MX2013015174A - Metodos y composiciones para producir plantas esteriles masculinas. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para hacer una modificación dirigida en un gen de fertilidad masculino en el genoma de una planta. Los métodos involucran poner en contacto una célula de planta con un agente inductor de ruptura de doble hebra diseñado capaz de inducir una ruptura de doble hebra en una secuencia objetivo en el gen de fertilidad masculino e identificar una célula que comprende una alteración en la secuencia objetivo. También se describen plantas, células de plantas, partes de plantas y semillas que comprende un gen de fertilidad masculino con una alteración en un gen de fertilidad masculino. Además se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden genes de fertilidad masculinos con por lo menos una modificación dirigida en los mismos, moléculas de ácido nucleico optimizadas que codifican endonucleasas que son agentes inductores de ruptura de doble hebra diseñados y casetes de expresión, células hospederas y plantas que comprenden una o más de las moléculas de ácido nucleico.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA PRODUCIR PLANTAS ESTÉRILES MASCULINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la biología molecular de las plantas, particularmente, con métodos para producir mutaciones objetivo en genes de fertilidad masculina en plantas.

REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS PRESENTADA COMO UN ARCHIVO DE TEXTO POR MEDIO DE EFS-WEB La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente por medio de EFS-Web como un listado de secuencias en formato ASCII con un archivo denominado 418871SEQLIST.TXT, creado el 12 de junio de 2012 que tiene un tamaño de 322 kilobytes y se archiva junto con la especificación. El listado de secuencias contenido en este documento en formato ASCII es parte de la especificación y se incorpora en la presente descripción en su totalidad como referencia.

ANTECEDENTES El desarrollo de cultivos de plantas híbridas ha permitido realizar avances considerables en la calidad y cantidad de los cultivos producidos. El aumento de la producción y la combinación de características deseables, tales como resistencia a las enfermedades y a los insectos, tolerancia al calor y a la sequía, junto con variaciones en la composición de las plantas son posibles debido a los procedimientos de hibridación. Frecuentemente estos procedimientos dependen en gran medida de que se proporcione un genitor masculino que aporte polen a un genitor femenino para producir el híbrido resultante.

Los cultivos de campo se producen mediante técnicas que aprovechan la ventaja del método de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza cuando se transfiere el polen de una flor a la misma flor o a otra de la misma planta o a una planta genéticamente idéntica. Una planta produce una polinización cruzada cuando el polen proviene de una flor de una planta diferente.

En algunas especies, como Brassica campestris, la planta normalmente es autoestéril y solo puede ser polinizada por polinización cruzada. En especies autopolinizadas , como la soja y el algodón, las plantas machos y hembras están anatómicamente yuxtapuestas. Durante la polinización natural, los órganos reproductivos masculinos de una flor polinizan los órganos reproductivos femeninos de la misma flor.

Las plantas de maíz {Zea mays L.) pueden cultivarse por técnicas de autopolinización y polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas, localizadas en la espiga y flores femeninas, localizadas en la espiga, de la misma planta. Se puede autopolinizar o realizar una polinización cruzada. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento sopla el polen desde las espigas a los filamentos que sobresalen desde la parte alta de las espigas incipientes.

El desarrollo de híbridos de maíz requiere el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruzamiento de estas líneas y la evaluación de los cruces. El cultivo genealógico y la selección recurrente son dos de los métodos de cultivo que se usan para desarrollar las líneas endogámicas a partir de las poblaciones. Los programas de cultivo combinan rasgos convenientes de dos o más líneas endogámicas o varias fuentes amplias de las cuales se desarrollan nuevas líneas endogámicas por autofertilizacion y selección de los fenotipos deseados. Una variedad de maíz híbrido es el cruce de dos de tales líneas endogámicas, cada una de las cuales puede tener una o más características deseables de las que carece la otra o que complementan a la otra. Las nuevas líneas endogámicas se cruzan con otras líneas endogámicas y los híbridos de tales cruces se evalúan para determinar cuál tiene potencial comercial. La progenie híbrida de la primera generación se designa como Fi. En el desarrollo de híbridos solo se requieren plantas híbridas Fi. El híbrido Fi es más vigoroso que sus genitores endogámicos. Este vigor híbrido o heterosis puede manifestarse de muchas maneras, que incluyen un aumento en el crecimiento vegetativo y un aumento de la producción.

La semilla de maíz híbrido puede producirse por un sistema de esterilidad masculina que incorpora el desespigamiento manual. Para producir una semilla híbrida, la espiga se elimina del genitor endogámico femenino en crecimiento, que puede plantarse de acuerdo con varios patrones de hileras alternas con el genitor endogámico masculino. En consecuencia, siempre que haya suficiente aislamiento de las fuentes de polen de maíz extraño, las espigas de las líneas endogámicas femeninas solo serán fertilizadas con el polen de las líneas endogámicas masculinas. Por lo tanto, la semilla resultante es híbrida (Fi) y formará plantas híbridas.

La variación de campo que afecta el desarrollo de la planta puede dar como resultado el desespigamiento de plantas después de completar un desespigamiento manual del genitor femenino. O bien, es posible que la espiga de la planta endogámica femenina no se haya eliminado completamente durante el proceso de desespigamiento. En todo caso, el resultado es que la planta femenina desprenderá exitosamente el polen y algunas plantas femeninas se autopolinizarán . Esto hará que la semilla endogámica femenina se coseche junto con la semilla híbrida que se produce normalmente. La semilla endogámica femenina no exhibe heterosis y, por lo tanto, es tan productiva como una semilla Fi. Además, la presencia de la semilla endogámica femenina puede representar un riesgo de seguridad del germoplasma para la compañía que produce el híbrido.

Alternativamente, la planta endogámica femenina puede desespigarse mecánicamente con máquinas. El desespigamiento mecánico es aproximadamente tan confiable como el desespigamiento manual, pero más rápido y menos costoso. Sin embargo, la mayoría de las máquinas desespigadoras producen más daños a las plantas que el desespigamiento manual. Por lo tanto, ninguna forma de desespigamiento es totalmente satisfactoria actualmente, y permanece la necesidad de alternativas que reduzcan aún más los costos de producción y eliminen la autopolinización del genitor femenino en la producción de la semilla híbrida.

Las mutaciones que causan esterilidad masculina en las plantas tienen el potencial de ser útiles en métodos de producción de semillas híbridas para plantas de cultivo como el maíz y pueden reducir los costos de producción al eliminar la necesidad de retirar las flores masculinas mediante mano de obra intensiva (conocido, además, como desespigamiento) de las plantas genitoras maternas usadas para producir la semilla híbrida. Se han producido mutaciones que causan esterilidad masculina en el maíz mediante diferentes métodos como rayos X o radiaciones UV, tratamientos químicos o inserción de elementos transponibles {ms23, ms25, ms26, ms32) (Chaubal et al. (2000) Am J Bot 87:1193-1201). La regulación condicional de genes de fertilidad a través "interruptores moleculares" de fertilidad/esterilidad podría aumentar las opciones para el diseño de nuevos sistemas de esterilidad masculina para el mejoramiento de cultivos (Unger et al. (2002) Transgeníc Res 11:455-465) .

Además de la identificación de nuevos genes que afectan la fertilidad masculina, existe la necesidad de proporcionar un sistema confiable para producir esterilidad masculina genética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para producir una modificación objetivo en un gen de fertilidad masculina en el genoma de una planta. Los métodos comprenden contactar al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en un gen de fertilidad masculina con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que es capaz de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo. Los métodos involucran, además, la identificación de al menos una célula que comprende una alteración en su genoma en la secuencia objetivo. Si se desea, los métodos pueden comprender, además, la regeneración de una planta fértil que comprende la alteración. Las alteraciones incluyen, por ejemplo, el reemplazo de por lo menos un nucleótido en la secuencia objetivo, la deleción de por lo menos un nucleótido en la secuencia objetivo, una inserción de por lo menos un nucleótido en la secuencia objetivo o cualquier combinación de estos. Por ejemplo, la alteración puede ser la inserción de un transgen en la secuencia objetivo del gen de la fertilidad masculina o una mutación nula, en donde una planta progenie, que es homocigota para la mutación nula, es macho estéril. En una modalidad de la invención, la inserción de un transgen en la secuencia objetivo del gen de la fertilidad masculina es una mutación nula en el gen de la fertilidad masculina .

En una primera modalidad, los métodos para producir una modificación objetivo en un gen de la fertilidad masculina en el genoma de una planta, el gen de la fertilidad masculina se selecciona del grupo compuesto por MS26, MS45, BS92-7, 5126 y Mscal.

En una segunda modalidad, los métodos comprenden, además, la regeneración de la planta, particularmente una planta fértil, que comprende la alteración.

En una tercera modalidad, el agente inductor de ruptura de enlace doble es una endonucleasa, una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa efectora TAL, una transposasa, o una recombinasa especifica del sitio.

Preferentemente, la endonucleasa se modifica, específicamente, para cortar la secuencia objetivo y ya no corta su secuencia objetivo de endonucleasa silvestre.

En una cuarta modalidad, los métodos comprenden, además, la autofertilización de la planta fértil y la selección de la planta progenie que resulta de ella, en donde esa planta progenie es homocigota para la alteración.

En una quinta modalidad, los métodos comprenden, además, el cruce de la planta fértil con una segunda planta fértil que comprende una mutación nula en el gen de fertilidad masculina y la selección de una planta progenie que resulta de ella, en donde esa planta progenie es macho estéril .

En una sexta modalidad, la alteración comprende la inserción de un transgen que comprende un polinucleótido de interés. El transgen puede comprender, además, un promotor unido operativamente al polinucleótido de interés, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido de interés en una planta. Por ejemplo, el polinucleótido de interés puede codificar un marcado fenotípico o un ARN o una proteína para proporcionar una ventaja agronómica a la planta.

En una séptima modalidad, se selecciona la planta de un grupo que consiste en maíz, sorgo, arroz, trigo, centeno, cebada, mijo y avena.

En una octava modalidad, el gen de la fertilidad masculina es MS26. Por ejemplo, la secuencia objetivo para esta modalidad puede comprender la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident.: 1. Por ejemplo, el agente inductor de ruptura de cadena doble puede derivar de I-Creí .

En una novena modalidad, el paso de contactar al menos una célula vegetal que comprenda una secuencia objetivo en MS26 con el agente inductor de ruptura de cadena doble comprende la introducción en al menos una célula vegetal de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble. Puede seleccionarse la secuencia nucleótida, por ejemplo, de un grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núm. de ident.: 4, 5, 6, y 7; y una secuencia nucleótida que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms . de ident.: 4, 5, 6, y 7, en donde la secuencia nucleótida codifica un polipéptido que comprende la actividad de endonucleasa . Si se desea, el constructo del ácido nucleico puede comprender, además, un promotor operativamente unido a la secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia nucleótida en una célula vegetal. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor de ubiquitina de maíz. Adicionalmente, el constructo de ácido nucleico puede comprender, además una secuencia codificadora unida operativamente para una señal de localización nuclear. Tales señales de localización nuclear pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms . de ident.: 2, 3, y 21.

En una décima modalidad, el gen de la fertilidad masculina es MS45. Por ejemplo, la secuencia objetivo para esta modalidad puede comprender la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident.: 20. Por ejemplo, el agente inductor de ruptura de cadena doble puede derivarse de I-Creí.

En una décimo primera modalidad, el paso de contactar al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en MS45 con el agente inductor de ruptura de cadena doble comprende la introducción en al menos una célula vegetal de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble. Puede seleccionarse la secuencia nucleótida, por ejemplo, de un grupo que consiste en la secuencia nucleótida expuesta en la sec. con núm. de ident.: 22, 23, o 34; y una secuencia nucleótida que tiene una identidad de al menos 80 % de la secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms . de ident.: 22, 23, o 34, en donde la secuencia nucleótida codifica un polipéptido que comprende la actividad de endonucleasa . Si se desea, el constructo del ácido nucleico puede comprender, además, un promotor operativamente unido a la secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia nucleótida en una célula vegetal. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor de ubiquitina de maíz. Adicionalmente, el constructo de ácido nucleico puede comprender, además, una secuencia codificadora unida operativamente para una señal de localización nuclear. Tales señales de localización nuclear pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms. de ident.: 2, 3, y 21.

La presente invención proporciona, además, moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden al menos un gen de fertilidad masculina con una modificación o alteración especifica y plantas, partes de plantas, células vegetales y semillas que comprenden al menos un gen de fertilidad masculina con una modificación o alteración especifica. Las plantas de la invención incluyen, pero no se limitan a, una planta producida por cualquiera de los métodos que se describen en la presente descripción y un descendiente de cualquier planta producida por cualquiera de tales métodos, caracterizados porque el descendiente comprende la alteración.

En una modalidad, la planta comprende una modificación objetivo en un gen de fertilidad masculina en su genoma, en donde la modificación objetivo es la inserción de un transgen, y en donde el gen de fertilidad masculina se selecciona de un grupo que consiste en MS26, MS45, BS92-7, 5126 y Mscal. Por ejemplo, la inserción de un transgen puede causar una mutación nula en el gen de fertilidad masculino y una planta que es homocigota para la alteración es macho estéril .

En otra modalidad, se selecciona la planta de un grupo que consiste en maiz, sorgo, arroz, trigo, centeno, cebada, mijo y avena.

En una modalidad adicional, la planta es una planta de sorgo que comprende una modificación objetivo en el gen de la fertilidad masculina MS26, en donde el gen MS26 comprende una secuencia nucleótida seleccionada de un grupo que consiste en la sec. con núms . de ident.: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.

Adicionalmente, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican agentes inductores de ruptura de cadena doble que son capaces de inducir una ruptura de cadena doble en un ADN que comprende una secuencia objetivo de la invención. Se proporcionan, además, casetes de expresión que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un agente inductor de ruptura de cadena doble, y células huésped y plantas que comprenden al menos uno de los casetes de expresión.

En una modalidad de la invención, los casetes de expresión comprenden un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida seleccionada de un grupo que consiste en una sec. con núms . de ident.: 4, 5, 6, 7, 22, 23, y 34.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta que comprende un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica una endonucleasa . La endonucleasa tiene la capacidad de unirse, específicamente, a y crear una ruptura de cadena doble en una secuencia objetivo seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1 y 20, en donde el promotor tiene la capacidad de activar la expresión de una secuencia nucleótida unida operativamente en una célula vegetal. La secuencia nucleótida que codifica la endonucleasa puede comprender una secuencia de codificación de un dominio de unión al ADN de una endonucleasa, en donde la secuencia codificante se selecciona del grupo que consiste en: (a) los nucleótidos 100-261 y los nucleótidos 661- 822 de la sec. con núm. de ident. : 4; (b) los nucleótidos 70-231 y los nucleótidos 631- 792 de la sec. con núm. de ident.: 5; (c) los nucleótidos 70-231 y los nucleótidos 820- 981 de la sec. con núm. de ident. : 6, 7 o 34; y (d) una secuencia de codificación degenerada de (a), (b), o (c).

Preferentemente, la secuencia nucleótida que codifica la endonucleasa es una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident.: 4, 5, 6, 7, 22, 23, y 34.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Y LA LISTA DE SECUENCIAS La presente invención se puede entender mejor con la siguiente descripción detallada junto con las ilustraciones y la lista de secuencias que integran esta solicitud. Las descripciones de secuencias y lista de secuencias adjuntas a la presente descripción cumplen con las normas que regulan las descripciones de las secuencias nucleótidas y de aminoácidos en las solicitudes de patentes como se exponen en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825. Las descripciones de secuencias contienen los códigos de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825, incorporadas en la presente descripción como referencia .

Figuras Figura 1. Alteración de ADN inducida por ruptura de cadena doble de ADN de un sitio objetivo endógeno. (A) Un sitio objetivo endógeno generalizado con secuencias de ADN genómico flanqueadoras denominadas ADN 1 y ADN 2 que pueden usarse como regiones de intercambio de ADN por medio de recombinación homologa. (B) Un constructo de ADN generalizado que puede usarse para expresar una endonucleasa de ADN (gen de nucleasa) para reconocer y clivar el sitio objetivo endógeno. El gen de endonucleasa de ADN puede unirse físicamente al ADN donante descrito en (C) o (D) , o puede sustituirse por otros agentes inductores de ruptura de cadena doble. (C) Un constructo de ADN donante generalizado que tiene dos regiones, ADN 1 y ADN 2, de homología con el objetivo genómico, que flanquean un polinucleótido de interés y/o gen marcador. (D) Un constructo de ADN donante generalizado que no tiene regiones de homología con el objetivo genómico para flanquear un polinucleótido de interés y/o gen marcador. La inserción del fragmento de ADN produce una inserción del polinucleótido de interés en o cerca del sitio de reconocimiento. (E) Un resultado esperado cuando el polinucleótido de interés y/o gen marcador del constructo donante descrito en (C) o (D) se inserta en el sitio objetivo endógeno por recombinación homologa o recombinación no homologa, respectivamente. (F) Otro resultado cuando el sitio objetivo endógeno se altera por una deleción durante la reparación de la ruptura de cadena doble de ADN generada por la endonucleasa de ADN. El polinucleótido de interés y/o gen marcador del constructo donante descrito en (C) o (D) se puede insertar en sitios no relacionados por integración aleatoria de ADN. (G) Otro resultado cuando el sitio objetivo endógeno se altera por la inserción de un ADN no relacionado durante la reparación de las rupturas de cadena doble de ADN clivadas por la endonucleasa de ADN. El polinucleótido de interés y/o gen marcador del constructo donante descrito en (C) o (D) se puede insertar en sitios no relacionados por integración aleatoria de ADN.

Figura 2 Sitio objetivo de alelos mutados del maíz TS-MS26. Los alelos mutados que se encuentran en los transformantes del maiz de primera generación (plantas TO) se centran en el extremo 3' GTAC protuberante aparente producido por la endonucleasa MS26. Tipo silvestre (sec. con núm. de ident . : 35), 3281 (sec. con núm. de ident.: 36), 2963 (sec. con núm. de ident.: 37), 2980 (sec. con núm. de ident.: 38), 3861 (sec. con núm. de ident.: 39), 3956 (sec. con núm. de ident.: 40), 3990 (sec. con núm. de ident.: 41), 6227 (sec. con núm. de ident.: 42).

Figura 3 Homología de la secuencia a través del sitio objetivo TD-MS26 ( S26 TS, sec. con núm. de ident. :1) entre regiones genómicas de genes MS26 de maíz (maíz MS26, sec. con núm. de ident.: 13), arroz (arroz MS26, sec. con núm. de ident.: 14), sorgo (sorgo MS26, sec. con núm. de ident.: 15), y centeno (centeno MS26, sec. con núm. de ident . : 16) .

Figura 4 Vectores para la transformación biolística del arroz.

Figura 5 Mutaciones en el gen MS26 del arroz introducido por transformación biolística.

Figura 6 A) Fragmento de plásmido de PHP40827 que se usa para la transformación del arroz. Este plásmido contiene un represor de tetraciclina bajo el control del promotor de ubiquitina del maíz y un gen fluorescente azul (CFP) regulado por el promotor ZmEND2. Además, este fragmento de plásmido contiene una copia de un gen fluorescente rojo regulado por el promotor de la histona 2B del maiz. Una parte del gen fluorescente rojo en este constructo se duplicó en una orientación directa, que consiste en dos fragmentos del gen RFP con 369 bp de superposición. Los dos fragmentos están separados por un espaciador 136-bp que contiene el sitio objetivo TS-MS26 (Figura 6A) . B) El análisis PCR para las mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 de los eventos tratados TET (1, 2, 3) comparados con los productos PCR de estos mismos eventos no expuestos a tetraciclina (control) .

Figura 7 Mutaciones en el gen MS26 del arroz identificado en eventos del callo de PHP40827. Se resalta en gris el TS-MS26 tipo silvestre del arroz. MS26 del arroz tipo silvestre (sec. de ident . núm. : 49), ms26.1 (sec. con núm. de ident.: 50), ms26.2 (sec. con núm. de ident.: 51), ms26.3 (sec. con núm. de ident.: 52), ms26.4 (sec. con núm. de ident.: 53), ms26.5 (sec. con núm. de ident.: 54), ms26.6 (sec. con núm. de ident.: 55), ms26.7 (sec. con núm. de ident.: 56), ms26.8 (sec. con núm. de ident.: 57).

Figura 8 Plantas de maiz T0 en el momento de la floración. No hubo una diferencia evidente en el crecimiento y desarrollo de plantas T0 que contienen un alelo ms26 mutado (dos plantas exteriores) comparada con el evento bialélico TO (la planta marcada) producido por la endonucleasa S26++ (A) . El evento bialélico fue estéril (la espiga en la antesis de eventos monoalélicos) (B) .

Figura 9. Plantas de la progenie TI (A, B, C) del maíz en el momento de la floración. Se muestran plantas de la progenie TI heterocigotas para los alelos mutantes ms26-Td o ms26-Ci (dos plantas en el lado izquierdo) y dos homocigotas, plantas TI estériles, en el lado derecho (A). No hubo efectos de las mutaciones del gen ms26 sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de la progenie TI. Ambos alelos mutantes {ms26-Td y ms26-Ci) producidos en un fenotipo estéril solo cuando está en estado homocigota en las plantas de la progenie TI (B y C) .

Figura 10. Panículos y las anteras de plantas de arroz estériles masculinas {ms26/ms26) y fértiles femeninas (MS26/ms26) . (A) Panículo de arroz que muestra plantas homocigotas estériles masculinas ms26/ms26 a la izquierda y plantas heterocigotas fértiles masculinas Ms26/ms26 a la derecha. En el Panel A se muestran anteras de calabaza de panículos estériles masculinos ms26/ms26 (B) y fértiles femeninos Ms26/ms26 (C) .

Figura 11A-E. Alineación de fragmentos de la secuencia nucleótida de meganucleasas optimizados para la planta que comprenden los nucleótidos 170-231 y los nucleótidos 820-981 de la sec. con núm. de ident.:6, 7 o 34, los nucleótidos 70-231 y los nucleótidos 631-792 de la sec. con núm. de ident . : 5, y los nucleótidos 100-261 y los nucleótidos 661-822 de la sec. con núm. de ident.: 4.

Figura 12. Alineación de la secuencia de reconocimiento MS26 y secuencias de ADN de diferentes plantas de sorgo que contienen mutaciones y deleciones en el sitio objetivo TS-MS26. Los núm.:l y 62-78 corresponden a la sec. con núms . de ident. :1 y 62-78, respectivamente. La sec. con núm. de ident.: 62 representa la secuencia de nucleótido MS26 del sorgo tipo silvestre.

Figura 13. (A) Panículos de plantas de sorgo MS26/ms26.78A y (B) panículos de ms26.78A / ms26.78A.

Figura 14. Estigma, anteras y polen de plantas MS26/ms26.78? (Figura 14A) y de plantas ms26.78A /ms26.78A (Figura 14B) . El polen se detectó fácilmente en las anteras de MS26/ms26.78? (Figura 14C) ; sin embargo, no se observó polen en las anteras de las plantas ms26.78A /ms26.78A (Figura 14D) .

Secuencias Sec. con núm. de ident.: 1 es la secuencia nucleótida del sitio objetivo TS-MS26 reconocido por la endonucleasa MS26 que tiene la capacidad de inducir una ruptura de la cadena doble en la secuencia objetivo.

La sec. con núm. de ident.: 2 es una señal de localización nuclear SV40 NLS-1.

La sec. con núm. de ident. : 3 es una señal de localización nuclear SV40 NLS-2.

La sec. con núm. de ident.: 4 es la secuencia nucleótida optimizada de la planta (sin un intrón) que codifica la endonucleasa MS26.

La sec. con núm. de ident.: 5 es la secuencia nucleótida optimizada de la planta (sin un intrón) que codifica la endonucleasa S26+.

La sec. con núm. de ident.: 6 es la secuencia nucleótida optimizada de la planta que codifica la endonucleasa MS26++. Esta secuencia nucleótida tiene un contenido GC ajustado a menos que 60 % y contiene un intrón.

La sec. con núm. de ident.: 7 es la secuencia nucleótida optimizada de la planta que codifica la endonucleasa MS26+. Esta secuencia nucleótida tiene un contenido GC ajustado a menos que 60 y contiene un intrón.

La sec. con núm. de ident.: 8 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica un citocromo P450 (MS26) en el maíz (AF366297).

La sec. con núm. de ident.: 9 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica un citocromo P450 (MS26) en el arroz (LOC_Os03g07250 ) .

La sec. con núm. de ident.: 10 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica un citocromo P450 (MS26) en el sorgo.

La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica un citocromo P450 (MS26) en el centeno (Sécale cereale, FJ539083) .

La sec. con núm. de ident.: 12 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina (MS26) que codifica un citocromo P450 en el maiz (AAK52956.1 ) .

La sec. con núm. de ident.: 13 es la región genómica del maiz que comprende el sitio objetivo TS-MS26 del maiz que se muestra en la Figura 3.

La sec. con núm. de ident.: 14 es la región genómica del arroz que comprende el sitio objetivo TS-MS26 del arroz que se muestra en la Figura 3.

La sec. con núm. de ident.: 15 es la región genómica del sorgo que comprende el sitio objetivo TS-MS26 del sorgo que se muestra en la Figura 3.

La sec. con núm. de ident.: 16 es la región genómica del centeno que comprende el sitio objetivo TS-MS26 del centeno que se muestra en la Figura 3.

La sec. con núm. de ident.: 17 es el iniciador UNIMS26 5 '-2.

La sec. con núm. de ident.: 18 es el iniciador UNIMS26 3'-l.

La sec. con núm. de ident . : 19 es la región genómica del maiz que comprende la secuencia objetivo TS-MS26 del maiz.

La sec. con núm. de ident.: 20 es la secuencia objetivo TS-MS45 del maiz.

La sec. con núm. de ident.: 21 es la secuencia de aminoácidos de localización nuclear que se usa en fusiones MAYl/MAY.

La sec. con núm. de ident.: 22 es la secuencia nucleótida optimizados para la planta que codifica MAYl.

La sec. con núm. de ident.: 23 es la secuencia nucleótida optimizados para la planta que codifica MAY2.

