MX2014012013A

MX2014012013A - Proteinas de la membrana exterior de histophilus somni y sus metodos.

Info

Publication number: MX2014012013A
Application number: MX2014012013A
Authority: MX
Inventors: Jeffrey P Knittel; Brice Dean Lilly
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2014-11-25
Also published as: US20130266613A1; UY34733A; US9597386B2; CA2866888A1; BR112014024491A2; SG11201406209WA; JP2015519305A; AR090613A1; AU2013243622A1; PH12014502223A1; AR090624A1; WO2013151979A1; EA201401078A1; CN104470539A; CL2014002658A1; CO7160028A2; EP2833912A1; KR20150003269A

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones inmunológicas de proteínas de la membrana exterior (OMP por sus siglas en ingles) de H. somni, así como también a métodos de extracción, un modelo para la exposición respiratoria, métodos de administración y ensayos y kits de diagnóstico.

Description

PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA EXTERIOR DE HISTOPHILÜS SOMNI Y SUS MÉTODOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones inmunológicas de las proteínas de la membrana exterior (OMP, outer membrane protein) de Histophilus somni para su uso contra infecciones respiratorias asociadas con Histophilus somni en el ganado vacuno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Complejo de Enfermedad Respiratoria Bovina (BRDC, por sus siglas en inglés) consiste en múltiples patógenos microbianos y contribuye a pérdidas económicas substanciales en la industria del ganado vacuno. Los costos de tratamiento que incluyen tanto la vacunación preventiva como la medicación después de un brote se estiman en alrededor de $4 billones por año (Griffin, D. 1997. Economic Impact Associated with Respiratory Disease in Beef Cattle. Vet. Clin. North Am. Anim. Pract. 13; pp. 367-377). Al impacto económico se agrega la pérdida asociada en la performance observada en los animales a los que se les diagnosticó BRDC; con pérdidas mensurables en el aumento de peso diario promedio, el peso corporal al sacrificarlos y el grado de calidad de la carne vacuna (Babcock, A.H. 2010. Epidemiology of Bovine Respiratory Disease and Mortality in Commercial Feedlots. Kansas State University (disertación doctoral) . Los informes sobre la pérdida monetaria especifica asociada con la menor performance varían; probablemente debido a las diversas definiciones de casos de BRDC, pero se estiman entre $40 (Fulton, R.W. et al. 2002. Evaluation of Health Status of Calves and the Impact on Feedlot Performances: Assessment of a Retained Ownership Program for Postweaning Calves. Can. J. Vet . Res. 66, 173-180) y casi $300 (Duff y Gaylean 2011. Recent Advances in Management of Highly Stressed, Newly Received Feedlot Cattle. Journal of Animal Science. 85; p 823-840)) por animal . Se ha demostrado además que la pérdida de performance aumenta significativamente con el número de veces que un animal requiere tratamiento para el BRDC (Fulton et al. 2002) .

Histophilus somni (antes Haemophilus somnus) ha sido identificado como un factor clave de la BRDC (Duff y Gaylean 2011) . Este cocobacilo pleomórfico gram-negativo que pertenece a la familia Pasterellaceae (Korczak et al. 2004. Phylogeny of the Family Pasteurellaceae based on rpoB sequences . International Journal of Syste ic and Evolutionary Microbiology. 54; p 1393-1399) forma parte de la microbiota normal de los tractos respiratorio superior y urogenital en el ganado vacuno, el ganado ovino y otros rumiantes (Ward et al. 2006. Haemophilus somnus {Histophilus somni) in Bighorn Sheep. Canadian Journal of Veterinary Research. 70; p. 34-42). Está relacionado estrechamente con otros patógenos bovinos incluyendo Pasteruella multocida y Mannheimia haemolytica (ambos también asociados con BRDC) asi como los patógenos humanos Haemophilus ducreyi y Haemophilus influenazae (Challacombe et al. 2007. Complete Genome Sequence of Haemophilus somnus {Histophilus somni) strain 129Pt and Comparison to Haemophilus durcreyi 35000HP and Haemophilus influenzae Rd. Journal of Bacteriology 189 (5) ; pp. 1890-1898).

Las estimaciones calculan la tasa de aislamiento de H. somni del tracto respiratorio superior de terneros sanos tan alta como 50% sin manifestaciones clínicas de la enfermedad; sin embargo, los animales a los que se les diagnosticó BRDC tienen una tasa de aislamiento de las bacterias aún mayor (Griffin, D. 2010. Bovine Pasteurellosis and Other Bacterial Infections of the Respiratory Tract . Veterinary Clinics of North American Food Animal Practice. 26(1); pp . 57-71). Bajo condiciones de estrés o estados de inmunosupresión, el H. somni puede colonizar el tracto respiratorio inferior, el endocardio o el sistema nervioso central y ha sido identificado como un agente etiológico en diversas enfermedades, tales como neumonía, endocarditis, artritis, aborto, septicemia y meningoencefalitis tromboembólica (TEME por sus siglas en inlges) ( ard et al . 2006).

En el momento del sacrificio, menos de 15% de los animales que reciben tratamiento adecuado para el BRDC (vacunaciones preventivas y antibióticos apropiados durante un brote) presentan signos de lesiones pulmonares y estas lesiones involucran menos del 5% del pulmón total (Griffin, D. 2010). Por el contrario, 50% de los animales que no reciben un cuidado apropiado presentan lesiones pulmonares en el momento del sacrificio y estas lesiones pueden involucrar 15% o más del pulmón total (Griffin, D. 2010) . En un estudio de campo de más de 10.000 animales, 459 terneros (4.6%) murieron a causa de la enfermedad de una forma u otra. De las mortalidades en el estudio, 279 (60.8%) demostraron estar relacionadas con afecciones respiratorias y de aquellas asociadas con infecciones respiratorias, 226 (81.0%) estaban asociadas con neumonía, pleuresía o abscesos relacionados con H. somni (Ribble et al. 1988. Efficacy of Immunization of Feedlot Cattle with a Commercial Haemophilus somnus bacterin. Canadian Journal of Veterinary Research. 52; pp . 191-198). Si bien el tratamiento con antibióticos puede ser exitoso en respuesta a una infección por H. somni, una creciente prevalencia de aislados de campo resistentes a los antibióticos es preocupante (Duff y Gaylean 2011) . El cuidado preventivo por medio de la vacunación se preferiría ya que es proactivo en lugar de reactivo y es mucho más efectivo con relación a los costos.

Muchas vacunas de H. somni se encuentran disponibles actualmente de varias compañías relacionadas con la salud animal, sin embargo estas vacunas están compuestas predominantemente por bacterinas de bacterias muertas y fueron aprobadas hace treinta años con el objetivo de prevenir la TEME. El uso de estas vacunas de bacterinas ha sido efectivo contra la TEME, sin embargo ha demostrado tener efectos neutros o aún negativos sobre la enfermedad respiratoria en el ganado vacuno criado en feedlot. Los efectos colaterales negativos incluyen shock anafiláctico inducido por IgE e interacciones cuando los terneros infectados con el Virus Respiratorio Sincicial Bovino (BRSV por sus siglas en ingles) son vacunados (Griffin, D. 2010). La disminución en la prevalencia de la TEME y la aparición de neumonía relacionada con H. somni en lo EE.UU. y la miocarditis en Canadá gue comenzó a fines de los años 80, han llevado a reguerir la investigación ulterior de antígenos eficaces para la producción de vacunas (O' Toóle et al. 2009. Diagnostic Exercise: Myocarditis due to Histophilus somni in Feedlot and Backgrounded Cattle. Veterinary Pathology. 46; pl015-1017). La neumonía relacionada con H. somni es una condición económicamente significativa para las industrias de la carne vacuna y de los lácteos. Hay poca evidencia de la eficacia de campo en las vacunas actualmente disponibles, de modo que la necesidad de investigación de productos de vacuna de la generación siguiente está garantizada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones inmunogénicas, vacunas y métodos relacionados que solucionan las deficiencias en el arte. Las composiciones y los métodos proveen proteínas de la membrana exterior (OMP por su siglas en ingles) de Histophilus somni para el tratamiento de las condiciones respiratorias en rumiantes, incluyendo, pero no limitado a, ganado vacuno, ganado ovino y bisontes.

La presente invención incluye además composiciones inmunogénicas y vacunas de la invención que comprenden OMP de Histophilus somni. Las composiciones inmunogénicas de la invención que comprenden por lo menos uno o más polipéptidos de Histophilus somni de OMP como se definen en la presente pueden comprender un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como un portador farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, un adyuvante o una combinación de estos.

Cualquiera de los polipéptidos de Histophilus somni de OMP provistos con la presente o cualesquiera composiciones inmunogénicas que comprenden uno o más de estos polipéptidos de Histophilus somni de OMP provistos con la presente pueden ser usados como un medicamento, preferentemente como una vacuna o una composición inmunogénica, con mayor preferencia, para la profilaxis o el tratamiento de un sujeto contra una infección por Histophilus somni.

Dos aislados representativos de polipéptidos de Histophilus somni de OMP incluyen Lg2-OK08 y LgDl-TN08, depositados en la American Type Culture Collection (ATCC por sus siglas en ingles) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 el 29 de marzo de 2012, bajo los términos del Tratado de Budapest y denominados PTA-12755 y PTA-12756, respectivamente.

Los expertos en el arte comprenderán que las composiciones usadas en la presente pueden incorporar soluciones inyectables, estériles, fisiológicamente aceptables, conocidas. Para preparar una solución lista para usar para la inyección o infusión parenteral, se encuentran fácilmente disponibles las soluciones isotónicas acuosas, por ejemplo, soluciones salinas o de proteínas plasmáticas. Además, las composiciones inmunogénicas y de vacunas de la presente invención pueden incluir portadores, diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes o adyuvantes, veterinariamente aceptables.

Los métodos de la invención incluyen, pero no están limitados a, un método para provocar una respuesta inmunológica contra una infección por Histophilus somni en un sujeto que comprende el paso de administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende uno o más polipéptidos de Histophilus somni de OMP como se definieron en la presente. Preferentemente, la respuesta inmunológica es provocada contra más de un serotipo o aislado de Histophilus somni. Las composiciones de la invención se pueden usar para tratar o alternativamente para prevenir una infección por Histophilus somni. Preferentemente, tal respuesta inmunológica reduce la incidencia de, o la severidad de, uno o más signos clínicos asociados con la infección con uno o más serotipos de Histophilus somni.

En la presente, los sujetos adecuados y los sujetos que necesitan que se les administren las composiciones de la invención, incluyen animales y humanos que necesitan o bien un tratamiento profiláctico o un tratamiento de una infección, una enfermedad o una condición viral, microbiana, parasitaria, protozoaria, bacteriana o fúngica asociada. Los animales preferidos incluyen el ganado bovino y el ganado ovino. Más preferentemente, se estimula una respuesta inmunológica en el ganado bovino.

La invención también provee un método para reducir la incidencia de, o la severidad de, uno o más signos clínicos asociados con la infección por Histophilus somni, que comprende el paso de administrar una composición inmunogénica de la invención que comprende uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP como se proveen con la presente y preferentemente una molécula portadora, de tal modo que la incidencia o la severidad de un signo clínico de la infección por Histophilus somni es reducida en por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 20%, se prefiere aún más por lo menos 30%, se prefiere más aún por lo menos 50%, con mayor preferencia, por lo menos 70%, con mayor preferencia aún, por lo menos 100% con relación a un sujeto que no ha recibido la composición inmunogénica como se provee con ésta. Tales signos clínicos incluyen respiración trabajosa o rápida, tos, anorexia, depresión o letargía, descarga nasal u ocular, y mortalidad. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método para la profilaxis de una infección por Histophilus somni, que comprende el paso de administrar una composición inmunogénica de la invención que comprende uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP como se proveen con la presente .

La invención también provee un método para la preparación de cualquiera de las composiciones inmunogénicas provistas con la presente, ese método comprende mezclar uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP como se proveen con la presente, con una molécula portadora, preferentemente de tal modo que el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP y la molécula portadora están acoplados o conjugados en forma covalente entre si. Tales conjugados pueden ser multivalentes o univalentes. Las composiciones o vacunas multivalentes incluyen una inmuno-conjugación de múltiples péptidos de Histophilus somni de OMP con una molécula portadora. En un aspecto adicional, la invención provee un método para producir uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP, ese método comprende transformar una célula huésped, preferentemente una célula procariótica tal como E. coli con una molécula de ácido nucleico que codifica para cualquiera de los péptidos de Histophilus somni como se proveen con esto. Alternativamente, la célula huésped puede ser una célula eucariótica, tal como una célula animal, una célula protista, una célula de planta o una célula fúngica. Preferentemente La célula eucariótica es una célula de mamífero, tal como CHO, BHK o COS, o una célula fúngica, tal como Saccharomyces cerevisiae, o una célula de insecto, tal como Sf9.

Otro aspecto de la invención provee un método para producir uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP que inducen una respuesta inmunológica contra Histophilus somni. Esto comprende cultivar un vector de expresión transformado que codifica para, y expresa, uno o más péptidos de Histophilus somni divulgados en la presente. Las proteínas expresadas son o bien retenidas por el organismo de expresión o segregadas en el medio de cultivo. La expresión se realiza bajo condiciones suficientes para producir un péptido de Histophilus somni de OMP capaz de inducir una respuesta inmunológica a Histophilus somni.

Los métodos para preparar composiciones de la invención pueden comprender además mezclar el conjugado de uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP y una molécula portadora con un vehículo fisiológicamente aceptable tal como un portador, adyuvante o combinación de estos farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. Los expertos en el arte reconocerán que la elección del vehículo, adyuvante o su combinación serán determinadas por la vía de suministro, la preferencia personal, y la especie animal, entre otros.

En otro aspecto, la invención provee un método de diagnóstico de una infección de Histophilus somni en un sujeto. Ese método comprende proveer uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP; poner en contacto el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP con una muestra obtenida del sujeto; e identificar el sujeto como teniendo una infección por Histophilus somni si se detecta en la muestra un anticuerpo capaz de unir el uno o más Histophilus somni.

En otro aspecto, la invención provee un método para evaluar a un sujeto que ha sido expuesto previamente a una infección por Histophilus somni y es capaz de expresar una respuesta inmunológica a Histophilus somni. Este método comprende proveer uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP; poner en contacto el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP con una muestra obtenida del sujeto; e identificar al sujeto como teniendo una infección por Histophilus somni si se detecta en la muestra un anticuerpo capaz de unir el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP.

La invención también provee kits que comprenden una composición inmunogénica que comprende uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP, preferentemente junto con una molécula portadora; un contenedor para envasar la composición inmunogénica; un conjunto de instrucciones impresas; y un dispensador que puede administrar la composición inmunogénica a un animal. Opcionalmente, el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP y la molécula portadora pueden ser envasados como un conjugado o como compuestos separados. Cuando se suministran en forma separada, también se suministra un medio para conjugar el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP y la molécula portadora, así como también las instrucciones impresas apropiadas.

La invención también provee kits para vacunar un animal que comprende un conjunto de instrucciones impresas; un dispensador que puede administrar la composición inmunogénica provista con éste que comprende uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP a un animal; y en donde por lo menos uno de los péptidos de Histophilus somni de OMP inmuniza efectivamente al animal contra por lo menos una enfermedad asociada con una infección por Histophilus somni. Preferentemente, el uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP es seleccionado entre aquellos provistos con la presente. Los kits de la invención pueden comprender además un portador, adyuvante o sus combinaciones, veterinariamente aceptables.

El dispensador en un kit de la invención es capaz de dispensar su contenido como gotas; y la composición inmunogénica comprende los péptidos de Histophilus somni de OMP como se proveen con la presente incluidos en el kit es capaz de reducir la severidad de por lo menos un signo clínico de una infección por Histophilus somni cuando se administra intranasalmente, oralmente, intradérmicamente o intramuscularmente a un animal. Preferentemente, la severidad de un signo clínico es reducida por al menos 10%, preferentemente por al menos 20%, con mayor preferencia aún, por al menos 30%, con mayor preferencia, todavía por al menos 50%, con mayor preferencia aún, por al menos 70%, con mayor preferencia, todavía por al menos 100% en comparación con un animal infectado, no tratado.

También se divulgan métodos para el tratamiento o la profilaxis de infecciones relacionadas con Histophilus somni. El método comprende la administración de una cantidad efectiva de la composición inmunogénica de la presente invención a un sujeto, en donde dicho tratamiento o profilaxis es seleccionado entre el grupo que consiste en reducir los signos de la infección por Histophilus somni, reducir la severidad de, o la incidencia de, los signos clínicos de la infección por Histophilus somni, reducir la mortalidad de los sujetos debido a la infección por Histophilus somni, y combinaciones de estos.

Las composiciones de la invención comprenden además un portador, adyuvante, o su combinación, veterinariamente aceptable. Tales composiciones se pueden usar como una vacuna y comprenden una vacuna atenuada, una vacuna inactivada, o sus combinaciones.

Los expertos en el arte comprenderán que las composiciones usadas en la presente pueden incorporar soluciones inyectables, estériles, fisiológicamente aceptables, conocidas. Para preparar una solución lista para usar para inyección o infusión parenteral, se encuentran fácilmente disponibles soluciones isotónicas acuosas, por ejemplo, soluciones salinas o de proteínas plasmáticas. Además, las composiciones inmunogénicas y de vacunas de la presente invención pueden incluir portadores, diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes, o adyuvantes, farmacéuticamente o veterinariamente aceptables .

Los métodos de la invención también pueden comprender mezclar una composición de la invención con un portador, adyuvante, o una combinación de estos, veterinariamente aceptable. Los expertos en el arte reconocerán que la elección del portador, adyuvante, o combinación será determinada por la vía de suministro, la preferencia personal, y la especie animal, entre otros.

La invención también provee un método para reducir la severidad de una infección por Histophilus somni en un animal, que comprende administrar al animal una composición que comprende una OMP de Histophilus somni.

Los métodos para el tratamiento o la profilaxis de infecciones asociadas con Histophilus somni también se divulgan. El método comprende administrar una cantidad efectiva de la composición inmunogénica de la presente invención a un animal, en donde dicho tratamiento o dicha profilaxis es seleccionado entre el grupo que consiste en reducir los signos de la infección por Histophilus somni, reduciendo la severidad de, o la incidencia de, los signos clínicos de la infección por Histophilus somni, reduciendo la mortalidad de los animales debido a la infección por Histophilus somni, y combinaciones de estos.

Las vías de administración preferidas incluyen intranasal, oral, intradérmica e intramuscular. Se prefiere la administración con el agua para beber, con mayor preferencia, en una sola dosis. El experto en el arte reconocerá que las composiciones de la invención también pueden ser administradas en dos o más dosis, así como también por otras vías de administración. Por ejemplo, tales otras vías incluyen las vías subcutánea, intracutánea, intravenosa, intravascular, intraarterial , intraperitoneal , intratecal, intratraqueal , intracutánea, intracardíaca, intralobal, intramedular, intrapulmonar o intravaginal . Dependiendo de la duración deseada y la efectividad del tratamiento, las composiciones de acuerdo con la invención pueden ser administradas una vez o varias veces, también en forma intermitente, por ejemplo, en una base diaria durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosificaciones.

La invención también provee kits para vacunar un animal que comprenden un conjunto de instrucciones impresas; un dispensador capaz de administrar una vacuna a un animal; y por lo menos un aislado de una OMP de Histophilus somni que inmuniza efectivamente al animal contra por lo menos una enfermedad asociada con Histophilus somni. Los kits de la invención pueden comprender además un portador, adyuvante, o combinación de estos, veterinariamente aceptable.

El dispensador en un kit de la invención es capaz de dispensar su contenido como gotas; y el aislado incluido en el kit es capaz de reducir la severidad de por lo menos un signo clínico de una infección por Histophilus somni cuando se administra por vía intranasal, oral, intradérmica, o intramuscular a un animal. En algunos kits, el aislado también es capaz de reducir la severidad de por lo menos un signo clínico de una infección por Histophilus somni. Preferentemente, la severidad de un signo clínico es reducida por lo menos 10% en comparación con un animal infectado, no tratado.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes de la siguiente descripción detallada. Debería entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican las formas de realización preferidas de la invención, están dados a modo de ilustración solamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en el arte a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras forman parte de la presente y están incluidos para demostrar adicionalmente algunos aspectos de la presente invención. La invención se comprenderá mejor por referencia a uno o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de las formas de realización especificas presentadas en la presente. La solicitud contiene por lo menos una figura realizada en color. Copias de esta publicación de solicitud de patente con figura (s) en color serán provistas por la Oficina a pedido y con el pago del arancel necesario.

La FIG. 1 es un gráfico que ilustra la temperatura rectal media por grupo de tratamiento. Las temperaturas rectales de linea de base fueron obtenidas por observación un dia antes y luego inmediatamente precediendo la carga, los Días -1 y 0. Las temperaturas rectales se registraron diariamente después de la carga y continuaron hasta la necropsia final realizada el Dia 7. Las barras de error representan la confianza con a=0.1.

La FIG. 2 es un gráfico que ilustra la patología pulmonar total en porcentaje. El porcentaje del compromiso pulmonar se determinó mediante la observación del veterinario que realizó el tratamiento en el sitio y la palpación de cada lóbulo. El porcentaje total se calculó usando el método descripto por Jericho y Langford (1982) .

Las barras de error representan la confianza con a=0.1. Los animales control que no recibieron la carga no presentaron patología. Todos los grupos a los que se les suministró la carga presentaron suficiente patología para considerar que la carga fue un éxito, sin embargo, el aislado Lg2-OK08 presentó la virulencia más alta y más consistente, y significativamente más patología que el aislado 5166 (p=0.08) .

La FIG. 3 es un gráfico que ilustra la temperatura rectal media por grupo de tratamiento. Las temperaturas rectales de línea de base se obtuvieron por observación un día antes, y luego inmediatamente precediendo la carga los Días -41 y 42. Las temperaturas rectales se registraron diariamente después de la carga y continuaron hasta la necropsia final que ocurrió el Día 49. Las barras de error representan la confianza con a=0.1 La FIG. 4 es un gráfico que ilustra la patología pulmonar total en porcentaje. El porcentaje de compromiso pulmonar se determinó mediante la observación del veterinario que realizó el tratamiento en el sitio y la palpación de cada lóbulo. El porcentaje total se calculó usando el método descripto por Jericho y Langford (1982) . Las barras de error representan la confianza con a=0.1. La vacuna de OMP redujo significativamente la patología pulmonar (p=0.001) cuando se comparó con los controles no vacunados .

La FIG. 5 es un gráfico que ilustra la temperatura rectal media por grupo de tratamiento. Las temperaturas rectales de linea de base se obtuvieron por observación un Día antes, y luego inmediatamente precediendo la carga los Días -41 y 42. Las temperaturas rectales se registraron diariamente después de la carga y continuaron hasta la necropsia final que ocurrió el Día 49. Las barras de error representan la confianza con a = 0.1.

La FIG. 6 es un gráfico que ilustra la patología pulmonar total. Se determinó el porcentaje de compromiso pulmonar mediante la observación del veterinario que realizó el tratamiento en el sitio y la palpación de cada lóbulo. El porcentaje total se calculó usando el método descripto por Jericho y Langford (1982) . Las barras de error representan la confianza con a = 0.1. Las vacunas extraídas con sarcosilo produjeron reducciones significativas en la patología cuando se comparó con los controles no vacunados cuando se preparó a partir del aislado Lg2-OK08 (p=0.03) y LgDl-TN08 (p=0.05). La extracción con SDS del aislado LgDl-TN08 produjo una reducción de la patología pulmonar, pero esto no era estadísticamente significativo (p=0.11). La extracción con Tritón X de 156A2 no mostró diferencia en la patología cuando se comparó con el grupo control.

La FIG. 7 es un gráfico que ilustra la temperatura rectal media por grupo de tratamiento. Las temperaturas rectales de linea de base se obtuvieron por observación un Día antes, y luego inmediatamente precediendo la carga los Días -41 y 42. Las temperaturas rectales se registraron diariamente después de la carga y continuaron hasta la necropsia final que ocurrió el Día 49. Las barras de error indican un intervalo de confianza con a = 0.1 que representa la disminución significativa de la temperatura rectal media de la Vacuna de Extracto de SDS cuando se comparó con el grupo control de carga comenzando el Día 44 y continuando a través del resto del periodo de carga .

La FIG. 8 es un gráfico que ilustra la patología pulmonar total en porcentaje. El porcentaje de compromiso pulmonar se determinó mediante la observación del veterinario que realizó el tratamiento en el sitio y la palpación de cada lóbulo. El porcentaje total se calculó usando el método descripto por Jericho y Langford (1982) . Las barras de error representan los intervalos de confianza con a=0.1 El prototipo de vacuna insoluble en sarcosilo era el único tratamiento para no reducir en forma significativa la patología pulmonar cuando se comparó con el grupo control no vacunado (p = 0.11) . Las vacunas que contenían o bien el material soluble en sarcosilo o que consistían en material extraído con SDS proporcionaron una reducción significativa de la patología observada.

