MX2013013115A - Uso de compuestos de tiazolida para la prevencion y tratamiento de enfermedades virales, cancer y enfermedades causadas por infecciones intracelulares. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una tiazolida en la estimulación del sistema inmunitario un sujeto en necesidad de la misma, de este modo preservando y/o tratando enfermedades virales, cáncer y enfermedades causadas por infecciones protozoarias intracelulares.

Description

USO DE COMPUESTOS DE TIAZOLIDA PAPA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES VIRALES, CÁNCER Y ENFERMEDADES CAUSADAS POR INFECCIONES INTRACELULARES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para inmunomodulación, incluyendo la prevención o tratamiento de enfermedades virales, . cáncer y. enfermedades causadas por infecciones protozoarias intracelulares .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La influenza es una enfermedad respiratoria aguda altamente contagiosa gue afecta a todos los grupos de edades y causa alrededor de 36,000 muertes y más de 226,000 hospitalizaciones por año únicamente en . los Estados Unidos de América. Se clasifica, (como tipos A, B, y C) de acuerdo a diferencias antigénicas en su nucleoproteina y proteina matriz, los virus de la influenza son. virus de ARN de hebra negativa, envueltos. Los muchos subtipos de virus DE influenza A difieren en sus dos glicoproteinas de superficie, hemaglutinina ("HA") ..y neuraminidasa ("NA"), que son los objetivos principales de la respuesta . inmunitaria protectora, y se etiquetan de acuerdo al tipo de hemaglutinina (denotada con un número H) y neuraminidasa (denotada con un número N)..

HA y ÑA varían continuamente como, resultado de variaciones genéticas menores., y. variaciones genéticas mayores. Se conocen dieciséis subtipos H (o "serotipos") y nueve subtipos N.

La hepatitis. B es una enfermedad infecciosa causada, por el virus de hepatitis 'B (HBV) . Alrededor de un cuarto de la población mundial, más de 2 mil millones de personas, se han infectado con el virus de la hepatitis B. La enfermedad aguda causa inflamación del hígado, vómito, ictericia y raramente, la muerte. La hepatitis B crónica', eventualmente causa cirrosis- hepática y- enfermedad fatal de cáncer a, con respuesta muy pobre a la quimioterapia actual. El virus de la hepatitis B tiene un genoma circular compuesto de ADN de hebra parcialmente doble .y, similar al retrovirus, replica, a través de. un intermedio de ARN . por transcripción inversa. Aunque, la replicación 'toma lugar en el hígado, el virus se esparce a la sangre donde las proteínas . específicas de virus y sus anticuerpos correspondientes se encuentran en las personas infectadas.' El cáncer se' caracteriza por el crecimiento incontrolable y la propagación de células anormales. Debido a que las células tümorales se derivan de células normales, el sistema inmunitarió hospedero no. reconoce los antígenos de células tümorales cómo . externos. Además, algunas células tümorales han desarrollado maneras para escapar del sistema de defensa inmünitário hospedero, eliminando antigenos o reduciendo el número de receptores en la superficie de la célula.

El melanoma es un. cáncer de piel maligno que se origina en los melanocitos. Si se detecta y trata de manera . temprana, es casi 100 por ciento curable. Sin el tratamiento temprano el- cáncer puede avanzar, propagarse y ser fatal. El melanoma es el cáncer de piel que causa la mayoría de las muertes. El melanoma de propagación superficial es el tipo más común de melanoma, especialmente entre gente joven. Este melanoma afecta la capa superior de la piel por un tiempo bastante largo antes de penetrar más profundamente. El lentigo maligno se encuentra más frecuentemente en las. personas de edad más avanzada que están^ crónicamente expuestas al sol. El melanoma lentiginoso acral' también se propaga superficialmente antes de penetrar más . rofundamente y es el melanoma más común en afroamericanos y asiáticos, y el menos común entre los caucásicos. El melanoma nodular es usualmente invasivo al tiempo en que es el que se diagnostica primero y es la forma más agresiva del , melanoma .

. La leucemia es un cáncer en la médula ósea o la sangre que se. caracteriza . por un. incremento anormal de las células de glóbulos blancos. La leucemia de células pilosas es una malignidad hematológica poco común caracterizada por la acumulación de linfocitos B anormales en la médula ósea, ' que interfiere con la producción de células, de glóbulos blancos, células de glóbulos rojos y plaquetas normales. La leucemia mieloide crónica (CML) es un cáncer de las células de glóbulos blancos caracterizado. por el crecimiento incrementado' e irregular de células predominantemente mieloides en la médula ósea y la acumulación de estas células en la sangre. Los linfomas no de Hodgkin pueden ' ser agresivos o indolentes, pueden ocurrir a cualquier edad y son frecuentemente marcados por ganglios linfáticos que son más grandes de lo normal, fiebre,, y pérdida de peso. Los linfomas no de Hodgkin de células B incluyen, linfoma de Burkitt, leucemia linfocitica . crónica/linforna linfocitico pequeño (CLL/SLL, por sus- siglas en inglés), linfoma difuso de células B grandes, . linfoma folicular, . linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma precursor B linfoide y linfoma de células del manto.. Los linfomas no de Hodgkin de células . T incluyen la micosis fungoide, linfoma' anaplástico de células grandes, y linfoma linfoblástico de precursor T.

El carcinoma de célula renal, que¦ incluye carcinoma de célula renal, carcinoma de pelvis renal y tumor ilms, es el tipo más común de cáncer de riñon en adultos. En 2010, hubo 58,240 nuevos casos estimados y 13,040 muertes .únicamente en los Estados. Unidos de América.

Aunque, los avances significativos a través de la biología molecular en la identificación de; antígenos de tumor y su producción en forma sintética y recombinante han permitido muchos enfoques sofisticados en el tratamiento del cáncer, el éxito inmunogénico de vacunas de células tumorales finalmente depende de la expresión del complejo de histoc.ompatibilidad mayor' (MHC) de expresión en células que presentan antígeno, y el reconocimiento de antigenos de tumor cómo "externos" por el sistema inmunitario hospedero. Sin embargo, la prevención y el tratamiento se han obstaculizado por la capacidad de los patógenos para escapar de la respuesta inmunitaria hospedera.

