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MX2014006739A - Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos. - Google Patents

Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.

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MX2014006739A
MX2014006739A MX2014006739A MX2014006739A MX2014006739A MX 2014006739 A MX2014006739 A MX 2014006739A MX 2014006739 A MX2014006739 A MX 2014006739A MX 2014006739 A MX2014006739 A MX 2014006739A MX 2014006739 A MX2014006739 A MX 2014006739A
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MX
Mexico
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antibody
conjugate
cytotoxin
formula
Prior art date
Application number
MX2014006739A
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English (en)
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David Y Jackson
Edward Ha
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Igenica Biotherapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

Se describen conjugados de anticuerpo-fármaco, anticuerpo-citotoxina y compuestos relacionados, tales como conjugados de enlazador-citotoxina y los enlazadores usados para hacer los mismos, análogos de tubulisina, y síntesis de intermediarios; composiciones; y métodos, incluyendo métodos para el tratamiento de cánceres.

Description

CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FARMACO Y COMPUESTOS RELACIONADOS. COMPOSICIONES. Y METODOS Antecedentes de la invención Campo de la invención Esta invención se refiere a conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs) y compuestos relacionados, tales como enlazadores usados para hacerlos, análogos de tubulisina e intermediarios en sus síntesis; composiciones; y métodos, incluyendo métodos para tratar cánceres.
Descripción de la téenica relacionada El cáncer es la segunda causa más frecuente de muerte en Estados Unidos, aunque existen pocas opciones de tratamiento efectivas más allá de resección quirúrgica. De los tratamientos médicos para cánceres, el uso de anticuerpos monoclonales que enfocan antígenos presentes en las células de cáncer se ha vuelto más común. Los anticuerpos anticánceres aprobados para uso terapéutico en Estados Unidos incluyen alemtuzumab (CAMPATH®), un anticuerpo anti-CD52 humanizado usado en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica; bevacízumab (AVASTIN®), un anticuerpo anti-VEGF humanizado usado en cáncer colorrectal; cetuximab (ERBITUX®, un anticuerpo de factor de crecimiento anti-epidérmico quimérico usado en cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, y carcinoma de células escamosas; ipilimumab (YERVOY®), un anticuerpo anti-CTLA-4 humano usado en melanoma; ofatumumab (ARZERRA®), anticuerpo anti-CD20 humano usado en leucemia linfocítica crónica, panitumumab (VECTIBIX®), un anticuerpo de receptor de factor de crecimiento anti-epidermico humano usado en cáncer colorrectal; rituximab (RITUXAN®), un anticuerpo anti-CD20 quimérico usado en linfoma no de Hodgkin; tositumomab (BEXXAR®), un anticuerpo anti-CD20 de murino usado en linfoma no de Hodgkin; y trastuzumab (HERCEPTIN®), un anticuerpo anti-HER2 humanizado usado en cáncer de pecho. Aunque estos anticuerpos han probado ser útiles en los tratamientos de los cánceres para los cuales son indicados, rara vez son curativos como agentes simples, y son generalmente usados en combinación con quimioterapia estándar para el cáncer.
Como un ejemplo, el trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de DNA recombinante que se une selectivamente con alta afinidad al dominio extracelular de la proteína de receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano, HER2 (ErbB2) (Coussens et al., Science 1985, 230, 1132-9; Salmón et al., Science 1989, 244, 707-12), inhibiendo por ello el crecimiento de células cancerosas HER2-positivas. Aunque HERCEPTIN es útil para tratar pacientes con cánceres de pecho que sobreexpresan HER2 que han recibido extensa terapia anti-cáncer previa, algunos pacientes en esta población fracasan en responder o responden solo pobremente a tratamiento con HERCEPTIN. Por lo tanto, existe una necesidad clínica significativa para desarrollar terapias de cáncer dirigidas por HER2 adicionales para aquellos pacientes con tumores que sobreexpresan HEr2 u otras enfermedades asociadas con expresión de HER2 que no responden, o responden pobremente, a tratamiento con HERCEPTIN.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs), una clase creciente rápidamente de terapéuticos dirigidos, representan una nueva aproximación prometedora hacia mejorar tanto la selectividad como la actividad citotóxica de fármacos para cáncer. Ver, por ejemplo, Trail et al., “Monoclonal antibody drug immunogonjugates for targetes treatment of cáncer” (Inmunoconjugados de anticuerpo monoclonal-fármaco para tratamiento dirigido de cáncer), Cáncer Immunol. Immunother. 2003, 52, 328-337; y Chari, “Targeted Cáncer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs” (Terapia de cáncer dirigida: que confiere especificidad a fármacos citotóxicos), Acc. Chem. Res., 2008, 41 (1 ), 98-107. Estos ADCs tienen tres componentes: (1 ) un anticuerpo monoclonal conjugado a través de un “2) enlazador a una (3) citotoxicina. Las citotóxicas son unidas a ya sea cadenas laterales de lisina o cisteína sobre el anticuerpo a través de enlazadores que reaccionan selectivamente con aminas primarias en lisina o con grupos sulfhidrilo sobre cisteína. El número máximo de enlazadores/medicamentos que puede ser conjugado depende el número de grupos amino o sulfhidrilo reactivos que están presentes en el anticuerpo. Un anticuerpo típico contiene hasta 90 lisinas como sitios de conjugación potenciales: sin embargo, el número óptimo de citotoxinas por anticuerpo para la mayoría de ADCs está normalmente entre 2 y 4 debido a la agregación de ADCs con mayor número de citotoxinas. Como resultado, los ADCs enlazados con lisina convencionales actualmente en desarrollo clínico son mezclas heterogéneas que contienen desde 0 hasta 10 citotoxinas por anticuerpo conjugado a diferentes grupos amino sobre el anticuerpo. Los factores clave en el éxito de un ADC incluyen que el anticuerpo monoclonal sea específico de antígeno de cáncer, no inmunogénico, de baja toxicidad e internalizado por células de cáncer; la citotoxina es altamente potente y es adecuada para unión a enlazador; mientras que el enlazador puede ser específico para unión de cisteína (S) o lisina (N), sea estable en circulación, puede ser cortable por proteasa y/o sensible a pH, y sea adecuado para unión a la citotoxina.
Los ADCs anti-cáncer aprobados para uso terapéutico en Estados Unidos incluyen brentuximab vedotin (ADCETRIS®), un anticuerpo anti-CD30 quimérico conjugado con monometilauristatin E usado en linfoma de células grandes anaplásticas y linfoma de Hodgkin; y gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®), un anticuerpo antí-CD33 humanizado conjugado con caliqueamicina g usado en leucemia mielógena aguda -aunque este fue retirado en 2010 por falta de eficacia.
Aunque varios ADCs han demostrado un éxito clínico reciente, la utilidad de la mayoría de ADCs actualmente en desarrollo pueden ser limitados por procesos sintéticos engorrosos que resultan en altos costos de productos, actividad anti-tumor insuficiente asociada con potencia limitada del fármaco citotóxico, y seguridad cuestionable debido a la inestabilidad de enlazador y heterogeneidad de ADC. Ver, por ejemplo, Ducry et al., “Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies” (Conjugados anticuerpo-fármaco: enlazan cargas citotóxicas a anticuerpos monoclonales), Bioconjugate Chem. 2010, 21 , 5-13; Chari, “Targeted Cáncer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs” (Terapia de cáncer dirigida; que confiere especificidad a fármacos citotóxicos), Acc. Chem. Res. 2008, 41 , 98-197; y Senter, “Recent advancements in the use of antibody drug conjugates for cáncer therapy” (Avances recientes en el uso de conjugados de anticuerpo fármaco para terapia de cáncer), Biotechnol.: Pharma. Aspects, 2010, 1 1 , 309-322.
