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MX2013009862A - Factor de coagulacion dirigido al transcripto 1 tipo trem (tlt-1) en plaquetas activadas. - Google Patents

Factor de coagulacion dirigido al transcripto 1 tipo trem (tlt-1) en plaquetas activadas.

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MX2013009862A
MX2013009862A MX2013009862A MX2013009862A MX2013009862A MX 2013009862 A MX2013009862 A MX 2013009862A MX 2013009862 A MX2013009862 A MX 2013009862A MX 2013009862 A MX2013009862 A MX 2013009862A MX 2013009862 A MX2013009862 A MX 2013009862A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
amino acids
tlt
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
MX2013009862A
Other languages
English (en)
Inventor
Ida Hilden
Bernd Peschke
Jens Breinholt
Mikael Kofod-Hansen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of MX2013009862A publication Critical patent/MX2013009862A/es

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Abstract

La invención actual se refiere a: proteínas procoagulantes que pueden, por ejemplo, ser proteínas de fusión o conjugados químicos; métodos para producir las proteínas procoagulantes; polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión y células que los expresan. Adicionalmente, la invención actual se refiere a proteínas procoagulantes para uso como un medicamento. Los individuos que tienen una coagulopatía, tal como hemofilia A y B con o sin inhibidores, pueden tratarse con las proteínas procoagulantes de la invención actual.

Description

FACTOR DE COAGULACION DIRIGIDO AL TRANSCRIPTO 1 TIPO TREM (TLT-1) EN PLAQUETAS ACTIVADAS Campo de la Invención La invención actual se refiere a proteínas procoagulantes, polinucleótidos que codifican proteínas de fusión procoagulantes, células que expresan proteínas de fusión procoagulantes, un proceso para preparar proteínas procoagulantes y usos de las proteínas procoagulantes.
Antecedentes de la Invención Las plaquetas en reposo normales fluyen libremente a través de la circulación de la sangre cuando el endotelio está intacto. Cuando la barrera endotelial de una sola capa se daña, las plaquetas en reposo se adhieren a las estructuras subendoteliales por medio de receptores de la glicoproteína (GP) . Por ejemplo, GPIalIa y GPVI enlazan colágeno; GPIcIIa enlaza fibronectina , GPIcIIa enlaza laminina y GPIb-V-IX enlaza polímeros del Factor von Willebrand (vWF, por sus siglas en inglés) . La adhesión a los componentes del tejido extravascular expuestos después de una lesión de los vasos, en conjunto con la influencia de factores producidos localmente en el sitio de la lesión, por ejemplo, la serina proteasa trombina, conduce a la activación de las plaquetas. En el complejo proceso de activación, las plaquetas cambian de forma y exponer ciertos fosfolípidos en Ref: 242614 su superficie. También, los receptores que ya están presentes en la superficie de las plaquetas en el estado de reposo se activan tras la activación de plaquetas. Además, la activación de plaquetas conduce a la liberación y la exposición en superficie de moléculas que en el estado de reposo se almacenan intracelularmente en gránulos alfa y densos y por lo tanto no está presente en la superficie de las plaquetas en el estado de reposo. GPIIblIIa es un ejemplo de un receptor de plaquetas presentes en la superficie de las dos plaquetas en reposo y activadas. GPIIblIIa existe en plaquetas en reposo en una conformación cerrada e inactiva y durante la activación de plaquetas asume una conformación abierta y activa capaz de unir sus ligandos, incluyendo fibrinógeno y fibrina. Un ejemplo de un receptor almacenado intracelularmente en los gránulos alfa de plaquetas en reposo, pero liberado y expuesto en la superficie de las plaquetas activadas es el transcripto 1 tipo TREM (TLT-1) (Washington et al, Blood, 104, 1042 - 1047 ( 2004), Gattis et al., Journal of Biological Chemistry, 281, 13396-13403 (2006) ) al que se refiere la presente solicitud.
La cascada de coagulación sanguínea se inicia cuando las células portadoras del factor de tejido (TF, por sus siglas en inglés) en el subendotelio se exponen a los componentes que circulan en la sangre. La exposición de TF a circulación del factor de coagulación Vlla (FVIIa) provoca la formación de pequeñas cantidades de trombina, que sirve como una señal procoagulante que conduce a un mayor reclutamiento y activación de plaquetas adheridas al sitio de la lesión. La coagulación se propaga y amplifica además en la superficie de las plaquetas activadas, llevando eventualmente a una explosión de la generación de trombina, que a su vez conduce a la activación y polimerización del fibrinógeno a las fibras de fibrina, la reticulación y estabilización del coágulo hemostático. Una característica atribuida a varios de los componentes de la cascada de la coagulación es su capacidad para asociarse específicamente con la membrana de fosfolípidos de las plaquetas activadas. Para este fin, FVIIa, así como, por ejemplo, los factores de coagulación IX y X (FIX y FX, respectivamente) y sus formas activadas correspondientes (FVIIa, FlXa, FXa, respectivamente), poseen una región rica en ácido y-carboxiglutámico (dominio Gla) que les permite ser dirigidas y enlazadas a la superficie de las plaquetas activadas. El factor de coagulación VIII (FVIII) se asocia con las plaquetas activadas mediante el enlace a través de su cadena ligera. El mecanismo del Factor de coagulación XI (FXI) que enlaza las plaquetas es más controvertido, pero la evidencia creciente sugiere que las plaquetas afectan FXI y FXIa y que el enlace de FXI a las plaquetas requiere de residuos en el dominio FXI A3 (Emsley et al., 2010, Blood, Vol . 115, p. 2569).
La membrana fuertemente enlazada aumenta la actividad de factores de coagulación tales como FVIIa. Sin embargo, sus interacciones con las membranas de las plaquetas son de afinidad variable. Por ejemplo, la constante de enlace (KD) para FVIIa a la superficie de las plaquetas está en el intervalo micromolar bajo. El enlace de plaquetas mejorado y la localización de los factores de coagulación a la superficie de las plaquetas activadas puede mejorar su actividad. Un medio de hacer esto es por lo tanto deseable.
En sujetos con una coagulopatia, tales como los seres humanos con hemofilia A, B o C, varias etapas de la cascada de coagulación se vuelven disfuncionales debido a, por ejemplo, la ausencia o presencia insuficiente de un factor de coagulación funcional. La disfunción de una parte de la coagulación resulta en coagulación sanguínea insuficiente lo que conduce a hemorragias espontáneas, por ejemplo, en las articulaciones y sangrado potencialmente mortal.
Un objetivo de la invención actual es proporcionar un compuesto que es adecuado para su uso como un fármaco procoagulante en tales sujetos. Un segundo objetivo de la invención actual es proporcionar moléculas procoagulantes que tienen actividad incrementada, en comparación con los factores de la coagulación de las que derivan. Un tercer objetivo de la invención actual es proporcionar moléculas que sobre-regulan la coagulación de la sangre en un microambiente fisiológicamente adecuado. Un cuarto objetivo de la invención actual es proporcionar moléculas procoagulantes que tienen una vida media más larga que el factor de coagulación del que derivan. Un quinto objetivo de la invención actual es proporcionar moléculas procoagulantes que no dan lugar a un descenso en el recuento de plaquetas. Un objetivo adicional de la invención actual es dirigir un factor de coagulación a la superficie de las plaquetas activadas. Un objetivo particular de la invención es aumentar la generación de FlXa y/o FXa en la superficie de las plaquetas activadas. Por lo tanto, el objetivo es permitir, el inicio de la coagulación de la sangre en la superficie de las plaquetas activadas que se encuentran intravascularmente o extravascularmente .
La WO06/096828 describe proteínas quiméricas que comprenden el factor de tejido soluble (sTF, por sus siglas en inglés) y un dominio de enlace de fosfatidil serina (PS, por sus siglas en inglés), tales como Anexina V. La PS está expuesta en la superficie de las células activadas, tales como monocitos, células endoteliales y las células sometidas a apoptosis, así como en las plaquetas activadas y en reposo. Las proteínas quiméricas son tanto pro-coagulantes como anticoagulantes; este último debido al hecho de que, en dosis más altas, los constructos compiten con los factores de coagulación en el enlace a PS en plaquetas activadas. Por lo tanto, las proteínas quiméricas de WO06/096828 tienen un conjunto diferente de propiedades que las proteínas procoagulantes descritas en este documento.
Breve Descripción de la Invención Las proteínas procoagulantes de la presente invención se dirigen específicamente a plaquetas activadas, presentes en los sitios de lesión. Las proteínas de la presente invención se basan en la identificación de receptores particulares y epítopos de componente que aparecen en las membranas de plaquetas cuando las plaquetas no están más en reposo pero se activan o en el proceso de activarse.- De esta manera, la invención se refiere a un método para aumentar la coagulación en la superficie de plaquetas activadas.
Las proteínas procoagulantes de la invención comprenden (i) al menos un factor de coagulación, enlazado covalentemente a (ii) un anticuerpo o un fragmento del mismo que es capaz de enlazar (iii) un receptor, y/o un fragmento o variante del mismo, que se expone en la superficie de plaquetas activadas y se expone hasta un grado inferior (y en algunos ensayos no se expone de manera detectable) en la superficie de plaquetas en reposo. El TLT-1 es un ejemplo de tal receptor y proteínas procoagulantes pueden, por ejemplo, enlazarse, a TLT-1 (16-162), TLT-1 (20-125) o TLT-1 (126-162). El factor de coagulación puede ser una serina proteasa en la forma de zimógeno, por ejemplo, FVII, FIX o FX o la correspondiente forma activada FVIIa, FlXa, y FXa, o un derivado de una serina proteasa; FV o un derivado del mismo, FVIII o un derivado del mismo o FXI o un derivado del mismo. El factor de coagulación y anticuerpo o fragmento de anticuerpo se unen opcionalmente por medio de un ligador. Las proteínas procoagulantes de la invención pueden ser proteínas de fusión o conjugados químicos. Por lo tanto, la invención también se refiere a su fabricación. Un proceso para preparar una composición que comprende al menos una proteína procoagulante de la invención involucra conjugar químicamente (i), un anticuerpo TLT-l o fragmento del mismo, con un grupo reactivo (RS1) de un ligador y hacer reaccionar (ii), el factor de coagulación, con otro grupo reactivo (RS2) del ligador.
En este caso, el ligador puede ser un polímero, tal como polietilen glicol (PEG) .
La invención actual también proporciona lo siguiente: una secuencia de nucleótido aislada que codifica cualquiera de las proteínas procoagulantes de acuerdo con la invención actual; un vector que comprende una secuencia de nucleótido aislada que, de nuevo, codifica cualquiera de las proteínas procoagulantes de acuerdo con la invención actual; una célula aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica cualquiera de las proteínas procoagulantes de la invención actual. La secuencia de nucleótido puede, de nuevo, expresarse por un vector intracelular . La célula aislada puede ser una célula, eucariótica, tal como una célula de mamífero, tal como una célula BHK o una CHO o una HEK.
Similarmente, la invención se refiere a una proteína procoagulante para uso como un medicamento y para el tratamiento de una coagulopatía . En una modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína se administra parenteralmente, tal como administrada intravenosamente o subcutáneamente, a un individuo que necesita del mismo. Tal individuo que necesita puede tener cualquier coagulopatía congénita, adquirida y/o iatrogénica.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Nucleótido TLT-1 humano y secuencias de aminoácidos. En la Figura 1, se muestran las secuencias de nucleótido y aminoácidos que representan hTLT-l. Aquí, la posición de la secuencia de nucleótido 1-45 codifica el péptido de señal predictiva, la secuencia de nucleótido en la posición 46-486 codifica el dominio extracelular de hTLT-l, la posición de la secuencia de nucleótido 487-555 codifica la región de transmembrana y la secuencia de nucleótido en la posición 556-933 codifica el dominio intracelular de hTLT-l.
Figura 2 : Secuencias de nucleótidos y aminoácidos que representan el dominio extracelular de TLT-1 humano que contiene una etiqueta His-6 de C-terminal. En la Figura 2, las secuencias de nucleótido y aminoácidos que representan el dominio extracelular de hTLT-l con una etiqueta His de C- terminal se muestran. Aquí, la secuencia subrayada (7-15) indica las posiciones de una secuencia kozak, la secuencia de nucleótido en la posición 16-60 codifica el péptido de señal predicha, la secuencia de nucleótido en la posición 61-501 codifica el dominio extracelular de hTLT-1 y la secuencia de nucleótido en la posición 502-519 codifica la etiqueta 6xHis (en negrita) . Los sitios de enzima de restricción HindIII (secuencia de nucleótido en la posición 1-6) y EcoRI (secuencia de nucleótido en la posición 523-528) también se muestran y el codón de paro se marca con un asterisco (520-522) .
Figuras 3A-3D: El dominio variable de 0012LC y 0012HC incluye la numeración Kabat: Figura 3A) El dominio variable de 0012LC; Figura 3B) El dominio variable de 0012LC -numeración Kabat; Figura 3C) El dominio variable de 0012HC; Figura 3D) El dominio variable de 0012HC - numeración Kabat. En la Figura 3A, la secuencia de nucleótido en la posición 1-57 codifica la secuencia de péptido de señal LC; la secuencia de nucleótidos en la posición 58-396 codifica el dominio variable de 0012LC. En la Figura 3B, las secuencias en negrita y gris representan posiciones de las CDRs 0012LC de acuerdo con la numeración Kabat. En la Figura 3C, la secuencia de nucleótido en la posición 1-54 codifica el péptido de señal 0012HC, la secuencia de nucleótido en la posición 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC. En la Figura 3D, las secuencias en negrita y gris representan posiciones de las CDRs 0012HC de acuerdo con numeración Kabat .
Figura 4: El dominio variable de 0012LC junto con la región constante de LC,kappa humana y una etiqueta HPC4 (codificada por pTT-0012LC. HPC ) . En la Figura 4, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-57 codifica el péptido de señal LC, la secuencia de nucleótido 58-396 codifica el dominio variable de 0012LC, la secuencia de nucleótido 397- 714 codifica la región constante de 0012LC, kappa humana y la secuencia de nucleótido 715-750 codifica una etiqueta HPC4.
Figura 5: El dominio variable de 0012HC junto con la región constante de IgG4 humana (pTT-0012HC) . En la Figura 5, la secuencia de nucleótido 1-54 codifica el péptido de señal HC, la secuencia de nucleótido 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC y la secuencia de nucleótido 397-1377 codifica la región constante de IgG4 humana (en negrita) .
Figura 6: La cobertura de secuencia de péptidos analizados HX de TLT-1 en presencia y ausencia de mAb0023. La secuencia primaria de hTLT-1 se exhibe arriba de los péptidos analizados HX (mostrado como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como ausencia de 0023 se exhiben en blanco mientras que los péptidos que muestran incorporación de deuterio reducida durante el enlace 0023 se colorean de negro.
Figura 7: La cobertura de secuencia de péptidos analizados HX de TLT-1 en presencia y ausencia de mAb0051. La secuencia primaria de hTLT-1 se exhibe arriba de los péptidos analizados HX (mostrado como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como ausencia de 0051 se exhiben en blanco mientras que los péptidos que muestran incorporación de deuterio reducida durante el enlace 0051 se colorean de negro.
Figura 8: La cobertura de secuencia de péptidos analizados HX de TLT-1 en presencia y ausencia de mAb0062. La secuencia primaria de hTLT-1 se exhibe arriba de los péptidos analizados HX (mostrado como barras horizontales) . Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como ausencia de 0062 se exhiben en blanco mientras que los péptidos que muestran incorporación de deuterio reducida durante el enlace 0062 se colorean de negro.
Figura 9: La cobertura de secuencia de péptidos analizados HX de TLT-1 en presencia y ausencia de mAb0061 (mAb0012). La secuencia primaria de hTLT-1 se exhibe arriba de los péptidos analizados HX (mostrado como barras horizontales) . Los ¦ péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como ausencia de 0061 se exhiben en blanco mientras que los péptidos que muestran incorporación de deuterio reducida durante el enlace 0061 se colorean de negro.
Figura 10: La cobertura de secuencia de péptidos analizados HX de región TLT-1 126-162. La secuencia primaria de hTLT-1 se exhibe arriba de los péptidos analizados HX (mostrado como barras horizontales) . Todos los péptidos muestran incorporación de deuterio reducida durante el enlace mAb0061 (mAb0012) .
Figura HA: ' Efecto de FVIIa-Fabl029 en formación de coágulo- de fibrina inducido por TF en sangre entera humana (HWB, por sus siglas en inglés) de un donador normal medido por trombo-elastografia (TEG) . Formación de coágulo en HWB re-calcificada (curva HWB) se induce por 0.03 pM TF (Innovin®) . La curva "Hemofilia" muestra la formación de coágulo retardada e inadecuada cuando la HWB se complementa con 10 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII. Otras curvas muestran las curvas obtenidas cuando la afección tipo hemofilia inducida por el anticuerpo FVIII se revierte por varias concentraciones (0; 0.25; 0.5; 1.0 nM) de ya sea FVIIa-Fabl029 o rFVIIa como se indica. La actividad de derivación FVIII de FVIIa-Fabl029 se muestra para ser más potente que la de rFVIIa.
Figura 11B: Efecto de FVI Ia-Fabl029 en la formación de coágulo de fibrina inducido por TF en sangre entera humana (HWB) de un donador normal medido por trombo-elastografia (TEG) . El tiempo R se determina a partir de los residuos TEG del experimento mostrado en la Figura 11A.
La sangre entera humana estabilizada citrada (HWB) se saca de donadores normales. Las afecciones tipo hemofilia se obtienen por incubación de HWB con 10 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII (Factor VIII anti-humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) por 30 min a temperatura ambiente. La formación de coágulo es medida por tromboelastografia (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EUA) . Varias concentraciones (0; 0.25; 0.5; 1.0 nM) de FVIIa-Fabl029 ' o rFVIIa se agregan a HWB citrada tipo hemofilia. La coagulación se inicia cuando 340 µ? de HWB normal o tipo hemofilia se transfiere a un vaso trombelastógrafo que contiene '20 µ? de CaCl2 0.2 M con TF lipidado 0.03 pM (Innovin®, Dade Behring GmbH (Marburg, Alemania) . Los residuos TEG se siguen continuamente por hasta 120 min. Se registran las siguientes variables TEG: Tiempo R (tiempo de coagulación es decir el tiempo desde el inicio de coagulación hasta que se obtuvo una amplitud de 2 mm) , ángulo (desarrollo del coágulo medido como el ángulo entre el valor R y el punto de inflexión de los residuos TEG) , K (velocidad de cinéticos de coágulo para alcanzar un cierto nivel de fuerza del coágulo, amplitud = 20 mm) , y MA (amplitud máxima de los residuos TEG refleja la · resistencia mecánica máxima del coágulo) .
Figura 12: Efecto de FIX-Fab0135 en la formación de coágulo de fibrina inducido por TF en sangre entera humana (HWB) de un donador normal medido por trombo-elastografia (TEG) . La formación de coágulo en HWB re-calcificada (curva HWB) se induce por TF 0.03 pM (Innovin®). La curva "Hemofilia" muestra la formación de coágulo retardada e inadecuada cuando la HWB se complementa con 10 pg/ml anticuerpo anti-FVIII. Otras curvas muestran residuos TEG obtenidos cuando la afección tipo hemofilia A inducida por el anticuerpo FVIII se revierte por varias concentraciones (0.1; 0.2; 1.0; 5.0; 10 nM) de FIX-Fab0135. Las curvas TEG obtenidas cuando la proteina de fusión FIX se remplaza por rFVIIa 1 nM o rFIX 10 nM se muestran para comparación.
Figura 13: FIX-Fab0135 dirigido a vesículas de fosfolípido enriquecidas con TLT-1 promueve marcadamente la activación FX inducida por FVIIa en ausencia de FVIII. Varias concentraciones (0.05 - 100 nM) de rFVIIa se incubaron para 15 min en solución amortiguadora Hepes (o) o en solución amortiguadora Hepes que contiene FIX 10 nM (-) ; FlXa 10 nM (-) o FIX-Fab0135 10 nM (A) . Esto se mezcla entonces e incuba por 3 min con FX 100 nM y vesículas de fosfolípidos enriquecidas con TLT-1 a dilución 1:4,000 en ausencia o presencia de FVIII 5 nM como se indica. La reacción se detiene con EDTA, y se mide -la generación de FXa en un ensayo cromogénico .
Figura 14:. Expresión TLT-1 en plaquetas humanas. La figura muestra el número TLT-1 en plaquetas en sangre entera depuradas por adelantado y dispeRSlón lateral en análisis de citometría de flujo. La fluorescencia media con la plaqueta depurada se usó para calcular el número TLT-1 usando una curva estándar obtenida de lechos con un número definido de sitios de enlace para la detección del anticuerpo. Las plaquetas se activaron con péptido SFLLRN que activa el receptor 1 activado con proteasa (0.3-30 µ?) . Para asegurar la máxima expresión TLT-1 se usó una combinación de SFLLRN (30 µ?) y Convulxin (Cvlxn) (100 ng/ml) como control. La expresión TLT-1 se midió por dos diferentes anticuerpos mAb0136 anti-TLT-1; gráfica en barra izquierda y mAb0123; gráfica en barra derecha. Los datos se presentan como mediaisem con el número de donadores de sangre en el intervalo desde 2 hasta 4 en los diferentes grupos.
Figura 15: La dosis de FVI Ia-Fab9015 reduce de manera dependiente el tiempo de sangrado (izquierda) y la pérdida de sangre (derecha) en ratones KOKI TLT-1 con hemofilia inducida por anticuerpo comparado con ratones hemofilicos que reciben vehículo. Una dosis de 20 nmol/kg de FVIIa-Fab9015 fue significativamente más efectiva comparada con 20 nmol/kg de rFVIIa. 1 Figura 16: Cuentas de plaquetas en ratones KOKI TLT-1 hemofilicos transitorios dosificado con FVIIa-Fab9015 (20 o 4 nmol/kg) , rFVIIa (20 nmol/kg) o vehículo. Los ratones se dosificaron a -5 min, se observó sangrado desde 0 hasta 30 min, y se observaron cuentas de plaquetas por 120 min después de la inducción del sangrado.
Figura 17A: La gráfica en barra muestra cantidades pico de trombina generadas por 25 nM de ya sea rFVIIa (barra sin llenar) o FVIIa-Fab9015 (barra llenada) . La generación de trombina se midió bajo condiciones de hemofilia A inducida (anticuerpos policlonales FVIII anti-humano de oveja) con una concentración de plaquetas fijada de 150000 plts/µ?. La reacción se inició con activación de plaquetas a través de la adición de péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ ) y el agonista GPIV Convulxin (100 ng/ml) .
Figura 17B: La gráfica en barra muestra cantidades pico de trombina generadas por 5 nM de ya sea rFVIIa (barra sin llenar) o FVIIa-Fab9Ó15 (barra llenada) . La generación de trombina se midió bajo condiciones de hemofilia A con una concentración de plaquetas fijada de 150000 plts/µ?. La reacción se inició con activación de plaquetas a través de la adición de péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ?) y el agonista GPIV Convulxin (100 ng/ml) .
Figura 18: La figura muestra que el efecto de FVIIa-Fab9015 fue dependiente de la activación de plaquetas. Se agregó FVIIa-Fab9015 25 nM a plasma rico en plaquetas humanas (150000 plts/µ?) que se hace tipo hemofilia A aunque con la adición de anticuerpos anti-FVIII humano de oveja. Las muestras con plaquetas inactivadas muestran una pobre generación de trombina (linea punteada) , péptido SFLLRN activado con PAR-1 (10 µ?) da algún incremento en la generación de trombina (linea con guiones) y plaquetas activadas con tanto SFLLRN (30 µ?) como el agonista GPVI Convulxin (100 ng/ml) da la generación de trombina más grande (linea sólida) .
Figura 19: La figura muestra que el incremento en la generación de trombina con FVI-Ia-Fab9015 comparado con rFVIIa fue dependiente de TLT-1. Los residuos originales muestran generación de trombina en plasma rico en plaquetas humanas (150000 plts/µ?) que se hace tipo hemofilico A a través de la adición de anticuerpos policlonales FVIII antihumano de oveja. La generación de trombina se inició por la adición de péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ?) y agonista GPVI Convulxin (100 ng/ml). Como se muestra por los residuos, FVI Ia-Fab9015 (5 nM) (linea sólida) da un pico de trombina significativamente más grande que rFVIIa (5 nM) (linea punteada) . Al incubar previamente las muestras con TLT-1 soluble (100 nM) la capacidad de generar trombina FVIIa-Fab9015 se redujo significativamente (linea con guiones) . Esto confirma que el efecto 9015 es dependiente del enlace TLT-1 en plaquetas activadas.
Figura 20: La figura muestra que el incremento en generación de trombina con FIX-Fab0155 comparado con rFIX fue dependiente de TLT-1. Los residuos originales muestran generación de trombina en plasma deficiente en FIX que contiene plaquetas humanas (150000 plts/µ?). La generación de trombina se inició por la adición de péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ?) y agonista GPVI Convulxin (100 ng/ml) . Como se muestra por los residuos, FIX-Fab0155 1 nM (linea sólida) da un pico de trombina significativamente más grande que rFIX (linea gris) . La incubación previa de TLT-1 soluble (100 nM) reduce significativamente la capacidad de generación de trombina de FIX-Fab0155 (linea con guiones) lo que confirma la dependencia de TLT-1.
Figura 21: Autoactivación de proteina de fusión FVII- Fab5001 en presencia de Factor de Tejido soluble (sTF) . La actividad proteolitica se midió en presencia de fosfolipidos (PC:PS) y sTF. Los resultados son promedios de dos mediciones independientes y se dan en valores kcat/Km relativos comparados con tnFVlla.
Figura 22A: Ninguno de los anticuerpos TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) afectan la agregación de plaquetas. La figura muestra residuos originales de mediciones de transmisión de luz en plasma rico en plaquetas donde las plaquetas se han activado con SFLLRN (1 µ?) . Las muestras se incubaron previamente con anticuerpo anti-TLT-1 o anticuerpo de control irrelevante (10 nM) 3 min antes de la activación de plaquetas.
Figura 22B: Ninguno de los anticuerpos TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) afecta la agregación de plaquetas. La figura muestra residuos originales de mediciones de transmisión de luz en plasma rico en plaquetas en el cual las plaquetas se han activado con SFLLRN (10 µ?) . Las muestras se han incubado previamente con anticuerpo anti-TLT-1 o anticuerpo de control irrelevante (10 nM) 3 min antes de la activación de plaquetas Figura 23: Efecto de FIX-mAb0145 en la formación de coágulo de fibrina inducido por TF en sangre entera humana (H B) de un donador normal medido por trombo-elastografia (TEG) . Se muestra el Tiempo R obtenido de los residuos TEG con HWB normal y sangre "hemofilia" complementada con varias concentraciones de FIX-mAb0145 o rFIX.
Figura 24: La gráfica en barra muestra cantidades pico de trombina generadas por 25 ' nM del FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fabl029 y FVIIa-FablOOl . Los tres constructos muestran potencia incrementada comparada con rFVIIa (25 nM) . La generación de trombina se midió bajo condiciones de hemofilia A inducida (anticuerpos policlonales FVIII anti-humano de oveja) con una concentración de plaquetas fijada de 150000 plts/µ?. La reacción se inició con activación de plaquetas a través de la adición de péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ?) y el agonista GPIV Convulxin (100 ng/ml) . Las barras muestran la mediaiSD de la generación de trombina pico (n=2-5) .
Figura 25: La figura muestra la potencia incrementada del FVIIa-Fab5001 comparado con rFVIIa de tipo natural. Los residuos originales muestran generación de trombina en plasma deficiente en factor VIII que contiene plaquetas humanas lavadas (150000 plts/µ?) . En las muestras activadas se inició la generación de trombina por la adición del péptido SFLLRN activado con PAR-1 (30 µ?) y el agonista GPVI Convulxin (100 ng/ml) . Como se muestra por los residuos FVIIa-Fab5001 (25 nM) (linea sólida) da aproximadamente un pico de trombina cuatro veces más grande que el rFVIIa de tipo natural (25 nM) (linea punteada) . No hubo aumento de la potencia con plaquetas inactivadas (linea con guiones).
Breve Descripción del Listado de Secuencias Las secuencias son como sigue: SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de nucleótido de (h)TLT-l humano .
SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia de aminoácidos de hTLT-1.
SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de nucleótido del dominio extracelular de hTLT-l-His6.
SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de hTLT-l-His6.
SEQ ID NOs : 5 hasta 8 proporciona las secuencias de aminoácidos de fragmentos hTLT-1: hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162, hTLT-1.126-162 y hTLT-1.129-142.
SEQ ID NO: 9 proporciona la secuencia de nucleótido del dominio variable de mAb 0012 LC.
SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable de mAb0012 LC .
SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de nucleótido del dominio variable de 0012 HC .
SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable de 0012 HC.
SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0012.
SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena ligera de mAb0012 y Fab0012.
SEQ ID NO: 15 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0023.
SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena ligera de mAb0023 y Fab0023.
SEQ ID NO: 17 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0051.
SEQ ID NO: 18 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena ligera de mAb0051 y Fab0051.
