MX2014000830A - Una tira de almohadilla individual para un ensayo de flujo lateral mejorado y un dispositivo de analisis que usa la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una tira para un ensayo de flujo latera! mejorado de una muestra biológica en un ensayo de cromatografía de flujo lateral y en un solo plano usando un dispositivo de análisis que contiene la misma. La tira de la presente invención consiste en una almohadilla individual, que puede mejorar el ensayo de flujo lateral proporcionando un procedimiento fácil y sencillo y una lectura visual clara. La tira de la presente invención consiste en una zona de aplicación de la muestra (muestra) y una zona de reactivo-resultante donde se deposita la mezcla de reacción (reactivo) que están en el mismo plano. Además, la presente invención proporciona un procedimiento cromatográfico en el que se separa la hemoglobina del analito por una cromatografía diferencial sobre la fase sólida. Cualquier interferencia de detección del resultado por la hemoglobina queda eliminada por la presente invención. La presente invención proporciona ventajas que incluyen un procedimiento fácil y sencillo con una respuesta rápida y clara.

Description

UNA TIRA DE ALMOHADILLA INDIVIDUAL PARA UN ENSAYO DE FLUJO LATERAL MEJORADO Y UN DISPOSITIVO DE ANÁLISIS QUE USA LA MISMA.

REFERENCIA CRUZADA CON LA SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad respecto de la solicitud de patente provisional de EE. UU. N.° de serie 61/510.762 presentada el 22 de julio de 201 1 , cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los análisis realizados en el lugar de asistencia al paciente (LAP) se han convertido en herramientas de diagnóstico comunes y muy útiles no sólo en centros sanitarios, incluyendo hospitales y consultorios médicos, sino también en otros emplazamientos clínicos que incluyen centros de trabajo o emplazamientos sobre el terreno lejanos. Debido a la urgencia y el propósito de los análisis, es muy deseable un dispositivo de análisis y un procedimiento sencillos y eficaces para obtener resultados de manera eficiente en cuanto al coste y al tiempo. Más específicamente, es necesario que los análisis fuera de centros sanitarios tales como los análisis en un emplazamiento clínico sobre el terreno lejano para enfermedades epidémicas de crecimiento rápido, análisis para agentes de la guerra biológica en el campo de batalla, análisis medioambientales para detectar contaminantes o análisis en centros de trabajo para detectar consumo de drogas, se realicen de forma sencilla y fácil. En ocasiones, dado que es frecuente que estos análisis los realicen individuos con escasa o ninguna formación en diagnóstico clínico, es necesario que estos puntos de pruebas de atención médica sean sencillos, rápidos y fáciles de usar. Además, los dispositivos se necesitan en un entorno con poco control de las condiciones de almacenamiento, tales como la temperatura o la humedad. Por tanto, idealmente, el dispositivo para el punto de pruebas de atención médica requiere una cantidad mínima de equipamiento y sería deseable que el procedimiento de análisis incluido en el dispositivo sea estable en condiciones ambientales adversas, incluidas la temperatura o la humedad.

Con el aumento de la necesidad de puntos de atención médica para un número aumentado de propósitos y un entorno variante, sigue existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar un procedimiento y un dispositivo para realizar el análisis de una muestra biológica de manera eficiente en cuanto al coste y el tiempo.

BREVE DESCRICIÓN DE LA INVENCIÓN En un modo de realización, la presente invención proporciona una tira a base de una almohadilla individual para un ensayo de flujo lateral, en la que la zona de aplicación de la muestra (muestra) y la zona de reactivo-resultante donde se deposita la mezcla de reacción (reactivo) están en un mismo plano, una almohadilla individual.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona una tira para un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado que consiste en: una almohadilla individual; y un sustrato depositado en forma seca.

En otro modo de realización más, la presente invención proporciona un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado que comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira que consiste en: (i) una almohadilla individual; y (ii) un sustrato depositado en forma seca; (b) aplicar una muestra a la almohadilla individual en la que se deposita el sustrato; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para alcanzar el sustrato; (d) dejar que la muestra reaccione con el sustrato para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para detectar la presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) que comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira de almohadilla individual que comprende: (i) una almohadilla individual digestiva pretratada con un tampón de lisis; (ii) una mezcla de ensayo que comprende glucosa-6-fosfato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), agente de transferencia de hidruros o electrones y una mezcla de los mismos; y (iii) una sal de tetrazolio, (b) aplicar una muestra en la almohadilla individual digestiva; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para que entre en contacto con la mezcla de ensayo; (d) dejar que la muestra reaccione con la mezcla de ensayo para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.