La sec. con núm. de ident.: 24 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una chalcona y estilbeno sintetasa (5126) en el maiz (AX060770) .

La sec. con núm. de ident.: 25 es la secuencia de ácidos nucleótidos de un gen de fertilidad masculina que codifica una chalcona y estilbeno sintetasa (5126) en el arroz (LOC_Os07g22850) .

La sec. con núm. de ident.: 26 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una dihidrofavonol 4-reductasa (BS7) en el maiz (AF366295) .

La sec. con núm. de ident. : 27 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una dihidrofavonol 4-reductasa (BS7) en el arroz (LOC_Os08g40440) .

La sec. con núm. de ident.: 28 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una estrictosidina sintasa (MS45) en el maíz (AF360356) .

La sec. con núm. de ident.: 29 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una estrictosidina sintasa (MS45) en el arroz (LOC_Os03gl5710) .

La sec. con núm. de ident.: 30 es el plásmido PHP31457.

La sec. con núm. de ident.: 31 es el plásmido PHP31459.

La sec. con núm. de ident.: 32 es la secuencia nucleótida de un gen de fertilidad masculina que codifica una proteína MS22 en el maíz.

La sec. con núm. de ident.: 33 es una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de localización nuclear en fusiones MAY1/MAY.

La sec. con núm. de ident.: 34 es un gen optimizado de la planta que codifica una proteína MAYl-conector-MAY2.

La sec. con núm. de ident.: 35 es un fragmento de ADN TS-MS26 de tipo silvestre que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 36 es el fragmento de ADN 3281 TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 37 es el fragmento de ADN 2963 TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 38 es el fragmento de ADN 2980 TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident. : 39 es el fragmento de ADN 3861TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 40 es el fragmento de ADN 3956TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 41 es el fragmento de ADN 3990TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 42 es el fragmento de ADN 6227 TS-MS26 que se muestra en la Figura 2.

La sec. con núm. de ident.: 43 es el es el fragmento de ADN TS-MS26 tipo silvestre que se muestra en la Figura 5.

La sec. con núm. de ident.: 44 es el fragmento de ADN Ev48 TS-MS26 que se muestra en la Figura 5.

La sec. con núm. de ident.: 45 es el fragmento de ADN Ev62.1 TS-MS26 que se muestra en la Figura 5.

La sec. con núm. de ident.: 46 es el fragmento de ADN Ev62.13 TS-MS26 que se muestra en la Figura 5.

La sec. con núm. de ident.: 47 es el fragmento de ADN Ev62.14 TS-MS26 que se muestra en la Figura 5.

La sec. con núm. de ident.: 48 es el fragmento de ADN Ev67 TS-MS26 DNA que se muestra en la Figura. 5.

La sec. con núm. de ident.: 49 es el fragmento de ADN TS-MS26 tipo silvestre que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 50 es el fragmento de ADN ms26.1 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 51 es el fragmento de ADN ms26.2 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 52 es el fragmento de ADN ms26.3 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 53 es el fragmento de ADN ms26.4 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 54 es el fragmento de ADN ms26.5 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 55 es el fragmento de ADN ms26.6 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 56 es el fragmento de ADNms26.7 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident.: 57 es el fragmento de ADN ms26.8 TS-MS26 que se muestra en la Figura 7.

La sec. con núm. de ident. : 58 es la secuencia nucleótida del plásmido PHP40082.

La sec. con núm. de ident.: 59 es la secuencia nucleótida del plásmido PHP40126.

La sec. con núm. de ident.: 60 es la secuencia nucleótida del plásmido PHP40827.

La sec. con núm. de ident.: 61 es la secuencia nucleótida del plásmido PHP42063.

La sec. con núm. de ident.: 62-78 son los fragmentos de ADN que se muestran en la Figura 12. La sec. con núm. de ident.: 62 es la secuencia nucleótida de una parte del gen MS26 del sorgo de tipo silvestre, sec. con núms . de ident.: 63-78 modificaciones expuestas a la secuencia nucleótida del gen MS26 del sorgo de tipo silvestre expuestas en la sec. con núm. de ident.: 62.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos con experiencia en la técnica a quienes se dirige la presente invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente descripción como referencia con el mismo alcance como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara especifica e individualmente para incorporarla como referencia .

Aunque la presente invención se ha descrito detalladamente a modo de ilustración y ejemplo para los fines de claridad de comprensión, resultará obvio que es posible practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas; la referencia a "una célula" incluye una o más células y equivalentes de estas conocidos para aquellos con experiencia en la técnica, etcétera.

Un sistema confiable de producir esterilidad masculina genética proporcionaría ventajas para desarrollar plantas híbridas. El proceso de desespigamiento laborioso puede evitarse en algunos genotipos con el uso de cepas endogámicas macho estériles citoplasmáticas (CMS) . En ausencia del gen restaurador de la fertilidad, las plantas de cepas endogámicas CMS son macho estériles como resultado de factores que resultan del citoplasmático, en oposición al genoma nuclear. Por lo tanto, esta característica se hereda exclusivamente por el genitor femenino en plantas de maíz, debido a que solo la hembra proporciona el citoplasma a la semilla fertilizada. Las plantas CMS se fertilizan con polen de otra planta endogámica que no es macho estéril. El polen de la segunda planta endogámica puede o no contribuir con genes que hagan fértiles masculinas a las plantas híbridas. Generalmente las semillas del maíz normal desespigado y las semillas producidas de CMS del mismo híbrido deben mezclarse para asegurarse de disponer de las cargas de polen adecuadas para la fertilización cuando crecen las plantas híbridas y para asegurar la diversidad citoplasmática .

La esterilidad nuclear (génica) puede ser dominante o recesiva. La esterilidad dominante solo puede usarse para la formación de semillas híbridas si es posible la propagación de la línea femenina (por ejemplo, por medio de propagación clonal in vitro) . La esterilidad recesiva puede usarse si las plantas estériles y fértiles se distinguen fácilmente. Sin embargo, la utilidad comercial de los sistemas de esterilidad génica está limitada por el costo de la propagación clonal y depuración de hileras femeninas de plantas autofértiles .

Se describe un tipo de esterilidad genética en las patentes de EE. UU. 4,654,465 y 4,727,219 a Brar, et al. Sin embargo, esta forma de esterilidad masculina genética requiere del mantenimiento de múltiples genes mutantes en ubicaciones separadas del genoma y requiere un sistema de marcadores complejo para rastrear los genes y usar el sistema convenientemente. Patterson describió, además, un sistema génico de translocaciones cromosómicas que pueden ser efectivas, pero que son complicadas. (Ver patentes de EE. UU. núms. 3,861,709 y 3,710,511).

Se han hecho muchos otros intentos de mejorar estos sistemas. Por ejemplo, Fabijanski, et al., desarrollaron varios métodos para causar esterilidad masculina en las plantas (ver la publicación EPO 89/3010153.8 núm. 329,308 y la solicitud del PCT, PCT/CA90/00037 publicada como patente núm. WO 90/08828). Un método incluye la introducción en la planta de un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor especifico del tejido masculino. Otro comprende un sistema codificante en el cual se identifica un gen critico para la fertilidad y un codificante del gen insertado en la planta. Fabijanski, et al. muestran, además, varios sistemas codificantes citotóxicos. Ver la patente núm. EP0329308. Otros sistemas usan genes "represores" que inhiben la expresión de otro gen critico para la esterilidad masculina. Ver PCT/GB90/00102 , publicado como patente núm. O 90/08829. Para ver otro ejemplo consulte la patente de EE. UU. núm. 6,281,348.

Otro mejoramiento de este sistema se describe en la patente de los EE. UU. núm. 5,478,369 en la cual un método para transmitir esterilidad masculina controlable se logra al inactivar o silenciar un gen nativo de la planta que es critico para la fertilidad masculina y al transformar esa planta con el gen critico para la fertilidad masculina unido a un promotor inducible que controla la expresión del gen. Es decir, se previene la expresión de la secuencia endógena por cualquiera de los métodos conocidos para la persona experimentada en la técnica para prevenir la expresión de una secuencia (tal como los métodos no codificantes, la cosupresión, la mutación, el uso de ribozimas u horquillas, varios sistemas de represión, etc., que se analizan más abajo.) Por lo tanto, la planta es estéril constitutivamente, y se vuelve fértil solo cuando se induce el promotor y se expresa su gen de fertilidad masculina unido .

En varias circunstancias, se expresa un rasgo de la planta de esterilidad masculina por mantenimiento de una condición recesiva homocigota. Surgen dificultades para mantener la condición homocigota, cuando debe usarse un gen de restauración para el mantenimiento. Por ejemplo, una mutación natural en un gen critico para la fertilidad masculina puede proporcionar un fenotipo de esterilidad masculina a las plantas cuando este alelo mutante está en estado homocigota. Pero, debido a que esta homocigocidad da como resultado esterilidad masculina, la linea macho estéril homocigota no puede mantenerse. La fertilidad se restablece cuando se introduce en la planta una forma no mutante del gen. Sin embargo, esta forma de mantenimiento de la linea elimina la condición homocigota recesiva deseada, restablece la fertilidad masculina completa en la mitad de la progenie resultante, y previene el mantenimiento de las lineas maternas estériles masculinas puras. Estos problemas pueden evitarse cuando se elimina la producción de polen que contiene el gen de restauración, para proporcionar, asi, una planta mantenedora que solo produce polen que no contiene el gen de restauración, y la progenie retiene su condición homocigota cuando es fertilizada por ese polen. Un ejemplo de un método se muestra en Dellaporta et al., 6,743, 968, en donde se produce una planta que tiene un constructo homocigótico que comprende un gen que produce un producto fatal para la célula, unido con un promotor especifico del polen y el gen de restauración. Cuando se cruza con una planta estéril recesiva homocigota, la progenie, por lo tanto, retiene la condición recesiva homocigota. Se han descrito otros métodos, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm. 7,696,405.

Como se observa, un aspecto importante de gran parte del trabajo en curso con los sistemas de esterilidad masculina es la identificación de genes que afectan la fertilidad masculina. Ese gen puede usarse en varios sistemas para controlar la fertilidad masculina, incluidos los que se describieron anteriormente.

Como se usa en la presente descripción, "esterilidad masculina genética" es resultado de una mutación, supresión u otro impacto a uno de los genes críticos para un paso específico en la microesporogénesis , el término aplicado al proceso completo de formación de polen. Se puede hacer referencia colectivamente a estos genes como genes de fertilidad masculina (o, alternativamente, genes de esterilidad masculina) . Hay muchos pasos en la ruta general, en donde la función del gen afecta la fertilidad, tal como se demuestra por la frecuencia de la esterilidad masculina genética en el maíz. Los nuevos alelos de esterilidad masculina mutantes están descubiertos en materiales que abarcan desde plantas endogámicas de élite hasta poblaciones no adaptadas.

En la patente de los EE. UU. núm. 5, 478, 369 se describe un método por el cual se marcó y clonó el gen de fertilidad masculina Ms45 en el cromosoma 9 del maíz. Previamente, se describió un gen de fertilidad masculina en el cromosoma 9, ms2, que nunca se habia clonado y secuenciado. No es alélico al gen mencionado en la patente ?369. Ver, Albertsen, M. y Phillips, R.L., "Developmental Cytology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize" Canadían Journal of Genetics & Cytology 23:195-208 (Ene. 1981). El único gen de fertilidad clonado previamente fue el gen Arabadopsis, que se describe en Aarts, et al., supra.

Los ejemplos de genes que se descubrieron posteriormente, que son importantes para la fertilidad masculina, son numerosos e incluyen el gen de MICROSPORAS ABORTADAS de Arabidopsis (AMS) , Sorensen et al., The Plant Journal (2003) 33 (2) : 413-423) ; el gen Arabidopsis MSl ( ilson et al., The Plant Journal (2001) 39 (2) : 170-181) ; el gen NEFl (Ariizumi et al., The Plant Journal (2004) 39 (2) : 170-181) ; el gen Arabidopsis AtGPATl (Zheng et al., The Plant Cell (2003) 15:1872-1887); la mutación dde2-2 de Arabdiopsís resultó defectuosa en el gen aleño óxido sintasa (Malek et al., Planta (2002)216:187-192); el gen del polen-1 de Arabidopsisanónimo (flpl) (Ariizumi et al, Plant Mol. Biol. (2003) 53:107-116); el gen MALE MEIOCYTE DEATH1 de la Arabidopisis (Yang et al., The Plant Cell (2003) 15: 1281-1295); el gen dedos de zinc especifico del tapete, TAZ1 (Kapoor et al., The Plant Cell (2002) 14:2353-2367); y el gen TAPETUM DETERMINANTl (Lan et al, The Plant Cell (2003) 15:2792-2804).

En la Tabla 1 se enumeran los mutantes o genes de fertilidad masculina conocidos de Zea mays.

Tabla 1 Mutantes o genes de fertilidad masculina de Zea mays.

La publicación de patente de los EE. UU. núm. 2008-0086783 Al describe un gel de fertilidad masculina llamado "BS52-7' o "BS7' que está localizado en el cromosoma 7 del maiz. El gen BS92-7 puede usarse en los sistemas que se describieron anteriormente, y otros sistemas que afectan la fertilidad masculina.

La patente de los EE. UU . núm. 5,750, 868, presentada el 12-05-1998 describe un gen de fertilidad masculina conocido como "5126" (Sec. con núm. de ident.: 24) .

La patente de los EE. UU. núm. 5, 478, 369, presentada el 26 de diciembre de 1995, describe un gen de fertilidad masculina conocido como "MS45".

La patente de los EE. UU. núm. 7517975, presentada el 14 de abril de 2009, describe un gen de fertilidad masculina conocido como "MS-?6" (conocido, además, como SB200 o SB u200) que está localizado en el cromosoma 1 del maiz. El gen MS26 puede usarse en los sistemas que se describieron anteriormente y otros sistemas que afectan la fertilidad masculina .

La publicación de la patente de los EE. UU. núm. 2009-0038026 Al, publicada el 05-02-2009, describe un gen de fertilidad masculina conocido como "Mscal" o "MS22" que está localizado en el cromosoma 7 del maiz y codifica una proteina critica para la fertilidad masculina. Las mutaciones conocidas como ms22 o mscal se observaron por primera vez como fenotípicamente macho estériles con anteras que no extrudían de la espiga y carecían de tejido esporogéneo. West y Albertsen (1985) Maize Newsletter 59:87; Neuffer et al. (1977) Mutants of maize. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. El locus mutante originalmente se conoció como ms22, pero más tarde cambió a mscal, o antera convertida estéril. Ver Chaubal et al. "The transformation of anthers in the mscal mutant of maize" Planta (2003) 216:778-788.

En el contexto de la presente descripción, se usa varios términos y abreviaturas. Se proporciona las siguientes definiciones .

El término "secuencia de reconocimiento" o "sitio de reconocimiento", como se usa en la presente descripción, se refiere a una secuencia de ADN en donde una ruptura de cadena doble es inducida en el genoma de la célula vegetal por un agente inductor de ruptura. Los términos "secuencia de reconocimiento" o "sitio de reconocimiento" se usan indistintamente en la presente descripción.

Los términos "sitio objetivo", "secuencia objetivo", "locus objetivo", "sitio genómico objetivo", "secuencia genómica objetivo", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una secuencia de polinucleótidos en el genoma de una célula vegetal que comprende una secuencia de reconocimiento para un agente inductor de ruptura de cadena doble.

Una "secuencia objetivo artificial" es una secuencia objetivo que se ha introducido en el genoma de una planta. Tal secuencia objetivo artificial puede ser idéntica en la secuencia a una secuencia objetivo endógena o natural en el genoma de una planta, pero puede estar ubicada en una posición diferente (es decir, una posición no endógena o no natural) en el genoma de una planta.

Una "secuencia objetivo endógena" o "secuencia objetivo natural" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a una secuencia objetivo que es endógena o natural al genoma de una planta y está en la posición endógena o natural de esa secuencia objetivo en el genoma de la planta.

Una "secuencia objetivo alterada" se refiere a una secuencia objetivo, como se describe en la presente descripción, que comprende por lo menos una alteración de la presente invención en comparación con la secuencia objetivo no alterada. Tales "alteraciones" de la presente invención incluyen, por ejemplo: (i) el reemplazo de por lo menos un nucleótido, (ii) una deleción de por lo menos un nucleótido, (iii)- una inserción de por lo menos un nucleótido, o (iv) cualquier combinación de (i) a (iii) .

El término "agente inductor de ruptura de cadena doble", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier nucleasa que produce una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo. La producción de ruptura de cadena doble en una secuencia objetivo u otro ADN puede mencionarse en la presente descripción como "corte" o "clivaje" de la secuencia objetivo u otro ADN. En algunas modalidades de la presente invención, el agente inductor de ruptura de cadena doble se ha diseñado genéticamente (o modificado) para cortar una secuencia objetivo endógena especifica, en donde la secuencia objetivo endógena antes de ser cortada por el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente no era una secuencia que un agente inductor de ruptura de cadena doble natural (no diseñado genéticamente o no modificado) hubiera reconocido.

Un "agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente" es cualquier agente inductor de ruptura de cadena doble, que incluye, pero no se limita a, agentes de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente de tipo silvestre y agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente previamente que ha sido modificado para producir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo de interés que tiene una secuencia nucleótida diferente que la secuencia objetivo original del agente inductor de ruptura de cadena doble antes de su modificación. Preferentemente, un agente inductor de ruptura de cadena doble de la invención ya no tiene la capacidad de producir una ruptura de la cadena doble en la secuencia objetivo original.

El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima que cliva el enlace fosfodiéster en una cadena de polinucleótidos e incluye las endonucleasas de restricción que clivan el ADN en sitios específicos sin dañar las bases. Las endonucleasas de restricción incluyen las endonucleasas tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV, que, adicionalmente, incluyen subtipos. En los sistemas tipo I y tipo III, tanto la actividad de metilasas y de restricción están contenidas en un solo complejo.

Las endonucleasas de restricción tipo I y tipo III reconocen los sitios de reconocimiento específicos, pero se clivan, típicamente, en una posición variable del sitio de reconocimiento, que puede estar cientos de pares de bases en dirección contraria del sitio de reconocimiento. En los sistemas tipo II la actividad de restricción es independiente de cualquier actividad de metilasas y el clivaje se produce, típicamente, en sitios específicos dentro o cerca del sitio de reconocimiento. La mayoría de las enzimas tipo II cortan secuencias palindrómicas; sin embargo, las enzimas tipo lia reconocen los sitios de reconocimiento no palindrómicos y se clivan fuera del sitio de reconocimiento, las enzimas tipo 11b cortan secuencias dos veces con ambos sitios fuera del sitio de reconocimiento, y las enzimas tipo lis reconocen un sitio de reconocimiento asimétrico y se clivan en un lado y a una distancia definida de aproximadamente 1 a 20 nucleótidos del sitio de reconocimiento.

Las enzimas de restricción tipo IV se dirigen a ADN metilado. Las enzimas de restricción se describen y se clasifican, adicionalmente, por ejemplo, en la base de datos REBASE (página web rebase.neb.com; Roberts, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, y Belfort, et al., (2002) en Mobile DNA II, pág. 761-783, Eds. Craigie, et al., (ASM Press, Washington, DC) .

Las endonucleasas incluyen, además, meganucleasas, también conocidas como endonucleasas homing (HEasas) que, al igual que las endonucleasas de restricción, se unen y cortan una secuencia de reconocimiento especifica; sin embargo, los sitios de reconocimiento para las meganucleasas son, típicamente, más largos, aproximadamente 18 bp o más. Se han identificado meganucleasas en cuatro familias en base a motivos de secuencias conservadas; las familias son LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H, y bloque His-Cys. Estos motivos participan en la coordinación de iones metálicos y en la hidrólisis de enlaces de fosfodiéster . Las HEasas destacan por sus sitios de reconocimiento prolongados y por tolerar ciertos polimorfismos de secuencias en sus sustratos de ADN. El convenio de la denominación para las meganucleasas es similar al convenio para otras endonucleasas de restricción. Las meganucleasas se caracterizan, además, por el prefijo F-,I- o PI- para las enzimas codificadas por los ORF independientes, intrones e internas, respectivamente. Por ejemplo, las meganucleasas codificadas por intrón, inteina y gen independiente Saccharomyces cerevisiae se denominan I-Scel, PI-SceI, y F-Scell, respectivamente. Los dominios, estructura y función de las meganucleasas son conocidos, ver, por ejemplo, Guhan y Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas, et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; y Moure, et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764. En algunos ejemplos se usa una meganucleasa diseñada genéticamente. Se conocen los métodos para modificar la cinética, las interacciones de los cofactores, la expresión, las condiciones óptimas y/o la especificidad del sitio de reconocimiento y para evaluar la actividad. Ver, por ejemplo, Epinat, et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier, et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble, et al., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman, et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:el78; Smith, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:el49; Gruen, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:el54; patente núm. WO2005105989 ; patente núm. WO2003078619; patente núm. WO2006097854 ; patente núm. O2006097853; patente núm. WO200609778 ; y patente núm. WO2004031346.

La endonucleasa puede ser una endonucleasa modificada que une una secuencia de reconocimiento no natural o exógena y no une una secuencia de reconocimiento natural o endógena. La modificación de la endonucleasa puede ser tan pequeña como un nucleótido. Una endonucleasa modificada no tiene la capacidad de producir una ruptura de cadena doble dentro de una secuencia objetivo silvestre. Una endonucleasa silvestre (es decir, antes de ser modificada) tiene la capacidad de producir una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia objetivo silvestre.

La endonucleasa se puede proporcionar por medio de un polinucleótido que codifica la endonucleasa. Tal polinucleótido que codifica una endonucleasa se puede modificar para substituir codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural. Por ejemplo, el polinucleótido que codifica la endonucleasa se puede modificar para sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta de maíz o frijol de soja, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural.

El término "endonucleasa diseñada genéticamente" es cualquier endonucleasa que ha sido diseñada genéticamente (o modificada) para cortar una secuencia objetivo endógena especifica, en donde la secuencia objetivo endógena antes del corte por parte de la endonucleasa diseñada genéticamente no era una secuencia que hubiera sido reconocida por una endonucleasa natural (no diseñada genéticamente ni modificada) .

En algunas modalidades de la invención, la endonucleasa diseñada genéticamente es una endonucleasa MS26 diseñada genéticamente, una endonucleasa MS26+ diseñada genéticamente, una endonucleasa MS26++ diseñada genéticamente o una endonucleasa MS45 diseñada genéticamente .

Como se usa en la presente descripción, "físicamente unidos", y "unión física", y "genéticamente unidos" se usan para referirse a cualquier par o más genes, transgenes, genes naturales, genes mutados, alteraciones, sitios objetivo, marcadores y similares que forman parte de la misma molécula de ADN o cromosoma.

Como se usa en la presente descripción, "un polinucleótido de interés" en una región genómica de interés es cualquier porción codificante y/o no codificante de la región genómica de interés que incluye, pero no se limita a, un transgen, un gen nativo, un gen mutado y un marcador genético tal como, por ejemplo, un marcador de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y un marcador de repeticiones de secuencia simple (SSR) .

La Abreviatura de "marco de lectura abierta" es ORF.

Como se usa en la presente descripción, "ácido nucleico" se refiere a un polinucleótido e incluye un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos . Los ácidos nucleicos pueden incluir, además, fragmentos y nucleótidos modificados. Por lo tanto, los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia nucleótida" y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente para indicar un polímero de ARN y/o ADN monocatenario o bicatenario que contiene, opcionalmente, bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas Los nucleótidos (que usualmente se encuentran en su forma 5-monofosfato) se mencionan por medio de su designación de una sola letra de la siguiente manera: "A" para adenosina o deoxiadenosina (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citosina o deoxicitosina, "G" para guanosina o deoxiguanosina, "U" para uridina, "T" para deoxitimidina, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina, y "N" para cualquier nucleótido.

Los términos "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en la presente descripción. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el cual se retiene la capacidad de alterar la expresión génica o de producir un cierto fenotipo ya sea que el fragmento o subfragmento codifique o no una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede usarse para diseñar genes quiméricos para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Los genes quiméricos pueden diseñarse para usar en la supresión al unir un fragmento de ácido nucleico o subfragmento de este, ya sea que codifique o no una enzima activa, en orientación codificante o no codificante con relación a la secuencia promotora de una planta.

El término "dominio conservado" o "motivo" se refiere a un grupo de aminoácidos conservados en posiciones especificas en una secuencia alineada de proteínas de evolución relacionada. Si bien los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre las proteínas homologas, los aminoácidos altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos esenciales para la estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Dado que se identifican por su grado alto de conservación en las secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden usarse como identificadores o "firmas", para determinar si una proteína con una secuencia recién determinada pertenece a una familia de proteínas identificada previamente.

Las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos, variantes de estas y las relaciones estructurales de estas secuencias pueden describirse con los términos "homología", "homologas", "prácticamente idénticas", "prácticamente similares" y "prácticamente correspondientes" que se usan indistintamente en la presente descripción. Estas se refieren a fragmentos de polipéptidos o de ácido nucleico en donde los cambios en uno o más aminoácidos o bases de nucleótidos no afectan la función de la molécula, tal como la capacidad de mediar la expresión génica o de producir un cierto fenotipo. Estos términos se refieren, además, a la modificación o modificaciones de fragmentos de ácido nucleico que prácticamente no alteran las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento inicial, no modificado. Estas modificaciones incluyen deleción, sustitución y/o inserción de uno o más nucleótidos en el fragmento de ácido nucleico.

Las secuencias de ácido nucleico prácticamente similares incluidas pueden definirse por su capacidad de hibridizarse (en condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo, SSC 0.5X, SDS al 0.1 %, 60 °C) con las secuencias ejemplificadas en la presente descripción, o con cualquier porción de las secuencias nucleótidas descritas en la presente descripción y que son funcionalraente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente descripción. Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para identificar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas a partir de organismos poco relacionados, con fragmentos altamente similares, tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados posteriores a la hibridación determinan condiciones rigurosas.