SEQ ID NO: 19 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0052.
SEQ ID NO: 20 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0062.
SEQ ID NO: 21 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena ligera de mAb0052, Fab0052 y mAb0062.
SEQ ID NO: 22 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0061.
SEQ ID NO: 23 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena pesada de mAb0082.
SEQ ID NO: 24 proporciona la secuencia de nucleótido de la cadena ligera de mAb0061, Fab0061, mAb008 y Fab0082.
SEQ ID NO: 25 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0012 VH-CH1.
SEQ ID NO: 26 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0023 VH-CH1.
SEQ ID NO: 27 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0051 VH-CH1.
SEQ ID NO: 28 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0052 VH-CH1.
SEQ ID NO: 29 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0061 VH-CH1.
SEQ ID NO: 30 proporciona la secuencia de nucleótido de Fab0082 VH-CHl.
SEQ ID NO: 31 proporciona la secuencia de nucleótido de hIgG4 bisagra-CH2-CH3 SEQ ID NO: 32 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0012, HC (VH ratón-IgG4 humana CH1-CH2-CH3) .
SEQ ID NO: 33 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0012, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) y Fab0012, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) .
SEQ ID NO: 34 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0023, HC (VH ratón- IgG4, humana CH1-CH2-CH3) .
SEQ ID NO: 35 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0023, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) y Fab0023, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) .
SEQ ID NO: 36 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0051, HC (VH ratón- IgG4 humana CH1-CH2-CH3) .
SEQ ID NO: 37 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0051, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) and Fab0051, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) .
SEQ ID NO: 38 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0052, HC (VH ratón- IgG4 humana CH1-CH2-CH3) .
SEQ ID NO: 39 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0052, LC (VL de ratón - CL Kappa humano); Fab0052, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) ; mAb0062, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) .
SEQ ID NO: 40 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0061, HC (VH ratón- IgG4 humana CH1-CH2-CH3) .
SEQ ID NO: 41 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0061, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) ; Fab0061, LC (VL de ratón - CL Kappa humano) and mAb0082, LC (VL de ratón -Kappa humano); Fab0082, LC (VL de ratón - CL Kappa humano).
SEQ ID NO: 42 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0062, HC (VH ratón- IgG4 humana CH1-CH2-CH3) • SEQ ID NO: 43 proporciona la secuencia de aminoácidos de mAb0082, HC (VH ratón- IgG4 humana CH1-CH2-CH3) • SEQ ID NO: 44 proporciona la secuencia de aminoácidos de Fab0012, VH de ratón - CH1 IgG4 humana.
SEQ ID NO: 45 proporciona la secuencia de aminoácidos de Fab0023, VH de ratón - CH1 IgG4 humana.
SEQ ID NO: 46 proporciona la secuencia- de aminoácidos de Fab0051, VH de ratón - CH1 IgG4 humana.
SEQ ID NO: 47 proporciona la secuencia de aminoácidos de Fab0052, VH de ratón - CH1 IgG4 humana.
SEQ ID NO: 48 proporciona la secuencia de aminoácidos de Fab0082, VH de ratón - CH1 IgG4 humana.
SEQ ID NOs: 49-58 proporcionan las secuencias de aminoácidos de ligadores opcionales L2-L10. Los ligadores opcionales se enumeran y enlistan en la Tabla 3.
SEQ ID NO: 59 proporciona la secuencia de aminoácidos de etiqueta de purificación HPC4.
SEQ ID NOs: 60-145 proporciona las secuencias de ácido nucleico de los cebadores usadas durante el desarrollo de los constructos de expresión descritos en los ejemplos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 25.
SEQ ID NO 146 proporciona la secuencia de aminoácidos de Fab0061 VH-CH 1.
SEQ ID NO 147 proporciona la secuencia de aminoácidos de hIgG4-bisagra-CH2-CH3.
SEQ ID NO 148 proporciona la secuencia de aminoácidos de una etiqueta His6.
SEQ ID NO 149 proporciona la secuencia de aminoácidos de hTLT-1.18-188.
SEQ ID NO 150 proporciona la secuencia de ácido nucleico del cebador no. 1004.
SEQ ID NO 151 proporciona la secuencia de ácido nucleico del cebador no. 1005.
SEQ ID NO 152 proporciona la secuencia de aminoácidos de FabOlOO HC.
SEQ ID NO 153 proporciona la secuencia de aminoácidos de FabOlOO LC.
SEQ ID NO 154 proporciona la secuencia de ácido nucleico del Factor FV humano de tipo natural.
SEQ ID NO 155 proporciona la secuencia de aminoácidos de Factor FV humano de tipo natural.
SEQ ID NO 156 proporciona la secuencia de ácido nucleico de Factor FVII humano de tipo natural.
SEQ ID NO 157 proporciona la secuencia de . aminoácidos de Factor FVII humano de tipo natural.
SEQ ID NO 158 proporciona la secuencia de ácido nucleico de Factor FVIII humano de tipo natural.
SEQ ID NO 159 proporciona la secuencia de aminoácidos de Factor FVIII humano de tipo natural.
SEQ ID NO 160 proporciona la secuencia de ácido nucleico de Factor FIX humano de tipo natural.
SEQ ID NO: 161 proporciona la secuencia de aminoácidos de Factor FIX humano de tipo natural.
SEQ ID "NO: 162 proporciona la secuencia de ácido nucleico de Factor FX humano de tipo natural.
SEQ ID NO: 163 proporciona la secuencia de aminoácidos de Factor FX humano de tipo natural.
SEQ ID NO: 164 proporciona la secuencia de ácido nucleico de Factor FXI humano de tipo natural.
SEQ ID NO: 165 proporciona la secuencia de aminoácidos de Factor FXI humano de tipo natural.
SEQ ID NO: 166 proporciona la secuencia de ADN 0012LC.C36A-HPC4.
SEQ ID NO: 167 proporciona la secuencia de aminoácidos 0012LC.C36A-HPC .
SEQ ID NO: 168 proporciona la secuencia de ADN 0012VH-CH 1-HPC .
SEQ ID NO: 169 proporciona la secuencia de aminoácidos 0012VH-CH1-HPC4.
SEQ ID NO: 170 proporciona la secuencia de ADN 0012VH. T60N-CH1-YGPPC.
SEQ ID NO: 171 proporciona la 0012VH . T60N-CH 1-YGPPC.
SEQ ID NO: 172 proporciona la secuencia de ADN FIX-L4b-0012LC.
SEQ ID NO: 173 proporciona la secuencia de aminoácidos. FIX-L4b-0012LC.
SEQ ID NO: 174 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0003 Fab-LC: 0062Fab-LC-HPC4.
SEQ ID NO: 175 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0003 Fab-HC:0062Fab-VH-CHl-YGPPC.
SEQ ID NO: 176 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0197-0000-0074 Fab-HC : 0197-0000-0051Fab-VH-CHl-YGPPC .
SEQ ID NO: 177 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0074 Fab-LC: 0051Fab-LC-HPC4.
SEQ ID NO: 178 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0004 Fab-HC : 0023Fab-VH-CHl-YGPPC .
SEQ ID NO: 179 proporciona la secuencia de aminoácidos de 0004Fab-LC: 0023Fab-LC-HPC .
SEQ ID NO: 180 proporciona la secuencia de aminoácidos de FVII-L4b-0062VH-CHl-HPC4 humana.
SEQ ID NO: 181 proporciona la secuencia de aminoácidos de FVII 407C humana.
SEQ ID NO: 182 proporciona la secuencia de aminoácidos de FIX-L4b-0061LC humana.
Descripción Detallada de la Invención Las proteínas procoagulantes de la invención actual comprenden al menos un factor de coagulación, o variante funcional del mismo, y un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es capaz de enlazar al receptor que es el único presente (en el sentido ubicuo de la palabra) en una plaqueta que experimenta los cambios morfológicos y funcionales asociados con la activación o una plaqueta activada. Tales receptores pueden originarse a partir de los gránulos alfa o densos de plaquetas en reposo, un ejemplo particular de tal receptor es el transcripto 1 tipo TREM (TLT-1, por sus siglas en inglés) .
Las moléculas procoagulantes pueden ser proteínas de fusión. El término "proteína de fusión" se refiere en la presente a proteínas que se crean a través de la unión en estructura de dos o más secuencias de ADN, que codifican originalmente proteínas o péptidos separados, o fragmentos de los mismos. La traducción de la secuencia de ADN de la proteína de fusión resultará en una secuencia de proteína sencilla, que puede tener propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas o péptidos originales. Las secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión pueden crearse artificialmente por métodos de biología molecular estándar tal como PCR traslapado o ligado de ADN y el ensamble se realiza excluyendo el codón de detención en la primera secuencia de ADN de extremo 5' mientras mantiene el codón de detención en la secuencia de ADN de extremo 3' . La secuencia de ADÑ de la proteina de fusión resultante puede insertarse en un vector de expresión apropiado que soporta la expresión de la proteina de fusión heteróloga en organismos hospederos estándar tal como bacterias, levadura, hongos, células de insecto o células de mamífero.
La proteína de fusión puede contener un ligador o secuencia de péptido espaciador que separa la proteína o partes del péptido que definen la proteína de fusión. La secuencia de péptido espaciador o ligador puede facilitar el plegado correcto de la proteína individual o partes del péptido y puede hacerse más probable para la proteína individual o partes del péptido para mantener sus propiedades funcionales individuales. Las secuencias de péptido espaciador o ligador pueden insertarse en secuencia de ADN de las proteínas de fusión durante el ensamble en estructura de los fragmentos de ADN individuales que hacen la secuencia de ADN de la proteína de fusión completa, es decir, durante el PCR traslapado o ligado de ADN.
Alternativamente, las proteínas procoagulantes de la invención pueden ser conjugados de su factor constituyente de coagulación y contrapartes del anticuerpo, de tal manera que el factor de coagulación y el anticuerpo se fabrican independientemente uno del otro y, posteriormente, se unen sintéticamente .
Como se menciona anteriormente, las moléculas procoagulantes de la invención pueden enlazar específicamente transcripto 1 tipo TREM (TLT-1) . Los receptores detonadores expresados en células mieloides (TREM, por sus siglas en inglés) tienen un papel bien establecido en la biología de varios linajes mieloides, que juegan papeles importantes en la regulación de inmunidad innata y adaptativa. TLT-1 pertenece a la familia de proteínas, aunque el gen TLT-1. sólo se expresa en un linaje sencillo, especialmente megacariocitos y trombocitos (plaquetas) y se encuentra exclusivamente en los gránulos alfa de megacariocitos y plaquetas. TLT-1 es una proteína de transmembrana que se expone en la superficie de plaquetas activadas durante la liberación del gránulo alfa. A la fecha, TLT-1 no se ha encontrado en la superficie de plaquetas en reposo o en la superficie de cualquiera de los otros tipos de células.
La porción extracelular de TLT-1 se conoce que está compuesta de un dominio tipo inmunoglobulina (tipo Ig) , sencillo,' conectado a la membrana de célula de plaqueta por una región ligadora llamada el tronco (Gattis et al., Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, pp. 13396- 13403). El dominio tipo Ig de TLT-1 humano (hTLT-1) está compuesto de 105 residuos y se enlaza a la membrana por el tronco de 37 aminoácidos. De esta manera, el dominio tipo Ig de TLT-1 se espera que tenga libertad de movimiento considerable. el supuesto segmento de transmembrana de hTLT-1 es de 20 aminoácidos de longitud. TLT-1 también tiene una porción inhibidora basada en tirosina del receptor inmunitario citoplásmico (ITIM, por sus siglas en inglés), que puede funcionar como una porción de transducción de señal intracelular .
El papel de TLT-1 en la biología de plaqueta aún no se ha esclarecido completamente; se ha mostrado que TLT-1 enlaza fibrinógeno y se considera que TLT-1 juega un papel en regular- la coagulación e inflamación en- el sitio de una lesión. Se ha reportado una forma soluble de TLT-1 que contiene el dominio tipo Ig (Gattis et al., Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, pp. 13396-13403). Queda por establecer las funciones específicas de TLT-1 soluble contra enlazado a la plaqueta.
Giomerarelli at al. (Thrombosis and Haemostasis (2007) 97, 955-963) reporta la generación de moléculas scFv anti-TLT-1 usando técnicas de exhibición de fagos. Algunas de las moléculas scFv anti-TLT-1 se encontraron que inhiben la agregación de plaquetas humanas mediada por trombina. De esta manera, las moléculas scFc anti-TLT-1 con tales características pueden tener propiedades anti-trombóticas , similares a las moléculas scFv anti-GPIIb/IIIa descritas por Schwartz et al. (FASEB Journal, (2004), 18, 1704-1706).
La presente invención se refiere a proteínas de fusión o conjugados que comprenden un factor de coagulación enlazado a un anticuerpo anti-TLT-1, o fragmentos enlazados al antígeno de los mismos, incluyendo scFv. El anticuerpo anti-TLT-1 o fragmentos de los mismos sirven para dirigir el factor de coagulación ligado a la superficie de plaquetas activadas al enlazarse a TLT-1 con el propósito de suministrar una actividad procoagulante en la superficie activada de plaquetas. En este- contexto, la inhibición de agregación de plaquetas no es una propiedad deseable del anticuerpo anti-TLT-1. De esta manera, los anticuerpos anti-TLT-1 de la invención actual preferiblemente no interfieren con funciones de TLT-1, y en particular no inhiben la agregación de plaquetas .
Un receptor tal como TLT-1 comprende epitopos que son objetivos útiles para las proteínas procoagulantes de la invención actual. Las proteínas procoagulantes pueden enlazar cualquier parte de TLT-1 que estaría disponible para enlazarse in vivo, tal como residuos accesibles de superficie del dominio tipo Ig, o parte del tronco. Por lo tanto, las proteínas de fusión pueden enlazar uno o más residuos con TLT-1 (20-125), TLT-1 (16-162), TLT-1 (126-162) y/o TLT-1 (129- 142) (los números entre paréntesis se refieren a residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2) .
En una modalidad preferida, las proteínas procoagulantes enlazan el tronco de TLT-1, tal como uno o más residuos de TLT-1 (126-162) o TLT-1 (129-142) . Las proteínas procoagulantes que enlazan al tronco de TLT-1 son poco probable que interfieran con la función del dominio tipo Ig. En otra modalidad preferida, al fusionar el factor de coagulación a la C-terminal de un anticuerpo, o fragmento del mismo, posicionará el factor de coagulación aún más favorablemente en la superficie celular de plaquetas activadas, con relación al de FVII y FVIIa.
En otra modalidad preferida, las proteínas procoagulantes de la invención enlazan a TLT-1 sin interferir en la agregación de plaquetas.
En otra modalidad las proteínas procoagulantes de la invención enlazan a TLT-1 sin competir con enlace de fibrinógeno a TLT-1.
En términos de la invención actual, TLT-1 puede ser de cualquier vertebrado, tal como cualquier mamífero, tal como roedor (tal como un ratón, rata o conejillo de indias), un lagomorfo (tal como un conejo), un artiodáctilo (tal como un cerdo, vaca, oveja o camello) o un primate (tal como mono o ser humano). TLT-1 es, preferiblemente, TLT-1 humano. TLT-1 puede traducirse a partir de cualquier genotipo o alelo que se presenta naturalmente que lleva a una proteína TLT-1 funcional. Un ejemplo no limitante de un TLT-1 humano es la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 incluye el péptido de señal (residuos 1-15 (MGLTLLLLLLLGLEG) de SEQ ID NO: 2, y el polipéptido TLT-1 maduro que corresponde a los residuos 16-311 de SEQ ID NO: 2.
Las proteínas procoagulantes de la invención comprenden un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que puede presentarse contra TLT-1. El anticuerpo o fragmento del mismo puede o no resultar en un cambio en la estructura conformacional de TLT-1. Adicionalmente, el anticuerpo o fragmento del mismo puede o no resultar en señalización intracelular, como un resultado del enlace a TLT-1. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de enlazarse al tronco de TLT-1. Por lo tanto, el anticuerpo o fragmento del mismo utiliza un receptor que se presenta naturalmente, o una porción del mismo, con objeto de alcanzar el efecto que es único para y proporcionado por la invención actual.
El término "anticuerpo" se refiere en la presente a la proteína, derivada de una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal, que es capaz de enlazarse específicamente a un antígeno que es TLT-1 o una porción del mismo. El término incluye anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo (esto es, IgA, IgE, IgG, IgM e/o IgY) y cualquier fragmento o cadena sencilla del mismo.
Los anticuerpos de longitud completa comprenden usualmente al menos cuatro cadenas de polipéptido: esto es, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están interconectadas por enlaces disulfuro. Una sub-clase de inmunoglobulina de interés farmacéutico particular es la familia IgG, que puede sub-dividirse en isotipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Las moléculas IgG están compuestas de dos cadenas pesadas, interligadas por dos o más enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras, cada una enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro. Una cadena pesada puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de cadena pesada (CH) : CH1, CH2 y CH3. Una cadena ligera puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL) . Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones complementariamente determinantes (CDR, por sus siglas en inglés) , interespaciadas con regiones que son más conservadoras, llamadas regiones de estructura (FR, por sus siglas en inglés). Las regiones VH y VL típicamente están compuestas de tres CDRs y cuatro FRs, configuradas desde la terminal amino a la C-terminalarboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 , FR . Las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera forman un dominio que es capaz de interactuar con un antígeno (TLT-1), pese a que la región constante de un anticuerpo puede mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores hospederos, incluyendo pero no limitado a varias células del sistema inmunitario (células efectoras), receptores Fe y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
El componente anticuerpo de las proteínas procoagulantes puede ser un anticuerpo monoclonal. Tal anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado en CDR, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o una porción enlazada al antígeno de cualquiera de los mismos. Para la producción de anticuerpos, el animal experimental es un mamífero apropiado tal como una cabra, conejo,, rata o ratón.
En términos estructurales, un anticuerpo monoclonal se representa por una especie molecular sencilla que tiene una especificidad de enlace sencilla y afinidad por un epítopo particular. Los anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) para las proteínas procoagulantes de la invención pueden producirse por una variedad de técnicas bien conocidas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional por ejemplo, la técnica de hibridación celular somática estándar de Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495, o tranformación vírica u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Se conocen en el campo los protocolos de inmunización y técnicas para aislado de esplenocitos inmunizados para fusión. También se conocen los compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales apropiados, pueden aislarse esplenocitos y/o células de ganglio linfático de ratones inmunizados, y fusionarse a una linea de célula inmortalizada apropiada, tal como una linea de célula de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden seleccionarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. El anticuerpo que secreta hibridomas puede volverse a colocar en placa, seleccionarse de nuevo, y si todavía son positivos para IgG apropiado, pueden subclonarse los anticuerpos monoclonales al menos dos veces por dilución limitada. Los subclones estables pueden cultivarse entonces in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización.
Los anticuerpos para la invención puede prepararse, expresarse, crearse o aislarse por medios recombinantes , tal como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para los genes de inmunoglobulina de interés o un hibridoma preparado del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedera transformada para expresar el anticuerpo de interés,, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una colección de anticuerpo de combinación, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquiera de otros medios que involucran división de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
Varios anticuerpos monoclonales apropiados, mostrados en la Tabla 1, se identifican en la presente por medio del prefijo "mAb" junto con un número de 4 dígitos. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal puede ser mAb0012 o una variante del mismo. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0023 o una variante del mismo. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0051 o una variante del mismo. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0061 o una variante del mismo. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0062 o una variante del mismo. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0082 o una variante del mismo.
Tabla 1: Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales apropiados El término "porción enlazada al antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un' anticuerpo gue mantienen la capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno, tal como TLT-1 u otro receptor objetivo, como se describe en la presente. Se ha mostrado que la función enlazada al antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. El componente anticuerpo de las proteínas procoagulantes puede ser por lo tanto un fragmento de un anticuerpo, tal como un fragmento de un anticuerpo monoclonal . Los ejemplos de fragmentos enlazados abarcados dentro del término "porción enlazada al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab' , un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb y una región complementariamente determinante aislada (CDR) . Los anticuerpos de cadena sencilla tal como scFv y anticuerpos de cadena pesada tales como VHH y anticuerpos de camello también se pretenden abarcar dentro del término "porción enlazada al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por aquellos de experiencia en la técnica, y los fragmentos pueden seleccionarse para utilidad de la misma manera como anticuerpos intactos.
Un fragmento "Fab" incluye un dominio variable y un dominio constante de la cadena, ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Un fragmento Fab' incluye una o más ligaduras disulfuro de C-terminalarboxi a las cadenas ligera o pesada. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos comprenden un par de fragmentos Fab que se ligan generalmente de manera covalente cerca de su C-terminalarboxi por cisteinas bisagra. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo también se conocen en el campo.
Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y enlace de antígeno completo, y comprende generalmente un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha que puede ser covalente por naturaleza, por ejemplo en un fragmento de dominio variable de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés) . Es en esta configuración en la cual las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para defini-r un sitio enlazado al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de enlace al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable sencillo sólo comprende tres regiones hipervariables específicas para un antígeno que tiene la capacidad de reconocer y enlazar un antígeno, aunque usualmente una afinidad más baja que la del sitio de enlace completo (Cai & Garen, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). Por ejemplo, los anticuerpos camélidos que se presentan naturalmente que sólo tienen un dominio variable de cadena pesada (VHH, por sus siglas en inglés) pueden enlazar un antigeno (Desmyter et al., J. Biol. Chem. , 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que la scFv forme la estructura deseada para el enlace del antigeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun, 1994, En: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds . Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace al antigeno, en los cuales los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH y VL) . Al usar un ligador que es muy corto para permitir el emparejado entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios variables son forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de enlace al antigeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; O 93/11161; y Hollinger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90: 6444-6448. 4 La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a anticuerpos como se describe en Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10): 1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos contienen un par de segmentos Fd en tándem (VH-CHI-VH-CHI) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones enlazadas al antigeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecificos o monoespecificos .
El término "monocuerpo" como se usa en la presente, se refiere a una molécula enlazada al antigeno con un dominio variable de cadena pesada y sin dominio variable de cadena ligera. Un monocuerpo puede enlazarse a un antigeno en ausencia de cadenas ligeras y típicamente tiene tres regiones hipervariables, por ejemplo CDRs designadas CDRH1, CDRH2, y CDRH3. Un monocuerpo IgG de cadena pesada tiene dos moléculas enlazadas al antígeno de cadena pesada conectadas por un enlace disulfuro. El dominio variable de cadena pesada comprende una o más regiones hipervariables, preferiblemente una región CDRH3 o HVL-H3.
El término "región hipervariable" , cuando se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables para el enlace al antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos a partir de una "región complementariamente determinante" o "CDR" (definida por la secuencia como residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "rizo hipervariable" (definido por la estructura y diferenciado por cada anticuerpo; ver, por ejemplo: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917) . En un ejemplo, los residuos HVL pueden incluir, 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada.
En una modalidad de la invención, la porción enlazada a TLT-1 de la proteina procoagulante es un fragmento Fab. Varios fragmentos Fab apropiados, mostrados en la Tabla 2, se identifican en la presente por medio del prefijo "Fab" junto con un número de 4 dígitos. El fragmento Fab puede ser Fab0003 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0004 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0012 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0023 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0051 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0052 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0061 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0062 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0074 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0082 o una variante del mismo. El fragmento Fab puede ser Fab0084 o una variante del mismo.
Tabla 2: Ejemplos no limitantes de f agmentos Fab apropiados Como se menciona anteriormente, un anticuerpo para la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto la estructura y las regiones CDR son derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humanas. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante es también derivada de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatorio o de sitio especifico in vitro o por mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no se pretende que incluya anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otras especies mamiferas, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humanas.
Tal anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Tal anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico cuyo genoma comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada .
Los anticuerpos humanos puede prepararse por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido por transformación de los linfocitos con virus Epstein-Barr .
El término "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo .
El término "anticuerpo humanizado" se refiere en la presente a anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humanas. Pueden hacerse modificaciones a la región de estructura adicional con las secuencias de estructura humanas .
Los anticuerpos de la invención pueden probarse para enlazarse a la proteina objetivo por, por ejemplo, ELISA estándar o Western blotting. También puede usarse un ensayo ELISA para seleccionar hibridomas que muestran una reactividad positiva con la proteina objetivo. La especificidad' de enlace de un anticuerpo también puede determinarse al vigilar el enlace del anticuerpo a las células que expresan la proteina objetivo, por ejemplo, por citometria de flujo.
La especificidad de un anticuerpo de la invención para la proteina objetivo puede estudiarse además al determinar si o no · el anticuerpo enlaza a otras proteínas. Por ejemplo, donde se desea producir un anticuerpo que enlaza TLT-1 específicamente o una parte particular, por ejemplo epítopo, de TLT-1, la especificidad del anticuerpo puede evaluarse al determinar si o no el anticuerpo también enlaza a otras moléculas o formas modificadas de TLT-1 que carecen de la parte de interés.
Los "fragmentos" de polipéptido o anticuerpo de acuerdo con la invención pueden hacerse por truncado de los anticuerpos monoclonales correspondientes, por ejemplo al remover uno o más aminoácidos de los extremos de N-terminal y/o C de un polipéptido. Hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 o más aminoácidos pueden removerse de la N-terminal y/o C de esta manera. Los fragmentos también pueden generarse por una o más eliminaciones internas.
En términos de la invención actual, "epitopo" se refiere al área o región en un antigeno (Ag), gue es una estructura molecular en la superficie de una plaqueta activada, a la cual la porción del anticuerpo (Ab) de la proteina procoagulante es capaz de enlazarse específicamente, es decir el área o región que está en contacto físico con el Ab. Un epítopo del antígeno puede comprender residuos de aminoácidos en el Ag que están involucrados directamente en enlazarse al Ab (el componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no se involucran directamente en el enlace, tal como residuos de aminoácidos del Ag que se bloquean efectivamente por el Ab (en otras palabras, el residuo de aminoácidos está dentro de la "superficie que excluye el solvente" y/o la "huella" del Ab) . El término epítopo incluye en la presente ambos tipos de sitios de enlace con cualquier región particular de un receptor, tal como TLT-1, que enlaza específicamente a un anticuerpo anti-TLT-1, o fragmento del mismo, a menos que se establezca de otra manera (por ejemplo, en algunos contextos la invención se refiere a anticuerpos que enlazan directamente a residuos de aminoácidos particulares) . Los receptores tales como TLT-1 pueden comprender un número diferente de epitopos, que pueden incluir, sin limitación, (1) epitopos de péptido lineal, (2) epitopos conformacionales que incluyen uno o más aminoácidos no contiguos localizados cerca uno del otro en la conformación del receptor maduro; y (3) epitopos posttraducción, que incluyen, ya sea en todo o parte, de estructuras moleculares enlazadas covalentemente a TLT-l, tal como grupos carbohidrato.
El epitopo para un par anticuerpo (Ab) /antigeno (Ag) dado puede definirse y caracterizarse a niveles dife-rentes de detalle usando una variedad de métodos de mapeo de epitopo experimental y por computadora. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) , Espectrometría de Masa de Intercambio de hidrógeno deuterio (HX-MS) y varios métodos de enlace por competencia. Ya que cada método se basa en un principio único, la descripción de un epitopo 'está ligada íntimamente al método por el cual se ha determinado. De esta manera, el epitopo para un par Ab/Ag dado se definirá dependiendo de manera diferente de método de mapeo de epitopo empleado.
En este nivel más detallado, el epitopo para la interacción entre el Ag y el Ab puede definirse por las coordenadas especiales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ab, así como información acerca de sus contribuciones relativas a los terraodinámicos enlazados. En un nivel menos detallado el epitopo puede caracterizarse por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y Ab. En un nivel aún menos detallado el epitopo puede caracterizarse por los residuos de aminoácido que comprende cómo se define por un criterio especifico, por ejemplo distancia entre los átomos en el Ab y Ag. En un nivel además menos detallado el epitopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, por enlace de competencia con. otros Abs. El epitopo también puede definirse más genéricamente como que comprende residuos de aminoácidos para los cuales la sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ab y Ag.
En el contexto de una estructura de cristal derivada de rayos X definida por coordenadas especiales de un complejo entre un Ab, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epitopo es en la presente, a menos que se especifique de otra manera o contradiga por el contexto, definido específicamente como residuos del receptor de plaqueta caracterizados por tener un átomo pesado (es decir, un átomo no de hidrógeno) con una distancia de 4 Á a partir de un átomo pesado en el Ab.
A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, que depende del método de mapeo de epitopo usado, se obtienen en diferentes niveles de detalle, se continua que la comparación de epitopos para diferentes Abs en el mismo Ag pueden conducirse similarmente a diferentes niveles de detalle.
Los epitopos descritos en el nivel de aminoácidos, por ejemplo determinados a partir de una estructura de rayos X, se dice que son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Los epitopos se dice que se traslapan si al menos un aminoácido e comparte por los epitopos. Los epitopos se dice que se separan (único) si no se comparte residuo de aminoácidos por los epitopos.
