MX2013014893A

MX2013014893A - Transaminasas inmovilizadas y procedimiento para la preparacion y uso de transaminasa inmovilizada.

Info

Publication number: MX2013014893A
Application number: MX2013014893A
Authority: MX
Inventors: Gregory Hughes; Matthew D Truppo; Jacob M Janey
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2014-02-17
Also published as: US20140106413A1; WO2012177527A1; CN103608355B; US9587229B2; JP2014519847A; JP2017079774A; EP2723763A1; JP6284474B2; CA2838744C; CA2838744A1; AU2012273271A1; CN103608355A; EP2723763A4; AR086719A1; TW201311890A; MX348130B

Abstract

La invención se dirige a las transaminasas inmovilizadas y a los procedimientos para la preparación y el uso de las mismas.

Description

TRANSAMINASAS INMOVILIZADAS Y PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN Y USO DE TRANSAMINASA INMOVILIZADA CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La invención se dirige a transaminasas inmovilizadas y procedimientos para su preparación y uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enzimas son moléculas de proteina que sirven para acelerar las reacciones químicas de las células vivas (a menudo mediante varios órdenes de magnitud). Sin las enzimas, la mayoría de las reacciones bioquímicas serían demasiado lentas incluso para llevar a cabo los procesos vitales. Las enzimas muestran gran especificidad y no se modifican permanentemente mediante su participación en reacciones. Ya que no cambian durante las reacciones, las enzimas se pueden usar de manera rentable como catalizadores para una transformación química deseada.

Las transaminasas son una clase específica de enzimas que catalizan la aminación directa de las cetonas en aminas quirales. Las aminas quirales enantioméricamente puras son intermedios clave en un número de compuestos farmacéuticos que poseen un amplio intervalo de actividades biológicas. Actualmente hay en curso un esfuerzo considerable para desarrollar procedimientos catalíticos eficaces para su preparación usando biocatalizadores. Recientemente las transaminasas han surgido como biocatalizadores prometedores para la producción de amina quiral. Truppo et al., Efficient kinetic resolution of recemic amines using a transaminase ¡n combination with an aromo acid oxidase, Chem. Commun., 2009, 2127-2129; y Truppo et al., Efficient Production of Enantiomerically Puré Chiral Amines at Concentrations of 50g/L Using Transaminases, Organic Process Research & Development 2010, 14, 234-237.

Por ejemplo, la hidrogenación de enamina asimétrica catalizada por rodio se usó originalmente para la fabricación a gran escala del compuesto antidiabético sitagliptina. El rodio se sustituyó con una transaminasa que ha llevado en última instancia a un procedimiento enzimático que reduce el desecho, mejora el rendimiento y la seguridad y elimina la necesidad de un catalizador metálico. Además, el biocatalizador resultante mostró una amplia aplicabilidad hacia la síntesis de aminas quirales que anteriormente solo eran accesibles mediante resolución. Savile et al., Biocatalytic Asymmetric Synthesis of Chiral Amines from Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture, Science, Vol. 329, páginas 305-309, 16 July 2010.

Aunque los avances en la producción de aminas quirales usando transaminasas han gozado de gran prestigio, aún existen algunos inconvenientes para el procedimiento enzimático. Actualmente los procesos enzimáticos sólo se pueden realizar en sistemas disolventes acuosos ya que las transaminasas no son estables en el 100% de los disolventes orgánicos.

Adicionalmente, durante el aislamiento de la amina producto, el catalizador de la transaminasa se desactiva y se descarta dando como resultado la incapacidad para volver a utilizar el catalizador.

De esta manera, aunque se han producido intentos para inmovilizar las transaminasas ninguno ha tenido éxito en la superación de su falta de estabilidad, más específicamente su falta de estabilidad en disolventes orgánicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En el presente documento se describen las transaminasas inmovilizadas que comprenden una transaminasa recombinante acoplada físicamente a una resina mediante interacciones hidrofóbicas éter o mediante enlaces covalentes. Las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento incluyen las transaminasas recombinantes que son capaces de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/^)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en presencia de un grupo amino dador a niveles cuantificables mediante una técnica de análisis. En determinadas realizaciones las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento se usan para preparar (2f?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8 -/)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina.

En determinadas realizaciones, en el presente documento se describen las transaminasas inmovilizadas que comprenden una transaminasa recombinante que es capaz de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en (2 :?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]tr¡azol[4,3-a]pirazin-7(8 ^-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en presencia de un grupo amino dador a niveles cuantificables mediante una técnica de análisis; y una resina, en la que la transaminasa recombinante se acopla a la resina mediante enlaces covalentes o interacciones hidrofóbicas y en la que la transaminasa inmovilizada es estable en un sistema disolvente que comprende al menos un 90% de disolventes orgánicos.

Por ejemplo en una realización, la transaminasa recombinante se acopla a una resina mediante interacciones hidrofóbicas. En otra realización, la transaminasa recombinante se acopla a una resina mediante enlaces covalentes.

Las transaminasas inmovilizadas que se describen en el presente documento son estables en sistemas disolventes orgánicos. Como se usa en el presente documento transaminasas inmovilizadas estables quiere decir que la transaminasa inmovilizada mantiene su conformación estructural o su actividad, en sistemas disolventes orgánicos. En una realización descrita en el presente documento, la transaminasa inmovilizada es estable en un sistema disolvente que comprende al menos un 95% de disolventes orgánicos.

En determinadas realizaciones descritas en el presente documento, la transaminasa recombinante es una transaminasa que es capaz de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en {2f?)-4-oxo-4-[3-(tr¡fluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en presencia de un grupo amino dador a niveles cuantifícables mediante absorbancia HPLC-UV.

Aún en otra realización la transaminasa recombinante se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168. La transaminasa recombinante se selecciona preferentemente del grupo que consiste en. SEQ ID NO: 80, 86, 96, 98, 100, 102, 110 o 166. En una realización la transaminasa recombinante es SEQ ID NO: 102. En otra realización, la transaminasa recombinante es SEQ ID NO: 110.

En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, la resina comprende polimetacrilato con grupos funcionales epóxido, polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido, copolimero de estireno/ DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo. Por ejemplo en una realización, la resina comprende copolimero de estireno/ DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo. En otro ejemplo, la resina es polimetacrilato con grupos funcionales epóxido o polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido. En otras realizaciones, la resina se selecciona del grupo que consiste en: SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S, SEPABEADS EXA252, SEPABEADS EXE119 y EPABEADS EXE120. Por ejemplo en una realización, la resina selecciona del grupo que consiste en: SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S y SEPABEADS EXE119. La resina se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: SEPABEADS EXA252 y SEPABEADS EXE120.

En una realización de la transaminasa inmovilizada, la transaminasa SEQ ID NO: 110 se acopla físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi). En otra realización, la transaminasa SEQ ID NO: 102 se acopla físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

También se describen en el presente documento procedimientos para la preparación y el uso de las transaminasas inmovilizadas. Las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento se pueden usar en reacciones discontinuas, en las que las transaminasas inmovilizadas se pueden filtrar al completar la reacción y se pueden volver a usar en otras reacciones. Alternativamente, las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento se pueden usar en un sistema de reacción continuo en el que el material de partida se pasa continuamente sobre la transaminasa inmovilizada y se recoge el producto.

En una realización, el procedimiento descrito en el presente documento es un procedimiento para la preparación de (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina que comprende las etapas de: 1) disolución de 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en un disolvente orgánico; 2) puesta en contacto de 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1I2,4]triazol[4)3-a]pirazin-7(8Ay)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona con una transaminasa inmovilizada que es capaz de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4l3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4)5-trifluorofenil)butan-2-ona en (2f?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]tr¡azol[4,3-a]pirazin-7(8/-/)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en presencia de un grupo amino.

En tal procedimiento la transaminasa inmovilizada es preferentemente la transaminasa SEQ ID NO: 1 0 acoplada físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

También se describe en el presente documento un procedimiento para la preparación de una transaminasa inmovilizada que comprende: 1) incubación de una disolución de transaminasa con una resina y una disolución de enzima para formar una transaminasa inmovilizada; 2) filtrado y aclarado de la transaminasa inmovilizada; 3) secado de la transaminasa inmovilizada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones "Transaminasa", también llamada "aminotransferasa", se usa en el presente documento en referencia a un polipéptido con una capacidad enzimática para transferir un grupo amino (NH2) y un átomo de hidrógeno desde una amina primaria (3) a un compuesto carbonilo aceptor (2), convirtiendo a la amina dadora en su compuesto carbonilo correspondiente (4) y al aceptor en su amina primaria correspondiente (1): (3) (2) (4) (1) Con respecto a las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, los polipéptidos transaminasa son capaces de convertir el sustrato de fórmula (2a), 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]tr¡azol[4,3-a]pirazin-7(8/- -il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona (el "sustrato cetoamida"), en el producto de fórmula (1a) (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2 trifluorofenil)butan-2-amina (el "producto") en presencia de un grupo amino dador de fórmula (3), como se indica a continuación: en la que, R1, R2, R3 y R4, cuando se toma cada uno independientemente, es un grupo alquilo, un grupo alquilarilo o un grupo arilo que no se sustituye o se sustituye con uno o más grupos no inhibidores enzimáticamente. R1 y R3 pueden ser el mismo o diferente a R2 y R4 respectivamente en estructura o quiralidad. Los grupos R1 y R2 o R3 y R4, tomados en conjunto, pueden formar un anillo que no está sustituido, sustituido o fusionado a otros anillos "Proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente en el presente documento para designar a un polímero de al menos dos aminoácidos unidos de modo covalente mediante un enlace amida, a pesar de la longitud o modificación post-traduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etcétera.). Dentro de esta definición se incluyen los aminoácidos D- y L- y las mezclas de los aminoácidos D- y L-.

