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MX2013014345A - Anticuerpos anti-angptl3 y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos anti-angptl3 y usos de los mismos.

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MX2013014345A
MX2013014345A MX2013014345A MX2013014345A MX2013014345A MX 2013014345 A MX2013014345 A MX 2013014345A MX 2013014345 A MX2013014345 A MX 2013014345A MX 2013014345 A MX2013014345 A MX 2013014345A MX 2013014345 A MX2013014345 A MX 2013014345A
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MX
Mexico
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antibody
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seq
hangptl3
angptl3
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MX2013014345A
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MX337644B (es
Inventor
Andrew J Murphy
Mark W Sleeman
Viktoria Gusarova
Original Assignee
Regeneron Pharma
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46298728&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2013014345(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of MX2013014345A publication Critical patent/MX2013014345A/es
Publication of MX337644B publication Critical patent/MX337644B/es

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Abstract

Se proporciona un anticuerpo totalmente humano o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo humano que se fija específicamente e inhibe o interfiere con al menos una actividad de la proteína 3 de tipo angiopoyetina humana (hANGPTL3). Los anticuerpos anti-hANGPTL3 humanos son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con ANGPTL3, tales como hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, con inclusión de hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, etcétera. Adicionalmente, los anticuerpos anti-hANGPTL3 pueden administrarse a un individuo en necesidad de ello para prevenir o tratar enfermedades o trastornos, para los cuales el metabolismo anormal de los lípidos es un factor de riesgo. Tales enfermedades o trastornos incluyen enfermedades cardiovasculares, tales como ateroesclerosis y enfermedades de las arterias coronarias; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); diabetes; obesidad; y análogos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-ANGPTL3 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de fijación de antígeno de anticuerpos humanos que se fijan específicamente a la proteína 3 de tipo angiopoyetina humana (hANGPTL3), y métodos terapéuticos de utilización de dichos anticuerpos.
ANTECEDENTES El gen de la proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) se identificó a partir de la base de datos EST basada en secuencias señal y hélices anfipáticas, y posteriormente se aisló un cDNA ANGPTL3 de longitud total de una biblioteca de cDNA de hígado/bazo fetal humana (Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). La proteína hANGPTL3 de 460 aminoácidos deducida comparte 76% de identidad de secuencia de aminoácidos con ANGPTL3 de ratón y tiene la estructura característica de las angiopoyetinas; es decir, un péptido señal, un dominio helicoidal extendido que se predice formará serpentines enrollados dímeros o trímeros, un péptido enlazador corto, y un dominio globular de homología de fibrinógeno (FD) (Conklin et al., 1999; supra). ANGPTL3 contiene los cuatro residuos cisteína conservados implicados en los enlaces disulfuro intramoleculares dentro del FD; sin embargo, ANGPTL3 no contiene ninguna de las dos cisteínas adicionales ni el motivo característico de fijación de calcio encontrado en los FDs de las angiopoyetinas (ANGs; es decir, ANG1 , ANG2 y ANG4) (Conklin et al., 1999, supra), que son factores de crecimiento proteínicos que promueven angiogénesis. Adicionalmente, al contrario que las ANGs, ANGPTL3 no se fija a Tie2; sin embargo, puede inducir también angiogénesis por fijación a la integrina a?ß3 por su FD C-terminal (Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277: 17281-17290).
Se obtuvieron datos exhaustivos in vivo a partir del modelo de ratón exogámico KK, que es moderadamente obeso con niveles anormalmente altos de insulina, glucosa, y lípidos en plasma, asemejándose a la diabetes mellitus tipo 2 en humanos (Koishi et al., 2002, Naure Genetics 30:151-157). Sin embargo, se encontró que una sub-variedad de ratón, el KK/San, exhibía niveles de lípidos en plasma anormalmente bajos (hipolipidemia), que eran heredados como un carácter mendeliano recesivo. El loci se mapeaba al cromosoma 4, y finalmente se identificó que era el gen codificante de ANGPTL3, que contenía una inserción de secuencia nucleotídica de 4 pares de bases en el exón 6 (Koishi et al., 2002, supra). Inversamente, los niveles de lípidos en plasma aumentan después de transferencia del gen ANGPTL3 mediada por adenovirus, o después de administración de ANGPTL3 humana recombinante en ratones KK/San. Este efecto no estaba mediado por cambios en los genes implicados en la síntesis del colesterol, el aclaramiento de las lipoproteínas o la oxidación de NEFA (Koishi et al., 2002, supra). Adicionalmente, el análisis in vitro de la proteína recombinante demostró que ANGPTL3 inhibe directamente la actividad de la lipoproteinlipasa (LPL), lo que indica que es un modulador del metabolismo de los lípidos que regula los niveles de triglicéridos de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) por la inhibición de la actividad de LPL (Shimizugawa et al., 2002, J. Biol Chem 277 (37: 33742-33748). Se ha demostrado que el dominio de serpentín enrollado N-terminal, especialmente los residuos 17-165 de la región N-terminal, y no el FD C-terminal, de ANGPTL3, se requiere para su actividad de aumento de los niveles de triglicéridos en plasma en ratones (Ono et al., 2003, J. Biol Chem 278: 41804-41809).
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de ANGPTL3 humana se muestran en SEQ ID NOS: 161 y 162, respectivamente. Anticuerpos para ANGPTL3 se describen en, por ejemplo, WO 2008/073300 y US 7.935.796.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos monoclonales totalmente humanos (mAbs) y fragmentos de fijación de antígeno de los mismos que se fijan y neutralizan, inhiben, bloquean, anulan, reducen o interfiere específicamente con al menos una actividad de ANGPTL3, en particular, ANGPTL3 humana (SEQ ID NO: 161 ). La actividad de ANGPTL3 que puede ser neutralizada, inhibida, bloqueada, anulada, reducida o interferida por los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, incluye, pero no con carácter de limitación, inhibición de la actividad de LPL, inducción de angiogénesis, y análogas. En una realización, un anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención puede neutralizar, inhibir, bloquear, anular, reducir o interferir una actividad de hANGPTL3 por fijación a un epítope de hANGPTL3 que está implicado directamente en la actividad direccionada de hANGPTL3. En otra realización, un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención puede neutralizar, inhibir, bloquear, anular, reducir o interferir con una actividad de hANGPTL3 por fijación a un epítope de hANGPTL3 que no está implicado directamente en la actividad direccionada de hANGPTL3, pero el anticuerpo o fragmento de fijación del mismo inhibe, bloquea, anula, reduce o interfiere estérica o conformacionalmente con la actividad direccionada de hANGPTL3. En otra realización adicional, un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se fija a un epítope de hANGPTL3 que no está implicado directamente en la actividad direccionada (v.g., inhibición de la actividad LPL, inducción de angiogénesis, etcétera) de hANGPTL3 (es decir, un anticuerpo no bloqueante), pero el anticuerpo o fragmento de fijación del mismo da como resultado la mejora del aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación, comparado con el aclaramiento de hANGPTL3 en ausencia del anticuerpo o fragmento del mismo, inhibiendo, bloqueando, anulando, reduciendo o interfiriendo indirectamente con la actividad de hANGPTL3. El aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación puede mejorarse particularmente por combinación de dos o más anticuerpos no bloqueantes diferentes que no compiten entre sí en cuanto a la fijación específica a hANGPTL3.
Los anticuerpos (Ab) pueden ser de longitud total (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 o lgG4) o pueden comprender sólo una porción de fijación de antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden estar modificados para afectar a la funcionalidad, v.g., para eliminar funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
En una realización, la invención comprende un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 y 180, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 18, 34, 66, 82, 4, y 180. En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 66.
En una realización, un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 06, 122, 138, 154, y 188, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% de identidad de secuencia. En otra realización, el anticuerpo o porción de fijación de antígeno de un anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 10, 26, 42, 74, 90, 122, y 188. En otra realización adicional, el anticuerpo o porción de fijación de antígeno de un anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 1 14/122, 130/138, 146/154 y 180/188. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122, y 180/188. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR de SEQ ID NO: 66/74.
En un segundo aspecto, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, y 186, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y una secuencia de aminoácidos CDR3 de la cadena ligera (LCDR3) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160 y 194, o secuencias sustancialmente similares de las mismas que tienen al menos 90%, al menos 95, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/1 12, 120/128, 136/144, 152/160 ó 186/194. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 72/80, 88/96, 120/128, ó 186/194. En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 72/80.
En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos de cadena presada CDR1 (HCDR1 ) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, y 182, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia; y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR2 (HCDR2) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150 y 184, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia; y comprende opcionalmente además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR1 (LCDR1 ) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156 y 190, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia; y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR2 (LCDR2) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 1 10, 126, 142, 158 y 192, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia.
Alternativamente, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que comprende una combinación HCDR1/HCDR2/HCDR3 seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 y 182/184/186; y/o una combinación LCDR1 /LCDR2/LCDR3 seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 y 190/192/194. En una realización, las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias CDR seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/ 04/108/110/1 12, 116/1 18/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194. En una realización, las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias CDR de SEQ ID NO: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 6/118/120/124/126/128 o 182/184/186/190/192/194. En otra realización, las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias CDR de SEQ ID NO:68/70/72/76/78/80.
En una realización afín, la invención comprende un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que fija específicamente hANGPTL3, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de los pares HCVR/LCVR seleccionados del grupo constituido por SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 1 14/122, 130/138, 146/154 y 180/188. Métodos y técnicas para identificación de CDRs dentro de secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR se conocen en la técnica y pueden aplicarse para identificar CDRs dentro de las secuencias de aminoácidos HCVR y/o LCVR especificadas descritas en esta memoria. Definiciones convencionales que pueden aplicarse para identificar los límites de las CDRs incluyen la definición de Kabat, la definición de Chothia, y la definición AbM. En términos generales, la definición de Kabat está basada en variabilidad de secuencia, la definición de Chothia está basada en la localización de las regiones bucle estructurales, y la definición AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, v.g., Kabat, "Sequences de Proteínas de Immunological Interest," National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991 ); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bases de datos públicas están disponibles también para la identificación de secuencias CDR dentro de un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias CDR contenidas dentro de un par de secuencias HCVR y LCVR de SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 o 180/188. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias CDR contenidas dentro de un par HCVR y LCVR de SEQ ID NO: 66/74.
En otra realización afín, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo que compite para fijación específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno que comprende secuencias CDR de cadena pesada y ligera contenidas en un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 1 4/122, 130/138, 146/154 o 180/188. En una realización, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de la invención compite para fijación específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO:66/74. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de la invención compite para fijación específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias CDR de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo constituido por 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/1 10/1 12, 116/1 18/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/ 44, 48/ 50/ 52/156/ 58/ 60 y 82/ 84/186/ 90/192/ 94. En una realización, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo de la invención compite para fijación específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias CDR de cadena pesada y ligera de SEQ ID NOS: 68/70/72/76/78/80.
En otra realización afín, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija al mismo epitope en hANGPTL3 que es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende secuencias CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 1 14/122, 130/138, 146/154 o 180/188. En una realización, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de la invención se fija al mismo epitope en hANGPTL3 que el reconocido por el anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO:66/74. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se fija al mismo epitope en hANGPTL3 que es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias CDR de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo constituido por 4/6/8/12/ 4/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/1 12, 1 16/1 18/120/124/ 26/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194. En una realización, dicho epítope es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias CDR de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO: 68/70/72/76/78/80.