La FIG. 9 es un gráfico que ilustra los resultados de ELISA para IgG de H. somni durante la Fase de Vacunación. La relación S: N se calculó dividiendo la A450 media de muestras por duplicado por la A450 media del control negativo en suero en cada placa permitiendo la comparación entre los ensayos. Los datos representan muestras en duplicado en tres ensayos, completados en Días separados (6 réplicas para cada muestra). Las barras de error indican la confianza con o¡=0.1.

La FIG. 10 es un gráfico que ilustra los resultados de ELISA para la IgG de H. somni durante la Fase de Vacunación. La relación S: N calculada dividiendo la A450 media de las muestras por duplicado por la A450 media del control negativo en suero en cada placa permitió la comparación entre ensayos. Los datos representan las muestras por duplicado realizadas en tres ensayos, completadas en Días separados (6 réplicas para cada muestra). Las barras de error indican la confianza con a=0.1.

La FIG. 11 es un gráfico que ilustra los resultados de ELISA para IgG de H. somni durante la Fase de Vacunación. La relación S: N calculada dividiendo la A450 media de las muestras por duplicado por la A450 media del control negativo en suero en cada placa permitió la comparación entre ensayos. Para este ensayo se testearon muestras de suero para cada animal individual en cada Dia de estudio, permitiendo la determinación de un intervalo de confianza a a = 0.1 (representado por barras de error). La relación S: N para el Estudio 4 era menor que las observadas en los Estudios 2 y 3. Esto podría atribuirse a la generación de stocks congelados para todos los reactivos y las muestras de control entre los tests para estos estudios.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención provee composiciones inmunológicas de las OMP de H. somni para usar como un tratamiento para infecciones respiratorias en el ganado vacuno, incluyendo, pero no limitado a, dos preparados representativos de OMP de Histophilus somni derivados de los aislados Lg2-OK08 y LgDl-TN08, depositados en la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 el 29 de marzo de 2012, bajo los términos del Tratado de Budapest y denominados PTA-12755 y PTA-12756 respectivamente .

Como una bacteria gram negativa, H. somni presenta una membrana exterior que es la primera área de interacción entre la bacteria y el sistema inmunológico del huésped. La membrana exterior de las bacterias gram- negativas consiste en fosfolipidos , lipopolisacáridos (LPS por sus siglas en ingles) y proteínas. Algunas estimaciones colocan la composición de la superficie exterior de la membrana exterior en 41% de LPS y 59% de proteína, mientras que la superficie interior se espera que contenga 53% de fosfolípidos y 47% de proteína (Nikaido y Nakae 1979. The Outer Membrane of Gram Negative Bacteria. Advances in Microbial Physiology. 20; pp. 163-250) . El componente fosfolípido de la membrana exterior contiene fosfatidiletanolamina , fosfatidilglicerol y cardiolipina, creando una bicapa, como se puede ver en otras membranas celulares (Nikaido y Nakae 1979) .

La membrana exterior de la mayoría de las bacterias gram negativas contiene lipopolisacáridos endotóxicos (LPS por sus siglas en ingles) . La parte externa de los LPS tiene un rol importante en la patogenicidad y la interacción con el sistema inmunológico del huésped mientras que muestra una extrema variabilidad aún dentro de una sola especie, y ha sido denominada previamente "antígeno O" (Nikaido y Nakae 1979) . Los antígenos O están unidos a la membrana por un polisacárido más conservado referido como el "núcleo R" que consiste en un azúcar de 8 carbonos, ácido 3-desoxioctulosónico, L-glicero-D-manoheptosa, fosfato, fosfato de etanolamina y pirofosfato de etanolamina (Nikaido y Nakae 1979, supra) .

Junto con los antigenos 0 y el núcleo R, los LPS típicamente contienen lípido A. El lípido A consiste en un esqueleto de D-glucosaminil- ( l- 6) -D-glucosamina con ácidos grasos saturados unidos ya sea por enlaces amida o éster. Se ha demostrado que la membrana exterior de H. somni no tiene algunos componentes de alto peso molecular que constituirían un verdadero LPS, de modo que sus endotoxinas son denominadas por lo tanto lipooligosacáridos (LOS) (St. Michael et al. 2006. Structural Analysis of the Lipooligosaccharide-derived Oligosaccharide of Histophilus somni (Haemophilius somnus) strain 8025. Carbohydrate Research. 341; p281-284) . Los LOS de H. somni, como los LPS de otras bacterias gram-negativas , muestran altos niveles' de variabilidad en estructuras expuestas, mientras que las regiones de anclaje asociadas a la membrana están más conservadas (St. Michael et al. 2006).

La purificación inicial de LOS y los ensayos bioquímicos mostraron que los LOS de H. somni consisten en ácidos grados dodecanoicos , tetradecanoicos y 3-hidroxitetradecanoicos , una alta proporción de hexosa, 3-desoxi-D-mano-octulónico (Kdo) , fosfato, una pequeña cantidad de heptosa (L-glicero-D-mano-heptosa) , glucosamina y lípido A (Inzana et al. 1988. Purification and Characteri zation of Lipooligosaccharides from Four Strains of Haemophilus somnus. Infection and Immunity. 56(11); p. 2830-2837). La investigación ulterior ha demostrado que el H. somní es capaz de variación de fase de sus LOS como resultado de la presentación diferencial de fosfoetanolamina (PEtn), fosfocolina (ChoP) y cadenas laterales de heptosa (Inzana et al. 1992. Phenotypic Phase Variation in Haemolphilus somnus Lipoologosaccharide During Bovine Pneumonía and After in vitro Passage. Infection and Immunity. 60(7); p2943-2951; Cox et al. 1998. Structural Analysis of the Phase-Variable Lipooligosaccharide from Haemolophilus somnus strain 738. Eur. J. Biochem. 253; p507-516; Elswaifi 2006. The Molecular Characterization of Phosphorylcholine (ChoP) on Histophilus somni Lipooligosaccharide: Contribution of ChoP to Bacterial Virulence y Pathogenesis . Virginia Polytechnic Institute and State University (disertación doctoral); Howard et al. 2000. Antigenic Diversity of Haemophilus somnus Lipooligosaccharide: Phase-Variable Accessibility of the Phosphorylcholine Epitope. Journal of Clinical Microbiology. 28(12); p4412-4419). Esto junto con la incorporación de ácido N-acetilneuramínico (que se encuentra comúnmente en las superficies celulares de mamíferos) en la membrana exterior, dan a H. somni una variedad de modos de evasión del sistema inmunológico del huésped (Inzana et al. 2002. Incorporation of N-Acetyleneuraminic Acid into Haemophilus somnus Lipooligosaccharide (LOS): Enhancement of Resistance to Serum and Reduction of LOS Antibody Binding. Infection and Immuníty. 70(9); pp . 4870-4879).

Como una bacteria gram-negativa , los componentes de la membrana exterior representan objetivos inmunológicos atractivos. Usando las OMP como la base de candidatos de vacunas puede ser posible inducir respuestas inmunológicas direccionadas selectivamente a antigenos de superficie asociados con virulencia. Las respuestas inmunológicas direccionadas generadas a partir de una vacuna de OMP pueden interferir con la capacidad de H. somni para colonizar el tracto respiratorio inferior, inhibir la captación de hierro requerida para la colonización continuada, o limitar el impacto de varios modos de evasión inmunológica e interferencia.

Si bien se ha realizado mucho trabajo para expandir el conocimiento basado en los mecanismos de virulencia de H. somni, todavía no está claro qué OMP, o qué combinación de OMP, es finalmente inmunológicamente importante. El trabajo en el modelo del ratón ha mostrado ser promisorio, sin embargo, aún faltan en la literatura actual estudios de eficacia de vacunas en animales huéspedes. Los objetivos de esta tesis son establecer la prueba de concepto para la eficacia de-_los candidatos de vacuna de OMP contra una carga respiratoria y comparar cualquier nivel de eficacia observado con los productos disponibles actualmente.

Para lograr este objetivo se estableció un modelo de carga capaz de producir resultados de lesiones pulmonares consistentes en animales control. Un modelo de carga apropiado debería producir lesiones pulmonares consistentes con la infección de H. somni de tipo salvaje produciendo lesiones pulmonares en > 50% de los animales control no tratados con > 15% de las lesiones pulmonares totales. Los candidatos de vacunas de OMP, que contienen múltiples antígenos expuestos en superficie fueron testeados in vivo y se comparó la eficacia con otras alternativas de vacunas. Estas alternativas incluían un producto de bacterinas muertas actual y mutantes vivas modificadas que no tenían algunas características de formación de biopelícula. Para monitorear respuestas de anticuerpos (IgG por sus siglas en ingles) debido a los candidatos de vacunas, se desarrolló un Ensayo de Inmunoabsorcion ligado a Enzimas (ELISA por sus siglas en ingles) para las pruebas serológicas y se realizó una Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato de Sodio (SDS-PAGE por sus siglas en ingles) seguido por un análisis de transferencia western para determinar si se pueden identificar proteínas inmunorreactivas específicas para estudio ulterior.

Estos mecanismos de variación de la membrana exterior son facilitados por el genoma complejo de H. somni. Varios aislados fueron secuenciados completamente y se halló que poseen genomas que oscilan entre 2.0 Mb y 2.3 Mb de tamaño (Challacombe et al., 2007). Comparando los genomas conocidos de aislados avirulentos con aquellos que son virulentos, se puede lograr una mejor comprensión de la patogenicidad. El aislado de H. somni 129Pt fue aislado del tracto urinario de un animal sano, y se considera que no es patogénico. El análisis de este genoma provee un buen punto de partida para la comparación con los aislados patogénicos. Se halló que el genoma de 129Pt era de 2.0 Mb de longitud con un contenido total de GC de 37%. El aislado también contiene el plásmido pHS129 de 5.2 kb . Dentro del genoma de cromosomas único, circular, se identificaron secuencias que codificaban 1.844 genes con un marco de lectura abierta de 980 bp. El origen de la replicacion está localizado en la base 1926721 (Challacombe et al. 2007). En comparación con H. ducreyi y H. influenzae muchos de estos genes se conservaron, sin embargo se observó que 319 eran únicos de H. somni. Se halló que estos genes únicos estaban involucrados en la síntesis de LOS, la captación y el metabolismo de carbohidratos, el transporte de cationes, el metabolismo de aminoácidos, la biosintesis de ubiquinona y menaquinona, la adhesión a la superficie celular, la síntesis del cofactor y el transporte de electrones (Challacombe et al. 2007). Estos genes únicos y sus proteínas expresadas subsiguientemente, especialmente aquellas que pueden ser unidas a la región de la membrana exterior serían de interés para aquellos involucrados en el desarrollo de la vacuna.

Se ha hallado que el aislado 2336 de H. somni patogénico tiene un genoma levemente más grande (2.3 Mb) y codifica para varios genes adicionales en comparación con el aislado 129Pt no patogénico. Se halló que los genes adicionales codifican para factores de virulencia tales como las adhesinas autotransportadoras , los homólogos de hemaglutinina filamentosos, los sistemas de restricción-modificación (RM por sus siglas en ingles), las secuencias tipo profago, y las proteínas de síntesis de LOS (Sandal e Inzana 2010. A Genomic indow into the Virulence of Histophilus. Trends in Microbiology. 18(2); p. 90-99). El análisis ulterior de las diferencias patogénicamente importantes entre los dos aislados resultaría en una propuesta más directa para el desarrollo de la vacuna.

La infección exitosa del tracto respiratorio inferior por Haemopfiilus spp. y el desarrollo subsiguiente de la enfermedad es facilitado por la presencia de vellosidades y adhesiones (Jacques y Paradis 1998. Adhesin-Receptor Interactions in Pasteruellaceae . FEMS Microbiol.

Rev. 22; p. 45-59) y LOS (Johnson e Inzana 1986. Loss of Ciliary Activity in Organ Cultures of Rat Trachea Treated with Lipo-oligosaccharide from Haemophilus ínfluenzae . J. Med. Microbiol. 22; ?265-268.)· Como un aislado no patogénico, se halló que el 129Pt codifica para 12 moléculas de adhesina grandes, pero no tiene muchos genes para vellosidades y adhesinas asociados con la colonización de superficies mucosas por aislados patogénicos tales como 2336 (Challacombe et al. 2007). Los genes que codifican los pili, que también pueden explicar los mecanismos de secreción, se encuentran en aislados patogénicos. Estos genes incluyen pilA, B, C, y D (Sandal e Inzana 2010) .

El genoma de aislados de H. somni virulentos, tales como 2336, también permiten la variación de fase antigénica de los LOS por el mal apareamiento por deslizamiento de hebra de una repetición en tándem de un número variable de 5'-CAAT-3' (VNTR por sus siglas en ingles) . Esta variación de fase no se observa en el aislado 129Pt. Estas VNTR' s están ubicadas corriente abajo de los codones de partida o dentro de los marcos de lectura abiertos (ORF's) para las glicosiltransferasas . Esta modificación traduccional se observa en los genes Io£>2ABCD y permiten que las bacterias cambien su presentación de LOS para evadir las respuestas inmunológicas de los huéspedes . La presencia del ácido N-acetil-5-neuraminico (Neu5Ac) en los LOS también permite que las bacterias se oculten de la respuesta inmunológica ya que Neu5Ac es común en las superficies de las células propias del huésped (Sandal e Inzana 2010) .

El operón líclABCD ha sido estudiado adicionalmente y se ha demostrado que junto con el gen glpQ controla la variación de fase de la fosforilcolina (ChoP) que es expresada en los LOS de H. somni. Un mal apareamiento por deslizamiento de hebra similar ocurre junto con una repetición en tándem de 5'-AACC-3' en el gen liclA y resulta en varias elongaciones y truncados y desviaciones del ORF fuera de alineamiento con el codón de partida. La variación de esta quinasa no parece afectar la operación de los genes liclBCD corriente abajo, pero ofrece otra variación en la presentación en superficie para evadir las defensas del huésped. Se demostró también que ChoP es un factor que contribuye a la colonización respiratoria por H. somni, sin embargo pareció interferir con la colonización durante una infección sistémica (Elswaifi 2006) . Finalmente se ha demostrado que ChoP aglomera plaquetas bovinas a través de la interacción con receptores de factores activadores de plaquetas (PAF-R) (Elswaifi 2006) .

Un trabajo concerniente a la capacidad de los aislados patogénicos de H. somni para incorporar Neu5Ac en los LOS también explica otro mecanismo de virulencia (Inzana et al. 2002) . Haciendo esto, la bacteria imita a la lacto-N-neotetraosa que recubre las células endoteliales bovinas y permite otro método de evasión del sistema inmunológico (Sandal e Inzana 2010) . Se ha demostrado que la variación de ChoP y la incorporación de Neu5Ac interfieren con la unión de anticuerpos, aún con anticuerpos monoclonales específicos para los LOS de H. somni purificados y también inhibe la eliminación por suero de la fase convaleciente (Sandal e Inzana 2010) .

Además, se ha demostrado que H. so ni produce biopelículas in vitro y se sospecha que hace esto in vivo aunque es difícil de examinar debido a una rápida selección artificial contra el fenotipo de la biopelícula por métodos de cultivo de laboratorio típicos e inexactitudes al usar modelos de no huéspedes (Sandal y otros, 2009) . Muchas bacterias forman biopelículas mediante una combinación de exopolisacáridos (EPS por sus siglas en ingles) y fimbrias para adherirse a superficies celulares y entre sí (Costerton 1999) . La bacteria usa la formación de biopelícula para mantener la adhesión celular y para protegerse contra las condiciones ambientales severas. La película propiamente dicha puede consistir en hasta 90% de EPS, protegiendo así a las bacterias de la detección y la respuesta inmunológica (Costerton 1999) . Se ha demostrado que la biopelicula formada por H. somni por microscopía electrónica de exploración (SEM por sus siglas en ingles) e hibridación fluorescente in sítu (FISH por sus siglas en ingles) es más organizada y extensa in vivo que otros miembros de la familia Pasteurllaceae (Sandal y otros, 2009) . La modificación de esta característica puede ser una propuesta atractiva para una vacuna viva modificada.

Las estrategias para nuevas vacunas también pueden estar direccionadas a proteínas presentes en la membrana exterior. Varias de estas OMP han sido caracterizadas y se ha hallado que algunas son inmunorreactivas con el suero del huésped (Sandal e Inzana 2010) . Las OMP permiten que las bacterias interactúen con su ambiente externo, y si bien algunas están altamente conservadas en diversas especies, muchas son específicas de las especies. Las OMP pueden conferir motilidad en la forma de estructuras flagelares o ciliares, pueden permitir la transferencia de metabolitos o desechos a través de la membrana, pueden facilitar la adhesión celular del huésped o pueden permitir otras características de unión importantes en la evasión inmunológica (Challacombe et al., 2007) .

El aislamiento de las OMP se logró por disrupción de las células bacterianas de un cultivo puro por lisis con detergente, solventes orgánicos, shock osmótico, o congelamientos-descongelamientos repetidos seguido por una centrifugación a baja velocidad para remover el debris celular (Bollag et al., 1996). El sobrenadante que contiene las OMP es sometido luego a ultracentrifugación removiendo todos los componentes insolubles. El pellet resultante es suspendido luego e incubado en un tampón HEPES 10 mM con 2% (p/v) de N-lauroil sarcosina (sarcosilo) y sometido a otra vuelta de ultracentrifugación (Hobb et al., 2009). El pellet resultante puede ser solubilizado de otro modo con dodecilsulfato de sodio (SDS por sus siglas en ingles) , ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS por sus siglas en ingles) , Tris, o tampones fosfato, sales rodanuros caotrópicas, o urea y purificado subsiguientemente por un método apropiado para las proteínas de interés (Rehm 2006) . Luego se examina la inmunorreactividad a través del uso de un suero de fase convaleciente en una transferencia Western (Kania y otros, 1990) .

Una de las primeras proteínas potenciales inmunológicamente importantes a ser descriptas de este modo es una proteína de 78 kDa que se demostró que estaba conservada en la mayor parte de los aislados testeados, incluyendo los aislados obtenidos de varios estados de enfermedad, así como también aislados no patogénicos (Kania y otros, 1990) . Otra OMP de 40 kDa de tamaño se aisló subsiguientemente de aislado 8025 de H. somni asociado con TEME y sometido a secuenciación N-terminal. Se halló que esta proteína tenía alta homología con las proteínas de porina halladas en H. influenzae y E. coli (Tagawa y otros, 1993a) . Se ha demostrado que las proteínas de porina facilitan la difusión en masa de bajo peso molecular de solutos a través de la membrana. Una OMP con un peso molecular modificable por calor también fue identificada con un peso molecular de 28-37 kDa dependiendo de que la proteína fuera solubilizada a 60°C o 100°C. Se demostró que esta proteína por secuenciación N-terminal era homologa a las proteínas OmpA de otras bacterias gram-negativa, incluyendo E. coli y Actinobacillus actinomycetemcomitans (Tagawa y otros, 1993b) .

La investigación ulterior buscó comparar las OMP predominantes de 53 aislados de H. somni para determinar sí la clasificación de la patogenicidad podría lograrse por el perfil de la proteína. Este estudio mostró una gran variación en los pesos moleculares de las OMP y fue capaz de clasificar los aislados testeados en 4 grupos y 3 subgrupos distintos. Estas clasificaciones sin embargo no correspondían a estados de enfermedad asociados con los diferentes aislados. La variación de la masa molecular de las OMP es de interés ya que la OMP predominante identificada en este estudio muestra homología N-terminal con respecto a la proteína P2 asociada con la patogenicidad en H. influenzae (Tagawa y otros, 2000) .

La capacidad de H. somni de adquirir hierro de su huésped también es un proceso importante para una infección exitosa y diferencias en las OMP que ligan transferrina pueden ser las responsables de la especificidad del huésped y la virulencia. Muchos miembros de la familia Pasteruellaceae utilizan un complejo receptor compuesto por dos OMP's, proteínas A y B que se unen a transferrina, para adquirir hierro unido a transferrina del huésped (Ekins y otros, 2004) . El operón responsable de Tbp está dispuesto de tal modo que TbpB precede a TbpA y es controlado típicamente por un mecanismo de represión que involucra proteínas reguladoras de captación férrica (Fur) en presencia de hierro disponible. Las diferencias alélicas en el gen tbph dan por resultado diferentes mecanismos de unión a transferrina que se han unido a aislados virulentos y no virulentos (Ekins y otros, 2004) . La presencia del alelo tbpA2 da por resultado un receptor TbpA de un solo componente como se señaló para el aislado 129Pt mientras que una combinación de los genes t£>pA y tbp codifica un complejo receptor bipartito identificado en los aislados 2336 y 649 de H. somni patogénicos (Tremblay y otros, 2006) .

El gen fhaB, presente sólo en aislados patogénicos de H. somni, codifica para una proteína que se une a inmunoglobulinas (IbpA por sus siglas en ingles) . El aislado 2336 codifica para cuatro homólogos fhaB separado en cuatro loci diferentes. La proteina IbpA es una gran exoproteina asociada en la inhibición de la fagocitosis por el sistema inmunológico del huésped (Sandal e Inzana, 2010) . La IbpA interactúa con la porción Fe de IgGl, IgG2, y IgM y ha sido descripta como una proteina de 350 kDa con subunidades de tamaños 270, 120, y 41 kDa. La subunidad de 41 kDa es la única porción que se mostró que reaccionaba con la IgGl bovina (Yarnall y otros, 1988).

Las investigaciones recientes han elucidado la importancia de la modificación postraduccional de las proteínas celulares del huésped por secreciones bacterianas como un mecanismo de virulencia y evasión inmunológica de la respuesta del huésped. La AMPilación es un proceso reversible de agregar en forma covalente adenosina monofosfato (AMP por sus siglas en ingles) a una cadena lateral de proteína hidroxilo de residuos de treonina y tirosina (Woolery y otros, 2010) . Las enzimas adenililtransferasa que facilitan este proceso contienen una filamentación inducida por el dominio cAMP (Fie) (HPFx (D/E) GN (G/K) R) que está ampliamente conservado en todas las especies (Xiao y otros, 2010) . Los dominios Fie se observan naturalmente en las células eucarióticas y frecuentemente tienen un rol en la señalización celular (Roy y Mukherjee, 2009) . Las proteínas que contienen el dominio Fie de procariotas sin embargo, parecen inhibir la función de la GTPasas dependientes de Rho en las células huésped ( orby y otros, 2009) .

La IbpA de los aislados de H. somni virulentos contiene dos dominios Fie consecutivos cerca del extremo C (Roy y Mukherje, 2009) y un dominio adhesina en el extremo N ( oolery y otros, 2010) . Parece que esta proteina es segregada por las bacterias en las células huésped dando por resultado la A Pilación de las GTPasas de las células huésped y la modificación del citoesqueleto de actina (Woolery y otros, 2010). La adenilación ocurre en el residuo de tirosina switchl en asociación con RhoA, Racl o Cdc42 como un substrato (Xiao y otros, 2010) . Este mecanismo también se observa con la proteína VopS de Vibrio parahaemolyticus que A Pila en cambio un residuo de treonina. Estas modificaciones llevan a una interferencia con la capacidad del macrofago para realizar la fagocotosis, el tráfico de fagosomas, la activación transcripcional de efectores inmunes, la estimulación de respuestas adaptivas, y apoptosis (Chimini y Chavrier, 2000). La citotoxicidad inducida por el dominio Fie de IbpA se observó sólo en aislados patogénicos tales como 2336 y no se observó en aislados no patogénicos tales como 129Pt (Zeckarias y otros, 2011).

Se han realizado trabajos para testear prototipos de vacuna con la subunidad IbpA con resultados mixtos. El uso de pET41a y pET-GSTx para producir las subunidades de IbpA recombinantes A3, A5, y DR2 (2do dominio Fie) en E. coli fue exitoso para prevenir la septicemia inducida por H. somni después de vacunación de ratones NIH Swiss Webster de 5-6 semanas con subunidades recombinantes (Geertsema y otros, 2008). También se informó que la subunidad DR2 de la IbpA muestra protección contra una carga respiratoria de H. somni en terneros Holstein de 5 semanas cuando se administró en dos dosis separadas por tres semanas (Geertsema y otros, 2011) . La capacidad para extrapolar datos de este estudio a una gran población es débil debido a grupos de tratamiento pequeños (5-6 animales cada uno) . Mientras que el grupo vacunado con DR2 presentó una disminución estadísticamente significativa en la patología pulmonar total cuando se comparó con el grupo control (p=0.04), esta disminución puede no ser biológicamente significativa ya que los animales control presentaron sólo 11% de patología pulmonar. Datos no publicados de un estudio en BIVI más grande que testeaba la subunidad DR2 no pudieron confirmar estos resultados.