Sustrato" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo amino aceptor, como una cetona, que acepta el grupo amino de un grupo amino dador en una reacción mediada mediante una transaminasa. Los sustratos pueden incluir el compuesto de fórmula (II), el compuesto de fórmula (2) y el compuesto de fórmula (2a), como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinados procedimientos descritos en el presente documento, "sustrato cetoamida" se refiere específicamente al compuesto de fórmula (2a), 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]triazol[4,3-a]piraz¡n-7(8H)-il]-1-(2l4,5-trifluorofenil)butan-2-ona.

Grupo amino dador" se refiere a un compuesto amino capaz de ceder un grupo amino a un compuesto carbonilo aceptor (es decir, un grupo amino aceptor), convirtiéndose de ese modo en un subproducto carbonilo. Los grupos amino dadores son moléculas de fórmula general (3), (3) en la que, R , R2, cuando se toma cada uno independientemente, es un grupo alquilo, un grupo alquilarilo, un grupo arito que no se sustituye o se sustituye con uno o más grupos no inhibidores enzimáticamente R1 puede ser el mismo o diferente de R2 en estructura o quiralidad. Los grupos R1 y R2, tomados en conjunto, pueden formar un anillo que no está sustituido, sustituido o fusionarse a otros anillos. Grupos amino dadores típicos que se pueden usar con la invención incluyen aminoácidos quirales y no quirales y aminas quirales y no quirales.

"Amina quiral" se refiere a las aminas de fórmula general R CH(NH2)-R2 en las que y R2 no son idénticos y se usa en el presente documento en su sentido más amplio, incluyendo una gran diversidad de compuestos alifáticos y alicíclicos de tipos diferentes, mixtos y funcionales, caracterizados por la presencia de un grupo amino primario unido a un átomo de carbono secundario que, además de un átomo de hidrógeno, lleva (i) un grupo divalente que forma una estructura quiral cíclica o (ii) dos sustituyentes (que no sean hidrógeno) diferenciándose entre si en estructura o quiralidad. Los grupos divalentes que forman una estructura cíclica quiral incluyen, por ejemplo, 2-metilbutano-1 ,4-diilo, pentano-1 ,4-diilo, hexano-1 ,4-diilo, hexano-1 ,5-diilo, 2-metilpentano-1 ,5-diilo. Los dos sustituyentes distintos en el átomo de carbono secundario (R-i y R2 mencionados anteriormente) también pueden variar ampliamente en incluyen alquilo, aralquilo, arilo, halo, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior, cicloalquilo, carboxi, carboalcoxi, carbamoílo, carbamoilo sustituido mono- y di-(alquílo inferior), trifluorometilo, fenilo, nitro, amino, amino sustituido mono- y di-(alquilo inferior), alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etcétera, así como alquilo, aralquilo o arilo sustituido mediante lo anterior.

"Subproducto carbonilo" se refiere al compuesto carbonilo formado a partir del grupo amino dador cuando el grupo amino en el grupo amino dador se transfiere al grupo amino aceptor en una reacción de transaminación. El subproducto carbonilo tiene la estructura general de fórmula (4): en la que R-i y R2 se definen anteriormente para el grupo amino dador.

"Piridoxal-fosfato", "PLP", "piridoxal-5'-fosfato", "PYP" y "P5P" se usan de manera indistinta en el presente documento para referirse al compuesto que actúa como una coenzima en las reacciones de la transaminasa. En algunas realizaciones, el piridoxal fosfato se define mediante la estructura del ácido 1-(4'-formil-3'-hidroxi-2'-metil-5'-piridil) metoxifosfónico, número CAS [54-47-7]. El piridoxal-5 -fosfato se produce en vivo mediante la fosforilación y la oxidación de piridoxol (también conocido como piridoxina o Vitamina B6). En las reacciones de transaminación que usan enzimas transaminasa, el grupo amino del grupo amino dador se transfiere a la coenzima para producir un subproducto ceto, mientras que el piridoxal-5'-fosfato se convierte en fosfato de piridoxamina. El piridoxal-5'-fosfato se regenera por reacción con un compuesto ceto distinto (el grupo amino aceptor). La transferencia del grupo amino desde el fosfato de piridoxamina al amino aceptor produce un amina quiral y regenera la coenzima. El piridoxal-5'-fosfato de la presente invención se puede sustituir mediante otros miembros de la familia de la vitamina B6, que incluyen, entre otros, piridoxal (PL), piridoxamina (PM) y sus homólogos fosforilados; fosfato de piridoxina (PNP) y fosfato de piridoxamina (PMP).

"Presente en la naturaleza" o "silvestre" se refiere a una forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido natural o silvestre o una secuencia de polinucleótidos es una secuencia presente en un organismo que se puede aislar a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado de manera intencional mediante manipulación humana.

"Recombinante" cuando se usa en referencia a, por ejemplo, una célula, un ácido nucleico o un polipéptido, se refiere a un material o a un material que corresponde a la forma natural o nativa del material, que se ha modificado de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o es idéntico a él pero producido o derivado de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando técnicas de recombinación. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, las células recombinantes que expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan de otra manera a un nivel diferente.

"Porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de identidad" y "porcentaje idéntico" se usan en el presente documento para referirse a comparaciones entre secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos y se determinan mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) cuando se compara con la secuencia de referencia para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica o el residuo de aminoácido sucede en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o un residuo de aminoácido se alinea con un hueco para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de la secuencia. La determinación de la alineación óptima y el porcentaje de la identidad de la secuencia se realiza usando los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (véase por ejemplo, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402). El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible al público a través del sitio web de Información del Centro Nacional de Biotecnología.

En pocas palabras, los análisis BLAST implican primero la identificación de pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia solicitada, que coinciden o satisfacen algún resultado de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere como la palabra más cercana en el umbral de puntuación (Altschul et al, supra). Estos éxitos de las palabras vecinales iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Las palabras de éxito se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las palabras de éxito en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulada desciende a la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada es menor o igual que cero, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa o a que se alcanza el final de cada secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST, determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11 , una expectativa (E) de 10, = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, 1989, Proc Nati Acad Sci USA 89: 10915).

Otros numerosos algoritmos están disponibles y funcionan de manera similar a como funciona BLAST proporcionando una identidad de porcentaje para dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede dirigir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444, medíante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el GCG Wisconsín Software Package) o mediante inspección visual (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa de participación entre Greene Publíshing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)). Adicíonalmente, la determinación de la alineación de la secuencia y el porcentaje de la identidad de la secuencia pueden emplear los programas BESTFIT o GAP en el paquete de GCG Wisconsín Software (Accelrys, Madíson Wl) usando los parámetros de los valores predeterminados proporcionados.

"Identidad sustancial" se refiere a una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos que tiene al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 85 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 89 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia e incluso más preferentemente al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de residuo, frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 30-50 residuos, en la que el porcentaje de la secuencia identidad se calcula comparando la secuencia de referencia con una secuencia que incluye supresiones o adiciones que suman un total de 20 por ciento o menor de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. En realizaciones especificas aplicadas a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de polipéptidos, cuando se alinean óptimamente, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT usando los pesos de los huecos predeterminados, comparten una identidad de secuencia de al menos un 80 por ciento de la identidad de secuencia, preferentemente al menos un 89 por ciento de la identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 95 por ciento de la identidad de secuencia o más (por ejemplo, un 99 por ciento de la identidad de secuencia). Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos.