Por consiguiente, hay una fuerte necesidad en la técnica para el desarrollo de nuevas opciones profilácticas y de tratamiento . para . enfermedades virales y cáncer. la nitazoxanida ( 2- (acetoliloxi ) -N- ( 5-nitro-2-tiazolil ) benzamida) es un agente antiparasítico tiazolido que tiene la siguiente estructura: ¦ La tizoxanida. ' · es el metabolito circulante activo nitazoxanida. Después de la administración. oral nitazoxanida o mezclas de .nitazoxanida más tizoxanida' en humanos, estos compuestos son particularmente absorbidos del tracto intestinal, y la nitazoxanida es . rápidamente hidrolizada para formar tizoxanida en el plasma. 'La tizoxanida está enlazada a proteínas . del plasma y su vida media .de eliminación urinaria es de 7.3 horas. La tizoxanida está conjugada por. glucurono, y el fármaco se elimina en .la orina y la' bilis como tizoxanida o tizoxanida glucuronida. La vida media de . la; tizoxanida en ..el plasma es de sólo aproximadamente 1.5 hora. La tizoxanida tiene la siguiente estructura: ¦ La RM-484'8 es una tiazolida sustituida que. tiene la misma estructura como la tizoxanida, pero incluye un grupo cloro substituido por el grupo nitro, de este modo resultando en el compuesto N- ( 5-clorotia.zol-2-il ) -2-hidroxibenzamida . La nitazoxanida (Alinia®, NTZ) y tizoxanida (TIZ) son compuestos de tiazolida con actividad contra parásitos, bacterias anaeróbicas, y virus.. TZ está aprobada en los Estados Unidos de América para el tratamiento de diarrea causada por Cryptosporidium par.vum y Giardia lamblia. La NTZ y TIZ también inhiben la replicación de virus de ARN .y ADN incluyendo virus de influenza A y hepatitis C. En ensayos clínicos, la NTZ se mostró que es efectiva en el tratamiento de gastroenteritis por rotavirus, gastroenteritis por norovirus y hepatitis C crónica, y está en el desarrollo clínico de fase final para el tratamiento de influenza.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención' proporciona el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden una tiazolida para inmunomodular un sujeto en. necesidad de las mismas', incluyendo para prevención y/o tratamiento de enfermedades virales, cáncer y enfermedades causadas por infecciones' bacterianas o por protozoario intracelular . En una modalidad específica, la invención proporciona un método de estimular una respuesta inmunitaria . en un' sujeto en necesidad de la misma, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de tiazolida. Los . compuestos de tiazolida aceptables de la invención incluyen aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 7,645,783, 7,550,493, 7,285,567, .6,117,89.4, 6,020,35.3, 5 , 968 , 961 , 5 , 965 , 590 , . 5,935,591, . y 5,886,013, que se. incorporan aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad preferida el agente de tiazolida es nitazoxanida . En- otra modalidad preferida, el agente de tiazolida es tiz'oxanida. Aún en otra modalidad preferida, el agente de tiazolida es RM-4848 o es su profármaco . de éster-, RM-5038. En un aspecto preferido de la¦ invención, el sujeto padece una infección viral. En otro aspecto preferido de la invención, . el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección viral. En un aspecto de la invención, la . infección viral es influenza. La influenza puede ser causada por un virus seleccionado de H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, y H10N7. En otro aspecto de la invención, la infección viral es Hepatitis B. En una modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo. En otras modalidades preferidas, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un inhibidor de neuraminidasa, tal como Laninamivir, . Oseltamivir, Zanamivir o Peramivir, o un inmunoestimulante , tal como Imiquimod o Resiquimod, o un análogo . de adamantina, o una proteína de fusión sialidasa recombinante, o un fármaco anti-hepátitis B¿ Aún en otra modalidad preferida, el compuesto de tiazolida..se administra en combinación con una vacuna.

En otro aspecto preferido de la invención, el sujeto padece de un cáncer. En un aspecto preferido diferente de la invención, el sujeto está' en riesgo' de desarrollar un cáncer. En una modalidad, el cáncer es leucemia. Preferiblemente, la leucemia es una leucemia de célula pilosa o leucemia mileoide crónica. En un aspecto diferente de la invención, el cáncer es melanoma. Aún en otro aspecto de la invención, el cáncer es linfoma no de Hodgkin. En n aspecto adicional de la invención, el cáncer es carcinoma, de célula renal. En una modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo. En otra modalidad preferida de. la invención, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna,¦ o un inmuñoestimulante , o u fármaco anticáncer. El fármaco anticáncer puede incluir, pero no se limita a, STI571, CGP 74588, ?-ß-D-Arabinofuranosilcitosina (Ara-C)', doxorbicina, dacarbazina, cisplátina, bleomicina, vincristina, lomustina, vinblastina, carmustina, DTIC, tamoxifen, sunitinib, sorafenib e. interferón a.

En otro aspecto preferido de la invención, el sujeto padece de una infección por protozoario intracelular . En un aspecto preferido -diferente de la invención, el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por protozoario intracelular. En una modalidad, la infección por protozoario intracelular es Cryptosporidium spp. En un aspecto diferente de la invención, la infección por protozoario intracelular.es Leishmania spp. Aún en otro aspecto de la invención, la infección por protozoarió intracelular es Toxoplasma gondii. En un aspecto adicional de la invención, la .infección' por protozoarió intracelular es Trypanosoma cruzii. En una •modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo.

En otra . modalidad preferida de la invención, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna, o un inmunoestimulante, o un fármaco antiprotozoario . El fármaco antiprotozoario puede incluir, pero no se limita a, trimetoprim/sulfametoxazola , atoyacuona, clindamicina, pirimetamina , espiramiciha, diminazina, homidium, suramina, melarsamina, est.ibogluconato de sodio y meglumina antimoniata .

En otro aspecto preferido de la invención, el sujeto padece de . una infección bacteriana intracelular. En un aspecto preferido diferente .de la invención, el sujeto está en riesgo de. .desarrollar una infección bacteriana intracelular. En . una modalidad, la infección bacteriana intracelular es Micobacterium tuberculosis.

En una modalidad especifica, la invención proporciona un método, de tratamiento o prevención de una infección viral .en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva . de un compuesto de tiazolida. En una modalidad preferida el agente de- tiazolida es nitazoxanida . En otra modalidad preferida, el agente .de tiazolida es tizoxanidá. Aún en otra modalidad preferida-, el agente de tiazolida es R -4848 o un profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto de la invención, la infección viral es influenza. La influenza puede ser causada por un virus seleccionado de H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, y H10N7. En otro aspecto de la invención, la infección viral · es Hepatitis B. En otro aspecto de la invención, la infección .viral es diarrea o gastroenteritis causada por rotavirus o norovirus. En una. modalidad, preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo. En otras modalidades preferidas, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un inhibidor neuraminidasa, tal como Laninamivir, Oseltamivir, Zanamivir o Peramivir, o un inmunoes.timulan.te, tal como Imiquimod o Resiquimod, o un análogo de adamantina, o una proteína de fusión .sialidasa recombinante, o un fármaco antihepatitis B. Aún en . otra modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna.

. En otra modalidad específica, la invención proporciona un método dé tratamiento .o prevención de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva, de un- compuesto de tiazolida. En una modalidad preferida el agente de tiazolida es nitazoxanida . En otra, modalidad preferida, el agente de tiazolida es tizoxanida. Aún en otra modalidad . preferida, el agente de tiazolida es RM-4848. En un . aspecto particular de la invención, el cáncer es leucemia.. Preferiblemente, la leucemia es una leucemia de célula pilosa o leucemia mieloide crónica. En un. aspecto diferente de la invención, el cáncer es melanoma. Aún en. otro aspecto de la invención, el cáncer es linfoma no de Hodgkin. En un aspecto adicional de la invención, el cáncer es carcinoma ' de célula renal. En una modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo. , En otra modalidad preferida de la invención, el compuesto de tiazolida se administra en combinación con¦ Una vacuna, o un inmunoes.timulante , o un. fármaco anticáncer. El fármaco anticáncer puede incluir, pero no se limita a, STI571, ' CGP 74588, ?-ß-D-Arabinofuranosilcitosina (Ara-C.) , doxorbicina, dacarbazina,. cisplatina, bleomicina, vincristina, . lomustina, vinblastina, carmustina, DTIC, tamoxifen,. sunitinio, sorafenib e inferieron a.

