenica entienden que determinados antigenos asociados con los tumores se expresan en tejidos no cancerosos, pero son objetivos terapéuticos viables en un hospedador que tiene un tumor. A este respecto, los expertos en la técnica entienden generalmente que determinados receptores específicos al tumor que no son TCR se expresan en tejidos no cancerosos, pero son viables en objetivos terapéuticos en un hospedador que tiene un tumor dado que pueden ser expresados a niveles considerablemente reducidos en células normales que en células tumorales.

Mientras que no es necesario para la mayoría de los usos terapéuticos de los linfocitos T con deficiencia de TCR del sujeto, en algunos casos puede ser deseable quitar algunos o todos los linfocitos T del donante del hospedador en seguida después de haber mediado su efecto antitumor. Esto se puede facilitar si se modifican genéticamente los linfocitos T para que expresen marcadores o receptores adicionales que faciliten su eliminación y/o identificación en el hospedador tal como GFP y similares. Mientras que la presente invención debería eliminar sustancialmente cualquier posibilidad de GVHD u otra reacción inmunitaria adversa en el recipiente, puede que esto se desee en algunos individuos. Esto no debería comprometer la eficacia dado que ya se ha demostrado que los linfocitos T de los donantes no necesitan permanecer por mucho tiempo en el hospedador para que se inicie un efecto antitumor a largo plazo (Zhang, T., et ál. 2007. Cáncer Res. 67:11029-11036; Barber, A. et ál. 2008. J. Immunol . 180:72-78).

En una modalidad de la invención, las construcciones de ácido nucleico introducidas en linfocitos T modificados genéticamente contienen además un gen suicida tal como la timidina cinasa (TK) del virus HSV (herpesvirus) de tipo I (Bonini, et ál. (1997) Science 276:1719-1724), un "gen suicida artificial" basado en Fas (Tho is, et ál. (2001) Blood 97:1249-1257), o el gen citosina desaminasa de E. coli que son activados por ganciclovir, AP1903, o 5-fluorocitosina, respectivamente. El gen suicida se incluye ventajosamente en la construcción de ácido nucleico de la presente invención para proporcionar la oportunidad de extirpar los linfocitos T transducidos en caso de toxicidad y para destruir la construcción quimérica luego que el tumor se ha reducido o eliminado. El uso de genes suicidas para eliminar las células transducidas o trasformadas es conocido en la téenica. Por ejemplo, Bonini, et ál. ((1997) Science 276:1719-1724) enseñan que los linfocitos del donante transducidos con el gen suicida HSV-TK proporcionan actividad antitumor en pacientes por hasta un año y la eliminación de las células transducidas se logra utilizando ganciclovir. Further, González, et ál. ((2004) J. Gene Med. 6:704-711) describe el direccionamiento del neuroblastoma con clones de linfocitos T citotóxicos genéticamente modificados para expresar un inmunoreceptor scFvFc:zeta quimérico especifico para un epitopo en Ll-CAM, donde la construcción expresa además el gen suicida de la higromicina timidina cinasa (HyTK) para eliminar los clones transgénicos.

Se contempla que el gen suicida se puede expresar a partir del mismo promotor que el ARNhp, minigén, o receptor que no es TCR, o a partir de un promotor diferente. Generalmente, sin embargo, las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína suicida y ARNhp, el minigén o el receptor que no es TCR residen en la misma construcción o vector. La expresión del gen suicida del mismo promotor que el ARNhp, el minigén o el receptor que no es TCR se puede lograr utilizando cualquier sitio de entrada de ribosoma interna (IRES, por sus siglas en inglés) conocido. Las secuencias de IRES adecuadas que se pueden utilizar en la construcción de ácido nucleico de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, IRES de EMCV, c-myc, FGF-2, poliovirus y HTLV-1. A modo de ilustración solamente, una construcción de ácido nucleico para expresar un receptor quimérico puede tener la siguiente estructura: promotor-> receptor quimérico->IRES- >gen suicida. De manera alternativa, el gen suicida se puede expresar de un promotor diferente que aquel del receptor quimérico (por ejemplo, promotor l->receptor quimérico->promotor 2->gen suicida).

Por motivo de la amplia aplicación de los linfocitos T para las terapias celulares y la naturaleza mejorada de los linfocitos T de la invención, la presente invención abarca cualquier método o composición donde los linfocitos T son terapéuticamente deseables. Tales composiciones y métodos incluyen aquellos para reducir o mejorar, o prevenir o tratar cáncer, GVHD, rechazo a un trasplante, infecciones, uno o más trastornos autoinmuntarios, malestar por radiación, u otras enfermedades o afecciones que se basan en el uso de linfocitos T derivados de una fuente alogénica que no tiene expresión de TCR funcional.

Tal como se indicó, modalidades adicionales de la invención abarcan la expresión recombinante de los receptores en dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, tal como NKG2D quimérico, dominios Fv quiméricos, NKG2D, o cualquier otro receptor para iniciar señales a los linfocitos T, creando de este modo linfocitos T efectores específicos y potentes. Un experto en la téenica puede seleccionar el receptor apropiado para que sea expresado por el linfocito T con deficiencia de TCR basándose en la enfermedad que se va a tratar. Por ejemplo, los receptores que pueden ser expresados por el linfocito T con deficiencia de TCR para el tratamiento del cáncer incluiría todo receptor a un ligando que se ha identificado en células cancerosas. Tales receptores incluyen, de modo no taxativo, NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLTl, AICL, CD26, NKRPl, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1 y NKp80.

En otra modalidad de la invención, tales receptores incluyen, de modo no taxativo, receptores quiméricos que comprenden un ligando que une un dominio obtenido de NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLTl, AICL, CD26, NKRPl, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, y NKp80, o un anticuerpo antitumor tal como anti-Her2neu o anti-EGFR, y un dominio de señalización obtenido de CD3-zeta, DaplO, CD28, 41BB y CD40L. Un receptor quimérico de ejemplo es chNKG2D, en el que NKG2D está unido al dominio citoplasmático de CD3zeta, y se asocia con DaplO para proporcionar señales de activación primarias y secundarias a los linfocitos T (Zhang, T. et ál.2006. C ncer Res. 66(11): 5927-5933). En una modalidad de la invención, el receptor quimérico se une a MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, RON, o uno o más miembros de la familia de ULBP/RAET1 que incluye ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 y ULBP6.

En los métodos de la presente invención, se le administra a un paciente que padece cáncer, GVHD, rechazo a trasplantes, infecciones, uno o más trastornos autoinmuntarios, o malestar por radiación una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende dichos linfocitos T con deficiencia de TCR. En otra modalidad de la invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende dichos linfocitos T con deficiencia de TCR para prevenir, tratar o reducir GVHD, rechazo a trasplante o cáncer.

Métodos para producir linfocitos T con deficiencia de TCR Los linfocitos T que de forma estable no tienen expresión de un TCR funcional de acuerdo con la invención se puede producir utilizando una variedad de enfoques. Los linfocitos T internalizan, clasifican y degradan todo el receptor del linfocito T como un complejo, con una semivida de alrededor de 10 horas en linfocitos T en reposo y 3 horas en linfocitos T estimulados (von Essen, M. et ál. 2004. J. Immunol . 173:384-393). El funcionamiento apropiado del complejo TCR requiere la relación estequiométrica apropiada de las proteínas que componen el complejo TCR. La función de TCR también requiere dos proteínas de TCR zeta en funcionamiento con motivos ITAM. La activación del TCR luego del acoplamiento de su ligando MHC-péptido requiere el acoplamiento de varios TCR en el mismo linfocito T, y todos deben señalizar de forma apropiada. Por lo tanto, si un complejo TCR se desestabiliza con proteínas que no se asocian apropiadamente o que no señalizan de forma óptima, el linfocito T no se activará lo suficiente para comenzar una respuesta celular.

Los métodos de la presente invención incluyen la expresión de Moléculas inhibidoras de TCR (TIM) en los linfocitos T para desestabilizar el complejo TCR con el bloqueo de la expresión de componentes esenciales del complejo TCR y/o la interrupción de la función o expresión del TCR. Hay varias clases de TIM, incluyendo, de modo no taxativo, ARN de horquilla pequeña (ARNhp) y proteínas inhibidoras dominantes negativss, por ejemplo, proteínas truncadas que no tienen motivos de señalización; proteínas de fusión a KIR que promueven señales inhibidoras; y proteínas con mutaciones que interrumpen la asociación adecuada con otros componentes de TCR y/o señalización adecuada. Generalmente, las TIM se pueden usar para generar linfocitos T con deficiencia de TCR evitando la expresión de cualquier o algún TCR funcional en la superficie de la célula, y/o promover la expresión de un TCR prácticamente afectado en la superficie de la célula.

Como lo demuestran los resultados en los ejemplos experimentales anteriores, el inventor de la presente ha demostrado que la función o expresión de TCR se puede interrumpir o eliminar usando TIM, por ejemplo, ARNhp y/o inhibidores dominantes negativos, produciendo de esa manera linfocitos T con deficiencia de TCR. Tales lineas celulares con deficiencia de TCR son adecuadas para usar en terapias a base de linfocitos T para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades y trastornos, como se describe a continuación.

En una modalidad de la invención, se elimina la expresión de TCR usando ARN de horquilla pequeña (ARNhp) que se dirige a ácidos nucleicos que codifican TCR específicos (por ejemplo, TCR-OÍ y TCR-b) y/o cadenas CD3 (por ejemplo, CD3 zeta) en células principales. Con el bloqueo de la expresión de una o más de estas proteínas, los linfocitos T dejarán de producir uno o más de los componentes clave del complejo TCR, desestabilizando de esa manera el complejo TCR y evitando la expresión de superficie celular de un TCR funcional. Aunque algunos complejos de TCR se pueden recielar en la superficie celular, el ARNhp evitará la producción nueva de proteínas de TCR que tiene como resultado la degradación y eliminación de todo el complejo TCR, lo que resulta en la producción de un linfocito T que tiene una deficiencia estable en la expresión de TCR funcional.

La expresión de ARNhp en los linfocitos T primarios se puede lograr utilizando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, un sistema de expresión lentiviral. Si bien los lentivirus son útiles para direccionar linfocitos T primarios en reposo, no todos los linfocitos T expresarán los ARNhp. Puede ser que algunos de estos linfocitos T no expresen cantidades suficientes de ARNhp para permitir una inhibición suficiente de expresión de TCR para alterar la actividad funcional de los linfocitos T. Por lo tanto, los linfocitos T que retienen una expresión de TCR de moderada a alta, se pueden eliminar después de la transducción viral, por ejemplo, mediante téenicas de separación o clasificación celular, para que los linfocitos T restantes tengan deficiencia de CD3 o TCR en la superficie celular, lo que permite la expansión de una población aislada de linfocitos T con deficiencia de la expresión de CD3 o TCR funcional.

En una modalidad no taxativa de la invención, se han diseñado ARNhp de direccionamiento de ejemplo para los componentes clave del complejo TCR como se establece a continuación (Tabla 1) .

Tabla 1 a Con referencia al n.° de acceso EU030678. b Con referencia al n.° de acceso AY247834. c Con referencia al n.° de acceso NM_000733. d Con referencia al n.° de acceso NM_000732. e Con referencia al n.° de acceso NM_000073. f·Con referencia al n.° de acceso NM_000734.