"Estereoselectividad" se refiere a la formación preferente en una reacción química o enzimática de un estereoisómero sobre otro. La estereoselectividad puede ser parcial, en la que la formación de un estereoisómero se favorece sobre el otro o puede ser completa en la que se forma solo un estereoisómero. Cuando los estereoisómeros son enantiómeros, la estereoselectividad se denomina enantioselectividad, la fracción (referida típicamente como un porcentaje) de un enantiómero en la suma de ambos. Comúnmente se presenta de manera alternativa en la técnica (típicamente como un porcentaje) como el exceso enantiomérico (e.e.) de los mismos calculado de acuerdo con la fórmula [enantiómero mayoritario -enantiómero minoritario]/[enantiómero mayoritario + enantiómero minoritario]. En el caso de que los estereoisómeros sean diaestereoisómeros, la estereoselectividad se conoce como diastereoselectividad, la fracción (presentada típicamente como un porcentaje) de un diastereómero en una mezcla de dos diastereómeros, comúnmente se presenta alternativamente como el exceso diastereomérico (d.e.). El exceso enantiomérico y el exceso diastereomérico son tipos de exceso estereomérico.

"Altamente estereoselectiva" se refiere a una reacción química o enzimática que es capaz de convertir un sustrato (por ejemplo, la fórmula (2a)) en su producto correspondiente (por ejemplo, la fórmula ( a)) con al menos un 85% de exceso estereoisomérico.

"Conversión" se refiere a la transformación enzimática de un sustrato en el producto correspondiente. "Porcentaje de conversión" se refiere al porcentaje del sustrato que se convierte en el producto en un periodo de tiempo en las condiciones especificadas. De esta manera, por ejemplo, la "actividad enzimática" o "actividad" de un polipéptido transaminasa se puede expresar como "porcentaje de conversión" del sustrato en el producto.

"Estable" se refiere a la capacidad de las enzimas inmovilizadas descritas en el presente documento para mantener su conformación estructural y/o su actividad en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. En determinadas realizaciones, las enzimas inmovilizadas estables pierden menos del 10% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 9% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 8% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 7% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 6% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 5% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 4% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 3% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 2% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos. Preferentemente, las enzimas inmovilizadas estables descritas en el presente documento menos del 1% de actividad por hora en un sistema disolvente que contiene disolventes orgánicos.

"Aminoácido" o "residuo" como se usa en el contexto de los polipéptidos desvelados en el presente documento se refiere al monómero específico en una posición de la secuencia (por ejemplo, P8 indica que el "aminoácido" o "residuo" en la posición 8 de SEQ ID NO: 2 es una prolina.) "Aminoácido hidrofilico o residuo" se refiere a un aminoácido o a un residuo con una cadena lateral que presenta una hidrofobicidad menor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad consenso normalizada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142, Los aminoácidos hidrofílicos codificados genéticamente incluyen L-Thr (T), L Ser (S), L His (H), L Glu (E), L Asn (N), L Gln (Q), L Asp (D), L Lys (K) y L Arg (R).

"Aminoácido ácido o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofilico o a un residuo con una cadena lateral que presenta un valor de pK menor que 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o en un polipéptido. Los aminoácidos ácidos tienen típicamente cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico debido a la pérdida de un ion hidrógeno. Los aminoácidos ácidos codificados genéticamente incluyen L Glu (E) y L Asp (D).

"Aminoácido básico o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofilico o a un residuo con una cadena lateral que presenta un valor de pKa mayor que 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o en un polipéptido. Los aminoácidos básicos tienen típicamente cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con un ion hidronio. Los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen L Arg (R) y L Lys (K).

"Aminoácido polar o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofílico o a un residuo con una cadena lateral que no presenta carga a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartidos en común mediante dos átomos se mantiene más cerca de uno de los átomos. Los aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen L Asn (N), L Gln (Q), L Ser (S) y L Thr (T).

"Aminoácido hidrofóbico o residuo" se refiere a un aminoácido o a un residuo con una cadena lateral que presenta una hidrofobicidad mayor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad consenso normalizada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Los aminoácidos hidrofóbicos codificados genéticamente incluyen L Pro (P), L lie (I), L Phe (F), L Val (V), L Leu (L), L Trp (W), L Met (M), L Ala (A) y L Tyr (Y).

"Aminoácido aromático o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofílico o hidrofóbico o a un residuo con una cadena lateral que incluye al menos un anillo aromático o heteroaromático. Los aminoácidos codificados genéticamente incluyen L Phe (F), L Tyr (Y), L His (H) y L Trp (W). La histidina L His (H) se clasifica en el presente documento como un residuo hidrofílico o como un residuo limitado.

"Aminoácido no polar o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofóbico o a un residuo con una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico y que tiene enlaces en los que el par de electrones compartidos en común mediante dos átomos generalmente se mantienen unidos igualmente por cada uno de estos dos átomos (es decir, la cadena lateral es no polar). Los aminoácidos no polares codificados genéticamente incluyen L Gly (G), L Leu (L), L Val (V), L lie (I), L Met (M) y L Ala (A).

"Aminoácidos alifáticos o residuo" se refiere a un aminoácido hidrofóbico o a un residuo con una cadena lateral de hidrocarburo alifático. Los aminoácidos alifáticos codificados genéticamente incluyen L Ala (A), L Val (V), L Leu (L) y L He (I).

"Cisteina" o L Cys (C) es poco común ya que puede formar puentes disulfuro con otros aminoácidos L Cys (C) u otros aminoácidos que contengan los grupos sulfanilo o sulfhidrilo. Los "residuos de tipo cisteina" incluyen cisteina y otros aminoácidos que contienen restos sulfhidrilo que están disponibles para la formación de puentes. La capacidad de la L Cys (C) (y otros aminoácidos con cadenas laterales que contengan SH) para existir en un péptido en la forma de SH libre reducido o de enlaces disulfuro oxidado afecta si la L Cys (C) contribuye al carácter hidrofóbico o hidrofílico de un péptido. Aunque la L Cys (C) presenta una hidrofobicidad de 0.29 de acuerdo con la escala de consenso normalizada de Eisenberg (Eisenberg et al., 1984, mencionado anteriormente), se debe entender que para los propósitos de la presente divulgación L Cys (C) se clasifica en su grupo único.

"Aminoácido que contiene grupo hidroxilo o residuo" se refiere a un aminoácido que contiene un resto hidroxilo (-OH). Los aminoácidos codificados genéticamente que contienen hidroxilo incluyen L Ser (S) L Thr (T) V L-Tyr (Y).

Transaminasas En general, las transaminasas catalizan la aminación directa de las cetonas en aminas quirales. Ejemplos de transaminasas incluyen cualquier polipéptido que tenga una capacidad enzimática para transferir un grupo amino (NH2) y un átomo de hidrógeno desde una amina primaria (3) a un compuesto carbonilo aceptor (2), convirtiendo a la amina dadora en su compuesto carbonilo correspondiente (4) y al aceptor en su amina primaria correspondiente (1): (3) (2) (4) (l) en la que R , R2, R3 y R4 cuando se toma cada uno independientemente, es un grupo alquilo, un grupo alquilarilo o un grupo arilo que no se sustituye o se sustituye con uno o más grupos no inhibidores enzimáticamente. R y R3 deben ser el mismo o diferente a R2 y R4 respectivamente en estructura o quiralidad. Los grupos R1 y R2 o R3 y R4, tomados en conjunto, pueden formar un anillo no sustituido, sustituido o fusionado a otros anillos.

En el presente documento se describen las transaminasas inmovilizadas que comprenden las transaminasas recombinantes que son capaces de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona ("el sustrato cetoamida") en (2f?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/-/)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina ("el producto").

En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, las transaminasas inmovilizadas incluyen las transaminasas que son capaces de convertir el 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2)4,5-trifluorofenil)butan-2-ona ("el sustrato cetoamida") en (2R)-4-oxo-4-[3-(tr¡fluorometil)-5)6-dih¡dro[1 >2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina ("el producto") en presencia de un grupo amino dador a niveles que se pueden medir mediante una técnica de análisis, tal como la absorbancia HPLC-UV.

En otras realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, las transaminasas inmovilizadas incluyen las transaminasas de SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 describe el polinucleótido que codifica el polipéptido transaminasa de SEQ ID NO: 2.

En todavía aún otras realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, las transaminasas inmovilizadas incluyen las transaminasas que son capaces de mejorar la conversión del 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona ("el sustrato cetoamida") en {2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-d¡hidro^ trifluorofenil)butan-2-amina ("el producto"), en comparación con SEQ ID NO. 2, en presencia de un grupo amino dador a niveles que se pueden medir mediante una técnica de análisis, tal como la absorbancia HPLC-UV. Tales transaminasas se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América con N° de serie 12/714397, presentada el 26 de Febrero de 2010, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones, las transaminasas capaces de convertir el sustrato cetoamida, 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1 -(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona para producir (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluoromet¡l)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en presencia de un grupo amino dador a niveles de producto detectables mediante una técnica de análisis, tal como absorbancia HPLC-UV comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

En algunas realizaciones, las transaminasas comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% a una secuencia de referencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44. 46, 48, 50. 52. 54. 56, 58, 60. 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94. 96. 98. 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126. 128. 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 ? 168.

SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 11 1 , 113, 1 15, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, o 167 describe los pol'mucleótidos que codifican los polipéptidos transaminasa de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 1 16, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

En determinadas realizaciones de las transaminasa inmovilizadas descritas en el presente documento, la transaminasa se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

En otras realizaciones de las transaminasa inmovilizadas descritas en el presente documento, la transaminasa se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, 86, 96, 98, 100, 102, 110 o 166.

Las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento incluyen una transaminasa que se acopla físicamente a un soporte sólido mediante interacciones hidrofóbicas o se acopla químicamente a un soporte sólido mediante enlaces covalentes.

En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, las transaminasas inmovilizadas incluyen una transaminasa que se acopla físicamente a un soporte sólido mediante interacciones hidrofóbicas. Las transaminasas adecuadas incluyen aminoácidos hidrofóbicos o residuos, es decir, aminoácidos o residuos que incluyen al menos una cadena lateral que presenta una hidrofobicidad mayor que 0 de acuerdo con la escala de hidrofobicidad consenso normalizada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Los aminoácidos hidrofóbicos codificados genéticamente incluyen L Pro (P), L lie (I), L Phe (F), L Val (V), L Leu (L), L Trp (W), L Met (M), L Ala (A) y L Tyr (Y). En determinadas realizaciones, las transaminasas pueden incluir aminoácidos no polares o residuos tales como, pero no se limitan a, L Gly (G), L Leu (L), L Val (V), L lie (I), L Met (M) y L Ala (A). En otras realizaciones, las transaminasas pueden incluir aminoácidos alifáticos o residuos tales como, pero no se limitan a, L Ala (A), L Val (V), L Leu (L) y L Me (I). En otras realizaciones más, las transaminasas pueden incluir aminoácidos aromáticos o residuos tales como, pero no se limitan a, L Phe (F), L Tyr (Y) y L Trp (W).

Un ejemplo adecuado de una transaminasa que se acopla físicamente a un soporte sólido, tal como una resina, mediante interacciones hidrofóbicas es SEQ ID NO: 102. Un ejemplo adecuado de una transaminasa que se acopla físicamente a un soporte sólido, tal como una resina, mediante interacciones hidrofóbicas es SEQ ID NO: 110.

En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, incluyen una transaminasa que se acopla químicamente a un soporte sólido mediante enlaces covalentes. Las transaminasas adecuadas incluyen aminoácidos o residuos ácidos o básicos. Los aminoácidos ácidos incluyen L Glu (E) y L Asp (D). Los aminoácidos básicos incluyen L Arg (R) y L Lys (K). Otras transaminasas que se pueden acoplar químicamente a un soporte sólido incluyen las transaminasas que incluyen aminoácidos hidrofílicos o residuos, los aminoácidos que contienen hidroxilo o residuos o los aminoácidos polares o residuos o transaminasas. Aún otras transaminasas que se pueden acoplar químicamente a un soporte sólido incluyen las transaminasas que incluyen cisteína. En un ejemplo, la transaminasa contiene L Lys (K) que se une mediante enlaces covalentes a una resina que contiene funcionalidades epóxido.

Un ejemplo adecuado de una transaminasa que se acopla químicamente a un soporte sólido mediante enlaces covalentes, tal como una resina, es SEQ ID NO: 102. Un ejemplo adecuado de una transaminasa que se acopla químicamente a un soporte sólido mediante enlaces covalentes, tal como una resina, es SEQ ID NO: 110.

Como se describe en el presente documento, los polipéptidos transaminasa de la divulgación pueden estar en forma de polipéptidos de fusión en los que los polipéptidos transaminasa se fusionan a otros polipéptidos, tales como, como medio de ejemplo y no de limitación, etiquetas de anticuerpo (por ejemplo, el epítopo myc), secuencias de purificaciones (por ejemplo, sus etiquetas para unirse a metales) y señales de localización celular (por ejemplo, señales de secreción). De esta manera, los polipéptidos transaminasa se pueden usar con o sin fusiones a otros polipéptidos.

Los polipéptidos descritos en el presente documento no se restringen a los aminoácidos codificados genéticamente. Además de los aminoácidos codificados genéticamente, los polipéptidos descritos en el presente documento pueden comprender, totalmente o en parte, aminoácidos naturales y/o no codificados sintéticos. Determinados aminoácidos no codificados que se encuentran comúnmente, de los que se pueden comprender los polipéptidos descritos en el presente documento, pero no se limitan a, son: los D-estereoisómeros de los aminoácidos codificados genéticamente; el ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr); ácido a aminoisobutírico (Aib); ácido e aminohexanoico (Aha); ácido d aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly o Sar); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (Búa); t-butilglicina (Bug); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (P g); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 2-clorofenilalanina (Ocf); 3-clorofenilalanina (Mcf); 4 clorofenilalanina (Pcf); 2 fluorofenilalanina (Off); 3 fluorofenilalanina (Mff); 4 fluorofenilalanina (Pff); 2-bromofenilalanina (Obf); 3- bromofenilalanina (Mbf); 4- bromofenilalanina (Pbf); 2-metilfenilalanina (Omf); 3- metilfenilalanina (Mmf); 4- metilfenilalanina (Pmf); 2- nitrofenilalanina (Onf); 3- nitrofenilalanina (Mnf); 4- nitrofenilalanina (Pnf); 2- cianofenilalanina (Ocf); 3-cianofenilalanina (Mcf); 4- cianofenilalanina (Pcf); 2-trifluorometilfenilalanina (Otf); 3- trifluorometilfenilalanina ( tf); 4-trifluorometilfenilalanina (Ptf); 4-aminofenilalanina (Paf); 4-yodofenilalanina (Pif); 4-aminometilfenilalanina (Pamf); 2,4-diclorofenilalanina (Opef); 3,4-diclorofenilalanina (Mpcf); 2,4-difluorofenilalanina (Opff); 3,4-difluorofenilalanina (Mpff); pirid-2- ilalanina (2pAla); pirid-3-ilalanina (3pAla); pirid-4-ilalanina (4pAla); naft-1-ilalanina (1nAla); naft-2-ilalanina (2nAla); tiazolilalanina (taAla); benzotienilalanina (bAla); tienilalanina (tAla); furilalanina (fAla); homofenilalanina (hPhe); homotirosina (hTyr); homotriptófano (hTrp); pentafluorofenilalanina (5ff); estirilalanina (sAla); autrilalanina (aAla); 3,3-difenilalanina (Dfa); ácido 3-amino-5-fenilpentanoico (Afp); penicilamina (Pen); ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic); ß 2-tienilalanina (Thi); sulfóxido de metionina (Mso); N(w)-nitroarginina (nArg); homolisina (hLys); fosfonometilfenilalanina (pmPhe); fosfoserina (pSer); fosfotreonina (pThr); ácido homoaspártico (hAsp); ácido homoglutámico (hGlu); ácido 1-aminociclopent-(2 ó 3)-en-4 carboxilico; ácido pipecólico (PA), ácido azetidin-3-carboxílico (ACA); ácido 1-aminociclopentan-3-carboxilico; alilglicina (aOly); propargilglicina (pgGly); homoalanina (hAla); norvalina (nVal); homoleucina (hLeu), homovalina (hVal); homoisoleucina (hile); homoarginina (hArg); N acetil lisina (AcLys); ácido 2,4 diaminobutírico (Dbu); ácido 2,3-diaminobutirico (Dab); N-metilvalina (MeVal); homocisteína (hCys); homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp) y homoprolina (hPro). Los aminoácidos no codificados adicionalmente de los cuales se pueden comprender los polipéptidos descritos en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, los diversos aminoácidos proporcionados en Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Ratón, FL, at pp. 3-70 y las referencias citadas en ese documento, todas ellas se incorporan por referencia). Estos aminoácidos pueden estar en la configuración L o D.

Los expertos en la materia reconocerán que los aminoácidos o los residuos que soportan grupos protectores de cadena lateral también pueden comprender los polipéptidos descritos en el presente documento. Ejemplos no limitantes de tales aminoácidos protegidos, que en este caso pertenecen a la categoría de los aromáticos, incluyen (los grupos protectores que aparecen entre paréntesis), pero no se limitan a: Arg (tos), Cys (metilbencilo), Cys (nitropiridinsulfenilo), Glu (d-benciléster), Gln (xantilo), Asn (?-d-xantilo), His (bom), His (bencilo), His (tos), Lys (fmoc), Lys (tos), Ser (O-bencilo), Thr (O-bencilo) y Tyr (O-bencilo).

Los aminoácidos no codificados que se restringen conformacionalmente de los cuales se pueden componer los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, N metil aminoácidos (configuración L); ácido 1 aminociclopent-(2 o 3)-en-4-carboxílico; ácido pipecólico; ácido azetidin-3-carboxilico; homoprolina (hPro) y ácido 1 aminociclopentano-3-carboxílico.

