MX2013014364A

MX2013014364A - Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.

Info

Publication number: MX2013014364A
Application number: MX2013014364A
Authority: MX
Inventors: Kevin Fitzgerald; Stuart Milstein; Brian Bettencourt; William Querbes; Maria Frank-Kamenetsky; Svetlana Shulga-Morskaya
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2014-07-30
Also published as: US20220073926A1; US20190316137A1; AU2021201547A1; MX360782B; US11306314B2; JP2017148048A; BR122019026068B1; US20200140866A1; JP7641997B2; US20140179768A1; CA2839573A1; BR122019026068B8; US10550390B2; US20190352645A1; MX2022012087A; EP3656860A1; US10934545B2; ES2923573T3; JP6430559B2; RU2019138721A

Abstract

La invención se relaciona con composiciones de ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) que tiene como objetivo el gen para ANGPTL3 así como métodos para inhibir la expresión de ANGPTL3 y métodos para tratar a sujetos que presentar un trastorno de metabolismo de lípidos tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia, utilizando las composiciones de ARNds.

Description

COMPOSICIONES DE ARNi SIMILARES A ANGIOPOYETINA 3 (ANGPTL3 ) Y METODOS PARA SU USO ANTECEDENTES DE LA INVENCION La sustancia similar a angiopoyetina 3 (ANGPTL3) es un miembro de la familia similar a angiopoyetina de factores secretados que regulan el metabolismo de lípidos y que se expresa de modo predominante en hígado (Koishi, R. et al., (2002) Nat. Genet. 30 (2) : 151-157) . ANGPTL3 inhibe de manera doble las actividades catalíticas de lipoproteína lipasa (LPL, por sus siglas en inglés) , la cual cataliza la hidrólisis de triglicéridos y de la lipasa endotelial (EL, por sus siglas en inglés) , la cual hidroliza fosfolípidos de lipoproteína de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) . En ratones KK/Snk hipolipidémicos pero obesos, una reducción en la expresión de ANGPTL3 tiene un efecto protector contra hiperlipidemia y aterosclerosis al promover la depuración de triglicéridos (Ando et al., (2003) J. Lipid Res., 44:1216-1223) . Las concentraciones en plasma de ANGPTL3 humano se correlacionan positivamente con las concentraciones de colesterol HDL en plasma y fosfolípidos HDL (Shimamura et al., (2007) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol . , 27:366-372).

Los desórdenes en el metabolismo de lípidos puede llevar a niveles elevados de lípidos en suero tales como triglicéridos y/o colesterol. Los lípidos en suero elevados Ref. 245381 se asocian fuertemente con úna presión sanguínea alta, enfermedad cardiovascular, diabetes y otras condiciones patológicas. La hipertrigliceridemia es un ejemplo de un trastorno de metabolismo de lípidos que es caracterizado por niveles sanguíneos altos de triglicéridos . Se ha asociado con aterosclerosis , incluso en ausencia de niveles de colesterol altos (hipercolesterolemia) . Cuando las concentraciones de triglicéridos son excesivas (es decir, mayores de 1000 mg/dl o 12 mmol/1) , la hipertrigliceridemia también puede generar pancreatitis. La hiperlipidemia es otro ejemplo de un trastorno en el metabolismo de lípidos que está caracterizado por niveles elevados de cualquiera o de la totalidad de los lípidos y/o lipoproteínas en la sangre. Los tratamientos actuales para desórdenes en el metabolismo de lípidos que incluyen dieta, ejercicio y tratamiento con estatinas y otros fármacos no siempre son eficaces. En consecuencia, existe la necesidad en el ámbito por tratamientos alternativos para sujetos que padecen desórdenes en el metabolismo de lípidos.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona composiciones de ARNi las cuales alteran la separación de transcritos de ARN de un gen para A GPL3 mediada por el complejo de bloqueo de expresión inducida por ARN (RISC) . El gen para ANGLP3 puede estar dentro de una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un humano. La presente invención también proporciona métodos de uso de las composiciones de AR i de la invención para inhibir la expresión de un gen para ANGPL3 y/o para tratar un sujeto quien se podría beneficiar de inhibir o reducir la expresión de un gen para ANGPTL3, por ejemplo, un sujeto que padece o que es susceptible de padecer un trastorno de metabolismo de lípidos tal como un sujeto que padece o que es susceptible de padecer hiperlipidemia o hipertrigliceridemia.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona ácidos ribonucleicos de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de ANGPTL3. Los AR ds comprenden una hebra directa y una hebra antisentido, en donde la hebra directa comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y la hebra antisentido comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que diferen en no más de 3 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 5.

En otro aspecto, la presente invención proporciona ácidos ribonucleicos de dojble hebra (los ARNds) para inhibir la expresión de ANGPTL3. Los ARNds comprenden una hebra directa y una hebra antisentido, la hebra antisentido comprende una región de complementariedad la cual comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias antisentido enumeradas en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En una modalidad, la hebra directa y antisentido comprende las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste de AD-53063.1, AD-53001.1, AD-53015.1, AD-52986.1, AD-52981.1, AD-52953.1, AD-53024.1, AD-53033.1, AD-53030.1, AD-53080.1, AD-53073.1, AD-53132.1, AD-52983.1, AD-52954.1, AD-52961.1, AD-52994.1, AD-52970.1, AD-53075.1, AD-53147.1, AD-53077.1 de las Tablas 7 y 8.

En algunas modalidades de la invención, los ARJXfds comprenden por lo menos un nucleótido modificado. En una modalidad, por lo menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste de un nucleótido modificado 21 -o-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico. En otra modalidad, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste de un nucleótido modificado con 2 ' -desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido inmovilizado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforoamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.

La región de complementariedad de los ARNds puede ser de por lo menos 17 nucleótidos de longitud, entre 19 y 21 nucleótidos de longitud o de 19 nucleótidos de longitud.

En una modalidad, cada hebra de ARNds es no mayor de 30 nucleótidos de longitud.

Por lo menos una hebra de un ARNds puede comprender una parte sobresaliente 3' de por lo menos 1 nucleótido o por lo menos 2 nucleótidos.

En algunas modalidades, un ARNds comprende adicionalmente un ligando. En una modalidad, el ligando se conjuga al extremo 3' de la hebra directa del ARNds.

En algunas modalidades, el ligando es uno o más derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc) unidos a través de un enlazante ramificado bivalente o trivalente. En modalidades particulares el ligando es En algunas modalidades, el agente de ARNi se conjuga al ligando como se muestra en el siguiente esquema En algunas modalidades, el agente de ARNi incluye además por lo menos un fosforotioato o un enlace internucleotídico metilfosfonato . En algunas modalidades el enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato se encuentra en la parte 3' terminal de una hebra. En algunas modalidades, la hebra es la hebra antisentido. En otras modalidades, la hebra es la hebra directa.

En una modalidad, la región de complementariedad del ARNds consiste de las secuencias antisentido de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En otra modalidad, un ARNds comprende una hebra directa que consiste de una secuencia de hebra directa que se selecciona de las secuencias de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 y una hebra antisentido que consiste de una secuencia antisentido que se selecciona de las secuencias de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula, por ejemplo, un hepatocito que contiene un ARNds de la invención.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que codifica para por lo menos una hebra de un ARNds, en donde el ARNds comprende una región de complementariedad con por lo menos una parte de un ARNm que codifica para ANGPTL3 , en donde el ARNds tiene una longitud de 30 pares de bases o menos, y en donde el ARNds tiene como objetivo el ARNm .para separación. La región de complementariedad puede ser de una longitud de 15 nucleótidos o de una longitud de 19 a 21 nucleótidos.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector que codifica para por lo menos una hebra de un ARNds, en donde el AR ds comprende una región de complementariedad con por lo menos una parte de un ARNm que codifica para ANGPTL3 , en donde el ARNds tiene una longitud de 30 pares de bases o menos y en donde el ARNds, tiene como objetivo el ARNm para separación.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 que comprende un ARNds o un vector de la invención .

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una formulación lipídica tal como una formulación MC3, SNALP o XTC .

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para inhibir la expresión de ANGPTL3 en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un ARNds ° un vector de la invención y mantener la célula producida durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcrito de ARNm de un gen para ANGPTL3 , por lo que se inhibe la expresión del gen para ANGPTL3 en la célula.

La célula puede estar dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano, por ejemplo un sujeto humano que padece de un trastorno del metabolismo de lípidos, por ejemplo, hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

En una modalidad de los métodos de la invención, se inhibe la expresión de ANGPTL3 en por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99%.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que presenta un trastorno que se podría beneficiar de la reducción en la expresión de ANGPTL3 , por ejemplo, un trastorno del metabolismo de lípidos tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNds o un vector de la invención y de esta manera tratar al sujeto.

El trastorno puede ser un trastorno en el metabolismo de lípidos tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

En una modalidad, la administración del ARNds al sujeto provoca una disminución en el nivel de un lipido en suero, triglicéridos, colesterol y/o ácidos grasos libres y/o una disminución en la acumulación de proteina ANGPTL3. En una modalidad, la administración del ARNds al sujeto provoca una disminución en el nivel de LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C y/o colesterol total.

En una modalidad, el ARNds se administra en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, por ej emplo, aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 5.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 6.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 8.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 9.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg . Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, el ARNds se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7,0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4., 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

En otra modalidad, el ARNds se administra en una dosis de aproximadamente 0 .5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente ! 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1. .5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2. , 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3. .5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4. .5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.75 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.75 ' mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.75 ' mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.75 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, a los sujetos se puede administrar una cantidad terapéutica de ARNi tal como aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4., 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para inhibir la expresión de ANGPTL3 en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNds o un vector de la invención, para de esta manera inhibir la expresión de ANGPTL3 en -el sujeto.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona kits para realizar los métodos de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un kit para realizar un método para inhibir la expresión del gen para A GPTL3 en una célula al poner en contacto una célula con un agente ARNi de doble hebra en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de A GPTL3 en la célula. El kit comprende un agente de ARNi e instrucciones para uso y, opcionalmente , un medio para administrar el agente ARNi a un sujeto.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema del procedimiento experimental utilizado para pruebas in vivo descrito en' el Ejemplo 2.

La figura 2A es una gráfica que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones WT después de tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 2B es una gráfica que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones ob/ob después de tratamiento con el ARNi indicado o un control .

La figura 3A es una gráfica que muestra los niveles medidos de LDL-c en ratones T después de tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 3B es una gráfica que muestra los niveles medidos de LDL-c en ratones ob/ob después de tratamiento con el ARNi indicado o un control .

La figura 4A es una gráfica que muestra los niveles medidos de triglicéridos en ratones WT después de tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 4B es una gráfica que muestra los niveles medidos de triglicéridos en ratones ob/ob después del tratamiento con ARNi indicado o un control .

La figura 5A es una gráfica que muestra los niveles medidos de colesterol total (TC) en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 5B es una gráfica que muestra los niveles medidos de colesterol total (TC) en ratones ob/ob después de tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 6A es una gráfica que muestra los niveles medidos de HDL-c en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 6B es una gráfica que muestra los niveles medidos de HDL-c en ratones ob/ob después de tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 7 es una gráfica que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones transgénicos PCS humano después de tratamiento con una dosis única del ARNi indicado o un control .

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID N0:1 >gi I41327750 I ref I M_014495.2 I similar a angiopoyetina 3 de homosapiens (ANGPTL3) , ARNm TTCCAGAAGAAAACAGTTCCACGTTGCTTGAAATTGAAAATCAAGATAAAAATGTTCACAA TTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGATCAAGACAATTC ATCATTTGATTCTCTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAA ATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACGA AGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCT ATCGCTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAA CTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAA GCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAAC TAACTTAATTCAAAATCAACCTGAAACTCCAGAACACCCAGAAGTAACTTCACTTAAAACT TTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACCGTGGAAGACCAATATA AACAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAGGACTAG TATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCC TTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGAATGTACCA CCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCA AGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGA ATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGC TTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTA TGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTT TACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCC CCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGG ACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAA AACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCCAGAGAGGAGAAGAG GATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGAT CCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAATTTA AACATTAACCTCATTCCAAGTTAATGTGGTCTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAA AGCTTGAGAAATAGATTTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCTATTTAAGATTAAACATACAA TCACATAACCTTAAAGAATACCGTTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTATAATACTATTTG TTTTAAATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCACAATCTAGATTATAATCAATA GGTGAACTTATTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAATTTAGAGACTTTTATTTTAAAAGGCA TCATATGAGCTAATATCACAACTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTACTCTTGTTAAAACTCT AAACTTGACTAAATACAGAGGACTGGTAATTGTACAGTTCTTAAATGTTGTAGTATTAATT TCAAAACTAAAAATCGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATACAAATTTTTAAAC TGATGCTTCATTTTGCTACAAAATAATTTGGAGTAAATGTTTGATATGATTTATTTATGAA ACCTAATGAAGCAGAATTAAATACTGTATTAAAATAAGTTCGCTGTCTTTAAACAAATGGA GATGACTACTAAGTCACATTGACTTTAACATGAGGTATCACTATACCTTATT SEC ID N0:2 >giI297278846 Iref | XM_001086114.2 | PREDICHO: similar a angiopoyetina 3 de Macaca mulatta (ANGPTL3 ) , AR m ATATATAGAGTTAAGAAGTGTAGGTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGTTGCTTGAA ATTGAAAATCAGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTT ATTTCCTCCAGAATTGACCAAGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAAT CAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACA TGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTC AACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAG AAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATAT GTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAA AAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGAAACTCCAG AACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGA CCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCACAGTCAAATAAAA GAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTT CCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAATGTAAA ACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTGGC ATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTATCAG GTAAAACCTGTCTAAGGAGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTA CAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCC ATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAAC ATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATGTAGT TAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACT TGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGTGGT GGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATC TAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATA AAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAA 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TTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAA GGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGACCTA TCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACTACATCTACAC TACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGAG TCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACC AACTTAATTCTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTT TTGTAGAACAGCAAGACAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAA ACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAAAAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGT ATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCC CTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGCCGACTGCTCTGC CGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACAC ATTAAACCAAGAAACTCCCAA GGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGA AAGATGGCTCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCT CGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTAC ATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTC ACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCC TGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGA CAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAA ACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGG GATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTC CAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAA TATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAG AATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAA ACAAAATTTATC SEQ ID N0:4 >gi I 68163568 I ref |N _001025065.1 I similar a angiopoyetina 3 de Rattus norvegicus (Angptl3) , A Nm GACGTTCCAAATTGCTTGAAATTGAATAATTGAAACAAAAATGCACACAATTAAGCTGCTC CTTTTTGTTGTTCCTCTAGTAATTTCGTCCAGAGTTGATCCAGACCTTTCGCCATTTGATT CTGTACCGTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCCAA TGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGTCTTAAAGATTTTGTCCATAAGACAAAGGGACAAATT AATGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTGTTTTTATGACCTATCACTTCAAA CCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACCACATCTAAACTACAAGTTAA AAACGAAGAGGTGAAGAATATGTCACTTGAACTGAACTCAAAGCTTGAAAGTCTACTGGAG GAGAAGATGGCGCTCCAACACAGAGTCAGGGCTTTGGAGGAACAGCTGACCAGCTTGGTTC AGAACCCGCCTGGGGCTCGGGAGCACCCAGAGGTAACGTCACTTAAAAGTTTTGTAGAACA GCAAGATAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAATATAAACAACTAAGT CAACAGCACATTCAGATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAAGACTGGCATTCAAGAAC CCACTGAAAATTCTCTTTATTCTAAACCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCATCT GAAGGAAGCAAAAAATATAGAACAAGATGATCTGCCTGCTGACTGCTCTGCCATTTATAAC AGAGGTGAACATACAAGTGGCGTGTATACTATTAGACCAAGCAGCTCTCAAGTGTTTAATG TCTACTGTGACACCCAATCAGGCACTCCACGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTC TCAAAACTTCAACCAAACGTGGGAAAACTACGAAAAGGGTTTTGGGAGGCTTGATGGTAAA GTGATTTCCTTGCATCACTCACTTATCTGTTGATTTAATAGTATTAGTTGGGTGTGTTGAC ACAGGCCTGAGACCATAGCGCTTTTGGGCAAGGGGGGAGGAGGAGCAGCAGGTGAATTGAA AGTTCAAGACCAGTCTGGGCCACACATTGATACTCCTTCTCGACATTAAGAATTATAAATT AAGCAGCAATTATAAAATGGGCTGTGGAAATGTAACAATAAGCAAAAGCAGACCCCAGTCT TCATAAAACTGATTGGTAAATATTATCCATGATAGCAACTGCAATGATCTCATTGTACTTA TCACTACTGCATGCCTGCAGTATGCTTGTTGAAACTTAATTCTATAGTTCATGGTTATCAT AAGTCTTATTAAGGAACATAGTATACGCCATTGGCTCTAGTGAGGGGCCATGCTACAAATG 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TAATCTTAAATAGACAGTGACTTTAAGATAAAAAAAATCTATTTCTCAAGCTTTCTCTTAA GGATTTAATACCAGATTATTAGACCACATTAACTTGGAATGAGGTTAATGTTTAAATTATT GCCTTTTAAATTTGCCTCAGTTCATTCAAAGCTTTCTGAATCTGTTGGATGGATCAACATT TTGGTTGATTTTATAGAGTATAACCTTCCATTTTGAGACTTCCAAGATAATCCTCTTCTCC TCTCTGGCTTAGATTTTGCTCTTGGTTTGTTATATTTACCATTTAGGTTGTTTTCTCCACA CTCATCATGCCACCACCAGCCTCCTGAATAACCCTCTGGACAGTTGAAGTGTCCTTTTGCT TTGTGATCCCAAGTAGAAAACACCAAATCTTTGTTTTCCGGGATTGCATTGGGGACATTGC CAGTAATCGCAACTAGATGTAGCGTATAGTTGGTTTCGTGATTTCCCAAGTAAAAAGAATA TTCAATATAATGTTTGTTGTCTTTCCAGTCTTCCAACTCAATTCGTAAAACATAATTAGAT TGCTTCACTATGGAGTATATCTTCTCTAGGCCCAACCAAAATTCTCCATCAAGCCTCCCAA AACCATATTTGTAGTTCTCCCACGTTTCATTGAAGTTTTGTGATCCATCTATTCGATGTTG AATTAATGTCCATGGACTACCTGATATAACATCACAGTAGACATGAAAAACTTGAGAGTTG CTGGGTCTGATGGCATACATGCCACTTGTATGTTCACCTCTGTTATAAATGGTGGTACATT CAGCAGGAATGCCATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAACTGAAGAAAGGGAGTAGT TCTTGGTGCTCTTGGCTTGGAAGATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATACTAGTCCTT CTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATTTGACTATGCTGTTGGTTTAATTGTTTATATTGGT CTTCCACGGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATCTTGTTTTTCTACAAAAGTTTTAAG TGAAGTTACTTCTGGGTGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTAAGTTAGTTAGTTGC TCTTCTAAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCAAGTT TTGAGTTGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGT AGTTCTTCTCAGTTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGCGATAGATCATAA AAAGACTGATCAAATATGTTGAGTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTCGTCTTAT GGACAAAGTCTTTAAGACCATGTCCCAACTGAAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATC GTCTAACATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGGAGATAGAGAATCAAATGATGAATTGTCT TGATCAATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGAGCTTAATTGTGAACA TTTTTATCTTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTTTTCTTCTGGAA SEC ID N0:6 Complemento inverso de la SEC ID NO : 2 TAAGGTATAGTGATACCTCATATTAAAGTCAATGTGACTTAGTAATCATCATCTCCATTTG TTTAAAAGACAGCGAACCTATTTTAATACAGTATTTAATCCTGCTTCATTAGGTTTCATAA ATAAATCCTATCAAAAATTTACTCCAGATTATTTTGTAGCAAAATGAGGCATCAGTTTAAA AATTTATATTACAGATTTTTACACATACTCTGTGCTGACAATTTTTAGTTTTGAAATTAAT ATTACAACAAATTTAAGAACTGTATAATTATCAGTCCTCTTTATTTAGTCAAGTTTAGAGT 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CTGATGGCATACATGCCACTTATATGTTCACCTCTATTGTAAATGGTGGTACAATCAGCAG GAATGCCATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAGCTGAAGAAAGGGAGTAGTTCTTGG TGCTCTTGGCTTGGAAGATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATATTAGTCATTCTGAGC TGATTTTCTATTTCTTTTATTTGACTGTGCTGTTGGTTTAATTGCTTATATTGTTCTTCCA CAGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATCTTGTTTTTCTACAAAACTTTTAAGTGAAGT TACTTCTGGATGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTAAGTTAGTTAGTTGCTCTTCT AAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCAAGTTTTGAGT TGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGTAGTTCT TCTCAGTTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGTGATAGATCATAAAAAGAC TGATCAAATATGTTGAGTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTAGTCTTATGGACAA AGTCTTTAAGACCATGTCCCAACTGAAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATCGTCTAA CATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGGAGATACAGAATCAAATGATGAATTGTCTTGGTCA ATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGAGCTTAATTGTGAACATTTTTA TCCTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTGTTCTTCTGGAAGCAGACCTAGACTTC TTAACTCTATATAT SEC ID N0:7 Complemento inverso de la SEC ID NO : 3 CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAAT 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ATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTC ACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCC TGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGA CAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAA ACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGG GATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTC CAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAA TATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAG AATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAA ACAAAATTTATC SEC ID NO:8 Complemento inveros de la SEC ID NO:4 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATTTTAAGTATCTGTTTATTTTTTATTTTTTTACT TATTTTTATAGTTTTGTTTTACAATCAAATAGAATTCATATTCTAGAACATGCAGAGACCC ACAGTTATATAGTATATGTTTATAATATGGAATAATTACAGGTAGGGTTGCAGGAGTTAGA CACCGTATCTCTGACGGTGACCCTGTCCCTTCTAACTCTCGCTCTGTGTTCCTATCACTTT CTTTGTGCTGCTGGGGATCAGTCCCAGTGTCCTGCTGGCCGCGTGTTCCACCACAACTGTG CCTCCAGCCCATTTCACCTGTGTTACGTTGTGCTTAGGATATCACTGAAAGAGCTCTATAC 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AATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTC AACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGCAAC TCCAGAACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATC AAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCATAGTCAAA TAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCT ATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAAT GTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAA GTGGCACGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGT ATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAA ACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAG AGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTG GAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTAT ACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATT TGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTC AGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAA CCAAGAACAAAATCTAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAA 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por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen para ANGPTL3. El gen ANGPTL3 puede estar dentro de una célula, por ejemplo una célula dentro de un sujeto, tal como un humano. La presente invención también proporciona métodos de uso de las composiciones de ANGPTL3 de la invención para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 y/o para tratar a un sujeto que presenta un trastorno que se podría beneficiar de la inhibición o reducción de la expresión de un gen para A GPTL3 , por ejemplo, un trastorno del metabolismo de lípidos tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

Los AR i de la invención incluyen una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región la cual es de aproximadamente una longitud de 30 nucleotidos o menos, por ejemplo 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25 , 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22 nucleotidos de longitud, región la cual es sustancialmente complementaria a por lo menos parte de un transcrito de ARNm de un gen para ANGPTL3. El uso de estos ARNi permite la degradación dirigida de los ARNm de un gen para ANGPTL3 en mamíferos. Dosificaciones muy bajas de los ARNi para ANGPTL3 , en particular, pueden mediar de modo específico y eficiente al ARN de interferencia (ARNi) lo que resulta en inhibición significativa de la expresión de un gen para ANGPTL3. Utilizando análisis basados en células, los presentes inventores han demostrado que los ARNi que tienen como objetivo ANGPTL3 pueden mediar AR i , lo que resulta en inhibición significativa de la expresión de un gen para A GPTL3. De esta manera, los métodos y composiciones que incluyen estos ARNi son útiles para tratar a un sujeto quien se beneficiaría por una reducción en dos niveles y/o actividad de una proteína ANGPTL3 tal como un sujeto que presenta un trastorno de metabolismo de lípidos tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

La siguiente descripción detallada describe la manera para elaborar y utilizar composiciones que contienen ARNi para inhibición la expresión de un gen para ANGPTL3 así como composiciones y métodos para tratar a sujetos que tienen enfermedades y trastornos que se beneficiarían de la inhibición y/o reducción de la expresión de este gen.

I. DEFINICIONES Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, se definen primero algunos términos. Además, debe hacerse notar que siempre que se mencione un valor o intervalo de valores o un parámetro, se pretende que los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se consideren como parte de esta invención.

Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento (por ejemplo, una pluralidad de elementos) .

El término "que incluye" se utiliza en la presente para indicar y se utilizan de manera intercambiable con la frase "que incluye pero que no se limita a". El término "o" se utiliza en la presente para indicar y es intercambiable con el término "y/o" a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido.

El término "ANGPTL3" se refiere a una proteína similar a angiopoyetina 3 que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier fuente vertebrada o de mamífero que incluye pero que no se limita a humano, bovino, pollo, roedor, ratón, rata, porcino, ovino, primate, mono y cobayo a menos que se especifique en otro sentido. El término también se refiere a fragmentos y variantes de ANGPTL3 nativo que mantienen por lo menos una actividad in vivo o in vitro de ANGPTL3 nativa. El término abarca formas precursoras no procesadas de longitud completa de ANGPTL3 así como formas maduras que resultan de separación postraduccional del péptido señal y formas que resultan de procesamiento proteolítico del dominio similar a fibrinógeno. La secuencia de un transcrito de AR m para ANGPTL3 humano se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank Acceso No. GI : 41327750 (NM_014495.2 ; SEC ID NO: 1). La secuencia predicha de ANRm para ANGPTL3 de macaco se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank acceso No. GI : 297278846 (XM 001086114.2; SEC ID NO: 2) . La secuencia de AR m para ANGPTL3 de ratón se puede encontrar en, por ejemplo, GenBank acceso No. GI : 142388354 (NM_013913.3 ; SEC ID NO: 3). La secuencia de ARNm de ANGPTL3 de rata se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank acceso No.: GI 68163568 (NM_001025065.1 ; SEC ID NO: 4).

El término "ANGPTL3", como se utiliza en la presente también se refiere a un polipéptido particular expresado en una célula por variaciones de secuencia de ADN que se presentan de modo natural del gen para ANGPTL3 , tal como un polimorfismo de nucleótido único del gen para ANGPTL3. Numerosos SNP dentro del gen para ANGPTL3 se han identificado y se pueden encontrar, por ejemplo en NCBI dbSNP (véase, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Los ejemplos no limitantes de los SNP dentro del gen para ANGPTL3 se pueden encontrar en NCBI de dbSNP Nos. de acceso rsl93064039 ; rsl92778191; rsl92764027 ; rsl92528948; rsl91931953 ; rsl91293319; rsl91171206 ; rsl91145608; rsl91086880 ; rsl91012841; o rsl90255403.

Como se utiliza en la presente, una "secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen para ANGPTL3 que incluye ARNm que es el producto de ARN de procesamiento de un producto de transcripción primario. En una modalidad, la porción objetivo de la secuencia será por lo menos suficientemente larga para servir como un sustrato para la separación dirigida por ARNi en o cerca de aquella porción de la secuencia nucleotídica de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen para ANGPTL3.

La secuencia objetivo puede ser una longitud de aproximadamente 9 a 36 nucleótidos, por ejemplo, de una longitud de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia objetivo puede ser de una longitud de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23-, 20 a 22, 20 a 21, 21 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25 , 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22. Los intervalos y longitudes intermedias a los intervalos mencionados en lo anterior y las longitudes también se contemplan como parte de a invención.

Como se utiliza en la presente, el término "hebra que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una hebra de nucleótidos que se describen por la secuencia a la que hace referencia utilizando la nomenclatura de nucleótidos estándar.

Las letras "G" , "C", "A" , "T" y "U" indican generalmente un nucleótido que contiene guanina, citosina, alanina, adenina, timidina y uracilo como una base, respectivamente. No obstante, se entenderá que el término " ibonucleót ido" o "nucleótido" también puede hacer referencia a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente en lo siguiente o una porción de sustitución afín. Una persona experta en el ámbito tendrá buen conocimiento de que la guanina, citosina, adenina y uracilo se pueden sustituir por otras porciones sin por esto alterar sustancialmente las propiedades de pareamiento de bases de un oligonucléotido que comprende un nucleótido que presenta tal porción de sustitución. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como se basa puede parearse en bases con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina se pueden sustituir en las secuencias nucleotídicas de AR ds descritas en la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, la adenina y citosina en cualquier parte en el oligonucléotido se pueden sustituir con guanina y uracilo, respectivamente para formar un pareamiento de bases Wobble G-U con un ARNm objetivo. Las secuencias que contienen tales porciones de sustitución son adecuadas para las composiciones y métodos descritos en la · invención.