En un tercer aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija a un epítope situado dentro de la región de serpentín enrollado N-terminal en los residuos 17 a 209 de SEQ ID NO: 161 y neutraliza, inhibe, anula, reduce o interfiere con al menos una actividad de hANGPTL3. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que se fija específicamente a un epítope situado dentro de la región de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 161 ) y neutraliza, inhibe, anula, reduce o interfiere con al menos una actividad de hANGPTL3, con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170 (corresponde a los residuos Glu32 a Leu57 de hANGPTL3 de SEQ ID NO: 161 ). En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se fija específicamente a un epítope dentro de los residuos 17 a 200, 17 a 100, 17 a 70, 17 a 65, 17 a 60, 17 a 57, ó 17 a 50, de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 161 ), opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se fija específicamente a un epítope dentro de los residuos 40 a 200, 40 a 100, 40 a 70, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 70, 58 a 200, 58 a 100, 58 a 70, 58 a 68, ó 61 a 66, de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 161 ), opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se fija a un epítope que puede implicar más de uno de los epítopes o residuos enumerados dentro de la región de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3, opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos, en particular, uno cualquiera de los arriba descritos. Vectores de expresión recombinantes portadores de los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras, v.g., células bacterianas, tales como E. coli, o células de mamífero, tales como células CHO, en las cuales se han introducido tales vectores, están abarcados también por la invención, al igual que métodos de producción de los anticuerpos por cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos, y recuperación de los anticuerpos producidos.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 , 17, 33, 49, 65, 81 , 97, 1 13, 129, 145 y 179, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con las mismas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , 17, 33, 65, 81 , 113, ó 179. En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65.
En una realización, un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 9, 25, 41 , 57, 73, 89, 105, 121 , 137, 153 y 187, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con las mismas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, 25, 41 , 73, 89, 121 ó 187. En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) codificado por un par de secuencias de ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1/9, 17/25, 33/41 , 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121 , 129/137, 145/153 y 179/187. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR/LCVR codificado por un par de secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1/9, 17/25, 33/41 , 65/73, 81/89, 1 13/121 ó 179/187. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR/LCVR codificado por un par de secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65/73.
En una realización, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:7, 23, 39, 55, 71 , 87, 103, 1 19, 135, 151 y 185, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:15, 31 , 47, 63, 79, 95, 1 11 , 127, 143, 159 y 193, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO:7/15, 23/31 , 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/1 1 1 , 1 19/127, 135/143, 151/159 y 185/193. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:7/15, 23/31 , 39/47, 71/79, 87/95, 119/127 o 185/193. En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:71/79.
En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51 , 67, 83, 99, 115, 131 , 147 y 181 , o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma; y un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:5, 21 , 37, 53, 69, 85, 101 , 1 17, 133, 149 y 183, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma; y comprende opcionalmente además un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1 1 , 27, 43, 59, 75, 91 , 107, 123, 139, 155 y 189, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma; y/o un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:13, 29, 45, 61 , 77, 93, 109, 125, 141 , 157 y 191 , o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con la misma.
Alternativamente, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo que comprende una combinación HCDR1/HCDR2/HCDR3 codificada por una combinación de secuencias de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:3/5/7, 19/21 /23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71 , 83/85/87, 99/101/103, 1 15/1 17/1 19, 131/133/135, 147/149/151 y 181/183/185; y/o una combinación LCDR1 /LCDR2/LCDR3 codificada por una combinación de secuencias de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1 1/13/15, 27/29/31 , 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91 /93/95, 107/109/1 1 1 , 123/125/127, 139/141/143, 155/157/159 y 189/191/193. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias CDR de cadena pesada y ligera codificadas por una combinación de secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO:67/69/71/75/77/79.
En un quinto aspecto, .la invención presenta un anticuerpo anti-ANGPTL3 humano o fragmento de fijación de antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias VH, DH y JH de la línea germinal, y una región variable de cadena ligera (LCVR) codificada por segmentos de secuencias de nucleótidos derivados de secuencias VK y JK de la línea germinal, en donde la HCVR y la LCVR están codificados por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de una combinación de genes germinales seleccionada del grupo constituido por: (i) VH3-43, DH3-3, JH3, VK1-5 y JK2; (ii) VH3-11 , DH1 -1 , JH , Vk1-39 y JK4; (iií) VH3-30, DH1-7, JH6, VK1-5 y JK1 ; (iv) VH3-30, DH1-26, JH6, VK1-12 y JK3; (v) VH3-30, DH3-10, JH6, VK1 -12 y JK3; y (vi) VH3-23, DH3-10, JH4, VK1 -5 y JK1.
En un sexto aspecto, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija específicamente a hANGPTL3 con una constante de disociación de equilibrio (KD) de aproximadamente 7 nM o menos, aproximadamente 6 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, aproximadamente 4 nM o menos, aproximadamente 3 nM o menos, aproximadamente 2 nM, o menos, o aproximadamente 1 nM o menos, como se mide por ensayo de resonancia de piasmones de superficie (por ejemplo BIACORE™). En ciertas realizaciones, el anticuerpo de la invención exhibe una KD de aproximadamente 800 pM o menos, aproximadamente 700 pM o menos; aproximadamente 600 pM o menos; aproximadamente 500 pM o menos; aproximadamente 400 pM o menos; aproximadamente 300 pM o menos; aproximadamente 200 pM o menos; aproximadamente 100 pM o menos; o aproximadamente 50 pM o menos.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija a la proteína hANGPTL3 de SEQ ID NO: 161 , pero no reacciona de manera cruzada con una proteína afín, tal como la proteína 4 de tipo angiopoyetina humana (hANGPTL4; SEQ ID NO: 164), como se determina, por ejemplo, por ELISA, ensayo de resonancia de piasmones de superficie, o Tecnología XMAP® de LUMINEX®, como se describe en esta memoria. ANGPTL4 es otra proteína secretada que se sabe reduce la actividad de LPL y tiene una región de serpentín enrollado N-terminal y un dominio de tipo fibrinógeno C-terminal (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279: 2038-2045; Yau et al, 2009, J Biol Chem 284: 1 1942-1 1952). En realizaciones afines, la invención proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija a una proteína hANGPTL3 y reacciona de manera cruzada con una proteína hANGPTL4. En ciertas realizaciones, la afinidad de fijación del anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo a la proteína hANGPTL4 es aproximadamente 75% o menos, o aproximadamente 50% o menos, de la afinidad de fijación de anticuerpo o fragmento a la proteína hANGPTL3.
En otra realización afín, la invención proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo que no reacciona de manera cruzada con ANGPTL3 de ratón (mANGPTL3; SEQ ID NO: 163), o ANGPTL3 de rata (rANGPTL3; SEQ ID NO: 175), pero reacciona de manera cruzada con ANGPTL3 de mono cinomolgus (Macaca fascicularis) (MÍANGPTL3), por ejemplo, con los residuos 17-170 N-terminales de SEQ ID NO: 177 (una secuencia parcial de aminoácidos de MfANGPTL3). En otra realización afín, la invención proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento del mismo que reacciona de manera cruzada con fANGPTL3, mANGPTL3 y rANGPTL3.
La invención abarca anticuerpos anti-hANGPTL3 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para eliminar sitios de glicosilación indeseables puede ser útil, o v.g., la eliminación de un resto fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente del antígeno (ADCC) (véase Shield et al. (1002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, la eliminación del sitio de glicosilación en N puede reducir reacciones inmunes indeseables contra los anticuerpos terapéuticos, o aumentar las afinidades de los anticuerpos. En otras aplicaciones adicionales, puede realizarse modificación de la galactosilación a fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En un octavo aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo que fija específicamente hANGPTL3 y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos de la invención, que no compiten de manera cruzada entre sí, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica de la invención puede contener dos o más anticuerpos no bloqueantes, que no compiten entre sí en cuanto a fijación específica a hANGPTL3 y son eficaces en el aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación. Combinaciones adecuadas de anticuerpos no bloqueantes incluyen, pero sin carácter limitante, una combinación de anticuerpos que comprende pares de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de: (i) SEQ ID NO: 82/90 y 180/188, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 1 14/122 y 180/188, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 82/90 y 18/26, respectivamente; o (iv) SEQ ID NO: 1 14/122 y 18/26, respectivamente.
En realizaciones afines, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo de la invención, y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser uno o más de cualquier agente tal como (1 ) inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, tales como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y análogos; (2) inhibidores de la absorción de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares; (3) niacina, que aumenta el catabolismo de las lipoproteínas; (4) fibratos o ácidos carboxílicos antipáticos, que reducen el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL), mejoran los niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) y TG, y reducen el número de ataques cardiacos no fatales; y (5) activadores del factor de transcripción LXR que juegan un papel en la eliminación del colesterol tales como 22-hidroxicolesterol, o combinaciones fijas tales como ezetimib más simvastatina; una estatina con una resina biliar (v.g., colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (v.g., niacina con lovastatina); o con otros agentes reductores de los lípidos tales como ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor). Adicionalmente, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más inhibidores diferentes de ANGPTL3 así como inhibidores de otras moléculas tales como ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 y la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), que están involucradas en el metabolismo de los lípidos, en particular, la homeostasis del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas y anticuerpos que se fijan específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad.
En realizaciones afines, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más agentes anti-cáncer, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes anti-angiogénicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotoxicos, agentes apoptóticos, y otros agentes bien conocidos en la técnica para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos, así como otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes anti-inflamatorios, con inclusión de agentes anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDS), tales como inhibidores de la Cox-2, y análogos, a fin de mejorar y/o reducir los síntomas que acompañan al cáncer/tumor subyacente.
En un noveno aspecto, la invención presenta métodos para neutralización, inhibición, bloqueo, anulación, reducción o interferencia con la actividad de hANGPTL3 que utilizan uno o más anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de fijación de antígeno de los mismos de la invención. En una realización, la invención proporciona un método terapéutico que comprende administrar a un individuo que se encuentra en necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de fijación de antígeno de los mismos de la invención y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales arriba descritos. Los anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos de la invención pueden ser anticuerpos neutralizantes o anticuerpos no bloqueantes contra ANGPTL3, o combinaciones de los mismos.
En realizaciones afines, la invención proporciona métodos de mejora del aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación de un individuo en necesidad de ello, que comprenden administrar al individuo al menos dos anticuerpos anti- hANGPTL3 o fragmentos de los mismos de la invención que no compiten entre sí para fijación a hANGPTL3 y preferiblemente no bloquean al menos una actividad de hANGPTL3 (es decir, anticuerpos no bloqueantes). Al menos una actividad de hANGPTL3 a la que se hace referencia incluye, pero sin carácter limitante, inhibición de la actividad de LPL, inducción de angiogénesis, y análogas. En una realización, una combinación de al menos dos anticuerpos anti-hANGPTL3 no bloqueantes o fragmentos de los mismos mejora el aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación al menos aproximadamente un 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, o aproximadamente 80%, con relación al caso en que no se administran los anticuerpos o fragmentos. Los niveles circulantes de hANGPTL3 pueden medirse por ensayos in vitro bien conocidos en la técnica y los descritos en esta memoria. En otra realización, la combinación de al menos dos anticuerpos anti-hANGPTL3 no bloqueantes comprende pares de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de: SEQ ID NO: 82/90 y 180/188, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 114/122 y 180/188, respectivamente; (iii) SEQ ID NO: 82/90 y 18/26, respectivamente; o (iv) SEQ ID NO: 1 14/122 y 18/26, respectivamente.
La enfermedad o trastorno tratable por los métodos de la invención es cualquier enfermedad o afección que se alivia, mejora, inhibe o previene, o se reduce su tasa de aparición, comparada con el caso sin tratamiento con el anticuerpo anti-hANGPTL3 (v.g., enfermedades o trastornos mediados por ANGPTL3), por eliminación, inhibición, reducción, o interferencia de cualquier otro modo con la actividad de ANGPTL3. Ejemplos de enfermedades o trastornos que pueden tratarse por los métodos de la invención incluyen, pero sin carácter limitante, aquéllos que implican metabolismo de los lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, con inclusión de dislipidemia aterogénica, dislipidemia diabética, hipertrigliceridemia, con inclusión de hipertrigliceridemia grave con TG > 1000 mg/dl, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia, y análogas, que están causados, por ejemplo, por actividad reducida de LPL y/o deficiencia de LPL, actividad reducida del receptor de LDL (LDLR) y/o deficiencia del receptor LDL (v.g., hipercolesterolemia homocigótica familiar con LDLR" _), ApoC2 alterada, deficiencia de ApoE, ApoB incrementada, producción incrementada y/o eliminación reducida de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), tratamiento con ciertos fármacos (v.g., dislipidemia inducida por tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, dieta, estilo de vida, y análogos. Los métodos de la invención pueden prevenir o tratar también enfermedades o trastornos asociados con o resultantes de hiperlipidemia, hiper-lipoproteinemia, y/o dislipidemia, con inclusión, pero sin carácter limitante, de enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como ateroesclerosis, aneurisma, hipertensión, angina, derrame cerebral, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades de las arterias coronarias, infarto de miocardio, enfermedades vasculares periféricas, y análogas; pancreatitis aguda, esteatohepatitis no alcohólica (NASH); trastornos de azúcares en la sangre, tales como diabetes; obesidad; y análogos.
