MX2014010082A - Metodo para la reduccion de desplazamientos del marco de lectura 1->2. - Google Patents

Abstract

En la presente se da a conocer un método para la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR, caracterizado porque el método comprende la recuperación del polipéptido a partir de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt, o el oligonucleótido gcg cgt, o el oligonucleótido gcc cgt.

Description

METODO PARA LA REDUCCION DE DESPLAZAMIENTOS DEL MARCO DE LECTURA l->2 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está en el campo de la producción recombinante de polipéptidos . En la presente se da a conocer un método para producir de manera recombinante un polipéptido con contenido reducido de subproductos, en donde la reducción del contenido de subproductos se logra por una modificación del ácido nucleico codificador que reduce los desplazamientos del marco de lectura durante el proceso de traducción o transcripción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas juegan un papel importante en el portafolio médico de la actualidad. Para la aplicación en humanos, cada sustancia farmacéutica tiene que cumplir distintos criterios. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos a humanos, se tienen que remover de manera especial los ácidos nucleicos, virus y las proteínas de células hospedadoras , que provocarán daño severo. Para cumplir con la especificación regulatoria uno o más pasos de purificación tienen que seguir el proceso de fabricación.

Se pueden producir polipéptidos recombinantes , por ejemplo, por células procarióticas tal como E. coli. El polipéptido recombinantemente producido da cuenta de la Ref. 249578 mayoría del contenido de polipéptido de la célula procariótica y frecuentemente está depositado como un agregado insoluble, es decir, como un llamado cuerpo de inclusión dentro de la célula procariótica. Para el aislamiento del polipéptido recombinante, las células se tienen que desintegrar y el polipéptido recombinante contenido en los cuerpos de inclusión se tiene que solubilizar después de la separación de los cuerpos de inclusión del desecho celular. Para la solubilización, se usan reactivos caotrópicos, tal como urea o cloruro de guanidinio. Para escindir los enlaces de disulfuro, se adicionan agentes reductores, especialmente bajo condiciones alcalinas, tal como ditieritritol , ditiotreitol , o ß-mercaptoetanol . Después de la solubilización de polipéptido agregado, la estructura globular del polipéptido recombinante, que es esencial para la actividad biológica, se tiene que restablecer. Durante este llamado proceso de renaturalización, se reduce (lentamente) la concentración de los agentes desnaturalizantes, por ejemplo, por diálisis contra un amortiguador adecuado, que permite que el polipéptido desnaturalizado se repliegue a su estructura biológicamente activa. Después de la re-naturalización, el polipéptido recombinante se purifica a una pureza aceptable para el uso propuesto. Por ejemplo, para el uso como una proteína terapéutica, se tiene que establecer una pureza de más de 90%.

Los polipéptidos recombinantemente producidos se logran normalmente por ácidos nucleicos, endotoxinas, y/o polipéptidos de la célula productora. Además de los subproductos derivados de la célula hospedadora, también están presentes subproductos derivados del polipéptido en una preparación cruda de polipéptido. Entre otras, puede estar presentes variantes acortadas del polipéptido de interés.

En la WO 95/25786, se reporta la producción de apolipoproteína Al humana en un sistema de expresión bacteriano .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha encontrado que el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR puede ser el punto de un desplazamiento de marco de lectura l->2 durante el proceso de traducción o transcripción de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende el dipéptido AR. Debido a la ocurrencia del desplazamiento de marco de lectura, se produce un polipéptido sin sentido con una secuencia de aminoácidos no codificadas.

De esta manera, se ha encontrado que el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR que está comprendido en un ácido nucleico que codifica para un polipéptido más grande se debe seleccionar de los oligonucleótidos gca cgt (SEQ ID NO: 03), gcg cgt (SEQ ID NO: 04), y gcc cgt (SEQ ID NO: 05). Se ha encontrado que el cuarto nucleótido en el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR no debe de ser "a" .

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06) , caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el oligonucleótido codifica para el dipéptido AR comprendido en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido tiene el nucleótido "c" en la cuarta posición.

De esta manera, en la presente se reportar como un aspecto un método para la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06) , caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: - recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) .

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la reducción de la formación de subproductos por un desplazamiento de marco de lectura l->2 en la producción de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06), caracterizado porque el método comprende el siguiente paso : recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR comprendido en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido tiene el nucleótido "c" cuarta posición.

De esta manera, en la presente se reporta como un aspecto un método para reducir la formación de sub-productos por el desplazamiento de marco de lectura l->2 en la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06), caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO : 05) .

En una modalidad de todos los aspectos como se reporta anteriormente el dipéptido AR es todos los dipéptidos AR.

En una modalidad de todos los aspectos como se reporta en la presente, el dipéptido AR es el último dipéptido AR en la secuencia de aminoácidos.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la producción recombinante de una apolipoproteína A-I de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06), caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: - recuperar la apolipoproteína A-I de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para la he apolipoproteína A-I de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11 y producir de este modo la apolipoproteína A-I, por lo que el oligonucleótido que codifica para el último dipéptido AR comprendido en el ácido nucleico que codifica para la apolipoproteína A- 13 tiene el nucleótido "c" en la cuarta posición.

De esta manera, en la presente se reporta como un aspecto un método para la producción recombinante de una apolipoproteína A-I de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06) , caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: - recuperar la apolipoproteína A-I de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para la apolipoproteína A-I de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11 y producir de este modo la apolipoproteína, por lo que el último dipéptido AR comprendido en la secuencia de aminoácidos de la apolipoproteína A-I se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO : 05) .

Un aspecto como se reporta en la presente es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende el dipéptido AR en su secuencia de aminoácidos por lo que el dipéptido AR se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) .

Un aspecto como se reporta en la presente es una célula que comprende un ácido nucleico como se reporta en la presente .

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso del oligonucleótido gca cgt (SEQ ID 30 NO: 03) , o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) para codificar el dipéptido AR comprendido en un polipéptido.

En lo siguiente se especifica las modalidades de todos los aspectos como se reporta en la presente .

En una modalidad, el dipéptido AR se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) .

En una modalidad, el dipéptido AR se codifica por el oligonucleótido gcg cgt 5 (SEQ ID NO: 04) .

En una modalidad, el dipéptido AR se codifica por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) .

En una modalidad, el polipéptido comprende de aproximadamente 50 residuos de aminoácido a aproximadamente 500 residuos de aminoácido. En una modalidad, el polipéptido comprende de aproximadamente 100 residuos de aminoácido a aproximadamente 400 residuos de aminoácido. En una modalidad, el polipéptido comprende de aproximadamen e 250 residuos de aminoácido a aproximadamente 350 residuos de aminoácido.