ESTRATEGIAS DE VACUNACIÓN La vacunación exitosa induce la memoria inmunológica dentro del huésped permitiendo una respuesta direccionada, rápida, a las infecciones subsiguientes. Hay varias estrategias para lograr esto, y cada una tiene sus ventajas y desventajas únicas. Las tecnologías actuales para la vacunación contra las infecciones bacterianas incluyen el uso vacunas a base de proteínas, imitantes vivas modificadas y bacterinas de bacterias muertas.

La proliferación de las células de memoria con especificidad antigénica con respecto a epitopos neutralizantes de toxinas bacterianas y proteínas de la superficie celular incorporadas en la pared celular gram-negativa son el principal objetivo de la vacunación. Cuando las infecciones subsiguientes son toleradas más fácilmente y eliminadas exitosamente por huéspedes individuales, mejora la inmunidad de la manada. Si bien el organismo patogénico puede causar aún problemas menores en animales individuales, es mucho menos probable que se observe una gran pérdida económica cuando se administran las vacunas apropiadas .

La manera más rápida para asegurar que una vacuna incluya todos los antígenos relacionados con la virulencia posibles presentes en una superficie celular es usar una bacterina de bacterias muertas. Estos productos, sin embargo, pueden inducir reacciones anafilácticas dependiendo de los métodos de producción y la sensibilidad del animal individual, y en productos de combinación que contienen múltiples organismos, estos eventos son más probables (Roth, 2007). El beneficio de estos productos típicamente supera el riesgo ya que estas vacunas han probado ser útiles en la prevención de la enfermedad para operaciones en el ganado vacuno y son típicamente el medio más efectivo en cuanto a los costos para controlar brotes de la enfermedad (Babiuk, 1994) .

La atenuación facilitada de aislados virulentos, o el aislamiento de aislados naturalmente avirulentos, lleva a menores costos de desarrollo, mientras que la simplicidad del proceso de producción disminuye los gastos generales permitiendo que los fabricantes proporcionen productos a precios más bajos para los consumidores. Es difícil, sin embargo, para las compañías asegurar la longevidad de sus productos ya que las mutaciones de tipo salvaje u otras condiciones en el campo pueden disminuir la efectividad de estos productos en el tiempo.

Los problemas de eficacia surgen cuando los antígenos presentes en la vacuna no confieren inmunidad a los aislados vivos de tipo salvaje. En el caso de las vacunas de H. somni, se ha demostrado gue algunas proteínas sobrenadantes de la superficie y de cultivo que son producidas in vivo no están representadas adecuadamente in vitro durante la producción de la vacuna (Griffin, 2010) .

Se sospecha que algunas de estas proteínas son inmunológicamente significativas, y se están realizando trabajos para determinar si varios métodos de cultivo, estrategias de purificación de proteínas, o aislados de mutantes knockout de genes pueden mejorar la eficacia de una vacuna (Tagawa, 1993; Sandal, 2009; Zekarias, 2010) . Sin nuevos aislados de vacunas, se podría lograr una mejora mediante el uso de varias plataformas de adyuvantes.

En una vacuna de bacterina de bacterias muertas, como no se introduce un patógeno vivo, los adyuvantes son incorporados para aumentar la respuesta inmunológica a antígenos importantes. Los adyuvantes usados actualmente en vacunas veterinarias incluyen sales de aluminio (alumbre) , emulsión en aceite, saponina, complejos inmunoestimulantes (ISCOMs por sus siglas en ingles), liposomas, micropartículas , copolímeros en bloque no iónicos, polisacáridos derivados, citoquinas, y derivados bacterianos (Spickler, 2003). Cada adyuvante tiene su propio conjunto de propiedades que determinan su modo de acción, el que a su vez puede influir en el tipo de respuesta inmunológica provocada.

Los adyuvantes en partículas (es decir, alumbre) sirven para mejorar la acción de las células que presentan antígenos formando agregados que son fagocitados más fácilmente (Spickler, 2003) . El hidróxido de aluminio se usa como el sistema adyuvante para varias vacunas de H. somni comercialmente disponibles, incluyendo Sommubac de Pfizer y Elite-9 HS de BIVI. Si bien las formulaciones de adyuvantes están patentadas y muchos mecanismos de acción reales son desconocidos, la teoría general para este tipo de de adyuvante sería la inducción de una respuesta mediada por anticuerpos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, Tipo II (MHC II) (Murphy, 2008) .

Los adyuvantes de emulsión en aceite ayudaría en la inducción de la respuesta de MHC II, probablemente debido a un "efecto de depósito" manteniendo los antígenos en su lugar en el sitio de inyección, permitiendo que más células que presentan antígenos encuentren los antígenos importantes en un período de tiempo extendido (Spickler, 2003) . Si bien no hay productos que usen actualmente este tipo de adyuvante comercialmente para la vacunación contra H. somni, el gel de hidróxido de aluminio Rehydragel® basado en aceite (que se puede obtener comercialmente de Reheis Inc.) se usa en vacunas de Clostridium que se pueden combinar con H. somni en un producto de combinación y se usa regularmente el adyuvante de Freund en estudios de investigación como un adyuvante inicial con el cual se puede probar el concepto de prueba para los nuevos candidatos de vacunas (Babiuk, 1994).

Como el H. somni es un patógeno bacteriano extracelular , los adyuvantes capaces de aumentar la inducción de la producción de IgG por las células plasmáticas, la activación del sistema de complemento y la neutralización de endotoxinas seria beneficiosa. Por esta razón se usan típicamente sales de aluminio y emulsiones de aceite en agua. Sin embargo, estos adyuvantes tienden a ser débiles en comparación con nuevas tecnologías, pero se usan aún ampliamente ya que han sido aprobados por las agencias reguladoras para usar en vacunas veterinarias y no representan una amenaza de toxicidad sistémica (Aguilar y Rodríguez, 2007) .

La vacunación usando organismos vivos modificados avirulentos no requiere el uso de adyuvantes, y ha demostrado ser más capaz de producir respuestas inmunológicas mediadas por células así como dirigidas por anticuerpos (Detmer y Glenting, 2006). Estos productos tienden a reducir la prevalencia de reacciones anafilácticas . Sin embargo, el desarrollo de aislados atenuados o mutantes de deleción como objetivos puede ser muy costosa y se encuentra asociado otro riesgo importante. Estos organismos vivos se comportan como sus contrapartes de tipo salvaje y mantienen su capacidad para intercambiar información genética con otros aislados dentro del animal. Debido a esta recombinación genética, los aislados de vacunas avirulentos pueden incorporar factores de virulencia y revertir a una forma virulenta. Estos organismos pueden desprenderse y diseminarse como cualquier otro aislado, lo que es beneficioso para la inmunidad de la manada si permanece avirulenta, pero puede causar serios problemas de brotes si ocurre una reversión (Detmer y Glenting, 2006) . Las vacunas de este tipo tienen que ser sometidas a extensos estudios de seguridad para disminuir estos problemas antes de la aprobación reglamentaria, sin embargo, la posibilidad permanece.

Las vacunas a base de proteínas, a celulares, eliminan los problemas de reversiones virulentas observadas en vacunas vivas modificadas mientras que continúan disminuyendo la incidencia de anafilaxis observada en los productos de bacterina. Se esperaría que las vacunas de este tipo actúen de la misma forma que la bacterina de bacterias muertas, y podrían ser combinadas con adyuvantes similares para inducir la inmunidad mediada por MHCII y anticuerpos. Estos preparados dan por resultado una mayor concentración de proteínas inmunológicamente importantes suministradas a través de vacunación y por lo tanto pueden producir una respuesta inmunológica más directa. Los costos de desarrollo pueden ser altos, sin embargo con el sistema de expresión recombinante apropiado los costos pueden permanecer bajos. La clave para este tipo de vacuna es introducir importantes epitopos de proteínas relacionadas con virulencia que inducen respuestas inmunológicas dirigidas a disminuir la capacidad de que se produzca una infección de tipo salvaje (Babiuk 1994) .

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante, química de las proteínas e inmunología, que se encuentran dentro del campo del experto en el arte. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II y III, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Vols. I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds . 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986) ; Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986) ; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification Methods -a practical approach (E.L.V. Harris y S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press) ; y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. eir y C. C. Black ell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications ) .

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no está limitada a secuencias de ADN, polipéptidos particulares o parámetros del proceso ya que por supuesto estos pueden variar. Debe entenderse además que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir formas de realización particulares de la invención solamente, y no pretende ser limitativa. Debe señalarse . que, como se usa en esta memoria y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "una", "un" y "el", "la", incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más antígenos, la referencia a "un excipiente" incluye mezclas de dos o más excipientes, y similares .

A. Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en el arte al cual pertenece esta invención en el momento de su presentación de solicitud. El significado y el alcance de los términos debería ser claro; sin embargo, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente tienen prioridad sobre cualquier definición del diccionario o extrínseca. Además, a menos que lo requiera de otro modo por el contexto, los términos singulares deberán incluir las pluralidades y los términos plurales deberán incluir el singular. En la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique de otra manera. Además, el uso del término "que incluye", asi como también otras formas tales como "incluye" e "incluido" no es limitativo. Todas las patentes y publicaciones que se mencionan en la presente son incorporadas por referencia en la presente.

"Protección contra enfermedades", "inmunidad protectora", "inmunidad funcional" y frases similares, significan una respuesta contra una enfermedad o condición generada por la administración de una o más composiciones terapéuticas de la invención, o una combinación de éstas, que da por resultado menos efectos deletéreos que los que se esperaría en un sujeto no inmunizado que ha sido expuesto a enfermedad o infección. Es decir, la severidad de los efectos deletéreos de la infección es disminuida en un sujeto vacunado. La infección puede ser reducida, retardada o posiblemente evitada completamente, en un sujeto vacunado. En la presente, en donde se dice prevención completa de la infección, esto se indica específicamente. Si no se indica prevención completa, entonces el término incluye prevención parcial.

En la presente, "reducción de la incidencia y/o la severidad de los signos clínicos" o "reducción de los síntomas clínicos" significa, pero no está limitado a, reducir el número de sujetos infectados en un grupo, reduciendo o eliminando el número de sujetos que exhiben signos clínicos de la infección, o reduciendo la severidad de cualesquiera signos clínicos que están presentes en uno o más sujetos, en comparación con la infección de tipo salvaje. Por ejemplo, debería referirse a cualquier reducción de la carga de patógenos, desprendimiento de patógenos, reducción de la transmisión de patógenos, o reducción de cualquier signo clínico Preferentemente estos signos clínicos son reducidos en uno o más sujetos que reciben la composición terapéutica de la presente invención por lo menos 10% en comparación con los sujetos que no reciben la composición y que se infectan. Más preferentemente los signos clínicos son reducidos en sujetos que reciben una composición de la presente invención por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 30%, con mayor preferencia, por lo menos 40%, y con mayor preferencia aún, por lo menos 50%.

La expresión "mayor protección" en la presente significa, pero no está limitado a, una reducción estadísticamente significativa de uno o más síntomas clínicos que están asociados con la infección por un agente infeccioso, preferentemente un H. somnus, respectivamente, en un grupo vacunado de sujetos vs . Un grupo de sujetos control no vacunados. La expresión "reducción estadísticamente significativa de los síntomas clínicos" significa, pero no está limitado a, la frecuencia en la incidencia de por lo menos un síntoma clínico en el grupo de sujetos vacunados es por lo menos 10%, preferentemente 20%, con mayor preferencia, 30%, con mayor preferencia aún, 50%, y con mayor preferencia, todavía 70% menor que en el grupo control no vacunado después de la carga del agente infeccioso .

"Protección de duración prolongada" se refiere a "mejor eficacia" que persiste por lo menos 3 semanas, pero con mayor preferencia, por lo menos 3 meses, con mayor preferencia aún, por lo menos 6 meses. En el caso de ganado vacuno, se prefiere más que la protección de duración prolongada persista hasta la edad promedio en que los animales son comercializados para carne.

Una "composición inmunogénica o inmunológica" se refiere a una composición de substancia que comprende por lo menos una OMP de H somni, o porción inmunogénica de ésta, que provoca una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmunológica medada por anticuerpos o celular a la composición. En una forma de realización preferida de la presente invención, una composición inmunogénica induce una respuesta inmunológica y, con mayor preferencia, confiere inmunidad protectora contra uno o más de los signos clínicos de una infección por Histophilus somni .

Un "inmunogénico" o "antigeno" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido o proteina que provoca una respuesta inmunológica como se describió en la presente. Un polipéptido o proteina "immunogénico" de Histophilus somni incluye la secuencia de longitud completa de cualquiera de las OMP de Histophilus somni identificadas en la presente o análogos o fragmentos inmunogénicos de estos. El término "fragmento inmunogénico" o "porción inmunogénica" se refiere a un fragmento o forma truncada y/o substituida de una OMP de Histophilus somni que incluye uno o más epitopos y provoca asi la respuesta inmunológica descripta en la presente. En general, tales formas truncadas y/o substituidas, o fragmentos, comprenderán por lo menos seis aminoácidos contiguos de la proteina de Histophilus somni de OMP de tipo salvaje. Más preferentemente, las formas truncadas o substituidas, o fragmentos, tendrán por lo menos 10, con mayor preferencia, por lo menos 15, y con mayor preferencia aún, por lo menos 19 aminoácidos contiguos de la proteina de Histophilus somni de OMP de longitud completa. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier número de técnicas de mapeo de epitopos, bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol . 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopos lineales pueden ser determinados sintetizando simultáneamente grandes cantidades de péptidos en soportes sólidos, los péptidos correspondiendo a porciones de la molécula de la proteina y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras * los péptidos aún están unidos a los soportes.

Tales técnicas son conocidas y se describen en el arte, por ejemplo, patente U.S. N.° 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; y Geysen et al. (1986) olec. Immunol. 23:709-715. Similarmente, los epitopos conformacionales son identificados fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, tal como, por ejemplo, por, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bi-dimensional . Ver Epitope Mapping Protocols, supra. Los antígenos sintéticos también se incluyen en la definición, por ejemplo, poliepitopos , epitopos flanqueadores , y otros antígenos derivados sintéticamente o recombinantes . Ver, por ejemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. Y Cell Biol . 75:402-408; y Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 18 de junio-3 de julio, 1998. (Cuyas enseñanzas y contenido se incorporan por referencia en la presente.) Una "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica" significa, pero no está limitada a esto, el desarrollo de una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una respuesta inmune o inmunológica incluye, pero no está limitada a, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células helper T, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigida específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped desplegará o bien una respuesta terapéutica o inmunológica protectora (memoria) de tal modo que la resistencia a la nueva infección estará aumentada y/o la severidad clínica de la enfermedad estarán reducidas. Tal protección se demostrará por o bien una reducción en el número de síntomas, la severidad de los síntomas, o la falta de uno o más de los síntomas asociados con la infección del patógeno, un retardo en la aparición de la viremia, reducida persistencia viral, una reducción en la carga viral total y/o una reducción de excreción real .

En la presente, "específicamente inmunorreactiva" se refiere a una proteína o un polipéptido inmunorreactivo que reconocen un antígeno característico de la infección por Histophilus somni pero no reacciona con un antígeno característico de un control de carga estricto.

Como se usa en la presente, "un portador farmacéuticamente o veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción, y similares. En algunas formas de realización preferidas, y especialmente aquellas que incluyen composiciones inmunogénicas liofilizadas, los agentes estabilizantes para usar en la presente invención incluyen estabilizantes para liofilización o secado por congelamiento .

En algunas formas de realización, la composición inmunogénica de la presente invención contiene un adyuvante. "Adyuvantes", como se usa en la presente, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) , GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals , Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión se puede basar en particular en aceite de parafina liquida liviano (tipo Farmacopea Europea) ; aceite de isoprenoide tal como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ásteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites de plantas, oleato de etilo, di- ( caprilato/caprato) de propilenglicol , tri- ( caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, en particular ésteres del ácido isoesteárico . El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de manuro (por ejemplo, oleato de anhidromanitol ) , de glicol, de poliglicerol , de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que son opcionalmente etoxilados, y bloques de copolimeros de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull , D. E. S.), John Wiley and Sons, NY, pp., 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Adyuvantes ilustrativos son la emulsión SPT descripta en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descripta en la página 183 de este mismo libro.

Un caso adicional de un adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolimeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos de adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que son reticulados, especialmente con éteres polialquenílicos de azúcares o polialcoholes . Estos compuestos son conocidos por el término carbómero (Phameuropa Vol . 8, No. 2, Junio 1996) . Los expertos en el arte también se pueden remitir a la patente U. S. N.° 2.909.462 que describe tales polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, estando reemplazados los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos 2 átomos de carbono.

Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener otros substituyentes , tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE . UU.) son particularmente apropiados. Son reticulados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol . Entre estos se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Se prefiere más el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, se encuentran los copolímeros EMA (Monsanto) , que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua lleva a una solución ácida que será neutralizada, preferentemente a pH fisiológico, para dar la solución de adyuvante en la cual se incorporarán la composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna propiamente dicha.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc.), el copolimero de bloques (CytRx, Atlanta GA) , SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , monofosforilo lipido A, adyuvante de Avridina lipido-amina, enterotoxina termolábil de E. coli ( recombinante o de otro modo) , toxina del cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo, o citoquinas que existen naturalmente o recombinantes o sus análogos o estimulantes de liberación de citoquina endógena, entre muchos otros.

Se espera que se pueda agregar un adyuvante en una cantidad de aprox. 100 µg a aprox. 10 mg por dosis, preferentemente en una cantidad de aprox. 100 pg a aprox. 10 mg por dosis, con mayor preferencia, en una cantidad de aprox. 500 \iq a aprox. 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún, en una cantidad de aprox. 750 ]iq a aprox. 2.5 mg por dosis, y con mayor preferencia, aún en una cantidad de aprox. 1 mg por dosis. Alternativamente, el adyuvante puede estar a una concentración de aprox. 0.01 a 50%, preferentemente a una concentración de aprox. 2% a 30%, con mayor preferencia, a una concentración de aprox. 5% a 25%, con mayor preferencia aún, a una concentración de aprox. 7% a 22%, y con mayor preferencia, a una concentración de 10% a 20% en volumen del producto final.

"Diluyentes" pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas del ácido etilendiaminatetracético , entre otros.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural, es decir, si se presenta en la naturaleza, ha sido cambiado o removido de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en la presente.

El término "seguridad" se refiere a la ausencia de consecuencias adversas en un animal vacunado después de la vacunación, lo que incluye sin limitación, la reversión potencial de una vacuna basada en bacteria a la virulencia, los efectos secundarios clínicamente significativos tales como enfermedad persistente o sistémica, o la inflamación sistémica inaceptable en el sitio de administración de la vacuna .

Las expresiones "vacunación" o "Histophilus somni" o variantes de las mismas, tal como se las usa en la presente significan, pero no se limita a, un proceso que incluye la administración de una composición inmunógena de la invención que, cuando se administra a un animal, suscita, o es capaz de suscitar, directa o indirectamente, una respuesta inmune en el animal contra Histophilus somni. El término "mortalidad", en el contexto de la presente invención, se refiere a la muerte asociada con la infección por Histophilus somni, e incluye la situación en la que la infección es tan grave que un animal es sacrificado bajo eutanasia para evitar sufrimiento y proveer un final humano a su vida.

El término "atenuación" significa la reducción de la virulencia de un agente patógeno. En la presente invención "atenuación" es sinónimo de "no virulento". En la presente invención, una bacteria atenuada es una en la que ha sido la virulencia reducida de modo que no cause signos clínicos de una infección por Histophilus somni pero es capaz de inducir una respuesta inmune en el mamífero blanco, pero también puede significar que las señales clínicas están reducidas en cuanto a incidencia o gravedad en los animales infectados con el Histophilus somni atenuado en comparación con un "grupo de control" de los animales infectados con Histophilus somni no atenuado y que no reciben la bacteria atenuada. En este contexto, el término "reduce/reducido" significa una reducción de al menos 10%, preferentemente 25%, incluso con mayor preferencia 50%, con mayor preferencia aún, 60%, incluso con mayor preferencia 70%, con mayor preferencia aún 80%, incluso con mayor preferencia 90% y con mayor preferencia de 100% en comparación con el grupo de control definido anteriormente. Por lo tanto, un aislado atenuado, sin virulencia, de Histophilus somni es uno que es adecuado para su incorporación en una composición inmunogénica que comprende una bacteria Histophilus somni viva modificada.

En la presente, la expresión "dosis efectiva" significa, pero no se limita a, una cantidad de antigeno que suscita, o es capaz de suscitar, una respuesta inmune que tiene como resultado una reducción de los síntomas clínicos en un animal al que se administra el antígeno.

Tal como se la utiliza en la presente, la expresión "cantidad efectiva" significa, en el contexto de una composición, una cantidad de una composición inmunogénica capaz de inducir una respuesta inmune que reduce la incidencia de, o reduce la gravedad de, la infección o incidencia de la enfermedad en un animal. En particularmente, una cantidad eficaz se refiere a unidades formadoras de colonias (CFU, colony forming units) por dosis. Alternativamente, en el contexto de una terapia, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o atenuar la gravedad o duración de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de ellos, prevenir el avance de una enfermedad o trastorno, causar la regresión de una enfermedad o trastorno, prevenir la recurrencia, el desarrollo, la aparición o la progresión de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno, o reforzar o mejorar profilaxis o el tratamiento de otra terapia o de un agente terapéutico El término "fragmento" se refiere a un fragmento o forma truncada y/o sustituida de una OMP de Histophilus somni o de un gen que codifica dicho péptido de OMP que incluye uno o más epítopos y por lo tanto suscita la respuesta inmunológica contra Histophilus somni. Es preferible que dicho fragmento sea un fragmento o forma truncada y/o sustituida de cualquiera de los péptidos de Histophilus somni o cualquiera de los genes de Histophilus somni provistos con la presente. En general, tales formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos, comprenderán al menos seis aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa. Es más preferible que las formas truncadas o sustituidas, o fragmentos tengan al menos 10, con mayor preferencia al menos 15, y con mayor preferencia aún, al menos 19 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier cantidad de técnicas de mapeo de epitopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopos lineales pueden determinarse mediante sintetización simultánea de grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteina, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía fijados a los soportes. Tales técnicas se conocen y describen en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N ° 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Nati. 7Acad. Sci . EE. UU. 81:3998-4002, y Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De manera similar, los epitopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional . Ver: Epitope Mapping Protocols, supra. Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos , epitopos flanqueantes, y otros antigenos recombinantes o derivados sintéticamente. Ver, por ejemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. y Cell Biol. 75:402-408; and Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de julio de 1998. (La totalidad de las enseñanzas y del contenido de estos documentos se incorpora en la presente a titulo de referencia) .

La expresión "inmunoreactivo a Histophilus somni" tal como se la utiliza en la presente significa que el péptido o fragmento suscita la respuesta inmunológica contra Histophilus somni.

La expresión "homología de secuencia", tal como se la usa en la presente, se refiere a un método para determinar el grado de relación entre dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o más secuencias se alinean de forma óptima, y se introducen huelgos o brechas si es necesario. Sin embargo, en contraste con la "identidad de secuencia", las sustituciones conservadoras de aminoácidos se cuentan como una concordancia para determinar la homología de secuencias. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tiene homología de secuencia del 95% con una secuencia de referencia, el 85%, preferentemente 90%, incluso con mayor preferencia 95% de los residuos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de referencia deben coincidir, o comprender una sustitución conservadora por otro aminoácido o nucleótido, o un número de aminoácidos o nucleótidos de hasta 15%, preferentemente hasta el 10%, incluso con mayor preferencia hasta 5% de los residuos de aminoácidos o nucleótidos totales, sin incluir las sustituciones conservadoras, en la secuencia de referencia, se puede insertar en la secuencia de referencia. Es preferible que, la secuencia homologa comprenda al menos un tramo de 50, incluso con mayor preferencia, de 100, incluso con mayor preferencia, de 250, y con mayor preferencia, aún, de 500 nucleótidos.

La expresión "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido o nucleótido por otro residuo de aminoácido o nucleótido que tiene características o propiedades similares, lo que incluye el tamaño, el carácter hidrófobo, etc., de tal manera que la funcionalidad general no cambie significativamente .