El término "se hibridiza selectivamente" incluye la referencia a la hibridación, en condiciones rigurosas de hibridación, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo especifica de ácido nucleico en un grado detectable mayor (por ejemplo, por lo menos el doble por encima del base) que su hibridación en secuencias de ácido nucleico no objetivo y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. Las secuencias de hibridación selectiva tienen, típicamente, aproximadamente al menos 80 % de identidad de secuencia, o 90 % de identidad de secuencia, hasta e incluye 100 % de identidad de secuencia (es decir, completamente complementaria) entre si.

El término "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" incluye lo referente a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridiza selectivamente en su secuencia objetivo en un ensayo de hibridación in vitro. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse las secuencias objetivo las que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo de homólogos) . Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierta falta de coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga) . Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, opcionalmente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas son aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M iones de Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de iones de Na (u otra sal o sales) a un pH de 7.0 a 8.3, y por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Además, pueden lograrse las condiciones rigurosas mediante la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. Las condiciones de rigor bajo ilustrativas incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, 1 M NaCl, 1 % SDS (sodio dodecilo sulfato) a 37 °C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M citrato trisódico) a 50-55 °C. Las condiciones de rigor moderado ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 40 a 45 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0.5X a IX a 55 a 60 °C. Las condiciones de rigor alto ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0.1X a 60 hasta 65 °C.

La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a partir de la ecuación Meinkoth, et al., (1984) Anal Biochem 138:267-284: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% forma) - 500/1; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se hibridiza el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridizarse con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca secuencias con =90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia objetivo y su complemento, con una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, las condiciones muy rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) . Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimiento ordinario en la técnica comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de desapareamiento deseado resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere aumentar la concentración del SSC de manera tal que pueda usarse una temperatura más alta. Una guia extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization wíth Nucleic Acid Probes, Part I, Capitulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993); y Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Las condiciones de hibridación y/o lavado pueden aplicarse por al menos 10, 30, 60, 90, 120 o 240 minutos.

"Identidad de secuencias" o "identidad" en el contexto de secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptidos se refiere a las bases de ácido nucleico o residuos de aminoácidos en dos secuencias que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia con una ventana de comparación especifica.

El término "porcentaje de identidad de secuencias" se refiere al valor determinado al comparar dos secuencias con alineación óptima con una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácidos idéntico en ambas secuencias para obtener la cantidad de posiciones emparejadas, se divide la cantidad de posiciones emparejadas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y se multiplica el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad de secuencias incluyen, pero no se limitan a, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o cualquier porcentaje de enteros de 50 % a 100 %. Estas identidades se pueden determinar con el uso de cualquiera de los programas descritos en la presente descripción.

Los cálculos de los alineamientos de secuencias y de la identidad porcentual o similitud porcentual pueden determinarse con el uso de una gran variedad de métodos de comparación diseñado genéticamente para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan al, programa MegAlign™ del paquete integrado para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, I) . Dentro del contexto de esta solicitud, se comprenderá que cuando se use un programa para análisis de secuencias, los resultados del análisis se basan en los "valores predeterminados" del programa de referencia, a menos que se especifique de cualquier otra manera. Como se usa en la presente descripción, los "valores predeterminados" se refiere a cualquier grupo de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa cuando se inicia la primera vez.

El "método de alineamiento Clustal V" corresponde al método de alineamiento etiquetado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins, et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y se encuentra en el programa MegAlign™ del paquete integrado para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para múltiples alineamientos, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 y PENÁLIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10. Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y para calcular la similitud porcentual de secuencias de proteínas con el uso del método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias con el uso del programa Clustal V, es posible obtener una "identidad porcentual" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.

El "método de alineamiento Clustal W" corresponde al método de alineamiento etiquetado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins, et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y se encuentra en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete integrado para bioinformática (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Los parámetros predeterminados para alineamiento múltiple (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=0.2 , retardo de secuencias divergentes (%)=30, peso de transición de ADN=0.5, matriz de pesos de proteina=serie Gonnet, matriz de pesos de ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias con el uso del programa Clustal W, es posible obtener una "identidad porcentual" al observar la tabla "distancias de secuencias" en el mismo programa.

A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencias proporcionados en la presente descripción se refieren a el valor obtenido con el uso de GAP versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) con el uso de los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleótida con el uso de un peso de penalización de creación de interrupciones de 50 y un peso de penalización de extensión de longitud de interrupciones de 3 y la matriz de puntajes nwsgapdna . cmp; el % de identidad y el % de similitud para una secuencia de aminoácidos con el uso de un peso de penalización de creación de interrupciones de 8 y de penalización de extensión de longitud de interrupciones de 2 y la matriz de puntajes BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). El programa GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J Mol Biol 48 : 443-53, para encontrar un alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de interrupciones. El programa GAP considera todos los alineamientos y posiciones de interrupciones posibles y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases emparejadas y la menor cantidad de interrupciones, con el uso de una penalización de creación de interrupciones y una penalización de extensión de interrupciones en unidades de bases emparejadas.

"BLAST" es el algoritmo de búsqueda proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usado para encontrar las regiones de similitud entre secuencias biológicas. El programa compara las secuencias nucleótidas o las secuencias de proteínas con las bases de datos de secuencias y calcula la importancia estadística de coincidencias para identificar las secuencias que tienen suficiente similitud con una secuencia de consulta de manera que no se prevé que la similitud ocurra aleatoriamente. El programa BLAST reporta las secuencias identificadas y su alineamiento local con la secuencia de consulta.

Una persona con experiencia en la técnica comprende que varios niveles de identidad de secuencias son útiles para identificar los polipéptídos de otras especies o modificados natural o sintéticamente, en donde tales polipéptídos tienen una función o actividad igual o similar. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad de secuencias incluyen, pero no se limitan a, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o cualquier porcentaje de enteros de 50 % a 100 %. Claramente, cualquier entero de identidad de aminoácidos de 50 % a 100 % puede ser útil para describir la presente invención, tales como 51 %, 52 g. 53 Q. 54 55 o 56 57 %, 5Í 3 %, 59 60 ¦S / 61 o 62 o. 63 Q. o o 64 Q. 65 66 o 67 %, 6í 3 %, 69 o. 70 71 72 73 74 75 76 77 %, 7S 3 %, 79 ° r 80 81 82 o / 83 84 85 86 87 %, 8í 3 %, 89 90 o 91 92 93 94 95 96 97 %, 98 % o 99 "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteina especifica, que incluye secuencias reguladoras anteriores (secuencias 5' no codificantes) y posteriores (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen natural, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por lo tanto, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de manera diferente a como se encuentran en la naturaleza, o en un locus genético diferente a como se encuentra en la naturaleza. Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos.

Un "gen mutado" es un gen natural que se ha alterado a través de intervención humana. Tal "gen mutado" tiene una secuencia que difiere de la secuencia del gen natural correspondiente en por lo menos una adición, deleción o sustitución de nucleótidos . En ciertas modalidades de la presente invención, el gen mutado comprende una alteración que resulta de un agente inductor de ruptura de cadena doble como se describe en la presente descripción.

Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación. Un transgen puede, por ejemplo, codificar una o más proteínas o ARN que no se traduce a proteína. Sin embargo, un transgen de la presente invención no necesita codificar una proteína y/o ARN sin traducir. En ciertas modalidades de la presente invención, el transgen comprende uno o más genes quiméricos, que incluyen genes quiméricos que comprenden, por ejemplo, un gen de interés, un marcador fenotípico, un marcador seleccionable y un ADN para silenciamiento de genes.

Como se usa en la presente descripción, una "modificación objetivo" es una modificación en la secuencia objetivo del genoma de un organismo que se hizo al alterar una secuencia objetivo dentro del gen nativo con el uso de un método que incluye un agente inductor de ruptura de cadena doble que tiene la capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en el ADN de la secuencia objetivo, como se describe en la presente descripción o como se conoce en la técnica. Una "mutación especifica" es una mutación en un gen nativo que se hizo al alterar una secuencia objetivo dentro del gen nativo con el uso de un método que incluye un agente inductor de ruptura de cadena doble que tiene la capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en el ADN de la secuencia objetivo, como se describe en la presente descripción o como se conoce en la técnica. Una "mutación especifica" es un tipo de "modificación objetivo".

Cuando se usa en la presente descripción con respecto al ADN, los genes, y otros ácidos nucleicos, los términos "alteración", "modificación" y "mutación" deben considerarse términos equivalentes a menos que se evidencie por el contexto que se pretende un significado diferente para uno o más de estos términos.

Una "mutación nula" es una mutación en un gen que conduce a que este no se transcriba en el ARN y/o traduzca en un producto de proteina funcional. Un alelo que comprende la mutación nula se conoce como un "alelo nulo". Una mutación nula en un gen puede ser causada, por ejemplo, por una alteración en el gen que incluye (i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido, o (iv) cualquier combinación de (i) a (iii) .

Tal como se usa en la presente descripción, un "gen de fertilidad masculina" es un gen que es critico para los pasos que conducen a e incluyen la microsporogénesis , el término aplicado a la totalidad del proceso de formación de polen. Se puede hacer referencia colectivamente a estos genes como genes de fertilidad masculina (o, alternativamente, genes de esterilidad masculina) . Los términos "gen de fertilidad masculina", "gen fértil masculino", "gen de esterilidad masculina" y "gen macho estéril" se usan indistintamente.

Una "planta fértil" es una planta que tiene la capacidad de producir una planta progenie. En ciertas modalidades de la presente invención, una planta fértil es una planta que produce gametos macho y hembra viables y es autofértil. Tal planta autofértil puede producir una planta progenie sin la colaboración de ninguna otra planta de un gameto y el material genético contenido en esta. Otras modalidades de la presente invención pueden incluir el uso de una planta que no es autofértil dado que la planta no produce gametos macho o hembra que sean prácticos o que de cualquier otra manera tengan la capacidad de fertilización. Como se usa en la presente descripción, una "planta macho estéril" es una planta que no produce gametos macho que son prácticos o que tienen de cualquier otra manera la capacidad de fertilización. Como se usa en la presente descripción, una "planta hembra estéril" es una planta que no produce gametos hembra que son prácticos o que tienen de cualquier otra manera la capacidad de fertilización. Se reconoce que las plantas estériles masculinas y estériles femeninas pueden ser fértiles femeninas y fértiles masculinas, respectivamente. Se reconoce, además, que una planta fértil masculina (pero estéril femenina) puede producir progenie viable cuando se cruza con una planta fértil femenina, y que una planta hembra fértil femenina (pero estéril masculina) puede producir una progenie viable cuando se cruza con una planta fértil masculina .

El término "genoma" aplicado a una célula vegetal no incluye únicamente el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino además el ADN de las organelas que se encuentran dentro de los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondria o plástido) de la célula.

Un "gen modificado por codones" o "gen especifico para codones" o "gen optimizado por codones" es un gen que tiene su frecuencia de uso de codones diseñada genéticamente para imitar la frecuencia de uso de codones preferida de la célula huésped.

Un "alelo" es una de las diversas formas alternas de un gen que ocupa un locus especifico en un cromosoma. Cuando todos los alelos presentes en un locus especifico en un cromosoma son iguales, esa planta es homocigota en ese locus. Si los alelos presentes en un locus especifico en un cromosoma difieren, esa planta es heterocigota en ese locus.

"Secuencia codificante" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos especifica. "Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias nucleótidas ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y que afectan la transcripción, el procesamiento de ARN o la estabilidad o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a: promotores, secuencias líder de traducción, secuencias 5' sin traducir, secuencias 3' sin traducir, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios efectores de unión, y estructuras de tallo-lazo.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN con la capacidad de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. La secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales corriente arriba, estos últimos se mencionan frecuentemente como potenciadores . Un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora, y puede ser un elemento natural del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar la actividad o el nivel o especificidad para tejidos de un promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o pueden componerse de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, y/o comprenden segmentos de ADN sintético. Aquellos con experiencia en la técnica comprenden que distintos promotores pueden activar la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Se reconoce, además, que dado que en la mayoría de casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de cierta variación pueden tener una actividad promotora idéntica. Los promotores que causan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayoría de las veces se denomina "promotores constitutivos". Constantemente se descubren nuevos promotores de varios tipos de células vegetales; numerosos ejemplos pueden encontrarse en la compilación por Okamuro y Goldberg, (1989) In The Biochemistry of Plants, Vol. 115, Stumpf y Conn, eds (New York, NY: Academic Press), págs . 1-82.

"Secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia nucleótida ubicada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm procesado completamente corriente arriba de la secuencia de inicio de la traducción.

La secuencia líder de traducción puede afectar el procesamiento del transcrito primario a ARNm, la estabilidad de ARNm o la eficacia de traducción. Los ejemplos de secuencias líder de traducción han sido descritos (por ejemplo, Turner and Foster, (1995) Mol Biotechnol 3:225-236) .

"Secuencias 3 no codificantes", "terminador de transcripción" o "secuencias terminadoras" se refieren a las secuencias de ADN ubicadas corriente abajo de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras con la capacidad de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias 3 no codificantes lo ejemplifican Ingelbrecht, et al., (1989) Plant Cell 1:671-680.

"Transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se menciona como el transcrito primario. Un transcrito de ARN se menciona como el ARN maduro cuando es una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional del transcrito primario. "ARN mensajero" o "ARNm" se refiere al ARN sin intrones y que la célula puede traducir en proteina. "ADNc" se refiere a un ADN complementario con, y sintetizado de, una plantilla de ARNm con el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o puede convertirse en bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de ADN polimerasa I. ARN "codificante" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y puede traducirse a proteína dentro de una célula o in vitro. "ARN no codificante" se refiere a un transcripto de ARN que es complementario a todos o parte de un transcripto primario objetivo o ARNm, y que bloquea la expresión de un gen objetivo (consulte, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,107,065). La complementariedad de un ARN no codificante puede ser con cualquier parte del transcrito de genes específico, por ejemplo, en la secuencia 5' no codificante, la secuencia 3' no codificante, intrones o la secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a ARN no codificante, ARN de ribozimas u otro ARN que no puede traducirse, pero que tiene un efecto en los procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento inverso" se usan indistintamente en la presente descripción con respecto a los transcritos de ARNm, y pretenden definir el ARN no codificante del mensaje.

El término "unido operativamente" se refiere a la asociación de las secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de uno está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando tiene la capacidad de regular la expresión de esa secuencia codificante (por ejemplo, la secuencia codificante está bajo control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en una orientación codificante o no codificante. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementario pueden estar unidas operativamente, ya sea directa o indirectamente, 5' al ARNm objetivo o 3' al ARNm objetivo, o dentro del ARNm objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al ARNm obj etivo .

Las técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular usadas en la presente descripción son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) . Los métodos de transformación son muy conocidos para aquellos con experiencia en la técnica y se describen más abaj o .

"PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica para la síntesis de segmentos de ADN específicos y consiste en una serie de ciclos repetitivos de desnaturalización, hibridación y extensión. Típicamente, un ADN bicatenario se desnaturaliza con calor y dos iniciadores complementarios con los limites 3' del segmento objetivo se hibridan hasta ADN a temperatura baja y, después, se extienden a una temperatura intermedia. Un grupo de estas tres etapas consecutivas se menciona como "ciclo".

El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de cualquier otra manera, por ejemplo, por síntesis química o por manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por medio de técnicas de ingeniería genética .

Los términos "plásmido", "vector" y "cásete" se refieren a un elemento cromosómico adicional que, frecuentemente, porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula y, usualmente, en forma de ADN bicatenario. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma, fagos o secuencias nucleótidas, en forma lineal o circular, de un ADN o ARN monocatenario o bicatenario, que se derivan de cualquier fuente, en donde varias secuencias nucleótidas se han unido o recombinado en un único constructo que tiene la capacidad de introducir un polinucleótido de interés en una célula. "Cásete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilitan la transformación de una célula huésped particular. "Cásete de expresión" se refiere a un vector especifico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilitan la expresión de ese gen en un huésped extraño.

Los términos "molécula de ADN recombinante", "constructo recombinante", "constructo de expresión", "constructo quimérico", "constructo", y "constructo de ADN recombinante" se usan indistintamente en la presente descripción. Un constructo recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y secuencias codificantes que no se encuentran todas juntas en la naturaleza. Por ejemplo, un constructo quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de distintas fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas en una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza. Tal construcción se puede usar sola o en conjunto con un vector. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se usará para transformar células huésped tal como conoce una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un vector plasmidico. El técnico con experiencia sabe bien cuáles elementos genéticos deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar células huésped. El técnico con experiencia reconocerá, además, que diferentes eventos de transformación independientes pueden generar diferentes niveles y patrones de expresión (Jones, et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida, et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86) y, por lo tanto, que múltiples eventos se evalúan típicamente para obtener líneas que presentan el nivel de expresión y el patrón deseados. Tal evaluación se puede llevar a cabo por ensayos convencionales de biología molecular, ensayos bioquímicos y otros ensayos que incluyen análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión de ARNm, PCR, PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real, PCR con transcripción inversa (RT-PCR) , análisis de inmunotransferencia de expresión proteica, ensayos de enzimas o actividad, y/o análisis fenotípico.

El término "expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a la producción de un producto final funcional (por ejemplo, un ARNm o una proteína) ya sea en forma precursora o madura.

El término "introducido (a) " se refiere a proporcionar un ácido nucleico (por ejemplo, constructo de expresión) o proteína en una célula. El término "introducido" incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula procariótica o eucariótica, en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula, así como la referencia a la provisión transitoria de un ácido nucleico o proteina en la célula. El término "introducido" incluye la referencia a métodos transitorios o estables de transformación, asi como a cruzamiento sexual. Por lo tanto, el término "introducido" en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante/constructo de expresión) en una célula, se refiere a la "transíección" o "transformación" o "transducción" e incluye lo referente a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial ) , se puede convertir en un replicón autónomo o se puede expresar temporalmente (por ejemplo, ARNm transíectado) .

Proteina "madura" se refiere a un polipéptido procesado postransicionalmente (por ejemplo, uno de donde puede eliminarse cualquier prepéptido o propéptido presente en el producto primario de traducción) . Proteina "precursora" se refiere al producto primario de traducción de ARNm (por ejemplo, con prepéptidos y propéptidos aún presentes) . Los prepéptidos y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales de localización intracelular .

"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, que incluye genomas tanto nucleares como organulares, lo que produce una herencia genéticamente estable. En contraste, "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u otro organela que contiene ADN, de un organismo huésped, lo que produce una expresión génica sin integración o herencia estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se mencionan como organismos "transgénicos".

Como se usa en la presente descripción, "transgénico" se refiere a una planta o una célula que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Típicamente, el polinucleótido heterologo se integra de manera estable dentro del genoma de manera que el polinucleótido se transmite a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede integrarse en el genoma solo o como parte de un constructo de expresión. El término "transgénico" se usa en la presente descripción para incluir cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta, cuyo genotipo se ha alterado con la presencia de ácidos nucleicos heterólogos que incluyen los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. Como se usa en la presente descripción, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo vegetal o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

El término "planta" se refiere a plantas enteras, órganos de plantas, tejidos vegetales, semillas, células vegetales, semillas y progenie de estas. Las células vegetales incluyen, pero no se limitan a, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raices, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Las partes de plantas incluyen tejidos diferenciados e indiferenciados que incluyen, pero no se limitan a, raices, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivos (por ejemplo, células únicas, protoplastos, embriones y tejido calloso) . El tejido vegetal puede estar en una planta o en el órgano de una planta, cultivo tisular o celular. El término "órgano de una planta" se refiere al tejido vegetal o un grupo de tejidos que constituyen una parte de una planta morfológica y funcionalmente distinta. El término "genoma" se refiere al complemento entero de material genético (genes y secuencias no codi icantes) que está presente en cada célula de un organismo, o virus u organelo; y/o un grupo completo de cromosomas heredados como una unidad (haploide) de un genitor. "Progenie" comprende cualquier generación posterior de una planta.

La presente invención encuentra aplicación en la producción de plantas híbridas. Las mutaciones que causan estirilidad masculina en las plantas son útiles en los métodos de producción de semillas híbridas para cultivos tales como, por ejemplo, el maíz. El uso de plantas estériles masculinas en la producción de semillas de maíz híbridas elimina la necesidad de retirar las flores masculinas mediante mano de obra intensiva (conocido, además, como desespigamiento, cuando la planta es de maíz) de las plantas genitores maternas usadas para producir la semilla híbrida. Se han producido mutaciones que causan esterilidad masculina en el maíz mediante diferentes métodos como rayos X o radiaciones UV, tratamientos químicos o inserción de elementos transponibles {ms23, ms25, ms26, ms32) (Chaubal et al. (2000) Am J Bot 87:1193-1201). Sin embargo, tales métodos son métodos de mutagénesis aleatorios que inducen mutaciones al azar por todo el genoma y no solo en el gen de interés. Típicamente, con tales métodos de mutagénesis aleatorios, se requiere un esfuerzo considerable para identificar una planta que contiene una mutación en el gen de interés y no es en absoluto seguro que se identificará tal planta. Además, con los métodos de mutagénesis aleatorios, es probable que cada planta examinada sea portadora de mutaciones múltiples. Por lo tanto, una planta que se identifica con la mutación del gen de interés debe ser cruzada por varias generaciones o más para eliminar las mutaciones no deseadas que no están dentro del gen de interés.

Al contrario de tales métodos de mutagénesis aleatoria, la presente invención proporciona métodos mejorados para producir plantas estériles masculinas al producir mutaciones objetivo o alteraciones en el gen de interés de fertilidad masculina en cualquier planta, particularmente, en plantas de cultivo. Debido a que las mutaciones se dirigen al gen de interés de fertilidad masculina, no es necesario seleccionar una población de miles de plantas que portan mutaciones aleatorias para identificar una planta con una mutación en el gen de interés de fertilidad masculina. Además, las mutaciones no deseadas fuera del gen de interés son raras, y si ocurren están en una planta particular producida por los métodos de la presente invención. Además, la necesidad de cruzar una planta para eliminar las mutaciones no deseadas que no están en el gen de interés se elimina o al menos se reduce.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona métodos para hacer una modificación objetivo en un gen de fertilidad masculina en el genoma de una planta. Los métodos comprenden el contacto de al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en un gen de fertilidad masculina con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo y, después, identificar al menos una célula que comprende una alteración de su genoma en la secuencia objetivo. Los métodos pueden comprender, además, la regeneración de una planta fértil o una planta estéril masculina que comprende la alteración.

Los métodos comprenden el uso de un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que tiene la capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en el ADN que comprende la secuencia objetivo en un gen de interés de fertilidad masculina. Los métodos de la presente invención no dependen de un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente particular, sino únicamente de que el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente tenga la capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en el ADN en una secuencia objetivo de la presente invención. Cualquier agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente, que se describe en la presente descripción o conocido en la técnica, puede usarse en los métodos de la presente invención. Además, la invención comprende el uso de cualquier agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que se haga por los medios que se describen en la presente descripción o que se conozcan en la técnica.

Los métodos de la invención comprenden contactar al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en un gen de fertilidad masculina con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que es capaz de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo. Tal contacto puede involucrar, por ejemplo, la introducción de un polipéptido que comprende un agente inductor de cadena doble directamente en una célula vegetal o la introducción en una célula vegetal de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de doble cadena diseñado genéticamente, por lo cual se produce en la célula un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente. El constructo de ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifican un agente de la invención inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente. Cualquier promotor que se describe en la presente descripción o conocido en la técnica que puede impulsar la secuencia nucleótida unida operativamente en la célula vegetal, puede usarse en los métodos de la presente invención .

Si se desea o es necesario obtener la localización nuclear del agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente, el constructo de nucleótido puede comprender, además, una secuencia nucleótida unida operativamente que codifica una señal de localización nuclear. Puede usarse cualquier señal de localización nuclear que pueda facilitar la localización nuclear del agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que se describe en la presente descripción o que se conoce en la técnica en los métodos de la presente invención. Tales señales de localización nuclear incluyen, pero no se limitan a, una señal de localización nuclear que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la sec. con núm. de ident . : 2 , 3 o 21.

Los métodos de la invención involucran alterar la secuencia objetivo. Tal alteración incluye, por ejemplo, el reemplazo de al menos un nucleótido, una deleción de al menos un nucleótido, una inserción de al menos un nucleótido y cualquier combinación de uno o más reemplazos, deleciones e inserciones.

En una modalidad de la invención, la alteración es una inserción de un transgen. Tal transgen puede comprender, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más polinucleótidos de interés. Si se desea, un polinucleótido de interés puede estar unido operativamente al promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido de interés en una planta. Los polinucleótidos de interés incluyen, pero no se limitan a, un marcador fenotipico y un ARN o una proteina que proporciona una ventaja agronómica a la planta.

En otra modalidad de la invención, la alteración de la secuencia objetivo del gen de la fertilidad masculina es una mutación nula. Cuando una planta es homocigota para tal mutación nula (es decir, tiene dos alelos nulos en el gen de interés de fertilidad masculina) , la planta es estéril masculina. Tal mutación nula puede ser el resultado de cualquier alteración que se haya expuesto en la presente descripción, y que incluye, por ejemplo, la inserción de un transgen. En ciertas modalidades de la invención, un transgen comprende un marcador fenotipico, particularmente, un marcador . selecciónatele . Se reconoce que cuando la mutación nula es causada por la inserción de un transgen que comprende un marcador fenotipico, particularmente, un marcador seleccionadle, la identificación de plantas que comprenden al menos un alelo nulo en el gen de interés de fertilidad masculina puede comprender la identificación de una planta que comprende un marcador fenotipico, particularmente, el marcador seleccionable .

Los métodos de la invención pueden comprender, además, la autofertilizacion de la planta fértil que comprende la alteración en el gen de fertilidad masculina y la selección de una planta progenie que resulta de estos, en donde dicha planta progenie es homocigota para la alteración. En una modalidad de la invención, los métodos comprenden, además, la autofertilizacion de la planta fértil que comprende una alteración que es una mutación nula del gen de fertilidad masculina y la selección de una planta progenie que resulta de estos, en donde dicha planta progenie es homocigota para la alteración y es estéril masculina .

