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MX2014005971A - Agentes de iarn modificados. - Google Patents

Agentes de iarn modificados.

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MX2014005971A
MX2014005971A MX2014005971A MX2014005971A MX2014005971A MX 2014005971 A MX2014005971 A MX 2014005971A MX 2014005971 A MX2014005971 A MX 2014005971A MX 2014005971 A MX2014005971 A MX 2014005971A MX 2014005971 A MX2014005971 A MX 2014005971A
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double
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MX2014005971A
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MX359548B (es
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Martin Maier
Muthiah Manoharan
Kallanthottathil G Rajeev
Tracy Zimmermann
Satyanarayana Kuchimanchi
Klaus Charisse
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of MX2014005971A publication Critical patent/MX2014005971A/es
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Abstract

Un aspecto de la presente invención se refiere a un agente de ARNi de doble hebra (ARNdh) dúplex capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El ARNdh dúplex comprende uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una o ambas hebras, particularmente en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Otros aspectos de la invención se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden estos agentes de ARNdh adecuados para uso terapéutico y métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo mediante la administración de estos agentes de ARNdh, por ejemplo, para el tratamiento de varias condiciones de enfermedad.

Description

AGENTES DE iARN MODIFICADOS CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a agentes de iARN dúplex que tienen motivos particulares que son ventajosos para la inhibición de la expresión de genes objetivo, así como también a composiciones de iARN adecuadas para uso terapéutico. Además, la invención proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo mediante la administración de agentes de iARN dúplex, por ejemplo, para el tratamiento de distintas enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La interferencia de ARN o "iARN" es una expresión inicialmente acuñada por Fire y colaboradores para describir la observación de que la iARN de doble hebra (ARNdh) puede bloquear la expresión de genes (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15, 188-200) . El ARNdh corto dirige un silenciamiento específico de genes post-transcripcional en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función de los genes. La iARN es mediada por un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) , una nucleasa específica de secuencias de múltiples componentes que destruye los ARN mensajeros homólogos al disparador de silenciamiento. Se sabe que el RISC contiene ARN cortos Ref . :248388 (aproximadamente 22 nucleótidos) derivados del disparador de ARN de doble hebra, pero los componentes de proteína de esta actividad seguían siendo desconocidos.
Las moléculas de ARN de doble hebra (ARNdh) con buenas propiedades de silenciamiento de genes son necesarias para el desarrollo de fármacos en base a la interferencia de ARN (iARN) . Una etapa inicial en la iARN es la activación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) , que requiere la degradación de la hebra sentido del dúplex de ARNdh. Se sabía que la hebra sentido actúa como el primer sustrato del RISC que es escindido por Argonauta 2 en el medio de la región de dúplex. Inmediatamente después de que los fragmentos del extremo 51 y extremo 31 escindidos de la hebra sentido se retiran de la endonucleasa Ago2 , el RISC se activa mediante la hebra antisentido (Rand et al. (2005) Cell 123, 621) .
Se creía que cuando la escisión de la hebra sentido era inhibida, la escisión endonucleolítica del ARNm objetivo era alterada (Leuschner et al. (2006) EMBO Rep . , 7, 314; Rand et al. (2005) Cell 123, 621; Schwarz et al. (2004) Curr. Biol.14, 787) . Leuschner et al. mostró que la incorporación de una ribosa 2'-0-Me en el sitio de escisión de Ago2 en la hebra sentido inhibe la iARN en células HeLa (Leuschner et al. (2006) EMBO Rep., 7, 314). Un efecto similar se observó con las modificaciones de fosforotioato, mostrando que la escisión de la hebra sentido era necesaria para una iAR eficiente también en mamíferos.
Morrissey et al. utilizaron un dúplex de ARNip que contiene residuos 2'-F modificados, entre otros sitios y modificaciones, también en el sitio de escisión de Ago2 , y obtuvo un silenciamiento compatible en comparación con los ARNip no modificados (Morrissey et al. (2005) Hepatology 41, 1349) . Sin embargo, la modificación de Morrissey no es específica para motivos, por ejemplo, una modificación incluye modificaciones 2'-F en todas las pirimidinas en las hebras sentido y antisentido siempre que esté presente el residuo de pirimidina, sin ninguna selectividad; y, por lo tanto, es incierto, en base a estas enseñanzas, si la modificación de motivo específico en el sitio de escisión de la hebra sentido puede tener algún efecto real en la actividad de silenciamiento de genes.
Muhonen et al. utilizaron un dúplex de ARNip que contiene dos residuos modificados 2'-F en el sitio de escisión de Ago2 en la hebra sentido o antisentido y encontraron que fue tolerado (Muhonen et al. (2007) Chemistry & Biodiversity 4, 858-873) . Sin embargo, la modificación de Muhonen es también específica para secuencias, por ejemplo, para cada hebra particular, Muhonen solamente modifica todas las pirimidinas o todas las purinas, sin ninguna selectividad Choung et al. utilizaron un dúplex de ARNip que contiene modificaciones alternativas por 2'-0Me o varias combinaciones de modificaciones de 2'-F, 2'-0Me y fosforotioato para estabilizar ARNip en suero a Surl0058 (Choung et al. (2006) Biochemical and Biophysical Research Communications 342, 919-927) . Choung sugirió que los residuos en el sitio de escisión de la hebra antisentido no deberían modificarse con 2'-0Me con el fin de aumentar la estabilidad del ARNip.
Por lo tanto, existe una necesidad continua para que los agentes de ARNi dúplex mejoren la eficacia del silenciamiento de genes de los productos terapéuticos génicos de ARNip. La invención se dirige a esa necesidad.
SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona motivos de nucleótidos o químicos para agentes de ARNdh opcionalmente conjugados con al menos un ligando que son ventajosos para la inhibición de la expresión de genes objetivo, así como composiciones de iARN adecuadas para uso terapéutico.
Los inventores sorprendentemente descubrieron que la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de un agente de ARNdh compuesto por hebras sentido y antisentido modificadas mejora la actividad de silenciamiento de genes del agente de ARNdh.
En un aspecto, la invención se refiere a un agente de iARN de doble hebra (ARNdh) capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh corrprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. El ARNdh dúplex está representado por la fórmula (III) : sentido: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb - (Z Z Z)j -Na -nq 3' antisentido: 3' np' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -Y ? ? ' -Nb' - (Z ' Z ' Z ' ) i-Na'- nq' 5- (III) .
En la fórmula (III) , cada i, j, k y 1 es independientemente 0 o 1; cada p y q es independientemente 0-6; n representa un nucleótido; cada Na y Na ' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb ' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos; cada np y nq independientemente representa una secuencia de nucleótidos salientes que comprende 0-6 nucleótidos; y cada XXX, YYY, ZZZ, ?'?'?', ???' y Z'Z'Z' representa independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; en donde la modificación en Nb es diferente de la modificación en Y y la modificación en Nb' es diferente de la modificación en Y' . Al menos uno de los nucleótidos Y forma un par de bases con sus nucleótidos Y' complementarios, y en donde la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y' .
Cada np y nq independientemente representa una secuencia de nucleótidos salientes que comprende 0-6 nucleótidos; cada n y n' representa un nucleótido saliente; y p y q cada uno es independientemente 0-6.
En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión dentro de la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en el sitio de escisión por al menos un nucleótido. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión dentro de la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión por al menos un nucleótido. La modificación en el motivo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra sentido es diferente de la modificación en el motivo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión.
En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5' . La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5' .
En otro aspecto, la invención proporciona, además, un método para suministrar el ARNdh a un objetivo específico en un sujeto mediante administración subcutánea o intravenosa.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Puede obtenerse un resultado superior mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una hebra sentido y/o una hebra antisentido de un agente de ARNdh, particularmente en o cerca del sitio de escisión La hebra sentido y la hebra antisentido del agente de ARNdh puede de otro modo modificarse completamente. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la hebra sentido y/o antisentido. El agente de ARNdh también se conjuga opcionalmente con un ligando derivado de GalNAc, por ejemplo en la hebra sentido. Los agentes de ARNdh resultantes presentan una actividad silenciadora de genes superior.
Sorprendentemente, los inventores descubrieron que tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos una hebra de un agente de ARNdh mejoró de forma superior la actividad de silenciamiento de genes del agente de ARNdh.
Por lo tanto, la invención proporciona un agente de iARN de doble hebra (ARNdh) capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido. Cada hebra del agente de ARNdh puede estar en el intervalo de 12-30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 14-30 nucleótidos de longitud, 17-30 nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 27-30 nucleótidos de longitud, 17-23 nucleótidos de longitud, 17-21 nucleótidos de longitud, 17-19 nucleótidos de longitud, 19-25 nucleótidos de longitud, 19-23 nucleótidos de longitud, 19-21 nucleótidos de longitud, 21-25 nucleótidos de longitud o 21-23 nucleótidos de longitud.
La hebra sentido y hebra antisentido típicamente forman un ARNdh dúplex. La región de dúplex de un agente de ARNdh puede tener de 12-30 pares de nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la región de dúplex puede tener entre 14-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-30 pares de nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 27-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-23 pares de nucleótidos de longitud, 17-21 pares de nucleótidos de longitud, 17-19 pares de nucleótidos de longitud, 19-25 pares de nucleótidos de longitud, 19-23 pares de nucleótidos de longitud, 19- 21 pares de nucleótidos de longitud, 21-25 pares de nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la región de dúplex se selecciona de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención puede contener una o más regiones salientes y/o grupos protectores del agente de ARNdh en el extremo 31 o extremo 51 o ambos extremos de una hebra. La saliente puede ser de 1-6 nucleótidos de longitud, por ejemplo 2-6 nucleótidos de longitud, 1-5 nucleótidos de longitud, 2-5 nucleótidos de longitud, 1-4 nucleótidos de longitud, 2-4 nucleótidos de longitud, 1-3 nucleótidos de longitud, 2-3 nucleótidos de longitud o 1-2 nucleótidos de longitud. Las salientes pueden ser el resultado de una hebra que es más larga que la otra o el resultado de dos hebras de la misma longitud que son escalonadas. La saliente puede formar un apareamiento incorrecto con el ARNm objetivo o puede ser complementaria a las secuencias del gen al que se dirige o puede ser otra secuencia. La primera y segunda hebra también pueden unirse, por ejemplo, mediante bases adicionales para formar una horquilla o mediante otros enlazantes no base.
En una modalidad, los nucleótidos en la región saliente del agente de ARNdh de la invención pueden ser cada uno independientemente un nucleótido modificado o sin modificar incluyendo, a modo no taxativo 2 ' -modificado por azúcar, tal como, 2-F 2'-0-metilo, timidina (T) , 2 "-0-metoxietil-5-metiluridina (Teo) , 2 " -O-metoxietiladenosina (Aeo) , 2"-0-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia saliente para cualquier extremo en cualquier hebra. La saliente puede formar un apareamiento incorrecto con el ARNm objetivo o puede ser complementaria a las secuencias del gen al que se dirige o puede ser otra secuencia.
Las salientes 5' o 3' en la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras del agente de A Ndh de la invención pueden fosforilarse . En algunas modalidades, la región saliente contiene dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, donde los dos nucleótidos pueden ser el mismo o diferente. En una modalidad, la saliente está presente en el extremo 3' de la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras. En una modalidad, esta saliente 3' está presente en la hebra antisentido. En una modalidad, esta saliente 3 ' está presente en la hebra sentido .
El agente de ARNdh de la invención comprende sólo una sola saliente, que puede fortalecer la actividad de interferencia del ARNdh, sin afectar su estabilidad general. Por ejemplo, la saliente de una sola hebra se ubica en el extremo 3' terminal de la hebra sentido o, alternativamente, en el extremo 3' terminal de la hebra antisentido. El ARNdh también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5' de la hebra antisentido (o el extremo 3 ' de la hebra sentido) o viceversa. Generalmente, la hebra antisentido del ARNdh tiene una saliente de nucleótido en el extremo 31 y el extremo 5' es romo. Si bien no se pretende ceñirse a teoría alguna, el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la hebra antisentido y una saliente del extremo 3' de la hebra antisentido favorecen la carga de la hebra guía en el proceso RISC.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención también puede tener dos extremos romos en ambos extremos del ARNdh dúplex.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención es un oligonucleótido de dos extremos romos de 19 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8, 9 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención es un oligonucleótido de dos extremos romos de 20 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 21 -F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9, 10 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención es un oligonucleótido de dos extremos romos de 21 nt de longitud, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 21 -F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5' .
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención comprende una hebra sentido de 21 nucleótidos (nt) y una hebra antisentido de 23 nucleótidos (nt) , en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'; la hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5', en donde un extremo del ARNdh es romo, mientras el otro extremo comprende una saliente de 2 nt . Preferiblemente, la saliente de 2 nt está en el extremo 3' de la antisentido. Opcionalmente, el ARNdh comprende además un ligando (preferiblemente GalNAc3) .
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención comprende una hebra sentido y una antisentido, en donde: la hebra sentido es de 25-30 residuos de nucleótidos de longitud, en donde comenzando en el nucleótido terminal 5' (posición 1) las posiciones 1 a 23 de la primera hebra comprenden al menos 8 ribonucleótidos ; la hebra antisentido es de 36-66 residuos de nucleotidos de longitud y, comenzando en el nucleótido terminal 31 , comprende al menos 8 ribonucleótidos en las posiciones apareadas con las posiciones 1- 23 de la hebra sentido para formar un dúplex; en donde al menos el nucleótido terminal 31 de la hebra antisentido no está apareado con la hebra sentido, y hasta 6 nucleotidos terminales 3' consecutivos no están apareados con la hebra sentido, formando así una saliente de una sola hebra 3' de 1-6 nucleotidos; en donde el extremo 5' de la hebra antisentido comprende de 10-30 nucleotidos consecutivos que no están apareados con la hebra sentido, formando así una saliente 5' de una sola hebra de 10-30 nucleotidos; en donde al menos los nucleotidos de 51 terminal y 31 terminal de la hebra sentido se aparean en bases con nucleotidos de la hebra antisentido cuando las hebras sentido y antisentido están alineadas para una complementariedad máxima, formando así una región sustancialmente de dúplex entre las hebras sentido y antisentido; y la hebra antisentido es suficientemente complementaria a un ARN objetivo junto con al menos 19 ribonucleótidos de la longitud de la hebra antisentido para reducir la expresión de genes objetivo cuando el ácido nucleico de doble hebra se introduce en una célula de mamífero; y en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleotidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión.
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención comprende hebras sentido y antisentido, en donde el agente de ARNdh comprende una primera hebra que tiene una longitud que es al menos 25 ya lo sumo 29 nucleótidos y una segunda hebra que tiene una longitud que es a lo sumo 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11, 12, 13 del extremo 5'; en donde el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra forman un extremo romo y la segunda hebra es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera hebra, en donde la región de dúplex que es de al menos 25 nucleótidos de longitud, y la segunda hebra es suficientemente complementaria a un ARNm objetivo a lo largo de al menos 19 nt de la longitud de la segunda hebra para reducir la expresión de genes objetivo cuando el agente de ARNdh se introduce en una célula de mamífero, y en donde escisión cortadora del agente de ARNdh preferentemente resulta en un ARNip que comprende el extremo 3' de la segunda hebra, reduciendo así la expresión del gen objetivo en el mamífero. Opcionalmente, el agente de ARNdh comprende además un ligando En una modalidad, la hebra sentido del agente de ARNdh contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se encuentra en el sitio de escisión en la hebra sentido.
En una modalidad, la hebra antisentido del agente de ARNdh también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido.
Para el agente de ARNdh que tiene una región de dúplex de 17-23 nt de longitud, el sitio de escisión de la hebra antisentido se encuentra típicamente alrededor de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5'. Por lo tanto, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden encontrarse en las posiciones 9, 10, 11; posiciones 10, 11, 12; posiciones 11, 12, 13; posiciones 12, 13, 14; o posiciones 13, 14, 15 de la hebra antisentido, comenzando el recuento desde el 1er nucleótido del extremo 5' de la hebra antisentido o comenzando el recuento desde el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra antisentido. El sitio de escisión en la hebra antisentido también puede cambiar de acuerdo con la longitud de la región de dúplex del ARNdh del extremo 51.
La hebra sentido del agente de ARNdh comprende al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la hebra; y la hebra antisentido puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido forman un dúplex de ARNdh, la hebra sentido y la hebra antisentido pueden alinearse de modo que un motivo de los tres nucleótidos en la hebra sentido y un motivo de los tres nucleótidos en la hebra antisentido tienen al menos una superposición de nucleótidos, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra sentido forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra antisentido. Alternativamente, al menos dos nucleótidos de los motivos de ambas hebras pueden superponerse, o los tres nucleótidos pueden superponerse .