La "identidad de secuencia "tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias de polinucleótidos , es decir, una secuencia de referencia y una secuencia dada que debe compararse con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias hayan sido alineadas de manera óptima de manera de producir el máximo grado de similitud de secuencia, determinado mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. Una vez hecha tal alineación, la identidad de secuencia se determina sobre una base de posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición en particular si en dicha posición, los nucleótidos o residuos de aminoácidos son idénticos. El número total de tales identidades de posición se divide seguidamente por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia, de manera de obtener una identidad porcentual de identidad. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, lo que incluye pero no limitado a, los descritos en: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. ., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, New York (1991); y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia se codifican en programas informáticos públicamente disponibles que determinan la identidad de 5 secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de tales programas incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research, 12 (1):. 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol . , 215:403-410 (1990). El programa 10 BLASTX está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al, NCVi NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, SF et al, J. Molec Biol, 215.: 403-410 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente por referencia) . Estos programas alinean óptimamente las 15 secuencias usando pesos de huelgos por defecto con el fin de producir el nivel más alto de identidad de secuencias entre la secuencia dada y la secuencia de referencia. Como ilustración, mediante un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una "identidad de 20 secuencia" de menos, por ejemplo, 85%, preferentemente 90%, incluso con mayor preferencia 95% con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia, se da a entender que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia con la salvedad que c la secuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, incluso con mayor preferencia hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85%, preferentemente 90%, incluso con mayor preferencia 95% de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 15%, preferentemente el 10%, incluso con mayor preferencia el 5% de la nucleótidos en la secuencia de referencia pueden estar suprimidos o sustituidos con otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta 15%, preferentemente 10%, incluso con mayor preferencia de 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden estar insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' ? 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia sea en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, mediante un polipéptido que tiene una secuencia dada de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de al menos, por ejemplo, 85%, preferentemente 90%, incluso con mayor preferencia 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, se da a entender que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia con la salvedad que la secuencia de polipéptido dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, incluso con mayor preferencia hasta 5, alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptido dada que tenga in a identidad de secuencia de al menos 85%, preferentemente 90%, incluso con mayor preferencia 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15%, preferentemente hasta el 10%, incluso con mayor preferencia hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede ser eliminado o sustituido por otro aminoácido, o un número de aminoácidos de hasta 15%, preferentemente hasta el 10%, incluso con mayor preferencia hasta 5% del número total de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden presentarse en las posiciones terminales amino o carboxilo de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia sea en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Es preferible que, las posiciones de residuos que no sean idénticas difieran por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como una coincidencia cuando se determina la identidad de secuencia. MOLÉCULAS PORTADORAS Las moléculas portadoras a las que los péptidos de Histophilus so ni de OMP pueden ser conjugados o unidos covalentemente son preferentemente las descritas anteriormente. Los portadores preferidos para uso en animales son la albúmina de suero bovina y hemocianina de lapa californiana . Los portadores proteicos adecuados para uso humano incluyen el toxoide tetánico, toxoide de difteria, vacuna pertussis acelular (toxoide LPF) , materiales de reacción cruzada (CRM, cross-reacting materials), que son antigénicamente similares a las toxinas bacterianas pero no son tóxicos por medio de mutación. Por ejemplo, CRM 197 obtenido de acuerdo con Pappenheimer, et al, Immunochemistry, 9, 891-906 (1972), y otros portadores de proteínas bacterianas, por ejemplo, puede utilizarse la proteína de membrana exterior meningocócica . Es preferible que, la proteína portadora en si misma sea un inmunógeno.

Los péptidos de Histophilus somni de OMP de la invención pueden acoplarse covalentemente al portador mediante cualquier método conveniente conocido en la técnica. Si bien el uso de un ligador tal como dihidrazida de ácido adípico, descrito por Schneerson et al, J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980), o un ligador heterobifuncional tal como N-succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato descrito por Fattom et al, Infection and Immunity, 56, 2292-2298 (1988) se hallan dentro de los alcances de la invención, se prefiere evitar el uso de cualquier enlazador pero en lugar de ello acoplar un péptido de Histophilus somni de la invención directamente a la molécula portadora. Tal acoplamiento puede lograrse mediante aminación reductora como describen Landi et al J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981) .

La magnitud de la composición inmunogénica, tal como se define por el peso molecular promedio, es variable y depende del o de los péptido (s) de Histophilus somni de OMP y de los métodos para acoplar el o los péptidos a Histophilus somni de OMP al portador. Por lo tanto, puede ser tan pequeño como 1.000 daltons (103) o mayor que 106 daltons. Con el método de acoplamiento por aminación reductiva, el peso molecular del o de los péptidos de Histophilus somni se halla normalmente en el intervalo de 5.000 a 500.000, por ejemplo de 300.000 a 500.000, o por ejemplo 5.000 a 50.000 daltons.

Las moléculas portadoras, es decir, péptidos, sus derivados y análogos, y los miméticos de péptidos que específicamente se unen a un péptido de Histophilus somni de OMP de la invención, pueden producirse mediante diversos métodos conocidos en la técnica que incluyen, sin limitación, la síntesis en fase sólida o mediante solución (Nakanishi et al., 1993, Gene 137:51-56; Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154; Neurath, H. et al., Eds . , The Proteins, Vol II, 3d Ed., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976), incorporados en la presente sn su totalidad a título de referencia) .

Los péptidos de Histophilus somni de OMP de la invención o los anticuerpos o porciones ligantes de ellos pueden ser administrados en dosis inyectables mediante solución o suspensión en un diluyente con un portador farmacéutico o veterinario.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales moléculas pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o con animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) .

Las vacunas de la invención pueden ser multivalentes o univalentes. Las vacunas multivalentes se preparan a partir de la inmuno-conjugación múltiples péptidos de Histophilus somni de OMP con una molécula portadora .

En un aspecto, las composiciones de péptido de Histophilus somni de OMP comprenden una cantidad inmunizante eficaz del conjugado inmunogénico, preferentemente en combinación con un inmunoestimulante, y un vehículo fisiológicamente aceptable. Tal como se usa en el presente contexto, el término "inmunoestimulante" tiene por objeto abarcar cualquier compuesto o composición que tenga la capacidad de aumentar la actividad del sistema inmunitario, ya sea un efecto potenciador específico en combinación con un antígeno específico, o simplemente un efecto independiente sobre la actividad de uno o más elementos de la respuesta inmune. Los compuestos inmunoestimulantes incluyen, pero no se limitan a geles minerales, por ejemplo hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos; polianiones; péptidos; emulsiones de aceite; alumbre y MDP. Los métodos para la utilización de estos materiales son conocidos en la técnica, y se hallan bien dentro de la capacidad del experto en la técnica para determinar una cantidad óptima de estimulante para una vacuna dada. En una formulación dada es posible utilizar más de un inmunoestimulante. El inmunógeno también se puede incorporar en liposomas, o conjugarse con polisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una formulación de vacuna.

Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender por ejemplo una lámina de metal o material plástico, tal como un envase blister. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración, preferentemente para la administración a un mamífero, especialmente un cerdo. Asociado con dicho (s) recipiente (s) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por la agencia para la fabricación, uso o venta para la administración humana.

ADYUVANTES A efectos de aumentar aún más el carácter inmunogénico de las composiciones inmunogénicas provistas en la presente, y que contienen uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP puede también comprender uno o más adyuvantes .

Es posible purificar el adyuvante por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente o conocidas en la técnica. La técnica de purificación preferida es la cromatografía sobre gel de sílice, en particular, la técnica de cromatografía "flash" (rápida), tal como se describe en: W. Clark Still et al, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978) . Sin embargo, otros métodos cromatográficos , lo que incluye HPLC, se pueden utilizar para la purificación del adyuvante. También puede utilizarse la cristalización para purificar el adyuvante. En algunos casos, no se requiere purificación, ya que la síntesis provee directamente un producto de pureza analítica .

Las composiciones de vacuna de la invención se preparan mezclando físicamente el adyuvante con el o los péptidos de Histophilus somni de OMP bajo condiciones estériles apropiadas de acuerdo con técnicas conocidas para producir la composición adyuvante. La complej ación del o de los péptido(s) de Histophilus somni de OMP con el adyuvante se ve facilitada por la existencia de una carga negativa neta sobre el conjugado que es atraída electrostáticamente por la carga positiva presente sobre el compuesto adyuvante alquilo de cadena larga.

Se prevé que es posible añadir un adyuvante en una cantidad de aproximadamente 100 ]ig a aproximadamente 10 mg por dosis, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 10 mg por dosis, con mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 500 \iq a aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún, en una cantidad de aproximadamente 750 pg a aproximadamente 2.5 mg por dosis, y con mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis. Alternativamente, el adyuvante puede hallarse presente en una concentración de aproximadamente 0.01% a 75%, preferentemente a una concentración de aproximadamente 2% a 60%, con mayor preferencia a una concentración de aproximadamente 5% a 25%, con mayor preferencia aún, a una concentración de aproximadamente 7% a 22%, y lo más preferible es que se halle presente en una concentración de 10% a 20% en volumen del producto final VEHÍCULOS FISIOLÓGICAMENTE ACEPTABLES Las composiciones de vacuna de esta invención se pueden formular para lo cual se utilizan técnicas similares a las usadas para otras composiciones farmacéuticas de polipéptidos . Por lo tanto, el adyuvante y el o los péptidos de Histophilus somní de OMP, preferentemente conjugados a una molécula portadora y/o mezclados con un adyuvante, pueden ser almacenados en forma liofilizada y se reconstituye en un vehículo fisiológicamente aceptable para formar una suspensión antes de la administración. Alternativamente, el adyuvante y el conjugado pueden ser almacenados en el vehículo. Los vehículos preferidos son soluciones estériles, en particular, las soluciones tampón estéril, tales como solución salina tamponada con fosfato. Es apropiado cualquier método para combinar el adyuvante y el conjugado en el vehículo de tal manera de lograra una mayor eficacia inmunológica de la composición inmunogénica . El volumen de una dosis única de la vacuna de esta invención puede variar, pero por lo general se hallará en los intervalos comúnmente empleados en las vacunas convencionales. El volumen de una sola dosis es preferentemente de entre aproximadamente 0.1 mi y aproximadamente 3 mi, preferentemente entre aproximadamente 0.2 mi y aproximadamente 1.5 mi, con mayor preferencia entre aproximadamente 0.2 mi y aproximadamente 0.5 mL, con las concentraciones del conjugado y de adyuvante señalados anteriormente .

Las composiciones de vacuna de la invención pueden ser administradas mediante cualquier método adecuado .

FORMULACIÓN Los conjugados inmunogénicos que comprenden uno o más péptidos de Histophilus somni de OMP acoplados a una molécula portadora se puede utilizar como vacunas para la inmunización contra uno o más serotipos de Histophilus somni. Las vacunas, que comprende el conjugado inmunogénico en un vehículo fisiológicamente aceptable, son útiles en un método para la inmunización de animales, preferentemente rumiantes, incluidos los bovinos u ovinos para el tratamiento o prevención de infecciones por Histophilus somni .

Los anticuerpos generados contra los conjugados inmunogénicos de la presente invención mediante la inmunización con un conjugado inmunogénico se puede usar en la inmunoterapia pasiva y generación de anticuerpos antiidiotipicos para tratar o prevenir infecciones por Histophilus somni .

El sujeto al que se administra la composición es preferentemente un animal, lo que incluye pero sin limitarse a vacas, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral (por ejemplo, pollos), cabras, gatos, perros, hámsteres, ratones y ratas; lo más preferible es que el mamífero sea una vaca. En otra forma de realización, el sujeto es un ser humano .

Las formulaciones de la invención comprenden una cantidad inmunizante eficaz de una o más composiciones inmunogénicas o anticuerpos contra los mismos y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas comprenden una cantidad inmunizante eficaz de uno o más composiciones inmunogénicas y un vehículo fisiológicamente aceptable. La formulación debería adaptarse al modo de administración.

Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH . La composición inmunogénica puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, pildora, cápsula, formulación de liberación prolongada, o polvo. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como tipos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

DOSIS EFECTIVA Los compuestos descritos en la presente se pueden administrar a un sujeto en dosis terapéuticamente efectivas para tratar enfermedad asociadas con Histophilus somni. La dosificación dependerá del huésped que recibe la vacuna, asi como también factores tales como el tamaño, peso y edad del huésped.

La cantidad precisa exacta de conjugado inmunogénico o de anticuerpo de la invención a ser empleada en una formulación dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del sujeto (por ejemplo, la especie, la edad, el tamaño, la etapa/nivel de la enfermedad) , y debería ser decidida de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada sujeto de acuerdo con técnicas clínicas estándar. Una cantidad inmunizante eficaz es aquella cantidad suficiente para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa por Histophilus somni en un sujeto. Las dosis eficaces también se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo de animales y puede variar de 0.001 mg/kg a 100 mg/kg, y con mayor preferencia una dosis de aproximadamente 400 g/dosis.

La toxicidad y eficacia a terapéutica de los compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o mediante animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD5o (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación LD50/ED5o. Los compuestos que muestran índices terapéuticos grandes son los preferidos. Si bien pueden utilizarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y de estudios con animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para el uso en animales, especialmente ganado vacuno, o seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Es posible formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición media máxima de los síntomas) , determinado en cultivo celular. Tal información puede ser utilizada para determinar más exactamente las dosis útiles en los sujetos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.

El carácter inmuno génico de una composición se puede determinar mediante el control de la respuesta inmune de los sujetos de ensayo después de la inmunización con la composición mediante el uso de cualquier inmunoensayo conocido en la técnica. La generación de una respuesta humoral (anticuerpo) y/o la inmunidad mediada por células, pueden tomarse como una indicación de una respuesta inmune. Los sujetos de prueba pueden incluir animales, tales como cerdos, ratones, hámsters, perros, gatos, conejos, vacas, caballos, ovejas, aves de corral (pollos, por ejemplo, patos, gansos y pavos), y los seres humanos.

La respuesta inmune de los sujetos de prueba puede analizarse mediante diversos enfoques tales como: la reactividad del suero inmune resultante con el conjugado inmunogénico, ensayado mediante técnicas conocidas, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA por su siglas en ingles), inmunoblots, inmunoprecipitaciones , etc., o mediante la protección de huéspedes inmunizados contra la infección por el patógeno y/o atenuación de los síntomas debidos a la infección por el agente patógeno en huéspedes inmunizados, determinado mediante cualquier método conocido en la técnica, para someter a ensayo los niveles de un agente de enfermedad infecciosa, por ejemplo, los niveles de bacterias (por ejemplo, mediante el cultivo de una muestra del sujeto), o mediante otra técnica conocida en la técnica. Los niveles del agente de enfermedad infecciosa también se pueden determinar mediante la medición de los niveles del antígeno contra el que se dirigió la inmunoglobulina . Una disminución en los niveles del agente de enfermedad infecciosa o una mejora de los síntomas de la enfermedad infecciosa indica que la composición es efectiva.

La terapéutica de la invención se pueden ensayar in vitro para establecer la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso in vivo en animales o seres humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro que se pueden utilizar para determinar si la administración de un agente terapéutico específico está indicada, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en los que las células adecuadas de una linea de células o células cultivadas a partir de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno en particular, son expuestos a, o de alguna otra manera se administran a un agente terapéutico, y se observa el efecto de la terapéutica en las células.

Como alternativa, el agente terapéutico se puede ensayar poniendo en contacto el agente terapéutico o las células (sea cultivadas a partir de un sujeto sea de una linea celular cultivada) que son susceptibles a la infección por el agente de la enfermedad infecciosa, pero que no están infectados con el agente de enfermedad infecciosa, exponiendo las células al agente de enfermedad infecciosa, y luego determinar si la tasa de infección de las células puestas en contacto con el agente terapéutico fue menor que la tasa de infección de las células que no entraron en contacto con el agente terapéutico. Puede ensayarse la infección de células con un agente de enfermedad infecciosa, mediante cualquier método conocido en la técnica.

Además, el agente terapéutico se puede evaluar midiendo el nivel de la molécula contra él está dirigido el anticuerpo en el modelo animal o sujeto humano a intervalos de tiempo adecuados antes, durante o después de la terapia. Cualquier cambio o ausencia de cambio en la cantidad de la molécula puede ser identificado y se correlaciona con el efecto del tratamiento sobre el sujeto. El nivel de la molécula puede ser determinada por cualquier método conocido en la técnica.

Después de la vacunación de un animal a un OMP de Hístophilus somni mediante los métodos y composiciones de la presente invención, puede utilizarse cualquier ensayo de unión conocido en la técnica para evaluar la unión entre el anticuerpo y la molécula resultante en particular. Estos ensayos también se pueden realizar para seleccionar anticuerpos que presentan una mayor afinidad o especificidad para el antigeno en particular.

DETECCIÓN Y MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Los anticuerpos, o porciones de unión de los mismos, resultantes de la utilización de péptidos de Hístophilus somni de OMP de la presente invención, son útiles para detectar en una muestra la presencia de bacterias Histophilus somni. Este método de detección comprende las etapas de proveer un anticuerpo aislado o parte de unión del mismo producido contra un péptido de Histophilus somni de OMP de la invención, agregando al anticuerpo aislado o a la porción de unión del mismo una muestra sospechosa de contener una cantidad de Histophilus somni , y detectar la presencia de un complejo que comprende el anticuerpo aislado o porción de unión del mismo unido a Histophilus somni.

Los anticuerpos o porciones de unión de los mismos de la presente invención también son útiles para detectar en una muestra la presencia de un péptido de Histophilus somni. Este método de detección comprende las etapas de proveer un anticuerpo aislado o parte de unión del mismo contra un péptido de Histophilus somni, añadir al anticuerpo aislado o porción de unión del mismo una muestra sospechosa de contener una cantidad del péptido de Histophilus somni, y detectar la presencia de un complejo que comprende el anticuerpo aislado o la porción de unión del mismo unido al péptido de Histophilus somni.

Las inmunoglobulinas , en particular (y fragmentos funcionalmente activos de los mismos) que se unen a una molécula especifica que es un miembro de un par de unión pueden utilizarse para diagnósticos y pronósticos, como se describe en la presente. En diversas formas de forma de realización, la presente invención provee la medición de un miembro del par de unión, y los usos de tales mediciones en aplicaciones clínicas. Las inmunoglobulinas en la presente invención pueden ser utilizadas, por ejemplo, en la detección de un antígeno en una muestra biológica mediante el cual los sujetos pueden ser sometidos a ensayo para establecer niveles aberrantes de la molécula a la que la inmunoglobulina se une, y/o la presencia de formas anormales de tales moléculas. Mediante la expresión "niveles aberrantes" se entiende aumentado o disminuido con relación a la presente, o un nivel estándar que representa que presente, en una muestra análoga a partir de una porción del cuerpo o de un sujeto que no tiene la enfermedad. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser incluidos como un reactivo en un kit para su uso en una técnica de diagnóstico o pronóstico.

En un aspecto, es posible utilizar un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecificamente a un péptido de Histophilus somni para diagnosticar, pronosticar o seleccionar sistemáticamente una infección por Histophilus somni.

En otro aspecto, .la invención provee un método para diagnosticar o seleccionar la presencia de una infección por Histophilus somni o la inmunidad a la misma, gue comprende medir en un sujeto el nivel de unión inmunoespecifica de un anticuerpo con respecto a una muestra derivada del sujeto, en donde el anticuerpo se une inmunoespecificamente a un péptido de Histophilus somni en donde un aumento en el nivel de dicha unión inmunoespecifica, referido al nivel de dicha unión inmunoespecifica en una muestra análoga procedente de un sujeto que no tiene el agente de enfermedad infecciosa, indica la presencia de Histophilus somni .

Los ejemplos de ensayos adecuados para detectar la presencia de péptidos de Histophilus somni o los antagonistas de los mismos incluyen, pero no se limitan a ELISA, radioinmunoensayo, ensayo de reacción por precipitación en gel de difusión, ensayo de inmunodifusión, ensayo de aglutinación, inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de proLeina A, o ensayo de inmuno electrofóresis .

Los inmunoensayos para la molécula en particular comprenderán típicamente incubar una muestra, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién cosechadas, o Usados de células cultivadas, en presencia de un anticuerpo etiquetado de forma detectable, y detectar el anticuerpo unido mediante cualquiera de entre un número de técnicas bien conocidas en la técnica.

La actividad de unión de un anticuerpo dado puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación de rutina.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a kits de diagnóstico para la detección o medición de Histophilus somni. Se proveen kits para uso de diagnóstico, que comprenden en uno o más contenedores un anticuerpo péptido anti Histophilus somni, y, opcionalmente, un compañero de unión etiquetado al anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo péptido de Histophilus somni de O P se pueden etiquetar (con un marcador detectable, por ejemplo, una parte quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radioactivo) . En consecuencia, la presente invención provee un kit de diagnóstico que comprende, un anticuerpo péptido de Histophilus somni de OMP y una inmunoglobulina de control. En una forma de realización especifica, uno de los compuestos anteriores del recipiente puede estar etiquetado de manera detectable. Un kit puede opcionalmente comprender en un recipiente una cantidad predeterminada de un péptido de Histophilus somni de OMP reconocido por el anticuerpo del kit, para su uso como un estándar o control.

ADMINISTRACIÓN A UN SUJETO Las rutas de administración preferidas incluyen pero no se limitan a intranasal, intradérmica, oral, e intramuscular. La administración en el agua potable, lo con mayor preferencia en una dosis única, es deseable. El experto en la técnica reconocerá que las composiciones de la invención también se pueden administrar en una, dos o más dosis, asi como también por otras vías de administración. Por ejemplo, dichas otras rutas incluyen subcutánea, intracutánea, intravenosa, intravascular, intraarterial , intraperitoneal , intratecal, intratraqueal , intracutánea , intracardial , intralobal, intraraedulasr , intrapulmonar, e intravaginal . En función de la duración deseada y de la eficacia del tratamiento, las composiciones según la invención pueden ser administradas una vez o varias veces, también de forma intermitente, por ejemplo sobre una base diaria durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosificaciones.

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar las formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la técnica han de tener presente que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben, a la luz de la presente divulgación, tener en cuenta que es posible efectuar muchos cambios en las formas de realización específicas que se describen y aún así obtener un resultado igual o similar, sin apartarse del espíritu y alcances de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Desarrollo de un modelo de exposición respiratoria en terneros CDs A. Objetivo A efectos de evaluar cualquier vacuna prototipo, se necesitaba un modelo de exposición satisfactorio y coherente para demostrar que la enfermedad correcta se manifiesta en los animales no tratados. La mayor parte de la literatura publicada y el trabajo previo de la BIVI Research and Development Lab ha atizado el Aislado 5166, provisto por la Universidad de California - San Diego (UCSD) con fines de exponer, pero esto ha producido resultados inconsistentes. En un esfuerzo para desarrollar un modelo más consistente, se utilizaron cepas más recientemente adquiridas en comparación con el Aislado 5166 para establecer cuál proveerá suficientes signos clínicos, patología pulmonar y mortalidad para servir en la labor adicional para evaluar prototipos de vacunas. De acuerdo con la literatura anterior, unas infecciones de tipo salvaje que permanecen sin tratamiento en el campo han resultado en un promedio de afectación pulmonar del 15% (Griffin 2009) . Esta medida se utilizó para determinar el éxito del modelo de exposición.

B. Materiales y Métodos AISLADOS BACTERIANOS Se obtuvo aislado 5166 de UCSD para el uso como un control. Los aislados 35576 (obtenidos de la Iowa State University Veterinary Diagnóstics Lab - ISUVDL) , LgDl-TN08 (PTA-12756), y Lg2-O 08 (PTA-12755) fueron recuperados de casos de campo con un diagnóstico de neumonía bacteriana.

Todos los preparados de aislados se prepararon y almacenaron en Cryobeads (Copan Diagnóstics ) . El crecimiento fue completado mediante la utilización de un bucle estéril de 10 yL para untar las perlas en placas Columbia Blood Agar (CBA por sus siglas en ingles) que contenían 5% de sangre de oveja (Remel) y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C con CO2 al 10%. Se seleccionaron colonias individuales de estas placas y se untaron sobre placas CBA nuevas para el crecimiento de césped y se incubaron de nuevo durante 24 horas. Los céspedes bacterianos se recogieron en 1.0 mL de fosfato estéril de solución salina tamponada (PBS - Gibco) y se utilizaron 300 ]iL para inocular CBA en matraces T-150 (Corning) y se propagó mediante el uso de perlas de vidrio estériles. Los vasos más grandes se incubaron de nuevo a 37 0 C con C02 al 10% y después se recogieron en el día de la exposición a las dieciocho horas de crecimiento mediante la utilización de las perlas de vidrio para desalojar el cultivo en 6,0 mi de RPMI-1640 (Hyclone) que contenía suero bovino fetal al 5 % (FBS-SAFC) por frasco. El trabajo previo ha demostrado que una transmitancia del 75% a 610 nm se correlaciona con aproximadamente 3.0x10a CFU/ml. Usando esta aproximación, los cultivos se diluyeron en medio RPMI-1640 a una concentración final de l.OxlO9 CFU/mL.