Aún en otra modalidad ' especifica, la invención proporciona un método de tratamiento o prevención de infecciones por protozoario intracelular en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de tiazolida. En una modalidad . preferida el agente de tiazolida es nitazoxanida . En otra modalidad preferida, el agente de tiazolida es tizoxanida. Aún en otra modalidad preferida., el agente de tiazolida es' RM-4848. En un aspecto particular de la invención, la infección por protozoario intracelular es Cryptosporidium spp. En un aspecto diferente de la invención, el cáncer es melanoma. En un aspecto, diferente de la invención, la infección por protozoario intracelular es Leishmania spp. Aún en otro aspecto de la invención, la infección por protozoario intracelular es. Toxoplasma gondii. En un aspecto, adicional de la invención, la infección por protozoario intracelular. es Trypanosoma cruzii. En una modalidad preferida, el compuesto de tiazolida se administra solo. En otra modalidad preferida de la invención, el compuesto de tiazolida se administra . en combinación con una vacuna, o un inmunoestimulante, o un fármaco antiprotozoario . El fármaco antiprotozoario puede incluir,: pero no se limita a, trimetoprim sulfametoxazol , atovacuona, clindamicina, pirimetamina, espiramicina, diminácina, homidium, suramina, melarsamina, estibogluconato de sodio y antimoniato de meglumina.

En sujetos con deficiencias inmunitarias ,. la respuesta ínmunitaria requerida para . tratar o prevenir efectivamente una. enfermedad viral, el cáncer o infección bacteriana o por protozoario int.racelular ' pueden no ser producidas por tiazolidas usando¦· el régimen de dosificación que se usa típicamente para tratar exitosamente un sujeto con un sistema inmunitario . completamente . competente. Los : sujetos con deficiencias inmunitarias extremas pueden no ser buenos candidatos para el tratamiento con tiazolidas.. Los sujetos con inmunodeficiencias moderadas . pueden requerir dosis más altas de , tratamiento de tiazolida, dosificación más frecuente, o dosificación por un periodo más largó de tiempo que ' los sujetos, con sistemas inmunitarios completamente competentes. Los sujetos con infección por VIH que no han desarrollado inmunodeficiencias pueden tratarse efectivamente con tiazolidas, mientras que los sujetos con inmunodeficiencias asociadas con la ¦ infección por .VIH pueden requerir tratamiento 'con fármacos antirretrovirales para reducir la concentración viral del . VIH y restaurar parcialmente la función ínmunitaria antes o simultáneamente con terapia.de tiazolida. De este modo, el uso de tiozalidas para estimular la respuesta ínmunitaria puede adaptarse para pacientes con estado inmunitario.

La descripción . general anterior . y la siguiente descripción breve de las figuras y la descripción detallada son de ejemplificación y explicativas y se pretende que proporcionen explicación adicional de la invención como se reivindica. ' Otros objetivos, ventajas, y características novedosas serán fácilmente aparentes para aquellas personas expertas en la técnica, a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A, : IB, y 1C son gráficas que expresan monocitos CD14+ en la ausencia o presencia de diferentes dosis de Tizoxanida en condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los valores medios, S.E. y los valores p.

Las Figuras 2A, 2B, y 2C son. gráficas que expresan la modulación de Tizoxanida de la trayectoria TLR en PBMCs no estimuladas y estimuladas con gripa en la ausencia . o presencia de diferentes dosis de Tizoxanida en condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los valores medios .

Las Figuras 3A, .3B, y 3C son gráficas que expresan modulación de Tizoxanida de la trayectoria IFN en PBMCs no estimuladas y estimuladas con gripa en la ausencia o presencia de dosis diferentes de .Tizoxanida en condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los valores medios.

Las Figuras 4A y 4B son gráficas que expresan células CD4 + T que secretan · IFNg e IL2 que funcionan como auxiliares en la ausencia o presencia de diferentes dosis de Tizoxanida en . condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los valores medios, S.E. y valores p.

Las Figuras 5A, .5B, y 5C son gráficas que expresan células CD8+ t que expresan Perforina,¦ granzima, y Fas, que funcionan como, células T citotóxicas en la ausencia o presencia de diferentes dosis de Tizoxanida en condiciones no estimuladas o estimuladas con gripa. Se indican los valores medios, S.E. y valores p.

Las Figuras 6A, 6B, y 6C son gráficas que expresan porcentaje de células CD14+ que expresan TLR3 (Fig. 6A) , TLR7 (Fig. 6B) y TLR8 (Fig. 6C) en condiciones no. estimuladas o estimuladas con gripa.. Se indican los datos obtenidos en la ausencia o presencia . de cinco diferentes dosis de RM4848 ?.?µ??/ml; 10'um/ml ; 20µp?/p?1; 40 m/ml·) . Se muestran los valores medios, S.E. y valores p.

Las Figures 7A y 7B son gráficas que expresan expresión mARN de trayectoria de señalización del receptor tipo Toll seguido de la estimulación con tres diferentes dosis de RM4848 (1. ?µp?/????; '. ' ??µ???/ml; 20µm/ml) en condiciones no estimuladas (Figura 7A) y estimuladas con gripa (Figura 7B) .

La expresión de 84 genes implicada en la trayectoria de señalización de receptor . tipo Toll ha sido evaluada por RT-PCR cuantitativa de tiempo real, calculada con relación a cinco genes constitutivos y mostrada como expresión de veces de cambio de la muestra no ' estimulada . Sólo los objetivos mostrando diferentes niveles de expresión seguidos de la estimulación de Tizoxanida se indican en la figura.

Las Figuras 8A y 8B son gráficas que expresan expresión de mARN de trayectoria de señalización de interferón tipo I seguido de la estimulación con tres diferentes dosis de RM4R48 (1 . Opm/ml 10pm/ml; 20pm/ml) en condiciones no estimuladas (Figura 8A:) y estimuladas con gripa (Figura 8B) . La expresión de genes 84 implicada en la trayectoria de señalización de interferón Tipo 1 ha. sido evaluada por RT-PGR cuantitativa de tiempo real,' calculada con relación a cinco genes constitutivos y mostrada como expresión de veces de cambio de la muestra no estimulada. Sólo los objetivos que muestran diferentes niveles de expresión seguido de la estimulación Tizoxanida se indican en la figura.

Las Figuras 9A y 9B son gráficas que 'expresan porcentaje de células CD4+ T que secretan' IFNy (Figura 9A) e IL2 (Figura 9B) en condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los datos: obtenidos en la ausencia o en la presencia de cinco diferentes dosis de RM4848 (0.5pm/ml; ?.?µp?/mi; ??µ???/ml; 20µp?/??1; 40µp?/??1) . Se muestran los valores medios, S.E. y los valores p.

Las Figuras 10A, 10B, y 10C son gráficas que expresan una modalidad de la invención en donde el porcentaje de células CD8+ T que expresan granzima (Figura 10A) , perforina (Figura 10B) y Fas (Figura 10C) en condiciones no estimuladas y estimuladas con gripa. Se indican los datos obtenidos en la ausencia o la presencia de cinco diferentes dosis de RM4848 (0.5µ??/???1; 1. ?µp?/ml; ??µp?/ml; 20µp?/p?1 40µ??/G?1) . Se muestran los valores medios, S.É. y los valores p.

La Figura 11 muestra' gráficas que expresan una modalidad de la invención en donde la inhibición de replicación del VIH-1: niveles p24 en PBMC expuestos a VIH. (Panel A) y porcentaje de inhibición de replicación del VIH (Panel B) en la ausencia/presencia de diferentes dosis de tizoxanida (0.5µp?/???1; "1. ?µp?/ml) ) se evalúan en 5 días después de la infección. Se indican los valores medios, S.E.,' y valores p.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN . A menos que se especifique de otro modo, "el/la", o "uno/una" significan "uno' '(a) o más".