Los epitopos caracterizados por enlace de competencia se dice que se traslapan si el enlace de los correspondientes Abs son mutuamente exclusivo, es decir si el enlace de un Ab excluye simultáneamente el enlace del otro Ab. Los epitopos se dice que son separados (único) si el Ag es capaz de acomodar el enlace de ambos Abs correspondientes simultáneamente. Adicionalmente, hay casos cuando uno o más anticuerpos no tienen epitopos traslapados pero no se enlazan simultáneamente. Debido a la estructura terciaria y cuaternaria de un antigeno, un anticuerpo puede no ser capaz de tener acceso a su epitopo debido al enlace previo de otro anticuerpo.
Las proteínas procoagulantes de la invención pueden ser capaces de enlazarse al mismo epitopo como mAb0012. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de enlazarse al mismo epítopo como mAb0023. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de enlazarse al mismo epítopo como mAb0051. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de enlazarse al mismo epítopo como mAb0061. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de enlazarse al mismo epítopo como mAbO062. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de enlazarse al mismo epítopo como mAb0082.
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de SEQ ID NO: 4 (correspondiente a K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de SEQ ID NO: 2) . .
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, 195 y L96 de SEQ ID NO: 5 (correspondiente a V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, L82, G83, G84, G85, L86, L87, G108, A109, RUO, Glll, P112, Q113, 1114 y L115 de SEQ ID NO: 2) .· El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S.100 y L101 de SEQ ID NO: 5 (correspondiente a L55, P56, E57, G58, C59, Q60, P61, L62, V63, S64, S65, A66, V92, T93, L94, Q95, E96, E97, D98, A99, G100, E101, Y102, G103, C104, M105, RUO, Glll, P112, Q113, 1114, L115, H116, R117, V118, S119 y L120 de SEQ ID NO: 2) .
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de SEQ ID NO: 5 (correspondiente a V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, RUO, Glll, P112, Q113, 1114, L115, H116, R117, V118, S119 y L120 de SEQ ID NO: 2) .
El epitopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de E5, T6, H7, K8, 19, G10, Sil, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19 y P20 de SEQ ID NO: 7 (correspondiente a E130, T131, H132, K133, 1134, G135, S136, L137, A138, E139, N140, A141, F142, S143, D144 y P145 de SEQ ID NO: 2) .
El epitopo puede comprender uno o más residuos-seleccionados del grupo que consiste de K8, 19, G10, Sil, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21 de SEQ ID NO: 7 (correspondiente a K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146.de SEQ ID NO: 2) .
La definición del término "parátopo" se deriva de la definición anterior de "epitopo" al invertir la perspectiva.
De. esta manera, el término "parátopo" se refiere al área o región en el Ab al cual un Ag se enlaza específicamente, es decir al cual se hace contacto físico al Ag.
El parátopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, VI 18 y Y120 de la cadena ligera (L) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 33), y residuos V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 y T120 de la cadena pesada (H) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 32) .
En el contexto de una estructura de cristal derivada de rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, por ejemplo un fragmento Fab, y su Ag, el término parátopo se define específicamente, a menos que se especifique o contradiga por el contexto, en la presente como residuos Ag caracterizado porque tienen un átomo pesado (es decir un átomo no de hidrógeno) con una distancia de 4 A desde un átomo pesado en el receptor de plaquetas.
El epítopo y parátopo para un par anticuerpo (Ab) /antígeno (Ag) dado puede identificarse por métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo puede determinarse al evaluar la capacidad de un anticuerpo para enlazarse a fragmentos o variantes diferentes de TLT-1. Los aminoácidos específicos dentro de TLT-1 que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con TLT-1 (parátopo) también pueden determinarse usando métodos de rutina, tal como aquellos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, el anticuerpo y molécula objetivo puede combinarse y el complejo Ab/Ag puede cristalizarse. La estructura de cristal del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su objetivo.
Las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo o fragmento del mismo también pueden definirse en términos de sus regiones complementariamente determinantes (CDRs). El término "región complementariamente determinante" o "región hipervariable" se refiere en la presente a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables para enlace antígeno. Las regiones complementariamente determinantes o "CDRs" generalmente están compuestas de residuos de aminoácidos 24-34 (LI), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department de Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242) y/o aquellos residuos de un "rizo hipervariable" (residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Típicamente, la numeración de residuos de aminoácidos en esta región se realiza por el método descrito en Kabat et al., supra. Las frases tales como "posición Kabat", "residuo Kabat", y "de acuerdo con Kabat" se refieren en la presente a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Usando el sistema de numeración Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal actual de un péptido puede contener algunos o adicionales aminoácidos correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, un FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (residuos 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después el residuo 82 de cadena pesada FR. La numeración Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia de un anticuerpo dado al alinear en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar".
El término residuos de "región de estructura" o "FR" se refiere a aquellos residuos VH o VL de aminoácidos que no están dentro de las CDRs, como se define anteriormente.
En una modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 hasta 54 (DYFMY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 hasta 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 hasta 129 (NKNWDDYYDMDY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente .
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 4,4 hasta 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 76 hasta 82 (WASTRES) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 115 hasta 122 (KQSYNLLT) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 hasta 54 (DYSMH) de SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 hasta 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 hasta 129 (APMITTGAWFAY) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente .
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 hasta 54 (KASQSVSNDVA) de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 hasta 76 (YASSRYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 hasta 117 (QQDYSSPYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.
En otra modalidad, 1.a cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, . para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 hasta 54 (SHWIE) de SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 hasta 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 hasta 130 (GYYGLNYDWYFDV) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente .
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 hasta 54 (RASQDISNYLN) de SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 hasta 76 (YTSRLHS) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 hasta 117 (QQDTKLPYT) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 hasta 53 (RYWMT) de SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 hasta 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 hasta 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 hasta 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 hasta 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 hasta 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 hasta 53 (RYWMT) de SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 hasta 84 ( EINPDSSTINYTPSLKD) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 hasta 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, para las proteínas procoagulantes de la invención comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 hasta 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o -. una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 hasta 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 hasta 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.
Los anticuerpos monoclonales , o fragmentos de los mismos, para las proteínas procoagulantes de la invención actual pueden ser variantes de glicosilación . Las variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en las cuales se altera el patrón de glicosilación de un anticuerpo. Por alterar significa eliminar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, agregar una o más porciones de carbohidrato al anticuerpo, cambiar la composición de glicosilación (patrón de glicosilación) , la extensión de la glicosilación.
Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadoras en sus regiones constantes (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 1997; 65: 111-128; Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas pueden afectar la función de la proteína (Boyd et al., Mol. Immunol. 1996; 32: 1311-1318), y la interacción intramolecular entre las porciones de la glicoproteína puede afectar la conformación y presentar una superficie tridimensional de la glicoproteína. Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína dada a ciertas moléculas con base en estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha reportado que en el IgG agalactosilado, la porción de oligosacárido "voltea" del espacio inter-CH2 y los residuos de acetilglucosamina de N-terminal se vuelven disponibles para enlazar la proteína enlazada a mañosa (Malhotra et al., Nature ed. 1995; 1: 237-243). La remoción por glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo IgGl monoclonal murino humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en células de Ovario de Hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) resulta en una reducción completa en la lisis mediada por complemento (CMCL, por sus siglas en inglés) (Boyd et al., Mol. Immunol. 1996; 32: 1311-1318), aunque la remoción selectiva de residuos de ácido siálico usando neuraminidasa no resulta en pérdida de DMCL. La glicosilación de anticuerpos también se ha reportado para afectar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) . En particular, las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de ß(1,4)-?- acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una formación que cataliza la glicosiltransferasa de GlcNAc biseccionado, se reportó para tener actividad ADCC mejorada (Umana et al. Nature Biotech. 1999; 17: 176-180).
La glicosilación de anticuerpos típicamente es ya sea ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere al enlace de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagia. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquiera aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para enlace enzimático de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia de ya sea estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Ligado a O se refiere al enlace de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N) . La alteración también puede hacerse por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a las secuencias del anticuerpo original (para sitios de glicosilacion ligados a 0) . Similarmente, la remoción de los sitios de glicosilacion puede realizarse por alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilacion nativos del anticuerpo.
La secuencia de aminoácidos se altera usualmente al alterar la secuencia de ácido nucleico fundamental. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido de un anticuerpo TLT-l se preparan por una variedad de métodos conocidos en el campo. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislado de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se presentan naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada previamente o una veRSlón no variante del anticuerpo TLT-l.
La glicosilacion (incluyendo patrón de glicosilacion) de anticuerpos también puede alterarse sin alterar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótido fundamental. La glicosilacion depende mayormente de la célula hospedera usada para expresar el anticuerpo. Ya que todos los .tipos de células usados para la expresión de glicoproteinas recombinantes , por ejemplo anticuerpos, como terapéuticos potenciales raramente es la célula nativa, puede esperarse variaciones importantes en el patrón de glicosilacion de los anticuerpos (ver, por ejemplo Hse et al., J. Biol . Chem. 1997; 272:9062- 9070). Además de la elección de células hospederas, los factores que afectan la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen modo de crecimiento, formulación media, densidad cultivo, oxigenación, pH, esquemas de purificación y similares. Se han propuesto varios métodos para alterar el patrón de glicosilación alcanzados' en un organismo hospedero particular incluyendo introducir o sobre-expresar ciertas enzimas involucradas en la producción de oligosacáridos (Pat. E.U.A. Nos. 5,047,335; 5,510,261 y 5,278,299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, pueden removerse enzimáticamente de la glicoproteina , por ejemplo usando endoglicosidasa H (Endo H) . Además, la célula hospedera recombinante puede producirse por ' ingeniería genéticamente, por ejemplo, haciéndola defectuosa en. procesar ciertos tipos de polisacáridos . Estas técnicas, y similares, son bien conocidas en el campo.
La estructura de glicosilación de anticuerpos puede analizarse fácilmente por técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, incluyendo cromatografía de lectina, RMN, espectrometría de masa, HPLC, GPC, análisis de composición de monosacárido, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que usa cromatografía de intercambio de aniones de pH alto para separar los oligosacáridos con base en la carga. Los métodos para liberar oligosacáridos para propósitos analíticos también se conocen, e incluyen, sin limitación, tratamiento enzimático, eliminación usando ambiente alcalino riguroso para liberar principalmente estructuras ligadas a 0, y métodos químicos que usan hidrazina anhidra para liberar oligosacáridos tanto enlazados a N como a 0.
Además de su porción enlazada a TLT-1, que involucra un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, las proteínas procoagulantes de la invención también comprenden un componente del factor de coagulación, cuya función es sobre-regular la coagulación sanguínea en la vecindad de la plaqueta activada.
Los factores de coagulación de proteínas de fusión procoagulantes o conjugados de la presente invención pueden estar ya sea en su forma inactiva o en su forma activada. El factor de coagulación puede ser una serina proteasa, en cuyo caso la forma inactiva del factor de coagulación corresponde a la forma zimógeno y la forma activada corresponde a la forma catalíticamente activa. El factor de coagulación puede ser un polipéptido FVII (FVII o FVIIa) , un polipéptido FVIII (es decir FVIII o FVIIIa) , polipéptido FIX (FIX o FlXa) , polipéptido FX ( FX o FXa) o polipéptido FXI (FXI or FXIa) . Los polipéptidos FVII, FVIII, FIX, FX y FXI de la presente invención también incluyen variantes, tales como variantes truncadas, y derivados de los factores de coagulación. Las variantes FVII, FIX, FX y FXI incluyen variantes des-Gla truncadas, es decir variantes de los factores de coagulación que carecen del dominio Gla responsable de la interacción con membranas de fosfolipido de los factores de coagulación.
Si el factor de coagulación es un polipéptido FVII, el componente FVII puede ser capaz de enlazarse al factor de tejido y este es, preferiblemente, capaz de escindir FIX o FX. Si el factor de coagulación es un polipéptido FVIII, el componente FVIII es, preferiblemente, capaz de enlazarse a FlXa y soportar la escisión de FX. Si el factor de coagulación es un polipéptido FlXa, preferiblemente es capaz de escindir FX. Si el factor de coagulación es FXa, entonces preferiblemente es capaz de escindir protrombina (FII) . Si el factor de coagulación es un polipéptido FXIa entonces preferiblemente es capaz de escindir FIX.
En una modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido Fv. El factor V se sintetiza por el hígado y secreta Factor V que circula en el plasma como un polipéptido de cadena sencilla de 330-kDa que es el procoagulante inactivo (Huang et al. (2008) Haemophilia 14: 1164-9). FV está compuesto de 2196 aminoácidos, incluyendo un péptido de señal de 28 aminoácidos. Está compuesto de seis dominios Al (Aa 30-329), A2 (Aa 348-684), B (Aa 692-1573), A3 (Aa 1578-1907), Cl (Aa 1907-2061), y C2 (Aa 2066-2221). Los dominios A y C de las dos proteínas son aproximadamente 40% homólogos con los dominios equivalentes de FVIII, pero los dominios B no son conservadores. Como es el caso con FVIII, la actividad FV se regula estrechamente por medio de proteólisis especifica al sitio. La trombina, y en una extensión menor el Factor Xa (FXa), son responsables primariamente por la activación FV por medio de escisiones en las · posiciones Arg70 -Ser710, Arg1018-Thr1019 y Arg1545-Ser1546. Estas escisiones liberan el dominio B y crean una molécula dimérica compuesta de una cadena pesada de 105-kDa que contiene los dominios Al y A2 y una cadena ligera de 71 a 74-kDa que contiene los dominios A3, Cl, y C2. Estas dos cadenas se mantienen unidas por calcio en los residuos Asp139 y Asp140 e interacciones hidrofóbicas . La cadena pesada proporciona los contactos para tanto FXa como protrombina, mientras que los dos dominios C en la cadena ligera son necesarios para la interacción de FVa con la superficie de fosfolipido. De esta manera, el Factor V es activo como el cofactor para FXa del complejo de trombinasa y la enzima FXa activada requiere calcio y FVa para convertir la protrombina en trombina en la membrana de superficie celular. El dominio A3 en la cadena ligera está involucrado en interacciones tanto FXa como fosfolipido. Tomados en conjunto, las dos cadenas FVa ligan FXa a la superficie de fosfolipido formada por el tapón de plaqueta en el sitio de lesión y permiten que FXa enlace eficientemente y escinda la protrombina para generar trombina. El Factor V es capaz de enlazarse a plaquetas activadas. Aunque FV se encuentra predominantemente como un componente soluble en el plasma sanguíneo, una fracción de FV también se presenta en los gránulos a de las plaquetas, que es importante para la hemostasis normal como se hace evidente por la deficiencia del Favor V específico de plaquetas (Janeway et al. (1996) Blood 87 : 3571- 8) .
Una secuencia del Factor V humano de tipo natural se proporciona en la SEQ ID NO: 155. El término "polipéptido del Factor V" se refiere en la presente a moléculas del Factor V de tipo natural así como variantes FV, derivados FV y conjugados FV. Tales variantes, derivados y conjugados pueden exhibir sustancialmente la misma, o mejorada, actividad biológica con relación al Factor V humano de tipo natural.
Para propósitos de la invención actual, el Factor V puede ser derivado del plasma o producido recombinante, usando métodos bien conocidos de producción y purificación. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiente de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
Los polipéptidos del Factor V pueden probarse usando ensayos de coagulación comercialmente disponibles, tales como el ensayo del Factor V de Hemocoágulo (Aniara, Ohio, EUA: Cat. No. ACK071K) .
En una modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FVIIa. El Factor VII (FVII) es una glicoproteína producida primariamente en el hígado. La proteína madura está compuesta de 406 residuos de aminoácidos y está compuesta de cuatro dominios como se define por la homología. Hay un dominio Gla de N-terminal seguido por dos dominios tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) y un dominio de serina proteasa de C-terminal. El FVII circula en el plasma como una molécula de cadena sencilla. Durante la- activación al FVII activado (FVIIa), la molécula se parte entre los residuos Argl52 e Ilel53, lo que resulta en una proteína de dos cadenas que se mantienen juntas por un enlace disulfuro. La cadena ligera contiene Gla y los dominios tipo EGF, mientras que la cadena pesada es el dominio de proteasa. El FVIIa requiere el enlace a su factor de tejido del cofactor de superficie celular para volver completamente biológicamente activo.
El término "Factor VII (a)" abarca en la presente el zimógeno no partido, Factor VII, así como la proteasa partida y de esta manera activada, Factor Vlla. El "Factor VII (a)" incluye variantes alélicas naturales de FVII (a) qüe pueden existir y ocurrir a partir de un individuo a otro. Se proporciona una secuencia del Factor Vlla humano de tipo natural en la SEQ ID NO: 157, así como en Proc Nati Acad Sci EUA 1986; 83: 2412-2416.
El término "polipéptido del Factor VII (a)" se refiere en la presente a moléculas del Factor Vlla de tipo natural asi como variantes FVII (a) , derivados FVII (a) y conjugados FVII (a). Tales variantes, derivados y conjugados pueden exhibir sustancialmente la misma, o mejorada, actividad biológica con relación al Factor Vlla humano de tipo natural.
El término "variante FVII (a)", como se usa en la presente, se pretende que designe al Factor FVII que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 157, en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteina y/o en donde uno o más aminoácidos se han agregado a la proteina precursora. Tal adición puede tomar lugar ya sea en el extremo de N-terminal o en el extremo de C-terminal de la proteina precursora o ambos. El "análogo" o "análogos" dentro de esta definición todavía tienen actividad FVII en su forma activada. En una modalidad una variante es al menos 90% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 157. En otra modalidad una variante es al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al 'menos 99% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 157. Como se usa en la presente, cualquier referencia a una posición específica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos no limitantes de variantes FVII(a) que tienen sustancialmente la misma o incrementada actividad proteolitica comparada con el Factor VII (a) humano de tipo natural incluyen aquellas descritas en WO 01/83725, O 02/22776, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 03/037932, WO 04/029090, WO 05/024006, WO 07/031559 y EP 05108713.8, US 7173000 B2; y JP4451514 B2.
El término "actividad biolóqica mejorada" se refiere a polipéptidos FVII (a) que exhiben i) sustancialmente la misma o incrementada actividad proteolitica comparada con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante en presencia y/o ausencia de factor de tejido o ii) a polipéptidos FVII (a) con sustancialmente la misma o incrementada afinidad TF comparada con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante o iii) a polipéptidos FVII (a) con sustancialmente la misma o incrementada vida media en plasma comparado con el Factor Vlla humano de tipo natural recombinante, o iv) a polipéptidos FVII (a) con sustancialmente la misma o incrementada afinidad por la plaqueta activada. La actividad biológica de un polipéptido FVIIa puede medirse usando una variedad de ensayos conocidos por la persona experta en el campo, tal como los ensayos de hidrólisis in vitro y proteólisis in vitro descritos en los ejemplos 26 y 27.
Para el propósito de la invención actual, el Factor VII (a) puede ser derivado del plasma o producido recombinante, usando métodos bien conocidos para la producción y purificación. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
Los residuos carboxilados con gamma en la secuencia FVII enseguida se representan por "y" SEQ ID NO: 157: Factor VII de coagulación humano de tipo natural ANAFLYYLRPGSLYRYCKYYQCSFYYARYIFKDAYRTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSC DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLAD GVSCTPTVEYPCKIPILEKNASKPQGRIVGGKVCPKGECP QVLLLVNGAQLCGGTLINTI WVVSAAHCFKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRL HQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQD CLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSC GDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCAV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FVIII. El Factor VIII (FVIII) es una glicoproteina en complejo, grande, que se produce primariamente por hepatocitos. FVIII está compuesto de 2351 aminoácidos, incluyendo un péptido de señal, y contiene varios dominios distintos como se define por la homología. Hay tres dominios A, un único dominio B, y dos dominios C. el orden de dominio pueden enlistarse como NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2- COOH. FVIII circula en el plasma como dos cadenas, separadas por el limite ?-?3. Las cadenas se conectan por enlaces de iones de metal divalentes. La cadena A1-A2-B es llamada la cadena pesada (HC, por sus siglas en inglés) mientras que la A3-C1-C2 es llamada la cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés). La C-terminal de regiones ácidas pequeña de la Al (la región ai) y A2 (la región a2) y la N-terminal del dominio A3 (la región a3) juegan papeles importantes en su interacción con otras proteínas de coagulación, incluyendo trombina y factor yon illebrand (vWF o VWF) , la proteína portadora para FVIII, in vivo.
Las moléculas FVIII endógenas circulan in vivo como un grupo de moléculas con dominios B de varios tamaños, el más corto tiene la C-terminal en la posición 740, es decir en la C-terminal de A2-a2. Estas moléculas FVIII con dominios B de diferente longitud todas tienen actividad procoagulante completa. Durante la activación con trombina, FVIII es la C-terminal partida de Al-ai en la posición 372, C-terminal de A2-a2 en la posición 740, y entre a3 y A3 en la posición 1689, el último desdoblamiento libera la región a3, con pérdida concomitante de afinidad para vWF. La molécula FVIII activada es nombrada FVIIIa. La activación permite la interacción de FVIIIa con superficies de fosfolípido tipo plaquetas activadas y factor IX activado (FlXa) : se forma el complejo tenasa, permitiendo la activación eficiente del factor X (FX) .
Los términos "Factor VIII (a)" y "FVIII (a)" incluyen tanto FVIII como FVIIIa. "Factor VIII" o "FVIII" se refiere en la presente a una glicoproteina de plasma humana que es un miembro de la trayectoria de coagulación intrínseca y es esencial en la coagulación sanguínea. "FVIII nativa" es ña molécula FVIII humana derivada de la secuencia de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 159 (aminoácidos 1-2332). "FVIII (a)" incluye variantes alélicas naturales de FVIII (a) que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro.
Las moléculas/variantes FVIII pueden ser moléculas FVIII truncadas de dominio B en donde los dominios restantes corresponden cercanamente a las secuencias como se establece en los números de aminoácidos 1-740 y 1649-2332 de SEQ ID NO: 159. En tales variantes, así como en FVIII derivadas de la secuencia de longitud completa, pueden introducirse mutaciones con objeto de, por ejemplo, reducir la capacidad de enlace vWF. Las modificaciones de aminoácidos, tales como sustituciones y eliminaciones, pueden introducirse en la molécula con objeto de modificar la capacidad de enlace de FVIII con varios otros componentes tales como LRP, varios receptores, otros factores de coagulación, superficies celulares, introducción y/o abolición de sitios de glicosilación . Otras mutaciones que no abolen la actividad FVIII pueden también acomodarse en una molécula/variante FVIII que puede usarse para los propósitos de la presente invención .
El dominio B de FVIII abarca los aminoácidos 741-1648 de SEQ ID NO: 159. El dominio B se parte en varios sitios diferentes, generando una heterogeneidad grande en las moléculas FVIII de plasma circulantes. La función exacta del dominio B altamente glicosilado se desconoce. Lo que se conoce es que el dominio B es indispensable para la actividad FVIII en la cascada de coagulación. La FVIII recombinante se produce asi frecuentemente en la forma de variantes eliminadas/truncadas en el dominio B.
La FVIII de longitud completa endógena se sintetiza como una molécula precursora de cadena sencilla. Antes de la secreción, el precursor se parte en la cadena pesada y la cadena ligera. La FVIII eliminada del dominio B recombinante puede producirse por medio de dos diferentes estrategias. Ya sea la cadena pesada sin el dominio B y la cadena ligera se sintetizan individualmente como dos cadenas de polipéptido diferentes (estrategia de dos cadenas) o la FVIII eliminada del dominio B se sintetiza como una cadena de polipéptido precursor sencilla (estrategia de cadena sencilla (que se parte en las cadenas pesada y ligera en la misma manera como el precursor FVIII de longitud completa.
En el polipéptido precursor FVIII eliminado del dominio B, producido por la estrategia de cadena sencilla, las porciones de cadena pesada y ligera a menudo se separan por un ligador. Para minimizar el riesgo de introducir epitopos inmunogénicos en el FVIII eliminado del dominio B, la secuencia del ligador se deriva preferiblemente del dominio B FVIII. Como un mínimo, el ligador deberá comprender un sitio de reconocimiento para la proteasa que parte el polipéptido precursor FVIII eliminado del dominio B en la cadena pesada y ligera. En el dominio B de FVIII de longitud completa, los aminoácidos 1644-1648 constituyen este sitio de reconocimiento. El sitio de escisión de trombina que lleva a la remoción del ligador en la activación de FVIII eliminado del dominio B se localiza en la cadena pesada. De esta manera, el tamaño y secuencia de aminoácido del ligador no es probable que tenga influencia en su remoción de la molécula FVIII restante por activación de trombina. La eliminación/truncado del dominio B es una ventaja para la producción de FVIII. Sin embargo, las partes del dominio B pueden incluirse en el ligador sin reducir la productividad. El efecto negativo del dominio B en la productividad no se ha atribuido a ningún tamaño específico o secuencia del dominio B.
Las moléculas FVIII para la presente invención son capaces de funcionar en la cascada de coagulación en una manera que es funcionalmente similar, o equivalente, a FVIII, lo que induce la formación de FXa por medio de la interacción con FlXa en una plaqueta activada y soporta la formación de in coágulo de sangre. La actividad FVIII puede evaluarse in vitro usando técnicas bien conocidas en el campo. El análisis de coágulo, ensayos de activación FX (a menudo nombrados ensayos cromogénicos ) , ensayos de generación de trombina y tromboelastografia de sangre entera son ejemplos de tales técnicas in vitro, dos de las cuales se describe en los ejemplos 28 y 29. Las moléculas FVIII de acuerdo con la presente invención tienen actividad FVIII que es al menos la de FVIII humana nativa.
El término "variante FVIII", como se usa en la presente, se pretende que designe el Factor FVIII que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 159, en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han sustituido por otros aminoácidos y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteina y/o en donde uno o más aminoácidos se han agregado a la proteina precursora. Tal adición puede tomar lugar ya sea en el extremo de N-terminal o en el extremo de C-terminal de la proteina precursora o ambos. El "análogo" o "análogos" dentro de esta definición todavía tiene actividad FVIII en su forma activada. En una modalidad una variante es al menos 90% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 159. En otra modalidad una variante es al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 159. Como se usa en la presente, cualquier referencia a una posición especifica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 159.
Para el propósito de la invención actual, FVIII puede ser derivado de plasma o producido recombinantemente, usando métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción pueden variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
En otra modalidad particular, el factor de coagulación es el polipéptido del Factor IX. El Factor IX (FIX) es, en su forma activa FlXa, una serina proteasa tipo tripsina que sirve en un papel clave en la hemostasis al generar, como parte del complejo tenasa, la mayoría del factor Xa requerido para soportar la formación de trombina apropiada durante la coagulación (revisado en (Hoffman and Monroe, III 2001)).
El Factor IX (FIX) es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K con similitudes estructurales al factor VII, protrombina, factor X, y proteína C. La forma de zimógeno circulante está compuesta de 415 aminoácidos divididos en cuatro dominios distintos que comprenden un dominio (Gla) rico en ácido ?-carboxiglutámico de N-terminal, dos dominios EGF y un dominio de serina proteasa tipo tripsina de C-terminal. la activación de FIX se presenta por proteólisis limitada en Arg1 5-Ala146 y Arg180-Val181 liberando un fragmento de 35-aa, el llamado péptido de activación (Schmidt and Bajaj 2003) . El péptido de activación es altamente glicosilado, conteniendo dos ligaduras N y hasta cuatro glicanos ligados a 0.
El "Factor IX" o "FIX", como se usa en la presente, se refiere a una glicoproteina del Factor IX de plasma humano que es un miembro de la trayectoria de coagulación intrínseco y es esencial a la coagulación sanguínea. El "Factor IX (a)" incluye las variantes alélicas naturales de FIX (a) que puede existir y ocurrir de un individuó a otro. El Factor IX (a) puede ser derivado de plasma o producido recombinantemente usando métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento. A menos que se especifique o indique de otra manera, el Factor IX significa cualquier molécula de proteína del Factor IX humano funcional en su papel normal en la coagulación, incluyendo cualquier fragmento, análogo y derivado del mismo.
Un ejemplo de un "FIX de tipo natural" es la molécula FIX de longitud completa, como se muestra en SEQ ID NO: 161.
Los términos "análogo FIX", como se usa en la presente, se pretende que designe el Factor FIX que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 161, en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han sustituido por otros aminoácidos y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteina precursora se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en proteina y/o en donde uno o más aminoácidos se han agregado a la proteina precursora. Tal adición puede tomar lugar ya sea en el extremo de N-terminal o en- el extremo de C-terminal de la proteina precursora o ambos. El "análogo" o "análogos" dentro de esta definición todavía tiene actividad FIX en su forma activada. En una modalidad una variante es al menos 90% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 161. En una modalidad adicional una variante es al menos 95% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 161. Como se usa en la presente cualquier referencia a posiciones específicas se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 161. Los ejemplos no limitantes de variantes FIX (a) que tienen sustancialmente la misma actividad, actividad de derivación FVIII o actividad proteolítica incrementada comparada con el Factor IX (a) humano de tipo natural recombinante incluye aquellas descritas en Milanov P, Ivanciu L, Abriss D, Quade-Lyssy P, Miesbach W, Alesci S, Tonn T, Grez M, Seifried E, Schuttrumpf (2012) J. Blood 119: 602-11 y US 2011/0217284 Al. A menos que se especifique de otra manera, los dominios del Factor IX incluyen los siguientes residuos de aminoácidos: dominio Gla siendo la región del residuo Tyrl al residuo Lys43; EGF1 siendo la región del residuo Gln44 al residuo Leu84; EGF2 siendo la región del residuo Asp85 al residuo Argl45; el Péptido de Activación siendo la región del residuo Alal46 al residuo Argl80; y el Dominio de Proteasa siendo la región del residuo Vall81 al Thr414. La cadena ligera se refiere a la- región que abarca el dominio Gla, EGFl y EGF2, mientras que la cadena pesada se refiere al Dominio de Proteasa.