En otra modalidad de la invención, los métodos de la invención comprenden, además, el cruce de una primera planta fértil que comprende una mutación nula en el gen de fertilidad masculina con una segunda planta fértil que comprende una mutación nula en el gen de la fertilidad masculina y la selección de una planta progenie que resulta de estos, en donde la planta progenie es estéril masculina. Tanto la primera y segunda plantas estériles masculinas pueden producirse por los métodos que se describen en la presente descripción o pueden ser descendientes de una planta fértil que se produce por los métodos que se describen en la presente descripción. La primera y segunda plantas estériles masculinas pueden comprender la misma mutación nula en el gen de la fertilidad masculina. Alternativamente, la primera planta estéril masculina puede comprender una primera mutación nula en el gen de la fertilidad masculina y la segunda planta estéril masculina puede comprender una segunda mutación nula en el gen de la fertilidad masculina, en donde la primera mutación nula no es idéntica a la segunda mutación nula. En una modalidad de la invención, la primera mutación nula comprende la inserción de un primer transgen que comprende un primer marcador fenotipico, particularmente, un primer marcador seleccionable y la segunda mutación nula comprende la inserción de un segundo transgen que comprende un segundo marcador fenotipico, particularmente, un segundo marcador seleccionable . Por lo tanto, cuando se cruza la primera planta fértil con la segunda planta fértil, la progenie estéril masculina, que comprende tanto la primera mutación nula como la segunda mutación nula, pueden identificarse como aquellas plantas progenie que comprenden el primero y segundo marcadores fenotipicos.

Los métodos de la invención pueden emplearse para hacer modificaciones objetivo en cualquier gen de fertilidad masculina en una planta y proporcionar, asi, la producción de plantas estériles masculinas en cualquier planta que comprende un gen de fertilidad masculina. Los genes de fertilidad masculina de interés incluyen, pero no se limitan a, los genes que se describen en la Tabla 1 y MS26, MS45, BS92-7, 5126 y Mscal.

En una modalidad de la invención, los métodos de la invención involucran una modificación objetivo en el gen de fertilidad masculina, MS26, en el genoma de una planta, tal como, por ejemplo, una planta de maíz o una planta de sorgo. Los métodos comprenden el contacto de al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en el gen MS26 con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo y, después, identificar al menos una célula que comprende una alteración de su genoma en la secuencia objetivo. Los métodos pueden comprender, además, la regeneración de una planta fértil que comprende la alteración.

Un ejemplo de una secuencia objetivo en el gen MS26 que puede usarse en esta modalidad se expone en TS-MS26 (sec. con núm. de ident.: 1). En este ejemplo puede usarse cualquier agente inductor de ruptura de cadena doble con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en esta secuencia objetivo.

El agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que tiene capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo TS-MS26 que comprende la sec. con núm. de ident.: 1 puede introducirse en una planta como un constructo de nucleótido que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente. Cualquier promotor que se describe en la presente descripción o conocido en la técnica que puede dirigir la expresión de la secuencia nucleótida unida operativamente que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente en la célula vegetal puede usarse en los métodos de la presente invención. La secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de doble cadena puede seleccionarse en el grupo que consiste en: las secuencias nucleótidas que se exponen en las sec. con núms . de ident . : 4 a 7; y una secuencia nucleótida que tiene una identidad de al menos 80 % de la secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms. de ident.: 4 a 7. El constructo de ácido nucleico puede comprender, además, una señal de localización nuclear unida operativamente.

En una modalidad, la planta producida por los métodos de la invención es una planta de sorgo que comprende una modificación objetivo en el gen de fertilidad masculina MS26, en donde el gen MS26 comprende una secuencia nucleótida seleccionada en el grupo que consiste en la sec. con núms. de ident.: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.

En otra modalidad de la invención, los métodos de la invención involucran una hacer, una modificación objetivo en el gen de fertilidad masculina, MS45, en el genoma de una planta, tal como, por ejemplo, una planta de maíz. Los métodos comprenden el contacto de al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en el gen MS45 con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo y, después, identificar al menos una célula que comprende una alteración de su genoma en la secuencia objetivo. Los métodos pueden comprender, además, la regeneración de una planta fértil que comprende la alteración .

Un ejemplo de una secuencia objetivo en el gen MS45 que puede usarse en esta modalidad se expone en sitio objetivo TS-MS45 (con núm. de ident . : 20). La secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de doble cadena puede seleccionarse en el grupo que consiste en: las secuencias nucleótidas que se exponen en la sec. con núms . de ident.: 22, 23, y 34; y una secuencia nucleótida que tiene una identidad de al menos 80 % de la secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms. de ident.: 22, 23, y 34. El constructo de ácido nucleico puede comprender, además, una señal de localización nuclear unida operativamente .

En este ejemplo puede usarse cualquier agente inductor de ruptura de cadena doble con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en esta secuencia objetivo: en una modalidad, puede usarse un primer polipéptido codificado por una secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident.: 22 y un segundo polipéptido codificado por la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident.: 23. El agente inductor de ruptura de cadena doble que tiene la capacidad de inducir rupturas de cadena doble en el sitio objetivo TS-MS45 (sec. con núm. de ident . : 20) puede introducirse en una planta como un constructo de nucleótido que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente. Cualquier promotor que se describe en la presente descripción o conocido en la técnica, que puede dirigir la expresión de la secuencia nucleótida unida operativamente que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente en la célula vegetal, puede usarse en los métodos de la presente invención. La secuencia nucleótida que codifica a los agentes de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente incluye, pero no se limita a, la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident.: 22, 23, o 34. El constructo de ácido nucleico puede comprender, además, una señal de localización nuclear unida operativamente .

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una planta que comprende en su genoma al menos un gen de fertilidad masculina con una modificación objetivo y descendientes de estos que comprenden al menos uno de los genes de fertilidad masculina con una modificación objetivo. Tales modificaciones objetivo comprenden las alteraciones en el gen de fertilidad masculina como se describió anteriormente. Las plantas de la invención pueden hacerse por los métodos que se describen en la presente descripción para hacer una modificación objetivo en el genoma de una planta que incluye, pero no se limita a, plantas fértiles que son heterocigotas para una mutación nula en un gen de fertilidad masculina, plantas estériles masculinas que son homocigotas para una mutación nula en el gen de la fertilidad masculina y plantas que comprenden una alteración en el gen de fertilidad masculina, en donde la alteración comprende la inserción de un transgen. En una modalidad de la invención, una planta de la invención comprende en su genoma la inserción de un transgen en el gen de fertilidad masculina y tal inserción es una mutación nula .

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un gen de fertilidad masculina con al menos una modificación objetivo. Tales modificaciones objetivo comprenden una o más alteraciones en un gen de fertilidad masculina como se describió anteriormente.

En un cuarto aspecto, la invención presente proporciona moléculas de ácido nucleico optimizadas para la planta aislada que codifican agentes inductores de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente, particularmente, un agente inductor de ruptura de cadena doble derivada de I-Crel, más particularmente un agente inductor de ruptura de cadena doble derivada de I-Creí que tiene la capacidad de inducir rupturas de cadena doble en el ADN de una secuencia objetivo TS-MS26 o TS- S45, más particularmente, un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente derivado de I-Creí que codifica una endonucleasa MS26 o una endonucleasa MS45 diseñada genéticamente. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleótida que se exponen en la sec. con núm. de ident.: 4, 5, 6, 7, 22, 23, o 34, secuencias nucleótidas y fragmentos y variantes de estos que codifican una endonucleasa MS26 diseñada genéticamente, una endonucleasa MS26+ diseñada genéticamente, y una endonucleasa MS26++ diseñada genéticamente o una endonucleasa MS45 diseñada genéticamente. En una modalidad de la invención, las moléculas de ácido nucleico comprenden secuencias nucleótidas que se han optimizado para la expresión en una planta de interés.

Las composiciones de la invención incluyen endonucleasas que son agentes de inducción de ruptura de cadena doble con capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en un reconocimiento especifico o secuencia objetivo en una molécula de ADN. Particularmente, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden secuencias nucleótidas que codifican endonucleasas. La invención abarca composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o prácticamente purificadas. Un polinucleótido o proteina "aislada" o" purificada" o una porción biológicamente activa de estos se encuentra práctica o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteina, tal como se encontró en su ambiente de origen natural. Por lo tanto, un polinucleótido o proteina aislada o purificada se encuentra sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o se encuentra sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Óptimamente, un polinucleótido "aislado" está libre de secuencias (óptimamente, las secuencias codificantes de proteínas) que flanquean el polinucleótido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en varias modalidades, el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de la secuencia nucleótida que flanquean naturalmente el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. Una proteína sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína con menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de esta se produce de manera recombinante, el medio de cultivo representa, óptimamente, menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de los precursores de sustancias químicas o sustancias químicas que no son las proteínas de interés.

Además la presente invención abarca, los fragmentos y variantes de los polinucleótidos y proteínas codificadas descritos de ese modo. Por "fragmento" se refiere a una porción del polinucleotido o una porción de la secuencia de aminoácidos y en consecuencia la proteína codificada de ese modo. Los fragmentos de un polinucleotido pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de una proteína ejemplificada y, en consecuencia, comprenden una endonucleasa activa especifica de la secuencia objetivo, particularmente una actividad de endonucleasa en el sitio objetivo TS-MS26 o TS-MS45, como se describe en la presente. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia nucleótida pueden encontrarse en el intervalo de por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 400 nucleótidos, y hasta la longitud total de polinucleótidos que codifican las proteínas de la invención.

El término "variantes" se refiere a secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende un polinucleotido que tiene deleciones (es decir, truncamientos) en los extremos 5' y/o 3'; deleción y/o adición de uno o más nucleótidos y uno o más sitios internos en el polinucleotido nativo; y/o sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en una secuencia nucleótida que se describen en la presente descripción. Para los polinucleótidos , variantes conservadoras incluyen las secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la endonucleasa de la invención. Las variantes de polinucleótidos incluyen, además, polinucleótidos de origen sintético, tales como los generados, por ejemplo, con el uso de mutagénesis dirigidas al sitio pero que codifican aún una proteina usada en la presente invención. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tienen por lo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de la secuencia con ese polinucleótido particular según los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otra parte de la presente descripción.

Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) se pueden evaluar, además, mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencias entre el polipéptido codificado por una variante del polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos cualquiera se puede calcular por medio del uso de los programas y parámetros de alineamiento de secuencias descritos en otra sección de la presente descripción. Si se evalúa cualquier par especifico de polinucleótidos de la invención por comparación del porcentaje de identidad de secuencias que comparten ambos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencias entre los dos polipéptidos codificados es por lo menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor.

"Variante de" proteina se refiere a una proteina derivada de la proteina natural por deleción (denominada truncamiento) o por adición de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteina natural; deleción y/o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteina natural; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteina nativa. Las variantes de proteínas que abarcan la presente invención son biológicamente activas, es decir, que aún tienen la actividad biológica deseada de la proteína natural, es decir, la actividad de nucleasa en el sitio objetivo TS-MS26 o TS-MS45, como se describe en la presente descripción. Las variantes biológicamente activas de la proteína de endonucleasa de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más con respecto a la secuencia de aminoácidos para la proteina natural según los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otra sección de la presente descripción. Una variante biológicamente activa de una proteina de la invención puede diferir de esa proteina por tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácidos.

Las proteínas de la invención se pueden alterar de varias maneras que incluyen sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para esas manipulaciones se conocen, generalmente, en la técnica. Por ejemplo, las variantes de las secuencias de aminoácidos y los fragmentos de las proteínas de endonucleasa pueden prepararse por mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones del polinucleótido se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente de los EE. UU. núm. 4,873,192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en estos. La guía en cuanto a las sustituciones de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), que se incorpora en la presente descripción como referencia. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.

Las variantes de polipéptidos mantendrán la actividad de nucleasa deseada en el sitio objetivo TS-MS26 o TS-MS45. Evidentemente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, óptimamente, no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Ver, publicación de solicitud de patente EP núm. 75.444.

No se pretende que las deleciones, inserciones y sustituciones de la secuencias de proteínas que abarca la presente invención produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando sea difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción que se realizará, una persona con experiencia en la técnica sabrá que el efecto se evaluará por medio de ensayos de evaluación rutinarios (Lucas et al. 2001 {Nucí. Acids Res. 29: 960-969).

Las variantes de polinucleótidos y proteínas abarcan, además, secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como barajado de ADN. Con tal procedimiento es posible manipular una o más secuencias de endonucleasas diferentes para crear una endonucleasa nueva que tenga las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprende regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y que pueden recombinarse homólogamente in vitro o in vivo. Las estrategias para tal barajado de ADN se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de los EE. UU. núms. 5,605,793 y 5,837,458.

Los métodos de la presente invención incluyen usar uno o más agentes inductores de ruptura de cadena doble. Un agente inductor de ruptura de cadena doble de la presente invención es cualquier agente que reconoce y/o se une a una secuencia de reconocimiento de polinucleótidos especifica para producir una ruptura en la secuencia objetivo en o cerca de la secuencia de reconocimiento. Los ejemplos de agentes inductores de ruptura de cadena doble incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas, recombinasas específicas del sitio, transposasas, topoisomerasas, nucleasas efectoras TAL y nucleasas con dedos de zinc, e incluyen derivados modificados, variantes y fragmentos de estas.

Una secuencia de reconocimiento es cualquier secuencia de polinucleótidos que se reconoce específicamente y/o se une a un agente inductor de ruptura de cadena doble. La longitud de la secuencia del sitio de reconocimiento puede variar e incluye, por ejemplo, las secuencias que tienen por lo menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21," 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más nucleótidos de longitud.

Es posible que el sitio de reconocimiento pueda ser palindrómico, es decir, la secuencia en una cadena se lee igual en la dirección opuesta en la cadena complementaria. El sitio de corte/cliva e podría estar dentro de la secuencia de reconocimiento o el sitio de corte/clivaj e podría estar fuera de la secuencia de reconocimiento. En otra variación, el clivaje podría ocurrir en posiciones de nucleótidos inmediatamente opuestas entre sí para producir un corte de extremos despuntado o, en otros casos, las incisiones podrían estar escalonadas para producir segmentos protuberantes monocatenarios llamados, además, "extremos adhesivos", que podría ser segmentos protuberantes en 5' o segmentos protuberantes en 3'. La secuencia de reconocimiento puede ser endógena o exógena. Cuando el sitio de reconocimiento es una secuencia endógena, puede ser una secuencia de reconocimiento reconocida por un agente inductor de ruptura de cadena doble nativo o de origen natural. Alternativamente, un sitio de reconocimiento endógeno podría ser reconocido y/o unido por un agente inductor de ruptura de cadena doble modificado o diseñado genéticamente o seleccionado para reconocer específicamente la secuencia de reconocimiento endógena para producir una ruptura de cadena doble. Un agente inductor de ruptura de cadena doble modificado puede derivarse de un agente inductor de ruptura de cadena doble natural o de origen natural o puede crearse o sintetizarse artificialmente.

Una gran variedad de métodos se encuentran disponibles para identificar las células que tienen un genoma alterado en o cerca de la secuencia de reconocimiento sin usar un fenotipo marcador evaluable. Tales métodos pueden observarse como el análisis directo de una secuencia de reconocimiento para detectar cualquier cambio en la secuencia de reconocimiento, que incluyen, pero no se limitan a, métodos de PCR, métodos de secuenciación, digestión de nucleasa, Southern blots y cualquier combinación de estos.

Las proteínas se pueden alterar de varias maneras que incluyen sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Generalmente, los métodos para tales manipulaciones son conocidos. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de la proteina o proteínas se pueden preparar por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y las alteraciones de secuencias nucleótidas incluyen, por ejemplo, Kunkel, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kunkel, et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; patente de los EE. UU. núm. 4, 873, 192; alker y Gaastra, eds. (1983) Techniques In Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en estos. Una guia con respecto a las sustituciones de aminoácidos que probablemente no afectan la actividad biológica de la proteína se encuentra, por ejemplo, en el modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati Biomed Res Found, Washington, D.C.). Se puede preferir las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. No se espera que las deleciones, inserciones y sustituciones conservadoras de aminoácidos produzcan cambios radicales en las características de la proteína y el efecto de cualquier sustitución, deleción, inserción o combinación de estos se puede evaluar mediante ensayos de evaluación rutinarios. Los ensayos para analizar la actividad inductora de ruptura de cadena doble son conocidos y determinan, generalmente, la actividad global y la especificidad del agente en los sustratos de ADN que contienen sitios de reconocimiento.

Cualquier meganucleasa puede usarse como agente inductor de ruptura de cadena doble, que incluye, pero no se limita a, I-Scel, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-Creí, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Tlil, I-Ppol, PI-PspI, F-Scel, F-Scell, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-Ddill, I-DirI, I-Dmol, I-Hmul, I-HmuII, I-HsNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-Nitl, I-Njal, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-Scal, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803l, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdelP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetalP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil, PI-Tlill, o cualquier variante o derivado de estos.

Una recombinasa especifica del sitio, conocida, además, como recombinasa, es un polipéptido que cataliza la recombinación conservadora especifica del sitio entre sus sitios de recombinación compatibles e incluye polipéptidos naturales asi como derivados, variantes y/o fragmentos que retienen la actividad, y polinucleótidos naturales, derivados, variantes y/o fragmentos que codifican una recombinasa que retiene la actividad.

Una etapa en el proceso de recombinación incluye el clivaje de polinucleótidos en o cerca del sitio de reconocimiento. Esta actividad de clivaje se puede usar para producir una ruptura de cadena doble. Para revisiones de recombinasas de sitio específico y sus sitios de reconocimiento, consulte Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; y Sadowski, (1993) FASEB 7:760-7.

La familia de integrasas de recombinasas tiene más de cien miembros e incluye, por ejemplo, FLP, Cre, lambda integrasa, y R. La familia de integrasas se agrupó en dos clases en base a la estructura de los sitios activos, recombinasas de serina y recombinasas de tirosina. La familia de tirosinas, que incluye Cre, FLP, SSV1 y lambda (?) integrasa, usa el grupo hidroxilo de la tirosina catalítica para un ataque nucleofilico en el enlace fosfodiéster del ADN. Típicamente, los miembros de la familia de tirosinas inicialmente cortan el ADN que, después, forma una ruptura de cadena doble. En la familia de serina recombinasas, que incluye phiC31 (OC31) integrasa, un residuo de serina conservada forma un enlace covalente para el sitio objetivo de ADN (Grindley et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16). Para otros miembros de la familia de integrasas consulte, por ejemplo, Esposito et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-14 y Abremski et al., (1992) Protein Eng 5:87-91.

Otros sistemas de recombinación incluyen, por ejemplo, el bacteriófago phiC31 de streptomycete (Kuhstoss, et al., (1991) J Mol Biol 20:897-908); el sistema de recombinación especifica de sitio SSV1 de Sulfolobus shibatae (Maskhelishvili, et al., (1993) Mol Gen Genet 237:334-42); y un sistema de integración a base de integrasas retrovirales (Tanaka, et al., (1998) Gene 17:67-76) .

Algunas veces la recombinasa es una que no requiere cofactores o un sustrato superenrollado, que incluyen, pero no se limitan a, Cre, FLP y derivados activos, variantes o fragmentos de estos. La FLP recombinasa cataliza una reacción especifica del sitio durante la replicación de ADN y la amplificación del plásmido de dos micrones de S. cerevisiae. La FLP recombinasa cataliza la recombinación especifica del sitio entre dos sitios FRT. La proteina FLP se ha clonado y expresado (Cox, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:4223-7). Los derivados, variantes y fragmentos funcionales de FLP son conocidos (Buchholz, et al., (1998) Nat Biotechnol 16:617-8, Hartung, et al., (1998) J Biol Chem 273:22884-91, Saxena, et al., (1997) Biochim Biophys Acta 1340:187-204, y Hartley, et al., (1980) Nature 286:860-4).

La bacteriófago recombinasa Cre cataliza la recombinación especifica del sitio entre dos sitios (Guo, et al., (1997) Nature 389:40-6; Abremski, et al., (1984) J Biol Chem 259:1509-14; Chen, et al., (1996) Somat Cell Mol Genet 22:477-88; Shaikh, et al., (1977) J Biol Chem 272:5695-702; y, Buchholz, et al., (1998) Wat Biotechnol 16:617-8). Los ejemplos de recombinasas de sitio específico que pueden usarse para producir una ruptura de cadena doble en una secuencia de reconocimiento, que incluye, por ejemplo, FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31, HK022, y R. Los ejemplos de sistemas de recombinación específica del sitio usados en plantas se pueden encontrar en la patente de los EE . UU. núm. 5,929,301; patente de los EE. UU . núm. 6,175,056; patente núm. 099/25821; patente de los EE. UU. núm. 6,331,661; patente núm. W099/25855; patente núm. W099/25841 y patente núm. WO99/25840, cuyos contenidos se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los métodos para modificar la cinética, la interacción de cofactores y los requerimientos, expresión, condiciones óptimas y/o especificidad del sitio de reconocimiento, y la evaluación para actividad de recombinasas y variantes son conocidos, por ejemplo, iller, et al., (1980) Cell 20:721-9; Lange-Gustafson and Nash, (1984) J Biol Chem 259:12724-32; Christ, et al., (1998) J Mol Biol 288:825-36; Lorbach, et al., (2000) J Mol Biol 296:1175-81; Vergunst, et al., (2000) Science 290:979-82; Dorgai, et al., (1995) J Mol Biol 252:178-88; Dorgai, et al., (1998) J Mol Biol 277:1059-70; Yagu, et al., (1995) J Mol Biol 252:163-7; Sclimente, et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:5044-51; Santoro and Schultze, (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:4185-90; Buchholz and Stewart, (2001) Nat Biotechnol 19:1047-52; Voziyanov, et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:1656-63; Voziyanov, et al., (2003) J Mol Biol 326:65-76; Klippel, et al., (1988) EMBO J 7:3983-9; Arnold, et al., (1999) EMBO J 18:1407-14; patente núm. O03/08045; patente núm. O99/25840; y la patente núm. W099/25841. Los sitios de reconocimiento se encuentran en el intervalo de aproximadamente 30 nucleótidos, los sitios mínimos, a algunos cientos de nucleótidos.

Se puede usar cualquier sitio de reconocimiento para una recombinasa, que incluyen los sitios de origen natural y las variantes. Las variantes de los sitios de reconocimiento son conocidas, ver, por ejemplo, Hoess, et al., (1986) Nucleic Acids Res 14:2287-300; Albert, et al., (1995) Plant J 7:649-59; Thomson, et al., (2003) Génesis 36:162-7; Huang, et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:443-8; Siebler and Bode, (1997) Biochemistry 36:1740-7; Schlake and Bode, (1994) Biochemistry 33:12746-51; Thygarajan, et al., (2001) Mol Cell Biol 21:3926-34; Umlauf and Cox, (1988) EMBO J 7:1845-52; Lee and Saito, (1998) Gene 216:55-65; patente núm. WO01/23545; patente núm. 099/25821; patente núm.

W099/25851; patente núm. WO01/11058; patente núm. WO01/07572 y la patente de los EE. UU. núm. 5,888,732.

Una recombinasa se puede proporcionar por medio de un polinucleótido que codifica la recombinasa o se puede proporcionar por medio de un polinucleótido modificado que codifica la recombinasa. Por ejemplo, el polinucleótido (que codifica una recombinasa) se puede modificar para sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural o se puede modificar para sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta de maiz o frijol de soja, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural.

Las nucleasas efectoras TAL son una clase nueva de nucleasas especificas de secuencias que pueden usarse para producir rupturas de cadena doble en secuencias objetivo especificas en el genoma de una planta u otro organismo. Las nucleasas efectoras TAL se crean al fusionar un efector tipo activador de transcripción (TAL) natural o modificado, o una parte funcional de este, con el dominio catalítico de una endonucleasa, tal como, por ejemplo, FokI. El dominio de unión al ADN del efector TAL modular facilita el diseño de proteínas con potencialmente cualquier especificidad específica de reconocimiento de ADN. Por lo tanto, los dominios de unión al ADN de las nucleasas efectoras TAL pueden modificarse para reconocer sitios objetivo de ADN específicos y, por lo tanto, pueden usarse para producir rupturas de cadena doble en las secuencias objetivo deseadas. Ver la patente núm. WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas .1013133107 ; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi: 10.1093/nar/gkq704; y Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148; las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.

Las transposasas son polipéptidos que median la transposición de un transposón de un lugar en el genoma a otro. Las transposasas típicamente inducen rupturas de cadena doble para escindir el transposón, reconocer repeticiones subterminales y unir los extremos del transposon escindido; en algunos sistemas también se requieren otras proteínas para unir los extremos durante la transposición.

Los ejemplos de transposones y transposasas incluyen, pero no se limitan a, los elementos Ac/Ds, Dt/rdt, Mu- l/Mn, y Spm(En)/dSpm del maíz, elementos Tam de snapdragon, el transposón Mu de bacteriófagos, transposones bacterianos (Tn) y secuencias de inserción (IS) , elementos Ty de levadura (retrotransposón) , elementos Tal de Arabidopsis (retrotransposón) , del elemento P de Drosophila (Gloor, et al., (1991) Science 253:1110-1117), elementos Copia, Mariner y Minos de Drosophila, elementos Hermes de la mosca doméstica, elementos PiggyBack de Trichplusia ni, elementos Tcl de C. elegans, y elementos IAP de ratones (retrotransposón) . En algunos ejemplos, la transposasa se proporciona por medio de un polinucleótido que codifica la transposasa .

Es posible modificar el polinucleótido que codifica la transposasa al sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta, en comparación con la secuencia de polinucleótidos , de origen natural al sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta de maíz o frijol de soja, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural.

Las topoisomerasas de ADN modulan el ADN secundario y estructuras de orden mayor y las funciones principalmente relacionadas con la replicación, transcripción, recombinación y reparación. Las topoisomerasas comparten dos características: (i) la capacidad para clivar y resellar la cadena principal de enlaces fosfodiéster de ADN en dos reacciones de transesterificación sucesivas; y (ii) una vez que se forma un intermedio de ADN clivado a topoisomerasa, la enzima permite que los extremos cortados del ADN se separen, lo cual permite la separación de otro segmento de ADN monocatenario o bicatenario Las topoisomerasas de ADN se pueden clasificar en tres familias independientes evolucionarías: tipo IA, tipo IB y tipo II.