En una modalidad, la hebra sentido del agente de ARNdh comprende más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo debe encontrarse en o cerca del sitio de escisión de la hebra y los otros motivos pueden ser modificaciones de alas. La expresión "modificación de ala" en la presente se refiere a un motivo que ocurre en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma hebra. La modificación de ala es adyacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos son inmediatamente adyacentes entre sí las químicas de los motivos son distintas entre sí y cuando los motivos se separan por uno o más nucleótidos las químicas de los motivos pueden ser iguales o diferentes. Dos o más modificaciones de alas pueden estar presentes. Por ejemplo, cuando dos modificaciones de alas están presentes, las modificaciones de alas pueden encontrarse en un extremo de la región de dúplex con respecto al primer motivo que está en o cerca del sitio de escisión o cada una de las modificaciones de alas puede encontrarse en cualquier lado del primer motivo.
Al igual que la hebra sentido, la hebra antisentido del agente de ARNdh comprende al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose al menos uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Esta hebra antisentido también puede contener una o más modificaciones de alas en una alineación similar a las modificaciones de alas que están presentes en la hebra sentido.
En una modalidad, la modificación de ala en la hebra sentido, la hebra antisentido o ambas hebras del agente de ARNdh típicamente no incluye el primero o dos primeros nucleótidos terminales en el extremo 31 , extremo 51 o ambos extremos de la hebra.
En otra modalidad, la modificación de ala en la hebra sentido, la hebra antisentido o ambas hebras del agente de ARNdh típicamente no incluye el primero o dos primeros nucleótidos apareados en la región de dúplex en el extremo 31 , extremo 5' o ambos extremos de la hebra.
Cuando la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de ARNdh contienen cada una al menos una modificación de ala, las modificaciones de alas pueden encontrarse en el mismo extremo de la región de dúplex y tener una superposición de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando cada una de la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de ARNdh contiene al menos dos modificaciones de alas, la hebra sentido y la hebra antisentido pueden alinearse de forma que dos modificaciones de alas de cada una de las hebras quede dentro de un extremo de la región de dúplex, teniendo una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; y dos modificaciones de cada una de las hebras quede en el otro extremo de la región de dúplex, teniendo una superposición de uno, dos o tres nucleótidos.
En una modalidad, puede modificarse cada nucleótido en la hebra sentido y la hebra antisentido del agente de ARNdh, incluyendo los nucleótidos que son parte de los motivos. Cada nucleótido puede modificarse con la misma o diferente modificación, que puede incluir una o más alteraciones de uno o ambos oxígenos de fosfato no de unión y/o uno o más de los oxígenos de fosfato que no son de unión; alteración de un constituyente del azúcar ribosa, por ejemplo, del 2' hidroxilo en el azúcar ribosa; reemplazo general del resto de fosfato con enlazantes "defosfo" ; modificación o reemplazo de una base natural; y reemplazo o modificación de la estructura principal de ribosa-fosfato .
Dado que los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones ocurren en una posición que está repetida dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o un resto de fosfato, o un 0 no enlazante de un resto de fosfato. En algunos casos la modificación ocurrirá en todas las posiciones del sujeto en el ácido nucleico pero en muchos casos no. A modo de ejemplo, una modificación puede ocurrir solamente en la posición terminal 3' o 5' en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra. Una modificación puede ocurrir en una región de doble hebra, una región de una sola hebra o en ambas. Una modificación puede ocurrir solamente en la región de doble hebra de un ARN o puede ocurrir en una región de una sola hebra de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición 0 no enlazante puede ocurrir solamente en uno o ambos extremos terminales, puede ocurrir en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra, o puede ocurrir en las regiones de doble hebra y de una sola hebra, particularmente en los extremos terminales. El extremo o extremos 5' pueden estar fosforilados .
Puede que sea posible, por ejemplo, mejorar la estabilidad, para incluir bases particulares en salientes, o para incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos en salientes de una sola hebra, por ejemplo, en una saliente 51 o 3', o en ambas. Por ejemplo, puede ser deseable incluir nucleótidos de purina en salientes. En algunas modalidades todas o algunas de las bases en una saliente 3' o 5' pueden modificarse, por ejemplo, con una modificación descrita en la presente. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en la posición 2' del azúcar ribosa con modificaciones que son conocidas en la técnica, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos , 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro (2'-F) o 2'-0-metilo modificados en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosforotioato . Las salientes no necesitan ser homologas con la secuencia objetivo.
En una modalidad, cada residuo de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con ANB, ??, CeNA., 2'-metoxietilo, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo, 2'-desoxi o 2'-fluoro. Las hebras pueden contener más de una modificación. En una modalidad, cada residuo de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con 2 ' -O-metilo o 2' -fluoro.
Al menos dos modificaciones diferentes se presentan típicamente en la hebra sentido y la hebra antisentido. Las dos modificaciones pueden ser las modificaciones 2 ' -O-metilo o 2'-fluoro, u otras.
En una modalidad, la hebra sentido y hebra antisentido contienen cada una dos nucleótidos modificados de diferente forma que se seleccionan de 2' -O-metilo o 2'-fluoro.
En una modalidad, cada residuo de la hebra sentido y hebra antisentido se modifica independientemente con un nucleótido de 2' -O-metilo, nucleótido de 2 " -deoxifluoro, nucleótido de 21 -O-N-metilacetamido (2'-0-NMA), nucleótido de 21 -O-dimetilaminoetoxietilo (2 ' -0-DMAEOE) , nucleótido de 2'-O-aminopropilo (2'-0-AP) o nucleótido de 21 -ara-F.
En una modalidad, el Na y/o Nb comprenden modificaciones de un patrón alternado. La expresión "motivo alternado" o "motivo alternativo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, ocurriendo cada modificación en nucleótidos alternados de una hebra. El nucleótido alternado puede referirse a uno por cada otro nucleótido o uno por cada tres nucleótidos o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada una un tipo de modificación del nucleótido, el motivo alternado puede ser "ABABABABABAB..." , "AABBAABBAABB..." , "AABAABAABAAB..." , "AAABAAABAAAB..." , "AAABBBAAABBB..." o "ABCABCABCABC..." , etc.
En una modalidad, el Na' y/o Nb' comprenden modificaciones de un patrón alternado. La expresión "motivo alternado" o "motivo alternativo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, ocurriendo cada modificación en nucleótidos alternados de una hebra. El nucleotido alternado puede referirse a uno por cada otro nucleotido o uno por cada tres nucleótidos o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada una un tipo de modificación del nucleotido, el motivo alternado puede ser "ABABABABABAB..." , "AABBAABBAABB..." , "AABAABAABAAB..." , "AAABAAABAAAB..." , "AAABBBAAABBB..." o "ABCABCABCABC..." , etc.
Los tipos de modificaciones contenidas en el motivo alternado pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada una un tipo de modificación en el nucleotido, el patrón alternado, es decir, las modificaciones en cada otro nucleotido, puede ser igual, pero cada una de la hebra sentido o hebra antisentido puede seleccionarse de varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alternado, tal como "ABABAB..." , "ACACAC..." "BDBDBD..." o "CDCDCD..." , etc .
En una modalidad, el agente de AR dh de la invención comprende el patrón de modificación para el motivo alternado en la hebra sentido con respecto al patrón de modificación para el motivo alternado en la hebra antisentido se cambia. El cambio puede ser de forma tal que el grupo modificado de nucleótidos de la hebra sentido corresponde a un grupo modificado de modo diferente de nucleótidos de la hebra antisentido y viceversa. Por ejemplo, la hebra sentido cuando se aparea con la hebra antisentido en el ARNdh dúplex, el motivo alternado en la hebra sentido puede comenzar con "ABABAB" de 5' -3' de la hebra y el motivo alternado en la hebra antisentido puede comenzar con "BABABA" de 3' -5' de la hebra dentro de la región de dúplex. Como otro ejemplo, el motivo alternado en la hebra sentido puede comenzar con "AABBAABB" de 5' -3' de la hebra y el motivo alternado en la hebra antisentido puede comenzar con "BBAABBAA" de 3' -5' de la hebra dentro de la región de dúplex, de modo que existe un cambio completo o parcial de los patrones de modificación entre la hebra sentido y la hebra antisentido.
En una modalidad, el agente de ARNdh comprende el patrón del motivo alternado de la modificación 2'-0-metilo y la modificación 2'-F en la hebra sentido inicialmente tiene un cambio con respecto al patrón del motivo alternado de la modificación 21 -O-metilo y la modificación 2'-F en la hebra antisentido inicialmente, es decir, el nucleótido 2 ' -O-metilo modificado en la base de la hebra sentido se aparea con un nucleótido 21 -F modificado en la hebra antisentido y viceversa. La posición 1 de la hebra sentido puede comenzar con la modificación 2'-F, y la posición 1 de la hebra antisentido puede comenzar con la modificación 2 '-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra sentido y/o hebra antisentido interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la hebra sentido y/o hebra antisentido. La interrupción del patrón de modificación de la hebra sentido y/o antisentido mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra sentido y/o antisentido mejora sorprendentemente la actividad silenciadora de genes al gen objetivo.
En una modalidad, cuando el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos se introduce en cualquiera de las hebras, la modificación del nucleótido junto al motivo es una modificación diferente de la modificación del motivo. Por ejemplo, la porción de la secuencia que contiene el motivo es "...?3????¾..." , donde "Y" representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y "Na" y "Nb" representan una modificación al nucleótido junto al motivo "YYY" que es diferente a la modificación de Y, y donde Na y Nb pueden ser las mismas o diferentes modificaciones. Alternativamente, Na y/o Nb pueden estar presentes o ausentes cuando hay una modificación de la presente.
El agente de AR dh de la invención puede comprender, además, al menos una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato . La modificación de la conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato puede ocurrir en cualquier nucleótido de la hebra sentido o hebra antisentido o ambas en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación de la conexión internucleotídica puede ocurrir en todos los nucleótidos en la hebra sentido y/o hebra antisentido; cada modificación de la conexión internucleotídica puede ocurrir en un patrón alternado en la hebra sentido o hebra antisentido; o la hebra sentido o hebra antisentido comprenden las modificaciones de la conexión internucleotídica en un patrón alternado. El patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra sentido puede ser la misma o diferente de la hebra antisentido, y el patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra sentido puede tener un cambio con respecto al patrón alternado de la modificación de la conexión internucleotídica en la hebra antisentido.
En una modalidad, el APJSTdh comprende la modificación de la conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato en la región de saliente. Por ejemplo, la región saliente comprende dos nucleótidos que tienen una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. Las modificaciones de la conexión internucleotídica también pueden realizarse para unir los nucleótidos salientes con los nucleótidos apareados terminales dentro de la región de dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o todos los nucleótidos salientes pueden unirse a través de una conexión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato y opcionalmente , puede haber conexiones internucleotídicas de fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unen el nucleótido saliente con un nucleótido apareado que está junto al nucleótido saliente. Por ejemplo, puede haber al menos dos conexiones internucleotídicas de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los cuales dos de los tres nucleótidos son nucleótidos salientes y el tercero es un nucleótido apareado junto al nucleótido saliente. Preferiblemente, estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 31 de la hebra antisentido.
En una modalidad la hebra sentido del ARNdh comprende 1-10 bloques de dos a diez conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra sentido se aparea con una hebra antisentido que comprende cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de dos conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de tres conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra anti sentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de cuatro conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentído del AR dh comprende dos bloques de cinco conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de seis conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de siete conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de ocho conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3, 4, 5 o 6 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad la hebra antisentido del ARNdh comprende dos bloques de nueve conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato separadas por 1, 2, 3 o 4 conexiones internucleótidos de fosfato, en donde una de las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato se ubica en cualquier posición en la secuencia de oligonucleótidos y la hebra antisentido se aparea con una hebra sentido que contiene cualquier combinación de fosforotioato, metilfosfonato y conexiones internucleótidos de fosfato o una hebra antisentido que comprende una conexión de fosforotioato o metilfosfonato o fosfato.
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una o más modificaciones en las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de 1-10 de las posiciones terminales de la hebra sentido y/o antisentido. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos pueden estar enlazados mediante una conexión internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato en un extremo o ambos extremos de la hebra sentido y/o antisentido .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una o más modificaciones en las conexiones intemucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de 1-10 de la región interna del dúplex de cada una de las hebras sentido y/o antisentido. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos pueden estar enlazados mediante una conexión intemucleótidos de fosforotioato metilfosfonato en la posición 8-16 de la región del dúplex contando a partir del extremo 5' de la hebra sentido; el ANdh opcionalmente puede adicionalmente comprender una o más modificaciones en las conexiones intemucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de 1-10 de las posiciones terminales.
En una modalidad, el AR dh de la invención adicionalmente comprende una a cinco modificaciones en las conexiones intemucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de la posición 1-5 y una a cinco modificaciones en las conexiones intemucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5')/ y una a cinco modificaciones en las conexiones intemucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato en las posiciones 1 y 2 y una a cinco dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión intemucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una modificación en las conexiones inte ucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en las conexiones internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5')· En una modalidad, el AR dh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5')/ y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') - En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y dos modificaciones en las conexiones internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 (contando a partir del extremo 5')/ y dos modificaciones en las conexiones internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5')· En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en las conexiones internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') - En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el AR dh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 1-5 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de la posición 18-23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato dentro de las posiciones 18-23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1 y 2, y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 20 y 21 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y una en la posición 21 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') · En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1, y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5')/ y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 20 y 21 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1 y 2, y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 y 22 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1, y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 21 y 22 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1 y 2, y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 22 y 23 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5') .
En una modalidad, el ARNdh de la invención adicionalmente comprende una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 1, y una modificación en la conexión internucleótidos de fosforotioato en la posición 21 de la hebra sentido (contando a partir del extremo 5'), y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 1 y 2 y dos modificaciones en la conexión internucleótidos de fosforotioato en las posiciones 23 y 23 de la hebra antisentido (contando a partir del extremo 5').
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención comprende uno o más apareamientos incorrectos con el objetivo, dentro del dúplex, o combinaciones de los mismos. El apareamiento incorrecto puede ocurrir en la región saliente o la región de dúplex. El par de bases puede puntuarse en base a su propensión para promover la disociación o fusión (por ejemplo, en la energía libre de asociación o disociación de un apareamiento particular, el abordaje más simple es para examinar los pares en un par de bases individual, aunque también puede utilizarse el vecino siguiente o un análisis similar) . En términos de promover la disociación: Se prefiere A:U a G:C; se prefiere G:U a G:C; y se prefiere I:C a G:C (I=inosina) . Los apareamientos incorrectos, por ejemplo, apareamientos no canónicos u otros que no son canónicos (como se describe en otra parte de la presente) se prefieren a apareamientos canónicos (A:T, A:U, G:C); y se prefieren los apareamientos que incluyen una base universal a apareamientos canónicos .
En una modalidad, el agente de ARNdh de la invención comprende al menos uno de los primeros 1, 2, 3, 4 o 5 pares de bases dentro de las regiones de dúplex del extremo 5 ' de la hebra antisentido pueden seleccionarse independientemente del grupo de: A:U, G:U, I:C, y pares no coincidentes, por ejemplo, apareamientos no canónicos u otros que no son canónicos o apareamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la hebra antisentido en el extremo 5' del dúplex.
En una modalidad, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región de dúplex del extremo 5' en la hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en A, dA, dU, U y dT. Alternativamente, al menos uno de los primeros 1, 2 o 3 pares de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5 ' de la hebra antisentido es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra antisentido es un par de bases AU.
En una modalidad, la secuencia de la hebra sentido puede representarse mediante la fórmula (I) : 5' np-Na- (X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb- (Z Z Z )j-Na-nq 3' (I) en donde : i y j son cada uno independientemente 0 o 1 ; p y q son cada uno independientemente 0-6; cada Na independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados; cada np y nq independientemente representa un nucleotido saliente ; en donde e Y no tienen la misma modificación; y cada XXX, YYY y ZZZ independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Pre eriblemente YYY es todo de nucleótidos 2'-F modificados .
En una modalidad, el Na y/o b comprenden modificaciones de un patrón alternado.