Los términos "ARNi", "agente de AR i " , "agente ARNi" y "agente de interferencia de ARN", como se utilizan de manera intercambiable en la presente se refieren a un agente que contiene ARN como se define el término en la presente y el cual media la separación dirigida de un transcrito de ARN por la vía de generación de un complejo de bloqueo de expresión inducida por ARN (RISC) . ARNi dirige la degradación específica de secuencia de ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (interferencia de ARNi) . El ARNi modulado, por ejemplo, inhibe la expresión de ANGPTL3 en una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto tal como un sujeto mamífero.

En una modalidad, un agente de interferencia de ARNi de la invención incluye un ARN de hebra sencilla que interactúa con la secuencia de ARN objetivo, por ejemplo, una secuencia de ARNm objetivo de ANGPTL3 para dirigir la separación del ARN objetivo. Sin desear unirse a teoría alguna, el ARN de doble hebra largo introducido en las células se descompone en ARNsi por una endonucleasa tipo III conocida como Dicer (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485) . Dicer, una enzima similar a ribonucleasa III procesa el ARNds en los ARN de interferencia cortos de 19 a 23 pares de bases con partes sobresalientes 3 ' de dos bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Los ARNsi después se incorporan en el complejo de bloqueo de expresión inducido por ARN (RISC) , en donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de AR si, lo que habilita la hebra antisentido complementaria . para guiar el reconocimiento objetivo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Ante la unión del ARNm objetivo apropiado, una o más endonucleasas dentro de RISC separan el objetivo para inducir el bloqueo de expresión (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Así, en un aspecto la invención se relaciona con un ARN de hebra sencilla (ARNsi) generada dentro de una célula y el cual promueve la formación de un complejo RISC para llevar a cabo el bloqueo de la expresión de un gen objetivo, es decir, un gen para ANGPTL3. En consecuencia, el término "ARNsi" también se utiliza en la presente para referirse a una interferencia de ARN como se describe en lo anterior.

En otro aspecto, el agente de interferencia de ARNi es una molécula de ARN antisentido de hebra sencilla. Una molécula de ARN antisentido es complementaria a una secuencia dentro del ARNm objetivo. El ARN antisentido puede inhibir la traducción de una manera estequiométrica por pareamiento de bases al ARNm y obstruir físicamente la maquinaria de traducción, véase Dias, N. et al., (2002) Mol. Cáncer Ther . 1:347-355. La molécula de ARN antisentido de hebra sencilla puede tener una longitud de aproximadamente 13, a aproximadamente 30 nucleótidos y puede tener una secuencia que es complementaria a una secuencia objetivo. Por ejemplo, la molécula de ARN antisentido de hebra sencilla puede comprender una secuencia que es de por lo menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias antisentido en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En otra modalidad, un "ARNi" para uso en las composiciones y métodos de la invención es un ARN de doble hebra y se denomina en la presente como "agente de interferencia de ARN de doble hebra", molécula de ARN de doble hebra (ARNds) " , "agente de ARNds " o "ARNds " . El término "ARNds" se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico que tienen una estructura dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico sustancialmente complementarias y antiparalelas a las que se hace referencia como orientaciones "directa" y "antisentido" con respecto a un ARN objetivo, es decir, un gen para ANGPTL3. En algunas modalidades de la invención, el ARN de doble hebra (ARNds) activa la degradación de un ARN objetivo, por ejemplo, un ARm mediante un mecanismo de bloqueo de expresión de gen postranscripcional al que se denomina en la presente como interferencia de ARN o interferencia de ARNi .

La región dúplex puede ser de cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN objetivo deseado a través de una vía RISC y puede variar de aproximadamente 9 a 36 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 15 a 30 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35 ó 36 pares de bases de longitud, tal como aproximadamente 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25 , 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22 pares de base de longitud. Los intervalos y longitudes intermedias a los intervalos y longitudes mencionados en lo anterior también se contemplan como parte de la invención.

Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande o pueden ser moléculas de ARN separadas . Cuando las hebras son parte de una molécula más grande y por lo tanto están conectadas por una hebra ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3 ' de una hebra y el extremo 5 ' de la otra hebra respectiva formando la estructura dúplex, la hebra de ARN de conexión se denomina como "bucle de horquilla". Un bucle de horquilla puede comprender por lo menos un nucleótido no pareado. En algunas modalidades, el bucle de horquilla puede comprender por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo meons 20, por lo menos 23 o más nucleótidos no pareados.

Cuando dos hebras sustancialmente complementarias de un ARNds están comprendidas por moléculas de ARN separadas, estas moléculas no necesitan, pero pueden estar conectadas covalentemente . Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios diferentes de una hebra ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 31 de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la estructura dúplex, la estructura de conexión se denomina como un "enlazante". Las hebras de ARN pueden tener un número igual o diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNds menos cualquier parte sobresaliente que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, una interferencia de ARN puede comprender una o más partes sobresalientes de nucleótidos.

Como se utiliza en la presente, el término "partes sobresalientes del nucleótido" se refiere a por lo menos un nucleótido no pareado que sobresale de la estructura dúplex de un ARNi , por ejemplo un ARNds. Por ejemplo, cuando un extremo 3 ' de una hebra de un ARNds se extiende sobrepasando el extremo 5' de la otra hebra, o viceversa, existe una parte sobresaliente de nucleótido. Un ARNds puede comprender una parte sobresaliente de por lo menos un nucleótido; de manera alternativa, la parte sobresaliente puede comprender por lo menos 2 nucleótidos, por lo menos 3 nucléotidos, por lo menos 4 nucleótidos, por lo menos 5 nucleótidos o más. Una parte sobresaliente de nucleótido puede comprender o consistir de un nucleót ido/análogo de nucleósido que incluye un desoxinucleótido/nucleósido . Una o varias partes sobresalientes pueden estar sobre la hebra directa, la hebra antisentido o cualquier combinación de las mismas. Además, uno o varios nucleótidos de una parte sobresaliente pueden estar presentes sobre el extremo 51 , el extremo 3 ' o ambos extremos en ya sea la hebra antiséntido o directa de un ARNds .

En una modalidad, la hebra antisentido de un ARNds tiene 1 a 10 nucleótidos, por ejemplo, una parte sobresaliente de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos en el extremo 3' y/o en el extremo 5' . En una modlidad, la hebra directa de un ARNds tiene 1 a 10 nucleótidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de la parte sobresaliente en el extremo 3' y/o en el extremo 5' . En otra modalidad, uno o más de los nucleótidos en la parte sobresaliente están sustituidos con un tiofosfato de nucleósido.

Los términos "romo" o "de extremo romo", como se utilizan en la presente con referencia a un AR ds significa que no hay nucleótidos no pareados o análogos de nucleótidos en un extremo terminal dado de un ARNds, es decir, no hay partes sobresalientes de nucleótidos. Uno o ambos extremos de un ARNds pueden estar romos . Cuando ambos extremos de un ARNds son romos, se dice que el ARNds tiene extremos romos. Para aclarar, un ARNds "con extremos romos" es un ARNds que es romo en ambos extremos, que no hay nucleótidos sobresalientes en cualquiera de los extremos de la molécula. Con mayor frecuencia tal molécula será de doble hebra sobre toda su longitud.

El término "hebra antisentido" o "hebra guía" se refiere a la hebra de un ARNi, por ejemplo un ARNds el cual incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia objetivo, por ejemplo, un ARNm para ANGPTL3. Como se utiliza en la presente, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo una secuencia objetivo, por ejemplo, una secuencia nucleótidos de ANGPTL3 como se define en la presente, en donde la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia objetivo, pueden presentarse pareamiento incompleto en la parte interna o en las regiones terminales de la molécula. Generalmente, los pareamientos incompletos más tolerados están en las regiones terminales, por ejemplo, dentro de 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos de la parte 51 y/o 31 terminal del ARNi .

El término "hebra directa" o "hebra pasajera", como se utiliza en la presente, se refiere a una hebra de un AR i que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido en el término que se define en la presente.

Como se utiliza en la presente y a menos que se indique en otro sentido, el término " complementariedad" cuando se utiliza para describir una primera secuencia nucleotídica en relación a una segunda secuencia nucleotídica, se refiere a una capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia nucleotídica para hibridizar y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia nucleotídica, como se entenderá por las personas expertas en el ámbito. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas en donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, 50°C ó.70°C durante 12-16 horas seguido por lavado (véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Otras condiciones tales como condiciones fisiológicamente relevantes como se pueden encontrar dentro de un organismo se pueden aplicar. La persona experta será capaz de determinar el conjunto de condiciones más apropiado para un conjunto de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleotidos hibridizados.

Las secuencias complementarias dentro de un ARNi, por ejemplo, dentro de un ARNds como se describe en la presente incluyen pareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia nucleotídica a un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia nucleotídica sobre toda la longitud de una o ambas secuencias nucleotídicas . Estas secuencias se pueden denominar como "completamente complementarias" una con respecto a la otra en la presente. No obstante, cuando una primera secuencia se denomina como " sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en la presente, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 5 , 4, 3 ó 2 pares de bases con pareamiento incompleto cuando se produce hibridación para un dúplex de hasta 30 pares de bases, mientras retiene la capacidad para hibridizar bajo las condiciones más relevantes para su aplicación final, por ejemplo, inhibición de la expresión de un gen por medio de la vía RISC. No obstante, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para formar, por hibridación, una o más partes sobresalientes de hebra única, estas partes sobresalientes no se considerarán como malos pareamientos con respecto a la determinación de complementariedad . Por ejemplo, un ARNds que comprende un oligonucleótido con una longitud de 21 nucleótidos y otro oligonucleótido con una longitud de 23 nucleótidos, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que son completamente complementarios al oligonucleótido más corto, aún se le puede denominar como "complementario completamente" para los propósitos que aquí se describen.

La "complementariedad" de las secuencias, como se utiliza en la presente, también incluye o se puede formar completamente a partir de pares de bases diferentes de atson-Crick y/o pares de bases formadas a partir de nucleótidos no naturales y modificados en la medida en que se satisfagan los requerimientos anteriores con respecto a su capacidad para hibridizar. Tales pares de bases diferentes a Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a pareamientos de bases tipo G:U Wobble o Hoogstein.

Los términos "complementariedad", "complementariedad completa" y sustancialmente complementarios" en la presente se pueden utilizar con respecto al pareamiento de bases entre la hebra directa y la hebra antisentido de un ARNds o entre una hebra antisentido y un agente ARNi y una secuencia objetivo, como se entenderá a partir de contexto de su uso.

Como se utiliza en la presente, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a por lo menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica para ANGPTL3). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a por lo menos parte de un ARNm para ANGPTL3 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica para ANGPTL3.

En general, la mayor parte de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos pero, como se describe con detalle en la presente, cada una o ambas hebras también pueden incluir uno o más ribonucleótidos diferentes, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, un "ARNi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas. Estas modificaciones pueden incluir todo tipo de modificaciones descritas en la presente ° conocidas en el ámbito. Cualquiera de estas modificaciones, como se utilizan en una molécula de ARNi están abarcadas por "ARNi" para los propósitos de esta especificación y reivindicaciones .

El término "inhibir", como se utiliza en la presente, se utiliza de manera intercambiable con "reducir", "silenciar o bloquear la expresión", "regular por disminución", "suprimir" y otros términos similares se incluye cualquier nivel de inhibición.

La frase "inhibir la expresión de un ANGPTL3", como se utiliza en la presente incluye la inhibición de expresión de cualquier gen para ANGPTL3 (tal como, por ejemplo, un gen para ANGPTL3 de ratón, un gen para ANGPTL3 de rata, un gen para ANGPTL3 de mono o un gen para ANGPTL3 de humano) así como variantes o imitantes de un gen para ANGPTL3 que codifica para una proteína ANGPTL3.

El término "inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3" incluye cualquier nivel de inhibición de un gen para ANGPTL3 , por ejemplo, supresión por lo menos parcial de la expresión de un gen para ANGPTL3 tal como inhibición por lo menos de aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99%.

La expresión de un gen para ANGPTL3 se puede determinar en base en el nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen para ANGPTL3 , por ejemplo, el nivel de AR m para A GPTL3 o el nivel de proteína ANGPTL3. La expresión de ANGPTL3 también se puede determinar indirectamente en base en los niveles de un lípido en suero, un triglicérido, colesterol (que incluye LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C y colesterol total) o ácidos grasos libres. La inhibición se puede determinar por una disminución en el nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel control. El nivel control puede ser cualquier tipo de nivel control que se utiliza en el ámbito, por ejemplo un nivel de valor inicial antes de la dosis o un nivel determinado a partir de un sujeto similar, célula o muestra que no ha sido tratada o que ha sido tratada con un control (tal como, por ejemplo, control únicamente con amortiguador o control con agente inactivo) .

En una modalidad, la supresión por lo menos parcial de la expresión de un gen para A GPTL3 se determina por una reducción de la cantidad de ARNm para ANGPTL3 la cual se puede aislar de, o se puede detectar en una primera célula o grupo de células en las cuales un gen para ANGPTL3 se transcribe y el cual tiene o ha sido tratado de manera que la expresión del gen para A GPTL3 se ha inhibido, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero las cuales tienen o no han sido tratadas de esta manera (células control) . El grado de inhibición se puede expresar en términos de : (ARNm en células control) - (ARNm en células tratadas) . nnm - — · 100% (ARN en células control) La frase "poner en contacto una célula con un agente de interferencia de ARN" tal como un ARNds, como se utiliza en la presente, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de interferencia de ARN incluye poner en contacto una célula in vitro con el ARNi o poner en contacto una célula in vivo con el ARNi. El contacto se puede realizar directa o indirectamente. Así, por ejemplo, el agente de interferencia de ARN se puede colocar en contacto físico con la célula por la realización individual del método o, de manera alternativa, el agente de interferencia de ARN se puede colocar en una situación que permitirá provocar que subsecuentemente se ponga en contacto con la célula.

El poner en contacto una célula in vitro se puede realizar, por ejemplo, por incubación de la célula con un agente de interferencia de ARN. El poner en contacto una célula in vivo se puede realizar, por ejemplo, al inyectar el agente de interferencia de ARN dentro o cerca del tejido en donde se localiza la célula, o por inyección del agente de interferencia de ARN en otra área,, por ejemplo, la corriente sanguínea o el espacio subcutáneo, de manera tal que el agente subsecuentemente alcanzará el tejido en donde se localiza la célula con la que se tiene que hacer contacto. Por ejemplo, el agente de interferencia de ARN puede contener y/o estar acoplado a un ligando, por ejemplo GalNAc3, que dirige al agente de interferencia de ARN a un sitio de interés, por ejemplo el hígado. Las combinaciones de los métodos in vitro e in vivo de contacto también son posibles. Por ejemplo, una célula también se puede poner en contacto in vitro con un agente de interferencia de ARN y subsecuentemente se puede transplantar a un sujeto.

En una modalidad, el contacto de una célula con un ARNi incluye "introducir" o "suministrar el ARNi en la célula" al facilitar o llevar a cabo la captación o absorción en la célula. La absorción o captación de un ARNi se puede producir a través de difusión no ayudada o procesos celulares activos o por agentes o dispositivos auxiliares. Introducir un ARNi en una célula puede ser in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, para introducción in vivo, el ARNi se puede inyectar en un sitio de te ido o se puede administrar sistémicamente . El suministro in vivo también se puede realizar por un sistema de suministro de beta-glucano, tal como los descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,032,401 y 5,607,677 y en la publicación de E.U.A. No. 2005/0281781, los contenidos completos de las cuales se incorporan en la presente en este documento como referencia. La introducción in vi tro en una célula incluye métodos conocidos en el ámbito tales como electroporación y lipofección. Los enfoques adicionales se describen en la presente a continuación y/o se conocen en el ámbito .

El término "SNAPL" se refiere a una partícula de ácido nucleico- lipido estable. Una SNALP es una vesículo o lípidos que recubren un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un ARNi o un plásmido a partir del cual se transcribe AR i. Las SNAPL se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 20060240093, 20070135372 y en la solicitud internacional No. WO 2009082817, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en este documento. Los ejemplos de formulaciones "SNALP" se describen a continuación.

Como se utiliza en la presente, un "sujeto" es un animal, tal como un mamífero, que incluye un primate (tal como un humano, un primate no humano, por ejemplo un mono y un chimpancé) , uno diferente de un primate (tal como una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un perro, un chivo, un conejo, un borrego, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón, un caballo y una ballena) o un ave (por ejemplo un pato o un ganso) . En una modalidad, el sujeto es un humano, tal como un ser humano que es tratado o que se determina para una enfermedad, trastorno o condición que podría beneficiarse de la reducción en la expresión de A GPTL3 ; un humano en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición que podría beneficiarse de la reducción en la expresión de A GPTL3 ; un humano que presenta una enfermedad, trastorno o condición que se beneficiaría de la reducción en la expresión de ANGPTL3 ; y/o un humano que es tratado por una enfermedad, trastorno o condición quien se beneficiaría de la reducción en la expresión de ANGPTL3 como se describe en la presente. Como se utiliza en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un resultado benéfico o deseado que incluye disminución de los niveles de triglicéridos en un sujeto. Los términos "tratar" o "tratamiento" también incluyen pero no se limitan a alivio o disminución de uno o más síntomas de un trastorno de metabolismo de lípidos tal como, por ejemplo, una disminución en el tamaño de xantomas eruptivos. El término "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento .

Mediante el término "inferior" en el contexto de un marcador de enfermedad o síntoma quiere significar una disminución estadísticamente significativa en este nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40% o mayor y preferiblemente es una reducción a un nivel aceptado dentro de un intervalo de normal para un individuo sin tal trastorno. Como se utiliza en la presente, "prevención" o "prevenir" cuando se utiliza con referencia a una enfermedad, trastorno o condición del mismo que se podría beneficiar de una reducción en la expresión de un gen para ANGPTL3 , se refiere a una reducción en la probabilidad de que un sujeto desarrolle un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, niveles de triglicéridos altos o xantoma eruptivo. La probabilidad de desarrollar triglicéridos altos o xantoma eruptivo se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo para niveles de triglicéridos altos o xantoma eruptivo falla en desarrollar niveles de triglicéridos altos o xantoma eruptivo o desarrolla niveles de triglicéridos altos o xantoma eruptivo con menos gravedad en relación a una población que tiene los mismos factores de riesgo y que no recibe tratamiento como se describe en la presente. La falla para desarrollar una enfermedad, trastorno o condición la reducción en el desarrollo de un síntoma asociado con la enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo, en por lo menos aproximadamente 10% en una escala aceptada clínicamente para la enfermedad o trastorno) o la presentación de síntomas retrasados (por ejemplo, por días, semanas, meses o años) se considera prevención eficaz.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "lípido en suero" se refiere a cualquier lípido mayor presente en sangre. Los lípidos en suero pueden estar presentes en la sangre ya sea en forma libre o como parte de un complejo proteínico, por ejemplo, un complejo con lipoproteína . Los ejemplos no limitantes de lípidos de suero pueden incluir triglicéridos y colesterol tal como colesterol total (TG) , colesterol con lipoproteína de baja densidad (LDL-C) , colesterol con lipoproteína de alta densidad (HDL-C) , colesterol con lipoproteína de muy baja densidad (VLDL-C) y colesterol con lipoproteína de densidad intermedia (IDL-C) .

Como se utiliza en la presente, un "trastorno del metabolismo de lípidos" se refiere a cualquier trastorno asociado con o causado por una alteración en el metabolismo de lípidos. Por ejemplo, este término incluye cualquier trastorno, enfermedad o condición que puede llevar a hiperlipidemia, o condición caracterizada por elevación anormal de niveles de cualquiera o la totalidad de los lípidos y/o lipoproteínas en la sangre. Este término se refiere a un trastorno heredado tal como hipertrigliceridemia familiar o un trastorno adquirido tal como un trastorno adquirido como resultado de una dieta o ingestión de ciertos fármacos. Los trastornos ejemplares del metabolismo de lípidos incluyen pero no se limitan a aterosclerosis , dislipidemia, hipertrigliceridemia (que incluye hipertrigliceridemia inducida por fármacos, hipertrigliceridemia inducida por diuréticos, hipertrigliceridemia inducida por alcohol, hipertrigliceridemia inducida por agentes bloqueadores beta-adrenérgicos , hipertrigliceridemia inducida por estrógenos, hipertrigliceridemia inducida por glucocorticoides, hipertrigliceridemia inducida por retinoides, hipertrigliceridemia inducida por cimetidina e hipertrigliceridemia familiar) , pancreatitis aguda asociada con hipertrigliceridemia, síndrome de quilomicrón, quilomicronemia familiar, deficiencia por resistencia a Apolipoproteína-E, deficiencia o hipoactividad de LPL, hiperlipidemia que incluye hiperlipidemia combinada familiar) , hipercolesterolemia , gota asociada con hipercolesterolemia, xantomatosis (depósitos de colesterol subcutáneos) .

Las enfermedades cardiovasculares asociadas con trastornos del metabolismo de lípidos también se consideran "trastornos del metabolismo de lípidos" como se definen en la presente. Estas enfermedades pueden incluir enfermedad de arteria coronaria (también denominada enfermedad cardíaca isquémica) , inflamación asociada con enfermedad de arteria coronaria, restensosis, enfermedades vasculares periféricas y apoplejía.

Los trastornos relacionados con el peso corporal también se consideran "trastornos del metabolismo de lípidos" como se definen en la presente. Estos trastornos pueden incluir obesidad, síndrome metabólico que incluye componentes independientes de síndrome metabólico (por ejemplo, obesidad central, FBG/prediabetes/diabetes , hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hipertensión) , hipotiroidismo, uremia y otras condiciones asociadas con ganancia de peso (que incluye ganancia de peso rápida) , pérdida de peso, mantenimiento de pérdida de peso o riesgo de readquisición de peso posterior a pérdida de peso.

Los trastornos de azúcar en la sangre se consideran adicionalmente "trastornos en el metabolismo de lípidos", como se define en la presente. Estos trastornos pueden incluir diabetes, hipertensión y síndrome de ovarios poliquísticos relacionados con resistencia a insulina. Otros trastornos ejemplares en el metabolismo de lípidos también pueden incluir transplante renal, síndrome nefrótico, síndrome de Cushing, acromegalia, lupus eritematosos sistémico, disglobulinemia, lipodistrofia , glucoxenosis tipo I y enfermedad de Addison.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz", como se utiliza en la presente se pretende que incluya la cantidad de un agente de interferencia de ARN que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno en el metabolismo de lípidos, sea suficiente para producir el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, al disminuir, aminorar o mantener la enfermedad existente o uno o más síntomas de enfermedad) . La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar dependiendo del agente de interferencia de ARN, la manera en que se administra el agente, la enfermedad y su gravedad y los antecedentes, edad, peso antecedentes familiares, constitución genética, los tipos de tratamiento precedentes o concomitantes, si los hay, y cualquier otra característica individual del sujeto que va a ser tratado.

Una "cantidad profilácticamente eficaz", como se utiliza en la presente, se pretende que incluya la cantidad en un ARNi que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno en el metabolismo de lípidos sea suficiente para evitar o disminuir la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. La disminución de la enfermedad incluye frenado del curso de la enfermedad o reducción de la gravedad de la enfermedad de desarrollo posterior. La "cantidad profilácticamente eficaz" puede variar dependiendo del ARNi, la manera en que se administra el agente, el grado de riesgo de enfermedad y los antecedentes, edad, peso, antecedentes familiares, constitución genética y tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que va a ser tratado.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" también incluye una cantidad de un agente de interferencia de ARN que produce cierto efecto local o sistémico deseado en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. El ARNi utilizado en los métodos de la presente invención se puede administrar en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio/riesgo razonable aplicable al tratamiento .

La frase "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación las cuales, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de sujetos humanos y sujetos animales sin exceso en cuanto a toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, conmensurados con la relación beneficio/riesgo razonable.

La frase "portador farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, significa una forma farmacéuticamente aceptable de material, composición o vehículo tal como la forma líquida o sólida de un relleno, diluyente, excipiente, auxiliar de manufactura (por ejemplo, lubricante, magnesio y talco, calcio o estearato de zinc o ácido esteárico) o material encapsulante de solvente, involucrado en el acarreo o transporte del compuesto objeto desde un órgano o porción del cuerpo a otro órgano o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el objeto que es tratado. Algunos ejemplos de materiales los cuales pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares ' tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto pulverizado; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorio; (9) aceites como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de frijol de soya; (10) glicoles tales como propilenglicol ; (11) polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; (12) esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadas en pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos ; (22) agentes de volumen tales como polipéptidos y aminoácidos (23), componente de suero tal como albúmina sérica, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas.

El término "muestra", como se utiliza en la presente incluye una colección de fluidos similares, células o tejidos aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos cerosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, fluidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras de te ido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, se pueden derivar muestras de órganos particulares, partes de órganos o fluidos o células dentro de estos órganos. En algunas modalidades las muestras se pueden derivar del hígado (por ejemplo el hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado tales como, por ejemplo, hepatocitos) . En algunas modalidades, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto.

II. ARNi de la invención En la presente se describen los ARNi los cuales inhiben la expresión de un gen para A GPTL3. En una modalidad el agente de ARNi incluye moléculas de ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 en una célula tal como una célula dentro de un sujeto, por ejemplo un mamífero tal como un humano que tiene un trastorno del metabolismo de lípidos, por ejemplo hiperlipidemia familiar. El ARNds incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad la cual es complementaria por lo menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen para ANGPTL3. La región de complementariedad es de una longitud de aproximadamente 30 nucleótidos o menos (por ejemplo, de aproximadamente una longitud de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 ó 18 nucleótidos o menos) . Al contacto con una célula que expresa el gen para ANGPTL3 , el ARNi inhibe la expresión del gen para ANGPTL3 (por ejemplo, un gen para ANGPTL3 de humano, de primate, de un animal no primate o de un ave) en por lo menos aproximadamente 10% analizado, por ejemplo, por un método basado en PCR o en ADN ramificado (ADNb) o por un método basado en proteína, tal como análisis de inmunofluorescencia utilizando, por ejemplo Western blot o técnicas de citometría de flujo.

Un AR ds incluye dos hebras de ARN que son complementarias y que hibridizan para formar una estructura dúplex bajo condiciones en las cuales se utilizará el ARNds. Una hebra de un ARNds (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria y generalmente de modo completamente complementaria a una secuencia objetivo. La secuencia objetivo se puede derivar de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen para ANGPTL3. La otra hebra (la hebra directa) incluye una región que es complementaria a la hebra antisentido de manera que las dos hebras hibridizan y forman una estructura dúplex cuando se combinan bajo condiciones adecuadas. Como se describe en otra parte en la presente y como se conoce en el ámbito, las secuencias complementarias de un ARNds también pueden estar contenidas como regiones autocomplementarias de una molécula única de ácido nucleico, en oposición a estar en oligonucleótidos separados .

Generalmente, la estructura dúplex tiene una longitud de entre 15 y 30 pares de bases, por ejemplo, entre 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25 , 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22 pares de bases de longitud. Los intervalos y las longitudes intermedias a los intervalos y longitudes mencionados en lo anterior también se contemplan como parte de la invención.

Similarmente , la región de complementariedad con la secuencia objetivo tiene una longitud de entre 15 y 30 nucleótidos, por ejemplo, entre 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25 , 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22 nucleótidos de longitud. Los intervalos y longitudes intermedios a los intervalos mencionados y longitudes anteriores también se contempla como parte de la invención.

En algunas modalidades, el AR ds tiene una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 nucleótidos o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En general, el ARNds es suficientemente largo para servir como un sustrato para una enzima Dicer. Por ejemplo, es bien conocido en el ámbito que los ARNds más largos de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos pueden servir como sustratos para Dicer. Como lo reconocerá también una persona habitualmente experta en el ámbito, la región de un ARN que es el objetivo para la separación con mucha frecuencia será parte de una molécula de ARN más grande, con frecuencia de una molécula de ARNm, en donde sea relevante, una "parte" de un objetivo ARNm es una secuencia contigua de un ARNm objetivo de longitud suficiente para permitir que sea un sustrato para la separación dirigida por interferencia de AR i (es decir, separación a través de la vía RISC) .

Una persona experta en el ámbito también reconocerá que la región dúplex es una porción funcional primaria de un ARNds, por ejemplo una región dúplex de aproximadamente 9 a 36 pares de bases, por ejemplo, aproximadamente 10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 9 a 35, 10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 9 a 34, 10 a 34, 11 a 34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 9 a 33, 10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 9 a 32, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 9 a 32, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 9 a 31, 10 a 31, 11 a 31, 12 a 31, 13 a 32, 14 a 31, 15 a 31, 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23,19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24, 20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ó 21 a 22 pares de bases. Así, en una modalidad, en la medida en que se vuelve procesado a un dúplex funcional de, por ejemplo, 15 a 30 pares de bases, los objetivos de un ARN deseado para separación, una molécula de ARN o complejos de moléculas de ARN que tienen una región dúplex mayor de 30 pares de bases es un ARNds. De esta manera, una persona habitulmente experta en el ámbito reconocerá que en una modalidad un ARNmi es un ARNds. En otra modalidad, un ARNds no es un ARNmi que se encuentra de modo natural. En otra modalidad, un agente ARNi útil para la expresión de ANGPTL3 objetivo no se genera en la célula objetivo por separación de un ARNds más grande.