Aquellas que clivan una cadena de ADN y permiten cambios de una sola etapa en el número de unión de ADN circular se definen como topoisomerasas de ADN tipo I. La topoisomerasa I y la topoisomerasa III de Escheríchia coli, la topoisomerasa III de Saccharomyces cerevisiae y la girasa inversa pertenecen a la subfamilia de tipo IA o tipo 1-5' como la proteína conectora es para un fosfato en 5' en el ADN. El prototipo de las enzimas tipo IB o 1-3' se encuentran en todos los organismos eucariotas y también en la topoisomerasa I del virus vaccinia, en donde la proteina se une a un fosfato 3' . A pesar de las diferencias en el mecanismo y la especificidad entre las enzimas bacterianas y eucariotas, la topoisomerasa I del ADN de levadura puede complementar un mutante de la topoisomerasa I mutante (Bjornsti, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:8971-5). Las topoisomerasas tipo IA relajan negativamente el ADN superenrollado y requieren magnesio y una región monocatenaria de ADN. Las topoisomerasas IB relajan tanto positiva como negativamente el ADN superenrollado con la misma eficiencia y no requieren una región monocatenaria de ADN ni iones metálicos para funcionar.

La familia de tipo II incluye girasa de ADN de E. coli, topoisomerasa IV de E. coli (par E) , topoisomerasas eucariotas tipo II y topoisomerasa VI arcaica. Las enzimas tipo II son homodiméricas (topoisomerasa II eucariota) o tetramérica (girasa) que clivan ambas cadenas de un bicatenario. Los sitios de corte preferidos son conocidos para topoisomerasas disponibles.

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son agentes inductores de ruptura de cadena doble modificados compuestos de dominio de unión al ADN con dedos de zinc y un dominio de agente inductor de ruptura de cadena doble. La especificidad del sitio de reconocimiento la confiere el dominio con dedos de zinc, que comprende, típicamente, dos, tres o cuatro dedos de zinc, por ejemplo, con una estructura C2H2; sin embargo, otras estructuras con dedos de zinc son conocidas y han sido modificadas. Los dominios con dedos de zinc son flexibles para diseñar polipéptidos que unen específicamente una secuencia de reconocimiento de polinucleótidos seleccionada. Las ZFN consisten en un dominio con dedos de zinc de unión al ADN modificado unido al dominio de endonucleasa no específico, por ejemplo, dominio de nucleasa a partir de una endonucleasa tipo lis tal como FokI. Las funcionalidades adicionales pueden unirse al dominio de unión con dedos de zinc, que incluyen dominios activadores transcripcionales, dominios represores de transcripción y metilasas. En algunos ejemplos se requiere la dimerización del dominio de nucleasa para la actividad de clivaje. Cada dedo de zinc reconoce tres pares de bases consecutivas en el ADN objetivo. Por ejemplo, en donde un dominio de 3 dedos reconoció una secuencia de 9 nucleótidos contiguos, con un requisito de dimerizacion de la nucleasa, dos grupos de tripletes de dedos de zinc se usan para unir una secuencia de reconocimiento de 18 nucleótidos. Una secuencia de reconocimiento de 18 nucleótidos tiene la longitud suficiente para ser única en el genoma de un mamífero (418 = 6.9 x 1010) .

Hasta la fecha, los módulos con dedos de zinc de diseño reconocen predominantemente los tripletes GNN y ANN (Dreier, et al., (2001) J Biol Chem 276:29466-78; Dreier, et al., (2000) J Mol Biol 303:489-502; Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6), pero también se conocen ejemplos con el uso de tripletes CNN o TNN (Dreier, et al., (2005) J Biol Chem 280: 35588-97; Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8). Ver, además, Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Segal, (2002) Methods 26:76-83; Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; consorcio de dedos de zinc (sitio web www.zincfinger.org); Pabo, et al., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40; Wolfe, et al., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212; Segal y Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7 ; Segal, et al., (2003) Biochemistry 42:2137-48; Beerli and Barbas, (2002) Wat Biotechnol 20:135-41; Carroll, et al., (2006) Nature Protocole 1:1329; Ordiz, et al., (2002) Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 99:13290-5; Guan, et al. , (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:13296-301; patente núm. WO200209908 ; patente núm. O00/42219; patente núm. WO02/42459; patente núm. WO2003062455 ; publicación de solicitud de patente núm. 20030059767; publicación de solicitud de patente núm. 2003/0108880; patente de los EE. UU. núms . 6,140,466, 6,511,808 y 6,453,242.

Alternativamente, los dominios de unión al ADN con dedos de zinc modificados pueden unirse a otros agentes inductores de ruptura de cadena doble o derivados de estos que retienen la actividad de corte/clivaj e de ADN. Por ejemplo, este tipo de fusión se puede usar para dirigir el agente inductor de ruptura de cadena doble hacia un sitio objetivo diferente para alterar la ubicación del sitio de corte o clivaje para dirigir el agente inductor hasta un sitio objetivo más corto o para dirigir el agente inductor hasta un sitio objetivo más largo. En algunos ejemplos, un dominio de unión al ADN con dedos de zinc se une a una recombinasa específica del sitio, transposasa, topoisomerasa o un derivado de estas que retiene la actividad de corte y/o clivaje de ADN.

Es posible proporcionar una nucleasa con dedos de zinc por medio de un polinucleótido que codifica la nucleasa con dedos de zinc. Este polinucleótido que codifica la nucleasa con dedos de zinc se puede modificar al sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural o al sustituir los codones que tienen una frecuencia de uso mayor en una planta de maíz o frijol de soja, en comparación con la secuencia de polinucleótidos de origen natural.

Una homología o identidad de secuencias suficiente indica que dos secuencias de polinucleótidos tienen suficiente similitud estructural para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homologa. La similitud estructural incluye la longitud total de cada fragmento de polinucleótidos, asi como la similitud de secuencias de los polinucleótidos. La similitud de secuencias se puede describir por medio del porcentaje de identidad de secuencias en toda la longitud de las secuencias y/o por las regiones conservadas que comprenden similitudes localizadas tales como nucleótidos contiguos que tienen 100 % de identidad de secuencias y el porcentaje de identidad de secuencias con una porción de la longitud de las secuencias.

La cantidad de homología o identidad de secuencias compartida por un polinucleótido objetivo y un donante puede variar e incluye las longitudes totales y/o regiones que tienen valores integrales de unidad en los intervalos de aproximadamente 1-20 bp, 20-50 bp, 50-100 bp, 75-150 bp, 100-250 bp, 150-300 bp, 200-400 bp, 250-500 bp, 300-600 bp, 350-750 bp, 400-800 bp, 450-900 bp, 500-1000 bp, 600-1250 bp, 700-1500 bp, 800-1750 bp, 900-2000 bp, 1-2.5 kb, 1.5-3 kb, 2-4 kb, 2.5-5 kb, 3-6 kb, 3.5-7 kb, 4-8 kb, 5-10 kb, o hasta y que incluyen la longitud total del sitio objetivo. Estos intervalos incluyen todos los enteros en el intervalo, por ejemplo, el intervalo de 1-20 bp incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 bp. La cantidad de homología se puede describir, además, por el porcentaje de identidad de secuencias en toda la longitud alineada de los dos polinucleótidos que incluye el porcentaje de identidad de secuencias de aproximadamente por lo menos 50 %, 5 % 60 %, 65 %, 70 71 ¿ 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 81 o"o. Q 9"o- QO "3 9- 84 % , 85 % , 86 %, 87 %, 88 % , 89 %, 90 o o / 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 o¦ Una homología suficiente incluye cualquier combinación de longitud de polinucleótidos, el porcentaje global de identidad de secuencias y, opcionalmente, regiones conservadas de nucleótidos contiguos o el porcentaje local de identidad de secuencias, por ejemplo, la homología suficiente se puede describir como una región de 75-150 bp que tiene por lo menos 80 % de identidad de secuencias con una región del locus objetivo. La homología suficiente se puede describir, además, por medio de la capacidad prevista de dos polinucleótidos para hibridizarse específicamente bajo condiciones de rigurosidad alta, ver, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) ; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds (1994) Current Protocols, (Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc) ; y Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, (Elsevier, New York) .

Se puede usar cualquier medio para juntar los diversos componentes necesarios para alterar el genoma de una célula de una planta dicotiledónea. Por ejemplo, en sistemas in vitro, el agente inductor de ruptura de cadena doble y el polinucleótido o polinucleótidos que comprenden el sitio o sitios de reconocimiento se pueden proporcionar al poner en contacto los componentes bajo las condiciones adecuadas para clivaje de ADN.

Alternativamente, se conoce una gran variedad de métodos para la introducción de secuencias nucleótidas y polipéptidos en un organismo, que incluyen, por ejemplo, la transformación, el cruce sexual y la introducción del polipéptido, ADN o ARNm en la célula.

Los métodos para contactar, proporcionar y/o introducir una composición en diversos organismos son conocidos e incluyen, pero no se limitan a, los métodos de transformación estable, los métodos de transformación transitoria, los métodos mediados por virus y la reproducción sexual. La transformación estable indica que el polinucleótido introducido se integra en el genoma del organismo y tiene la capacidad de heredarse por progenie de este. La transformación transitoria indica que la composición introducida se expresa únicamente temporalmente o que está presente en el organismo.

Los protocolos para introducir polinucleótidos y polipéptidos en las plantas pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal objetivo para la transformación, como monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los métodos adecuados para introducir polinucleótidos y polipéptidos en las células vegetales y la inserción posterior en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-34 y patente de los EE. UU. núm. 6,300,543), transformación del meristema (patente de los EE. UU. núm. 5,736,369), electroporación (Riggs, et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-6, transformación mediada por Agrobacterium (patentes de los EE. UU. núms. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J 3:2717-22), y aceleración de partículas balísticas (patentes de los EE. UU. núms. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; 5,932,782; Tomes, et al., (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells vía Microprojectile Bombardment" in Plant Cell , Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg & Phillips (Springer-Verlag, Berlin) ; McCabe, et al. , (1988) Biotechnology 6:923-6; Weissinger, et al., (1988) Ann Rev Genet 22:421-77; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al., (1988) Plant Physiol 87:671-4 (frijol de soja); Finer and McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P: 175-82 (frijol de soja); Singh, et al., (1998) Theor Appl Genet 96:319-24 (frijol de soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-40 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-9 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-63 (maíz); patentes de los EE. UU. núms. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol 91:440-4 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-9 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature 311:763-4; patente de los EE. UU. núm. 5,736,369 (cereales); Bytebier, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-9 (Liliaceae) ; De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York), pág. 197-209 (polen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Rep 9:415-8) y Kaeppler, et al., (1992) Theor Appl Genet 84:560-6 (transformación mediada por filamentos); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505 (electroporacion); Li, et al., (1993) Plant Cell Rep 12:250-5; Christou y Ford (1995) Annals Botany 75:407-13 (arroz) y Osjoda, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:745-50 (maíz por medio de Agrobacterium tumefaciens) .

Alternativamente, los polinucleótidos se pueden introducir en las plantas al poner las plantas en contacto con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos incluyen incorporar un polinucleótido dentro de una molécula de ADN o ARN viral. En algunos ejemplos, un polipéptido de interés puede sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteina viral, que, después, se procesa por proteolisis in vivo o in vitro para producir la proteina recombinante deseada. Los métodos para introducir los polinucleótidos en plantas y para expresar una proteina codificada allí que incluyen moléculas de ADN o ARN viral son conocidos, ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 y 5,316,931. Los métodos de transformación transitoria incluyen, pero no se limitan a, la introducción de polipéptidos, tales como un agente inductor de ruptura de cadena doble, directamente en el organismo, la introducción de polinucleótidos, tales como polinucleótidos de ADN y/o ARN, y la introducción del transcrito de ARN, tal como un ARNm que codifica un agente inductor de ruptura de cadena doble, en el organismo. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o el bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen Genet 202:179-85; Nomura, et al., (1986) Plant Sci 44:53-8; Hepler, et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2176-80; y, Hush, et al., (1994) J Cell Sci 107:775-84.

Los métodos convencionales de aislamiento de ADN, purificación, clonación molecular, construcción de vectores y verificación/caracterización están bien establecidos, ver, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) . Los vectores y constructos incluyen plásmidos circulares y polinucleótidos lineales que comprenden un polinucleótido de interés y, opcionalmente, otros componentes que incluyen conectores, adaptadores, regiones reguladoras, intrones, sitios de restricción, potenciadores, aisladores, marcadores seleccionables, secuencias nucleótidas de interés, promotores y/u otros sitios que ayudan en la construcción o análisis de vectores. En algunos ejemplos, un sitio de reconocimiento y/o sitio objetivo puede estar contenido dentro de un intrón, secuencia codificante, UTR 5', UTR 3', y/o regiones reguladoras .

Se puede usar cualquier promotor y se puede seleccionar en base al resultado deseado. Un promotor es una región de ADN involucrado en el reconocimiento y unión de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un promotor vegetal es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales; para una revisión de los promotores de plantas, consulte, Potenza, et al., (2004) In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor principal del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. 099/43838 y la patente de los EE. UU. núm. 6,072,050; el promotor principal CaMV 35S (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-2); actina del arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-71); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-32; Christensen, et al., (1992) Plant Mol Biol 18:675-89); pEMU (Last, et al., (1991) Theor Appl Genet 81:581-8); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J 3:2723-30); promotor ALS patente de los EE . UU . núm. 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos se describen en, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611. En algunos ejemplos, se puede usar un promotor inducible. Los promotores inducibles por patógenos indujeron la siguiente infección por un patógeno que incluyen, pero no se limitan a, los que regulan la expresión de proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 , 3-glucanasa, quitinasa, etc.

Los promotores regulados por sustancias químicas pueden usarse para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. El promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión génica, o un promotor reprimible por sustancias químicas, en donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión génica. Los promotores inducibles por sustancias químicas incluyen, pero no se limitan a, promotor In2-2 de maíz, activado por protectores herbicidas de benceno sulfonamida (De Veylder, et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), el promotor GST de maíz (GST-II-27, patente núm. WO93/01294), activado por compuestos electrofílicos hidrofóbicos usados como herbicidas pre-emergentes y el promotor PR-la de tabaco (Ono, et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7) activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por sustancias químicas incluyen promotores que responden a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides (Schena, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-5; McNellis, et al., (1998) Plant J 14:247-257); promotores inducibles de tetraciclina y represores de tetraciclina (Gatz, et al., (1991) Mol Gen Genet 227 : 229-37 ; patentes de los EE. UU. núms. 5,814,618 y 5,789,156).

Los promotores específicos del tejido se pueden usar para dirigir la expresión mejorada dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores específicos del tejido incluyen, por ejemplo, Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen, et al., (1997) Mol Gen Genet 254:337-43; Russell, et al., (1997) Transgenic Res 6:157-68; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol 112:1331-41; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol 112:525-35; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol 112:513-524; Lam, (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-96; and Guevara-García, et al., (1993) Plant J 4:495-505. Los promotores específicos de hojas incluyen, por ejemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J 12:255-65; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol 35:773-8; Gotor, et al., (1993) Plant J 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1129-38; Matsuoka, et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:9586-90; Simpson, et al., (1958) EMBO J 4:2723-9; Timko, et al., (1988) Nature 318:57-8. Los promotores específicos de la raíz incluyen, por ejemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18 (gen de glutamina sintasa específico de la raíz de frijol de soja) ; Miao, et al., (1991) Plant Cell 3:11-22 (glutamina sintetasa citosólica (GS) ) ; Keller and Baumgartner, (1991) Plant Cell 3:1051-61 (elemento de control específico de la raíz en el gen GRP 1.8 de las judías verdes); Sanger, et al., (1990) Plant Mol Biol 14:433-43 (promotor específico de la raíz de manopina sintasa (MAS) de A. tumefaciens) ; Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2:633-41 (promotores específicos de la raíz aislados de Parasponia andersonii y Trema tomentosa) ; Leach and Aoyagi, (1991) Plant Sci 79:69-76 (genes inductores de la raíz rolC y rolD de A. rhizogenes) ; Teeri, et al., (1989) EMBO J 8:343-50 (genes TR1 y TR2 inducidos por devanado de Agrobacterium) ; promotor del gen VÍEN0D-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72); y promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91; gen de faseolina (Murai, et al., (1983) Science 23:476-82; Sengopta-Gopalen, et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3320-4). Ver, además, las patentes de los EE. UU. núms . 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 y 5, 023, 179.

Los promotores preferidos de las semillas incluyen tanto los promotores específicos de las semillas activos durante el desarrollo de semillas, así como los promotores de germinación de semillas activos durante la germinación de semillas. Ver, Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108. Los promotores preferencíales de las semillas incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citocinina) ; cZ19Bl (zeína de maíz de 19 kDa) ; y milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (patente núm. WO00/11177; y patente de los EE. UU. núm. 6,225,529). Para las plantas dicotiledóneas, los promotores preferencíales de las semillas incluyen, pero no se limitan a, ß-faseolina del frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de frijol de soja, cruciferina y similares. Para las plantas monocotiledóneas, los promotores preferencíales de las semillas incluyen, pero no se limitan a, la zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, gamma zeína de 27 kDa, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, oleosina y nucí. Ver, además, la patente núm. WO00/12733, en donde se describen los promotores preferenciales de las semillas de los genes END1 y END2.

Un marcador fenotipico es un marcador evaluable o seleccionable que incluye marcadores visuales y marcadores seleccionables ya sea un marcador seleccionable positivo o negativo. Se puede usar cualquier marcador fenotipico. Específicamente, un marcador seleccionable o evaluable comprende un fragmento de ADN que permite identificar o seleccionar para o contra una molécula o una célula que lo contiene, frecuentemente, en condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, pero que no se limita a, la producción de ARN, péptido o proteína, o pueden proporcionar un sitio de unión para ARN, péptidos, proteínas, compuestos inorgánicos y compuestos orgánicos o composiciones y similares.

Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, segmentos de ADN que comprenden sitios con enzimas de restricción; los segmentos de ADN que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos tóxicos de alguna otra manera que incluyen antibióticos, tales como, espectinomicina, ampicilina, canamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) ) ; Los segmentos de ADN que codifican productos que hacen falta de cualquier otra manera en la célula receptora (por ejemplo, genes de ARNt, marcadores auxotróficos ) ; Los segmentos de ADN que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotipicos, tales como ß-galactosidasa, GUS; proteínas fluorescentes, tales como proteina fluorescente verde (GFP) , ciano (CFP) , amarillo (YFP) , verde (RFP) y proteínas de superficie celular) ; la generación de nuevos sitios de iniciadores para PCR (por ejemplo, la yuxtaposición de dos secuencias de ADN no yuxtapuestas previamente) , la inclusión de secuencias de ADN no activadas o activadas con una endonucleasa de restricción u otra enzima modificadora de ADN, sustancia química, etc.; y la inclusión de una secuencia de ADN requerida para una modificación objetivo (por ejemplo, metilación) que permite su identificación .

Los marcadores selecciónateles adicionales incluyen genes que confieren resistencia a los compuestos herbicidas, tales como el glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2 , 4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver, por ejemplo, Yarranton, (1992) Curr Opin Biotech 3:506-11; Christopherson, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6314-8; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol Microbiol 6:2419-22; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-66; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-12; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-22; Deuschle, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5400-4; Fuerst, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2549-53; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-3; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1917-21; Labow, et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3343-56; Zambretti, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-6; Baim, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-6; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:4647-53; Hillen and issman, (1989) Topics Mol Struc Biol 10:143-62; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:1591-5; Kleinschnidt , et al., (1988) Biochemistry 27:1094-104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-51; Oliva, et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913-9; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí, et al., (1988) Nature 334:721-4.

Las células que tienen la secuencia introducida se pueden cultivar o regenerarse en plantas con el uso de condiciones convencionales; ver, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Rep 5:81-4. Después, estas plantas se pueden cultivar y polinizar con la misma cepa transformada o con una cepa transformada o no transformada diferente y la progenie resultante que tiene la característica deseada y/o que comprende el polinucleótido o polipéptido introducido identificado. Dos o más generaciones se pueden cultivar para asegurar que el polinucleótido se mantiene y se hereda de manera estable, y las semillas se cultivan.

Se puede usar cualquier planta, que incluyen las plantas monocotiledóneas y las plantas dicotiledóneas. Los ejemplos de las plantas monocotiledóneas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, maiz (Zea mays) , arroz {Oryza sativa) , centeno (Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla ( Pennisetum glaucum) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo cola (Setaria itálica) , mijo africano (Eleusine coracana) ) , trigo (Triticum aestivum) , caña de azúcar (Saccharum spp.) , avena (Avena), cebada (Hordeum) , piña (Ananas comosus) , banana (Musa spp. ) , palma, plantas ornamentales, y céspedes. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, frijol de soja (Glycine max) , cañóla (Brassica napus y B. campestris) , alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana tabacum) , Arabidopsis (Arabídopsis thaliana) , girasol (Helianthus annuus) , algodón (Gossypium arboreum) , y cacahuate (Arachis hypogaea) , tomate (Solanum lycopersicum) , patatas (Solanum tuberosum) etc.

Los transgenes, moléculas de ADN recombinante, secuencias de ADN de interés y polinucleótidos de interés pueden comprender uno o más genes de interés. Tales genes de interés pueden codificar, por ejemplo, una proteina que proporciona una ventaja agronómica a la planta. Los genes de interés pueden ser el reflejo de los mercados comerciales y el interés de aquellos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y, como las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, emergerán también nuevos cultivos y tecnologías. Adicionalmente, ya que el conocimiento de los rasgos y características agronómicas tales como rendimiento y heterosis aumenta, la selección de los genes para la transformación cambiará en correspondencia. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes involucrados en la información, tales como dedos de zinc, los involucrados en la comunicación, tales como las quinasas, y los involucrados en todas las células, tales como proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas, esterilidad, características del grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, generalmente, los involucrados en el metabolismo del aceite, almidón, carbohidratos o nutrientes, así como los que afectan el tamaño del grano, la carga de sacarosa y similares.

Los rasgos agronómicamente importantes, tales como contenido de aceite, almidón y proteina, pueden alterarse genéticamente además del uso de métodos tradicionales de cultivo. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oléico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y, además, modificar el almidón. Las modificaciones de la proteina hordotionina se describen en las patentes de los EE. UU. núms. 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802, y 5,990,389, incorporadas en la presente descripción como referencia en su totalidad. Otro ejemplo es la proteina de semillas ricas en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S del frijol de soja que se describe en la patente de los EE. UU. núm. 5,850,016, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, que se describe en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los derivados de las secuencias codificantes pueden realizarse por mutagénesis especifica al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica la polipéptido de cebada de alto contenido de lisina (BHL) deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, solicitud de patente de los EE. UU. con serie núm. 08/740, 682, presentada el 1 de noviembre de 1996, y la patente núm. WO 98/20133, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Otras proteínas incluyen proteínas de plantas ricas en metionina como las de semillas de girasol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Apple hite (/American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pág. 497-502; incorporadas en la presente descripción como referencia) ; trigo (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; incorporadas en la presente descripción como referencia) ; y arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . Otros genes agronómicamente importantes codifican el látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a los insectos pueden codificar la resistencia a las plagas que tienen una gran capacidad de adherencia, tales como gusano de la raíz, gusano cortador, taladro europeo del maíz y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los EE. UU . núms . 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); y similares.

Los genes que codifican características de resistencia a la enfermedad incluyen genes de desintoxicación, tales como genes contra la fumonosina (patente de los EE. UU. núm. 5, 792, 931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y similares .

Los rasgos de resistencia a los herbicidas pueden incluir genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS) , particularmente, los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que producen tal resistencia, particularmente, las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) ; glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; ver, por ejemplo, la publicación de los EE. UU. núm. 20040082770 y la patente núm. WO 03/092360) ; u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica para la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican para la resistencia al herbicida clorsulfurón .

Los genes de esterilidad pueden codificarse, además, en un cásete de expresión y proporcionan una alternativa al desespigamiento físico. Los ejemplos de genes usados de esa manera incluyen genes específicos del tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tales como QM, descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5,583,210. Otros genes incluyen las quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofitico masculino o femenino. Puede llevarse a cabo la interferencia con la formación, función o dispersión de polen al interrumpir la acumulación de almidón, tal como se describe en las patentes de EE . UU. núms . 7,969,405 y 7,612,251.

La calidad del grano se refleja en rasgos tales como los niveles y tipos de aceites, si son saturados e insaturados, la calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y los niveles de celulosa. En el maiz, las proteínas de hordotionina modificada se describen en las patentes de EE. UU. núms. 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802, y 5,990,389.

Los rasgos comerciales pueden codificarse, además, en un gene o genes que pudieran aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol, o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos, tales como los descritos en la patente de los EE. UU . núm. 5, 602, 321. Los genes tales como ß-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA) .

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales así como de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente, las proteínas modificadas que tienen una distribución mejorada de aminoácidos para mejorar el valor nutriente de la planta. Esto se logra por la expresión de tales proteínas que tienen un contenido mejorado de aminoácidos.

Los transgenes, moléculas de ADN recombinante, secuencias de ADN de interés, y polinucleótidos de interés pueden comprender una o más secuencias de ADN para el silenciamiento de genes. Los métodos para silenciamiento de genes que incluye la expresión de las secuencias de ADN en la planta son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, cosupresión, supresión no codificante, interferencia de ARN bicatenario (ARNbc) , interferencia de ARN en horquilla (ARNhp) , interferencia de ARN en horquilla que contienen intrones (ihpRNA), silenciamiento génico transcripcional e interferencia de microARN (miARN) .