Otros ejemplos de enfermedades o trastornos que pueden tratarse por los métodos de la invención incluyen cáncer/tumor así como enfermedades o trastornos no neoplásticos asociados con angiogénesis, con inclusión de enfermedades o trastornos angiogénicos oculares, tales como degeneración macular relacionada con la edad, oclusión de la vena retiniana central u oclusión de la vena retiniana ramificada, retinopatía diabética, retinopatía de la premadurez, y análogas, enfermedades o trastornos inflamatorios, tales como artritis, artritis reumatoide (RA), psoriasis, y análogas.
Otras realizaciones resultarán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de secuencias de los Péptidos 1 -3 utilizados en un experimento de fijación de anticuerpos anti-hANGPTL3 (Ejemplo 5) contra las porciones relevantes de la secuencia de hANGPTL3 (es decir, dentro de los residuos 30 a 70 de SEQ ID NO: 161 o GenBank #NP_055310). Péptido 1 (control: péptido ANGPTL4; SEQ ID NO: 168); Péptido 2 (péptido ANGPTL3; SEQ ID NO: 169); y Péptido 3 (péptido ANGPTL3; SEQ ID NO: 170).
La Figura 2 muestra los resultados de la fijación del anticuerpo anti-hANGPTL3 a los péptidos de serpentín enrollado N-terminales de hANGPTL3 (Péptido^ 2 y 3) o hANGPTL4 (Péptido ...: Control Isotipo; y ¦: anticuerpo H4H1276S.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de describir en detalle la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos particulares y condiciones experimentales descritas, dado que tales métodos y condiciones pueden variar. Debe entenderse también que la terminología utilizada en esta memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales preferidos.
Definiciones La expresión "proteína 3 de tipo angiopoyetina humana" o "hANGPTL3", como se utiliza en esta memoria, se refiere a ANGPTL3 que tiene la secuencia del ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 162 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 , o un fragmento biológicamente activo de la misma.
El término "anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina que comprenden 4 cadenas de polipéptido, 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) ¡nterconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está constituida por una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región constante de cadena pesada (CH; constituida por dominios CH1 , CH2 y CH3). Cada cadena ligera está constituida por una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región constante de cadena ligera (CL). La HCVR y la LCVR pueden subdividirse ulteriormente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado (FR). Cada HCVR y LCVR está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el término amino al término carboxi en el orden siguiente: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4.
La sustitución de uno o más residuos CDR u omisión de una o más CDRs es posible también. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los cuales puede prescindirse de una o más CDRs para fijación. Padlan ef al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizó las regiones de contacto entre anticuerpos y sus antígenos, basadas en estructures cristalinas publicadas, y llegó a la conclusión de que sólo aproximadamente un quinto a un tercio de los residuos CDR están realmente en contacto con el antígeno. Padlan encontró también muchos anticuerpos en los cuales una o dos CDRs no tenían aminoácido alguno en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos er al. 2002 J Mol Biol 320:4 5-428).
Los residuos CDR que no están en contacto con el antígeno pueden identificarse basándose en estudios previos (por ejemplo, los residuos H60-H65 en CDRH2 no se requieren a menudo), de regiones de CDRs Kabat que quedan fuera de las CDRs de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más residuos de la misma, éste se sustituye usualmente con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humana o un consenso de tales secuencias. Las posiciones para sustitución dentro de las CDRs y los aminoácidos a sustituir pueden seleccionarse también empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservadoras o no conservadoras.
La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto incluir anticuerpos que tienen regiones variable y constante derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAbs humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (v.g., mutaciones introducidas por mutagénesis in vitro aleatoria o específica del sitio o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en esta memoria, no tiene por objeto incluir mAbs en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (v.g., ratón), han sido injertadas en secuencias FR humanas.
Los anticuerpos anti-hANGPTL3 completamente humanos descritos en esta memoria pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones de entramado y/o CDR de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera en comparación con las secuencias correspondientes de la línea germinal. Tales mutaciones pueden comprobarse fácilmente por comparación de las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria con secuencias de la línea germinal disponibles de, por ejemplo, bases de datos de secuencias públicas de anticuerpos. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de fijación de antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones de entramado y/o CDR están mutados al o a los residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se derivaba el anticuerpo, o al o a los residuos correspondientes de otra secuencia de línea germinal humana, o a una sustitución de aminoácidos conservadora del o de los residuos de la línea germinal correspondiente (a tales cambios de secuencia se hace referencia colectivamente en esta memoria como "mutaciones de la línea germinal"). Una persona con experiencia ordinaria en la técnica, partiendo de las secuencias de región variable de las cadenas pesada y ligera descritas en esta memoria, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de fijación de antígeno que comprenden una o más retromutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, la totalidad de los residuos de entramado y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL están retromutados a los residuos que se encuentran en la secuencia original de la línea germinal de la cual se derivaba el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente ciertos residuos están retromutados a la secuencia original de la línea germinal, v.g., únicamente los residuos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1 , CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del o los residuos de entramado y/o CDR están mutados al o a los residuos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se derivaba originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones de entramado y/o CDR, v.g., en donde ciertos residuos individuales están mutados a los residuos correspondientes de una secuencia particular de la línea germinal en tanto que otros residuos que difieren de la línea germinal original se mantienen o están mutados al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de fijación de antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden testarse fácilmente en cuanto a una o más propiedades deseadas tales como especificidad de fijación mejorada, afinidad de fijación aumentada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o aumentadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de fijación de antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente invención.
La presente invención incluye también anticuerpos anti-ANGPTL3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR descritas en esta memoria que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-ANGPTL3 que tienen secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR con v.g., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, 2 ó 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos con relación a cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR descritas en esta memoria. En una realización, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 487 con 10 o menos sustituciones de aminoácidos conservadoras en ella. En otra realización, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 487 con 8 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 487 con 6 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 487 con 4 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización adicional, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 487 con 2 ó 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En una realización, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4444 con 10 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ellas. En otra realización, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 con 8 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización, a LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 con 6 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 con 4 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella. En otra realización adicional, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 con 2 o 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos en ella.
A no ser que se indique específicamente otra cosa, debe entenderse que el término "anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, abarca moléculas de anticuerpo que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas enteras de anticuerpo") así como fragmentos de fijación de antígeno de las mismas. Las expresiones "porción de fijación de antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de fijación de antígeno" de un anticuerpo, y análogas, como se utilizan en esta memoria, incluyen cualquier pollpéptido o glicoproteína existente naturalmente, obtenible enzimáticamente, sintético, o modificado por ingeniería genética que se fija específicamente a un antígeno para formar un complejo. Fragmentos de fijación de antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, v.g., de moléculas de anticuerpo enteras utilizando cualesquiera técnicas estándar adecuadas tales como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que Implican la manipulación y expresión de DNA codificante de dominios variables y (opclonalmente) constantes de anticuerpos. Dicho DNA es conocido y/o está disponible fácilmente de, v.g., fuentes comerciales, bibliotecas de DNA (con inclusión, v.g., de bibliotecas de anticuerpos de presentación de fago) o puede sintetizarse. El DNA puede secuenclarse y manipularse químicamente o por utilización de técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos cisteína, modificar, añadir o deleclonar aminoácidos, etc.
Ejemplos no limitantes de fragmentos de fijación de antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab, (¡i) fragmentos F(ab')2; (¡i¡) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarlas (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vli) unidades de reconocimiento mínimas constituidas por los residuos de aminoácidos que mimetizan la reglón hlpervariable de un anticuerpo (v.g., una región aislada determinante de la complementariedad (CDR) tal como un péptldo CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio simple, anticuerpos de dominios delecionados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos . injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (v.g. nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIPs), y dominios IgNAR variables de tiburón, están abarcados también dentro de la expresión "fragmento de fijación de antígeno", como se utiliza en esta memoria.
Un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos un CDR que es adyacente a o está en marco con una o más secuencias de entramado. En los fragmentos de fijación de antígeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados uno con relación a otro en cualquier configuración adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dímera y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL inonómero.
En ciertas realizaciones, un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable enlazado covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones ilustrativas no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1 ; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3¡ (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-Ch1-CH2-Ch3; (vi) VH-CH2-Ch3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1 -CH2; (xii) VL-Ch1-Ch2-CH3; (xiii) VL-Ch2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, con inclusión de cualquiera de las configuraciones ilustrativas arriba enumeradas, los dominios variables y constantes pueden estar enlazados directamente unos a otros o pueden estar enlazados por una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede estar constituida por al menos 2 (v.g., 5, 10, 5, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semi-flexible entre los dominios adyacentes variables y/o constantes de una molécula de polipéptido simple.
Además, un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variables y constantes arriba enumeradas en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monómeros (v.g., por uno o más enlaces disulfuro).
Como en el caso de las moléculas de anticuerpos enteros, los fragmentos de fijación de antígeno puede ser monoespecíficos o multiespecíficos (v.g., biespecífícos). Un fragmento de fijación de antígeno multiespecífico de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de fijarse específicamente a un antígeno separado o a un epítope diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, con inclusión de los formatos de anticuerpos biespecífícos ilustrativos descritos en esta memoria, puede adaptarse para uso en el contexto de un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando métodos de rutina disponibles en la técnica.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados a un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo.
La expresión "se fija específicamente", o análogas, significa que un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La fijación específica puede caracterizarse por una constante de disociación de equilibrio (KD) de aproximadamente 1 x 10"6 M o menor (es decir, una KD menor denota una fijación más fuerte). Métodos para determinar si dos moléculas se fijan específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmones de superficie, y análogos. Un anticuerpo aislado que fija específicamente hANGPTL3 puede, sin embargo, exhibir reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas ANGPTL3 de otras especies, por ejemplo, ANGPTL3 de mono cinomolgus, ANGPTL3 de ratón, ANGPTL3 de rata, y/o hANGPTL4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164. Además, anticuerpos multiespecíficos (v.g. biespecíficos) que se fijan a hANGPTL3 y uno o más antígenos adicionales se consideran sin embargo como anticuerpos que "fijan específicamente" hANGPTL3 como se utiliza en esta memoria.
La expresión anticuerpo "de afinidad alta" hace referencia a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de fijación a hANGPTL3, expresada como KD, de aproximadamente 2 x 10"9 M o menos, aproximadamente 1 ,5 x 10"9 M o menos, aproximadamente 1 x 10"9 M o menos, aproximadamente 0,5 x 10~9 M o menos, aproximadamente 0,25 x 10"9 M o menos, aproximadamente 1 x 10~10 M o menos, o aproximadamente 0,5 x 10"10 M o menos, como se mide por resonancia de plasmones de superficie, v.g., BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.
El término "KD", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto hacer referencia a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
Por la expresión "grado de disociación lento", "Koff" o "ka" se entiende un anticuerpo que se disocia de hANGPTL3 con una constante de velocidad de 4 x 10"3 s"1 o menos, 3 x 10 3 s"1 o menos, 2 x 10"3 s"1 o menos, 1 x 10~3 s"1 o menos, 1 x 0"4 s'1 o menos, tal como se determina por resonancia de plasmones de superficie, v.g. BIACORE™ .
Por la expresión "constante de afinidad intrínseca" o "ka" se entiende un anticuerpo que se asocia con hANGPTL3 con una constante de velocidad de aproximadamente 1 x 10 3 M"1 s" o mayor, como se determina por resonancia de plasmones de superficie, v.g. BIACORE™ .