El Factor IX puede ser derivado de plasma o producido recombinantemente, usando métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
Un kit de ensayo comercialmente disponible conocido como kit del Factor IX Cromogénico Hyphen BioMed (Aniara) ' puede ser usado para evaluar el nivel de actividad del polipéptido FIX. En este ensayo, el Factor Xla activa el Factor IX en el Factor IXa, que junto con el Factor VIII :C activado, fosfolipidos y Ca2+, activa el Factor X en el Factor Xa. La cantidad de Factor Xa generado se midió a 405 nm por la cantidad de pNA liberado del factor Xa especifico del sustrato homogénico SXa-11.
Los residuos carboxilados gamma en la secuencia FVII siguiente se representa por "?" SEQ ID NO: 161: Factor IX de coagulación humano de tipo natural YNSGKLYYFVQGNLYRYCMYYKCSFYYARYVFYNTYRTTYFWKQYVDGDQCES PC LNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRL AENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDF TRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIE ETEHTEQKRNVIRI IPHHNYN AAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALV LQYLRVPLVDRATCLRSTKFTYNN FCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIIS WGEECA KGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FX. El factor de coagulación X (FX) es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K con similitudes estructurales al factor VII, protrombina, factor IX (FIX) , y proteina C. Se sintetiza con una pre-pro-secuencia de 40 residuos que contiene una secuencia de señal hidrofóbica (Aa 1-31) que dirige la proteína para secreción. El pro-péptido es importante para dirigir la carboxilación ? a la cadena ligera del Factor X. El zimógeno FX humano circulante está compuesto de 445 aminoácidos divididos en cuatro dominios distintos que comprenden un dominio (Gla) rico en ácido gamma-carboxiglutámico de N-terminal, dos dominios EGF, y un dominio de serina proteasa tipo tripsina de C-terminal. la forma de dos cadena madura de FX está compuesta de una cadena ligera (Aa41-179) y una cadena pesada (Aal83-488) mentanidas en conjunto por un puente disulfuro (Cys172 - Cys342 ) . La cadena ligera contiene 11 residuos Gla, que son importantes para el enlace dependiente de Ca2+ de FX a membranas de fosfolipido cargadas negativamente. El factor X de coagulación humano de tipo natural tiene dos sitios de glicosilación N (Asn221 y Asn231) y dos sitios de glicosilación 0 (Thr199 y Thr211) en el péptido de activación. La hidroxilación ß se presenta en Asp103 en el primer dominio EGF, lo que resulta en ácido ß-hidroxiaspártico (Hya) . La activación de FX se presenta por proteólisis limitada en Arg234-Ile235 liberando un péptido de activación de 52 aminoácidos (Aa 183-234). En la trayectoria extrínseca, esto se presenta durante la exposición del factor de tejido (TF) en la membrana de células subendoteliales al plasma y la posterior activación de FVIIa. La activación por medio de la trayectoria intrínseca se presenta con la interacción del factor IXa, factor Villa, superficies fosfolípidas de calcio y ácidas. La protrombina es el sustrato más importante del Factor Xa, pero' la activación requiere el factor Va del co-factor FXa, superficie fosfolípida de calcio y ácida. La deficiencia de FX es un trastorno de sangrado recesivo autosomal raro con una incidencia de 1:1,000,000 en la población general (Dewerchin et al. (2000) Thromb Haemost 83:185-190). Aunque se produce una tendencia de sangrado variable, los pacientes con deficiencia FX severa tienden a ser los más seriamente afectados entre los pacientes con defectos de coagulación raros. La prevalencia de deficiencia FX heterozigota es de alrededor de 1:500, pero usualmente es clínicamente asintomática .
Un ejemplo de un "FX de tipo natural" es la molécula FX humana de longitud completa, como se muestra en SEQ ID NO: 163.
El "polipéptido del Factor X" se refiere en la presente a cualquier molécula de proteína del Factor X funcional capaz de activar trombina, incluyendo fragmentos, análogos y derivados de SEQ ID NO: 163.
El término "análogo FX", como se usa en la presente, se pretende que designe el Factor FX que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 163, en donde uno o más aminoácidos de la proteína precursora se han sustituido por otros aminoácidos y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína precursora se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han agregado a la proteína precursora. Tal adición puede tomar lugar ya sea en el extremo de N-terminal o en el extremo de C-terminal de la proteína precursora o ambos. El "análogo" o "análogos" dentro de esta definición todavía tiene actividad FX en su forma activada. En una modalidad una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 163. En una modalidad adicional una variante es al menos 95% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 163. Como se usa en la presente cualquier referencia a posiciones específicas se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 163.
El FX puede ser derivado de plasma o producido recombinantemente, usando métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, carboxilación gamma y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido del Factor XI. El Factor XI (FXI) es el zimógeno de una proteasa de coagulación sanguínea, el factor Xla (FXIa), que contribuye a la hemostasis a través de la activación del factor IX. El factor se produce por el hígado (Emsley et al. (2010) Blood 115 : 2569-77). La proteína es un dímero ligado al disulfuro de 160 kDa de 607 aminoácidos idénticos, cada uno conteniendo 4 repeticiones de 90 o 91 aminoácidos llamados dominios manzana (de la N-terminal: Al: Aa 20-103, A2 : Aa 110-193, A3 : Aa 200-283, A : Aa 291-374) y un dominio catalítico tipo tripsina de C-terminal . La proteína es expresada con un péptido de señal Aal-18. La estructura es diferente de aquella de las proteasas de coagulación dependiente de vitamina K bien caracterizada. FXI circula en la sangre como un complejo con cininógeno de alto peso molecular (HK) . La precalicreina (PK), el zimógeno de la calicreína proteasa, es un homólogo monomérico de FXI con la misma estructura de dominio que también circula en complejo con HK. El factor zimógeno se activa en el factor Xla por el factor Xlla (FXIIa), trombina, y también es autocatalitico . La activación de escisión se presenta en el rizo de activación que contiene el sitio de escisión Arg369-Ile370. Ya que la deficiencia en FXI causa sangrado relativamente moderado, FXI tiene un papel especulativo en la generación de fibrina temprana. FXIa se postula para ser parte de un rizo de retroalimentación que sostiene la generación de trombina a través de la activación FIX para consolidar la coagulación. Ciertos tejidos con actividad fibrinolitica robustos parecen importantes para la actividad FXIa, incluyendo orofarinje y tracto urinario, ya que estos son sitios comunes de sangrado en pacientes deficientes en FXI. .La deficiencia FXI congénica se asocia con un trastorno de sangrado medio a moderado. Más de 180 de otras mutaciones de genes FXI asociadas con deficiencia FXI se han reportado (http://www.factorxi.org, http://www.isth.org), incluyendo más de 100 sustituciones de aminoácidos sencillos (sin sentido) . La deficiencia severa es prevalente en las personas de ascendencia judia (Seligsohn et al. (2007) Thromb Haemost. 98:84-89). La relación del portador es aproximadamente 5% en judíos Ashkenazi, con deficiencia (horaozigótica) severa encontrada en 1 en 450 personas. Como un ejemplo, una mutación severa en Glull7Paro resulta en una proteína truncada y homozigota que carece completamente de antígeno FXI en plasma.
El Factor Xla activa el factor IX al escindir selectivamente Arg14 -Ala146 y Arg180-Val181.
El término "análogo FXI", como se usa en la presente, se pretende que designe el Factor XI que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 165, en donde uno o más aminoácidos de la proteína precursora se han sustituido por otros aminoácidos y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína precursora se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han agregado a la proteína precursora. Tal adición puede tomar lugar ya sea en el extremo de N-terminal o en el extremo de C-terminal de la proteína precursora o ambos. El "análogo" o "análogos" dentro de esta definición todavía tiene actividad FX en su forma activada. En una modalidad una variante es al menos 90% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 165. En una modalidad adicional una variante es al menos 95% idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 165. Como se usa en la presente .cualquier referencia a una posición específica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 165.
El FXI puede ser derivado de plasma o producido recombinantemente, usando métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, y otras modificaciones post-traducción puede variar dependiendo de la célula hospedera elegida y sus condiciones de crecimiento.
El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de parentesco de secuencias entre polipéptidos, como se determina por el número de emparejados entre hebras de dos o más residuos de aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de emparejados idénticos entre las más pequeñas de dos o más secuencias con alineaciones en espacio (si hay) dirigidas por un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, "algoritmos") . La identidad de los polipéptidos relacionada puede calcularse fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M . , ed. , Oxford UniveRSlty Press, Nueva York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis de Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., and Griffin, H . G., eds . , Humana Press, Nueva Jersey, 1994;· Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds . , . Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988) .
Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar el emparejado más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programa GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, UniveRSlty de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra) . El algoritmo Smith Waterman bien conocido también puede usarse para determinar la identidad.
Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, UniveRSlty de Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos para los cuales se determina el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para emparejado óptimo de sus respectivos aminoácidos (el "alcance emparejado", como se determina por el algoritmo). Una penalización de abertura de espacio (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación usada; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada emparejado de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de espacio (que usualmente es {fracción (1/10)} veces la penalización de abertura de espacio) , asi como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. Una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl.3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA 89, 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa por el algoritmo.
Los parámetros preferidos para una comparación de secuencia de péptido incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol . 48, 443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 del Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Penalización de espacio: 12, Penalización de Longitud de Espacio: 4, Umbral de Similitud: 0.
El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros predeterminados para comparaciones de péptido (junto con no penalización para espacios finales) usando el algoritmo GAP.
Por lo tanto, las proteínas procoagulantes de la invención actual comprenden (i) al menos un factor de componente de coagulación y (ii) un anticuerpo o fragmento del mismo que es capaz de enlazar al receptor, y/o un fragmento del mismo, en donde el receptor se presenta sólo (en el sentido no ubicuo de la palabra) en la superficie de plaquetas activadas. En una modalidad preferida, el receptor es TLT-1. Las proteínas procoagulantes de la invención actual preferiblemente son producidas por ingeniería de tal manera que sus partes constituyentes pueden funcionar independientemente una de la otra. Por ejemplo, el componente del factor de coagulación de la invención actual es capaz de sobre-regular la coagulación sanguínea. Similarmente, el componente "anticuerpo" de la invención preferiblemente es capaz de enlazar el receptor tal como TLT- 1, sin estorbarse por la presencia del componente del factor de coagulación. La C-terminalarboxi del componente del factor de coagulación puede ser enlazado covalentemente a la terminal amino del componente de anticuerpo del constructo, o al contrario. El componente de anticuerpo del constructo preferiblemente no se enlazada a o demuestra poca afinidad por cualquiera de los otros receptores activados expresados en células mieloides (TREM) . El constructo de la invención actual puede o no comprender un ligador entre el factor de coagulación y los constituyentes del anticuerpo. El ligador opcional puede ser cualquiera de los ligadores descritos en la Tabla 3, o puede ser cualquier otro ligador que enlaza tanto el ' factor de coagulación como las partes del constituyente del anticuerpo del cons.tructo, de tal manera que ambos sin funcionales. En una modalidad, el factor de coagulación y componentes anti-TLT-1 se expresan como proteínas de fusión. En una modalidad, el factor de coagulación y componentes anti-TLT-1 se conjugan químicamente.
Las proteínas procoagulantes donde la parte (ii) es un mAb que puede comprender dos polipéptidos de factor de coagulación (parte (i) ) . El factor de coagulación puede fusionarse a un HC del mAb; El factor de coagulación puede fusionarse a un LC del mAb. El factor de coagulación puede fusionarse a un anticuerpo, o fragmento del mismo, que, en turno, se fusiona a un HC del mAb o un LC del mAb.
De esta manera, una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido Fv y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FVII y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FVIII y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-l .
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FIX y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-l.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FX y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-l.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FXI y (ii) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar TLT-l.
Las proteínas procoagulantes pueden comprender demás un ligador. Ejemplos no limitantes de ligador de secuencias de aminoácidos, que pueden ser utilizados cuando las proteínas procoagulantes se fabrican como proteínas de fusión, se muestran en la Tabla 3. Por lo tanto, el ligador puede ser Ll. El ligador puede ser L2. El ligador puede ser L3. El ligador puede ser L . El ligador puede ser L5. El ligador puede ser L6. El ligador puede ser L7. El ligador puede ser L8. El ligador puede ser L9. El ligador puede ser LIO.
Tabla 3: Ejemplos no limitantes de ligadores opcionales Como se menciona anteriormente, la parte extracelular de TLT-1 está compuesta de un dominio similar a inmunoglobulina y un tronco. Las proteínas procoagulantes de la invención puede ser capaces de enlazarse a cualquiera de estos. Cuando la parte (ii) de la proteína procoagulante es capaz de enlazar al dominio similar a inmunoglobulina, un ligador más largo puede permitir que la parte (i) de la proteína de fusión se adapte a una posición y orientación funcionalmente relevantes en la superficie de la plaqueta activada, de este modo facilitando su función.
Una proteina procoagulante que es capaz de enlazar el tronco de TLT-1 es adyacente a la membrana de la plaqueta.
Una proteina procoagulante que es capaz de enlazar el tronco puede comprender un ligador pero la inclusión de un ligador no necesariamente afecta la función de la parte del factor de coagulación de la proteina de fusión.
Como se describe anteriormente, las proteínas procoagulantes de la invención son capaces de enlazar un receptor que está presente en plaquetas que experimentan activación o que están totalmente activadas, tal como TLT-1.
El término "afinidad de enlace" se pretende se refiera a la propiedad de proteínas procoagulantés, o el componente anticuerpo de proteínas procoagulantes, para enlazar o no enlazar a su objetivo. La afinidad de enlace puede ser cuantificada determinando la constante de enlace (KD) para un componente anticuerpo y su objetivo. Similarmente, la especificidad de enlace de un componente anticuerpo a su objetivo puede definirse en términos de las constantes de enlace comparativas (KD) del anticuerpo para su objetivo como comparado con la constante de enlace con respecto al anticuerpo y otra, molécula no objetivo.
Típicamente, el KD para el anticuerpo con respecto al objetivo será de 2-tantos, preferiblemente 5-tantos, más preferiblemente 10-tantos menos que KD con respecto a la otra, molécula no objetivo tal como material no relacionado o material acompañante en el entorno. Más preferiblemente, el KD será 50-tantos menos, incluso más preferiblemente 100-tantos menos, y aún más preferiblemente 200-tantos menos.
El valor de esta constante de enlace puede determinarse directamente por métodos conocidos, y puede computarizarse incluso para mezclas complejas por medio de métodos tal como aquellos, por ejemplo, establecidos en Caceci et al. (Byte 9: '340-362, 1984). Por ejemplo, el KD puede establecerse usando un ensayo de enlace de filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como ese descrito por Wong & Lohman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Otros ensayos estándares para evaluar la habilidad de enlace de anticuerpos hacia objetivos que son conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISAs, lotes Western, RIAs, y análisis de citometría de flujo. Las cinéticas de enlace (por ejemplo, constantes de tasa de asociación y tasa de disociación) y afinidad de enlace del anticuerpo también pueden evaluarse por ensayos estándares conocidos en la técnica, tal como por análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) .
Un ensayo de enlace competitivo puede conducirse en el cual el enlace del anticuerpo al objetivo se compara con el enlace del objetivo por otro, ligando conocido de ese objetivo, u otro anticuerpo.
Los valores KD para el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la invención también pueden ser al menos 1 x 10"15M, tal como al menos 1 x 10~14M, tal como al menos 1 x 10~13M, tal como al menos 1 x 10~12M, tal como al menos 1 x 10_11M, tal como al menos 1 x 10"10M, tal como aproximadamente 3 x 10"9M, tal como al menos 1 x 10~9M, o al menos 1 x 10~8M. Un anticuerpo de la invención puede tener un Kd (o Ki) para su objetivo de 1 x 10~7 o menos, 1 x 10"8M o menos o 1 x 10"9M o menos.
Los valores KD preferidos para el anticuerpo, o fragmento del mismo, puede ser 1 x 10~15M a 1 x 10~1M, tal como 1 x 10~14M a 1 x 10"13M 1 x 10"13M a 1 x 10"12M, tal como 1 x 10"12M a 1 x 10"nM, tal como 1 x 10_11M a 1 x 10"10M, tal como 1 x 10"10M a 1 x 10~9M tal como aproximadamente 3 x 10"9M, tal como 1 x 10"9M a 2 x 10"8M.
Un anticuerpo o fragmento del mismo gue específicamente enlaza su objetivo puede enlazar u objetivo con una afinidad alta, tal como un KD como se discute anteriormente, y puede enlazar a otra, de las moléculas no objetivo con una afinidad inferior. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar a una de las moléculas no objetivo con un KD de 1 x 10"6M o más, más preferiblemente 1 x 10~5 M o más, más preferiblemente 1 x 10~4 M o más, más preferiblemente 1 x 10"3 M o más, incluso más preferiblemente 1 x 10~2 M o más. Una proteína procoagulante de la invención es preferiblemente capaz de enlazarse a su objetivo con una afinidad que es al menos dos-tantos, 10 -tantos, 50-tantos, 100-tantos, 200-tantos, 500-tantos, 1 , 000-tantos o 10 , 000-tantos o más grande que su afinidad para enlazarse a otra molécula no objetivo, tal como otro TREMs que TLT- 1 .
Los efectos funcionales de las proteínas procoagulantes inventadas pueden evaluarse por medio de varios experimentos in vitro e in vivo. Los experimentos in vitro pueden diseñarse para acceder a la función de las proteínas de fusión como un todo, así como también su componente (i) factor de coagulación y (ii) partes de anticuerpo. In vivo, las proteínas de fusión pueden probarse en un modelo de sangrado de cola en ratones hemofílicos que se transfieren con plaquetas humanas.
Adicionalmente in vivo, las proteínas de fusión pueden probarse en un moldeo de sangrado de cola de ratones i hemofílicos con el gen humano TLT- 1 insertado ("humanizado" con respecto a TLT- 1 ) .
Como se menciona anteriormente, las proteínas procoagulantes pueden proporcionarse en la forma de proteínas de fusión o conjugados químicos. En el primer caso, la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las proteínas procoagulantes de la invención. De esta manera, un polinucleótido de la invención puede codificar cualquier proteína procoagulante como se describe en la presente. Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, ARN mensajero (mARN) , cADN, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un plinucleótido de la invención puede proporcionarse de forma aislada o purificada.
Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (el el caso de ADN) y traslada (en el caso de mARN) en un polipéptido in vivo, cuando se coloca bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas. Los limites de la secuencia de codificación se determina por un codón de inicio en el término 5' (amino) y a la traducción de codón de detención en el término 3' (carboxi) . Para propósitos de la invención, tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a, cADN de viral, mARN procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariótico, e incluso las secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de transcripción puede ubicarse 3' a la secuencia de codificación.
Los polinucleótidos de la invención pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press) .
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden proporcionarse en la forma de un cásete de expresión que incluye secuencias de control operablemente ligadas a la secuencia insertada, de este modo permitiendo la expresión del anticuerpo de la invención in vivo. Estos casetes de expresión, de nuevo, se proporcionan típicamente dentro de los vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales recombinantes) . Tal cásete de expresión puede ser directamente administrado a un sujeto hospedero. Alternativamente, un vector que comprende un polinucleótido de la invención puede administrarse a un sujeto hospedero. Preferiblemente el polinucleótido se prepara y/o administra usando un vector genérico. Un vector idóneo puede ser cualquier vector que sea capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética, y permitiendo la expresión de un polipéptido de la invención.
La presente invención de este modo incluye vectores de expresión que comprenden tales secuencias de polinucleótidos. Tales vectores de expresión se construyen rutinariamente en el arte de la biología molecular y pueden por ejemplo implicar el uso de ADN de plásmido e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tal como por ejemplo señales depoliadelinación que pueden ser necesarias, y que se posicionan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores idóneos serían aparentes para personas expertas en la técnica. A modo de ejemplo adicional en este aspecto ns referimos a Sambrook et al.
La invención también incluye células aisladas que han sido modificadas para expresar proteínas de fusión de acuerdo con la invención. Tales células incluyen líneas celulares eucarióticas transitorias o preferiblemente más altas estables, tal como células de mamífero o células de insecto; célula eucarióticas más bajas, tal como levadura; o células procarióticas tal como células bacterianas. Los ejemplos particulares de células que pueden ser modificados por inserción de vectores o casetes de expresión que codifican para un constructo de la invención incluyen células de mamífero HEK293T, CHO, HeLa y COS. Preferiblemente la línea celular seleccionada será una que no es sólo estable, sino también permite la glicosilación madura y la expresión de superficie celular de un polipéptido.
Tales líneas celulares de la invención pueden ser cultivadas usando métodos de rutina para producir una proteína de fusión o constructo de acuerdo con la invención. Alternativamente, .polinucleótidos , casetes de expresión o vectores de la invención pueden ser administrados a una célula de un sujeto ex vivo y la célula entonces regresarse al cuerpo del sujeto.
Alternativamente, las proteínas procoagulantes pueden ser obtenidas por conjugación química del anticuerpo (tal como un mAb) , o fragmento del mismo, y el factor de coagulación. En este caso, un ligador entre las dos proteínas puede contener una o más porciones químicas que no están presentes en aquellos aminoácidos que son codificados por ADN .
En una modalidad, una porción química usada en este ligador comprende el biradical con la estructura donde * muestra las posiciones de conexión de este biradical .
El término "biradical" se refiere a un compuesto químico de incluso electrón con dos centros radicales libres que actúan independientemente de uno a otro.
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador comprende un polímero: una macromolécula compuesta de unidades estructurales de repetición que están típicamente conectadas por enlaces químicos covalentes. Tal polímero puede ser hidrofilico.
El término hidrofilico o "soluble en agua" se refiere a porciones que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar solubiidad en agua son bien conocidos en la técnica.
Los polímeros solubles en agua de ej emplificación de acuerdo con la invención incluyen péptidos, sacáridos, (poi) éteres, (poli) aminas, ácidos (poli) carboxilicos y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas y estra compuestos de un aminoácido sencillo, por ejemplo, (poli ) lísina . Un polisacárido de ej emplificación es ácido (poli) siálico. Un (poli) éter de ej emplificación es glicol (poli) etileno . (Poli)etilen imina es una poliamina de ej emplificación, y ácido (poli) acrílico es un ácido (poli ) carboxílico representativo.
El polímero hidrofilico de acuerdo con la presente invención es, preferiblemente, que no ocurre de manera natural. En un ejemplo, el grupo modificador que no ocurre de manera natural es un grupo de modificación polimérica, en el que al menos una porción polimérica no ocurre de manera natural. En otro ejemplo, el grupo modificador que no ocurre de manera natural es un carbohidrato modificado. El lugar de la funcionalización con el grupo de modificación se selecciona de manera que no previene el "azúcar modificado" de ser agregado enzimáticamente a un polipéptido. El "azúcar modificado" también se refiere a cualquier porción mimética glicosil que es funcionalizada con un grupo de modificación y que es un sustrato para una enzima natural o modificada, tal como una glicosiltransferasa .
Muchos otros polímeros son también idéenos para la invención. Las estructuras de los polímeros que son no peptídicas y solubles en agua, son particularmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros idóneos incluyen, pero no se limitan a, otros poli (glicoles alquileno) , tal como poli(glicol propileno) ("PPG"), copolímeros de glicol etileno y glicol propileno y similares, poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol oléfmico) , poli ( inilpirrolidona ) , poli (hidroxipropilmetacrilamida) , poli (ácido [alfa] -hidroxi) , alcohol polivinil) , polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,629,384, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad, así como también copolímeros, terpolíneros , y mezclas de los mismos.
El ligador polimérico puede alterar una propiedad de la proteína procoagulante, tal como su biodisponibilidad, actividad biológica o su vida media en el cuerpo.
El ligador polimérico es, preferiblemente, lineal.
Aunque el peso molecular de cada cadena de polímeros individual puede variar, está típicamente en el intervalo de 1, 000 Da (1 kDa) a alrededor de 40,000 Da (40 kDa), tal como alrededor de 1, 000 Da a alrededor de 12, 000 Da tal como alrededor de 2, 000 Da a alrededor de 11, 000 Da, tal como alrededor de 2,000 Da a alrededor de 3,000 Da; alrededor de 3,000 Da a alrededor de 4,000 Da; alrededor de 4,000 a alrededor de 5,000 Da; alrededor de 5,000 a alrededor de 6,000 Da; alrededor de 6,000 a alrededor de 7,000 Da; alrededor de 7,000 a alrededor de 8,000 Da; alrededor de 8,000 a alrededor de 9,000 Da; alrededor de 9,000 a alrededor de 10,000 Da; or alrededor de 10,000 a alrededor de 11,000 Da. Debe de entenderse que estos tamaños representan estimaciones más que mediciones exactas. De acuerdo con una modalidad preferida, las moléculas de acuerdo con la invención se conjugan con una población heterogénea de polímeros hidrofílieos .
En una modalidad particular, una porción química usada en el ligador comprende glicol polietileno (PEG).
El término "PEG" se refiere en la presente a un biradical que comprende la estructura en donde n' es un entero más grande que 1.
PEG se prepara por polimerización de óxido etileno y está comercialmente disponible en un intervalo amplio de pesos moleculares. El PEG para uso de acuerdo con la presente invención es, preferiblemente, lineal.
Adicionalmente, "PEG" puede referirse a un compuesto de glicol polietileno, o derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, porciones de acoplamiento o activación (por ejemplo, con ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o una porción de maleimida) .
En una modalidad particular el PEG para uso de acuerdo con la invención es monodisperso . En una modalidad particular, el PEG para uso de acuerdo con la invención es polidisperso .
PEG polidisperso está compuesto de moléculas PEG que tiene varios pesos moleculares. La distribución de tamaño puede ser caracterizada estadísticamente por el peso de su peso molecular promedio (Mw) y el número de su peso molecular promedio (Mn) , la relación que es llamada el índice de polidispeRSldad (Mw/Mn) (ver por ejemplo "Polymer Synthesis and Characterization", J. A. Nairn, UniveRSlty de Utah, 2003). Mw y Mn pueden medirse por espectroscopia de masa.
El índice de polidispeRSldad puede ser un número que sea más grande que o igual a uno y puede ser estimado de los datos de Cromatografía de permeacion de gel. Cuando el índice de polidispeRSldad es 1, el - producto es monodisperso y de este modo esta hecho de compuestos con un peso molecular sencillo. Cuando el índice de polidispeRSldad es más grande que 1 el polímero es polidisperso, y el índice de polidispeRSldad dice que tan amplia es la distribución de polímeros con pesos moleculares diferentes. El índice de polidispeRSldad típicamente incrementa con el peso molecular del PEG. En modalidades particulares, el índice de polidispeRSldad del PEG para uso de acuerdo con la invención es i) debajo de 1.06, ii) debajo de 1.05, iii) debajo de 1.04, iv) debajo de 1.03 o v) entre 1.02 y 1.03.
Diferentes formas de PEG están disponibles, dependiendo del iniciador usado para el proceso de polimerización.
Numerosos métodos para la conjugación de sustitutos de PEG se describen en Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 459 -476, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 DOI: 10.1038/nrd 1033, Adv Polym Sci, 2006, 192, 95-134, DOI 10.1007/12_022, Springer-Verlag, Berlín Heidelberg, 2005, y referencias allí. Alternativamente, la conjugación del sustituto de polímero hidrofílico podría tomar lugar por medio del uso de métodos enzimáticos . Tales métodos son por ejemplo uso de glicosiltransferasas como se describe en O2003/031464 o uso de transglutaminasas como se describe en O2006134148.
Para efectuar la adjunción covalente de la molécula (s) de polímero al polipéptido, los grupos de término hidroxil de la molécula de polímero se proporcionan en forma activada, es decir con grupos funcionales relativos. Las moléculas de polímero activadas idóneas están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA, Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Alemania, o de PolyMASC Pharmaceuticals pie, RU. Alternativamente, las moléculas de polímero pueden activarse por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en WO 90/13540. Los ejemplos específicos de polímeros PEG activados se describen en Pat. E.U.A. No. 5,932, 462 y Pat. E.U.A. No. 5,643,575. Adicionalmente, las siguientes publicaciones describen moléculas de polímero útiles y/o químicas de PEGilación: WO2003/031464, WO2004 /099231.