Terneros Sesenta y siete terneros Holstein privados de calostro, que dieron resultados negativos para la infección persistente por el virus de la diarrea viral bovina (BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus), mediante muesca en oreja, Mycoplasma bovis por q-PCR de hisopos nasales, y que no habían recibido ninguna vacuna H. somni, fueron provistos por Dykstra Dairy (Struble, IA) . Todos los terneros fueron determinados por el veterinario a cargo de las instalaciones de la granja de investigación de BiVi en Sioux Center, IA, como en buen estado de salud antes del inicio del estudio. En el momento de la exposición, las edades de los terneros variaban entre 55 y 71 días, con una media de 59 días. Los animales fueron alimentados con una ración diaria adecuada para su edad y peso de acuerdo a los procedimientos de instalación. El agua estaba disponible ad libitum por medio de contenedores de goma disponibles para cada corral. Los terneros se asignaron aleatoriamente a cada uno de cinco grupos y fueron asignados aleatoriamente a un corral individual, dispuestos en bloques de diez.

EXPOSICIÓN Los animales de control estricto fueron sacrificados bajo eutanasia y sometidos a necropsia antes de la exposición para garantizar la ausencia de patología respiratoria desde la fuente. A otros animales de control se les administraron dosis 2x20.0 mi de RPMI 1640 que contenia FBS al 5% por vía intratraqueal a través de endoscopio sin Histophilus somni. Para todos los animales de experimentación, 20.0 mi de Histophilus somni cosechado a partir del aislado asignado se diluyó a razón de 1,0x10s CFU/ml y se administró a cada ternero por vía intratraqueal al nivel de la primera bifurcación mediante endoscopio para una dosis de exposición total estimada de 2.0 x 1010 CFU. Esto fue seguido por un lavado de 20.0 mi con medio RPMI-1640 que contenia FBS al 5%.

OBSERVACIONES CLÍNICAS Los signos clínicos y las temperaturas rectales fueron observados diariamente durante siete días después de la exposición. Si bien se observaron todos los sistemas corporales, se prestó especial atención a los signos de estrés respiratorio. Los animales que mostraron signos de dificultad respiratoria grave, imposibilidad no pudieron mantenerse de pie, o no podían llegar a los alimentos y/o agua sin ayuda, fueron sacrificados por razones humanitarias, y se efectuó la necropsia. Todos los animales restantes se sacrificaron y se practicó la necropsia a los siete días después de la exposición. En el momento de la necropsia, el veterinario a cargo registró la patología general y el porcentaje de patología pulmonar en cada lóbulo pulmonar. Se reunieron muestras de pulmón consistentes en tejido de la margen de la lesión y tejido bueno. Se recogieron dos muestras por ternero y se almacenó sobre hielo hasta el momento de la entrega al laboratorio para su análisis. Una muestra adicional de cada ternero fue fijado en formalina al 10 % para el examen histopatológico . RECUPERACIÓN BACTERIANA Se chamuscó tejido con un soplete de propano y luego se cortó asépticamente para dejar al descubierto una superficie interior. Un hisopo seco se insertó en el tejido y se hizo rotar con recoger muestra. El hisopo se sumergió en 5 mi de caldo BHI suplementado con tampón Tris y monofosfato de tiamina como se sugiere por Asmussen y Baugh (1981). Los tubos de caldo se incubaron durante 24-72 horas a 37 ° C. bajo agitación 130 rpm. El segundo conjunto de tejido se almacenó a-70 °C. Después de la incubación, los cultivos de caldo se calificaron como positivo o negativo en cuanto al crecimiento, en base a la turbidez en comparación con los tubos de control positivo y negativo. PCR Para verificar la presencia de Histophilus somni dentro de las cultivos de pulmones infectados, se tomó una muestra de 50 µ?, de cada caldo de cultivo y se sometió a extracción de ADN (Qiagen kit de ADN) y se ensayó para establecer la presencia de ADN de Histophilus somni mediante q-PCR. Los cebadores utilizados fueron especies de Histophilus somni especificas para secuencias dentro de 16S ADNr- cebador directo (5 ' -GAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3 ' ) y cebador inverso ( 5 ' -TTCGGGCACC AAGTRTTCA-3 ' ) (Angen et al. 1998) . Se llevó a cabo la PCR en un formato de 96 cavidades en volúmenes de 25 ul para lo cual se utiliza un termociclador CFX-96 (Bio-Rad) con Bio-Rad Master ix, 0.4 ug/uL albúmina de suero bovino (BSA) , y un conjunto de cebadores de control en proceso para verificar la validez de la reacción en cada cavidad. Una curva estándar de ADN de Histophilus somni se llevó a cabo en cada placa. Una etapa de activación inicial a 95.0 °C durante cinco minutos se llevó a cabo, seguido por cuarenta y cinco ciclos de desnaturalización a 95.0 °C durante quince segundos y una etapa de recocido/alargamiento paso a 60.0 °C durante treinta segundos con una captura en tiempo real de la fluorescencia de la sonda en el extremo de cada ciclo. Los datos se capturaron y analizaron usando el software Bio-Rad CFX. Las muestras se ensayaron por duplicado y se comparó el ciclo umbral medio (Ct) con el Standard ara determinar si cada muestra fue positiva o negativa. En el caso de que una muestra tenia una cavidad positiva y una cavidad negativa, la muestra se volvió a pasar por triplicado, determinándose el carácter positivo, el cual resultado se representó en más del 50% de las cavidades ensayadas.

HISTOPATOLOGÍA Unas muestras de pulmón fijados en formalina al 10% fueron transportadas a la ISU-VDL en Ames, IA para su examen histopatológico . Se utilizó un sistema de puntuación de 0-4. Una puntuación de 0 indica ausencia de lesiones microscópicas, 1 indica lesiones leves o focales, 2 designa lesiones moderadas o multifocales , 3 designa graves lesiones microscópicas o difusas, y 4 designa lesiones microscópicas graves y difusas.

RESULTADOS Todos los grupos expuestos mostraron un aumento detectable de la media de las temperaturas rectales en comparación con el grupo de control durante el curso del estudio. El aislado 5166 fue el más rápido en llegar a una temperatura máxima en el Dia 1; sin embargo el aislado 35576 logró la máxima temperatura rectal observada en el Dia 2. Las temperaturas rectales de los grupos expuestos a cada aislado mostraron una disminución en el promedio con respecto a una temperatura pico en el 1 Dia 1 o 2. Al comparar las temperaturas rectales observadas entre los grupos, solamente el Aislado 35576 mostró un aumento significativo de la temperatura por arriba de los de los otros aislados (p = 0.004). Las temperaturas rectales medias en el transcurso del periodo de exposición se resumen en la Figura 1.

Los signos clínicos como la depresión, disminución del apetito, respiración rápida, dificultad para respirar, cabeza baja, la renuencia a moverse, descarga ocular y nasal, se observaron en todos los animales expuestos. Los signos fueron más graves y más frecuentes en el Día 1 a Día 3 después de la exposición. El número más grave y más elevado de síntomas se observó en el Grupo 2 (Aislado Lg2-OK08) donde once de los quince animales fueron encontrados muertos o fueron sacrificados por razones humanitarias en el Día 3. La mortalidad se resume en la Tabla 1.

El cultivo bacteriano y el posterior análisis q-PCR mostraron una alta tasa de recuperación de los pulmones de todos los grupos expuestos. El Grupo 2 (Lg2-OK08) produjo un solo animal del que no se observó PCR positivo de los cultivos de tejidos de pulmón.

La patología pulmonar total se midió en la necropsia de cada animal. Se observó una consolidación pulmonar con hepatización en el intervalo de rojo al gris a amarillo. Las lesiones siguieron el árbol bronquial. También se vieron rótulos de fibrina con adherencias a la caja torácica, con exceso de líquido en la cavidad torácica y en el saco pericárdico de algunos animales. Algunos de los animales tenían pleuresía también. El Grupo 2 (Lg2-OK08) produjo 36.89% + 8.64% (a = 0.1) de afectación pulmonar total. El Grupo 1 (5166) produjo 22.16% + 7.66% (a = 0.1) de afectación pulmonar total. Esta diferencia es estadísticamente significativa (p = 0.08). La patología de pulmón se resume en la Figura 2.

Los tejidos pulmonares recibieron evaluaciones relacionadas con la gravedad de las lesiones (escala 0-4) y de si las observaciones eran compatibles con neumonía bacteriana. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos, pero una causación exitosa de neumonía por exposición con cada aislado, es compatible. Las puntuaciones de gravedad del examen histopatológico se resumen en la Tabla 2.

Tabla 1: Mortalidad según grupo de tratamiento *E1 aislado Lg2-OK08 produjo una mortalidad significativamente más elevada (p=0.01) que 5166 **aislado 35576 produjo una mortalidad significativamente más elevada (p=0.02) que 5166 La mortalidad se informa como el número de muertes en cada grupo en cada dia que tales hechos fueron observados. Los porcentajes representan la proporción del grupo de tratamiento afectado. Ninguno de los animales murió entre la mañana del dia 3 y la necropsia final del dia 7.

C. Conclusión El propósito de este estudio fue determinar si los aislados Lg2-OK08, LgDl-TN08, y 35576 se podrían utilizar en un modelo de exposición exitoso en comparación con el Aislado 5166 anteriormente utilizado. El aislado Lg2-OK08 superó el aislado original 5166 en la producción de las manifestaciones clínicas de la enfermedad que incluyen una temperatura rectal media equivalente durante el transcurso del estudio, con un pico de temperatura mayor en el Día 2, los signos clínicos más visibles, la mortalidad significativamente mayor, y un porcentaje de lesión pulmonar significativamente mayor en este experimento. El aislado Lg2-OK08 también produjo resultados más consistentes que cualquiera de las otras cepas aisladas analizadas (LgDl-TN08 o 35576) . Si bien todos los aislados probados producían neumonía bacteriana y se mostraban la patología pulmonar deseada (> 15%) prevista por el modelo, el Aislado Lg2-OK08 parece mostrar la mayor virulencia en comparación con los otros aislados. Dado que este aislado produjo una patogénesis adecuada de manera consistente en el grupo de tratamiento y puede reflejar con mayor precisión las infecciones respiratorias de tipo salvaje actuales debido a su aislación más reciente; se utilizó Lg2-OK08 para seguir trabajando como un organismo de exposición .

Tabla 2: Puntajes de gravedad del examen histopatológico Las puntuaciones de gravedad se asignaron sobre la base de la evaluación de los técnicos de la ISU-VDL. El porcentaje indica la proporción del grupo de tratamiento que muestra una gravedad dada de lesiones microscópicas. Puntaje: 0 = sin lesiones microscópicas 1 = Lesiones leves o focal 2 = Lesiones moderadas o multifocal 3 = Lesiones graves o difusas 4 = Lesiones graves y difusas EJEMPLO 2: Evaluación de la estrategia en un modelo de ternero CD A. OBJETIVO El objetivo de este estudio fue el de evaluar la eficacia de diversos prototipos de vacunas que representan tecnologías de vacunas actualmente disponibles contra el modelo de exposición respiratoria descrita en el Ejemplo 1. Las vacunas investigadas en este estudio incluyeron una bacterina muertos, dos mutantes in vivo modificado con supresiones en los genes de la formación de biopellculas, y un extracto de OMP bruto obtenido por extracción de sarcosilo. El éxito de la exposición respiratoria se midió de nuevo contra la patología pulmonar observada en los estudios de campo con la confirmación de la recuperación bacteriana, PCR específico para Histophilus somni, y examen histopatológico de lesiones microscópicas. La eficacia de las vacunas se evaluó en base a la reducción de la patología pulmonar en comparación con los controles no vacunados .

B. Materiales y métodos AISLADOS BACTERIANOS Se utilizó aislado Lg2-OK08 de histeria monocytogenes (PTA-12755) 0172] para la extracción de OMP, así como también para la exposición. Dos mutantes de supresión modificado-vivos carentes de determinadas de formación de biopellculas se obtuvieron de Virginia Polytechnic Institute and State University (Vatech) . Se obtuvo un producto bacterina muerto comercialmente disponible para servir como una comparación entre la eficacia de los métodos actualmente disponibles y los prototipos. El cultivo del Aislado Lg2-OK08 para la extracción de OMP se describe en el siguiente capitulo. El cultivo de este aislado para la exposición, asi como también el cultivo de los aislados de vacuna modificado-vivo se llevó a cabo de forma idéntica al método descrito para el Ejemplo 1.

EXTRACCIÓN DE OMP Los métodos para la extracción de OMP fueron modificados a partir de los métodos descritos por Bollag et al. (1996) and Rehm (2006). El aislado Lg2-OK08 (PTA-12755) almacenado en Cryobeads (Copan Diagnóstics) fue aplicado a placas de CBA que contienen sangre de ternero al 5% (Remel) y se incubaron a 37 ° C con CO2 al 10% durante veinticuatro horas. Las colonias se transfirieron seguidamente a 10 mi de un medio caldo propiedad (BIVI por sus siglas en ingles) suplementado con FBS (SAFC por sus siglas en ingles), extracto de levadura (BIVI por sus siglas en ingles) y dextrosa (BIVIpor sus siglas en ingles) en un tubo de 50 mi cónico (Corning) . El caldo se incubó a 37 °C con agitación a 130 rpm durante veinticuatro horas. Turbidez coherente con crecimiento típico de Histophilus somni se verificó midiendo la densidad óptica (DO) a 610 nm usando un espectrofotómetro y 1.5 mi de este cultivo inicial se inoculó en 1.5 L de medio fresco en un matraz de agitación de 2.8 litros. Los cultivos más grandes se incubaron a 37 ° C con agitación a 130 rpm durante dieciocho horas. Las bacterias se recogieron por centrifugación del cultivo a 10.000 x g durante diez minutos. Las células recogidas se resuspendieron a una concentración 10 x en tampón 10 mM de ácido 4- (2-hidroxietil ) -1-piperazinetansulfónico (HEPES por sus siglas en ingles) (Sigma) que contenia inhibidores de proteasa (Sigma) . Los pellets resuspendidos se sometieron seguidamente a tres ciclos de congelación y descongelación para comenzar la lisis celular. Después de la tercera descongelación, los cultivos se sometieron a lisis celular mediante tres rondas de sonicación para lo cual se utiliza un cuerno de copa con ráfagas de 0.5 segundos en toda su amplitud durante un minuto. Los Usados celulares se centrifugaron a 17.000 x G durante veinte minutos para eliminar los desechos celulares. El material sobrenadante resultante se centrifugó a 100.000 x g a 4 °C durante una hora para pelletizarlas proteínas ligadas a membrana de los pellets. Los pellets de esta centrifugación fueron resuspendidos con una concentración 10 X en HEPES con inhibidores de proteasa (Sigma) y después se trataron con sarcosilo al 2.0 % (Sigma) durante treinta minutos a temperatura ambiente para solubilizar los componentes no proteicos. La suspensión tratada se centrifugó de nuevo a 100.000 x g a 4 °C durante una hora para pelletizar las proteínas. Los pellets resultantes se resuspendieron en HEPES 10 mM y se diluyeron con una concentración final de 1.0 mg/mL como se muestra mediante el kit de ensayo de proteína total BCA (Thermo) .

El proceso de extracción demostró ser menos eficiente de lo esperado en la cantidad total de proteína producida; se observó también que gran parte de la proteína del tratamiento final quedó en la fracción soluble. Western Blot de estos preparados mediante suero de terneros que habían recibido una vacuna de bacterina muerta, indicaron que los perfiles de proteínas de estas dos fracciones fue casi idénticos. Con el fin de proveer suficiente material para la vacunación, tanto las fracciones solubles como las insolubles procedentes del tratamiento con sarcosilo se utilizaron en esta vacunación.

TERNEROS Setenta terneros Holstein privados de calostro, que dieron resultados negativos para la infección persistente por el virus mediante muesca en oreja, Mycoplasma bovis por q-PCR de hisopos nasales, y que no habían recibido ninguna vacuna anterior H. somni, fueron provistos por J & R Livestock (Iowa) . La edad de los terneros variaba entre 41 y 51 días en el momento de la primera vacuna, con una edad media de 90 días en la exposición. Todos los terneros fueron determinados por el veterinario a cargo de las instalaciones de la granja de investigación de BIVI en Cosby, MO, como en buen estado de salud antes del inicio del estudio. Los animales fueron alimentados con una ración diaria adecuada para su edad y peso de acuerdo a los procedimientos de instalación. El agua estaba disponible ad libitum por medio de contenedores de goma disponibles para cada corral. Los terneros se asignaron aleatoriamente a cada uno de cinco grupos y se asignaron cajas individuales en bloques de acuerdo con el tratamiento. A los animales de control se les asignados cajas en todo lo posible para las vacunas vivas modificadas para la fase de vacunación del estudio. Además de la duración de la vacunación, los animales fueron atendidos siempre en el mismo orden: controles, vacunas con bacterina, vacunas con OMP, y seguidamente vacunas vivas modificadas .

VACUNACIÓN Y EXPOSICIONES Se administraron vacunas en el Día 0 del estudio y luego se dieron reforzadores tres semanas después, el día 21. Alos animales de exposición se leas administró PBS solo. Las vacunados con bacterina recibieron 2.0 mi de bacterina de dosis por vía subcutánea (SQ) como se sugiere en la etiqueta del fabricante. Los vacunados OMP recibieron 400 ]iq de material OMP por dosis SQ en Adyuvante Incompleto de Freund (Sigma) . Los vacunados con modificado vivo recibieron dosis de 2.0 mL a través de dos vias o rutas diferentes (SQ e internasalmente - IN) , con una dosis estimada de l.OxlO9 CFU/dosis.

En el Dia 41 (un día antes de la exposición) los animales fueron asignados aleatoriamente a nuevos corrales para actuar como un factor de estrés. En el dia 42 los animales fueron expuestos a l.OxlO10 CFU de Aislado Lg2- OK08 diluido en RPMI-1640 que contenía FBS al 5% en un método idéntico al del estudio anterior. Todas las observaciones después de la exposición, las muestras recogidas, métodos de ensayo y puntos de finalización humanas fueron idénticos a los descritos en el Ejemplo 1. La vacunación y el programa de exposición se han resumido en la Tabla 3.

Tabla 3: Diseño experimental somni 1.00x1 Lg2- 010 OK08L CFU/do g2- sis OK08 seguid o por 20. OmL RPMI 1640 lavado La vacunación tuvo lugar el día 0 y el dia 21 del estudio. La exposición tuvo lugar el día 42 OBSERVACIONES CLÍNICAS Los signos clínicos y las temperaturas rectales fueron observados diariamente durante siete días después de la exposición. Aunque todos los sistemas del cuerpo se observaron, se prestó especial atención a los signos de estrés respiratorio. Los animales que mostraron signos de dificultad respiratoria grave, imposibilidad para mantenerse de pie, o que podían llegar a los alimentos y/o agua sin ayuda fueron sacrificados por razones humanitarias y sometidos a necropsia. Todos los animales restantes se sacrificaron y se les practicó la necropsia a los siete días después de la exposición. En el momento de la necropsia, el veterinario a cargo registró la patología general y el porcentaje de lesiones presente en cada lóbulo pulmonar. Se recolectaron muestras de pulmón consistentes en tejido de la margen del tejido de la lesión y tejido bueno. Se recogieron dos muestras por ternero y se almacenó en hielo hasta el momento de la entrega al laboratorio para su análisis. Una muestra adicional de cada ternero fue fijada en formalina al 10% para el examen histopatológico . RECUPERACIÓN BACTERIANA Se recuperaron hisopos de tejido pulmonar para la detección de bacterias. En un método idéntico al Estudio 1, el tejido pulmonar se chamuscó sobre una llama abierta, se trasladó a una campana estéril, y se hizo una incisión de manera tal que la superficie interior del tejido podía ser hisopeada asépticamente. Estos hisopos fueron luego transferidos a medio de cultivo. Debido a la falta de turbidez observada después de la incubación, una segunda muestra de tejido pulmonar, que había sido almacenada a -70 C. Se descongeló posteriormente. Se repitió el procedimiento anterior desde el Estudio 1, y se utilizó un segundo hisopo para untar placas de Columbia Blood Agar (CBA) con sangre de oveja al 5% (Remel) . También se retuvo el segundo hisopo para PCR directo. Las muestras de cada caldo de cultivo, placa de agar, y los hisopos de la segunda serie de pruebas fueron también sometidas, cada uno de ellos, a la extracción de ADN y análisis de PCR.

PCR Para verificar la presencia de Histophilus somni dentro de los cultivos de pulmones infectados, una muestra de 50 yL fue tomada de cada caldo de cultivo y se sometió a extracción de ADN (Qiagen kit de ADN) y se ensayó para establecer la presencia de ADN de Histophilus somni mediante q-PCR usando cebadores específicos para el gen 16S de Histophilus somni como se describe para el Estudio 1. Se llevó a cabo el PCR en un formato de 96 cavidades en volúmenes de 25 yL para lo cual se utiliza un termociclador CFX-96 (Bio-Rad) con Bio-Rad Master Mix, 0.4 yg/yL de albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas en ingles), y un conjunto de cebadores para control en proceso, para verificar la validez de la reacción en cada cavidad. Una curva estándar de ADN de Histophilus somni se llevó a cabo en cada placa. Se llevó a cabo una etapa de activación inicial a 95.0 °C durante cinco minutos, seguido por cuarenta y cinco ciclos de desnaturalización a 95.0 °C durante quince segundos y la etapa de recocido/alargamiento paso a 60.0 °C durante treinta segundos con una captura en tiempo real de la fluorescencia de la sonda al final de cada ciclo. Los datos se capturaron y analizaron usando el software Bio-Rad CFX. Las muestras se ensayaron por duplicado, y se comparó el ciclo umbral medio (Ct) con el estándar para determinar si cada muestra era positiva o negativa. En el caso en que una muestra tenía una cavidad positiva y una negativa, la muestra se volvía a pasar por triplicado con la determinación final del carácter positivo el cual resultado fue representado en > 50% de las cavidades ensayadas.

HISTOPATOLOGÍA Unas muestras de pulmón fijados en formalina al 10% fueron transportados a la ISU-VDL en Ames, IA para su examen histopatológico . Un sistema de puntuación de 0-4 se utilizó. Una puntuación de 0 indica ausencia de lesiones microscópicas, 1 indica lesiones leves o focales, 2 designa lesiones moderadas o multifocales , 3 designa graves lesiones microscópicas o difusa, y 4 designa lesiones microscópicas graves y difusas.

RESULTADOS Las temperaturas rectales para todos los grupos aumentó en aproximadamente tres grados en el día después de la exposición. El grupo vacunado con bacterina mostró la temperatura promedia más elevada, si bien los animales vacunados con mutante 1 tenían la temperatura media más baja. No hubo una reducción significativa en la temperatura rectal con cualquiera de las vacunas. Las temperaturas rectales se resumen en la Figura 3.

En trabajos anteriores los cultivos de caldo de hisopos de pulmón se volvieron turbios después de 24-72 horas de incubación. En el estudio actual, esta turbidez no se observó, lo que indica una falta de recuperación de bacterias viables a partir de los tejidos pulmonares. Nuevamente, el segundo conjunto de cultivos de caldo no mostró turbidez después de 72 horas de incubación a 37 °C con agitación a 130 rpm. Sin embargo, las placas de CBA presentaban colonias típicas de Histophílus somni después de 24 horas de incubación a 37 °C con C02 al 10% sin crecimiento aparente de cualquier organismos no Histophílus somni. Como se describe en la Tabla 4, el análisis de PCR para cada uno de los siguientes: cultivos de caldo, las colonias recubiertas, y frotis directo, todos indicaron la presencia de Histophílus somni.

Tabla 4: Detección de H. somni a partir de animales expuestos Los porcentajes indican la proporción de cada grupo que proveyó una detección exitosa de Histophilus somni por q-PCR específica para el gen 16S rRNA. Ni el cultivo de caldo fresco, ni el caldo de cultivo congelados produjo turbidez que indicarían un crecimiento exitoso de Histophilus somni como se ha visto anteriormente con regularidad, sin embargo PCR confirma detectable, si no es viable, los organismos y los cultivos plateados indican que no había otras bacterias contaminantes presentes.

Los signos clínicos observados incluyen depresión, disminución del apetito, respiración rápida y/o dificultosa, tos, secreción nasal, escalofríos e hinchazón en la zona de la inyección de vacunas. Los signos clínicos de todos los grupos se mantuvo durante el período de exposición, sin embargo los vacunados OMP se quedaron con sólo una tos menos 5 días después de la exposición. El tratamiento con las vacunas de OMP resultó en una disminución significativa en la incidencia observada de depresión (p = 0.06), la reducción en el número de días- con una disminución del apetito (p = 0.02), la reducción de la secreción nasal (p = 0.03), y una reducción en el número total de signos clínicos observados (p = 0.05) en comparación con el grupo de control. La vacuna de Mutante 1 fue el único tratamiento probado que no redujo la incidencia de la respiración trabajosa ni redujo la secreción nasal.

Cinco animales en el grupo de control murieron antes del final del periodo de exposición. Dos animales en el grupo con bacterina comercial, tres animales en el grupo de mutante 1, y tres animales en el grupo mutante 2 también murieron durante el transcurso del período de exposición. Ninguno de los animales que recibieron la vacuna contra la OMP murió antes de la necropsia, lo que es significativo en comparación con los controles (p = 0.02). La mortalidad se resume en la Tabla 5.