Los ARNm de TCR-alfa, TCR-beta, TCR-gamma, TCR-delta, CD3-gamma, CD3-delta, CD3-épsilon, o CD3-zeta se pueden direccionar de manera separada o juntos utilizando una variedad de ARNhp de direccionamiento. Las cadenas de TCR-a y TCR-b están compuestas por partes constantes y variables. Varios ARNhp de direccionamiento han sido diseñados para las partes constantes de estas secuencias de TCR/CD3. Se puede utilizar un ARNhp o una combinación de estos para cada objetivo molecular para identificar el inhibidor más eficiente de la expresión de TCR. Con la utilización de protocolos establecidos, cada construcción de ARNhp se clona, por ejemplo, en un plásmido pLko.l o un vector pSMc2, con la expresión controlada por un promotor utilizado de manera rutinaria en la téenica, por ejemplo, el promotor de U6p. La construcción resultante se puede analizar y confirmar para determinar su exactitud con la secuenciación. El plásmido de expresión de ARNhp luego se puede transfectar en cualquier célula hospedadora adecuada (por ejemplo, 293T), junto con un plásmido empaquetado y un plásmido de envoltura para envasado. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas primarias se aíslan de donantes saludables y se activan con una dosis baja de anti-CD3 soluble y, por ejemplo, 25U/ml a 50U/ml, rhulL-2 durante 72 horas. Aunque no se requiere activar los linfocitos T para la transducción retroviral, la transducción funciona más eficientemente y permite que las células continúen expandiéndose en IL-2. Las células activadas se lavan y se traducen, por ejemplo, utilizando una infección por centrifugación de 1 hora a 30 °C, seguido de un período de descanso de 7 horas.

En otra modalidad de la invención, la sobreexpresión de una proteína inhibidora dominante negativa es capaz de interrumpir la función o expresión de TCR. En esta modalidad de la invención, se prepara un minigén que incorpora parte, o la totalidad de un polinucleótido que codifica uno de los componentes de TCR (por ejemplo, TCR-alfa, TCR-beta, CD3-ga ma, CD3-delta, CD3-épsilon, o CD3-zeta), pero se modifica para que: (1) no tenga los motivos de señalización claves (por ejemplo, un ITAM) requerido para la función de la proteína; (2) se modifique para que no se asocie adecuadamente con sus otros componentes de TCR naturales; o (3) se pueda asociar adecuadamente pero que no una ligandos (por ejemplo, un minigén de TCR beta truncado). Además, se modificó el minigén para que incluya un motivo de señal inhibidora, por ejemplo, un dominio citoplásmico de una proteina KIR, que modifica la señalización celular y promueve señales inhibidoras mediante la captación de fosfatasas, por ejemplo, SHP1 y SHP2.

Estos minigenes también pueden codificar una parte de una proteina que sirve como medio para identificar el minigén sobreexpresado. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican una proteína CD19 truncada, que contiene el sitio de unión para los mAbs anti-CD19, se puede unir de manera operativa al minigén para que la célula resultante que expresa el minigén exprese la proteína codificada y se pueda identificar con mAbs anti-CD19. Esta identificación permite determinar la medida de la expresión del minigén y aislar células que expresan esta proteína (y que por lo tanto carecen de TCR funcional).

En una modalidad de la invención, la sobreexpresión de un minigén que carece de uno o más motivos de señalización lleva a que un complejo TCR no pueda señalizar adecuadamente cuando el TCR esté acoplado por su ligando MHC-péptido en una señal opuesta. En una modalidad no taxativa de la invención, la expresión de alto nivel de este minigén (y su polipéptido codificado) supera la proteina natural completa cuando los componentes de TCR se asocian, lo que resulta en un complejo TCR que no puede señalizar. En otra modalidad de la invención, el minigén comprende, o de manera alternativa consiste en un polinucleótido que codifica polipéptidos totales o parciales CD3-zeta, CD3-gamma, CD3-delta, o CD3-épsilon sin motivos ITAM necesarios para la señalización. La proteina CD3-zeta contiene tres motivos ITAM en la parte citoplásmica y en una modalidad de la invención, la eliminación de todos estos mediante el truncamiento inhibe la señalización adecuada de TCR en cualquiera de los complejos donde se incorpora esta proteina modificada. Ver, por ejemplo, TIM5-8 en Tabla 2, que corresponde a las SEQ ID NO:72-79. La construcción puede incorporar ITIM u otros motivos de señalización, que se sabe que modifican la señalización celular y promueven las señales inhibidoras mediante la captación de fosfatasas tales como SHP1 y SHP2.

Ver, por ejemplo, TIM9-13 en Tabla 2, que corresponde a las SEQ ID NO:80-89.

En una modalidad de la invención, el minigén comprende un polinucleótido que codifica polipéptidos totales o parciales CD3-zeta, CD3-gamma, CD3-delta, o CD3-épsilon con mutaciones, por ejemplo, una única modificación de nucleótidos, que produce un cambio del amino ácido codificado por el polinucleótido. Ver, por ejemplo, TIM14-19 en Tabla 2, que corresponde a las SEQ ID NO: 90-101.

En otra modalidad de la invención, la sobreexpresión de un minigén se modifica para que el polipéptido codificado se pueda asociar con algunos, pero no todos, de sus compañeros naturales, generando competición con la proteína normal para esas proteínas de asociación. En otra hipótesis no taxativa de la invención, la expresión de nivel alto del minigén (y el polipéptido codificado) supera las proteínas de compañeros naturales y evita la reunión de un complejo TCR funcional, que requiere que todos los componentes se asocien en las relaciones adecuadas e interacciones proteína-proteína. En otra modalidad de la invención, los minigenes comprenden, o consisten de manera alternativa en, todo o parte de los polinucleótidos que codifican proteínas de longitud completa (por ejemplo, TCR-alfa, TCR-beta, CD3-gamma, CD3-delta, CD3- épsilon, o CD3-zeta), pero que contienen eliminaciones seleccionada en la secuencia que codifica aminoácidos en la parte de transmembrana de la proteina que se sabe son necesarios para la reunión con otras proteínas TCR/CD3.

En una modalidad preferida de la invención, las eliminaciones seleccionadas en la secuencia que codifica aminoácidos en la parte de transmembrana de la proteina que se sabe es necesaria para la reunión con otras proteínas TCR/CD3 incluyen, de modo no taxativo: el residuo de arginina en la posición 5 en la región transmembrana TCR-alfa; el residuo de lisina en la posición 10 en la región transmembrana TCR-alfa; el residuo de lisina en la posición 9 en la región transmembrana TCR-beta; el residuo de ácido glutámico en la región transmembrana de CD3-gamma; el residuo de ácido aspártico en la región transmembrana de CD3-delta-épsilon; el residuo de ácido aspártico en la región transmembrana de CD3-épsilon; y el residuo de ácido aspártico en la región transmembrana de CD3-zeta.

La sobreexpresión de una proteína TCR-alfa TCR -beta, TCR-gairana, o TCR-delta truncada resulta en un complejo TCR que no se puede unir a ligandos MHC-péptido y por lo tanto no funcionará para activar el linfocito T. Ver la Figura 2, paneles (A) y (B). En otra modalidad de la invención, los minigenes comprenden o de manera alternativa consisten en polinucleótidos que codifican las partes transmembrana y citoplásmicas enteras de estas proteínas y partes de la región extracelular, pero no tiene polinucleótidos que codifican todo o parte del primer dominio extracelular (es decir, el dominio más exterior que contiene el sitio de unión al ligando). En una modalidad preferida, dichos polinucleótidos de minigenes no codifican polipéptidos Valfa y Vbeta de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta. En una modalidad, los polinucleótidos de los minigenes se pueden unir de manera operativa a polinucleótidos que codifican una etiqueta de epítopo de proteína (por ejemplo, CD19), permitiendo de esa manera la identificación mAb de las células que expresan estos genes.

En otra modalidad, estos minigenes se pueden expresar usando un promotor viral potente, tal como el 5'LTR de un retrovirus, o un promotor CMV o SV40. Típicamente, este promotor está inmediatamente anterior al minigén y causa una expresión alta del minigén ARNm. En otra modalidad, la construcción codifica una segunda secuencia de polinucleótido bajo el mismo promotor (utilizando, por ejemplo, una secuencia de ADN IRES en medio) u otro promotor. Esta segunda secuencia de polinucleótidos puede codificar un receptor funcional no-TCR que proporciona especificidad para el linfocito T. Los ejemplos de este polinucleótido incluyen, de modo no taxativo, NKG2D quimérico, NKp30 quimérico, NKp46 quimérico, o anti-Her2neu quimérico. En una modalidad adicional, los minigenes promotores se construyen en un plásmido retroviral o en otro plásmido adecuado de expresión y se transfectan o traducen directamente en los linfocitos T utilizando métodos estándares (Zhang, T. et ál., (2006) Cáncer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et ál., (2007) Cáncer Res., 67(10):5003-5008).

Luego de la transducción viral y la expansión utilizando cualquiera de los métodos discutidos anteriormente, cualquiera de los linfocitos T que aun expresan TCR/CD3 se eliminan utilizando Abs anti-CD3 y cuentas magnéticas utilizando columnas de selección Miltenyi como se describió anteriormente (Barber, A. et ál., (2007) Cáncer Res., 67 (10):5003-5008). Los linfocitos T se lavan y cultivan en IL-2 (25U/ml) durante 3 a 7 dias para permitir la expansión de las células efectoras de una manera similar que para el uso de la célula in vivo.

La expresión de TCR ab y CD3 se puede evaluar mediante citometria de flujo y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) . La expresión de los ARNm TCR- , TCR-b, CD3s, ??3-z y GAPDH (como un control) se puede analizar con qRT-PCR utilizando un instrumento de PCR en tiempo real ABI7300 y cebadores TAQMAN® específicos del gen utilizando métodos similares a los utilizados en Sentman, C.L. et ál. ((2004) J. Immunol . 173:6760-6766). Los cambios en la expresión de la superficie celular se pueden determinar utilizando anticuerpos específicos para TCR-a, TCR-b, CD3s, CD8, CD4, CD5, y CD45.

Es posible que una única especie de ARNhp no puedan inhibir suficientemente la expresión de TCR en la superficie celular. En este caso, los ARNhp de TCR múltiples se pueden usar simultáneamente para direccionar componentes múltiples del complejo TCR. Cada componente es necesario para la reunión del complejo TCR en la superficie celular, por lo que la pérdida de una de estas proteínas puede resultar en pérdida de expresión de TCR en la superficie celular. Si bien se puede mantener un poco o toda de la expresión de TCR, es la función receptora la que determina si el receptor induce una respuesta inmunitaria. La deficiencia funcional, en vez de completar la ausencia de la superficie celular, es la medida crítica. En general, cuanto menor es la expresión de TCR, menos probabilidades hay de que se produzca la reticulación de TCR que cause la activación de linfocitos T mediante el complejo TCR. Si bien algunas modalidades particulares abarcan el direccionamiento de TCR-alfa, TCR-beta y CD3- épsilon, también se pueden direccionar otros componentes del complejo TCR, tales como CD3-gamma, CD3-delta o CD3-zeta.