Como un ejemplo, el trastuzumab ha sido conjugado al fármaco maitansinoide mertansina para formar ADC trastuzumab emtansina, también llamado trastuzumab-DM1 o trastuzumab-MC-DM1 , abreviado T-DM1 (LoRusso et al, “Trastuzumab Emtansine: A Unique Antibody-Drug Conjúgate in Development for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cáncer” (Trastuzumab Emtansina: un conjugado de anticuerpo-fármaco único para desarrollo de receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2-cáncer positivo), Clin. Cáncer Res. 2011 , 17, 6437-6447; Burris et al., “Trastuzumab emtansine: a novel antibody-drug conjúgate for HER2-positive breast cáncer” (Trastuzumab emtansina: un novedoso conjugado de anticuerpo-fármaco para cáncer de pecho positivo a HER2), Expert Opin. Biol. Ther. 2011 , 11 , 807-819). Está ahora en estudios de Fase III en US para esa indicación. La mertansina es conjugada con trastuzumab a través de un enlazador de maleimidocapropilo (MC), el cual se une a la maleimida al extremo de ácido 4-tiovalérico de la cadena lateral de mertansina y forma un enlace de amida entre el grupo carboxilo del enlazador y una amina básica de lisina del trastuzumab. El trastuzumab tiene 88 lisinas (y 32 cisteinas). Como un resultado, la trastuzumab emtansina es altamente heterogénea, conteniendo docenas de diferentes moléculas conteniendo desde 0 hasta 8 unidades de mertansina por treastuzumab, con una proporción de mertansina/trastuzumab promedio de 3.4.
Las cisteínas de anticuerpo también pueden ser usadas para conjugación a citotoxinas a través de enlazadores que contienen maleimidas u otros grupos funcionales específicos de tiol. Un anticuerpo típico contiene 4, o algunas veces 5, enlaces disulfuro intercadena (2 entre las cadenas pesadas y 2 entre las cadenas pesadas y ligeras), que unen covalentemente las cadenas pesadas y ligeras juntas y contribuyen a la estabilidad de los anticuerpos in vivo. Estos disulfuros intercadena pueden ser reducidos selectivamente con ditiotreitol, tris(2-carboxietil)fosfina u otros agentes de reducción suaves para dar 8 grupos sulfhidrilo reactivos para conjugación. Los ADCs enlazados a cisteína son menos heterogéneos que los ADCs enlazados a lisina debido a que existen menos sitos de conjugación potenciales; sin embargo, también tienden a ser menos estables debido a la pérdida parcial de los enlaces disulfuro intercadena durante la conjugación, debido a que los enlazadores de cisteína actuales se unen a solo un átomo de azufre. El número óptimo de citotoxinas por anticuerpo para ADCs enlazados a cisteína también es 2 a 4. Por ejemplo, ACETRIS es una mezcla heterogénea que contiene 0 a 8 residuos de monometilauristatina E por anticuerpo conjugado a través de cisteínas.
Las tubulisinas, aisladas primero por el grupo Hófle/Reichenbach de cultivos mixobacterianos (Sasse et al., J Antibito. 2000, 53, 879-885), son inhibidores de crecimiento celular excepcionalmente potentes que actúan al inhibir la polimerización de tubulina y por ello inducen apoptosis. (Khalil et al., Chem. Biochem. 2006, 7, 678-683; y Kaur et al., Biochem. J. 2006, 396, 235-242). Las tubulisinas, de las cuales la tubulisina D es la más potente, tienen actividad que excede la mayoría de los demás modificadores de tubulina incluyendo, las epotilonas, vinblastina, y paclitaxel (TAXOL®), por 10 a 1000 veces. (Steinmetz et al., Angew. Che. 2004, 116, 4996-5000; Steinmetz et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4888-4892; y Hófle et al., Pure App. Che. 2003, 75-167-178). El paclitaxel y vinblastina son tratamientos actuales para una variedad de cánceres, y los derivados de epotilona están bajo evaluación activa en ensayos clínicos. Los derivados sintéticos de tubulisina D proporcionarían información esencial sobre el mecanismo de inhibición e interacciones de unión clave, y podrían tener propiedades superiores como agentes anti-cáncer ya sea como entidades aisladas o como cabezas químicas sobre anticuerpos o ligandos dirigidos.
La tublisina D es un tetrapéptido complejo que puede ser dividido en cuatro regiones, Mep (ácido D-N-metilpipecolínico), lie (isoleucina), Tuv (tubuvalina) y Tup (tubufenilalanina), como se muestra en la fórmula: La mayoría de los derivados de tubulisina más potentes, incluyendo tubulisina D, también incorporan la funcionalidad de O-acil N,O-acetal, la cual ha sido observara rara vez en los productos naturales. Esta funcionalidad reactiva es lábil tanto en condiciones de reacción ácidas como básicas, y por lo tanto pueden jugar un papel clave en la función de las tubulisinas. (Ilcy et al., Pharm. Res. 1997, 14, 1634-1639). Recientemente, la síntesis total de tubulisina D fue reportada, la cual representa la primera síntesis de cualquier miembro de la familia de tubulisina que incorpora la funcionalidad de O-acil N,0-acetal. (Peltier et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16018-16019). Otras tubulisinas, incluyendo tubulisinas U y V, han sido sintetizadas por Dómling et al., “Total Synthesis of Tubulysins U and V” (Síntesis total de tubulisinas U y V), Angew. Che. INt. Ed. 2006, 45, 7235-7239.
La publicación de solicitud de patente estadounidense no. US 2011/0021568 A1 (Ellman et al.) describe la síntesis y actividades de una variedad de análogos de tubulisina, incluyendo compuestos (40) y (10) referidos en la presente como T1 y T2, respectivamente: Schumacher et al., ?h Situ Maleimide Bridging of Disulfides and a New Approact to Protein PEGylation” (Puenteo de maleimida ¡n situ de disulfuros y una nueva aproximación a PEGilación de proteína), Bioconjugate Chem. 2011 , 22, 132-136, describen la síntesis de maleimidas 3,4-disubstiutidas, tales como, 3,4-bis(2-hidroxietilsulfanil)pirrol-2,5-diona [referida por Schumacher et al. Como “dimercaptoetanolma leí mida”] y 3,4-hbis(fenilsulfanil)pirrol-2,5-diona [“ditiofenolmaleimida”], y sus derivados N-PEGilados como agentes PEGilantes para somatostatina, donde los enlaces de maleimida substituidos a los dos átomos de azufre de un enlace disulfuro de cisteína-cisteína abierto.
Sería deseable desarrollar ADCs homogeneos, potentes, composiciones conteniéndolos, y métodos para su uso para tratar cánceres, y métodos e intermediarios en su preparación.
Breve descripción de la invención En un primer aspecto, esta invención es un conjugado de anticuerpo-fármaco de anticuerpo-citotoxina (ADCs) de la fórmula: donde: A es un anticuerpo, PD es pirrol-2,5-diona o pirrolidin-2,5-diona, el doble enlace representa enlaces de las posiciones 3 y 4 de la pirrol-2,5-diona o pirrolidin-2,5-diona a los dos átomos de azufre de un enlace disulfuro de cisteína-cisteína abierto en el anticuerpo, L es— (C H 2)m- o -(CH2CH2O)mCH2CH2-, CTX es una citotoxina unida a L por un enlace de amida, n es un entero de 1 a 4, y m es un entero de 1 a 12.
Debido a la unión bidentada del PD a los dos átomos de azufre de un enlace disulfuro cisteína-cisteína abierto en los anticuerpos, estos ADCs son homogéneos y tienen estabilidad mejorada sobre ADCs con enlazadores monodentados. Por lo tanto, tendrán vidas medias incrementadas in vivo, reduciendo la cantidad de citotoxina sistémicamente liberada, y serán más seguros que ADCs con enlazadores monodentados.
En un segundo aspecto, esta invención son composiciones farmacéuticas conteniendo ADCs del primer aspecto de esta invención; y en un tercer aspecto, esta invención son métodos de tratamiento de cánceres enfocados por los anticuerpos relevantes al administrar ADCs del primer aspecto de esta invención o composiciones farmacéuticas del segundo aspecto de esta invención.
En cuarto aspecto, esta invención son conjugados de enlazador-citotoxina de fórmula A, fórmula B, y fórmula C: —— - A B C donde R es alquilo de Ci-6, opcionalme nte substituido con halo o hidroxi lo; fenilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C i -3 alcoxicarbonilo, o Ci-3 alcoxicarbonilo, o C1-3 alquilo; naftilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo, o C1-3 alquilo; o 2-piridilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, Ci-3 alcoxicarbonilo o C1.3 alquilo, L es -(CH2)m- o -(CH2CH2O)mCH2CH2-, CTX es una citotoxina unida a L por un enlace de amida, y m es un entero de 1 a 12.