Debe entenderse que un "anticuerpo aislado", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros mAbs que tienen especificidades de antígeno diferentes (v.g., un anticuerpo aislado que se fija específicamente a hANGPTL3 y está sustancialmente exento de mAbs que fijan específicamente antígenos distintos de hANGPTL3). Un anticuerpo aislado que fija específicamente hANGPTL3 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas ANGPTL3 de otras especies, tales como mono cinomolgus, ratón, rata, y/u otras proteínas afines, tales como ANGPTL4 humana.
Un anticuerpo "neutralizante", "de bloqueo", o "de anulación", como se utiliza en esta memoria (o un anticuerpo que "neutraliza", "bloquea", o "anula" la actividad de ANGPTL3), debe entenderse que hace referencia a un anticuerpo cuya fijación a ANGPTL3 da como resultado la inhibición directa de al menos una actividad biológica de ANGPTL3, como se evalúa por ensayos estándar in vitro conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse los Ejemplos más adelante). Los términos, "neutralizar", "inhibir", "bloquear" y "anular", pueden utilizarse en esta memoria de modo intercambiable. Un anticuerpo "no bloqueante" hace referencia a un anticuerpo cuya fijación ANGPTL3 no bloquea directamente una actividad direccionada de ANGPTL3 tal como se evalúa por ensayos estándar in vitro, pero puede ser todavía un anticuerpo "interferente" cuya fijación a ANGPTL3 da como resultado inhibición, reducción, atenuación, u otra interferencia indirecta de al menos una actividad biológica de ANGPTL3 in vivo, v.g., por mejora del aclaramiento de ANGPTL3 de la circulación. El aclaramiento de ANGPTL3 de la circulación puede mejorarse particularmente por una combinación de al menos dos anticuerpos no bloqueantes. La neutralización, inhibición, anulación, reducción, atenuación por interferencia, de una actividad biológica de ANGPTL3 puede evaluarse por medida de uno o más indicadores de la actividad biológica de ANGPTL3 por uno o más ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véanse también los ejemplos más adelante).
La expresión "resonancia de plasmones de superficie", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones biespecificas en tiempo real por detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo utilizando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
El término "epítope" es una región de un antígeno que es fijada por un anticuerpo. Los epítopes pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopes funcionales son por regla general un subconjunto de los epítopes estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopes pueden ser también conformacionales, es decir, estar compuestos de aminoácidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epítopes pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales de moléculas químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características específicas de carga.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idénticos", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando está alineado óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90%, y de modo más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotídicas, como se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se expone más adelante.
Cuando se aplica a polipéptidos, la expresión "semejanza sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas óptimamente, por ejemplo por los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de laguna por defecto, comparten al menos 90% de identidad de secuencia, de modo aún más preferible al menos 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (v.g., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren una de otra por sustituciones conservadoras, el porcentaje o grado de semejanza puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, v.g., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina, y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Grupos de sustitución conservadores de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazamiento conservador es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz log-probabilidad PAM250 descrita en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Un reemplazamiento "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz log-probabilidad PAM250 .
La semejanza de secuencia para polipéptidos se mide típicamente utilizando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas iguala las secuencias similares utilizando medidas de semejanza asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, con inclusión de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden utilizarse con parámetros por defecto a fin de determinar homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente afines, tales como polipéptidos homólogos de especies de organismos diferentes o entre una proteína de tipo salvaje y una muteína de la misma. Véase, v.g., la versión GCG 6.1. Las secuencias de polipéptidos pueden compararse también utilizando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en la versión GCG 6.1. FASTA (v.g., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones e identidad porcentual de secuencia de las regiones del solapamiento óptimo entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de organismos diferentes es el programa de computadora BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, que utilizan parámetros por defecto. Véase, v.g., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y (1997) Nucleic Acids Res 25: 3389 402.
Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el cual se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, la edad y el volumen de un individuo tratado, la ruta de administración, y análogos, y podrá ser averiguada por un experto en la técnica utilizando métodos conocidos (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science y Technology de Pharmaceutical Compounding).
Preparación de Anticuerpos humanaos Métodos para generación de anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de tales métodos conocidos puede utilizarse en el contexto de la presente invención para fabricar anticuerpos humanos que se fijan específicamente a ANGPTL3.
Utilizando tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para la generación de anticuerpos monoclonales, se aislan inicialmente anticuerpos quiméricos de afinidad alta para ANGPTL3 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental que sigue, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítope, y análogas.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades altas, poseyendo típicamente KD de aproximadamente 10"12 M a aproximadamente 10"9 M, cuando se mide por fijación a antígeno inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con regiones constantes humanas deseadas, por ejemplo, lgG1 o lgG4 de tipo salvaje, o lgG1 o lgG4 modificadas, para generar los anticuerpos totalmente humanos de la invención. Si bien la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de fijación de antígeno con afinidad alta y especificidad de diana de los anticuerpos residen en la región variable.
Mapeado de Epítope y Tecnologías Afines Para cribado respecto a anticuerpos que se fijan a un epítope particular, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lañe (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otras moléculas incluyen mutantes de escaneo de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63), o análisis de escisión de péptidos. Adicionalmente, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopes, extracción de epítopes, y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Proteína Science 9: 487-496).
El término "epítope" se refiere a un sitio de un antígeno al cual responden las células B y/o T. Los epítopes de las células B pueden estar formados a la vez por aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegado terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente durante la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por plegado terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítope incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8- 0 aminoácidos en una conformación espacial singular.
La Determinación del Perfil Asistida por Modificación (MAP), conocida también como Determinación del Perfil de Anticuerpos Basada en la Estructura del Antígeno (ASAP) es un método que clasifica grandes números de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las semejanzas del perfil de fijación de cada anticuerpo a superficies de antígeno modificadas química o enzimáticamente (US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítope singular claramente diferente de o que se solapa parcialmente con el epítope representado por otra categoría. Esta tecnología permite la filtración rápida de mAbs genéticamente idénticos, de tal modo que la caracterización puede enfocarse en mAbs genéticamente distintos. Cuando se aplica a cribado de hibridomas, la MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma raros que producen mAbs que tienen las características deseadas. La MAP puede utilizarse para clasificar los mAbs anti-ANGPTL3 de la invención en grupos de mAbs que fijan epítopes diferentes.
ANGPTL3 contiene un dominio de serpentín enrollado amino-terminal y un dominio carboxi-terminal semejante a fibrinógeno (FD) y la proteína ANGPTL3 forma un oligómero en ausencia de enlaces disulfuro intermoleculares (Ge et al., 2005, J Lipid Res 46: 1484- 490). Se ha comunicado que el dominio de serpentín enrollado N-terminal es importante en la inhibición de la actividad de LPL (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:4 804-41809). Así, en ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-ANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo fija un epítope dentro del dominio de serpentín enrollado N-terminal (residuos 17-209) de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 161 ) y neutraliza al menos una actividad de hANGPTL3 (v.g., la inhibición de la actividad de LPL). En otras realizaciones, el anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo fija un epítope dentro del dominio de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3 y neutraliza al menos una actividad de hANGPTL3, con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se fija específicamente a un epítope dentro de los residuos 17 a 200, 17 a 100, 17 a 70, 17 a 65, 17 a 60, 17 a 57, 17 a 55, 17 a 50, 17 a 45, 17 a 40, o 17 a 35, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161 ), opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se fija específicamente a un epítope dentro de los residuos 40 a 200, 40 a 100, 40 a 70, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 70, 58 a 200, 58 a 100, 58 a 70, 58 a 68, o 61 a 66 (conocido como un "motivo de fijación de heparina") de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161 ), opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO:170. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se fija a un epítope que puede implicar más de uno de los epítopes o residuos enumerados dentro de la región de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3, opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170.
En otras realizaciones, el anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo se fija a uno o más fragmentos de hANGPTL3, por ejemplo, un fragmento de al menos 5 residuos, al menos 7 residuos, al menos 10 residuos, al menos 20 residuos, al menos 30 residuos, al menos 50 residuos, al menos 70 residuos, al menos 100 residuos, al menos 150 residuos, o al menos 200 residuos, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161 ), opcionalmente con la salvedad de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO:170.
La presente invención incluye anticuerpos hANGPTL3 que se fijan al mismo epítope que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en esta memoria. Análogamente, la presente invención incluye también anticuerpos anti-hANGPTL3 que compiten para fijación a hANGPTL3 o un fragmento de hANGPTL3 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en esta memoria.
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se fija al mismo epítope que, o compite en cuanto a fijación con un anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de test se fija al mismo epítope que un anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia de la invención, se deja que el anticuerpo de referencia se fije a una proteína o péptido hANGPTL3 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de test para fijarse a la molécula hANGPTL3. Si el anticuerpo de test es capaz de fijarse a hANGPTL3 después de la fijación de saturación con el anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia, puede deducirse que el anticuerpo de test se fija a un epítope diferente que el anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia. Por el contrario, si el anticuerpo de test no es capaz de fijarse a la molécula hANGPTL3 después de fijación de saturación con el anticuerpo de referencia anti-hANGPTL3, entonces el anticuerpo de test puede fijarse al mismo epítope que el epítope fijado por el anticuerpo de referencia anti-hANGPTL3 de la invención.
Para determinar si un anticuerpo compite respecto a fijación con un anticuerpo de referencia anti-hANGPTL3, la metodología de fijación arriba descrita se realiza en dos orientaciones: en una primera orientación, se deja que el anticuerpo de referencia se fije a una molécula hANGPTL3 en condiciones de saturación seguido por evaluación de fijación del anticuerpo de test a la molécula hANGPTL3. En una segunda orientación, se deja que el anticuerpo de test se fije a una molécula hANGPTL3 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la fijación del anticuerpo de referencia a la molécula ANGPTL3. Si, en ambas orientaciones, sólo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de fijarse a la molécula ANGPTL3, se deduce entonces que el anticuerpo de test y el anticuerpo de referencia compiten para fijación a hANGPTL3. Como será apreciado por una persona con experiencia ordinaria en la técnica, un anticuerpo que compite para fijación con un anticuerpo de referencia puede no fijarse necesariamente al mismo epítope que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear esféricamente la fijación del anticuerpo de referencia por fijación a un epítope solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se fijan al mismo epítope o a un epítope solapante si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la fijación del otro al antígeno. Es decir, un exceso de un anticuerpo de 1 , 5, 10, 20 ó 100 veces de un anticuerpo inhibe la fijación del otro al menos un 50%, pero preferiblemente un 75%, 90%, o incluso 99% como se mide en un ensayo de fijación competitiva (véase, v.g., Junghans et al., Cáncer Res, 1990: 50:1495-1502). Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítope si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la fijación de un anticuerpo reducen o eliminan la fijación del otro. Dos anticuerpos tienen epítopes solapantes si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la fijación de un anticuerpo reducen o eliminan la fijación del otro.
Puede realizarse luego experimentación adicional de rutina (v.g., análisis de mutación de péptidos y fijación) para confirmar si la falta de fijación observada del anticuerpo de test es debida de hecho a fijación al mismo epítope que el anticuerpo de referencia o si un bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de fijación observada. Experimentos de esta clase pueden realizarse utilizando ELISA, RIA, resonancia de plasmones de superficie, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de fijación de anticuerpos disponible en la técnica.
I nmunoconjugados La invención abarca un anticuerpo monoclonal humano anti-ANGPTL3 conjugado a un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Agentes de citotoxina incluyen cualquier agente que es perjudicial para las células. Ejemplos de agentes de citotoxina y agentes quimioterapéuticos adecuados para formación de ¡nmunoconjugados se conocen en la técnica, véase por ejemplo, WO 05/103081.
Biespecíficos Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, o multiespecíficos. Los mAbs multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido diana o pueden contener dominios de fijación de antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, v.g., Tutt et al. (1991 ) J. Immunol. 147: 60-69. Los mAbs humanos anti- hANGPTL3 pueden enlazarse a o coexpresarse con otra molécula funcional, v.g., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar enlazado funcionalmente (v.g., por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de fijación.