Tabla 5: Mortalidad por grupo de tratamiento vacuna O P produjo una mortalidad significativamente menor que la del grupo de control (p = 0.02) La mortalidad se informa como el número de muertes en cada grupo en cada día que tales hechos fueron observados. Los porcentajes representan la proporción del grupo de tratamiento afectado.

Si bien ambos aislados mutantes vivos mostraron una disminución en el porcentaje medio de lesiones pulmonares en comparación con el grupo de control de exposición (24.38% para el mutante 1 y 24.47% para el mutante 2), esta diferencia no resultó ser estadísticamente significativa. Sin embargo, el candidato a vacuna OMP produjo un promedio de 13 % de las lesiones pulmonares, lo que es significativo (p = 0.001) en comparación con el 32.47% en el grupo de control. La vacuna de bacterina muerta disponible en el mercado no mostró diferencia en las puntuaciones de lesión (32.10%) en comparación con el grupo de control. La patología de los pulmones se resume en la Figura 4.

El examen histológico fue compatible con neumonía bacteriana. El investigador informó que los septos interlobulares estaban frecuentemente ensanchados/dilatado con edema, células inflamatorias, y trombosis de vasos linfáticos. No se observaron diferencias entre los grupos, y estos datos se utilizaron para fines conformacionales solamente . c . Conclusión La evaluación de la eficacia de las vacunas en cuestión arrojó resultados prometedores para el material de preparación de OMP como un candidato a vacuna; muestra una disminución significativa en el conjunto general de los signos clínicos, la patología pulmonar porcentual, y mortalidad en comparación con el grupo de control. Los candidatos vivos modificados mostraron una tendencia a la reducción de estas variables; sin embargo, no se observó que fuesen significativamente en este estudio. La bacterina, producto disponible en el comercio, no mostró eficacia contra la exposición respiratoria.

La falta de turbidez de los caldos de cultivo bacteriano durante la recuperación bacteriana puede haber sido un artefacto del lote particular de los medios, o de uno de sus componentes. La falta de turbidez no se correlacionaba con la ausencia de Histophilus somni detectable por PCR. El método de cultivo de caldo puede ser abandonado para trabajos ulteriores, ya que el método del hisopo mostró el mismo nivel de recuperación de Histophilus somni además de reducir el tiempo de procesamiento en hasta 72 horas.

Si bien el candidato OMP parece prometedor, hay que señalar que la vacuna OMP se generó a partir del aislado de explosión (BIVI - Lg2-OK08), y el método del sarcosilo para la preparación de OMP no es actualmente transferible a niveles de producción en masa debido al elevado volumen de cultivo necesaria para obtener la cantidad requerida de proteína para la vacunación y el uso de la ultracentrifugación en la extracción de proteínas. Deberían examinarse métodos alternativos de extracción que sean eficientes para la producción (es decir, mayor rendimiento de proteína con una concentración de filtro o menor velocidad de centrifugación) , y de debería examinarse la eficacia de una preparación de OMP heteróloga.

EJEMPLO 3: Eficacia de prototipos de vacunas OMP en base al método de la extracción de proteínas A. Objetivo Habiendo observado en el estudio 2 la eficacia de una preparación de OMP extraído de sarcosilo a partir del aislado (Lg2-OK08), se hizo importante evaluar una preparación de vacuna heteróloga. Los aislados LgDl-TN08 y 156A2 fueron seleccionados para este propósito. El método del sarcosilo para la extracción de OMP utilizado en el Estudio 2 dio como resultado perfiles de proteínas 5 similares para las fracciones solubles e insolubles, lo que indica ineficiencia en el proceso, y proveyó un rendimiento total de proteína más bajo de lo esperado. La eficacia de OMP extraídas para lo cual se utiliza SDS y Tritón X, que a diferencia del método del sarcosilo pueden escalarse a 10 niveles de producción en masa, también fue examinada.

B. Materiales y métodos Aislados bacterianos Para este estudio se utilizaron los aislados de H. somni Lg2-OK08 (PTA-12755), LgDl-TN08 (PTA-12756I ) , y 15 156A2 (BIVI) . El crecimiento en cultivo y la extracción de sarcosilo de los aislados Lg2-OK08 y LgDl TN08-fueron idénticos al método usado en el estudio 2. En ambos aislados se observó de nuevo que el método del sarcosilo produjo una cantidad relativamente pequeña de proteína 20 total, y que la mayor parte de la proteína final permaneció en la fracción soluble de sarcosilo. Ambas fracciones, soluble e insoluble, se utilizaron para la formulación de la vacuna, extracción de SDS, como se describe en la siguiente capítulo, se utilizó para los aislados LgDl-TN08 ? r y Tritón X, para 156A2. El método de SDS se llevó a cabo a una escala de laboratorio para el aislado LgDl-TN08 y los métodos de Triton-X para la producción a escala fueron utilizados para el aislado 156A2, que se utiliza en un producto de vacuna actual.

EXTRACCIÓN DE SDS Un método para Triton-X para extraer proteínas de la membrana exterior mediante filtración por fibra hueca fue señalado a grandes rasgos por la instalación de producción BIVI en Fort Dodge, IA. Brevemente, unos cultivos vivos fueron sometidos a concentración por filtración por fibra hueca (HFF por sus siglas en ingles) con un filtro de corte de 0.2 µp?, se resuspendieron, se trató con Triton-X, y después se llevó de regreso a su volumen original. El antígeno tratado se somete luego a una segunda ronda de HFF con un corte de filtro de 5 kDa y se concentra a la carga de proteína deseada. El antígeno del aislado 156A2 generado en la escala de producción por esta planta se utiliza para vacunar a un grupo.

Se vacunó un segundo grupo con material extraído de SDS del aislado de investigación LgDl-TN08. Para este procedimiento a escala de laboratorio, se prepararon cultivos de caldo de este aislado como se describe para el método de extracción de sarcosilo en el Estudio 2, y se cosechó por centrifugación a 10.000 x g durante diez minutos en lugar de la HFF de 0.2 µ?t?. Los pellets se resuspendieron luego a una concentración de 10 veces en HEPES 10 mM con inhibidores de proteasa (Sigma) . Esta suspensión se incubó seguidamente a 60 ° C durante una hora. Se añadió SDS con una concentración total de 0.04% y se incubó a 41 °C durante treinta minutos. El extracto tratado se centrifugó seguidamente a 9.500 x G durante veinticuatro minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante fue seguidamente devuelto a la concentración IX usando HEPES 10 mM con inhibidor de la proteasa, y se concentró a 20X usando filtración de fibra hueca a través de un filtro de 5 kDa .

Terneros Setenta terneros Holstein privados de calostro, gue dieron resultados negativos para la infección persistente por BVDV mediante muesca en oreja, de M. bovis por q-PCR de hisopos nasales, y que no habían recibido ninguna vacuna de H. so ni, fueron provistos por J & R Livestock (Iowa). La edad de los terneros variaba entre 44 a 54 días en el momento de la primera vacunación, con una edad media de 92 días en la exposición. Todos los terneros fueron determinados por el veterinario a cargo de las instalaciones de la granja de investigación de BIVI en Sioux Center, como en buen estado de salud antes del inicio del estudio. Los animales fueron alimentados con una ración diaria adecuada para su edad y peso de acuerdo a los procedimientos de instalación. El agua estaba disponible ad libitum por medio de contenedores de goma disponibles para cada corral. Los terneros se asignaron aleatoriamente a cada uno de cinco grupos y se asignaron aleatoriamente a un corral, dispuestos en grupos de diez. Un día antes de la exposición todos los terneros fueron reasignados aleatoriamente a un nuevo corral para que actúe como un agente de estrés.

VACUNACIÓN Y EXPOSICIÓN Todos los prototipos de vacuna se formularon en adyuvante incompleto de Freund (Sigma) a una concentración de proteina de 400 µg por dosis. Las vacunas se administraron en inyecciones de 2.0 mi SQ en el dia 0 y en el dia 21, como se hizo para la vacuna OMP en el Estudio 2. Realeatorización de asignación por corrales se produjo el día 41, y la exposición, idéntica a la que se llevó a cabo en el Estudio 2, se llevó a cabo en el día 42. La vacunación y el programa de la exposición se han resumido en la Tabla 6.

OBSERVACIONES CLÍNICAS Los signos clínicos y las temperaturas rectales fueron observados diariamente durante siete días después de la exposición. Aunque todos los sistemas del cuerpo se observaron, se prestó especial atención a los signos de estrés respiratorio. Los animales que mostraron signos de dificultad respiratoria grave, imposibilidad para mantenerse de pie, o que no podían llegar a los alimentos y/o agua sin ayuda fueron sacrificados por razones humanitarias, y se efectuó la necropsia. Todos los animales restantes se sacrificaron y se les practicó la necropsia a los siete días después de la exposición. En el momento de la necropsia, el veterinario a cargo registró la patología general y el porcentaje de lesiones presentes en cada lóbulo de pulmón. Se recolectaron muestras de pulmón consistentes en tejido del margen de la lesión y tejido sano. Se recolectaron dos muestras por ternero, y se las almaceno sobre hielo hasta el momento de su entrega al laboratorio para el ensayo. Una muestra adicional de cada ternero fue fijado en formalina al 10% para el examen histopatológico .

Tabla 6: Diseño Experimental 20. Om L in RPMI 1640 @ Aisla 1. OOx do 1010 Día 0 vivo CFU/d & Día H. Día 42 osis 21 somni seguí Lg2- do OK08 por RPMI 1640 lavad o RECUPERACION BACTERIANA Tal como se hizo en el Ejemplo 2, después de la necropsia unas muestras de pulmón se congelaron a -70 °C y se descongelaron antes de su procesamiento. Las muestras descongeladas se chamuscaron sobre una llama abierta, se las trasladó a un ambiente estéril, se les practicó una incisión, y se pasó un hisopo por la superficie interna. El hisopo se utilizó para untar placas CBA (Remel) que se incubaron durante la noche a 37 ° C con C02 al 10 % para verificar la ausencia de agentes extraños. Los hisopos se sometieron seguidamente a extracción de ADN y PCR para verificar la presencia de Histophilus somn.

PCR Para verificar la presencia de H. somni de hisopos en pulmones infectados, los hisopos fueron sometidos a extracción de ADN (Qiagen kit de ADN) y se ensayó para establecer la presencia de ADN de Histophilus somni mediante q-PCR, para lo cual se utilizaron cebadores específicos para el gen 16S Histophilus somni descritos para el estudio 1. Se llevó a cabo la PCR en un formato de 96 cavidades en volúmenes de 25 \i~L utilizando un termociclador CFX-96 (Bio-Rad) con Bio-Rad Master Mix, 0.4ug/uL albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas en ingles), y un conjunto de cebadores de control en proceso para verificar la validez de la reacción en cada cavidad. Una curva estándar de ADN de Histophilus somni se llevó a cabo en cada placa. Una etapa de activación inicial a 95,0 °C durante cinco minutos se llevó a cabo, seguido por cuarenta y cinco ciclos de desnaturalización a 95.0 °C durante quince segundos y una etapa de recocido/alargamiento a 60.0 °C durante treinta segundos con una captura en tiempo real de la fluorescencia de la sonda en el extremo de cada ciclo. Los datos se capturaron y analizaron usando el software Bio-Rad CFX. Las muestras se ensayaron por duplicado y se comparó el ciclo umbral medio (Ct) con el Standard para determinar si cada muestra fue positiva o negativa. En el caso de que una muestra tenia una cavidad positiva y una cavidad negativa, la muestra se volvió a pasar por triplicado, determinándose el carácter positivo, el cual resultado se representó en más del 50% de las cavidades ensayadas.

HISTOPATOLOGÍA Unas muestras de pulmón fijadas en formalina al 10% fueron transportadas a la ISU-VDL en Ames, IA para su examen histopatológico . Se utilizó un sistema de puntuación de 0-4. Una puntuación de 0 indica ausencia de lesiones microscópicas, 1 indica lesiones leves o focales, 2 designa lesiones moderadas o multifocales , 3 designa graves lesiones microscópicas o difusa, y 4 designa lesiones microscópicas graves y difusas.

RESULTADOS Las temperaturas rectales de todos los grupos aumentó en aproximadamente tres grados en el día después de la exposición (Día 43) . La temperatura pico más elevada se observó en el grupo vacunado con aislado 156A2 extraído de Triton-X, alcanzando aproximadamente 104.0°F un dia después de la exposición. Si bien se observaron diferencias significativas en la temperatura en días individuales para algunos grupos de vacuna en comparación con los controles de la exposición, estas observaciones no parecen ser biológicamente significativos como un indicador de la protección, ya que estas diferencias se observaron entre grupos independientemente de su reducción observada en el porcentaje de la patología pulmonar. Las temperaturas rectales se resumen en la Figura 5.

El estudio anterior indicó que el q-PCR directo de hisopos de tejido pulmonar congelado y descongelado permitiría una detección exitosa de Histophilus somni de estas muestras. El número de muestras que permitan la detección exitosa fue menor en el estudio actual, así como también el número de muestras que proveen Histophilus somni viable para el crecimiento del cultivo. Si bien está más allá del alcance de este estudio determinar la causa de esta observación, puede indicar un aumento en la limpieza de la infección debido a la administración de la vacuna. No se observaron diferencias significativas entre los grupos, pero se observó un mayor nivel de detección y recuperación en grupos que carecían de cualquier eficacia observada de la vacuna. Este parámetro se seguirá examinado en estudios adicionales. La recuperación de histeria monocytogenes se describe en la Tabla 7.

Tabla 7: Detección de Histophilus somni en animales que han sido expuestos Se registraron los signos clínicos empezando el día después de exposición, e incluya depresión, disminución del apetito, respiración rápida y/o respiración, y tos. Se observó una descarga nasal serosa en unos pocos animales, que empezaba tres días después de la exposición. Los signos clínicos de todos los grupos duraron durante el período de exposición. No se observaron diferencias significativas entre los grupos en lo que respecta a cualquier signo individual, o el número total de signos mostrados.

Tres animales del grupo de control murieron antes del final del periodo de exposición. Cuatro animales en el grupo de 156A2, dos animales en la OMP LgDl-TN08 por grupo sarcosilo, y tres animales en el grupo LgDl-TN08 OMP también murieron durante el transcurso del periodo de exposición. Ninguno de los animales que recibió Lg2-OK08 OMP por la vacuna sarcosilo murió antes de la necropsia. Cualquier diferencia en comparación con el grupo de control de la exposición no fue estadísticamente significativa. La mortalidad se resume en la Tabla 8.

Tabla 8: Mortalidad por grupo de tratamiento La mortalidad se indica como la cantidad de muertes en cada grupo en cada día en que tales acontecimientos han tenido lugar. Los porcentajes representan la proporción del grupo de tratamiento afectado .

Las vacunas que consisten en OMP generados por extracción con sarcosilo del Aislado Lg2-OK08 (13.72%, p = 0.045) y Aislado LgDl-TN08 (14.14%, p = 0.037) mostraron una reducción significativa en la patología pulmonar total en comparación con grupo de control de la exposición (28.37%) . La vacuna OMP generado mediante la extracción por SDS del Aislante LgDl TN08 (16.22%, p = 0.114) mostró una tendencia similar en la reducción de la patología promedia de pulmón observada para el grupo. Sin embargo, debido a la variación en las él e grupo, los puntajes de las lesiones no parecieron ser significativamente diferentes del grupo de control de la exposición. El antígeno 156A2 extraído mediante Tritón X 100 (25.36%, p = 0.814) no mostró diferencias en la patología pulmonar en comparación con el grupo de control de la exposición. Los porcentajes de la patología pulmonar se resumen en la Figura 6.

El examen histológico de los tejidos del pulmón era compatible con neumonía bacteriana. La presencia de tapones de las vías respiratorias, edema, pleuritis, necrosis y atelectasia también se informó en los animales en todos los grupos, pero fueron más graves en el grupo de control de la exposición. Se prevé que la presencia de estos hallazgos en grupos vacunados era prevista, ya que las muestras para este examen se tomaron de los márgenes de las lesiones. Esto no da ninguna indicación de patología global observado en los animales individuales y sólo debe tomarse para indicar que la exposición fue de nuevo exitosa .

C. Conclusión Una vacuna de dos dosis con material preparado por extracción con sarcosilo de aislados Histophilus somni sea homologas (Lg2-OK08, p = 0.045) sea heteróloga (LgDl-TN08, p = 0.037) para el aislado de exposición mostró una disminución significativa en la patología pulmonar total en comparación con los animales de control de exposición. El mismo programa de vacunación mismo utilizando una extracción con SDS de aislado heterólogo LgDl-TN08 mostró una disminución similar en patología pulmonar total, pero debido a la variabilidad dentro del grupo no se observó que fuese significativa (p = 0.114) en este estudio. El antígeno 156A2, preparado por extracción con Tritón X, no mostró diferencia en la patología pulmonar total en comparación con el grupo de control (p = 0.814). La patología pulmonar total sigue siendo el parámetro más relevante para la comparación de la eficacia. También hay que señalar que los 400 iq de proteína por dosis utilizada en este estudio están por debajo de los criterios de potencia para la vacuna comercial real en donde se utiliza el antígeno 156A2. El aumento de la concentración de proteína o la utilización de terneros convencionales, inmuno-competentes, podría alterar los resultados observados en este estudio.

Las vacunas derivadas de material extraído mediante sarcosilo han sido formulados para lo cual se utiliza una combinación de pellas insolubles en sarcosilo sí como también materiales sobrenadantes solubles en sarcosilo, dado que los rendimientos de proteína dentro de los pellets como tales han sido insuficientes para la vacunación. El análisis Western blot mostró que en ambas fracciones existen proteínas inmunorreactivas de peso molecular similar. Debería completarse trabajo adicional para mejorar la eficiencia de este proceso en un intento de aumentar el rendimiento de proteína total y para aumentar la cantidad de proteína depositada en los pellets insolubles. Los métodos de sonicación y centrifugación para este método de extracción pueden ser posibles puntos para una mejora.

El método de extracción SDS es más eficiente, pero produce un perfil de proteina diferente cuando son separadas por SDS-PAGE y se someten a análisis Western blot. Si bien pueden observarse bandas similares a la preparación de sarcosilo, son mucho más diluidas en la preparación total y también es posible observar varias otras proteínas de importancia desconocida. Esto puede explicar la disminución observada en la patología pulmonar en los animales que recibieron una vacunación extracto de SDS, y también la variabilidad del éxito dentro del grupo.

Si bien el estudio 2 también mostró una disminución significativa en la depresión observada, respiración dificultosa, el total de los signos clínicos y la mortalidad cuando se utiliza la vacuna de extracción homologa a sarcosilo (Lg2-OK08), esto no se observó en el estudio actual. El grupo que recibió la extracción con sarcosilo de Lg2-OK08 no presentó ninguna mortalidad en el presente estudio, lo cual es consistente con las observaciones anteriores. Todos los otros grupos de estudio mostró una tasa de mortalidad de entre el 14.3% (extracción con sarcosilo de LgDl-TN08) y 26,7% (extracción con Tritón X de 156A2) después de la exposición. Si bien en estos estudios los signos clínicos no son actualmente un parámetro primario, la producción de consistentes signos clínicos y la mortalidad serían beneficios para cualesquiera futuros trabajos de comparación entre vacunas Otros parámetros examinados incluyeron las temperaturas rectales, la recuperación de Histophilus somni mediante cultivos y q-PCR, y una comparación de las reacciones en los sitios de inyección. Ninguno de ellos mostró ninguna diferencia significativa entre los grupos. No es inesperado tener recuperaciones similares y la detección de PCR como el propósito de estas pruebas es la confirmación de la presencia de Histophilus somni en las lesiones, independientemente de la participación de las lesiones en el porcentaje. Si bien la recuperación de Histophilus somni fue menor que la observada en estudios previos, fue menor para todos los grupos, lo que sugiere que el exposición fue consistente entre los grupos. Si bien el estudio 2 indicó que la congelación de las muestras de pulmón frescas no afectó la recuperación de H. somni, es posible que la congelación/descongelación tenido un impacto negativo en la recuperación. Por lo tanto, se recomienda que los futuros estudios utilicen hisopos de pulmones frescos (no congelados) cuando sea posible para la recuperación exitosa de las bacterias del tejido pulmonar. Es importante señalar que mientras que q-PCR se utiliza para la detección, los resultados se han de interpretar cualitativamente en cuanto a la presencia o ausencia, y los valores de Ct no son una medida cuantitativa precisa de la cantidad de bacterias detectadas, ya que el ensayo no ha sido validado.

EJEMPLO 4: Eficacia de las fracciones OMP extraídas mediante los métodos de sarcosilo y de SDS D. Objetivo Las vacunas extraídas mediante sarcosilo continuaron mostrando reducciones significativas en la patología de los lóbulos pulmonares causada por el exposición en el Estudio 3, sin embargo, el proceso de extracción en sí seguía siendo ineficiente. Mediante la modificación de la etapa de sonicación para mejorar la lisis celular y las etapas de centrifugación para mejorar la separación de las fracciones soluble e insoluble, se logró tanto un mayor rendimiento total y una mayor concentración de proteína en la fracción insoluble final. Como la eficacia anterior se había basado en la vacunación que consistía predominantemente de la fracción insoluble, era importante examinar la eficacia de estas fracciones por separado. También el método de extracción por SDS produjo una reducción evidente en las puntuaciones totales de pulmón en el Estudio 3, sin embargo, esto no resultó ser estadísticamente significativo. Se consideró importante volver a ensayar esta vacuna candidata.

E. Materiales y métodos Aislados bacterianos Se utilizó Aislado LgDl-TN08 para preparar todos los prototipos de vacunas para este estudio. El crecimiento en cultivo y el método de extracción por SDS para este aislado eran idénticos a los procedimientos utilizados en el Estudio 3. Los cambios en el método de extracción por sarcosilo para este aislado se describen a continuación. El aislado Lg2-OK08 se utilizó para preparar el material de exposición para este estudio. El crecimiento, cosecha, y la preparación del material de exposición fueron idénticos a los del procedimiento utilizado en todos los estudios anteriores .

EXTRACCIÓN MEDIANTE SARCOSILO El método de extracción por sarcosilo para este estudio se modificó en un intento de aumentar el rendimiento de proteina total, y para aumentar la eficiencia de la separación de las proteínas insolubles en la preparación final. Para aumentar el rendimiento de proteína total, se completó la sonicación usando una sonda insertada directamente en el cultivo en lugar de utilizar la copa de cuerno como se hizo anteriormente. Esto dio lugar a la lisis mejorada de la célula, liberándose más proteínas unidas a la membrana en el material sobrenadante después de la etapa de la centrifugación 17k x G como se confirma mediante el Ensayo BSA Proteína total (Thermo) comparándose las concentraciones de proteina en los materiales sobrenadantes de los dos métodos de preparación (datos no mostrados) . Para mejorar la eficiencia de la separación de la proteina insoluble, todas las etapas que requieren ultracentrifugación se llevaron a cabo aron usando un rotor 70TI de ángulo fijo en lugar de un rotor SW28 de cubeta oscilante que había sido utilizado anteriormente. El rotor de ángulo fijo permitía una a sedimentación más eficiente. Estas dos modificaciones dieron como resultado los efectos deseados. Se obtuvo un rendimiento de proteína suficiente para formulaciones de vacunas separadas utilizándose solamente la fracción insoluble o solamente la fracción soluble en sarcosilo. Una combinación de las dos fracciones se preparó también para permitir la comparación con la preparación de vacuna que se utilizó en los estudios anteriores.

LOS TERNEROS Setenta y ocho terneros privados de calostro, que dieron resultados negativos para la infección persistente por BVDV mediante muesca en oreja, de M.bovis por q-PCR de hisopos nasales, y que no habían recibido ninguna vacuna de H. somni, fueron provistos por J & R Livestock (Iowa) . La edad de los terneros variaba entre 36 y 50 días en el momento de la primera vacunación, con una edad media de 90 días en la exposición. Todos los terneros fueron determinados por el veterinario a cargo de las instalaciones de la granja de investigación de BIVI en Sioux Center IA, como en buen estado de salud antes del inicio del estudio. Los animales fueron alimentados con una ración diaria adecuada para su edad y peso de acuerdo a los procedimientos de instalación. El agua estaba disponible ad libitum por medio de contenedores de goma disponibles para cada corral. Los terneros se asignaron aleatoriamente a cada uno de cinco grupos y se asignaron aleatoriamente a un corral, dispuestos en grupos de a diez. Un día antes de la exposición todos los terneros fueron reasignados aleatoriamente a un nuevo corral para que ello actúe como un agente de estrés.