La cosupresión se pueden usar para inhibir la expresión de los genes de las plantas para producir plantas que tienen niveles indetectables de proteína para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión puede usarse, además, para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,942,657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk et al (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63:753-763; y las patentes de los EE. UU. núms. 5,034,323, 5,283,184, y 5,942,657; incorporadas en la presente descripción como referencia. La eficacia de la cosupresión puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3 a la secuencia codificante y 5 de la señal de poliadenilacion. Ver la publicación de patente de los EE. UU. núm. 20020048814, incorporada en la presente descripción como referencia. Típicamente, tal secuencia nucleótida tiene la similitud sustancial de secuencias para la secuencia de la transcripción del gen endógeno, óptimamente, mayor que aproximadamente 65 % de identidad de secuencias, de manera más óptima, mayor que aproximadamente 85 % de identidad de secuencias y, más óptimamente, mayor que aproximadamente 95 % de identidad de secuencias. Ver las patentes de los EE. UU. núms . 5,283,184 y 5,034,323; incorporadas en la presente descripción como referencia.

La supresión no codificante se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. Uü. núm. 5,942,657. Además, se puede usar porciones de los nucleótidos no codificantes para alterar la expresión del gen objetivo. Generalmente, se puede usar secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Los métodos para usar la supresión no codificante para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en, por ejemplo, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y patente de los. EE. UU. núms. 5,759,829 y 5,942,657, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. La eficacia de la supresión no codificante puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' a la secuencia no codificante y 5' de la señal de poliadenilación. Ver la publicación de patente de los EE. UU. núm. 20020048814, incorporada en la presente descripción como referencia.

Los métodos para usar la interferencia de ARNbc para inhibir la expresión de genes endógenos de plantas se describen en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13959-13964, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y la patente núm. WO 99/49029, patente núm. O 99/53050, patente núm. WO 99/61631 y patente núm. WO 00/49035; incorporadas en la presente descripción como referencia .

Los métodos de interferencia de ARNhp se describen en Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 y las referencias mencionadas en la presente descripción. Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos. Ver, por ejemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; y Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Los métodos para usar la interferencia de ARNhp para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, y publicación de patente de los EE. UU. núm. 20030175965; incorporadas en la presente descripción como referencia. Un ensayo transitorio para la eficacia de las construcciones de ARNhp para silenciar la expresión génica in vivo ha sido descrito por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporada en la presente descripción como referencia.

Para el ARNhpi, las moléculas interferentes tienen la misma estructura general que para el ARNhp, pero la molécula de ARN comprende, adicionalmente, un intrón capaz de dividirse en la célula en la cual se expresa el ARNhpi . El uso de un intrón minimiza el tamaño del lazo en la molécula de ARN horquilla después de la división, y esto aumenta la eficacia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith et al. muestran una supresión de 100 % de la expresión del gen endógeno con el uso de la referencia mediada por ARNhpi. Los métodos para usar la interferencia del ARNhpi para inhibir la expresión de genes endógenos de plantas se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001) Plant J. 27:581-590; Wang y Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, y publicación de patente de los EE. UU. núm. 20030180945, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

El silenciamiento génico transcripcional se puede lograr con el uso de constructos de ARNhp, en donde la repetición invertida de la en horquilla comparte la identidad de secuencias con la región promotora de un gen a silenciar. El procesamiento del ARNhp en ARN cortos que pueden interactuar con la región promotora homologa puede desencadenar la degradación o metilación para llegar al silenciamiento (Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Suppl. 4) :16499-16506; Mette et al . (2000) EMBO J 19(19) :5194-5201) .

La inhibición de la expresión de una proteina objetivo se puede lograr por interferencia por ARN mediante la expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN) . Los miARN son agentes reguladores que consisten de aproximadamente 22 ribonucleótidos . Los miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo, Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, incorporada en la presente descripción como referencia. Para la interferencia del ARNmi, el cásete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN que se modela en un gen ARNmi endógeno. El gen de miARN codifica un ARN que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos complementaria para otro gen endógeno (secuencia objetivo). Las moléculas de miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen es heredada por las generaciones posteriores de plantas.

La frecuencia de recombinación homologa está influenciada por varios factores. Distintos organismos varían con respecto a la cantidad de recombinación homologa y la proporción relativa de recombinación homologa y recombinación no homologa. Generalmente, la longitud de la región de homología afecta la frecuencia de los eventos de recombinación homologa, mientras mayor sea la región de homología, mayor será la frecuencia. La longitud de la región de homología necesaria para observar recombinación homologa depende, además, de la especie. En muchos casos, se ha usado por lo menos 5 kb de homología, pero la recombinación homologa se ha observado con tan poco como 25-50 bp de homología. La longitud mínima de homología requerida se ha calculado en 20-50 bp en E. coli (Singer, et al., (1982) Cell 31:25-33; Shen y Huang, (1986) Genetics 112:441-57; Watt, et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:4768-72) , 63-89 bp in Sacchromyces . cerevisaie (Sugawara and Haber, (1992) Mol Cell Biol 12:563-75), and 163-300 bp en células de mamíferos (Rubnitz and Subramani, (1984) Mol Cell Biol 4:2253-8; Ayares, et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5199-203; Liskay, et al., (1987) Genetics 115:161-7).

La recombinación homologa se ha demostrado en insectos. En Drosophila, Dray y Gloor descubrieron que tan poco como 3 kb de homología total de plantilla: objetivo bastó para copiar un segmento grande no homólogo de ADN en el objetivo con una eficiencia razonable (Dray and Gloor, (1997) Genetics 147: 689-99). Con el uso de la integración de ADN mediada por FRT en Drosophila, Golic, et al., objetivo en la mosca de las frutas, Golic et al. demostraron que la integración fue aproximadamente 10 veces más eficiente cuando el donante y el objetivo compartían 4.1 kb de homología en comparación con 1.1 kb de homología (Golic, et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:3665). Los datos de Drosophila indican que 2-4 kb de homología es suficiente para una dirección eficiente, pero hay cierta evidencia que indica que una homología mucho menor puede ser suficiente, en el orden de aproximadamente 30 bp hasta aproximadamente 100 bp (Nassif and Engels, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:1262-6; Keeler and Gloor, (1997) Mol Cell Biol 17:627-34) .

La recombinación homologa también se ha logrado en otros organismos. Por ejemplo, se requirió por lo menos 150-200 pb de homología para la recombinación homologa en el protozoo parasítico Leishmania ( Papadopoulou and Dumas, (1997) Nucleic Acids Res 25:4278-86). En el hongo filamentoso Aspergillus nidulans, el reemplazo de genes se ha logrado con tan poco como 50 bp que flanquean la homología (Chaveroche, et al., (2000) Nucleic Acids Res 28:e97). Adicionalmente, el reemplazo de genes objetivo se ha demostrado en el ciliato Tetrahymena thermophila (Gaertig, et al., (1994) Nucleic Acids Res 22:5391-8). En mamíferos, la recombinación homologa ha tenido más éxito en el ratón con el uso de líneas de células madre embrionarias (ES) pluripotenciales que pueden reproducirse en cultivo, transformarse, seleccionarse e introducirse en un embrión de ratón. Los embriones que comprenden células ES transgénicas insertadas se desarrollan como crías genéticamente quiméricas. Al cruzar hermanos, se puede obtener ratones homocigotos que portan los genes seleccionados. Una descripción del proceso se proporciona en Watson, et al., (1992) Recombinant DNA, 2.° ed., (Scientific American Books distribuido por WH Freeman & Co.); Capecchi, (1989) Trends Genet 5:70-6; y Bronson, (1994) J Biol Chem 269:27155-8. La recombinación homologa en mamíferos distintos al ratón ha sido limitada por la falta de células madres con la capacidad de ser transplantadas a oocitos o de desarrollar embriones. Sin embargo, McCreath, et al., Nature 405:1066-9 (2000) reportaron la recombinación homologa exitosa en ovejas por transformación y selección en células de fibroblastos embrionarios primarios.

Los mecanismos de reparación de ADN propensa a errores puede producir mutaciones en sitios de ruptura de cadena doble. Las rutas de unión de extremos no homólogos (NHEJ) son el mecanismo de reparación más común para unir los extremos rotos (Bleuyard, et al., (2006) DNA Repair 5:1-12). La integridad estructural de los cromosomas se conserva, típicamente, por medio de la reparación, pero son posibles las deleciones, inserciones u otros rearreglos. Los dos extremos de una ruptura de cadena doble son los sustratos más predominantes de NHEJ (Kirik, et al., (2000) EMBO J 19:5562-6) ; sin embargo, si ocurren dos rupturas de cadena doble diferentes, los extremos libres de las diferentes rupturas pueden ligarse y producir deleciones cromosómicas (Siebert and Puchta, (2002) Plant Cell 14:1121-31), o translocaciones cromosómicas entre los diferentes cromosomas (Pacher, et al., (2007) Genetics 175:21-9).

Las moléculas de ADN episomal pueden ligarse, además, a la ruptura de cadena doble, por ejemplo, por integración de T-ADN en rupturas cromosómicas de cadena doble (Chilton and Que, (2003) Plant Physlol 133:956-65; Salomón and Puchta, (1998) EMBO J 17:6086-95). Una vez que la secuencia alrededor de las rupturas de cadena doble se altera, por ejemplo, por actividades de exonucleasa incluidas en la maduración de rupturas de cadena doble, las rutas de conversión de genes pueden restaurar la estructura original si se encuentra disponible una secuencia homologa, tal como un cromosoma homólogo en células somáticas que no dividen o una cromátide hermana después de la replicación de ADN (Molinier, et al., (2004) Plant Cell 16:342-52). Las secuencias de ADN ectópico y/o epigénico pueden funcionar, además, como una plantilla de reparación del ADN para recombinación homologa (Puchta, (1999) Genetics 152:1173-81) .

La alteración del genoma de la célula de una planta, por ejemplo, por medio de recombinación homologa (HR) , es una herramienta poderosa para la ingeniería genética. A pesar de la baja frecuencia de recombinación homologa en plantas superiores, hay algunos ejemplos de recombinación homologa exitosa de genes endógenos de plantas. Los parámetros para la recombinación homologa en plantas se han investigado, principalmente, mediante el rescate de los genes marcadores seleccionables truncados introducidos. En estos experimentos, los fragmentos de ADN homólogo tenían, típicamente, entre 0.3 kb y 2 kb. Las frecuencias observadas para recombinación homologa estaban en el orden de 10~4 hasta 10~5. Ver, por ejemplo, Halfter, et al., (1992) Mol Gen Genet 231:186-93; Offringa, et al., (1990) EMBO J 9:3077-84; Offringa, et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7346-50; Paszkowski, et al., (1988) EMBO J 7:4021-6; Hourda and Paszkowski, (1994) Mol Gen Genet 243:106-11; y Risseeuw, et al., (1995) Plant J 7:109-19.

Un gen endógeno no seleccionable fue el objetivo en Arabidopsis con el uso de un vector dirigido que contiene una región de aproximadamente 7 kb de homología con el gen objetivo y se calculó que la frecuencia objetivo era de por lo menos 3.9 X 10"4 (Maio and Lam, (1995) Plant J 7:359-65). En otro ejemplo, con el uso de un esquema de selección positiva-negativa y un vector dirigido que contiene hasta 22.9 kb de homología de secuencias con el objetivo, la recombinación homologa se detectó con una frecuencia menor que 5.3 X 10~5, a pesar de las grandes secuencias flanqueadoras disponibles para la recombinación (Thykjcer, et al., (1997) Plant Mol Biol 35:523-30) . En Arabidopsis, el gen de bloque AGL5 MADS se bloqueó por recombinación homologa con el uso de un constructo dirigido que consiste en un cásete de resistencia a canamicina insertado en la secuencia AGL5 a aproximadamente 3 kb del extremo 5' y 2 kb desde el extremo 3'. De las 750 lineas transgénicas resistentes a canamicina que se generaron, una linea contenia la inserción anticipada (Kempin, et al., (1997) Nature 389:802-3). Hanin, et al., obtuvieron eventos de recombinación homologa a una frecuencia basal de 7xl0~4 con el uso de 3 kb en el extremo 5' y 2kb en el extremo 3' de homología con el genn PPO de Arabidopsis que codifica protoporfirinogeno oxidasa (Hanin, et al., (2001) Plant J 28:671-7). Terada, et al., tuvieron como objetivo el locus ceroso en el arroz con el uso de un procedimiento de transformación mediada por Agrobacterium. La selección negativa, en forma de dos copias del gen de toxina de difteria ubicado en ambos extremos del T-ADN, se usó para eliminar la integración aleatoria de T-ADN, lo cual permitió el enriquecimiento de los eventos raros de recombinación homologa en el material seleccionado, y su sistema de transformación generó miles de eventos a partir de únicamente 150 semillas de arroz. La frecuencia reportada de recombinación homologa del gen ceroso en arroz era de 0.65xl0~3, sin la inclusión de elementos para mejorar la recombinación homologa (Terada, et al., (2002) Nat Biotech 20:1030-4).

Las rupturas de cadena doble (DSB) de ADN parecen ser un factor efectivo para estimular las rutas de recombinación homologa en todos los organismos analizados hasta la fecha (Puchta, et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92; Tzfira and White, (2005) Trends Biotechnol 23:567-9; Puchta, (2005) J Exp Bot 56:1-14). Con el uso de agentes de ruptura de ADN, se observó un incremento de dos a nueve veces en la recombinación homologa entre las repeticiones de ADN homólogo construido artificialmente en plantas (Puchta, et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92). En los protoplastos de maíz, los experimentos con moléculas de ADN lineal demostraron una recombinación homologa mejorada entre los plásmidos (Lyznik, et al., (1991) Mol Gen Genet 230:209-18) .

Los efectos de DSB en la recombinación homologa se han investigado con el uso de cortes raros, asi como transposones, tales como Ac y Mutator (Chiurazzi, et al., (1996) Plant Cell 8:2057-66; Puchta, et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:5055-60; Xiao and Peterson, (2000) Mol Gen Genet 263:22-9; y Shalev y Levy (1997) Genetics 146:1143-51). Chiurazzi, et al., (1996) Plant Cell 8:2057-66) introdujeron DSB en un cromosoma de Arabidopsis con el uso de HO-endonucleasa y observaron un incremento de 10 veces en la frecuencia de recombinación homologa entre las repeticiones que flanquean el sitio de reconocimiento HO. La eliminación de los elementos transposables Ac estimularon, además, la recombinación homologa entre las repeticiones que flanquean los elementos a una frecuencia incluso mayor (Xiao and Peterson (2000) Mol Gen Genet 263:22-9).

Puchta et al reportaron que la frecuencia de recombinación homologa en un locus objetivo artificial se incrementó por hasta dos órdenes de magnitud cuando se generó DSB con el uso de I-Scel (Puchta, et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:5055-60). En el experimento de Puchta et al., se introdujo un cásete de expresión de I-Scel en las lineas objetivo de tabaco transgénico junto con el constructo dirigido por coinoculación con las dos cepas Agrobacterium respectivas. La recombinación homologa entre T-ADN que contiene el constructo dirigido y el sitio objetivo reconstituyeron el gen de resistencia a canamicina (nptll) . Hubo una correlación evidente entre la frecuencia de recombinación homologa y la cantidad del cásete de expresión de I-Scel, lo cual sugiere que más DSB produjo mayor frecuencia de recombinación homologa.

La frecuencia alta de recombinación homologa en un sitio objetivo artificial previamente introducido se obtuvo con el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) en tabaco ( right, et al., (2005) Plant J 44:693-705). El cásete de expresión de nucleasa con dedos de zinc y el ADN donante se introdujeron en los protoplastos por coelectroporación y la modificación objetivo se monitoreó por la resistencia a canamicina y la actividad de GUS. Se observó un evento modificado en aproximadamente cada 10 transformantes; sin embargo, únicamente 20 % de los eventos modificados contenia los productos de recombinación homologa deseados, según el análisis de Southern blot.

Las nucleasas con dedos de zinc son endonucleasas modificadas con especificidades alteradas, por ejemplo, por fusión de un dominio de unión al ADN modificado para una endonucleasa, por ejemplo, Fokl (Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Mani, et al., (2005) Biochem Biophys Res Comm 335:447-57). Wright, et al., y Lloyd, et al., reportaron una mutagénesis de frecuencia alta en un sitio objetivo de ADN integrado en tabaco o ADN cromosómico de Arabidopsis con el uso de nucleasas con dedos de zinc (Wright, et al., (2005) Plant J 44:693-705; Lloyd, et al., (2005) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102:2232-7). Con el uso de una nucleasa con dedos de zinc diseñada genéticamente que reconoce un locus del gen de acetolactato sintasa ALS endógeno de tabaco, se introdujo un gen de ALS mutado conocido por conferir resistencia a imidazolinona y a los herbicidas de sulfonilurea, para reemplazar el gen de ALS endógeno a frecuencias que exceden el 2 % de células transformadas (Townsend, et al., (2009) Nature 459:442-5). El bloqueo de un gen endógeno y la expresión de un transgen se pueden lograr simultáneamente por selección de genes. El gen IPK1, que codifica inositol-1 , 3 , 4 , 5 , 6 -pentacisfosfato 2-cinasa que se requiere en la etapa final de biosintesis de fitato en semillas de maíz, fue el objetivo con el uso de una nucleasa con dedos de zinc diseñada genéticamente para insertar por medio de recombinación homologa un gen de PAT, que codifica la tolerancia a la fosfinotricina acetil transferasa para herbicidas de glufosinato de amonio, tales como bialafos. La interrupción del gen IPK1 con la inserción del gen PAT produjo tanto una tolerancia a los herbicidas como la alteración esperada del perfil de inositol fosfato para semillas en desarrollo (Shukla, et al., (2009) Nature 459:437-41).

Los miembros de la familia de serinas de recombinasas producen rupturas de cadena doble en los sitios de recombinación como parte de sus actividades catalíticas (Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16). El sistema R/RS en la naranja dulce pareció inducir mutaciones de los sitios RS, que produjo deleciones cromosómicas no asociadas con las reacciones de recombinación especifica del sitio en si (Ballester, et al., (2006) Plant Cell Rep 26:39-45).

Otro método usa la ingeniería de proteínas de endonucleasas homing existentes para alterar sus especificidades objetivo. Las endonucleasas homing, tales como I-Scel o I-Creí, se unen a y clivan secuencias de reconocimiento de ADN relativamente largas (18 bp y 22 bp, respectivamente) . Se predice que estas secuencias ocurren naturalmente pocas veces en un genoma, típicamente, solo 1 o 2 sitios/genoma . La especificidad del clivaje de una endonucleasa homing se puede cambiar mediante el diseño racional de sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión al ADN y/o ensamblaje combinatorio y selección de monómeros mutados (ver, por ejemplo, Arnould, et al., (2006) J Mol Biol 355:443-58; Ashworth, et al., (2006) Nature 441:656-9; Doyon, et al., (2006) J Am Chem Soc 128:2477-84; Rosen, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; y Smith, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:el49; Lyznik, et al., (2009) publicación de solicitud de patente de los EE. UU. núm. 20090133152A1; Smith, et al., (2007) publicación de solicitud de patente de los EE. UU. núm. 20070117128A1 ) . Se ha demostrado que las meganucleasas modificadas pueden clivarse a sitios mutantes cognados sin ampliar su especificidad. Un sitio de reconocimiento artificial especifico para la nucleasa homing I-Scel de levadura silvestre se introdujo en el genoma de maiz y las mutaciones de la secuencia de reconocimiento se detectaron en 1 % de plantas Fl analizadas al introducir un I-Scel transgénico por cruzamiento y activarlo por excisión de genes (Yang, et al., (2009) Plant Mol Biol 70:669-79). Más prácticamente, el locus sin lígula de maíz fue el objetivo con el uso de una endonucleasa monocatenaria modificada diseñada genéticamente en base a la secuencia de meganucleasas I-Creí. Las mutaciones de la secuencia de reconocimiento del locus sin lígula seleccionado se detectaron en 3 % de las plantas transgénicas cuando se introdujo la endonucleasa homing diseñada genéticamente por transformación mediada por Agrobacterium-de embriones inmaduros (Gao, et al., (2010) Plant J 61:176-87) .

Los mecanismos de reparación del ADN de células son la base de la transformación para introducir ADN extraño o inducir mutaciones en genes endógenos. La recombinación homologa de ADN es una manera especializada de reparación del ADN, en donde las células reparan los daños del ADN con el uso de una secuencia homologa. En las plantas, la recombinación homologa de ADN ocurre a frecuencias muy bajas para usar en la transformación hasta que se descubrió que el proceso puede estimularse por rupturas de cadena doble de ADN (Bibikova et al. (2001) Mol. Cell Biol. 21:289-297; Puchta y Baltimore (2003) Science 300:763; right et al. (2005) Plant J. 44:693-705) .

E emplos La presente invención se define, además, en los siguientes ejemplos, en donde las partes y porcentajes se representan en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique de cualquier otra manera. Se debe comprender que estos ejemplos, si bien indican las modalidades de la invención, se proporcionan en forma de ilustración únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica puede determinar las características fundamentales de la presente invención y puede realizar varios cambios y modificaciones de la presente invención para adaptarla a diversos usos y condiciones, todo sin apartarse del espíritu y alcance de esta. Tales modificaciones deben, además, estar incluidas en el alcance de las reivindicaciones anexas .

Los significados de las abreviaturas son los siguientes: "s" significa segundo(s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora (s) , "d" significa día(s), "µ?" significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro ( s ) , "1" significa litro (s), "µ " significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "µp????" significa micromole ( s ) , "g" significa gramo (s), "ug" significa microgramo ( s ) , "ng" significa nanogramo ( s ) , "U" significa unidad (es), "bp" significa par (es) de bases y "kb" significa kilobase(s).

Ejemplo 1 Alteración inducida por ruptura de cadena doble de ADN de un sitio objetivo endógeno Cuando un agente inductor de ruptura de cadena doble de ADN reconoce y se cliva a una secuencia de reconocimiento específica en un sitio objetivo en el genoma, se forma una ruptura de cadena doble de ADN y desencadena los mecanismos de reparación de ADN de células para movilizar la reparación del daño que podría ser fatal para la célula. El proceso se puede usar en la trans ormación de plantas para introducir las mutaciones específicamente en el sitio objetivo para bloquear el gen que reside en el sitio objetivo o para insertar un ADN donante de interés en el sitio objetivo. Una vez se forma la ruptura de cadena doble de ADN, según los diseños de los constructos de ADN involucrados y los procesos reales de reparación del ADN, se puede obtener distintos resultados con distintos propósitos de transformación.

Para las mutaciones de genes específicas del sitio simples, un sitio objetivo que contiene una secuencia de reconocimiento (Figura 1A) y un agente de ruptura de cadena doble de ADN, tal como una endonucleasa (Figura IB) que reconoce específicamente la secuencia de reconocimiento tienen que estar presentes en la misma célula. Después de que la endonucleasa reconoce y corta el ADN, los dos extremos libres pueden repararse por la unión de extremos por medio del mecanismo de reparación del ADN de células sin la intervención de ningún factor externo. Los dos extremos pueden repararse hasta su estado original de manera que no se detecte ningún cambio o pueden alterarse antes de repararlos lo cual produce cambios detectables después de conectarlos nuevamente, tales como la deleción de uno o más nucleótidos de la secuencia de reconocimiento y, posiblemente, secuencias circundantes adicionales (Figura 1F) . Las mutaciones se introducen en el sitio objetivo por medio del último proceso.

Para lograr las inserciones de ADN especificas del sitio, un ADN donante que contiene el ADN de interés debe estar presente simultáneamente en la célula además del sitio objetivo y la endonucleasa . El ADN donante puede contener las mismas secuencias de ADN que flanquean el sitio objetivo para flanquear el ADN de interés, es decir, las secuencias homologas (Figura 1C) . El ADN de interés se puede insertar en el sitio objetivo por recombinación homologa (Figura 1E) , un proceso estimulado por la ruptura de cadena doble de ADN en el sitio objetivo. El ADN donante puede contener, además, únicamente el ADN de interés sin flanquear ninguna secuencia homologa (Figura ID) . El ADN de interés todavía se puede insertar en el sitio objetivo, aun de manera menos predecible, por medio de recombinación no homologa. Similarmente, cualquier ADN no relacionado que está presente al reparar los extremos de ADN puede insertarse en el sitio objetivo (Figura 1G) . Los distintos resultados (Figuras 1E-G) pueden obtenerse simultáneamente en el mismo experimento de transformación.

Cualquier medio que haga una ruptura de cadena doble del ADN in vivo puede usarse como agente inductor de ruptura de cadena doble, tal como las meganucleasas que se usan más comúnmente que reconocen > secuencias de 18 bp de largo suficiente para ser únicas en la mayoría de los genomas. Se encontraron y caracterizaron numerosas meganucleasas para reconocer muchas secuencias diferentes, pero tales secuencias a menudo no se presentan naturalmente en los cultivos importantes como el frijol de soja o el maíz. Si bien pueden encontrarse secuencias similares en genomas de cultivos, las cantidades limitadas de estas secuencias aún son demasiado pequeñas para resultar útiles. Ciertas meganucleasas, tales I-Creí, pueden modificarse por ingeniería de proteínas de manera que ya no reconocerá, preferentemente, la secuencia de reconocimiento de I-Creí silvestre y, en lugar de eso reconocerá, preferentemente, las secuencias de interés específicamente seleccionadas. Aprovechando la flexibilidad de la endonucleasa I-Creí, se puede diseñar y producir una I-Creí modificada para clivar un sitio objetivo de nuestra elección en el genoma y, posteriormente, introducir mutaciones o insertar genes de interés en el sitio objetivo seleccionado. La ingeniería genética precisa que proporciona esta metodología resolverá muchos problemas que enfrentan actualmente los métodos convencionales de transformación de plantas, tales como la infección por Agrobacterium y el bombardeo biolístico, tales como la integración impredecible, interrupción de genes endógenos no deseada, expresión de genes impredecible, etc.

Ejemplo 2 Plantas de maíz estériles masculinas producidas por mutagénesis especifica de un gen de tipo citocromo P450, MS26, con el uso de una endonucleasa MS26 diseñada genéticamente ZmMS26 es un locus de interés para hacer una mutación estéril en el maíz localizado en el brazo corto del cromosoma 1. El gen del maíz MS26 (sec. con núm. de ident.: 8; AF366297) consiste en cinco exones y codifica una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident.: 12; AAK52956.1) que muestra una homología sustancial del gen CYP704B1-Zm, un miembro de la familia amplia (más de 26 genes) de monooxigenasas citocromo P450 del maíz. El dominio heme, esencial para la actividad catalítica, se encuentra en el quinto exon (patente de los EE. UU. núm. 7517975). Los mutantes nulos del gen del maíz MS26 causan la terminación prematura del desarrollo de microsporas en los lóculos de la antera debido a que este gen ha estado implicado en la formación de la pared de polen (Li et al. (2010) Plant Cell; 22:173) . Se espera que las mutaciones de la terminación prematura o marco de lectura en esta región bloqueen la función del gen MS26 del maíz.

