MX2013014626A - Desinfectantes fitoquimicos para lechuga (lactuca sativa). - Google Patents

Abstract

La presente invención describe composiciones para la desinfección y/o preservación efectiva de alimentos de origen vegetal contaminados con microorganismos patógenos y deterioradores en dichos alimentos. Las composiciones descritas contienen extractos derivados de plantas con actividad antimicrobiana, los cuales pueden actuar por si solos o en combinación con otros agentes desinfectantes, como por ejemplo ácidos orgánicos y compuestos del cloro, y tensoactivos, como el polisorbato 80. Las composiciones de la invención son capaces de eliminar o inactivar la contaminación microbiana, incluyendo la de microorganismos patógenos, de lechuga sin alterar las propiedades nutritivas y/o alimenticias y/o sensoriales de las lechugas.

Description

DESINFECTANTES F1T0QÜÍMIC0S PARA LECHUGA f Lactuca sativa) CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al desarrollo de formulaciones que contienen fitoquímicos presentes en plantas y que son utilizadas como desinfectantes y conservadores para alimentos, por ejemplo de origen vegetal y animal; más particularmente a formulaciones acuosas a base de extractos de cálices de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa), el método mediante el cual se obtiene y sus usos como formulación efectiva para eliminar bacterias patógenas de frutas y hortalizas, pero con la más alta efectividad para lechugas ( Lactuca sativa) ESTADO DE LA TÉCNICA La lechuga es un producto agrícola ampliamente consumido en todo el mundo. En México es uno de los principales productos agrícolas, con un poco más de 17 mil hectáreas dedicadas a su siembra. Los tipos de lechuga más importantes que se siembran, tanto a campo abierto como en agricultura protegida, son: Orejona (la que más se produce), Romana, Iceberg, Boston, Italiana, Cos, Baby, Butterhead, Cutting, Stalk, Latín entre otras (Sagarpa, 2013).

No obstante, a la par con el incremento en el consumo de lechuga se han presentado brotes de enfermedades provocados por bacterias asociados al consumo de lechuga (CDC, 2012). Por ejemplo, en el 2012 la lechuga fue el vehículo en un brote multi-estatal, es decir que afecto varios estados en la unión americana, el microorganismo implicado en este brote fue Escherichia coli 0157:H7 (CDC, 2012).

Este tipo de brotes ha provocado una regulación estricta para los productores que exportan lechugas a los estados unidos (USA, por sus siglas en ingles); y ha significado con frecuencia retención de los embarques de lechuga en la frontera, cierre parcial o total de la exportación de este producto a USA y perdidas económicas por parte de los productores al no cumplir con los estándares microbiológicos.

Cabe señalar que aunque en México no existen reportes de brotes de enfermedad de etiología microbiana asociados al consumo de lechugas, debido a las malas prácticas de higiene que generalmente ocurren durante el cultivo, cosecha, transporte y comercialización de las lechugas, es de esperar la participación de estos productos crudos en brotes de enfermedad. Un hecho que sustenta esta observación, es la frecuencia con la que se ha aislado recientemente cepas de Salmonella y grupos patógenos de Escherichia coli a partir de ensaladas de lechuga lista para el consumo en México (Castañeda-Ramírez et al., 2011; Castro-Rosas et al., 2012).

Los recientes brotes de enfermedades 'alimentaria asociadas con lechuga crearon la necesidad de determinar las fuentes de contaminación de la lechuga y comprender la sobrevivencia y/o crecimiento de microorganismos patógenos en lechuga; estos han conducido al desarrollo de teenologías innovadoras de control. En general, los agentes patógenos en la lechuga se podrían controlar mediante la prevención de la contaminación durante el cultivo y la cosecha de los productos, también mediante el uso de desinfectantes con poder antimicrobiano en el producto cosechado, y por el almacenamiento de la lechuga a baja temperatura. No obstante, se ha identificado a la desinfección del las lechugas como la etapa de mayor importancia para la inocuidad microbiana de la lechuga cruda.

Por lo general las lechugas no se consumen directamente como se cosechan. Después de la cosecha ya sea en el campo o en la industria (y aún en el hogar) reciben tratamientos diversos que tienden a favorecer su conservación y/o inocuidad. La aplicación de lavado y desinfección de la lechuga mejora su imagen microbiana. No obstante, es difícil lograr de manera segura la inactivación o remoción de microorganismos patógenos aún en condiciones extremas de tratamientos que no dañen sensorialmente al la lechuga.

La prevención de la contaminación de la lechuga es también una estrategia de control porque no se requiere el crecimiento de patógenos para causar enfermedad. Por lo tanto, las medidas de control adicionales pueden ser de valor. Cabe señalar que el comportamiento de los microorganismos patógenos en las lechugas se ve afectado por la ubicación del patógeno en el producto, la calidad de la lechuga, la temperatura de almacenamiento, tipo de embalaje, y la humedad relativa. Las hojas de las lechugas suelen tener escasos nutrientes en su superficie lo que limita el crecimiento de patógenos durante el almacenamiento a temperatura ambiente o de refrigeración.

No obstante, cabe destacar que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coli 0157:H7 son capaces de sobrevivir por tiempo prolongado en la superficie de las hojas de lechuga tanto en refrigeración como a temperatura ambiente (Changa y Fang, 2007; Kroupitski et al., 2009). Además una vez sobre la lechuga las bacterias patógenas cómo Salmonella podría producir polímeros extracelulares en las hojas de la lechuga lo que lleva a la formación de una biopelícula que los puede proteger contra los desinfectantes (Kroupitski et al., 2009); este comportamiento de los microorganismos patógenos se ha observado en diferentes vegetales como por ejemplo en tomate (Iturriaga et al., 2007).

Un hecho a destacar es que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coll 0157:H7, por ejemplo, son capaces de multiplicarse en lechuga picada o cortada incrementando de forma muy significativa su concentración y haciendo mucho más peligroso al alimento (Changa y Fang, 2007).

Los microorganismos patógenos en la superficie de las hojas de lechuga pueden contaminar los tejidos internos e infiltrase y posteriormente durante el cortado de las hojas podrían contaminar el producto picado y crecer en el (Changa y Fang, 2007). Varios hallazgos de la investigación indican que los patógenos bacterianos pueden infiltran en los productos vegetales, como las hojas de lechuga (Kroupitski et al., 2009; Bartz, 1982; Guo et al., 2002; Ibarra-Sanchez et al., 2004; Zhuang y Beuchat 1995) cuando hay un diferencial de temperatura entre el producto vegetal y el agua de lavado y por la presión hidrostática cuando los vegetales se sumergen en el tanque de recepción (Bartz, 1982; Bartz y Showalter, 1981).