En una modalidad, el motivo YYY se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra sentido. Por ejemplo, cuando el agente de ARNdh tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede estar en o cerca del sitio de escisión (por ejemplo, puede estar en las posiciones 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 u 11, 12, 13) de la hebra sentido, comenzando la cuenta desde el primer nucleotido a partir del extremo 5' ; u opcionalmente, comenzando la cuenta en el primer nucleotido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5' .
En una modalidad, i es l y j es O, o i es O y j es l, o tanto i como j son 1. La hebra sentido puede, por lo tanto, estar representada mediante las siguientes fórmulas: 51 np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (la); 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ib); o 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 31 (Ic) .
Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (la) , Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Ib) , N representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (Ic) , cada Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 Cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z pueden ser iguales o diferentes entre sí.
En una modalidad, la hebra antisentido secuencia del ARNdh puede representarse mediante la fórmula (II) : 5' nq'-Na'- (Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- (X 'X 'X ' ) i-N ' a-np ' 3' (II) en donde : k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 0-6; cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada b' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados; cada np ' y nq' independientemente represente un nucleótido saliente que comprende 0-6 nucleótidos; en donde Nb' e Y' no tienen la misma modificación; y cada ?'?'?', Y'Y'Y' y Z'Z'Z1 independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una modalidad, el Na' y/o Nb' comprenden modificaciones de un patrón alternado.
El motivo Y'Y'Y' se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra antisentido. Por ejemplo, cuando el agente de ARNdh tiene una región de dúplex de 17-23 nt de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede estar en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la hebra antisentido, comenzando la cuenta desde el primer nucleótido a partir del extremo 5' ; u opcionalmente , comenzando la cuenta en el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5'. Preferiblemente, el motivo Y'Y'Y' se encuentra en las posiciones 11, 12, 13.
En una modalidad, un motivo Y'Y'Y' es todo de nucleótidos 2 ' -OMe modificados.
En una modalidad, k es l y l es O, o k es 0 y 1 es 1, o tanto k como 1 son 1.
La hebra antisentido puede, por lo tanto, estar representada mediante las siguientes fórmulas: 5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (Ha); 5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-IV-X'X'X'-np' 3' (Hb) ; o 5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X 'X 'X ' -Na ' -np ' 3' (He) Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (Ha) , Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (Ilb) , Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (lie) , cada Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferiblemente, ¾ es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Cada uno de X', Y' y Z1 puede ser iguales o diferente con respecto a los demás.
Cada nucleótido de la hebra sentido y la hebra antisentido puede modificarse independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2 ' -metoxietilo, 2'-0-metilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo o 2'-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con 2'-0-metilo o 2'-fluoro. Cada X, Y, Z, X1, Y' y Z', en particular, puede representar una modificación 2'-0-metilo o una modificación 2'-fluoro.
En una modalidad, la hebra sentido del agente de A dh comprende un motivo YYY que se encuentra en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región de dúplex tiene 21 nt, comenzando el conteo desde el primer nucleótido desde el extremo 5' u, opcionalmente , comenzando el conteo desde el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex desde el extremo 5'; e Y representa una modificación 2'-F. La hebra sentido adicionalmente puede contener un motivo XXX o motivos ZZZ como modificaciones de alas en extremos opuestos de la región de dúplex; y cada XXX y ZZZ independientemente representa una modificación 2'-OMe o una modificación 2'-F.
En una modalidad, la hebra antisentido puede contener un motivo Y 1 Y 1 Y 1 en las posiciones 11, 12, 13 de la hebra, comenzando la cuenta desde el primer nucleótido a partir del extremo 5' u, opcionalmente , comenzando la cuenta en el primer nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, a partir del extremo 5'; e Y' representa una modificación 2'-0-metilo. La hebra antisentido adicionalmente puede contener un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z1 como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y cada X'X'X' y Z'Z'Z' independientemente representa una modificación 2'-OMe o modificación 2'-F.
La hebra sentido representada mediante cualquiera de las fórmulas precedentes (la) , (Ib) y (Ic) forma un dúplex con una hebra antisentido representada mediante cualquiera de las fórmulas (lia), (Ilb) y (lie) , respectivamente.
De esta forma, los agentes de ARMdh pueden comprender una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de ARNdh representado por la fórmula (III) : sentido: 51 np -Na- (X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb - (Z Z Z)-¡-Na-nq 3 » antisentido: 3' np' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -?? ? ' -Nb' - (Z ' Z ' Z ' ) i- a'-nq' 5' (III) en donde : i, j, k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados ; en donde cada ??' , np, nq' y nq independientemente representa una secuencia de nucleótido saliente; y cada XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y 1 Y ' Y 1 y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una modalidad, i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 1. En otra modalidad, k es 1 y 1 es 0; k es 0 y 1 es 1; o tanto k como 1 son 1.
En una modalidad, los agentes de AR dh de la invención comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de ARNdh representado por la fórmula (V) : sentido: 5' Na- (X X X)i-Nb-Y Y Y -Nb- (Z Z Z)j-Na-nq 3 ' antisentido: 3· np -Na' - (?' X ' ' ) k-Nb' -Y ? ? ' -Nb' - (Z'Z'Z')i-Na' 5' (V) en donde : i, j, k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 2 ; cada Na y Na independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados ; en donde cada np' y nq independientemente representa una secuencia de nucleótido saliente; y cada XXX, YYY, ZZZ, ?'?'?', ?' ?' Y' y Z'Z'Z' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una modalidad, i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1 ; o tanto i como j son 1. En otra modalidad, k es 1 y 1 es 0; k es 0 y 1 es 1 ; o tanto k como 1 son 1.
En una modalidad, los agentes de ARNdh de la invención comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de ARNdh representado por la fórmula (Va) : sentido: 5' Na- (X X X)i-Nb-Y Y Y -Nb- (Z Z Z)j-Na 3' antisentido: 3' ??' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -?? ? ' -Nb' - (Z ' Z ' Z ' ) !- Na' 5' (Va) en donde : i, j, k y 1 son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 2 ; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma; cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados ; en donde np' representa una secuencia de nucleótido saliente; y cada XXX, YYY, ZZZ, ?'?'?', ?'?'?' y ?'?'?' independientemente representa un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
Combinaciones ejemplares de la hebra sentido y la hebra antisentido que forman un dúplex de ARNdh incluyen las siguientes fórmulas: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5' (Illa) 5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X' -Nb'-Y'Y'Y' -Na' -nq' 5' (Illb) 5 ' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3 ' 3' np'-Na'-X'X'X' -Nb'-Y'Y'Y' -Nb' -Z 'Z'Z' - a-rig' 5' (IIIc) Cuando el agente de ARNdh se representa mediante la fórmula (Illa) , cada Nb y Nb independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na' y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados .
Cuando el agente de ARNdh se representa mediante la fórmula (Illb) , cada Nb' y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0- 10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNdh se representa mediante la fórmula (lile) , cada Nb' y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada Na, Na' , Nb y Nb' independientemente comprende modificaciones de patrón alternado.
Cada X, Y y Z en la fórmulas (III), (Illa), (Illb) y (lile) pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cuando el agente de ARNdh se representa mediante la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) , al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y1. De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Y1; o los tres nucleótidos Y todos forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Y1.
Se comprenderá que los nucleótidos Na de la base se aparean con Na' , los nucleótidos Nb de la base se aparean con Nb' , los nucleótidos X de la base se aparean con X' , los nucleótidos Y de la base se aparean con Y' , y los nucleótidos Z de la base se aparean con Z' .
Cuando el agente de ARNdh se representa mediante la fórmula (Illa) o (lile), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z1. De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Z1; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos Z'.
Cuando el agente de ARNdh se representa como la fórmula (Illb) o (lile) , al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X' . De forma alternativa, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos X1; o los tres nucleótidos X forman pares de bases con los correspondientes nucleótidos X1.
En una modalidad, la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y' , la modificación en el nucleótido Z es diferente de la modificación en el nucleótido Z' y/o la modificación en el nucleótido X es diferente de la modificación en el nucleótido X' .
En una modalidad, el agente de ARNdh es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) , en donde los dúplex están conectados mediante un enlazante. El enlazante puede ser escindible o no escindible . Opcionalmente , el multímero adicionalmente comprende un ligando. Cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En una modalidad, el agente de ARNdh es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) , en donde los dúplex están conectados mediante un enlazante. El enlazante puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero adicionalmente comprende un ligando. Cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En una modalidad, dos agentes de ARNdh representados mediante la fórmula (III) , (Illa) , (Illb) o (lile) están enlazados entre sí en el extremo 5' y uno o ambos de los extremos 3' se conjugan opcionalmente con un ligando. Cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los ARNdh puede dirigirse al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
Varias publicaciones describieron ARNip multiméricos y pueden usarse con el ARNdh de la invención. Las publicaciones incluyen los documentos WO2007/091269, Patente de los Estados Unidos No. 7858769, WO2010/141511 , WO2007/117686 , WO2009/014887 y O2011/031520 cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
El agente de AR dh que contiene conjugaciones de uno o más restos de carbohidratos con un agente de ARNdh puede optimizar una o más propiedades del agente de ARNdh. En muchos casos, el resto de carbohidrato estará unido a una subunidad modificada del agente de ARNdh. Por ejemplo, el azúcar ribosa de una o más subunidades de ribonucleótidos de un agente de ARNdh puede reemplazarse por otro resto, por ejemplo, un portador no carbohidrato (preferiblemente cíclico) al cual se une un ligando de carbohidrato. Una subunidad de ribonucleótidos en la cual el azúcar ribosa de la subunidad se ha reemplazado de este modo se denomina en la presente como una subunidad de modificación de reemplazo de ribosa (SMRR) . Un portador cíclico puede ser un sistema de anillos carbocíclico, es decir, todos los átomos del anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillos heterocíclico, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre. El portador cíclico puede ser un sistema de anillos monocíclico, o puede contener dos o más anillos, por ejemplo, anillos fusionados. El portador cíclico puede ser un sistema de anillos completamente saturados, o puede contener uno o más enlaces dobles.
El ligando puede estar unido al polinucleótido a través de un portador. Los portadores incluyen (i) al menos un "punto de unión de estructura principal", preferiblemente dos "puntos de unión de estructura principal" y (ii) al menos un "punto de unión de conexión" . Un "punto de unión a estructura principal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo o, generalmente, un enlace disponible para, y que es adecuado para la incorporación del portador en la estructura principal, por ejemplo, el fosfato, o fosfato modificado, por ejemplo, azufre que contiene, estructura principal, de un ácido ribonucleico. Un "punto de unión de conexión" (TAP) en algunas modalidades se refiere a un átomo de anillo constituyente del portador cíclico, por ejemplo, un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión de estructura principal) que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, por ejemplo, un carbohidrato, por ejemplo, monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido . Opcionalmente , el resto seleccionado se conecta mediante una conexión interviniente al portador cíclico. Por lo tanto, el portador cíclico a menudo incluirá un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, o generalmente proporcionará un enlace que es adecuado para la incorporación o conexión de otra entidad química, por ejemplo, un ligando al anillo constituyente.
En modalidades, el AR dh de la invención se conjuga con un ligando a través de un portador, en donde el portador puede ser un grupo cíclico o acíclico; preferiblemente, el grupo cíclico se selecciona de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1 , 3] dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, pridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalino; preferiblemente, el grupo acíclico se selecciona de estructura principal de serinol o estructura principal dietanolamina .
El agente de AR de doble hebra (ARNdh) de la invención opcionalmente puede conjugarse con uno o más ligandos. El ligando puede estar unido a la hebra sentido, hebra antisentido o ambas hebras, en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos. Por ejemplo, el ligando puede conjugarse con la hebra sentido, en particular, el extremo 3' de la hebra sentido.
Ligandos Una amplia variedad de entidades pueden acoplarse a los oligonucleótidos de la presente invención. Restos preferidos son ligandos, que están acoplados, preferiblemente covalentemente , ya sea directamente o indirectamente a través de una conexión interviniente .
En modalidades preferidas, un ligando altera la distribución, objetivo o vida de la molécula a la cual está incorporada. En modalidades preferidas un ligando proporciona una afinidad mejorada para un objetivo seleccionado, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimiento, receptor, por ejemplo, un compartimiento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, como, por ejemplo, en comparación con una especie ausente tal como un ligando. Los ligandos que proporcionan afinidad mejorada para un objetivo seleccionado también se denominan ligandos dirigidos.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas . Los ligandos endosomolíticos promueven la lisis del endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra una actividad de membrana dependiente de pH y fusogenecidad. En una modalidad, el ligando endosomolítico asume su conformación activa en el pH endosomal . La conformación "activa" es la conformación en la cual el ligando endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. Ligandos endosomolíticos ejemplares incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc . , 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys . Acta, 2002, 1559: 56-68). En una modalidad, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que se someterá a un cambio en la carga o protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden mejorar el transporte, hibridación y propiedades de especificidad y pueden mejorar también la resistencia de nucleasa del oligorribonucleótido modificado o natural resultante o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descrita en la presente y/o ribonucleótidos modificados o naturales.
Los ligandos en general pueden incluir modificantes terapéuticos, por ejemplo, para mejorar la captación; compuestos diagnósticos o grupos reporteros por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes de reticulación y restos que confieren resistencia a la nucleasa. Ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas e imitaciones de péptidos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés), lipoproteína de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) , lipoproteína de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) o globulina) ; un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) ; o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un ácido de poliamina sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero) . Ejemplos de ácidos de poliamina incluyen ácido de poliamina es una polilisina (PLL) , poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de anhídrido de estireno-ácido maleico, copolímero poli (L-láctido-co-glicólido) , copolímero de anhídrido de éter maleico, copolímero de N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA) , polietilenglicol (PEG) , alcohol polivinílico (PVA) , poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico) , polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina . Ejemplo de poliaminas incluye: polietilenimina, polilisina (PLL) , espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido helicoidal alfa.
Los ligandos también pueden incluir grupos dirigidos, por ejemplo, un agente que se dirige a células o tejido, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico tal como una célula de riñon. Un grupo dirigido puede ser una tirotropina, melanotropina , lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva , carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente , N-acetil -galactosamina, mañosa multivalente de N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados , galactosa multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lipido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, una imitación de un péptido RGD o un aptámero. La Tabla 2 muestra algunos ejemplos de ligandos dirigidos y sus receptores asociados.
Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas) , reticuladores (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C) , porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapphirina) , hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina) , endonucleasas artificiales o un quelante (por ejemplo, EDTA) , moléculas lipofílicas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, 1-ácido butírico de pireno, dihidrotestosterona, 1 , 3 -Bis-0 (hexadecil ) glicerol , grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol , borneol, mentol, 1,3-propanediol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03- (oleoil) litocólico, ácido 03- (oleoil) colénico, dimetoxitritilo, o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat) , agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K) , MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radioetiquetados , enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico) , ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupamientos de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos) , dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específica tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también incluyen hormonas y receptoras de hormonas. Ellos también pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente , N-acetil-galactosamina, mañosa multivalente de N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente o aptámeros . El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de cinasa p38 MAP o un activador de NF-KB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de iARN en la célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo, mediante la alteración de los microtúbulos , microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinólido, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
El ligando puede aumentar la captación del oligonucleótido en la célula mediante, por ejemplo, la activación de una respuesta inflamatoria. Ligandos ejemplares que tendrían el efecto incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa) , interleuquina-1 beta o interferón gamma.
En un aspecto, el ligando es un lípido o molécula en base a lípidos. El lípido o molécula a base de lípidos se une preferiblemente a una proteína de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) . Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ejemplo, un tejido objetivo no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser el hígado, incluyendo células parenquimales del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden utilizarse como ligandos. Por ejemplo, también puede utilizarse naproxeno o aspirina. Un lípido o ligando en base a lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o transporte en una célula objetivo o membrana celular y/o (c) puede utilizarse para ajustar la unión a una proteína de suero, por ejemplo, HSA.
Un ligando en base a lípidos puede utilizarse para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido objetivo. Por ejemplo, será menos probable que un lípido o ligando en base a lípidos que se une a HSA más fuertemente sea dirigido al riñon y de este modo menos probable que sea eliminado del cuerpo. Un lípido o ligando en base a lípidos que se une a HSA menos fuertemente puede utilizarse para dirigir el conjugado al riñon.
En una modalidad preferida, el ligando en base a lípidos se une a HSA. Preferiblemente, se une a HSA con una afinidad suficiente de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente a un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión HSA-ligando no pueda revertirse.
En otra modalidad preferida, el ligando en base a lípidos se une a HSA levemente o no se une en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente al riñon Otros restos que se dirigen a las células de riñon también pueden utilizarse en lugar o además del ligando en base a lípidos.