. . Las composiciones y métodos de la presente invención- son para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad de la misma, de este modo, previniendo y tratando infecciones y/o' condiciones de cáncer. El objetivo, de la invención . es proporcionar métodos efectivos, no invasivos, para prevenir y tratar una infección viral, una condición de cáncer y/o enfermedades causadas ,por infecciones protozoarias intracelulares en un sujeto en necesidad del mismo, estimulando una respuesta inmunitaria fuerte en el sujeto, que es mediada por el sistema inmunitario tanto innato como adquirido.

El sistema inmunitario innato, que confiere defensa de corto plazo, inmediata, contra infección, proporciona el reclutamiento d fagocitos y especialmente neutrófilos en el sitio de inflamación, que de nuevo estimulan la. liberación de leucocitos y linfocitos, con la producción concomitante de citoquinas, incluyendo TNF, HMGB1 e. IL-1. Los leucocitos innatos incluyen células exterminadoras naturales, mastocitos, eosinófilos, basófilos y fagocitos, incluyendo macrófagos, neutrófilos y células . dendriticas . Los receptores tipo Toll (TLRs) son componentes clave del sistema inmunitario innato, ya que detectan la infección microbiana y desencadenan las respuestas hospederas anti-microbianas . Los TLRs controlan múltiples funciones de las células dendriticas y desencadenan la cascada que lleva a la respuesta del sistema inmunitario adquirido, incluyendo la producción de interferones tipo 1 (IFNs 1). Los TLRs 3, 7,. 8 y 9 están implicados en la detección viral y reconocen los ácidos nucleicos patógenos. Los TLRs 1, 8 y 9 se ubican en compartimentos endolisosomales intracelulares .

El sistema inmunitario adquirido, o adaptado, que se desencadena en vertebrados cuando un patógeno evade el sistema inmunitario innato, es responsable del reconocimiento de antigenos "no auto" específicos durante la presentación de antígeno y de la respuesta inmunitaria enfocada a la eliminación . de patógenos externos o células infectadas con patógeno. En el sistema inmunitario adquirido, las células B están implicadas en la respuesta inmunitaria humoral, y las células T son responsables de las . respuestas inmunitarias mediadas, por células. Lá presentación de antigeno por las células dendríticas . estimula a las células T a volverse ya sea células CD8+ "citotóxicas" o células CD4+ "auxiliares".

En los ganglios . linfáticos, las células dendríticas presentan los antígenos "no auto" en su superficie acoplándolos al complejo de . histocompatibilidad Mayor (MHC, también conocido, en. humanos como antígeno leucocito humano (HLA) ) , que es reconocido por las células' T pasando a través de los ganglios linfáticos. Los' antígenos exógenos son usualmente exhibidos en moléculas MHC de clase II, que activan células CD4+ T auxiliares. Los antígenos endógenos producidos por virus que replican, dentro de una célula hospedera, se exhiben típicamente en . moléculas MHC de clase I, . y activan células -CD8+ T citotóxicas.. El sistema inmunitario adquirido incluye células T citotóxicas, también conocidas como TC, célula T exterminadora, o linfocito . T citotóxico (CTL). Una vez que el receptor de célula T (TCR) en las. células T. citotóxicas interactúa con una molécula MCH de clase I enlazada al péptido, el CTL se vuelve activado y se convierte en CTL efector, liberando citotoxinas, tal como perforina y granulisina, que forman poros en la membrana de plasma, de la célula, objetivo. La activación de CTL es regulada por linfocitos CD4+ o' células T auxiliares. Las células T auxiliares expresan receptores de célula T (TCR) que reconocen el antígeno enlazado a las moléculas MHC de ¦ clase II. Las células CD4+ T auxiliares efectoras pueden responder a una infección desencadenando una respuesta tipo Thl o Th2. La respuesta Thl lleva a la inmunidad mediada por célula y se caracteriza por la producción de Interferón gamma, que activa macrófagos e induce a las células B a producir anticuerpos. La respuesta Th2 lleva a inmunidad humoral y se caracteriza por la liberación de Interleucina 4, con la activación consecuente de células B y la producción de anticuerpos de neutralización. Generalmente, las respuestas Thl son más efectivas contra patógenos intracelulares, tales como virus y bacterias que están dentro de. las células hospederas, mientras que las respuestas. Th2 son más efectivas contra bacterias,, parásitos y toxinas extracelulares.

Los inventores actuales descubrieron que los efectos anti-virales de agentes tiozalida, en particular nitazoxanida, tizoxanida y RM-4848, o un profármaco del mismo, resulta de la . actividad inmunomoduladora de estos agentes, . que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria fuerte activando el sistema inmunitario tanto innato como adquirido. En particular, los inventores de la solicitud a.ctual descubrieron que la nitazoxanida, tizoxanida y RM-4848 estimulan la célula auxiliar T y actividad CTL,- la expresión TLR7 y T.LR8 y respuesta de interferón tipo I, induciendo un incremento en: 1) células CD4+ T que secretan IFNy e IL2, 2) desgranulación CTL, 3 ) células CD8+ T qµe expresan Fas, 4) monocitos que expresan TLR8, 5) expresión de mARN I FNa e IFNP, 6) mARN especifico para genes inducibles IFN. tipo I (MXA, PRKCZ, A-DAR, CXCL10, IRF1, PRKRA) , y 7) mRNA especifico para gen implicado en la presentación de MHC clase I (HLA-A, HLA-B, TAP1). Por consiguiente, estos agentes de tiozalida pueden usarse para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad de la misma, y en particular en sujetos que están en riesgo de desarrollar o están padeciendo de una enfermedad donde se necesita una respuesta inmunitaria fuerte, tal como infección viral, un cáncer o una enfermedad causada . por infección (es ) por protozoario intracelular . Adicionalmente, los métodos de la invención pueden usarse para aliviar los síntomas de la enfermedad, o como una medida preventiva en un sujeto.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan intercambiablemente, y se refieren a cualquier mamífero, incluyendo humanos, que tenga, o esté en riesgo de desarrollar, una infección viral o una condición de cáncer. El sujeto o paciente · es típicamente humano, sin embargo, otros sujetos o pacientes idóneos incluyen, pero no se limitan a, animales de laboratorio, tal como ratón, rata, conejo,, o conejillo de indias, animales de granja o animales domésticos o mascotas-. También se incluyen los primates no humanos .

Como se usa en la presente los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a Una reducción en la severidad y/o frecuencia, de síntomas, eliminación de síntomas y/o causa subyacente, prevención de la aparición de síntomas y/o su causa subyacente (por ejemplo, terapia profiláctica), mejora o remedio de daño, o reducción en la intensidad de la infección.

Como se . usa en lá presente, una "cantidad terapéuticamente activa" es una cantidad efectiva para eludir una' respuesta celular que es clínicamente importante.

Por "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, por ejemplo, el material puede incorporarse en . una composición farmacéutica y administrase a un paciente sin causar ninguno de los efectos biológicos indeseables ¦ o interactuando de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes dé la composición en la que está contenido. Cuando el término "farmacéuticamente aceptable" se usa para referirse a un -portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, se da a entender que el. portador o excipiente ha cumplido con los estándares. requeridos de pruebas toxicológicas y de fabricación o que está incluido en la Guia de Ingredientes Inactivos preparada por . la administración de Fármacos de E.U-.A.