La infiltración bacteriana aumenta en los vegetales crudos en presencia de heridas y pinchazos. Los patógenos infiltrados no se eliminan por las prácticas normales de lavado. El principal beneficio de la adición de productos químicos antimicrobianos (como los desinfectantes químicos a base de hipoclorito o a base de ácidos orgánicos) al agua de lavado de las lechugas es el control de la propagación de agentes patógenos, su inactivación y/o evitar su infiltración a las hojas de lechugas. No obstante, los desinfectantes químicos actualmente disponibles tienen beneficios limitados sobre los productos vegetales, como las lechugas. Se ha estudiado el efecto antimicrobiano de soluciones de hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y el agua electrolizada en su capacidad para reducir los agentes patógenos en productos vegetales durante el proceso de lavado. No obstante, se ha concluido que estos tratamientos tienen un efecto limitado sobre los microorganismos patógenos, presumiblemente porque los agentes activos no tienen suficiente contacto con los microorganismos patógenos sobre los productos vegetales crudos.

El proceso de desinfección se refiere a la destrucción física de los microorganismos cuya actividad compromete la inocuidad o las características sensoriales de un alimento. El efecto puede lograrse a través de medios físicos o químicos, estando su eficacia en función de los microorganismos (tipo y número), el substrato sobre el cual se encuentran (presencia de materia orgánica), la estructura del material (que permita el acceso directo del germicida a los microorganismos) y el germicida (concentración, temperatura y tiempo de contacto) (Fernández, 2000). En el proceso de desinfección, la sustancia germicida participa en reacciones químicas, de manera que mientras mayor es el número de microorganismos mayor demanda del agente para lograr una inactivación total de la población. La susceptibilidad a un germicida específico varía entre los microorganismos; algunos se inactivan desde el primer momento de contacto, mientras que en el otro extremo pueden existir sobrevivientes. Finalmente hay que tener presente que entre los microorganismos es posible la selección de cepas con resistencia creciente al efecto de una agente germicida específico. En consecuencia, con el tiempo, llegan a requerirse concentraciones muy superiores del desinfectante a las iniciales para alcanzar el mismo nivel de inactivación (Fernández, 2000).

Diferentes estudios demuestran que los tratamientos de desinfección de productos agrícolas crudos con frecuencia tienen un efecto débil ó limitado. Por ejemplo el lavado y desinfección con 200 mg/L de cloro activo (hipoclorito), de yodo (yodóforo), de bióxido de cloro o de 100 mg/L de un producto comercial a base de extracto de semilla de toronja (citricidal) redujeron el contenido de germinado de alfalfa en sólo 1-2 logi0; la disminución de S. typhi o de V. cholerae 01 inoculados en el laboratorio no fue mayor a 1.5 logio UFC/g (Castro-Rosas y Escartín, 1999).

La industria de alimentos cuenta con una diversidad de agentes germicidas. Sus virtudes y limitaciones obligan a seleccionar cuidadosamente aquellos que mejor se ajusten a cada necesidad particular (Fernández, 2000). La inactivación de las bacterias patógenas en las plantas procesadoras de alimentos es un requisito básico para controlarlas e impedir su acceso al producto terminado (Álvarez, 1998).

Lo común es que un germicida se considere efectivo cuando demuestra capacidad para inactivar al menos 3 Logio de una suspensión de microorganismos en 30s (Fernández, 2000).

Las soluciones a base de cloro son un desinfectante barato y disponible como hipoclorito o en sus formas de liberación lenta (cloraminas, por ejemplo) (Lelieveld et al., 2013). Los hipocloritos tienen un amplio espectro de actividad antibacteriana, aunque son menos efectivos contra esporas que contra bacterias no formadoras de esporas y tienen bajo efecto contra micobacterias (Russell et al., 2004). Las soluciones de cloro como hipoclorito de sodio ó bióxido de cloro, son ampliamente utilizadas por la industria de alimentos como desinfectante. Los dos son oxidantes fuertes que actúan a nivel de las membranas y otros constituyentes celulares (Harmon et al., 1987). No obstante, el primero presenta la desventaja de reaccionar fácilmente con la materia orgánica, por lo que se inactiva más rápido. En el segundo la interferencia es mínima (Castro-Rosas y Escartin, 1999). La principal desventaja del hipoclorito de sodio es que la humedad, el calor, la luz y sobre todo la presencia de materia orgánica, incrementan la tasa de pérdida de cloro libre. La actividad germicida del cloro generalmente ha sido atribuida al ácido hipocloroso (HOCI), el cual es generado en soluciones acuosas de hipoclorito de sodio y otros compuestos que contengan cloro.

Los desinfectantes se pueden incorporar al agua de lavado y de esta forma contribuir a la reducción de la carga microbiana. La efectividad del hipoclorito no solamente es afectada por el tiempo de exposición y la concentración del cloro libre, si no por otros factores como temperatura, pH, tipo de cepa, así como presencia y tipo de materia orgánica (Álvarez, 1998). No obstante, algunos autores señalan que la eficiencia del hipoclorito en la reducción de microorganismos patógenos presentes en verduras es limitada (Adams et al., 1997).

Compuestos químicos derivados del cloro, yodo y plata han sido típicamente usados como desinfectantes de verduras, como las lechugas. Sin embargo, recientemente diversos estudios muestran que los tratamientos de desinfección con estos compuestos resultan ineficientes en la eliminación o reducción de los niveles de patógenos microbianos. Por tal motivo, muchos países han abandonado el uso de hipoclorito o soluciones de yodo para la desinfección de verduras crudas.

Los ácidos orgánicos han sido utilizados tradicionalmente como conservadores de alimentos o en soluciones para desinfectar verduras crudas. Su efecto antimicrobiano se ejerce a traves de la forma no disociada causando una baja del pH.

El ácido acético es una sustancia inocua; no existen límites oficiales para la ingesta diaria en el hombre. Cuando se incorpora ácido acético a un alimento se expresan dos efectos, uno acidulante y otro preservativo. A concentración de 1-2% inhibe casi toda la flora total dentro de límites razonablemente elevados de carga inicial. Al 0.1% actúa sobre la mayoría de los patógenos y esporulados; al 0.5% tiene efecto sobre los hongos toxigénicos. Se ha evaluado la eficacia del ácido acético contra algunos patógenos específicos utilizando como medio algunos alimentos. Los informes publicados a menudo son difíciles de comparar por que las concentraciones de ácido han sido variables expresadas como porcentaje, molaridad o pH final del medio de ensayo acidificado. La actividad antimicrobiana depende del tiempo de exposición, temperatura, tipo de ácido, concentración del ácido, nivel de disociación y pH (Harmon et al., 1987). No obstante, los resultados generales demuestran que la eficacia del ácido acético aumenta a medida que aumenta la concentración, disminuye el pH, la temperatura aumenta y la carga microbiana disminuye (Harmon et al., 1987). Entre las bacterias, las Gram positivas suelen ser más resistentes que las bacterias Gram negativas (Rameshkumar et al., 2007). Las esporas bacterianas y los virus son más resistentes que las células vegetativas. Sin embargo, los ácidos orgánicos han mostrado también poca efectividad para desinfectar verduras crudas (Fernández, 2000).

La investigación reciente indica que los productos químicos antimicrobianos en la fase de vapor pueden reducir significativamente las poblaciones de patógenos en la superficie de vegetales. El uso de 5 mg / litro de gas dióxido de cloro durante 1 h fue significativamente más eficaz contra la Salmonella en la cicatriz del pedúnculo de tomates que eran soluciones acuosas de 200 ppm de hipoclorito de sodio (2 min de exposición) y 1200 ppm de hipoclorito de sodio acidificado (2 min de exposición) (Yuk et al., 2005). El uso de 10 mg / litro de ozono inactiva por completo 7 log UFC de Salmonella enteritidis de la superficie de tomates cherry después de 15 min, sin embargo, se afecta el color de los tomates (Das et al., 2003).