Estos conjugados de enlazador-citotoxina bidentados son útiles para preparar los conjugados de anticuerpo-fármaco del primer aspecto de esta invención.
En un qumto aspecto, esta invención son enlazadores de fórmula AA, BB y CC: AA BB CC donde R es Ci-e alquilo, opcionalmente substituido con halo o hidroxilo; fenilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo, o C1.3 alquilo; naftilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo, o C1.3 alquilo; o 2-piridilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o C1-3 alquilo, L es -(CH2)m- o -(CH2CH20)mCH2CH2-, Z es carboxilo, C1-6 alcoxicarbonilo, o amino, y m es un entero de 1 a 12.
Estos enlazadores bidentados son útiles para preparar los conjugados de enlazador-citotoxina del cuarto aspecto de esta invención.
En un sexto aspecto, esta invención son enlazadores de fórmula AAA, BBB y CCC: ' donde R’ es cloro, bromo, yodo, Ci-6 alquilsulfoniloxi, trifluorometanosulfoniloxi, bencenosulflniloxi, o 4-toluenosulfoniloxi, L es -(CH2)m- o -(CH2CH2O)mCH2CH2-, Z es carboxilo, Ci-e alcoxicarbonilo, o amino, y m es un entero de 1 a 12.
Estos enlazadores bidentados tambien son útiles para preparar los conjugados de enlazador-citotoxina del cuarto aspecto de esta invención, y son útiles para preparar los enlazadores del qumto aspecto de esta invención.
En un séptimo aspecto, esta invención son tubulisinas de las fórmulas de las fórmulas T3 y T4: ¡ - Estas nuevas tubulisinas son análogos de las tubulisinas conocidas T1 y T2 referidas previamente, pero debido a que la N-metilpiperidina terminal ha sido reemplazada por una piperidina no substituida, estos nuevos compuestos son capaces de formar conjugados de tubulisina-enlazador con enlazadores conteniendo un grupo carboxilo al formar un enlace de amida entre el átomo de nitrógeno de piperidina y el carbonilo del grupo carboxi de enlazador.
Las modalidades preferidas de esta invención son caracterizadas por la especificación y por las características de las reivindicaciones 1 a 47 de esta solicitud como se presenta, y de composiciones farmaceuticas correspondientes, métodos, y usos de estos compuestos.
Descripción detallada de la invención Definiciones Un “anticuerpo”, también conocido como inmunoglobulina es una proteína con forma de Y grande usada por el sistema inmune para identificar y neutralizar objetos extraños, tales como bacterias y virus. El anticuerpo reconoce una parte única del objetivo extraño, llamado un antígeno, debido a que cada punta del “Y” del anticuerpo contiene un sitio que es específico a un sitio en un antígeno, permitiendo estas dos estructuras unirse con precisión. Un anticuerpo consiste de cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces de disulfuro de cisteína. Un “anticuerpo monoclonal” es un anticuerpo monoespecífico, donde todas las moléculas de anticuerpo son idénticas debido a que se hacen mediante células inmunes idénticas que son todas clones de una célula madre única. Inicialmente, los anticuerpos monoclonales son preparos normalmente al fundir células de mieloma con las células de bazo a partir de un ratón (o células B de un conejo) que ha sido inmunizado con el antígeno deseado, purificando entonces los hibridomas resultantes por tales téenicas como purificación por afinidad. Los anticuerpos monoclonales recombinantes son preparados en células de virus o levadura en lugar de en ratones, a través de las tecnologías referidas como clonación de repertorio o despliegue de fagos/despliegue de levadura, la clonación de segmentos de genes de inmunoglobulinas para crear genotecas de anticuerpos con secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes a partir de los cuales los anticuerpos con especificidades deseadas pueden ser obtenidos. Los anticuerpos resultantes pueden ser preparados a gran escala mediante fermentación. Anticuerpos “quiméricos” o “humanizados” son anticuerpos conteniendo una combinación de las secuencias de DNA originales (usualmente de ratón) y humanas usadas en el proceso recombinante, tal como aquellos en los cuales el DNA de ratón codifica la porción de unión de un anticuerpo monoclonal es fundido con DNA productor de anticuerpos humanos para producir un anticuerpo monoclonal parcialmente humano, parcialmente de ratón. Los anticuerpos completamente humanizados son producidos usando ratones transgénicos (diseñados para producir anticuerpos humanos) o genotecas de despliegue de fagos. Los anticuerpos de interés particular en esta invención son aquéllos que son específicos para antígenos de cáncer, son no inmungénicos, tienen baja toxicidad, y son fácilmente internalizados por células de cáncer; y anticuerpos adecuados incluyen alembtuzumab, bevacizumab, brentuximab, cetuximab, gemtuzumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab.
Una “citotoxina” es una molécula que, cuando se libera dentro de una célula de cáncer, es tóxica a esa célula. Las citotoxinas de interés particular en esta invención son las tubulisinas (tales como las tubulisinas de las fórmulas T3 y T4), las auristatinas (tales como monometilauristatia E y monometilauristatina F), los maitansinoides (tal como mertansina), las caliqueamicinas (tal como caliqueamicina g); y especialmente esas citotoxinas que, igual que las tubulisinas de las fórmulas T3 y T4, son capaces de coordinación a través de un enlace de amida a un enlazador, tal como al poseer una amina básica o un grupo carboxilo.
Un “enlazador” es una molécula con dos extremos reactivos, uno para conjugación a un anticuerpo y el otro para conjugación a una citoxocina. El extremo reactivo de conjugación de anticuerpo del enlazador es normalmente un sitio que es capaz de conjugación del anticuerpo a través de un grupo tiol de cisteína o amina de lisina en el anticuerpo, y así es normalmente un grupo reactivo de tiol, tal como un doble enlace (como en maleimida) o un grupo que sale, tal como un cloro, bromo, o yodo, o un grupo R-sulfanilo, o un grupo reactivo de amina, tal como un grupo carboxilo; aunque el extremo reactivo de conjugación de anticuerpo del enlazador es normalmente un sitio que es capaz de conjugación a la citotoxina a través de la formación de un enlace de amida con un grupo carboxilo o amina básico en la citotoxina, y así es normalmente un grupo carboxilo o amina básica. Cuando el termino “enlazador” es usado para describir el enlazador en forma conjugado, uno o ambos de los extremos reactivos estarán ausentes (tal como que el grupo que sale del grupo reactivo de tiol) o incompleto (tal como el ser solo el carbonilo del ácido carboxílico) debido a la formación de los enlaces entre el enlazador y/o la citotoxina.
Un “conjugado de anticuerpo-fármaco” o “ADC” es un anticuerpo que es conjugado a uno o más (normalmente 1 a 4) citotoxicinas, cada uno a través de un enlazador. El anticuerpo es normalmente un anticuerpo monoclonal específico a un antígeno de cáncer.
La “tubulisina” incluye tanto los productos naturales descritos como tubulisinas, tales como por Sasse et al. y otros autores mencionados en la Descripción de la téenica relacionada, y también los análogos de tubulisina descritos en la publicación de la solicitud de patente estadounidense no. US 2011/0021568 A1. Las tubulisinas de interés particular en esta invención son las tubulisinas de las fórmulas T3 y T4, y otras tubulisinas donde la N-metilpiperidina terminal ha sido reemplazad por una piperidina no substituida, permitiendo la formación de enlace de amida con un enlazador.
Una “amina básica”, tal como la amina que forma una parte del grupo de piperidina terminal de las tubulisinas de las fórmulas T3 y T4, es una amina primaria o secundaria que o es parte de una amida.
Una “cantidad terapéuticamente efectiva” significa que la cantidad de un ADC del primer aspecto de esta invención o composición del segundo aspecto de esta invención la cual, cuando se administra a un humano que sufre de un cáncer, es suficiente para efectuar el tratamiento para el cáncer. “Tratar” o “tratamiento” del cáncer incluye uno o más de: (1 ) limitar/inhibir el crecimiento del cáncer, es decir, limitando su desarrollo; (2) reducir/prevenir el esparcimiento del cáncer, es decir, reducir/prevenir la metástasis; (3) aliviar el cáncer, es decir, provocar la regresión del cáncer, (4) reducir/prevenir la recurrencia del cáncer; y (5) paliar los síntomas del cáncer.