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que es captado por una célula objetivo, por ejemplo, una célula proliferante. Estas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por la proliferación de células no deseadas, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Vitaminas ejemplares incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por células cancerosas.
También se incluyen HAS, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) .
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación de células, preferiblemente un agente de permeación de células helicoidales. Preferiblemente, el agente es antipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennopedia . Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluyendo un peptidomimético, invertómeros , conexiones no peptídicas o pseudo-peptídicas , y el uso de D-aminoácidos . El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipofílica y una fase lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en la presente como un oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El péptido o resto peptidomimético puede ser de aproximadamente 5-50 aminoácido de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación de células, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe) . El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS, por sus siglas en inglés) . Un péptido que contiene MTS hidrófoba ejemplar es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP . Un análogo de RFGF (por ejemplo, secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto dirigido. El resto peptídico puede ser un péptido "de suministro", que puede portar moléculas polares grandes, incluyendo péptidos, oligonucleótidos y proteína en las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat de VIH (GRKKRRQRRRPPQ) y la proteína Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede codificarse mediante una secuencia aleatoria de ADN, de modo que un péptido identificado de una biblioteca que expresa bacteriófagos o una biblioteca combinatoria una-perla-un-compuesto (OBOC, por sus siglas en inglés) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferiblemente el péptido o peptidomimético conectado a un agente de iARN a través de una unidad de monómero incorporado es un péptido que se dirige a una célula tal como un péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o imitación de RGD. Un resto peptídico puede estar en el intervalo de longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos de péptido pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales . Puede utilizarse cualquiera de las modificaciones estructurales descritas más adelante. Un resto peptídico RGD puede utilizarse para dirigirse a una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cáncer Res., 62:5139-43, 2002). Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de iARN a tumores de una variedad de otros tejidos, incluyendo el pulmón, riñon, bazo o hígado (Aoki et al., Cáncer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Preferiblemente, el péptido RGD facilitará el direccionamiento de un agente de iARN al riñon. El péptido RGD puede ser lineal o cíclico y se puede modificar, por ejemplo, glicosilar o metilar, para facilitar el direccionamiento a tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glicosilado puede suministrar un agente de iARN a una célula tumoral que expresa a?ß3 (Haubner et al., Jour. Nucí. Med. , 42:326-336, 2001). Pueden utilizarse los péptidos que los marcadores objetivos enriquecieron en células proliferantes. Por ejemplo, el RGD que contiene péptidos y peptidomiméticos puede dirigirse a células cancerosas, en particular células que exhiben una integrina. Por lo tanto, uno puede utilizar péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos , así como imitaciones RGD sintéticas.
Además de RGD, uno puede utilizar restos que se dirigen al ligando de integrina. Generalmente, los ligandos pueden utilizarse para controlar células proliferantes y angiogénesis . Conjugados preferidos de este tipo de ligando se dirigen a PECAM-1, VEGF u otro gen canceroso, por ejemplo, un gen canceroso descrito en la presente.
Un "péptido de permeacion celular" es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeacion celular microbiana puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropina Pl) , un péptido que contiene un enlace de disulfuro (por ejemplo, a-defensina, ß-defensina o bactenecina) , o un péptido que contiene solamente uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina) . Un péptido de permeacion celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS) . Por ejemplo, un péptido de permeacion celular puede ser un péptido anfipático bipartita, tal como MPG, que se deriva del dominio de péptido de fusión de VIH-1 gp41 y la NLS del antígeno T grande SV40 (Simeoni et al.. Nucí. Acids Res. 31:2717-2724, 2003) .
En una modalidad, un péptido dirigido puede ser un péptido a-helicoidal anfipático. Péptidos a-helicoidales anfipáticos ejemplares incluyen, a modo no taxativo, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, péptido similar a borabinina (BLP) , catelicidinas , ceratotoxinas , péptidos S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales de mixinos (HFIAPs) , magaininas, brevininas-2 , dermaseptinas , melitinas, pleurocidina, péptidos H2A, péptidos Xenopus, esculentinis-1 y caerinas. Una cantidad de factores se considerarán preferiblemente para mantener la integridad de la estabilidad de la hélice. Por ejemplo, se utilizará una cantidad máxima de residuos de estabilización de hélice (por ejemplo, leu, ala o lys) y se utilizará una cantidad mínima de residuos de desestabilización de hélice (por ejemplo, prolina o unidades monoméricas cíclicas) . Se considerará el residuo protector (por ejemplo Gly es un residuo protector de N ejemplar y/o puede utilizarse la amidación del extremo C para proporcionar un enlace H extra para estabilizar la hélice. La formación de puentes salinos entre los residuos con cargas opuestas, separados por las posiciones i ± 3 o i ± 4 pueden proporcionar estabilidad. Por ejemplo, residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato.
Los ligandos peptídicos y peptidomiméticos incluyen aquellos que tienen péptidos naturales o modificados, por ejemplo, péptidos D o L; péptidos OÍ, ß o ?; péptidos N-metilos; azapéptidos ; péptidos que tienen una o más amidas, es decir, péptido, conexiones reemplazadas con uno o más urea, tiourea, carbamato o conexiones de urea sulfonilo; o péptidos cíclicos .
El ligando dirigido puede ser cualquier ligando que es capaz de dirigirse a un receptor específico. Ejemplos son los siguientes: folato, GalNAc, galactosa, mañosa, manosa-6P, agrupamientos de azúcares tales como agrupamiento de GalNAc, agrupamiento de mañosa, agrupamiento de galactosa o un aptámero. Un agrupamiento es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos dirigidos también incluyen ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimioquina, transíerrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos LDL y HDL. Los ligandos también pueden basarse en ácido nucleico, por ejemplo, un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descritas en la presente.
Agentes de liberación endosomal incluyen imidazoles, poli u oligoimidazoles , PEIs, péptidos, péptidos fusogénicos, policaboxilatos, policationes , oligo o poli cationes o aniones enmascarados, acétales, poliacetales , cetales/poliacetales, ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas.
Modulador FC significa modulador farmacocinético . Moduladores de la FC incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos fosfolípidos , péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Moduladores de la FC ejemplares incluyen, a modo no taxativo, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos , diacilglicérido, fosfolípidos , esfingolípidos , naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se conoce que los oligonucleótidos que comprenden una cantidad de conexiones de fosforotioato se unen a la proteína de suero, por lo tanto los oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples conexiones de fosforotioato en la estructura principal también son abordables para la presente invención como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores de la FC) .
Además, los aptámeros que se unen a componentes de suero (por ejemplo, proteínas de suero) también son abordables para la presente invención como ligandos moduladores de la FC.
Otros conjugados de ligandos abordables para la invención se describen en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos USSN: 10/916,185, presentada el 10 de agosto de 2004; USSN: 10/946,873, presentada el 21 de setiembre 2004; USSN: 10/833,934, presentada el 3 de agosto de 2007; USSN: 11/115,989 presentada el 27 de abril de 2005 y USSN: 11/944,227 presentada el 21 de noviembre de 2007, que se incorporan a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos.
Cuando dos o más ligandos están presentes, los ligandos pueden tener las mismas propiedades, todos tienen propiedades diferentes o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen diferentes propiedades. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades moduladoras FC. En una modalidad preferida, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos pueden acoplarse a los oligonucleótidos en varios lugares, por ejemplo, extremo 3', extremo 5' y/o en una posición interna. En modalidades preferidas, el ligando está unido a los oligonucleótidos a través de una conexión interviniente , por ejemplo, un portador descrito en la presente. El ligando o ligando conectado puede estar presente en un monómero cuando el monómero se incorpora en la hebra en crecimiento. En algunas modalidades, el ligando puede incorporarse a través del acoplamiento a un monómero "precursor" después de que el monómero "precursor" se ha incorporado en la hebra de crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tiene, por ejemplo, una conexión amino-terminada (es decir, que tiene un ligando no asociado) , por ejemplo, TAP- (CH2) nNH2 puede incorporarse en una hebra de oligonucleótido de crecimiento. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene un grupo electrofílico, por ejemplo, un éster pentafluorofenilo o grupo aldehido, puede estar unido posteriormente al monómero precursor mediante el acoplamiento del grupo electrofílico del ligando con el grupo nucleofílico de la conexión del monómero precursor.
En otro ejemplo, puede incorporarse un monómero que tiene un grupo químico adecuado para tomar parte en la reacción de una química "clic", por ejemplo, una conexión/enlazante terminado de azida o alquino. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene un grupo químico complementario, por ejemplo, un alquino o azida puede unirse al monómero precursor mediante el acoplamiento del alquino y la azida juntos.
Para los oligonucleótidos de doble hebra, los ligandos pueden unirse a una o ambas hebras. En algunas modalidades, un agente de iARN de doble hebra contiene un ligando conjugado con la hebra sentido. En otras modalidades, un agente de iARN de doble hebra contiene un ligando conjugado con la hebra antisentido.
En algunas modalidades, el ligando puede conjugarse a nucleobases, restos de azúcar o conexiones internucleosídicas de moléculas de ácido nucleico. La conjugación a nucleobases de purina o derivados de las mismas pueden ocurrir en cualquier posición incluyendo, átomos endocíclicos y exocíclicos. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 6-, 7- u 8- de una nucleobase de purina se unen a un resto de conjugado. La conjugación a nucleobases de pirimidina o derivados de la misma también puede ocurrir en cualquier posición. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 5- y 6-de una nucleobase de pirimidina pueden sustituirse con un resto de conjugado. La conjugación a restos de azúcar de nucleósidos puede ocurrir en cualquier átomo de carbono. Átomos de carbono ejemplares de un resto de azúcar que puede unirse a un resto de conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5' . La posición 1' también puede unirse a un resto de conjugado, tal como en un residuo abásico. Las conexiones internucleosídicas también pueden contener restos conjugados. Para las conexiones que contienen fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditiotato, fosforoamidato y similares) , el resto conjugado puede estar unido directamente al átomo de fósforo o a un átomo 0, N o S unido al átomo de fósforo. Para las conexiones internucleosídicas que contienen amina o amida (por ejemplo, APN) , el resto conjugado puede estar unido al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente .
Puede utilizarse cualquier ligando adecuado en el campo de la interferencia de ARN, aunque el ligando es típicamente un carbohidrato, por ejemplo monosacárido (tal como GalNAc) , disacárido, trisacárido, tetrasacárido, polisacárido .
Las conexiones que conjugan el ligando al ácido nucleico incluyen aquellas descritas anteriormente. Por ejemplo, el ligando puede ser uno o más derivados de GalNAc (N-acetilglucosamina) unidos a través de enlazantes ramificados bivalentes o trivalentes.
En una modalidad, el ARNdh de la invención se conjuga con un enlazante ramificado bivalente y trivalente incluye las estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (IV) - (VII) : Fórmula (IV) Fónnula (V) Fónnula (VI) Fónnula (VII) en donde : q _2A, q_2B, q_3A, q_3B, q_4„A, q_4B, q^,5A, q^.5B y q„5C representan independientemente para cada caso 0-20 y en donde la unidad de repetición puede ser la misma o diferente; p2A p2B p3A p3B p4A p4B p5A p5B p5C , 2A r-,2B ,p3A rp3B TA, T4B, TA, T5B, T5C son cada una independientemente para cada caso ausente, CO, NH, 0, S, 0C(0), NHC(O), CH2, CH2NH o CH20 ; Q2\ Q2B, Q3\ Q3B, Q4A, Q4B, Q5\ Q5B, Q5C son independientemente para cada caso ausente, alquileno, alquileno sustituido en donde uno o más metilenos pueden interrumpirse o terminarse por uno o más de 0, S, S (0) , S02, N(RN), C(R')=C(R"), C=C o C(0); R2\ R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C son cada uno independientemente para cada caso ausente, NH, 0, S, CH2, C(0)0, C(0)NH, NHCH(Ra)C(0) , -C (O) -CH (Ra) -NH- , CO, CH=N-0, rociclilo; T L 2A, yL 2B, yL 3A, tL 3B, TL 4A, tL 4B, TL 5A, tL 5B y TL 5C representan e _Tl ligando; es decir, cada uno independientemente para cada caso un monosacárido (tal como GalNAc) , disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o una cadena lateral de aminoácidos.
Los derivados de GalNAc de conjugación trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen objetivo, tal como aquellos de la fórmula (VII) : Fórmula (VII) en donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, tal como un derivado de GalNAc .
Ejemplos de derivados de GalNAc que conjugan grupos enlazantes ramificados bivalentes y trivalentes adecuados incluyen, a modo no taxativo, los siguientes compuestos: ?? Definiciones Tal como se utilizan en la presente, los términos "ARNdh" , "AR ip" y "agente de AR i" se utilizan de forma intercambiable para agentes que pueden mediar el silenciamiento de un AR objetivo, por ejemplo, ARNm, por ejemplo, un transcripto de un gen que codifica una proteína. Para conveniencia, el ARNm también se denomina en la presente ARNm a silenciar. El gen también se denomina un gen objetivo. En general, el ARN a silenciar es un gen endógeno o un gen patógeno. Además, los ARN que no sean ARNm, por ejemplo, ARNt, y ARN virales, también pueden ser dirigidos.
Tal como se utiliza en la presente, la frase "que media iARN" se refiere a la capacidad de silenciar, de un modo específico para las secuencias, un ARN objetivo. Sin ánimo de ceñirse a ninguna teoría, se cree que el silenciamiento utiliza la maquinaria o proceso de iARN y un ARN guía, por ejemplo, un agente de ARNip de 21 a 23 nucleótidos.
Tal como se utiliza en la presente, "específicamente hibridable" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que la unión estable y específica ocurre entre un compuesto de la invención y una molécula de ARN objetivo. La unión específica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias no objetivas en condiciones en las cuales se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vi tro, en condiciones en las cuales se realizan los ensayos. Las secuencias no objetivo típicamente difieren en al menos 5 nucleótidos.
En una modalidad, un agente de ARNdh de la invención es "suficientemente complementario" a un ARN objetivo, por ejemplo, un ARNm objetivo, de forma tal que el agente de ARNdh silencia la producción de proteína codificada por el ARNm objetivo. En otra modalidad, el agente de ARNdh de la invención es "exactamente complementario" a un ARN objetivo, por ejemplo, el ARN objetivo y el agente de dúplex de ARNdh se aparean, por ejemplo para formar un híbrido hecho exclusivamente de pares de bases Watson-Crick en la región de complementariedad exacta. Un ARN objetivo "suficientemente complementario" puede incluir una región interna (por ejemplo, de al menos 10 nucleótidos) que es exactamente complementaria a un ARN objetivo. Más aun, en algunas modalidades, el agente de ARNdh de la invención específicamente discrimina una diferencia de un solo nucleótido. En este caso, el agente de ARNdh solamente media la iARN si se encuentra complementariedad exacta en la región (por ejemplo, dentro de 7 nucleótidos de) la diferencia de un solo nucleótido.
Tal como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico (ARN o ADN) , por ejemplo, de una longitud de menos de 100 , 200 , 300 o 400 nucleótidos.
El término "halo" se refiere a cualquier radical flúor, cloro, bromo o yodo. El término "alquilo" se refiere a cadenas de hidrocarburos no aromáticos saturados e insaturados que pueden ser una cadena recta o cadena ramificada que contienen el número indicado de átomos de carbono (estos incluyen, a modo no taxativo, propilo, alilo o propargilo) , que pueden insertarse opcionalmente con N, O o S. Por ejemplo, Ci- Ci0 indica que el grupo puede tener de 1 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. El término "alcoxi" se refiere a un radical - 0-alquilo. El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-) . El término "alquilenodioxo" se refiere a una especie divalente de la estructura -0-R-O-, en la cual R representa un alquileno. El término "aminoalquilo" se refiere a un alquilo sustituido por un amino. El término "mercapto" se refiere a un radical -SH. El término "tioalcoxi" se refiere a un radical -S-alquilo.
El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclico de 6 carbonos o biciclico de 10 carbonos en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo pueden sustituirse por un sustituyente . Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y similares. El término "arilalquilo" o el término "aralquilo" se refieren a alquilo sustituido por un arilo. El término "arilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido por arilo.
El término "cicloalquilo" , tal como se emplea en la presente, incluye grupos de hidrocarburo cíclico saturado y parcialmente insaturado que tienen 3 a 12 carbonos, por ejemplo, 3 a 8 carbonos, y, por ejemplo, 3 a 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente puede sustituirse opcionalmente . Grupos cicloalquilo incluyen, a modo no taxativo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo .
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico de 5-8 miembros, biciclico de 8-12 miembros, o tricíclico de 11-14 miembros aromático que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, seleccionándose los heteroátomos de 0, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, O o S si es monocíclico, bicíclico o tricíclico, respectivamente) , en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo pueden sustituirse por un sustituyente . Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo y similares. El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refieren a un alquilo sustituido por un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi " se refiere a un alcoxi sustituido por heteroarilo.
El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillos monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros no aromático que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1-9 heteroátomos si es tricíclico, seleccionándose los heteroátomos de O, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, 0 o S si es monocíclico, bicíclico o tricíclico, respectivamente) , en donde 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo pueden sustituirse por un sustituyente. Ejemplos de grupos heterociclilo incluyen triazolilo, tetrazolilo, piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y similares.
El término "oxo" se refiere a un átomo de oxígeno que forma un carbonilo cuando se une a carbono, un N-óxido cuando se une a nitrógeno y un sulfóxido o sulfona cuando se une a azufre .
El término "acilo" se refiere a un sustituyente de alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, arilcarbonilo, heterociclilcarbonilo o heteroarilcarbonilo, cualquiera de los cuales puede sustituirse adicionalmente por sustituyentes El término "sustituido" se refiere al reemplazo de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado incluyendo, a modo no taxativo: halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heterociclilo, tiol, alquilotio, ariltio, alquilotioalquilo, ariltioalquilo, alquilosulfonilo, alquilosulfoniloalquilo, arilsulfoniloalquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, aminocarbonilo, alquiloaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, haloalquilo, amino, trifluorometilo, ciano, nitro, alquiloamino, arilamino, alquiloaminoalquilo, arilaminoalquilo, aminoalquiloamino, hidroxi, alcoxialquilo, carboxialquilo, alcoxicarboniloalquilo, aminocarboniloalquilo, acilo, aralcoxicarbonilo, ácido carboxílico, ácido sulfónico, sulfonilo, ácido fosfónico, arilo, heteroarilo, heterocíclico y alifático. Se comprende que el sustituyente puede sustituirse adicionalmente.
Grupos de enlace escindibles Un grupo de enlace escindible es uno que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que tras ingresar en una célula objetivo se escinde para liberar las dos partes que el enlazante mantiene juntas. En una modalidad preferida, el grupo de enlace escindible se escinde al menos 10 veces o más, preferiblemente al menos 100 veces más rápido en la célula objetivo o en una primera condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar condiciones intracelulares) que es la sangre de un sujeto, o en una segunda condición de referencia (que puede, por ejemplo, seleccionarse para imitar o representar condiciones encontradas en la sangre o suero) .
Los grupos de enlace escindibles son susceptibles a agentes de escisión, por ejemplo, pH, potencial de redox o la presencia de moléculas de degradación. Generalmente, los agentes de escisión son más prevalentes o se encuentran en niveles o actividades más altos dentro de células que en suero o sangre. Ejemplos de los agentes de degradación incluyen: agentes de redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluyendo, por ejemplo, enzimas oxidativas o reductivas o agentes reductivos tales como mercaptanos, presentes en células, que pueden degradar un grupo de enlace escindible de redox mediante reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente ácido, por ejemplo, aquellos que resultan en un H de cinco o menos; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de enlace escindible ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas de sustratos) y fosfatasas.
Un grupo de enlace escindible, tal como un enlace de disulfuro, puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es 7.4, mientras el pH intracelular promedio es levemente más bajo, en el intervalo de aproximadamente 7.1-7.3. Los endosomas tienen el pH más ácido, en el intervalo de 5.5-6.0, y los lisosomas tienen un pH incluso más ácido: alrededor de 5.0. Algunos enlazantes tendrán un grupo de enlace escindible que se escinde en un pH preferido, liberando de este modo el lípido catiónico del ligando dentro de la célula o en el compartimiento deseado de la célula.
Un enlazante puede incluir un grupo de enlace escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de enlace escindible incorporado en un enlazante puede depender de la célula que será dirigida. Por ejemplo, los ligandos que se dirigen al hígado pueden unirse a los lípidos catiónicos a través de un enlazante que incluye un grupo éster. Las células del hígado son ricas en esterasas y, por lo tanto, el enlazante se escindirá más eficientemente en células del hígado que en tipos de célula que no son ricas en esterasa. Otros tipos de células ricas en esterasas incluyen células del pulmón, corteza renal y testículos.
Los enlazantes que contienen enlaces peptídicos pueden utilizarse cuando se apunta a tipos de célula ricas en peptidasas, tales como células del hígado y sinoviocitos .
En general, la adecuación de un grupo de enlace escindible candidato puede evaluarse mediante la prueba de la capacidad de un agente de degradación (o condición) para escindir el grupo de enlace candidato. También será deseable evaluar el grupo de enlace de escisión candidato para determinar la capacidad de resistir la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no objetivo. Por lo tanto uno puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona para ser indicativa de la escisión en una célula objetivo y la segunda se selecciona para ser indicativa de la escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, sangre o suero. La evaluaciones pueden llevarse a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivo celulares, en órganos o cultivos tisulares o en animales enteros. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libres de células o de cultivo y para confirmar mediante evaluaciones adicionales en animales enteros. En modalidades preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con sangre o suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares) .
Grupos de enlace escindibles de redox Una clase de grupos de enlace escindibles son grupos de enlace escindibles de redox que se escinden tras reducción u oxidación. Un ejemplo de grupo de enlace reductivamente escindible es un grupo de enlace de disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo de enlace escindible candidato es un "grupo de enlace reductivamente escindible" adecuado, o por ejemplo es adecuado para su uso con un resto de ARNi particular y un agente de direccionamiento particular, pueden verse los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, un candidato puede evaluarse mediante incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente de reducción utilizando reactivos conocidos en la técnica que imitan la tasa de escisión que se observaría en una célula, por ejemplo, una célula objetivo. Los candidatos también pueden evaluarse en condiciones que se seleccionan para imitar las condiciones de la sangre o suero. En una modalidad preferida, los compuestos candidatos se escinden a los sumo 10% en la sangre. En modalidades preferidas, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares) . La tasa de escisión de los compuestos candidatos puede determinarse utilizando ensayos de cinética de enzimas estándar en condiciones elegidas para imitar un medio intracelular y compararse con condiciones elegidas para imitar un medio extracelula .
Grupos de enlace escindibles en base a fosfato Los grupos de enlace escindibles en base a fosfato son escindidos por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en células son enzimas tales como fosfatasas en células. Ejemplos de grupos de enlace en base a fosfato son -0-P (0) (ORk) -O- , -O-P(S) (ORk) -O-, -O-P(S) (SRk)-O-, -S-P (O) (ORk) -O-, -O-P(O) (ORk) -S-, -S- (0) (ORk) -S- , -O- (S) (ORk) -S- , -S-P (S) (ORk) -O-, -0-P(0) (Rk) -O-, -0-P (S) (Rk) -O- , -S-P (0) (Rk) -O- , -S-P(S) (Rk) -0-, -S-P(0) (Rk) -S-, -0-P(S)( Rk) -S- . Modalidades preferidas son -0-P (0) (OH) -0- , -0-P (S) (OH) -0- , -0-P (S) (SH) -0- , -S-P(O) (OH) -0-, -0-P(0) (OH)-S-, -S-P (O) (OH) -S- , -0-P(S)(0H)-S-, -S-P (S) (OH) -0- , -0-P(0) (H) -0-, -0-P (S) (H) -0- , -S-P(0)(H)-0-, -S-P(S) (H) -O-, -S-P(O) (H) -S-, -O-P(S) (H) -S- . Una modalidad preferida es -0-P (O) (OH) -O- . Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos para aquellos descritos anteriormente.
Grupos de enlace escindibles ácidos Los grupos de enlace escindibles ácidos son grupos de enlace que se escinden en condiciones ácidas. En modalidades preferidas los grupos de enlace escindibles ácidos son escindidos en un ambiente ácido con un pH de aproximadamente 6.5 o menos (por ejemplo, aproximadamente 6.0, 5.5, 5.0 o menos) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los organelos de pH bajo específicos, tales como endosomas y lisosomas, pueden proporcionar un ambiente de escisión para grupos de enlace escindibles ácidos. Ejemplos de grupos de enlace escindibles ácidos incluyen, a modo no taxativo, hidrazonas, esteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles ácidos pueden tener la fórmula general - C=NN-, C(0)0 o -0C(0). Una modalidad preferida es cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, grupo alquilo sustituido o grupo alquilo terciario, tal como dimetil pentilo o t-butilo. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos para aquellos descritos anteriormente .
Grupos de enlace en base a ésteres Los grupos de enlace en base a ésteres son escindidos por enzimas tales como esterasas y amidasas en células. Ejemplos de grupos de enlace en base a ésteres incluyen, a modo no taxativo, ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos escindibles de ésteres pueden tener la fórmula general -C(0)O- o -0C(0) - . Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos para aquellos descritos anteriormente.
Grupos de enlace en base a péptidos Los grupos de enlace en base a péptidos son escindidos por enzimas tales como peptidasas y proteasas en células. Los grupos de enlace escindibles en base a péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para proporcionar oligopéptidos (por ejemplo, dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos . Los grupos escindibles en base a péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-) . El grupo amida puede formarse entre cualquier alquileno, alquenileno o alquineleno Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida formado entre aminoácidos para proporcionar péptidos y proteínas. El grupo escindible en base a péptidos está generalmente limitado al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que proporcionan péptidos y proteínas y no incluye el grupo funcional de amida entero. Los grupos de enlace escindibles en base a péptidos tienen la fórmula general - NHCHRAC (0) NHCHRBC (0) - , donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos pueden evaluarse utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente. Tal como se utiliza en la presente, "carbohidrato" se refiere a un compuesto que es un carbohidrato de por sí compuesto por una o más unidades de monosacáridos que tienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre enlazado con cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte del mismo un resto carbohidrato compuesto por una o más unidades de monosacáridos , teniendo cada una al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre enlazado a cada átomo de carbono. Carbohidratos representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen aproximadamente 4-9 unidades de monosacáridos) y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas polisacáridas . Monosacáridos específicos incluyen azúcares de al menos C5 (preferiblemente C5-C8) ; di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacáridos (preferiblemente C5-C8) .
Modalidades alternativas En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido. Cada nucleótido en la hebra sentido y hebra antisentido ha sido modificado. Las modificaciones en hebra sentido y hebra antisentido comprenden cada una independientemente al menos dos modificaciones diferentes En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de AR dh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El patrón de modificación de la hebra antisentido es desplazado por uno o más nucleótidos con relación al patrón de modificación de la hebra sentido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, cuando al menos uno de los motivos se encuentra en el sitio de escisión en la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en el sitio de escisión por al menos un nucleótido. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión por al menos un nucleótido.
En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos . La hebra sentido contiene al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos se encuentra en el sitio de escisión en la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en el sitio de escisión por al menos un nucleótido. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra y al menos uno de los motivos se encuentra en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión por al menos un nucleótido. La modificación en el motivo que se encuentra en el sitio de escisión en la hebra sentido es diferente de la modificación en el motivo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido. En otro aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNdh capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo. El agente de ARNdh comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 12 a 30 nucleótidos. La hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, en donde al menos uno de los motivos se encuentra en el sitio de escisión en la hebra. La hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos.
La hebra sentido adicionalmente puede comprender uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde el o los motivos adicionales se encuentran en otra porción de la hebra que está separada de las tres modificaciones 2'-F en el sitio de escisión por al menos un nucleótido. La hebra antisentido adicionalmente puede comprender uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en donde el o los motivos adicionales se encuentran en otra porción de la hebra que está separada de las tres modificaciones 2'-0-metilo por al menos un nucleótido. Al menos uno de los nucleótidos que tiene una modificación 2'-F puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos que tiene una modificación 2'-0-metilo.
En una modalidad, el ARNdh de la invención se administra en amortiguador.
En una modalidad, los compuestos de ARNip descritos en la presente pueden formularse para la administración a un sujeto. Una composición de ARNip formulada puede suponer una variedad de estados. En algunos ejemplos, la composición es al menos parcialmente cristalina, uniformemente cristalina y/o anhidra (por ejemplo, menos de 80, 50, 30, 20 o 10% de agua) . En otro ejemplo, el ARNip se encuentra en una fase acuosa, por ejemplo, en una solución que incluye agua.
La fase acuosa o las composiciones cristalinas pueden, por ejemplo, incorporarse en un vehículo de administración, por ejemplo, un liposoma (particularmente para la fase acuosa) o una partícula (por ejemplo, una micropartícula que sea apropiada para una composición cristalina) . Generalmente, la composición de ARNip está formulada de un modo que es compatible con el método deseado de la administración, como se describe en la presente. Por ejemplo, en modalidades particulares, la composición se prepara por al menos uno de los siguientes métodos: secado por pulverización, deshidratación por aspersión, secado al vacío, evaporación, secado en lecho fluido o una combinación de estas técnicas; o sonicación con un lípido, liofilización, condensación y otro auto-ensamblado .
Una preparación de ARNip puede formularse en combinación con otro agente, por ejemplo, otro agente terapéutico o un agente que estabiliza un ARNip, por ejemplo, una proteína que se une con A Nip para formar un RNPi . Otros agentes incluyen quelantes, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para remover cationes divalentes tales como Mg2+) , sales, inhibidores de RNAsa (por ejemplo, un inhibidor de RNAsa de especificidad amplia tal como RNAsin) , etc.
En una modalidad, la preparación de ARNip incluye otro compuesto de ARNip, por ejemplo, un segundo ARNip que puede mediar la iARN con respecto a un segundo gen o con respecto al mismo gen. Otra preparación puede incluir al menos 3, 5, diez, veinte, cincuenta o cien o más especies de ARNip diferentes. Los ARNip pueden mediar la iARN con respecto a un número similar de genes diferentes.
En una modalidad, la preparación de ARNip incluye al menos un segundo agente terapéutico (por ejemplo, un agente que no sea un ARN o un ADN) . Por ejemplo, una composición de ARNip para el tratamiento de una enfermedad viral, por ejemplo, VIH, puede incluir un agente antiviral conocido (por ejemplo, un inhibidor de proteasa o inhibidor de transcriptasa inverso) . En otro ejemplo, una composición de ARNip para el tratamiento de un cáncer puede comprender, además, un agente quimioterapéutico .
A continuación se describen formulaciones ejemplares. Liposomas . Para facilitar la exposición, las formulaciones, composiciones y métodos en esta sección se describen en gran medida con respecto a compuestos de ARNip no modificados. Sin embargo, puede comprenderse que estas formulaciones, composiciones y métodos pueden ponerse en práctica con otros compuestos de ARNip, por ejemplo, ARNip modificados, y la puesta en práctica se encuentra dentro de la invención. Una preparación de un compuesto de ARNip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra o compuesto de ARNi de una sola hebra, (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un compuesto de ARNip más grande que puede procesarse en un compuesto de ARNi de una sola hebra, o un ADN que codifica un compuesto de ARNip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra, o compuesto de ARNi de una sola hebra o precursor del mismo) puede formularse para la administración en un ensamblado molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Tal como se utiliza en la presente, el término "liposoma" se refiere a una vesícula de lípidos anfifílieos dispuestos en al menos una bicapa, por ejemplo, una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilamerales o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición de ARNip. El material lipolífico aisla el interior acuoso de un exterior acuoso, que normalmente no incluye la composición de ARNip, a pesar de que en algunos ejemplos, puede hacerlo. Los liposomas son útiles para la transferencia y administración de ingredientes activos al sitio de acción.
Dado que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican los liposomas a un tejido, la bicapa liposomal se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que avanza la fusión del liposoma y la célula, el contenido acuoso interno que incluye el AR ip se administra a la célula donde el AR ip puede unirse específicamente con un ARN objetivo y puede mediar la iARN. En algunos casos, los liposomas también están específicamente dirigidos, por ejemplo, para dirigir el ARNip a tipos de células particulares.
Un liposoma contiene un ARNip que puede prepararse mediante una variedad de métodos. En un ejemplo, el componente lípido de un liposoma se disuelve en un detergente de forma que se formen micelas con el componente líquido. Por ejemplo, el componente lípido puede ser un lípido catiónico antipático o un conjugado lípido. El detergente puede tener una concentración de micelas crítica y puede ser no iónico. Detergentes ejemplares incluyen colato, octilglucósido, desoxicolato y lauroil sarcosina. La preparación de ARNip se agrega luego a las micelas que incluyen el componente lípido. Los grupos catiónicos en el lípido interactúan con el ARNip y se condensan alrededor del ARNip para formar un liposoma. Después de la condensación, se quita el detergente, por ejemplo, mediante diálisis, para proporcionar una preparación liposomal de ARNip.