Debido a que los agentes antimicrobianos en fase vapor pueden ser eficaces contra bacterias adheridas a ubicaciones de los productos agrícolas crudos no alcanzadas por los agentes activos en solución acuosa, su uso en los productos envasados (en bolsas de plástico) o durante el procesamiento de productos (en la empresa) podría proporcionar un beneficio extra en el control de patógenos. Sin embargo, este tipo de tratamientos con vapor no sería un tratamiento opcional ni practico para los productores primarios de lechugas en campo ya que por lo general los productores venden su producto empacado en cajas cartón o madera entre otras cosas por la facilidad y para evitar acumulación e humedad lo que ocurriría si se usaran bolsas de plástico. Además, este tampoco sería un tratamiento práctico para aplicarlo en los restaurantes o en los hogares.

El uso de sustancias químicas como desinfectantes de verduras crudas para mejorar o preservar su inocuidad, es un procedimiento universalmente utilizado por los productores. Sin embargo, algunos de estos antimicrobianos pueden resultar tóxicos para los consumidores; es el caso de las soluciones de hipoclorito. Reportes recientes señalan que el hipoclorito en solución puede formar precursores de cáncer. Además, muchos de los desinfectantes químicos, como las soluciones a base de yodo o plata coloidal, muestran limitado o variado efecto antimicrobiano en productos como las verduras crudas; una situación similar ocurre con los conservadores para alimentos.

Debido a ello, los desinfectantes y conservadores obtenidos a partir de plantas recientemente han surgido como una alternativa viable, ya que estos podrían tener igual o mayor potencial antimicrobiano y con un mínimo riesgo para los consumidores.

La aplicación de extractos del ajo en fruta fresca contra enfermedades poscosecha han obtenido el control completo de la putrefacción marrón de los melocotones causados por el Monilinia fructicola (Roller, 2003). Yucel y Karapinar (2005) evaluaron la reducción de S. typhimuríum en cebollas mediante la aplicación de jugo de limón, vinagre y sus mezclas, observando una reducción respectiva de 0.87-2.93, 0.66-2.92 y 0.86-3.24 Log UFC/g.

Los aceites esenciales provenientes de plantas son capaces de inactivar los patógenos de interés en productos frescos. De 96 diferentes tipos de aceites esenciales examinados, sólo 3 resultaron eficaces contra E. coli 0157:H7 y Salmonella entérica los cuales fueron de orégano, tomillo, y canela. En otro estudio se ensayaron 16 compuestos individuales de los aceites más eficaces contra E. coli 0157:H7 y Salmonella y se encontró que los compuestos más eficaces fueron timol, cinamaldehído, y carvacrol (Friedman et al., 2002). Esta información se obtuvo usando el aceite en la fase líquida. Existe limitada información disponible sobre la eficacia de los aceites esenciales en forma de vapor. En otro estudio, Muñoz (2003) evaluó el efecto de dos concentraciones de carvacrol y el desinfectante comercial Boradantix© (EVESA, Extractos Vegetales S.A.) en la sobrevivencia de L monocytogenes, P. fluorescens, E. coli, Erwinia caratovora y S. typhimurium en jugo de lechuga y zanahoria. Todos los microorganismos de estudio fueron inhibidos en ambas concentraciones del carvacrol. Las bacterias estudiadas mostraron mayor sensibilidad hacia el carvacrol que al Boradantix©. Lin et al., (2000) evaluaron el efecto del alil y metil isocianato (AITC/MITC) (componentes clave de mostaza verde) sobre L. monocytogenes, E. coli 0157:1-17 y S. montevideo, inoculadas sobre la superficie de lechuga y tomate. AITC fue más efectivo contra Salmonella y E. coli, lográndose 8 Log de reducción con un tratamiento de vapor generado de 400 mI de AITC después de 4 y 2 días, respectivamente sobre lechuga. También se alcanzaron 8 Log de reducción de S. Montevideo sobre cutícula de tomate con 500 mI de AITC.

Han sido relativamente pocos los estudios de la acción antimicrobiana de los aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos y en alimentos verdaderos. Sin embargo, la eficacia de aceites esenciales in vitro es a menudo mucho mejor que in vivo o in situ, es decir en alimentos. Generalmente al aplicar un antimicrobiano de plantas a un alimento o in vitro se necesitan de 10 a 100 veces más concentración de antimicrobiano que lo observado in vivo. Por ejemplo, el aceite esencial de la menta ( Mentha piperita) ha demostrado inhibir el crecimiento de Salmonella enteritidis y L. monocytogenes en medios de cultivo por 2 días a 30°C. Sin embargo, el efecto del aceite esencial de la menta en el aperitivos griegos tzatziki (pH 4.5) y el taramasalata (pH 5.0) y en paté (pH 6.8) a 4°C y 10°C fue variable (Roller, 2003). Salmonella enteritidis fue eliminada en aperitivos bajo todas las condiciones examinadas pero no cuando fue inoculado en paté y mantenido a 10°C. En éste mismo estudio, L monocytogenes se comportó de forma semejante, ya que la cuenta microbiana disminuyó en los aperitivos pero aumentó en el paté (Roller, 2003). El crecimiento de E. coli, Salmonella sp., L monocytogenes y Staphylococcus aureus fueron inhibidos por el aceite esencial del orégano en caldos de cultivo. Sin embargo, cuando estos aceites se probaron en alimentos tales como berenjena, taramasalata ó mayonesa se observaron reacciones tales como incremento del pH, incremento de temperatura y para el caso de las emulsiones separación del aceite usado (Roller, 2003). En otro estudio L monocytogenes y S. typhimuríum fueron inhibidos en carne tratada con aceite esencial de clavo y orégano, respectivamente. Una reducción marcada de Aeromonas hydrophila ha sido también reportada en carne de cerdo cocinada que fue tratada con aceites del clavo o cilantro, empaquetada a vacío o con aire y almacenada a 2°C y 10°C. (Roller, 2003).

Las diferencias que se observan entre los estudios de efecto antimicrobiano cuando se aplican directamente los aceites extraídos de plantas sobre los microorganismos (microorganismos en suspensión acuosa) y aquellos en los que existe un alimento o materia orgánica de por medio, es posible que ocurra por la interferencia con los componentes del alimento o de la materia orgánica (proteínas, grasas, azúcares, sales). Por lo tanto, es muy posible que solamente una proporción del aceite esencial adicionado al alimento tenga actividad antibacteriana. Por otra parte, la distribución espacial de las diferentes fases (sólido/líquido) en un alimento y la carencia de homogeneidad de factores como el pH, aw entre otros, pueden jugar un papel en la eficacia. Debido a todo lo anterior, en diversas partes del mundo se encuentran en curso estudios encaminados a la búsqueda de antimicrobianos alternativos (Jongen, 2005). Entre las nuevas alternativas de desinfectantes se ha optado por compuestos naturales con amplia capacidad antimicrobiana.