Los cánceres de interés para tratamiento incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastromtestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama incluyendo, por ejemplo, cáncer de mama HER2-positivo, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células B, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello y metástasis asociadas.
Abreviaturas/acrón irnos ADC: conjugado de anticuerpo-fármaco; DEA: dietilamina; DCC: 1 ,3-diciclohexilcarbodiimida; DIAD: azodicarboxilato de diisopropilo; DIPC: 1 ,3-diisopropilcarbodiimida; DIPEA: diisopropiletilamina; DMF: N,N-dimetMformamida; DPBS: solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco; DTPA: ácido dietilentriaminopentaacético; DTT: ditiotreitol; EDC: etil 3-(3-dimetilamiopropil)carbodiimida; HATU: hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N ,N,N’,N’-tetrametiluronio; HOBT: N-hidroxibenzotriazol; NHS: N-hidroxisuccinimida; NMM: N-metilmorfolina; MMAE: monometilauristatina E; MMAF: monometilauristatina F, monomtilauristatin fenilalanina; MC: maleimidocaproilo, 6-(2,5-dioxopirroliljhexanoilo; PBS: solución salina amortiguada con fosfato; PEG: poli(etilenglicol); TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -i!)-1 , 1 ,3,3-tetrametiluronio; TCEP: tris(2-carboxietil)fosfina; TGI: inhibición de crecimiento de tumor.
Los ADCs de la invención Como se menciona en la Descripción de la téenica relacionada, los ADCs de la técnica anterior que coordinan a cisteína tioles del anticuerpo han empleado enlazadores monofuncionales, de los cuales el enlazador de MC es un ejemplo. La reducción y abertura de los enlaces disulfuro de cisteína-cisteína para dar tioles libres para conjugación disminuye la estabilidad del anticuerpo, y la formación del ADC mediante reacción de los tioles reducidos no re-forman un enlace, como es ilustrado en el esquema a continuación: i i l i i¬ - l i i i Sin embargo, los enlazadores basados en pirrol-2,5-diona y pirrolidin-2,5-diuona bifuncionales de esta invención contienen dos grupos funcionales reactivos (X en el esquema a continuación) que reaccionan con los dos átomos de azufre de un enlace disulfuro de cisteína-cisteína abierto. La reacción del enlazador bifuncional con las dos cisternas da un conjugado de anticuerpo de ditiosuscinimida o ditiomaleimida “engrapada” con un enlazador por disulfuro conectado a través de dos enlaces de tioéter, como es mostrado en el esquema a continuación (doble enlace ausente del anillo: enlazadores de succinimida de las fórmulas AA y AAA; doble enlace presente en el anillo: enlazadores de maleimida de las fórmulas BB y BBB): i i A diferencia de los métodos convencionales para conjugación de cisteína, la reacción re-forma una estructura covalentemente unida entre los 2 átomos de azufre de cisteína y por lo tanto no comprometen la estabilidad global del anticuerpo. El método también permite la conjugación de un óptimo de 4 fármacos por anticuerpo para dar un ADC homogéneo debido a que todas las cisteínas reactivas son usadas. El resultado global es reemplazo de un disulfuro relativamente lábil con una “grapa” estable entre las cisteínas. Los enlazadores de maleimida monosubstituidos (fórmulas CC y CCC) también son efectivamente bifuncionales en conjugación con el anticuerpo debido a que el doble enlace de la maleimida es capaz de conjugación a uno de los átomos de azufre de cisteína y el grupo X con el otro.
Preparación de los compuestos de la invención Los compuestos de la invención, tales como ADCs, conjugados de enlazador-citotoxina, enlazadores y tubulisinas, son preparadas mediante métodos convencionales de química orgánica y bio-orgánica. Ver, por ejemplo, Larock, “Comprehensive Organic Transformations” (Transformaciones orgánicas extensas”, Wilcy-VCH, New York, N.Y. , U.S.A. Grupos protectores adecuados y sus métodos de adición y remoción, donde son apropiados, son descritos en Greene et al. , “Protective Groups in Organic Synthesis" (Grupos protectores en la síntesis orgánica), 2a ed., 1991 , John Wilcy and Sons, New York, NY. U S. A. También puede hacerse referencia a los documentos referidos en otra parte en la solicitud, tal como el artículo de Schumacher et al. Referido antes para la síntesis de enlazadores, la publicación de solicitud de patente estadounidense no. US 2011/0021568 A1 para la preparación de tubulisinas, etc.
Preparación de las tubulisinas Las tubulisinas T3 y T4 son preparadas mediante métodos análogos para aquéllos de Peltier et al. y la publicación de solicitud de patente estadounidense no. US 2011/0021568 A1 , al substituir ácido D-pipecolínico para el ácido D-N-metilpipecolínico, proteger y desproteger si es apropiado.
Preparación de los enlazadores El comparador enlazador de MC es preparado mediante los métodos conocidos en la téenica para su preparación.
Los enlazadores de esta invención son preparados mediante los métodos análogos para aquéllos de Schumacher et al., como sigue (en este esquema de reacción, R, L y Z tienen los significados dados en ellos en la discusión de los qumto y sexto aspectos de la invención anteriores): - - - i 2,3-dibromomaleimida, 1 equivalente, y una base tal como bicarbonato de sodio, aproximadamente 5 equivalentes, se disuelven en metanol, y una solución de 2-piridintiol, ligeramente más de 1 equivalente, en metanol, es adicionada. La reacción es agitada durante 15 min a temperatura ambiente. El solvente es removido bajo vacío y el residuo es purificado, tal como mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (éter de petróleo:acetato de etilo, elución de gradiente desde 9: 1 hasta 7:3, para dar 3,4-bis(2-piridilsulfanil)pirrol-2,5-diona.
El acoplamiento de la 3,4-bis(2-piridilsulfonail)pirrol-2,5-diona con la cadena lateral es realizado bajo condiciones estrictamente secas. Para la 3,4-bis(2-piridilsulfan¡ l)pirrol-2, 5-diona, 1 equivalente, y trifenilfosfina, 1 equivalente, en una mezcla de tetrahidrofurano y diclorometano, se adiciona en forma de gotas DIAD, 1 equivalente, a -78°C. La reacción es agitada durante 5 min y la cadena lateral, 0.5 equivalente, en diclorometano es adicionado en forma de gotas. Después de agitar durante 5 min, el alcohol neopentílico, 1 equivalente, en tetrahidrofurano y diclorometano es adicionado, y agitado durante unos 5 min adicionales, entonces la 3,4-bis(2-piridilsulfoanil)pirrol-2,5-diona, 1 equivalente, es adicionado y es agitado durante otros 5 min. Se permite que la reacción se caliente a temperatura ambiente con agitación durante 20 h, entonces los solventes son removidos bajo vacío. El residuo es purificado, tal como mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (metanol:diclorometano, elución de gradiente de 0-10% metanol), para dar el enlazador. La cadena lateral puede sr usada en forma protegida y desprotegida siguiendo la reacción de Mitsunobu, si es apropiado.
De manera alternativa, la cadena lateral, opcionalmente protegida si es apropiado, puede ser acoplada a una 3,4-dibromomaleimida mediante acoplamiento de Mitsunobu; y el compuesto resultante activado para intercambio de disulfuro mediante reacción con un R-tiol en la presencia de base; a la inversa de la síntesis descrita en los dos párrafos previos.
Un método similar puede ser usado para enlazadores conteniendo la porción de pirrolidin-2,5-diona en lugar de la porción de pirrol-2,5-diona mostrada antes, al iniciar con 2,3-dibromosuccinimida; pero más usualmente estos enlazadores son preparados al preparar el enlazador con una maleimida no substituida y bromar el enlazador para dar la porción de dibromosuccinimida después del acoplamiento con la cadena lateral, y entonces “activar” el enlazador con el R-tiol como el último paso.