En otro modo de realización, la presente invención se basa en un ensayo de formato seco en el que la muestra aplicada en la zona de aplicación de la muestra se desplaza hasta la zona de reacción por fuerzas de capilaridad al mismo tiempo que la zona de aplicación y la zona de reacción están en el mismo plano. El reactivo contiene una combinación de componentes que incluyen enzimas y una composición para desencadenar la reacción de color y se deposita como una forma seca. En la presente invención, la muestra se desplaza hasta la zona de reacción y se mezcla con el el reactivo. A medida que la muestra se mezcla con el reactivo, la composición resultante migrará lentamente y permanecerá en la zona de reactivo-resultante, mientras que los demás componentes de la muestra, tales como hemoglobina, se mueven más rápidamente que la composición resultante y siguen desplazándose para separarse del resultante deseado, tal como por fuerzas de capilaridad. Después de reaccionar con una muestra que contiene los analitos, la zona de reactivo-resultado presentará el resultado en un indicador, tal como un color. La retención del resultante y el movimiento por capilaridad continuo del otro componente de la muestra eliminarán todas las interferencias de los demás componentes, tales como la hemoglobina, y mejorarán la identificación del resultado. La muestra se desplaza por las fuerzas de capilaridad de un líquido contenido en la muestra, tal como sangre, o una solución tampón que se aplica adicionalmente con la muestra.

En un modo de realización, la presente invención proporciona una prueba de diagnóstico rápido (PDR) en formato de ensayo en seco sobre una tira de una almohadilla para análisis de diagnóstico inmediato. La cromatografía lateral sobre una almohadilla proporciona un análisis estable, un procedimiento sencillo y un resultado del análisis rápido.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento cromatográfico en el que se separa la hemoglobina del analito usando una cromatografía diferencial sobre la fase sólida. El color de la hemoglobina interfiere con frecuencia en la lectura visual de la reacción de color del analito en glóbulos rojos. La presente invención proporciona un procedimiento cromatográfico lateral en el que la migración diferencial de las muestras se produce debido a la diferencia de tamaños, la viscosidad, la precipitación del analito con el reactivo, la diferencia de cargas a través de la matriz porosa impregnada con reactivos que interaccionarán con el analito.

Una ventaja de la invención incluye la capacidad de un procedimiento fácil y sencillo y una lectura visual clara sin interferencias de la hemoglobina.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, los siguientes términos tienen los significados descritos a continuación.

"Material biológico", "muestra biológica" o "muestra" se refiere a fluidos o tejido extraído de vertebrados, tal como sangre completa, suero, plasma, saliva, orina y líquido cefalorraquídeo.

"Analito" se refiere a un componente determinado de un material biológico, una muestra biológica o una muestra que contiene una actividad específica para la que el propósito del ensayo es identificar uno de los resultados tales como presencia, ausencia o concentración.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado con que los entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para poner en práctica o probar la invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, primará la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 proporciona una estructura de la tira de una almohadilla de la presente invención, en comparación con una tira de dos almohadillas.

La FIG. 2 proporciona una comparación visual de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional para la prueba de deficiencia en G6PD. La intensidad de la identificación visual del color se mide por la puntuación proporcionada en la figura.

La FIG. 3 proporciona una comparación de intensidad de señal de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional usando un ensayo enzimático para la prueba de G6PD. La intensidad de la identificación visual del color se mide por la puntuación proporcionada en la figura.

La FIG. 4 proporciona una comparación visual de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional para la prueba de lactato deshidrogenasa.

La FIG. 5 proporciona una comparación de intensidad de señal de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional usando un ensayo enzimático para la prueba de lactato deshidrogenasa. La intensidad de la identificación visual del color se midió con un lector aQzen.

La FIG. 6 proporciona una comparación visual de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional para la prueba de alcohol.

La FIG. 7 proporciona una comparación de intensidad de señal de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional usando un ensayo enzimático para la prueba de alcohol deshidrogenasa. La intensidad de la identificación visual del color se midió con un lector aQzen.

La FIG. 8 proporciona una comparación de intensidad de señal de resultados de análisis entre la tira de una almohadilla de la presente invención comparada con la tira de dos almohadillas convencional usando un ensayo enzimático para la prueba de lactato deshidrogenasa. La intensidad de la identificación visual del color se mide por la puntuación proporcionada en la figura.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una tira para un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado que consiste en: una almohadilla individual; y un sustrato depositado en forma seca.

En un modo de realización, la almohadilla individual de la presente invención es una almohadilla digestiva pretratada con un tampón de lisis, tal como cloruro de magnesio.

En otro modo de realización, el analito se selecciona de entre proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos en fluidos humanos o animales.

En otro modo de realización, el sustrato se deposita en forma seca en una mezcla de ensayo que contiene un sustrato reactivo para el analito, tal como glucosa-6-fosfato para la glucosa deshidrogenasa (G6PD), que puede comprender además fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP), agente de transferencia de hidruros y una mezcla de los mismos.

En un modo de realización determinado, el analito se selecciona de entre glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), lactato deshidrogenasa o alcohol.

En un modo de realización preferente, el analito es glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD).