Cabe destacar que los extractos obtenidos de algunas plantas han mostrado efecto antimicrobiano contra cepas de patógenos multiresistentes a antibióticos, lo cual, abre todo un campo nuevo para el desarrollo de nuevos antimicrobianos para su uso en humanos y animales.

Como antecedente de la presente solicitud, se ha evaluado el efecto antimicrobiano de alrededor de 60 diferentes plantas usadas en la herbolaria (Cruz-Gálvez et al., 2013); donde algunas de éstas han mostrado un elevado poder antimicrobiano contra diferentes microorganismos patógenos, tales como Salmonella o Escherichia coli 0157:H7, entre otros, así como contra microorganismos deterioradores de alimentos ( Pseudomonas aeruginosas, por ejemplo), y la planta que mayor efecto antimicrobiano ha mostrado han sido los cálices de la flor de jamaica, siendo en algunos casos mayor el efecto antimicrobiano que el de desinfectantes comerciales a base de hipoclorito, yodo, plata coloidal o que el de antibióticos como la penicilina.

Diferentes investigadores ha reportado también que los cálices de la flor de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa L) poseen sustancias con elevado poder antimicrobiano (Aziz etal·, 1998; Fernández etal., 1996; Kang etal., 2007).

La jamaica es una de las plantas en las que recientemente se ha reportado presencia de compuestos antimicrobianos en cálices deshidratados (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang et al·, 2007). En los cálices de la flor de Jamaica se han detectado una gama de compuestos fitoquímicos que podrían ser los responsables del efecto antimicrobiano observado, tales como por ejemplo los polifenoles (Tajkarimi et al., 2010), entre ellos algunos ácidos fenólicos (Tajkarimi et al·, 2010), así como flavonoides, catequinas y epicatequinas (Friedman et al. 2002). No obstante, no existen estudios puntuales que muestren cuales son efectivamente las moléculas o compuestos químicos responsable del efecto antimicrobiano observado en los cálices de Jamaica. Diferentes investigadores coinciden en que es necesario realizar mayores estudios para identificar las moléculas específicas y responsables del efecto antimicrobiano provocado por los cálices de Jamaica en solución.

Escasos son los documentos de patente que describen extractos de los cálices de la flor de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa ) y su uso como material con propiedades antimicrobianas.

Por ejemplo, la solicitud de patente JP2002128602 describe su uso en una composición agroquímica para proteger plantas en campos de sembradíos, mientras que la solicitud US20100323046 describe el empleo de un extracto crudo de los cálices de Jamaica para producir un medicamento para tratar infecciones urinarias causadas por Escherichia coli y Candida albicans.

En la solicitud de patente KR20080092186 se describe un extracto de Jamaica que es empleado para mejorar la calidad de la carne de res, puerco y pollo y para incrementar su estabilidad de almacenaje. El extracto es preparado mediante extracción con etanol y sometido a un proceso de secado en frío. La concentración del extracto en la composición es de 500 mg/ml y se trata la carne con una preparación del 0.5-al 3.0 % (por peso).

Por otro lado, en la solicitud US20120015062 se describen composiciones que comprenden extracto de la planta Agapanthus africanus y composiciones que comprenden este extracto mas otros extractos de otras plantas diferentes, como por ejemplo plantas de la familia Rosa o de alfalfa para usarse como agentes en la protección biológica de otras plantas incluyendo sus semillas. A pesar de que en este documento de solicitud de patente se hace referencia al artículo publicado por Leksomboon et al. (Kasetsart, Journal Natural Science 35: 392-396, 2001.) en donde se menciona que extractos obtenidos de diversas plantas ( Hibiscus sabdariffa, Psidium guctjava, Púnica granatum, Spondias pin nata and Tamarindus indica) tienen una función antimicrobiana, dicho documento no aporta ninguna evidencia experimental que involuere los extractos de Hibiscus sabdariffa para el mismo uso que se le da a los extractos de Agapanthus africanus.

Por lo anterior, es necesario contar con composiciones antimicrobianas protectoras efectivas para evitar y/o combatir la contaminación microbiana de los alimentos, principalmente de aquellos que se consumen crudos, como por ejemplo las lechugas, con la finalidad de preservarlos y consumirlos sin el riesgo de adquirir enfermedades causadas por su contaminación con microorganismos patógenos.

Hasta antes de la presente invención, no había sido posible desarrollar composiciones efectivas para desinfectar eficientemente y sin daño al producto como las descritas aquí, y que al mismo tiempo permitieran conservar las propiedades nutritivas de frutas y verduras y no afectar, por ejemplo la calidad de lechugas, con lo cual es posible con la presente invención obtener lechugas crudas inocuas microbiológicamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de PROTÓN (1H) del extracto ACUOSO seco obtenido de los cálices de jamaica que se utilizó en la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con los problemas mencionados anteriormente, existe la necesidad de proveer una formulación de mayor eficacia para inactivar o remover microorganismos patógenos de lechugas ( Lactuca sativa) aún en condiciones extremas de tratamiento, pero que no dañen sensorialmente el alimento.

La presente invención se refiere a soluciones que contienen fitoquímicos presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes de alimentos de origen vegetal y animal, por ejemplo dirigidos a la desinfección y preservación de alimentos de origen vegetal, particularmente a la desinfección y/o preservación de lechugas ( Lactuca sativa).

Una modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de un preparado vegetal que comprende extractos acuosos de los cálices de la flor de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos derivados de plantas que son utilizados como desinfectantes contra microorganismos patógenos presentes en los alimentos y para retrasar el deterioro de los alimentos y/o preservar su inocuidad, es decir, como conservadores para alimentos, los que constituyen una alternativa al uso de desinfectantes tradicionales que pueden llegar a ser tóxicos al ser humano, a los animales o al medio ambiente.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la elaboración de composiciones que contengan el extracto de los cálices de jamaica ( Hibiscus sabdariffa) que tengan una función desinfectante y conservadora de alimentos conjuntamente con otros compuestos que tengan propiedades desinfectantes por ejemplo ácido acético, hipoclorito, etc.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos obtenidos a partir de cálices de jamaica que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos. Un aspecto de esta modalidad se refiere a la aplicación de extractos obtenidos a partir de cálices de la planta de jamaica ( Hibiscus sabdariffa) que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos de origen vegetal, preferentemente lechugas.

Otra modalidad de la presente invención es el desarrollo de un método para la obtención del extracto acuoso a partir de cálices de Jamaica, extracto que resulta ser útil como desinfectante y conservador de alimentos.

Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento y/o conservación de alimentos de origen animal y/o vegetal mediante la aplicación de composiciones que contienen extractos de cálices de jamaica que permiten la desinfección y su conservación de los mismos.

El uso de los extractos de cálices de jamaica como desinfectante y/o conservador de alimentos, es otra modalidad que se describe en la presente invención.