Un formato de anticuerpo bi-específico ilustrativo que puede utilizarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio de inmunoglobulina (Ig) CH3 y un segundo dominio Ig CH3, en donde el primer y el segundo dominios Ig CH3 difieren uno de otro al menos en un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de un aminoácido reduce la fijación del anticuerpo biespecífico a Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ig CH3 fija proteína A, y el segundo dominio Ig CH3 contiene una mutación que reduce o anula la fijación de proteína A, tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMTG; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender adicionalmente una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse en el segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1 ; N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N, y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG4. Variaciones del formato de anticuerpo biespecífico descritas arriba se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
Bioequivalentes Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo anti-hANGPTL3 de la presente invención abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las correspondientes a los mAbs descritos, pero que retienen la capacidad de fijación de ANGPTL3 humana. Tales mAbs y fragmentos de anticuerpo variantes comprenden una o más adiciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia parental, pero exhiben actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los mAbs descritos. Análogamente, las secuencias de DNA codificantes de anticuerpos anti-hANGPTL3 de la presente invención abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones, o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-hANGPTL3 que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-hANGPTL3 de la invención. Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos y DNA variantes se han expuesto anteriormente.
Dos proteínas de fijación de antígeno o anticuerpos se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, las mismas son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuyas velocidad y magnitud de absorción no exhiben una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, sea dosis simple o dosis múltiple. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si los mismos son equivalentes en la magnitud de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y sin embargo pueden considerarse bioequivalentes debido a que tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para el alcance de concentraciones eficaces de fármaco en el cuerpo en, v.g., uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto fármaco particular estudiado. En una realización, dos proteínas de fijación de antígeno son bioequivalentes si no existen diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza, y potencia.
En una realización, dos proteínas de fijación de antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, con inclusión de un cambio clínicamente significativo en inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de fijación de antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o las condiciones de utilización, en el grado en que se conocen tales mecanismos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, v.g., (a) un test in vivo en humanos u otros mamíferos, en el cual la concentración del anticuerpo o sus metabolitos se miden en sangre, plasma, suero, u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) un test in vitro que ha sido correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en humanos; (c) un test in vivo en humanos u otros mamíferos en el cual el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) se mide en función del tiempo; y (d) en una prueba clínica bien controlada que establece seguridad, eficacia, o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-hANGPTL3 de la invención pueden construirse, por ejemplo, realizando diversas sustituciones de residuos o secuencias o delecionando residuos o secuencias terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, residuos cisteína no esenciales para actividad biológica pueden delecionarse o reemplazarse con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos después de la renaturalización.
Administración Terapéutica y Formulaciones La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de fijación de antígeno de los mismos de la presente invención y los métodos terapéuticos de utilización de las mismas. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con portadores, excipientes, y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar transferencia, suministro, tolerancia, y análogos mejorados. Una multitud de formulaciones apropiadas pueden encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas (catiónicas o aniónicas) que contienen lípidos tales como LIPOFECTIN™, conjugados de DNA, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mixturas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium de excipients para parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y el volumen del individuo a administrar, la enfermedad diana, el propósito del tratamiento, las condiciones, ruta de administración, y análogos. Cuando el anticuerpo de la presente invención se utiliza para tratamiento de diversas afecciones y enfermedades asociadas directa o indirectamente con ANGPTL3 , con inclusión de hipercolesterolemia, trastornos asociados con LDL y apolipoproteina B, y trastornos del metabolismo de los lípidos, y análogas, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa o subcutánea el anticuerpo de la presente invención en una sola dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, de modo más preferible aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y duración del tratamiento. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo de la invención pueden administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida por administración de una segunda o una pluralidad de dosis subsiguientes del anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente igual o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis subsiguientes están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Se conocen y pueden utilizarse diversos sistemas de suministro para administrar la composición farmacéutica de la invención, v.g., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptores (véase, v.g., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Métodos de introducción incluyen, pero sin carácter limitante, las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. La composición puede administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolus, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (v.g., la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica puede suministrarse también en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; véase en general la misma obra).
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede utilizarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 ).
En otra realización, pueden utilizarse materiales polímeros; véase, Medical Applications de Controlled Reléase, Langer y Wise (editores), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974). En otra realización adicional, puede situarse un sistema de liberación controlada en proximidad de la diana de la composición, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, v.g., Goodson, en Medical Applications de Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables se pueden preparar por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar, v.g., por disolución, suspensión o emulsionamiento del anticuerpo o su sal arriba descrita en un medio acuoso estéril o un medio aceitoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes adyuvantes, etc., que pueden utilizarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (v.g. etanol), un polialcohol (v.g., propilenglicol, polietilenglicol), un agente tensioactivo no iónico [v.g. polisorbato 80, HCO-50 (aducto con polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio aceitoso se emplean, v.g., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden utilizarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se envasa preferiblemente en una ampolla apropiada. Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse subcutáneamente o por vía intravenosa con una aguja y jeringuilla estándar. Adicionalmente, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo de suministro de tipo pluma tiene fácilmente aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de suministro de tipo pluma puede ser reutilizable o desechabie. Un dispositivo de suministro tipo pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que la totalidad de la composición farmacéutica contenida en el cartucho ha sido administrada y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse con un cartucho nuevo que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de suministro de tipo pluma puede reutilizarse luego. En un dispositivo desechable de tipo pluma, no hay ningún cartucho reemplazable. En lugar de ello, el dispositivo de suministro de pluma desechable se adquiere previamente lleno con la composición farmacéutica contenida en un depósito en el interior del dispositivo. Una vez que el depósito está vacío de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo entero.
Numerosos dispositivos de suministro de tipo pluma reutilizables y autoinyectores tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de la composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos incluyen, pero evidentemente sin carácter limitante, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, y OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), para citar sólo unos pocos. Ejemplos de dispositivos de suministro tipo pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero evidentemente sin carácter limitante, los dispositivos SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk), y el KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral arriba descritas se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para proveer una dosis de los ingredientes activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad contenida del anticuerpo arriba citado es por regla general aproximadamente 0,1 a aproximadamente 800 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyección, el anticuerpo arriba citado está contenido en aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, en aproximadamente 5 a 300 mg, en aproximadamente 8 a 200 mg, y en aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg para las otras formas de dosificación.
Terapias de Combinación La invención proporciona adicionalmente métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades o trastornos que están directa o indirectamente asociados con hANGPTL3, por administración de un anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El agente terapéutico adicional puede ser uno o más de cualquier agente que está combinado ventajosamente con uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, con inclusión de inhibidores de la HNG-CoA-reductasa, tales como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastina, ros-uvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y análogas; niacina; diversos fibratos, tales como fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil, y análogos; activadores del factor de transcripción LXR, y análogos. Adicionalmente, el anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención puede co-administrarse con otros inhibidores de ANGPTL3 así como inhibidores de otras moléculas, tales como ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 y la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), que están implicadas en el metabolismo de los lípidos, en particular, la homeostasis del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas y anticuerpos que se fijan específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad (véanse, por ejemplo, los anticuerpos anti-PCSK9 dados a conocer en U.S. 2010/0166768 A1 ).
Además, el agente terapéutico adicional puede ser uno o más agentes anticáncer, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes anti-angiogénicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes apoptoticos, y otros agentes bien conocidos en la técnica para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos. Ejemplos de agentes anticáncer incluyen, pero sin carácter limitante, un agente anti-mitótico, tal como docetaxel, paclitaxel, y análogos; un compuesto quimioterapéutico basado en platino, tal como cisplatino, carboplatino, iproplatino, oxaliplatino, y análogos; otro agente citotóxico convencional, tal como 5-fluorouracilo, capecitabina, irinotecán, Leucovorina, gemcitabina, y análogos, y agentes anti-angiogénicos, con inclusión de antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tales como anticuerpos anti-VEGF, v.g., bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) y un bloqueador de VEGF basado en receptores, v.g., "VEGF trap" descrito en la patente US No. 7.070.919, antagonistas del ligando 4 tipo delta (DII4), tales como los anticuerpos anti-DII4 que se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2008/0181899, y una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de DII4, v.g., DII4-Fc como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2008/0107648; inhibidores de tirosina-quinasas receptoras y/o de la angiogénesis, con inclusión de sorafenib (NEXAVAR® por Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® por Pfizer), pazopanib (VOTRIENT™ por GlaxoSmithKIine), toceranib (PALLADIA™ por Pfizer), vandetanib (ZACTIMA™ por AstraZeneca), cediranib (RECENTIN® por AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506 por Bayer), axitinib (AG013736 por Pfizer), lestaurtinib (CEP-701 por Cephalon), erlotinib (TARCEVA® por Genentech), gefitinib (IRESSA™ por AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ por Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® por GlaxoSmithKIine), neratinib (HKI-272 por Wyeth/Pfizer), y análogos, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Adicionalmente, otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, con inclusión de fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDS), tales como inhibidores de la Cox-2, y análogos, pueden coadministrarse también con el anticuerpos hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención a fin de mejorar y/o reducir los síntomas que acompañan al cáncer/tumor subyacente.
El anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención y el o los agentes terapéuticos adicionales pueden co-administrarse juntos o por separado. Cuando se utilizan formulaciones de dosificación separada, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención y los agentes adicionales pueden administrarse simultáneamente, o por separado en momentos escalonados, es decir, secuencialmente, en ordenes apropiados.
Usos Diagnósticos de los Anticuerpos Los anticuerpos anti-ANGPTL3 de la presente invención pueden utilizarse también para detectar y/o medir ANGPTL3 en una muestra, v.g., para propósitos diagnósticos. Por ejemplo, un Ab anti-ANGPTL3 o fragmento del mismo puede utilizarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por expresión aberrante (v.g., sobre-expresión, infra-expresión, falta de expresión, etc.) de ANGPTL3. Ensayos diagnósticos ilustrativos para ANGPTL3 pueden comprender, v.g., poner en contacto una muestra obtenida de un paciente con un Ab anti-ANGPTL3 de la invención, en donde el anticuerpo anti-ANGPTL3 está marcado con un marcador o molécula informadora detectable o se utiliza para capturar y aislar selectivamente la proteína ANGPTL3 de muestras del paciente. Alternativamente, puede utilizarse un Ab anti-ANGPTL3 sin marcar en aplicaciones diagnósticas en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado detectablemente en sí mismo. El marcador o molécula informadora detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 1311 o 125l; un resto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, o luciferasa. Ensayos que pueden utilizarse para detectar o medir ANGPTL3 en una muestra incluyen ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), y análogos.
EJEMPLOS Los ejemplos que siguen se exponen a fin de proporcionar a los expertos en la técnica una exposición y descripción completas del modo de realizar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras utilizadas, pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A no ser que se indique otra cosa, el peso molecular es peso molecular medio, la temperatura se expresa en grados centígrados, y la presión es la atmosférica o está próxima a la misma.
Ejemplo 1 : Generación de Anticuerpos humanaos para ANGPTL3 humana Se inmunizaron ratones VELOCIMMUNE™ con ANGPTL3 humana, y la respuesta inmune del anticuerpo se monitorizó por inmunoensayo específico del antígeno utilizando suero obtenido de estos ratones. Células B que expresaban anti-hANGPTL3 se cosecharon de los bazos de los ratones inmunizados que se demostró tenían títulos elevados de anticuerpo anti-hANGPTL3 y se fusionaron con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Los hibridomas se cribaron y seleccionaron para identificar líneas de células que expresaban anticuerpos específicos de hANGPTL3 utilizando los ensayos que se describen más adelante. Los ensayos identificaron varias líneas de células que producían anticuerpos quiméricos anti-hANGPTL3, v.g., H1 M896N.