El objetivo principal de eliminar el TCR de la superficie celular es evitar la activación del linfocito T en alelos de MHC incompatibles. Para determinar si la reducción en la expresión de TCR con cada construcción de minigenes o ARNhp es suficiente modificar la función de linfocitos T, los linfocitos T se pueden analizar para determinar: (1) la supervivencia celular in vitro; (2) la proliferación en la presencia de PBMC alogénicas tratadas con mitomicina C; y (3) la producción de citocina en respuesta a PBMC alogénicas, mAbs anti-CD3, o mAbs anti-TCR.

Para analizar la supervivencia celular, los linfocitos T transducidos se propagan en un medio RPMI completo con rhuIL-2 (por ejemplo, 25U/ml a 50U/ml). Las células se colocan en placas a densidades similares en el comienzo del cultivo y una muestra se puede eliminar para el conteo celular y para determinar la viabilidad diariamente por 7 o dias o más. Para determinar si los linfocitos T expresan TCR suficiente para inducir una respuesta en contra de las células alogénicas, se cultivan los linfocitos T de control o transducidos con PBMC singénicas o alogénicas tratadas con mitocina C, por ejemplo, a una relación de 4:1. Los linfocitos T están precargados con CFSE, que es una tinta permeable a la célula que divide de forma igualitaria entre las células hijas luego de la división. La extensión de la división celular puede determinarse fácilmente mediante citometria de flujo. Otra característica distintiva de la activación de linfocitos T es la producción de citocinas. Para determinar si cada construcción de ARNhp inhibe la función de linfocitos T, se cultivan linfocitos T transducidos con diferentes dosis de mAbs anti-CD3 (1,6 a 5000 ng/ml). Luego de 24 horas, los sobrenadantes sin células se recolectan y la cantidad de IL-2 y/o IFN-g producidos se cuantifican con ELISA. Se utilizan PMA/iomicina como control positivo para estimular los linfocitos T, y los linfocitos T solos se usan como control negativo.

El efecto de las TIM de ejemplo, por ejemplo, ARNhp, proteínas truncadas dominantes negativas, proteínas dominantes negativas de fusión KIR, y proteínas dominantes negativas con secuencia de aminoácidos modificada como un resultado de modificaciones de nucleótido único, diseñados para los componentes claves del complejo TCR, por ejemplo, CD3-épsilon o CD3-zeta, se evaluó en la función efectora de los linfocitos T y los resultados se proporcionan a continuación en la Tabla 2. Estos resultados demuestran que los linfocitos T con deficiencia de TCR se pueden producir utilizando TIM.

Es posible que la eliminación de los componentes TCR-alfa o TCR-beta pueda permitir la expansión preferencial de los linfocitos T de TCR-gama/delta. Estos linfocitos T son poco frecuentes en la sangre, sin embargo, la presencia de estas células se puede determinar con anticuerpos anti-TCR-gama/delta. Si hay un broteo de estas células, se puede utilizar el direccionamiento de CD3-épsilon, que es necesario para la expresión de superficie celular para TCR-alfa/beta y TCR-gamma/delta en la superficie celular. Tanto IL-2 y IFN-y son citocinas efectoras clave que causan la expansión de linfocitos T y la activación de micrófagos. Por lo tanto, la falta de producción de estas citocinas es un signo de inactivación funcional. También es posible medir los cambios en otras citocinas, tales como TNF-a. Se puede determinar la reducción en la supervivencia de linfocitos T luego de la eliminación de expresión de TCR mediante el cultivo de linfocitos T con deficiencia de TCR con PBMC, que refleja de mejor manera el ambiente in vivo y proporciona el apoyo para la supervivencia de linfocitos T.

Métodos para producir linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan un receptor funcional que no es de linfocitos T.

En otra modalidad de la invención, los linfocitos T con deficiencia estable en la expresión de TCR funcional expresan un receptor funcional que no es TCR. En esta modalidad, la eliminación de la función de TCR (como se describió anteriormente) se combina además con la expresión de uno o más receptores de direccionamiento no TCR exógenos (tales como, por ejemplo, moléculas Fv o NKG2D (chNKG2D) quiméricas) Esta modalidad proporciona productos de células "universales", que se pueden almacenar para la terapia futura de cualquier paciente con cualquier tipo de cáncer, siempre que se utilice un receptor de direccionamiento adecuado.

Modalidades adicionales de la invención abarcan la expresión recombinante de los receptores en dichos linfocitos T con deficiencia de TCR, tal como chNKG2D, dominios Fv quiméricos, NKG2D, o cualquier otro receptor para iniciar señales a los linfocitos T, creando de este modo linfocitos T efectores específicos y potentes. Un experto en la téenica puede seleccionar el receptor apropiado para que sea expresado por el linfocito T con deficiencia de TCR basándose en la enfermedad que se va a tratar. Por ejemplo, los receptores que pueden ser expresados por el linfocito T con deficiencia de TCR para el tratamiento del cáncer incluiría todo receptor a un ligando que se ha identificado en células cancerosas. Dichos receptores incluyen, de modo no taxativo NKG2D (número de acceso de GENBANK BC039836), NKG2A (número de acceso de GENBANK AF461812), NKG2C (número de acceso de GENBANK AJ001684), NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AB055881), NKp44 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AJ225109), NKp46 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AJ001383), CD244 (2B4), DNAM-1, y NKp80.

En otra modalidad de la invención, tales receptores incluyen, de modo no taxativo, receptores quiméricos que comprenden un dominio que une un ligando obtenido de NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, y NKp80, o un anticuerpo antitumor tal como anti-Her2neu y anti-EGFR, y un dominio de señalización obtenido de CD3-zeta ^?3z (por ejemplo, número de acceso de GENBANK human NM_ 198053)(SEQ ID N0:62), DaplO (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AF072845), CD28, 41BB, y/o CD40L.

En una modalidad adicional de la invención, el receptor quimérico une MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, RON, o uno o más miembros de la familia de ULBP/RAET1 que incluye ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 y ULBP6.

A modo de ejemplo únicamente, los ARNhp o minigenes que se muestran para eliminar la expresión de superficie celular del complejo TCR se coexpresan con el receptor chNKG2D mediante uno o más vectores virales. Para lograr la coexpresión en un vector, el ARNhp se puede impulsar por un promotor U6 y el receptor chNKG2D por un promotor PGK. En otra modalidad, si una secuencia IRES se utiliza para separar los elementos genéticos, entonces solo se usa un promotor.

Una proteina receptora de células NK similares a la lectina, de tipo C particularmente adecuados para usar en el receptor quimérico incluye un receptor expresado en la superficie de los linfocitos citolíticos naturales, donde luego de su unión a su o sus ligandos cognados altera la activación de células NK. El receptor puede trabajar solo o en conjunto con otras moléculas. Los ligandos de estos receptores se expresan generalmente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales, por ejemplo, asociados con cánceres de colon, pulmones, mamas, riñón, ovarios, cuello del útero y próstata; melanomas; mielomas; leucemias y linfomas (Wu et ál. (2004) J. Clin. Invest.114:60-568; Groh, et ál. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:6879-6884; Pende, et ál. (2001) Eur. J. Imunol. 31:1076-1086) y no están ampliamente expresados en la superficie de las células de tejidos normales.

Los ejemplos de dichos ligandos incluyen, de modo no taxativo, MIC-A, MIC-B, proteínas de choque térmico, proteínas de unión a ULBP (por ejemplo, ULPB 1-4) y moléculas HLA no clásicas tales como HLA-E y HLA-G, mientras que las moléculas MHC clásicas tales como HLA-A, HLA-B, o HLA-C y los alelos de estos no se consideran generalmente ligandos fuertes de la proteína receptora de células NK similares a la lectina, de tipo C de la presente invención. Los receptores de células NK similares a la lectina, de tipo C que se unen a estos ligandos generalmente tienen una estructura de proteína de tipo II, donde el extremo N de la proteína es intracelular. Además de cualquiera de los receptores de células NK enumerados anteriormente, receptores de células NK de ejemplo adicionales de este tipo incluyen, de modo no taxativo, Dectin-1 (número de acceso de GENBANK AJ312373 o AJ312372), Antígeno asociado a la función de mastocitos (número de acceso de GENBANK AF097358), HNKR-P1A (número de acceso de GENBANK U11276), LLT1 (número de acceso de GENBANK AF133299), CD69 (número de acceso de GENBANK NM_ 001781), homólogo CD69, CD72 (número de acceso de GENBANK NM_ 001782), CD94 (número de acceso de GENBANK NM_ 002262 o NM_ 007334), KLRF1 (número de acceso de GENBANK NM_ 016523), receptor de LDL oxidado (número de acceso de GENBANK NM 002543), CLEC-1, CLEC-2 (número de acceso de GENBANK NM 016509), NKG2D (número de acceso de GENBANK BC039836), NKG2C (número de acceso de GENBANK AJ001684), NKG2A (número de acceso de GENBANK AF461812), NKG2E (número de acceso de GENBANK AF461157), WUGSC:H_DJ0701016.2, o lectina de asociación a DAP12 mieloide (MDL-1; número de acceso de GENBANK AJ271684). En una modalidad preferida de la invención, el receptor de células NK es NKG2D humano (SEQ ID NO:58) o NKG2C humano (SEQ ID NO:59).

Los receptores similares de tipo I que serán útiles en el receptor quimérico incluyen NKp46 (número de acceso de GENBANK AJ001383), NKp30 (número de acceso de GENBANK AB055881), o NKp44 (número de acceso de GENBANK AJ225109).

Como una alternativa a la proteina de receptor celular de NK similar a lectina de tipo C, se puede usar una proteína asociada con una proteína receptora de células NK similar a la lecitina de tipo C en la proteína receptora quimérica. En general, las proteínas asociadas con el receptor de células NK similar a la lecitina de tipo C se definen como proteínas que interactúan con el receptor y transducen señales a partir de este. Las proteínas humanas adecuadas que funcionan de esta manera incluyen además, de modo no taxativo, DAP10 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AF072845)(SEQ ID NO:60), DAP12 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK AF019562)(SEQ ID NO:61) y FcR gamma.

En el extremo N del receptor de células NK similares a la lectina de tipo C se fusiona un receptor de señalización inmunitario que tiene un motivo de activación de inmunoreceptor a base de tirosina (ITAM), (Asp/Glu)-Xaa-Xaa-Tyr*-Xaa-Xaa-(Ile/Leu)-Xaa6-8_Tyr*-Xaa-Xaa-(Ile/Leu) (SEQ ID NOS: 55-57) que está involucrado en la activación de respuestas celulares mediante receptores inmunitarios. De manera similar, cuando se utiliza una proteina asociada con un receptor de células NK similares a la lectina de tipo C, se puede fusionar un receptor de señalización inmunitario al extremo C de dicha proteina (Figura 1). Los receptores de señalización inmunitarios adecuados para usar en el receptor quimérico de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, la cadena zeta del receptor de linfocitos T, la cadena eta que difiere de la cadena zeta solo en su exón más cercano al extremo C como resultado de un corte y empalme alternativo de las cadenas de ARNm zeta, delta, gamma, épsilon del receptor de linfocitos T (cadenas CD3) y la subunidad gama del receptor de FcRl. En modalidades particulares, además de los receptores de señalización inmunitarios identificados anteriormente, el receptor de señalización inmunitario es CD3-zeta (CD3 (por ejemplo, número de acceso de GENBANK human NM_ 198053 y NM-000734)(SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:64, respectivamente), o la cadena gamma de receptores épsilon de Fe humano (por ejemplo, número de acceso de GENBANK M33195)(SEQ ID NO:63) o el domino citoplásmico o una variante de corte y empalme de este. En particular, por ejemplo, CD3-zeta tiene 2 variantes de transcripción alternativamente cortadas y empalmadas que codifican isoformas distintas, es decir, variante de transcripción 1 (SEQ ID NO:62) y variante de transcripción 2 (SEQ ID NO:64). A la isoforma codificada de la variante 2 (SEQ ID NO:65) le falta un aminoácido interno en comparación con la variante 1.