La conjugación del anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo o factor de coagulación con las moléculas de polímero activado pueden ser conducidos por medio del uso de cualquier método convencional, por ejemplo como se describe en las siguientes referencias (que también describen métodos idóneos para la activación de moléculas de polímero) : R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry de Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y., ' Bioconjugate Techniques, Second Edition, Greg T. Hermanson, 2008, Amsterdam, Elsevier). La persona experta estará consciente de que el método de activación y/o química de conjugación a usarse depende de los grupo (s) de adjunción del polipéptido (los ejemplos los cuales se dan además anteriormente) , así como también los grupos funcionales del polímero (por ejemplo siendo amina, hidroxil, carboxil, aldehido, sulfhidril, succinimidil, maleimida, vinilsulfona o haloacetato) . La PEGilación puede ser dirigida hacia conjugación para todos los grupos de adjunción disponibles en el polipéptido (es decir tales grupos de adjunción que son expuestos en la superficie del polipéptido) o puede ser dirigida hacia uno o más grupos de adjunción específica, por ejemplo el grupo amino de N-terminal. Adicionalmente, la conjugación puede lograrse en una etapa o de una manera paso a paso.
En otra modalidad, una porción química usada como el ligador es almidón hidroxietil. El término "almidón hidroxietil" (HES/HAES) , como se usa en la presente, se refiere a un derivado de almidón no iónico. Diferentes tipos de almidón hidroxietil se describen típicamente por su peso molecular promedio, típicamente alrededor de 130 a 200 kDa .
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador comprende ácido polisiálico.
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador se enlaza a al menos una de las proteínas a un glicano: un polisacárido o un oligosacárido que e enlaza a una proteína.
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador se enlaza a al menos una de las proteínas a un glicano ligado a 0.
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador se enlaza a al menos una de las proteínas a un glicano religado .
Tanto N-glicanos como O-glicanos se enlazan a proteínas tal como mAbs y factores de coagulación por medio de las células que producen estas proteínas. La maquinaria de N-glicosilación celular reconoce y glicosila señales N-glicosilación (porciones N-X-S/T) en la cadena de aminoácidos, ya que la proteína naciente se traslada del ribosoma al retículo endoplásmico (Kiely et al. 1976; Glabe et al. 1980). Igualmente, O-glicanos se enlazan a sitios de O-glicosilación específicos en la cadena de aminoácidos, pero las porciones que desencadenan O-glicosilación son mucho más heterogéneas que las señales N-glicosilación, y muestra habilidad para predecir sitios de O-glicosilación en secuencias de aminoácidos sigue siendo inadecuada (Julenius et al. 2004). Los métodos de conjugación de polipéptidos con varios grupos secundarios poliméricos se describen por ejemplo en O0331464.
En otra modalidad, una porción química usada en el ligador comprende una porción química, que es usa para adjuntar el ligador a al menos una de las proteínas con una estructura seleccionada de los biradicales: En una modalidad, el ligador comprende la estructura biradical de en donde * muestra las posiciones de conexión de este biradical.
En otra modalidad, el ligador comprende la estructura en donde * muestra las posiciones de conexión de este biradical .
Un compuesto de la fórmula general Anti-TLT1 mAB (fragmento) -ligador - proteína en donde "anti-TLT-1 mAb (fragmento)" puede ser un mAb de tamaño completo contra TLT-1 o un fragmento o un análogo intelectualmente derivado del mismo tal como pero no limitado a, un fragmento FAB o un sc-FAB con ninguna, una o más mutaciones de punto, el ligador puede ser un polímero soluble en agua tal como pero no limitado a por ejemplo PEG, ácido polisiálico, o almidón hidroxietil, y la proteína es cualquier proteína que se piensa tiene una o más propiedades mejoradas cuando enlaza a un anti-TLT-1 mAb (fragmento) puede ser por ejemplo preparada en un procedimiento de dos etapas.
Durante una primera etapa, un ligador, con dos diferentes grupos reactivos RSl y RS2 puede ser enlazado al anti-TLT-1 mAb (fragmento) . La reacción puede ejecutarse con selectividad de sitio bajo o de manera selectiva, tal como RSl sólo reacciona en una o algunas posiciones del anti TLT-1 mAb (fragmento) . Como un ejemplo no exclusivo, RSl podría ser un aldehido y reaccionar por animación reductiva sólo con término N del anti TLT-1 mAb (fragmento) por animación reductiva, conocido para una persona capacitada en la técnica. Otro ejemplo no exclusivo RSl podría ser un grupo maleimida, que puede reaccionar con un tiol libre en el anti TLT-1 mAb (fragmento) .
Durante la segunda etapa, el grupo reactivo RS2 puede hacerse reaccionar con selectividad de sitio baja o selectividad de sitio con una molécula FVI la. Como un ejemplo no exclusivo, una reacción selectiva de sitio en FVIIa puede ser obtenida cuando RS2 es un derivado de ácido siálico, que puede reaccionar en presencia de una enzima idónea tal como pero no limitada a ST3Gal-III con glicados ligados a N, que no terminan exclusivamente con ácidos siálicos. snthTLTi mAb (fragnenb) J~ ligador-RS2 + j proteína j — »- ^anfrUTi mAb (tagrrienb)j- ligador-| proteína j El orden de la adjunción del ligador a las dos proteínas, principalmente el anti-TLT-1 mAb (fragmento) y la proteína puede cambiarse, de este modo adjuntando primero la molécula RSl-Ligador-RS2 a la molécula de proteína y entonces al anti TLT-1 mAb (fragmento) .
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tal como las proteínas de fusión, polinucleótidos , vectores y células descritas en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de fusión de la invención, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Por consiguiente, un objetivo de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende tal anticuerpo que está presente en una concentración de 0.25 mg/ml a 250 mg/ml, y en donde la formulación tiene un pH de 2.0 a 10.0. La formulación puede comprender además un sistema amortiguador, conservador (es ) , agente (s) de tonicidad, agente (s) quelantes, estabilizadores y tensioactivos . El uso de conservadores, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizadores y tensioactivos en composiciones farmacéuticas son bien conocidos para una persona experta en la técnica. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice de Pharmacy, 19a edición, 1995.
En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Tal formulación es típicamente una solución o una suspensión. El término "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos 50% p/p agua. Igualmente, el término "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos 50%p/p agua, y el término "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos 50%p/p agua.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la ' que el médico o el paciente agrega solventes y/o diluyentes previo a su uso.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de tal anticuerpo, y una solución amortiguadora, en donde el anticuerpo está presente en una concentración de 1 mg/ml o arriba, y en donde la formulación tiene un pH de alrededor de 2.0 a alrededor de 10.0.
El término "tratamiento", como se usa en la presente, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro animal que necesita del mismo. El sujeto se espera que haya experimentado examinación física por un facultativo médico, que ha dado un diagnóstico tentativo o definitivo que indicaría que le uso del tratamiento específico es benéfico para la salud del humano u otro sujeto animal. La sincronización y propósito del tratamiento puede variar de un individuo a otro, de acuerdo con el status quo de la salud del sujeto. La administración preventiva o profiláctica de anticuerpos de la invención también se contempla, con la prevención siendo definida mientras se retrasa o evita el agravamiento de la manifestación de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. De esta manera, el tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.
En términos de la presente invención, los tratamientos profiláctico, palitativo, sintomático y/o curativo pueden representar aspectos separados de la invención.
Una coagulopatía que resulta en una tendencia hemorrágica incrementada puede ser causada por cualquier deficiencia cualitativa o cuantitativa de algún componente pro-coagulativo de la cascada de coagulación normal o cualquier sobre-regulación de fibrinolisis . Tales coagulopatías pueden ser congenitales y/o adquiridas e/o iatrogénicas y ser identificadas por una persona experta en la técnica.
Los ejemplos no limitantes de hipocoagulopatias congenitales son hemofilia A, hemofilia B, deficiencia Factor VII, deficiencia Factor X, deficiencia Factor XI, enfermedad de von Willebrand y trombocitopenias tal como Glanzmann's tromboastenia y síndrome de Bernard-Soulier .
Un ejemplo no limitante de una coagulopatía adquirida es deficiencia de serina proteasa causada por deficiencia de vitamina K; tal deficiencia de vitamina K puede ser causada por administración de un antagonista de vitamina K, tal como warfarina. La coagulopatía adquirida puede también ocurrir seguida del trauma excesivo. En este caso de otro modo conocido como el "ciclo vicioso sangrante", se caracteriza por la hemodilución (trombocitopenia dilucional y la dilución de los factores de coagulación) , hipotermia, consumo de factores de coagulación y trastornos metabólicos (acidosis) . La terapia de fluido y fibrinolisis incrementada puede exacerbar esta situación. La hemorragia puede ser de cualquier parte del cuerpo .
La hemofilia A con "inhibidores" (esto es, alo-anticuerpos contra factor VIII) y hemofilia B con "inhibidores" (esto es, alo-anticuerpos contra factor IX) son ejemplos no limitantes de coagulopatías que son parcialmente congénitas y parcialmente adquiridas.
Un ejemplo no limitante de una coagulopatía iatrogénica es una sobredosis de mediacación anticoagulante - tal como heparina, aspirina, warfarina y otra agregación de inhibidores de plaquetas - esto puede ser prescrito para tratar enfermedad tromboembólica . Un segundo, ejemplo no limitante de coagulopatia iatrogénica es esa que se induce por terapia de fluido excesiva y/o inapropiada, tal como esa que puede ser inducida por una transfusión de sangre.
En una modalidad de la invención actual, la hemorragia se asocia con hemofilia A o B. En otra modalidad, la hemoragia se asocia con hemofilia A o B con inhibidores adquiridos. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la enfermedad de von Willebrand. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con daño severo al tejido. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trauma severo. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con cirugía. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con gastritis y/o enteritis hemorrágica. En otra modalidad, la hemorragia es sangrado uterino abundante, tal como en el desprendimiento de la placenta. En otra modalidad, la hemorragia ocurre en órganos con una posibilidad limitada para hemostasia mecánica, tal como intracranialmente, intraoralmente o intraocularmente . En otra modalidad, la hemorragia se asocia con terapia anticoagulante.
En una modalidad adicional, la hemorragia puede ser asociada con trombocitopenia . En individuos con trombocitopenia, los constructos de la invención actual pueden ser co-administrados en plaquetas.
La siguiente es una lista no limitante de modalidades de la presente invención: Modalidad 1: Una proteina procoagulante que comprende (i) al menos ' un factor de coagulación, enlazado covalentemente a (ü) un anticuerpo, o fragmento del mismo, que es capaz de enlazar (iii) TLT-1, y/o un fragmento o variante del mismo.
Modalidad 2 : La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 1, en donde (iii) es TLT-1, or un fragmento o variante del mismo.
Modalidad 3: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (16-162) .
Modalidad 4 : La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (20-125) .
Modalidad 5: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (126-162) .
Modalidad 6: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-2, en donde (i) es una serina proteasa o un derivado del mismo.
Modalidad 7: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido Factor VII.
Modalidad 8: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido Factor IX.
Modalidad 9: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido Factor X.
Modalidad 10: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido Factor V.
Modalidad 11: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido Factor VIII.
Modalidad 12: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido Factor XI .
Modalidad 13: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-6, en donde (ii) es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.
Modalidad 14: La proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 10, en donde (ii) es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb o una región de determinación complementaria aislada (CDR) .
Modalidad 15: La proteina procoagulante de acuerdo a la modalidad 11, en donde (ii) es un fragmento Fab.
Modalidad 16: La proteina procoagulante de acuerdo co cualquiera de modalidades 13-15, en donde el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, 195 y L96 de SEQ ID NO: 5.
Modalidad 17: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse al mismo epitopo como mAb0023.
Modalidad 18: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-17, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia de aminoácidos CDR1 50 a 54 (DYFMY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (NKN DDYYDMDY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente.
Modalidad 19: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16- 18, en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 115 a' 122 (KQSYNLLT) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 20: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16- 17, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYYDMDY) de SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede ser sustituidos por un aminoácido diferente . y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: -una secuencia CDRl de aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 21: Una proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 20, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de amionoácidos 50 a 54 (DYFMY) de SEQ ID NO: 34; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de SEQ ID NO: 34; y una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYYDMDY) de SEQ ID NO: 34 , y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de SEQ ID NO: 35; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de SEQ ID NO: 35; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de SEQ ID NO: 35.
Modalidad 22: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 13-15, en donde el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S100 and L101 de SEQ ID NO: 5.
Modalidad 23: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse al mismo epitopo como mAb0051.
Modalidad 24: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 22-23, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o -una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (APM ITTGAWFAY) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente .
Modalidad 25: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 22-24, en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDRl de aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente; y/o -una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 26: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 22-23, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDRl de aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (APMITTGAWFAY) de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente . y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDRl de aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sr sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos puede ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 27: Una proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 26, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de SEQ ID NO: 36; y una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de SEQ ID NO: 36; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 129 (APMITTG A FAY) de SEQ ID NO: 36; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende : - una secuencia CDRl de aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de SEQ ID NO: 37; y . - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de SEQ ID NO: 37; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de SEQ ID NO: 37.
Modalidad 28: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades ,13-15, en donde el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S100 and L101 de SEQ ID NO: 5.
Modalidad 29: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un ' fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse al mismo epitopo como mAb0062.
Modalidad 30: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 28-29, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYD YFDV) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede ser sustituidos por un aminoácido diferente .
Modalidad 31: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 28- 30, en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser substituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 32: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 28- 31, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente . y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos or tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 33: Una proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 32, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de SEQ ID NO: 42; y una secuencia CDR2 de aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de SEQ ID NO: 42; y una secuencia CDR3 de aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de SEQ ID NO: 42; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de SEQ ID NO: 39; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de SEQ ID NO: 39; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de SEQ ID NO: 39.
Modalidad 34: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epitopo de (ü) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de E5, T6, H7, K8, 19, G10, Sil, L12, A13, E14, N 15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21 de SEQ ID NO: 7.
Modalidad 35: La proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 34, en donde los residuos son K8, 19, G10, Sil, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21.
Modalidad 36: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de K118, 1119, G120, S121, L122, A123, E124, N125, A126, F127 de SEQ ID NO: 6.
Modalidad 37: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse al mismo epitopo como mAb0061 o mAb0082.
Modalidad 38: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-37, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente.
Modalidad 39: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-38, en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o . - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 40: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-39, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDRl de aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de ¦ SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente. y en donde, la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 41: Una proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 40, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de • SEQ ID NO: 40; y una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de SEQ ID NO: 40; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 40; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41.
Modalidad 42: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-37, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de SEQ ID NO: 50, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) de SEQ ID NO: 50, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 50, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 43: Una proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 42, en donde la cadena pesada "de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RY MT) de SEQ ID NO: 50; y una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) de SEQ ID NO: 50; and - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 50; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41.
Modalidad 44: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el parátopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, V118 y Y120 de la cadena ligera anti-TLT-1 (L) (SEQ ID NO: 33), y residuos V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 y T120 de la cadena pesada anti-TLT-1 (H) (SEQ ID NO: 32) Modalidad 45: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15 y 44, en donde el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de SEQ ID NO: 4.
Modalidad 46: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse al mismo epitopo como mAb0012.
Modalidad 47: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44- 46, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RY MT) de SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede ser sustituidos por un aminoácido diferente.
Modalidad 48: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44-47, en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 49: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44- 48, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RY MT) de SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres or cuatro de estos aminoácidos puede ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
Modalidad 50: Una proteina procoagulante de acuerdo con modalidad 49, en donde la cadena pesada de (ii) comprende: - una secuencia CDR1 de aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de SEQ ID NO: 32; y una secuencia CDR2 de aminoácidos 68 a 84 ( EINPDSSTINYTPSLKD) de SEQ ID NO: 32; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de SEQ ID NO: 32; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: una secuencia CDR1 de aminoácidos 43 a ¦ 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de SEQ ID NO: 33; y - una secuencia CDR2 de aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 33; y - una secuencia CDR3 de aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 33.
Modalidad 51: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo.
Modalidad 52: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo.
Modalidad 53: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las- modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.
Modalidad 54: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 51-53, en donde el isotipo de (ii) es IgG.
Modalidad 55: La proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 54, en donde el isotipo es IgGl, IgG2 or IgG4.
Modalidad 56: La proteina procoagulante de acuerdo con la modalidad 55, en donde el isotipo es IgG .
Modalidad 57: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-56, que además comprende un ligador entre (i) y (ii) .
Modalidad 58: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-57, que es una proteina de fusión.
Modalidad 59: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-57, que es un conjugado de (i) y (ü) · Modalidad 60: El conjugado de acuerdo con modalidad 59, en donde (i) y (ii) están covalentemente conectados por un ligador que comprende polietileneglicol (PEG) .
Modalidad 61: El conjugado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 59-60, en donde (i) y (ii) están covalentemente conjugados por medio de un glicano de al menos una de las proteínas.
Modalidad 62: Un proceso para preparar una composición que comprende al menos un conjugado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 59-61, que comprende químicamente conjugar (i) el anticuerpo TLT-1 o fragmento del mismo con un grupo reactivo (RS1) de un ligador y hacer reaccionar (ii) el factor de coagulación con otro grupo reactivo (RS2) del ligador.
Modalidad 63: El proceso como se define en la modalidad 62, en donde (i) es un anticuerpo monoclonal.
Modalidad 64: El proceso como se define en la modalidad 62, en donde (i) es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.
Modalidad 65: El proceso como se define en la modalidad 64, en donde (i) es un fragmento Fab.
Modalidad 66: El proceso como se define en la modalidad 65, en donde el fragmento Fab contiene una mutación Cys en la región constante.
Modalidad 67: El proceso como se define en la modalidad 62, en donde (i) es un fragmento sc-Fab.
Modalidad 68 : El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido Fv.
Modalidad 69: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido FVIIa.
Modalidad 70: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido FVIII.
Modalidad 71: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido FIX.
Modalidad 72: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido FX.
Modalidad 73: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido FXI .
Modalidad 74: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-73, en donde el ligador es soluble en agua .
Modalidad 75: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-74, en donde el ligador es polímero.
Modalidad 76: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 74-75., en donde (ii) es glicol polietileno (PEG) .
Modalidad 77: El proceso como se define en la cualquiera de modalidades 74-75, en donde (ii) es ácido plisiálico.
Modalidad 78: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 74-75, en donde (ii) es almidón hidroxietil .
Modalidad 79: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es un aldehido.
Modalidad 80: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es un grupo maldeimida.
Modalidad 81: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es derivado de carbohidrato activado capaz de reaccionar en una reacción catalizada de enzima.
Modalidad 82: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 81, en donde RS1 es un derivado de ácido siálico activado capaz de reaccionar en una reacción catalizada de enzima.
Modalidad 83: El proceso como se define en la modalidad 82, en donde RS1 es O2- ácido [5 ' ] citidilil- ?-neuraminico .
Modalidad 84: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un aldehido.
Modalidad 85: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un grpo maldeimida.
Modalidad 86: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es derivado de carbohidrato activado capaz de reaccionar en una reacción de enzima catalizada.
Modalidad 87: El proceso como se define en la cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un derivado de ácido siálico.
Modalidad 88: La proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61, en la que (ii) tiene un KD de menos que 100 nM, tal como menos que 10 nM.
Modalidad 89: Un método de objetivo de un factor de coagulación, o un fragmento funcional del mismo, a la superficie de plaquetas activadas, el método comprende contactar las plaquetas activadas con una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61.
Modalidad 90: Una proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61 para uso como un medicamento .
Modalidad 91: La proteína procoagulante de la modalidad 87 para uso como un procoagulante.
Modalidad 92: Una formulación farmacéutica que comprende la proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61.
Modalidad 93: La proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61 o la formulación farmacéutica de acuerdo con la modalidad 92 para su uso en el tratamiento de una coagulopatía .
Modalidad 94: Use de la proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una coagulopatia .
Modalidad 95: Uso de acuerdo con cualquiera de las modalidades 93 o 94, en donde la coagulopatia es hemofilia A, con o sin inhibidores, o hemofilia B, con o sin inhibidores Modalidad 96: Un método de tratamiento de coagulopatia, que comprende administrar una cantidad efectiva de la proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61 o la formulación de la modalidad 93 a un individuo que necesita del mismo.
Modalidad 97: El método de acuerdo con la modalidad 95, en donde la coagulopatia es hemofilia A, con o sin inhibidores, y hemofilia B, con o sin inhibidores.
Modalidad 98: Un polinucleótido que codifica la proteina procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61.
Modalidad 99: Una célula aislada que comprende la proteina de fusión de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-61 y/o el polinucleótido de acuerdo con la modalidad 97.
Modalidad 100: Una proteina procoagulante para cualquiera de las modalidades 1-61, en donde (ii) enlazan a TLT-1 sin competir con fibrinógeno para enlazarse a TLT-1.
Modalidad 101: Una proteina procoagulante para cualquiera de las. modalidades 1-61, en donde (ii) no inhibe agregación de plaquetas.
La presente invención además es ilustrada por los siguientes ejemplos que no deben construirse como limitantes adicionales. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias citadas por toda esta solicitud se incorporan expresamente como referencia en su totalidad.
Ejemplos En los ejemplos, los anticuerpos anti-TLT-l y fragmentos de los mismos, por ejemplo fragmento Fab, se usaron como objetivo de factores de coagulación para plaquetas activadas. Con el fin de facilitar la interpretación de los datos presentados en el ejemplo, la Tabla 3A resume la información respecto a algunos de los anticuerpos anti-TLT-l y fragmentos de los mismos adicionalmente descritos anteriormente. En la tabla 3A, los anticuerpos precursores, variantes, fragmentos, fusiones y conjugados de los mismos se enlistan con referencia al mAb precursor y tipo de proteina. Nombre se refiere al nombre de la proteina, Precursor se refiere a el anticuerpo del que el mAb anti-TLT-l, Fab o fusión/conjugado se deriva y el Tipo define si la proteina es un mAb, un Fab, una fusión de ADN (fusión) con un factor de coagulación o un conjugado químico con un factor de coagulación (conjugado) .
Tabla 3A: Visión en conjunto de los anticuerpos (mAbs) , fragmento de anticuerpos (Fabs) y Fusión-proteínas Ejemplo 1: Clonación y expresión de hTLT-1 ECD-His antigeno.
Secuencia de nucleótidos que codifican el dominio extracelular de ' TLT-1 humano (hTLT- 1) (Figura 1) junto con una etiqueta His-6 de C-terminal se amplificaron con PCR con un cebador delantero que contiene un sitio de reconocimiento HindIII junto con una secuencia kozak, y un cebador inverso que contiene un codón de detención y un sitio de reconocimiento EcoRI (Figura 2). El fragmento PCR que digiere HindIII y EcoRI se insertó en los sitios HindIII- y EcoRI de un vector de expresión basado en pTT. El vector pTT está descrito esencialmente en Durocher, Y. et al., (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9. El plásmido de expresión resultante se designó pTT-hTLT-l ECD-His. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para hTLT-1 ECD-His se muestran en SEQ ID NO: 3 y 4. pTT-hTLT-1 ECD-His se transfirió en células de suspensión HEK293-6E con el fin de expresar transitoriamente hTLT-1 ECD-His. Las células HEK293-6E se maduraron en medio Freestyle HEK293 (GIBCO, cat. no. 12338-018) complementado con P/S al 1% (GIBCO cat. no. 15140-122), 0.1% plurónico (GIBCO, cat. no. 24040-032) y 25 ug/mL Geneticina (GIBCO, cat. no. 10131-019) y las células se transfectaron a una densidad celular de 1 mill/mL usando 293fectina (Invitrogen, cat. no. 12347-019) . Por cada litro de células HEK293-6E, la transfección fue realizada por la dilución de 1 mg de pTT-hTLT-1 ECD-His ADN en 30 mL Optimem (dilución A) y diluyendo 1 mL de 293fectina en 30 mL de Optimem (GIBCO, cat. no. 51985-026, dilución B) . Las diluciones A y B se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. La mezcla de transfección de aquí en adelante se agregó a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humificada con rotación orbital (125 rpm) . De cinco a siete días después de la transfección, las células se removieron por centrifugación y el hTLT-1 ECD-His resultante que contiene sobrenadantes se filtraron estériles previo a su purificación.
Ejemplo 2: Purificación y caracterización de proteina hTLT-1 ECD-His .
La purificación de la proteina hTLT-1 ECD-His se condujo como un proceso de 2 etapas compuesto de 1) cromatografía de His-afinidad usando la resina cargada de cobalto TALON (Clon.tech, cat. no. 635506) y 2) cromatografía de intercambio de anión usando la fuente de resina de partícula fina 15Q (GE Healthcare, cat. no. 17-0947). Las purificaciones se condujeron usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat. no. 18- 1112-41). Los sistemas amortiguadores usados para la primera etapa de purificación fue una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Hepes 20 mM, pH 7.0, NaCl 150 mM, una solución amortiguadora de lavado compuesta de Hepes 20 mM, pH 7.0, NaCl 0.5 M y una solución amortiguadora de elusión compuesta de Hepes 20 mM, pH 7.0, Imidazol 150 mM. El sobrenadante celular se aplicó directamente sin algún ajuste en una columna TALON pre-equilibrada . La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio, 20 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado y finalmente con 20 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio. La proteina se eluyó isocraticalmente en aproximadamente 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución. La masa molecular de la proteina eluida se analizó usando geles SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat . no. NP0321BOX) y Espectrometría de masa de tiempo de vuelo de ionización de desorpción de láser asistido de matriz (MALDI-TOF S) configurado al sistema Micro-flex (Bruker Daltonics) . Aquí, dos distintas masas de proteína se observaron de aproximadamente 16.7 y 33.4 kDa de casi cantidades iguales. Las masas observadas correspondieron a formas de monómero y dímero de hTLT-1 ECD-His. La reducción de la proteína resultó en la abolición completa de la proteína 33.4 kDa, mientras se intensifica la proteína 16.7 kDa como se juzga de un análisis SDS-PAGE/Coomassie. De esta manera, la proteína hTLT-1 ECD-His contuvo un dímero C-C interligado. Con el fin de segregar el monómero de dímero, una segunda etapa de purificación se empleó. Los sistemas amortiguadores usados para esta etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Hepes 50 mM, pH 8.0 y una solución amortiguadora de elución compuesta de Hepes 50 mM, pH 8.0, NaCl 1 M. La muestra se ajustó a un pH de 8.0 usando 1 M NaOH y entonces se diluyó a una conductividad de aproximadamente 10 mS/cm. La proteína se aplicó a una columna Source 15Q de pre-equilibrio, se lavó con 5 volúmenes de columna de equilibrio y se eluyó usando 0 - 100% solución amortiguadora de elución sobre 20 volúmenes de columna. Basándose en el monitoreo UV280, dos picos fueron aparentes con casi la separación de línea base. Las fracciones de análisis sobre los dos picos usando análisis SDS-PAGE/Coomassie, MALDI-TOF MS y Dynamic Light-Scattering (DLS) usando un instrumento Dynapro (Wyatt Technology) mostraron la presencia de monómero de proteína hTLT-1 ECD-His primero en el pico de elución y segundo en el dímero Cys-Cys en el pico de elución. Un contenedor se preparó que contiene el monómero proteína hTLT-1 ECD-His únicamente. La integridad de la proteína final se analizó basándose en un método de Cromatografía líquida de desempeño alto de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) configurado en un sistema Agilént LC 1100/1200 y usando una columna BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm (Phenomenex, cat. no. 00H-2146-K0) y una solución amortiguadora de ejecución compuesta de 200 mM NaPhosphate pH 6.9, NaCl 300 mM e isopropanol al 10%. La proteína eluída como un pico simétrico sencillo en un tiempo de retención de aproximadamente 9.9 min en una tasa de flujo de 1 ml/min.
Un lote de hTLT-1 ECD-His se preparó con un estudio de inmunización para la producción de anticuerpos monoclonales anti-TLT-1. De esta manera, la proteína se dializó en una solución amortiguadora PBS isotónica usando un Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette lOkDa MWCO (Pierce, cat. no. 66453) . Para medir la concentración de proteina final, un espectro-tómetro NanoDrop (Thermo Scientific) se usó junto con un coeficiente de extinción de 0.55.
Ejemplo 3: Preparación de anticuerpos TLT-1 monoclonales.
Los ratones RBF se inmunizaron inyectando 50 pg de hTLT-1 ECD-His. FCA subcutáneamente seguido por dos inyecciones con 20pg de hTLT-1 ECD-His en FIA. Los ratones de respuesta alta fueron estimulados vía intravenosa con 25pg de hTLT-1 ECD-His y los bazos se recogieron después de 3 días. Las células del bazo se fusionaron con la linea celular Fox de mieloma. Los sobrenadantes se seleccionaron para la producción de anticuerpo especifico hTLT-1 en un ELISA especifico y en un ensayo FACS utilizando hTLT-1- o células CHO transfectadas de Mock como células objetivo positivas y negativas, respectivamente. Se hizo una segunda selección en el resto versus plaquetas activadas agonistas duales de origen humano, mono cynomolgous, perro, conejo o ratón.
Ejemplo 4: Clonación y secuenciado de anti-TLT-1 mAb LC y HC cADNs de hibridoma.