Un ARNds como se describe en la presente puede incluir adicionalmente uno o más partes sobresalientes de nucleótidos de hebra sencilla, por ejemplo, 1, 2, 3, ó 4 nucléotidos. Los ARNds que tienen por lo menos una parte sobresaliente nucleotídica pueden presentar propiedades inhibidoras inesperadamente superiores en relación a sus contrapartes de extremo romo. Una parte sobresaliente de nucleótido puede comprender o consistir de un análogo de nucléotido/nucleósido, que incluye un desoxinucleótido/nucleósido. Una o varias de las partes sobresalientes pueden estar sobre la hebra directa, la hebra antisentido o cualquier combinación de las mismas. Además, uno o varios de los nucleótidos de una parte sobresaliente pueden estar presentes en el extremo 5 ' , el extremo 3 ' o ambos extremos de ya sea la hebra antisentido o directa de un AR ds .

Un ARNds se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en el ámbito como se discuten adicionalmente en lo siguiente, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador automatizado de ADN, tal como los que se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, de Biosearch, Applied Biosystems, Inc.

Los compuestos de ARNi de la invención se pueden preparar utilizando un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, las hebras individuales de una molécula de ARN de doble hebra se preparan por separado. Después se reasocian las hebras constitutivas. Las hebras individuales del compuesto ARNsi se pueden preparar utilizando síntesis orgánica en solución fase o en sólido-fase o ambos. La síntesis orgánica proporciona la ventaja de que las hebras de oligonucleót idos que comprenden nucleótidos no naturales o modificados se pueden preparar fácilmente. Los oligonucleót idos de hebra sencilla de la invención se pueden preparar utilizando síntesis orgánica en solución- fase o sólido- fase, o ambos.

En un aspecto, un ARNds de la invención incluye por lo menos dos secuencias nucleotídicas , una secuencia directa y una secuencia antisentido. La hebra directa se selecciona del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 y la hebra antisentido correspondiente de la hebra directa se selecciona del grupo de secuencias de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10. En aspecto, una de las dos secuencias es complementaria a la otra de las dos secuencias en donde una de las secuencias es sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión de un gen para ANGPTL3. De esta manera, en este aspecto un ARNds incluirá dos oligonucleótidos en donde un oligonucleótido se describe como la hebra directa en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 y el segundo oligonucleótido se describe como la hebra antisentido correspondiente de la hebra directa en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10. En una modalidad, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNds están contenidas en oligonucleótidos separados. En otra modalidad, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNds están contenidas en un oligonucléotido único.

Una persona experta en el ámbito tendrá buen conocimiento de que los ARNds que tienen una estructura dúplex de entre aproximadamente 20 y 23 pares de bases, por ejemplo 21 pares de bases se han resaltado como particularmente eficaces para inducir interferencia de ARN (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). No obstante, otros han encontrado que estructuras dúplex de ARN más cortas o más largas también pueden ser eficaces (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). En las modalidades descritas en lo anterior, en virtud de la naturaleza de las secuencias oligonucleotídicas proporcionadas en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, los ARNds descritos en la presente pueden incluir por lo menos una hebra de una longitud mínima de 21 nucleótidos. Se pueden esperar razonablemente que dúplex más cortos que tengan una de las secuencias de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, menos solo algunos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser similarmente efectivos en comparación con los ARNds descritos en lo anterior. Por lo tanto, los ARNds que tienen una secuencia de por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó más nucleótidos contiguos derivados de una de las secuencias de las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 en no más de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25 ó 30% de inhibición a partir de un ARNds que comprende la secuencia completa, se contempla para que se encuentren dentro del ámbito de la presente invención.

Además, los ARN proporcionados en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, identifican uno o varios sitios en un transcrito de ANGPTL3 que es susceptible a la separación mediada por RISC. De esta manera, la presente invención describe adicionalmente ARNi que tienen como objetivo dentro de uno de estos sitios. Como se utiliza en la presente, un ARNi se dice que está dirigido al interior de un sitio particular de un transcrito de ARN si el ARNi promueve la separación del transcrito en cualquier parte dentro de ese sitio particular. Tal ARNi generalmente incluirá por lo menos 15 nucleótidos contiguos desde una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, acopladas a secuencias nucleotídicas adicionales tomadas desde la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen para ANGPTL3.

Aunque una secuencia objetivo generalmente tiene una longitud de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, existe una amplia variación en lo adecuado de secuencias particulares en este intervalo para dirigir la separación de cualquier ARN objetivo dado. Diversos paquetes de programa y las líneas de guía que se establecenen la presente proporcionan una guía para la identificación de secuencias objetivo óptimas para cualquier objetivo de gen dado, pero un enfoque empírico también puede tomarse en el cual una "ventana" o "máscara" de un tamaño dado (como un ejemplo no limitante, 21 nucleótidos) se coloca de manera literal o figurativa (incluyendo, por ejemplo in silico) sobre la secuencia de ARN objetivo para identificar secuencias en el intervalo de tamaño que pueden servir como secuencias objetivo. Al mover la "ventana" de secuencia progresivamente una corriente arriba o corriente abajo del nucleótido de una ubicación de secuencia objetivo inicial, la siguiente secuencia objetivo potencial se puede identificar, hasta que el conjunto completo de posibles secuencias se identifica para cualquier tamaño de objetivo dado seleccionado. Este proceso, acoplado con la síntesis sistemática y prueba de las secuencias identificadas (utilizando análisis como se describen en la presente o como se conocen en el ámbito) para identificar aquellas secuencias que funcionan de manera óptima puede identificar a aquellas secuencias de ARN que, cuando están dirigidas con un agente de un ARNi, median la mejor inhibición de la expresión de un gen objetivo. Así, aunque las secuencias identificadas, por ejemplo, en las Tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, representan secuencias objetivo efectivas, se contempla que la optimización adicional de la eficiencia de inhibición se pueda obtener al "pasear la ventana" progresivamente un nucleótido corriente arriba o corriente abajo de las secuencias dadas para identificar secuencias con características de inhibición iguales o mej ores .

Además, se contempla que para cualquier secuencia identificada, por ejemplo, en las Tablas, 2, 3, 7, 8, 9 y 10, se puede obtener optimización adicional al realizar sistemáticamente y hacia adición o remoción de nucleótidos para generar secuencias más grandes o más cortas y al probar estas secuencias generadas por desplazamiento de una ventana del tamaño más grande o más corto hacia arriba o hacia abajo del ARN objetivo desde ése punto. Nuevamente, el acoplamiento de este enfoque para generar objetivos candidatos nuevos con prueba para eficacia de sus AR i se basa en aquellas secuencias objetivo en un análisis de inhibición como se conocen en el ámbito y/o como se describen en la presente que pueden llevar a mejoras adicionales en la eficiencia de inhibición. Adicionalmente , las secuencias optimizadas se pueden ajustar, por ejemplo, por la introducción de nucleótidos modificados como se describe en la presente o como se conoce en el ámbito, la adición o cambios en la parte sobresaliente u otras modificaciones como se conocen en el ámbito y/o como se describen en la presente para optimizar adicionalmente la molécula (por ejemplo, incrementar la estabilidad de suero o la vida media circulante, incrementar Ia estabilidad térmica, mejorar el suministro transmembranal, dirigirse a una ubicación o tipo de célula particular, incrementar la interacción con las enzimas de la vía de bloqueo de expresión, incrementar la liberación desde endosomas) como inhibidor de expresión.

Un ARNi como se describe en la presente puede contener uno o más pareamientos incompletos con la secuencia objetivo. En una modalidad, un ARNi como se describe en la presente contiene un máximo de 3 pareamientos incompletos. Si la hebra antisentido del ARNi contiene pareamientos incompletos con una secuencia objetivo, es preferible que el área de pareamiento incompleto no se localice en el centro de la región de complementariedad . Si la hebra antisentido del ARNi contiene pareamientos incompletos con la secuencia objetivo, es preferible que los pareamientos incompletos se limitan a estar dentro de por lo menos 5 nucleótidos para ya sea el extremo 5' ó 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para un agente de ARNi de 23 nucleótidos, la hebra la cual es complementaria a una región de un gen ANGPTL3 no contiene pareamiento incompleto alguno dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos que aquí se describen o los métodos conocidos en el ámbito se pueden utilizar para determinar si un ARNi que contiene un pareamiento incompleto hacia una secuencia objetivo es eficaz para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3. La consideración de la eficacia de los ARNi con pareamientos incompletos para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 es importante, especialmente si la región particular de complementariedad en un para ANGPTL3 se sabe que tiene variación de secuencia polimórfica dentro de la población .

III. ARNi modificado de la invención En una modalidad, el ARN de un ARNi de la invención, por ejemplo un ARNds es modificado químicamente para mejorar la estabilidad u otras características benéficas. Los ácidos nucleicos objetivo de la invención se pueden sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en el ámbito tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry" , Beaucage, S.L. et al. (Edrs) , John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, Estados Unidos, la cual se incorpora en la presente como referencia. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de extremo, por ejemplo modificaciones en el extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos) o modificaciones en el extremo 3 ' (con ugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de base, por ejemplo sustitución con bases estabilizantes, bases desestabilizantes o bases con pares de bases con un repertorio expandido de asociados, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones de azúcar (por ejemplo, en la posición 2' o la posición 4') o sustitución del azúcar y/o modificaciones de estructura principal que incluyen modificación o sustitución de los enlaces fosfodiéster . Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en las modalidades que aquí se describen incluyen, pero no se limitan a los ARN que contienen estructuras principales modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales. Los ARN que tienen estructuras principales modificadas incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo fósforo en la estructura principal. Para los propósitos de esta especificación y con referencia algunas veces a la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica también se pueden considerar como oligonucleósidos . En algunas modalidades, un ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica .

Las estructuras principales de ARN modificado incluyen, por ejemplo, fosforot ioatos , fosforioatos quirales, fosforoditioatos , fosfotriésteres , aminoalquilfosfo-triésteres, fosfonatos de metilo u otro alquilo que incluyen fosfonatos de 3-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforoamidatos que incluyen 3 ' -aminofosforoamidato y fosforoamidatos de aminoalquilo, tionofosforoamidatos, tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres y borano fosfatos que tienen enlaces normales 3 ' a 5 ' , análogos unidos 2' a 5' de estos o aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos se unen 3 '-5' a 5 '-3' o 21 -51 a 5 '-2' . También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. Nos 3,687,808; 4,469,863; 4, 476, 301; 5, 023, 243; 5, 177, 195; 5, 188, 897; 5,264,423; 5, 276, 019; 5, 278, 02; 5, 286, 717; 5, 321, 131; 5,399,676; 5,405, 939; 5,453,496; 5, 455, 233 ; 5,466,677; 5,476, 925; 5,519, 126; 5, 536, 821; 5, 541, 316; 5, 550, 111; 5,563,253; 5, 571, 799; 5, 587, 361; 5, 625, 050; 6, 028, 188; 6,124,445; 6, 160, 109; 6, 169, 170; 6, 172, 209; 6,239,265; 6, 277, 603 ; 6,326, 199; 6, 346, 614; 6, 444, 423 ; 6, 531, 590; 6,534,639; 6,608, 035; 6, 683, 167; 6, 858, 715; 6, 867, 294 ; 6,878,805; 7, 015, 315; 7, 041, 816; 7, 273, 933 ; 7,321,029; y la patente de E.U.A. RE39464, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

Las estructuras principales de ARN modificado que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras principales que se conforman por enlaces internucleosídicos alquilo o cicloalquilo de hebra corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleósidos alquilo o cicloalquilo, uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de hebra corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados, en parte, de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras principales siloxano; sulfuro, sulfóxido y estructuras principales sulfona; estructuras principales formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales sulfamato; estructuras principales metilenimino y metilenhidrazino ; estructuras principales sulfonato y sulfonamida; estructuras principales amida y otras que tienen partes constitutivas mixtas N, 0, S y CH2.

Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562, 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,63,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

En otras modalidades, los miméticos de ARN adecuados se contemplan para uso en los AR i en los cuales tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, la estructura principal de las unidades nucleo ídicas se sustituyen con grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Uno de estos compuestos oligoméricos , un mimético de ARN que se ha demostrado tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina como un ácido péptido nucleico (APN) . En compuestos APN, la estructura principal azúcar de un ARN ha sido sustituido con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal aminoetilglicina . Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirecta a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal. Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de compuestos PAN incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. Nos. 5,539,082; 5,714,331 y 5,719,262, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente en este documento como referencia. Los compuestos APN adicionales adecuados para uso en los ARNi de la invención se describen en, por ejemplo, Nielsen et al., Science, 1991, 254,1497-1500.

Algunas modalidades descritas en la invención incluyen los ARN con estructuras principales fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos y en particular -CH2-NH-CH2- ; -CH2-N (CH3) -0-CH2- [conocidos como estructura principal metileno (metilimino) o M I] , -CH2-0-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3) -N(CH3) -CH2- y -N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura principal fosfodiéster nativa está representada como -0-P-0-CH2-] de las patentes de E.U.A. a las que se hace referencia en lo anterior No. 5,489,677 y las estructuras principales amida de la patente de E.U.A. No. 5,602,240 a la que se hizo referencia antes. En algunas modalidades, los ARN objeto de la presente invención tienen estructuras principales morfolino de la patente de E.U.A. No. 5,034,506 mencionada antes.

Los ARN modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar sustituidas. Los AR i, por ejemplo, los ARNds objeto de la presente pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F, O-, S- o N-alquilo; 0-, S- o N-alquenilo ; 0-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-0-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser formas sustituidas o no sustituidas de alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 10 y alquinilo. Las modificaciones adecuadas ejemplares incluyen 0 [ (CH2) n0] mCH3 , 0 (CH2) .n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)„ONH2 y 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2 , en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otras modalidades, los ARNds incluyen uno de los siguientes en la posición 21 : alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl , Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo que separa ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un AR i y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas modalidades, la modificación incluyen un 21 -metoxietoxi (21-0-CH2CH2OCH3 , también conocido como 2 ' -O- (2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) , es decir, un grupo alcoxi-alcoxi . Otra modificación ejemplar es 21 -dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo O (CH2) 2O (CH3) 2 , también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos en lo siguiente y 21 -dimetilaminooetoxietoxi (también conocido en el ámbito como 21 -O-dimetilaminoetoxietilo o 21 -DMAEOE) , es decir, 2 ' -0-CH2-0-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones incluyen 2 ' -metoxi (2'-OCH3), 2 ' -aminopropoxi (21 -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F) . También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en el ARN o un ARNi, particularmente la posición 31 del azúcar sobre el nucleótido 31 terminal o en los ARNds unidos 21 -51 y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcar tales como porciones ciclobutilo en lugar de un azúcar pentofuranosilo . Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de estas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920, algunas de las cuales son propiedad común con la presente solicitud. El contenido completo de cada una de las anteriores se incorpora en la presente como referencia.

Un ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones en la nucleobase (con frecuencia denominada en el ámbito como "base") . Como se utiliza en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidínicas timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2 -aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2 -tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5 -halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8 - sustituidas , 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5 -sustituidas , 7 -metilguanina y 7 -metiladenina , 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7 -desazaguanina y 7 -daazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina . Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente de E.U.A. No. 3,687,808, las descritas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. , Wiley-VCH, 2008; las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, es las descritas en Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613, y las descritas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos objeto de la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas , 6-azapirimidinas y purinas sustituidas N-2, N-6 y 0-6, que incluyen 2 -aminopropiladenina , 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina incrementan la estabilidad dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, p . 276-278) y son sustituciones de bases ejemplares, incluso de manera más particular cuando se combinan con modificaciones de azúcar 21 -O-metoxietilo .

Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas en lo anterior así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. indicadas en lo anterior Nos. 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; y 7,495,088, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en a presente como referencia.

El ARN o un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más ácidos nucleicos inmovilizados (LNA) . Un ácido nucleico inmovilizado es un nucleótido que tiene una porción ribosa modificada en la cual la porción ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 21 y 4'. Esta estructura "inmoviliza" efectivamente la ribosa en la conformación estructural 31 -endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos inmovilizados a los ARNsi incrementa la estabilidad de los ARNsi en suero y reduce los efectos fuera del objetivo (Elraen, J. et al., (2005) Nuclelc Acids Research 33 (1) : 439-447 ; Mook OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3 ): 833-843 ; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12) :3185-3193) .

Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de nucleótidos de ácido nucleico inmovilizados incluyen, pero no se limitan a las siguientes: patentes de E.U.A. No.s 6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; y 7,399,845, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

Las modificaciones potencialmente estabilizantes a los extremos de moléculas de ARN pueden incluir N- (acetilaminocaproil) -4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc) , N- (caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6) , N- (acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc) , timidina-2 ' - 0 -desoxitimidina (éter), N- (aminocaproil ) -4 -hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino) , 2-docosanoil-uridina-3 " -fosfato, bases invertidas dT(idT) y otros. La descripción de esta modificación se puede encontrar en la publicación PCT No. WO 2011/005861.

IV. ARNi conjugados a ligandos Otra modificación del ARN de un ARNi de la invención involucra enlazar químicamente al ARN uno o más ligandos, " porciones o conjugados que incrementen la actividad, la distribución celular y la captación celular del ARNi. Estas porciones incluyen pero no se limitan a porciones lipídicas tales como la porción colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let . , 4:1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril -S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let . , 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al . , (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538) una hebra alifática, por ejemplo dodecandiol o residuos undecilo (Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietil -amonio (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl . Acids Res., 18:3777-3783), una poliamina o una hebra polietilenglicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654), una porción palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237) o una porción octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol . Exp. Ther., 277:923-937).

En una modalidad, un ligando altera la distribución, direccionamiento o tiempo de vida de un agente AR i en el cual se incorpora. En modalidades preferidas, un ligando proporciona afinidad mejorada por un objetivo seleccionado, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimiento, por ejemplo, un compartimiento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, por ejemplo, en comparación con una especie ausente del ligando. Los ligandos preferidos no tomarán parte en el pareamiento dúplex en un ácido nucleico dúplex.

Los ligandos pueden incluir una sustancia como se encuentra de manera natural tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) , lipoproteína de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) o globulina); carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina , N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina o ácido hialurónico) ; o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética tal como un polímero sintético, por ejemplo un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido en que es una polilisina (PLL) , ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli (L- lactida-co-glicolida) , copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA) , polietilenglicol (PEG) , alcohol polivinílico (PVA) , poliuretano, poli (ácido 2-etilacrílico) , polímeros de N- isopropilacrilamida o polifosfazina . El ejemplo de poliaminas incluye: polietilenimina, polilisina (PLL) , espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, péptido mimético poliamina, dendrímero poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de poliamina o un péptido alfa helicoidal.

Los ligandos también pueden incluir grupos dirigidos, por ejemplo a un agente dirigido a una célula o tejido, por ejemplo una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo un anticuerpo que se une a un tipo de célula especificado tal como una célula de riñon. Un grupo objetivo puede ser una tirotropina, melanotropina , lectina, glucoproteína, tensioactivo de proteína A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente , N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina mañosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados , galactosa multivalente, transíerrina, bis-fosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un colesterol lipídico, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido RGD o un péptido mimético de RGD.

Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes de intercalado (por ejemplo acridinas) , reticulantes (por ejemplo psoraleno, mitomicina C) , porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina) , hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo fenazina, dihidrofenazina) , endonucleasas artificiales (por ejemplo EDTA) , moléculas lipofílicas, por ejemplo colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona , 1,3-bis- O (hexadecil) glicerol, un grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol , borneol, mentol, 1 , 3 -propanodiol , un grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil) litocólico, ácido 03- (oleoil) colénico, dimetoxitritilo o fenoxiazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antenapedia, péptido Tat) , agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo PEG-40K) , MPEG [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados , enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina) , facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico) , ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, conjuntos imidazol, conjugados de acridina-imidazol , complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos) , dinitrofenilo, HRP o AP.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glucoproteínas o péptidos, por ejemplo moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se une a un tipo de célula especificado tal como una célula hepática. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente , galactosa multivalente , N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, mañosa multivalente o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activadores de p38 MAP cinasa o un activador de NF-KB.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco el cual puede incrementar la captación del agente ARNi en la célula, por ejemplo al romper el citoesqueleto de la célula, por ejemplo al romper los microtúbulos de la célula, microfilamentos y/o filamentos intermedios. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalacina, nocodazol, j aplakinolida , latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina .

En algunas modalidades un ligando unido a un ARNi como se describe en la presente actúa como un modulador farmacocinético (modulador PK) . Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos fosfolipídicos , péptidos, agentes que unen proteína, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK ejemplares incluyen pero no se limitan a colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos , diacilglicérido, fosfolípidos , esfingolípidos , naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc., Los oligonucleótidos que incluyen un número de enlaces fosforotioato también se conoce que se unen a proteínas séricas, y por lo tanto a oligonucleótidos cortos, por ejemplo oligonucleótido de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases que comprenden múltiplos de enlaces fosforotioato en la estructura principal que también son susceptibles a la presente invención como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores PK) . Además, los aptámeros que unen componentes de suero (por ejemplo, proteínas de suero) también son adecuados para uso como ligandos moduladores de PK en las modalidades que aquí se describen. Los oligonucleótidos conjugados a ligando de la invención se pueden sintetizar mediante el uso de un oligonucleótido que presente una funcionalidad reactiva pendiente tal como la derivada de la unión de una molécula enlazante sobre el oligonucleótido (descrito más adelante) . Este oligonucleótido reactivo se puede hacer reaccionar directamente con ligandos disponibles comercialmente, ligandos que son sintetizados que presentan cualquiera de una diversidad de grupos protectores o ligandos que tienen una porción enlazante unida al mismo.

Los oligonucleótidos utilizados en los conjugados de la presente invención se pueden elaborar de modo conveniente y habitual mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para esta síntesis se vende por varios proveedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif .) . Cualquier otro medio para la síntesis conocido en el ámbito se puede utilizar de manera adicional o alternativa. También se conoce el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados .

En los oligonucleótidos conjugados a ligando y los nucleósidos unidos a específicos a secuencia que presentan molécula de ligando de la presente invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos se pueden ensamblar en un sintetizador de ADN adecuado utilizando precursores convencionales de nucleótidos o nucleósidos o precursores de conjugado de nucleótido o nucleósido que ya presentan de antemano la porción enlazante, precursores de ligándonucleótido o nucleósido-conjugado que de antemano presentan la molécula ligando o bloques de construcción que presentan ligando no nucleosídico .

Cuando se utilizan precursores nucleótido-conjugado que ya presentan una porción enlazante, la síntesis de los nucleósidos unidos específica a secuencia típicamente se completa y la molécula de ligando después se hace reaccionar con la porción enlazante para formar el oligonucleótido conjugado ligando. En algunas modalidades, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la presente invención se sintetizan por un sintetizador automatizado utilizando fosforoamiditas derivadas de conjugados ligando-nucleósido además de las fosforoamiditas convencionales y fosforoamiditas no convencionales que están disponibles comercialmente y que se utilizan habitualmente en la síntesis de oligonucleótidos.

A. Conjugados lipidíeos En una modalidad, el ligando o conjugado es un lípido o molécula basada en lípido. El lípido o la molécula basada en lípido preferiblemente se une a una proteína sérica, por ejemplo albúmina sérica humana (HSA) . Un ligando que se une a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ejemplo tejido objetivo que no es riñon en el cuerpo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser el hígado, que incluye células de parénquima del hígado. Otras moléculas que unen HSA también se pueden utilizar como ligandos. Por ejemplo se puede utilizar neproxina o aspirina. Un ligando lipídico o basado en lípido puede (a) incrementar la resistencia a degradación del conjugado, (b) incrementar el direccionamiento o transporte a una célula objetivo o membrana celular y/o (c) se puede utilizar para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.

Se puede utilizar un ligando de base lipídica para inhibir, por ejemplo, el control de la unión del conjugado a un tejido objetivo. Por ejemplo, un ligando lipídico o basado en lípido que se une a HSA más fuertemente con menos probabilidad que se dirija al riñon y por lo tanto es menos probable que sea depurado del cuerpo. Un ligando lipídico o basado en lípido que se une a HSA con menos fuerza se puede utilizar para dirigir el conjugado al riñon.

En una modalidad preferida, los ligandos basados en lípidos unen HSA. Preferiblemente, unen HSA con una afinidad suficiente de manera que el conjugado preferiblemente se distribuirá a un tejido diferente del renal. No obstante, se prefiere que la afinidad no sea demasiado fuerte de modo que no se pueda revertir la unión HSA- ligando.

En otra modalidad preferida, el ligando basado en lípido une HSA débilmente o no lo une de modo alguno, de manera que el conjugado preferiblemente se distribuirá al riñon. Otras porciones que tienen como objetivo células del riñon también se pueden utilizar en lugar de o además del ligando basado en lípido.

En otro aspecto, el ligando es una porción, por ejemplo, una vitamina la cual es captada por una célula objetivo, por ejemplo una célula proliferante. Estas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por proliferación celular no deseada, por ejemplo del tipo maligno o no maligno, por ejemplo células cancerosas. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen vitamina B, por ejemplo ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal y otras vitaminas o nutrientes captados por las células objetivo tales como células hepáticas. También se incluyen HSA y lipoproteína de baja densidad (LDL) .

B. Agentes de permeación de células En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación de células, preferiblemente un agente de permeación de células helicoidal. Preferiblemente, el agente es antipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antenopedia. Si el agente es un péptido, se puede modificar, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros , enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal preferiblemente es un agente a-helicoidal el cual preferiblemente tiene una fase lipofílica y una lipofóbica.

El ligando puede ser un péptido o péptido mimético.

Un péptido mimético (también denominado en la presente como un oligopéptido mimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural . La unión de péptido y péptidos miméticos a agentes AR i puede afectar la distribución farmacocinética del ARNi, por ejemplo al incrementar el reconocimiento y absorción celulares. El péptido o la porción peptidomimético pueden tener una longitud de aproximadamente 5 a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos Un péptido o péptido mimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, un péptido catiónico, un péptido anfipático o un péptido hidrofóbico (por ejemplo, que consiste principalmente de Tyr, Trp o Phe) . La porción peptídica puede ser un péptido dendrímero, un péptido limitado o un péptido reticulado. En otra alternativa, la porción peptídica puede incluir una secuencia de translocación de membrana (MTS) hidro óbica . Un péptido ejemplar que contiene MTS hidrofóbica es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEC ID NO: 9) . Un análogo de RFGF (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEC ID NO: 10) que contiene una MTS hidrofóbica también puede ser una porción objetivo. La porción peptídica puede ser un péptido "de suministro" el cual puede presentar moléculas polares grandes que incluyen péptido, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, las secuencias para la proteína tat de VIH (GRKKRRQRRRPPQ (SEC ID NO: 11) y la proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKI FQNRRMK KK (SEC ID NO : 12) se ha encontrado que son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o péptido mimético puede ser codificado por una secuencia aleatoria de ADN tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación de fago, o una biblioteca combinatoria de una esfera un compuesto (OBOC, por sus siglas en inglés) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Los ejemplos de un péptido o un péptido mimético dirigido a un agente ARNds por medio de una unidad monomérica incorporada para propósitos de direccionamiento de célula es un péptido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD, por sus siglas en inglés) , un imitador de RGD. Una porción peptídica puede variar en longitud desde aproximadamente 5 aminoácidos hasta aproximadamente 40 aminoácidos. Las porciones peptídicas pueden tener una modificación estructural, de manera que se incremente la estabilidad o las propiedades conformacionales directas. Cualquiera de las modificaciones estructurales descritas en lo siguiente se pueden utilizar.

Un péptido RGD para uso en las composiciones y métodos de la invención puede ser lineal o cíclico, y puede estar modificado, por ejemplo glucosilado o metilado para facilitar el direccionamiento a uno o varios tejidos específicos. Los péptidos y peptidiomiméticos que contienen RGD puede incluir D-aminoácidos así como imitadores de RGD sintéticos. Además de RGD, uno puede utilizar otras porciones que tienen como objetivo el ligando de integrina. Los conjugados preferidos de este ligando tienen como objetivo PECAM-1 o VEGF .

Un "péptido de permeación celular" es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana tal como una célula bacteriana o micótica o una célula de mamífero tal como una célula humana. Un péptido permeador de célula microbiana puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropina Pl) , un péptido que contiene un enlace disulfuro (por ejemplo, a-defensina, ß-defensina o bactenecina) , o un péptido que contiene únicamente uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo PR-39 o indolicidina) . Un péptido de permeación de célula también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS) . Por ejemplo, un péptido de permeación de célula puede ser un péptido antipático bipartida, tal como MPG, el cual se deriva del dominio del péptido de fusión de gp41 de VIH-1 y el antxgeno T grande NLS de SV40 (Simeoni et al., Nucí. Acids Res. 31:2717-2724, 2003) .