Como se describe anteriormente las diversas modificaciones introducidas en el polipéptido natural para generar una enzima transaminasa mediante ingeniería genética se pueden orientar a una propiedad específica de la enzima.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona los polinucleótidos que codifican los polipéptidos transaminasa mejorados. Los polinucleótidos se pueden unir operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que controlan la expresión del gen para crear un polinucleótido recombinante capaz de expresar el polipéptido transaminasa. Los constructores de la expresión que contienen un polinucleótido heterólogo que codifica la transaminasa generada mediante ingeniería genética se pueden introducir en las células huésped adecuadas para expresar el polipéptido transaminasa correspondiente.

Debido al conocimiento de los codones correspondientes a los diversos aminoácidos, la disponibilidad de una secuencia de proteína proporciona una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar al sujeto. La degeneración del código genético, en el que se codifican los mismos aminoácidos mediante codones alternativos o sinónimos permite preparar un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, de los que todos codifican los polipéptidos transaminasa mejorados desvelados en el presente documento. De esta manera, identificando una secuencia de aminoácidos en concreto, los expertos en la materia podrían preparar cualquier número de ácidos nucleicos diferentes modificando simplemente la secuencia de uno o más codones de una forma que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteina. En este sentido, la presente divulgación contempla específicamente todas y cada una de las posibles variaciones de los polinucleótidos que se podrían hacer seleccionando combinaciones en base a las posibles elecciones de codones y todas estas variaciones se consideran desveladas específicamente para cualquier polipéptido desvelado en el presente documento.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos se puede seleccionar y/o someter a ingeniería genética para comprender los codones que se seleccionan preferentemente para adaptarse a la célula huésped en la que se produce la proteína. Por ejemplo, los codones preferidos usados en bacterias se usan para expresar el gen en la bacteria; los codones preferidos usados en levadura se usan para la expresión en levadura y los codones preferidos usados en mamíferos se usan para la expresión en células de mamíferos. Ya que no todos los codones necesitan ser reemplazados para optimizar el uso del codón de las transaminasas (por ejemplo, porque la secuencia natural puede tener codones preferidos y porque el uso de los codones preferidos puede no ser requerido para todos los residuos de aminoácidos), los polinucleótidos optimizados de codón que codifican los polipéptidos transaminasa pueden contener codones preferidos en el 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o mayor que el 90% de las posiciones del codón de la longitud total de la región de codificación.

Soporte sólido En el presente documento se describen las transaminasas inmovilizadas que comprenden una transaminasa que se acopla física o químicamente a un soporte sólido. Los materiales de soporte pueden comprender un amplio intervalo de material, biológico, no biológico, orgánico, inorgánico o una combinación de cualquiera de éstos. Por ejemplo, el material de soporte puede ser una lámina polimerizada de Langmuir Blodgett, vidrio funcionalizado, Si, Ge, GaAs, GaP, S¡02, SiN4l silicona modificada o cualquiera de una gran diversidad de geles o polímeros tales como (poli)tetrafluoroetileno, difluoruro de (poli)vinilideno, poliestireno, poliestireno reticulado, ácido poliacrilico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli(lactido glicósido), polianhidruros, poli(metil metacrilato), poli(etilen-co-vinil acetato), polisiloxanos, sílice polímérica, látex, polímeros de dextrano, epoxis, policarbonato o combinaciones de los mismos. Los materiales de soporte pueden ser materiales de soporte cristalino plano tales como materiales de soporte a base de sílice (por ejemplo, vidrio, cuarzo o similares) o materiales de soporte cristalino usados en, por ejemplo, las industrias de semiconductores y microprocesadores, tales como silicona, arseniuro de galio y similares. Los aerogeles de sílice también se pueden usar como materiales de soporte y se pueden preparar mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Los materiales de soporte de aerogel se pueden usar como sustratos independientes o como un recubrimiento de superficie para otro material de soporte.

Un material de soporte puede tomar cualquier forma o estructura y típicamente es una placa, un portaobjetos, una perla, un sedimento, un disco, una partícula, una hebra, un precipitado, una membrana, opcionalmente un gel poroso, láminas, un tubo, una esfera, un recipiente, un capilar, un relleno, un corte, una película, un chíp, una placa de múltiples pocilios o disco, fibra óptica, etcétera. Aunque el material de soporte toma típicamente una forma inanimada, para algunas aplicaciones de los péptidos de acoplamiento tales como la citometría de flujo o la hibridación in situ, puede ser cualquier forma que sea rígida o semi rígida. El material de soporte puede contener regiones elevadas o deprimidas en las que se sitúa una sonda de captura. La superficie del material soporte se puede grabar usando técnicas bien conocidas para proporcionar las características de superficie deseadas, por ejemplo zanjas, surcos en v, estructuras en colina o similares.

Las superficies en el material de soporte se pueden componer del mismo material que la parte interior del soporte o se pueden hacer de un material diferente y se pueden acoplar al material de soporte interior mediante medios químicos o físicos. Tales superficies acopladas se pueden componer de cualquiera de una gran diversidad de materiales, por ejemplo, polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales con base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos, membranas o cualquiera de los materiales de soporte de la lista mencionada anteriormente. En una realización, la superficie es ópticamente transparente y puede tener una superficie de funcionalidades Si—OH, tales como aquellas descubiertas en las superficies de sílice.

Las platinas para microscopio de vidrio o de plástico se han usado comúnmente como soportes de matriz sólidos para análisis micromatriz. Los materiales para la cobertura de la matriz opacos usados para producir micromatrices incluyen nylon, PVDF (polifluoruro de vinilideno) y nitrocelulosa. La nitrocelulosa, un sustrato polímero tradicional en uso durante más de 50 años, se puede usar para aplicaciones de acoplamiento por micromatriz. (Por ejemplo, Tonkinson y Stillman, Frontiers in Bioscience 7: c1-12, 2002). La nitrocelulosa opaca se ha usado ampliamente para inmovilizar las proteínas y los ácidos nucleicos para el análisis biomolecular. La nitrocelulosa inmoviliza las moléculas de interés casi de manera cuantitativa y permite el almacenamiento a corto y largo plazo. La nitrocelulosa también permite a las especies objetivo de la fase de disolución unirse de manera eficaz a las entidades inmovilizadas.

Un soporte sólido puede ser de cualquier composición adecuada al que se puede aplicar el acoplamiento de la molécula. Se puede tratar previamente o funcionalizar antes de la aplicación del acoplamiento/molécula de péptido para facilitar el enlace de las moléculas de acoplamiento o para cualquier otro propósito deseado, tal como favorecer las condiciones favorables para la actividad o cualquier otra propiedad deseada de la entidad o evitar interacciones no deseadas con otras entidades. Muchos de estos tratamientos de superficie y/o funcionalizaciones se conocen en la técnica y la selección de un tratamiento adecuado y/o funcionalización dependerán de la identidad y de las características del acoplamiento de la molécula/péptido y la entidad y dependerán de las condiciones concomitantes y de la actividad deseada.

Con respecto a las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento el soporte sólido es una resina. Las resinas se pueden preparar a partir de cualquier composición adecuada que incluye, pero no se limita a, polimetacrilato y copolimero de estireno/ DVB. Tales resinas pueden incluir grupos funcionales y facilitar el enlace covalente de la transaminasa recombinante a la resina. Los grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, epóxido y amino epóxido. Además, otros grupos funcionales tales como octadecilo y resinas que incluyen una estructura porosa facilitan la generación de interacciones hidrofóbicas con la transaminasa recombinante.

En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, la resina comprende polimetacrilato con grupos funcionales epóxido, polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido, cópolímero de estireno/DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo. Los ejemplos de resinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S, SEPABEADS EXA252, SEPABEADS EXE1 9 y SEPABEADS EXE120.

La siguiente tabla incluye las resinas adecuadas que se pueden usar en conexión con las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento: TABLA 1 En determinadas realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, la transaminasa inmovilizada incluye una resina que se acopla físicamente a la transaminasa mediante interacciones hidrofóbicas. Las resinas adecuadas comprenden el copolímero de estireno/DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, SEPABEADS EXA252 y SEPABEADS EXE120.

En otras realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, la transaminasa inmovilizada incluye una resina que se acopla químicamente a una transaminasa mediante enlaces covalentes. Las resinas adecuadas comprenden polimetacrilato con grupos funcionales epóxido o polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S y SEPABEADS EXE1 19.