El ARN total se extrajo de cuatro diferentes anti-TLT-1 mAb expresando hibridoma designados: 0012Hyb, 0023Hyb, 0051Hyb y 0052Hyb. El ARN se extrajo de células de hibridoma usando el mini kit RNeasy (Qiagen, cat. no. 74106) y una alícuota del ARN resultante se usó como plantilla para la síntesis de cADN de primera hebra usando el kit de amplificación SMART RACE cADN (Clontech, cat . no. 634914) seguido de las instrucciones del fabricante para 5' RACE y usando el cebador A 5' RACE CDS junto con oligonucleótido ARN SMART II A. Los cADNs de reión de codificación de cadena ligera (LC) la cadena pesada (HC) de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 de aquí en adelante fueron amplificados de PCR usando la mezcla de cebador delantero UPM junto con ya sea un LC de ratón, cebador inverso especifico kappa (numero de cebador inverso 339, 348, o 610) o junto con secuencias de un ratón de reconocimiento de cebador inverso IgGl, IgG2a, IgG2b o IgG3 (número de cebador inverso 341, 347, 613, 614, 615, o 616, las secuencias de cebador se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60-145) . Las reacciones PCR se realizaron usando mezcla PCR de fusión (FinnZymes, cat no.: F-531L) . Los fragmentos PCR resultantes se clonaron usando el kit de clonación Zero blunt Topo PCR para la secuencia (Invitrogen, cat. no. K287540) y secuenciado. Las secuencias de dominio variable para 0012LC y HC se muestran en las Figuras 3A-3D.
Ejemplo 5: Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012HC, pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT- 0052HC.
El dominio de variable HC (VH) que codifica las secuencias de ADN aislado de cada uno de los cuatro diferentes hibridomas anti-TLT-1 se amplificaron por PCR con cebadores delanteros que contienen un sitio de enzima de restricción HinDIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción Nhel para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN 0012VH, 0023VH, 0051VH y 0052VH se amplificaron por PCR usando mezcla de PCR de fusión (FinnZymes, cat No. F-531L) con los siguientes pares de número de cebador: 490 (delantero) + 491 (inverso), 546 (delantero) + 547 (inverso), 627 (delantero) + 628 (inverso), y 617 (delantero) + 618 (secuencias inverso, delantero se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60-145), respectivamente, y se insertan en los sitios de enzima de restricción HinDIII y Nhel de un vector basado en pTT designado pTT- hIgG4, que contiene la región constante que codifica las secuencias para IgG4 humana HC (esto es CHl-bisagra-CH2-CH3) . El vector pTT es esencialmente descrito en Durocher, Y. et al., (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9 (Figura 22A-22B) . Los vectores resultantes se designaron pTT-0012HC (Figura 5), pTT-0023HC, pTT-0051HC, y pTT-0052HC. Las secuencias de aminoácidos HC anti-TLT-1 codificadas por los vectores de expresión se muestran (SEQ. ID NO: 0012HC: 32, 0023HC: 34, 0051HC: 36, 0052HC: 38).
Ejemplo 6: Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC y pTT- 0052LC.
El domino variable LC (VL) que codifica las secuencias de ADN aislado de de cada uno de los cuatro diferentes hibridomas anti-TLT-1 se amplificaron por PCR con cebadores delanteros que contienen un sitio de enzima de restricción HinDIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción BsiWI para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN 0012VL, 0023VL, 0051VL y 0052VL se amplificaron por PCR con los siguientes pares de número de cebadores: 493 (delantero) + 495 (inverso) , 548 (delantero) + 549 (inverso) , 492 (delantero) + 494 (inverso), y 619 (delantero) + 620 (las secuencias de cebador inverso se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60- 145) , respectivamente, y se insertan en los sitios de enzima de restricción HinDIII y BsiWI de un vector con base en pTT designado, pTT-hLC, Kappa, que contiene la región constante que codifica secuencias para LC humano, kappa. Los vectores resultantes se designaron pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC, y pTT-0052LC. La secuencia de aminoácido anti-TLT-1 LC codificada para los vectores de expresión se muestra en (SEQ ID NO: 0012LC: 33, 0023LC: 35, 0051LC: 37, 0052LC: 39) .
Ejemplo 7: Desarrollo de pTT-0012HC .T60N, pTT-0012HC . T60A, pTT- 0012LC.C36A y pTT-0052HC . C91Y .
La secuencia de aminoácido 0012VH contiene un sitio de glicosilación potencial ligado a N (T60, numeración Kabat) y las secuencias de aminoácidos 0012VL y 0052VH cada uno contiene un Cys sin par (C36 y C91, respectivamente, numeración Kabat). Los vectores de expresión que codifican 0012HC.T60N o 0012HC.T60A o 0012LC.C36A o 0052HC.C91Y se desarrollaron usando mutagénesis dirigida al sitio (Quickchange II, Stratagene, número de catálogo 20523-5) seguido de las instrucciones del fabricante. Las reacciones de mutagénesis dirigida al sitio se realizaron usando a) pTT-0012HC ADN como plantilla y números de cebador 682 (delantero) + 683 (inverso) para pTT-0012HC . T60N, b) pTT-0012HC ADN como plantilla y números de cebador 688 (delantero) + 689 (inverso) para pTT-0012HC . 60A, c) pTT- 0012LC ADN como plantilla y números de cebador 598 (delantero) + 599 (inverso) para pTT-0012LC.C36A, d) pTT-0052HC ADN como plantilla y los siguientes números de cebador 684 (delantero) + 685 (secuencias de cebador inverso se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60-145) para pTT-0052HC . C91Y . Los vectores de expresión resultantes se secuenciaron con el fin de verificar' las secuencias de ADN. La secuencia de aminoácido anti-TLT-1 HC y LC codificada por los vectores de expresión pTT-0012HC . T60N, pTT-0012HC.T60A y pTT-0012LC . C36A se muestran en (SEQ ID NO: 0012HC.T60N (también llamada 0061HC) : 40, 0012HC.T60A (también llamada 0082HC) : 43, 0012LC.C36A (también llamada 0061LC) : 41). La secuencia de aminoácidos 0012LC.C36A también se muestra sin secuencia de péptido de señal de N-terminal en SEQ ID NO: 153.
Ejemplo 8: El desarrollo de constructos de expresión pTT- 0012LC-HPC4, pTT-0012LC . C36A-HPC4 , pTT- 0023LC-HPC4 , pTT- 0051LC-HPC4 y pTT-0052LC-HPC4.
VL que codifica las secuencias de ADN aislado de cada uno de los cuatro diferentes hibridomas anti-TLT-1 se amplificaron por PCR con cebadores delanteros que contienen un sitio de enzima de restricción HinDIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción BsiWI para propósitos . de clonación. Las secuencias de ADN 0012VL, 0012VL.C36A, 0023VL, 0051VL y 0052VL se amplificaron por PCR en los siguinetes números de cebador: 493 (delantero) + 495 (inverso) , 493 (delantero) + 495 (inverso) , 548 (delantero) + 549 (inverso), 492 (delantero) + 494 (inverso), y 619 (delantero) + 620 (las secuencias de cebador inverso se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs : 60-145) respectivamente, usando mezcla PCR de fusión (FinnZymes, cat No. F-531L) . El CL humano, kappa que codifica la secuencia se amplificó por PCR con número de cebador delantero 486 y número de cebador inverso 485. El número de cebador delantero 486 conteien un sitio de enzima de restricción BsiWI y un cebador inverso 485 que codifica una etiqueta HPC4 seguido por un codón de detención y contiene un sitio EcoRI flanqueado 3' para propósitos de clonación. La reacción PCR se realizó usando mezcla PCR de fusión (FinnZymes, cat No. F-531L) . HindIII+BsiWI digirió el fragmento PCR 0012VL que se mezcló con BsiWI+EcoRI digerido de humano CL, fragmento PCR kappa-HPC4 y se insertó en los sitios HinDIII + EcoRI de un vector de expresión basado en pTT resultando en pTT-0012LC-HPC4 (Figura 4). Con el fin de desarrollar vectores de expresión correspondientes que codifican la veRSlón LC-HPC4 de las cuatro secuencias anti-TLT-1 LC restantes, la secuencia 0012VL en pTT-0012LC-HPC4 se escindió con HinDIII+ BsiWI y se remplazó con HinDIII+BsiWI fragmentos PCR 0023VL, 0051VL, 0052VL y 0012VL.C36A digeridos. Los cuatro vectores de expresión resultantes se designaron: pTT-0023LC-HPC4 , pTT-0051LC- HPC4, pTT-0052LC-HPC4 y pTT-0012LC.C36A.HPC4 (Figura 4B) . Las secuencias de aminoácidos codificadas por pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4 , pTT-0051LC-HPC4 y pTT-0052LC-HPC4 se muestran en SEQ ID NO: 0012LC . C36A-HPC4 (también llamada 0061LC-HPC4 ) : 167, 0023LC-HPC4: 179, 0051LC-HPC4: 177, 0052LC-HPC4 (también llamada 0062LC-HPC4 ) : 174.
Ejemplo 9: Desarrollo de constructos de expresión pTT- 0012VH.T60N-CH1-YGPPC, pTT-0023VH-CHl- YGPPC, pTT-0051VH-CHl- YGPPC, y pTT-0052VH.C91Y-CHl-YGPPC.
Las secuencias 0012VH. T60N-CH 1-YGPPC, 0023VH-CH 1-YGPPC, 0051VH-CH 1-YGPPC y 0052VH. C91Y-CH 1-YGPPC (YGPPC es una secuencia de aminoácido de bisagra humana IgG4 parcial) se amplificó por PCR de pTT-0012HC . T60N, pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT-0052HC . C91Y respectivamente usando pares de cebador delantero e inverso: 572 (delantero) + 698 (inverso), 57.6 (delantero) + 698 (inverso), 627 (delantero) +698 (inverso) and 617 (delantero) +698 (inverso), respectivamente. Los cebadores delanteros contienen un sitio de enzima de restricción HinDIII y el cebador inverso 698 contiene un codón de detención y un sitio EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento PCR resultante se digirió con HinDIII+EcoRI y se insertó en los sitios HinDIII+EcoRI de un vector basado en pTT. Los vectores de expresión resultantes se designaron pTT-0012VH. T60N-CH1-YGPPC (Figura 4), pTT-0023VH-CH1- YGPPC, pTT-005lVH-CHl-YGPPC y pTT-0052VH . C91Y-CH 1-YGPPC. Las secuencias de aminoácidos codificadas por pTT-0012VH . T6ON-CH1-YGPPC (Figura 4A) , pTT-0023VH-CHl- YGPPC, pTT-0051VH-CH1-YGPPC y pTT-0052VH . C91Y-CH1-YGPPC se muestran en SEQ ID NO: 0012VH. T6ON-CH1-YGPPC (también llamada 0061VH -CH 1-YGPPC) : 171, 0023VH-CH1- YGPPC: 178, 0051VH-CH 1-YGPPC 176, 0052VH.C91Y-CH 1-YGPPC (también llamada 0062VH- CHl-YGPPC) : 175.
Ejemplo 10 : Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012VH-CH1, pTT-0012VH-CHl-HPC4 , pTT- 0023VH-CH1, pTT-0023VH-CHl-HPC4 , pTT-005lVH-CHl, pTT-0051VH-CHl-HPC4 , pTT-0052VH-CHl y pTT- 0052VH-CH1-HPC4.
Las secuencias 0012VH, 0023VH, 0051VH, y 0052VH aisladas de 0012Hyb, 0023Hyb, 0051Hyb, 0052Hyb se amplificaron por PCR con números de cebador: 490 (delantero) + 491 (inverso), 546 (delantero) + 547 (inverso), 627 (delantero) +628 (inverso), 617 (delantero) + 618 (secuencias de cebador inverso se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60-145) , respectivamente, usando mezcla PCR de fusión (FinnZymes, cat No. F-531L) . Todos los cebadores delanteros (490, 546, 627, y 617) contuvieron un sitio HinDIII y toos los cebadores inversos (491, 547, 628, y 618) contuvieron un sitio Nhel para propósitos de clonación. La región CH1 IgG4 humana se amplificó por PCR ya sea con números de cebador: 489 (delantero) + 488 (inverso), o números de cebador 489 (delantero) + 487 (inverso) . El número de cebador delantero 489 contuvo un sitio Nhel, el número de cebador inverso 488 contuvo un codón de detención y un sitio EcoRI, y el número de cebador inverso 487 contuvo una secuencia de codificación de etiqueta HPC4, un codón de detención seguido por un sitio EcoRI para propósitos de clonación. HinDIII+Nhel digerido de fragmento PCR 0012VH se combinó con ya sea Nhel+EcoRI digerido de fragmento PCR CHlPCR IgG4 humana o con Nhel+EcoRI digerido de fragmento PCR CH1-HPC4 IgG4 y se clonó en los sitios HindIII+EcoRI para un vector basado en pTT . Los vectores resultantes se designaron pTT-0012VH-CHl y pTT-0012VH-CH1-HPC4, respectivamente. El vector pTT-0012VH-CHl-HPC4 se muestra en la Figura 5. El aminoácido 0012VH-CH1-HPC4 y las secuencias de ADN se muestran en SEQ ID NOs 168-169. Los dominios VH de pTT-0012VH-CHl y de pTT-0012VH-CHl- HPC4 se escindieron por digestión HindIII+Nhel y HinDIII+Nhel digirió 0197-0000-0023VH, 0197-0000-0051VH y 0197-0000-0052VH los fragmentos PCR fueron insertados. Los vectores de expresión resultantes se designaron: pTT-0023VH-CHl , pTT-0023VH-CHl-HPC4, pTT-005lVH-CHl, pTT-0051VH-CHl-HPC4 , pTT-0052VH-CH1 , y pTT-0052VH-CHl-HPC4.
Ejemplo 11 : Desarrollo de constructos de expresión pTT- 0012VH.T60N-CH1, pTT-0012VH.T60N-CHl-HPC4, pTT-0052VH . C91Y-CH1 y pTT-0052VH.C91Y-CHl-HPC4.
La secuencia 0012VH. T60N-CH1 y 0052VH. C91Y-CH1 (incluyendo la secuencia que codifica el péptido de señal) se amplificó por PCR de pTT-0012HC . T60N y pTT-0052HC. C9.1Y, respectivamente usando mezcla PCR de fusión (FinnZymes, cat No. F-531L) . Para el fragmento PCR 0012VH . T60N-CH1 el número de cebador delantero 572 que contiene un sitio de enzima de restricción HinDIII y el número de cebador inverso 488 que contiene un sitio EcoRI para propósitos de clonación o cebador inverso 487 que contiene una secuencia que codifica la etiqueta HPC4 junto con un sitio EcoRI para propósitos de clonación se emplearon. Para el fragmento PCR 0052VH. C91Y-CH1 el número de cebador delantero 617 junto con ya sea número de cebador inverso 488 o 487 se emplearon (las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y SEQ ID NOs 60-145) . Los fragmentos PCR resultantes se digirieron con HinDIII+ EcoRI y se insertaron en los sitios HinDIII + EcoRI de un vector basado en pTT. Los vectores de expresión resultantes se designaron pTT-0012VH. T60N-CH1, pTT-0012VH . T60N-CH1-HPC4 , pTT-0052VH.C91Y-CH1 y pTT-0052VH. C91Y-CHq-HPC . La secuencia de aminoácidos codificada por pTT-0012VH. T60N-CHq se muestra en SEQ ID NO: 0012VH. T60N-CH1 (también llamada 0061VH-CH1) : 146 mientras que la secuencia de aminoácido correspondiente sin la secuencia de péptido de señal de N-terminal se muestra en SEQ ID NO: 152.
Ejemplo 12 : Desarrollo de constructos de expresión pTT-FIX- L4b-0012LC y pTT-FIX-L4b- 0012LC . C36A.
La secuencia de ADN FIX (incluyendo la secuencia que codifica la péptidoseñal) se amplificó por PCR de las secuencias de ADN FIX humano usando cebador delantero 753 y cebador inverso 754. El cebador delantero 753 inserta un sitio de enzima de restricción HinDIII extremo 5' y el cebador interno 754 inserta un ligador de glicina-serina largo de aminoácidos 17 (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS ) que contiene un sitio de enzima de restricción BamHI extremo 3' para propósitos de clonación. El fragmento PCR FIX-L4b se insertó en los sitios HinDIII + BamHI de pTT- hTF.1-219-L4b-0012LC es decir remplazando las secuencias de ADN hTF.1-219 y resultando en el constructo de expresión FIX- L4b-0012LC designado pTT-FIX-L4b-0012LC (Figura 5) . El aminoácido FIX- L4b-0012LC y las secuencias de ADN se muestran en SEQ ID NO: 172-173.
Con el fin de desarrollar un plásmido de expresión que codifique pTT-FIX-L4b-0012LC . C36A la región de codificación 0012LC.C36A excluyendo la .secuencia de péptido de señal se amplificó por PCR usando pTT-0012LC . C36A como plantilla y usando cebador delantero 1055 que contiene un sitio BamHI extremo 5' y cebador inverso 1056 que contiene un codón de detención y un sitio EcoRI para propósitos de clonación (Tabla 4). El fragmento PCR resultante se insertó en los sitios BamHI y EcoRI de pTT-FIX-L4b-0012LC es decir remplazando la secuencia de ADN 0012LC con la secuencia de ADN 0012LC.C36A. El vector de expresión resultante se llamó pTT-FIX-L4b-0012LC . C36A y codifica the secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: FIX-L4b-0012LC.C36A (también llamada FIX-L4b-0061LC) : 182.
Ejemplo 13: Desarrollo del constructo de expresión pTT-FVII- L4b-0052VH . C91Y-CH1-HPC4.
La secuencia de ADN FVII humano (incluyendo la secuencia que codifica la péptidoseñal ) se amplificó por PCR de las secuencias de ADN FVII humano usando el cebador delantero 751 y el cebador inverso 752. El cebador delantero 751 inserta un sitio de enzima de restricción HinDIII de extremo 5' y el cebador inverso 752 inserta un ligador de glicina-serina largo de aminoácidos 17 (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS) que contiene un sitio de enzima de restricción BamHI de extremo 3' para propósitos de clonación. El fragmento PCR FVII-L4b se insertó en los sitios HinDIII + BamHI de pTT-hTF. 1-219-L4b-0012LC es decir remplazando las secuencias de ADN hTF.1-219 y resultando en el constructo de expresión FVII-L4b-0012LC designado pTT-FVII-L4b-0012LC. La secuencia de ADN que codifica 0052VH C91Y-CH1-HPC4 se amplificó por PCR usando el vector pTT-0052VH.C91Y-CH1-HPC4 como plantilla y usando el cebador delantero 1236 que contiene una enzima de sitio e restricción BamHI de extremo 5' y usando cebador inverso 1095 que contiene un codón de detención y un sitio EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR resultante se insertó en el sitio BamHI + EcoRI de pTT-FVII-L4b-0012LC esto es remplazando la secuencia 0012LC y resultando en el vector de expresión designado pTT-FVII-L4b-0052VH. C91Y-CH1-HPC4. El aminoácido FVII-L4b- ' 0052VH.C91Y-CH1-HPC4 se muestra en SEQ ID NO: FVII-L4b-0052VH.C9lY-CHl-HPC4 (también llamado FVI I-L4b-0062VH-CH1-HPC4): 180.
Ejemplo 14: Transfección transitoria de células HEK293-6E.
Todos mAb, Fab, y proteínas de fusión se expresaron en células de suspensión HEK293-6E por plásmidos de expresión de t-ransfección transitoria en células. Las combinaciones de plásmidos individuales subyacentes de los compuestos de proteína específica resultantes se muestran en la Tabla 5. Las células HEK293-6E se maduraron en medio Freestyle HEK293 (GIBCO, cat. no. 12338-018) suministradas con P/S 1% (GIBCO cat. no. 15140-122), plurónico al 0.1% (GIBCO, cat. no. 24040-032) y 25 ug/mL Geneticina (GIBCO, cat. no. 10131-019) y las células se transíectaron en una densidad celular de aproximadamente 1 mill/mL usando 293fectina (Invitrogen, cat. no. 12347-019) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve, por cada litro de células HEK293-6E, la transfección se realizó diluyendo un total de 1 mg de ADN en 30 mL Optimem (dilución A) y diluyendo 1 mL 293fectina en 30 mL Optimem (GIBCO, cat. no. 51985-026, dilución B) . Las diluciones A y B se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. La mezcla de trasnfección de aquí en adelante se agregó a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humificada con rotación orbital (125 rpm) . DE cinco a siete días después de la transfección, las células se removieron por centrifugación y los sobrenadantes del cultivo celular resultante se filtraron estériles previos a la purificación. Para todos los experimentos de transfección transitoria usando co-transfección de 2 plásmidos de expresión, los plásmidos se cotransfectaron en una relación de plásmido 1:1 (ug:ug) usando una cantidad de ADN total de lmg por cada litro de células HEK293-6E para transfectarse.
Tabla 4: Números y secuencias de cebadores .
Tabla 5 : Visión en conjunto de la combinación de plásmido subyacente a la expresión de ID de proteína 0061 (SEQ40+41) , 0023 (SEQ34+35) , 0051 (SEQ36+37) , 0062 (SEQ42+39) , 0084 (SEQ1 71 +SEQ1 67) , 0074 (SEQ176+177) , 0003 (SEQ175+174) , 0004 (SEQ178+179) , 0135 (SEQ169+SEQ173) , 0145 (SEQ32+173) e ID de proteína 5001 (SEQ180+39) .
Ejemplo 15: Purificación y caracterización de antiTLT-1 Fabs (Fab0084, Fab0074, Fab0003 y Fab0004) recombinantemente expresados .
La purificación de los anti-TLT-1 Fabs (0084, 0074, 0003 y 0004) se condujo usando cromatografía de afinidad basada en la resina kappaSelect (GE Healthcare, cat . no. 17- 5458-01). Los cuatro Fabs contienen un residuo de cisteina libre sencillo, cada uno incluido en la secuencia. La purificación se condujo usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat. no. 18-1112-41).· Los sistemas amortiguadores usados para la etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de lavado/equilibrio compuesta de Nafosfato 10 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM y una solución amortiguadora de elución compuesta de ácido fórmico 20 mM, pH 3.0. No se condujeron ajustes del sobrenadante celular clarificado previo a la aplicación en una columna pre-equilibrada empacada con la resina kappaSelect. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio/lavado. La proteína se eluyó isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución. La elución se ajustó a pH 7 usando Nafosfato 0.5 M, pH 9.0. La masa molecular de la proteína eluída se analizó usando geles SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat. no. NP0321BOX) y establecimiento del método de Espectrometría de masa de tiempo de vuelo de ' ionización de desorción de láser asistido de matriz en un instrumento Agilent 6210 y una columna de desalinización MassPREP (Waters, cat . no. USRM 10008656) . Una proteina pura y homogénea con una masa molecular esperada se observó. Un análisis de cromatografía líquida de desempeño alto de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) se estableció en un sistema Agilent LC 1100/1200 y usando una columna BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm (Phenomenex, cat. no. 00H-2146-K0) y una solución amortiguadora de ejecución compuesta de 200 m Nafosfato pH 6.9, NaCl 300 mM y isopropanol 10% también se condujo. Aquí, la proteína eluída como un pico simétrico sencillo en un tiempo de retención de aproximadamente 9.1 min en una tasa de flujo de 1 ml/min. Para medir la concentración de proteína final, un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) se usó junto con un coeficiente de extinción de 1.29.
Ejemplo 16: Purificación y caracterización de proteina de fusión (FIX-Fab0135) FIX- anti-TLT-1 Fab recombinantemente expresada .
La purificación de FIX-Fab0135 se condujo usando un método de cromatografía de afinidad basado en .una resina anti-HPC4 (Roche, cat. no. 11815024001). La purificación se condujo usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat. no. 18-1112-41). Los sistemas amortiguadores usados para la etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Hepes 20 mM, pH 7.5, CaC12 1.0 mM, NaCl 100 mM y 0.005% (v/v) Tween-80, una solución amortiguadora de lavado compuesta de de Hepes 20 mM, pH 7.5, CaC12 1.0 mM, NaCl 1.0 M y 0.005% (v/v) Tween-80, y una solución amortiguadora de elución compuesta de Hepes 20 mM, pH 7.5, EDTA 5.0 mM y NaCl 100 mM. Los sobrenadantes se ajustaron con concentración final de CaC12 1 mM y un pH de 7.5 y se aplicaron en una columna anti-HPC4 pre-equilibrada . La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio, 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado y al menos con 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio. La proteina se eluyó isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución. La proteina se analizó usando SDS-PAGE/Coomassie y Espectrometría de masa de tiempo de vuelo de ionización de desorción de láser asistido de matriz (MALDI-TOF MS) establecido en un sistema Micro-flex (Bruker Daltonics) , mostrando que una proteína pura y homogénea con una masa molecular de 106 kDa se obtuvo. Ya que la masa teorética de la secuencia de aminoácidos para el constructo FIX-Fab0135 fue 95.9 kDa, la proteína expresada contuvo modificaciones post-traslacionales . Para medir las concentraciones de proteína final, un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) se usó junto con coeficiente de extinction de Ejemplo 17: Plásmidos mutantes pcADN3.1( + ) -hTLT-1 ECD-HPC4 ala .
Cuarenta constructos de expresión mutante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala se designaron de acuerdo con la Tabla 6. Los constructos de expresión se desarrollaron por contractor externo GENEART AG ( Im Ge erbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) y todos los 40 constructos de expresión se hicieron basándose en el vector de expresión designado pcADN3.1(+). Alícuotas de ADN para cada uno de los constructos de expresión 40 hTLT-1 ECD-HPC4 pcADN3.1(+) se transfectaron en células de suspensión HEK293-6E con el fin de expresar transitoriamente cada proteina mutante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 6) . La transfección transitoria y cultivo de células HEK293- 6E se realizaron como se describe en el ejemplo 14.
Tabla 6 wt tipo natural 1 L22A 2 V25A 3 Q27A 4 V30A 5 L35A 6 H39A 7 R 1A 8 L42A tipo natural Q43A K46A Q48A F54A L55A P56A E57A Q60A D68A R69A R70A R75A L82A L86A E90A M91A T93A Q95A E96A E97A D107A R110A H116A R117A wt tipo natural 33 S119A 34 P125A 35 E126A 36 E128A 37 E130A 38 S136A 39 N140A 40 K159A Ejemplo 18: Purificación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-TLT-1 (mAb0012, mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) .
La purificación de los anticuerpos anti-TLT-1 monoclonales recombinantemente expresados descritos en la Tabla 5 fue conducida por un proceso de 2 etapas compuesta de cromatografía de actividad usando una resina Proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare, cat. no. 17- 5438-01) y cromatografía de filtración de gel usando una columna 26/60 Superdex 200 PrepGrade (GE Healthcare, cat no. 17-1071-01). Las purificaciones se condujeron usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat. no. 18-1112-41). Los sistemas amortiguadores usados para la etapa de purificación de afinidad fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Nafosfato 20 mM pH 7.2, NaCl 150 mM, de solución amortiguadora de - elución compuesta de ácido fórmico 10 mM pH 3.5 y una solución amortiguadora de ajuste de pH compuesta de Nafosfato 0.5 M pH 9.0. Los sobrenadantes celulares se aplicaron directamente sin algún ajuste en una columna MabSelect SuRe pre-equilibrada . La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio y los anticuerpos monoclonales se eluyeron isocráticamente en aproximadamente 2-5 volumen de columna de solución amortiguadora de elución. Las fracciones agrupadas se ajustaron a un pH neutral usando la solución amortiguadora de pH ajustado inmediatamente después de la elución. La proteína además se purificó y la solución amortiguadora se intercambió usando la columna de filtración de gel. La solución amortiguadora de ejecución usada para cromatografía de exclusión de tamaño fue His 25 mM pH 6.5, NaCl 135 mM. La tasa de flujo usada fue 2.5 ml/min y los anticuerpos anti-TLT-l monoclonales eludidos como picos sencillos en aproximadamente 0.4 volúmenes de columna. Basándose en análisis de fracciones sobre el pico entero usando el método SEC-HPLC previamente descrito (como se describe en ejemplo 2) , los grupos se prepararon los cuales contuvieron proteína de anticuerpo pura eluyendo como picos simétricos a aproximadamente 8.5 min. y con un contenido mínimo de elución temprana de proteína de peso molecular alto.
Los anticuerpos purificados se caracterizaron usando los métodos SDS- PAGE/Coomassie (como se describe en ejemplo 2) y SEC-HPLC previamente descritos, mostrando que todas las preparaciones de proteina anticuerpo fueron altamente homogéneas. Todos los anticuerpos exhibieron componentes esperados de cadena pesada de aproximadamente 50 kDa y componentes de cadena ligera de aproximadamente 25 kDa cuando se usan las condiciones de reducción previo a la ejecución de los análisis SDS-PAGE/Coomassie . Las determinaciones de masa molecular intacta se realizaron usando un establecimiento del método de Espectrometría de masa de tiempo de vuelo de ionización de desorción de láser asistido de matriz en un instrumento Agilent 6210 y una columna de destilación assPREP (Waters, cat. no. USR 10008656) . La solución amortiguadora usada fue una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de ácido fórmico al 0.1% en LC-MS H20 graduada y una solución . amortiguadora de elución compuesta de ácido fórmico al 0.1% en LC-MS ACN graduado. Todos los anticuerpos exhibieron masas moleculares intactas de 147.2 -148.6 kDa, que están aproximadamente 2.7 - 3.1 kDa arriba de las masas teoréticas de las secuencias de aminoácidos para cada uno de los anticuerpos. De esta manera, todos los anticuerpos anti-TLT-1 recombinantemente expresados exhibieron modificaciones post-traslacionales correspondientes a glicosilaciones HCN esperadas. Las purezas fianles de 95 - 99% se obtuvieron para los seis anticuerpos. Para verificar la secuencia de N-terminal de los anticuerpos anti-TLT-1 clonados y purificados, las degradaciones EDMAN se realizaron usando un sistema secuenciador automatizado (Applied Biosystems 494 Protein Sequencer) . Los ciclos de degradación 10-20 se condujeron para cada anticuerpo. Aquí, las secuencias de cadena ligera y pesada esperadas se confirmaron para los seis anticuerpos anti-TLT-1 clonados. Para medir - las concentraciones de proteina final, un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) se usó junto con coeficientes de extensión especifica para cada uno de los seis anticuerpos en el intervalo desde 1.34-1.51.