En una modalidad, la célula es una célula procariótica . En una modalidad, la célula procariótica es una célula de E. coli, o una célula de bacillus.

En una modalidad, la célula es una célula procariótica. En una modalidad, la célula es una célula CHO, o una célula HEK, o una célula BHK, o una célula NS0, o una célula SP2/0, o una célula de levadura.

En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido hetero-multimérico . En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido homo-multimérico . En una modalidad, el polipéptido es un homo-dime o o un homo-trímero .

En una modalidad, el polipéptido es apolipoproteína A-I humana o una variante de la misma que tiene la actividad biológica de la apolipoproteína A-I humana. En una modalidad, la variante de apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 09 a SEQ ID NO: 14.

En una modalidad, el polipéptido es apolipoproteína A-I humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11.

BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA Figura 1.- Supresión o salto del nucleótido a760 en un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína que da por resultado un desplazamiento de marco de lectura 1 -> 2y terminación del proceso de traducción directamente en el siguiente codón.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones El término "aminoácido" denota el grupo de carboxi a-aminoácidos, que directamente o en forma de un precursor se puede codificar por ácido nucleico. Los aminoácidos individuales se codifican por ácidos nucleicos que consisten de tres nucleótidos, los llamados codones o tripletes base. Cada aminoácido se codifica por al menos un codón. La codificación del mismo aminoácido por diferentes codones se conoce como "degeneración del código genético" . El término "aminoácido" denota los carboxi-a-aminoácidos que se presentan de forma natural y comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisterna (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I) , leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptofano (trp, W) , tirosina (tyr, Y), y valina (val, V) .

El término "apolipoproteína A-I" denota un polipéptido helicoidal anfifílico con propiedades de interacción proteína- lípido y proteína-proteína. La apolipoproteína A-I se sintetiza por el hígado e intestino delgado como prepro-apolipoproteína de 267 residuos de aminoácido que se segrega como una pro-apolipoproteína que se escinde al polipéptido maduro que tiene 243 residuos de aminoácido. La apolipoproteína A-I consiste de 6 a 8 diferentes repeticiones de aminoácido que consisten cada una de 22 residuos de aminoácido separados por una porción ligadora que frecuentemente es prolina, y en algunos casos consiste de un tramo hecho de hasta varios residuos. Una secuencia de aminoácidos de apolipoproteína A-I humana de ejemplo se reporta en la entrada NM-000039 de la base de datos GenPept o la entrada X00566 de base de datos; GenBank NP-000030.1 (gi 4557321). De la apolipoproteína A-I humana (SEQ 25 ID NO: 07) existen variantes que se presentan de forma natural, tal como P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D, D127N, supresión de K131, K131M, W132R, E133K, R151C (residuo de aminoácido 151 se cambia de Arg a Cys , apolipoprotexna A-I-Paris) , E160K, E163G, P167R, L168R, E171V, P189R, R197C (residuo de aminoácido 173 se cambia de Arg a Cys, apolipoproteína A-I-Milano) y E222K. También se incluyen variantes que tienen modificaciones conservadoras de aminoácido.

El término "codón" denota un oligonucleótido que consiste de tres nucleótidos que codifica para un aminoácido definido. Debido a la degeneración del código genético se codifican algunos aminoácidos por más de un codón. Estos diferentes codones que codifican para el mismo aminoácido tienen diferentes frecuencias relativas de uso en las células hospedadoras individuales. De esta manera, un aminoácido específico se puede codificar por un grupo de diferentes codones . Igualmente, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido se puede codificar por diferentes aminoácidos. Por lo tanto, un aminoácido específico se puede codificar por un grupo de diferentes codones, por lo que cada uno de estos codones tiene una frecuencia de uso dentro de una célula hospedadora determinada.

Tabla: Uso de codones de Escherichia Coli (codón/aminoácido codificado/frecuencia de uso [%] ) En la siguiente tabla se muestra las sustituciones conservadoras bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Se proporcionan más cambios sustanciales adicionales en la siguiente tabla bajo el encabezado de "sustituciones de ejemplo", y como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de cadena lateral de aminoácidos Las sustituciones no conservadoras conllevarán el intercambio de un miembro de una de etas clases por otra clase .

El término "modificación conservadora de aminoácido" denota modificaciones de la secuencia de aminoácidos que no afectan ni alteran las características de polipéptido. Se pueden introducir modificaciones por técnicas normales conocidas en la técnica tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las modificaciones conservadoras de aminoácidos incluyen una de las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuo de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .

El término "variante de un polipéptido" denota un polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de "origen" por hasta dies, en una modalidad de aproximadamente dos a aproximadamente cinco, adiciones, supresiones y/o sustituciones. Se pueden realizar modificaciones de la secuencia de aminoácidos por mutagénesis con base a modelado molecular como se describe por Riechmann, L . , et al., Nature 332 (1988) 323-327, y Queen, C, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.

La homología e identidad de las diferentes secuencias de aminoácidos se puede calcular usando algoritmos bien conocidos tal como BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, O BLOSUM 90. En una modalidad, el algoritmo es BLOSUM 30.

Los términos "célula hospedadora" , "línea de células hospedadoras" , y "cultivo de células hospedadoras" se usan de manera indistinta y se refieren a células en las cuales se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de estas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin considerar el número de pasadas. La progenie puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula de origen, sino que puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se examina o selecciona para la célula originalmente transformada se incluyen en la presente .

Los términos "ácido nucleico" y "secuencia de ácido nucleico" denotan una molécula polimérica que consiste de los nucleótidos individuales (también llamadas bases) 'a', XC, 'g' , y 't' (o 25 u' en AR ) , es decir, ADN, AR , o modificaciones de esto. Esta molécula de polinucleótido puede ser una molécula de polinucleótido que se presenta de forma natural o una molécula de polinucleótido sintética o una combinación de una o más moléculas de polinucleótido que se presentan de forma natural con una o más moléculas sintéticas de polinucleótido. También se abarcan por esta definición las moléculas de polinucleótido que se presentan de forma natural en las cuales se cambian uno o más nucleótidos (por ejemplo por mutagénesis) , se suprimen o adicionan. Un ácido nucleico ya sea se puede aislar, o integrar en otro ácido nucleico, por ejemplo, en un cásete de expresión, un plásmido, o el cromosoma de una célula hospedadora. Un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico que consiste de nucleótidos individuales. El término "oligonucleótido" denota una molécula polimérica que consiste de a lo mucho 10 nucleótidos individuales (también llamadas bases) 'a1, 'c', ' g' , y ' t ' (o 'u' en AR ) .