Los métodos ¦ dé la presente invención contemplan la administración de formulaciones que contengan compuestos de tiozalida. Los compuestos de tiazolida de la invención aceptables son aquellos descritos en las Patentes de E.U.A Nos. 7, 645, 783, 7, 550, 493, 7, 285, 567,. 6 , 117 , 894 , '6 , 020 , 353 , 5,968,961, 5,965,590, 5,935,591, 5,886,013, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad. , Los compuestos de tiazolida preferidos son- nitazoxanida, tizoxanida o RM-4848, o su profármaco de éster, RM-5038. Se entiende que otros profármacos análogos u homólogos a RM-5038 también se prevén, y están en una modalidad de esta invención. Como se usa en la presente, el término "tiozalida" se. refiere a una tiazolida, un análogo de tiazolida o una tiozalida sustituida. Como se usa en la presente, el término "nitazoxanida" se refiere tanto a nitazoxanida (2- (acetoliloxi) -N- ( 5-nitro-2-tiazolil ) benzamida) como a un análogo de nitazoxanida, por ejemplo, a uno de los compuestos descritos en la patente de E.U.A. No. 7,285,567 o US 2007/0167504. Como se usa en la presente, el término "tizoxanida" se refiere a tizoxanida, un análogo de tizoxanida o una tizoxanida · sustituida. Nitazoxanida, tizoxanida, RM-4848 o cualquiera de los análogos de tiozalida puede administrase en ' la forma del compuesto per se, y/o, donde sea idóneo, en la forma de una sal, polimorfo, éster, amida, profármaco, . derivado, o similar, siempre y cuando la sal, polimorfo,, éster, amida, profármaco o derivado, sea farmacológicamente ' idóneo. Tales sales, ésteres, amidas, profármacos y otros derivados de estos agentes activos pueden prepararse usando procedimientos estándar conocidos por aquellas personas expertas ert la técnica de química orgánica y sintética y descritos, por ejemplo, por J. March, Advanced Organic Chemistry: . Reactions, Mechanisms and Structure, 4a Ed. (New York: W.iley-Interscience, 1992). La cantidad total dé nitazoxanida ?· tizoxanida en las composiciones de la invención es .típicamente alrededor de 60% a 75% en peso de la composición. Las composiciones pueden formularse para liberación inmediata, liberación controlada o liberación sostenida. Las composiciones pueden contener uno o más aditivos, derivados o excipientes adicionales farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes. son ingredientes terapéuticamente inertes que son. bien conocidos y apreciados en la técnica. Como se usa en la presente, el término "ingrediente inerte" se refiere a aquellos ingredientes terapéuticamente inertes que son bien conocidos en. la técnica de la ciencia farmacéutica, que .pueden usarse de manera sencilla o en varias combinaciones, e incluyen, por ejemplo, diluyentes, desintegradores, aglutinantes, agentes de suspensión, mejoradores de flujo, lubricantes, rellenos, agentes de recubrimiento, agente solubilizante, agentes edulcorantes, agentes colorantes, agentes saborizantes , y antioxidantes. Ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing .company", 19a edición, Easton, Pa.

Los ejemplos de diluyentes o rellenos incluyen, pero no se . limitan a, almidón, lactosa, xilitol, sorbitol, azúcar de confitería, azúcar compresible, dextratos, dextrina, dextrosa, fructosa, lactitol, manitol,. sacarosa, talco, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico o tribásico, dehidrato de fosfato de dicalcio, sulfato de calcio., y similares. La cantidad de diluyentes o rellenos puede estar en un intervalo de entre alrededor de 2% a alrededor de 15 % en peso de la composición entera .

Los ejemplos de desintegradores incluyen, pero . no se limitan a, ácido alginico, ácido metacrilico DVB, PVP reticulada, celulosa microcristalina, croscarmelosa de sodio, crospovidona, polacrilina de potasio, glicolato de almidón de sodio, almidón, incluyendo almidón de. maíz o mazorca, almidón pregelatini.zado y similares. Los desintegradores típicamente representan de alrededor de 2% a alrededor de 15 % en peso de 1?· composición entera.

Los ejemplos de aglutinantes incluyen, pero no se limitan a, almidones tal como almidón de papa, almidón de trigo, almidón de maíz; celulosa microcristalina; celulosas tal como hidroxipropil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa (HPMC) , etil celulosa, carboxi metil celulosa de. sodio; gomas naturales tales como goma arábiga, ácido, alginico, goma guar, glucosa líquida, dextrina, povidona, jarabe, óxido de polietileno, polivinil pirrolidona, poli-N-amida de vinilo, polietilenglicol , gelatina, poli propilen glicol, tragacanto, y similares. La cantidad de alutinantes es de alrededor de 0.2% .a alrededor de 14 % en peso de la composición entera.

Los ejemplos de mej oradores de flujo incluyen, pero no se limitan a, dióxido de silicio, sílice anhidro coloidal, trisilicato de magnesio, fosfato tribásico de calcio, silicato de calcio, silicato de magnesio, dióxido de silicio coloidal, celulosa, en polvo, almidón, talco,, y similares. La cantidad de los mejoradores de flujo es de alrededor de 0.01% a alrededor de 0.3 % en peso de la composición entera. ¦ Los ejemplos. de lubricantes incluyen,, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de aluminio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico, polietilenglicol , behenato de glicerilo, aceite mineral, estearil fumarato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado y similares. La cantidad de lubricantes es de alrededor de 0.2% a alrededor de 1.0 % en peso de la composición entera.

Las composiciones pueden contener un aglutinante que sea un polímero de viscosidad baja. Los ejemplos de polímeros de viscosidad baja incluyen,, pero no se limitan a, polímeros de hidroxipropil metilcelulosa de viscosidad baja tal como aquellos vendidos, por 'Dow Chemical bajo el nombre comercial "Methocel®" (por ejemplo, Methocel E5.0LV®, Methocel K100LV®, y Methocel F50LV®) y, polímeros de hidroxietilcelulosa de viscosidad baja. ' El polímero de viscosidad baja está típicamente presente en alrededor de 10% a alrededor de 20%, o de alrededor de. ,10% a alrededor de.1.5%, o preferiblemente alrededor de 12%, del peso total de la composición entera, o, en aquellas modalidades que tiene . porciones de liberación controlada y de liberación inmediata, el polímero de viscosidad baja en la porción de liberación controlada está típicamente presente en alrededor de 15% a alrededor de 20%, preferiblemente alrededor de 18%, del peso de la porción de liberación controlada. .

Las composiciones pueden además comprender un material de revestimiento. El material de revestimiento está típicamente presente como una capa exterior en la forma de dosificación que cubre completamente la formulación. Por ejemplo, en algunas modalidades, la forma de dosificación es un comprimido oral en el que la porción de liberación controlada forma una primera capa del comprimido y la porción de liberación inmediata forma una segunda capa que se deposita en la parte superior de la primera capa para formar un comprimido de núcleo. En tales modalidades, por ejemplo, el material de recubrimiento puede estar en la forma de una capa de recubrimiento exterior que se deposita en la parte superior del . comprimido de núcleo. El material de recubrimiento típicamente es de alrededor de 1% a alrededor de 5% en peso de la composición, y puede comprender hidroxipropilmetilcelulosa y/o polietilen glicol, y uno o más excipientes seleccionados del grupo que comprende agentes de recubrimiento, opacificantes, agentes '. enmascaradores de sabor, rellenos, agentes de pulido, agentes colorantes, agentes antiespesantes y similares:.. . Los ejemplos de sustancias de recubrimiento de película y métodos para usar tales sustancias de recubrimiento son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica.