En caso de que sea necesario, un compuesto portador que asiste en la condensación puede agregarse durante la reacción de condensación, por ejemplo, mediante adición controlada. Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero que no sea un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina) . El pH también puede ajustarse para favorecer la condensación.
Una descripción adicional de métodos para producir vehículos de administración de polinucleótidos estables, que incorpora un complejo de polinucleótido/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo de administración, se describen en, por ejemplo, WO 96/37194. La formación de liposomas también puede incluir uno o más aspectos de métodos ejemplares descritos en Felgner, P. L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci., Estados Unidos 8:7413-7417, 1987; Pat . de los Estados Unidos No. 4,897,355; Patente de los Estados Unidos No. 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol . 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys . Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; y Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Las técnicas comúnmente utilizadas para preparar aglomerados lípidos de tamaño apropiado para utilizar como vehículos de administración incluyen sonicación y congelado-descongelado más extrusión (ver, por ejemplo, Mayer, et al. Biochim. Biophys . Acta 858:161, 1986). Se puede utilizar microfluidización cuando se deseen aglomerados consistentemente pequeños (50 a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984) . Estos métodos se adaptan fácilmente al empaquetado de las preparaciones de agente de ARNip en liposomas.
Los liposomas que son sensibles al pH o de carga negativa atrapan a las moléculas de ácidos nucleicos en vez de formar complejos con éstos. Dado que tanto las moléculas de ácidos nucleicos como el lípido tienen carga similar, ocurre repulsión en vez de formación de complejos. Sin embargo, parte de las moléculas de ácidos nucleicos son atrapadas dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles a pH se han utilizado para administrar el ADN que codifica el gen de cinasa de timidina a monocapas celulares en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Reléase, 19, (1992) 269-274) .
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos que no sean fosfatidilcolina derivada de medios naturales. Las composiciones de los liposomas neutros, por ejemplo, pueden formarse de fosfatidilcolina de dimiristoilo (DMPC, por sus siglas en inglés) o fosfatidilcolina de dipalmitoilo (DPPC, por sus siglas en inglés) . Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman de fosfatidilglicerol de dimiristoilo, mientras que liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente de fosfatidiletanolamina de dioleoilo (DOPE, por sus siglas en inglés) . Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en células in vitro e incluyen la Pat . de los Estados Unidos No. 5,283,185; la Pat. de los Estados Unidos No. 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol . Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Nati. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; y Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
En una modalidad, se utilizan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficientemente con la membrana de plasma, son captados por los macrófagos in vivo y pueden utilizarse para administrar ARNdh a macrófagos .
Otras ventajas de liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables ; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger los ARNip encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en "Pharmaceutical Dosage Forms, " Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volumen 1, pág. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga de la superficie de lípidos, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Un lípido catiónico sintético de carga positiva, cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi) propil] -N, , -trimetilamonio (DOTMA) , puede utilizarse para formar pequeños liposomas que interactúan de manera espontánea con el ácido nucleico para formar complejos de lípidos-ácidos nucleicos que son capaces de fusionarse con los lípidos de carga negativa de las membranas celulares de células de cultivo tisular, resultando en la administración de ARNip (ver, por ejemplo, Felgner, P. L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci., Estados Unidos 8:7413-7417, 1987 y la Pat . de los Estados Unidos No. 4,897,355 para una descripción de DOTMA y su uso con ADN) .
Un análogo de DOTMA, 1 , 2 -bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , puede utilizarse en combinación con un fosfolípido para formar vesículas que forman complejos con ADN. Lipofectin™ de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md. es un agente efectivo para la administración de ácidos nucleicos a células de cultivo de tejido que comprenden liposomas de DOTMA con carga positiva que interactúan espontáneamente con polinucleótidos de caga negativa para formar complejos. Cuando se utilizan suficientes liposomas con carga positiva, la carga neta en los complejos resultantes es positiva. Los complejos de carga positiva preparados de este modo se unen de manera espontánea a las superficies celulares de carga negativa, se fusionan con la membrana de plasma y entregan los ácidos nucleicos funcionales a, por ejemplo, células de cultivo de tejido. Otro lípido catiónico disponible en el mercado, 1,2-bis (oleoiloxi) -3 , 3- (trimetilamonio) ropano ( "DOTAP" ) (Boehringer Mannheim, Indianápolis , Indiana) difiere de DOTMA en que los restos de oleilo están unidos por éster, en vez de por conexiones de éter.
Otros compuestos lipidíeos catiónicos reportados incluyen aquellos que se han conjugado con una variedad de restos que incluyen, por ejemplo, la carboxiespermina que se ha conjugado con uno de dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como 5-carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermil-amida ("DPPES") (ver, por ejemplo, la Pat . de los Estados Unidos No. 5,171,678).
Otro conjugado lípido catiónico incluye la derivatización del lípido con colesterol ("DC-Col") que se ha formulado en liposomas en combinación con DOPE (Ver Gao, X. y Huang, L . , Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Se ha informado que la lipopolilisina, realizada conjugando la polilisina con DOPE, es efectiva para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para ciertas líneas celulares, se dice que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos exhiben toxicidad y proporcionan una transfección más eficiente que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos lípidos catiónicos disponibles en el mercado incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland) . Otros lípidos catiónicos adecuados para la administración de oligonucleótidos se describen en el documento WO 98/39359 y WO 96/37194.
Las formulaciones liposomales son particularmente adecuadas para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Las ventajas incluyen menos efectos secundarios relacionados con la absorción sistémica alta del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad de administrar un agente de ARNip a la piel . En algunas implementaciones, los liposomas se utilizan para administrar el ARNip a células epidérmicas y también para mejorar la penetración del ARJMip a los tejidos dérmicos, por ejemplo, a la piel. Por ejemplo, los liposomas pueden aplicarse tópicamente. La administración tópica de los fármacos como liposomas a la piel se ha documentado (ver, por ejemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol . 2,405-410 y du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; annino, R. J. y Fould-Fogerite , S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz . 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. y Huang, L. , Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 84:7851-7855, 1987).
Los sistemas liposomales no iónicos también han sido examinados para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol . Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) y Novasome II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) se utilizaron para administrar un fármaco a la dermis de la piel de ratón. Las formulaciones con el agente de ARNip son útiles para tratar un trastorno dermatológico .
Los liposomas que incluyen un agente de ARNip pueden hacerse altamente deformables. La deformabilidad puede hacer que los liposomas penetren a través de los poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, las transferosomas son un tipo de liposomas deformables. Los transferosomas pueden hacerse agregando activadores de borde de superficie, normalmente tensioactivos , a una composición liposomal estándar. Los transferosomas que incluyen el ARNip pueden administrarse, por ejemplo, por vía subcutánea por infección con el fin de administrar un ARNip a queratinocitos en la piel. Para cruzar la piel de mamífero intacta, las vesículas lipídicas pasan a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Adicionalmente , debido a las propiedades lipídicas, estas transferosomas pueden autooptimizarse (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel), autorrepararse y pueden frecuentemente alcanzar sus objetivos sin fragmentarse, y a menudo pueden ser autocargables .
Otras formulaciones aplicables a la presente invención se describen en las solicitudes provisionales de los Estados Unidos Nos. de serie: 61/018,616, presentada el 2 de enero de 2008; 61/018,611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039,748, presentada el 26 de marzo de 2008; 61/047,087, presentada el 22 de abril de 2008 y 61/051,528, presentada el 8 de mayo de 2008. La solicitud PCT no. PCT/US2007/080331, presentada el 3 de octubre de 2007 también describe formulaciones que son aplicables a la presente invención.
Tensioactivos . Para facilitar la exposición, las formulaciones, composiciones y métodos en esta sección se describen en gran medida con respecto a compuestos de AR ip no modificados. Sin embargo, puede comprenderse que estas formulaciones, composiciones y métodos pueden ponerse en práctica con otros compuestos de ARNip, por ejemplo, compuestos de ARNip modificados, y la puesta en práctica se encuentra dentro de la invención. Los tensioactivos tienen un amplio campo de aplicabilidad en formulaciones tales como emulsiones (incluidas las microemulsiones) y liposomas (ver anteriormente) . Las composiciones de ARNip (o un precursor, por ejemplo un ARNidh que se puede procesar para obtener ARNip, o un ADN que codifica un precursor de ARNip) pueden incluir un tensioactivo . En una modalidad, el ARNip se formula como una emulsión que incluye un tensioactivo. La forma más común de clasificar y jerarquizar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, consiste en utilizar el balance de hidrófilos/lipófilos (BHL) . La naturaleza del grupo hidrófilo proporciona el medio más útil para categorizar los distintos tensioactivos utilizados en formulaciones (Rieger, en "Pharmaceutical Dosage Forms," Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 1988, pág. 285) .
Si la molécula tensioactiva no se ioniza, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos tienen un amplio campo de aplicabilidad en productos farmacéuticos y se pueden utilizar en un gran intervalo de valores de pH. En general, sus valores de BHL varían de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen esteres no iónicos tales como ásteres de etilenglicol , ésteres de propilenglicol , esteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitol, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Los alcanolamidas y éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados y polímeros de bloques etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los integrantes más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula tensioactiva contiene una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acil lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquil sulfatos y alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, acil isetionatos, acil tauratos y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos anióicos son los alquil sulfatos y los jabones.
Si la molécula tensioactiva contiene una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternarias y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternarias son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula tensioactiva tiene la capacidad para cargar ya sea una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfotero. Los tensioactivos anfoteros incluyen derivados de ácido acrilico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
El uso de tensioactivos en productos, formulaciones y emulsiones farmacéuticas ha sido reseñado (Rieger, en " Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, 1988, pág. 285) .
Micelas y otras formulaciones membranosas. Para facilitar la exposición, las micelas y otras formulaciones, composiciones y métodos en esta sección se describen en gran medida con respecto a compuestos de ARNip no modificados. Sin embargo, puede comprenderse que estas micelas y otras formulaciones, composiciones y métodos pueden ponerse en práctica con otros compuestos de ARNip, por ejemplo, compuestos de ARNip modificados, y la puesta en práctica se encuentra dentro de la invención. El compuesto de ARNip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra, o compuesto de ARNi de una sola hebra (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un compuesto de ARNip más grande que puede procesarse en un compuesto de ARNi de una sola hebra, o un ADN que codifica un compuesto de AR ip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra, o compuesto de ARNi de una sola hebra o precursor del mismo) ) composición puede proporcionarse como una formulación micelar. Las "micelas" se definen por la presente como un tipo particular de montaje molecular en el cual las moléculas antipáticas se disponen en una estructura esférica, de forma que todas las porciones hidrófobas de las moléculas quedan dispuestas hacia adentro, con las porciones hidrófilas en contacto con la fase acuosa que lo rodea. Se produce un montaje inverso si el entorno es hidrófobo .
Se puede preparar una formulación de micelas mixta adecuada para administrarse a través de membranas transdérmicas al mezclar una solución acuosa de la composición de ARNip, un alquil sulfato de metal alcalino de C8 a C22 y un compuesto formador de micelas. Entre los ejemplos de compuestos formadores de micelas se incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de manzanilla, extracto de pepino, acido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monoleína, monoleatos, monolauratos, aceite de borrajas, aceite de onagra, mentol, trihidroxi oxo colanil glicina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleina, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, éteres de polidocanol alquilo y análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato y sus mezclas. Los compuestos formadores de micelas se pueden agregar al mismo tiempo o después de agregar el alquilsulfato de metal alcalino. Las micelas mixtas se formarán básicamente con cualquier tipo de mezcla de ingredientes pero debe producirse un mezclado vigoroso para lograr micelas más pequeñas .
En un primer método se prepara una primera composición de micelas que contiene la composición de ARNip y al menos el alquilsulfato de metal alcalino. La primera composición de micelas se mezcla entonces con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición de micelas mixtas. En otro método, la composición de micelas se prepara al mezclar la composición de ARNip, el alquilsulfato de metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido de la incorporación del resto de los compuestos formadores de micelas, con un mezclado vigoroso.
Se puede agregar fenol y/o m-cresol a la composición de micelas mixta para estabilizar la formulación y protegerla contra el crecimiento de bacterias. Alternativamente, el fenol y/o el m-cresol se pueden agregar con los ingredientes formadores de micelas. Un agente isotónico tal como glicerina también se puede agregar luego de la formación de la composición de micelas mixta.
Para administrar la formulación de micelas como pulverización, la formulación se puede introducir en un dispensador de aerosol, y el dispensador se carga con propulsor. El propulsor, que está bajo presión, se encuentra en forma líquida en el dispensador. La relaciones entre los ingredientes se ajustan de forma que las fases acuosa y propulsora se conviertan en una, es decir, que haya una sola fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una porción del contenido, por ejemplo, a través de una válvula medida. La dosis dispensada de agente farmacéutico es propulsada desde la válvula medida en una pulverización fina.
Los propulsores pueden incluir clorofluorocarbonos que contengan hidrógeno, fluorocarbonos que contengan hidrógeno, éter dimetílico y éter dietílico. En ciertas modalidades se puede utilizar HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano) .
Las concentraciones específicas de los ingredientes esenciales se pueden determinar mediante experimentación relativamente sencilla. Para la absorción a través de las cavidades orales, suele ser deseable aumentar, por ejemplo, al menos duplicar o triplicar, la dosis que se utiliza para la inyección o administración a través del tracto intestinal.
Partículas . Para facilitar la exposición, las partículas, formulaciones, composiciones y métodos en esta sección se describen en gran medida con respecto a compuestos de AR ip modificados. Sin embargo, puede comprenderse que estas partículas, formulaciones, composiciones y métodos pueden ponerse en práctica con otros compuestos de ARNip, por ejemplo, compuestos de ARNip no modificados, y la puesta en práctica se encuentra dentro de la invención. En otra modalidad, las preparaciones de un compuesto de ARNip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra o compuesto de ARNi de una sola hebra, (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un compuesto de ARNip más grande que puede procesarse en un compuesto de ARNi de una sola hebra, o un ADN que codifica un compuesto de ARNip, por ejemplo, un compuesto de ARNip de doble hebra, o compuesto de ARNi de una sola hebra o precursor del mismo) pueden incorporarse en una partícula, por ejemplo, una micropartícula . Las micropartículas se pueden producir mediante secado por pulverizado, pero se pueden producir también por otros métodos que incluyen la liofilización, evaporación, secado por lecho fluidizado, secado al vacío o una combinación de las técnicas.
Composiciones farmacéuticas Los agentes de iARN de la invención pueden formularse para uso farmacéutico. Las composiciones farmacéuticamente aceptables comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los agentes de ARNdh en cualquiera de las modalidades precedentes, cuando se toman solas o se formulan junto con uno o más de portadores (aditivos) , excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse específicamente para administración en forma sólida o líquida, incluidas aquellas adaptadas para los siguiente casos: (1) administración oral, por ejemplo, líquidos para emparar (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas) , comprimidos, por ejemplo, aquellas dirigidas a absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o inyección epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril o formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o parche de liberación controlada o pulverización aplicada a la piel; (4) por vía intravaginal o intrarrectal , por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) por vía sublingual; (6) por vía ocular; (7) por vía transdérmica ; o (8) nasal. La administración mediante el uso de métodos subcutáneos o intravenosos puede ser particularmente ventajosa.
La frase "cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza en la presente, significa aquella cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la invención que es efectiva para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una sub-población de células en un animal con una relación razonable beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de una opinión médica sólida, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivos u otro problema o complicación, proporcionales con la relación beneficio/riesgo.
La frase "portador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en la presente, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, asistente de fabricación (por ejemplo, lubricante, magnesio de talco, calcio o estearato de cinc o ácido estérico) , o un material que encapsula un disolvente, que participa en el transporte del compuesto en cuestión de un órgano o porción del cuerpo a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido que es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tales como aceite de maní, aceite de colza, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol ; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y poletilenglicol ; (12) ásteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos ; (22) agentes espesantes, tales como polipéptidos y aminoácidos (23) componente de suero, tales como albúmina de suero, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en composiciones farmacéuticas.
Las formulaciones pueden presentarse, de manera conveniente, en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una única forma de dosificación generalmente será la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 10 por ciento a aproximadamente 30 por ciento .