Los enlazadores de maleimida mono-substituida son preparados convenientemente mediante dehidrobromación de los enlazadores de dibromosuccinimida bajo condiciones básicas y métodos relacionados.
Preparación de los conjugados de enlazador-citotoxina Los conjugados de enlazador-citotoxina pueden ser preparados mediante métodos análogos a aquéllos de Doronina et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124, y documentos similares. El enlazador, 1 equivalente, y HATU, 1 equivalente, son disueltos en DMF anhidro, seguido por la adición de DIPEA, 2 equivalentes. La solución resultante es adicionada a la citotoxina, 0.5 equivalentes, disueltos en DMF, y la reacción agitada a temperatura ambiente durante 3 h. El conjugado de enlazador-citotoxina es purificado mediante HPLC de fase inversa en una columna de C-18.
Preparación de ADCs Los anticuerpos, normalmente anticuerpos monoclonales son elevados contra un objetivo de cáncer específico (antígeno) y son purificados y caracterizados. Los ADCs terapéuticos conteniendo el anticuerpo son preparados mediante métodos estándares para conjugación de cisteína, tales como mediante métodos análogos a aquéllos de Hamblett et al. , “Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjúgate” (Efectos de carga de fármaco sobre la actividad antitumor de un conjugado de anticuerpo monoclonal fármaco), Clom. Cáncer Res. 2004, 10, 7063-7070; Doronina et al., “Development of potent and highly efficacious monoclonal antibody auristatin conjugates for cáncer therapy” (Desarrollo de conjugados de anticuerpo monoclonal auristatina altamente eficaz y potente para terapia de cáncer), Nat. Biotechnol., 2003, 21 (7), 778-784; y Francisco et al., “cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethylauristatin E conjúgate with potent and selective antitumor activity” (cAC10-vcMMAE, un conjugado de anti-CD30-monometilauristatina E con actividad antitumor potente y selectiva), Blood, 2003, 102, 1458-1465. Conjugados de anticuerpo-fármaco para cuatro fármacos por anticuerpo son preparados mediante la reducción parcial del anticuerpo con un exceso de un reactivo reductor, tal como DTT o TCEP a 37°C durante 30 min, entonces el amortiguador es intercambiado por elución a través de resina SEPHADEX® G-25 con 1 mM DTPA en DPBS. El eluyente es diluido con DPBS adicional, y la concentración de tiol del anticuerpo puede medirse usando ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) [reactivo de Ellman] Un exceso, por ejemplo de 5 veces, el conjugado de enlazador-citotoxina es adicionado a 4°C durante 1 h, y la reacción de conjugación puede ser extinguida mediante adición de un exceso substancial, por ejemplo 20 veces, de cisteína. La mezcla de ADC resultante puede ser purificada en SEPHADEX G-25 equilibrado en PBS para remover el conjugado de enlazador-citotoxina sin reaccionar, es desalado si se desea, y purificado mediante cromatografía de exclusión por tamaños. El ADC resultante puede ser entonces filtrado estéril, por ejemplo, a través de un filtro de 0.2 mM, y liofilizado si se desea para almacenamiento.
La formación de un ADC de esta invención es ilustrada mediante el esquema de reacción a continuación, donde la estructura con forma de “Y” denota el anticuerpo, solo un enlace disulfuro es mostrado, y los detalles del conjugado de enlazador-citotoxina son omitidos para simplicidad que muestra el concepto del ADC: i l - i , - l i Normalmente, n será 4, donde todos los enlaces de disulfuro de cisterna intercadena son reemplazados por conjugados de enlazador-fármaco. Schumacher et al. En su conjugación con somatostatina añaden el agente reductor a una mezcla de la somatostatina y el enlazador PEGilado, de manera que esto puede ser posible con anticuerpos y conjugados de enlazador-citotoxina también y no es excluido como un método de síntesis.
Ensayos Los ADCs de esta invención pueden ser ensayados para afinidad de unión a y especificidad para el antígeno deseado por cualquiera de los métodos convencionalmente usados para el ensayo de los anticuerpos; y pueden ser ensayados por eficacia como agentes anticáncer mediante cualquiera de los métodos convencionalmente usados para el ensayo de agentes citostáticos/citotóxicos, tales como ensayos para la potencia contra cultivos celulares, ensayos de xenomjerto y similares. Una persona de habilidad ordinaria en la téenica no tendrá dificultad, considerando que la habilidad y la literatura disponibles, para determinar las teenicas de ensayo adecuadas; a partir de los resultados de esos ensayos, para determinar las dosis adecuadas para probar en humanos como agentes anticáncer, y, a partir de los resultados de esas pruebas, para determinar dosis adecuadas para uso para tratar cánceres en humanos.
Formulación y administración Los ADCs del primer aspecto de esta invención normalmente serán formulados como soluciones para administración intravenosa, o como concentrados liofilizados para reconstitución para preparar soluciones intravenosas (para ser reconstituidas, por ejemplo, con solución salina normal, 5% de dextrosa, o soluciones isotónicas similares). Normalmente serán administradas mediante infusión o inyección intravenosa. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica de la formulación farmacéutica, especialmente la formulación de anticuerpos anti-cáncer, no tendrá dificultad, considerando la habilidad y la literatura disponibles, para desarrollar formulaciones adecuadas.
Ejemplos Síntesis de enlazadores Ejemplo 1 - Síntesis de 3,4-bis(2-piridilsulfanil)pirrol-2,5-diona 3,4-dibromopirrol-2,5-diona [2,3-dibromomaleimida], 1 g, se adicionó a un matraz de fondo redondo de 100 mi limpio con un tapón de hule y burbujeador, y se disolvió en 50 mi de metanol grado HPLC. 2-piridintiol, 2 equivalentes, se adicionaron a un vial de centelleo de 20 mi, y se disolvieron en 10 mi de metanol. Bajo nitrógeno y con agitación, la solución de 2-piridintiol/metanol se adicionó en forma de gotas a la 3,4-dibromopirrol-2,5-diona vía una jeringa de 20 mi con una aguja de calibre 16, y la mezcla de reacción se agitó durante unas 3-4horas adicionales. El metanol se evaporó y el producto crudo fue disuelto en acetato de etilo y cargado sobre aproximadamente 2 g de gel de sílice. El producto crudo cargado en gel de sílice fue eluido a través de un cartucho de gel de sílice de 12 g con un gradiente de hexano:acetato de etilo desde 9: 1 hasta 0: 1 sobre 25 volúmenes de columna. Las fracciones enriquecidas fueron identificadas, extraídas y liofilizadas a sequedad. El producto final fue recristalizado a partir de acetato de etilo y dietil éter para proporcionar cristales de agujas amarillos, los cuales fueron recolectados por filtración.
Síntesis similares pueden ser realizadas usando los métodos de Schumacher et al. Para otras 3,4-di(R-sulfanil)pirrol-2,5-dionas (ver los Supplementary Materials en las páginas S17-S18). Síntesis similares también pueden ser realizadas iniciando con enlazadores (3,4-dibromo-2,5-dioxopirrolil)-terminados [es decir, compuestos donde una cadena lateral ya ha sido adicionada al nitrógeno de pirrol] para dar los enlazadores (2, 5-dioxo-3,4-d¡(R-sulfanil)p¡rrolilo)-term inados correspondientes; y/o con otros tioles (tales como el bencenotiol y 2-hidroxietanotiol de Schumacher et al.) para dar los enlazadores correspondientes; y/o con otras pirroldionas o pirrolidindionas, tales como 3,4-dicloropirrol-2,5-diona o 3,4-dibromopirrolidin-2,5-diona, o basadas en ellas, para dar las 3,4-di(R-sulfanil)pirrol-2,5-dionas o 3,4-di(R-sulfanil)pirrolidin-2,5-dionas correspondientes o enlazadores basados en ellas.