En otro modo de realización, el sustrato contiene un indicador tal como un compuesto de tinte. Se pueden emplear sin limitaciones muchos compuestos que se pueden modificar electrónica o estructuralmente por contacto con el sustrato o el analito y expresan el cambio en cualquier forma detectable visualmente o usando un procedimiento o instrumento de medida. Los ejemplos de tales compuestos incluyen, pero sin limitación, un tinte. Los compuestos que expresan colores diversos suelen cambiar de color por cualquier modificación química o del estado electrónico en la estructura. Los tintes de formazano son compuestos cromogenos producidos a partir de una reducción de sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas. Los tintes de formazano tienen una variedad de colores desde el azul oscuro hasta el rojo intenso o el naranja, en función de la sal de tetrazolio original usada como sustrato para la reacción. Una lista de sales de tetrazolio incluye, pero sin limitación, TTC (tetrazolio, cloruro de tetrazolio o cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio), INT (cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio), MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio), XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida), NBT (nitroazul de tetrazolio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) o DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol). Algunas sales de tetrazolio son más solubles en agua que otras. Después de la reducción por enzimas o condiciones químicas tales como por reacción con hidruro de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) o fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH) o cualquier agente de transferencia de hidruros, la sal de tetrazolio puede cambiar de color e incluso puede formar un precipitado insoluble. EL resultado se puede detectar por procedimientos tales como, pero sin limitación, por inspección visual, colorímetro, detector UV, espectrofotómetro, lector de análisis de imagen.etc.

En un modo de realización, la presente invención proporciona un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado que comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira que consiste en: (i) una almohadilla individual; y (ii) un sustrato depositado en forma seca; (b) aplicar una muestra a la almohadilla individual en la que se deposita el sustrato; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para alcanzar el sustrato; (d) dejar que la muestra reaccione con el sustrato para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.

En un modo de realización preferente, el analito es una enzima tal como G6PD.

En otro modo de realización preferente, la presente invención proporciona un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para detectar la presencia de G6PD que comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira de almohadilla individual que comprende: (i) una almohadilla individual digestiva single pretratada con un tampón de lisis; (ii) una mezcla de ensayo que comprende glucosa-6-fosfato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), agente de transferencia de hidruros y una mezcla de los mismos; y (iii) una sal de tetrazolio, (b) aplicar una muestra en la almohadilla individual digestiva; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para que entre en contacto con la mezcla de ensayo; (d) dejar que la muestra reaccione con la mezcla de ensayo para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.

La presente invención proporciona un ensayo de flujo lateral en el que la zona de aplicación de la muestra (muestra) y la zona de reactivo-resultante donde se deposita la mezcla de reacción (reactivo) están en un mismo lugar, una almohadilla individual.

Además, la presente invención se basa en un ensayo de formato seco en el que la muestra aplicada en la zona de aplicación de muestra se desplaza hasta la zona de reacción por fuerzas de capilaridad al mismo tiempo que la zona de aplicación y la zona de reacción están en el mismo plano. El reactivo contiene una combinación de componentes que incluyen enzimas y una composición para desencadenar la reacción de color y se deposita como una forma seca. En la presente invención, la muestra se desplaza hasta la zona de reacción y se mezcla con el el reactivo.

A medida que la muestra se mezcla con el reactivo, la composición resultante precipitará, se moverá lentamente y permanecerá en la zona de reactivo-resultante, mientras que los demás componentes del analito, tales como hemoglobina, siguen desplazándose para separarse del resultante deseado, tal como por fuerzas de capilaridad. Después de reaccionar con una muestra que contiene el analito, la zona de reacción-resultado presentará el resultado con un indicador, tal como un color, que se puede detectar visualmente. Al mismo tiempo, también es posible la lectura inversa: Después de reaccionar con una muestra que contiene analito, la zona de reacción-resultado con un indicador, tal como color, desaparecería. Si la muestra no contiene analito: el color permanece en la zona de resultado. La retención del resultante y el movimiento por capilaridad continuo del otro componente de la muestra eliminarán todas las interferencias del otro analito, tal como la hemoglobina, y mejorarán la identificación del resultado. La muestra se desplaza por las fuerzas de capilaridad de un líquido contenido en la muestra, tal como sangre, o una solución tampón que se puede aplicar adicionalmente con la muestra.

Tira de una almohadilla La presente invención proporciona un dispositivo de tira de una almohadilla, en el que la zona de aplicación de la muestra y la zona de reactivo-resultado están todas en una almohadilla. El ensayo realizado en una almohadilla individual proporcionará la migración uniforme de analitos y producirá resultados coherentes al eliminar la migración irregular de la muestra a través de varias capas. Por ejemplo, cuando se aplica una muestra de sangre a la tira de una almohadilla que está pretratada con tampón de lisis, se puede separar fácilmente la hemoglobina del resultante.

Además, se puede aumentar la sensibilidad en el dispositivo de tira de una almohadilla al aumentar la cantidad real de analito que reacciona con el reactivo en lugar de la cantidad de analito, ya que la muestra se desplazará a través de la misma superficie en lugar de pasar a través de diferentes medios o capas. Asimismo, al emplear el dispositivo de tira de una almohadilla, el coste de producción será más bajo y el procedimiento será más sencillo que el del ensayo multicapa convencional.

Por ejemplo, la prueba d eG6PD BinaxNOW® tiene una tira que consiste en dos almohadillas diferentes que son una almohadilla de muestra y una almohadilla de reacción. Las muestras con actividad G6PD normal producen un cambio de color evidente. El color rojo de la muestra cambia a color marrón/negro en la mitad superior de la almohadilla de reacción. El color del producto de reacción en la muestra de sangre no elimina el color de la hemoglobina; en consecuencia, el color marrón/negro no tiene una diferencia clara del color rojo de la sangre. A diferencia del sistema bi o multifase y el discontinuo usados en otros dispositivos, incluido el BinaxNOW®G6PD, la presente invención emplea una sola fase y cromatografía continua. La tira de análisis consiste en una almohadilla individual y la cromatografía continua proporciona una separación más fácil del resultante con un tinte, tal como un tinte de formazano, de la hemoglobina de la tira que una cromatografía de dos fases.