En todavía otras realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas el presente documento, la transaminasa inmovilizada se comprende por la transaminasa SEQ ID NO: 102 físicamente acoplada a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi). En todavía otras realizaciones de las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento, la transaminasa inmovilizada se comprende por la transaminasa SEQ ID NO: 110 físicamente acoplada a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

Procedimiento para la Preparación de la Transaminasa Inmovilizada También se describen en el presente documento los procedimientos para preparar la transaminasa inmovilizada. En determinadas realizaciones de los procedimientos para preparar las transaminasas inmovilizadas descritos en el presente documento, el procedimiento comienza preparando una disolución tamponada de la transaminasa. El polipéptido transaminasa puede usar fosfato de piridoxal (PLP) como una coenzima, que se puede unir a la enzima cuando se prepara, por ejemplo, como proporcionada mediante la célula huésped en la que se expresa el polipéptido. En algunas realizaciones, se pueden añadir PLP, los análogos de PLP o los precursores de PLP a los medios de las células huésped durante la expresión del polipéptido transaminasa. En algunas realizaciones de los procedimientos, se pueden añadir el PLP o los análogos de PLP a una reacción para proporcionar la coenzima requerida para la actividad de la enzima. Alguien experto en la materia puede determinar la cantidad de PLP suficiente para la actividad de la enzima.

En algunas realizaciones de los procedimientos para preparar la transaminasa inmovilizada, la disolución de transaminasa puede comprender un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 9.0. En algunas realizaciones, la condición de la reacción para el procedimiento es un pH de aproximadamente 7.5.

El procedimiento comprende adicionalmente el contacto o la incubación de la transaminasa con una resina, mediante la adición de la resina a la disolución. La disolución entonces se agita durante un intervalo de tiempo, tal como durante una noche.

En algunas realizaciones, la condición de la reacción para llevar a cabo el procedimiento puede comprender una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 70 °C. En algunas realizaciones, la condición de la reacción es una temperatura de aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente).

Una vez que se completa la reacción, la transaminasa inmovilizada se filtra y se aclara. Después de aclarar la enzima inmovilizada con un tampón, en determinadas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento, la preparación se seca antes de su uso en un sistema disolvente orgánico al 100%. La enzima inmovilizada se puede secar al vacío con una aspiración de nitrógeno para retirar el agua de la superficie exterior de la resina de la enzima inmovilizada. La preparación inmovilizada se puede agitar durante el secado para permitir incluso el contenido húmedo en todo el lecho de la enzima inmovilizada y para prevenir un exceso o una falta de secado de cualquier porción de la preparación de la enzima inmovilizada. La preparación inmovilizada también se puede secar mediante el lavado con disolventes orgánicos. El exceso de secado puede dar como resultado una pérdida de actividad ya que el agua se elimina de la molécula de la enzima acoplada a la resina. La falta de secado puede dar como resultado una transferencia de masa insuficiente en un sistema disolvente orgánico que perjudica la transaminación del sustrato deseado.

Procedimientos para el Uso de la Transaminasa Inmovilizada Las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento se pueden usar para transferir un grupo amino (NH2) y un átomo de hidrógeno desde una amina primaria a un compuesto carbonilo aceptor, convirtiendo a la amina dadora en su correspondiente compuesto carbonilo y al aceptor en su correspondiente amina primaria. Tal procedimiento comprende el contacto del compuesto carbonilo aceptor con una transaminasa inmovilizada descrita en el presente documento en presencia de un grupo amino dador en un disolvente orgánico adecuado en condiciones de reacción adecuadas en las que el compuesto carbonilo aceptor se convierte en su amina primaria correspondiente.

En algunas realizaciones, las transaminasas inmovilizadas se pueden usar en un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula estructural (I): con la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; en un exceso enantiomérico de al menos un 70% con respecto al enantiómero opuesto, en el que Z es OR2 O NR2R3; R1 es un grupo alquilo C1-8, arilo, heteroarilo, alquil arilo-Ci-2 o alquil heteroarilo-Ci-2; R y R3 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo C1-8, arilo o alquil arilo-Cl-2; o R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un sistema anular heterociclico de 4 a 7 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional que se selecciona entre O, S, NH y alquilo NCfj-4, siendo el anillo heterociclico no sustituido o sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, alcoxi C -4 y alquilo C1-4, en el que el grupo alquilo y el grupo alcoxi son no sustituidos o sustituidos con uno a cinco átomos de flúor; y el sistema de anillos heterociclico se fusiona opcionalmente con un sistema de anillos carbociclico saturado o aromático de 5 a 6 miembros que contiene uno a dos heteroátomos que seleccionan entre O, S y alquilo NCrj-4, siendo el sistema de anillos fusionados no sustituido o sustituido con uno a dos sustituyentes que se seleccionan entre hidroxi, amino, flúor, alquilo Ci-4, alcoxi C1-4 y trifluorometilo. En estas realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de contacto de una cetona proquiral de fórmula estructural (II): 01) con un polipéptido transaminasa inmovilizado en presencia de un grupo amino dador en un disolvente orgánico adecuado en condiciones adecuadas de reacción para la conversión del compuesto de fórmula (II) en el compuesto de fórmula (I).

En algunas realizaciones del procedimiento, el grupo R1 de fórmula (II) es bencilo, en el que el grupo fenilo del bencilo no se sustituye o se sustituye con uno a tres sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste en flúor, trifluorometilo y trifluorometoxi.

En algunas realizaciones del procedimiento, la Z de la fórmula (II) es NR2R3.

En algunas realizaciones del procedimiento, el NR2R3 de la fórmula (II) es un heterociclo de fórmula estructural (III): en la que R4 es hidrógeno o alquilo C1-4 que no se sustituye o se sustituye con uno a cinco átomos de flúor.

En algunas realizaciones, las transaminasas inmovilizadas se pueden usar en un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula estructural (1 ): con la configuración (R) en el centro estereogénico marcado con un triple ***, en un exceso enantiomérico de al menos un 70% sobre el enantiomérico con la configuración opuesta (S)¡ en el que Ar es fenilo que no se sustituye o se sustituye con uno a cinco sustituyentes seleccionados independientemente del grupo compuesto que consiste en flúor, trifluorometilo y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o alquilo C 1-4 no sustituido o sustituido con uno a cinco átomos de flúor. En tales realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de contacto con una cetona proquiral de fórmula estructural (2): polipéptido transaminasa inmovilizado desvelado el presente documento en presencia de un grupo amino dador en un disolvente orgánico adecuado en condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2) en el compuesto de fórmula (1).

En algunas realizaciones del procedimiento, el grupo Ar de la fórmula (2) es 2,5-difluorofenilo 2,4,5-triflüorofenilo y R4 es trifluorometilo.

En algunas realizaciones del procedimiento, el grupo Ar de la fórmula (2) es 2,4,5-trifluorofenilo.

En algunas realizaciones, las transaminasas se pueden usar en un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula (1a), (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1 -(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina, en exceso enantiomérico: En esta realizaciones, el procedimiento comprende la etapa de contacto de una cetona proquiral de fórmula estructural (2a), 4-oxo-4-[3- (trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5 trifluorofenil)butan-2-ona): con una transaminasa inmovilizada descrita en el presente documento en presencia de un grupo amino dador en un disolvente orgánico adecuado en condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2a) en el compuesto de fórmula (1a).

En algunas realizaciones del procedimiento mencionado anteriormente, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1 ) o el compuesto de fórmula (1a) se producen en al menos un exceso enantiomérico del 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior.

En algunas realizaciones del procedimiento, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1 a) se producen en al menos un exceso enantiomérico del 99%.

El compuesto de fórmula (II), el compuesto de fórmula (2) y el compuesto de fórmula (2a), junto con sus síntesis, se describen en, entre otros, las Patentes de los Estados Unidos de América N°. 7,326,708 y 7,468,459, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones, el procedimiento de uso de las transaminasas inmovilizadas descrito en el presente documento comprende las etapas de: 1) disolución del 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/- -il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en un disolvente orgánico; 2) contacto del 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona con una transaminasa inmovilizada descrita en el presente documento en presencia de un grupo amino.

En el presente documento se describen las transaminasas inmovilizadas que comprenden una transaminasa recombinante acoplada a una resina mediante enlaces covalentes o interacciones hidrofóbicas, en la que la transaminasa es estable en disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos adecuados que se pueden usar en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen cualquier disolvente orgánico conocido comúnmente en la técnica tal como, metanol, etanol, THF, DMSO, tolueno, acetato de isopropilo, hexanos, propanol, benceno, acetona, xileno, metiletil cetona, éter y acetato de etilo. En determinados ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento el disolvente orgánico es acetato de isopropilo.

En determinadas realizaciones el disolvente orgánico es un disolvente saturado no acuoso. En otras realizaciones en disolvente orgánico es un disolvente saturado acuoso. La saturación de agua puede mantener la enzima inmovilizada en una concentración constante de agua y previene el secado adicional de la enzima inmovilizada durante el transcurso de la reacción. Esto puede permitir una estabilidad operativa mayor cuando la enzima inmovilizada se aisla al final de la reacción y se puede volver a utilizar en lotes múltiples. En determinados ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento el disolvente orgánico es acetato de isopropilo saturado en agua.