Ejemplo 2 - Síntesis de ácido 39-(3,4-dibromo-2,5-dioxopirrol¡l)-3,6,9, 12,15,18,21 ,24,27,30,33 ,36-dodecaoxanonatriacontanoico: ; I l ! — Un matraz de fondo redondo de dos cuellos de 100 mi fue secado a flama y enfriado bajo nitrógeno. El matraz enfriado fue cargado con 200 mg (0.296 mmol) de 39-hidroxi-3, 6, 9, 12, 15, 18,21 ,24,27,30,33,36- dodecaoxanonatrioacontanoato de ter-butilo. Trifenilfosfina, 106 mg, fue disuelta en aproximadamente 5 mi de tetrahidrofurano anhidro en un vial, y la solución fue adicionada al matraz de 100 mi vía cánula bajo nitrógeno. El matraz de 100 mi fue enfriado en un baño de agua helada durante 15 minutos. A la solución enfriada se adicionaron 55 mg (0 271 mmol) de 3,4-dibromopirrol-2,5-diona con agitación hasta que se observó una solución transparente. DIAD, 58.3 mI, se adicionó a la mezcla de reacción enfriada, la cual fue agitada en el baño de hielo durante unos 10 minutos adicionales. La mezcla de reacción fue agitada y se permitió que alcanzara temperatura ambiente sobre aproximadamente 20 horas, entonces se concentraron sobre un evaporador rotatorio hasta secarse, dando un aceite amarillo viscoso, el cual fue absorbido sobre aproximadamente 1 g de gel de sílice y cargado en seco sobre una unidad de cromatografía de fase normal Reveleris. El aceite fue eluido sobre un cartucho de gel de sílice de 12 g con un gradiente de metanohdiclorometano desde 1 :0 hasta 9:1 sobre 28 volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo el producto deseado fueron extraídas y concentradas a sequedad. El producto purificado fue suspendido en 50:50 acetonitrilo:agua y liofilizado durante la noche para proporcionar un aceite amarillo claro viscoso transparente. Mediante análisis de LC-MS, el producto de ácido carboxílico ter-butil-protegido ha sido desprotegido parcialmente durante la elaboración. Para desproteger completamente el material al ácido libre, el material liofilizado fue tratado con 5% de ácido trifluoroacético en diclorometano, se concentró a sequedad y se liofilizó en acetonitrilo:agua (50:50) durante la noche.
Síntesis similares pueden ser realizadas iniciando con ácido 39-(2,5-dioxo-3,4-bis(2-piridilsulfanil)pirrolil)- 3, 6, 9,12,15,18,21 ,24,27, 30,33, 36-dodecaoxanonatriacontanoico, o iniciando con otras 3,4-di(R-sulfanil)pirrol-2,5-dionas para dar los enlazadores correspondientes; y/o iniciando con otras cadenas laterales hidroxilo-terminadas, por ejemplo, usando 6-hidroxihexanoato de ter-butilo para dar ácido 6-(3,4-dibromo-2,5-dioxoirrolil)hexanoico, etc. Las síntesis similares que inician con maleimida en lugar de 2,3-dibromomaleimida dan enlazadores comparadores de la teenica anterior, tal como ácido 6-(2,5-dioxopirrolil)hexanoico, el enlazador de MC.
Ejemplo 3: Síntesis de ácido 39-(3,4-dibromo-2,5-dioxopirrolidinil)- 3,6,9, 12,15,18,21 ,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatriacontanoico [el enlazador dBrPEG]: I ] El ácido 39-(2,5-dioxopirrolil)-3,6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatriacontanoico fue preparado en la misma manera que el ácido 39-(3,4-dibromo-2,5-dioxopirrolil)- 3,6,9,12,15,18,21 ,24,27, 30,33, 36-dodecaoxanonatriacontanoico del Ejemplo 2, pero iniciando con maleimida en lugar de 2,3-dibromomaleimida. El ácido fue tratado con 0.5 equivalentes de bromo en cloroformo seguido por reflujo durante la noche para dar ácido 39-(3,4-dibromo-2,5-dioxopirrolidinil)-3,6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27,30, 33, 36-dodecaoxanonatriacontanoico despues de la purificación instantánea en gel de sílice.
Las síntesis similares pueden ser realizadas usando otras cadenas laterales hidroxilo-terminadas, por ejemplo, usando 6-hidroxihexanoato de ter-butilo para dar ácido 6-(3,4-dibromo-2,5-dioxopirrolidiniljhexanoico, etc. Los enlazadores dibromados que son productos de esta síntesis pueden ser dehidrobromados con base en un paso adicional para dar enlazadores (3-bromo-2,5-dioxopirrolil)-terminados, tal como ácido 6-(3-bromo-2,5-dioxopirrolil)hexanoico.
Síntesis de conjugados de enlazador-citotoxina Ejemplo 4: Síntesis de T4 l i , , , .
Fmoc-T4 fue preparado al acoplar el ácido Fmoc-D-2-piperidincarboxílico a isoleucina en la presencia de EDC y bicarbonato de sodio, entonces acoplando el Fmoc-D-Pip-lle-OH resultante al intermediario N-metilvalina 1 (comprado a Concortis) al mezclar con 1 equivalente de HOBT y DIPC en DMF seguido por adición de 2.5 equivalentes de NMM. La mezcla de reacción fue agitada durante la noche y purificada mediante cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente de hexano y acetato de etilo. La evaporación de solvente dio Fmoc-T4 como un aceite amarillo. El Fmoc-T4 fue desprotegido entonces mediante tratamiento con 20% DEA en cloruro de metileno durante 30 minutos para dar T4, el cual fue purificado mediante HPLC preparatoria en una columna de fase inversa de C18 eluida con acetonitrilo/agua.
Ejemplo 5: Síntesis de 6-(2,5-dioxopirrolil)hexanoil-T4 [MC-T4] y 39-(3, 4-dibromo-2,5-dioxopirrolidinil)-3,6,9,12,15,18,21 ,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatri acontan oil-T 4 [dBrPEG-T4] .
I T4 + .
El acoplamiento de T4 a los enlazadores MC o dBrPEG descritos en el Ejemplo 2 y 3 respectivamente fue realizado al activar los enlazadores con 1 equivalente de TBTU en la presencia de 2 equivalentes de DIPEA en DMF, entonces el acoplamiento con T4 durante 72 horas a temperatura ambiente. La purificación mediante HPLC de C18 prepatatoria (gradiente de acetonitrilo-agua) dio MC-T4 o dBrPEG-T4 adecuada para conjugación a anticuerpos.
Las síntesis similares que usan otros enlazadores dan los conjugados de enlazador-T4 correspondientes. Síntesis similares usando T3, MMAF u otras citotoxinas con una amina básica dan los conjugados de enlazador-citotoxina correspondientes. Las síntesis similares que usan enlazadores terminados en amina y citotoxinas con un grupo carboxilo, que activan la citotoxina en la misma manera como el enlazador fue activado en el Ejemplo anterior, dan otros conjugados de enlazador-citotoxina.
Ejemplo 6: Síntesis de 39-(2,5-dioxo-3,4-bis(2-piridilslfanil)pirrolil)- 3,6,9,12,15,18,21 ,24,27, 30,33, 36-dodecaoxanonatriacontanoiI-MMAF [dPSPEG-MMAF]: | — El ácido 39-(2,5-dioxo-3,4-bis(piridin-2-iltio)-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)-3,6,9, 12,15, 18,21 ,24,27,30,33,36-dodecaoxanonatriacontanoico se adicionó a un matraz de fondo redondo de 50 mi secado a flama, limpio, y el ácido carboxílico fue activado con NHS en 3 mi de DMF en la presencia de DCC. MMAF fue predisuelto en aproximadamente 1 mi de DMF y se transfirió al ácido NHS-activado vía aguja de calibre 22. Se adicionó DIPEA a la mezcla de reacción y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción cruda fue purificada mediante HPLC de fase inversa en una columna PREP-C18 Agilent de 21.2 mm x 50 mm a una velocidad de flujo de 35 ml/min sobre 20 volúmenes de columna (aproximadamente 30 minutos de tiempo de gradiente). Las fracciones enriquecidas fueron identificadas, extraídas y liofilizadas para dar el conjugado dPSPEG-MMAF como un semi-sólido blanco.
Síntesis similares que usan otros enlazadores dan los conjugados de enlazador-MMAF correspondientes. Síntesis similares que usan T3, T4, u otras citotoxinas con una amina básica dan los conjugados de enlazador-citotoxina correspondientes, tal como dPSPEG-T4. Síntesis similares que usan enlazadores terminados en amina y citotoxinas con un grupo carboxilo, activando la citotoxina en la misma manera que el enlazador fue activado en el Ejemplo anterior, dan otros conjugados de enlazador-citotoxina.