Las composiciones presentes pueden usarse efectivamente para estimular el sistema inmunitario en un sujeto en necesidad del mismo, de este modo. tratando o previniendo una infección viral, un cáncer o enfermedades causadas por protozoario intracelular o infecciones bacterianas. La infección viral puede ser influenza,-, en particular una influenza causada por un virus seleccionado de H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, y H10N7, o Hepatitis B, o diarrea o gastroenteritis causada . por rotavirus o norovirus. El cáncer puede ser leucemia, incluyendo leucemia de célula pilosa . y leucemia- mieloide crónica, melanoma, linfoma no de Hodgkin, o carcinoma de célula renal. La enfermedad causada por infección por protozoario intracelular- puede ser Cryptosporidium spp. , Leishmania spp., . Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzii: La enfermedad causada por infección bacteriana intracelular puede ser Mycobacterium tuberculosis. Las composiciones pueden administrarse por cualquier duración de tiempo idónea para tratar o prevenir efectivamente una infección viral, un cáncer o una enfermedad causada por. infección por protozoario intracelular . Cualquier dosificación y régimen apropiados pueden usarse para las- composiciones. La administración típicamente puede llevarse a cabo, en un . periodo de tiempo .de alrededor de 3 días a' alrededor de 104. semanas, pero puede llevarse a cabo en un periodo de tiempo más largo que 104 semanas y puede llevarse a cabo indefinidamente. Los regímenes apropiados pueden determinarse por un médico.

Los compuestos de tiazolida pueden, administrarse solos o en combinación con uno o más agentes activos adicionales, incluyendo un inhibidor de neuraminidasa, tal como Laninamivir, Oseltamivir, Zanamivir o Peramivir, un estimulante inmunitario, tal como Imiquimod o Resiquimod, un análogo de adamantina, y una proteína . de fusión sialidasa recombinante . Los compuestos de tiazolida también pueden administrase solos o en combinación con uno o más agentes activos adicionales, incluyendo un fármaco antiprotozoario . El fármaco antiprotozoario puede incluir, pero no se limita a, trimetoprim sul fametoxazol , atovacuona, clindamicina, pirimetamina, esp.iramicina, diminacina, homidium', suramina, melarsamina, estibogluconato de sodio y antimoniato de meglumina. Los compuestos de tiazolida pueden administrarse profilácticamente en combinación con una vacuna, o en combinación con un fármaco anticáncer . . El fármaco anticáncer puede incluir, pero no se limita a, STI571, CGP 74588, ?-ß-D-Arabinofuranosilcitosina (Ara-C) , .doxorbicina, dacarbazina, cisplatina, bleomicina, vincristina, . lomustina, vinblastina, carmustina, DTIC, tamoxifen, sunitinib, ' sorafenib .'. e interferón a. La. composición y el agente activo adicional (por ejemplo, ¦ un interferón) pueden administrase simultáneamente, o por separado, al mismo tiempo, o en diferentes composiciones (incluyendo en composiciones separadas que varían en la forma de dosificación, perfiles de liberación, y similares) . Es de entenderse que la descripción anterior así como también los ejemplos que siguen se pretenden que ilustren y no limiten el enfoque de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del . enfoque de la invención serán aparentes para aquellas personas expertas a las que les concierne la invención.

En sujetos ¦. con inmunodeficiencias , la respuesta inmunitaria requerida, para tratar o prevenir efectivamente una enfermedad viral, cáncer o infección bacteriana o por protozoario intracelular puede. no ser producida por tíoz.alidas usando el régimen de dosificación que sé usa típicamente para tratar exitosamente un. sujeto con un sistema inmunitario completamente competente. ; Los . sujetos con deficiencias inmunitarias ' extremas pueden no ser buenos candidatos para tratamiento con tiozalidas. Los sujetos cón deficiencias inmunitarias moderadas pueden requerir dosis más altas de tratamiento de tiozalida, dosificación más frecuente, o dosificación por un periodo de tiempo más largo que los sujetos con sistemas . inmunitarios completamente competentes. Los sujetos con infección por VIH que no han desarrollado, deficiencias inmunitarias ' pueden ser tratados efectivamente con tiozalidas, mientras que los sujetos con deficiencias inmunitarias asociadas con infección por, VIH pueden requerir tratamiento con fármacos antirretrovirales para reducir la concentración viral del VIH y parcialmente restaurar la función inmunitaria antes o simultáneamente con terapia de tiozalida. Asi, el uso de tiozalidas para estimular la respuesta inmunitaria puede adaptarse para pacientes basados en. el estado inmunitario.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Preparación celular Las células de sangre mononucleares tienen una función importante en el sistema de respuesta inmunitaria, ya que producen diferentes . citoquinas en repuesta a las infecciones por patógeno. Por consiguiente, los efectos inmunomoduladores de tizoxanida (TIZ) en células de sangre mononucleár periféricas (PMBCs) obtenidas de diez (10) donantes saludables y aislan por centrifugación en Ficoll-Paque . Las P BCs se cultivaron .en medio RPMI-1640 suplementado con suero humano al 10% en la presencia o ausencia de tres diferentes dosis de TIZ (0.5, 1.0 y 10 mg/ml) en condiciones tanto no estimulada como estimulada- 'con gripa.

EJEMPLO 2: Análisis inmunológicos Las PMBCs no estimuladas y estimuladas se analizaron para la actividad CTL. y auxiliar . T asi como también¦ para expresión TLR7 y TLR8 y respuestas IFN. tipo I en la ausencia o presencia de diferentes dosis de tizoxanida. Los análisis inmunológicos fueron como siguen: Las funciones del auxiliar T se detectaron determinando la cantidad de células CD4+ T que secretan IFNy e IL-2. La actividad CTL se detectó determinando la cantidad de células CD8+ T que expresan, perforina, granzima y Fas.

La expresión TLR . se detectó midiendo monocitos CD14+ que expresan TLR8, TLR7 y TLR3. La modulación de tizoxanida de la trayectoria TLR se detectó por análisis de configuración PCR de Interferon Tipo I Humano (IFN) .

Específicamente, los efectos de inmunomodulación TIZ se determinaron en PMBCs no estimuladas y estimuladas por el análisis de lo siguiente: • Interferón Tipo I Humano (IFN) y trayectoria TLR (configuración PCR) : Interferones : Ligandos para receptores de Interferón alfa e Interferón beta: IFNA1, IFNA4, IFNB1, IFNK, IFNW1. Ligandos para receptores de Interferón gamma: IFNG. Ligandos para receptores de Hematopoyetina y , citoquina ' de clase Interferón (dominio. D200) : IFNA14, IFNA2, IFNA21, IFNA5 , IFNA6, IFNA8, IFNE1, IL15. Otros genes relacionados . a Interferones: IFRD1, IFRD2, IL28A, IL29,: IL6.