En modalidades particulares, un receptor quimérico de la presente invención es una fusión entre NKG2D y CD3-zeta, o DaplO y CD3-zeta.

En la construcción de ácido nucleico de la presente invención, el promotor está unido de manera operativa a la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor quimérico de la presente invención, es decir, están ubicados para que promuevan la transcripción del ARN mensajero del ADN que codifica el receptor quimérico. El promotor puede ser de origen genómico o puede generarse sintéticamente. En la téenica se conoce una variedad de promotores para usar en los linfocitos T (por ejemplo, el promotor CD4 descrito por Marodon, et ál. (2003) Blood 101(9):3416-23). El promotor puede ser constitutivo o inducible, donde la inducción está asociada con el tipo de célula específica o un nivel específico de maduración. De manera alternativa, también son adecuados una cantidad de promotores virales bien conocidos. Los promotores de interés incluyen el promotor de b-actina, promotores tardíos y tempranos SV40, promotor de inmunoglobulina, promotor de citomegalovirus humano, promotor de retrovirus y el promotor del virus de Friend formador de focos en el bazo. Los promotores pueden o no estar asociados con potenciadores, donde los potenciadores pueden estar naturalmente asociados con el promotor particular o asociados con un promotor diferente.

La secuencia del marco de lectura abierto que codifica el receptor quimérico se puede obtener a partir de una fuente de ADN genómico, una fuente de ADNc o se puede sintetizar (por ejemplo, mediante PCR) o combinaciones de estos. Dependiendo del tamaño del ADN genómico y de la cantidad de intrones, puede ser conveniente usar ADNc o una combinación de este, ya que se descubrió que los intrones estabilizan el ARN o proporcionan la expresión específica de linfocitos T (Barthel y Goldfeld (2003) J. Immunol.171(7):3612-9). Además, puede ser beneficioso usar regiones no codificantes exógenas o endógenas para estabilizar el ARNm.

Para la expresión de un receptor quimérico de la presente invención, se puede usar la región de iniciación de transcripción endógena de origen natural de la secuencia de ácido nucleico que codifica el componente de extremo N del receptor quimérico para generar el receptor quimérico en el hospedador objetivo. De manera alternativa, se puede usar una región de iniciación de transcripción exógena, lo que permite la expresión inducible o constitutiva, donde la expresión se puede controlar dependiendo del hospedador objetivo, el nivel de expresión deseado, la naturaleza del hospedador objetivo, y similares.

Asimismo, la secuencia de señal que dirige el receptor quimérico a la membrana de la superficie puede ser la secuencia de señal endógena del componente de extremo N del receptor quimérico. De manera opcional, en algunos casos, puede ser deseable intercambiar esta secuencia por una secuencia de señal diferente. Sin embargo, la secuencia de señal seleccionada debe ser compatible con la via secretora de los linfocitos T para que el receptor quimérico se presente en la superficie del linfocito T.

De manera similar, una región de terminación se puede proporcionar por la región de terminación de transcripción endógena o de origen natural de la secuencia de ácido nucleico que codifica el componente del extremo C del receptor quimérico. De manera alternativa, la región de terminación se puede derivar de una fuente diferente. En su mayoría, la fuente de la región de terminación generalmente no se considera de crucial importancia a la expresión de una proteína recombinante y una amplia variedad de regiones de terminación se pueden utilizar sin afectar negativamente la expresión.

Como lo apreciará el experto en la téenica, en algunos casos, se pueden eliminar algunos aminoácidos en los extremos del receptor de linfocitos citolíticos similares a la lectina de tipo C (o proteína asociada con este) o receptor de señalización inmunitario, usualmente no más de 10, más usualmente no más de 5 residuos. También, puede ser conveniente introducir una pequeña cantidad de aminoácidos en los límites, usualmente no más de 10, más usualmente no más de 5 residuos. La eliminación o inserción de aminoácidos usualmente será el resultado de las necesidades de la construcción, proporcionando sitios de restricción convenientes, facilidad de manipulación, mejora en los niveles de expresión, o similares. Además, el sustituto de urto o más aminoácidos con un aminoácido diferente se puede producir por razones similares, usualmente no sustituyendo más de alrededor de cinco aminoácidos en cualquier dominio.

La construcción quimérica, que codifica el receptor quimérico se puede preparar de maneras convencionales. Ya que, en su mayoría, se utilizan secuencias naturales, los genes naturales se aíslan y se manipulan, de la manera que sea adecuado (por ejemplo, cuando se utilizan un receptor Tipo II, el componente de receptor de señalización inmunitario deberá tener que invertirse), para permitir la unión adecuada de los distintos componentes. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de extremo C y extremo N del receptor quimérico se pueden aislar utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores adecuados que produzcan la eliminación de las partes no deseadas del gen. De manera alternativa, se pueden utilizar digeridos de restricción de genes clonados para generar la construcción quimérica. En cualquier caso, las secuencias se pueden seleccionar para proporcionar sitios de restricción que tienen extremos romos, o tienen superposiciones complementarias.

Las diversas manipulaciones para preparar la construcción quimérica se puede llevar a cabo in vitro y en modalidades particulares se introduce la construcción quimérica en los vectores para la clonación y expresión en un hospedador adecuado utilizando métodos de transfección o transformación estándares. Por lo tanto, luego de cada manipulación, se clona la construcción resultante de la unión de las secuencias de ADN, se aísla el vector y las secuencias se analizan para asegurarse que las secuencias codifiquen el receptor quimérico deseado. La secuencia se puede analizar mediante análisis de restricción, secuenciación o similares.

Está contemplado que la construcción quimérica se puede introducir en los linfocitos T como ADN no conjugado o en un vector adecuado. Los métodos para la transfección estable de linfocitos T mediante la electroporación utilizando ADN no conjugado son conocidos en la téenica. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6,410,319. ADN no conjugado se refiere generalmente a el ADN que codifica un receptor quimérico de la presente invención contenido en un vector de expresión plásmido en una orientación adecuada para la expresión. De manera ventajosa, el uso de ADN no conjugado reduce el tiempo necesario para producir linfocitos T que expresan el receptor quimérico de la presente invención.

De manera alternativa, se puede usar un vector viral (por ejemplo, un vector retroviral, vector adenovirus, vector viral adeno-asociado o vector lentiviral) para introducir la construcción quimérica en los linfocitos T. Los vectores adecuados para su uso de acuerdo con el método de la presente invención no se reproducen en los linfocitos T de los sujetos. Se conoce una gran cantidad de vectores que están basados en virus, donde el número de copias del virus mantenido en la célula es lo suficientemente bajo como para mantener la viabilidad de la célula. Los vectores de ejemplo incluyen vectores pFB-neo (STRATAGENE™) asi como también vectores basados en V1H, SV40, EBC, HSV o BPV. Una vez que está establecido que el linfocito T transducido o transfectado es capaz de expresar el receptor quimérico como una proteína de membrana de superficie con la regulación deseada y a un nivel deseado, se puede determinar si el receptor quimérico es funcional en la célula hospedadora para proporcionar la inducción de señal deseada (por ejemplo, producción de Rantes, Mipl-alfa, GM-CSF luego de la estimulación con el ligando adecuado).

Como se describe anteriormente, las PBMC humanas primarias se aíslan de donantes saludables y se activan con anti-CD3 solubles de dosis baja (por ejemplo, 40 ng/ml) y rhulL-2 (por ejemplo, 50 U/ml), cuentas anti-CD3/anti-CD28 y rhuIL-2, o se les irradia células presentadoras de antígenos y rhuIL-2. Luego se lavan los linfocitos T activados y se transducen con retrovirus, por ejemplo, 1 hora de espinoculación a 32 °C, seguido por un periodo de descanso de 7 horas. Aunque no se requiere activar los linfocitos T para la transducción lentiviral, la transducción es más eficiente y las células continúan expandiéndose en IL-2. Las células activadas se lavan y transducen, como se describe en la presente, seguido de un periodo de descanso y luego se presentan para selección, por ejemplo G418 durante 3 dias. Luego de la selección, las células se lavan y se cultivan en IL-2 de 2 a 7 dias para permitir la expansión de las células efectoras de una manera similar que para el uso de célula in vivo. Los cambios en la expresión de la superficie celular de receptores se analizan utilizando anticuerpos específicos para CD3, CD4, NKG2D o CD5. Se espera que la expresión del receptor no TCR exógeno aumentará en las células que han sido transducidas para expresar ese receptor particular, por ejemplo, se espera que los linfocitos T transducidos con retrovirus que expresan chNKG2D tengan un nivel de expresión de superficie aumentada de chNKG2D.

La expresión de TCRa , CD3 y NKG2D se puede evaluar mediante la citometría de flujo y la qRT-PCR cuantitativa como se discute en la presente. La cantidad de linfocitos T CD4+ y CD8+ también se puede determinar. Las cantidades totales de células y el porcentaje de linfocitos T que expresan chNKG2D, con deficiencia de complejo TCR y con TCR competente se pueden determinar por citometria de flujo. Estas cantidades se pueden comparar con las PBMC que han sido transducidas solo con el ARNhp o los genes chNKG2D (como controles). Las células transducidas solo por vectores también se pueden incluir como controles.

Luego de la expansión y transducción viral, las células TCR-y TCR+ se pueden separar con mAbs con cuentas magnéticas en columnas de Miltenyi y se identifican y aíslan los linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan el receptor chNKG2D. Por ejemplo, la expresión chNKG2D se puede verificar con QRT-PCR utilizando cebadores específicos para el receptor dechNKG2D (Zhang, T. et ál. (2007) Cáncer Res. 67:11029-11036; Barber, A. et ál. (2008) J. Immunol . 180:72-78). La función de estas células chNKG2D+ con deficiencia de TCR se puede determinar mediante el cultivo de células con PBMC alogénicos o células tumorales que expresan ligandos NKG2D. La proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas (por ejemplo, IFN-g y/o IL-2) se puede determinar con citometria de flujo y ELISA, respectivamente. Para determinar si los linfocitos T que han perdido la función TCR y han retenido la función de chNKG2D, los linfocitos T transducidos o de control se cultivarán con anti-CD3 (1,6 a 5000 ng/ml), PBMC alogénicas tratadas con mitocina C o PBMC singénicas. Se recolectan los sobrenadantes celulares y se determina la extensión de la producción de citocinas (por ejemplo, IFN-g y/o IL-2) con ELISA. Los linfocitos T se pueden precargar con CFSE, que es una tinta permeable a la célula que divide de forma igualitaria entre las células hijas luego de la división. La extensión de la división celular puede determinarse fácilmente mediante citometria de flujo.