Se aislaron también anticuerpos humanos específicos de ANGPTL3 directamente de células B inmunizadas con antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en U.S. 2007/0280945 A1 . Se clonaron regiones variables de cadena pesada y ligera para generar anticuerpos anti-hANGPTL3 totalmente humanos de isotipo lgG4 designados como H4H1248P, H4H1250P, H4H1263S, H4H1268S, H4H1276S, H4H1279P, H4H1282P, H4H1292P, H4H1295P y H4H1296P. Se establecieron líneas de células CHO estables recombinantes que expresaban anticuerpos.
Ejemplo 2. Análisis de Utilización de Genes Variable Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, se clonaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que codificaban regiones variables de anticuerpo. A partir de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso de genes para cada Región Variable de Cadena Pesada (HCVR) y Región Variable de Cadena Ligera (LCVR). La Tabla 1 muestra el uso de genes para los anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención Tabla 1 La Tabla 2 muestra los pares de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos anti-hANGPTL3 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Las designaciones N, P y S se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesada y ligera con secuencias CDR idénticas pero con variaciones de secuencia en regiones que caen fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones de entramado). Así, las variantes N, P y S de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas en sus regiones variables de cadena pesada y ligera, pero contienen modificaciones en las regiones de entramado.
Tabla 2 Ejemplo 3. Parámetros Cinéticos de los Anticuerpos anti-hANGPTL3 que se Fijan a ANGPTL3 Todos los experimentos cinéticos de fijación se realizaron a 25°C o 37°C en un instrumento BIACORE™ T200 de interacción molecular sin etiqueta (GE Healthcare) utilizando un chip sensor CM5. Resumidamente, se generó una superficie de captura de antígeno por acoplamiento covalente de un anticuerpo específico anti-lgG de ratón (anti-mFc; GE Healthcare; catálogo #BR-1008-38) o un anticuerpo específico anti-pentahistidina (Qiagen; catálogo #34660) a la superficie de un chip sensor CM5 utilizando un método estándar de acoplamiento de amina. Utilizando HBS-EP(10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH 7.4) o PBSP (10 mM fosfato de sodio, 2.7 mM KCI, 137 mM NaCI, 0.025% Surfactant P20, pH 7.2 o 5.75) como el tampón de ejecución, se capturaron variantes humanas y de otras especies de ANGPTL3 con marcadores oligohistidina en la superficie acoplada a anti-penta-histidina hasta que se alcanzó una respuesta de fijación de 4,4-46,5 RUs. Las proteínas recombinantes capturadas eran: ANGPTL3 humana madura de longitud total (es decir, los residuos de aminoácidos 17-460 de SEQ ID NO: 161 ) con un marcador decahistidina C-term¡nal [[hANGPTL3(17-460)-H¡s; R&D Systems, MN; catálogo #3829-AN], dominio de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3 (i.e., residuos de aminoácidos 17-170 de SEQ ID NO:161 ) que contenían un marcador hexahistidina C-termínal [hANGPTL3(17-170)-His], dominio de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3 de Macaca fascicularis [i.e., residuos de aminoácidos 17-170 de SEQ ID NO:177 (una secuencia parcial de Macaca fascicularis ANGPTL3)] que contenía un marcador myc-myc-hexahistídina [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEQ ID NO:167], ANGPTL3 madura de longitud total de Mus musculus (i.e., residuos de aminoácidos 17-455 de SEQ ID NO:163) con un marcador decahistidina C-terminal [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; catálogo #136-AN], dominio de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3 de Mus musculus (i.e., residuos de aminoácidos 17-240 de SEQ ID NO:163) que contenía un marcador hexahistidina [mANGPTL3(17-240)-His; SEQ ID NO: 166], y un dominio de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3 de Rattus norvegicus (es decir, los residuos de aminoácidos 17-240 de SEQ ID NO: 175) que contenía un marcador hexahistidina myc-myc [rANGPTL3(17-240)-mmH; SEQ ID NO: 176]. Adicionalmente, el dominio de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3 (es decir, los residuos de aminoácidos 17-169 de SEQ ID NO: 161 ) que contenía una fusión Fe de ratón C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEQ ID NO: 165] se capturó en la superficie acoplada a anti-mFc hasta que se alcanzó una respuesta de fijación de 24,8 + 1 ,5 RUs. Para medir las velocidades de asociación y disociación para la formación del complejo anticuerpo/antígeno, se inyectaron una sola concentración (Tablas 3 y 7) o concentraciones múltiples (Tablas 4-6) de anticuerpo a través de la superficie de proteína capturada a un caudal de 50 µ?/minuto durante 3 minutos y se monitorizó la disociación del complejo durante 20 minutos. Los datos de fijación se procesaron y se ajustaron a un módulo de fijación 1 :1 con transporte de masa utilizando la versión 2.0a de Scrubber (BioLogic Software). Las semividas cinéticas (ti/2) se calcularon a partir de la constante de velocidad de disociación, kd.
La Tabla 3 muestra la fijación de diversos anticuerpos anti-hANGPTL3 a hANGPTL3 a 25°C, pH 7,4, en tampón HBS-EP.
Tabla 3 Como se muestra en la Tabla 3, los anticuerpos anti-hANGPTL3 se fijaban a la proteína de longitud total con un marcador decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His] con constantes de disociación de equilibrio calculadas (KD = kd/ka) comprendidas entre 96,8 pM y 5,61 nM y al dominio de serpentín enrollado N-terminal con una fusión Fe C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc] con KDs comprendidas entre 8,41 pM y 6,23 nM.
Las Tablas 4 y 5 muestran la fijación de especies cruzadas de H4H1276S a ANGPTL3 a 25°C y 37°C, respectivamente, a pH 7,4, en tampón HBS-EP. La Tabla 6 muestra la fijación de H4H1276S a ANGPTL3 humana y de cinomolgus, a 25°C o 37°C, a pH 5,75 o pH 7,2, en tampón PBSP.
Tabla 4 Tabla 6 Como se muestra en las Tablas 4-6, el anticuerpo H4H1276S exhibía fijación a ANGPTL3 de mono, ratón, y rata con afinidades de fijación y constantes cinéticas similares a las correspondientes a la fijación a ANGPTL3 humana.
La Tabla 7 muestra la fijación de anticuerpos anti-hANGPTL3 seleccionados a hANGPTL3 y mANGPTL3 a 37°C, pH 7,4, en tampón HBS-EP.
NB: no fijado.
Tabla 7 Como se muestra en la Tabla 7, los anticuerpos anti-hANGPTL3 fijados a la proteína de longitud total con un marcador decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His] a pH 7,4 y 37°C con constantes de disociación de equilibrio calculadas (KD = kd/ka) comprendidas entre 158 pM y 1 ,02 nM y a ANGPTL3 de ratón [mANGPTL3(17-455)-His] con valores KDs comprendidos entre 167 pM y 682 pM, excepto para H4H1248P y H4H1263S, que no exhibían fijación detectable a mANGPTL3. Se muestran también las semividas cinéticas (½).
Ejemplo 4. Estudio Biacore de Competición Cruzada para Anticuerpos anti- hANGPTL3 Se realizaron experimentos de competición cruzada a 25°C en un Biacore esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 anterior. Resumidamente, utilizando HBS-EP como el tampón de ejecución, se capturó hANGPTL3 de longitud total (es decir, los residuos de aminoácido 17-460 de SEQ ID NO: 161 ) con un marcador decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, M; catálogo #3829-AM] en la superficie acoplada a anti-penta-histidina hasta que se alcanzó una respuesta de fijación de 64 RUs. Para determinar si dos anticuerpos podrían fijarse simultáneamente a la ANGPTL3 capturada, se inyectaron secuencialmente pares de anticuerpos, cada uno a 167 nM a un caudal de 4 µ?/minuto durante 15 minutos, sobre la superficie, y se midió la señal de respuesta de fijación máxima (RU) para cada evento de fijación. Los resultados se muestran en la Tabla 8 con la respuesta de fijación para el primer anticuerpo (mAb1 ), seguido por la respuesta de fijación del segundo anticuerpo (mAb2) en la superficie de ANGPTL3 precargada con el primer anticuerpo. Los números en negrita indican que los pares de anticuerpos son capaces de fijarse a hANGPTL3 simultáneamente. Los números en cursiva indican que los pares de anticuerpos son capaces de fijarse a hANGPTL3 simultáneamente cuando se añaden secuencialmente en una dirección pero no en la otra. Los corchetes indican auto- competición consigo mismo ("self-self competition").
Tabla 8 Como se muestra en la Tabla 8, los pares de anticuerpos H1 M896N/H4H1279P y H1 M896N/H4H1292P eran capaces de fijarse simultáneamente a ANGPTL3 inmovilizada, con indiferencia del orden de adición de los anticuerpos. H4H1250P se fijaba a ANGPTL3 pre-fíjada a H4H 279P; sin embargo, cuando se invirtió el orden de adición de los anticuerpos, H4H1279P exhibía una señal de fijación aproximadamente 24% de la respuesta máxima esperada después que ANGPTL3 se pre-fijó con H4H1250P. Análogamente, H4H1250P se fijaba a ANGPTL3 pre-fijada con H4H1292P; sin embargo, cuando se invirtió el orden de adición de los anticuerpos, H4H1292P exhibía una señal de fijación aproximadamente 20% de la respuesta máxima esperada después que ANGPTL3 se pre-fijaba con H4H1250P.
Ejemplo 5. Fijación del Anticuerpo anti-hANGPTL3 a los Péptidos de Serpentín Enrollado N-Terminales de ANGPTL3 Para evaluar la fijación del anticuerpo anti-ANGPTL3 H4H1276S a péptidos derivados de la región de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3, se realizó un ensayo de fijación de biosensores exentos de etiqueta utilizando el sistema OCTET® RED (FortéBio, Inc.). Para inmovilización en el sensor, los péptidos se etiquetaron con un marcador biotina N-terminal [separado por un enlazador flexible, aminoácidos "AGSSPGG" (SEQ ID NO: 171 , para Péptido 1 y Péptido 2; y los aminoácidos "GGGGS" (SEQ ID NO: 172) para Péptido 3], o un marcador biotina C-terminal [separado por un enlazador flexible, aminoácidos "GPSSGAPPPK" (SEQ ID NO: 173) para Péptido 1 y Péptido 2; y los aminoácidos "GGGGSK" (SEQ ID NO: 174) para Péptido 3]. Las secuencias peptídicas testadas fueron: un péptido de control negativo, Péptido 1 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 168); residuos Arg34 a Leu66 de ANGPTL4 humana de SEQ ID NO: 164); y péptidos derivados de la región de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3, es decir, Péptido 2 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 169); residuos Arg36 a Leu68 de hANGPTL3 de SEQ ID NO: 161 ); Péptido 2 marcado con biotina C-terminal; Péptido 3 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 170); corresponde a los residuos Glu32 a Leu57 de hANGPTL3 de SEQ ID NO: 161 ), y Péptido 3 marcado con biotina C-terminal. Las secuencias peptídicas se muestran también en la Figura 1 . Se recubrieron puntas de biosensor recubiertas con estreptavidina con los péptidos biotinilados dando como resultado 1.22-2,26 nm de unidades de respuesta de fijación dependiendo del péptido. Las puntas de biosensor recubiertas de péptido se sumergieron luego en pocilios que contenían 1 µ? de anticuerpo H4H1276S anti-hANGPTL3 o un anticuerpo de control negativo coincidente en isotipo, y se monitorizó la fijación durante 2,5 minutos. La respuesta de fijación de H4H1276S y el anticuerpo de control de isotipo a cada uno de los péptidos se resume en la Figura 2. Se observó que H4H1276S se fija a la secuencia lineal de ANGPTL3 definida por el Péptido 2 pero no a la secuencia solapante pero distinta definida por el Péptido 3 (véase también la Figura 1 ). El anticuerpo de control de isotipo servía también como control positivo para carga del Péptido 1 (es decir, el péptido hANGPTL4) en el biosensor, dado que este anticuerpo de control de isotipo reconoce específicamente hANGPTL4. Como se muestra en la Figura 2, la fijación del anticuerpo de control al Péptido 1 confirmaba que el Péptido 1 estaba presente en la superficie del sensor y lo mismo ocurría con los otros péptidos.