Una endonucleasa homing en base a I-Creí diseñada genéticamente, conocida como endonucleasa MS26 diseñada genéticamente, pudo producir rupturas de cadena doble en el gen MS26 del maíz que condujeron a la introducción de mutaciones que bloquean la función de la proteína MS26. El proceso es ventajoso porque no requiere un paso de selección dedicado o una modificación en los protocolos de transformación de rutina. Como se anticipó, las deleciones o inserciones de un solo nucleótido en la secuencia de codificación de MS26 producen plantas de maíz estériles.

A. Sitio objetivo TS-MS26 y las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente Se seleccionó un sitio objetivo designado como sitio objetivo "TS- S26" (sec. con núm. de ident.: 1) para el diseño de un agente inductor de ruptura de cadena doble personalizado. El sitio objetivo TS-MS26 es un polinucleótido de 22 bp ubicado a 62 bps del extremo 5' del quinto exon del gen MS26 del maíz que tiene la secuencia siguiente : gatggtgacgtacAgtgccctac (sec. con núm. de ident.: 1).

Se destaca el sitio de ruptura de cadena doble y la región protuberante; la enzima se corta después del C13, como indica el . Las secuencias de nucléotidos optimizados de la planta para tres endonucleasas diseñadas genéticamente (sec. con núm. de ident .: 4 codifican la endonucleasa MS26 diseñada genéticamente; las sec. con núm. de ident. : 5 y 7 codifican la endonucleasa MS26+ diseñada genéticamente; la sec. con núm. de ident . : 6 codifica la endonucleasa MS26++ diseñada genéticamente) se diseñaron en base a la endonucleasa homing I-Crel para unir y hacer rupturas de cadena doble en el sitio objetivo TS-MS26 seleccionado (sec. con núm. de ident.: 1).

B. La construcción del vector para los vectores de expresión de la planta codifican las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente y reparan los ADN para integración del transgen por recombinación homologa Los vectores que comprenden casetes de expresión para la endonucleasa diseñada genéticamente adecuada se construyeron con el uso de técnicas convencionales de biología molecular.

Los casetes de expresión de la planta contenidos en la secuencia nucleótida optimizados por codón de la planta codifican la endonucleasa MS26 diseñada genéticamente para un mejor rendimiento de las células de maíz. Estas secuencias optimizadas de la planta se complementaron, además, con secuencias de ADN que codifican las señales de localización nuclear se añaden al extremo N terminal de la proteína (sec. con núm. de ident.: 2) para la endonucleasa MS26 diseñada genéticamente y la sec. con núm. de ident.: 3 para la endonucleasa MS26++ diseñada genéticamente. Las secuencias de terminadores de genes del promotor de ubiquitina de maíz y del inhibidor de proteinasa de la papa II completaron los diseños de genes de endonucleasa . En algunos casos, la secuencia nucleotida optimizada para la planta que codifican la endonucleasa MS26+ diseñada genéticamente (sec. con núm. de ident.:5) se modificó adicionalmente mediante la adición del intrón ST-LS1 a la secuencia codificante del primer monómero de endonucleasa para eliminar su expresión en E.coli y Agrobacterium (sec. con núm. de ident . : 7). El cásete de expresión que contiene la secuencia nucleotida optimizada para la planta que codifica la endonucleasa MS26++ diseñada genéticamente (sec. con núm. de ident.: 6) también contenida en el intrón ST-LS1 insertado en las secuencias de codificación del primer monómero para eliminar su expresión en E.coli y Agrobacterium y su secuencia de codones se optimizó para el contenido de GC.

Estos casetes de expresión se insertaron en moléculas de T-DNA que se equiparon, además, con un gen marcador seleccionable BAR o moPAT que permite la selección de eventos transgénicos en medios que contienen bialafos. No se aplicó ninguna selección para mutaciones del sitio objetivo de TS-MS26.

C. Producción de plantas transgénicas Los embriones inmaduros de maiz (Zea mays) se transformaron por un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium modificado, según se describe en (Djukanovic et al. 2006) . Los embriones inmaduros de diez a once dias (1.3-1.8 mm) se disecaron de los granos esterilizados y se colocaron en 2 mi de medio liquido [4.0 g/l de sales básales N6 (Sigma C-1416; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU.), 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511) , 1.0 mg/1 de HC1 de tiamina, 1.5 mg/1 de 2.4-ácido diclorofenoxiacético (2, 4-D) , 0.690 g/l de L-prolina, 68.5 g/l de sacarosa, 36.0 g/l de glucosa, pH 5.2]. La suspensión de Agrobacterium se diluyó a una densidad óptica de 0.175 a 550 nm. El medio que contenia el embrión se reemplazó con 1 mi de suspensión de Agrobacterium y se permitió la incubación de los embriones durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se transfirieron los embriones (40 embriones por placa) , el eje del embrión hacia abajo, sobre una placa que contenia 4.0 g/l de sales básales N6 (Sigma C-1416) , 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 1.0 mg/1 de HC1 de tiamina, 1.5 mg/1 2, 4-D, 0.690 g/l de L-prolina, 30.0 g/l de sacarosa, 0.85 mg/1 de nitrato de plata, 0.1 nM de acetosiringona, 3.0 g/l de Gelrite, pH 5.8. Los embriones se incubaron en la oscuridad durante 3 a 4 dias a 21 °C y, después se transfirieron a medios que contenían 4.0 g/l de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 1.5 mg/1 de 2, 4-D, 0.690 g/l de L-prolina, 30.0 g/l de sacarosa, 0.5 g/l de regulador de 2- (N-morfolino) etano ácido sulfónico (MES), 0.85 mg/1 de nitrato de plata, 100 mg/1 de carbenicilina, y 8 g/1 de agar Sigma por cuatro dias más de incubación en la oscuridad a 28 °C. Después, los embriones se transfirieron (19 embriones/placa) a placas nuevas que contenían 4.0 g/1 de sales básales N6 (Sigma C-1416) , 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 1.5 mg/1 2, 4-D, 0.69 g/1 de L-prolina, 30.0 g/1 de sacarosa, 0.5 g/1 de regulador MES, 0.85 mg/1 de nitrato de plata, 1.5 mg/1 de bialafos, 100 mg/1 de carbenicilina, 8.0 g/1 de agar, pH 5.8, y se coloca en la oscuridad a 28 °C. Después de tres semanas, el callo correspondiente (7 callos por placa) se subcultivó en medios que contenían 4.0 g/1 de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 1.5 mg/1 2, 4-D, 0.69 g/1 de L-prolina, 30.0 g/1 de sacarosa, 0.5 g/1 de regulador MES, 0.85 mg/1 de nitrato de plata, 3.0 mg/1 de bialafos, 100 mg/1 de carbenicilina, 8.0 g/1 de agar, pH 5.8. Después de cinco semanas en la oscuridad a 28 °C, se indujo la embriogénesis somática al transferir una pequeña cantidad de tejido seleccionado a un medio de regeneración (1 evento transgénico por placa) que contenía 4.3 g/1 de sales de Murashige y Skoog (MS) (Gibco 11117; Gibco, Grand Island, NY) , 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (Sigma M3900) , 100 mg/1 de mio-inositol, 0.1 µ? de ácido abscísico (ABA), 1 mg/1 de ácido indolacético (IAA), 0.5 mg/1 de zeatina, 60.0 g/1 de sacarosa, 3.0 mg/1 de bialafos, 100 mg/1 de carbenicilina, 6.0 g/1 de agar ultrapuro, pH 5.6. Las placas se incubaron en la oscuridad durante 2 a 3 semanas a 28 °C. Todo el material con brotes y raices se transfirieron (5-10 brotes por evento/placa) en medios que contenían 4.3 g/1 de sales MS (Gibco 11117), 5.0 ml/1 de solución madre de vitaminas MS (Sigma M3900) , 100 mg/1 de mio-inositol, 40.0 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos, 100 mg/1 de benomilo, 6.0 g/1 de bacto agar, pH 5.6, y se incubó bajo luz artifical a 28 °C. Una semana más tarde, las plántulas se trasladaron a tubos de ensayo (1 plántula por tubo) que contenía el mismo medio menos el bialafos y se dejaron crecer bajo luz artificial hasta que se realizaron las muestras y/o se plantaron en la tierra.

Cuatro versiones de secuencias optimizadas para la planta que codifican la endonucleasa diseñada genéticamente dirigida al sitio objetivo TS-MS26 (sec. con núm. de ident.:4, sec. con núm. de ident.:5, sec. con núm. de ident.:6 o sec. con núm. de ident.:7) se suministraron por transformación mediada por Agrobacterium de los embriones de maíz inmaduros. Se produjeron más de 1.000 plantas T0, cada planta se regeneró con un tejido de callo independiente seleccionado en medios que contenían 1.5 mg/1 de bialafos. La eficiencia de la transformación representó un porcentaje de los embriones cocultivados que produjeron eventos de transformación. La frecuencia de transformación comprendió de 14 % a 35 % para la endonucleasa MS26 diseñada genéticamente; esta estuvo dentro de las frecuencias de transformación de rutina registradas para otros genes usados para la transformación genética de embriones de maíz con cepas de Agrobacterium similares.

D. Selección para mutaciones en un sitio objetivo TS-MS26 y selección de plantas mutantes.

Se seleccionaron plantas T0 para las mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 por amplificación por PCR de la región del sitio objetivo TS-MS26 y posterior digestión del producto de la PCR con la enzima de restricción BsiWI, gue se corta en el sitio objetivo TS-MS26, seguido de electroforesis en gel de los productos de digestión de restricción. La imposibilidad de cortar la región del sitio objetivo amplificada por PCR hasta la terminación con BsiWI indicó que no ocurrió la mutación. Se identificaron tres alelos MS26 mutados entre 300 plantas T0 del experimento de transformación en el que se usó la sec. con núm. de ident.:5 (Tabla 2) y se identificaron tres alelos MS26 mutados entre 257 plantas T0 analizadas del experimento en el que se usó la sec. con núm. de ident.: 7. No se encontraron alelos MS26 mutantes en el experimento de transformación en el que se usó la sec. con núm. de ident.: 4. La mayor frecuencia de alelos mutantes se observó cuando se usó la sec. con núm. de ident . : 6 en el experimento de transformación, que produjo 15 mutaciones entre las 344 plantas TO analizadas (Tabla 2) .

Los resultados se presentan en la Tabla 2. La tasa de mutaciones representa el porcentaje de plantas TO analizadas que contienen una mutación en el sitio objetivo TS-MS26. Los alelos ms26 mutados encontrados en las plantas TO se centraron en el extremo 3' GTAC aparente protuberante producido por endonucleasas diseñadas genéticamente (Figura 2) .

Tabla 2.

Tasa de mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 de plantas de maíz TO que expresan las endonucleasas diseñadas genéticamente Endonucleasa Núm. de plantas Núm. de Tasa de (Secuencia optimizada para la planta) TO analizadas mutaciones mutaciones* MS26 (sec. con núm. de ident.: 4) 229 0 0 MS26+ (sec. con núm. de ident.: 5) 300 3 1 % MS26+ (sec. con núm. de ident.: 7) 257 3 1.2 % MS26++ (sec. con núm. de ident.: 6) 344 15 5.8 % En la Figura 8 se muestran las plantas T0 en el momento de la floración. No hubo una diferencia evidente en el crecimiento y desarrollo de plantas T0 que contienen un alelo ms26 mutado (dos plantas exteriores) comparada con el evento bialélico TO (la planta marcada) producido por la endonucleasa MS26++ (A) . El evento bialélico fue estéril (se muestra la espiga en la antesis entre dos espigas de eventos monoalélicos ) (B) .

Se cultivaron plantas TO seleccionadas que contiene una inserción de nucleótido {ms26-Ci) o una deleción de nucleótido (ms26-Td) en el gen MS26 endógeno en un invernadero y se autopolinizaron para producir plantas de la progenie TI. Los alelos MS26 presentes en las plantas TI se determinaron por ensayos de PCR en muestras de ADN de la hoja de las plantas TI. En la Tabla 3 se muestra la segregación de los alelos ms26-Ci (inserción de un nucleótido) y ms26-Td (inserción de un nucleótido) en la progenie TI.

Tabla 3.

Datos de segregación de la progenie de las plantas TO que fueron autopolinizadas .

Alelo TO Núm. de Núm. de MS26/MS26 Genotipo semillas TI semillas TI (mutación) plantadas germinadas MS26/ms26 ms26/ms26 ms26-Ci 100 69 25 21 17 s26-Td 100 93 26 50 17 E. La esterilidad inducida por las mutacionesen el sitio TS-MS26.

Se cultivaron plantas de maíz Ti hermanas derivadas de la autofertilización de dos plantas T0 originales, que portan cada una mutación en el gen MS26 {ms26-Ci y ms26-Td) en condiciones de crecimiento estándar. La Figura 9A muestra una planta heterocigota MS26/ms26- y una homocigota ms26-/ms26- derivada de cada evento TO en el momento de la floración. Todas las plantas tuvieron una altura similar y alcanzaron la madurez en tiempos similares. Los filamentos surgieron de las vainas en los extremos de las espigas durante un periodo de pocos dias en total. En las Figuras 9B y 9C se ven las fotos en primer plano de las inflorescencias de la espiga madura en la antesis. Las plantas produjeron espigas que contienen espiguillas con raquis central y ramas. Solo las plantas hermanas TI MS26/ms26-Ci y MS26/ms26-Td heterocigotas desarrollaron anteras que colgaron de filamentos elongados. Las espigas de las plantas hermanas homocigotas ms26-Ci/ms26-Ci y ms26-Td/ ms26-Td contenían espiguillas sin evidencias de anteras emergentes, lo que indica esterilidad masculina.

Ejemplo 3 Plantas de arroz estériles masculinas producidas por mutagénesis específica de un gen de tipo citocromo P450, MS26, con el uso de una endonucleasa MS26 diseñada genéticamente Gen MS26 del maíz (ZmMS26, núm. de acceso AF366297; sec. con núm. de ident.: 8) y sus ortólogos en el arroz (núm. de acceso LOC_Os03g07250; sec. con núm. de ident . : 9) sorgo (sec. con núm. de ident.: 10) y centeno (sec. con núm. de ident.: 11) codifica un citocromo P450, familia CYP704B (publicación de solicitud de patente de los EE . UU . núm. 2009/0183284), propuesto para catalizar la producción de ácidos grasos hidroxilados omega con 16 a 18 cadenas de carbono (Li et al. (2010) Plant Cell 22:173). Las mutaciones recesivas homocigotas que interrumpen el marco de codificación de los genes del maíz (patente de los EE. UU. núm. 7517975) o del arroz MS26 producen la incapacidad de la planta de generar granos de polen funcionales que probablemente se deban a una menor producción de ácidos grasos críticos para la formación de la pared de polen (Li et al. (2010) Plant Cell 22:173). Los genes MS26 del maíz, arroz, sorgo y centeno contienen una secuencia de 22 nucleótidos idénticos, conocidos como el sitio objetivo "TS-MS26", en el último exon de los genes (Figura 3).

A. Sitio objetivo TS-MS26 y las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente Como se describe en el Ejemplo 2 , se seleccionó el sitio objetivo TS- S26 para el diseño de las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente. Las variedades de arroz Indica y japónica contienen este sitio objetivo TS-MS26 endógeno en sus genomas . La región genómica comprendió el sitio objetivo TS-MS26 en el arroz como se muestra en la Figura 3 (sec. con núm. de ident.: 14). La Figura 3 muestra, además, la región genómica que comprende el sitio objetivo TS- S26 en el maíz (sec. con núm. de ident.: 13), arroz (sec. con núm. de ident.: 14), sorgo (sec. con núm. de ident.: 15) y centeno (sec. con núm. de ident.: 16) e ilustra que estas regiones genómicas pueden contener algunas diferencias de pares de bases entre especies y aún habrá un sitio objetivo funcional para una endonucleasa MS26 diseñada genéticamente.

B. Vectores y transformación El callo del arroz joven (Oryza sativa ssp. japónica cv. Nipponbare o Kitaake) que contiene un sitio objetivo TS- S26 endógeno se usó como objetivo de transformación para producir ADN mediado por biolistica o Agrobacterium. Para la transformación biolistica, los vectores PHP40082 y PHP40126 (Figura 4; sec. con núms . de ident.: 58 y 59, respectivamente) se cobombardearon en un callo de dos semanas, derivado de semillas al modificar un protocolo que describen Chen et al. ((1998) Plant Cell Rep. 18:25-31). PHP40082 contiene una secuencia optimizada para la planta (sec. con núm. de ident.: 5) que codifica una endonucleasa MS26+ de cadena única diseñada genéticamente, colocada bajo el control transcripcional del promotor ubiquitina del maíz. PHP40126 contiene un marcador seleccionable de resistencia a herbicidas fusionado al gen fluorescente rojo (RFP) y colocado bajo la regulación del promotor END2 del maíz.

PHP40827 se usó para generar eventos de arroz por transformación mediada por Agrobacterium. PHP40827 contiene una secuencia nucleótida optimizada para la planta (sec. con núm. de ident.:5), que codifica una endonucleasa MS26+ de cadena única diseñada genéticamente, colocada bajo el control transcripcional de un promotor CAMV35S que contiene 3 copias del operador Tet . Este plásmido contiene, además, el represor de tetraciclina bajo el control del promotor de ubiquitina del maíz y un gen fluorescente azul (CFP) regulado por el promotor ZmEND2. Además, el PHP40827 contiene una copia de un gen fluorescente rojo regulado por el promotor de la histona 2B del maíz. Una parte del gen fluorescente rojo en este constructo se duplicó en una orientación directa, que consiste en dos fragmentos del gen RFP con 369 bp de superposición. Los dos fragmentos están separados por un espaciador 136-bp que contiene el sitio objetivo TS-MS26 (Figura 6A) . En ausencia de la tetraciclina, el callo se vuelve azul fluorescente debido a la expresión del marcador CFP. En presencia de tetraciclina, la represión de la meganucleasa MS26+ diseñada genéticamente dirigiría a rupturas de cadena doble en el sitio objetivo TS-MS26 entre las dos secuencias superpuestas para promover la recombinación intramolecular y producir un gen RFP funcional, que se pone de manifiesto por la aparición de células fluorescentes rojas contra un fondo azul fluorescencente . Se seleccionaron los eventos del callo rojo fluorescente para la caracterización adicional y regeneración de la planta.

C. Identificación de mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 en tejidos de plantas.

Los eventos de callo rojo fluorescente resistente a bialafos o el callo rojo y azul fluorescente generados por transformación biolistica o mediada por Agrobacterium, respectivamente, se seleccionaron para mutaciones del sitio objetivo TS-MS26 por amplificación de la región por PCR al usar el par iniciador UNIMS26 5' -2 (GACGTGGTGCTCAACTTCGTGAT) (sec. con núm. de ident.: 17) y UNIMS26 3'-l (GCCATGGAGAGGATGGTCATCAT) (sec. con núm. de ident.: 18) y la digestión de los productos amplificados con la enzima de restricción del ADN, BsiWI, que reconoce la secuencia 5'-CGTACG-3' . Se realizó electroforesis a los productos de estas reacciones en 1% de geles de agarosa y se evaluaron para determinar las bandas resistentes a la digestión BsíNI que indican mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26.

Veintidós de los 292 eventos resistentes a bialafos generados por cobombardeo de eventos PHP40082 y PHP40126 contenían productos de PCR resistentes a la digestión de la enzima de restricción BsiWl que indica mutaciones en el sitio objetivo TS- S26. La subclonación y el análisis de la secuencia de ADN de estos productos PCR revelaron diferentes mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26, que incluyen mutaciones puntuales, además de deleciones e inserciones que comprenden de uno a más de 250 nucleótidos. En la Figura 5 se muestran ejemplos de estas mutaciones. En varios casos la inserción del sitio objetivo TS-MS26-consistió en fragmentos de secuencias derivadas del vector cobombardeado (por ejemplo, ver, Figura 5; el evento 48(Ev.48) contiene 54 pares de bases de RFP) .

Los eventos de callos de arroz azul fluorescentes que contienen PHP40827 se evaluaron, además, para determinar la presencia de mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 después del tratamiento con tetraciclina (Figura 6B) . Ocho eventos de PHP40827 independientes se colocaron en medio de mantenimiento del callo que contenia 1 mg/litro de tetraciclina (TET) durante 24 horas a 37 °C; el ADN genómico se aisló y analizó por PCR para determinar mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 y se comparó con los productos PCR de estos mismos eventos no expuestos a tetraciclina (control) (Figura 6B) . Seis de los ocho eventos PHP40827 produjeron productos PCR resistentes a BsiWI que eran independientes de la aplicación de tetraciclina. Los productos PCR de TET y los tratamientos de control se subclonaron y se les hizo análisis de la secuencia de ADN. La mayoría de los productos PCR de las reacciones de tratamiento control sin cortes no revelaron mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26. Por el contrario, la mayoría de las secuencias de ADN de productos PCR resistentes a BSIWI revelaron una alta proporción de deleciones e inserciones en el sitio objetivo TS-MS26 (ver ejemplos en la Figura 7) . Las plantas se regeneraron de eventos del callo que contienen mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 para el análisis fenotipico.

D. Análisis fenotipico de plantas de arroz que contienen mutaciones MS26 Se cultivaron plantas resistentes a herbicidas regeneradas de eventos del callo cobombardeado con PHP40082 y PHP40126 además de plantas de callos azul fluorescentes que contienen PHP40827 en condiciones de invernadero, se analizaron para determinar mutaciones en MS26 y se permitió colocar semillas autosembradas (semilla Ti) . Se evaluó la fertilidad masculina al seleccionar la semilla TI de 6 plantas (3 PHP40082/PHP40126 y 3 PHP40827) que contenían mutaciones MS26 no idénticas pero carecían de los vectores que se usan para la transformación. Se determinó la fertilidad masculina al examinar las anteras para determinar el desarrollo de almidón que llenaba los granos de polen junto con la capacidad de la planta de dar semillas propias. Las plántulas se evaluaron por PCR para determinar mutaciones del sitio objetivo TS-MS26; Las plantas heterocitoqasMS26/ms26 y homocigotas ms26/ms26 mutantes se avanzaron y clasificaron por su capacidad de generar polen funcional (Figura 10A) . En resumen, 34 de 34 de las plantas MS26/ms26 eran fértiles masculinas, mientras que, con dos excepciones, 27 de las 29 plantas ms26/ms26 eran estériles masculinas (Tabla 4). El examen microscópico de las anteras derivado de plantas ms26/ms26 por etapas en un desarrollo tardío de microsporas uninucleadas manifestó una menor cantidad de microsporas de formas anormales (Figura 10B) . Por el contrario, las anteras de las plantas MS26/ms26 contenían muchas microsporas normales (Figura 10C) similares a las observaciones informadas por Li et al. (Plant Cell 2010; 22:173). Las plantas estériles masculinas eran fértiles femeninas, como se demostró por su capacidad de dar semillas cuando se fertilizaron con polen de arroz silvestre.

Tabla 4.

Puntajes de fertilidad de plantas de arroz de semillas autosembradas *Genotipo incorrecto Ejemplo 4 Mutaciones objetivo en el gen MS45 del maíz Las lineas de maíz que comprenden una secuencia de reconocimiento objetivo endógena en su genoma se pusieron en contacto con una meganucleasa diseñada genéticamente de para reconocer específicamente y crear una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo endógena del gen MS45. Los embriones que comprenden un sitio objetivo endógeno se pusieron en contacto con los componentes descritos a continuación, eventos seleccionados y caracterizados.

A. Sitio objetivo TS-MS45 del maíz y endonucleasa MS45 diseñada genéticamente Se seleccionó el sitio objetivo genómico del maíz endógeno en el gen MS45 y conocido como sitio objetivo TS- MS45 (sec. con núm. de ident.: 20), para el diseño de un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente .

La región genómica que comprende el sitio objetivo TS-MS45 tiene la siguiente secuencia, con el sitio objetivo TS-MS45 que se muestra subrayado: ggagttctgcggccggccgctcggcctgaggttccacggggagaccggcgagctctacgtc gccgacgcgtactacggtctcatggtcgt (sec. con núm. de ident.: 19) El sitio objetivo TS-MS45 es un polinucleótido de 22 bp que tiene la siguiente secuencia: CGGGGAGACCGGCAGAGCTCTAC (sec. con núm. de ident.: 20) El sitio de ruptura de cadena doble y región de protuberancia se muestra en negritas, la enzima se corta después del nucleótido 133, según se indica con A.

Se produjo una endonucleasa MS45 diseñada genéticamente designada al reconocimiento del sitio objetivo TS-MS45 bajo un contrato con Precisión BioSciences, Inc. (Durham, NC EE. UU . ) . La endonucleasa MS45 diseñada genéticamente es un heterodimero . Un monómero se designó como MAY1 y el otro se designó como MAY2.

Se adicionó una señal de localización del núcleo (sec. con núm. de ident.: 21) en el extremo amino de cada monómero para mejorar el transporte de la proteina al núcleo. Se construyeron secuencias nucleótidas optimizados para la planta que codifican MAY1 (sec. con núm. de ident.: 22) o MAY2 (sec. con núm. de ident . : 23).

B. Construcción del vector para los vectores de expresión de la planta que codifican la endonucleasa MS45 diseñada genéticamente y repara los ADN para integración del transgen por recombinación homologa.

Las estrategias empleadas para generar y seleccionar alteraciones genómicas producidas no emplean la reconstitución de un cásete de expresión de marcador seleccionable, por lo tanto los vectores del agente inductor de ruptura de cadena doble no tienen un fragmento de un cásete marcador seleccionable. En este ejemplo, los vectores del agente inductor de ruptura de cadena doble tenían un cásete de expresión del marcador fenotípico que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa, que se usaba para validar la producción exitosa del vector.