Para una persona experta en la técnica son bien conocidos los procedimientos y métodos para convertir una secuencia de aminoácidos, por ejemplo de un polipéptido, en una correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica para esta secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácido nucleico que consiste de nucleótidos individuales igualmente por la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado de este modo .

"Por ciento ( ) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para lograr el porciento máximo de identidad de secuencia y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la habilidad de la técnica, por ejemplo, usando software de computadora públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para propósitos en la presente, sin embargo, los valores del por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN- 2 se publicó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con documentación de usuario en la oficina Copyright U.S.-, Washington D.C., 20559, donde se registró bajo el No. de Registro Copyright U.S. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para el uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D de digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se exponen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácido, el % de identidad de secuencias de aminoácido de una secuencia A de aminoácidos, dada, a, con, o contra una secuencia B de aminoácidos, dada (que se puede parafrasear alternativamente como una secuencia A de aminoácidos, dada que tiene o comprende un cierto % de entidad de secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia B de aminoácidos, dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y donde X es el número de residuos de aminoácido punteados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia A de aminoácidos no es igual a la longitud de la secuencia B de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se señale específicamente de otro modo, todo los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos, usados en la presente, se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de computadora ALIGN-2.

Los términos "polipéptido recombinante" y "polipéptido recombinantemente producido" denotan un polipéptido que se prepara, expresa, o crea por medios recombinantes , tal como por polipéptidos aislados de células hospedadoras , tal como células E. coli, NSO, BH , o CHO.

El término "sustituir" denota el cambio de un nucleótido específico en un ácido nucleico de origen para obtener el ácido nucleico sustituido/cambiado.

El método como se reporta en la presente: Los métodos y técnicas conocidas por una persona experta en la técnica, que son útiles para llevar a cabo la invención, se describen por ejemplo en Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), iley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ; Morrison, S.L., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 y US 5,204,244.

Se ha encontrado que el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR que está comprendido en un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende el dipéptido AR puede ser el punto de un desplazamiento de marco de lectura l->2 (mutación) durante el proceso de transcripción o traducción del ácido nucleico que codifica para el polipéptido que comprende el dipéptido AR. Debido a la ocurrencia del desplazamiento de marco de lectura, se produce un polipéptido con una secuencia de aminoácidos no codificada, más probablemente una secuencia de aminoácidos y sentido o acortada.

En más detalle se ha encontrado que dependiendo del oligonucleótido, que codifica para el dipéptido AR y que está comprendido en uno más grande, es decir, un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácido, un desplazamiento de marco de lectura l->2 durante el proceso de transcripción o traducción del oligonucleótido se presenta con diferente frecuencia (ver la siguiente Tabla) .

Tabla De esta manera, un aspecto como se reporta en la presente es un método para la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06) , caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: - recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) , o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) .

De esta manera, un aspecto como se reporta en la presente es un método para la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06) , caracterizado porque el método comprende el siguiente paso: - recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido, por lo que el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR comprendido en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido tiene el nucleótido ' c' en la cuarta posición.

En una modalidad, el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR comprende como el codón que codifica para el aminoácido A un codón seleccionado de gct, gcc, gca y gcg y como codón que codifica para el aminoácido R un codón seleccionado de cgt, cgc, cga y cgg.

En una modalidad, el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR se selecciona del grupo que comprende los oligonucleótidos gct cgt, gct cgc, gct cga, gct cgg, gcc cgt, gcc cgc, gcc cga, gcc cgg, gca cgt, gca cgc, gca cga, gca cgg, gcg cgt, gcg cgc, gcg cga, y gcg cgg.

En una modalidad, el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR se selecciona del grupo que comprende los oligonucleótidos gca cgt (SEQ ID NO: 03) , gcg cgt (SEQ ID NO: 04), y gcc cgt (SEQ ID NO: 05).

En una modalidad, el método comprende lo siguientes pasos: - proporcionar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido, cultivar la célula (bajo condiciones que son adecuadas para la expresión del polipéptido) , - recuperar el polipéptido de la célula o el medio de cultivo, -opcionalmente purificar el polipéptido producido con uno o más pasos de cromatografía.

En una modalidad, el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que comprende el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) que codifica para el dipéptido AR se obtiene al sustituir dos a tres nucleótidos en el oligonucleótido gcg agg (SEQ ID NO: 01) , o por el oligonucleótido gcg aga (SEQ ID 25 NO: 02) por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) que codifica por el dipéptido AR.

En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con uno a cinco pasos de cromatografía. En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con dos a cuatro pasos de cromatografía. En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con tres pasos de cromatografía.

Los métodos cromatográficos generales y su uso se conocen por la persona experta en la técnica. Ver, por ejemplo, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (ed. ) , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl , Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, Los países bajo, (1998) ; Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K. , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ; Scopes, Proteína Purification: Principies and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); or Current Protocole in Molecular Biology, Ausubel, F. M. , et al. (ed.), John Wiley & Sons, Inc., New York.

Un aspecto como se reporta en la presente es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende el dipéptido AR en su secuencia de aminoácidos, por lo que el dipéptido AR se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03), o por el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04), o por el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) . 10 Un aspecto como se reporta en la presente es una célula que comprende un ácido nucleico como se reporta en la presente .

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso del oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) , o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) para codificar el dipéptido AR comprendido en un polipéptido.

Un aspecto como se reporta en la presente es método para reducir la formación de subproductos durante la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR, que comprende el paso de: - sustituir en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido tres nucleótidos en el nucleótido gcg agg (SEQ ID NO: 01) , o en el oligonucleótido gcg aga (SEQ ID NO: 02) que codifica para el dipéptido AR para obtener el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) , o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05) , produciendo de este modo un ácido nucleico que codifica para el polipéptido sustituido, y - recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende el ácido nucleico sustituido que codifica para el polipéptido y reduciendo de este modo la formación de subproductos durante la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para incrementar la expresión de un polipéptido recombinantemente producido, que comprende el dipéptido AR, que comprende el paso de : - sustituir en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido dos a tres nucleótidos en el oligonucleótido gcg agg (SEQ ID NO: 01) , o el oligonucleótido gcg aga (SEQ ID NO: 02) que codifica para el dipéptido para obtener el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) , o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) , o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO: 05), produciendo de este modo un ácido nucleico que codifica para el polipéptido sustituido, y - recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende el ácido nucleico sustituido que codifica para el polipéptido e incrementando de este modo la expresión del polipéptido, que comprende el dipéptido AR.