Otra caracteristicadistintiva de la activación de linfocitos T es la producción de citocinas. Para determinar si las células chNKG2D+ con deficiencia de TCR inducen la activación de linfocitos T, los linfocitos T se cocultivan con PBMC alogénicos tratados con mitomicina C, PBMC singénicas o células tumorales: P815-MICA (un tumor murino que expresa MICA humano, un ligando para NKG2D), P815, A2008 (una célula tumoral de ovario humano, NKG2D ligandot), y U266 (una linea celular de mieloma humano, NKG2D ligando†). Luego de 24 horas, los sobrenadantes sin células se recolectan y la cantidad de IL-2 y IFN-g producidos se cuantifican con ELISA. Los linfocitos T solos y el cultivo con PBMC singénicas se utilizaron como controles negativos. Se observó una reducción mayor que 40 % en la producción de IFN-g en los linfocitos T que expresan TIM7 y TIM8 que también coexpresaron chNKG2D (no se muestran los resultados en la Figura 3).

Posteriormente, los linfocitos T se reintroducen o se administran al sujeto para activar las respuestas antitumorales en dicho sujeto. Para facilitar la administración, de acuerdo con la invención, los linfocitos T transducidos se pueden hacer en composiciones farmacéuticas o implantes adecuados para la administración in vivo, con portadores o diluyentes adecuados, que pueden ser además farmacéuticamente aceptables. Los medios para elaborar dicha composición o un implante se han descrito en la téenica (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack, ed. (1980)). Cuando corresponda, los linfocitos T transducidos se pueden formular en una preparación en forma liquida o semisólida, tal como una cápsula, solución, inyección, inhalador o aerosol, en las maneras convencionales para su vía de administración respectiva. Los medios conocidos en la técnica se pueden utilizar para evitar o minimizar la liberación y absorción de la composición hasta que alcance el tejido u órgano objetivo, o para asegurar la liberación cronometrada de la composición. Sin embargo, de manera conveniente, se utiliza una forma farmacéuticamente aceptable que no deja sin efecto las células que expresan el receptor quimérico. Por lo tanto, de manera conveniente, los linfocitos T transducidos se pueden hacer en una composición farmacéutica que contiene una solución salina balanceada, preferentemente, la solución salina balanceada de Hanks o la solución salina normal.

Metodos para mejorar o reducir síntomas, o tratar o prevenir enfermedades y trastornos utilizando linfocitos T con deficiencia de TCR La invención también se dirige a métodos para reducir o mejorar, o prevenir o tratar enfermedades y trastornos utilizando linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente, poblaciones aisladas de estos o composiciones terapéuticas que los comprenden. En una modalidad, los linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente, poblaciones aisladas de estos o composiciones terapéuticas que los comprenden se utilizan para reducir o mejorar, o prevenir o tratar cáncer, infecciones, uno o más trastornos autoinmuntarios, malestar por radiación, o para prevenir o tratar la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) o el rechazo a trasplante en un sujeto que se somete a una cirugía de trasplante.

Los linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente, poblaciones aisladas de estos o composiciones terapéuticas que los comprenden son útiles para modificar el rechazo de trasplantes o autoinmuntarios porque estas células efectoras se pueden cultivar en TGF-b durante el desarrollo y se diferenciarán para convertirse en linfocitos T reguladores inducidos. En una modalidad, el receptor funcional que no es TCR se utiliza para proporcionar a estos linfocitos T reguladores inducidos la especificidad funcional necesaria para que realicen su función inhibidora en el sitio del tejido de la enfermedad. Por lo tanto, se cultiva una gran cantidad de linfocitos T reguladores específicos de antígeno para su uso en pacientes. La expresión de FoxP3, que es esencial para la diferenciación de linfocitos T reguladores, se puede analizar mediante citometría de flujo, y la proliferación de linfocitos T de inhibición funcional de estos linfocitos T reguladores se puede analizar examinando las disminuciones en la proliferación de linfocitos T luego de la estimulación de anti-CD3 luego del cocultivo.

Otra modalidad de la invención está dirigida al uso de los linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente, las poblaciones aisladas de estos o las composiciones terapéuticas que los comprenden para la prevención o tratamiento de malestar por radiación. Uno de los desafíos luego del tratamiento de radiación o exposición (por ejemplo, exposición a la bomba sucia, filtración de radiación) u otra afección que extirpe células de médula ósea (algunas terapias de fármacos) es reconstituir el sistema hematopoyético. En pacientes que se someten a trasplantes de médula ósea, el conteo absoluto de linfocitos el día 15 luego del trasplante se correlaciona con el resultado exitoso. Aquellos pacientes con un conteo de linfocitos alto se reconstituyen bien, por lo que es importante tener una buena reconstitución de linfocitos. La razón de este efecto no es clara, pero puede ser debido a la protección de linfocitos de la infección y/o producción de factores de crecimiento que favorecen la reconstitución hematopoyética.

En esta modalidad, los linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente, las poblaciones aisladas de estos o las composiciones terapéuticas que los comprenden causan la producción de una gran cantidad de linfocitos T que son incapaces de responder a antigenos MHC alogénicos. Por lo tanto, estos linfocitos T se pueden usar para la reconstitución en personas y ofrecer protección contra infecciones, lo que lleva a una autoreconstrucción más rápida de personas que padecen de extirpación de la médula ósea debido a la exposición a radiación. En caso de una exposición inesperada o en condiciones catastróficas de altas dosis de radiación, los linfocitos T con deficiencia de TCR descritos en la presente que tienen otro receptor funcional, poblaciones aisladas de estos o las composiciones terapéuticas que los comprenden se pueden infusionar rápidamente en pacientes para ofrecer alguna reconstitución de su respuesta inmunitaria y producción del factor de crecimiento durante dias o semanas hasta que sus propias celulas hematopoyéticas se hayan reconstituido a si mismas, o hasta que la persona haya sido tratada con una fuente adicional de células madre hepatopoyéticas (por ejemplo, un trasplante de médula ósea).

Un experto en la téenica entenderá como tratar el cáncer, infección, rechazo de trasplante, uno o más trastornos autoinmuntarios, malestar por radiación, o GVHD basándose en su propia experiencia con el uso de otros tipos de linfocitos T.

Además de los linfocitos T chNKG2D+ con deficiencia de TCR de ejemplo descritos en la presente, se contempla que los linfocitos T con deficiencia de TCR se pueden modificar o desarrollar para expresar otros receptores funcionales útiles para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer o infección como se describió anteriormente. En resumen, los métodos de tratamiento de la invención contemplan el uso de linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan receptores funcionales que no son TCR, tales como chNKG2D, dominios Fv quiméricos, NKG2D, o cualquier otro receptor para iniciar señales a los linfocitos T, creando de este modo linfocitos T efectores específicos y potentes. Un experto en la técnica puede seleccionar el receptor apropiado para que sea expresado por el linfocito T con deficiencia de TCR basándose en la enfermedad que se va a tratar. Por ejemplo, los receptores que pueden ser expresados por el linfocito T con deficiencia de TCR para el tratamiento del cáncer incluiría todo receptor que se une a un ligando que se ha identificado en células cancerosas. Tales receptores incluyen, de modo no taxativo, NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1 y NKp80.

En otra modalidad de la invención, tales receptores incluyen, de modo no taxativo, receptores quiméricos que comprenden un ligando que une un dominio obtenido de NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLTl, AICL, CD26, NKRP1, NKp30, NKp44, NKp46, CD244 (2B4), DNAM-1, y NKp80, o un anticuerpo antitumor tal como anti-Her2neu o anti-EGFR, y un dominio de señalización obtenido de CD3zeta, DaplO, CD28, 41BB y CD40L.

En una modalidad adicional de la invención, el receptor quimérico une MIC-A, MIC-B, Her2neu, EGFR, mesotelina, CD38, CD20, CD19, PSA, MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MÜC19, MUC20, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, RON, o uno o más miembros de la familia de ULBP/RAETl que incluye ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 y ULBP6 .

La presente invención también contempla los linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan un receptor que no es TCR asociado con patógenos y el uso de linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan el receptor de patógenos para tratar o prevenir enfermedades infecciosas. En esta modalidad, el receptor que no es TCR se une al antígeno del virus o al antigeno inducido por el virus encontrado en la superficie de una célula infectada. La infección que se va a prevenir o tratar, por ejemplo, puede estar causada por un virus, bacteria, protozoo o parásito. Los virus que se pueden tratar incluyen, de modo no taxativo, HCMV, EBV, hepatitis tipo D, hepatitis tipo B (HBV), hepatitis tipo C (HCV), virus de ébola, VSV, influenza, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (HSV-1), herpes simplex tipo 2 (HSV-2), virus de la peste bovina, rhinovirus, echovirus, rotavirus, virus sinticial respiratorio, virus del papiloma, citomegalovirus (CMVj, echinovirus, arbovirus, hantavirus, coxsackievirus, virus de paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, poliovirus, y/o virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 o tipo 2 (HIV-1, HIV-2). Las infecciones no virales que se pueden tratar usando los linfocitos T con deficiencia de TCR incluyen, de modo no taxativo, Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Bacillus anthracis, Lactobacillus sp., Listeria sp., Corynebacterium diphtheriae, Nocardia sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Gardnerella sp., Streptomyces sp., Thermoactinomyces vulgaris, Treponema sp., Camplyobacter sp., Raeruginosa sp., Legionella sp., N. gonorrhoeae , N. meningitides , F. meningosepticum, F. odoraturn, Brucella sp. , B. pertussis, B. bronchiseptica , E. coli, Klebsiella , Enterobacter , S. marcescens , S. liquefaciens , Edwardsiella , P. mirabilis, P. vulgaris , Streptobacillus , R. fickettsfi, C. psittaci, C. trachornatis , M. tuberculosis, M. intracellulare , M. folluiturn, M. laprae , M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii , M. lepraernurium, trypanosomes , Chlamydia, o ric ettsia infecciosos.

La eficacia de las composiciones de la presente invención se pueden demostrar en el sistema de modelo in vivo más adecuado dependiendo del tipo de producto de fármaco que se desarrolla. La bibliografía médica proporciona la divulgación de las ventajas y utiliza una amplia variedad de dichos modelos. Por ejemplo, hay muchos tipo diferentes de modelos de cáncer que se utilizan comúnmente para examinar la actividad farmacológica de los fármacos contra el cáncer tal como modelos de ratón de xenoinjerto (por ejemplo, Mattern, J. et ál.1988. C ncer Met stasis Rev. 7:263-284; Macor, P. et ál. 2008. Curr. Pharm. Des. 14:2023-2039) o incluso la inhibición del crecimiento de células tumorales in vitro. En el caso de GVHD, hay modelos en ratones de ambos GVHD agudo (por ejemplo, He, S. et ál.2008. J. Immunol . 181:7581-7592) y GVHD crónico (por ejemplo, Xiao, Z.Y. et ál. 2007. Life Sci. 81:1403-1410).

Una vez que las composiciones de la presente invención han demostrado ser eficaces in vivo en animales, los estudios clínicos se pueden diseñar basándose en las dosis que demostraron ser seguras y eficaces en animales. Un experto en la téenica puede diseñar dichos estudios clínicos utilizando protocolos estándares tal como se describe en los libros de texto como Spilker (2000. Guide to Clinical Triáis. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia).