Los vectores que contienen secuencias optimizadas para la planta que codifican una endonucleasa MS45 se construyeron con el uso de técnicas de biología molecular estándar. El PHP31456 comprende los siguientes componentes unidos operativamente: Ubi pro::ubi 5' UTR: : cMAYl : : pinll : : Ubi pro::ubi 5' UTR: : cMAY2 : : pinll : : 35S CaMV pro : : BAR: : pinll ; en donde ubi pro es el promotor de ubiquitina de maíz, ubi 5' UTR es la región no traducida de 5' del gen de ubiquitina de maíz, cMAYl y cMAY2 son las secuencias de ADN que codifican los monómeros de MAY1 y MAY2, respectivamente, diseñado genéticamente para reconocer específicamente e inducir una ruptura de cadena doble en el sitio objetivo del genoma del maíz TS-MS45 endógeno, 35S CaMV pro es el promotor del virus mosaico de la coliflor 35S, BAR codifica la fosfinotricina acetiltransferasa y pinll es la secuencia de terminación de la transcripción del inhibidor II de la proteinasa de la papa. El PHP31458 comprende los siguientes componentes unidos operativamente: Ubi pro::ubi 5' UTR: : NLS : : cMAYl : : pinll : : Ubi pro::ubi 5' UTR: : NLS : : cMAY2 : : pinll : : 35S CaMV pro: : BAR: : pinll; en donde ubi pro es el promotor de ubiquitina de maíz, ubi 5' UTR es la región no traducida de 5' del gen de ubiquitina de maíz, NLS es un fragmento de ADN que codifica una señal de localización nuclear SV40, cMAYl y cMAY2 son las secuencias de ADN que codifican los monómeros de MAY1 y MAY2, respectivamente, diseñado genéticamente para reconocer específicamente e inducir una ruptura de cadena doble en el sitio objetivo del genoma del maíz TS-MS45 endógeno, 35S CaMV pro es el promotor del virus mosaico de la coliflor 35S, BAR codifica la fosfinotricina acetiltransferasa y pinll es la secuencia de terminación de la transcripción del inhibidor II de la proteinasa de la papa.

Estos vectores fueron diseñado genéticamente para inducir rupturas de cadena doble en el sitio objetivo TS-MS45 y por lo tanto, producir alteraciones en el sitio objetivo TS-MS45. Los componentes del vector de PHP31456 y PHP31458 se insertaron entre el borde derecho y el borde izquierdo de T-ADN para la introducción mediada por Agrobacterium en células vegetales al crear vectores de PHP31457 y PHP31459.

Los embriones inmaduros del maíz 9 a 12 días después de la polinización (DAP) se transformaron con el vector PHP31457 (sec. con núm. de ident . : 30) o PHP31459 (sec. con núm. de ident.: 31) con el uso de métodos mediados por Agrobacterium según se describe en el Ejemplo 2C.

Se usó la resistencia a bialafos para identificar eventos de transformación putativa por selección del callo en los medios que contenían 3 mg/1 de bialafos. El tejido calloso y/o las plantas regeneradas a partir de transformantes estables con el uso de condiciones convencionales de cultivo y regeneración se evaluaron para detectar la modificación del sitio objetivo MPP14 endógeno.

C. Evaluación del maíz transformado para modificación del sitio objetivo TS-MS45 Puede usarse cualquier protocolo estándar para el aislamiento, manejo y caracterización de polinucleótidos y/o proteínas para identificar, seleccionar y caracterizar eventos de modificación putativos.

Se produjeron productos PCR de ADN genómico obtenido de células de maíz transformadas con el uso de iniciadores que flanquean el sitio objetivo y que son purificados por Qiaquick (Qiagen Inc., Valencia, NM, EE. UU.) . La enzima inductora de ruptura de cadena doble o una enzima de restricción contenida en el sitio objetivo se adicionó al ADN de producto PCR sitio objetivo purificado para probar si el sitio objetivo había sido modificado. Esta mezcla se digirió a 37 °C durante 0.5 horas aproximadamente a toda la noche (aproximadamente 17 horas), y el tiempo de digestión dependió de la enzima que se usó. Las muestras con enzima meganucleasa se trataron con 0.5 µ? de proteinasa K y 0.2 µ? de SDS al 20 % para desnaturalizar la proteína. Los productos de digestión se separaron en un gel de agarosa al 1.5-2 %. Los productos sin digerir indican que se modificó el sitio objetivo.

Se evaluó el callo resistente a bialafos y/o los eventos de la planta T0 para detectar mutaciones en el sitio objetivo TS-MS45 por amplificación de PCR de la región del sitio objetivo mediante el uso de un par de iniciadores que produjeron un producto de 389 bp . Las muestras que produjeron el producto PCR de 389 bp se sometieron a digestión enzimática con una endonucleasa MS45 diseñada genéticamente. En algunos casos el producto PCR se clonó y secuenció directamente. No se identificaron eventos de transformación con modificaciones del sitio objetivo TS-MS45 en aproximadamente 300 plantas transformadas analizadas.

D. Me oramientos en la endonucleasa MS45 diseñada genéticamente Otra evaluación de la endonucleasa MS45 diseñada genéticamente indicó que la actividad de esta nucleasa era inferior a la de otras nucleasas, por ejemplo, MS26+ y MS26++, que pudieron producir modificaciones de los sitios objetivo del maíz endógeno.

Un mejoramiento en el diseño de la endonucleasa MS45 diseñada genéticamente que se esperó aumentara la actividad de nucleasa en el maíz es una proteina de cadena única que comprende los monómeros MAY1 y MAY2 fusionados con el uso de un polipéptido de unión. Los monómeros AY1 y MAY2 pueden unirse para crear una proteina de cadena única de la forma MAYl-conector-MAY2 o MAY2-conector-MAYl . Un gen optimizado para la planta que codifica una proteina MAY1-conector-MAY2 se muestra en la sec. con núm. de ident.: 34. Si se desea, se puede adicionar una señal de localización nuclear (por ejemplo, sec. con núm. de ident.: 21) al extremo amino de esta proteina.

E. Método alternativo para producir genes de endonucleasas MS45 diseñado genéticamente en las células de maíz Introducción de un gen de endonucleasa MS45 diseñado genéticamente por medio de un método de producción de ADN directo, por ejemplo, bombardeo de particular, aumenta la cantidad de copias del gen de meganucleasa, comparado a la introducción del gen de meganucleasa por medio de Agrobacterium; la cantidad de copias del gen de meganucleasa aumentadas incrementa la frecuencia de las modificaciones del sitio objetivo en 10 a 50 veces. Los embriones de maíz inmaduros de plantas donantes cultivadas en el invernadero o en el campo High tipo II (Hill) se bombardean al menos con un constructo del polinucleótido que se describió anteriormente. Si el constructo no incluye un marcador seleccionable, otro polinucleótido que contiene un gen marcador seleccionable puede coprecipitarse en las partículas usadas para el bombardeo .

Las espigas se cosechan de 8 a 12 días después de la polinización para el aislamiento de embriones fertilizados. La superficie de las espigas cosechadas se esteriliza en blanqueador Clorox® al 50 % más detergente Micro al 0.5 % durante 20 minutos y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se aislan y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa. Estos se cultivan en un medio de agar 560L durante 4 días antes del bombardeo en la oscuridad. El medio 560L es un medio basado en ?ß que contiene vitaminas de Eriksson, tiamina, sacarosa, 2,4-D y nitrato de plata. El día del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio 560Y durante 4 horas y se los coloca en una zona objetivo de 2.5 cm. El medio 560Y es un medio osmótico alto (560L con una alta concentración de sacarosa) .

Se preparan partículas por precipitación del ADN para pasara a gránulos de oro de 1.0 pm (diámetro promedio) con el uso de un procedimiento de precipitación de CaCl2 de la siguiente manera: 100 µ? de partículas de oro preparadas (0.6 mg) en agua, 20 µ? (2 µg) de ADN en regulador de TrisEDTA (1 g total), 100 µ? de 2.5 M de CaC12, 40 µ? 0.1 M de espermidina. Se agrega cada reactivo secuencialmente a la suspensión de partículas de oro. La mezcla final se sónica brevemente. Después del período de precipitación, se centrifugan las partículas brevemente, se lavan con 500 µ? de etanol al 100 %, granulada nuevamente y resuspendida en 60 µ? de etanol al 100 % para preparar la suspensión final. Los macroportadores se preparan por sonicación breve de la preparación final, se colocan 5 µ? en el centro de cada macroportador y se seca por 2 minutos aproximadamente antes del bombardeo. Las placas de muestra se bombardean a una distancia de 8 cm desde la pantalla de parada al tejido, con el uso de una pistola de partículas de helio de DuPont Biolistics. Todas las muestras reciben un solo disparo a 4481.6 kPa (650 PSI) con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de las partículas/ADN que se prepararon.

Alternativamente, el ADN que se producirá está asociado con micropartículas con el uso de un reactivo que comprende una solución lipidica catiónica. Por ejemplo, se añaden soluciones de ADN a 50 µ? de una solución madre de partículas de oro (0.1 vq/]il de 0.6 micrones de partículas de oro) . Se añade una solución madre de ADN, 10 µ? de una solución de plásmido de 0.1 µg/µl a 30 µ? de agua. A esta mezcla de ADN se añaden 50 µ? de la solución madre de oro y la mezcla se sónica brevemente. Después, se añade 5 µ? de TFX-50™ (Promega Corp, Madison WI) y se coloca la muestra en un agitador giratorio a 100 rpm durante 10 minutos. La mezcla se centrifuga brevemente para precipitar las partículas de oro y eliminar el sobrenadante. Una vez eliminado el exceso de solución de ADN/TFX, se añade 120 µ? de EtOH absoluto y se dispensan alícuotas de 10 µ? en los macroportadores usados típicamente con la pistola de partículas de helio DuPont PDS-1000. La partículas de oro con el ADN adherido se dejan secar en los portadores y, después, se usan para el bombardeo de partículas estándar.

Cuatro a 12 horas después del bombardeo, los embriones se trasladan a un medio de iniciación del callo osmótico bajo durante 3 a 7 días a 28 °C, después, se transfieren a un medio de selección y se subcultivan cada 2 semanas. La incubación de los embriones post bombardeo por aproximadamente 48 h a 32 °C aumenta la frecuencia de modificaciones del sitio objetivo de 2 a 4 veces para la mayoría de las meganucleasas . Después de 10 semanas aproximadamente, los embriones se transfieren a medios de regeneración. Después, de 2 a 4 semanas de maduración de embriones somáticos, los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren a un medio de germinación en una sala de cultivo iluminada. Aproximadamente 7 a 10 días más tarde, las plántulas en desarrollo se transfieren a tubos hasta que estén bien consolidadas y puedan transplantarse a macetas o recipientes y crecer hasta su madurez.

Ejemplo 5 Plantas de sorgo estériles masculinas producidas por mutagénesis específica de un gen de tipo citocromo P450, MS26, con el uso de una endonucleasa S26 diseñada genéticamente A. Sitio objetivo TS-MS26 y las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente Como se describe en el Ejemplo 2, se seleccionó el sitio objetivo TS-MS26 para el diseño de las endonucleasas MS26 diseñadas genéticamente. La región genómica comprende el sitio objetivo TS-MS26 en el sorgo {Sorghum bicolor) se muestra en la Figura 3 (sec. con núm. de ident.: 15).

B. Vectores y transformación Los embriones de sorgo inmaduro (Sorghum bicolor) contienen el sitio objetivo MS26 (TS-MS26, sec. con núm. de ident.: 1) se usaron como objetivos de transformación para producir ADN de Agrobacterium. PHP42063 (sec. con núm. de ident.: 61) se usó para generar eventos de callos de sorgo por transformación mediada por Agrobacterium. El PHP42063 contiene una endonucleasa MS26+ de cadena única (se describe en el Ejemplo 2) se coloca bajo el control transcripcional del promotor CASI del maíz. Se demostró que el promotor CASI ha sido inducido transcripcionalmente por sulfonilurea-protectora, 2-CBSU, o por temperatura elevada (solicitud de patente de los EE. UU. núm. 61/648, 758, presentada el 18 de mayo de 2012) . El PHP42063 contiene, además, un gen azul fluorescente (CFP) regulado por el promotor de ZmEND2 que se usa como marcador visual para la selección de integración del T-ADN en células del sorgo. Además, el PHP42063 contiene, además, una copia de un gen fluorescente rojo regulado por el promotor de la histona 2B del maíz. Una parte del gen fluorescente rojo en este constructo se duplicóen una orientación directa, que consiste en dos fragmentos del gen RFP con 369 bp de superposición. Los dos fragmentos se separaron por un espaciador de 136-bp que contiene un sitio objetivo MS26, según se describe para PHP40827 (Fig. 6, sec. con núm. de ident.: 60). Los embriones inmaduros se transformaron con PHP42063 de acuerdo a Zhao et al {Plant Molecular Biology 44: 789-798, 2000). Los callos azules fluorescentes se seleccionaron y usaron para la regeneración de plantas y se cultivaron en invernadero hasta su madurez y producción de semillas. Las plantas de sorgo gue contienen inserciones de ADN de PHP42063 se verificaron por análisis de la cantidad de copias. Cuatro plantas transformadas de PHP42063 de una o baja copia independiente se seleccionaron para un experimento adicional. Se cosecharon embriones inmaduros azules fluorescentes 14 a 20 días después de la polinización, esterilizados, colocados en un medio de mantenimiento (PHI-U sin selección de PPT) e incubados en la oscuridad a temperatura ambiente (23C-26C) o a una temperatura elevada de 37C durante 24 a 48 horas. Al final de este periodo, los embriones incubados a una temperatura elevada se colocaron a temperatura ambiente (<26 °C) y se dejaron crecer en la oscuridad. Como se describió arriba, los embriones que contienen PHP42063 y se mantienen a 26 °C después de la cosecha solo son azules fluorescente debido a la expresión del marcador CFP. Por el contrario, aproximadamente 72 horas después del tratamiento a temperatura elevada, los embriones incubados a 37 °C comienzan a desarrollar sectores fluorescentes rojos en el embrión. Esta observación sugiere que el cásete del gen inducible por calor, CASI : S26+, produjo rupturas de cadena doble en el sitio objetivo MS26 entre las dos secuencias superpuestas de la recombinación intramolecular promotora reportada RF-FP y que produjo un gen RPF funcional que se revela por la aparición de células rojo fluorescentes contra un fondo azul fluorescente. Los eventos del callo rojo fluorescente seleccionado para la regeneración de la planta y caracterización molecular y fenotipica adicional.

C. Identificación de mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26 en tejidos de sorgo Se evaluaron plantas regeneradas para detectar mutaciones del sitio objetivo TS-MS26 por amplificación de la región por PCR con el par iniciador UNIMS26 5' -2 (GACGTGGTGCTCAACTTCGTGAT, sec. con núm. de ident . : 17) y UNIMS26 3'-l (GCCATGGAGAGGATGGTCATCAT, sec. con núm. de ident.: 18) y la digestión de los productos amplificados con la enzima de restricción del ADN, BsiWI, que reconoce la secuencia 5' -CGTACG-3' . Se realizó electroforesis a los productos de estas reacciones en 1 % de geles de agarosa y se evaluaron para determinar las bandas resistentes a la digestión BsiWI que indican mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26.

Ciento veintinueve de 389 plantas regeneradas de embriones PHP42063 tratados con calor generados contienen productos PCR resistentes a la digestión de la enzima de restricción BsiWL, que indica mutaciones del sitio objetivo TS-MS26. La subclonación y el análisis de la secuencia de ADN de estos productos PCR reveló diferentes mutaciones en la región TS-MS26 que consistieron principalmente en deleciones en el sitio objetivo TS-MS26 que comprende de 3 a 98 nucleótidos. Ocasionalmente, se detectaron pequeñas inserciones de uno a 11 nucleótidos. En total, se identificaron 16 mutaciones no idénticas en estas plantas de sorgo regeneradas (Figura 12, sec. con núm. de ident.: 62-78). Para el análisis fenotipico se usaron plantas que contenían mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26.

D. Análisis fenotipico de plantas de sorgo que contienen mutaciones MS26 Se cultivaron plantas regeneradas que contenían mutaciones en TS-MS26 en el sorgo en condiciones de invernadero y se les permitió que produjeran semillas autosembradas (semilla TI) . Se evaluó el fenotipo de fertilidad masculina al plantar semillas TI de plantas que contienen la deleción de 78 bp (ms26.78A en el sitio objetivo TS-MS26 y permitir la floración a estas plantas. Antes de florecer, se evaluaron las semillas por PCR para detectar mutaciones en el sitio objetivo TS-MS26; se identificaron y avanzaron las plantas MS26/ S26 (silvestre), MS26/ms26.78? (heterocigota) y ms26.78A/ms26.78? (recesivas). Se determinó la fertilidad masculina al examinar las anteras para determinar el desarrollo de granos de polen llenos de almidón junto con la capacidad de la planta de producir semillas propias. Como se muestra en la Figura 13A, los panículos de MS26/ ms26.78A revelaron extrusión de anteras, desprendimiento de polen y producción de semillas. Por el contrario, las plantas ms26.78A / ms26.78A (Figura 13B) extrudieron pequeñas anteras marchitas, no desprendieron polen ni produjeron semillas. Por el contrario, el examen de las anteras de las plantas MS26/ ms26.78A (Figura 14A) , anteras de plantas ms26.78A / ms26.78A fueron pequeñas (Figura 14B) . Además, cuando las anteras de estas plantas se examinaron detenidamente, se detectó fácilmente polen en las anteras de MS26/ ms26.78A (Figura 14C) ; sin embargo, no se observó polen en las anteras de las plantas ms26.78A / ms26.78A (Figura 14D) . Se observó una buena relación entre el fenotipo de la fertilidad y el genotipo MS26. En resumen, todas las plantas MS26/MS26 y MS26/ ms26.78A fueron fértiles masculinas, mientras que todas las plantas ms26.78A / ms26.78A fueron estériles masculinas (Tabla 5). Estas plantas estériles masculinas eran fértiles femeninas, como se demostró por su capacidad de producir semillas cuando se fertilizaron con polen de sorgo silvestre (no se presentan estos datos) .

Tabla 5 Puntajes de fertilidad de plantas de sorgo Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos con experiencia en la técnica a quienes se dirige la presente invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente descripción como referencia con el mismo alcance como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara especifica e individualmente para incorporarla como referencia .

Claims (46)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una modificación objetivo en un gen de fertilidad masculina en el genoma de una planta; el método comprende: (a) contactar al menos una célula vegetal que comprende una secuencia objetivo en un gen de fertilidad masculina con un agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente que tiene la capacidad de inducir una ruptura de cadena doble en la secuencia objetivo; y (b) identificar al menos una célula de un paso (a) que comprende una alteración en su genoma de la secuencia objetivo en donde la alteración se selecciona en un grupo que consiste en el (i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) a (iii) ; en donde la alteración del gen de fertilidad masculina es una mutación nula.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el gen de fertilidad masculina se selecciona de un grupo que consiste en MS26, MS45, BS92-7, 5126 y Mscal.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además, la regeneración de una planta fértil que comprende la alteración.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente es una endonucleasa, una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa efectora TAL, una transposasa, o una recombinasa específica del sitio.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la endonucleasa se modifica específicamente para cortar la secuencia objetivo, y en donde la endonucleasa ya no corta su secuencia objetivo de endonucleasa silvestre.

6. El método de la reivindicación 4, en donde una planta que es homocigota para la mutación nula es estéril masculina .

7. El método de la reivindicación 3, que comprende, además, la autofertilización de la planta fértil y la selección de la planta progenie gue resulta de ella, en donde la planta progenie es homocigota para la alteración.

8. El método de la reivindicación 3, que comprende, además, cruzar la planta fértil con una segunda planta fértil que comprende una mutación nula en el gen de fertilidad masculina, y seleccionar una planta progenie que resulta de allí, en donde la planta progenie es estéril masculina .

9. El método de la reivindicación 1, caracterizada además porque la alteración comprende la inserción de un transgen que comprende un polinucleotido de interés.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el transgen comprende, además, un promotor operativamente unido al polinucleotido de interés, en donde el promotor tiene la capacidad de dirigir la expresión del polinucleotido de interés en una planta.

11. El método de la reivindicación 9, en donde el polinucleotido de interés codifica un marcador fenotípico o un ARN o proteína que proporciona una ventaja agronómica a la planta.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la planta se selecciona de un grupo que consiste en maíz, sorgo, arroz, trigo, cebada, centeno, mijo y avena.

13. El método de la reivindicación 1, en donde el gen de la fertilidad masculina es MS26.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la secuencia objetivo comprende la secuencia nucleótida especificada en la sec. con núm. de ident.: 1.

15. El método de la reivindicación 13, en donde el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente deriva de I-Creí.

16. El método de la reivindicación 14, en donde el paso (a) comprende la introducción en al menos una célula vegetal de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la secuencia nucleótida se selecciona del grupo que consiste en : (a) la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, 5, 6, o 7; y (b) una secuencia nucleótida que tiene una identidad de al menos 80 % de la secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms . de ident.: 4, 5, 6, y 7, en donde la secuencia nucleótida codifica un polipéptido que comprende la actividad de endonucleasa .

18. El método de la reivindicación 17, en donde el constructo del ácido nucleico comprende, además, un promotor operativamente unido a la secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia nucleótida en una célula vegetal.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el promotor es un promotor de ubiquitina de maiz.

20. El método de la reivindicación 17, en donde el constructo de ácido nucleico comprende, además, una secuencia codificadora unida operativamente para una señal de localización nuclear.

21. El método de la reivindicación 20, en donde la señal de localización nuclear comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident.: 2, 3, y 21.

22. El método de la reivindicación 1, en donde el gen de fertilidad masculina es MS45.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la secuencia objetivo comprende la secuencia nucleótida especificada en la sec. con núm. de ident.: 20.

24. El método de la reivindicación 22, en donde el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente deriva de I-Creí.

25. El método de la reivindicación 23, en donde el paso (a) comprende la introducción en al menos una célula vegetal de un constructo de acido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica totalmente o en parte el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente.

26. El método de la reivindicación 25, en donde la secuencia nucleótida se selecciona del grupo que consiste en : (a) la secuencia nucleótida que se expone en la sec. con núm. de ident . : 22, 23, o 34; y (b) una secuencia nucleótida que tiene una identidad de al menos 80 % de la secuencia nucleótida hasta al menos una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleótidas expuestas en la sec. con núms . de ident.: 22, 23, y 34, en donde la secuencia nucleótida codifica un polipéptido que comprende la actividad de endonucleasa.

27. El método de la reivindicación 26, en donde el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido .

28. El método de la reivindicación 26, en donde el constructo del ácido nucleico comprende, además, un promotor operativamente unido a la secuencia nucleótida que codifica el agente inductor de ruptura de cadena doble diseñado genéticamente, en donde el promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia nucleótida en una célula vegetal.

29. El método de la reivindicación 28, en donde el promotor es un promotor de ubiquitina de maíz.

30. El método de la reivindicación 26, en donde el constructo de ácido nucleico comprende, además, una secuencia codificadora unida operativamente para una señal de localización nuclear.

31. El método de la reivindicación 30, en donde la secuencia de codificación para una señal de localización nuclear se selecciona del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident . : 2, 3, y 21.

32. Una planta producida por el método de reivindicación 1, o un descendiente de la planta producido por el método, en donde el descendiente comprende la alteración .

33. La planta de la reivindicación 32, en donde la planta es una planta de sorgo y el gen de fertilidad masculina es MS26.

34. La planta de la reivindicación 33, en donde el gen alterado MS26 comprende una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms. de ident.: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.

35. Una planta que comprende una modificación objetivo en un gen de fertilidad masculina en su genoma, en donde la modificación es una mutación especifica o la inserción de un transgen, y en donde el gen de fertilidad masculina se selecciona de un grupo que consiste en MS26, MS45, BS92-7, 5126 y Mscal.

36. La planta de la reivindicación 35, en donde la modificación objetivo es una mutación nula en el gen de fertilidad masculina.

37. La planta de la reivindicación 36, en donde la planta es homocigota para la alteración.

38. La planta de la reivindicación 37, en donde la planta es estéril masculina.

39. La planta de la reivindicación 35, en donde la planta se selecciona de un grupo que consiste en maíz, sorgo, arroz, trigo, cebada, centeno, mijo y avena.

40. La planta de la reivindicación 39, en donde la planta es una planta de sorgo que comprende una mutación especifica en el gen de fertilidad masculina MS26.

41. La planta de la reivindicación 40, en donde el gen MS26 comprende una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident.: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78.

42. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un gen de fertilidad masculina producida por el método de la reivindicación 1, en donde el gen de fertilidad masculina comprende la alteración.

43. Una planta que comprende un constructo de expresión; el constructo de expresión comprende un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica una endonucleasa, en donde la endonucleasa tiene la capacidad de unirse específicamente a y crear una ruptura de cadena doble en una secuencia objetivo seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident .: 1 y 20, y en donde el promotor tiene la capacidad de activar la expresión de una secuencia nucleótida unida operativamente en una célula vegetal.

44. La planta de la reivindicación 43, en donde la secuencia nucleótida comprende una secuencia codificante de un dominio de unión al ADN de una endonucleasa, y en donde la secuencia codificante se selecciona del grupo que consiste en: (a) los nucleótidos 100-261 y los nucleótidos 661 -822 de la sec. con núm. de ident.: 4 ; (b) los nucleótidos 70-231 y los nucleótidos 631-792 de la sec. con núm. de ident.: 5; (c) los nucleótidos 70-231 y los nucleótidos 820-981 de la sec. con núm. de ident.: 6, 7 o 34; y (d) una secuencia de codificación degenerada de (a) , (b) , o (c) .

45. La planta de la reivindicación 43, en donde la secuencia nucleótida se selecciona del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 4, 5, 6, 7, 22, 23, y 34.

46. Un constructo de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia nucleótida seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident.: 4, 5, 6, 7, 22, 23, y 34.