Ejemplo 19: enlace y competencia de mAb de diferentes mABs para enlazar a TLT- 1.
Materiales : Tabla 7: Reactivos Reactivos Fuente TLT-l-His Ej emplo 1 mAB0061 Ej emplo 18 mAb0023 Ej emplo 18 mAb0051 Ej emplo 18 mAb0062 Ej emplo 18 Fab0074 Ej emplo 15 Fab0084 Ej emplo 15 Fab0003 Ej emplo 15 Fab0004 Ej emplo 15 Método : Los mAbs de interés ya sea fueron inmovilizados directamente a un chip C 5 o por captura por medio de un mAb de captura Fe humano inmovilizado a un chip CM5, mientras TLT-l-His se inmovilizó por captura por medio de un chip C 5 anti-His mAb para análisis de Fab's. Los reagentes que se usaron se muestran en la Tabla 7. mAb captura directa: Los mAbs TLT-1 se inmobilizaron a apróx 500- 1000 RU en un chip CM5 (50 pg/ml diluido en Na-acetato, pH 4.0) usando el procedimiento estándar recomendado por el suministrador. Las diluciones de dos-tantos de TLT-1 de 200 nM a 0.2 nM se probaron para enlazarse a los mAbs. Las soluciones amortiguadoras de ejecución y dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, 0.005% p20, pH 7.4. La regeneración se obtuvo por Glicina 10 mM, pH 1.7. mAb captura por medio de mAb Fe humano: mAb Fe humano se inmovilizó" a apróx. 10.000 RU . El mAb de interés se agregó (apróx. 100 nM) . Las dilcuiones dos-tantos de TLT-1 de 200 nM a 0.2 nM se probaron. Las soluciones amortiguadoras de ejecución y dilución: 10 mM HEPES, 150 mM, 0.005% p20, pH 7.4. La regeneración se obtuvo en MgC12 3 M .
TLT-1 -His captura por medio de anti-His mAb (R&D # MAB050); El anti-His mAb se inmovilizó a apróx. 9.000 RU . El TLT-l-His se agregó a un nivel de apróx. 30-40 RU (10 pg/ml diluido en 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20) usando el procedimiento estándar recomendado por el suministrador. Las diluciones de 8 tantos de Fabs de 3 a 0.047 pg/ml se probaron para enlazarse al TLT-l-His. Las soluciones amortiguadoras de ejecución y dilución: Hepes 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, 0.005% Tween-20. La regeneración fue obtendia por MgCl2 3 M.
La determinación de las constantes cinética y de enlace (kon, koff, KD) se obtuvo asumiendo una interacción 1:1 de TLT-1 y fibrinógeno usando el software de evaluación Biacore T100.
Competencia: El análisis de interacción de enlace de competencia se obtuvo por Resonancia de Plasmón de Superficie en un enlace de análisis Biacore T-100 de varios TLT-1 mAbs a TLT-1 cuando se enlaza a mAb0012 inmovilizado (o un mAb alternativo) . La inmovilización directa a un chip CM5 de los mAbs a un nivel de 5000-10000 RU se logró en 10 mM de acetato de sodio pH 4.5-5.0. Esto fue seguido por el enlace de 50 nM TLT-1 y después de 2 min de disociación seguido por el enlace de los otros tres mAbs para ser probados para competencia. Solución amortiguadora de ejecución y dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, 0.005% p20, pH 7.4. La regeneración se obtuvo por 10 mM Glicina, pH 1.7.
Resultados : Tabla 8 Tabla 9: análisis SPR. Constante de enlace para enlazarse a TLT-1. Competencia con mñb0012 Conclusión : Las constantes de enlace para mAb0061, mAb0023, mAb0051 y mAb0062 y Fab0074, Fab0084, Fab0003 y Fab0004 son estimadas por el análisis Biacore (ver Tabla 8). mAb0061 y mAb0051 no compiten con cualquiera de otros mAbs para enlazar (ver Tabla 9) . mAb0023 y mAb0062 compiten el uno con el otro (ver la Tabla 9) .
Ejemplo 20: Preparación de 20:80 PS : vesículas PC y clonación, expresión, repliegue y repidilacion de TLT-1.
TLT-1 relipidado en vesículas 20:80 PS: PC se preparaon usando Tritón X-100 como detergente como se describe en Smith and orrissey (2005) J. Thromb. Haemost., 2, 1155- 1162 excepto que TLT-1 se usó en lugar de TF.
Materiales Kanamycin medio LB (50 mg/ml) . Kanamycin Sigma K-0254 1000 mM IPTG (IPTG Sigma 1-6758) Solución amortiguadora de lisis: lx Bugbuster (Novagen) en Tris-HCl 50mM, NaCl lOOmM, EDTA 2mM, pH 8.0. Add 0.5mg/ml lisozima + ADNsel. Adición lx Coctail inhibidor completo (Roche) IB-solución amortiguadora de lavado 1:1:10 Bugbuster en IB-solución amortiguadora. Add 50pg/ml lisozima + 0.5x Coctail inhibidor completo (Roche) IB-solución amortiguadora de lavado 2:1:10 Bugbuster en IB-solución amortiguadora IB-solución amortiguadora: Tris-HCl 50mM, lOOmM NaCl, EDTA 2mM, pH 8.0 Solución amortiguadora GndHCI : 6M Guanidinio HCl, Tris-HCl 50mM, NaCl 50 mM, 0.1% Tritón. X-100 rojo., pH 8.0 Solución amortiguadora Replegado: Tris-HCl 50mM, 800mMArginina, 0.1% Tritón X-100, glutationa reducida 5mM, glutationa oxidada 0.5mM pH 8.5 Solución amortiguadora de diálisis: Tris-HCI 20mM, 0.1% Tritón X-100, pH 8.0 DTT: glutationa reducida (Sigma G4251) glutationa oxidizada Sigma G4376 PC: 10mg/ml L-a-fosfatidilcolina (huevo, pollo) en cloroformo (Avanti Polar Lipids Inc.) No. de catálogo 840051C. Mw 760.09 PS: 10mg/ml sal de sodio L-a-fosfatidilserina (Brain, porcino) en cloroformo. (Avanti Polar Lipids Inc.) No. catálogo 840032C. Mw 812.05 Tritón X-100: 10% Tritón X-100, hidrogenado, detergente de grado de proteina, filtrado estéril. Calbiochem. No. de catálogo 648464 Concentraciónl59 mM (Mw 628) Solución amortiguadora HBS: HEPES 50mM, NaCl lOOmM, pH 7.4 Bio-perlas: Bio-perlas SM2 Adsorbentes, malla 20-50 BioRad Laboratories, No. de catálogo. 152-3920.
Método Expresión: TLT-1 (hTLT-1.18-188 ; SEQ ID NO: 149) incluyendo dominio extracelular, ligador y dominio de transmembrana se clonó en pET24a usando cebadores 1004 (SEQ ID NO: 150) y 1005 (SEQ ID NO: 151) y pTT-hTLT-1 como plantilla. Las técnicas estándar para preparación de ADN se emplearon. La transformación se realizó en BL21 (DE3) . Cultivo durante toda la noche: 1 x 50 mi LB medio en 250 mi matraces (plástico) y 50 µ? de 50 mg/ml Kanamicina + 1 coloni (transformación) de la placa BL21 se mezclaron. El cultivo se incubó ON a 37°C, 220 rpm. Cultivo de inicio: 2 x 500 mi LB medio en 2L matraces (plástico) con 300 µ? de 50 mg/ml Kanamicina se agregaron. 10 mi EN cultivo TLT-1 lip/pET24a en BL21 (DE3) se agregaron y OD600 seguido se incubaron a 37°C, 220 rpm. Inducción: 2 x 500 mi con TLT-1 lip/pET24a ~ BL21 (DE3) en LB. 25°C ~ 0.2 mM IPTG se agregó (100 µ? de 1 ) al cultivo celular cuando OD6oo alcanzó entre 0.6 - 0.8. Esto se incubó por 3h a 25°C, 220 rpm. El cultivo se recogió después de 3h y se centrifugó por 30 min a 4600 rpm. El sobrenadante se desechó. El peletizado se almacenó a -20°C. Lisis de cuerpos de inclusión: El peletizado E. coli se resuspendió en 5ml solución amortiguadora de lisis/g peletizado. MgS04 se agregó a 5mM para apoyar la actividad ADNsel. La suspensión celular se incubó en la plataforma de agitación por 20 min a temperatura ambiente. El lisato fue aclarado por centrifugación 20000g (8500 rpm) por 20 min a 4°C. El peletizado se resuspendió en 100 mi solución amortiguadora de lavado IB. La suspensión se mezcló por agitación vorticial suave y se incubó a TA por 5 min. La suspensión se centrifugó a 20000g por 20 min a 4°C para recolectar los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se resuspensdieron en 100 mi IB-solución amortiguadora de agua 2. La muestra se centrifugó a 20000g por 20 min a 4°C para recolectar los cuerpos de inclusión. El peletizado se resuspendió en 100 mi agua y se centrifugó a 20000g por 20 min a 4°C para recolectar los cuerpos de inclusión. Replegado : El peletizado se resolubilizó en x mi GdnHCI solución amortiguadora (20 mi) . La concentración final de TLT-1 (A280 se midió) fue 1-2 mg/ml. DTT (400 µ?) se agregaron a una concentración final de 20 mM. La solubilización completa se aseguró por agitación magnética por -1-2.5 hrs (1.5 h) a TA. El material insoluble se removió por centrifugación a 20000g por 20 min. Una bomba perisáltica se usó lentamente (durante toda la noche) para transferir la solución GdnHCI/proteina (20 mi) a >20x solución amortiguadora de Replegado (400 mi) a 4°C. La solución amortiguadora de replegado se agitó rápidamente para asegurar la dilución rápida. La ejecución de la bomba se obtuvo a una tasa de flujo lx, velocidad 2.5, 4°C y se dejó durante toda la noche 4°C. La proteina precipitada se removió por centrifugación a 20000g (8500 rpm) en 50 mi tubos por 30 min. El borde TLT-1 se concentró de 400 mi a 120 mi en filtro Amico 76mm día., 10.000 MWCO a 4.5 barra. La proteína se verificó en SDS-PAGE por precipitación EtOH debido al GdnHCI en la muestra. 2x 500 µ? y 2x 25 µ? se concentraron en 0.5 mi tubos con 10.000 MWCO. 50 µ? muestra + 9 vol. hielo frío 99% EtOH (450 µ?) se mezclaron y se colocaron en -20°C por 10 min. La muestra se centrifugó a velocidad completa 13.000 rpm por 5 min. El sobrenadante se desechó. El peletizado se lavó con 450 µ? hielo frió 96% EtOH + 50 µ? Q. Se centrifugó de nuevo. Se dejó secar (EtOH debe de eliminarse antes de SDS-PAGE) . 100 µ? se resuspendieron lx solución amortiguadora de muestra PS : PC preparación y relipidación : El protocolo exacto descrito en Smith SA & orrissey JH (2004) "Rapid and efficient incorporation de tissue factor into liposomes". J. Thromb. Haemost. 2: 1155-1162 fue seguido por la relapidación de TLT-1.
Ejemplo 21: Análisis de fibrinogeno de enlace a TLT-1 y competencia de enlace entre mAbs TLT-1 y fibrinogeno.
TLT-1 enlaza al fibrinogeno según lo probado por el análisis SPR. Adicionalmente, el enlace simultáneo de fibrinogeno y cada uno de los cuatro mAbs: mAb0012, mAb0023, mAb0051 y mAb0062 se probaron por análisis SPR en un instrumento Biacore T100.
Los materiales utilizados se muestran en la Tabla 10. Tabla 10 Método : TLT-1 humano se inmovilizó a un nivel de apróx. 1000 RU en un chip CM5 (50 pg/ml diluido en Na-acetato, pH 4.0) usando el procedimiento estándar recomendado por el suministrador. Diluciones de cuatro tantos de fibrinógeno humano de 200 nM a 0.2 nM se probaron para enlazarse al TLT-1 inmovilizado. Solución amortiguadora de ejecución y dilución: 10 mM HEPES , 150 mM, 0.005% p20, pH 7.4. La regeneración se obtuvo por 10 mM Glicina, pH 1.7.
La determinación de las constantes cinética y de enlace (kon, k0ff, KD) se obtuvo asumiendo una interacción 1:1 de TLT-1 y fibrinógeno usando el software de evaluación Biacore T100 (Tabla 11) .
La competencia de los diferentes mAbs para enlazarse a TLT-1 y fibrinógeno simultáneamente se probó por inmovilización de cada uno de los mAbs a aproximadamente 10000-15000 RU en una microplaqueta CM5 seguido por el enlace de 50 nM TLT-1 que siguió después de 2-3 min de disociación por concentraciones variantes de los mAbs a ser probados para competir. La regeneración de la microplaqueta se obtuvo por Glicina 10 mM, pH 1.7 (Tabla 12).
Resultados : Tabla 11: TLT-1 enlazando a fibrinógeno Tabla 12: Competencia con fibrinógeno . El mñb de interés se inmovilizó a un chip. La adición de TLT-1 fue seguida por fibrinógeno (un intercalado) .
Conclusión : TLT-1 (HCI-0150R) enlaza a fibrinógeno. mAb0023 y mAb0062 compiten con este sitio de enlace. mAb0012 y mAb0051 no compiten.
Ejemplo 22 : Mapeo del epitopo por espectrometría de masa de intercambio de nitrógeno (HX- MS) .
La técnica HX-MS ha sido empleada para identificar los epítopos de enlace TLT-1 cubiertos por los cuatro anticuerpos monoclonales mAb0023, mAb0051, mAb0062 y mAb0061.
Para los experimentos de mapeo hTLT- 1.20- 125, hTLT-1.16-162 y hTLT-1.126-162 que corresponden a SEQ ID NO 5, 6 y 7, respectivamente, se usaron. Todas las proteínas se intercambiaron de solución amortiguadora en PBS pH 7.4 antes de los experimentos.
Método: experimentos HX-MS .
Instrumentación y registro de datos. Los experimentos HX fueron automatizados por un robot Leap (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) operado por el software LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizó la iniciación de la reacción de intercambio de deuterio, control de tiempo de reacción, reacción de apagado, inyección en el sistema UPLC y control de tiempo de digestión. El robot Leap se equipó con dos apilamientos controlados de temperatura mantenidos en 20°C para almacenamiento de solución amortiguadora y reacciones HX y se mantuvo a 2°C para almacenamiento de proteína y solución de apagado, respectivamente. El robot Leap adicionalmente contuvo un Trio enfriado VS unidad (Leap Technologies Inc.) manteniendo las columnas pepsina, pre y analítica, y el tubo LC y cambiando las válvulas a 1°C. El cambio de válvulas ha sido mejorado de HPLC a válvulas de cambio Microbore UHPLC (Cheminert, VICI AG) . Para la digestión de pesina en línea, 100 pL de muestra apagada que contiene 200 pmol TLT-1 se cargó y se pasó sobre un Cartucho de pepsina inmovilizada Poroszima (R) (2.1 x 30 mm (Applied Biosystems) ) usando una tasa de flujo isocrático de 200 pL/min (0.1% ácido fórmico : CH3CN 95: 5). Los péptidos resultantes se atraparon y se desalinizaron en una pre-columna VanGuard BEH C18 1.7 pm (2.1 x 5 mm (Waters Inc.)). Subsecuentemente, las válvulas se cambiaron para colocar la pre-columna en linea con la columna analítica, UPLC-BEH C18 1.7 pm (2.1 x 100 mm (Waters Inc.)), y los péptidos se separaron usando un gradiente 9 min de 15-40% B entregado a 150 pL/min de un sistema AQUITY UPLC (Waters Inc.). Las fases móviles consistieron de A: 0.1% ácido fórmico y B: 0.1% ácido fórmico en CH3CN. Los datos ESI MS, y las adquisiciones (CID) MS/MS dependientes de datos separados y los experimentos de energía elevada (MSE) se adquirieron en modo de ión positivo usando un cebador Q-Tof MS (Waters Inc.). Leucina- encefalina se usó como el ión de masa de bloqueo ([M+H]+ en m/z 556.2771) y los datos se recolectaron en modo continuo .
Análisis de datos. Los péptidos pépticos se identificaron en experimentos separados usando métodos CID MS/MS o MSE estándar (Waters Inc.). Los datos MSE se procesaron usando BiopharmaLynx 1.2 (veRSlón 017). La adquisición MS/MS dependiente de datos CID se analizó usando el software MassLynx y la base de datos MASCOT interna.
Los archivos de datos primarios HX-MS fueron sometidos a corrección continua de masa de bloqueo. Los análisis de datos, es decir, determinación centroide de péptidos deuterados y el trazado de curvas en intercambio, se realizaron usando HX-Express ( (VeRSlon Beta); Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)).
Mapeo de epítopo de mAb0023: El intercambio de hidrógeno amida/deuterio (HX) se inició por una dilución de 30 tantos de hTLT-1.20-125 en la presencia o ausencia de mAb0023 en la solución amortiguadora deuterada correspondiente (es decir PBS preparada en D20, 96% D20 final, pH 7.4 (valor no corregido)). Todas las reacciones HX se llevaron a cabo a 20°C y contuvieron 4 µ? hTLT-1.20-125 en la ausencia o presencia de 2.4 µ? m/Ab0023 de este modo dando un exceso molar de 1.2 tantos de sitios de enlace a mAb. En intervalos apropiados de tiempo en el intervalo desde 10 seg a 8 horas, las alícuotas de la reacción HX se apagaron por un volumen igual de solución amortiguadora de apagado de hielo frío (1.35M TCEP) resultando en un pH final de 2.6 (valor no corregido) .
Mapeo de epítopo de mAbs 0051 y 0062: El mapeo de epítopo de mAb0051 y mAb0062 se realizó en un experimento separado usando hTLT-1.20-125 y llevado a cabo similarmente para el mapeo de mAb0023 como se describe anteriormente.
Mapeo de epítopo de mAb0061: El mapeo de epítopo de mAb0061 se realizó en dos experimentos separados usando ya sea la proteína hTLT-1.16-162 o el péptido hTLT-1.126-162.
Los experimentos se realizaron similarmente como se describe anteriormente . para mAb0023. Sin embargo, la columna de pepsina se colocó á temperatura ambiente para los experimentos usando hTLT-1.126-162. Esto resultó en una eficacia de digestión de pepsina incrementada con pérdida mínima de intercambio adicional.
Resultados Mapeo de epítopo de mAb0023 El curso de tiempo HX de 20 péptidos, cubriendo 100% de la secuencia primaria de TLT-1, se monitorearon en la presencia y ausencia de mAb0023 por 10 seg a 8 horas.
El patrón de intercambio observado en la presencia o ausencia de mAb0023 puede dividirse en dos diferentes grupos: Un grupo de péptidos TLT-1 exhibido en un patrón de intercambio que no es afectado por el enlace de mAb0023 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestra la protección de intercambio bajo enlace a mAb0023. Las regiones que exhiben protección sobre enlace a mAb0023 abarcan los péptidos que cubren los residuos TLT-1 36-51, 79-91 y 105-120. Comparando las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0023 puede estrecharse a residuos 36-47, VQCHYRLQDVKA (50%), 82-87, LGGGLL (30%), 108-115, GARGPQIL (20%) con la protección de intercambio relativa para cada segmento anotado en paréntesis'. Un panorama general del mapa de péptido para el epítopo 0023 se muestra en la Figura 6.
Mapeo del epítopo de mAb0051 El curso del tiempo HX de 22 péptidos, cubriendo 100% de la secuencia primaria de TLT-1, se monitorea en la presencia y ausencia de mAb0051 por 10 seg a 1000 seg.
El. patrón de intercambio observado en la presencia o ausencia de mAb0051 puede dividirse en dos diferentes grupos: un grupo de péptidos TLT-1 exhibe un patrón de intercambio que no es afectado por el enlace de mAb0051 y un grupo que es afectado. Las regiones exhibiendo protección bajo enlace a mAb0051 abarcan péptidos que cubren residuos 52-66, 92-120. Comparando las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epitopo para mAb0051 puede reducirse a residuos 55-66, LPEGCQPLVSSA (75%) y 110-120, RGPQILHRVSL (25%) así como también una interacción débil en el 92-105. Un panorama general del mapa de péptido para el epítopo 0051 se muestra en la Figura 7.
Mapeo de epítopo de mAb0062 El tiempo de curso HX de 22 péptidos, cubriendo 100% de la secuencia primaria de TLT-1, se monitorearon en la presencia y ausencia de mAb0062 por 10 seg a 1000 seg.
El patrón de intercambio observado en la presencia o ausencia de mAb0062 puede dividirse en dos diferentes grupos: Un grupo de péptidos TLT-1 que exhibe un patrón de intercambio que no es afectado por el enlace a mAb0062 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestra protección. Las regiones que exhiben protección bajo enlace a mAb0062 abarcan péptidos que cubren residuos 36-51 y 105-120. Comparando las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epitopo para mAb0062 puede reducirse a 36-47, VQCHYRLQDVKA (60%) y 110-120, RGPQILHRVSL (40%). ün panorama completo de mapa de péptido para el epitopo 0062 se muestra en la Figura 8.
Mapeo del epitopo de mAb0061 El epitopo para mAb0061 se mapeó en dos experimentos por separado usando ya sea la proteina hTLT-1.16-162 o la hTLT-1.126-162.
Para hTLT-1.16-162 el tiempo-curso HX de 19 péptidos, cubriendo 85% de la secuencia primaria de TLT-1, se monitorearon en la presencia y ausencia de mAb0061 por 10 seg a 8 horas. Debido a una O-glicosilación en el residuo S148, no puedo registrarse información más allá del residuo 141.
El patrón de intercambio observado en la presencia o ausencia de mAb0061 puede dividirse en dos diferentes grupos: Un grupo de péptidos TLT-1 exhibe un patrón de intercambio que no es afectado por el enlace dé mAb0061 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestra protección de intercambio bajo enlace a mAb0061. Las regiones que exhiben protección bajo enlace a mAb0061 abarcan péptidos que cubren los residuos 121-141. Sin embargo, es importante observar que no se da información en este experimento para el residuo 142 y más allá. Comparando las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epitopo para mAb0061 puede reducirse para comenzar en el residuo 130.
Con el fin de ganar información completa en el epitopo mAb0061, el experimento de mapeo se repitió usando el péptido hTLT- 1.126-162. Este péptido enlaza a mAb0061 con alta afinidad y no es modificado por glicosilación . De este modo debe ser capaz de dar información HX-MS para la región entera.
El curso de tiempo de HX de 12 péptidos, cubriendo 126- . 162 TLT-1 la región entera se monitoreó en la presencia y ausencia de mAb0061 por 10 seg a 3000 seg.
Todos los péptidos en esta región 126-162 exhiben protección de intercambio bajo enlace a mAb0061. Comparando las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epitopo para mAb0061 puede reducirse para estar dentro de los residuos 130-145, ETHKIGSLAENAFSDP . Un panorama general del mapa de péptido para el epitopo 0061 se muestra en las Figuras 9 y 10.
Ejemplo 23: Producción, caracterización y análisis de enlace de imitantes hTLT-1 ECD- HPC4 Ala.
Los constructos mutantes de hTLT-1 ECD-HPC4 Alanina se designaron de acuerdo con la Tabla 6. Los constructos de expresión se desarrollaron por contractor externo GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) y todos los constructos de expresión se hicieron basándose en el vector de expresión designado por pcADN3.1(+). Las alícuotas de ADN para cada uno de los constructos de expresión 40 hTLT-1 ECD-HPC4 pcADN3.1(+) se transíectaron en las células de suspensión HEK293-6E con el fin de expresar transitoriamente cada proteína mutante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 6) . La transfección transitoria y cultivo de células HEK293 6e se realizó como se describe en el ejemplo A.
A los siete días de post-transfección, las células se removieron por transfección y la . proteína mutante resultante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala que contienen sobrenadantes se filtraron esterilizaron previo a los análisis. La concentración de proteína mutante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala expresada en el sobrenadante celular clarificado se determinó usando una combinación de análisis RP-HPLC y SDS-PAGE/Coomassie . Estos estuvieron en un intervalo de 4 - 40 pg/mL que contiene grado variable de formación de dímero. Como se describe previamente para la producción de proteína hTLT usada para los experimentos de inmunización, las formas de monómero/dímero de la proteína expresada se observaron para todos los constructos mutantes hTLT ECD-HPC4 Ala. La concentración relativa de monómero/dímero de proteína hTLT-1 ECD-HPC4 se estimó por SDS-PAGE/Coomassie y un M promedio para cada preparación de mutante se calculó. Todos los estudios de enlace se corrieron a 25°C, y las muestras se almacenaron a 15°C en el compartimento muestra en un Analizador ProteOn (BioRad) que mide las interacciones moleculares en tiempo real a través de la resonancia de plasmón de superficie. La señal (RU, unidades de respuesta) reportada por el ProteOn está directamente correlacionada a la masa en los puntos de superficie de la microplaqueta de sensor individual.
El anticuerpo policlonal Anti-hFc se inmovilizó en células de flujo separadas de un chip sensor GLM usando una mezcla 1:1 de 0.4 M EDAC [clorhidrato l-etil-3-(3-dimetilaminopropil ) carbodimida] y 0.1 M Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida] . Cada anticuerpo se diluyó en 10 mM acetato de sodio pH 5.0 a una concentración de 50 pg/ml, y se inmovilizó para una célula de flujo individual a 30 µ?/min por 240s. Los anticuerpos se inmovilizaron para células de flujo A1-A6 (dirección horizontal) . Después de la inmovilización, los sitios activos en la célula de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. El nivel final de inmovilización de anticuerpo de captura está típicamente en un intervalo de aproximadamente 9,000 a 10,000 RU en un experimento. La captura de los anticuerpos anti-TLT-1 mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062 fue conducida diluyendo a 0.5 pg/ml en solución amortiguadora HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3mM, tensioactivo P20 al 0.05%, pH 7.4) y se inyectó a 30 µ?/min por 60s en dirección vertical, creando puntos de referencia interpunto con sólo anticuerpos anti-humano Fe. El nivel de captura final de anticuerpos de prueba típicamente estuvo en un intervalo de aproximadamente 200 a 300 RU en un experimento. El enlace de proteína hTLT-1 ECD-HPC4 tipo natural o mutante Ala se condujo inyectando sobre células de flujo paralelas en dirección horizontal para permitir los análisis comparativos de enlace a anticuerpos anti-TLT-1 diferentes capturados relativos a enlazar a las referencias de interpunto. Cada proteína hTLT-1 ECD-HPC4 se diluyó a 100 nM, basándose en el Mw ' promedio calculado, en solución amortiguadora HBS-EP y se inyectó a 30 µ?/min por 240s. La microplaqueta GL se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito por medio de una inyección 18s de 1 M ácido fórmico seguido por una inyección 18s de 50 mM NaOH a 100 µ?/min. Esta etapa de regeneración removió el anticuerpo anti-TLT-1 y cualquier enlace TLT-1 de la superficie de anticuerpo de captura inmovilizada, y fue seguida por el enlace subsecuente del siguiente par de muestra de prueba. El procedimiento de regeneración no removió directamente el anticuerpo de captura anti-humano-Fc inmovilizado de la superficie de la microplaqueta.
El análisis de datos se realizó usando el software ProteOn ManagerTM. No se observó enlace no específico importante a las superficies de control de interpunto. Las curvas de enlace se procesaron por una referencia doble (la substracción de señales de superficie de control de interpunto así como también las inyecciones de solución amortiguadora en blanco sobre anticuerpos anti-TLT-1 capturados) . Esta corrección permitió el ruido de instrumento, cambio y giro del volumen durante las inyecciones de muestra. La señal de enlace a 10s después de la detención de inyección de analito se normalizó a un nivel de anticuerpo capturado anti-TLT-1 y se presentó como relativo al enlace a proteina tn hTLT-1 ECD-HPC4.