En una modalidad, el método comprende uno o más de los siguientes pasos adicionales: - proporcionar la secuencia de aminoácidos o el ácido nucleico codificador de un polipéptido que comprende el dipéptido AR, y/o - transfectar una célula con el ácido nucleico sustituido que codifica para el polipéptido, y/o cultivar la célula transfectada con el ácido nucleico sustituido (bajo condiciones que son adecuadas para la expresión del polipéptido) , y/o - recuperar el polipéptido de la célula o el medio de cultivo, y/o - purificar opcionalmente el polipéptido producido con uno o más pasos de cromatografía.

En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con uno a cinco pasos de cromatografía. En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con dos a cuatro pasos de cromatografía. En una modalidad, el polipéptido producido se purifica con tres pasos de cromatografía .

El método como se reporta en la presente se ejemplifica en los siguiente con un polipéptido recombinante producido en una célula procariótica, es decir, el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I producido en E. coli.

El polipéptido de fusión de tetranectina- apolipoproteína A-I comprende (en la dirección N- a C-terminal) el elemento estructural de trimerización de tetranectina humana y la apolipoproteína A-I humana tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos del elemento estructural de trimerización de tetranectina humana se puede acortar por los primeros 9 aminoácidos, de esta manera, partiendo con el residuo de isoleucina de la posición 10, un sitio de truncamiento que se presenta de forma natural. Como una consecuencia de ese truncamiento, el sitio de O-glicosilación en el residuo de treonina de la posición 4 se ha suprimido. Entre el elemento estructural de trimerización de tetranectina y la apolipoproteína A-I humana, se removieron los cinco residuos de aminoácido SLKGS (SEQ ID NO: 08) .

Para la expresión y purificación mejorada, se puede generar una construcción que comprende una marca de purificación N-terminal, por ejemplo, una marca de hexahistidina, y un sitio de escisión de proteasa para la remoción de la marca de purificación. En una modalidad, la proteasa es IgA proteasa y el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de IgA-proteasa. Como resultado de la escisión específica de la proteasa, se retienen algunos residuos de aminoácido del sitio de escisión de proteasa en el N-término del polipéptido, es decir, en el caso de un sitio de escisión de IgA-proteasa, se mantienen dos residuos de aminoácido, como la primer alanina o glicina o serina o treonina y como la segunda prolina, en el N-término del polipéptido, por ejemplo el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I .

El elemento estructural de trimerización de tetranectina proporciona un dominio que permite la formación de un homo-trímero de tetranectina-apolipoproteína A-I que está constituido por interacciones no covalentes entre cada uno de los monómeros de tetranectina-apolipoproteína A-I individuales.

En una modalidad, el polipéptido de fusión de apolipoproteína A-I es una variante que comprende sustituciones conservadoras de aminoácido.

En una modalidad, el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I comprende una marca de expresión y purificación y tiene la secuencia de aminoácidos de CDLPQTHSLGSHHHHHHGSWAPPAPIVNAKKDW TKMFEELKSRLDTL AQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQF EGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLR QEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKK QEEMELYRQKVEPLRAELQEGAR QKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEAL KENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSA LEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO: 09) .

En una modalidad, el polipéptido de fusión (IVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de : IV AKKDWNTKMFEEL SRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSP DR VKDLATVYVDVL DSGRDYVSQFEGSALGKQLNL LLDNWDSVTSTFSK LREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKW QEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVD ALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKA KPALEDLRQGLLVPLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO: 10) .

De esta manera, en una modalidad, el polipéptido de fusión (PIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de: PIVNAKKDWNTKMFEEL SRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWD RVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQEFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFS KLREQLGPVTQEF DNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDQKK WQEEMELYRQKVEPLRAELQEGAROKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHV DALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHSTLSEK AKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO : 11) .

En una modalidad, el polipéptido de fusión de (XPIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de: (G, S , T) PIVNAKKDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPP QP DRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDN DS VTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLD DFQKKWQEEMELYTRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDR ARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHL STLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO: 12) .

De esta manera, en una modalidad, el polipéptido de fusión (APIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de APIVNAKKDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPW DRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDN DSVTSTF SKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQK K QEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAH VDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYTHAKATEHLSTLSE KAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO: 13) .

En una modalidad, el polipéptido de fusión (XIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I que comprende una marca de hexa-histidina tiene la secuencia de aminoácidos de: HHHHHHXIV AKKDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDE PPQSP DRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDN D SVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYL DDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRD RARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGAARLAEYHAKATEH LSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEQ ID NO: 14) . En donde X puede ser cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácido: A, G, S, P, AP, GP, SP, PP, GSAP (SEQ ID NO: 15), GSGP (SEQ ID NO: 16), GSSP (SEQ ID NO: 17), GSPP (SEQ ID NO: 18), GGGS (SEQ ID NO: 19), GGGGS (SEQ ID NO: 20), GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 22), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23) , GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSAP (SEQ ID NO: 25), GGGSGP (SEQ ID NO: 26), GGGSSP (SEQ ID NO: 27), GGGSPP (SEQ ID NO: 28), GGGGSAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGP (SEQ ID NO: 30), GGGGSSP (SEQ ID NO: 31), GGGGSPP (SEQ ID NO: 32), GGGSGGGSAP (SEQ ID NO: 33), GGGSGGGSGP (SEQ ID NO: 34), GGGSGGGSSP (SEQ ID NO: 35), GGGSGGGSPP (SEQ ID NO: 36), GGGSGGGSGGGSAP (SEQ ID NO : 37), GGGSGGGSGGGSGP (SEQ ID NO: 38) , GGGSGGGSGGGSSP (SEQ ID NO: 39), GGGSGGGSGGGSPP (SEQ ID NO : 40, GGGGSAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGP (SEQ ID NO: 42), GGGGSSP (SEQ ID NO: 43), GGGGSPP (SEQ ID NO: 44), GGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO : 45), GGGGSGGGGSGP (SEQ ID NO: 46) , GGGGSGGGGSSP (SEQ ID NO : 47) , GGGGSGGGGSPP (SEQ ID NO: 48) , GGGGSGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 49) , GGGGSGGGGSGGGGSGP (SEQ ID NO : 50), GGGGSGGGGSGGGGSSP (SEQ ID NO: 51), y GGGGSGGGGSGGGGSPP (SEQ ID NO : 52) .