C. Conjugados de carbohidratos En algunas modalidades de las composiciones y métodos de la invención un oligonucleótido ARNi comprende además un carbohidrato. El ARNi conjugado a carbohidrato es ventajoso para el suministro in vivo de ácidos nucleicos así como composiciones adecuadas para uso terapéutico in vivo, como se describe en la presente. De la manera en que se utiliza en la presente, "carbohidrato" se refiere a un compuesto el cual es ya sea un carbohidrato por sí mismo constituido de una o más unidades monosacáridas que tiene por lo menos 6 átomos de carbono (el cual puede ser lineal, ramificado o cíclico) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como una parte del mismo una porción carbohidrato constituida de una o más unidades monosacáridas cada una con por lo menos seis átomos de carbono (la cual puede ser lineal, ramificada o cíclica), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los carbohidratos representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen desde aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 unidades monosacáridas) , y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas de polisacárido . Los monosacáridos específicos incluyen azúcares de 5 átomos de carbono y superiores (por ejemplo, de 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono) ; di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades monosacáridas (por ejemplo, de 5, 6, 7 u 8 carbonos) .

En una modalidad, un conjugado de carbohidrato para uso en las composiciones y métodos de la invención es un monosacárido . En una modalidad, el monosacárido es una N-ace ilgalactosamina tal como Fórmula II.

En otra modalidad, un conjugado de carbohidrato para uso en las composiciones y métodos de la invención se selecciona del grupo que consiste de: Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV, 25 Fórmula V, Fórmula VI, Fórmula VII, Fórmula VIII, ?? 25 Otro conjugado de carbohidrato representativo para uso en las modalidades que se describen en la presente incluye, pero no se limita a, (Fórmula XXIII) , cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es un hidrógeno.

En algunas modalidades, el conjugado de carbohidrato comprende además uno o más ligandos adicionales como se describen en lo anterior, tal como, pero sin limitarse a un modulador PK y/o un péptido de permeación de células.

D. Enlazantes En algunas modalidades, el conjugado o ligando que se describe en la presente se puede unir a un oligonucleót ido de AR i con varios enlazantes que pueden ser separables o no separables .

El término "enlazante" o "grupo enlazante" significa una porción orgánica que conecta dos partes de un compuesto, por ejemplo, que une covalentemente dos partes de un compuesto. Los enlazantes típicamente comprenden un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR3, C(0) , C(0)NH, SO, S02, S02NH o una hebra de átomos tal como, pero sin limitarse a alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclil-alquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenil-arilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilheterociclilalquinilo, alquenilheterociclilalquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilheteroarilo, el cual uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por 0, S, S (0) , S02, N(R8), C(0), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocíclico sustituido o no sustituido; en donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En una modalidad, el enlazante tiene entre aproximadamente 1 a 24 átomos, 2 a 24, 3 a 24, 4 a 24, 5 a 24, 6 a 24, 6 a 18, 7 a 18, 8 a 18 átomos, 7 a 17, 8 a 17, 6 a 16 , 7 a 17 u 8 a 16 átomos.

Un grupo enlazante separable es aquel el cual es suficientemente estable fuera de la célula pero que al entrar en una célula objetivo se separa para liberar las dos partes del enlazante que se mantienen juntas. En una modalidad preferida, el grupo enlazante separable se separa por lo menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o más o por lo menos aproximadamente 100 veces más rápido en una célula objetivo o bajo una primera condición de referencia (la cual se puede seleccionar, por ejemplo, para que imite o represente condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o bajo una segunda condición de referencia (la cual se puede seleccionar, por ejemplo, para que imite o represente condiciones encontradas en la sangre o suero) .

Los grupos enlazantes separables son susceptibles para agentes separables, por ejemplo, pH, potencial redox o la presencia de moléculas degradantes. Generalmente, los agentes de separación son más prevalentes o se encuentran en concentraciones o actividades más altas dentro de las células que en suero o sangre. Los ejemplos de los agentes degradantes incluyen: agentes redox los cuales se seleccionan para sustratos particulares o los cuales no tienen especificidad de sustrato que incluye, por ejemplo, enzimas oxidativas o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo enlazante separable redox por reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente ácido, por ejemplo aquellos que resultan en un pH de 5 o menor; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo enlazante separable por ácido al actuar como un ácido general, peptidasas (las cuales pueden ser específicas de sustrato) y fosfatasas.

Un grupo de enlace separable, tal como un enlace disulfuro puede ser susceptible a pH. El pH del suero humano es 7.4, mientras que el pH intracelular promedio es ligeramente más bajo, que varía entre aproximadamente 7.1-7.3. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5.5-6.0 y los lisosomas tienen incluso un pH más ácido de aproximadamente 5.0. Algunos enlazantes tendrán un grupo enlazante separable que se separa a un pH preferido, por lo que se libera un lípido catiónico del ligando dentro de la célula o dentro del compartimiento deseado de la célula.

Un enlazante que incluye un grupo enlazante separable que es separable por una enzima particular. El tipo de grupo enlazante separable incorporado en un enlazante puede depender de la célula que se tenga como objetivo. Por ejemplo, un ligando dirigido al hígado unirse a un lípido catiónico a través de un enlazante que incluye un grupo áster. Las células del hígado son ricas en esterasa y si por 1° tanto el enlazante se puede separar más eficientemente en células del hígado que en picos de células que no son ricas en esterasas. Otros tipos de células ricas en esterasas incluyen células de pulmón, corteza renal y testículos.

Los enlazantes que contienen enlaces peptídicos se pueden utilizar con tipos de células objetivo ricas en peptidasas tales como células hepáticas y sinoviositos .

En general, lo adecuado de un grupo enlazante separable candidato se puede evaluar al probar la capacidad de un agente (o condición degradante) para separar el grupo enlazante candidato. También sería deseable que probar adicionalmente el grupo enlazante separable candidato para su capacidad para resistir la separación en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido diferente que no es el objetivo. Así, uno puede determinar la susceptibilidad relativa a separación entre una primera y una segunda condición en donde la primera se selecciona para ser indicativa de separación en una célula objetivo y la segunda se selecciona para que sea indicativa de separación en otros tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, sangre o suero. Las emanaciones se pueden llevar a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivo celular, en cultivo de órgano o de tejido o en animales completos. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libre de células o en cultivo y confirmar mediante evaluaciones adicionales en animales completos. En modalidades preferidas, los compuestos candidatos útiles se separan por lo menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o bajo condiciones in vitro que se seleccionan para imitar condiciones intracelulares) en comparación con sangre o suero (o bajo condiciones in vitro que se seleccionan para imitar condiciones extracelulares . i. Grupos enlazantes separables por redox En una modalidad, un grupo enlazante separable es un grupo enlazante separable por redox que se separa por reducción u oxidación. Un ejemplo de un grupo enlazante separable reductivamente es un grupo enlazante disulfuro (-S-S-) . Para determinar si un grupo enlazante separable candidato es un "grupo enlazante separable reductivamente" adecuado o, por ejemplo, es adecuado para uso con una porción de AR i particular y un agente direccionado particular, uno puede buscar métodos descritos en la presente. Por ejemplo, se puede evaluar un candidato por incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor utilizando reactivos conocidos en el ámbito los cuales imitan la velocidad de separación la cual se puede observar en una célula, por ejemplo, una célula objetivo. Los candidatos también se pueden evaluar bajo condiciones las cuales se seleccionan para imitar condiciones de sangre o suero. En uno, los compuestos candidato se separan por un máximo de aproximadamente 10% en sangre. En otras modalidades, los compuestos candidatos útiles se degradan por lo menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o bajo condiciones in vitro que se seleccionan para imitar condiciones intracelulares) en comparación con sangre (o bajo condiciones in vitro que se seleccionan para imitar condiciones extracelulares) . La velocidad de separación de los compuestos candidatos se puede determinar utilizando análisis cinéticos de enzima convencionales bajo condiciones que se seleccionan para imitar los medios intracelulares en comparación con las condiciones que se seleccionan para imitar medios extracelulares. ii. Grupos enlazantes separables basados en fosfato En otra modalidad, un enlazante separable comprende un grupo enlazante separable basado en fosfato. Un grupo enlazante separable basado en fosfato se separa por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que separa grupos fosfato en células son enzimas tales como fosfatasas en células. Los ejemplos de grupos enlazantes basados en fosfato son -0-P(0) (ORk) -0-, -O-P(S) (ORk)-O-, -0-P(S) (SRk) -O-, -S-P(O) (ORk)-O-, -0-P (O) (ORk) -S- , -S-P (0) (ORk) -S-, -S-P(S) (ORk) -0-, -0-P(0) (ORk) -0-, -0-P (S) (ORk) -0- , -S-P(0) (Rk)-, -S-P(S) (Rk) -0-, -S-P (0) (Rk) -S- , -0-P (S) (Rk) -S . Las modalidades preferidas son -0-P (O) (0H)-0-, -O-P(S) (OH) -O-, -0-P(S) (SH) -0-, -S-P(0) (OH) -0-, -0-P (0) (OH) -S- , -S-P (0) (OH) -S-, -0-P (S) (OH) -S- , -S-P (S) (OH) -O- , -0- P (0) (H) -O- , -0-P(S) (H)-0-, -S-P(O) (H) -0-, -S-P(S) (H) -0-, -S-P(O) (H) -S-, -0-P(S) (H)-S-. Una modalidad preferida es -0-P (0) (OH) -0- . Estos candidatos pueden ser evaluados utilizando métodos análogos a los descritos en lo anterior. iii. Grupos enlazantes separables por ácido En otra modalidad, un enlazante separable comprende un grupo enlazante separable por ácido. Un grupo enlazante separable por ácido es un grupo enlazante que se separa bajo condiciones ácidas. En modalidades preferidas, los grupos enlazantes separables por ácido se separan en un ambiente ácido con un pH de aproximadamente 6.5 o menor (por ejemplo, aproximadamente 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0, o menor) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los órganos de pH bajo específicos tales como los endosomas y lisozomas pueden proporcionar un ambiente de separación para grupos enlazantes separables por ácido. Los ejemplos de grupos enlazantes separables por ácido incluyen, pero no se limitan a hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos separables por ácido pueden tener la fórmula -C=NN-, C(0)0, o -OC(O) . Una modalidad preferida es cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquilo terciario tal como dimetilpent ilo o terbutilo. Estos candidatos se pueden evaluar utilizando métodos análogos descritos en lo anterior. v. Grupos enlazantes basados en éster En otra modalidad, un enlazante separable comprende un grupo enlazante separable basado en éster. Un grupo enlazante separable basado en éster es separado por enzimas tales como esterasas y amidasas en células. Los ejemplos de grupos enlazantes separables basados en éster incluyen pero no se limitan a ásteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos enlazantes separables por éster tienen la fórmula general -C(0)0-, o -0C(0)-. Estos candidatos pueden ser evaluados utilizando métodos análogos a los descritos en lo anterior. v. Grupos separables basados en péptidos En otra modalidad adicional, un enlazante separable comprende un grupo enlazante separable basado en péptido. Un grupo enlazante separable basado en péptido se separa por enzimas tales como peptidasas y proteasas en células. Los grupos enlazantes separables basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para proporcionar oligopéptidos (por ejemplo, dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos . Los grupos separables basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida se puede formar entre cualquier alquileno, alquenileno o alquinileno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida formado entre aminoácidos para proporcionar péptidos y proteínas . El grupo separable basado en péptido generalmente se limita al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que proporcionan péptidos y proteínas y que no incluye la totalidad del grupo funcional amida. Los grupos de enlace separables basados en péptidos tienen la fórmula general -NHCHRAC (0) NHCHRBC (0) - (SEC ID NO: 13) , en donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos pueden ser valuados utilizando métodos análogos a los descritos en lo anterior.

En una modalidad, un ARNi de la invención se conjuga a un carbohidrato a través de un enlazante. Los ejemplos no limitantes de conjugados de carbohidratos de ARNi con enlazantes de las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, (Fórmula XXIV) , (Fórmula XXV) , (Fórmula XXVIII) , (Fórmula ????) , (Fórmula XXX) , en donde uno de X o Y es un oligonucleótido y el otro es un hidrógeno.

En algunas modalidades de las composiciones y métodos de la invención, un ligando es uno o más de derivados de GalNAc (N-acetilgalactosamina) unidos a través de un enlazante ramificado bivalente o trivalente.

En una modalidad, un ARNds de la invención se conjuga a un enlazante ramificado bivalente o trivalente que se selecciona del grupo de estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (XXXI )- (XXXIV) : Fórmula XXI Fórmula XXXII (Fórmula VII) ; Fórmula XXXIII Fórmula XXXIV en donde : q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente cada vez que se presentan 0-20 y en donde la unidad repetida puede ser igual o diferente; p2A p2B p3A p3B p A p4B p5A p5B p5C rj-,2A rp2B rp3A T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C son cada uno independientemente, cada vez que se presentan, ausente o CO, H, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH O CH20; ^ Q2A, Q2B, ,Q~ 3A, Q3B, Q ~.4A, Q.4B, ,Q~ 5A, Q.5B, Q -.5C son independientemente, cada vez que se presentan, están ausentes o son alquileno, alquileno sustituido en donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminar en uno o más de 0, S, S(0), S02, N(RN), C (R ' ) =C (R ' ' ) , C=C o C(0); R2\ R2B, R3\ R3B, R\ RB, R5\ RB, R5C son cada uno independientemente cada vez que se presentan están ausentes, o son NH, 0, S, CH2, C(0)0, C(0)NH, NHCH (Ra) C (0) , -C(0)-CH(Ra)-NH-, CO, TL2A, TL 2B, tL 3A, TIJ 3B, TIJ 4A, T1J 4B, T.L 5A, TIJ 5B y TL 5C „re„„p„re„s„e„„n4t-an el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada presentación es un monosacárido (tal como GalNAc) , disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido ; y Ra es H o una hebra lateral aminoácido. Los derivados de GalNAc conjugantes trivalentes son particularmente útiles para uso con agentes ARNi para inhibir la expresión de un gen objetivo, tal como los de la fórmula (XXXV) : Fórmula XXXV en donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido tal como un derivado de GalNAc .

Los ejemplos de grupos enlazantes ramificados divalentes y trivalentes adecuados que conjugan derivados de GalNAc incluyen, pero no se limitan a las estructuras mencionadas en lo anterior como fórmulas II -VII, XI, X y XIII .

Las patentes de E.U.A. representativas que describen la preparación de los conjugados de ARN incluyen, pero no se limitan a las patentes de E.U.A. Nos. 4,828,979; 4, 948, 882 5, 218, 105 525,465; 5,541,313; 5, 545, 730 5, 552, 538 5,578, 717 580,731; 5,591,584; 5, 109, 124 5, 118, 802 5, 138, 045 5,414, 077; 5,486, 603; 5, 512,439 5, 578, 718 5,608, 046 4, 587, 044 ; 4 , 605 , 735; 4, 667, 025 4, 762, 779 4, 789, 737 4,824,941; 4,835,263; 4, 876,335 4, 904, 582 4, 958, 013 5, 082, 830 ; 5, 112, 963; 5, 214, 136 5, 082, 830 5 , 112 , 963 5 , 214 , 136 ; 5 , 245 , 022 ; 5, 254 , 469 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 and 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022, la totalidad de las cuales se incorporan cada una como referencia en la presente .

No es necesario para todas las posiciones en un compuesto dado que estén modificados uniformemente y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas antes se pueden incorporar en un compuesto único o incluso en un nucleósido único dentro de un ARNi . La presente invención también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.

Los compuestos ARNi "quiméricos" o "quimeras" en el contexto de esta invención son compuestos de ARNi, preferiblemente los ARNds los cuales contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida de por lo menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNds. Estos ARNi típicamente contienen por lo menos una región en donde el ARN está modificado de manera que confiere al ARNi resistencia aumentada a degradación por nucleasa, captación celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del ARNi puede servir como un sustrato para enzimas capaces de separar AR rADN o híbridos ARN:AR . A modo de ejemplo, la ribonucleasa H es una endonucleasa celular la cual separa la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la ribonucleasa H resulta en la separación del ARN objetivo por lo que incrementa en gran medida la eficiencia de inhibición por AR i de la expresión de un gen. En consecuencia, con frecuencia se pueden obtener resultados comparables con los ARNi más cortos cuando se utiliza ARNds quimérico, en comparación con los ARNds desoxifosforotioato que hibridizan hacia la misma región objetivo. La separación del ARN objetivo se puede detectar habitualmente por electroforesis en gel y, si es necesario técnicas de hibridación de ácido nucleico asociado conocidas en el ámbito.

En algunas circunstancias, el ARN o ARNi se pueden modificar por un grupo no ligando. Se han conjugado numerosas moléculas no ligandos a los ARNi con el fin de incrementar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNi y los procedimientos para realizar estas conjugaciones están disponibles en la literatura científica. Las porciones no ligandos que tienen porciones lipídicas incluidas tales como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. , 2007, 365 (1) : 54-61; Letsinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett . , 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al . , Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al . , Bioorg. Med. Chem. Let . , 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl . Acids Res., 1992, 20:533), una hebra alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una hebra de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), una porción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys . Acta, 1995, 1264:229), o una porción octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol . Exp. Ther., 1996, 277:923). Las patentes de Estados Unidos representativas que describen la preparación de los conjugados de ARN se incluyen en lo anterior. Los protocolos de conjugación típicos involucran la síntesis de un ARN que presenta un aminoenlazante en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino después se hace reaccionar con la molécula que se conjuga utilizando acoplamiento apropiado o reactivos activantes. La reacción de conjugación se puede realizar ya sea con el ARN aún unido al soporte sólido o posterior de la separación del ARN, en la fase en solución. La purificación del conjugado de ARN por CLAR típicamente proporciona el conjugado puro.

IV. Suministro de un ARNi de la invención El suministro de un ARNi de la invención a una célula, por ejemplo una célula dentro de un sujeto tal como un sujeto humano (por ejemplo, un sujeto en necesidad del mismo, tal como un sujeto que tiene un trastorno en el metabolismo de lípidos) se puede llevar a cabo de numerosas maneras diferentes. Por ejemplo el suministro se puede realizar al poner en contacto una célula con un ARNi de la invención ya sea in vitro o in vivo. El suministro in vivo también se puede realizar directamente al administrar una composición que comprende un AR i, por ejemplo, un ARNds , a un sujeto. De manera alternativa, el suministro in vivo se puede realizar indirectamente al administrar uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del AR i. Estas alternativas se describen adicionalmente más adelante.

En general, cualquier método de suministro de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) se puede adaptar para uso con un ARNi de la invención (véase, por ejemplo, Akhtar S. and Julián RL., (1992) Trends Cell . Biol . 2(5) :139-144 and WO94/02595, los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) . Para suministro in vivo, los factores a considerar con el fin de suministrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, estabilidad biológica de la molécula suministrada, prevención de efectos no específicos y acumulación de la molécula suministrada en el tejido objetivo. Los efectos no específicos de un ARNi se pueden minimizar por administración local, por ejemplo, por inyección directa o implantación en un tejido o al administrar tópicamente la preparación. La administración local a un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limitan la exposición del agente a tejidos sintéticos que de otra manera podrían dañarse por el agente o que pueden degradar al agente, y permite una dosis total menor de la molécula de ARNi que se va a administrar. Varios estudios han demostrado que el bloqueo de la expresión exitosa de productos de gen cuando se administra ARNi localmente. Por ejemplo, el suministro intraocular de un ARNds para VEGF por inyección dentro del ' humor vitreo en macacos (Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138) e inyecciones subretinales en monos (Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) han demostrado ambas que evitan la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa un ARNds en ratones reduce el volumen de tumor (Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther.11 ·.267 -274 ) y puede prolongar la supervivencia de ratones que presentan tumor (Kim, J. et al., (2006) Mol. Ther.14 : 343-350; Li, S. et al . , (2007) Mol. Ther.15 : 515-523) . La interferencia de ARN también se ha demostrado con éxito en el suministro local al SNC por inyección directa (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther.12 :59-66 ; Makimura, H. et a.l (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscierice 129:521-528; Thakker, ER. , et al. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci . U. S .A.101:17270-17275 ; Akaneya,Y., et al. (2005) J". Neurophysiol . 93:594-602) y a los pulmones por administración intranasal (Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther.14 :476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol . Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med.11 : 50-55) . Para administrar un ARNi sistémicamente para el tratamiento de una enfermedad, el ARN puede ser modificado o de manera alternativa se puede suministrar utilizando un sistema de suministro de fármaco; ambos métodos actúan para evitar la degradación de la ARNds por endonucleasas y exonucleasas in vivo. La modificación del ARN o el portador farmacéutico también permite el direccionamiento de la composición de ARNi al tejido objetivo y evitar efectos no deseables fuera del objetivo. Las moléculas de ARNi se pueden modificar por conjugación química a grupos lipofílieos tales como colesterol para incrementar la captación celular y evitar la degración. Por ejemplo, un ARNi dirigido contra apoB conjugado a una porción de colesterol lipofilica se puede inyectar sistémicamente en ratones y puede resultar en bloqueo de la expresión de AR m para apoB tanto en hígado como en yeyuno (Soutschek, J. et al., (2004) IVature 432:173-178) . La conjugación de un ARNi a un aptámero se ha demostrado que inhibe el crecimiento de tumor y media la regresión de tumor en un modelo de ratón de cáncer de próstata (McNamara, JO. et al., (2006) Nat . Biotechnol . 24:1005-1015). En una modalidad alternativa, el ARNi se puede suministrar utilizando sistemas de suministro de fármacos tales como nanopartículas , un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de suministro catiónico. Los sistemas de suministro catiónico cargados positivamente facilitan la unión de una molécula de ARNi (cargada negativamente) y también incrementa las interacciones en la membrana de células cargadas negativamente para permitir la captación eficiente de un ARNi por la célula. Los lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros pueden unirse a un ARNi o se pueden inducir para formar una vesícula o micela (véase, por ejemplo Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Reléase 129 (2) : 107-116) que encierre al ARNi. La formación de vesículas o micelas evita adicionalmente la degradación del ARNi cuando se administra sistémicamente. Los métodos para elaborar y administrar complejos de ARNi catiónicos se encuentran dentro de las habilidades de una persona experta en el ámbito (véase, por ejemplo, Sorensen, DR., et al. (2003) J". Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cáncer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al., (2007) J. Hypertens . 25:197-205, las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) . Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de suministro de fármacos útiles para el suministro sistémico de los ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra), Oligofectamine , "partículas de lípidos de ácido nucleico sólidas" (Zimmermann, TS . et al., (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY. et al., (2005) Cáncer Gene Ther.12 : 321-328 ; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol . 71659), péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), y poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc . Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res.16:1799-1804) . En algunas modalidades, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para administración sistémica. Los métodos para administración y composiciones farmacéuticas de los ARNi y ciclodextrinas se pueden encontrar en la patente de E.U.A. No. 7,427 605, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

A ARNi de la invención codificados por vector El ARNi que tiene como objetivo el gen para ANGPTL3 se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores ADN o ARN (véase, por ejemplo Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicación PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicación PCT Internacional No. WO 00/22114, y Conrad, U.S. Patente de No. 6,054,299). La expresión puede ser transitoria (en el orden de horas o semanas) o sostenida (semanas a meses o más prolongada) dependiendo de la construcción específica utilizada y el tejido o tipo de célula objetivo. Estos transgenes se pueden introducir como una construcción lineal o un plásmido circular, o un vector viral el cual puede ser un vector integrante o no integrante. El transgen también se puede construir para permitir ser heredado en un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 92 : 1292) .

La hebra o hebras individuales de un ARNi se puede transcribir desde un promotor o un vector de expresión. Cuando dos hebras separadas se van a expresar para generar, por ejemplo, un ARNds, dos vectores de expresión separados se pueden co- introducir (por ejemplo, por transfección o infección) en una célula objetivo. De manera alternativa, cada hebra individual de un ARNds se puede transcribir por promotores, ambos los cuales se localizan en el mismo plásmido de expresión. En una modalidad, un ARNds se expresa como polinucleótidos repetidos invertidos unidos por una secuencia polinucleotídica enlazante de manera tal que el ARNds tiene una estructura de tallo y bucle.

Los vectores de expresión de ARNi generalmente son plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores de expresión compatibles con células eucarióticas , preferiblemente aquellos compatibles con células de vertebrado se pueden utilizar para producir construcciones recombinantes para la expresión de un ARNi como se describe en la presente. Los vectores de expresión de células eucarióticas son bien conocidas en el ámbito y están disponibles de numerosas fuentes comerciales. Típicamente, los vectores se proporcionan con sitios de restricción convenientes para inserción del segmento de ácido nucleico deseado. El suministro de vectores que expresan ARNi puede ser sistémico o por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células objetivo explantadas del paciente seguido por la introducción al paciente o por cualquier otro medio que permita la introducción en la célula objetivo deseada.

Los plásmidos de expresión de ARNi pueden ser transfectados en células objetivo como un complejo con protadores lipidíeos catiónicos (por ejemplo, Ol igofectamine) o portadores basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo Transit-TKOMR) . Las transfecciones de lípidos múltiples para bloqueo en la expresión mediada por ARNi dirigida a diferentes regiones de un AR objetivo sobre un período de una semana o más también se contemplan por la invención. La introducción exitosa de vectores en células hospedadoras se pueden monitorear utilizando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalizar con un indicador tal como un marcador fluorescente tal como proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) . La transfección estable de células in vivo se puede asegurar utilizando marcadores que proporcionen la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos) tales como resistencia a higromicina B.

Los sistemas de vector viral los cuales pueden ser utilizados con los métodos y composiciones que aquí se describen incluyen pero no se limitan a (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, que incluyen pero que no se limitan a vectores lentivirales , virus de leucemia murina moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados ; (d) vectores de virus de herpes simple; (e) vectores de SV40; (f) vectores de virus de polioma; (g) vectores de virus de papiloma; (h) vectores de picornavirus ; (i) vectores de virus de viruela tal como orthopox, por ejemplo vectores de virus de vaccinia o viruela aviar, por ejemplo, viruela del canario o viruela vacuna; y (j) un adenovirus dependiente de cooperador o sin intestino. Los virus defectuosos en replicación también pueden ser útiles. Diferentes vectores se incorporarán o no en el genoma de las células. Las construcciones pueden incluir secuencias virales para transfección, si se desea. De manera alternativa, la construcción se puede incorporar en vectores capaces de replicación episómica, por ejemplo vectores EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, por ejemplo, promotores, mej oradores, etc. para asegurar la expresión del ARNi en las células objetivo. Otros aspectos a considerar para vectores y construcciones se describen adicionalmente en lo siguiente.

Los vectores útiles para el suministro de un ARNi incluirán elementos reguladores (promotor, mejorador, etc.) suficientes para expresión del ARNi en la célula o tejido objetivo deseado. Los elementos reguladores se pueden seleccionar para proporcionar expresión constitutiva o regulada/ inducible .

La expresión del ARNi se puede regular con precisión, por ejemplo mediante la utilización de una secuencia reguladora inducible que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo concentraciones de glucosa circulante u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24) . Estos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de los ARNds en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, regulación por ecdnisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil -beta-Dl-tiogalactopiranósido (IPTG) . Una persona experta en el ámbito bien podrá seleccionar la secuencia reguladora/promotora adecuada en base en el uso destinado del transgen para AR i .

Los vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para ARNi se pueden utilizar. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (véase Miller et al., (1993) Meth. Enzymol . 217:581-599) . Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empacado correcto del genoma viral e integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para un ARNi se clonan en uno o más vectores los que facilitan el suministro del ácido nucleico en un paciente. Se pueden encontrar más detalles acerca de los vectores retrovirales, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), la cual describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdrl a blastocitos hematopoyéticos con el fin de volverlos blastocitos más resistentes a quimioterapia. Otras referencias ilustran el uso de vectores retrovirales en genoterapia son: Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest. 92:644-651; Kiem et al., (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons y Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman y ilson, (1993) Curr . Opin. in Genetics and Devel . 3:110-114. Los vectores lentivirales contemplados para uso incluyen, por ejemplo, vectores virales basados en VIH descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 6,143,520; 5,665,557; y 5,981,276, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Los adenovirus también se contemplan para uso en el suministro de los ARNi de la invención. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, por ejemplo para el suministro de genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de manera natural los epitelios respiratorios cuando provocan una enfermedad ligera. Otros objetivos de sistemas de suministro basados en adenovirus son hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, (1993) Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503 presentan una revisión de genoterapia basada en adenovirus. Bout et al., (1994) Human Gene Therapy 5:3-10 demuestran el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de macacos. Otras instancias respecto al uso de adenovirus en genoterapia se pueden encontrar en Rosenfeld et al., (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., (1993) J. Clin. Invest . 91:225-234; Publicación PCT W094/12649; y Wang et al., (1995) Gene Therapy 2:775-783. Un vector AV adecuado para expresar un AR i objeto de la invención, un método para construir un vector AV recombinante y un método para suministrar el vector en células objetivo se describe en Xia H et al. (2002), Nat . Biotech. 20 : 1006-1010.