En determinadas realizaciones el disolvente en el que es estable la transaminasa es un componente de un sistema de disolvente. En determinadas realizaciones de los procedimientos para el uso de las transaminasas inmovilizadas descritos en el presente documento, el sistema disolvente es un sistema disolvente orgánico al 100%. En otras realizaciones el sistema disolvente contiene un 50-60% de disolventes orgánicos. Preferentemente, el sistema disolvente contiene un 60-70% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene un 70-80% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene un 80-90% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene un 90-100% de disolventes orgánicos. En otras realizaciones el sistema disolvente contiene al menos un 50% de disolventes orgánicos. En otras realizaciones el sistema disolvente contiene al menos un 55% de disolventes orgánicos. Preferiblemente, el sistema disolvente contiene al menos un 60% de disolventes orgánicos. Preferiblemente, el sistema disolvente contiene al menos un 65% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 70% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 75% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 80% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 85% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 90% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 95% de disolventes orgánicos. Más preferentemente, el sistema disolvente contiene al menos un 100% de disolventes orgánicos. El sistema disolvente puede contener más de un disolvente orgánico, en el que la transaminasa inmovilizada es estable en uno o todos de los disolventes orgánicos presentes en el sistema disolvente.

Como se ha analizado anteriormente, el grupo amino dador usado en el procedimiento puede ser una amina quiral o una amina no quiral. Un grupo amino dador no quiral presenta la ventaja de no estar limitado en su reacción a un estereoisómero especifico, requiriendo de esta manera menos del grupo amino dador. Se pueden usar diversos grupos dadores amino adecuados, que incluyen, como modo de ejemplo y no de limitación, isopropilamina (también conocida como 2-aminopropano), L, D o DL alanina, fenilalanina, glutamato, glutamina, leucina (u otros a-aminoácidos adecuados), ácido 3-aminobutírico (u otros ß-aminoácidos adecuados) y metiletilbencilamina. En algunas realizaciones, el grupo amino dador es la isopropilamina. En algunas realizaciones, se pueden usar otros grupos amino dadores, que incluyen, entre otros, a-fenetilamina (también denominada 1-feniletanamina) y sus enantiómeros (S)-l-feniletanamina y (R)-1-feniletanamina, 2-amino-4-fenilbutano, glicina, ácido L-glutámico, L-glutamato, glutamato monosódico, ácido L- aspártico, L-lisina, L-ornitina, ß-alanina, taurina, n-octilamina, ciclohexilamina, 1 ,4-butariodiamina, 1 ,6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutírico, tiramina y bencil amina, 2-aminobutano, 2-amino-1-butanol, 1-amino-1-feniletano, l-amino-1-(2-metox¡-5- fluorofenil)etano, 1-amino-1-fenilpropano, 1-amino-1-(4-hidroxifenil)propano, 1-amino-1-(4-bromofenil)propano, 1-amino-1-(4-nitrofenil)propano, l-fenil-2-aminopropano, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-aminopropano, 2-aminopropanol, I-amino-l-fenilbutano, l-fenil-2-aminobutano, 1 -(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-aminobutano, l-fenil-3-aminobutano, 1-(4-hidroxifenil)-3-aminobutano, 1-amino-2-metilciclopentano, l-amino-3-metilciclopentano, l-amino-2-metilciclohexano, l-amino-1-(2-naftil)etano, 3-metilciclopentilamina, 2-metilciclopentilamina, 2-etilciclopentilamina, 2-metilciclohexilamina, 3-metilciclohexilamina, 1-aminotetralina, 2-aminotetralina, 2-amino-5-metoxitetralina y 1-aminoindano, que incluyen ambos isómeros sencillos (R) y (S) cuando sea posible y que incluyen todas las sales posibles de las aminas. En determinados ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento el grupo amino dador es la isopropilamina.

En determinados ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento la transaminasa inmovilizada es la transaminasa SEQ ID NÓ: 102 acoplada físicamente a la resina SEPABEADS EXE 120 (Mitsubishi). En determinados ejemplos de los procedimientos descritos en el presente documento la transaminasa inmovilizada es la transaminasa SEQ ID NO: 110 acoplada físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

En algunas realizaciones de los procedimientos descritos anteriormente, las transaminasas inmovilizadas descritas en el presente documento se pueden reciclar, en las que una vez que las transaminasas inmovilizadas se eliminan por filtración una vez que la reacción se completa y se usan en reacciones posteriores. De esta manera determinados procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender adicionalmente la etapa de separación mediante filtración de la transaminasa inmovilizada y se pueden usar en reacciones posteriores.

En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente, una etapa del procedimiento puede comprender adicionalmente la eliminación del subproducto carbonilo formado a partir del grupo amino dador cuando el grupo amino se transfiere al grupo amino aceptor. Tal eliminación in situ puede reducir el índice de la reacción inversa de tal manera que la reacción directa domina y se convierte más sustrato en producto.

La eliminación del subproducto carbonilo se puede llevar a cabo de maneras diversas. Cuando el grupo amino dador es un aminoácido, tal como la alanina, el subproducto carbonilo, un ceto ácido, se puede eliminar mediante la reacción con peróxido (véase, por ejemplo, el documento de patente de los Estados Unidos de América N° 2008/0213845, incorporada por referencia en el presente documento). Los peróxidos que se pueden usar incluyen, entre otros, peróxido de hidrógeno; peroxiácidos (perácidos) tales como el ácido peracético (CH3C03H), ácido trifluoroperacético y ácido metacloroperoxibenzoico; peróxidos orgánicos tales como el peróxido de t-butilo ((CH3)3COOH) u otros oxidantes selectivos tales como el perrutenato de tetrapropilamonio, ???2, KMn04, tetróxido de rutenio y los compuestos relacionados. Alternativamente, se puede conseguir la eliminación de piruvato mediante su reducción a lactato empleando la lactato deshidrogenasa para desplazar el equilibrio al producto amina (véase, por ejemplo, Koszelewski et al., 2008, Adv. Syn. Catal. 350: 2761-2766). La eliminación de piruvato también se puede conseguir mediante su descarboxilación a dióxido de carbono y acetaldehido mediante el empleo de piruvato descarboxilasa (véase, por ejemplo, Hóhne et al., 2008, Chem BioChem 9: 363-365).

En algunas realizaciones, en las que la elección del grupo amino dador da como resultado un subproducto carbonilo que tiene una presión de vapor superior a la del agua (por ejemplo, un coproducto de bajo punto de ebullición tal como un compuesto carbonilo orgánico volátil), el subproducto carbonilo se puede eliminar mediante la extracción de la disolución de la reacción con un gas no reactivo o mediante la aplicación de vacío para disminuir la presión de la reacción y eliminando el subproducto carbonilo presente en la fase de gas. Un gas no reactivo es cualquier gas que no reacciona con los componentes de la reacción. Los diversos gases no reactivos incluyen el nitrógeno y los gases nobles (por ejemplo, los gases inertes). En algunas realizaciones, el gas no reactivo es el gas nitrógeno.

En algunas realizaciones, el aminoácido dador usado en el procedimiento es la isopropilamina, que forma el subproducto carbonilo acetona por transferencia del grupo amino al grupo aceptor amino. La acetona se puede eliminar mediante extracción con gas nitrógeno o mediante aplicación de vacío a la disolución de la reacción y eliminando la acetona de la fase gas mediante una trampa de acetona, tal como un condensador u otra trampa fría. Alternativamente, la acetona se puede eliminar mediante la reducción a isopropanol usando una cetoreductasa.

En algunas realizaciones de los procedimientos mencionados anteriormente en las que se retira el subproducto carbonilo, el grupo amino dador correspondiente se puede añadir durante la reacción de transaminación para reponer el grupo amino dador y/o mantener el pH de la reacción. La reposición del grupo amino dador también desplaza el equilibrio hacia la formación de producto, incrementando de ese modo la conversión del sustrato en producto. De esta manera, en algunas realizaciones en las que el grupo amino dador es la isopropilamina y el producto acetona se retira in situ, se puede añadir la isopropilamina a la solución para reponer el grupo amino dador perdido durante la eliminación de acetona. Alternativamente, en las realizaciones en las que un aminoácido se usa como grupo amino dador, el subproducto carbonilo ceto ácido se puede reciclar y devolver al aminoácido mediante la reacción con amoníaco y NADH usando una enzima deshidrogenasa aminoácido adecuada, reponiendo de ese modo el grupo amino dador.

Los procedimientos de uso de las transaminasas inmovilizadas descritos en el presente documento incluyen procedimientos discontinuos y procedimientos continuos. Los procedimientos continuos incluyen los procedimientos en los que el sustrato cetona está continuamente en contacto con la transaminasa inmovilizada y en los que el producto se recoge continuamente. Los ejemplos incluyen aquellos en los que la transaminasa inmovilizada se introduce en una columna y se pasa una disolución del sustrato cetona a través de la columna. De esta manera la cetona está continuamente en contacto con la resina inmovilizada y el producto se recoge cuando ha pasado a través de la columna.