VACUNACIÓN Y EXPOSICIÓN Las vacunas se administraron en inyecciones de 2.0 mi SQ que contenían 400 µg de proteína total en el día 0 y en el día 21. El grupo de control de exposición recibió inyecciones similares que contienen PBS estéril (Gibco) y adyuvante incompleto de Freund (Sigma) solamente. La exposición ocurrió el Día 42 y consistía de un cultivo fresco de aislado de Histophilus somni Lg2-OK08 diluido en medio RPMI-1640 con FBS al 5% para contener l.OxlO9 CFU/ml administrada por vía intratraqueal a través de endoscopio en un volumen de 20.0 mi, seguido de un lavado de 20,0 mi con medio RPMI-1640 con FBS al 5%. El programa de vacunación y exposición junto con el tamaño del grupo y la dosificación se describe en la Tabla 9.

OBSERVACIONES CLÍNICAS Los signos clínicos y las temperaturas rectales fueron observados diariamente durante siete días después de la exposición. Aunque todos los sistemas del cuerpo se observaron, se prestó especial atención a los signos de estrés respiratorio. Los animales que mostraron signos de dificultad respiratoria grave, imposibilidad para mantenerse de pie, o que no podían llegar a los alimentos y/o agua sin ayuda fueron sacrificados por razones humanitarias, y se efectuó la necropsia. Todos los animales restantes se sacrificaron y se les practicó la necropsia a los siete días después de la exposición. En el momento de la necropsia, el veterinario a cargo registró la patología general y el porcentaje de lesiones presentes en cada lóbulo de pulmón. Se recolectaron muestras de pulmón consistentes en tejido del margen de la lesión y tejido sano. Se recolectaron dos muestras por ternero, y se las almacenó sobre hielo hasta el momento de su entrega al laboratorio para el ensayo. Una muestra adicional de cada ternero fue fijado en formalina al 10% para el examen histopatológico .

Tabla 9: Diseño experimental ?? 2. OmL SQ RECUPERACION BACTERIANA Las muestras de pulmón post-necropsia se almacenaron a 4 ° C hasta que se las pudo procesar. Estas muestras fueron chamuscadas sobre una llama abierta, trasladadas a un ambiente estéril, se les practicó una incisión, y se pasó un hisopo por la superficie interna se limpió. El hisopo se utilizó para untar placas CBA (Remel) que se incubaron durante la noche a 37 0 C con CO2 al 10% para verificar la ausencia de agentes extraños. Los hisopos se sometieron entonces a la extracción de ADN y a PCR para verificar la presencia de Histophilus somni.

PCR Para verificar la presencia de H. somni en los hisopos tomados de pulmones infectados, los hisopos fueron sometidos a extracción de ADN (Qiagen kit de ADN) y se ensayó para establecer la presencia de ADN de Histophilus somni mediante q-PCR, para lo cual se utilizaron cebadores específicos para el gen 16S Histophilus somni descritos para el estudio 1. Se llevó a cabo la PCR en un formato de 96 cavidades en volúmenes de 25 i para lo cual se utiliza un termociclador CFX-96 (Bio-Rad) con Bio-Rad Master Mix, 0.4 ug/uL albúmina de suero bovino (BSA por su siglas en ingles) , y un conjunto de cebadores de control en proceso para verificar la validez de la reacción en cada cavidad. Una curva estándar de ADN de Histophilus somni se llevó a cabo en cada placa. Una etapa de activación inicial a 95.0 °C durante cinco minutos se llevó a cabo, seguido por cuarenta y cinco ciclos de desnaturalización a 95.0 °C durante quince segundos y una etapa de recocido/alargamiento a 60.0 °C durante treinta segundos con una captura en tiempo real de la fluorescencia de la sonda en el extremo de cada ciclo. Los datos se capturaron y analizaron usando el software Bio-Rad CFX. Las muestras se ensayaron por duplicado y se comparó el ciclo umbral medio (Ct) con el Standard para determinar si cada muestra fue positiva o negativa. En el caso de que una muestra tenía una cavidad positiva y una cavidad negativa, la muestra se volvió a pasar por triplicado, determinándose el carácter positivo, el cual resultado se representó en más del 50% de las cavidades ensayadas.

HISTOPATOLOGÍA Unas muestras de pulmón fijados en formalina al 10% fueron evaluadas para su examen histopatológico . Se utilizó un sistema de puntuación de 0-4. Una puntuación de 5 0 indica ausencia de lesiones microscópicas, 1 indica lesiones leves o focales, 2 designa lesiones moderadas o multifocales , 3 designa graves lesiones microscópicas o difusas, y 4 designa lesiones microscópicas graves y difusas . 10 RESULTADOS Nuevamente se observó que las temperaturas rectales de todos los grupos de tratamiento aumentó en aproximadamente tres grados en el dia después de la exposición. Se observó que el grupo de control no vacunado 15 mantuvo la temperatura rectal de mayor promedio a lo largo de la fase de la exposición. Todos los grupos vacunados mostraron una disminución en la temperatura rectal media en el mismo marco de tiempo, sin embargo los grupos vacunados sea con una combinación de fracciones extraídas con 20 sarcosilo, o con un extracto al SDS, eran más pronunciados y constantes en su reducción de temperaturas rectales medias. Las temperaturas rectales observadas se resumen en la Figura 5.

La recuperación de H. somni de tejido pulmonar ? c fresco fue superior a la observada en el estudio anterior, cuando se utilizaron muestras congeladas. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento, aunque la recuperación viable fue mayor en el grupo de control no vacunado. Estas observaciones se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10: detección de H. somni en animales expuestos porcentaje indica la proporción de cada grupo que proveyó una detección exitosa de H. somni por Q-PCR específica para el gen 16S rRNA Tabla 5.3: Mortalidad por grupo de tratamiento La mortalidad se informa como el número de muertes en cada grupo en cada día que tales hechos fueron observados. Los porcentajes representan la proporción del grupo de tratamiento afectado. Ninguno de los animales murió en los días 45, 46 ó 48.

Los signos clínicos comunes observados en los estudios anteriores incluyeron dificultad respiratoria, tos, depresión y anorexia. Para este estudio, estos cuatro parámetros se normalizaron en escalas de 0 a 3 que indican la gravedad del signo en un día dado. El mayor número de los signos clínicos y la gravedad más elevada se observaron en el grupo de control. Debido a la naturaleza ordinal del sistema de puntuación, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

Cuatro animales en el grupo de control murieron antes del final del período de exposición. Un animal en el grupo de pellas con sarcosilo, dos animales en el grupo de combinación de sarcosilo, y un animal del Grupo de SDS también murieron durante el transcurso del período de exposición. Ninguno de los animales que recibieron la vacuna de material sobrenadante de sarcosilo murió antes de la necropsia. Ninguna diferencia en comparación con el grupo de control de exposición fue estadísticamente significativa. La mortalidad se describe en la Tabla 11.

Tabla 11: Mortalidad por grupo de tratamiento La mortalidad se informa como el número de muertes en cada grupo en cada día que tales hechos fueron observados. Los porcentajes representan la proporción del grupo de tratamiento afectado. Ninguno de los animales murió en los días 45, 46 o 48.

El parámetro principal para la comparación de la eficacia de las vacunas para este estudio sigue siendo la patología pulmonar porcentual. Uno de los animales vacunados con la fracción insoluble en sarcosilo demostró carecer de lóbulo craneal derecho. Dado que este lóbulo simplemente no estaba presente debido a una anomalía anatómica, y no podía darse una puntuación total, el animal fue eliminado del análisis. Los controles no vacunados tuvieron una puntuación media de patología pulmonar de 31.02%. Una reducción significativa de la patología pulmonar se logró mediante la vacunación con soluble sobrenadante en sarcosilo (19.70%, p = 0.05), una combinación de sarcosilo soluble e insoluble en sarcosilo (17.08%, p = 0.02), o OMP extraído con SDS (8.60%, p <0.01) . La vacunación con un material pellet insoluble en sarcosilo mostró una ligera disminución en, pero no produjo una reducción significativa en, la patología pulmonar (22.98%, p = 0.11). Estos datos se resumen en la Figura 8.

Nuevamente se sometieron muestras para su examen histopatológico . Los tapones de las vías respiratorias, edema interlobular, necrosis y atelectasia; todo ellos compatibles con neumonía bacteriana, se volvieron a observar en los animales en todos los grupos, sin embargo, demostraron ser más graves en el grupo de control de la exposición, y menos graves en los vacunados con OMP extraído con SDS.

Conclusión Una vacunación de dos dosis de material O P que contenia sea material soluble en sarcosilo sea material insoluble en sarcosilo sea extraído con SDS proveyó una reducción estadísticamente significativa de la patología pulmonar total en comparación con los controles no vacunados. Los animales que solamente recibieron la vacunación con material insoluble en material de sarcosilo, mostraron una disminución en su patología pulmonar total, pero no se encontró que esto fuese estadísticamente significativo.

Ambas, la detección de H. somni por q-PCR y la recuperación de H. somni viable mediante el cultivo de las muestras de pulmón eran más efectivos en el estudio actual, en comparación con el Ejemplo 3.

En este estudio, las muestras de pulmón de este estudio se mantuvieron a 4 C en lugar de ser congeladas antes de los procedimientos de laboratorio. No se observaron diferencias significativas entre los grupos en cuanto a detección o recuperación viable, sin embargo ambas fueron los más grandes en el grupo no vacunado.

Los signos clínicos de enfermedad que incluyen la temperatura rectal, dificultad respiratoria, tos, depresión y anorexia se registraron diariamente durante la fase de exposición del estudio. La vacunación con antígenos extraídos SDS resultó en temperaturas rectales significativamente más bajas a partir del Día 44 (dos días después de la exposición) en comparación con el grupo de control no vacunado, y continuaron a lo largo de la duración del estudio en el día 49. No se observaron otras diferencias significativas entre grupos al comparar la presencia o la gravedad de los signos clínicos observados. Este conjunto de datos indica que ambos métodos, el de la extracción con SDS y el de la extracción con sarcosilo, permiten obtener proteínas que proveen una respuesta inmune eficaz contra una exposición respiratorio con H. somni. La falta de eficacia para la fracción insoluble para sarcosilo indica que algo se conserva en la fracción soluble que es necesario para la eficacia observada en esto, así también como los estudios anteriores. Tanto si se trata de una proteína específica, un componente no proteico de la LOS o el sarcosilo en sí mismo, queda por determinar. Se utilizará el análisis de Western blot para determinar si es posible identificar proteínas inmuno reactivas específicas que sean únicas para sea las fracciones de sarcosilo sea el extracto SDS.

EJEMPLO 5: ELISA serológico para supervisar titulaciones bovinas anti-H. somni A. Objetivo Si bien es importante comparar las puntuaciones finales de patología como el parámetro principal entre los grupos de tratamiento, esto no da ninguna indicación en cuanto a cuál es la respuesta inmune tiene realmente lugar en el animal durante el ciclo de vacunación y exposición. Como se prevé una respuesta de MHCII, la medición de la actividad de IgG sería prudente. Mediante el desarrollo de un ELISA serológico capaz de detectar cambios en la respuesta de anticuerpos a lo largo del tiempo sería posible determinar la importancia de la respuesta humoral en relación a las vacunas administradas.

B. Materiales y Métodos ANTÍGENO DE RECUBRIMIENTO Se ha utilizado el aislado de H. Somni Lg2-OK08 con fines de exposición en los estudios anteriores. Por tanto, es importante tener en cuenta la respuesta de anticuerpos hacia este aislado generado por las vacunas administradas antes de la exposición. Para ello un cultivo de este aislado se cultivó en caldo según se describe anteriormente. La cosecha fue completada por centrifugación a 10.000 x g durante diez minutos, seguido de tres lavados en PBS (Gibco) en los que los pellets fueron devueltos a la concentración de 3 veces en PBS y se centrifugó a 10.000 x g durante diez minutos. Tras el lavado final con PBS, el cultivo se resuspendió con una concentración de 3 veces en HEPES 10 mM con inhibidores de proteasa.

MUESTRAS DE SUERO Se recogió el suero semanalmente de cada animal en los estudios anteriores y se almacenó a 40° C en volúmenes de aproximadamente 2.0 mi por muestra. Las mezclas de suero para cada grupo se generaron mediante la combinación de 100 yL de suero de cada animal en el grupo para cada momento en el tiempo.

ELISA Los experimentos se completaron con muestras de suero supuestamente positivas y negativas (animales de control en el dia 0 para los vacunados negativos, y vacunados Lg2-OK08 Sarcosilo OMP en el dia 41 para positivos) que determinaron las concentraciones de reactivos apropiadas que deben utilizarse. Las concentraciones registradas aseguran que las lecturas de representan datos de la porción lineal de la curva de dilución .

El antigeno de recubrimiento 3X derivado de Lg2-OK08 (preparado como se ha descrito anteriormente) se diluyó en tampón carbonato de recubrimiento (Sigma) a 1:300 y se añadieron a razón de 100 i por cavidad de una placa de micro titulación de 96 cavidades de medio de unión (Greiner) y se incubó a 37 ° C durante dos horas. El antigeno no unido se eliminó por lavado mediante tres lavados de TBS + Tween 20 (BIVI por sus siglas en ingles) para lo cual se utiliza un lavador de placas de micro titulación (Dynex por sus siglas en ingles) . Las áreas no ocupada de las cavidades se bloquearon a continuación mediante la adición de proteina libre 250 pL de tampón de bloqueo (Thermo) y se incubaron a 37 ° C durante una hora seguido por otro paso de lavado. Las mezclas de suero para cada grupo en cada punto de tiempo (Estudios 2 y 3), o de suero de animales individuales (estudio 4) se diluyeron a 1:1.600 en tampón de bloqueo y se añadieron a cavidades por duplicado en la placa en volúmenes de 100 pL y se incubaron durante una horas a 37 ° C seguido por otra etapa de lavado. Un conjugado de conej o-peroxidasa (Jackson Immunolabs) se diluyó a 1:10,000 en tampón de bloqueo, se añadió a razón de 100 pL por cavidad, se incubó a 37 ° C durante cuarenta y cinco minutos, y el exceso fue lavado. Se revelaron las cavidades usando Sureblue 1-componente de substrato (KPL por sus siglas en ingles) mediante la adición de 100 pL por cavidad e incubación a temperatura ambiente durante 6 minutos, en cuyo punto se añadieron 100 pL de HCl 1 N para detener la reacción. Las absorbancias se leyeron a 450 nm utilizando un espectrofotómetro SpectraMax M5 (Molecular Devices) . Cada placa contiene un estándar de suero negativo y un suero estándar positivo para permitir la comparación entre las placas, y no hay antigeno y hay cavidades de control de suero para asegurarse de que no hay ningún aumento de la señal de fondo entre las placas. Los datos de absorbencia se transformaron en una "señal a ruido" dividiendo la absorbencia media para cada muestra mediante la absorbencia media para el suero estándar negativo .

C. Resultados Ejemplo 2 Todos los tratamientos de vacunas utilizadas en este estudio produjeron un aumento en la respuesta de IgG en el curso de la vacunación. El grupo vacunado con una bacterina disponible comercialmente produjo la respuesta menos prevalente, mientras que los animales vacunados con los mutantes de deleción vivas modificadas produjeron el mayor nivel de respuesta de IgG. El grupo vacunado con OMP fue el más rápido en producir una respuesta de IgG. Los niveles detectados de IgG para los grupos vivos modificado y el Grupo OMP fueron casi idénticos en el momento de la exposición en el día 42. Los controles no vacunados no produjeron ningún aumento detectable en la producción de anticuerpos, pero se observó un pequeño incremento en el día 28 con una fuente indeterminada. Este incremento no se observó en fechas posteriores en el estudio. Estos datos se resumen en la Figura 9.

EJEMPLO 3 Todas las vacunas usadas en este estudio produjeron nuevamente un aumento detectable de IgG en el trascurso de la vacunación. Estos niveles alcanzaron un pico el día 14 y declinó en el día 21, y luego aumentaron bruscamente después de la revacunación en ese día. Se observó un incremento de nuevo en el día 35, con una pequeña caída antes de la exposición en el día 42. El OMP extraído de sarcosilo desde el aislado Lg2-O 08 produjo la mayor respuesta de IgG, mientras que la vacuna 156A2 Tritón X produjo la más baja. Las respuestas procedentes de animales vacunados con preparaciones de Aislado LgDl-TN08 fueron similares. Los animales vacunados no mostraron ningún aumento detectable en los niveles de IgG en el curso de la vacunación. Estos datos se resumen en la Figura 10. EJEMPLO 4 Los animales vacunados en este estudio produjeron resultados similares a los estudios anteriores con picos menos pronunciados que lo observado en el Estudio 2011034. El grupo de extracto de SDS produjo la mayor respuesta de IgG, mientras que todos los tratamientos con sarcosilo produjeron resultados similares. El grupo de control no vacunado mostró un aumento en la respuesta de IgG al inicio del día 35 y continuó a través del día 42. Después de otro examen, este aumento es atribuible a cuatro animales individuales. Las barras de error, representativas de un intervalo de confianza con = 0.1 en la Figura 11, indican la presencia de valores extremos dentro del conjunto de datos para estos instantes en el tiempo. La causa de esta respuesta de IgG en los animales vacunados no se explica fácilmente en base únicamente en los datos.

D. Conclusión Puede observarse un aumento de la respuesta de anticuerpos IgG en el trascurso de la vacunación en los grupos vacunados, para todos los estudios. Esta respuesta aumenta hasta dos semanas después de la vacunación y después comienza a nivelarse o a decaer, pero aumenta de nuevo por la segunda vacunación que se produce en el día 21. Los niveles más altos de respuesta de los anticuerpos tienen lugar entre el día 28 y el día 42, con un pico evidente en el día 35.

Como la exposición se produjo el día 42 en todos los estudios, cualquier descenso en el nivel de anticuerpos de un pico anterior puede haber afectado la eficacia observada. El nivel de respuesta de anticuerpos a partir de antigeno 156A2 Triton-X en el día 35 en el Estudio 3 es similar a los niveles observados en los grupos vacunados con sarcosilo en el día 42. Si estas respuestas se generan a importantes epitopos protectores dentro del preparado de la vacuna, una evaluación diferente puede ocurrir con una exposición anterior. Seria más alentador ver el nivel de respuesta de los anticuerpos, en lugar de su caída, sin embargo, esto puede ser un artefacto de una dosis demasiado baja de la vacuna, un adyuvante inapropiado, o la debilidad del sistema inmune de los terneros CD extremadamente j óvenes .

Si bien los datos parecen mostrar una respuesta de anticuerpos silenciado en el estudio final en comparación con los otros, se debe señalar que las existencias de reactivos finales para el ELISA se prepararon después de pruebas para los dos primeros estudios. Estos reactivos incluyen el antigeno de recubrimiento y los sueros de control que se dividieron en alícuotas en viales de un solo uso y se almacenaron a -70 °C. Con ello se pretende mejorar la estabilidad de los antígenos a través del tiempo, pero la congelación y descongelación iniciales puede haber disminuido la afinidad de unión del antígeno de recubrimiento. Por esta razón la comparación directa de las relaciones entre señal y ruido entre los estudios debería evitarse, sin embargo los ensayos hechos dentro de cada estudio fue producida mediante reactivos idénticamente tratados.

No se produce un aumento en la detección de anticuerpos en los grupos de control, con la excepción de cuatro animales en los días 35 y 42 en el estudio final. La razón de este aumento en la detección de anticuerpos para estos animales no se conoce en este momento, pero podría ser el resultado de las muestras manejadas incorrectamente, la exposición prematura de estos animales a H. somni, o la exposición de estos animales a otra bacteria gram-negativa con antigenos de reacción cruzada antigenos de superficie similar a H. somni. Se pone de manifiesto que el ensayo es capaz de medir la diferencia en los niveles de anticuerpos en el tiempo, sin embargo la especificidad del ensayo tendrá que ser examinada. El ensayo mide una respuesta generalizada de IgG y también será importante examinar la especificidad de estos anticuerpos.

EJEMPLO 6: Análisis Western Blot de Proteínas Inmunoreacti as A. Objetivo Si bien el ELISA descrito en el capítulo 6 da una medida de la respuesta total de IgG en el curso de la vacunación, no da ninguna indicación en cuanto a la especificidad de estos anticuerpos, ni de las proteínas contra las que estos anticuerpos se generan. Los Western blots que utilizan suero de animales vacunados para sondear las preparaciones de vacunas diferentes se completaron para identificar mejor las proteínas inmunológicamente relevantes presentes en las preparaciones que mostraron protección. Mediante la comparación de esta respuesta de grupos que mostraron una disminución en la patología pulmonar con aquellos que no mostraron una disminución, deberían identificarse proteínas importantes.

B. Materiales y métodos SDS-PAGE Las proteínas presentes en las preparaciones de vacuna se separaron por peso molecular mediante electroforesis . Se utilizaron geles de NuPAGE 10% Bis-Tris de SDS ( Invitrogen) , con una configuración dato cavidad única o de 12 cavidades. Para los geles de cavidad individual, las muestras que contienen 12.0 µg de proteína total se combinaron con tampón de carga SDS (Invitrogen) que contiene ß-mercaptoetanol (Sigma) como agente reductor y se cargaron en un volumen de 400 vL. Una carga de 10 L de Novex Sharp Prestained Ladder (Invitrogen) se utilizó en la cavidad de escalera. Estos geles se corrieron en tampón 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPSpor sus siglas en ingles) (Invitrogen) a 200 V durante cincuenta minutos utilizando un módulo de electroforesis X de células (Bio-Rad) . Estos geles se utilizaron seguidamente para la transferencia de membrana y posterior western blot como se describe a continuación. Por doce geles de cavidad, las muestras que contienen 2.0 \iq de proteína total se combinaron con tampón de carga SDS (Invitrogen) que contiene ß-mercaptoetanol (Sigma) como agente reductor y se cargaron en volúmenes de 20 L. Una carga de 5 pL de Novex de Sharp Pre-stained Ladder (Invitrogen) se utilizó para la comparación. Estos geles se corrieron también en Tampón MOPS (Invitrogen) a 200 V durante cincuenta minutos utilizando el Módulo de Electroforesis X de células (Bio-Rad) . Estos geles se utilizaron para la tinción de Coomassie, como se describe a continuación.

TINCIÓN COOMASSIE Después de la electroforesis en un formato de doce cavidades, los geles se sumergieron en Imperial Blue Gel Stain (Thermo) y se tiñeron durante una hora bajo agitación suave. Seguidamente se removió la mancha, y los geles se dejaron desteñirse durante doce horas en agua RO. El agua se cambió dos veces, una vez después de treinta minutos, y una vez después de una hora. Los geles teñidos fueron visualizados y analizados para lo cual se utiliza un modelo M Imager (Bio-Sciences) .

Transferencia de membrana Después de la electroforesis en un formato de una sola cavidad, los geles se insertaron en un Módulo X Blot de células (Bio-Rad) . La transferencia a membranas de PVDF (Invitrogen) se completó en tampón de transferencia (Invitrogen) a 30 V durante noventa minutos a temperatura ambiente. La transferencia exitosa se determinó por examen visual del Novex Pre-stained Ladder. Las membranas se utilizaron seguidamente para el Western Blot como se describe a continuación.

Western Blot Después del procedimiento de transferencia, las membranas de PVDF se incubaron en tampón de bloqueo proteina libre (PFBBpor sus siglas en ingles ) (Thermo) bien durante treinta minutos a temperatura ambiente bajo agitación suave, o toda la noche a 4 °C. Después del bloqueo, las membranas se lavaron tres veces durante dos minutos bajo agitación suave para lo cual se utiliza tampón Tris que contiene Tween (TTBS por sus siglas en ingles) preparado por BIVI Central Services. Las membranas lavadas se transfirieron entonces a una empaquetadura Mini-Prep multi-Screen -Gasket (Bio-Rad) . Esta empaquetadura presenta veinte carriles para el sondeo de muestras separadas. Las mezclas de suero de cada grupo de estudio, ya sea en el día 0, día 21, o día 35 se diluyeron a razón de 1:500 en PFBB y se cargaron con un volumen de 600 i~L por cavidad. Las membranas se incubaron a continuación a temperatura ambiente bajo agitación suave durante una hora. Las muestras se retiraron a continuación de la junta por medio mediante vacio. Las membranas fueron luego transferidas a platos de material plástico para el resto del procedimiento. Un IgG de conejo anti-IgG de bovino (Jackson Immunolabs) diluido a razón de 1:2500 en PFBB se añadió a cada membrana y se incubó a temperatura ambiente durante una hora bajo agitación suave, seguido de un lavado adicional. El lavado final con TTBS fue seguido por dos lavados adicionales con tampón fosfato salino (PBS), como se sugiere en las instrucciones del fabricante para el sustrato. Se preparó Opti-4CN Substrate (Bio-Rad) según las 5 instrucciones del fabricante y se añadió a las membranas lavadas. Se dejo desarrollar el sustrato durante cinco minutos para maximizar la formación de la banda mientras se minimiza el fondo. Se utilizó RO para detener la reacción. Los blots desarrollados se dejaron secar durante doce horas 10 y seguidamente se formó imagen y se analizaron utilizando un Modelo M Imager (Bio-Sciences) .