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) también se pueden utilizar para suministrar un ARNi de la invención (Walsh et al., (1993) Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 204:289-300; patente de E.U.A. No. 5,436,146) . En una modalidad, el ARNi se puede expresar como dos moléculas de ARN de hebra sencilla complementarias, separadas a partir de un vector AAV recombinante que tiene, ya sea los promotores de ARN U6 o Hl o el promotor de citomegalovirus (CMV) . Los vectores AAV adecuados para expresar el ARNds objeto de la invención, los métodos para construir el vector AV recombinante y los métodos para suministrar los vectores en células objetivo se describen en Samulski R et al. (1987) , J. Virol . 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996) , J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989) , J". Virol. 63: 3822-3826; patente de E.U.A. 5,252,479; patente de E.U.A. No. 5,139,941; solicitud de patente internacional No. O 94/13788; y solicitud de patente internacional No. WO 93/24641, la descripción completa de las cuales se incorpora en la presente como referencia .

Otro vector viral adecuado para suministro en un ARNi de la invención es un virus de viruela tal como el virus de vaccinia, por ejemplo, una vaccinia atenuada tal como virus de Ankara modificado (MVA) o NYVAC, un avipox o viruela de aves tal como viruela vacuna o viruela aviar.

El tropismo de vectores virales se puede modificar por pseudotipificación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus o por sustitución de proteínas de cápside viral diferentes, según sea apropiado. Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden ser pseudotipificados con proteínas de superficie a partir de virus de estomatitis vesicular (VSV) , virus de la rabia, del ébola, de Mokola y similares. Los vectores AAV se pueden elaborar para tener como objetivo diferentes células al manipular los vectores para expresar serotipos de proteína de cápside diferentes; véase, por ejemplo Rabinowitz J E et al. (2002), J. Virol . 76:791-801, la descripción completa de la cual se incorpora en la presente como referencia.

La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable o puede incluir una matriz de liberación lenta en la cual se incrusta el vehículo de suministro del gen. De manera alternativa, cuando el vector de suministro de gen completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes , por ejemplo vectores retrovirales , la preparación farmacéutica puede incluir una o más células las cuales producen el sistema de suministro de gen.

V. Composiciones farmacéuticas de la Invención La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones las cuales incluyen los ARNi de la invención. En una modalidad, se proporciona en la presente composiciones farmacéuticas que contienen un AR i, como se describe en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen para ANGPTL3 , por ejemplo un trastorno de metabolismo de lípidos tal como hipertrigliceridemia .

Las composiciones farmacéuticas se formulan en base en el modo de suministro. Un ejemplo son las composiciones que se formulan para administración sistémica por medio de suministro parenteral, por ejemplo, por administración intravenosa (IV) o subcutánea. Otro ejemplo son composiciones que se formulan para suministro directo en el hígado, por ejemplo por infusión en el hígado tal como infusión de bomba continua . as composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3. En general, una dosis adecuada de un ARNi de la invención estará en el intervalo de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, de manera general en el intervalo de aproximadamente 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, el AR ds se puede administrar a aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aprl 3 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg por dosis única .

Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7,0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4., 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

En otra modalidad, el ARNds se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.75 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.75 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 25 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0. 25 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg ,a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, el AR ds se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.01, 0.02, 0. 03, 0 .04, 0 .05, 0.06, 0. 07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0. 5, 0. 6, 0.7,0.8, 0.9, 1, 1. 1, 1 .2, 1. 3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1 .8, 1 .9, 2, 2.1, 2.2, 2. 3, 2.4, 2.5, 2 .6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3. 5, 3.6, 3.7, 3. .8, 3.9, 4, 4.1, 4.: 2, 4.3, 4.4. , 4.5, 4.6, 4. 7, 4.8, 4.9, 5 , 5.1, 5.2, 5.3, 5. 4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5. 9, 6, 6 .1, 6. 2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6 .7, 6 .8, 6. 9, 7, 7.1, 7. 2, 7.3, 7.4, 7 .5, 7.6, 7.7, 7.8, 7. 9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8. 4, 8.5, 8.6, 8 .7, 8.8, 8.9, 9, 9. 1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9. 6, 9.7, 9.8, 9. 9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

En otra modalidad, el ARNds se administra en una dosis de aproximadamente 0 .5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg. a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg. aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0. 5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0. 75 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7. 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, a los sujetos se puede administrar una cantidad terapéutica de ARNi tal como aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7,0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4., 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el ARNi se puede administrar como dos, tres o más sub-dosis en intervalos apropiados durante el día o incluso utilizando infusión o suministro continuo a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso el ARNi contenido en cada sub-dosis debe ser correspondientemente menor con el fin de obtener la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede estar constituida para suministros durante varios días, por ejemplo utilizando una formulación de liberación sostenida convencional la cual proporcione liberación sostenida del ARNi durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenidas son bien conocidas en el ámbito y son particularmente útiles para el suministro de agentes en un sitio particular tal como el que se podría utilizar con los agentes de la presente invención. En esta modalidad, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.

El efecto de una dosis única sobre los niveles de ANGPTL3 puede ser de larga duración, de manera tal que dosis subsecuente se administre en intervalos no mayores de 3 , 4 ó 5 días, o en intervalos no mayores de 1, 2, 3 ó 4 semanas.

Las personas expertas en el ámbito apreciarán que ciertos factores pueden influir en la dosificación y sincronización requerida para tratar efectivamente a un sujeto, que incluyen pero que no se limitan a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Los estimados de dosificaciones efectivas y las vidas medias in vivo para los ARNi individuales abarcados por la invención se pueden elaborar utilizando metodologías convencionales o en base de pruebas in vivo utilizando un modelo animal apropiado, como se describe en otra parte en este documento.

Los avances en genética de ratones han generado numerosos modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades en humanos tal como trastornos en el metabolismo de lípidos que se podrían beneficiar de la reducción en la expresión de ANGPTL3. Estos modelos se pueden utilizar para pruebas in vivo de ARNi así como para determinar la dosis terapéuticamente eficaz. Los modelos de ratón adecuados se conocen en el ámbito e incluyen, por ejemplo, el ratón obeso (ob/ob) que contiene una mutación en el gen obeso (ob) ( iegman et al., (2003) Diabetes, 52:1081-1089) ; un ratón que contiene bloqueo en la expresión homocigota de un receptor de LDL (ratón LDLR- /- ; Ishibashi et al . , (1993) J. Clin Invest 92 (2) : 883-893) ; modelo de ratón con aterosclerosis inducida por dieta (Ishida et al., (1991) J. Lipid. Res., 32:559-568); y modelo de ratón con bloqueo en la expresión de lipoproteína lipasa heterocigota (Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest. 96 (6) -.2555-2568) .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de numerosas maneras dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y en base en el área que va a ser tratada. La administración puede ser tópica (por ejemplo, mediante un parche transdérmico) , pulmonar, por ejemplo por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye por medio de nebulizador, intratraqueal , intranasal, epidérmico y transdérmico, oral o parenteral . La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo por medio de un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, por administración intraparenquimal , intratecal o intraventricula .

El ARNi se puede suministrar de una manera a un tejido objetivo o particular tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado) .

Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aspersiones, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, en polvo u oleosas, los espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Los condones recubiertos, guantes y similares también pueden ser útiles. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las cuales los ARNi objeto de la invención se mezclan con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ásteres de ácido graso, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos . Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoil fosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) , negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleiolfosfatidil etanolamina DOTMA) . Los ARNi objeto de la invención se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. De manera alternativa, los ARNi pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanóico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona y acilcarnitina, una acilcolina o un éster de alquilo de 1 a 20 átomos de carbono (por ejemplo, miristato de isopropilo IPM) , monoglicérido, diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las formulaciones tópicas se describen con detalle en la patente de E.U.A. No. 6,747,014, la cual se incorpora en la presente como referencia.

A. Formulaciones de ARNi que comprenden montajes moleculares membranosos Un ARNi para uso en las composiciones y métodos de la invención se puede formular para suministro en un montaje molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Como se utiliza en la presente, el término "liposoma" se refiere a una vesícula constituida de lípidos anfifílicos distribuidos en por lo menos una bicapa, por ejemplo una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilamelares y multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene una composición de AR i. El material lipofílico aisla el interior acuoso de un exterior acuoso, el cual típicamente no incluye la composición de ARNi, aunque en algunos ejemplos si puede. Los liposomas son útiles para la transferencia y suministro de ingredientes activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, la bicapa liposómica se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. Conforme progresa la fusión del liposoma con la célula, el contenido acuoso interno que incluye al ARNi es suministrado a la célula en donde el ARNi se puede unir específicamente al ARN objetivo y puede mediar la interferencia de ARN. En algunos casos, los liposomas también están dirigidos específicamente, por ejemplo para dirigir al ARNi a tipos de células particulares.

Un liposoma que contiene un agente de interferencia de ARN se puede preparar por una diversidad de métodos. En un ejemplo, el componente lipídico de un liposoma se disuelve en un detergente de manera que se forman micelas con el componente lipídico. Por ejemplo, el componente lipídico puede ser un lípido catiónico antipático o un conjugado lipídico. El detergente puede tener una concentración de micelas crítica alta y puede ser no iónico. Los detergentes ejemplares incluyen colato, CHAPS, glucósido de octilo, desoxicolato y lauroil sarcosina. La preparación del agente de interferencia de ARN después se puede agregar a las micelas que incluyen el componente lipídico. Los grupos catiónicos en el lípido interactúan con el agente de interferencia de ARN y los condensan alrededor del agente de interferencia de ARN para formar un liposoma. Después de la condensación se retira el detergente, por ejemplo por diálisis para proporcionar una preparación liposómica de un agente de interferencia de ARN.

Si es necesario un compuesto portador que ayude a la condensación se . puede agregar durante la reacción de condensación, por ejemplo mediante adición controlada.' Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero diferente de un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina) . También se puede ajustar el pH para favorecer la condensación.

Los métodos para producir vehículos de suministro de polinucleótido estables, los cuales incorporan un complejo polinucleótido/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo del suministro se describen adicionalmente , por ejemplo, en WO 96/37194, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia. La formación de liposoma también puede incluir uno o más aspectos de métodos ejemplares descritos en Felgner, P. L. et al., (1987) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 8:7413-7417; patente de E.U.A. No. 4,897,355; patente de E.U.A. No. 5,171,678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol . 23:238; olson efc al., (1979) Biochim. Biophys . Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim Biophys. Acta 728;339; y Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757. Las técnicas utilizadas comúnmente para preparar agregados lipidíeos de tamaño apropiado para uso como vehículos de suministro incluyen sonicado y congelamiento-recalentamiento más extrusión (véase, por ejemplo, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys . Acta 858:161. La microfluidización se puede utilizar cuando se desea agregados consistentemente pequeños (50 a 200 nm) y agregados relativamente uniformes (Mayhew et al., (1984) Biochim Biophys. Acta 775:169. Estos métodos están adaptados de antemano al empacado de preparaciones de agente de interferencia de ARN en liposomas.

Los liposomas se encuentran en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente los cuales interactúan con moléculas de ácido nucleico cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo de ácido nucleico cargado positivamente/liposoma se une a la superficie de la célula cargada negativamente y es internalizado en un endosoma. Debido al pH ácido dentro de la endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido al citoplasma de la célula ( ang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. , 147:980-985).

Los liposomas, los cuales son sensibles a pH o están cargados negativamente, atrapan ácidos nucleicos en vez de formar complejos con ellos. Puesto que ambos, el ácido nucleico y el lípido están cargados de modo similar, se produce repulsión en vez de formación de complejo. No obstante, parte del ácido nucleico es atrapado dentro del interior acuoso de los liposomas. Se han utilizado liposomas sensibles a pH para suministrar ácidos nucleicos que codifican para el gen para timidina cinasa a monocapas de células en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en células objetivo (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Reléase, 19 : 269-274) .

Un tipo mayor de composición liposómica incluye fosfolípidos diferentes de fosfatidilcolina derivada de modo natural. Las composiciones de liposomas neutro se pueden formar, por ejemplo, a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) . Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) . Otro tipo de composición liposómica se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de frijol de soya y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol .

Los ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en las células in vi tro e in vivo incluyen la patente de E.U.A. No. 5,283,185; la patente de E.U.A. No. 5,171,678; los documentos WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol . Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143 ; y Strauss, (1992) EMBO J//:1417.

Los sistemas liposómicos no iónicos también han sido examinados para determinar su utilidad en el suministro de fármacos en la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones liposómicas no iónicas comprenden NovasomeMR I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-esteariléter) y NovasomeMR II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-esteariléter) se utilizaron para suministrar ciclosporina A en la dermis de la piel de ratón. Los resultados indican que tales sistemas liposómicos no iónicos son eficaces al facilitar la deposición de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al., (1994) S.T.P.Phar a Sci., 4(6):466).

Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados estéricamente" un término el cual, como se utiliza en la presente, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en los liposomas, resultan en tiempos de vida en circulación aumentada en relación a los liposomas que carecen de estos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los cuales parte de la porción de lípido que forma vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos , tal como monosialogangliósido GMi o (B) es derivatizado con uno o más polímeros hidrofílicos tales como la porción polietilenglicol (PEG) . Aunque no se desea estar unido por teoría alguna particular se considera en el ámbito que, por lo menos para los liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos , esf ingomielina o lípidos derivatizados de PEG, la vida en circulación mejorada de estos liposomas estabilizados estéricamente deriva de una captación reducida en células del sistema retículo endotelial (RES) (Alien et al., (1987) FEBS Letters , 223:42; Wu et al., 1993) Cáncer Research, 53 : 3765) .

Se conocen en el ámbito diversos liposomas que comprenden uno o más glucolípidos. Papahadjopoulos et al., {Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987) , 507:64) han reportado la capacidad de monogangliósido GMi, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las vidas medias en sangre de liposomas. Estos hallazgos fueron ampliados por Gabizon et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., (1988) , 85:6949) . La patente de E.U.A. No. 4,837,028 y el documento WO 98/04924, ambos para Alien et al. describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido GMi o un éster de sulfato de galactocerebrósido. L patente de E.U.A. No. 5,543,152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina . Los liposomas que comprenden 1 , 2 -sn-dimiristoilfosfatidilcolina se describen en el documento WO 97/13499 (Lim et al) .

En una modalidad se utilizan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse a la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficientemente con la membrana plasmática son captados por macrófagos in vivo y pueden ser utilizados para suministrar la interferencia de AR i a los macrófagos.

Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen: liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales que son biocompatibles y biodegradables ; liposomas que pueden incorporar una gama amplia de fármacos solubles en agua y en lípidos; liposomas que pueden proteger a los agentes de interferencia de ARN encapsulados en sus compartimientos internos a partir del metabolismo y degradación (Rosoff , in " Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volumen 1, p. 245). Consideraciones importantes e la preparación de formulaciones de liposoma son la carga de superficie de lípidos, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.

Un lípido catiónico sintético cargado positivamente, cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi ) ropil] -?,?,?-trimetilamonio (DOTMA) se puede utilizar para formar liposomas pequeños que interactúan de manera espontánea con ácido nucleico para formar complejo de lípido-ácido nucleico los cuales son capaces de fusionarse con lípidos cargados negativamente de las membranas celulares o células de cultivo de tejido, lo que resulta en un suministro de un agente de interferencia de ARNi (véase, por ejemplo, Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, y patente de los Estados Unidos No. 4,897,355 para una descripción de DOTMA y su uso con ADN) .

Se puede utilizar un análogo de DOTMA, 1,2-bis (oleoiloxi ) -3 - (trimetilamonio) propano (DOTAP) en combinación con un fosfolípido para formar vesículas que forman complejos con ADN. La LipofectinMR Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) es un agente eficaz para el suministro de ácidos nucleicos altamente aniónicos en células de cultivo de tejido vivas que comprenden liposomas de DOTMA cargados positivamente los cuales interactúan espontáneamente con polinucleótidos cargados negativamente para formar complejos. Cuando se utilizan suficientes liposomas cargados positivamente, la carga neta de los complejos resultantes también es positiva. Los complejos cargados positivamente preparados de esta manera se unen espontáneamente a superficies de células cargadas negativamente, se fusionan con la membrana plasmática y suministran eficientemente ácidos nucleicos funcionales en, por ejemplo, células de cultivo de tejido. Otro lípido catiónico disponible comercialmente , 1 , 2 -bis (oleoiloxi) -3,3- (trimetilamonio) ropano ( "DOTAP" ) (Boehringer Mannheim, Indianapolis , Indiana) difiere de DOTMA en que las porciones oleoilo están unidas por éster, en vez de enlaces éter.

Otros compuestos lipidíeos catiónicos reportados incluyen aquellos que han sido conjugados a una diversidad de porciones que incluyen, por ejemplo, carboxiespermina la cual se ha conjugado a uno de dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como 5 -carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida ("DOGS") (TransfectamMR, Promega, Madison, Wisconsin) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermilamida ("DPPES") (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5, 171, 678) .

Otro conjugado lipídico catiónico incluye derivatización de lípido con colesterol ("DC-Chol") el cual ha sido formulado en liposomas en combinación con DOPE (Véase, Gao, X. y Huang, L . , (1991) Bíochim. Bíophys. Res. Commun. 179:280) . La lipopolilisina , constituida al conjugar polilisina a DOPE, se ha reportado que es eficaz para transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., (1991) Bíochim. Biophys . Acta 1065:8) . Para ciertas líneas de células, los liposomas que contienen lípidos catiónicos conjugados se afirma que presentan menor toxicidad y proporcionan una transfección más eficiente en comparación con las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos lipidíeos catiónicos disponibles comercialmente incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland) . Otros lípidos catiónicos adecuados para el suministro de oligonucleótidos se describen en los documentos O 98/39539 y WO 96/37194.

Las formulaciones liposómicas son particularmente adecuadas para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Las ventajas incluyen efectos secundarios reducidos en relación con una alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación aumentada del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad de administrar un agente de interferencia de AR i en la piel. En algunas implementaciones , los liposomas se utilizan para suministrar un agente de interferencia de ARNi a células epidérmicas y también para incrementar la penetración del agente de interferencia ARNi en tejidos dérmicos, por ejemplo, en la piel. Por ejemplo, los liposomas se pueden aplicar tópicamente. El suministro tópico de fármacos formulado como liposomas en la piel ya ha sido documentado (véase, por ejemplo, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 y du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite , S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al . , (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. et al . (1987) Meth. Enzymol . 149:157-176; Straubinger R. M . y Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol .101 : 512-527 ; ang, C. Y . y Huang, L . , (1987) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 84:7851-7855).

Los sistemas liposómicos no iónicos también han sido examinados para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol . Las formulaciones liposómicas no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-esteariléter) y Novasome II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10-esteariléter) se han utilizado para suministrar un fármaco en la dermis de piel de ratón. Tal formulación con un agente de interferencia de ARN son útiles para tratar un trastorno dermatológico.

Los liposomas que pueden incluir AR i pueden elaborarse altamente deformables. Tal capacidad deformable puede permitir que los liposomas penetren a través de los foros que sean más pequeños que el radio promedio de liposoma. Por ejemplo, los transfersomas son un tipo de liposomas deformables. Los transfersomas pueden elaborarse al agregar activadores de borde de superficie, habitualmente tensioactivos a una composición liposómica convencional. Los transfersomas pueden incluir un agente de interferencia de ARN que puede ser suministrado, por ejemplo, subcutáneamente, por infección con el fin de suministrar el agente de interferencia de ARN a queratinocitos en la piel. Con el fin de atravesar la piel intacta del mamífero, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Además, debido a las propiedades de lípido, estos transíerosomas pueden ser autooptimizantes (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel) , autorreparables y con frecuencia pueden alcanzar su objetivo sin fragmentación y con frecuencia por autocargado .

Otras formulaciones susceptibles para la presente invención se describen en la solicitud provisional de los Estados Unidos Nos. de Serie 61/018,616, presentada el 2 de enero del 2008; 61/018,611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039,748, presentada el 26 de marzo del 2008; 61/047,087 presentada el 22 de abril del 2008 y 61/051,528, presentada el 8 de mayo del 2008. La solicitud PCT No. PCT/US2007/080331 , presentada el 3 de octubre del 2007 y también describe formulaciones que son susceptibles para la presente invención.

Los transfersomas son otro tipo adicional de liposomas y son agregados lipidíeos altamente deformables los cuales son candidatos atractivos para vehículo de suministro de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas lipídicas las cuales son altamente deformables de manera que son fácilmente susceptibles de penetrar a través de los poros los cuales son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al ambiente en el cual se utilizan, por ejemplo, son autooptimizantes (adaptables a la forma de los poros a la piel) , autorreparables , con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentarse y con frecuencia son autocargables. Para producir transfersomas es posible agregar activadores de borde de superficie, habitualmente tensioactivos a una composición liposómica convencional. Se han utilizado transfersomas para suministrar albúmina sérica a la piel . El suministro mediado por transfersoma de albúmina sérica se ha demostrado que es tan eficaz como la inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina sérica.

Los tensioactivos encuentran amplia aplicación y formulaciones tales como emulsión (que incluye microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y establecer la calidad de las propiedades de muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos y mediante el uso de un balance hidrofílico/lipofílico (HLB) . La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como la "cabeza") proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes tensioactivos utilizados en formulaciones (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y. , 1988, p. 285) .

Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y son utilizables sobre una amplia gama de valores de pH. En general, sus valores de HLB varían de 2 a aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen esteres no iónicos tales como ásteres de etilenglicol , ésteres de propilenglicol , ésteres de glicerilo, ésteres poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y los ésteres tales como los etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.

Si la molécula de tensioactivo presenta una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como bencensulfonatos de alquilo, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son sulfatos de alquilo y los jabones.

Si la molécula de tensioactivo presenta una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son las más utilizadas de esta clase.

Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de transportar ya sea una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfotérico. Los tensioactivos anfotéricos incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.

El uso de tensioactivos en productos de fármacos, formulaciones y en emulsiones ha sido revisado (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y. , 1988, p. 285) .

El ARNi para uso en los métodos de la invención también se puede proporcionar como formulaciones micelares. Las "micelas" se definen en la presente como un tipo particular de montaje molecular en el cual las moléculas anfipáticas están distribuidas en una estructura esférica de manera que todas las porciones hidrofóbicas de las moléculas se dirigen hacia adentro, dejando las porciones hidrofílicas en contacto con la fase acuosa circundante. Existe una distribución inversa si el ambiente es hidrofóbico.

Una formulación micelar mixta adecuada para suministro a través de las membranas transdérmicas se puede preparar al mezclar una solución acuosa de la composición de AR si, un sulfato de alquilo d 8 a 22 átomos de carbono de metal alcalino y compuestos formadores de micelas. Los compuestos formadores de micela ejemplares incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleina, monooleatos, monolauratos , aceite de borraja, aceite de onagra, mentol, trihidroxioxocolanilglicina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleina, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, polidocanol alquiléteres y análogos de los mismos, quenodesoxicolato, desoxicolato y mezclas de los mismos. Los compuestos formadores de micela se pueden agregar al mismo tiempo o después de la adición del sulfato de alquilo de metal alcalino. Las micelas mixtas se formarán con sustancialmente cualquier clase de mezclado de los ingredientes pero mezclado vigoroso con el fin de proporcionar micelas de tamaño más pequeño.

En un método se prepara una primera composición micelar la cual contiene la composición de ARNsi y por lo menos un sulfato de alquilo de metal alcalino. La primera composición micelar después se mezcla con por lo menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición micelar mixta. En otro método, la composición micelar se prepara al mezclar la composición de ARNsi, el sulfato de alquilo de metal alcalino y por lo menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido por adición de los compuestos remanentes formadores de micelas, con mezclado vigoroso .

Se pueden agregar fenol y/o m-cresol a la composición micelar mixta para estabilizar la formulación y protegerla contra crecimiento bacteriano. De manera alternativa, se pueden agregar fenol y/o m-cresol con los ingredientes formadores de micela. Un agente isotónico tal como glicerina también se puede agregar después de la formación de la composición micelar mixta.

Para suministro de la formulación micelar como una aspersión, la formulación se puede colocar en un surtidor en aerosol y el surtidor se carga con un propelente. El propelente, el cual está bajo presión, está en forma líquida en el surtidor. Las relaciones de los ingredientes se ajustan de manera que las fases acuosas y de propelente se vuelvan una, es decir, exista una fase. Si existen dos fases, es necesario agitar el surtidor antes de suministrar una porción del contenido, por ejemplo, a través de una válvula dosificadora . La dosis suministrada de agente farmacéutico es impulsada desde la válvula dosificadora en una aspersión fina .

Los propelentes pueden incluir clorofluorocarburos que contendrán hidrógeno, fluorocarburos que contegan hidrógeno, dimetiléter y dietiléter. En algunas modalidades se puede utilizar HFA 134a (1 , 1 , 1 , 2-tetrafluoroetano) .

Las concentraciones específicas de los ingredientes esenciales se pueden determinar por experimentación relativamente directa. Para absorción a través de las cavidades orales, con frecuencia es deseable incrementar, por ejemplo a por lo menos el doble o triple la dosificación para inyección pasante o administración a través del tracto gastrointestinal .

B. Partículas lipídicas de ácido nucleico Los AR i , por ejemplo los ARNds de la invención pueden ser encapsulados completamente en la formulación lipídica, por ejemplo, para formar un SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula de ácido nucleico- lípido . Como se utiliza en la presente, el término "SNALP" significa una partícula estable de ácido nucleico-lípido, que incluye SPLP. Como se utiliza en la presente, el término "SPLP" se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende ADN plasmídico encapsulado dentro de una vesícula lipídica. Las SNALP y SPLP típicamente contienen un lípido catiónico como un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado PEG-lípido) . Las SNALP y las SPLP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas dado que presentan tiempos de vida en circulación prolongados posterior a la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración) . Las SPLP incluyen "pSPLP, " las cuales incluyen un complejo encapsulado de agente condensante-ácido nucleico como se establece en la publicación PCT número WO 00/03683. Las partículas de la presente invención típicamente tienen una media de diámetro de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de manera más típica de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de manera más típica de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, y de manera mucho más típica de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención son resistentes en solución acuosa a degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Números 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; Publicación de E.U.A. Número 2010/0324120 y Publicación PCT Número O 96/40964.

En una modalidad, la relación lípido respecto a fármaco (relación masa/masa) (por ejemplo, relación lípido respecto a ARNds) estará en el intervalo desde aproximadamente 1 : 1 a aproximadamente 50:1, desde aproximadamente 1 : 1 a aproximadamente 25:1, desde aproximadamente 3 : 1 a aproximadamente 15:1, desde aproximadamente 4 : 1 a aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1 o aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1. Los intervalos intermedios a los intervalos mencionados en lo anterior también se contemplan como parte de la invención.

El lípido catiónico puede ser, por ejemplo cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC) , bromuro de N,N-diestearil-N, N-dimetilamonio (DDAB) , cloruro de N-(I-(2,3-dioleoiloxi) propil) -N, , -trimetilamonio (DOTAP) , cloruro de N- (I- (2 , 3 -dioleiloxi) propil) -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) , N, N-dimetil-2 , 3 -dioleiloxi ) ropilamina (DODMA) , 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA) , 1,2-dilinoleniloxi -N, -dimetilaminopropano (DLenDMA) , 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP) , 1 , 2 -dilinoleioxi-3 - (dimetilamino) acetoxipropano (DLin-DAC) , 1 , 2 -dilinoleioxi-3 -morfo1inopropano (DLin-MA) , 1,2- dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP) , 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilarainopropano (DLin-S-DMA) , 1-linoleoil-2 -linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP) , sal de cloruro de 1, 2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA. Cl ) , sal de cloruro de 1 , 2 -dilinoleoil -3 -triraetilaminopropano (DLin-TAP . Cl ) , 1 , 2-dilinoleiloxi-3- (N-metilpiperazino) propano (DLin-MPZ) o 3 - (N, N-dilinoleilamino) -1, 2-propanodiol (DLinAP) , 3- (N, N-dioleilamino) -1,2-propanodiol (DOAP) , 1, 2-dilinoleiloxo-3- (2-N,N-dimetilamino) etoxipropano (DLin-EG-DMA) , 1 , 2 -dilinoleniloxi-N, -dimetilaminopropano (DLinDMA) , 2 , 2 -dilinoleil -4 -dimetilaminometil- [1, 3] -dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR, 5s, 6aS) -N,N-dimetil-2 , 2-di ( (9Z, 12Z) -octadeca-9 , 12-dienil) tetrahidro-3aH-ciclopenta [d] [1,3] dioxol-5-amina (ALN100), (6Z , 9Z , 28Z , 31Z) -heptatriaconta-6 , 9 , 28 , 31-tetraen-19-il 4 - (dimetilamino) butanoato (MC3 ) , 1 , 1 ' - (2 - (4 - ( 2 -( (2- (bis (2-hidroxidodecil) amino) etil) (2-hidroxidodecil) -amino) etil ) piperazin- 1- il) etilazanediil ) didodecan-2 -ol (Tech Gl) , o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente 20 moles % a aproximadamente 50 moles % o aproximadamente 40 moles % del lípido total presente en la partícula.