Se tiene que señalar que si un polipéptido se produce de manera recombinante en cepas de E. coli, el residuo de metionina N- terminal usualmente no se escinde de manera eficiente por proteasas de E. coli. De esta manera, el residuo de metionina N- terminal está parcialmente presente en el polipéptido producido.

Un polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I de SEQ ID NO : 09 se produjo de manera recombinante en E. coli. Se puede detectar un subproducto principal .

Mediante secuenciación de Edmann y correlación de péptidos de Lys-C (LC-ESI-MS/MS) , se detectó la secuencia de aminoácidos N- terminal después de la escisión de IgA proteasa. La secuencia corresponde a la secuencia de aminoácidos N- terminal del polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I (APIV AKKDW =residuos de aminoácido 1-12 de SEQ ID NO: 13) .

Mediante MS superior- inferior, el fragmento de aminoácido C-terminal de longitud completa que corresponde a SEQ ID NO: 13 no se puede detectar. Se pueden encontrar los fragmentos que corresponden a los residuos 1 a 105 de SEQ ID NO: 13.

Mediante correlación de péptido de Lys-C (LC-ESI-MS/MS) , el péptido C- terminal tampoco se puede detectar. Se pueden observar todos los péptidos del residuo de aminoácido 1 a 224 de SEQ ID NO: 13.

De esta manera, la desviación del ácido nucleico codificador se presenta en el intervalo de aminoácidos del residuo 225 al residuo 230 de SEQ ID NO: 13.

Se ha encontrado que la desviación de la secuencia propuesta de aminoácidos presentada en la posición 760 en el nucleótido 'a' del ácido nucleico que codifica para el polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 (que corresponde a la posición de aminoácidos 254 de SEQ ID NO: 09) , que no se procesa durante el proceso de transcripción o traducción.

La desviación presentada en un codón iniciando con el nucleótido 4 a' de un oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR (ver Figura 1) . El dipéptido AR está presente en 4 posiciones en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09, es decir, en la posición 196-197, en la posición 218-219, en la posición 242-243 y en la posición 253-254. Como se resume anteriormente, la formación de un subproducto debido a un desplazamiento de marco de lectura 1 -> 2 sólo se observó para el dipéptido AR en la posición 253-254 de SEQ ID NO: 09. Esto es más sorprendente como en la región de la posición 215 a la posición 219 de SEQ ID NO: 09, que comprende 3 residuos de arginina dentro de un total de 5 residuos de aminoácido y que comprende también el dipéptido AR, no se puede detectar el desplazamiento de marco de lectura 1 -> 2.

Los dipéptidos AR individuales en SEQ ID NO: 09 se codifican como se muestra en la siguiente tabla.

Tabla manera, se ha encontrado que oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR que está comprendido en un ácido nucleico que codifica para un polipéptido más grande se puede seleccionar de los oligonucleótidos gca cgt (SEQ ID NO: 03) , gcg cgt (SEQ ID NO: 04) y gcc cgt (SEQ ID NO: 05) . Se ha encontrado que el cuarto nucleótido en el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR no debe ser v a' .

Se proporcionan los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras para ayudar en el entendimiento de la presente invención, el alcance verdadero de la cual se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que se pueden hacer modificaciones en los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción del Listado de secuencias SEQ ID NO: 01 Oligonucleótido agg.

SEQ ID NO: 02 Oligonucleótido gcg aga .

SEQ ID NO: 03 Oligonucleótido gca cgt.

SEQ ID NO: 04 Oligonucleótido gcg cgt .

SEQ ID NO: 05 Oligonucleótido gcc cgt.

SEQ ID NO: 06 Dipéptido AR.

SEQ ID NO: 07 Apolipoproteína A-I humana SEQ ID NO: 08 Polipéptido SLKGS removido SEQ ID NO: 09 Polipéptido de fusión de apolipoproteína A-I que comprende de expresión y purificación.

SEQ ID NO: 10 Polipéptido de fusión (IVN) de tetranectina-apolipoproteína A-l .

SEQ ID NO: 11 Polipéptido de fusión (PIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I .

SEQ ID NO: 12 Polipéptido de fusión (XPIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I .

SEQ ID NO: 13 Polipéptido de fusión (APIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I .

SEQ ID NO: 14 Polipéptido de fusión (XIVN) de tetranectina-apolipoproteína A-I que comprende marca de hexa-histidina .

SEQ ID NO: 15 a 52 Polipéptidos ligadores.

SEQ ID NO: 53 Secuencia de aminoácidos C-terminal subproducto principal.

SEQ ID NO: 54 Fragmento de interferón.

SEQ ID NO: 55 Marca de hexa-histidina.

SEQ ID NO: 56 Sitio de escisión de IgA proteasa Materiales y métodos Determinación de proteína: La concentración de proteína se determinó al determinar la densidad óptica (OD) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado con base a la secuencia de aminoácidos .

Técnica de ADN recombinante : Se usaron métodos adecuados para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 1 Elaboración y descripción de los plásmidos de expresión de E. coli El polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I se preparó por medios recombinantes . La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión expresado en la dirección N- a C-terminal es como sigue: - el aminoácido metionina ( ) , - un fragmento de una secuencia de interferón que tiene la secuencia de aminoácidos de CDLPQTHSL (SEQ ID NO: 54) , - un ligador de GS, una marca de hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 55) , - un ligador de GS, - un sitio de escisión de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEQ ID NO: 56) , y tetranectina-apolipoproteína A-I que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

El polipéptido de fusión de tetranectina- apolipoproteína A-I como se describe anteriormente es un polipéptido precursor del cual se liberan los polipéptidos de fusión finales de tetranectina-apolipoproteína A-I por escisión enzimática in vitro usando IgA proteasa.

El gen de fusión que codifica para el polipéptido precursor se montó con métodos y técnicas recombinantes conocidas por conexión de segmentos apropiados de ácido nucleico. Se verificaron mediante secuenciación de ADN las secuencias de ácido nucleico elaborados por síntesis química. El plásmido de expresión para la producción del polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I de SEQ ID NO: 10 que codifica para un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 09 se preparó como sigue.

Elaboración de plásmido de expresión de E. coli: El plásmido 4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) es un plásmido de expresión para la expresión de estreptavidina núcleo en E. coli. Se generó por ligación del fragmento EcoRI/Cel II-vector de 3142 pb de largo derivado del plásmido 1966 (1966-pBRori-URA3-LACI-T-repetición; reportado en EP-B 1 422 237) con una estreptavidina núcleo de 435 pb de largo que codifica para EcoRI/Cel II -fragmento .