En algunas realizaciones, el procedimiento para convertir el sustrato cetoamida 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/-/)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en el producto (2f?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/^-il]-1-(2,4,5-trifluorofen¡l)butan-2-amina comprende la disolución del sustrato cetoamida 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/-0-il]-1 -(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona para producir (2/?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 l2,4]triazol[4,3-a]piraz¡n-7(8 ^-il]-1-(2)4,5-trifluorofenil)butan-2-amina en acetato de isopropilo; estando en contacto el sustrato cetoamida con una transaminasa inmovilizada descrita en el presente documento en condiciones de reacción a una temperatura de 30 a 50 °C en presencia de isopropilamina de aproximadamente 1M a aproximadamente 2M, en el que al menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96% o 98% o superior del sustrato cetoamida se convierte en el producto en 24 h. En algunas realizaciones, la transaminasa inmovilizada capaz de llevar a cabo la reacción anterior comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 80, 86, 96, 98, 100, 102, 110 o 166 acoplada físicamente o químicamente a una resina que comprende SEPABEADS EXE119, SEPABEADS EXE120, SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S y SEPABEADS EXA252.

En algunas realizaciones, los procedimientos mencionados anteriormente pueden comprender adicionalmente la etapa de aislamiento del compuesto de fórmula estructural (I), el compuesto de fórmula estructural (1) o el compuesto de fórmula estructural (1a) desde el disolvente de la reacción.

En algunas realizaciones, los procedimientos mencionados anteriormente pueden comprender adicionalmente una etapa de conversión del compuesto de fórmula estructural (1) o del compuesto de fórmula estructural (1a) en una sal farmacéuticamente aceptable mediante el contacto del compuesto con un ácido farmacéuticamente aceptable en un disolvente de reacción adecuado. En algunas realizaciones, el ácido farmacéuticamente aceptable es el ácido fosfórico y la sal farmacéuticamente aceptable es la sal de dihidrógeno fosfato. En algunas realizaciones, la sal de (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5l6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8H)-il]-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-amina es la sal de monohidrato fosfato, con la siguiente fórmula química: En algunas realizaciones, en un procedimiento para la preparación de (2/?)-4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/-/)-il]-1-(2,4,5-tr¡fluorofenil)butan-2-amina fosfato : monohidrato (1 :1), la mejora en el procedimiento comprende una etapa de conversión del compuesto de fórmula (1a) en el compuesto de fórmula (2a) con una transaminasa inmovilizada descrita en el presente documento en presencia de un grupo amino dador en un disolvente orgánico adecuado en condiciones adecuadas de reacción, en el que el compuesto de fórmula (1a) es y el compuesto compuesto de fórmula (2a) es: En algunas realizaciones de la preparación de la sal monohidrato fosfato, el grupo amino dador es la isopropilamina.

Los procedimientos para la preparación de diversas sales se describen en las patentes de los Estados Unidos de América N° 7,326,708 y 7,468,459 cada una de las cuales se incorpora por la presente por referencia en el presente documento.

EJEMPLOS EJEMPLOS 1-5 Inmovilización de la transaminasa Se evaluaron cinco resinas diferentes, como se muestra Tabla 2.

TABLA 2 Se preparó una disolución de 25 g/L de SEQ ID NO: 110 en un tampón de fosfato potásico 100mM (pH 7.5) con 1 g/L de PLP (piridoxal-5-fosfato). Se incubó 1 g de cada resina con 5 mi de la disolución de enzima en un agitador durante una noche a temperatura ambiente. La resina se filtró de la disolución de transaminasa y se aclaró 5 veces con 5 mi de tampón fosfato potásico 100mM (pH 7.5). Después se evaluó la función de la resina contra la preparación de la enzima liofilizada en la siguiente transaminación: Las preparaciones de la transaminasa inmovilizada presentaron buena actividad especifica comparada con la de la enzima liofilizada.

EJEMPLO 6 Evaluación del procedimiento de secado de la resina SEPABEADS EXE120 y demostración de la actividad de la enzima inmovilizada en el sistema de disolvente orgánico al 100%.

La enzima inmovilizada (SEQ ID NO: 110 / resina SEPABEADS EXE120) se secó al vacío con un barrido de nitrógeno para retirar el agua de la superficie externa de la resina de la enzima inmovilizada. La preparación inmovilizada se agitó durante el secado para tener en cuenta incluso el contenido de humedad en todo el lecho de la enzima inmovilizada y para prevenir un exceso o una falta de secado de cualquier porción de la preparación de la enzima inmovilizada. Se disolvieron 100 mg de sustrato cetoamida en 1 mi de IPAc (acetato de isopropilo) saturado en agua. Se añadieron 40 ? de IPM (isopropilamina) a la disolución de la reacción. Se añadieron a la reacción 100 mg de transaminasa inmovilizada seca (SEQ ID NO: 110 / resina SEPABEADS EXE120). La reacción se agitó en un Termomezclador a 1000 rpm y 50 °C. Las muestras se extrajeron durante 70 horas y se determinaron la conversión y el e.e. Se obtuvo un e.e. > 99.9% del producto amina deseado. La transaminasa inmovilizada presentó una actividad razonable en comparación con la enzima libre liofilizada que no presentó actividad en el sistema de reacción de IPAc.

EJEMPLO 7 Procedimiento de la reacción de flujo de Pistón (PFR) para la fabricación de sitagliptina en IPAc Se preparó una disolución de 10 mi de sustrato de cetonamida con (100 g/L - 400 g/L de cetona, 40 µ??t?? - 160 µ?/??? de isopropilamina en IPAc). Se rellenaron en suspensión 0.75 g de transaminasa inmovilizada (SEQ ID NO: 110 / resina SEPABEADS EXE120) en una columna en condiciones de gravedad usando IPAc. La disolución sustrato se suministró a la columna mediante una bomba de jeringa, que se cubrió con una camisa a 50 °C. Se estableció un caudal de 0.1 ml/h.

En el estado estacionario, se observó un 85-90% de conversión de la amina sitagliptina (> 99% e.e.) en la salida de la columna.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una transaminasa inmovilizada que comprende: una transaminasa recombinante que es SEQ ID NO: 110; y una resina, en la que la transaminasa recombinante se acopla a la resina y en la que la transaminasa inmovilizada es estable en un sistema disolvente que comprende al menos un 90% de disolventes orgánicos.

2.- La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 1 , caracterizada además porque la transaminasa recombinante se acopla a una resina mediante interacciones hidrofóbicas.

3.- La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 1 , caracterizada además porque la transaminasa inmovilizada es estable en un sistema disolvente que comprende al menos un 95% de disolventes orgánicos.

4 - La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 1 , caracterizada además porque la resina comprende polimetacrilato con grupos funcionales epóxido, polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido, copolimero de estireno/ DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo.

5.- La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 1 , caracterizada además porque la resina se selecciona del grupo que consiste en: SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S, SEPABEADS EXA252, SEPABEADS EXE119 y SEPABEADS EXE120.

6. - La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 2, caracterizada además porque la resina comprende copolímero de estireno/DVB o polimetacrilato con grupos funcionales octadecilo.

7. - La transaminasa inmovilizada de conformidad de la reivindicación 2, caracterizada además porque la resina se selecciona del grupo que consiste en: SEPABEADS EC-EP, SEPABEADS EC-HFA/S y SEPABEADS EXE119.

8. - Una transaminasa inmovilizada que comprende la transaminasa SEQ ID NO: 110 acoplada físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

9 - Un procedimiento para la fabricación de (2R)-4-oxo-4-[3-(trifluoromet¡l)-5,6-d¡h¡dro[1 trifluorofenil)butan-2-amina, que comprende las etapas de: 1) disolución de 4-oxo-4-[3-(trifluoromet¡l)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]p¡razin-7(8H)-il)-1-(2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona en un disolvente orgánico; 2) puesta en contacto de 4-oxo-4-[3-(trifluorometil)-5,6-dihidro[1 ,2,4]triazol[4,3-a]pirazin-7(8/- -ilh (2,4,5-trifluorofenil)butan-2-ona con una transaminasa inmovilizada de la reivindicación 1 en presencia de un grupo amino.

10.- El procedimiento de la reivindicación 9, caracterizado además porque la transaminasa inmovilizada es la transaminasa SEQ ID NO: 110 acoplada físicamente a la resina SEPABEADS EXE120 (Mitsubishi).

11.- Un procedimiento de preparación de una transaminasa inmovilizada, que comprende: 1) incubación de una disolución de transaminasa con una resina y una disolución de enzima para formar una transaminasa inmovilizada; 2) filtrado y aclarado de la transaminasa inmovilizada; 3) secado de la transaminasa inmovilizada.