Adminis t ración En una modalidad de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR se administran a un sujeto receptor en una cantidad de células entre alrededor de 106 a 1011. En una modalidad preferida de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR se administran a un sujeto receptor en una cantidad de células entre 108 a 109. En una modalidad preferida de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, o una vez cada cuatro semanas o menos.

Estos valores proporcionan la guía del intervalo de linfocitos T transducidos a ser utilizados por el profesional luego de optimizar el método de la presente invención para la práctica de la invención. La lectura de dichos intervalos en la presente, de ninguna manera descarta el uso de una cantidad más alta o más baja de un componente, como se puede justificar en una aplicación particular. Por ejemplo, la dosis actual y el itinerario puede variar dependiendo de si las composiciones se administran en combinación con otras composiciones farmacéuticas, o dependiendo de las diferencias interindividuales en la farmacocinética, disposición del fármaco y metabolismo. Un experto en la téenica fácilmente puede realizar cualquier ajuste necesario de acuerdo con las exigencias de la situación particular.

Un experto en la técnica podría determinar una dosis y una frecuencia de administración eficaces basado en las enseñanzas de la técnica o a través de experimentos de rutina, por ejemplo, guiándose por las descripciones de la presente y las enseñanzas en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R.

A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology.

Lippincott's illustrated reviews. Filadelfia: Lippincott Williams & Wilkins; y Golan, D. E. (2008). Principies of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy.

Filadelfia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins. El itinerario de dosificación se puede basar en las terapias a base de células bien establecidas (ver, por ejemplo, Topalian and Rosenberg (1987) Acta Haematol.78 Suppl 1:75-6; patente estadounidense n.° 4,690,915) o se puede utilizar una estrategia de infusión continua alternativa.

En otra modalidad de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR se administran a un sujeto en una formulación farmacéutica.

En una modalidad de la invención, los linfocitos T con deficiencia de TCR se pueden administrar opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y anticitocina. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-OÍ, IFN-g, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), Hepcidina, incluyendo anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen ácidos 2- Arilpropiónicos, Aceclofenac, Acemetacina, ácido Acetilsalicílico (Aspirina), Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, ácidos Arilalcanoicos, Azapropazona, Benorylato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bro fenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib Faislamina ácidos fenámicos , Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranílicos, Factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés), Oxametacina, Oxaprozin, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib.

Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglicosidas, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefe , Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalothin, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxi a, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloramfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritro icina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclocielina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolidas, Mafenida, eropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetracielina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina Trovafloxacina y Vancomicina.

Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona. Se contempla también cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.

Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un portador, normalmente un liquido, donde se formula un agente terapéutico activo. En una modalidad de la invención, el agente terapéutico activo es una población de linfocitos T con deficiencia de TCR. En una modalidad de la invención, el agente terapéutico activo es una población de linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan un receptor funcional que no es TCR. El excipiente en general no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica. Se pueden encontrar ejemplos de formulaciones, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.a Ed., Grennaro, A., Ed., 1995, que se incorpora en la presente mediante esta referencia.

Como se usa en la presente, un "portador" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción que son fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el portador es adecuado para la administración parenteral. De manera alternativa, el portador puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la téenica. Salvo en la medida en que algún medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, los portadores adecuados incluyen, de modo no taxativo, solución salina balanceada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), o cualquier otro medio de congelación que tenga por ejemplo 10 % de DMSO y 90 % de suero humano.

Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en una forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución. El portador puede ser un medio que dispersión que contiene, por ejemplo, agua.

Para cada una de las modalidades descritas, los compuestos pueden administrarse mediante una variedad de formas de dosificación. Se contemplan todas las formas de dosificación biológicamente aceptables conocidas por los expertos en la téenica y combinaciones de estas. Los ejemplos de tales formas de dosificación incluyen, de modo no taxativo, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, inyectables (incluyendo inyecciones subcutáneas, intramusculares, intravenosas e intradérmicas), infusiones y combinaciones de estos .

La descripción anterior de varias modalidades ilustradas de la invención no pretende ser taxativa ni limitar la invención a la forma concreta descrita. Mientras que modalidades específicas y ejemplos de la invención se describen en la presente con fines ilustrativos, es posible realizar diversas modificaciones equivalentes dentro del alcance de la invención, como lo reconocerán los expertos en la téenica pertinente. Las enseñanzas de la invención proporcionadas en la presente pueden aplicarse con otros fines distintos a los ejemplos descritos anteriormente.

Se pueden realizar estos y otros cambios a la invención a la luz de la descripción detallada anteriormente. En general, en las reivindicaciones a continuación, no deberá entenderse que los términos utilizados limitan la invención a las modalidades específicas descritas en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones. Por consiguiente, la descripción no limita la invención sino que, en cambio, el alcance de la invención estará totalmente determinado por las reivindicaciones que figuran más adelante.

La invención puede ponerse en práctica de formas distintas a aquellas descritas particularmente en la descripción anterior y en los ejemplos. Son posibles diversas modificaciones y variaciones de la invención en vista de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Determinadas enseñanzas relacionadas con composiciones de linfocitos T con deficiencia del receptor de linfocitos T y los métodos para su uso se describieron en la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/255,980, presentada el 29 de octubre de 2009, cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Determinadas enseñanzas relacionadas con la producción de receptores quiméricos que expresan linfocitos T y los métodos para su uso se describieron en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2010/0029749, publicada el 4 de febrero de 2010, cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Dichas secuencias de polinucleótidos útiles para la producción de linfocitos T con deficiencia del receptor de linfocitos T de la invención se describen en el listado de secuencias que acompaña esta presentación de solicitud de patente, y la descripción de dicho listado de secuencias se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

La totalidad de la descripción de cada documento citado (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos de revistas, resúmenes, manuales, libros u otras descripciones) en los Antecedentes de la Invención, Descripción Detallada y Ejemplos, se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionar a los expertos en la téenica una descripción completa de cómo realizar y usar la invención objeto de la presente y no se pretende que limiten el alcance de lo que se entiende como la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero puede haber algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se da en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a esta.

EJEMPLOS Ejem lo 1; Producción de linfocitos T con deficiencia de receptor de los linfocitos T (TCR) Los minigenes se codifican en un plásmido de expresión de retrovirus (por ejemplo, pFB-neo o pSFG) que contiene secuencias de LTR 5' y 3'. Los plásmidos están empaquetados en una linea celular empaquetadora retroviral, tal como PT67 o PG13, y se recolectan las partículas virales luego que las células empaquetadoras han crecido hasta lograr la confluencia. Luego se activan los linfocitos T mediante PHA, anti-CD3, o anti-CD3/28 mAbs durante 1 a 3 días en un medio completo (o medio sin suero) más rIL-2 (25 U/ml), y se transducen los linfocitos T mediante espinoculación a 32 °C en la presencia de retronectina o polibreno. Luego de descansar por unas 5 a 7 horas, las células se lavaron y se colocaron en medio fresco más IL-2 por 2 a 7 días. Las células se cuentan periódicamente para evitar la concentración celular excesiva (es decir, > 2 x 106 células/ml) y se vuelven a ubicar en placas a 7 x 105 células/ml. El medio de selección para quitar linfocitos T no transducidos se utiliza opcionalmente luego de 2 días durante un período de 3 a 5 días. Las células vivas se cultivan con gradiente Lymphoprep™ (Sentinel, Milán, Italia) y se expanden adicionalmente por 1 a 3 días.

Luego de la incubación, las células se analizan para ver la expresión y función de los TCR. La expresión del receptor no TCR funcional también se puede analizar en este punto, si se considera apropiado. La citometria de flujo se utiliza para analizar la expresión de TCR/CD3 utilizando anticuerpos marcados con fluorocromo. Las células vivas se tiñen con anticuerpos contra a CD5, CD8 y CD4 en combinación con un anticuerpo contra CD3s, TCRa, TCRp, TCRy o TCR5. Si se utiliza la expresión de los genes CD3 o los TCR, la expresión de las proteínas TCR y CD3 deberían reducirse drásticamente en comparación con los linfocitos T tratados con el vector de control. Los anticuerpos de control de isotipos se utilizan para controlar la fluorescencia de fondo. Para identificar los linfocitos T, las células se regulan con CD5, luego se determina la expresión de CD4, CD8, CD3 y TCR. Se utilizaron muestras múltiples para cada tratamiento y se utiliza compensación apropiada de espectro de emisión de fluorocromo. La expresión de otro receptor (por ejemplo, chNKG2D) se determina utilizando anticuerpos específicos y citometría de flujo, tal como se describe previamente en la téenica (Zhang, T. et ál., (2006) Cáncer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et ál., (2007) Cáncer Res., 67(10):5003-5008).

Para analizar la deficiencia funcional de los TCR, se utilizó estimulación anti-CD3 de las células efectoras al final del cultivo para medir la producción de interferón (IFN)-gamma luego de 24 horas. Los linfocitos T (2 x 105) se cultivan con mAbs anti-CD3 (OKT3) solubles en medio completo. Luego de 24 horas, el medio acondicionado libre de células se recolecta y se ensaya mediante ELISA para detectar IFN-gama. Los cambios en la expresión o función de TCR se deberían reflejar en la producción reducida de IFN-gamma.

Para analizar la función del receptor funcional que no es TCR, se utiliza la producción de citocina especifica por linfocitos T incubados con células tumorales que expresan o no su ligando especifico. Por ejemplo, para probar la función de chNKG2D, 105linfocitos T se incuban con 105 células tumorales P815-MICA (ligando+), 105 células P815 (ligando-), 105 células RPMI8226 (ligando†) o linfocitos T solos. Luego de 24 horas, el medio acondicionado libre de células se recolecta y el IFN-g se mide con ELISA. Los linfocitos T NKG2D quiméricos producen IFN-g luego del cultivo con células tumorales que expresan ligando (Zhang, T. et ál., (2006) Cáncer Res., 66(11) 5927-5933; Barber, A. et ál., (2007) Cáncer Res., 67(10);5003-5008). También es posible comparar la citotoxicidad celular con las células tumorales ligando†, tal como se describió previamente en la téenica (Zhang, T. et ál., (2006) Cáncer Res., 66(11) 5927-5933). La especificidad se muestra utilizando células ligando-tumorales o mAbs que bloquean receptores específicos.

Ejemplo 2: Producción de linfocitos T con deficiencia de receptor de los linfocitos T (TCR) que expresan chNKG2D En este ejemplo se realiza la expresión simultánea de un receptor chNKG2D y la inhibición de la expresión de TCR endógena. En este ejemplo, se utiliza un receptor chNKG2D murino, compuesto de NKG2D en combinación con un CD3-zeta unido por el extremo N. El receptor chNKG2D se genera y se expresa en linfocitos T murinos. NKG2D es una proteína de tipo II, en la que el extremo N se ubica intracelularmente (Raulet (2003) Nat. Rev. Imunol. 3:781-790), mientras que la cadena CD3-zeta es una proteína de tipo I con el extremo C en el citoplasma (Weissman, et ál. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 85:9709-9713). Para generar una proteína de fusión NKG2D-CD3-zeta quimérica, se coloca un codón de inicio ATG delante de la secuencia codificante para la región citoplásmica de la cadena CD3-zeta (sin un codón TAA de detención) seguido por un gen NKG2D de tipo salvaje. Luego de la expresión, la orientación de la parte CD3-zeta se revierte dentro de las células. Los dominios extracelular y transmembrana derivan de NKG2D. También se construye un segundo gen quimérico que codifica el gen DaplO seguido por un fragmento que codifica el dominio citoplásmico CD3-zeta. La Figura 1 presenta las estructuras de los receptores quiméricos y de tipo salvaje.