Los compuestos provenientes de los cálices de Jamaica pueden ser de utilidad en la elaboración de un desinfectante eficiente para eliminar a las bacterias patógenas presentes en alimentos de origen vegetal crudos, tal como los las lechugas. En la presente invención aunque se describen tres tipos de extractos de cálices de jamaica, uno acuoso, un metanólico y otro acetónico, específicamente el ACUOSO puede ser utilizado como desinfectante y/o conservador de alimentos debido a su eficiencia en la eliminación de bacterias patógenas de alimentos de origen vegetal crudos tales como las lechugas.

A diferencia de otras composiciones conocidas hasta ahora para el mismo fin, las composiciones de la presente invención son capaces de eliminar a las bacterias patógenas presente en alimentos de origen vegetal crudos, como por ejemplo lechugas per se, sin alterar sus propiedades alimenticias así como las características de calidad del producto. En consecuencia, la aplicación de las composiciones de la presente invención en alimentos de origen vegetal crudos, permite su conservación, así como su desinfección efectiva, lo que los convierte en alimentos seguros para su consumo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las composiciones de la presente invención comprenden extractos de plantas con conocida actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos acuosos y acetónicos de cálices de la flor de Jamaica, ya sean solos o en combinación con otros componentes con probada actividad desinfectante, tales como por ejemplo ácidos orgánicos que incluyen ácido acético y compuestos de cloro que incluyen hipoclorito de sodio. Para el caso de la desinfección de en alimentos de origen vegetal crudos tales como por ejemplo lechugas, las composiciones de la invención que incluyen una mezcla de extractos de cálices de la flor de jamaica así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, que suelen ser muy efectivas para eliminar los microorganismos residentes en el vegetal, logrando al mismo tiempo que sus propiedades organolépticas y/o nutricionales no se vean afectadas y sin que se altere, por ejemplo la calidad comercial de las lechugas.

Para efectos de la presente invención, las composiciones descritas aquí, comprenden: a) Un extracto metanólico derivados de plantas, los cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo extractos derivados de cálices de la flor de jamaica ( Hibiscus sabdariffa), b) Un acido orgánico con actividad desinfectante, como por ejemplo ácido acético, ácido láctico, acido cítrico, ácido peracético, ácido octanoico, ácido peroxietanoico y ácido 1 -hidroxietiliden-1 , 1 -difosfónico, y mezclas de los mismos, en una concentración p/p de 0.01% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%, c) Un compuesto de cloro con actividad desinfectante, como por ejemplo hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, bióxido de cloro y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.001% a 0.1%, y d) Un tensoactivo con actividad emulsificante de las grasas o ceras naturales que se encuentran en el tomate, como por ejemplo, polisorbatos, Polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil C12-C18 dimetil betaína (cocobetaína, alquil C10-C16 dimetilbetaína (laurilbetaína), Sulfobetaína acil (C10-C14 graso) amidopropilen(hidroxipropilen), sulfobetaína, Ciclodextrinas, B- ciclodextrinas y b-Cyclodextrin y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.1% a 5%, preferentemente de 0.5% a 1%.

Para efectos de la invención, las composiciones se agregan a los alimentos a desinfectar y/o preservar a traves de métodos conocidos en el arte, tales como aplicación directa, a través de aerosoles, la inmersión completa de las frutas y verduras en las soluciones desinfectantes o bien mediante dispositivos que permitan su adecuada dispersión en los alimentos a tratar. Las composiciones de la invención pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos en una cantidad de 0.1mL por 1000g de alimento, preferentemente de 0.1 a 1mL por 100g de alimento, o bien adicionarse en volúmenes mayores conforme a las necesidades que se tengan de desinfección del alimento. Después de aplicadas, las composiciones pueden permanecer el tiempo necesario hasta obtener el efecto desinfectante y/o de preservación deseado en las frutas y verduras. Previo a su consumo, las frutas y verduras tratadas con las composiciones descritas aquí simplemente se lavan con agua potable para eliminar dichas composiciones.

Las composiciones descritas aquí, pueden ser obtenidas mediante la mezcla de sus componentes en las concentraciones deseadas, para posteriormente almacenarlas a temperatura ambiente, con lo que se encuentran listas para aplicarse a los alimentos cuando se considere necesario.

Para efectos de la invención, las composiciones descritas deben estar en mezcla con los extractos vegetales con actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos derivados de cálices de Jamaica, las cuales se ponen en contacto con los alimentos, por ejemplo a alimentos de origen vegetal crudos como la lechuga, con la finalidad de desinfectarlos y/o preservarlos. En la presente invención, se describe la actividad desinfectante de extractos derivados de cálices de Jamaica, en la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo a alimentos de origen vegetal crudos, por lo que pueden usarse directamente o bien formando parte de composiciones que las contengan. En este sentido, los extractos derivados de los cálices de Jamaica, pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos a desinfectar y/o preservar en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%.

La efectividad desinfectante y/o de preservación en los alimentos de las composiciones descritas aquí es tal, que inactiva o elimina a las bacterias patógenas al humano o deterioradoras de alimentos que puedan estar presentes en ellos, mientras que al mismo tiempo no afecta las propiedades organolépticas y/o nutritivas del alimento. En el caso de alimentos frescos como poF ejemplo las lechugas, las composiciones de la invención desinfectan adecuadamente el alimento sin afectar sus propiedades alimenticias, mientras que al mismo tiempo no afectan las propiedades organolépticas o de calidad.

Los extractos vegetales de la presente invención pueden ser obtenidos mediante el método siguiente: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir agua, en proporción 1:9; preferentemente se colocan 100 g de la planta seca en un recipiente (matraz) en condiciones asépticas, hervir a 90-100°C por 15-30 minutos y dejar enfriar a 20-30°C; b) Retirar los cálices y recuperar el extracto acuoso; preferentemente el extracto resultante se recupera previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido; c) Pasar el extracto por un tamiz y recuperar el extracto filtrado; preferentemente el extracto se pasa por un tamiz No. 200; d) Retirar el agua del extracto mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; e) Recuperar el extracto seco; preferentemente en un contener previamente estéril.

Obtenidos los extractos éstos se almacena a temperatura ambiente hasta su uso.

Una vez obtenidos los extractos éstos puede utilizarse solos, o bien en combinación con otros desinfectantes para obtener las composiciones de la invención, las cuales pueden ser obtenidas mediante métodos conocidos en el arte donde implique la combinación de los diversos elementos que las conforman para formar soluciones y/o suspensiones para ser aplicadas posteriormente a los alimentos a desinfectar y/o preservar, mediante métodos conocidos en el arte.

La presente invención constituye el primer reporte de la utilización y efectividad de composiciones que contienen extractos vegetales con actividad microbiana, ya sea solos o en combinación con otros desinfectantes, para la desinfección y/o preservación de alimentos, particularmente de frutas y hortalizas, como por ejemplo las lechugas. Como podrá observarse más adelante, las composiciones de la invención son capaces de desinfectar y/o eliminar microorganismos presentes en lechugas de forma muy eficiente, con lo que es posible contar con lechugas inocuas microbiológicamente y seguras para su consumo.

A continuación se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ilustrar la presente invención, sin que ello implique limitación alguna a su alcance.

Ejemplo 1. Materiales y métodos. 1.1. Material vegetal.