En otra modalidad, se puede utilizar el compuesto 2 , 2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1,3] -dioxolano para preparar nanopartículas de lípido-ARNsi . La síntesis de 2,2- dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1, 3] -dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número 61/107,998 presentada el 23 de octubre de 2008, la cual se incorpora en la presente como referencia.

En una modalidad, la partícula de lípido-ARNsi incluye 40% de 2, 2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1, 3] -dioxolano: 10% de DSPC: 40% de colesterol : 10% PEG-C-DOMG (moles por ciento) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una relación de 0.027 de AR si/lípido .

El lípido ionizable/no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro que incluye pero que no se limita a diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) , dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) , dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) , dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) , dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) , palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC) , palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) , 4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1- carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal) , dipalmitoilfosfatidil etanolamina (DPPE) , dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE) , diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE) , 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil -2 -oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE) , colesterol o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede tener desde aproximadamente 5% moles a aproximadamente 90% moles, aproximadamente 10% moles o aproximadamente 58% moles si se incluye colesterol del lípido total presente en la partícula.

El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG) -lípido que incluye, sin limitación un PEG-diacilglicerol (DAG) , un PEG-dialquiloxipropilo (DAA) , un PEG-fosfolípido, a PEG-ceramida (Cer) , o una mezcla de los mismos. El conjugado PEG-DAA puede ser por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (Ci2) , un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4) , un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) , o un PEG-diesteariloxipropilo (C] 8) . El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede ser de 0% moles a aproximadamente 20% moles o aproximadamente 2% moles del lípido total presente en la partícula .

En algunas modalidades, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye además colesterol, por ejemplo, en aproximadamente 10% moles a aproximadamente 60% moles o aproximadamente 48% moles del lípido total presente en la partícula .

En una modalidad, el lipidoide ND98-4HC1 (MW 1487) (Véase la solicitud de patente de E.U.A. número 12/056,230, presentada el 3/26/2008, la cual se incorpora en la presente como referencia) , Cholesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-Ceramide C16 (Avanti Polar Lipids) se pueden utilizar para preparar nanopartícülas de lípido-AR ds (es decir, partículas LNP01) .

Las soluciones concentradas de cada uno en etanol se pueden preparar como sigue: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramide C16, 100 mg/ml. Las soluciones concentradas de ND98, colesterol y PEG-Ceramide C16 después se pueden combinar, por ejemplo, en una relación molar 42:48:10. La solución lipídica combinada se puede mezclar con AR ds acuoso (por ejemplo, en acetato de sodio, pH 5) de manera que la concentración de etanol final es de aproximadamente 35-45% y la concentración de acetato de sodio final es de aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNds típicamente se forman espontáneamente por mezclado. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseado, la mezcla de nanopartículas resultante se puede extruir a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo con un límite de 100 nm) utilizando, por ejemplo, un extrusor de termocilindro, tal como un Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc) . En algunos casos, se puede omitir la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio simultáneo de amortiguador se pueden llevar a cabo, por ejemplo, por diálisis o filtración en flujo tangencial. Se puede intercambiar el amortiguador, por ejemplo, con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) a pH aproximadamente 7, por ejemplo, a pH aproximadamente 6.9, pH aproximadamente 7.0, pH aproximadamente 7.1, pH aproximadamente 7.2, pH aproximadamente 7.3 o pH aproximadamente 7.4.

ND98, Isómero I Fórmula 1 Las formulaciones de LNP01 se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud internacional número WO 2008/042973, la cual se incorpora en la presente como referencia .

Las formulaciones de lípido-AR ds ejemplares adicionales se describen en la tabla siguiente DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC : dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG, o PEG-C14) (PEG con un peso molecular promedio de 2000) PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG, o PEG-C18) (PEG con un peso molecular promedio de 2000) PEG-cDMA: PEG- carbamoil - 1 , 2 -dimiristiloxipropilamina (PEG con un peso molecular promedio de 2000) SNALP ( 1 , 2-dilinoleniloxi -N, N-dimetilaminopropano (DLinDMA) ) que comprende formulaciones se describen en la Publicación Internacional Número WO2009/127060 , presentada el 15 de abril del 2009, la cual se incorpora en la presente como referencia.

XTC comprende formulaciones que se describen, por ejemplo, en el documento provisional de E.U.A. Número de serie 61/148,366, presentado el 29 de enero del 2009; el documento Provisional de E.U.A. Número de serie 61/156,851, presentado en de marzo del 2009; documento Provisional de E.U.A. Número de serie presentado en 10 de junio del 2009; Documento Provisional de E.U.A. Número de serie 61/228,373, presentado el 24 de julio del 2009; Documento Provisional de E.U.A. Número de serie 61/239,686, presentado el 3 de septiembre del 2009 la Solicitud Internacional Número PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero del 2010, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Las formulaciones que comprenden MC3 se describen, por ejemplo, en la publicación de E.U.A. Número 2010/0324120, presentada el 10 de junio del 2010, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia.

Las formulaciones que comprenden ALNY-100 se describen, por ejemplo en la solicitud de patente internacional número PCT/US09/63933 , presentada el 10 de noviembre del 2009, la cual se incorpora en la presente como referencia .

Las formulaciones que comprenden C12-200 se describen en el documento provisional de E.U.A. Número de serie 61/175,770, presentado el 5 de mayo del 2009 y la solicitud internacional Número PCT/US10/33777 , presentada el 5 de mayo del 2010, las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Síntesis de lipidos ionizables/catiónicos Cualquiera de los compuestos, por ejemplo lipidos catiónicos y similares, utilizados en las partículas de ácido nucleico- lípido de la invención se pueden preparar por técnicas de síntesis orgánica conocidas que incluyen los métodos descritos con mayor detalle en los ejemplos. Todos los sustituyentes son como se define a continuación a menos que se indique en otro sentido.

"Alquilo" significa un hidrocarburo alifático de hebra lineal, ramificada, no cíclico o cíclico, saturado, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Los alquilos de hebra lineal saturado representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, ter-butilo, isopentilo, y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares.

"Alquenilo" significa un alquilo, como se define en lo anterior, que contiene por lo menos un enlace doble entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen isómeros cis y trans. Los alquenilos de hebra lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, y similares.

"Alquinilo" significa cualquier alquilo o alquenilo, como se define en lo anterior, el cual adicionalmente contiene por lo menos un enlace triple entre carbonos adyacentes. Los alquinilos de hebra lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metilo-l butinilo y similares.

"Acilo" significa cualquier alquilo, alquenilo, o alquinilo en donde el carbono en el punto de unión está sustituido con un grupo oxo, como se define en lo siguiente. Por ejemplo, -C (=0) alquilo, -C (=0) alquenilo y -C (=0) alquinilo son grupos acilo.

"Heterociclo" significa un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros monocíclico o bicíclico de 7 a 10 miembros el cual está saturado, insaturado o aromático y el cual contiene uno o dos heteroátomos que se seleccionan independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre y en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden estar oxidados y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede estar cuaternizado, que incluye anillos bicíclicos en los cuales cualquiera de los heterociclos anteriores está fusionado a un anillo benceno. El heterociclo se puede unir por medio de cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se definen más adelante. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo , hidantoinilo, valerolactamilo , oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo , tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo , tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.

Los términos "alquilo opcionalmente sustituido", "alquenilo opcionalmente sustituido", "alquinilo opcionalmente sustituido", "acilo opcionalmente sustituido" y "heterociclo opcionalmente sustituido" significa que, cuando están sustituidos, por lo menos un átomo de hidrógeno está sustituido con un sustituyente . En caso de un sustituyente oxo (=0) se sustituyen dos átomos de hidrógeno. A este respecto, los sustituyentes incluyen oxo, halógeno, heterociclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry, -NRxS02Ry, -C(=0)Rx, -C(=0)0Rx, -C(=0)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy, en donde n es 0, 1 o 2, Rx y Ry son iguales o diferentes e independientemente son hidrógeno, alquilo o heterociclo, y cada uno de los sustituyentes alquilo y heterociclo puede estar sustituido adicionalmente con uno o más de oxo, halógeno, -OH, -CN, alquilo, -ORx, heterociclo, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry, -NRxS02Ry, -C(=0)Rx, -C(=0)ORx, -C(=0)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy.

"Halógeno" significa fluoro, cloro, bromo y yodo.

En algunas modalidades, los métodos de la invención pueden requerir el uso de grupos protectores. La metodología del grupo protector es bien conocida por los expertos en el ámbito (véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley- Interscience , New York City, 1999) . Brevemente, los grupos protectores dentro del contexto de esta invención son cualquier grupo que reduce o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional. Un grupo protector se puede agregar a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante ciertas reacciones y después puede ser retirado para mostrar el grupo funcional original. En algunas modalidades se utiliza un "grupo protector de alcohol". Un "grupo protector de alcohol" es cualquier grupo que disminuye o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional alcohol. Se pueden agregar grupos protectores y se pueden remover utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito.

Síntesis de la fórmula A En algunas modalidades, las partículas de ácido nucleico- lípido de la invención se formulan utilizando lípido catiónico de fórmula A en donde Rl y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno opcionalmente puede estar sustituido y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 se pueden tomar juntos para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, el lípido catiónico es XTC (2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetilo- [1 , 3 ] -dioxolano) . En general, un lípido de fórmula A anterior se puede elaborar mediante los siguientes esquemas de reacción 1 o 2, en donde todos los sustituyentes son como se define en lo anterior a menos que se indique en otro sentido.

ESQUEMA DE REACCION 1 do A, en donde Rl y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, pueden estar cada uno opcionalmente sustituidos, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 se pueden tomar juntos para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. Se pueden preparar de acuerdo con el esquema de reacción 1. La cetona 1 y el bromuro 2 se pueden adquirir o se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. La reacción de 1 y 2 proporcionan cetal 3. El tratamiento del cetal 3 con la amina 4 proporciona lípidos de fórmula A. Los lípidos de fórmula A se pueden convertir en la sal de amonio correspondiente con una sal orgánica de fórmula V, en donde X es un contraión aniónico que se selecciona de halógeno, hidróxido, fosfato, sulfato o similares.

ESQUEMA DE REACCION 2 De manera alternativa, el material inicial cetona 1 se puede preparar de acuerdo con el esquema de reacción 2. El reactivo de Grignard y el cianuro 7 se pueden comprar o se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos habitualmente expertos en el ámbito. La reacción de 6 y 7 proporcionan la cetona 1. La conversión de la cetona 1 a los lípidos correspondientes de fórmula A es como se describe en el esquema de reacción 1.

Síntesis de MC3 Preparación de DLin-M-C3 -DMA (es decir, 4-(dimetilamino) butanoato) de (6Z, 9Z, 28Z, 31Z) -heptatriaconta-6 , 9 , 28 , 31-tetraen-19- ilo . Una solución de clorhidrato del ácido (6Z,9Z,28Z,31Z) -heptatriaconta- 6 , 9,28, 31-tetraen-19-ol (0.53 g) , 4-N,N-dimetilaminobutírico (0.51 g) , en 0.61 g de 4 -N, N-dimetilaminopiridin y 0.53 g de clorhidrato de 1-etil - 3 -( 3 -dimetilaminopropil ) carbodiimida en 5 mi de diclorometano se agita a temperatura ambiente durante la noche. La solución se lava con ácido clorhídrico diluido seguido por bicarbonato de sodio acuoso diluido. Las fracciones orgánicas se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y el solvente se separa en un evaporador giratorio, el residuo se hace pasar descendiendo por 20 g de una columna de gel de sílice utilizando un gradiente de elución de metal/diclorometano 1-5%. Las fracciones que contienen el producto purificado se combinan y el disolvente se separa, lo que proporciona 0.54 g de un aceite incoloro.

Síntesis de ALNY-100 Síntesis del cetal 519 [ALNY-100] se realiza utilizando el siguiente esquema de reacción.

ESQUEMA DE REACCION 3 Síntesis de 515 A una suspensión agitada de LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 moles) en 200 mi de THF anhidro en un matraz de fondo redondo de dos cuellos de 1 1 se agrega una solución de 514 (10 g, 0.04926 moles) en 70 mi de THF lentamente a 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de adición completa, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente y después se calienta a reflujo durante 4 h. El avance de la reacción se monitorea por CCD. Después de completar la reacción (determinado por CCD) la mezcla se enfría a 0°C y se suspende con la adición cuidadosa de una solución saturada de Na2S04. La mezcla de reacción se agita durante 4 h a temperatura ambiente y se separa por filtración. El residuo se lava bien con THF. El filtrado y los lavados se mezclan y diluyen con 400 mi de dioxano y 26 mi de HCl concentrado y se agita durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las fracciones volátiles se separan por depuración bajo vacío para suministrar la sal clorhidrato de 515 como un sólido blanco. Rendimiento: 7.12 g RMN 1H (DMSO, 400MHz) : d = 9.34 (amplio, 2H) , 5.68 (s, 2H) , 3.74 (m, 1H) , 2.66-2.60 (m, 2H) , 2.50-2.45 (m, 5H) .

Síntesis de 516 A una solución agitada del compuesto 515 en 100 mi de DCM seca en un matraz de fondo redondo de dos cuellos 250 mi se agrega NEt3 (37.2 mi, 0.2669 moles) y se enfría a 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de una adición lenta de N- (benciloxi-carboniloxi) -succinimida (20 g, 0.08007 moles) en 50 mi de DCM seco se permite que la mezcla de reacción se caliente a temperatura ambiente. Después de completado de la reacción (2-3 horas por CCD) la mezcla se lava sucesivamente con una solución de HCl 1 1 (1 x 100 mi) y una solución de NaHC03 saturada (1 x 50 mi) . La capa orgánica después se seca sobre Na2S04 anhidro y el disolvente se evapora para proporcionar el material crudo el cual se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 516 como una masa pegajosa. Rendimiento: 11 g (89%). RMN ?? (CDC13, 400MHz): d = 7.36-7.27 (m, 5H) , 5.69 (s, 2H) , 5.12 (s, 2H) , 4.96 (amplio, 1H) 2.74 (s, 3H) , 2.60 (m, 2H) , 2.30-2.25(m, 2H) . CL-EM [M+H] -232.3 (96.94%) .

Síntesis de 517? y 517B El ciclopenteno 516 (5 g, 0.02164 moles) se disuelve en una solución de 220 mi de acetona y agua (10:1) en un matraz de fondo redondo de 500 mi de un solo cuello al cual se agrega N-metilmorfolina-N-óxido (7.6 g, 0.06492 moles) seguido por 4.2 mi de una solución 7.6% de Os04 (0.275 g, 0.00108 moles) en ter-butanol a temperatura ambiente. Después de completar la reacción (~ 3 h) , la mezcla se suspende con la adición de Na2S03 sólido y la mezcla resultante se agita durante 1.5 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con 300 mi de DCM y se lava con aguan (2 x 100 mi) seguido por una solución saturada de NaHC03 (1 x 50 mi) , agua (1 x 30 mi) y finalmente con salmuera (1 x 50 mi) . La fase orgánica se seca sobre Na2S04 y el solvente se separa al vacío. La purificación cromatográfica en columna de gel de sílice del material crudo proporciona una mezcla de diastereoisómeros los cuales se separan por CLAP preparativa. Rendimiento: 6 g crudo. 517A - Pico - 1 (sólido blanco), 5.13 g (96%). RMN XH (DMSO, 400MHz) : d = 7.39-7.31 (m, 5H) , 5.04 (s, 2H) , 4.78-4.73 (m, 1H) , 4.48-4.47 (d, 2H) , 3.94-3.93 (m, 2H) , 2.71 (s, 3H) , 1.72- 1.67 (m, 4H) . CL-EM - [M+H] -266.3, [M+NH4 +] -283.5 presente, CLAR-97.86%. estereoquímica confirmada por rayos X.

Síntesis de 518 Utilizando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 505, se obtiene el compuesto 518 (1.2 g, 41%) como un aceite incoloro. RMN 1H (CDC13, 400MHz) : d = 7.35-7.33 (m, 4H) , 7.30-7.27 (m, 1H) , 5.37-5.27 (m, 8H) , 5.12 (s, 2H) , 4.75 (m, 1H) , 4.58-4.57 (m,2H) , 2.78-2.74 (m,7H) , 2.06-2.00 (m, 8H) , 1.96-1.91 (m, 2H) , 1.62 (m, 4H) , 1.48 (m, 2H) , 1.37-1.25 (m amplio, 36H) , 0.87 (m, 6H) . CLAR-98.65%.

Procedimiento general para la Síntesis del compuesto 519 Una solución de 1 equivalente del compuesto 518 en 15 mi de hexano se agrega a gotas a una solución enfriada con hielo de LAH en THF (1 M, 2 equivalentes) . Después de adición completa, la mezcla se calienta a 40°C durante 0.5 h y después se enfría nuevamente en un baño con hielo. La mezcla se hidroliza cuidadosamente con Na2S04 acuoso saturado y se filtra después a través de Celite y se reduce a un aceite. La cromatografía en columna proporciona 519 puro (1.3 g, 68%) el cual se obtiene como un aceite incoloro. RMN 13C d = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3) , 29.3 (x2), 27.2 (x3) , 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; Electroaspersion EM (+ve) : Peso molecular para C44H80NO2 (M + H) + Calculado 654.6, Encontrado 654.6.

Se preparan formulaciones ya sea por el método estándar o libre de extrusión que puede ser caracterizado de manera similar. Por ejemplo, las formulaciones típicamente se caracterizan por inspección visual. Deben ser soluciones translúcidas blancuzcas libres de los agregados o sedimentos. El tamaño de partícula y la distribución de tamaño de partícula de los lípidos-nanopartículas se puede medir por dispersión de luz utilizando, por ejemplo, el equipo Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA) . Las partículas deben tener un tamaño de aproximadamente 20-300 nm, por ejemplo 40-100 nm. La distribución de tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración de ARNds total en la formulación así como la fracción atrapada se calcula utilizando un análisis de exclusión de colorante. Una muestra del ARNds formulado se puede incubar con un colorante que une ARN tal como Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo que rompe la formulación, por ejemplo Triton-X100 0.5%. El ARNds total en la formulación se puede determinar por la señal a partir de la muestra que contiene el tensioactivo, en relación a una curva estándar. La fracción atrapada se determina al restar el contenido de ARNds "libre" (medido por Ia señal en ausencia de tensioactivos) a partir del contenido de ARNds total. El ARNds atrapado típicamente es >85%. Para una formulación de SNALP el tamaño de partícula es de por lo menos 30 nm, por lo menos 40 nm, por lo menos 50 nm, por lo menos 60 nm, por lo menos 70 nm, por lo menos 80 nm, por lo menos 90 nm, por lo menos 100 nm, por lo menos 110 · nm y por lo menos 120 nm. El intervalo adecuado típicamente es de por lo menos aproximadamente 50 nm a aproximadamente por lo menos 110 nm, aproximadamente por lo menos 60 nm a aproximadamente por lo menos 100 nm, o aproximadamente por lo menos 80 nm a aproximadamente 90 nm.

Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, microparticulados , nanoparticulados , suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquitos, tabletas o minitabletas . Pueden ser deseables espesantes, agentes saborizantes , diluyentes, emulsificantes , auxiliares de suministro o aglutinantes. En algunas modalidades las formulaciones orales son aquellas en las cuales los AR ds objeto de la invención se administran junto con uno o más tensioactivos mej oradores de penetración y quelantes . Los tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos biliares/sales adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA) , ácido cólico, ácido dehidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glucodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24 , 25 -dihidro- fusidato de sodio y glucodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido laúrico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido . linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina , un acilcolina o un monoglicérido como un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (por ejemplo, sodio) . En algunas modalidades, se utilizan combinaciones de mejoradores de penetración, por ejemplo ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación ejemplar es la sal de sodio del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los mejoradores de penetración adicionales incluyen polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetiléter . Los AR ds objeto de la invención se pueden suministrar oralmente, en forma granular que incluye partículas secadas por aspersión o formando complejos con micro o nanopartículas . Los agentes formadores de complejo de ARNds incluyen poli -aminoácidos ; poliiminas; poliacrilatos ; acrilatos de polialquilo, polioxetanos , cianoacrilatos de polialquilo; gelatinas cationizadas , albúminas, almidones, acrilatos polietilenglicoles (PEG) y almidones; cianoacrilatos de polialquilo; poliiminas derivatizadas con DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Los agentes formadores de complejo adecuados incluyen quitosana, N-trimetilquitosana poli -L-lisina , polihistidina, poliornitina, poliesperminas , protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminostireno (por ejemplo p-amino) , poli (cianoacrilato de metilo), poli (cianoacrilato de etilo), poli (cianoacrilato de butilo), poli (cianoacrilato de isobutilo) , poli (cianoacrilato de isohexilo) , DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano , acrilato de polimetilo, acrilato de polihexilo, poli (ácido D, L-láctico) , poli (ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA) , alginato y polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones orales para AR ds y su preparación se describen con detalle en la patente de E.U.A. 6,887,906, publicación de E.U.A. número 20030027780 la patente de E.U.A. número 6,747,014, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimal (dentro del cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles las cuales también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a mej oradores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una diversidad de componentes que incluyen, pero que no se limitan a líquidos preformados, sólidos o autoemulsificantes o semisólidos autoemulsificantes . Se prefieren particularmente las formulaciones que tienen como objetivo el hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como carcinoma hepático.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención las cuales convenientemente se pueden presentar en forma de dosificación unitaria se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Estas técnicas incluyen la etapa de colocar en asociación los ingredientes activos con uno o varios portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan al colocar de manera uniforme e íntima en asociación los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y después, si es necesario, conformar el producto.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o medios mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que incrementan la viscosidad de la solución que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes .

C. Formulaciones Adicionales i. Emulsiones Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones típicamente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersable en otro en forma de gotitas que habitualmente exceden un diámetro de 0. ?µp? (véase por ejemplo Ansel 1 s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG. , and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.) , New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi efc al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa . , 1985, p. 301) . Las emulsiones con frecuencia son sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas íntimamente y dispersadas una dentro de la otra. En general, las emulsiones pueden ser ya sea de la variedad agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) . Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa como gotitas minúsculas sobre una fase oleosa a granel, la composición resultante se denomina una emulsión agua en aceite (w/o) . De manera alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa en gotitas minúsculas dentro de una fase acuosa a granel la composición resultante se denomina en una emulsión aceite en agua (o/w) . Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo el cual puede presentarse como una solución ya sea en fase acuosa, en fase oleosa o en si misma como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsificantes , estabilizantes, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones según se necesite. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que están comprendidas de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w) . Las formulaciones complejas con frecuencia proporcionan ciertas ventajas que las simples emulsiones binarias no proporcionen. Las emulsiones múltiples en las cuales las gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran a gotas de agua pequeñas constituyen una emulsión w/o/w. De igual manera, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizadas en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.

Las emulsiones son caracterizadas por poca o nula estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersada o discontinua de la emulsión está bien dispersada dentro de la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de medios de emulsificantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como en el caso de bases de ungüento de estilo de emulsión y cremas. Otros medios para estabilizar emulsiones implica el uso de emulsificantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsificantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: tensioact ivos sintéticos, emulsificantes que se encuentran de modo natural, bases de absorción y sólidos dispersados finamente (véase por ejemplo Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed. ) , New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199) .

Los tensioact ivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la literatura (véase, por ejemplo Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG . , and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed. ) , New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199). Los tensioactivos típicamente son anfifílicos y comprenden una porción hidrofílica y una hidrofóbica. La relación de la naturaleza hidrofílica respecto a la hidrofóbica del tensioactivo se ha denominado como el balance hidrofílico/lipofílico (HLB) y es una herramienta útil para clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases en base en la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (véase, por ejemplo Ansel ' s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG. , and Ansel HC. , 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1 , p . 285 ) .

Los emulsificantes que se encuentran de manera natural utilizados en las formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma acacia.

Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas de manera que pueden remojarse en agua para formar emulsiones w/o y aún así retener sus consistencias semisólidas tales como lanolina anhidra y petrolato hidrofílico. Los sólidos finamente divididos también se han utilizado como buenos emulsif icantes especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estas incluyen sólidos inorgánicos polares tales como hidróxidos de metal pesado, arcillas que no se expanden tales como bentonita, atapulgita, hectorita, kaolín, montmorillonita , silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbono o triestearato de glicerilo.

Una gran variedad de materiales no emulsificantes también se incluyen en las formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, esteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos , conservadores y antioxidantes (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms , Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199) .

Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas como se encuentran de manera natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma acacia, agar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma de karaya y tragacanto) , derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo) . Estos se dispersan o expanden en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan emulsiones para formar películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas en fase dispersada y al incrementar la viscosidad de la fase externa.

Puesto que las emulsiones con frecuencia contienen varios ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteróles y fosfátidos que pueden soportar fácilmente el crecimiento de los microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservadores. Los conservadores utilizados habitualmente incluidos en las formulaciones emulsiones incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico y ácido bórico. Los antioxidantes también se agregan habitualmente a las formulaciones de emulsiones para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferóles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio y sinergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina .

La aplicación de formulaciones de emulsión por medio de vía dermatológica, oral y parenteral y métodos para su manufactura se han revisado en la literatura (véase, por ejemplo Ansel 1 s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG. , and Ansel HC. , 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed. ) , New York, NY; Idson, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Las formulaciones de emulsión para suministro oral se han utilizado ampliamente debido a la facilidad de formulación así como la eficacia a partir del punto de vista de absorción y biodisponibilidad (véase, por ejemplo Ansel ' s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199) . Los laxantes de base en aceite mineral, las vitaminas liposolubles y las preparaciones nutritivas altas en grasas están entre los materiales que comúnmente han sido administrados oralmente como emulsiones o/w. ii. Microemulsion.es En una modalidad de la presente invención las composiciones de AR i y los ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones . Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y un amfifilo el cual es una solución líquida isotrópica ópticamente única y termodinámicamente estable (véase, por ejemplo, Ansel 1 s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG., and Ansel HC. , 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Típicamente las microemulsiones son sistemas que se preparan al primero dispersar un aceite en una solución tensioactiva acuosa y después agregar una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de hebra intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones isotrópicamente claras, termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles que son estabilizados por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung and Shah, in: Controlled Reléase of Drugs : Polyimers and Agrégate Systems, Rosoff, M . , Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215) . Las microemulsiones comúnmente se preparan por medio de una combinación de tres a cinco componentes que incluye aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Cuando la microemulsión es del tipo agua en aceite ( /o) o aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y tensioactivo utilizados y de la estructura y empacado geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburos de las moléculas de tensioactivo (Schott, in Remington 1 s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co . , Easton, Pa . , 1985, p. 271) .

El enfoque fenomenológico utilizando diagramas de fase ha sido estudiado ampliamente y ha proporcionado un conocimiento exhaustivo para los expertos en el ámbito de la manera en que se deben formular microemulsiones (véase, por ejemplo Ansel 1 s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV. , Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed. ) , New York, NY; Rosoff , in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). En comparación con emulsiones convencionales, las microemulsiones proporcionan la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.

Los tensioactivos utilizados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, brij 96, polioxietileno oleilétres, ásteres de ácido graso de poliglicerol , monolaurato de tetraglicerol (ML310) , monooleato de tetraglicerol (MO310) , monooleato hexaglicerol (PO310) , pentaoleato de hexaglicerol (PO500) , monocaprato de decaglicerol (MCA750) , monooleato de decaglicerol (MO750) , sequioleato de decaglicerol (SO750) , decaoleato de decaglicerol (DAO750) , solos o en combinación con cotensioactivos . El cotensioactivo, habitualmente un alcohol de hebra corta tal como etanol, 1 -propanol y 1-butanol, sirve para incrementar la fluidez interfacial al penetrar dentro de la película de tensioactivo y en consecuencia generar una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. No obstante, las microemulsiones se pueden preparar si el uso de cotensioactivos y se conocen en el ámbito sistemas de microemulsión autoemulsificantes sin alcohol. La fase acuosa típicamente puede ser, pero no se limita a agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles , propilenglicoles y derivados de etilenglicol . La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MC , esteres de ácido graso, mono, di y tri -glicéridos de hebra media (de 8 a 12 átomos de carbono) , ésteres de ácido graso de glicérido polioxietilados , alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados , glicéridos de 8 a 10 átomos de carbono poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceites de silicona.

Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de solubilización de un fármaco y la absorción mejorada de fármacos. Se han propuesto las microemulsiones basadas en lípidos (tanto o/w como w/o para incrementar la biodisponibilidad oral de fármacos, que incluyen péptidos (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp . Clin. Pharmacol . , 1993, 13, 205) . Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilización mejorada de fármaco, protección del fármaco de la hidrólisis enzimática, posible mejoramiento de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por tensioactivo en la fluidez de membrana y permeabilidad, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y toxicidad disminuida (véanse,, por ejemplo las patentes de E.U.A. números 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci . , 1996, 85, 138- 143) . Frecuentemente las emulsiones se pueden formar espontáneamente con sus componentes y se unen a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formula fármacos, péptidos o ARNi termolábiles . Las microemulsiones también han sido eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsion de la presente invención facilitará la absorción sistémica aumentada de los ARNi y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal así como mejoramiento de la captación celular local de los ARNi y los ácidos nucleicos. Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3) , Labrasol y me oradores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para incrementar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente invención. Los mejoradores de penetración utilizados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar que pertenecen a una de cinco categorías amplias tensioactivos , ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92) . Cada una de estas clases se ha discutido en lo anterior. iii. Micropartículas Un agente de interferencia de ARN; de la invención se puede incorporar en una partícula, por ejemplo, una micropartícula . Las micropartículas se pueden producir por secado por aspersión pero también se pueden producir por otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado en lecho fluido, secado al vacío o una combinación de estas técnicas . iv. Mejoradores de penetración En una modalidad, la presente invención utiliza diversos mej oradores de penetración para llevar a cabo el suministro eficiente de ácidos nucleicos, particularmente los ARNi , a la piel de los animales. La mayor parte de los fármacos están presentes en solución tanto en formas ionizada como no ionizada. No obstante, habitualmente solo los fármacos solubles en lípidos o lipofílicos atraviesan fácilmente las membranas de las células. Se ha descubierto que incluso fármacos no lipofílicos pueden atravesar las membranas de las células si la membrana que se va a atravesar es tratada con un mej orador de penetración. Además de ayudar en la difusión de los fármacos no lipofílicos a través de las membranas de las células, los mej oradores de penetración también incrementan la permeabilidad de fármacos lipofílicos.

Los mej oradores de penetración pueden clasificarse que pertenecen a uno de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos , ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, Y, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) . Cada una de la clases mencionadas en lo anterior de mej oradores de penetración se describen a continuación con mayor detalle.

Los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que la absorción de los ARNi a través de la mucosa se incrementa. Además de las sales biliares y ácidos grasos, estos mej oradores de penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietileno- 9-lauriléter y polioxetileno-20-cetiléter (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol . , 1988, 40, 252).

Diversos ácidos grasos y sus derivados los cuales actúan como mejoradores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n- decanoico) , ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol) , dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, l-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas , acilcolinas, ésteres de alquilo de 1 a 20 átomos de carbono de los mismos (por ejemplo metilo, isopropilo y terbutilo) y mono- y di -glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.), (véase, por ejemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol . , 1992, 44, 651-654).

El papel fisiológico de la bilis incluye facilitación de la dispersión y adsorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, Y, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , 9th Ed. , Hardman et al. Eds . , McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935) . Diversas sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como mejoradores de penetración. De esta manera, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes como se encuentran de manera natural de bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio) , ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio) , ácido glucólico (glucolato de sodio) , ácido glicólico (glicolato de sodio) , ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio) , ácido taurocólico (taurocolato de sodio) , ácido taurodesoxicólico ( taurodesoxicolato de sodio) , ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio) , ácido ursodesoxicólico (UDCA) , tauro-24 , 25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF) , glucodihidrofusidato de sodio y polioxietileno-9-lauriléter (POE) (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceut ical Sciences, 18th Ed. , Gennaro, ed. , Mack Publishing Co . , Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583) .

Los agentes quelantes, como se utilizan en relación con la presente invención, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la solución al formar complejos con los mismos, con el resultado de que la absorción de los ARNi a través de la mucosa se incrementa. Con respecto a su uso como mej oradores de penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja agregada de servir también como inhibidores de desoxirribonucleasa, dado que la mayor parte de las ácido desoxirribonucleasas caracterizadas requieren un ion de metal divalente para catálisis y por lo tanto son inhibidos por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr. , 1993, 618, 315-339) . Los agentes quelantes adecuados incluyen pero no se limitan a etilendiaminotetraacetato de sodio (EDTA) , ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato) , derivados de N-acilo de colágeno, laureth-9 y derivados de N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (véase, por ejemplo, atdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical , biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Pa9e 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Reí., 1990, 14, 43-51) .

Como se utiliza en la presente, los compuestos me oradores de penetración no quelantes y no tensioactivos se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como . tensioactivos pero que no obstante incrementan la absorción de los ARNi a través de la mucosa alimentaria (véase, por ejemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33) . Esta clase de mejoradores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco de sodio, indometacina y fenilobutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol . , 1987, 39, 621-626) .

Los agentes que incrementan la captación de los ARNi a nivel celular también se pueden agregar a las composiciones farmacéuticas y otras de la presente invención. Por ejemplo, los lípidos catiónicos tales como lipofectina (Junichi et al, Patente de E.U.A. número 5,705,188), los derivados de glicerol catiónicos y las moléculas policatiónicas tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731) , también se sabe que incrementan la captación celular de los ARNds. Los ejemplos de reactivos de transfección disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, LipofectaminMR ( Invitrogen; Carlsbad, CA) , Lipofectamine 200MR (Invitrogen; Carlsbad, CA) , 293fectiMR (Invitrogen; Carlsbad, CA) , CellfectiMR (Invitrogen; Carlsbad, CA) , DMRIE-C (Invitrogen; Carlsbad, CA) , FreeStileMR MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA) , LipofectamineMR 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA) , Lipofectaminemr (Invitrogen; Carlsbad, CA) , RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA) , OligofectamineMR (Invitrogen; Carlsbad, CA) , OptifectMR (Invitrogen; Carlsbad, CA) , Reactivo de transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), Reactivo de transfección liposómico DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), Reactivo de transfección liposómico DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza), o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo TransíectamMR (Promega; Madison, I), Reactivo de transfección TransFastMR (Promega; Madison, WI) , reactivo TfxMR-20 (Promega; Madison, WI) , reactivo TfxMR-50 (Promega; Madison, WI), DreamFectMR (OZ Biosciences; Marsella, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), Reactivo de transfección TransPassa DI (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA) , LyoVecMR/LipoGenMR (Invitrogen; San Diego, CA, USA), Reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, USA) , Reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), Reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA) , Reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, USA) , Reactivo de transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, USA) , Reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA) , Reactivo de transfección TroganPORTERMR (Genlantis; San Diego, CA, USA) , RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; ountain View, CA, USA) , SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA) , o HiFectMR (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA), entre otros.

Otros agentes pueden ser utilizados para incrementar la penetración de los ácidos nucleicos administrados e incluyen glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol , pirróles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y mentona. v. Portadores Algunas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se utiliza en la presente un "compuesto portador" o "portador" puede hacer referencia a un ácido nucleico o un análogo del mismo el cual es inerte (es decir, no posee actividad biológica por si mismo) pero que se reconoce como un ácido nucleico por procesos in vivo que reduce la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, al degradar el ácido nucleico biológicamente activo o promover su extracción de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de esta última sustancia, puede resultar en una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñon u otros depósitos extracirculatorios , debido probablemente a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNds de fosforotioato parcialmente en tejido hepático se puede reducir cuando se administra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4 ' -isotiociano-estilbeno-2 , 21 -disulfónico (Miyao et al., DsR A Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsR A & Nucí. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183. iv. Excipientes En contraste con un compuesto o portador, un "portador farmacéutico" o "excipiente" es un solvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte que suministre uno o más ácidos nucleicos a un animal . El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera planeada de administración en mente, de manera que proporciona el volumen, consistencia, etc., deseados cuando se combine con el ácido nucleico u otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); materiales de relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina , pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato ácido de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles , benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón y sodio, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc. ) .

Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral los cuales no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos también se pueden utilizar para formular las composiciones de la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las formulaciones para administración tópica de los ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral los cuales reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos se pueden utilizar.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles , gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, diversas parafinas, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares. vii. Otros Componentes Las composiciones de la presente invención adicionalmente pueden contener otros componentes adyuvantes encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en el ámbito. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antipruríticos , astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención tales como colorantes, agentes saborizantes , conservadores, antioxidantes, opacificantes , agentes espesantes y estabilizantes. No obstante, estos materiales, cuando se agregan no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden ser esterilizadas y, si se desea, se puede mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes , sales para alterar la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares las cuales no interactúan de manera perjudicial con uno o varios de los ácidos nucleicos de la formulación.

Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias las cuales incrementan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas objeto de la invención incluyen: (a) uno o más compuestos de AR i, y (b) uno o más agentes los cuales funcionan por un mecanismo diferente de AR y los cuales son útiles para tratar un trastorno del metabolismo de lípidos. Los ejemplos de estos agentes incluyen pero no se limitan a un agente antiinflamatorio, agente anti-esteatosis , agentes antivirales y/o antifibrosis . Además, otras sustancias utilizadas habitualmente para proteger el hígado, tal como silimarina también se pueden utilizar junto con los ARNi descritos en la presente. Otros agentes útiles para tratar enfermedades del hígado incluyen telbivudina, entecavir e inhibidores de proteasa tales como telaprevir y otros descritos, por ejemplo, en Tung et al., publicaciones de solicitudes de E.U.A. números 2005/0148548, 2004/0167116 y 2003/0144217; y en Hale et al., publicación de solicitud de E.U.A. Número 2004/0127488.

La toxicidad y eficacia terapéutica de estos compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos de células o animales de experimentación, por ejemplo al determinar la DL50 (la dosis mortal para 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados .

Los datos obtenidos a partir de los análisis de cultivo de células y los estudios en animales se pueden utilizar para formular una gama de dosificaciones para uso en humanos. La dosificación de las composiciones que aquí se describen en la invención se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos objeto de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente a partir de los análisis de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos en animales para obtener un intervalo de concentración en plasmas circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia objetivo (por ejemplo, al obtener una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba la cual proporciona inhibición semimáxima de los síntomas) determinado en el cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión dosis útiles en humanos. Los líderes en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

Además de su administración, como se describe en lo anterior, los ARNi objeto de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de ANGPTL3. En cualquier caso, el médico que administra puede ajustar la cantidad y sincronización de administración de ARNi en base en los resultados observados utilizando medidas convencionales de eficacia conocidas en el ámbito o que aquí se describen.

VI. METODOS DE LA INVENCION La presente invención también proporciona métodos de uso de ARNi de la invención y/o una composición que contiene un ARNi de la invención para reducir y/o inhibir la expresión de ANGPTL3 en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un ARNds de la invención y mantener la célula durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcrito de ARNm de un gen para ANGPTL3 , y de esta manera inhibir la expresión del gen para ANGPTL3 en la célula. La reducción en la expresión del gen se puede determinar por cualquiera de los métodos conocidos en el ámbito. Por ejemplo, una reducción en la expresión de ANGPTL3 se puede determinar al determinar el nivel de expresión de ARNm de ANGPTL3 utilizando métodos sistemáticos comunes para aquellos habitualmente expertos en el ámbito, por ejemplo, transferencia Northern, qRT-PCR; por determinación del nivel de proteínas de ANGPTL3 utilizando métodos sistemáticos para una persona habitualmente experta en el ámbito tal como Western blot , técnicas inmunológicas . Una reducción en la expresión de ANGPTL3 también se puede determinar indirectamente al medir una disminución en la actividad biológica de ANGPTL3 , por ejemplo, una disminución en el nivel de lípidos en suero, triglicéridos , colesterol y/o ácidos grados libres.

En los métodos de la invención a células se puede poner en contacto in vitro o in vivo, es decir, la célula puede estar dentro de un sujeto.

Una célula adecuada para tratamiento utilizando los métodos de la invención puede ser cualquier célula que exprese un gen para ANGPTL3. Una célula adecuada para uso en los métodos de la invención puede ser una célula de mamífero, por ejemplo una célula de primate (tal como una célula no humana o una célula de un primate no humano, por ejemplo una célula de mono o una célula de chimpancé) , una célula de un animal que no sea un primate (tal como una célula de vaca, una célula dé cerdo, una célula de camello, una célula de llama, una célula de caballo, una célula de chivo, una célula de conejo, una célula de borrego, una célula de hámster, una célula de cobayo, una célula de gato, una célula de perro, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de león, una célula de tigre, una célula de oso o una célula de búfalo) , una célula de ave (por ejemplo, una célula de pato o una célula de ganso) o una célula de ballena. En una modalidad, la célula es una célula humana, por ejemplo célula hepática humana.

La expresión de ANGPTL3 se inhibe en la célula en por lo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o aproximadamente 100%.

Los métodos in vivo de la invención pueden incluir administrar un sujeto una composición que contiene un ARNi, en donde el ARNi incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a por lo menos una parte de un transcrito de ARN del gen para ANGPTL3 del mamífero que va a ser tratado. Cuando el organismo que va a ser tratado es un mamífero tal como un humano, la composición se puede administrar por cualquier método conocido en el ámbito que incluye, pero que no se limita a la vía oral, intraperitoneal o parenteral que incluye la administración intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal) , intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (que incluye bucal y sublingual) .

En algunas modalidades las composiciones se administran por infusión o inyección intravenosa. En algunas modalidades las composiciones se administran por inyección subcutánea .

En algunas modalidades, la administración s por medio de una inyección de depósito. Una inyección de depósito puede liberar el ARNi de una manera consistente durante un período de tiempo prolongado. Así, una inyección de deposición puede reducir la frecuencia de dosificación necesaria para obtener un efecto deseado, por ejemplo una inhibición deseada de ANGPTL3 o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de deposición también puede proporcionar concentraciones en suero más consistentes. Las inyecciones de deposición pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En modalidades preferidas, la inyección de deposición es una inyección subcutánea.

En algunas modalidades, la administración es por medio de una bomba. La bomba puede ser una bomba externa o una bomba implantada quirúrgicamente. En algunas modalidades, la bomba es una bomba osmótica implantada subcutáneamente. En otras modalidades la bomba es una bomba de infusión. Una bomba de infusión se puede utilizar para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales . En modalidades preferidas, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otras modalidades la bomba es una bomba implantada quirúrgicamente que suministra el ARNi al hígado .

El modo de administración se puede seleccionar en base en si se desea tratamiento local o sistémico y basado en el área que va a ser tratada. La vía y sitio de administración se pueden seleccionar para incrementar el direccionamiento .

En un aspecto, la presente invención también proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3 en un mamífero. Los métodos incluyen administrar al mamífero una composición que comprende un ARNds que se dirige a un gen para ANGPTL3 en una célula del mamífero y mantener al mamífero durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcrito de AR m del gen para A GPTL3 , con lo que se inhibe la expresión del gen para ANGPTL3 en la célula. La reducción en la expresión del gen se puede determinar por cualquier método conocido en el ámbito y por métodos, por ejemplo, qRT-PCR, descritos en la presente. La reducción en la producción de proteína se puede determinar por cualquier método conocido en el ámbito y por métodos, por ejemplo, ELISA descritos en la presente. En una modalidad, una muestra de biopsia hepática por punción sirve como el material de te ido para monitorear la reducción de un gen para ANGPTL3 y/o la expresión de proteína.

La presente invención proporciona adicional métodos d<= tratamiento de un sujeto en necesidad del mismo. Los métodos de tratamiento de la invención incluyen administrar un ARNi de la invención a un sujeto, por ejemplo un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de ANGPTL3 , en una cantidad terapéuticamente eficaz de direccionamiento de AR i hacia un gen para ANGPTL3 o una composición farmacéutica que comprende un ARNi dirigido hacia un gen para ANGPTL3.

Un ARNi de la invención se puede administrar como un "ARNi libre". Un ARNi libre se administra en ausencia de una composición farmacéutica. El ARNi desnudo puede estar en una solución amortiguadora adecuada. La solución amortiguadora puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, la solución amortiguadora es una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El pH y la osmolalidad -de la solución amortiguadora que contiene el ARNi se puede ajustar de manera que sea adecuada para administración a un suj eto .

De manera alternativa, un ARNi de la invención se puede administrar como una composición farmacéutica tal como una formulación liposómica de ARNds.

Los sujetos que se beneficiarían de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen para ANGPTL3 son aquellos que presentan un trastorno en el metabolismo de lípidos, por ejemplo un trastorno heredado o metabolismo de lípidos o un trastorno adquirido de metabolismo de lípidos. En una modalidad, un sujeto que presenta un desorden de metabolismo de lípidos presenta hiperlipidemia . En otra modalidad, un sujeto que presenta un trastorno de metabolismo de lípidos tiene hipertrigliceridemia . El tratamiento de un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen para A GPTL3 incluye tratamiento terapéutico (por ejemplo, un sujeto que presenta xantomas eruptivos) y un tratamiento profiláctico (por ejemplo, el sujeto que no tiene xantomas eruptivos o un sujeto que puede estar en riesgo de desarrollar xantomas eruptivos) .

La invención adicionalmente proporciona métodos para el uso de un ARNi o una composición farmacéutica del mismo, por ejemplo, para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción y/o inhibición de expresión de ANGPTL3 , por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno de metabolismo de lípidos, en combinación con otros métodos farmacéuticos y/o terapéuticos conocidos tales como, por ejemplo, aquellos los cuales actualmente se utilizan para el tratamiento de estos trastornos. Por ejemplo, en algunas modalidades, un ARNi dirigido a ANGPTL3 se administra en combinación con, por ejemplo, un agente útil para tratar un trastorno de metabolismo de lípidos como se describe en otra parte en este documento. Por ejemplo, los agentes adicionales adecuados para tratar a un sujeto que se beneficiaría de una reducción en la expresión de ANGPTL3 , por ejemplo un sujeto que presenta un trastorno de metabolismo de lípidos puede incluir agentes que disminuyen uno o más lípidos en suero. Los ejemplos no limitantes de estos agentes pueden incluir inhibidores de síntesis de colesterol tales como inhibidores de HMG-CoA reductasa, por ejemplo, estatinas. Las estatinas pueden incluir atorvastat ina (Lipitor) , fluvastatina (Lescol) , lovastatina (Mevacor) , lovastatina de liberación extendida (Altoprev) , pitavastatina (Livalo) , pravastatina (Pravachol) , rosuvastatina (Crestor) , y simvastatina (Zocor) . Otros agentes útiles en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de lípidos pueden incluir agentes que secuestran bilis, tales como colestiramina y otras resinas; inhibidores de secreción de VLDL tales como niacina; antioxidantess lipofílicos, tales como Probucol ; inhibidores de acil-CoA colesterol aciltransferasa ; antagonistas del receptor de farnesoide X; activadores de proteína de unión reguladora de esterol de separación activante de proteína (SCAP, por sus siglas en inglés) ; inhibidores de proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos (MTP, por sus siglas en inglés) ; péptido relacionado con ApoE; y anticuerpos terapéuticos contra ANGPTL3. Los agentes terapéuticos adicionales también pueden incluir agentes que incrementan lipoproteína de alta densidad (HDL) , tal como inhibidores de proteína de transferencia de colesteriléster (CETP, por sus siglas en inglés) . Además, los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse al mismo tiempo y/o en la misma combinación, por ejemplo, parenteralmente o el agente terapéutico adicional se puede administrar como parte de una composición separada o en momentos separados y/o por otro método conocido en el ámbito o descrito en la presente.

En una modalidad, el método incluye administrar una composición objeto de la presente de manera que la expresión del gen objetivo para ANGPTL3 disminuya, por ejemplo durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32, o aproximadamente 36 horas. En una modalidad, la expresión del gen para A GPTL3 objetivo disminuye por una duración extendida, por ejemplo por lo menos de aproximadamente dos, tres, cuatro días o más, por ejemplo aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas o un período más prolongado.

Preferiblemente, los ARNi útiles para los métodos y composiciones que aquí se describen específicamente los ARN objetivo (primarios o procesados) del gen para ANGPTL3 objetivo.

Las composiciones y métodos para inhibir la expresión de estos genes utilizando los ARNi se pueden preparar y realizar como se describe en la presente.

La administración de ARNds de acuerdo con los métodos de la invención puede resultar en una reducción en la gravedad, signos, síntomas y/o marcadores de estas enfermedades o trastornos en un paciente con un trastorno de metabolismo de lípidos. Por "reducción" en este contexto se quiere indicar una disminución estadísticamente significativa en tal nivel. La reducción puede ser, por ejemplo, de por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% O aproximadamente 100%.

La eficacia del tratamiento o prevención de enfermedad se puede determinar, por ejemplo, al medir el progreso de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, reducción en el dolor, mejoramiento en la calidad de vida, dosis de una medicación requerida para sostener un efecto de tratamiento, nivel de un marcador de enfermedad o cualquier otro parámetro mensurable apropiado para una enfermedad dada que está siendo tratada o que es el objetivo para prevención. Está dentro de la capacidad de una persona experta en el ámbito monitorear la eficacia del tratamiento o prevención al medir cualquiera de estos parámetros o cualquier combinación de parámetros. Por ejemplo, la eficacia de tratamiento de un trastorno del metabolismo de lípidos se puede determinar, por ejemplo, por monitoreo periódico de uno o más niveles de lípidos en suero. Las comparaciones de estas últimas lecturas con las lecturas iniciales proporciona al médico una indicación de si el tratamiento es eficaz. Está dentro de la capacidad de una persona experta en el ámbito monitorear la eficacia del tratamiento o prevención al medir cualquiera de estos parámetros o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un ARNi dirigido a ANGPTL3 o composición farmacéutica del mismo, "eficaz contra" un trastorno del metabolismo de lípidos indica que la administración de una manera clínicamente apropiada resulta en un efecto benéfico para por lo menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tal como una mejoría de síntomas, una cura, una reducción en la enfermedad, extensión de vida, mejora en la calidad de vida, u otro efecto reconocido generalmente como positivo por doctores familiarizados con el tratamiento del trastorno de metabolismo de lípidos y las causas relacionadas.

Un tratamiento de efecto preventivo es evidente cuando existe una mejoría estadísticamente significativa en uno o más parámetros de estado de enfermedad o por una falla en el empeoramiento para desarrollar síntomas que de otra manera habrían sido anticipados. Como un ejemplo, un cambio favorable de por lo menos 10% en un parámetro de enfermedad mensurable y preferiblemente de por lo menos 20%, 30%, 40%, 50% o mayor puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia para un fármaco AR i dado o formulación de ese fármaco también se puede considerar utilizando un modelo animal experimental para la enfermedad dada, como se conoce en el ámbito. Cuando se utiliza un modelo animal experimental, la eficacia de tratamiento, como se vuelve evidente cuando se observa una reducción estadísticamente significativa en un marcador o síntoma.

I De manera alternativa, la eficacia se puede medir por una reducción en la gravedad de la enfermedad determinado por un experto en el ámbito de diagnóstico en base en una escala de graduación de gravedad de enfermedad aceptado clínicamente, como por ejemplo la calificación de Child-Pugh (algunas veces denominada como Child-Turcotte-Pugh) . Cualquier cambio positivo que resulta, por ejemplo, en disminución de la gravedad de la enfermedad medida utilizando la escala apropiada representa tratamiento adecuado utilizando un ARNi o una formulación de ARNi como se describe en la presente .

A los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de AR ds tal como aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0. 01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0. 05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0. 05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0 .1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0 , .1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0 .2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0. .2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0 .3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0. .3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0 .4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0. .4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0 .5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 5.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. aproximadamente 6.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 8.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 9.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg . Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, el ARNds se puede administrar a una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0 .5, 0 .6, 0.7. 0. ¦ 8, 0.9, 1, 1 .1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1 .8 .1.9 , 2, 2. .1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3. 1, 3.2, 3. .3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8. 3.9, 4, 4.1, 4. 2, 4. 3, 4.4, 4 , • 5, 4.6, 4.7, 4.8. 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5. 4, 5. .5, 5.6, 5. ¦ 7, 5.8. 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6. .6, 6. • 7, 6.8, 6 , ¦ 9, 7, 7 .1, 7. ,2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8. 7. 9, 8, 8.1, 8 , .2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8. 8.9, 9, 9. ¦ 1, 9. 2, 9.3, 9, • 4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o aproximadamente 10 mg/kg . Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

En otras modalidades, por ejemplo, cuando una composición de la invención comprende un ARNds como se describe en la presente y una N-acetilgalactosamina , a los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de ARNds, tal como una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamen e 3.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 30 mg/kb, aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3 é aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 e aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kb, aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención.

Por ejemplo, a los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de ARNds tal como aproximadamente 0. • 1, 0 • 2, 0 • 3, 0 • 4, 0.5, 0.6, 0.7. 0.8, 0.9, 1, 1. 1, 1. • 2, 1. .3, 1. 4, 1. 5, 1. i 5, 1.7, 1.8.1.9, 2, 2.1, 2.2, 2 • 3, 2 • 4, 2. • 5, 2. • 6, 2 • 7, 2 .8. 2 -9, 3, 3.1, 3.2, 3 .3, 3.4, 3. 5, 3. 6, 3. .7, 3. .8. 3. 9, 4, 4. ¦ 1, 4. 2, 4.3, 4.4, 4.5 , 4.6, 4.7, 4. 8. 4. 9, 5, 5. • 1, 5 • 2, 5 ¦ 3, 5 -4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8. 5,9, 6, 6. 1, 6. • 2, 6. ¦ 3, 6 • 4, 6 •5, 6 •6, 6.7, 6.8. 6.9, 7, 7.1, 7. 2, 7. 3, 7. .4, 7 , .5, 7 • 6, 7 • 7, 7 .8. 7.9, 8, 8.1, 8 .2, 8.3, 8. 4, 8. 5, 8. • 6, 8. 7, 8 .8. 8 •9, 9 5.1, 9.2, 9.3, 9 .4, 9.5, 9. 6, 9. 7, 9. .8. 9.9, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios a los valores mencionados también se pretende que sean parte de esta invención .

El ARNi se puede administrar por infusión intravenosa durante un período de tiempo, por ejemplo durante un período de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o aproximadamente a 25 minutos. La administración se puede repetir, por ejemplo en una base regular, por ejemplo cada quince días (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o un período más prolongado. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar en una base menos frecuente. Por ejemplo, después de administración cada quince días durante tres meses, se puede repetir la administración una vez al mes, durante seis meses o un año o un período más prolongado. La administración del ARNi puede reducir los niveles de A GPTL3 , por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimiento del paciente en por lo menos aproximadamente 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o por lo menos aproximadamente 99% o mayor.

Antes de la administración de una dosis completa del ARNi a los pacientes se les puede administrar una dosis más pequeña, por ejemplo una reacción de infusión 5% y se puede monitorear en búsqueda de efectos adversos tal como una reacción alérgica. En otro ejemplo, al paciente se le puede monitorear por efectos inmunoestimuladores no deseados tal como niveles aumentados de citocina (por ejemplo, TNF-alfa o INF-alfa) .

De manera alternativa, el ARNi se puede administrar por vía subcutánea, es decir, por inyección subcutánea. Se pueden utilizar una o más inyecciones para suministrar la dosis diaria deseada de ARNi a un sujeto. Las inyecciones se pueden repetir durante un período de tiempo, tal como durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 días. La administración se puede repetir, por ejemplo, en una base regular, por ejemplo cada quince días (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o un período más prolongado. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar en una base menos frecuente. En algunas modalidades, una dosis única de ARNi es seguida por dosificación mensual. En algunas modalidades la dosificación puede comprender una fase de cargado de dosis múltiples en días consecutivos.

A menos que se defina en otro sentido, todos los términos técnicas y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado al entendido habitualmente por una persona habitualmente experta en el ámbito a la cual pertenece la invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen se pueden utilizar en la práctica o prueba de los ARNi y métodos objeto de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen en lo siguiente. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto prevalecerá la presente especificación, incluyendo definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. SINTESIS DE ARNi Fuente de reactivos Cuando la fuente de un reactivo no se proporciona específicamente en la presente, el reactivo se puede obtener de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con una calidad/pureza habitual para aplicación en biología molecular .

Transcriptos El diseño de ARNsi se llevó a cabo para identificar a los ARNsi objetivo para el transcripto para ANGPTL3 humano anotado en la base de datos NCBI de gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) y un transcripto de ANGPTL3 de macaco (Macaca fascicularis ; en lo siguiente "macaco") producido por medio de secuenciado de ADNc preparado a partir de ARN de hígado. El secuenciado de ARNm para ANGPLT3 de macaco se realizó dentro del laboratorio y la secuencia de ARNm se muestra en la SEC ID NO : 9. el diseño utilizado para los siguientes transcriptos a partir de la colección NCBI: humano NM_014495.2 (SEC ID N0:1); de ratón - NM_013913.3 (SEC ID NO: 2) . Todos los ARNsi dúplex se diseñaron para compartir 100% de identidad cuando se enumeran transcriptos humanos y de macaco. Un subconjunto de los dúplex de ARNsi , descrito más adelante, también comparte 100% de identidad con el transcripto de ANGPTL3 de ratón (Mus musculüs) encontrado en Ia base de datos NCBI de gen.