Ejemplo 6. Inhibición de hANGPTL3 por Anticuerpos anti-hANGPTL3 en Bioensayos de LPL La lipoproteinlipasa (LPL) juega un papel crítico en el metabolismo de los lípidos en humanos. LPL cataliza la hidrólisis de los triglicéridos y libera ácidos grasos para ser metabolizados. ANGPTL3 inhibe la actividad de LPL conduciendo a un nivel incrementado de lípidos (Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 1 1 (10): 473-479). La región de serpentín enrollado N-terminal de ANGPTL3 inhibe la LPL cuando se expresa sin la región de fibrinógeno C-terminal y parece conferir por tanto su función inhibidora. Se desarrolló un bioensayo sin células para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-hANGPTL3 para inhibir la disminución inducida por ANGPTL3 en la actividad de LPL.
La inhibición de la actividad de hANGPTL3 por los anticuerpos anti-hANGPTL3 se determinó utilizando el Test Fluorométrico Continuo de Lipasa CONFLUOLIP™ (Progen, Alemania) utilizando tres proteínas hANGPTL3: hANGPTL3 madura de longitud total (i.e., residuos de aminoácidos 17-460 de SEQ ID NO:161 ) con un marcador decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; catálogo #3829-AN], la región de serpentín enrollado N-terminal (i.e., residuos de aminoácidos 17-169 de SEQ ID NO: 161 ) con una fusión Fe de ratón C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEQ ID NO:165], y el dominio de serpentín enrollado N-terminal de hANGPTL3 (i.e., residuos de aminoácidos 17-170 de SEQ ID NO:161 ) que contenían un marcador hexahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-170)-His].
Resumidamente, se premezclaron LPL de bovino (concentración final de 2 nM), ApoCII humana (un cofactor de LPL, concentración final de 0,23 µ?) y BSA (concentración final de 2 mg/ml) en PBS. Las proteínas recombinantes hANGPTL3 se añadieron a la mixtura Apo/LPL (concentraciones finales de 80-100 nM). Se añadieron luego las mixturas de proteínas Apo/LPL/ALGPTL3 junto con anticuerpos anti-hANGPTL3 diluidos en serie y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 100 µ? de sustrato lipasa reconstituido, 1 -trinitrofenil-amino-dodecano¡l-2-pirendecanoil-3-O-hexadecil-sn-glicerol (LS-A, Progen) a 25 µ? de la mixtura de anticuerpos a una placa de ensayos de 96 pocilios y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Se midió luego la fluorescencia a 342 nm/400 nm (excitación/emisión) utilizando un Lector de Microplacas FLEXSTATION® 3 (Molecular Devices, CA). La fluorescencia es directamente proporcional a la actividad de LPL.
El anticuerpo H4H1276S exhibía inhibición de la actividad inhibidora de hANGPTL3's contra LPL. Se realizó en primer lugar una dosis-respuesta completa utilizando la proteína hANGPTL3 en el ensayo LPL para determinar la CE50 de ANGPTL3 para cada experimento, y se realizaron luego determinaciones de Cl50 para el anticuerpo utilizando concentraciones constantes de proteína ANGPTL3, como se muestra en la Tabla 8. Se determinó que las concentraciones de anticuerpo requeridas para inhibición máxima de 50% (Cl50) eran 9,6 nM para 80 nM hANGPTL3(17-460 )-His, 2,9 nM para 100 nM hANGPTL3(17-170)-His y 21 nM para 80 nM hANGPTL3(17-169)-mFc, respectivamente. Las concentraciones de anticuerpos oscilaban desde 0 a 300 nM para el test de las proteínas humanas ANGPTL3.
Análogamente, se testó H4H1276S en el bioensayo de LPL en cuanto a su capacidad para inhibir ortólogos de especies cruzadas: la región N-terminal del mono cinomolgus (residuos de aminoácidos 17-170 de SEQ ID NO: 177) se expresaba con un marcador myc-myc-hexa-histidina C-terminal [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEQ ID NO: 167], los residuos de aminoácidos 17-240 de la región N-terminal ortóloga de ratón de SEQ ID NO:163 con un marcador hexa-histidina C-terminal [mANGPTL3(17-240)-His; SEQ ID NO:166], y ANGPTL3 madura de longitud total de Mus musculus (i.e., residuos de aminoácidos 17-455 de SEQ ID NO:163) con un marcador decahistidina C-terminal [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; catálogo #136-AN]. Se determinó que las CI50s eran 10 nM para MfANGPTL3 500 nM constante (17-170)-mmH, 14 nM para mANGPTL380 nM constante (17-455)-His, y 31 nM para mANGPTL3500 nM constante (17-240)-His. Las concentraciones de anticuerpos oscilaban desde 0 a 600 nM en el caso del test de proteínas ANGPTL3 de mono y de ratón. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
Se ha demostrado también que los anticuerpos contra la región N-terminal de la proteína homologa ANGPTL4 bloquean la función inhibidora de ANGPTL4 en LPL (Lee et al., 20009, J. Biol. Chem. 284:13735-13745). Por esta razón, a fin de evaluar la posible reactividad cruzada con ANGPTL4, se testó también el anticuerpo inhibidor anti-ANGPTL3 H4H1276S contra ANGPTL4 humana en el ensayo de la lipasa LPL, realizado como se ha descrito arriba para las proteínas ANGPTL3. Una forma recombinante de la región de serpentín enrollado de ANGPTL4 humana (residuos 26-148 de SEQ ID NO:164) con una fusión lgG2a C-terminal de ratón [hANGPTL4(26-148)-mFc, SEQ ID NO:178] exhibía un valor CE50 en el ensayo LPL de 0,2 nM (Tabla 9). H4H1276S, testada a lo largo de un intervalo de concentraciones de 0-600 nM, no bloqueaba esta inhibición (NB: no fijado; en Tabla 9).
Tabla 9 Como se ha demostrado anteriormente, H4H1276S inhibía la actividad de ANGPTL3 humana (longitud total y N-terminal), la proteína ANGPTL3 de mono (N-terminal) y la ANGPTL3 de ratón (longitud total y N-terminal) en grados comparables con un intervalo Cl50 de aproximadamente 3-31 nM.
Se testaron también un subconjunto de anticuerpos a fin de determinar si combinaciones de dos anticuerpos ANGPTL3 no bloqueantes añadidos simultáneamente podrían bloquear la actividad inhibidora de LPL de ANGPTL3. Se testaron pares de anticuerpos respecto a la inhibición de los dominios N-terminales de ANGPTL3 humana y de ratón, es decir, hANGPTL3(17-169)-mFc y mANGPTL3(17-240)-His, respectivamente. Para este ensayo, las proteínas ANGPTL3 exhibían valores CI50 para bloqueo de LPL de 47 nM [para hANGPTL3(17-169)-mFc] y 341 nM [para mANGPTL3(17-240 )-His]. Los pares siguientes, cuando se añadieron a concentraciones finales para cada anticuerpo de al menos 200nM, no bloqueaban la inhibición de LPL por hANGPTL3(17-169)-mFc a 80nM o por mANGPTL3(17-240 )-His a 500 nM: H1 M896N + H4H1279P; H4H1250P + H4H1279P; H4H1248P + H4H1292P; y H4H1263S + H4H1292P. En este mismo ensayo, H4H1276S solo bloqueaba estas mismas concentraciones constantes de ANGPTL3 humana y de ratón con valores CI50s de 33 nM y 64 nM, respectivamente.
Ejemplo 7.1. Efecto in vivo del Anticuerpo anti-hANGPTL3 sobre los Niveles de Lípidos en Suero Se determinó el efecto del anticuerpo H4H1726S anti-hANGPTL3 sobre los niveles de lípidos en el suero en ratones C57BI/6. Los ratones se pre-sangraron 7 días antes del experimento y se pusieron en grupos de seis ratones cada uno para cada dosis de anticuerpo testada. Los anticuerpos se administraron a niveles de dosificación de 5 mg/kg (H4H1726S) y 10 mg/kg [H4H1726S y control de hlgG4(S108P) de isotipo coincidente con especificidad irrelevante] por inyección subcutánea el día 0 del estudio. Los ratones se sangraron después de 4 horas de ayuno los días 1 , 4, 7 y 12 después de las inyecciones de anticuerpos y se determinaron los niveles de lípidos en el suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no-HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) en el suero por un Sistema de Química ADVIA® 1800 (Siemens). Se calcularon los valores medios para cada uno de los momentos puntuales y para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (valor medio ± SEM) de concentración de lípidos en suero, se muestran en las Tablas 10-14.
Tabla 10 Tabla 11 Tabla 13 Tabla 14 Los niveles de H4H1726S circulante (Ab del suero) se determinaron también utilizando un ensayo estándar ELISA. Resumidamente, se recubrieron placas con un anticuerpo de cabra anti-Fc humana (Sigma-Aldrich) para capturar Ab del suero. Se añadió luego suero a las placas y el anticuerpo humano capturado se detectó por quimioluminiscencia utilizando un anticuerpo de cabra anti-lgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (valor medio ± SÉM) se muestran en la Tabla 15. Control: ratones que recibieron un Ab de control de isotipo coincidente.
Tabla 15 La administración simple de H4H1276S a ratones C57BI/6 a 10 mg/kg condujo a una reducción de ~ 60% en los triglicéridos circulantes 7 días después de la administración del anticuerpo (comparado con control de isotipo). La administración de H4H1276S condujo también a una reducción significativa en colesterol total, colesterol no-HDL y colesterol HDL, y no tenía efecto alguno sobre el colesterol LDL. Se observó también una reducción en los niveles de lipidos, pero menos pronunciada, al nivel de 5 mg/kg comparado con los niveles de dosificación de 10 mg/kg; v.g., los triglicéridos en suero se redujeron un 44% (comparados con el control de isotipo) 7 días después de la administración del anticuerpo.
Ejemplo 7.2 Efecto in vivo de los Anticuerpos anti-ANGPTL3 sobre los Niveles de Lipidos en Suero La evaluación de los efectos in vivo de los anticuerpos H4H1276S anti-hANGPTL3 y el anticuerpo comparador 4.9.1 sobre los niveles de lipidos en el suero se realizó en ratones C67BI/6. El anticuerpo 4.9.1 se preparó basándose en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (VH) y SEQ ID NO: 32 (VL) como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2008/0177045 y como un ratón isotipo lgG1. Los ratones se pre-sangraron 7 días antes del experimento y se pusieron en grupos de seis ratones por grupo. Los anticuerpos H4H1276S, 4.9.1 , y los controles negativos de isotipo coincidente (lgG4 humano e lgG1 de ratón, respectivamente) con especificidad irrelevante se administraron a una dosis de 10 mg/kg por inyección subcutánea el día 0 del estudio. Los ratones se sangraron después de 4 horas de ayuno los días 1 , 7, 11 y 20 después de inyección de anticuerpos, y se determinaron los niveles de lipidos en el suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no-HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) en el suero utilizando un Sistema de Química ADVIA® 1800 (Siemens). Se calcularon las concentraciones medias de lípidos para cada uno de los momentos y para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (valor medio ± SEM) de concentración de lípidos en el suero se muestran en las Tablas 16-20.
Tabla 16 Tabla 17 Tabla 18 Tabla 19 Tabla 20 Una sola dosis de 10 mg/kg de H4H1276S en ratones C57BI/6 dio como resultado una reducción de los niveles de triglicéridos en plasma comparados con el control de isotipo los días 1 , 7, 1 1 y 20 después de la inyección del anticuerpo; y este efecto era más sostenido comparado con un solo tratamiento para el mismo nivel de dosis con el comparador 4.9.1 (Tabla 16). La administración de H4H1276S conducía también a una reducción en el colesterol total (Tabla 17) y el colesterol HDL (Tabla 20) en los ratones C57BI/6.