Receptores de interferón: Receptores de Interferón alfa e Interferón beta: IFNARl, I FNAR2. Receptores Interferón gamma : IFNGR1, IFNGR2. Otros receptores, de Hematopoietina y citoquina de clase. Interferón (dominio D200) : CNTFR, CRLF2 , CSF2RA, CSF3R, EBI3, F3, IL20RB (FNDC6) , IL10RA, IL10RB, IL1 IRA, IL12B,. IL13RA1, IL20RA, IL21R, IL22RA2, IL28RA, IL2RB, IL2RG, IL31RA, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, LEPR, MPL, TTN.

Factores regulatorios de interferón: Reguladores transcripcionales : IRF1, IRF2, IRF3,.' IRF4, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8. Otras proteínas . regulatorias de interferón: ÍRF2BP1, IRF2BP2. Proteínas. inducibles por interferón: Genes implicados en la respuesta al virus: ISG15 (G1P2), IFI16, IFI35, IFI44, . . IFIHl, MXl, OAS1. Reguladores transcripcionales : IFI16, SP110. Otros genes inducibles por interferón: ADAR, CXCL10, IFI6 (G1P3), IFI27, IFI30, IFI44L, IFIT1, IFIT1L, IFIT2, IFIT3, IFITM1, IFITM2, IRGM, PSMEl, PYHINl.

• Receptores tipo Toll: LY64, SIGIRR, TLR1, TLR2 , TLR3 , TLR4, TLR5 , TLR6, TLR7 , TLR8 , TLR9, TLR10.; Proteínas de interacción TLR y adaptadoras : BTK, CDI4, HMGB1, HRAS, HSPA1A, HSPD1, LY86 ( D-1), LY96 (MD-2), MAPK8IP3, MYD88, PELI1, RIPK2 , SARM1, TICAM2, TIRAP, TOLLIP, TRIF.

' Efectores: CASP8,. EIF2AK2, FADD, IRAKI, IRAK2, MAP3 7 (TAK1) , ???3?7??.1 ( TAB1 ) , NR2C2, PPARA, PRKRA, SITPEC, TRAF6, UBE2N, UBE2V1.

Genes objetivos y trayectorias cadena abajo: Trayectoria NFKB: CCL2 , CHUK, . CSF2 (GMCSF) , CSF3 (GCSF) , IFNA1, IFNB1, IFNG, 1KBKB, ILlA, IL1B, IL2, IL6, IL8, IL10, IL12A, LTA, MAP3K1, MAP4K4 , NFKB1,. NFKB2 , NFKBIA, NFKBIL1, NFRKB, REh, RELA, TNF, TNFRSF1A.

Trayectoria JNK/p38: ELK1 , FOS . (c-Fos),. JU, MAP2K3 , MAP2K4 (JNKKl), MAP3K1 (MEKK) ,¦ MAPK8 ( JNK1) .

Trayectoria F/11,6: CLECSF9, PTGS2.

Trayectoria IRF: CXCL10, IFNA1 , .. IFNBl , IFNG, IRF1, IRF3;, TBK1.

Regulación de inmunidad adaptada: CD80, . CD86, RIPK2, TRAF6.

EJEMPLO 3: Los efectos inmunomoduladores dé Tizoxanida TIZ muestra efectos inmunomoduladores potentes induciendo un incremento en: 1) células CD4+ T que secretan IFNY e IL2 (Figuras 4A y 4B) ; 2) degranulación CTL (Figura 5B) ; 3) células CD8+ T que expresan Fas (Figura 5C); 4) expresión de TLR3, TLR8 y TLR7 en . monocitos (Figuras 1A-1C) ,· 5) expresión de mARN IFN e IFN (Figura 3A) , 6) mARN especifico para genes inducibles IFN tipo I (MXA, PRKCZ, ADAR, CXCLIO, IRF1, PRKRA) (Figura 3B) ; y 7) mARN especifico para el gen implicado en la presentación de clase I (HLA-A, HLA-B, TAP1) (Figura 3C) .

Estos resultados claramente demuestran que . TIZ tiene actividad inmunomoduladora remarcable y estimula una respuesta inmunitaria fuerte, que es mediada tanto por los sistemas inmunitarios tanto innato como adquirido.

EJEMPLO 4: Expresión TLR en monocitos.

La expresión TLR3, TLR7 y TLR8 se evaluó en células CD14+ (monocitos). tanto en condición no estimulada como estimulada con gripa. RM-4848 induce un incremento en el porcentaje de células ·0?14+ que expresan TLR7 comparado al control bajo estimulación gripa-antigénica (1.0pg/ml dosis: p=0.001; 10 g/ml dosis: p=0.023), aunque no se observaron diferencias importantes en condición sin estimulación. No hubo efecto en células CD14+ que expresan TLR.3 y TLR8 para todas las cinco , dosis probadas en condiciones tanto no estimulada como estimulada con gripa. (Figuras 1A, IB y 1C) .

EJEMPLO 5: Trayectoria TLR y RM-4848 Para determinar si un efecto, ejercido por RM-4848 en la expresión TLR depende de una modulación diferencial de las trayectorias de transduccion asociadas a, TLR, se ha usado una configuración PCR en tiempo real, que se1, selecciona para la expresión de 84 genes que están implicados en la activación de trayectoria TLR. Los datos obtenidos en PBMC no estimulado después' de 3 horas de incubación con RM-4848 muestran que sólo 3 de los 84 genes se sobre-regulan con aproximadamente un incremento 5 veces de IL1A e IL1B y un incremento 6 veces del IL6 en la dosis de 2C^g/ml como se indica en la Figura 2A. ' Los datos obtenidos en PBMC estimulado con gripa después de 3 horas de incubación con RM-4848 muestran que sólo 7 de los 84 genes se sobre-regularon como se muestra en la Figura 2B. En la dosis de 1 pg/ml, hubo aproximadamente un incremento de 6 veces de INFA1 e INFB1 ' y , un incremento de 7 veces en TLR3 y TLR5, un incremento de.6 veces para TLR9 pero en la dosis de 2'0µ?/???1, mientras que TLR-7 y TLR8 estuvieron ligeramente arriba de la linea base de 2. veces para todas las dosis probadas.

EJEMPLO 6:. Trayectoria IFN y RM-4848 Para determinar si los incrementos en niveles de expresión de interferón Tipo I en PBMC incubado con RM-4848 podría influenciar la expresión de genes inducibles de interferón, se usó una configuración PCR en tiempo real que selecciona para la expresión de 84 genes que están implicados en la respuesta de interferón alfa y beta.

Los resultados de los análisis realizados en PBMC no estimulado incubado con RM-4848 mostraron que ninguno de los 84 genes probados se sobre-regularon, . por el contrario 16 genes se sub-regul'aron . En particular, una disminución de 20 veces para INFA1, una: disminución de 15 veces para INFA2 y INFB1, y una disminución de 10 veces en INFA4 en la dosis en 20µg/ml alta se reportaron. Estos efectos sub-regulatorios no se vieron en las dos dosis más bajas de 1 y 10 g/ml (Figura 3A) .

Los resultados . de los análisis realizados en PBMC estimulado con gripa incubados con RM-4848 mostraron que 12 de los 84 genes ' probados se sobre-regularon. Los datos obtenidos en PBMC estimulado con gripa después de 3 horas de incubación con. RM-4848 muestran un incremento de 10 veces para INFA1 y INFA4> un incremento de 8 veces para INFBI y un un incremento de 6 veces para IFNA2 en la dosis lyg/ml baja. Los tres niveles de dosis sobre-regularon moderadamente los ISGs, IFI27 y IFIT1 con un efecto más pronunciado en la dosis de 10µg/ml (>4 veces) .(Figura 3B) .