Un ARNhp está unido de forma operativa en un vector lentiviral con el receptor chNKG2D. Para alcanzar la expresión de ambos genes, el ARNhp es impulsado por un promotor U6 y el receptor chNKG2D por un promotor PGK. Las PBMC humanas primarias están aisladas de los donantes saludables y se activan con anti-CD3 solubles de dosis baja y 25 U/ml de rhuIL-2 durante 48 horas. Aunque no se requiere activar los linfocitos T para la transducción lentiviral, la transducción funcionará más eficazmente y permitirá que las células continúen expandiéndose en IL-2. Las células activadas se lavan y transducen utilizando una infección por centrifugación de 1 hora a 30 °C, seguido de un período de descanso durante 7 horas. Las células se lavan y se cultivan en 25 U/ml de IL-2 durante 3 a 7 días para permitir la expansión de las células efectoras en una manera similar a la que hacemos para utilizar las células in vivo. La expresión de TCRap, CD3 y NKG2D se evalúa mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). El número de linfocitos T CD4+ y CD8+ se determina mediante citometría de flujo. El número general de células y el porcentaje de linfocitos T de expresión y con deficiencia de complejo TCR se determinan mediante citometría de flujo. Estas se comparan con las PBMC que se transducen solo con los genes chNKG2D o el ARNhp (como controles). Las células transducidas solo por vector también se incluyen como controles.

Se anticipa que aquellas células con muy poca expresión de TCR o sin ella en la superficie celular expresarán cantidades mayores de NKG2D de superficie celular por la coexpresión del receptor chNKG2D.

Como alternativa, la transducción puede ocurrir con dos virus al mismo tiempo, uno con la construcción ARNhp y una con el receptor chNKG2D. Se utiliza una cantidad mayor del virus chNKG2D para asegurar la expresión alta de chNKG2D en aquellos linfocitos T que no tienen expresión de TCR. Los linfocitos T de TCR+ que puede que permanezcan se eliminan para obtener linfocitos T de TCR- y chNKG2D+.

Luego de la expansión y transducción viral, las células TCR+ y TCR- se separan por mAbs con cuentas magnéticas sobre columnas Miltenyi. La verificación de la expresión chNKG2D se realiza mediante QRT-PCR utilizando cebadores específicos para el receptor chNKG2D.

Para determinar si los linfocitos T han perdido la función TCR y han retenido la función de chNKG2D, los linfocitos T transducidos o de control se cultivan con PBMC alogénicas tratadas con mitocina C o PBMC singénicas. Los linfocitos T están precargados con CFSE, que es una tinta permeable a la célula que divide de forma igualitaria entre las células hijas luego de la división. La extensión de la división celular puede determinarse fácilmente mediante citometría de flujo .

Para determinar si la construcción de ARNhp puede inhibir la función del TCR y puede permitir la función del receptor de chNKG2D, se cultivan los linfocitos T transducidos con PBMC alogénicas tratadas con mitocina C, PBMC singénicas, o células tumorales. P815-MICA (un tumor murino que expresa MICA humano, un ligando para NKG2D), P815, A2008 (una célula tumoral de ovario humano, NKG2D ligando!), y U266 (una línea celular de mieloma humano, NKG2D ligando!). Luego de 48 horas, los sobrenadantes libres de células se recolectan y la cantidad de IL-2 y IFN-g producidos se cuantificarán mediante ELISA. Se utilizaron los linfocitos T solos como control negativo.

Ejemplo 3: Administración in vivo de linfocitos T con deficiencia de receptor de los linfocitos T (TCR) que expresan cbNKG2D En este ejemplo, se administran los linfocitos T con deficiencia de TCR que expresan un receptor chNKG2D murino, tal como se produjo en el Ejemplo 2, a los ratones para evaluar el potencial terapéutico in vivo de dichos linfocitos T en determinados cánceres. Los linfocitos T que tienen NKG2D quimérico (106) son inyectados conjuntamente con las células tumorales RMA/Rae-Ib (105) de forma subcutánea a los ratones C57BL/6. Los ratones tratados con linfocitos T con deficiencia de TCR que tienen NKG2D quimérica y que no tienen tumores o tienen un crecimiento inhibido de tumor de los tumores RMA/Rae-Ib luego de 30 dias refleja la actividad anticancerígena terapéutica en estos ratones.

En un modelo secundario y más estricto, los linfocitos T transducidos (107) se transfieren de forma adoptiva por vía intravenosa en ratones B6 un día antes de la inoculación del tumor RMA/Rae-Ib por vía subcutánea en el flanco derecho. La supresión del crecimiento de los tumores RMA/Rae-Ib (s.c) en comparación con los linfocitos T modificados por vectores de control reflejan la actividad anticancerígena terapéutica en estos ratones. En cuanto a la toxicidad del tratamiento con linfocitos T modificados con NKG2D quimérico, se anticipa que los animales no mostrarán ninguna evidencia evidente de daño inflamatorio (es decir, pelo erizado, joroba o diarrea, etc.) cuando se traten con linfocitos T que tienen NKG2D quimérico, lo cual refleja una ausencia de toxicidad evidente.

En un modelo más estricto de tumores de ovarios establecidos (ID8), los linfocitos T chNKG2D transducidos (5 x 106 linfocitos T, i.p.) se inyectan en ratones con tumores durante 5 semanas. A los ratones se les inyecta además linfocitos T en las semanas 7 y 9 luego de la estimulación del tumor. En estas condiciones, los ratones tratados con linfocitos T chNKG2D permanecerán sin tumores durante más de 250 días, mientras que los ratones tratados con un itinerario similar con linfocitos T de control morirán a causa del crecimiento tumoral en 100 días. En cuanto a la toxicidad del tratamiento con linfocitos T modificados con NKG2D quimérico, se anticipa que los animales no mostrarán ninguna evidencia evidente de daño inflamatorio (es decir, pelo erizado, joroba o diarrea, etc.) cuando se traten con linfocitos T que tienen NKG2D quimérico, lo cual refleja una ausencia de toxicidad evidente.

En un modelo de ieloma múltiple, los ratones que tienen células tumorales 5T33MM son tratados en el día 12 luego de la infusión de células tumorales con linfocitos T chNKG2D (5 x 106 células, i.v.). Este tratamiento tendrá como resultado un tiempo de vida aumentado de todos los ratones y alrededor de la mitad de estos ratones serán sobrevivientes sin tumores a largo plazo. Los ratones tratados con linfocitos T de control sucumbirán a sus tumores en 30 días. No se observarán pruebas evidentes de toxicidad debido al tratamiento con los linfocitos T chNKG2D.

Dado que el sistema inmunitario puede seleccionar variantes de tumor, las inmunoterapias eficaces para el cáncer probablemente sean aquellas que inducen la inmunidad contra múltiples antígenos tumorales. En un tercer experimento, se están realizando pruebas para saber si el tratamiento con linfocitos T que tienen NKG2D quimérico inducirán inmunidad en el hospedador contra células tumorales de tipo salvaje. Los ratones que están siendo tratados con linfocitos T que tienen NKG2D quimérico y células tumorales 5T33MM, y que están libres de tumores luego de 80 dias, son estimulados con células tumorales 5T33MM. Los ratones sobrevivientes sin tumores resisten una estimulación posterior de células 5T33MM (3 x 105), en comparación con los ratones de control sin tratamiento previo que sucumben al tumor en un promedio de 27 dias. Sin embargo, los ratones sobrevivientes sin tumores no resisten una estimulación posterior de células tumorales RMA-Rael (3 x 105), y sucumben al tumor en un periodo de tiempo similar al de los ratones sin tratamiento previo (20 dias). Esto indica que la transferencia adoptiva de los linfocitos T que tienen NKG2D quimérico permitirá a los hospedadores que generen una memoria de linfocitos T específicos al tumor.

En esta invención, se proporcionan cuatro clases de moléculas inhibidoras de TCR (TIM) que efectúan la función de linfocitos T. La Tabla 2 es un resumen del efecto de 19 TIM diferentes sobre la función de linfocitos T efectores ya sea en respuesta a estimulación (CD3) anti-CD3 (0KT3 (200 ng/ml) soluble, o cultivo con PBMC alogénica (Alio). Las denominaciones a la izquierda se refieren a la clase de TIM. Los valores numéricos indican la reducción en porcentaje en la inhibición de TCR con respecto a los linfocitos T transducidos por el vector pFB de control. NI: sin inhibición. ND: no se realizó.

Tabla 2. Resumen del efecto de las moléculas inhibidoras de TCR (TIM) en la función de los linfocitos T.

Ejemplo 4: Producción de linfocitos T con deficiencia de receptores de linfocitos T (TCR) utilizando ácidos nucleicos que se dirigen a ARNhp que codifican CD3-epsilon o CD3-zeta En este ejemplo, la expresión de TCR endógena se inhibió utilizando secuencias de ARNhp que se dirigen a los ácidos nucleicos que codifican CD3-épsilon o CD3-zeta.

Se compraron las secuencias ARNhp clonadas en el vector retroviral pSM2c (Open Biosystems), con la expresión controlada por el promotor U6. Estas construcciones de ARNhp se utilizaron para bloquear la expresión de las proteínas CD3-épsilon y/o CD3-zeta, para que el linfocito T ya no produzca uno de los componentes clave del complejo TCR. Como consecuencia, el complejo TCR se desestabilizó y se impidió la expresión de la superficie celular de un TCR funcional, lo que tuvo como resultado una función de linfocitos T reducida a través del complejo TCR. La secuencia de ARNhp en función de CD3-épsilon o CD3-zeta se describe en la Tabla 1, que corresponde a las SEQ ID NOS:9-26 y 68-71, respectivamente.

Para determinar si los ARNhp alteraron la función de TCR, la producción de IFN-gamma se midió en respuesta a (i) la estimulación anti-CD3 soluble (CD3), o (ii) en respuesta al cultivo con PBMC alogénicas (Alio). En particular, los linfocitos T tratados con TIM1 o TIM3 tuvieron una reducción de 22,6 % o 14,9 % en inhibición de TCR, respectivamente, siguiendo la estimulación con 200 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3. Ver la Tabla 2 arriba.

Ejemplo 4: Producción de linfocitos T con deficiencia de receptores de linfocitos T (TCR) utilizando un inhibidor dominante negativo de CD3-zeta En este ejemplo, la sobreexpresión de una proteina inhibidora dominante negativa, es decir, una TIM, interrumpió la expresión y función de TCR. La expresión de TCR endógena se inhibió utilizando una proteina inhibidora negativa dominante que comprende CD3-zeta alterada para incluir una señal inhibidora de KIR2DL1, y los linfocitos T resultantes no se activaron en respuesta a la estimulación de TCR.