Se usaron cálices secos de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) de la variedad criolla de Oaxaca, mientras que en el caso de las lechugas ( Lactuca sativa ) se utilizaron de la variedad Iceberg. Se obtuvieron lechugas de un tamaño y estado fisiológico o edad uniforme. 1.2. Cepas bacterianas.

Se utilizaron cepas de E. coli 0157:1-17 (P1C6, aislada de un brote de enfermedad), E. coli enteroinvasiva (4VC81-5, aislada de caso clínico) E. coli enterotoxigénica (1620 TL, aislada de caso clínico), E. coli enteropatógena (52 GM 291, aislada de caso clínico), Salmonella typhimuríum (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Listeria monocytogenes Scott A, Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) y Shigella flexneri (ATCC 12022), V. cholerae (87151, serotipo Inaba aislada del ambiente) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Las cepas de E. coli 0157:H7 y la de V. cholerae 01 fueron donadas por el Dr. Fernández Escartin de la Universidad Autónoma de Querétaro. Todas las cepas fueron marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de la flora microbiana nativa del extracto (Castro-Rosas y Escartin, 2000). Ésta resistencia al antibiótico se mantuvo en el transcurso durante todo el estudio. Las cepas se mantuvieron a 4 - 7°C en agar base sangre (ABS, Merck®, Alemania) con transferencias quincenales, activándose en caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon®, México) con incubación a 35°C/24h. 1.3. Obtención de extracto acuoso a partir de los cálices de Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmcyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de agua destilada, llevando a ebullición la mezcla durante 20 minutos. Una vez finalizado el tratamiento se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró toda el agua del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. El extracto seco se recuperó en un frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso. 1.4. Obtención de extracto metanólico y acetónico a partir de los cálices de Jamaica.

Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de metanol o acetona y se almacenaron durante 7 días a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró todo el metanol o acetona del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Los extractos secos (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso. 1.5. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, metanólico y acetónico de los cálices de Jamaica en medio de cultivo (estudios in vi tro). 1.5.1. Preparación del inoculo de las cepas.

Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 ml_ de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. Posteriormente, la concentración de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /ml_. Finalmente cada cepa se diluyó decimalmente en solución salina isotónica una sola ocasión. 1.5.2. Preparación de las soluciones de los extractos.

A partir de los extractos secos se prepararon soluciones acuosas empleando agua destilada estéril o una solución de Polisorbato 80: agua en una proporción 20:80. Los extractos acuosos y metanólico se solubilizaron en agua destilada mientras que los extractos acetónicos fueron solubilizados en la solución de Polisorbato 80:agua. A el agua o a el polisorbato 80:agua se les agregaron los extractos secos en una proporción 1:10 (agua:extracto) por separado y se depositarán en frascos estériles. 1.5.3 Efecto antimicrobiano de los extractos en medio de cultivo.

Por separado, 100 mL de la primera dilución de los cultivos de los patógenos fueron inoculados sobre cajas de AST suplementadas con 10 mg/L de el antibiótico rifampicina, el inoculo se distribuyó en toda la superficie del agar mediante la téenica de extensión por superficie. Sobre las cajas inoculadas, por separado, se colocaron alícuotas de 10 mL de la solución de los extractos (acuoso, metanólico o acetónico). Se realizaron cuatro repeticiones para cada tratamiento. Después de que el extracto o fracciones fueron absorbidos por el agar, las cajas de cultivo se incubaron a 35 ± 1°C, por 24 h. Finalmente se midió el diámetro de cada uno de los halos de inhibición formados en la superficie del medio inoculado. 1.6. Evaluación del efecto antimicrobiano de los extractos acuoso, metanólico, acetónico, acido acético, hipoclorito y formulaciones específicas en la reducción de Salmonella y E. coli 0157: H7 en lechugas contaminadas. 1.6.1. Preparación de las soluciones desinfectantes.

Las soluciones de extractos de cálices de Jamaica así como las mezclas conteniendo extractos, acido acético e hipoclorito fueron preparadas a las concentraciones, proporciones o mezclas que se describen en la Tabla 1. Por ejemplo, para preparar 100 mi de una solución conteniendo extracto metanólico de cálices Jamaica al 1 %, acido acético al 0.1 % y 100 mg/L de hipoclorito: a 100 mL de agua destilada se le agregó 1 g de extracto metanólico seco de cálices de Jamaica, además 1 mi de una solución de acido acético al 10 % y 0.2 mi de una solución de hipoclorito al 5 %. A estas soluciones se les agrego o no el tensoactivo polisorbato 80 (también conocido como tween 80) a la proporción que se describe en la tabla 1. 1.6.2. Cepas.

Para éstos estudios se trabajó con 7 serotipos de Salmonella: (3 typhimurium [ATCC 14028, uno aislado de tomate, J1, y otro de semilla de alfalfa, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi , gaminara, y montevideo) y 3 de E. coli 0157:H7 (dos aisladas en nuestro laboratorio a partir de carne cruda [P1C6 y M5C8] y otra aislada de un brote provocado por consumo de carne en los Estados Unidos de Norteamérica [E09]). Todas las cepas fueron marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de la flora microbiana nativa del extracto (Castro y Escartín, 2000).

Tabla 1. Tratamientos a los que fueron sometidas por separado las hojas de lechugas contaminadas con las mezclas de las cepas de Salmonella o de las cepas de E. coli 0157:H7 Tratamientos 1 Sin tratamiento (control) 2 Extracto acuoso 1 % 3 Extracto acetónico 1% 4 Extracto metanólico 1% 5 Hipoclorito de sodio 50 ppm 6 Hipoclorito de sodio 100 ppm 7 Ácido acético 0 1 % 8 Ácido acético 0.5 % 9 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% 10 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% 11 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% 12 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% 13 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% 14 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% 15 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 16 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 17 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 18 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 19 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 20 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 21 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 22 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 23 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 24 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 25 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 26 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 27 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 28 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 29 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 30 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 31 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 32 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 33 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 34 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 35 Extracto metanólico1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 36 Extracto metanólico1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 37 Extracto metanólico1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 38 Extracto metanólico1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% Para la elaboración de las soluciones se empleo como base: A) el extracto seco de los cálices de Jamaica en la sección anterior, B) Solución de hipoclorito de sodio con el 5 % de hipoclorito libre, C) Ácido acético glacial al 10 %, d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Pollsorbato 80), d) Agua destilada estéril a pH 6 1.6.3. Preparación del inoculo de las cepas.

Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. La concentración resultante de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /mL. Un mililitro de cada cepa de Salmonella fue mezclado en un tubo de ensaye vacío para tener una mezcla de las 7 cepas de Salmonella examinadas. Lo mismo se realizó con las cepas de E. coli 0157:H7, para tener una mezcla de las tres cepas de E. coli 0157:H7. 1.6.4. Inoculación de la lechuga Se utilizaron lechugas de las variedades Iceberg; las lechugas fueron obtenidas de un productor local. Previo a la inoculación, se separaron las hojas, de las lechugas y se limpiaron suavemente con un paño limpio para retirar partículas de polvo. Se utilizaron hojas de lechuga enteras de un tamaño uniforme o semejante y que no presentaron daños visibles. Por separado, se inocularon las hojas de lechuga de manera individual colocando en 5 diferentes parte centrales de cada hoja 10 mL de una suspensión de cada tipo de mezcla de bacteria patógena ( Salmonella ó E. coli 0157:1-17) conteniendo aproximadamente 1 x 107 UFC, las hojas inoculadas se colocaron en una charolas y se introdujeron en una campana bioclimática por dos horas a una humedad relativa de 90±1% y 26.5±1 °C. La finalidad de este tratamiento fue la de provocar la adherencia o infiltración de las células de las bacterias patógenas de estudio para simular las condiciones naturales o comunes de contaminación. 1.6.5. Tratamiento de desinfección de las hojas de lechuga.