Ejemplo 8. Efecto in Vivo de H4H1276S sobre los Niveles de Lípidos en el Suero en Ratones Hiperlipidémicos ApoE"'" Se determinó el efecto del anticuerpo H4H1276S anti-hANGPTL3 sobre los niveles de lípidos en el suero en ratones ApoE"7". Estos ratones son hiperlipidémicos, encontrándose la mayor parte de su colesterol circulante en la forma de VLDL y LDL. Los ratones se presangraron 7 días antes del experimento y se pusieron en grupos de seis ratones por grupo. Los anticuerpos, H4H1276S y un control de isotipo coincidente (hlgG4) con especificidad irrelevante, se administraron a una dosis de 10 mg/kg por inyección subcutánea el día 0 del estudio. Los ratones se sangraron después de 4 horas de ayuno los días 1 , 4, 7 y 1 1 después de la inyección de anticuerpos; y se determinaron los niveles de lípidos en el suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no-HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) en el suero utilizando un Sistema de Química ADVIA® 1800 (Siemens). Se calcularon las concentraciones medias de lípidos para cada uno de los momentos puntuales y para cada grupo tratado con anticuerpo. Los resultados, expresados como (valor medio ± SEM) de concentración de lípidos en suero, se muestran en las Tablas 21-25.
Tabla 21 Tabla 22 Tabla 23 Tabla 24 Tabla 25 La administración simple de H4H1276S a ratones ApoE_/" a 10 mg/kg condujo a una reducción de ~ 72% (valor medio) en triglicéridos circulantes (Tabla 21 ) y una reducción de ~ 46% (valor medio) en colesterol LDL (Tabla 24) 7 días después de la administración del anticuerpo (comparado con el control Ab de isotipo coincidente, es decir, hlgG4). La administración de H4H1276S conducía también a una reducción en el colesterol total (Tabla 22) y el colesterol no-HDL (Tabla 23).
Los niveles de H4H1276S circulante (Ab del suero) se determinaron también utilizando un ensayo ELISA estándar. Resumidamente, se recubrieron placas con un anticuerpo de cabra anti-Fc humana (Sigma-Aldrich) para capturar Ab del suero. Se añadió luego suero a las placas y los anticuerpos capturados se detectaron por químioluminiscencia utilizando un anticuerpo de cabra anti-lgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (valor medio ± SEM), se muestran en la Tabla 26. (Control: ratones que recibieron un Ab de control de isotipo coincidente, es decir hlgG4).
Tabla 26 Ejemplo 9. Efecto in Vivo de H4H1276S sobre los Niveles de Lípidos Circulantes en Ratones Hiperlipidémicos Ldlr"'" Se determinó el efecto del anticuerpo H4H1726S anti-hANGPTL3 sobre los niveles de lípidos en el suero en ratones Ldlr-/-. Estos ratones son hiperlipidémicos, encontrándose una mayor parte de colesterol circulante en la forma de LDL debido a la falta de LDLR, el receptor principal para la absorción del colesterol LDL.
Los ratones se pre-sangraron 7 días antes del experimento y se pusieron en grupos de seis ratones. Los anticuerpos, H4H1726S y control negativo de isotipo coincidente (hlgG4), se administraron a una dosis de 10 mg/kg por inyección subcutánea el día 0 del estudio. Los ratones se sangraron después de 4 horas de ayuno los días 1 , 4, 7 y 1 1 después de inyección del anticuerpo y se determinaron los niveles de lípidos en el suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no-HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) utilizando un analizador de química clínica ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Se calcularon los valores medios para cada momento puntual y para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (valor medios ± SEM) de concentración de lípidos en el suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no-HDL, colesterol LDL y colesterol HDL), se muestran en las Tablas 27-31 , respectivamente. (Control = ratones que recibieron un anticuerpo de control de isotipo coincidente).
Tabla 27. Triglicéridos en suero (ml/dl) Tabla 29. Colesterol no-HDL (mg/dl) Tabla 30. Colesterol LDL (mg/dl) Tabla 31. Colesterol HDL (mg/dl) Como se muestra en las Tablas 27-31 , la administración de H4H1726S a ratones Ldlr-/- conducía a una reducción de, los triglicéridos en plasma con una reducción máxima observada de 44% (basada en valores medios). Se observaron también reducciones importantes en colesterol LDL (hasta 23%), así como colesterol total, colesterol no-HDL y colesterol HDL en los individuos tratados con H4H1726S. La reducción del colesterol LDL en los ratones deficientes para el receptor principal de la absorción de colesterol LDL (LDLR) sugiere un mecanismo independiente de LDLR para la reducción del colesterol LDL por inhibición de ANGPTL3.
Se determinaron también los niveles de H4H1726S circulante (Ab del suero) utilizando un ensayo ELISA estándar. Resumidamente, se recubrieron placas con un anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Sigma-Aldrich) para capturar Ab del suero. Se añadió luego suero a las placas y los anticuerpos capturados se detectaron por quimioluminiscencia utilizando un anticuerpo de cabra anti-lgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (valor medio ± SEM) se muestran en la Tabla 32. (Control = ratones que recibieron un anticuerpo de control de isotipo coincidente).
Tabla 32. Ab del Suero (Mg/ml) Como se muestra en la Tabla 32, los niveles en suero de H4H1726S disminuían a aproximadamente 21 pg/ml al cabo de 1 1 días después de la inyección de los ratones con 10 mg/kg de anticuerpo.
La presente invención no debe considerarse limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas en esta memoria. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en esta memoria serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede y las figuras que se adjuntan. Debe entenderse que tales modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

REIVINDICACIONES Se reivindica:
1. - Un anticuerpo humano aislado o fragmento de fijación de antígeno del mismo que se fija específicamente a la proteína 3 humana de tipo angiopoyetina (hANGPTL3) de SEQ ID NO: 161 y neutraliza, reduce, o interfiere con al menos una actividad de hANGPTL3.
2. - El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se fija a un epítope situado dentro de la región de serpentín enrollado N-terminal en los residuos 17 a 209 de SEQ ID NO: 161.
3.- El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo no se fija al péptido ANGPTL3 de SEQ ID NO: 170.
4. - El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el epítope está situado dentro de los residuos 17 a 200, 17 a 100, 17 a 70, 17 a 65, 17 a 60, 17 a 57, 17 a 50, 40 a 200, 40 a 100, 40 a 70, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 70, 58 a 200, 58 a 100, 58 a 70, 58 a 68, o 61 a 66, de SEQ ID NO:161.
5. - El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo totalmente humano.
6. - El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:2, 18, 34, 50, 66,- 82, 98, 114, 130, 146 y 180; y/o una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154 y 188.
7. - El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 180/188.
8.- El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo o fragmento comprende secuencias de región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada, HCDR1 , HCDR2 y HCDR3, y secuencias CDR de cadena ligera, LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, contenidas dentro de un par de secuencias (HCVR/LCVR) de una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 180/188.
9. - El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 8, en donde la combinación de secuencias HCDR1/HCDR2/HCDR3 se selecciona del grupo constituido por SEQ ID NO:4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 y 182/184/186; y/o la combinación de secuencias LCDR1/LCDR2/LCDR3 seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 y 190/192/194.
10. - El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 8 ó 9, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una combinación de secuencias HCDR1 /HCDR2/HCDR3/LCDR1 /LCDR2/LCDR3 seleccionada del grupo constituido por 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194.
11. - Un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno del mismo que compite para fijación a hANGPTL3 con, o que se fija al mismo epítope en hANGPTL3 que un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno que comprende una combinación de secuencias de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo constituido por 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194.
12. - El anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en donde el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno reacciona de manera cruzada con ANGPTL3 de mono cinomolgus.
13. - El anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno reacciona de manera cruzada con ANGPTL3 de ratón o de rata.
14. - El anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el anticuerpo o fragmento reacciona de manera cruzada con cualquiera de ANGPTL3 de mono cinomolgus, ANGPTL3 de ratón, y ANGPTL3 de rata.
15.- El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monocatenario, un Fab, o un F(ab')2.
16. - Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. - Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16.
18. - Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 17.
19.- Un método de producción de un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de fijación de antígeno del mismo, que comprende dejar crecer la célula hospedadora de la reivindicación 18 en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo, y recuperar el anticuerpo o fragmento del mismo así producido.
20. - Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un portador farmacéuticamente aceptable.
21. - La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una combinación de secuencias de región determinante de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID NO: 68/70/72/76/78/80, o un par HCVR/LCVR de región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 66/74.
22.- La composición farmacéutica de la reivindicación 20, que comprende una combinación de anticuerpos o fragmentos de los mismos seleccionada del grupo constituido por pares de secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR) (HCVR/LCVR) de: (i) SEQ ID NO:82/90 y 180/188; (ii) SEQ ID NO:114/122 y 180/188; (iii) SEQ ID NO:82/90 y 18/26; y (iv) SEQ ID NO:114/122 y 18/26.
23.- La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende adicionalmente uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo constituido por un inhibidor de HMG-CoA reductasa; un inhibidor de la absorción de colesterol o la reabsorción de ácidos biliares, o ambos; un agente que aumenta el catabolismo de las lipoproteínas; un agente que reduce el número de ataques cardiacos no fatales; y un activador del factor de transcripción LXR.
24.- La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo constituido por estatina, niacina, fibrato, anticuerpo anti-hANGPTL4 y anticuerpo anti-PCSK9.
25.- Un método para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno que se previene, alivia, mejora o inhibe por reducción o inhibición de la actividad de ANGPTL3, que comprende administrar a un individuo en necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24.
26. - Un método para prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno que se previene, alivia, mejora o inhibe por reducción o inhibición de la actividad de ANGPTL3, que comprende administrar a un individuo en necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
27. - El método de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente administrar al individuo uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo constituido por un inhibidor de HMG-CoA reductasa; un inhibidor de la absorción de colesterol o la reabsorción de ácidos biliares, o ambos; un agente que aumenta el catabolismo de las proteínas; un agente que reduce el número de ataques cardiacos no fatales; y un activador del factor de transcripción LXR.
28.- El método de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente administrar al individuo uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo constituido por estatina, niacina, fibrato, anticuerpo anti-hANGPTL4 y anticuerpo anti-PCSK9.
29. - El método de la reivindicación 27 ó 28, en donde uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos y uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran simultánea o sucesivamente.
30. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, en donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo constituido por hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia aterogénica, una enfermedad o trastorno cardiovascular, pancreatitis aguda, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes y obesidad.
31. - Un método de mejora del aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación de un individuo en necesidad de ello, que comprende administrar al individuo al menos dos anticuerpos o fragmentos de fijación de antígeno de los mismos que no compiten entre sí para fijación a hANGPTL3 y no bloquean al menos una actividad de hANGPTL3.
32.- El método de la reivindicación 31 , en donde la actividad de hANGPTL3 es la inhibición de la actividad de lipoproteinlipasa (LPL).
33.- El método de la reivindicación 31 ó 32, en donde los dos anticuerpos se seleccionan del grupo constituido por pares de secuencias (HCVR(LCVR) de región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR) de: (i) SEQ ID NO:82/90 y 80/188; (ii) SEQ ID NO:82/90 y 18/26; (l¡¡) SEQ ID NO:114/122 y 180/188; y (iv) SEQ ID NO: 114/122 y 18/26.
34. - La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que se previene, alivia, mejora o inhibe por reducción o inhibición de la actividad de ANGPTL3.
35. - La composición farmacéutica de la reivindicación 34, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo constituido por hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia aterogénica, una enfermedad o trastorno cardiovascular, pancreatitis aguda, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes y obesidad. RESUMEN Se proporciona un anticuerpo totalmente humano o fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo humano que se fija específicamente e inhibe o interfiere con al menos una actividad de la proteína 3 de tipo angiopoyetina humana (hANGPTL3). Los anticuerpos anti-hANGPTL3 humanos son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con ANGPTL3, tales como hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, con inclusión de hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, etcétera. Adicionalmente, los anticuerpos anti-hANGPTL3 pueden administrarse a un individuo en necesidad de ello para prevenir o tratar enfermedades o trastornos, para los cuales el metabolismo anormal de los lípidos es un factor de riesgo. Tales enfermedades o trastornos incluyen enfermedades cardiovasculares, tales como ateroesclerosis y enfermedades de las arterias coronarias; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); diabetes; obesidad; y análogos.
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