Las construcciones de minigenes que incorporaron todo o parte de un polinucleótido modificado que codifica CD3-zeta se generaron mediante PCR utilizando modelos de ADNc CD3-zeta y KIR2DL1, que corresponden a la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO:66, respectivamente, compradas de Open Biosystems (Huntsville, AL). Todas las PCR se realizaron utilizando la polimerasa de ADN Phusion High-Fidelity (New England Biolabs, Ipswich, MA), y los cebadores se sintetizaron a través de Teenologías Integradas de ADN (Coralville, IA). Cada construcción se clonó en el vector retroviral pFB-neo (Stratagene) utilizando protocolos establecidos, con la expresión controlada por el 5' LTR. Las construcciones resultantes se examinaron y se comprobó la exactitud mediante- secuenciamiento y se analizaron mediante el dinamo de ADN (Blue Tractor Software Ltd). Las secuencias de ADN y sus secuencias de proteína previstas corresponden a las SEQ ID NOS: 68-101.

Las TIM se expresaron en linfocitos T primarios utilizando un sistema de expresión retroviral. Se utilizaron dos lineas celulares de empaquetamiento diferentes para producir virus con titulaciones bajas o altas. Se produjo un virus de baja titulación con células GP2-293T que se transfectaron temporalmente con el plásmido de empaquetamiento y un plásmido de envoltura. Luego de 72 horas, el sobrenadante viral se cultivó y se midieron las titulaciones mediante la infección de las células N1H-3T3 luego de la selección con G418. Las titulaciones de los virus producidos por este sistema fueron entre 5xl05 y lxlO7 CFU/ml. Para producir titulación de virus alta, los virus se elaboraron mediante el sistema GP2-293T para transducir células empaquetadoras PT67. Las células PT67 infectadas con partículas virales se seleccionaron en tratamiento con G418 durante 5 días. Las células PT67 que expresan TIM se expandieron y se utilizaron para la producción de virus. 72 horas luego de que las células alcanzaron la confluencia, se cultivó el sobrenadante viral y se midieron las titulaciones en N1H-3T3. Las titulaciones de los virus obtenidos por este sistema fueron en el rango de 7xl07 a 2xl08 CFU/ml.

Para transducir los linfocitos T humanos, se aislaron las PBMC humanas primarias de los donantes saludables y se activaron con 40ng/ml de anti-CD3 soluble y 50 U/ml de rhuIL-2 durante 72 horas. Los linfocitos T activados se lavaron y se transdujeron con retrbvirus producido por virus de baja o alta titulación utilizando infección por centrifugación de 1 hora a 32 °C, seguido por un período de descanso de 6 horas. Las células se lavaron y se cultivaron en 50 U/ml de IL-2 durante 48 horas, y luego se sometieron a selección durante 3 días. Luego de la selección, las células vivas se aislaron utilizando Lymphoprep (Mediatech), y las células efectoras se expandieron en 50 U/ml de IL-2 durante 48 horas cuando las células se utilizaron para ensayos funcionales. La expresión celular endógena de CD3-épsilon y CD3-zeta en células transducidas con ARNhp, y la disminución en expresión de los genes mediante ARNhp, se analizaron por PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR). Brevemente, se extrajo el ARN de los linfocitos T, y 0,5-1 ug del ARN total se sometió a transcripción inversa utilizando el kit de transcripción inversa de QuantiTect (Qiagen). El ADNc resultante se utilizó con SYBR green (Applied Biosystems) para análisis de qRT-PCR, y los datos se normalizaron a niveles de la degliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los cambios en la expresión de la superficie celular se analizaron utilizando anticuerpos específicos para CD3, CD8, CD4 y CD5, y no se observó ninguna diferencia en la expresión de estas moléculas de superficie celular en los linfocitos T que expresan TIM en comparación con el control del vector.

Para determinar si la reducción en la expresión de TCR con cada construcción de minigén o ARNhp (que eliminó o alteró al TCR en la superficie celular) fue suficiente para prevenir la activación del linfocito T respecto a la estimulación de TCR, los linfocitos T se analizaron para detectar: (1) la supervivencia celular in vitro; y (2) la producción de la citocina en respuesta a las PBMC alogénicas y/o las mAb anti-CD3.

Para analizar la supervivencia celular, los linfocitos T transducidos se propagaron en un medio RPMI completo con rhuIL-2 (50 U/ml). Las células se colocaron en placas a densidades similares en el comienzo del cultivo y una muestra se quitó para el conteo celular y para determinar la viabilidad diariamente por 7 o dias o más. No se observó diferencia en el crecimiento de los linfocitos T que expresan TIM en comparación con los linfocitos T que expresan el control de vector correspondiente. Para determinar si los linfocitos T expresaron TCR suficiente para inducir una respuesta en contra de las células alogénicas, se cultivaron los linfocitos T de control o transducidos con PBMC autóloga o alogénica a una relación de 4:1. Luego de 24 horas, los sobrenadantes sin células se recolectaron y la cantidad de IFN-g producido se cuantificó con ELISA. Solo los linfocitos T, incluyendo las PBMC y células transducidas, fueron utilizadas como controles negativos. Entre las moléculas inhibidoras de TCR analizadas, se identificaron dos minigenes (TIM7 y TIM8) que eran capaces de reducir considerablemente la función de TCR en los linfocitos T. Ver, Figura 2. El ensayo alogénico se realizó utilizando 19 donantes diferentes que expresaban TIM7 o TIM8, donde cada donante se cultivó con 3 PBMC alogénicas diferentes. Se observó una reducción promedio en la producción de IFN-g de 49 % en los linfocitos T que expresan TIM7, y se observó una reducción promedio de 60 % en los linfocitos T que expresan TIM8.

Para determinar si cada TIM inhibía la función de los linfocitos T mediante la estimulación directa de los anticuerpos del complejo TCR, los linfocitos T transducidos por TIM se trataron con una variedad de concentraciones diferentes de mAbs anti-CD3 (1,6 a 5000 ng/ml). Luego de 24 horas, se recolectan los sobrenadantes sin células y la cantidad de IFN-g producido se cuantifica con ELISA. Se utilizaron los linfocitos T solos como control negativo. Cuando las células se estimularon con 200 ng/ml de mAb anti-CD3 durante 24 h, se observó una reducción máxima en la producción de IFN-g de 44 % y 58 % en los linfocitos T que expresan TIM7 y TIM8, respectivamente. Colectivamente, esto indica que una reducción en la expresión de TCR, por ejemplo, utilizar TIM para quitar o distorsionar el TCR, es suficiente para alterar la función de los linfocitos T.

Ejemplo 5: Producción de linfocitos T con deficiencia de receptor de los linfocitos T (TCR) que expresan chNKG2D En este ejemplo, se realizó la sobreexpresión simultánea de una proteina inhibidora de TCR dominante negativa, es decir, una TIM, y la expresión de un receptor quimérico dirigido a tumores. En particular, la expresión de TCR endógena se inhibió utilizando una TIM y se expresó el receptor quimérico chNKG2D, es decir, NKG2D unido al dominio citoplásmico de CD3-zeta. NKG2D se asocia con DaplO para proporcionar las señales de activación primarias y secundarias a los linfocitos T. Ver, Zhang, T. et ál.2006. Cáncer Res.66(11): 5927-5933. Los ligandos para NKG2D son expresados por la mayoría de las células tumorales humanas, pero no en la mayoría de las células normales.

Para analizar la expresión de ambas de una TIM y un receptor quimérico que se dirige a tumores, las PBMC humanas primarias se aislaron de los donantes saludables y se activaron con 40 ng/ml de anti-CD3 soluble y 50 U/ml de rhuIL-2 durante 72 horas. Los linfocitos T activados se lavaron y se transdujeron con retrovirus de alta titulación utilizando 1 hora de espinoculación a 32 °C, seguido por un período de descanso de 7 horas. Se utilizaron cantidades iguales de TIM y del virus chNKG2D para la transducción. Las células se lavaron y se cultivaron en -50 U/ml de IL-2 durante 48 horas, y luego se sometieron a selección G418 durante 3 dias. Luego de la selección, las células vivas se aislaron utilizando Lymphoprep (Mediatech), y las células efectoras se expandieron en 50 U/ml de IL-2 durante 48 horas cuando las células se utilizaron para ensayos funcionales. Los cambios en la expresión de la superficie celular se analizaron utilizando anticuerpos específicos para CD3, CD4, NKG2D y CD5. No se observó una diferencia significativa en la expresión de estas moléculas de superficie celular en los linfocitos T que expresan TIM en comparación con el control del vector, a excepción de una expresión mayor del receptor NKG2D en las células transducidas con el virus chNKG2D, tal como se esperaba.

Para determinar si las células chNKG2D+ TIM+ tendrían una respuesta reducida a las células alogénicas, pero una respuesta aumentada respecto a las células tumorales, los linfocitos T se cultivaron conjuntamente con PBMC alogénicas, PBMC singénicas o células tumorales: RPMI8226 (una línea celular de mieloma humano, ligandot NKG2D), PANC-1 (una línea celular pancreática humana, NKG2D+), o N1H-3T3 (una línea celular de ratón normal, ligando- NKG2D), como control negativo. Luego de 24 horas, los sobrenadantes sin células se recolectaron y la cantidad de IFN-g producido se cúantificó con ELISA. Los linfocitos T solos y el cultivo con PBMC singénica se utilizaron como control negativo.

En el ensayo alogénico, se observó una reducción del 45 % en la producción de IFN-g en los linfocitos T que expresan TIM7, y se observó una reducción del 44 % en la producción de IFN-g en los linfocitos T que expresan TIM8 que tuvieron coexpresión de chNKG2D en comparación con las células que expresan el control del vector. Cuando se cultivaron con las células tumorales, se observó un aumento considerable en la cantidad de producción de IFN-g en células TIM+ chNKG2D+, en comparación con las células que expresan TIM solamente, cuando las células tumorales expresaron ligandos NKG2D (RPMI8226 y PANC-1), pero no cuando se cultivaron con células tumorales con deficiencia de ligandos (N1H-3T3). Ver la Figura 3 que muestra un experimento representativo utilizando RPMI8226. El mismo experimento también demostró que una producción de IFN-g mayor era dependiente de NKG2D, porque la incubación con un mAb bloqueador para NKG2D tuvo como resultado una producción de IFN-g no aumentada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir linfocitos T con deficiencia de TCR que comprenden introducir en uno o más linfocitos T, una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica una proteina inhibidora dominante negativa que comprende un polipéptido CD3-zeta truncado.

2. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido CD3-zeta truncado no tiene un ITAM.

3. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido CD3-zeta truncado de la SEQ ID NO:77 o 79.

4. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido CD3-zeta truncado comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:76 o 78.

5. El método de la reivindicación 1 donde el linfocito T además se modifica genéticamente para expresar un receptor quimérico dirigido a tumores.

6. Un linfocito T con deficiencia de TCR producido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una composición farmacéutica que comprende un linfocito T con deficiencia de TCR de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método de terapia que comprende introducir en un sujeto que lo necesita un linfocito T o linfocitos T con deficiencia de TCR de acuerdo con la reivindicación 6.

9. El método de la reivindicación 8 donde el sujeto tratado tiene cáncer.

10. Un vector que contiene un ácido nucleico que codifica el polipéptido CD3-zeta truncado de la SEQ ID NO:77 o 79.

11. El vector de la reivindicación 10 que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido CD3-zeta truncado es la SEQ ID NO:76 o 78.

12. Una célula que expresa el polipéptido CD3-zeta truncado de la SEQ ID NO:77 o 79.