El plásmido de expresión de E. coli de estreptavidina núcleo comprende los siguientes elementos: - el origen de replicación del vector pBR322 para la replicación en E. coli (que comprende a la posición pb 2517-3160 de acuerdo a Sutcliffe, G. , et al., Quant . Biol. 43 (1979) 77-90) . el gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae que codifica para orotidina 5 '-fosfato descarboxilasa (Rose, M. et al . Gene 29 (1984) 113-124) que permite la selección de plásmido por complementación de cepas mutantes de E. coli pyrF (auxotrofia de uracilo) , - el cásete de expresión de estreptavidina núcleo que comprende - el promotor híbrido T5 (promotor híbrido T5- PN25/03/04 de acuerdo con Bujard, H. , et al. Methods . Enzymol. 155 (1987) 416-433 and Stueber, D. , et al . , Immunol . Methods IV (1990) 121-152) que incluye un sitio de unión ribosómico sintético de acuerdo a Stueber, D., et al. (ver anteriormente) , - el gen de estreptavidina núcleo, - dos terminadores de transcripción derivados de bacteriófago, el terminador ?-?? (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) y el terminador fd (Beck, E. and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58), - el gen represor lacl de E. coli (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769) .

El plásmido de expresión final PARA LA expresión del polipéptido precursor de tetranectina-apolipoproteína A-I se preparó al escindir el gen estructural de estreptavidina núcleo del vector 4980 usando el sitio de escisión de endonucleasa de restricción EcoRI y Cel II de flanqueo singular y al insertar el ácido nucleico flanqueado por el sitio de restricción EcoR Il/Cel II que codifica para el polipéptido precursor en el fragmento del vector EcoRI/Cel 11-4980 de 3142 pb de largo.

Ejemplo 2 Expresión de tetranectina-apolipoproteína A-I Para la expresión de la proteína de fusión, se empleó un sistema de hospedador/ vector de E. coli que permite una selección de plásmido libre de antibiótico por complementación de una auxotrofia de E. coli (PyrF) (ver EP 0 972 838 y US 6, 291, 245) .

La cepa CSPZ-2 de E. Coli K12 (leuB, proC, trpE, th-1, ApyrF) se transformó por electroporación con el plásmido de expresión p ( IF -His6 - IgA-tetranectina-apolipoproteína A-I). Las células de E. coli transformadas se cultivaron primero a 37° C en placas de agar.

Protocolo de fermentación 1: Para la pre-fermentación, se ha usado un medio 9 de acuerdo a Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2da edición (Diciembre de 1989) complementado con aproximadamente 1 g/1 de L-leucina, aproximadamente 1 g/1 de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 tiamina-HCl.

Para la pre-fermentación, se inocularon 300 mi del medio M9 en un matraz Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores con 2 mi de una ampolleta en blanco de semilla primaria. El cultivo se realizó en un agitador giratorio durante 13 horas a 37° C hasta que se obtuvo una densidad óptica (578 nm) de 1-3.

Para la fermentación, se usó un medio de lote de acuerdo a Riesenberg et al. (Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27): 27.6 g/1 de glucosa*H20, 13.3 g/1 de KH2P04/ 4.0 g/1 de (NH4)2HP04, 1.7 g/1 de citrato, 1.2 g/1 de MgS04*7 H20, 60 mg/1 de citrato de hierro (III), 2.5 mg/1 de CoCl2*6 H20, 15 mg/1 de MnCl2*4 H20, 1.5 mg/1 de CuCl2*2 H20, 3 mg/1 H3B03, 2.5 mg/1 de Na2Mo04*2 H20, 8 mg/1 de Zn(CH3COO)2*2 H20, 8.4 mg/1 de Titriplex III, 1.3 ml/1 de agente anti-espuma Synperonic 10%. El medio de lote se complementó con 5.4 mg/1 de tiamina-HCl y 1.2 g/1 de L-leucina y L-prolina respectivamente. La solución de alimentación 1 contuvo 700 g/1 de glucosa complementada con 19.7 g/1 de MgS04*7 H20. La solución alcalina para regulación de pH fue una solución acuosa de NH3 al 12.5% (p/v) complementada con 50 g/1 de L-leucina y 50 g/1 de L-prolina, respectivamente. Todos los componentes se disolvieron en agua desionizada .

La fermentación se llevó a cabo en un termentador Biostat C DCU3 de 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania) .

Partiendo con el medio de lote de fermentación estéril 6.4 1 más 300 mi de inoculo de la pre- ermentación, la fermentación por lote se realizó a 37° C, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbar y una velocidad de aeración de 10 1/min. Después de que se agotó la glucosa inicialmente complementada, la temperatura se cambió a 28° C y la fermentación entró en el modo de lote alimentado. Aquí, el valor relativo del oxígeno disuelto (p02) se mantuvo a 50% (DO-stat, ver por ejemplo Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol . Biotechnol . 2 (1987) 79-85) al adicionar la alimentación 1 en combinación con una velocidad constantemente creciente del agitador (de 550 rpm a 1000 rpm en un período de 10 horas y de 1000 rpm a 1400 rpm en un período de 16 horas) y velocidad de aeración constantemente creciente (de 10 1/min a 16 1/min en 10 horas y de 16 1/min a 20 1/min en 5 horas) . El suministro con aminoácidos adicionales resultó de la adición de la solución alcalina, cuando el pH alcanzó el límite inferior de regulación (6.70) después de aproximadamente 8 horas de cultivo. La expresión de la proteína terapéutica recombinante se indujo por la adición de IPTG 1 MM a una densidad óptica de 70.

Al final de la fermentación, la tetranectina-apolipoproteína A-I citoplásmica y soluble, expresada, se transfirió agregados insolubles de proteína, los llamados cuerpos de inclusión, con un paso térmico donde el caldo completo de cultivo en el termentador se calienta a 50° C durante 1 o 2 horas antes de la recolección (ver por ejemplo EP-B 1 486 571) . Posteriormente, el contenido del fermentador se centrifugó con una centrífuga de flujo de paso (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa recolectada se almacenó a -20° C hasta procesamiento adicional. Las proteínas precursoras sintetizadas de tetranectina-apolipoproteína A-I se encontraron exclusivamente en la fracción insoluble de lechos celulares en la forma de agregados insolubles de proteína, los llamados cuerpos de inclusión (IBs, por sus siglas en inglés) .