RESULTADOS Un gel teñido con Coomassie dio una representación de todas las proteínas presentes en las 15 fracciones de preparación de diversas OMP usados en la formulación de prototipo de vacuna, independientemente de su importancia inmunorreactiva. La tinción reveló una fuerte concentración de proteínas de un tamaño de entre 35 kDa y 40 kDa en los pellets insoluble en sarcosilo, con 20 bandas menos concentradas a aproximadamente 80 kDa, 60 kDa, 28 kDa, y 25 kDa. Un mayor número de bandas de pesos moleculares variables, con concentraciones más bajas, puede observarse tanto en el material sobrenadante soluble en sarcosilo y en las fracciones de extracto de SDS. Los oc- perfiles de cada fracción son diferentes, sin embargo cada uno mostró ofrecer una reducción de la patología en al menos uno de los estudios descritos previamente. La determinación de cuál de estas proteínas juega un papel en esta protección se vio facilitada por Western blot .

Ejemplo 2 En el estudio inicial de eficacia, sólo la vacuna candidata OMP produjo una patología pulmonar significativamente menor. El antígeno de esta vacuna se separó por SDS-PAGE y se utilizó para el análisis de Western blot usando mezclas de suero de los grupos de estudio en el Día 0, Día 21, y Día 35. El grupo de control de exposición en este estudio no mostró una respuesta de anticuerpos en ninguno de los puntos de tiempo ensayados. Todos los grupos vacunados produjeron bandas reactivas a 80 kDa y 18kDa. Dado que éstos se observaron en grupos de tratamiento que no mostraron ninguna diferencia en la patología pulmonar en comparación con los controles, no parecen ser inmunológicamente importantes. De interés es la detección de proteínas en el intervalo de 35 kDa - 40 kDa que sólo se observaron en el grupo OMP vacunado Ejemplo 3 En el segundo estudio de vacunación, se llevó a cabo la comparación entre los métodos de extracción y los aislados. Nuevamente se observó que el grupo de control de exposición no produjo ninguna respuesta de anticuerpo en el trascurso de la vacunación. Asimismo, el grupo vacunado con una extracción de aislado 156A2 extraído con SDS, que no produjo una reducción en la patología pulmonar, mostró un aumento insignificante en la respuesta de anticuerpos. Los 5 otros grupos vacunados con una extracción de aislado de sarcosilo Lg2-OK08, extracción de sarcosil LgDl-TN08, o extracciones de SDS de LgDl-TN08 mostraron reducciones similares en las puntuaciones medias de pulmón, y de nuevo muestran una elevada concentración de la respuesta de 10 anticuerpos a las proteínas en el intervalo de 35 kDa a 40 kDa.

Ejemplo 4 En el estudio final de la eficacia en animal huésped se examinaron las fracciones soluble e insoluble de 15 las extracciones de sarcosilo, una combinación de estas fracciones (como se había utilizado en los estudios anteriores), y se volvió a examinar el método de extracción con SDS. Todas las vacunas de este estudio fueron generadas a partir de aislado LgDl-TN08. Para este estudio, cada una 20 de las preparaciones de vacunas se separó mediante SDS-PAGE y se sondearon con pools de sueros de los grupos de estudio, de nuevo utilizando los días 0, 21, y 35. La vacunación con el pellet insoluble en sarcosilo produjo una leve reducción en la patología pulmonar, que se encontró P r que no era estadísticamente significativa con respecto a al grupo de control. Se observa que esta vacuna produce un patrón similar de bandas similar al observado en blots de los estudios anteriores, con bandas no secuenciales en 80 kDa y 18kDa. Sin embargo, también produce bandas en el intervalo de 35-40 kDa que se consideraron inmunológicamente importantes por los exámenes anteriores (Figura 7) . También hay que señalar que, aunque se observaron niveles incrementados de IgG a través de las pruebas de ELISA de la mezcla de sueros de animales de control en el día 35 y en el día 42 en el Estudio 4, el Western Blot no refleja este resultado. Si bien el IgG detectado en el ELISA unido a antigenos de H. somni presentes en una preparación de recubrimiento de células enteras, estos no eran específicos para ninguno de los antígenos presentes en las vacunas.

Cuando la fracción soluble en sarcosilo se separó mediante electroforesis, y se sondeó con los mismos grupos de suero, la mayor parte de la reactividad de 35-40kDa fue disminuida. Se observaron unas proteínas aparentemente sin importancia tanto de peso molecular más elevado como más bajo, sin embargo, lo m ismos que las proteínas a 80 kDa y 18 kDa, éstos son comunes a todos los grupos de vacuna, independientemente de la eficacia observada. Se observó una banda en la fracción insoluble en sarcosilo y en los vacunados con extracto de SDS sólo, con un peso molecular aproximado de 40 kDa . Nuevamente, la intensidad de estas bandas aumentó en el transcurso de la fase de vacunación del estudio.

Cuando el extracto de SDS se somete al mismo procedimiento de western blot, nuevamente se redujo la reactividad en el intervalo e 35 kDa-40 kDa en comparación con el observado con una fracción insoluble en sarcosilo. Al igual que en la fracción soluble en sarcosilo, varias proteínas con mayor o menor peso molecular se detectaron independientemente del grupo de tratamiento. Varias bandas eran exclusivas de la vacuna SDS con un tamaño de 40 kDa y 80 kDa. Se observó que una proteína de aproximadamente 40 kDa de tamaño reaccionó en la fracción soluble en sarcosilo lo mismo que la fracción de SDS como se observó con el blot de la fracción soluble, y puede estar directamente relacionado con la eficacia observada C. Conclusión A través del examen de Western blots diseñados para identificar proteínas inmunológicamente importantes que generan respuestas de IgG durante la vacunación, se identificaron varias proteínas inmunorreactivas . De manera compatible con todos los grupos, e independientemente de la eficacia de la vacuna, eran las proteínas con un peso molecular estimado de 80 kDa y 18kDa respectivamente. Si bien se producen anticuerpos contra estas proteínas, por sí solos no parecen ser protectores. Las vacunas que produjeron una reducción significativa en la patología pulmonar comparten, todos ellos, una producción de anticuerpos reactivos a las proteínas en el rango de 35 kDa a 40 kDa. Sin embargo, cuando se utilizaron para las vacunas que contienen material insoluble en sarcosilo, la fracción insoluble en sarcosilo en la que esta formación de bandas es la más concentrada, no confirió protección por sí sola. La fracción soluble en sarcosilo y el método de extracción por SDS, que fueron observados por ser eficaces en la reducción de la patología pulmonar producen una banda distintiva, si bien de menor intensidad, de aproximadamente 40 kDa en tamaño junto con múltiples otras bandas débiles observadas con diversos pesos moleculares que no se observan específicamente en la fracción insoluble en sarcosilo .

Ejemplo 5 Unos OMP extraídos de SDS a partir del aislado LgDl-TN08 se precipitaron mediante incubación en ácido tricloroacético al 10% a 4 ° C durante 30 minutos seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 5 minutos. Las pellas de proteína se lavaron en acetona enfriada con hielo y después se resuspendió dos veces para lo cual se utiliza una solución de urea 8 M, CHAPS al 2%, y DTT 100 mM. No todas las proteínas a partir del extracto era solubles en esta suspensión, pero una posterior separación por SDS-PAGE y Western blot para lo cual se utiliza suero de animales vacunados con el extracto, reveló que se habían recuperado tres proteínas inmunológicamente relevantes. Las bandas de proteínas con pesos moleculares aproximados de 41, 38 y 23kDa se escindieron de una membrana PVDF teñida y fueron presentados al Protein Facility del Iowa State University para el secuenciado Edman N-terminal. Los resultados de secuenciación se insertaron a continuación en el análisis de BLAST para determinar la homología con respecto a proteínas previamente secuenciadas .

Los resultados de la secuenciación indican que la proteína de 41 kDa comparte una elevada homología N-terminal con la subunidad fimbral (fimA) de los aislados de H. somni 2336 y 129Pt y está asociada probablemente con la formación del pilus y/o mecanismos de secreción. Esta proteína también es homologa a la proteína pilA de H. ducreyi y H. influenza. La respuesta eficaz en animales vacunados con OMP extraídas de SDS LgDl-TN08 ha sido correlacionada con la inducción de la respuesta de IgG a esta proteína.

Se encontró que la proteína de 38 kDa tiene una elevada homología N-terminal con la proteína de polrina ompA que ha demostrado ser altamente conservada en muchos miembros de la familia Pasteurellaceae . Una vez más, la eficacia de las vacunas que consisten en OMP extraídas con SDS del aislado LgDl-TN08 ha sido correlacionada con la inducción de la respuesta de IgG a esta proteína.

La proteína de 23kDa estaba más estrechamente vinculada a Hs_0779, una proteína hipotética caracterizada sólo por los datos genómicos del aislado H. somni 129Pt. La función de esta proteína no ha sido descrita con precisión. La respuesta de IgG a esta proteína se ha observado a partir de animales vacunados con OMP extraídos con SDS del aislado LgDl-TN08; sin embargo esta respuesta se ha presentado en todos los vacunados independientemente de la eficacia de la vacuna.

Los resultados del BLAST son como sigue: Muestra: Hs_LGDl_061812-l Comentarios: -OMP inmunoreactivo de 41 kDa del que se observó que se correlaciona con la eficacia en estudios de OMP proof-of-concept .

Secuencia:E L M I V V A I I G I L A G I A I P Q Y Q L G Resultados de BLAST Valor-E = 4e-11: subunidad fimbral (fimA) de H. somni 2336 y 129Pt fimA del que se sospecha que es parte de los componentes de Pilus o del mecanismo de secreción Homólogo con respecto a pilA presentado por H. ducreyi y H. influenza y muchos otros Muestra: Hs_LGDl_061812-2 Comentarios: OMP inmunorreactivo de aproximadamente 38 kPa del que se observa que se correlaciona con la eficacia en estudios de OMP proof-of-concept .

Secuencia: : A P Q A N T F Y A G A 7 L Resultados de BLAST Valor-E = le-5: ompA Muy conservado en Pasteurellaceae, la porina actúa como canal no especifico para moléculas hidrófilas pequeñas Muestra: Hs_LGDl_061812-3 Comentarios: ~ OMP inmunoreactivo de aproximadamente 23 kDa observado en todos los animales vacunados independientemente de la eficacia secuencia :S I N I A P Q I T E I L A I N G L 7 Q ? Resultados de BLAST Valor-E = 0.19 : Proteina hipotética Hs_0779 de H. somni 129Pt Proteina conservada común a muchas bacterias, no caracterizada, y de función desconocida Tblast N 8/11 Transportador de calcio Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Si bien las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de formas de realización preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcances de la invención. Más específicamente, será evidente que determinados agentes que están relacionados entre sí tanto química como fisiológicamente pueden emplearse en lugar de los agentes descritos en la presente, obteniéndose los mismos resultados o resultados similares. Se considera que todos estos sustitutos similares y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se hallan dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención tal como la misma se define por las siguientes reivindicaciones. REFERENCIAS Todas las referencias citadas en la memoria descriptiva citadas en la memoria descriptiva se incorporan en la presente por referencia.

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionen detalles de procedimiento de ejemplo u otros detalles completamentarios a los establecidos en la presente se incorporan específicamente en la presente por referencia .

Aguilar, J.C. and Rodríguez, E.G. (2007). Vaccine adjuvants revisited. Vaccine. 25; p 3752-3762.

Asmussen, M.D. and Baugh, C.L. 1981. Thiamine pyrophosphate ( cocarboxylase ) as a growth factor for Haemophilus somnus. Journal of Clinical Microbiology. 14(2); pl78-183.

Angen, 0., Ahrens, P., and Tegtmeir, C. 1998. Development of a PCR test for identification of Haemophilus somnus in puré and raixed cultures. Veterinary Microbiology. 63; p39-48.

Babcock, A.H. 2010. Epidemiology of bovine respiratory disease and mortality in commercial feedlots. Kansas State University .

Babiuk, L.A. and Potter, A.A. (1994). Veterinary vaccines. Biotech. Adv. 12; p 489-523.

Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996). Protein Methods . Second Ed. Wiley-Liss & Sons, Inc.; New York .

Challacombe , J.F., Duncan, A.J., Brettin, T.S., Bruce, D., Chertkov, O., Detter, J.C., Han, C.S., Misra, M . , Richardson, P., Tapia, R. , Thayer, N., Xie, G., and Inzana, T.J. 2007. Complete genome sequence of Haemophilus somnus (Histophilus somni) strain 129Pt and comparison to Haemophilus ducreyi 35000HP and Haemophilus influenzae Rd . Journal of Bacteriology. 189(5); p 1890-1898.

Chimini, G. and Chavrier, P. 2000. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment . Nat. Cell Biol. 2; pl91-196.

Costerton, J.W. 1999. Introduction to biofilm. International Journal of Antimicrobial Agents. 11; p 217 -221.

Cox, A.D., Howard, M.D., Brisson, J.R., Van Der Zwan, M . , Thibault, P., Perry, M.B., and Inzana, T.J. 1998. Structural analysis of the phase-variable lipooligosaccharide from Haemophilus somnus strain 738. Eur. J. Biochem. 253; p507-516.

Detmer, A. and Glenting, J. Live bacterial vaccines - a review and identification of potential hazards. Microbial Cell Factories. 5:23; Bio Med Central <http: //www. microbialcellfactories . com/content/5/l/23> Duff, G.C. and Galyean, M.L. 2011. Recent advances in management of highly stressed, newly received feedlot cattle. Journal of Animal Science. 85; p823-840.

Ekins, A., Bahrami, F . , Sijercic, A., Maret, D., and Niven, D.F. 2004. Haemophilus somnus possesses two systems for acquisition of transferrin-bound iron. Journal of Bacteriology. 186(13); p4407-4411.

Elswaifi, S.F. 2006. The molecular characterization of phosphorylcholine (ChoP) on Histophilus somni lipooligosaccharide: Contribution of ChoP to bacterial virulence and pathogenesis . Virginia Polytechnic Institute and State University.

Fulton, R.W., Cook, B.J., Step, D.L., Confer, A.W., Saliki, J.T., Payton, M.E., Burge, L.J., elsh, R.D., Blood, K.S., 2002. Evaluation of health status of calves and the impact on feedlot performance: assessment of a retained ownership program for postweaning calves. Can. J. Vet . Res. 66, 173- 180.

Geertsema, R.S., Worby, C, Kruger, R.P., Tagawa, Y., Russo, R., Herdman, D.S., Lo, K. , Kimball, R.A., Dixon, J. , and Corbeil, L.B. 2008. Protection of mice against H. somni septicemia by vaccination with recombinant immunoglobulin binding protein subunits. Vaccine. 26; p 4506-4512.

Geertsema, R.S., Zekarias, B., La Franco Scheuch, L . , Worby, C, Russo, R. , Gershwin, L.J., Herdman, D.S., Lo, K. , and Corbeil, L.B. 2011. IbpA DR2 subunit immunization protects calves against Histophilus somni pneumonía. Vaccine. 29; 4805-4812.

Griffin, D. 1997. Economic impact associated with respiratory disease in beef cattle. Vet. Clin. North Am. Anim. Pract. 13; p367-377.

Griffin, D. 2010. Bovine pasteurellosis and other bacterial infections of the respiratory tract. Veterinary Clinics of North American Food Animal Practice. 26(1); p57-71 Hobb, R.I., Fields, J.A., Burns, C.M., and Thompson, S.A. 2009. Evaluation of procedures for outer membrane isolation from Campylobacter jejuni. Microbiology. 155(3); p 979-988.

Howard, M.D., Cox, A.D., eiser, J.N., Schurig, G.G., and Inzana, T.J. 2000. Antigenic diversity of Haemophilus somnus lipooligosaccharide: Phase-variable accessibility of the phosphorylcholine epitope. Journal of Clinical Microbíology. 38(12); p4412-4419.

Inzana, T.J., Iritani, B., Gogolewski, R.P., Kania, S.A., and Corbeil, L.B. 1988. Purification and characterization of lipooligosaccharides from four strains of Haemophilus somnus. Infection and Immunity. 56(11); p2830-2837.

Inzana, T.J., Gogolewski, R.P., and Corbeil, L.B. 1992. Phenotypic phase variation in Haemophilus somnus lipooligosaccharide during bovine pneumonía and after in vitro passage. Infection and Immunity. 60(7); p2943-2951. Inzana, T.J., Glindemann, G., Cox, A.D., Wakarchuk, W., and Howard, M.D. 2002. Incorporation of N-Acetylneuraminic Acid into Haemophilus somnus lipooligosaccharide (LOS): Enhancement of resistance to serum and reduction of LOS antibody binding. Infection and Immunity. 70(9); p4870-4879.

Jaques, M. and Paradis, S.E. 1998. Adhesin-receptor interactions in Pasteruellaceae . FEMS Microbiol . Rev. 22; p45-59.

Jericho, K.W.F. and Langford, E.V. 1982. Aerosol vaccination of calves with Pasteurella haemolytica against experimental respiratory disease. Can. J. comp. Med. 46; p287-292.

Johnson, A.P. and Inzana, T.J. 1986. Loss of ciliary activity in organ cultures of rat trachea treated with lipo-oligosaccharide from Haemophilus influenzae. J. Meo!. Microbiol. 22; p265-268.

Kania, S.A., Gogolewski , R.P., and Corbeil, L.B. 1990. Characterization of a 78-kilodalton outer membrane protein of Haemophilus somnus. Infection and Immunity. 58(1); p237-244.

Korczak, B., Christensen, H., Emler, S., Frey J., and Kuhnert, P. 2004. Phylogeny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbíology. 54; p 1393-1399. urphy, K., Travers, P., and Walport, M. (2008). Janeway' s Immunobiology: Ith Ed. Garland Science; NYC .

Nikaido, H. and Nakae, T. 1979. The outer membrane of gram-negative bacteria. Advances in Microbial Physiology. 20; pl63-250.

O'Toole, D., Hunter, A.R., and Corbeil, L.B. 2009. Diagnostic exercise: myocarditis due to Histophilus somni in feedlot and backgrounded cattle. Veterinary Pathology. 46; p 1015-1017.

Rehm, H. 2006. Protein Biochemistry and Proteomics. Elsevier Academic Press; New York.

Ribble, C.S., Jim, G.K., and Janzen, E.D. 1988. Efficacy of immunization of feedlot cattle with a commercial Haemophílus somnus bacterin. Canadian Journal of Veterinary Research. 52: pl91-198.

Roth, J.A. 2007. Mechanistic basis for adverse vaccine 5 reactions and vaccine failures. Advances in Veterinary Medicine. 41: p681-700.

Roy, C.R. and Mukherjee, S. 2009. Bacterial Fie proteins amp up infection. Science Signaling. 2(62), pl4. [DOI: 10.1126/scisignal.262.0pel4] . 10 Sandal, I., Shao, J.Q., Annadata, S., Apicella, M.A., Boye, M . , Jensen, T.K., Saunders, G.K., and Inzana, T.J. 2009.

Histophilus somni biofilm formation in cardiopulmonary tissue of the bovine host following respiratory challenge.

Microbes and Infection. 11; p 254-263. 15 Sandal, I. and Inzana T. 2010. A genomic window into the virulence of Histophilus. Trends in Microbiology. 18(2): p 90-99.

Spickler, A.R. and Roth, J.A. 2003. Adjuvants in veterinary vaccines: odes of action and adverse effeets. J Vet Intern 20 Med; 17, p 273-281.

St. Michael, F. , Inzana, T.J., and Cox, A.D. 2006.

Structural analysis of the lipooligosaccharide-derived oligosaccharide of Histophilus somni (Haemophílus somnus) strain 8025. Carbohydrate Research. 341; p281-284. ~ c Tagawa, Y. et . al. (1993) . Antigenic analysis of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus with monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 61(5); p 2257-2259.

Tagawa, Y . , Ishikawa, H . , and Yuasa, N. 1993. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somni. Infection and Immunity. 61 (1) ; p91-96.

Tagawa, Y. Haritani, M . , Ishikawa, H., and Yuasa, N. 1993. Characterization of a heat-modifiable outer membrane protein of Haemophilus somnus. Infection and Immunity. 61 (5) ; pl750-1755.

Tagawa, Y., Bastida-Corcuera, F. , and Corbeil, L.B. 2000. Immunological characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus. Veterinary Microbiology. 71; p245-254.

Tremblay, Y.D., Bahrami, F. , and Niven, D.F. 2006.

Acquisition of haemoglobin-bound iron by Histophilus somni. Vet. Microbiol. 114; pl04-114.

Ward, A.C., Weiser, G.C., Anderson, B.C., Cummings, P.J., Arnold, K.F., and Corbeil, L.B. 2006. Haemophilus somnus (Histophilus somni) in bighorn sheep. Canadian Journal of Veterinary Research. 70; p 34-42. orby, C.A., Mattoo, S., Kruger, R.P., Corbeil, L.B., Koller, A., Méndez, J.C., Zekarias, B., Lazar, C, and Dixon, J.E. 2009. The Fie domain: a new paradigm for adenylylation. Mol. Cell. 34(1): 93.

Doi: 10.1016/j .molcel .2009.03.008. oolery, A.R., Luong, P., Broberg, C.A., and Orth, K. 2010. AMPylation: something old is new again. Frontiers in Mícrobiology. 1; doi: 10.3389/fmicb .2010.00113.

Xiao, J. Worby, C.A., Mattoo, S., Sankaran, B., and Dixon, J.E. 2010. Structural basis for Fie inedxated adenylylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17(8); p 1004-1010.

Yarnall, M . , idders, P.R., and Corbiel, L.B. 1988. Isolation and characterization of Fc receptors from Haemophilus somnus. Scand. J. Immunol. 28; p 129-137 Zekarias, B., Mattoo, S., Worby, C, Lehmann, J. , Rosenbusch, R.F., and Corbeil, L.B. 2010. Histophilus somni IbpA DR2/Fic in virulence and immunoprotection at the natural host alveolar epithelial barrier. Infection and Immunity. 78(5); p 1850-1858.

Zekarias, B., O'Toole, D., Lehmann, J. , and Corbeil, L.B. 2011. Histophilus somni IbpA Fie cytotoxin is conserved in disease strains and most carrier strains from cattle; sheep and bison. Veterinary Mícrobiology. 149 (1-2); p 177-185.

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende al menos un péptido de Histophilus somni de proteina de la membrana exterior (OMP) y un vehículo fisiológicamente aceptable, en donde el péptido de Histophilus somni de OMP es inmunoreactivo a Histophilus somni . 2. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el vehículo fisiológicamente aceptable está seleccionado del grupo que consiste en un portador, adyuvante, o combinación de los mismos, farmacéuticamente o veterinariamente aceptables. 3. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende PTA-12755, PTA-12756 y sus combinaciones. 4. - El uso de una composición inmunogénica como la que se reclama en la reivindicación 1, para preparar un medicamento útil para ocasionar una inmune respuesta contra la infección por Histophilus somni en un sujeto. 5. - El uso de una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, para preparar un medicamento útil para reducir la incidencia o gravedad de un signo clínico asociado con la infección por Histophilus somni en un un sujeto, en donde la reducción de la incidencia o de la gravedad de un signo clínico es de por lo menos un 10 % referido a un sujeto que no recibe la composición inmunogénica . 6. - El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el signo clínico se selecciona del grupo consistente en respiración trabajosa o rápida, tos, anorexia, depresión o letargo, descarga nasal y ocular, y mortalidad . 7. - El uso de conformidad con la reivindicación 0 5, caracterizada porque el sujeto es un animal seleccionado del grupo consistente en un bovino u ovino. 8. - Un método para preparar una composición inmunogénica como la que se reclama en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende mezclar por lo menos un 5 péptido de Histophilus somni de OMP con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 9. - Un método in vitro para diagnosticar una infección de Histophilus somni en un sujeto, caracterizado porque comprende proveer por lo menos un péptido de 0 Histophilus somni de OMP, poner en contacto el péptido de Histophilus somni con una muestra de un sujeto, e identificar el sujeto como portador de una infección de Histophilus somni si se detecta un anticuerpo en la muestra que es capaz de unir el péptido de Histophilus somni. s 10.- Un kit, caracterizado porque comprende por lo menos un péptido de Histophilus somni de OMP, un portador inmunogénico, un contenedor para empacar el péptido de Histophilus somni de OMP y el portador inmunogénico, un conjunto de instrucciones impresas, y un dispensador capaz de administrar una vacuna a un animal. 11. - Un kit para preparar una composición inmunogénica como la que se reclama en la reivindicación 1, caracterizado porque que comprende: (i) el péptido de Histophilus somni de OMP, y ii) el vehículo fisiológicamente aceptable, en donde (i) e (ii) están empacados por separado. 12. - El kit de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque comprende instrucciones para el uso del kit. 13. - El kit de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque además comprende un dispensador .