La presente invención consiste en tres áreas, la zona de aplicación de la muestra (muestra), la zona de reactivo y la resultante. La zona de reacción es el área en que se deposita la combinación de componente para desencadenar la reacción de color como forma seca, la zona resultante es un área de lectura visual y la zona de la muestra es un área en la que se aplica la muestra. Debido a que estas zonas están comprendidas en la misma matriz, el formato continuo de una almohadilla permite la migración uniforme del analito y produce resultados coherentes al eliminar la posibilidad de una migración irregular de la muestra a través de varias capas. Además, se puede aumentar la sensibilidad aumentando la cantidad real de analito que reacciona con el reactivo en lugar de la cantidad de analito que pasa a través de la multicapa. Asimismo, el formato de la presente invención reduce el coste del producto y hace el procedimiento del producto más fácil que el del ensayo multicapa convencional.

Ensayo cromatográfico de flujo lateral El analito reacciona con el reactivo usando diversas reacciones, tales como una reacción inmunológica entre una reacción anticuerpo-antígeno, una reacción enzima-sustrato, una conjugación proteína-sustrato o una formación de una complejo sustrato-sustrato.

Aunque los ensayos inmunológicos han utilizado con frecuencia un ensayo cromatográfico de flujo lateral, el ensayo cromatográfico de flujo lateral no se ha empleado comúnmente para ensayos enzimáticos. Un ensayo enzimático de flujo lateral identifica la presencia o ausencia de una enzima determinada y su concentración usando una reacción con un sustrato y detectando la reacción usando un indicador tal como un tinte, que puede expresar un color determinado después de reaccionar con un compuesto químico determinado, tal como un hidruro, producido por la reacción entre la enzima y el sustrato.

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) Un modo de realización específico de la presente invención proporciona un ensayo a base de enzimas, tal como la detección directa de la presencia de una enzima en la muestra, tal como G6PD en una muestra de sangre, utilizando la actividad del metabolito de la reacción entre la enzima y su sustrato que puede reducir un tinte para que exprese determinados indicadores tales como un color. Una molécula de tinte, tal como un compuesto de tetrazolio, se puede reducir para formar un formazano insoluble. El formazano insoluble presentará un color morado que se puede identificar fácilmente de forma visual sin equipamiento específico.

Una enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) humana realiza una función esencial en la bioquímica del ser humano. Forma parte de la ruta oxidativa de las pentosas, en la que funciona reduciendo al mínimo los ataques oxidativos de los radicales libres a las células al proporcionar equivalentes reductores. Por ejemplo, la G6PD convierte la glucosa-6-fosfato en 6-fosfogluconato, liberando de este modo un protón que reduce el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) a NADPH, una forma reducida del NADP. El NADPH inicia una serie de reacciones posteriores que en última instancia reducen los agentes oxidantes de radicales libres y convierten muchos de ellos en ineficaces en la bioquímica normal del ser humano.

La G6PD está presente en la mayoría de las células humanas, pero está en mayor concentración en glóbulos rojos que, en una de sus funciones principales, actúan como transportadores de oxígeno y, por lo tanto, son particularmente sensibles al ataque oxidativo. Esta enzima ayuda a proteger los glóbulos rojos del daño oxidativo y la destrucción prematura. La eficacia del sistema de la G6PD es notablemente alta, como refleja el hecho de que, durante la actividad normal, se utiliza menos del 1 % de su capacidad para combatir y evitar reacciones oxidativas no deseables. Sin embargo, cuando se deben introducir en el organismo humano agentes oxidantes fuertes, tales como miembros de la clase de las quininas de fármacos antipalúdicos, aumenta enormemente la necesidad de una producción rápida de agente reductor.

Se conocen varias mutaciones del gen que codifica la G6PD que reducen la eficacia de las enzimas en la bioquímica de individuos que procesan una mutación de este tipo en ambas mitades de su genoma, lo que provoca que la cantidad de la G6PD se mantenga al mismo nivel que en gente con un gen normal, pero también hace que la G6PD muestre una actividad específica enormemente reducida. En estos individuos, la administración de agentes oxidantes fuertes tales como miembros de la clase de fármacos antipalúdicos de tipo quinina pueden provocar complicaciones clínicas graves, tales como anemia hemolítica, porque la baja actividad específica de la G6DP no permite la producción de suficientes agentes reductores para evitar los efectos oxidativos no deseados rápidos en los glóbulos rojos. En áreas donde son comunes las infecciones palúdicas y en ocasiones incluso epidémicas, existe por tanto la necesidad de proporcionar una prueba eficaz y rápida que distinga fácilmente a las personas que tienen una G6PD de baja actividad específica de las personas cuya actividad de G6PD es normal y permitirá al personal médico garantizar que (1) solamente se recetan fármacos antipalúdicos de quinina a individuos con actividad específica de G6PD normal o superior y (2) que las personas con actividad específica de G6PD más baja que la actividad de G6PD normal se medican con un tipo alternativo de fármacos antipalúdicos.