Las muestras extraídas del fermentador, antes de la inducción y las otras en los puntos de tiempo dedicado después de la inducción de la expresión de proteína se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Para cada muestra, se re- suspendió la misma cantidad de células (ODobjetivo = 5) en 5 mL de amortiguador BPS y se desestabilizó mediante ultrasonido en hielo. Entonces, 100 uL de cada suspensión se centrifugan (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se retira y se transfiere a un frasco separado. Esto es para discriminar entre proteína objetivo expresada soluble e insoluble. A cada fracción de sobrenadante (= soluble) 300 xl¡ y a cada fracción de sedimento (= insoluble) , se adicionan 400 ih de amortiguador de muestra de SDS (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) . Las muestras se calientan durante 15 minutos a 95° C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas en las muestras . Después del enfriamiento a temperatura ambiente, se transfieren 5 µ?? de cada muestra a un gel de poliacrilamida libre de manchas 4-20% TGX Criterion (Bio-Rad) . Adicionalmente , en el gel se colocan 5 µ? de norma de peso molecular (Precisión Plus Protein Standard, Bio-Rad) y 3 cantidades de normas de cuantificación (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) con concentración conocida de proteína de producto (0.1 ug/µ?) · La electroforesis se corre durante 60 minutos a 200 V y posteriormente el gel se transfiere al GelDOC EZ Imager (Bio-Rad) y se procesa durante 5 minutos con radiación UV. Las imágenes en gel se analizaron usando software de análisis Image LAB (Bio-Rad) . Con las tres normas, se calculó una curva de regresión lineal con un coeficiente de > 0.99 y de lo mismo se calcularon las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original.

Protocolo 2 de fermentación: Para la pre-fermentación, se ha usado un medio M9 de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989) ) complementado con aproximadamente 1 g/1 de L-leucina, aproximadamente 1 g/1 de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 de tiamina-HCl.

Para la pre-fermentación, se inocularon 300 mi del medio M9 modificado en un matraz Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores de la placa de agar o con 1-2 mi de una ampolleta en blanco de semilla primaria, el cultivo se realizó en un agitador giratorio durante 13 horas a 37° C hasta que se obtuvo una densidad óptica (578 nm) de 1-3.

Para la fermentación y la expresión en alto rendimiento de tetranectina-apolipoproteína A-I, se usaron los siguientes medios por lote y alimentaciones: 8.85 g/1 de glucosa, 63.5 g/1 extracto de levadura, 2.2 g/1 de NH4C1, 1.94 g/1 de L-leucina, 2.91 g/1 de L-prolina, 0.74 g/1 de L-metionina, 17.3 g/1 de KH2P04*H20, 2.02 g/1 de gS04*7 H20, 25.8 mg/1 de Tiamina-HCl , 1.0 ml/1 de agente anti-espuma Synperonic 10%. La solución de alimentación 1 contuvo 333 g/1 extracto de levadura y 333 g/1 de glicerol al 85% complementado con 1.67 g/1 de L-metionina y 5 g/1 de L-leucina y L-prolina cada uno. La alimentación 2 fue una solución de 600 g/1 L-Prolina. La solución alcalina para la regulación del pH fue una solución de KOH al 10% (p/v) y como ácido se usó la solución de glucosa al 75%. Todos los componentes se disolvieron en agua desionizada.

La fermentación se llevó a cabo en un termentador Biostat C DCU3 de 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania). Iniciando con 5.15 1 de medio por lote de fermentación estéril más 300 mi de inoculo de la pre-fermentación, la fermentación de lote de alimentación se realizó a 25° C, pH 6.7 ± 0.2, 300 mbar y una velocidad de aeración de 10 1/min. Antes de que se agotara la glucosa inicialmente complementada, el cultivo alcanzó una densidad óptica de 15 (578 nm) y la fermentación entró en el modo de lote alimentado cuando se inició la alimentación 1 con 70 g/h. monitoreando la concentración de glucosa en el cultivo, la alimentación 1 se incrementó a un máximo de 150 g/h en tanto que se evita la acumulación de glucosa y se mantiene el pH cerca del límite superior de regulación de 6.9. A una densidad óptica de 50 (578 nm) , se inició la alimentación 2 con una velocidad de alimentación constante de 10 ml/h. el valor relativo del oxígeno disuelto (p02) se mantuvo por arriba de 50% al incrementar la velocidad del agitador (de 500 rpm a 1500 rpm) , la velocidad de aeración (de 10 1/min a 20 1/min) y la presión (de 300 mbar a 500 mbar) en paralelo. La expresión de la proteína terapéutica recombinante se indujo por la adición de IPTG 1 mM a una densidad óptica de 90.

Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, se analizaron siete muestras extraídas del termentador, una antes de la inducción en las otras en los puntos de tiempo dedicados después de la inducción de la expresión de la proteína. De cada muestra, se resuspendió la misma cantidad de células (ODobjetivo = 5) en 5 mL de amortiguador PBS y se desestabilizó mediante ultrasonido en hielo. Entonces, se centrifugaron 100 µL de cada suspensión (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se retiró y transfirió a un frasco separado. Esto es para discriminar entre la proteína objetivo expresada, soluble e insoluble. A cada fracción de sobrenadante (= soluble) 300 µL y a cada fracción de sedimento (= insoluble) se adicionaron 200 L de amortiguador de muestra de SOS (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685). Las muestras se calentaron durante 15 minutos a 95° C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas de las muestras. Después de enfriar a temperatura ambiente, se transfirieron 5 pL de cada muestra a un gel de poliacrilamida Bis-Tris al 10% (Novagen) . Adicionalmente , en el gel se colocaron 5 µ? de la norma de peso molecular (Precisión Plus Protein Standard, Bio-Rad) y 3 cantidades (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) de la norma de cuantificación con concentración conocida de la proteína de producto (0.1 µ9/µ1) .

La electroforesis se corrió durante 35 minutos a 200 V y luego el gel se tiñó con tinte Azul R brillante de Coomassie, se destiñó con agua caliente y se transfirió a un densitometro óptico para digitalización (GS710, Bio-Rad) . Las imágenes de gel se analizaron usando el software de análisis Quantity One 1-D (Bio-Rad) . Con las tres normas, se calculó una curva de regresión lineal con un coeficiente >0.98 y de esto se calcularon las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original.