En ciertas modalidades, una formulación de la presente invención comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en ciclodextrinas , celulosas, liposomas, agentes de formación de micelas, por ejemplo, ácidos biliares y portadores poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhidridos y un compuesto de la presente invención. En ciertas modalidades, una formulación mencionada anteriormente hace que un compuesto de la presente invención esté biodisponible oralmente.
La preparación de un agente de ARNi puede formularse en combinación con otro agente, por ejemplo, otro agente terapéutico o un agente que estabiliza un ARNi, por ejemplo, una proteína que forma un complejo con el ARNi para formar un RNPi . Otros agentes adicionales incluyen quelantes, por ejemplo, EDTA (por ejemplo, para quitar cationes divalentes tales como Mg2+) , sales, inhibidores de RNasa tales como RNAsin) , etc .
Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un compuesto de la presente invención con el portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes secundarios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme y profunda un compuesto de la presente invención con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, dar forma al producto.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse por medio del uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada parenteralmente se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.
Los compuestos de acuerdo con la invención pueden formularse para administración en cualquier forma conveniente para su uso en medicamentos para humanos o animales, por analogía con otros productos farmacéuticos.
El término "tratamiento" pretende abarcar también profilaxis, terapia y cura. El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesita, incluyendo primates, en particular humanos y otros mamíferos tales como equinos, vacas, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general .
Los agentes de iAR de doble hebra se producen en una célula in vivo, por ejemplo, de plantillas de ADN exógenas que se administran en la célula. Por ejemplo, las plantillas de ADN pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia genética. Los vectores de terapia genética pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (Patente de los Estados Unidos No. 5,328,470), o mediante inyección estereostática (ver, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia genética puede incluir el vector de terapia genética en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual el vehículo de administración genética está incluido. Las plantillas de ADN, por ejemplo, pueden incluir dos unidades de transcripción, una que produce un transcripto que incluye la hebra superior de un agente de ARNdh y una que produce un transcripto que incluye la hebra inferior de un agente de AR dh. Cuando las plantillas se transcriben, se produce el agente de ARNdh y se procesa en fragmentos de un agente de ARNip que media el silenciamiento de genes.
Vías de administración Una composición que incluye un ARNi puede administrarse a un sujeto mediante una variedad de vías. Los ejemplos de vías incluyen: intravenosa, subcutánea, tópica, rectal, anal, vaginal, nasal, pulmonar, ocular.
Las moléculas de ARNi de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Las composiciones típicamente incluyen una o más especies de ARNi y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares, que sean compatibles con la administración farmacéutica. El uso de los medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones de la invención. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en una cantidad de maneras dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y el área a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transdérmica) , oral o parenteral . La administración parenteral incluye goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, o administración intratecal o intraventricular .
La vía y el sitio de administración se pueden elegir para mejorar la determinación del objetivo. Por ejemplo, para dirigirse a células de músculo, la inyección intramuscular en los músculos de interés sería una elección lógica. Las células de pulmón podrían dirigirse mediante la administración de ARNi en forma de aerosol. Las células endoteliales vasculares podrían dirigirse mediante el recubrimiento de un catéter con globo con el ARNi e introduciendo mecánicamente el ADN.
Dosificación En un aspecto, la invención presenta un método para administrar un agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip, a un sujeto (por e emplo, un sujeto humano) . El método incluye administrar dosis unitaria del agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip, por ejemplo, un agente de ARNip de doble hebra que (a) la parte de doble hebra es de 14-30 nucleótidos (nt) de longitud, por ejemplo, 21-23 nt, (b) es complementaria a ARN objetivo (por ejemplo, un ARN objetivo endógeno o patógeno) , y, opcionalmente , (c) incluye al menos una saliente 3' de 1-5 nucleótidos de longitud. En una modalidad, la dosis unitaria es menor que 10 mg por kg de peso corporal, o menor que 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 o 0.00001 mg por kg de peso corporal, y menor que 200 nmol de agente de ARN (por ejemplo, aproximadamente 4.4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menor que 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 nmol de agente de ARN por kg de peso corporal .
La cantidad definida puede ser una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o afección, por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con el ARN objetivo. La dosis unitaria, por ejemplo, puede administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular) , una dosis inhalada o una aplicación tópica. En algunas modalidades las dosis pueden ser menores que 10, 5, 2 , 1 o 0.1 mg/kg de peso corporal .
En algunas modalidades, la dosis unitaria se administra menos f ecuentemente que una vez al día, por ejemplo, menos que cada 2, 4, 8 o 30 días. En otra modalidad, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no una frecuencia regular) . Por ejemplo, la dosis unitaria puede administrarse una sola vez.
En una modalidad, la dosis efectiva se administra con otras modalidades terapéuticas tradicionales. En una modalidad, el sujeto tiene una infección viral y la modalidad es un agente antiviral que no sea un agente de ARNdh, por ejemplo, que no sea un agente de ARNi . En otra modalidad, el sujeto tiene aterosclerosis y la dosis efectiva de un agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip, se administra en combinación con, por ejemplo, después de una intervención quirúrgica, por ejemplo, angioplastia .
En una modalidad, a un sujeto se le administra una dosis inicial y una o más dosis de mantenimiento de un agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un agente de ARNdh más grande que puede procesarse para formar un agente de ARNip, o un ADN que codifica un agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip, o un precursor del mismo) . Las dosis de mantenimiento pueden ser iguales o más bajas que la dosis inicial, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir tratar el sujeto con una o más dosis que están en el intervalo de 0.01 µg a 15 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 o 0.00001 mg por kg de peso corporal por día. Las dosis de mantenimiento son administradas, por ejemplo, no más de una vez cada 2, 5, 10 o 30 días. Además, el régimen de tratamiento puede durar por un período de tiempo que variará de acuerdo con la naturaleza de la enfermedad específica, su gravedad y la condición general del paciente. En algunas modalidades la dosis se puede administrar no más de una vez por día, por ejemplo, no más de una vez cada 24, 36, 48 o más horas, por ejemplo, no más de una vez cada 5 u 8 días . Luego del tratamiento puede monitorearse el paciente para verificar si hubo cambios en su condición y un alivio de los síntomas del estado de la enfermedad. La dosis de los compuestos puede aumentar en el caso de que el paciente no responda significativamente a esos niveles de dosis, o reducirse si se observa un alivio en los síntomas del estado de enfermedad, si el estado de enfermedad ha sido eliminado o si se observan efectos secundarios no deseados.
La dosis efectiva puede administrarse en una sola dosis o en dos o más dosis, como se desee o considere apropiado en circunstancias específicas. Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, se puede aconsejar la implantación de un dispositivo de administración, por ejemplo, una bomba, un stent semipermanente (por ejemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un depósito.
En una modalidad, la composición incluye una pluralidad de especies de agentes de ARNdh. En otra modalidad, las especies de agentes de ARNdh tienen secuencias que no se superponen y no son adyacentes a otras especies con respecto a una secuencia objetivo natural. En otra modalidad, la pluralidad de especies de agentes de ARNdh es específica para diferentes genes objetivos naturales. En otra modalidad, el agente de ARNdh es específico de alelos.
Los agentes de ARNdh de la invención descritos en la presente pueden administrarse a mamíferos, particularmente mamíferos grandes tales como primates no humanos o humanos de diversas maneras .
En una modalidad, la administración de la composición del agente de ARNdh, por ejemplo, un agente de ARNip, es parenteral, por ejemplo, intravenosa (por ejemplo, como un bolo o como una infusión difusible) , intradérmica, intraperitoneal , intramuscular, intratecal, intraventricular, intracraneal, subcutánea, transmucosa, bucal, sublingual, endoscópica, rectal, oral, vaginal, tópica, pulmonar, intranasal, uretral u ocular. La administración puede proporcionarse mediante el sujeto o mediante otra persona, por ejemplo, un proveedor de atención médica. La medicación puede proporcionarse en dosis medidas o en un dispensador que administra una dosis cuantificada . Los modos seleccionados de administración se describen en más detalle a continuación.
La invención proporciona métodos, composiciones y kits para la administración rectal o administración de agentes de ARNdh descritos en la presente.
Métodos para inhibir la expresión del gen objetivo Las modalidades de la invención también se refieren a métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo. El método comprende la etapa de administrar los agentes de ARNdh en cualquiera de las modalidades precedentes, en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del gen objetivo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para modular la expresión de un gen objetivo en una célula, que comprende proporcionar a la célula un agente de ARNdh de la presente invención. En una modalidad, el gen objetivo se selecciona del grupo que consiste en el Factor VII, Eg5 , PCSK9, TPX2 , apoB, SAA, TTR, RSV, gen beta PDGF, gen Erb-B, gen Src, gen CRK, gen GRB2 , gen RAS, gen MEKK, gen JNK, gen RAF, gen Erkl/2, gen PCNA(p21), gen MYB, gen JUN, gen FOS, gen BCL-2, hepciden, Proteína C activada, gen de Ciclina D, gen de VEGF, gen de EGFR, gen de Ciclina A, gen de Ciclina E, gen WNT-1, gen de beta-catenina, gen c-MET, gen PKC, gen NFKB, gen STAT3 , gen de survivina, gen Her2/Neu, gen de topoisomerasa I, gen de topoisomerasa II alfa, mutaciones en el gen p73, mutaciones en el gen p21 ( AF1/CIP1) , mutaciones en el gen p27(KIPl), mutaciones en el gen PPM1D, mutaciones en el gen RAS, mutaciones en el gen de caveolina I, mutaciones en el gen MIB I, mutaciones en el gen MTAI , mutaciones en el gen M68, mutaciones en los genes supresores de tumores y mutaciones en el gen supresor de tumores p53.
Se ilustra la invención además a través de los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como restrictivos. El contenido de todas las referencias, solicitudes de patentes pendientes y patentes publicadas, citadas en toda la solicitud se incorpora expresamente a la presente a modo de referencia.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Detección sistemática in vitro de dúplex de ARNip Cultivo celular y transfecciones : Se cultivaron células Hep3B humanas o células H.II.4.E de rata (ATCC, Manassas, VA) casi hasta la confluencia a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02 en RPMI (ATCC) complementado con 10% de FBS, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinizacion. La transfección se llevó a cabo agregando 14.8ml de Opti-ME más 0.2 mi de Lipofectamina RNAi ax por pocilio (Invitrogen, Carlsbad CA . cat . No. 13778-150) hasta 5ml de dúplex de ARNip por pocilio en una placa de 96 pocilios y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. 80 µ? de medios de cultivo completos sin antibióticos que contenían ~2 xlO4 células Hep3B se agregaron luego a la mezcla de ARNip. Las células se incubaron durante 24 o 120 horas antes de la purificación del ARN . Se realizaron experimentos de una sola dosis a lOnM y 0. In de concentración de dúplex final y se llevaron a cabo experimentos de respuesta a dosis usando diluciones en serie de 8, 4 veces con una dosis máxima de lOnM de concentración de dúplex final.
Aislamiento de ARN total usando el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, No. de art . : 610-12): Las células se cultivaron y se lisaron en 150 µ? de Lisis/Amortiguador de Unión y luego se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm usando un Thermomixer Eppendorf (la velocidad de mezclado fue la misma a lo largo de todo el proceso) . Diez microlitros de perlas magnéticas y 80 µ? de mezcla de Lisis/Amortiguador de Unión se agregaron a una placa de fondo redondo y se mezcló durante 1 minuto. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se retiró sin alterar las perlas. Después de quitar el sobrenadante, las células Usadas se agregaron a las perlas restantes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron 2 veces con 150 mi de Amortiguador de Lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas se capturaron nuevamente y se quitó el sobrenadante. Las perlas se lavaron luego con 150 µ? de Amortiguador de Lavado B, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Las perlas se lavaron luego con 150 µ? de Amortiguador de Elución, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Las perlas se dejaron secar durante 2 minutos. Después de secarse, se agregaron 50 µ? de Amortiguador de Elución y se mezcló durante 5 minutos a 70°C. Las perlas se capturaron sobre un imán durante 5 minutos. Se retiraron 40 µ? de sobrenadante y se agregaron a otra placa de 96 pocilios.
Síntesis de ADNc usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat No. 4368813) : Una mezcla principal de 1 µ? de Amortiguador 10X, 0.4µ1 de dNTP 25X, ?µ? de cebadores aleatorios, 0.5 µ? de Transcriptasa Inversa, 0.5 µ? de inhibidor de RNasa y 1.6µ1 de H20 por reacción se agregó a 5 µ? de ARN total. Se generó ADNc usando un Bio-Rad C-1000 o ciclador térmico S-1000 (Hercules, CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 seg, 4°C de espera.
PCR en tiempo real: Se agregaron 2µ1 de ADNc a una mezcla principal que contenía 0.5µ1 de Sonda GAPDH TaqMan (Applied Biosystems Cat No. 4326317E (humana)), Cat No. 4308313 (roedor)), 0.5µ1 de sonda de TTR TaqMan (Applied Biosystems cat No. HS00174914 _ml (humana) cat No. Rn00562124_ml (rata)) y 5µ1 de una mezcla principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat No. 04887301001) por pocilio en una placa de 384 pocilios (Roche cat No. 04887301001) . La PCR en tiempo real se realizó en una máquina de PCR en Tiempo Real Roche LC 480 (Roche) . Cada dúplex se evaluó en al menos dos transfecciones independientes y cada transfección se ensayó por duplicado, a menos que se indique lo contrario.
Para calcular el cambio múltiplo relativo, los datos en tiempo real se analizaron usando el método de AACt y se normalizaron a ensayos realizados con células transíectadas con ???? AD-1955 o células transfectadas simuladas. Las CI50 se calcularon usando un modelo de ajuste de 4 parámetros usando XLFit y normalizado a las células transfectadas con AD-1955 o células sin tratamiento previo en el mismo intervalo de dosis o a su propia dosis más baja. Las CI50 se calcularon para cada transfección individual, asi como en combinación, donde una sola CI50 se ajustó a los datos de ambas transfecciones .
Los resultados del silenciamiento de genes del dúplex de ARNip ejemplar con varias modificaciones de motivos de la invención se muestran en la tabla a continuación.
Ejemplo 2. Síntesis de ARN y apareamiento de dúplex 1. Síntesis de oligonucleotidos: Todos los oligonucleotidos se sintetizaron en un sintetizador AKTAoligopilot o un sintetizador ABI 394. Se utilizó para la síntesis de oligonucleotidos un soporte sólido de vidrio de poro controlado disponible en el mercado (dT-CPG, 500Á, Síntesis de Cebador) y fosforamiditas de ARN con grupos protectores estándar, 5 ' -O-dimetoxitritil N6-benzoil-2 ' - t-butildimetilsilil-adenosina-3 ' -O-N, N ' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, 51 -0-dimetoxitritil-N4-acetil-21- t-butildimetilsilil-citidina-3 ' -O-N, ' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, 5 ' -O-dimetoxitritil-N2—isobutril-2 ' -t-butildimetilsilil-guanosina-3 ' -O-N, N ' -diisopropil-2- cianoetilfosforamidita y 5 ' -0-dimetoxitritil-21 - 1-butildimetilsilil-uridina-3 ' -0-N, N ' -diisopropil-2-cianoet ilfosforamidita (Pierce Nucleic Acids Technologies), a menos que se especifique lo contrario. Las 2'-F fosforamiditas, 5 ' -0-dimetoxitritil-N4-acetil-2 ' -fluro-citidina-3' -O-N, N 1 -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita y 5 ' -0-dimetoxitritil-21 -fluro-uridina-3 ' -0-N, ' -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita se adquirieron en (Promega) . Todas las fosforoamiditas se utilizaron a una concentración de 0.2 en acetonitrilo (CH3CN) , excepto la guanosina que se utilizó a una concentración de 0.2M en 10% de THF/ANC (v/v) . Se utilizó un tiempo de acoplamiento/reciclaje de 16 minutos. El activador fue 5-etil tiotetrazol (0.75M, American International Chemicals) ; para la oxidación de PO se utilizó Yodo/Agua/Piridina y para la oxidación de PS se utilizó PADS en 2, 6-lutidina/ACN (1:1 v/v) .