Además, se conocen diversos tipos de fármacos que aumentan la anemia hemolítica y la lista incluye, pero sin limitación, antipalúdicos (primaquina, pamaquina, etc.), sulfonamidas (sulfanilamida, sulfacetamida, sulfapiridina, sulfametoxazol, etc.), sulfonas (dapsona, etc.), nitrofuranos (nitrofurantoína, etc.) y otros (ácido nalidíxico, naftaleno, ciprofloxacina, azul de metileno, azul de toluidina, etc.).

Para analizar la deficiencia en G6PD, se lisan los glóbulos rojos que contienen glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) sobre la tira de análisis cuando entran en contacto con la zona de aplicación de la muestra pretratada con reactivo de lisis de sangre. La G6PD de un glóbulo rojo lisado reacciona con sus sustratos en la tira seca pretratada y la reacción enzimática da lugar al inicio del proceso de formación del color en presencia de un tinte de tetrazolio y un agente de transferencia de hidruros. La G6PD catalizada puede oxidar can la glucosa-6-fosfato para liberar NADPH y el NADPH liberado reduce el tinte de tetrazolio para cambiar el color del tinte de tetrazolio a formazano, tal como morado o azul, etc., que se puede detectar visualmente en la misma almohadilla.

En un modo de realización específico, se construye la tira de análisis en una sola capa cuya zona de aplicación de la muestra y de reacción de formación de color están en la misma almohadilla. La parte superior de la tira de análisis comprende una almohadilla absorbente con material secante, si es necesario. La tira de análisis está pretratada con reactivo de lisis que incluye tensioactivos iónicos o no iónicos. Proporciona un procedimiento sencillo para realizar el análisis, ya que no requiere la etapa de lisis de la sangre antes de la aplicación de la muestra. La tira de análisis pretratada está impregnada con reactivos que comprenden: glucosa-6-fosfato que es un sustrato específico de la G6PD, coenzima NADP o NAD, tinte de tetrazolio y un agente de transferencia de hidruros y un estabilizando como un resto de azúcar o un polímero soluble en agua.

Prueba de diagnóstico rápido (PDR) y análisis dual En un modo de realización, la presente invención proporciona una prueba de diagnóstico rápido (PDR) en formato de ensayo en seco sobre una tira de una almohadilla para análisis de diagnóstico inmediato. La cromatografía lateral en formato seco proporciona un dispositivo de análisis estable, un procedimiento sencillo y un resultado del análisis rápido. La deficiencia en G6PD es una de las deficiencias enzimáticas humanas más comunes, afecta a 400 millones de personas y tiene una alta prevalencia en áreas de paludismo endémico. Parece que esta deficiencia proporciona cierta protección contra la infección por paludismo. Sin embargo, también puede provocar hemolisis tras la administración de determinados fármacos para el paludismo, incluida la PRI AQUINA. Por lo tanto, existe la necesidad urgente de proporcionar una prueba de diagnóstico rápido (PDR) adecuada para la detección sobre el terreno.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento de análisis en el que los resultados de análisis de la PDR de G6PD usando muestras clínicas se pueden correlacionar con los resultados de análisis cuantitativos. El análisis puede detectar aproximadamente <4 UI/gHb (normal 12 ± 2,09 U/gHb a 37 °C) como deficiente. El límite se puede modificar en función de la tolerancia de los glóbulos rojos frente a la PRIMAQUINA en el paciente deficiente en G6PD. Estudios de estabilidad acelerados indicaron que las tiras de análisis eran estables durante tres meses a 45 °C y 10 días a 60 °C. Esta PDR para G6PD se puede combinar con una PDR para el paludismo que puede detectar menos de 30 parásitos por µ? de sangre. Este kit de análisis dual puede diagnosticar la infección por paludismo y la deficiencia en G6PD al mismo tiempo usando una cantidad pequeña de sangre (habitualmente menos de 10 µ?). El análisis del ensayo es rápido (<10 minutos) con una cantidad pequeña de muestra (<10 µ? de sangre), sencillo de usar, eficaz en cuanto al coste, portátil y no presenta requisitos de almacenamiento especiales, lo que es un elemento esencial para su uso sobre el terreno.

Cromatografía de flujo lateral Muchos análisis de diagnóstico inmediato usados comúnmente utilizan un ensayo de flujo lateral a base de inmunocromatografía basada en membranas, que aprovecha la acción de capilaridad de las membranas microporosas. En los ensayos cromatográficos de flujo lateral, se separan los analitos de las soluciones de muestra de fase móvil de los demás componentes por unión por afinidad a moléculas de captura sobre fases sólidas estacionarias. Las membranas, fabricadas de nitrocelulosa o nailon, proporcionan una matriz para la fase sólida estacionaria de cromatografía de afinidad y la fase líquida de cromatografía de reparto que dirige las partículas de inmunocomplejo hacia la separación de otros solutos líquidos por acción capilar.