Síntesis de conjugados de anticuerpo-fármaco Ejemplo 7: Síntesis de trastuzumab-dTSPEG-MMAF ADC Trastuzumab Trastuzumab (solo un enlace (reducido) disulfuro m t d ) l Trastuzumab, 1 mi de una solución de 20 mg/ml en pH 7.4 PBS (libre de Mg y Ca de Gibco) con 1 mM DTPA, es cargado en un tubo de Eppendorf de 1.7 mi estéril, entonces 2.75 equivalentes de hidrocloruro de TCEP (concentración de 0.5M de ampolleta de Sigma), son adicionados y la mezcla es incubada a 37°C durante 1 hora para dar un promedio de 4 pares de tiol libres por trastuzumab (esto puede verificarse por el ensayo colorimétrico de Ellman - ver Ellman, “Tissue sulfhydryl gropus” (Grupos de sulfhidrilo de tejido), Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77 o documentos posteriores que se refieren a este ensayo). La solución de anticuerpo reducida es enfriada en un baño de hielo a aproximadamente 0°C durante 15 minutos; entonces una solución de aproximadamente 4 equivalentes de dPSPEG-MMAF en sulfóxido de dimetilo es adicionado y la mezcla se incubó a 37°C durante 2 horas (o a 4|C durante 20 horas). El ADC de trastuzumab-dTSPEG-MMAF resultante es purificado mediante cromatografía de exclusión por tamaño (sistema cromatográfico puro de GE ÁKTA) o columna de desalado de PD10.
Síntesis similares que usan otros conjugados de enlazador-citotoxina, tal como dPSPEG-T4 y/u otros anticuerpos, tal como 18-2A (un anticuerpo de lgG2a de murino), dan los ADCs correspondientes.
Ensayos Los ADCs de esta invención son probados por potencia y selectividad in vitro al determinar su citotoxicidad en líneas de células de cáncer de interés, tales como aquéllas líneas de células de cáncer que expresan el antígeno correspondiente para la porción de anticuerpo del ADC y líneas de células de cáncer similares que carecen del antígeno. Son probados por potencia y seguridad in vivo en tales modelos animales, como los modelos de xenomjerto de cáncer subcutáneo de ratón y xenoinjerto de cáncer ortotópico de ratón bien conocidos para aquellos de habilidad en la téenica de investigación de cáncer.
Ejemplo 8: Citotoxicidad de ADCs de trastuzumab comparada con trastuzumab La citoxicidad de dos ADCs donde se conjugó trastuzumab a la citotoxina actualmente usada MMAF a través de un enlazador MC [trastuzumab-MC-MMAF] fue comparada con la citotoxicidad de trastuzumab sola en células de tumor HER2-posit¡vas y HER2-negativas. En las células de tumor HER2-negativas, la IC50 para ambos ADCs y para trastuzumab por sí solo fue >500 nM; sin embargo, en las células de tumor HER2-positivas, mientras que la IC50 para trastuzumab por sí mismo fue todavía >500 nM, los dos ADCs de trastuzumab-MC-MMAF tuvieron IC50 de 0.009 nM y 0.018 nM. Estos resultados sugieren los ADCs son considerablemente más potentes que sus anticuerpos párenteles.
Ejemplo 9: Citotoxicidad de T1 y T2 comparada con MMAF La citotoxidad de tubulisinas T1 y T2 fue comparada con la citotoxicidad de MMAF usando la línea de células BT474 (HER2+) en un ensayo de citotoxicidad celular estándar. En estas células, MMAF tuvo una IC50 de 11 nM, y T2 tuvo una I C5o de < 0.1 nM, mostrando que estas tubulisinas son considerablemente más potentes que MMAF. Estos resultados sugieren que las tubulisinas N-conjugables T3 y T4 son de potencia similar a tubulisinas no-N-conjugables T1 y T2, y considerablemente más potentes que MMAF. Estos resultados y los resultados del Ejemplo 8 sugieren que las ADCs de tubulisina son considerablemente más potentes que ADCs de MMAF, y serán agentes anticáncer efectivos.
Ejemplo 10: Afinidad de unión de ADCs para celulas que expresan antígeno La unión de los anticuerpos y ADCs a células que expresan antígeno se miden usando un ELISA de células. Las células de sarcoma transducidas para expresar el objetivo (células F279 para HER2, células F244 para CD98) son platinadas el día a 5000 células por cavidad en una placa de 384 cavidades. El días siguiente, los anticuerpos son diluidos serialmente en una placa separada, y entonces son transferidos a la placa celular, la cual ha tenido previamente el medio removido mediante aspiración. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la placa es lavada con amortiguador de lavado (DPBS a pH 7.4 con 0.1 % de albúmina de suero bovino) y entonces 25 pl de anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa de rábano picante diluido en medio es adicionado e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa es lavada entonces y 15 ml de un substrato quimioluminiscente (Pierce catálogo #37069) son adicionados; y la placa es eluída en un lector de luminiscencia basado en placa. Trastuzumab y ADCs de trastuzumab (trastuzumab-MC-MMAF, trastuzumab-MC-T4, trastuzumab-dTSPEG-MMAF y trastuzumab-dTSPEG-T4) demostraron una afinidad comparable para células F277; y 18-2A y conjugados de 18-2A (18-2A, 18-2A-MC-T4, 18-2A-dTSPEG- MMAF y 18-2A-dTSPEG-T4) demostraron afinidad comparable para células F244, indicando que la conjugación de las cargas de fármaco no afectan la unión de antígeno.
Ejemplo 11 : Potencia de ADCs contra células que expresan antígeno La potencia de ADCs para inhibición de crecimiento de células de tumor fue probada en ensayos de proliferación en células. Las líneas de células Ramos (linfoma de células B) y BT4747 (carcinoma de mama humana HER2+) fueron sembradas en placas de la mitad de área de 96 cavidades el día antes del tratamiento con fármaco a 3000 y 5000 células por cavidad, respectivamente. Los ADCs y controles fueron diluidos serialmente en una placa maestra, y entonces se transfirieron a las placas de células, las cuales fueron incubadas a 37 grados Celsius y 5% CO2 durante 3 días. Las células fueron cuantificadas al medir el nivel de ATP en las cavidades usando el kit ATPLite 1 Step (Perkin Elmer catálogo #50-904-9883) como se describe por el fabricante. Los ADCs 18-2A (18-2A-MC-MMAF, 18-2A-MC-T4, 18-2A-dTSPEG-MMAF y 18-2a-dTSPEG-T4) fueron aproximadamente equipotentes y considerablemente más potentes que el anticuerpo 18-2A padre en células Ramos, mientras que los ADCs de trastuzumab (trastuzumab-MC-MMAF, trastuzumab-MC-T4, trastuzumab-dTSPEG-MMAF, y trastuzumab-dTSPEG-T4) fueron aproximadamente equipotentes y considerablemente más potentes que el anticuerpo de trastuzumab padre en células BT474.
Ejemplo 12: Eficacia de ADCs en modelos de xenomjerto de murino El modelo de xenoinjerto de células Ramos.
La línea de células Ramos fue obtenida de ATCC y se cultivaron de acuerdo con los protocolos del proveedor. Los ratones hembra inmunodeficientes de 4-6 semanas de edad (Taconic C.B-17 scid) fueron inyectadas subcutáneamente en el flanco derecho con 1 x107 de células viables en una mezcla de PBS (sin magnesio o calcio) y BD Matrigel (BD Biosciences) a una proporción 1 :1. EL volumen total inyectado por ratón fue 200 mI con 50% siendo Matrigel. Una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 65-200 mm3, los ratones fueron aleatorizados. Los ADCs fueron formulados en PBS y administrados una vez de manera intravenosa a una dosis de 1 mg/kg en la vena de cola lateral, y los pesos corporales y tumores fueron medidos dos veces a la semana. El volumen de tumor fue calculado como se describe en van der Horst et al., “Discovery of Fully Human Anti-MET Monoclonal Antibodies with Antitumor Activity against Colon Cáncer Tumor Models In Vivo” (Descubrimiento de anticuerpos monoclonales anti-MET completamente humanos con actividad antitumor contra modelos de tumor de cáncer de con in vivo), Neoplasia, 2009, 1 1 , 355-364. Los experimentos fueron realizados en grupos de 8 animales por punto experimental. El grupo de control negativo recibió HB121 (un anticuerpo lgG2a-negativo) y MMAF libre o T4, como es apropiado, a una concentración equimolar a la concentración que sería liberada por los ADCs, mientras que el grupo de control positivo recibió 18-2A. Los ADCs 18-2A con los enlazadores de esta invención (18-2A-dTSPEG-MMAF y 18-2A— MMAF y 18-2A-MC-T4, respectivamente), y más TGI que el anticuerpo de 18-2A, aunque todos demostraron TGI significativo comparados con el control. No se observó toxicidad con base en las mediciones de peso animal.