Después de las dos horas en la cámara bioclimática, cada hoja se lavó por separado para eliminar los microorganismos que no se adhirieron, el lavado consistió en sumergir y agitar las partes inoculadas de la lechuga en agua destilada por 10 S; se dejó escurrir la parte lavada a temperatura ambiente hasta sequedad total y posteriormente, por separado, la parte inoculada de las lechugas se sumergió por 10 min en las diferentes soluciones desinfectantes señaladas en la Tabla 1. Un tratamiento solo con agua destilada sirvió como control positivo. 1.6.6. Recuento de microorganismos sobrevivientes a los tratamientos Después del tratamiento, las hojas de lechuga se retiraron de la solución desinfectante y para eliminar el desinfectante remanente se sumergió la parte inoculada en agua destilada por 10 s, posteriormente se cortó las partes inoculadas con ayuda de un bisturí estéril, las porciones de cada lechuga se colocaron juntas en una bolsas de plástico y se les adicionó 10 mi de diluyente de peptona. Posteriormente, los materiales se agitaron manualmente presionando y frotando con fuerza la parte inoculada y toda la porción de lechuga inoculada desde la parte exterior de la bolsa por un 2 minutos. Después de este tiempo se realizó el recuento de cada bolsa mediante la téenica de vertido en placa empleando agar para métodos estándar (Bioxon, México) adicionado de 100 mg/L de Rifampicina (Sigma, México), las cajas se incubaron a 35°C/24-48 h. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada replica. Cada tratamiento se efectuó por quintuplicado. 1.6.7. Análisis estadístico Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey, con un nivel de significancia del 0.05. 1.7. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de los extractos Se determinó el espectro de RMN del protón (1H) tanto del extracto acuoso secos obtenido de los cálices de Jamaica. Los extractos se solubilizaron en agua deuterada. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (Varían NMR, 400 MHz).

La espectroscopia de RMN estudia los núcleos atómicos. Esta téenica espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos), para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta situación se da en los átomos de 1H I3Q i9p ^ 3ip ste 0 nijC|eos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. El espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN.

Ejemplo 2. Efecto antimicrobiano de los extractos de los cálices de Jamaica.

Los tres tipos de extractos (acuoso, metanólico y acetónico) mostraron un acentuado efecto antimicrobiano (Tabla 2). Todos los microorganismos ensayados fueron inhibidos desde los primeros instantes de contacto. No obstante, el extracto metanólico fue el que mostró mayor actividad antimicrobiana (Tabla2). Y el que mostró menor efecto fue el extracto acuoso.

El efecto inhibitorio observado sugiere la presencia de substancias antimicrobianas en los extractos. Este efecto puede provocar un daño letal a la célula o solo causar un efecto subletal ó estrés celular (Busta, 1976). Distintos componentes del vegetal podrían ser los responsables de éste efecto antimicrobiano. Es posible que los cálices de jamaica contengas antimicrobianos diferentes; es decir, el efecto antimicrobiano puede ser debido al efecto de diferentes moléculas con actividad antimicrobiana, esta observación se sustenta en el hecho de que los extractos se obtuvieron con tres solventes de distinta polaridad, y los tres tipos de extractos mostraron actividad antimicrobiana.

Tabla 2. Efecto antimicrobiano del extracto acuoso de Jamaica diluido 1:10 y el de una solución de penicilina (control) sobre diferentes microorganismos * (mm) Ejemplo 3. Potencial desinfectante de los extractos solos o en mezclas con ácido acético, hipoclorito de sodio y/ó Polisorbato 80.

Se encontró que todos los tratamientos tuvieron efecto antimicrobiano con respecto al control (Tablas 3). No obstante sólo 3 combinaciones (28, 29 y 30) fueron 100 porciento efectivas (Tablas 3) para desinfectar la lechuga. Fue con la combinación en la que se incluyó el extracto acuoso de los cálices de jamaica. Por alguna razón, ya al aplicar los extractos acuosos en combinación con los otros componentes de los tratamientos 28, 29 y 30, directamente sobre la lechuga, estos extractos mostraron mayor efecto que los metanólico y acetónico. Esto sugiere que en el extracto metanólico están presentes sustancias específicas que no están presentes en los otros extractos o bien que en los otros extractos si están presentes pero en mucho menor concentración de tal forma que no influyen en el efecto antimicrobiano.