Las membranas microporosas, fabricadas de nailon o nitrocelulosa, se han usado para análisis de antígeno/anticuerpo aproximadamente desde 1979, cuando se demostró por primera vez que se podían transferir las proteínas a través de una membrana. La nitrocelulosa se ha utilizado ampliamente como superficie para inmovilizar proteínas en técnicas de investigación tales como la transferencia de bandas Western y el inmunodiagnóstico de flujo lateral. La microporosidad y la nitrocelulosa ofrecen muchos beneficios para los ensayos de inmunocromatografía rápidos, que incluyen, por ejemplo, una alta capacidad de unión, la unión no covalentes de proteínas y un entorno de inmovilización a largo plazo estable.

En general, en la cromatografía lateral, incluidos los ensayos controlados por enzimas tales como la prueba de la deficiencia en G6PD, se deposita previamente el sustrato seco cerca de y justo detrás de la unión del área de recepción de la muestra sobre la tira cromatográfica, es decir, una tira de una almohadilla como en la presente invención. No obstante, se puede situar en otro lugar de la trayectoria de flujo de la muestra para adaptarse a requisitos particulares de la muestra o de uno o más ingredientes del sustrato, siempre que se sitúe en la trayectoria de flujo sustancialmente antes del final o en la "almohadilla de absorción", donde se detiene el flujo de la muestra y el exceso de fluido presente se escurre hacia el interior de la almohadilla de absorción u otro dispositivo superficial que se proporcione.

Es importante que el sustrato desecado se deposite en un intervalo, preferentemente dentro de un área confinada, con el fin de facilitar que se incorpore por completo al flujo hacia de avance de la muestra. La colocación del sustrato desecado en la trayectoria de flujo también debería tener en cuenta que la reconstitución del sustrato en forma disuelta o dispersada dentro de la muestra líquida se completa, de forma deseable, en el momento en que la muestra alcanza el punto donde se detiene el flujo de la muestra.

Por comodidad en el transporte, el almacenamiento y el uso, cada tira cromatográfica de la presente invención se puede alojar, preferentemente, dentro de un dispositivo construido de modo que la tira está dispuesta lateralmente. Muchos dispositivos de este tipo son bien conocidos en la técnica y se puede utilizar de forma apropiada cualquiera de ellos construido de modo que la realización de un ensayo en la tira cromatográfica dispuesta en su interior se lleve a cabo por flujo lateral.

En un modo de realización específico, la tira de una almohadilla de la presente invención proporciona características que incluyen, sin limitación, las siguientes: 1. La tira de una almohadilla comprende una matriz porosa seleccionada de entre membrana de nitrocelulosa, fibra de vidrio, celulosa o poliéster, etc. 2. La tira comprende una tira de una almohadilla donde la zona de aplicación de la muestra y la zona de depósito de la mezcla de reactivo desecada de dicha tira están en la misma almohadilla, independientemente de si las dos áreas están superpuestas o no. 3. La tira de la presente invención tiene una sola vía de flujo de líquido hacia la mezcla de reacción que se produce después de recibir el fluido de muestra. 4. Opcionalmente, la tira de una almohadilla de la presente invención se puede recubrir previamente con reactivo de lisis que contiene tensioactivo iónico (aniónico, catiónico o iónico dipolar) o no iónico y cloruro de magnesio, lo que permite la lisis del fluido biológico por contacto con la zona de aplicación de la muestra directamente sin una lisis previa con tampón. 5. La tira de una almohadilla de la presente invención contiene un resto de azúcar seleccionado de entre un monosacárido, un disacárido, polisacáridos o un polímero soluble en agua como estabilizante para aumentar la estabilidad térmica. 6. Las tiras de una almohadilla de la presente invención se formulan de forma diferencial y se montan en un dispositivo de formato de análisis dual para distinguir la deficiencia en G6PD moderada (por ejemplo: detección del 10-60 % de la actividad normal) y grave (por ejemplo: detección de menos del 10 % de la actividad normal) a simple vista. El % de actividad para la detención no está limitado al 10-60 % o menos del 10 %. 7. Los componentes de la zona de reacción comprenden sustratos enzimáticos, reactivos que desarrollan color y estabilizante. El sistema de una almohadilla se puede emplear para un ensayo cuantitativo o semicuantitativo, ya que el cambio de color de la tira se puede leer con instrumentos tales como un espectrofotómetro óptico, un escáner, un lector o un densitómetro. El 8. sistema de una almohadilla también es aplicable a un sistema electroquímico. La transferencia de electrones desde el NADPH o el NADH producido por la G6PD hacia un electrodo a través de una oxidorreductasa o un mediador de transferencia de electrones se puede cuantificar con el uso de un electrodo en formato seco. 9. El sistema de una almohadilla se puede emplear para un inmunoensayo que inmoviliza moléculas de captura sobre la fase sólida.

Separación de la hemoglobina del analito por cromatografía diferencial Los parámetros clave que controlan la intensidad de la señal en los ensayos de cromatografía lateral son la velocidad del flujo por capilaridad y la capacidad de unión de proteínas de la membrana. La velocidad de flujo por capilaridad y la capacidad de unión vienen determinadas por el tamaño de poro, la porosidad y el grosor de la membrana. La capacidad de unión de proteínas de la membrana depende de su tamaño de poro y de las propiedades de superficie.