EJEMPLO 7: funciones de auxiliar T y RM-4848 La producción de IFN-?- e IL2 por células CD4+ T se evaluó tanto en condición basal como después de la estimulación con antigenos específicos de gripa. La dosis de 05yg/ml baja .de. RM-4848 indujo una sobre-regulación estadísticamente importante en la producción de IFN-? en células no estimuladas (p=0.035) y en condiciones estimuladas (p=0.050) (Figura 4A) . Una tendencia similar se observó en células CD4+ T que secretan IL2 en condiciones tanto no estimulada (0.5pg/ml dosis: p=0.047) como estimulada con gripa (0.5 g/ml dosis: p= 0.037) (Figura 4B).

EJEMPLO 8: Actividad CTL y RM-4848 Las células CD8+ T que expresan Granzimaa, Perforina y Fas se analizaron en condición no estimulada y durante la estimulación con antigeno de gripa. RM-4848, en los tres niveles de dosis más altos probados, induce una desgranulación de CTLs,. evaluados por reducción en expresión de. perforina (Figura 5B).. El porcentaje de células CD8+ T que expresan Fas- también se incrementó estadísticamente importante en la presencia de las dosis de 20 y 40 g/ml de RM-4848 más altas tanto en condición sin estímulo (p=0.006) como estimulada (p=0.003) (Figura 5C) .

De los Ejemplos '4-8 es aparente que hay una sobre-regulación y activación de TLR especialmente directamente con TLR7 resultando en un incremento selectivo de la producción de interferón tipo 1 (IFN-a, IFN-ß )¦¦, con activación subsecuente de trayectorias de gen estimulados con interferón (IsG) . Más específicamente, los genes inducibles IFN Tipo I (CD70, COL16A1, HSPA1L, IFI27, IFIT1, NRG1 y SHB) se sobre-regulan. Estos genes están todos implicados en el control de replicación viral. RM4848 activa al mismo tiempo linfocitos CD4 + y CD8+ T. En particular, en el linfocito CD4+ T hay una sobre-regulación de producción INF-? e IL-2, mientras que las células CD8+ T se inducen para desgranular, consistente con una activación de inmunidad mediada por célula.

Estos resultados remplazan la actividad antiviral de espectro amplio de RM4848, que estimula el sistema inmunitario para' combatir la infección viral. Es particularmente remarcable que el fármaco no sólo estimula una respuesta inmunitaria innata probablemente responsable de limpiar la mayoría de las infecciones antes de que causen enfermedad perceptible incluso si muchos patógenos ¦ han evolucionado mecanismos para obstruir su detección. Desde un punto . de vista clínico se sugeriría que RM4848 - y probablemente las otras tiozalidas con. un perfil estimulante inmunitario similar pudieran usarse para prevenir enfermedades o limitar la propagación de una enfermedad. La actividad de .RM4848 contra la inmunidad adaptada no sólo es remarcable porque viene además de su efecto contra la inmunidad innata, sino también porque es el mecanismo por el cual las enfermedades virales se curan.. La inmunidad adaptada se basa en linfocitos, que tiene un . tipo sencillo de receptores pero un repertorio esencialmente rio limitado de antígenos que reconocen variantes, un término operacionalmente definido que refleja su versatilidad. Además de. las producciones de varios linfocitos, los auxiliares o aniquiladores culminarán con la producción de anticuerpos por las células B. Si la inmunidad adaptada se retrasa algunos días durante el comienzo de una infección específica, su acción al producir partículas tóxicas al patógeno y el desarrollo de memoria inmunitaria son el mecanismo antiviral más poderoso que el observado con inmunidad innata mientras ambas son necesarias e inter-rela'ciona.das .

Aunque lo anterior se refiere a modalidades particulares preferidas, . se entenderá que la presente invención no está así limitada. Se le ocurrirá a aquellas personas expertas en la técnica que pueden hacerse varias modificaciones a las modalidades descritas y que tales modificaciones se pretende que estén dentro del enfoque de la presente invención.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad de la misma, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de tiazolida, en donde el compuesto de tiazolida es nitazoxanida o tizoxanida o . RM-4848,. o una :sal, polimorfo, éster, amida, profármaco, o derivado de los mismos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto padece de o está en riesgo de desarrollar una infección viral,' un cáncer o una infección por . protozoario intracelular.

3. El método . de conformidad con. la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna.

4. El método, de .conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un estimulante inmunitario.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el estimulante inmunitario es Imiquimod o Resiquimod.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de .tiazolida se administra en combinación con un inhibidor de neuraminidasa, seleccionado del ' grupo que consiste de Laninamivir, Oseltamivir , Zanamivir y Peramivir.

7. 'El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un análogo de adamantina.

. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en . combinación¦' con una proteína de . fusión sialidasa recombinante .

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque estimula los resultados de la respuesta inmunitaria en el. tratamiento o la prevención de' una infección viral en el sujeto.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la infección viral es infección por influenza.

11. El método de conformidad con la reivindicación.10, caracterizado porque la infección viral es causada por un virus seleccionado de¦ H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, y H10N7'.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la infección viral es Hepatitis B.

13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación . con un fármaco anti-hepatitis B.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna.

15. El método de - conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un estimulante inmunitario.

16. El. método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el estimulante inmunitario es Imiquimod o Resiquimod.

17. El método de. conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un análogo de adamantina.

18.. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado' porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación .con una proteina de. fusión sialidasa recombinante .

19. El. método -de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque estimula los resultados de respuesta inmunitaria en el tratamiento o prevención' de un cáncer en. el sujeto.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer es leucemia.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado . porque la leucemia es una leucemia de célula pilosa o leucemia mieloide crónica.

22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer es melanoma.

23. El método de. conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer es linfoma no de Hodgkin.

24. El método, de . conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cáncer es carcinoma de célula renal.

25. El método . de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto de tiazolida. se administra en combinación con una vacuna.

26. El método, de . conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un estimulante inmunitario.

27. El método de conformidad cón la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación cort un fármaco anticáncer.

28. El método de conformidad con la. reivindicación 27, caracterizado porque el fármaco de anticáncer se selecciona del grupo que consiste de STI571, CGP 74588, ?-ß-D-Arabinofuranosilcitosina (Ara-C) , doxorbicina, dacarbazina, cisplatina, bleomicina; vincristina., lomustina, vinblastina, carmustina, DTIC, tamoxifen, sunitinib, sorafenib e Interferón a.

29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque ¦ estimula los resultados de respuesta inmunitaria en el tratamiento o prevención de' una infección por protozoario intracelul'ar en el sujeto.

30. El método de . conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la infección por protozoario intracelular se , selecciona del grupo¦ que consiste, de Cryptosporidium spp., -Leishmania spp., Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzii. ¦

31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con una vacuna, o un estimulante inmunitario, o un fármaco antiprotozoario.

32. El método, de . conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el compuesto de tiazolida se administra en combinación con un fármaco antiprotozoario seleccionado del grupo que . consiste de trimetoprim/sulfametoxazola, atovacuona, clindami'cina, pirimetamina, espiramicina, dimmazina, homidium, suramma, melarsamma, estibogluconato de sodio y meglum na antimoniata. .

33. El método de · conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque estimula los resultados de respuesta inmunitaria en¦ el ' tratamiento o prevención de una infección bacteriana intracelular.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la infección bacteriana intracelular es Mycobacterium tuberculosis.