Al final de la fermentación, el pro-polipéptido de tetranectina-apolipoproteína A-I citoplasmático, expresado y soluble se transfirió a agregados insolubles de proteína, los llamados cuerpos de inclusión (IB) , con un paso térmico donde el caldo completo de cultivo del termentador se calienta a 50° C durante 1 o 2 horas antes de la recolección (ver por ejemplo, EP-B 1 486 571) . Después del paso térmico, el pro-polipéptido de tetranectina-apolipoproteína A-I sintetizado se encontró exclusivamente en la fracción insoluble de desechos celulares en la forma de IB.

Los contenidos del termentador se enfrían a 4-8° C, se centrifugan con una centrífuga de flujo de paso (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa recolectada se almacena a -20° C hasta el procesamiento adicional. El rendimiento total de la biomasa recolectada varió entre 39 g/1 y 90 g/1 de materia seca dependiendo de la construcción expresada.

Ejemplo 3 Preparación de tetranectina-apolipoproteína A-I Se llevó a cabo la preparación de los cuerpos de inclusión por resuspensión de células bacterianas recolectadas en una solución de amortiguador de fosfato de potasio (0.1 M, complementada con MgS0 1 MM, pH 6.5). Después de la adición de ADNasa, las células se perturbaron por homogenización a una presión de 900 bar. A la suspensión de células homogenizadas , se adicionó una solución amortiguadora que comprende NaCl 1.5 . Después del ajuste del valor de pH a 5.0 con HC1 al 25% (p/v) , se obtuvo la suspensión espesa final de cuerpos de inclusión después de un paso adicional de centrifugación. La suspensión espesa se almacenó a -20° C en bolsas de plástico estériles de uso único hasta procesamiento adicional.

Se solubilizaron 11.75 g de cuerpos de inclusión en 235 mi de cloruro de guanidinio 6 M, Tris 50 mM, DTT 1 mM, pH 8.0 durante 3.5 horas. Después de la centrifugación, el producto solubilizado se cargó en una columna NiNTA (Qiagen) puesta en equilibrio en Tris 50 mM, NaCl 1 M, urea 8 M, pH 8.0. Posteriormente, la columna se enjuagó con Tris 50 mM, cloruro de guanidinio 6 M, pH 8.0 seguido por lavados alternados con Tris 50 mM, urea 8 M, pH 8.0 y Tris 50 mM, isopropanol al 60% (5 ciclos) , el último paso que es Tris 50 mM, urea 8 M, pH 8.0. La elución se realizó con un gradiente de pH iniciando a Tris 50 mM, NaCl 0.5 M, urea 8 M, pH 7.0 a Tris 50 mM, NaCl 0.5 M, urea 8 M, pH 3.0. Las fracciones pico se mezclaron y dializaron contra Tris 100 mM, NaCl 100 mM, pH 7.8. Se realizó a temperatura ambiente durante 24 horas la escisión con IgA proteasa con una relación de 1:2000 p/p (IgA proteasa : proteína) . Esta solución se dializó contra acetato de sodio 25 mM, Tris 1 mM, pH 4.5. Se adicionó urea a una concentración final de 8 M. Esta solución de proteína se cargó en una SP-Sefarosa (GE) puesta en equilibrio con amortiguador de acetato de sodio 25 mM, Tris 1 mM, urea 8 M, pH 4.5 y se eluyó con un gradiente a acetato de sodio 25 mM, Tris 1 mM, NaCl 0.3 M, urea 8 M, pH 4.5. Las fracciones se mezclaron de acuerdo a SDS-PAGE y se dializaron contra Tris 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7.5.

Ejemplo 4 Análisis de polipéptidos de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I Las mezclas o fracciones de las columnas de purificación NiNTA (Qiagen) y SP-Sefarosa (TM) (GE) se desaliñaron y analizaron por espectrometría de masas con ionización por electro-rociado (ESI-MS) .

Se realizó la desalinación fuera de línea por cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna HR5/20 (0.7 x 22 cm, Amersham Bioscience) empacada en casa con material súper fino Sephadex G25 (Amersham Bioscience 17-0851-01) y una elución isocrática con 40% de acetonitrilo, 2% de ácido fórmico con un flujo de 1 ml/min. La señal se monitorizó a una longitud de onda de 280 nm y se recolectó manualmente el pico de polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína, de elución.

Se realizó ESI-MS para monitorizar la presencia del fragmento en un espectrómetro de masas Q-Star Elite QTOF (Applied Biosystems (ABI) , Darmstadt, Alemania) equipado con un sistema fuente Triversa NanoMate (Advion, Ithaka, EUA) usando un potencial desembragador de 50 y un potencial de enfoque de 200. Se registraron 15 exploraciones por 5 segundos en el intervalo m/z de 700 a 2000.

Se analizaron los datos de ESI-MS usando dos paquetes de software, Analyst (Applied Biosystems (ABI) , Darmstadt, Alemania) y MassAnalyzer (plataforma de software desarrollado en casa) . Los espectros de masa se verificaron manualmente para la presencia de señales que tengan la masa molecular del fragmento de proteína que resulta del desplazamiento de marco de lectura en el oligonucleótido respectivo que codifica para el dipéptido AR (delta de -6269 Da en comparación a la masa molecular esperada del polipéptido de fusión de longitud completa) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para la reducción de la formación de subproductos por el desplazamiento del marco de lectura l->2 en la producción de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06), caracterizado porque comprende el siguiente paso: recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido. en donde el oligonucleótido que codifica para el dipéptido AR comprendido en el ácido nucleico que codifica para el polipéptido tiene el nucleótido ? c' en la cuarta posición.

2. Un método para reducir la formación de subproductos por desplazamiento de marco de lectura 1 -> 2 en la producción recombinante de un polipéptido, que comprende el dipéptido AR (SEQ ID NO: 06), caracterizado porque comprende el siguiente paso: recuperar el polipéptido de las células o el medio de cultivo de un cultivo de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido y producir de este modo el polipéptido. por lo que el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt (SEQ ID NO: 03) o el oligonucleótido gcg cgt (SEQ ID NO: 04) o el oligonucleótido gcc cgt (SEQ ID NO : 05) .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dipéptido AR comprendido en el polipéptido se codifica por el oligonucleótido gca cgt, o el oligonucleótido gcg cgt, o el oligonucleótido gcc cgt.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula es una célula procariótica .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula procariótica es una célula de E. coli.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el polipéptido es una apolipoproteína A-I, o una variante de ésta que tiene actividad de apolipoproteína A-I, o un polipéptido de fusión del mismo que tiene actividad de apolipoproteína A-I.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 09 a SEQ ID NO: 14.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 o SEQ ID NO: 11.