El modelo de xenomjerto de células BT474.
La línea de células BT474 fue obtenida de ATCC y cultivados de acuerdo con los protocolos de proveedor. Los ratones hembra inmunodeficientes de 4-6 semanas de edad (Taconic C.B-17 scid) fueron implantados con una pella de b-estradiol antes de ser inyectada subcutáneamente en el flanco derecho con 1 x107 de células viables en una mezcla de PBS (sin magnesio o calcio) y BD Matrigel (BD Biosciences) en una proporción de 1 :1. El volumen total inyectado por ratón fue 200 ml con 50% siendo Matrigel. Una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 100-150 mm3, los ratones fueron aleatorizados. Los ADCs fueron formulados en PBS y administraron una vez de manera intravenosa a una dosis de 1 mg/kg en una vena de cola lateral, y pesos corporales y tumores fueron medidos dos veces a la semana. El volumen de tumor fue calculado como se describió en van der Horst et al., citados antes. Los experimentos fueron realizados en grupos de 8 animales por punto experimental. El grupo de control negativo recibió HB121 y libre MMAF o T4, según sea apropiado, a una concentración equimolar a la concentración que sería liberada por los ADCs, aunque el grupo de control positivo recibió trastuzumab a 1 mg/kg. Los ADCs de trastuzumab con los enlazadores de esta invención (trastuzumab-dTSPEG-MMAF y trastuzumab-dTSPEG-T4) demostraron TGI comparables a los ADCs comparadores (trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-T4, respectivamente), y ligeramente más TGI que el trastuzumab padre, mientras que todos demostraron TGI significativo comparado con el control. No se observó toxicidad con base en mediciones de peso animales.
Las pruebas similares son conducidas con otros cánceres (aquéllos que expresan diferentes antígenos) y ADCs donde el anticuerpo corresponde al antígeno expresado por el cáncer.

Claims (46)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco de la fórmula: donde: A es un anticuerpo, PD es pirrol-2,5-diona o pirrolidin-2,5-diona, El doble enlace representa enlaces de las posiciones 3 y 4 de la pirrol-2,5-diona o pirrolidin-2,5-diona a los dos átomos de azufre de un enlace disulfuro de cisteína-cisteína abierto en el anticuerpo, L es -(CH2)m- o -(CH2CH2O)m-CH2CH2-, CTX es una citotoxina unida a L por un enlace de amida, n es un entero de 1 a 4, y m es un entero de 1 a 12.
2. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 , donde A es un anticuerpo monoclonal.
3. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 o 2, donde A es un anticuerpo humano o humanizado.
4. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde A es un anticuerpo que es específico a un antígeno de cáncer.
5. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación A es alemtuzumab, bevacizumab, brentuximab, cetuximab, gemtuzumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositu o ab, o trastuzumab.
6. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 , donde A es trastuzumab.
7. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde CTX es un auristatina, un caliqueamicina, un maitansinoide o una tubulisina.
8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 7, donde CTX es monometilauristatina E, monometilauristatina F, caliqueamicina y, mertansina, tubulisina T3 o tubulisina T4.
9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde PD es pirrolidin-2,5-diona.
10. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde PD es pirrol-2,5-diona.
11. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde L es -(CH2)m-.
12. El conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde L es -(CH2CH2O)mCH2CH2-.
13. Una composición farmaceutica conteniendo un conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un método para tratar un cáncer al administrar a un humano que sufre de lo mismo una cantidad efectiva de un conjugado de anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una composición farmacéutica de la reivindicación 13.
15. Un conjugado de enlazador-citotoxina de fórmulas A, B o C: ' A B C donde R es Ci-b alquilo, opcionalmente substituido con halo o hidroxilo; fenilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o Ci-3 alquilo; naftilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o C1-3 alquilo; o 2-piridilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1.3 alcoxicarbonilo o C1-3 alquilo; L es -(CH2)m- o -(CH2CH20)mCH2CH2-, CTX es una citotoxina unida a L por un enlace de amida, y m es un entero de 1 a 12.
16. El conjugado de enlazador-citotoxina de la reivindicación 15, donde el conjugado es de fórmula A.
17. El conjugado de enlazador-citotoxina de la reivindicación 15, donde el conjugado es de fórmula B.
18. El conjugado de enlazador-citotoxina de la reivindicación 15, donde el conjugado es de fórmula C.
19. El conjugado de enlazador-citotoxina de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde R es 2-piridilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1.3 alcoxicarbonilo o C1.3 alquilo.
20. El conjugado de enlazador-citotoxina de la reivindicación 19, donde R es 2-piridilo.
21. El conjugado de enlazador-citotoxina de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, donde CTX es una auristatina, una caliqueamicina, un maitansinoide o una tubulisina.
22. El conjugado de enlazador-citotoxina de la reivindicación 21 , donde CTX es monometilauistatina E, monometilauristatina F, caliqueamicina, mertansina, tubulisina T3, o tubulisina T4.
23. El conjugado de enlazador-citotoxina de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 , donde L es -(CH2)m-.
24. El conjugado de enlazador-citotoxina de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 , donde L es -(CH2CH2O)mCH2CH2-,
25. Un enlazador de fórmula AA, BB o CC: . AA BB cc donde R es Cí e alquilo, opcionalmente substituido con halo o hidroxilo; fenilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o C1.3 alquilo; naftilo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o Ci-3 alquilo; o 2-piridílo, opcionalmente substituido con halo, hidroxilo, carboxilo, C1-3 alcoxicarbonilo o Ci-3 alquilo, L es -(CH2)m- o -(CH2CG20)mCH2CH2-, Z es carboxilo, C1-6 alcoxicarbonilo o amino, y m es un entero de 1 a 12.
26. El enlazador de la reivindicación 25, donde el enlazador es formula AA.
27. El enlazador de la reivindicación 25, donde el enlazador es de fórmula BB.
28. El enlazador de la reivindicación 25, donde el enlazador es de fórmula CC.
29. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, donde R es 2-piridilo.
30. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde L es -(CH2)m-.
31. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde L es -(CH2CH2O)mCH2CH2-.
32. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , donde Z es carboxilo.
33. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , donde Z es Ci-6 alcoxicarbonilo.
34. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31 , donde Z es amino.
35. Un enlazador de fórmula AAA, BBB, o CCC: AAA BBB CCC donde R’ es cloro, bromo, yodo, C1-6 alquilsulfoniloxi, trifluorometanosulfoniloxi, bencenosulfoniloxi o 4-toluenosulfoniloxi, L es -(CH2)m- o -(CH2CH20)mCH2CH2-, Z es carboxilo, C1-6 alcoxicarbonilo, o amino, y m es un entero de 1 a 12.
36. El enlazador de la reivindicación 35, donde el enlazador es de fórmula AAA.
37. El enlazador de la reivindicación 35, donde el enlazador es de fórmula BBB.
38. El enlazador de la reivindicación 35, donde el enlazador es de fórmula CCC.
39. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, donde L es -(CH2)m-.
40. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, donde L es -(CH2CH2O)mCH2CH2-.
41. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, donde Z es carboxilo.
42. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, donde Z es Ci-6 alcoxicarbonilo.
43. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, donde Z es amino.
44. El enlazador de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 43, donde R’ es cloro, bromo o yodo.
45. El enlazador de la reivindicación 44, donde R’ es bromo.
46. Un compuesto de tubulisina de la fórmula T3:
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