Diseño de ARNsi, especificidad y predicción de eficacia La especificidad predicha de todos los posibles conjuntos de 19 unidades se predicen a partir de cada secuencia. Los bloques de 19 unidades candidatos después se seleccionan para que carezcan de secuencia repetidas más grandes de 7 nucleótidos. Estos 977 ARNsi de humano/macaco candidatos y un subconjunto de 38 que también coinciden de ratón ("los ARNsi candidatos de humano/macaco/ratón") se utilizaron después en una búsqueda extensa contra un transcriptoma humano (definido como el conjunto de NM_y XM_registros dentro del conjunto Refseq NCBI humano) utilizando el algoritmo exhaustivo "fuerza bruta" implementado por el programa pitón "BruteForce . py" . El programa después realiza un análisis sintáctico de las alineaciones transcripto-oligo para generar una calificación en base en la posición y números de varios apareamientos incompletos entre el ARNsi y cualquier transcripto potencial "fuera de objetivo". La calificación fuera de objetivo se pondera para enfatizar diferencias en la región "de siembra" de los ARNsi, en las posiciones 2 a 9 del extremo 5' de la molécula. Cada par oligo-transcripto a partir de la búsqueda a fuerza bruta se le proporciona una calificación de apareamiento erróneo al sumar las calificaciones de apareamientos erróneos individuales; los apareamientos erróneos en las posiciones 2 a 9 se cuentan como 2.8, los errores de apareamiento en las posiciones de sitio de separación 10 a 11 se cuentan como 1.2 y los apareamientos incompletos en la región 12 a 19 se cuentan como 1.0. Se lleva a cabo una predicción fuera de objetivo adicional al comparar la frecuencia de heptámeros y octómeros derivados de 3 hexámeros derivados se semilla distintos de cada oligonucleótido . Los hexámeros de las posiciones 2 a 7 en relación al inicio 5' se utilizan para crear dos heptámeros y un octómero. Se genera "heptámero 1" al agregar un A 3' al hexámero; se genera el "heptámero 2" al agregar un A 5' a un hexámero; se genera un octómero al agregar un A tanto en los extremos 5' como 3' del hexámero. La frecuencia de octómeros y heptámeros en el UTRoma 3' humano (definido como la secuencia del transcriptoma a partir de la base de datos NCBI Refseq en donde el extremo de la región codificante de los "CDS" se define claramente) se calculó previamente. La frecuencia de octómeros se normalizó a la frecuencia de heptámero utilizando la mediana de valor para el intervalo de frecuencias de octómero. Después se calculó "mirSeedScore" al calcular la suma de ( (3 X cuenta de octómero normalizada) + (2 X cuenta de heptámero 2) + (I X cuenta de heptámero 1) ) .

Ambas hebras de ARNsi se asignaron a una categoría de especificidad de acuerdo con las calificaciones calculadas: una calificación superior a 3 califica como altamente específico, igual a 3 como específico y entre 2.2 y 2.8 como moderadamente específico. La clasificación se llevó a cabo por la especificidad de la hebra antisentido. Los dúplex después se seleccionaron a partir del conjunto humano/macaco con oligonucleótidos antisentido que carecen de coincidencias de siembra AR mi , calificaciones de 3 o mejores, menores de 65% de contenido GC total, sin GC en la primera posición, 4 o más Us o As en la región de siembra y GC en la décimo novena posición. Los dúplex del conjunto humano/macaco/ratón con oligonucleótidos antisentido que presentaban calificaciones de 2 o mejores, menores de 65% en su contenido total de GC y sin GC en la primera posición también se seleccionaron.

Selección de secuencia ARNsi Un total de 47 oligonucleótidos de ARNsi directos y 47 antisentido del conjunto humano/macaco se sintetizaron y conformaron en dúplex. Un total de 15 directos y 15 antisentido ARNsi derivados del conjunto de humano/macaco/ratón se sintetizaron y se conformaron en dúplex.

Síntesis de secuencias para ANGPTL3 Las secuencias para ANGPTL3 se sintetizaron en un sintetizador MerMade 192 ya sea a escala de 1 ó 0.2 µp??? . Se sintetizaron hebras simples con modificaciones 2'0-metilo para transfección basadas en cribado in vitro. Para uso en los análisis de cribado de captación libre, se elaboraron conjugados 3' GalNAc elaborados con modificaciones químicas 2'F y 2'-0-metilo. En estos diseños, la porción GalNAc se colocó en el extremo 3' de la hebra directa. La secuencia antisentido tiene una longitud de 23 nucleótidos y también contenía modificaciones químicas 2'F y 2'Ometilo con dos enlaces fosforotioato en el extremo 3'.

Sobre un conjunto de hebras únicas de 21 unidades y dúplex se aplicó química "endolight" (luz interior) como se detalla a continuación.

• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra directa se modificaron con nucleótidos 2'-0-metilo (2' O-metilo C y 2'-0-metilo U) • En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes (hacia la posición 5') a ribo A nucleósido se sustituyeron con los nucleósidos 2' -O-metilo correspondientes .

• Una extensión de dos bases dTsdT en el extremo 3 ' de ambas secuencias, directa y antisentido se introdujo.

Para la secuencia de 21 unidades directa conjugada con GalNAc y las secuencias antisentido de 23 unidades complementaria, se sintetizaron hebras únicas modificadas con 2'F y 2'0metilo. La síntesis se realizó en un soporte de CPG modificado con GalNAc para la hebra directa y modificado con CPG con soporte universal para la secuencia antisentido a escala de 1 µp??? . El motivo de secuencias denominado TOFFEE se aplicó en el cual la hebra directa contiene un motivo modificado 2'F de tres nucleótidos en las posiciones 9, 10 y 11 y en el antisentido se incluyó un motivo modificado 2'0metilo incluido en las posiciones 11, 12 y 13.

Síntesis, separación y desprotección La síntesis de las secuencias para ANGPTL3 utilizando síntesis de oligonucleótido de soporte sólido utilizando química de fosforoamidita . Para las secuencias endolight de 21 unidades, se utilizó una CPG de desoxitimidina como el soporte sólido mientras que para los conjugados GalNAc, el soporte sólido de GalNAc para la hebra directa y CPG universal para la hebra antisentido fue lo que se utilizó.

La síntesis de las secuencias anteriores se realizó a escala ya sea de 1 ó 0.2 µp? en placas de 96 pozos. Se prepararon soluciones de amidita a una concentración . de 0.1 M y se utilizó como el activador etiltiotetrazol (0.6 M en acetonitrilo) a una concentración de 0.1 M.

Las secuencias sintetizadas se separaron y desprotegieron en placas de 96 pozos utilizando metilamina en la primera etapa y reactivo de fluoruro en la segunda etapa. Para las secuencias que contienen GalNAc y nucleósido 2'F, se modificaron las condiciones de desprotección. Las secuencias después de separación y desprotección se precipitaron utilizando una mezcla de acetona: etanol (80:20) y los sedimentos se resuspendieron en amortiguador de acetato de sodio 0.2 M. Las muestras de cada secuencia se analizaron por CL-EM para confirmar la identidad, UV para cuantificación y un conjunto seleccionado de muestras por cromatografía IEX para determinar pureza.

Purificación, eliminación de sal y recocido Las secuencias de A GPTL3 se precipitaron y purificaron en un sistema purificador AKTA utilizando una columna Sephadex. La ANGPTL3 se corrió a temperatura ambiente. La inyección y recolección de muestra se realizó en placas de 96 pozos con pozos con una profundidad de 1.8 mi. Se recolectó en el eluyente un pico único que corresponde a la secuencia de longitud completa. Las secuencias de A GPTL3 sin sal se analizaron para concentración (mediante medición UV a A26o) y pureza (por CLAR de intercambio iónico) . Las hebras únicas complementarias después se combinaron en una relación estequiométrica 1:1 para formar hebras dúplex de ARNsi.

EJEMPLO 2. CRIBADO IN VITRO Cultivo celular y transfecciones Se hicieron crecer células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) hasta casi confluencia a 37°C en una atmósfera de C02 5% en RPMI (ATCC) suplementado con FBS 10%, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes de ser liberados de la placa por tripsinización. La transfección se llevó a cabo al agregar 14.8 µ? de Opti-MEM más 0.2 µ? de Lipofectamine R AiMax por pozo (Invitrogen, Carlsbad CA. cat# 13778-150) a 5 µ? de dúplex de ARNsi por pozo en una placa de 96 pozos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después se agregaron a la mezcla de ARNsi 80 µ? de medio de crecimiento completo sin antibiótico que contiene ~ 2 x 104 células Hep3B. Las células se incubaron ya sea por 24 o 120 horas antes de purificación de ARN. Se llevaron a cabo experimentos de dosis única a 10 nM y 0.1 nM de concentración dúplex final y los experimentos dosis-respuesta se llevaron a cabo a 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 y 0.00001 nM de concentración dúplex final a menos que se establezca de otra manera.

Transfección de captación libre Se combinaron 5 µ? de cada ARNsi conjugado GalNac en PBS con 4 X 104 de hepatocitos de macaco crioconservados y recién calentados resuspendidos en 95 µ? de medio In Vitro Qro CP (In Vitro Technologies-Celsis , Baltimore, MD) en cada pozo de una placa de 96 pozos. La mezcla se incubó durante aproximadamente 24 h a 37°C en una atmósfera de C02 5%. Los ARNsi se probaron a concentraciones finales de 500 nM, 100 nM y 10 nM para eficacia en los análisis de captación libre. Para los cribados de dosis-respuesta, las concentraciones de ARNsi finales fueron de 500 nM, 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM y 0.0064 nM .

Aislamiento de ARN total utilizando el kit de aislamiento DYNABEADS mRNA (ÍNVITROGEN, PART #: 610-12) Se cosechan células y se lisan en 150 µ? de amortiguador de lisis/unión y después se mezclan durante 5 minutos a 850 rpm utilizando un equipo Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado es la misma en todo el proceso) . se agregaron a una placa de fondo redondo 10 µ? de esferas magnéticas y 80 µ? de mezcla de amortiguador de lisis/unión y se mezcló durante 1 minuto. Las esferas magnéticas se captaron utilizando una placa magnética y el sobrenadante se separó sin alterar las esferas. Después de quitar el sobrenadante, las células Usadas se agregaron a las esferas remanentes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de quitar el sobrenadante las esferas magnéticas se lavaron dos veces con 150 µ? de amortiguador de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las esferas se captaron nuevamente y se eliminó el. sobrenadante. Las esferas después se lavaron con 150 µ? de amortiguador de lavado B, se captaron y el sobrenadante se separó. Las esferas después se lavaron con 150 µ? de amortiguador de elusión, se captaron y el sobrenadante se separó. Se permitió que las esferas secaran durante 2 minutos. Después del secado se agregaron 50 µ? de amortiguador de elusión y se mezcló durante 5 minutos a 70 °C. Las esferas se captaron sobre un imán durante 5 minutos. Se separaron 40 µ? de sobrenadante y se agregaron a otra placa de 96 pozos .

Síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción de ADNc inverso de alta capacidad ABI High (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813) Una mezcla maestra de 2 µ? de amortiguador 10X, 0.8 µ? de 25X de d TP, 2 µ? de cebadores aleatorios, 1 µ? de transcriptasa inversa, 1 µ? de inhibidor de ribonucleasa y 3.2 µ? de H20 por reacción se agregaron a 10 µ? de ARN total. Se generó ADNc utilizando un equipo Bio-Rad C-1000 o S-1000 thermal cycler (Hercules, CA) mediante las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 segundos, retención a 4°C.

PCR en tiempo real Se agregaron 2 µ? de ADNc a una mezcla maestra que contiene 0.5 µ? de GAPDH TaqMan Probé (Applied Biosystems Cat #4326317E) , 0.5 µ? de ANGPTL TaqMan probé (Applied Biosystems cat #Hs00205581_ml) y 5 µ? de mezcla maestra de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat #04887301001) por pozo en 50 placas de 384 pozos (Roche cat # 04887301001) . La PCR en tiempo real se realizó en un sistema de PCR de tiempo real ABI 7900HT (Applied Biosystems) utilizando el análisis AACt(RQ) . Cada dúplex se probó en dos transfecciones independientes y cada transfección se analizó por duplicado a menos que se indique en otro sentido en las tablas de resumen .

Para calcular el cambio de múltiplo relativo, los datos de tiempo real se analizaron utilizando el método AACt y se normalizaron a análisis realizados con células transfectadas con 10 nM de AD-1955, o células transfectadas en falso. Se calcularon las CI50 utilizando el modelo de ajuste de 4 parámetros utilizando XLFit y se normalizó a células transfectadas con AD-1955 o células previamente no expuestas sobre el mismo intervalo de dosis o para su propia dosis más baja. La secuencia AD-1955, utilizada como un control negativo dirigida a luciferasa y tiene la siguiente secuencia: directa: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT ; antisentido: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT .

Cribados de viabilidad La viabilidad de la célula se midió en los días 3 y 6 en células HeLa y Hep3B posterior a transfección con ARNsi 10, 1, 0.5, 0.1 y 0.05 nM. Las células se sembraron en placa a una densidad de 10,000 células por pozo en placas de 96 pozos. Cada ARNsi se analizó por triplicado y se promediaron los datos. Los ARNsi que están dirigidos a PLKl y AD-19200 se incluyeron como controles positivos para pérdida de viabilidad y AD-1955 y células transfectadas en falso como controles negativos. PLKl y AD-19200 resultó en una pérdida de viabilidad dependiente de la dosis. Para medir viabilidad, se agregaron 20 µ? de CellTiter Blue (Promega) a cada pozo de las placas de 96 pozos después de 3 ó 6 días y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Las placas después se leen en un espectrofotómetro (Molecular Devices) a 560 Ex/590 Em. La viabilidad se expresó como valor promedio de unidades de luz a partir de tres transfecciones por duplicado +/- desviación estándar. La viabilidad relativa se determinó al promediar primero las tres transfecciones por duplicado y después normalizar las células transfectadas en falso. Los datos se expresan como % de células viables.

TABLA 1. ABREVIATURAS DE MONOMEROS DE NUCLEOTIDOS UTILIZADOS EN LA REPRESENTACION DE SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO Se entenderá que estos monómeros , cuando están presentes en un oligonucléotido se encuentran unidos mutuamente por enlaces 5 ' -3 ' -fosfodiéster Secuencias de hebra directa y antisentido no modificadas de los ARNds para 5 15 5 15 5 15 Tabla 3. Secuencias de hebra directa y antisentido modificadas de los ARNds para A GPTL3 10 15 Los nucleótidos en minúsculas (a, u, g, c) son 2'-0-metil nucleótidos; s 10 es un enlace fosforotioato . 15 TABLA 4. RESULTADOS DE CRIBADO DE DOSIS UNICA UTILIZANDO SECUENCIAS DE ARNds PARA ANGPTL3 Los experimentos se llevaron a cabo utilizando hebras dúplex oligonucleotídicas modificadas incluidas en la tabla 3. La secuencia de AD-15838.2 es idéntica a las secuencias de AD-15838.1. El suministro de los dúplex de ARNsi se realizó utilizando los LNP.

TABLA 5 . RESULTADOS DE CRIBADO DOS IS - RESPUESTA PARA SECUENCIAS DE ARNdS PARA ANGPTL3 Los experimentos se llevaron a cabo utilizando dúplex oligonucleotídicos modificados incluidos en al tabla 3. La secuencia de AD-15838.2 es idéntica a la secuencia de AD-15838.1.

Tabla 6. RESULTADOS DE CRIBADOS DE VIABILIDAD CELULAR UTILIZANDO SECUENCIAS MODIFICADAS DE ARNdS PARA ANGPTL3 Los experimentos se llevaron a cabo utilizando dúplex olinucleótidicos modificados incluidos en la tabla 3. La secuencia de AD-15838.2 es idéntica a la secuencia de AD-15838.1. Los datos de viabilidad se expresan como % viables en relación a células tratadas en falso 5 5 15 TABLA 7. SECUENCIAS DE HEBRA DIRECTA Y ANTISENTIDO NO MODIFICADAS DE LOS ARNds CONJUGADOS A GalNac PARA ANGPTL3 5 10 5 10 10 15 5 10 5 10 5 El símbolo "x" indica que la secuencia contiene un conjugado GalNAc 15 TABLA 8. SECUENCIAS DE HEBRA DIRECTA Y, ANTISENTIDO MODIFICADAS DE LOS ARNds CONJUGADOS A GalNac PARA ANGPTL3 Los nucleótidos en minúsculas (a, u, g, c) son 2'-0-metil nucleótidos; Nf (por ejemplo, Af) es un 2 ' -fluoronucleótido; s es un enlace fosforotioato; L96 indica un ligando GaLNAc.

TABLA 9. SECUENCIAS DE HEBRA DIRECTA Y ANTISENTIDO NO MODIFICADAS DE LOS ARNdS PARA ANGPTL3 SIN LA CONJUGACION GalNal Estas secuencias son las mismas que las secuencias incluidas en la tabla 7, excepto que no contienen la conjugación GalNal 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 TABLA 10. SECUENCIAS DE HEBRA DIRECTA Y ANTISENTIDO MODIFICADAS DE LOS ARNds PARA ANGTPL3 SIN LA CONJUGACION GalNal Estas secuencias son las mismas que las secuencias incluidas en la tabla 8 excepto que no contienen la conjugación GalNal.

TABLA 11. RESULTADOS DEL CRIBADO DE DOSIS UNICA UTILIZANDO LOS AR ds CONJUGADOS A GalNac PARA ANGPTL3 Los ARNsi modificados se probaron por transfección de células Hep3b y por captación libre en células de macaco primarias (PCH) a las dosis establecidas en lo anterior 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 TABLA 12. RESULTADOS DE CRIBADO DOSIS-RESPUESTA PARA LAS SECUENCIAS DE ARNds CONJUGADO A GalNac PARA ANGPTL3 Un subconjunto de los ARNsi activos a partir del cribado de una sola dosis (a los que se hace referencia en la tabla 11) se probaron en un experimento dosis-respuesta mediante captación libre en células PCH. un subconjunto de estos ARNsi activos también se probaron en dosis-respuesta en células Hep3B por transfeccion.

TABLA 13. RESULTADOS DE CRIBADO DE DOSIS UNICA UTILIZANDO SECUENCIAS INCLUIDAS EN LA TABLA 10 TABLA 14. RESULTADOS DE UN CRIBADO DOSIS-RESPUESTA UTILIZANDO UN SUBCO JUNTO DE LA TABLA 13 Un subconjunto de los ARNsi para ANGPTL3 activos de la tabla 10 se probaron por transfeccion en células Hep3B en cribados dosis-respuesta TABLA 15. ID DE LOS PARES DUPLEX PARA LOS CUALES SE SINTETIZARON Y PROBARON TANTO LA VERSION NO CONJUGADA COMO CONJUGADA A GalNac Estos dúplex tienen la misma secuencia y patrón de modificación 33 5 10 15 20 Pruebas In vivo EJEMPLO 3.

Artículos de prueba Se llevaron a cabo experimentos in vivo utilizando las secuencias de ARNds de la invención. La secuencia de ARNds utilizada en los experimentos fue AD-52981 conjugada a GalNac ( "ANG" , secuencia directa: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 ; secuencia antisentido: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg) . La secuencia de ARNds utilizada como control negativo fue AD-48399B1 conjugada a luciferasa ("Luc", secuencia directa: Cf CfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAfL96 , secuencia antisentido: uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgUfgsAfsu) . También se utilizó como un control negativo AD-1955 conjugado a GalNal que contiene modificaciones 2' -metilo y 2' fluoro alternantes.

Procedimiento experimental Las secuencias de ARNds se probaron en ratones C57BL/6 (WT) y ob/ob. Los ratones WT recibieron cinco dosis diarias de ARNds en PBS, Luc a 20 mg/kg, o ANG a 5 ó 20 mg/kg; y los ratones ob/ob recibieron cinco dosis diarias de los NPL formulados con Luc a 20 mg/kg o ANG a 20 mg/kg. Todos los artículos de prueba se administraron por inyección subcutánea de acuerdo con el procedimiento que se muestra en la figura 1. Específicamente, cinco dosis diarias de los artículos de prueba se administraron en cinco días consecutivos (día 0, 1, 2, 3 y 4), y se recolectaron muestras de sangre 5, 3 ó 1 día antes de la administración así como en los días 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 15, 18, 21, 25, 30, 37, 45 y 50 posterior a la adminis ración. Las muestras de sangre recolectadas se utilizaron para medir la expresión de la proteína ANGPTL3 utilizando un análisis de ELISA. También se midieron las concentraciones de trigl icéridos en suero (TG) , colesterol y lipoproteína de baja densidad (LDLc), colesterol y lipoproteína de alta densidad (HDLc) y colesterol total (TC) en un equipo Olympus Analyzer.

Resultados En la figura 2A se muestran los niveles de proteína A GPTL3 murina (mA GPTL3, proteína medida en ratones WT después de la administración de control o ANG a 5 ó 20 mg/kg. En la figura 2B también se muestran los niveles de proteína mANGPTL3 medida en ratones o ob/ob después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que, tanto para ratones WT como ob/ob, la administración de ANG resulta en niveles disminuidos de proteína mANGPTL3, en comparación con los controles.

En la figura 3A, se muestran los niveles de LDL-c medidos en ratones WT después de administración de control o ANG a 20 mg/kg. En la figura 3B se muestran los niveles de LDL-c medidos en ratones ob/ob después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de ANG provoca niveles disminuidos de LDL-c, particularmente en ratones ob/ob, en comparación con los controles .

En la figura 4A, se muestran los niveles de triglicéridos medidos en ratones WT después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. En la figura 4B se muestran los niveles de triglicéridos medidos en ratones ob/ob después de la administración de control o ANG, a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de ANG provoca niveles disminuidos de triglicéridos, particularmente en ratones ob/ob, en comparación con los controles.

En la figura 5A y 5 B se muestran los niveles de colesterol total (TC) medidos en ratones WT y ob/ob, respectivamente, después de la administración de control o A G, a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de A G provoca una disminución moderada en los niveles de TC en ratones ob/ob, pero no en ratones WT. De manera similar, la administración de ANG provoca una disminución moderada en los niveles de HDL-c en ratones ob/ob pero no en ratones WT, como se muestra en las gráficas en las figuras 6a-6b.

EJEMPLO 4.

Artículo de prueba se probó el efecto de la inyección única de la secuencia de ARNds de la invención sobre el nivel de proteína ANGPTL3. La secuencia de ARNds utilizada en los experimentos es AD-52981 conjugada a GalNac ("ANG", secuencia directa: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 ; secuencia antisentido: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg) . Se utulizó PBS como un control negativo.

Procedimiento experimental Las secuencias de ARNds se probaron en ratones transgénicos PCS humanos caracterizados por expresión específica en hígado del gen PCSK9 humano de longitud completa. Los ratones transgénicos a PCS humano se dosificaron con AD-52981 o PBS utilizando una inyección subcutánea única. Los ratones se dividieron en cuatro grupos, cada grupo consistió de dos machos y dos hembras». Cada grupo recibió una inyección de PBS o 5 mg/kg, 20 mg/kg o 60 mg/kg como dosis de AD-52981. Las muestras de sangre se recolectaron el día 1 y el día 0 antes de la dosificación y a las 72 horas después de la dosificación. Las concentraciones de proteína ANGPTL3 se midieron por ELISA y se compararon con los niveles en el día 1 y en el día 0 antes de la dosificación.

Resultados En la figura 7 se muestran los niveles de proteína ANGPTL3 murina (mA GPTL3) medida en ratones transgénicos PCS humano. Los datos que se muestran se expresan en relación al control de PBS y representan un promedio de 2 machos y 2 hembras en cada grupo. Las barras de error representan desviación estándar. Las datos indican que la administración de una inyección única de AD-52981 reduce los niveles de la proteína ANGPTL3 en ratones de una manera dependiente de la dosis, con la dosis de 60 mg/kg que disminuye los niveles de proteína A GPTL3 más de cinco veces (véase la figura 7) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de ANGPTL3 , caracterizado porque el ARNds comprende una hebra directa y una hebra antisentido, en donde la hebra directa comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y la hebra antisentido comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que difieren no más de 3 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 5.

2. Un ácido ribonucleicos de doble heJra (ARNds) para inhibir la expresión de ANGPTL3 , caracterizado porque el ARNds comprende una hebra directa y una hebra antisentido, la hebra antisentido comprende una región de complementariedad la cual comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias antisentido enumeradas en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

3. El ARNds de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las hebras directa y antisentido comprenden las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste de AD-52981-1, AD-53063.1, AD-53001.1, AD-53015.1, AD-52986.1, AD-52953.1, AD-53024.1, AD-53033.1, AD-53030.1, AD-53080.1, AD-53073.1, AD-53132.1, AD-52983.1, AD-52954.1, AD-52961.1, AD-52994.1, AD-52970.1, AD-53075.1, AD-53147.1, AD-53077.1 de las tablas 7 y 8.

4. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el ARNds comprende por lo menos un nucleótido modificado.

5. El ARNds de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque por lo menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste de un nucleótido modificado 2'-0-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 51 -fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo de un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico.

6. El ARNds de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste de un nucleótido modificado 21 -desoxi-21 -fluoro, un nucleótido modificado 2'-desoxi, un nucleótido inmovilizado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado 2'-amino, un nucleótido modificado 2 '-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforoamidato y un nucleótido que comprende una base no natural .

7. El ARNds de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de complementariedad es de una longitud de por lo menos 17 nucleótidos .

8. El A ds de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de complementariedad tiene una longitud de entre 19 y 21 nucleótidos .

9. El ARNds de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la región de complementariedad tiene una longitud de 19 nucleótidos.

10. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque cada hebra es no mayor de 30 nucleótidos de longitud.

11. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque por lo menos una hebra comprende una parte sobresaliente 3' de por lo menos 1 nucleótido .

12. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque por lo menos una hebra comprende una parte sobresaliente 3' de por lo menos 2 nucleótidos .

13. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende además un ligando.

14. El ARNds de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el ligando está conjugado al extremo 3' de la hebra directa del AR ds .

15. El ARNds de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el ligando es un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc) .

16. El ARNds de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ligando es

17. El ARNds de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de complementariedad consiste de una de las secuencias antisentido de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

18. El ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende una hebra directa que consiste de una secuencia de hebra directa que se la secuencia de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y l0 y una hebra antisentido que consiste de una secuencia antisentido que se selecciona de las secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

19. Una célula caracterizada porque contiene el ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.

20. Un vector caracterizado porque codifica para por lo menos una hebra de un ARNds, en donde el ARNds comprende una región de complementariedad con por lo menos una parte de un ARNm que codifica para ANGPTL3 , en donde el ARNds tiene una longitud de 30 pares de bases o menos, y en donde el ARNds tiene como objetivo al ARNm para separación.

21. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la región de complementariedad tiene una longitud de por lo menos 15 nucleótidos .

22. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la región de complementariedad tiene una longitud de 19 a 21 nucleótidos.

23. Una célula caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 20.

24. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen para ANGPTL3, caracterizada porque comprende el ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, o el vector de conformidad con la reivindicación 20.

25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende además una formulación lipidíca.

26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la formulación lipidíca comprende SNALp o XTC.

27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la formulación lipidíca comprende un MC3.

28. Un método para inhibir la expresión de ANGPTL3 en una célula, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la célula con el ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, o el vector de conformidad con la reivindicación 20; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcripto de ARJSím de un gen para ANGPTL3 , por lo que se inhibe la expresión del gen para ANGPTL3 en la célula.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la célula está dentro de un sujeto.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto es un humano .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el sujeto humano padece de un trastorno de metabolismo de lipidos.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el trastorno de metabolismo de lípidos es hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, caracterizado porque la expresión de ANGPTL3 se inhibe en por lo menos aproximadamente 30%.

34. Un método para tratar un sujeto que presenta un trastorno que se prodría beneficiar de reducción en la expresión de ANGPTL3 , caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, o el vector de conformidad con la reivindicación 20, para de esta manera tratar al sujeto.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el trastorno es un trastorno de metabolismo de lípidos.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el trastorno de metabolismo de lípidos es hiperlipidemia o hipertrigliceridemia .

37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la administración del ARNds al sujeto provoca una disminución en uno o más de lípidos de suero y/o una disminución en la acumulación de proteína ANGPTL3.

38. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el ARNds se administra a una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.

39. Un método para inhibir la expresión de ANGPTL3 en un sujeto, caracterizado porque comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNds de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, o el vector de conformidad con la reivindicación 20, para de esta manera inhibir la expresión de ANGPTL3 en el sujeto.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el ARNds se administra al sujeto en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.