La presente invención proporciona una cromatografía en la que se separa la hemoglobina del analito usando una cromatografía diferencial sobre la fase sólida. El color de la hemoglobina interfiere con frecuencia en la lectura visual de la reacción de color del analito en glóbulos rojos. La presente invención proporciona un procedimiento cromatográfico lateral en el que la diferente migración de las muestra se produce debido a la diferencia de tamaños, la viscosidad, la precipitación del analito con el reactivo, la diferencia de cargas a través de la matriz porosa impregnada con reactivos que interaccionarán con el analito. Los glóbulos rojos se aplican sobre la zona de la muestra, que está pretratada con agente de lisis para la lisis de glóbulos rojos en la zona de reacción y se aplica tampón según sea necesario. Los glóbulos rojos lisados se mueven hacia la zona de reacción-resultado y se mezclan con el reactivo, la composición resultante permanecerá sobre la zona de reactivo-resultante, mientras que la hemoglobina continúa desplazándose para separarse del resultante deseado tal como por fuerzas de capilaridad. La separación de la hemoglobina hará la detección del resultado por un indicador tal como un color más clara y fácil de identificar.

EJEMPLO A continuación en la presente memoria se describe específicamente un ensayo específico de G6PD que puede usarse fácilmente y de forma satisfactoria por cualquier persona que trabaje sobre el terreno, en casa, en un consultorio médico o en cualquier emplazamiento donde no haya personal de laboratorio formado ni instrumentación y se proporcionan los resultados en las figuras 1-3 adjuntas.

Ejemplo 1. Preparación y realización de análisis de muestras para la tira de análisis de deficiencia en G6PD Se pretrató la almohadilla con tampón de lisis y se secó a temperatura ambiente. En la FIG. 1 se muestran las estructuras de tiras de una almohadilla y dos almohadillas. Se fijó la almohadilla pretratada sobre el soporte plástico y se superpuso un papel secante a la almohadilla en la parte superior del soporte plástico como una almohadilla absorbente. Se preparó la mezcla de ensayo que contenía glucosa-6-fosfato, NADP, tetrazolio y un agente de transferencia de hidruros o electrones y se impregnó sobre la almohadilla porosa. Se dejó secar la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo a temperatura ambiente durante la noche.

• Preparación de una almohadilla: La almohadilla impregnada con mezcla de ensayo sobre el soporte plástico.

• Preparación de dos almohadillas: Se fija la almohadilla para la aplicación de la muestra en la parte inferior de la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo superponiendo 1-2 mm sobre el soporte plástico.

Se aplicó muestra normal o deficiente sobre la tira. El resultado muestra que las muestras normales indudablemente producían un color morado más fuerte y más nítido en el sistema de tira de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas, como se muestra en la FIG. 2. La muestra deficiente no producía ningún color ni en una ni en dos almohadillas, ya que no hay G6PD disponible para producir NADPH. El resultado mostraba además que la migración de fluido es más uniforme y rápida en una almohadilla que en dos almohadillas y la finalización de la eliminación de la sangre es más rápida en un sistema de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas.

Ejemplo 2. Preparación y realización de análisis de muestras para la tira de análisis de lactato deshidrogenasa Se pretrató la almohadilla con tampón de lisis que contenía cloruro de magnesio y se secó durante la noche a temperatura ambiente. Se fijó la almohadilla pretratada sobre el soporte plástico y se superpuso un papel secante a la almohadilla en la parte superior del soporte plástico como una almohadilla absorbente. Se preparó la mezcla de ensayo que contenía lactato, NAD, tetrazolio y tampón Tris-HCI a pH 8,0 como agente de transferencia de hidruros y se impregnó sobre la almohadilla porosa. Se dejó secar la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo a temperatura ambiente durante la noche.

• Preparación de una almohadilla: La almohadilla impregnada con mezcla de ensayo sobre el soporte plástico.

• Preparación de dos almohadillas: Se fijan las almohadillas de muestra a la parte inferior de la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo superponiendo 1-2 mm sobre el soporte plástico.

Se aplicaron dos microlitros de muestra de sangre sobre la tira. El resultado muestra que la enzima LDH en sangre indudablemente producía un color morado más fuerte y más nítido en el sistema de tira de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas, como se muestra en la FIG. 4. El resultado mostraba además que la migración de fluido es más uniforme y rápida en una almohadilla que en dos almohadillas y la finalización de la eliminación de la sangre es más rápida en un sistema de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas. La intensidad del color morado se midió con un lector aQzen, como se muestran en la tabla 1. La intensidad del sistema de una almohadilla es mayor que la del de dos almohadillas, como se muestra en la fig. 5.

Tabla 1.

Ejemplo 3. Preparación y realización de análisis de muestras para la tira de análisis de alcohol Se pretrató la almohadilla con tampón que contenía detergente y se secó durante la noche a temperatura ambiente. Se fijó la almohadilla pretratada sobre el soporte plástico y se superpuso un papel secante a la almohadilla en la parte superior del soporte plástico como una almohadilla absorbente. Se preparó la mezcla de ensayo que contenía alcohol, NAD, tetrazolio y tampón Tris-HCI a pH 8,0 como agente de transferencia de hidruros y se impregnó sobre la almohadilla porosa. Se dejó secar la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo a temperatura ambiente durante la noche.

· Preparación de una almohadilla: La almohadilla impregnada con mezcla de ensayo sobre el soporte plástico.