Tabla 3. Concentración de E. cotí 0157:1-17 y S.T phimurium en lechuga al inicio y después de diferentes tratamiento E. cotí 0157:H7 Salmonella Tratamiento Número Número Número Número Inicial Final Inicial Final Sin tratamiento (control) 4.80 ± 0.201 * 4.60 ± 0.30 5.00 ±0.30 4.80 ± 0.20 2 Extracto acuoso 1% 4.80 ±0.20 3.20 ±0.30 5.00 ±0.30 3.00 ± 0.20 3 Extracto acetónico 1% 4.80 ± 0.20 3.00 ± 0.30 5.00 ±0.30 3.00 ± 0.20 4 Extracto metanólico 1 % 4.80 ±0.20 3.10 ±0.30 5.00 ±0.30 3.10 ±0.20 5 Hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80 ± 0.20 3.20 ± 0.30 5.00 ±0.30 3.60 ± 0.20 6 Hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80 ±0.20 2.80 ±0.40 5.00 ±0.30 3.30 ± 0.20 7 Ácido acético 0.1 % 4.80 ±0.20 3.20 ±0.30 5.00 ±0.30 3.20 ± 0.30 8 Ácido acético 05 % 4.80 ± 0.20 3.00 ± 0.20 5.00 ±0.30 3.00 ±0.30 9 Extracto acuoso 1 % + ácido acético 0.1% 4.80 ± 0.20 2.80 ± 0.30 5.00 ±0.30 2.90 ±0.40 10 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% 4.80 ±0.20 2.30 ±0.20 5.00 ±0.30 2.20 ± 0.40 11 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% 4.80 ±0.20 2.60 ±0.20 5.00 ±0.30 2.60 ±0.20 12 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% 4.80 ±0.20 2.20 ±0.30 5.00 ±0.30 2.20 ±0.20 13 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.1 % 4.80 ± 0.20 2.50 ± 0.30 5.00 ±0.30 2.50 ±0.30 14 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.5% 4.80 ±0.20 2.20 ±0.20 5.00 ±0.30 2.20 ±0.30 15 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80±0.20 2.20±0.30 5.00 ±0.30 2.00 ±0.20 16 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80±0.20 2.10±0.30 5.00 ±0.30 1.80 ±0.20 17 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80±0.20 2.00±0.20 5.00 ±0.30 1.90 ±0.30 18 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80 ±0.20 1.9D±0.30 5.00 ±0.30 2.00 ±0.20 19 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80±0.20 1.80 ±0.30 5.00 ±0.30 2.00 ± 0.30 20 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80 ±0.20 1.90 ±0.30 5.00 ±0.30 1.90 ±0.30 o 21 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80±0.20 1.40 ±0.30 5.00 ±0.30 1.60 ±0.30 22 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80 ± 0.20 1.20 ± 0.30 5.00 ±0.30 2.20 ±0.30 23 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80±0.20 1.80 ±0.30 5.00 ±0.30 2.00 ± 0.30 24 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 50 ppm 4.80±0.20 1.90 ±0.30 5.00 ±0.30 1.80 ±0.20 25 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80±0.20 1.20 ±0.30 5.00 ±0.30 1.40 ±0.20 26 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm 4.80 ±0.20 1.40 ±0.40 5.00 ±0.30 1.20 ±0.20 27 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1 %+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.20 ± 0.40 5.00 ±0.30 1.10 ±0.30 28 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 0.00 S.00± 0.30 0.00 29 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1 %+hipoclorito desodio 100 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ±0.20 0.00 5.00 ± 0.30 0.00 30 Extracto acuoso 1 %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 0.00 5.00 ± 0.30 0.00 31 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1 %+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.70 ± 0.20 5.00 ±0.30 1.70 ±0.30 32 Extracto acetónico 1 %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.50 ± 0.20 5.00 ±0.30 1.10 ±0.30 33 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1 %+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.70± 0.20 5.00 ±0.30 1.80 ±0.20 34 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.60 ± 0.20 5.00 ±0.30 1.70 ±0.20 35 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.1 %+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ± 0.20 1.50 ± 0.20 4.00 ±0.30 1.80 ±0.30 36 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 50 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ±0.20 1.40 ±0.20 4.00 ±0.30 1.20 ±0.20 37 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.1 %+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802 % 4.80±0.20 1.30 ±0.20 4.00 ±0.30 1.40 ±0.20 38 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 4.80 ±0.20 1.20 ±0.20 4.00 ±0.30 1.10 ±0.20 1 Unidades Formadoras de Colonias / porción inoculada, * Promedio de estudios por quintuplicado, ±: desviación estándar En la tablas 3, se observa que solo 3 combinaciones lograron eliminar a niveles no detectables la concentración de las mezclas de cada patógeno: los tratamientos 28, 29, 30 redujeron 5 logio la concentración de ambos tipos de patógenos (Tablas 3) En la presente invención, 3 combinaciones específicas (tratamiento 28, 29, 30) de tres antimicrobianos y un tensoactivo (polisorbato), se logró la eliminación total de los microorganismos patógenos inoculados sobre las hojas d elechuga entera; esto es un ejemplo de lo que actualmente se conoce como tratamiento de barreras múltiples. Las barreras múltiples son la combinación de tratamientos antimicrobianos que potencian el efecto antimicrobiano global, lo que da como resultado alimentos estables, seguros e inocuos.

Cabe señalar el posible papel potenciador del polisorbato 80 en el efecto antimicrobiano observado, ya que al ser un tensoactivo es posible que haya favorecido la emulsificación de la cera natural de las hojas de lechuga lo cual pudo incrementar el efecto de la solución desinfectante al eliminar o disminuir el efecto protector que la cera estaría proporcionando a los microorganismos inoculados sobre las hojas de lechuga Por lo anterior, las composiciones de la presente invención son una excelente alternativa para la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo alimentos de origen vegetal crudos, sin que alteren sus propiedades nutritivas. En este sentido, las composiciones descritas aquí, permiten la desinfección o inactivación efectiva de microorganismos patógenos de alimentos de origen vegetal crudos, preferentemente lechugas, permitiendo el consumo seguro de tales productos.

Ejemplo 4. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido del extracto acetónico.

El espectro de RMN obtenido del extracto acuoso seco de los cálices de Jamaica se presenta en la Figura 1. En el espectro se observan varios picos característicos del extracto que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza el extracto acuoso usado en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 3.

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Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar lechugas ( Lactuca sativa), caracterizada porque comprende: a) Extracto acuoso de cálices de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) b) Ácido acético; c) Hipoclorito de Sodio; d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80)

2. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el a) extracto acuoso de cálices de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%.

3. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el b) ácido acético está presente en una concentración entre 0.01 a 10%.

4. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el c) hipoclorito de Sodio está presente en una concentración entre 10 a 1000 ppm.

5. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el d) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 está presente en una concentración entre 0.1 a 10 %.

6. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el e) extracto acuoso de cálices de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 1.

7. La solución de la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una presentación como formulación acuosa.

8. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención del extracto.

9. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.

10. La solución definida en las reivindicaciones anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) del extracto acuoso obtenido de los cálices de la Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) (Figura 1).

11. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen vegetal y animal.

12. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, especialmente lechuga.

13. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las principales variedades de lechugas ( Lactuca sativa) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Orejona, Romana, Iceberg, Boston, Italiana, Cos, Baby, Butterhead, Cutting, Stalk, Latín.

14. Un método para la desinfección y/o preservación de lechugas ( Lactuca sativa), caracterizado porque comprende aplicar a la lechuga la solución definida en las reivindicaciones anteriores.

15. Un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar lechugas ( Lactuca sativa), caracterizado porque es obtenido mediante las siguientes etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir agua, hervir durante 20 minutos y dejar enfriar a a 22° ± 2° C, b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el agua del extracto, y c) Recuperar el extracto seco.

16. El extracto de la reivindicación 15, caracterizado porque se obtiene con agua.

17. El extracto de conformidad con la reivindicación 15, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la obtención del extracto.

18. El extracto de la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es la planta de Jamaica ( Hibiscus sabdariffa).

19. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto es obtenido de los cálices de la Jamaica.

20. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 1.

21. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.

22. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, preferentemente lechuga.

23. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las principales variedades de lechugas ( Lactuca sativa) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Orejona, Romana, Iceberg, Boston, Italiana, Cos, Baby, Butterhead, Cutting, Stalk, Latín.

24. Un método para la desinfección y/o preservación de lechugas ( Lactuca sativa), caracterizado porque comprende aplicar a la lechuga el extracto definido en las reivindicaciones de la 15 a la 23.

25. Un método para obtener un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar lechugas ( Lactuca sativa), caracterizado porque comprende las siguiente etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir agua, hervir durante 20 minutos y dejar enfriar a a 22° ± 2° C, b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el agua del extracto, y c) Recuperar el extracto seco.

26. El método para obtener el extracto vegetal de la reivindicación 25, caracterizado porque el extracto puede tener una presentación sólida o liquida.

27. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar lechugas ( Lactuca sativa), caracterizado por comprender los pasos de: a) Colocar Jamaica ( Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir agua, hervir durante 20 minutos y dejar enfriar a a 22° ± 2o C, b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el agua del extracto y, c) Recuperar el extracto seco, d) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, extracto acuoso seco de la planta, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno Sorbitan o polisorbato 80,

28. El método conforme a la reivindicación 27 donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.