Las hebras conjugadas con ligandos se sintetizaron usando un soporte sólido que contenia el ligando correspondiente. Por ejemplo, la introducción de un resto de carbohidrato/ligando (por ejemplo, GalNAc) en el extremo 3' de una secuencia se logró comenzando la síntesis con el soporte sólido de carbohidrato correspondiente. De manera similar, se introdujo un resto de colesterol en el extremo 3' comenzando la síntesis sobre el soporte de colesterol. En general, el resto de ligando se conectó a trans-A- hidroxiprolinol por medio de un enlace de elección, tal como se describe en los ejemplos precedentes para obtener un resto de hidroxiprolinol-ligando . El resto de hidroxiprolinol-ligando se acopló luego con un soporte sólido por medio de un enlazante de succinato o se convirtió en fosforamidita por medio de condiciones de fosfitilación estándar para obtener los bloques de construcción de conjugados de carbohidratos deseados. Los ARNip etiquetados con fluoróforos se sintetizaron a partir de la fosforamidita o soporte sólido correspondiente, que se adquirió en Biosearch Technologies. El soporte de polímero oleil litocólico (GalNAc)3 se realizó internamente a una carga de 38.6 µp???/gramo. El soporte de polímero de Mañosa (Man) 3 también se realizó internamente a una carga de 42.0 µ????/gramo.
La conjugación del ligando de elección en la posición deseada, por ejemplo, en el extremo 5' de la secuencia, se logró acoplando la fosforamidita correspondiente a la cadena creciente en condiciones de acoplamiento de fosforamidita estándar, a menos que se especifique lo contrario. Un acoplamiento de 15 min extendido de 0.1M de solución de fosforamidita en CH3CN anhidro en presencia del activador de 5- (etiltio) -lH-tetrazol a un oligonucleótido unido sólido. La oxidación de la fosfita internucleótidos al fosfato se realizó usando yodo-agua estándar, tal como se informó en (1) o mediante tratamiento con terc-butil hidroperóxido/acetonitrilo/agua (10:87:3) con un oligonucleótido conjugado a un tiempo de espera de oxidación de 10 min. El fosforotioato se introduce mediante oxidación de fosfito a fosforotioato usando un reactivo de la transferencia de azufre tal como DDTT (adquirido en AM Chemicals), PADS y/o reactivo de Beaucage . La fosforamidita de colesterol se sinterizó internamente y se utilizó a una concentración de 0.1 M en diclorometano . El tiempo de acoplamiento para la fosforamidita de colesterol fue 16 minutos. 2. Desprotección- I (Desprotección de nucleobases) Después de completarse la síntesis, el soporte se transfirió a una botella de vidrio de 100 mL (VWR) . El oligonucleótido se escindió del soporte con desprotección simultánea de los grupos base y de fosfato con 80 mL de una mezcla de amoníaco etanólico [amoníaco: etanol (3:1)] durante 6.5h a 55°C. La botella se enfrió brevemente sobre hielo y luego la mezcla de amoníaco etanólico se filtró en una nueva botella de 250 mi. EL CPG se lavó con porciones de 2 x 40 mL de etanol/agua (1:1 v/v) . El volumen de la mezcla se redujo luego a ~ 30 mL por evaporador rotativo. La mezcla se congeló luego sobre hielo seco y se secó al vacío sobre un SpeedVac. 3. Desprotección-II (Eliminación del grupo 2'-TBDMS) El residuo seco se resuspendió en 26 mL de trietilamina, trihidrofluoruro de trietilamina (TEA»3HF) o piridina-HF y DMSO (3:4:6) y se calentó a 60°C durante 90 minutos para quitar los grupos de terc-butildimetilsililo (TBDMS) en la posición 2'. Luego se aplacó la reacción con 50 mi de acetato de sodio 2mM y el pH se ajustó a 6.5, y se almacenó en congelador hasta su purificación.
. Análisis Los oligonucleotidos se analizaron por cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) antes de la purificación y la selección del amortiguador y la columna depende de la naturaleza de la secuencia y/o ligando conjugado. 5. Purificación por HPLC Los oligonucleotidos conjugados con ligandos se purificaron por HPLC preparativa de fase inversa. Los oligonucleotidos no conjugados se purificaron por HPLC de intercambio de aniones sobre una columna de gel de TSK cargada en el lugar. Los amortiguadores fueron fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en 10% de CH3CN (amortiguador A) y fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en 10% de CH3CN, NaBr 1M (amortiguador B) . Las fracciones que contenían los oligonucleotidos de longitud completa se agruparon, desalinizaron y liofilizaron . Aproximadamente 0.15 OD de oligonucleotidos desalinizados se diluyeron en agua hasta 150 µL y luego se colocaron en pipetas en viales especiales para CGE y análisis de LC/MS. Los compuestos se analizaron finalmente mediante LC-ESMS y CGE. 6. Preparación de ARNip Para la preparación de ARNip se calentaron cantidades equimolares de hebra sentido y antisentido en lxPBS a 95°C durante 5 min y se enfrió lentamente a temperatura ambiente. La integridad del dúplex se confirmó mediante análisis por HPLC.
Tabla 2. Dúplex modificado por ANGPTL3 Ejemplo 3: Actividad de silenciamiento in vitro con varias modificaciones químicas en ARNip de TTR La CI50 para cada ARNip modificado se determinó en células Hep3B mediante transfección inversa estándar usando Lipofectamina RNAiMAX. Brevemente, la transfección inversa se lleva a cabo agregando 5 \iL de Opti-MEM a 5 pL de dúplex de ARNip por pocilio en una placa de 96 pocilios con 10 ]xl¡ de Opti-MEM más 0.5 il¡ de Lipofectamina RNAiMax por pocilio (Invitrogen, Carlsbad CA. cat No. 13778-150) e incubando a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Luego de la incubación, se agregan 100 ]iL de medios de cultivo completos sin antibiótico que contienen 12,000-15,000 de células Hep3B a cada pocilio. Las células se incuban durante 24 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de C02 antes de lisis y análisis de ApoB y A Nm de GAPDH por ADNb (Quantigene) . Se evalúan siete concentraciones de ARNip diferentes en el intervalo de lOnM a 0.6pM para determinar la CI50 y ApoB/GAPDH para células transfectadas de ApoB se normaliza a las células transfectadas con lOnM de Luc ARNip.
Tabla 3. Dúplex modificado por A GPTL3 Ejemplo 4: Actividad de silenciamiento in vitro con varias modificaciones químicas en AR ip de A GPTL3 Cultivo celular y transfecciones Se cultivaron células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) casi hasta la confluencia a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02 en RPMI (ATCC) complementado con 10% de FBS, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de liberarse de la placa por tripsinización . La transfección se llevó a cabo agregando 14.8 µ? de Opti-MEM más 0.2 µ? de Lipofectamina R AiMax por pocilio (Invitrogen, Carlsbad CA. cat . No. 13778-150) a 5 µ? de dúplex de ARNip por pocilio en una placa de 96 pocilios y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. 80 µ? de medios de cultivo completos sin antibióticos que contenían ~2 xlO4 células Hep3B se agregaron luego a la mezcla de ARNip Las células se incubaron durante 24 o 120 horas antes de la purificación del ARN. Se realizaron experimentos de una sola dosis a lOnM y O.lnM de concentración de dúplex final y experimentos de respuesta a la dosis a 10, 1, 0.5, 0.1,0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 y 0.00001 nM de concentración de dúplex fina, a menos que se indique lo contrario.
Síntesis de ADNc usando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat No. 4368813) Se agregó una mezcla principal de 2µ1 de Amortiguador 10X, 0.8 µ? de 25X dNTPs, 2µ1 de Cebadores aleatorios, ?µ? de Transcriptasa Inversa, 1 µ? de inhibidor de RNasa y 3.2µ1 de H20 por reacción a ??µ? de ARN total. Se generó ADNc usando un Bio-Rad C-1000 o ciclador térmico S-1000 (Hercules, CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 seg, 4°C de espera.
PCR en tiempo real Se agregaron 2µ1 de ADNc a una mezcla principal que contenía 0.5µ1 de Sonda GAPDH TaqMan (Applied Biosystems Cat No. 4326317E) , 0.5µ1 de sonda de ANGPTL TaqMan (Applied Biosystems cat No. Hs00205581_ml) y 5µ1 de una mezcla principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat No. 04887301001) por pocilio en 50 placas de 384 pocilios (Roche cat No. 04887301001) . La PCR en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en Tiempo Real ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando el ensayo ÁACt (RQ) . Cada dúplex se evaluó en dos transfecciones independientes y cada transfección se ensayó por duplicado, a menos que se indique en las tablas de resumen.
Para calcular el cambio múltiplo relativo, los datos en tiempo real se analizaron usando el método de ñACt y se normalizaron a ensayos realizados con células transfectadas con ???? AD-1955 o células transfectadas simuladas. Las CI50 se calcularon usando un modelo de ajuste de 4 parámetros usando XLFit y normalizado a las células transfectadas con AD-1955 o células sin tratamiento previo en el mismo intervalo de dosis o a su propia dosis más baja. La secuencia de AD-1955, utilizada como testigo negativo, se dirige a la luciferasa y tiene la siguiente secuencia: sentido: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT; antisentido : UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT .
Las diversas modalidades descritas anteriormente pueden combinarse para proporcionar modalidades adicionales. Todas las patentes de los Estados Unidos, Publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones que no son patentes a las que se hace referencia en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Aspectos de las modalidades pueden modificarse de ser necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar más modalidades.
Estos y otros cambios pueden efectuarse en las modalidades a la luz de la descripción detallada anteriormente. En general, en las siguientes reivindicaciones, no debería interpretarse que los términos utilizados limitan las reivindicaciones a las modalidades específicas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, sino que deberían interpretarse de forma de incluir todas las posibles modalidades junto con el alcance total de equivalentes abarcados por las reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no están limitadas por la descripción.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (46)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un agente de iARN de doble hebra capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo caracterizado porque comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, en donde el dúplex está representado por la fórmula (III) : sentido: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb - (Z Z Z)j -Na -nq 3' antisentido: 3' np' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -Y ? 'Y ' -Nb' - (Z'Z'Z')i-Na'- nq' 5' (III) en donde: cada i, j, k y 1 es independientemente 0 o 1 ; cada p y q es independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma, cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos; cada rip, ??' , nq y nq' independientemente representa una secuencia de nucleótidos salientes que comprende 0-6 nucleótidos ; y cada XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representa independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; y en donde la modificación en Nb es diferente de la modificación en Y y la modificación en Nb' es diferente de la modificación en Y' .
2. El agente de iAR de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque i es 1; j es 1; o tanto i como j son 1.
3. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque k es 1; 1 es 1; o tanto k como 1 son 1.
4. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el motivo YYY se encuentra en o cerca del sitio de escisión de la hebra sentido .
5. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el motivo Y'Y'Y' se encuentra en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra antisentido desde el extremo 5' .
6. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el Y' es 2'-0Me.
7. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) está representada como la fórmula (Illa) : 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq 5' (Illa) en donde cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados .
8. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) está representada como la fórmula (Illb) : 5 ' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Na-nq 3 ' 3' np-Na-X 'X 'X ' -Nb-Y 'Y ? ' -Na-nq 5' (IHb) en donde cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados .
9. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fórmula (III) está representada como la fórmula (Ule) : 5' np-Na-X X X -N-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq 3' 3' np-Na-X'X'X'-Nt-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na-nq 5' (Ule) en donde cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados y cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-10 nucleótidos modificados .
10. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región de dúplex tiene 17-30 pares de nucleótidos de longitud.
11. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la región de dúplex tiene 17-19 pares de nucleótidos de longitud.
12. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la región de dúplex tiene 27-30 pares de nucleótidos de longitud.
13. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada hebra tiene 17-30 nucleótidos.
14. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-0-alquilo, 2'-0-alilo, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi y combinaciones de los mismos.
15. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque los nucleótidos se modifican con 2'-OCH3 o 2'-F.
16. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende al menos un ligando.
17. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazante ramificado bivalente o trivalente.
18. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en un nucleótido de 2'-0-metilo, nucleótido de 2 ' -desoxifluoro, nucleótido de 21 -O-N-metilacetamido (21 -O-NMA) , nucleótido de 2 ' -O-dimetilaminoetoxietilo (2 ' -0-DMAEOE) , nucleótido de 2'-O-aminopropilo (2 ' -O-AP) o nucleótido de 2 ' -ara-F y combinaciones de los mismos.
19. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando está unido al extremo 3' de la hebra sentido.
20. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende al menos una conexión internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato .
21. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nucleótido en la posición 1 del extremo 5' del dúplex en la hebra antisentido se selecciona del grupo que consiste en A, dA, dU, U y dT.
22. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el par de bases en la posición 1 del extremo 5' del dúplex es un par de bases AU
23. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos Y contienen una modificación 2'-fluoro.
24. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos Y' contienen una modificación 2'-0-metilo.
25. Un agente de iARN de doble hebra capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo, caracterizado porque comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, en donde la hebra sentido contiene al menos dos motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose uno de los motivos en el sitio de escisión en la hebra y encontrándose al menos uno de los motivos en otra porción de la hebra que está separada del motivo en el sitio de escisión por al menos un nucleótido; y en donde la hebra antisentido contiene al menos un primer motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión en la hebra y encontrándose un segundo motivo en otra porción de la hebra que está separada del primer motivo por al menos un nucleótido; en donde la modificación en el motivo que se encuentra en el sitio de escisión en la hebra sentido es diferente de la modificación en el motivo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido.
26. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque al menos uno de los nucleótidos que se encuentra en el sitio de escisión en la hebra sentido forma un par de bases con uno de los nucleótidos en el motivo que se encuentra en o cerca del sitio de escisión en la hebra antisentido.
27. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el dúplex tiene 17-30 nucleótidos.
28. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el dúplex tiene 17-19 nucleótidos.
29. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque cada hebra tiene 17-23 nucleótidos.
30. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las modificaciones en los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-0-alquilo, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi y combinaciones de los mismos.
31. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las modificaciones en el nucleótido son 2'-OCH3 o 2'-F.
32. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque adicionalmente comprende un ligando unido al extremo 3' de la hebra sentido.
33. Un agente de iARN de doble hebra capaz de inhibir la expresión de un gen objetivo, caracterizado porque comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, en donde la hebra sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión en la hebra; y en donde la hebra antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-0-metilo en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión.
34. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la hebra sentido comprende uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose los motivos en otra porción de la hebra que está separada de las tres modificaciones 2'-F en el sitio de escisión por al menos un nucleótido .
35. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la hebra antisentido comprende uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, encontrándose los motivos en otra porción de la hebra que está separada de las tres modificaciones 2'-0-metilo por al menos un nucleótido.
36. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque al menos uno de los nucleótidos que tiene una modificación 2'-F forma un par de bases con uno de los nucleótidos que tiene una modificación 2'-0-metilo.
37. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el dúplex tiene 17-30 pares de nucleótidos de longitud.
38. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el dúplex tiene 17-19 pares de nucleótidos de longitud.
39. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque cada hebra tiene 17-23 nucleótidos.
40. El agente de iARN de doble hebra de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque adicionalmente comprende un ligando unido al extremo 3' de la hebra sentido.
41. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el agente de iAR de doble hebra de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes solo o en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable .
42. Un método para inhibir la expresión de un gen objetivo, , caracterizado porque comprende el paso de administrar el agente de iARN de doble hebra de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del gen objetivo.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el agente de iARN de doble hebra se administra mediante administración subcutánea o intravenosa.
44. Un método para proporcionar un polinucleótido a un objetivo específico en un sujeto mediante la administración de el agente de ARNdh representado por la fórmula (III) : sentido: 5' np -Na -(X X X) i- b -Y Y Y -Nb - (Z Z Z)j -Na -nq 3 ' antisentido: 3' np' -Na' - (?' X 'X ' ) k-Nb' -Y ? 'Y ' -Nb' - (Z'Z'Z')i-Na'- nq' 5' (III) caracterizado porque: cada i, j, k y 1 es independientemente 0 o 1; cada p y q es independientemente 0-6; cada Na y Na' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de diferente forma, cada Nb y Nb' independientemente representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que son modificados o no modificados o combinaciones de los mismos; cada np, ??' , nq y nq' independientemente representa una secuencia de nucleótidos salientes que comprende 0-6 nucleótidos; y cada XXX, YYY, ZZZ, ?'?'?', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representa independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; y en donde la modificación en Nb es diferente de la modificación en Y y la modificación en Nb' es diferente de la modificación en Y' .
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el paso de administración se lleva a cabo mediante un medio de administración que comprende intramuscular, intrabronquial , intrapleural , intraperitoneal , intraarterial , linfática, intravenosa, subcutánea, cerebroespinal o combinaciones de las mismas.
46. Un método para suministrar un polinucleótido a un objetivo específico un sujeto, caracterizado porque comprende: suministrar el agente de ARNdh de acuerdo con la reivindicación 1 mediante administración subcutánea en el sujeto, de forma tal que el polinucleótido es suministrado en un objetivo específico del sujeto.
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