• Preparación de dos almohadillas: Se fijan las almohadillas de muestra a la parte inferior de la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo superponiendo 1-2 mm sobre el soporte plástico.

Se aplicaron dos microlitros de muestra de sangre que contenía alcohol sobre la tira. El resultado muestra que la presencia de alcohol en sangre indudablemente producía un color morado más fuerte y más nítido en el sistema de tira de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas, como se muestra en la FIG. 6. La intensidad del color morado se midió con un lector aQzen, como se muestran en la tabla 2. La intensidad del sistema de una almohadilla es mayor que la del de dos almohadillas, como se muestra en la fig. 7.

Tabla 2 Ejemplo 4. Preparación y realización de análisis de muestras para la tira de análisis de lactato deshidrogenasa dependiente de la actividad de la lactato deshidrogenasa Se pretrató la almohadilla con tampón que contenía detergente y se secó durante la noche a temperatura ambiente. Se fijó la almohadilla pretratada sobre el soporte plástico y se superpuso un papel secante a la almohadilla en la parte superior del soporte plástico como una almohadilla absorbente. Se preparó la mezcla de ensayo que contenía lactato, NAD, tetrazolio y tampón Tris-HCI a pH 8,0 como agente de transferencia de hidruros y se impregnó sobre la almohadilla porosa. Se dejó secar la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo a temperatura ambiente durante la noche.

• Preparación de una almohadilla: La almohadilla impregnada con mezcla de ensayo sobre el soporte plástico.

• Preparación de dos almohadillas: Se fijan las almohadillas de muestra a la parte inferior de la almohadilla impregnada con mezcla de ensayo superponiendo 1-2 mm sobre el soporte plástico.

Se aplicaron dos microlitros de muestra que contenía lactato deshidrogenasa (desde 0,5 unidades hasta 6 unidades) sobre la tira El resultado muestra que la actividad de la enzima LDH producía un color morado más fuerte y más nítido en el sistema de tira de una almohadilla de la presente invención que en el de dos almohadillas, como se muestra en la FIG. 8.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una tira para un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado, caracterizada porque comprende: una almohadilla individual; y un sustrato depositado en forma seca.

2. La tira de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el analito es seleccionado del grupo que consiste en proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos de fluidos humanos o animales.

3. El ensayo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el analito es seleccionado del grupo que consiste en glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), lactato deshidrogenasa y alcohol.

4. La tira de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la almohadilla individual está pretratada con un tampón o un tampón de lisis.

5. La tira de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sustrato es una mezcla de ensayo que comprende glucosa-6-fosfato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), agente de transferencia de hidruros o electrones y una mezcla de los mismos.

6. La tira de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sustrato comprende un indicador.

7. La tira de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el indicador es un compuesto de tinte.

8. La tira de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el compuesto de tinte es seleccionado del grupo que consiste en TTC (tetrazolio, cloruro de tetrazolio o cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio), INT (cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio), MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio), XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida), NBT (nitroazul de tetrazolio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol).

9. La tira de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el compuesto de tinte es cloruro de tetrazolio o tetrazolio.

10. Un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para un analito preseleccionado, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira que consiste en: (i) una almohadilla individual; y (ii) un sustrato depositado en forma seca; (b) aplicar una muestra a la almohadilla individual en la que se deposita el sustrato; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para alcanzar el sustrato; (d) dejar que la muestra reaccione con el sustrato para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.

11. El ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el analito es seleccionado del grupo que consiste en proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos de fluidos humanos o animales.

12. El ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el analito es seleccionado del grupo que consiste en glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), lactato deshidrogenasa y alcohol.

13. El ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la almohadilla individual está pretratada con un tampón o un tampón de lisis.

14. El ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el sustrato es una mezcla de ensayo que comprende glucosa-6-fosfato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), agente de transferencia de hidruros o electrones y una mezcla de los mismos.

15. El ensayo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el sustrato comprende un indicador.

16. El ensayo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el indicador es un compuesto de tinte.

17. El ensayo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el compuesto de tinte es seleccionado del grupo que consiste en TTC (tetrazolio, cloruro de tetrazolio o cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio), INT (cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio), MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio), XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida), NBT (nitroazul de tetrazolio), MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol).

18. El ensayo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el compuesto de tinte es cloruro de tetrazolio o tetrazolio.

19. El ensayo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el tampón de lisis comprende cloruro de magnesio.

20. Un ensayo de flujo cromatográfico lateral controlado por enzimas para detectar la presencia de G6PD, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un dispositivo de análisis que comprende una tira de almohadilla individual que comprende: (i) una almohadilla individual digestiva pretratada con un tampón de lisis; (ii) una mezcla de ensayo que comprende glucosa-6-fosfato, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), agente de transferencia de hidruros y una mezcla de los mismos; y (iii) una sal de tetrazolio, (b) aplicar una muestra en la almohadilla individual digestiva; (c) dejar que la muestra fluya a través de la almohadilla digestiva para que entre en contacto con la mezcla de ensayo; (d) dejar que la muestra reaccione con la mezcla de ensayo para producir una respuesta; e (e) identificar e interpretar la respuesta para indicar la presencia o la concentración del analito en la muestra.