Las siguientes mutaciones Ala exhiben una disminución importante de enlace a anti-TLT-1 respectivo comparado con proteina hTLT-1 ECD-HPC4 tn. mAb0051: F54A < 0.4 tn; M91A < 0.2 tn; R117A < 0.2 tn; S119A < 0.6 tn. mAb0062: R41A < 0.2 tn; L42A < 0.6 tn; Q43A < 0.4 tn; F54A < 0.6 tn; M91A < 0.4 tn; R110A < 0.2 tn; H 116A < 0.6 tn. mAb0023: L42A < 0.2 tn; Q43A < 0.2 tn; K46A < 0.2 tn; M91A < 0.4 tn; R110A < 0.2 tn. Ya que el enlace disminuye podría observarse para el M91A mutante hTLT-1 ECD-HPC4 para todos los 4 anticuerpos anti-TLT- 1, el residuo probablemente tiene una influencia importante en estabilidad de proteína en vez de ser parte de un epítopo actual. El mAb0061 no muestra un enlace disminuido a cualquiera de las variantes TLT-1 mutadas probadas, indicando que el epítopo no se cubre por los mutantes introducidos en el estudio de enlace.
Ejemplo 24: Complejos de estructura de cristal entre péptidos tronco Fab anti-TLT-1 y TLT-1.
Expresión de Fab anti-TLT-1, FabOlOO (idéntica a- Fab0061), para cristalización: El fragmento Fab anti-TLT-1, FabOlOO, que comprende la cadena pesada correspondiente a la SEQ ID NO: 152 y la cadena ligera correspondiente a la SEQ ID NO: 153 se expresó transitoriamente en células HEK293 de acuerdo con el procedimiento generalizado.
Purificación de Fab anti-TLT-1, FabOlOO, para cristalización: La purificación del Fab se condujo por un proceso de dos etapas compuesto de cromatografía de afinidad usando la resina kappaSelect (GE Healthcare, cat. .no. 17-5458-01) y cromatografía por exclusión de tamaño. La purificación se condujo usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat. ¦ no. 18-1112-41). Los sistemas de solución amortiguadora usados para la etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de NaFosfato 10 mM, pH 7.5 y NaCl 150 mM y una solución amortiguadora de elución compuesta de ácido fórmico 20 mM, pH 3.0. El sobrenadante se ajustó con NaOH 1 M hasta un pH de 7.5 y aplicado sobre una columna kappaSelect pre-equilibrada. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio y la proteína Fab se eluyó isocráticamente usando aproximadamente 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución. La proteína Fab se analizó usando análisis SDS-PAGE/Coomassie y LC-MS, mostrando que se obtuvo una proteína pura y homogénea con un peso molecular esperado de 46.9 kDa . Para medir la concentración de la proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con coeficiente de extinción de 1.31. El pulido final de la proteína Fab se condujo usando una columna de exclusión de tamaño (Superdex200) .
Preparación de péptidos para cristalización: El hTLT-1.126-162 de péptido TLT-l-tronco (SEQ ID NO: 7) se preparó por síntesis de péptido de fase sólida. Igualmente, se preparó una veRSlón más corta hTLT-1.129-142 del péptido tronco correspondiente a la SEQ ID NO: 8.
Preparación, cristalización y determinación de estructura de los complejos FabOlOO : TLT-1 : La preparación de FabOlOO: hTLT-1.126-162: El complejo entre FabOlOO y hTLT-1.126-162 se preparó al agregar dos veces el exceso molar de hTLT-1.126-162 a una solución de FabOlOO seguido por aislamiento del complejo al separar hTLT-1.126-162 en exceso usando cromatografía por exclusión de tamaño preparativa. De esta manera, el complejo FabOlOO : hTLT-1.126-162 se preparó al mezclar Fab (1100 µ?, 98 µ?) y hTLT-1.126-162 (155 µ?, 1391 µ ) , ambos en solución amortiguadora PBS (pH 7.4). El complejo se sometió a filtración de gel usando una columna Superdex 200 HighLoad 26/60 (GE Healthcare) eluida con solución amortiguadora de PBS (pH 7.4) a una relación de flujo de 1 ml/min. Se recolectaron fracciones correspondientes a un volumen de 3 mi. Las fracciones que contiene el complejo FabOlOO: hTLT-1.126-162 deseado se agruparon y luego concentraron usando un dispositivo de filtro centrifugo (Amicon, corte 10 kDa) a una concentración de la proteina de 8.6 mg/ml. Esta preparación se usó para cristalización del complejo FabOlOO : hTLT-1.126-162.
Preparación de FabOlOO : hTLT-1.129-142 : El complejo entre FabOlOO y el péptido tronco más corto (hTLT-1.129-142 ) se preparó similarmente con las excepciones de que la relación molar entre hTLT-1.129-142 y Fab fue 1.5:1 y que el paro de filtración de gel se omitió debido a enlace más débil de hTLT-1.129-142 comparado con aquel del péptido tronco más grande (hTLT-1.126-162) .
La cristalización y recolección de datos de los complejos FabOlOO: hTLT-1.129-142 y FabOlOO : hTLT-1.126-162 : FabOlOO : complejos hTLT-1.129-142 y FabOlOO : hTLT-1.126-162 fueron a temperatura ambiente cristalizados por el método de calda de ajuste. Se cristalizó FabOlOO : hTLT-1.129-142 al agregar a la solución de proteina, en una relación de volumen 1:2 (precipitado : proteina) , una solución de precipitación que contiene fosfato diácido de potasio 0.04 M, 16% p/v de PEG 8,000 y glicerol al 20%, mientras que el complejo FabOlOO : hTLT-1.126-162 se cristalizó al agregar a la solución de proteina, en una relación de volumen 1:1 (precipitado : proteina ) , una solución de precipitación que contiene 20% p/v de PEG 10, 000 y Hepes 0.10 M pH 7.5. Un cristal del complejo FabOlOO : hTLT-1.129-142 de congeló en un instante en N2 liquido y durante la recolección de datos se mantuvo a 100 K por una corriente de gas N2 criogénica. Los datos cristalográficos se recolectaron posteriormente a una resolución 2.14 Á usando un ánodo rotativo Rigaku MicroMax-007 HF y un detector de rayos X marCCD 165. La determinación, integración y escalamiento del grupo de espacio de los datos se hicieron por el paquete de software XDS ( absch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800). Los parámetros celulares del cristal se determinaron para ser 82.10, 64.99, 107.73 Á, 90°, 95.12° y 90°, para a, b, c, , ß y ? respectivamente, y el grupo de espacio se determinó para ser C2. Rsym para intensidades de el ajuste de datos se calculó para ser 6.5%. Las coordenadas de un modelo Fab de la estructura 1NGZ depositada en PDB (Berman, H.M. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 235-242) (Yin, J. et al. PNAS us 100, 856-861) se usó para determinación de estructura del la molécula anti-TLT-1 Fab. El modelo Fab 1NGZ se dividió en dos dominios, los dominios variable y los constantes, que luego se usaron como modelos de búsqueda independientes en un reemplazo molecular corrido por el programa de software PHASER (Mccoy, A.J. et al. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61, 458-464; Mccoy, A.J. et al. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674) de la serie CCP4 (Bailey, S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). El paquete de software ARP-wARP (Evrard, G.X. et al. Acta Crystallographica Sección D 63, 108-117) se usó posteriormente para ajuste de fase y construcción del modelo automático. Se aplicaron los refinamientos cristalográficos adicionales, usando el programa de software REFMAC5 (Murshudov, G.N. et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255), seguido por inspección de gráficas por computadora de los mapas de densidad de los electrones, construcción y correcciones del modelo, usando el programa de software COOT (Emsley, P. et al. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132). El procedimiento se hizo en ciclo hasta que pudieron hacerse mejoras importantes adicionales para el modelo. El libre de R y R calculado final después de 3 ciclos de intervención manual y los siguientes refinamientos fueron 0.185 y 0.245, respectivamente, y el modelo muestra una desviación de raíz media cuadrada (RMSD, por sus siglas en inglés) de longitudes de enlace ideales de 0.022 A.
Un cristal del complejo FabOlOO :hTLT-l .126-162 se transfirió a una crio-solución que contiene 75% de la solución de precipitado y 25% de glicerol. El cristal se dejó en remojo durante alrededor de 15 segundos, luego se congeló en un instante en N2 liquido y durante la recolección de datos se mantuvo a 100 K por una corriente de gas N2 criogénica. Los datos cristalográficos se recolectaron posteriormente hasta una resolución 1.85 Á en BL911-3 de línea de haz (Ursby, T. et al. (2004) AIP Conference Proceedings 705, 1241-1246) en MAX-lab, Lund, Suecia. La determinación, integración y escalamiento del grupo de espacio de los datos se hicieron en el paquete de software XDS. Los parámetros celulares para los datos sincrotrón se determinaron para ser 82.54, 65.32, 108.05 Á, 90°, 95.15° y 90°, para a, b, c, OÍ, ß y ?, respectivamente, y el grupo de espacio se determinó para ser C2. Rsym para intensidades del ajuste de datos se calculó para ser 6.7%. El cristal fue isomorfo con los cristales FabOlOO : hTLT-1.129-142 y por lo tanto se usó refinamiento de cuerpo rígido del complejo FabOlOO : hTLT-1.129-142 para el ajuste de fase original del Fab0100:hTLT-l.126- 162 seguido por ajuste de fase y construcción del modelo automático usando el paquete de software ARP-wARP. Se " aplicaron refinamientos cristalográficos adicionales, usando el programa de software REFMAC5, seguido por inspección de las gráficas por computadora de los mapas de densidad de electrones, construcción y correcciones del modelo, usando el programa del software COOT . El procedimiento se hizo en ciclo hasta que no pudieron hacerse mejoras importantes adicionales al modelo. El libre de R y R calculado final después de 13 ciclos de intervención manual y los siguientes refinamientos fueron 0.171 y 0.223, respectivamente, y el modelo muestra un RMSD de longitudes de enlace ideales de 0.027 Á (Tabla 11).
Resultados Como se muestra en las Tablas 14 y 15, el anti-TLT-1 enlaza efectivamente al tronco de TLT-1. Usando el programa de software AREAIMOL, de la serie del programa, las áreas promedio excluidas en interacción en pares entre FabOlOO y TLT-1 se calcularon para ser 764 Á2. Las áreas promedio excluidas en interacciones en pares dadas para los complejos Fab0100:hTLT-l.126-162 656 y 871 Á2, para anti-TLT-1 y TLT-1 respectivamente .
Los residuos en el péptido TLT-1 (hTLT-1.126-162) que hace contacto directo con el Fab anti-TLT-1 en el complejo FabOlOO: hTLT-1.126-162 se define como el epitopo y los residuos en FabOlOO que hacen contacto directo con hTLT-1.126-162 en el complejo FabOlOO : hTLT-1.126-162 se define como el parátopo. Se identificaron residuos de epitopo y parátopo al correr el software CONTACTS de la serie del programa CCP4 usando una distante de corte de 4.0 Á entre el Fab anti-TLT-1 y la molécula TLT-1. Los resultados de los cálculos de contacto para el complejo FabOlOO : hTLT-1.126-162 de las estructuras de cristal se muestran en las Tablas 14 y 15. El epitopo TLT-1 resultante para FabOlOO se encontró para comprender los siguientes residuos de SEQ ID NO: 7) : Lys 8 (133), He 9 (134), Gly 10 (135), Ser 11 (136), Leu 12 (137), Ala 13 (138), Asn 15 (140), Ala 16 (141), Phe 17 (142), Ser 18 (143), Asp 19 (144), Pro 20 (145), Ala 21 (146) donde los números en paréntesis se refieren a los ' residuos correspondientes en la SEQ ID NO: 2 (Tablas 12 y 13) .
El parátopo resultante incluye residuos His 31, Asn 33, Tyr 37, His 39, Tyr 54, Phe 60, Ser 96, Thr 97, Val 99 y Tyr 101 de la cadena ligera FabOlOO corresponden a la SEQ ID NO: 153 (Tabla 12) , y los residuos Val 2, Phe 27, Arg 31, Tyr 32, Trp 33, Glu 50, Thr 57, Asn 59, Ser 98, 'Gly 99, Val 100 y Thr 102 de la cadena pesada FabOlOO corresponden a la SEQ ID NO: 152 (Tabla 13) . Los residuos de epitopo TLT-1 involucrados en el enlace de hidrógeno también se indican en las Tablas 12 y 13.
Tabla. 13: Resultados del refinamiento del modelo de rayos X para los datos observados del complejo FabOlOO :hTLT-1.126-162 por el programa de software refma'cS.
COMENTARIO 3 REFINAMIENTO.
COMENTARIO 3 PROGRAMA: REFMAC 5.5.0109 COMENTARIO 3 AUTORES: MURSHUDOV, VAGIN, DODSON COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 OBJETIVO DE REFINAMIENTO: PROBABILIDAD MAX COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.
COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN ALTO (ANGSTROMS) : 1 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN BAJO (ANGSTROMS) : 3 COMENTARIO 3 CORTE DE DATOS (SIGMA(F)): NINGUNO COMENTARIO 3 TOTALIDAD PARA EL INTERVALO (%): 99.89 COMENTARIO 3 NÚMERO DE REFLECCIONES : 46512 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 AJUSTE PARA DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.
COMENTARIO 3 MÉTODO DE VALIDACIÓN CRUZADA: TOTALMENTE COMENTARIO 3 SELECCIÓN DE AJUSTE DE PRUEBA DE VALOR R LIBRE: ALEATORIA COMENTARIO 3 VALOR R (TRABAJO + AJUSTE DE PRUEBA): 0.17330 COMENTARIO 3 VALOR R (AJUSTE DE TRABAJO) : 0.17070 COMENTARIO 3 VALOR R LIBRE: 0.22260 COMENTARIO 3 TAMAÑO DE AJUSTE DE PRUEBA DEL VALOR R LIBRE (%) : 5.0 COMENTARIO 3 CONTEO DE AJUSTE DE PRUEBA DEL VALOR R LIBRE: 2463 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 AJUSTE EN EL DEPÓSITO DE RESOLUCIÓN MÁS ALTO.
COMENTARIO 3 NÚMERO TOTAL DE DEPÓSITOS USADOS: 20 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE DEPÓSITO ALTO: 1.8 50 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE DEPÓSITO BAJO: 1.8 98 COMENTARIO 3 REFLEXIÓN EN EL DEPÓSITO (AJUSTE DE TRABAJO) : 3409 COMENTARIO 3 TOTALIDAD DE DEPÓSITO (TRABAJO+PRUEBA) (%): 99.81 COMENTARIO 3 VALOR R DE DEPÓSITO (AJUSTE DE TRABAJO): 0.266 COMENTARIO 3 CONTEO DE AJUSTE DEL VALOR R LIBRE DEL DEPÓSITO: 195 COMENTARIO 3 VALOR R LIBRE DEL DEPÓSITO: 0.309 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 NÚMERO DE ÁTOMOS NO DE HIDRÓGENO USADOS EN EL REFINAMIENTO COMENTARIO 3 TODOS LOS ÁTOMOS: 3993 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 VALORES B.
COMENTARIO 3 DEL RESIDUO ILSON (A**2): NULO COMENTARIO 3 VALOR B MEDIO (GENERAL, A**2) : 14.967 COMENTARIO 3 VALOR B ANISOTROPICO GENERAL.
COMENTARIO 3 BU (A**2) : -0.06 COMENTARIO 3 B22 (A**2) : 0.23 COMENTARIO 3 B33 (A**2) : -0.24 COMENTARIO 3 B12 (A**2) : 0.00 COMENTARIO 3 B13 (A**2) : -0.36 COMENTARIO 3 B23 (A**2) : 0.00 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 ERROR DE COORDENADA GENERAL ESTIMADA.
COMENTARIO 3 ESU CON BASE EN EL VALOR R (A) : 0.116 COMENTARIO 3 ESU CON BASE EN EL VALOR R LIBRE (A) : 0.123 COMENTARIO 3 ESU CON BASE EN LA PROBABILIDAD MÁXIMA (A) : 0.084 COMENTARIO 3 ESU PARA VALORES B CON BASE EN LA PROBABILIDAD MÁXIMA (A**2) 6.165 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 COEFICIENTES DE CORRELACIÓN.
COMENTARIO 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC: 0.963 COMENTARIO 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN LIBRE DE FO-FC: 0.939 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 DESVIACIONES RMS DE VALORES IDEALES CONTEO RMS PESO COMENTARIO 3 ÁTOMOS REFINADOS DE LONGITUDES DE ENLACE (A): 3538; 0.027; 0.022 COMENTARIO 3 ÁTOMOS REFINADOS DE ÁNGULOS DE ENLACE (GRADOS): 4833; 2.132; 1.958 COMENTARIO 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 1 (GRADOS) 473; 6.972; 5.000 COMENTARIO 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 2 (GRADOS) 137; 35.607; 24.453 COMENTARIO 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 3 (GRADOS) 583; 14.216; 15.000 COMENTARIO 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERIODO 4 (GRADOS) 14; 23.096; 15.000 COMENTARIO 3 RESTRICCIONES DEL CENTRO QUIRAL (A**3) : 552; 0.180; 0.200 COMENTARIO 3 ÁTOMOS REFINADOS DE PLANES GENERALES (A) : 2664; 0.013; 0.021 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 RESTRICCIONES DEL FACTOR TÉRMICO ISOTROPICO. CONTEO RMS PESO COMENTARIO 3 ÁTCMOS REFINADOS ENLACE CADENA PRINCIPAL (A**2) : 2262; 1.399; 1.500 COMENTARIO 3 ÁTOMOS REFINADOS DE ÁNGULO DE CADENA PRINCIPAL (A**2) : 3679; 2.333; 2.000 COMENTARIO 3 ÁTCMOS REFINADOS ENLACE DE CADENA LATERAL (A**2) : 1276; 3.462; 3.000 COMENTARIO 3 ÁTCMOS REFINADOS ÁNGULO DE CADENA LATERAL (A**2) : 1139; 5.231; 4.500 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 ESTADÍSTICAS DE RESTRICCIONES NCS COMENTARIO 3 NÚMERO DE GRUPOS NCS: NULO COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 DETALLES IDENTICOS COMENTARIO 3 NÚMERO DE DOMINIOS IDÉNTICOS: NULO COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 DETALLES TLS COMENTARIO 3 NÚMERO DE GRUPOS TLS: 2 COMENTARIO 3 REGISTRO DE ÁTOMO QUE CONTIENE FACTORES B RESIDUALES ÚNICAMENTE COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 GRUPO TLS: 1 COMENTARIO 3 NÚMERO DE COMPONENTES DEL GRUPO: 3 COMENTARIO 3 COMPONENTES C SSSEQI COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESIDUO: L 1 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESIDUO: H 1 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESIDUO: 7 P 21 COMENTARIO 3 ORIGEN PARA EL GRUPO -4.1790 48.4400 34.3450 COMENTARIO 3 TENSOR T COMENTARIO 3 Til 0.1731 T22 0.1937 COMENTARIO 3 T33 0.1093 T12 -0.0155 COMENTARIO 3 T13 -0.0164 T23 -0.0192 COMENTARIO 3 TENSOR L COMENTARIO 3 Lll 1.9367 L22 0.4840 COMENTARIO 3 L33 3.8383 L12 -0.1522 COMENTARIO 3 L13 -1.2215 L23 -0.1172 COMENTARIO 3 TENSOR S COMENTARIO 3 Sil 0.0447 S12 -0.2657 S13 0.0758 COMENTARIO 3 S21 0.0958 S22 -0.0414 S23 -0.0674 COMENTARIO 3 S31 0.0036 S32 0.0098 S33 -0.0032 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 GRUPO TLS: 2 COMENTARIO 3 NÚMERO DE COMPONENTES DEL GRUPO: 2 COMENTARIO 3 COMPONENTES C SSSEQI PARA C SSSEQI COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESIDUO: L 114 L 219 COMENTARIO 3 INTERVALO DE RESIDUO: H 116 H 215 COMENTARIO 3 ORIGEN PARA EL GRUPO (A) 24.4360 51.7710 5.9920 COMENTARIO 3 TENSOR T COMENTARIO 3 TI: 0.0252 T22: 0.0170 COMENTARIO 3 T33: 0.0735 T12 : 0.0161 COMENTARIO 3 T13: 0.0018 T23: 0.0048 COMENTARIO 3 TENSOR L COMENTARIO 3 Lll: 2.0324 L22: 1.6905 COMENTARIO 3 L33: 0.8461 L12: 0.7328 COMENTARIO 3 L13: 0.0695 L23: 0.3337 COMENTARIO 3 TENSOR S COMENTARIO 3 Sil -0.0068 S12 0.0156 S13 0.0515 COMENTARIO 3 S21 -0.0127 S22 -0.0101 S23 0.1316 COMENTARIO 3 S31 -0.0077 S32 -0.0763 S33 0.0168 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 MODELADO DE SOLVENTE DE VOLUMEN.
COMENTARIO 3 MÉTODO USADO: MÁSCARA COMENTARIO 3 PARÁMETROS PARA CÁLCULO DE MÁSCARA COMENTARIO 3 RADIO DE SONDA: 1.40 COMENTARIO 3 RADIO DE SONDA DE IONES: 0.80 COMENTARIO 3 RADIO DE CONTRACCIÓN: 0.80 COMENTARIO 3 COMENTARIO 3 OTROS COMENTARIOS DE REFINAMIENTO: COMENTARIO 3 HIDRÓGENOS SE HAN AGREGADO EN LAS POSICIONES DE SOPORTE COMENTARIO 3 VALORES U: RESIDUAL ÚNICAMENTE COMENTARIO 3 LINKR SG CYS L 139 SG ACYS L 199 SS LINKR SG CYS H 22 SG ACYS H 96 SS LINKR SG ACYS H 141 SG ACYS H 197 SS CISPEP 1 THR L 7 PRO L 8 0.00 CISPEP 2 VAL L 99 PRO L 100 0.00 CISPEP 3 TYR L 145 PRO L 146 0.00 CISPEP 4 PHE H 147 PRO H 148 0.00 CISPEP 5 GLU H 149 PRO H 150 0.00 Tabla 14 Interacciones hTLT-1.126-162 "P" (SEQ ID NO 7) con la cadena ligera FabOlOO (SEQ ID NO: 163). Un corte de 4.0 Á se usó. Los contactos se identificaron por el programa de computadora CONTACT de la serie CCP4. En la última columna "***" indica una posibilidad fuerte para un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Á) como se calcula por CONTACT, "*" indica una posibilidad débil (distancia > 3.3 Á) . Blanco indica que el programa considera que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno son específicos entre un donador y un receptor, son típicamente fuertes, y son fácilmente identificables . /i 717-1.126-162 Anti-TLT-1 Distancia Posiblemente [A] enlace a H Ttpode # de res. Nombre Tipo de # de res. Nombre res. y cadena del átomo res. y cadena del átomo lie 9P CB Tyr 101L OH 3.76 Ite 9P CD1 Ser 96L 0 3.58 Thr 97L 0 3.68 lie 9P CG2 Val 99 L CG2 3.51 He 9P C Tyr 101L OH 3.95 Gly 10P N Tyr 101L OH 3.06 Gly 10P CA Tyr 101L OH 3.48 Gly 10P C Tyr 10ÍL OH 3.67 Ser I IP N Tyr 101L OH 3.09 *** Ser 11P CB Ser 96L OG 3.89 Tyr 37 L COI 3.94 Ser 96L 0 3.37 Ser 1 1P OG Ser 96L OG 2.88 *** Ser 96L CA 3.76 hTLT-1.126-162 Antí-TLT-1 Distancia Posiblemente enlace a H Tipo de # de res. Nombre Tipo de # de res. Nombre [A] res. y cadena del átomo res. y cadena del átomo His 39L CE1 3.32 His 39L NE2 3.60 Phe 17P z His 39L CE1 3.36 His 39L . NE2 3.66 Tyr 37L CD1 3.98 Phe 17P CE 2 Tyr 37L CD1 3.79 Tyr 37L CE1 3.84 Phe 17P 0 Phe 60L CD1 3.84 Phe 60L CE1 3.31 As 19P N Phe 60L CE1 3.88 Asp 19P CA Phe 60L CZ 3.80 Asp 19P CB Phe 60L cz 3.85 Tabla 15 Las interacciones hTLT-1.126-162 "P" (SEQ ID NO 7) con cadena pesada FabOlOO (SEQ ID NO: 162) . Se usó un corte de 4.0 Á. Los contactos se identificaron por el programa de computadora CONTACT de la serie CCP4. En la última columna indica una posibilidad fuerte para un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3.3 Á) como se calcula por CONTACT, indica una posibilidad débil (distancia > 3.3 Á) . El espacio en blanco indica que el programa considera que no hay posibilidad de un enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno son específicos entre un donador y un receptor, están típicamente fuertes, y están fácilmente identificables . hTLT-1.126- 162 Anti-TLT-1 Distancia Posiblemente res. Nombre tipo de # de res. Nombre [A] enlace a H tipo de # de res. y cadena del átomo res. y cadena del átomo Lys 8P C Asn 59H ODl 3.95 Lys 8P 0 Asn 59H CG 3.69 Asn 59H ND2 3.78 * Trp 33H CH2 3.86 Asn 59H ODl 2.85 Thr 57H CG2 3.45 lie 9P CA Trp 33H CH2 3.91 Glu 50H OE2 3.52 Asn 59H ODl 3.79 lie 9P CB Glu 50H OE2 3.81 lie 9P c Trp 33H CZ3 4.00 Trp 33H CH2 3.65 Glu 50H OE2 3.62 Trp 33H CZ2 3.87 lie 9P 0 Trp 33H CZ2 3.92 Gly 10P N Glu 50H CD 3.40 Glu 50H OE1 3.38 * Trp 33H CZ3 3.55 Trp 33H CH2 3.68 Glu 50H OE2 2.77 *** Trp 33H CE3 3.85 Trp 33H CZ2 3.99 Gly 10P CA Glu 50H CD 3.79 Glu 50H OE1 3.40 Trp 33H CZ3 3.80 Glu 50H OE2 3.61 Trp 33H CE2 3.75 Trp 33H CD2 3.55 Trp 33H CE3 3.58 hTLT- 1.126- 162 Anti-TLT-1 Distancia Posiblemente Tipo de # de res. Nombre Tipo de # de res. Nombre [A] enlace a H res. y cadena del átomo res. y cadena del átomo Trp 33H CZ2 3.99 Gly 10P C Val 100H CG2 3.82 Gly 10P 0 Val 100H CG2 3.86 Ser 11P N Val 100H CG2 3.78 Ser 11P CA Val 100H CG2 3.78 Ala 13P CB Trp 33H CD1 3.60 Trp 33H NE1 3.52 Asn 15P CG Tyr 32H CD1 3.88 Tyr 32H CE1 3.83 Asn 15P ND2 Arg 31H C 3.94 Arg 31H 0 3.09 *** Tyr 32H CG 3.98 Tyr 32H CD1 3.76 Tyr 32H CE1 3.70 Tyr 32H CZ 3.88 Arg 31H NH 1 3.93 * Ala 16P O Val 100H CB 3.86 Val 100H CA 3.80 Val 100H N 2.91 *** Thr 102H CG2 3.46 Gly 99H CA 3.74 Gly 99H C 3.78 Phe 17P CA Thr 102H CG2 3.64 P e 17P CD1 Val 100H 0 3.93 Phe 17P CE1 Val 100H CB 3.46 Val 100H CG1 3.52 Val 100H 0 3.86 Phe 17P CZ Val 100H CB 3.81 Val 100H CG1 3.89 Phe 17P C Thr 102H CG2 3.59 Phe 17P 0 Thr 102H CG2 3.79 Ser 18P c Thr 102H CG2 3.94 hTLT-1.126-162 Antí-TLT-1 Distancia Posiblemente enlace a H Tipo de # de res. Nombre Tipo de # de res. Nombre [A] res. y cadena del átomo res. y cadena del átomo Ser 18P 0 Thr 102H CB 3.48 Thr 102H 0G1 3.64 * Thr 102H CG2 3.26 Pro 20P CA Tyr 32H OH 3.47 Tyr 32H CZ 3.90 Pro 20P CB Val 2H CG2 3.92 Phe 27H CB 3.93 Phe 27H CD1 3.86 Phe 27H CG 3.78 Pro 20P CG Thr 102H OG1 3.88 Ser 98H OG 3.54 Pro 20P CD Thr 102H CB 3.95 Thr 102H OG1 3.83 Pro 20P C Val 2H CG2 3.98 Pro 20P 0 Phe 27H CB 3.52 Ala 21P N Val 2H CG2 3.51 Ala 21P CA Val 2H CG2 3.97 Ala 21P CB Val 2H CG2 3.77 Ejemplo 25: Mapeo de epitopo por desplazamiento del péptido .
El ELISA de desplazamiento del péptido define la región de enlace mínima del péptido. Esto se estableción al recubrir los péptidos biotinilados con un cambio de residuo en la región tronco de TLT-1 en placas de estreptavidina seguido por enlace del anticuerpo de interés (mAb0061) . Se agregó un anticuerpo secundario para detección y el enlace se midió en 450 nm. Control positivo: enlazado a TLT-1 biotinilado.
Materiales 10X PBS: 10X GPBS 14200 Gibco T een20: Aldrich Cat# 27,434-8, Lote # S30950-315 Placa: placa recubierta con estreptavidina de 96 pozos Nunc#466014 BSA: A7030-100g Lote# 057K0737 Solución amortiguadora de bloqueo/diluida: IX PBS pH BSA al 2% Tween20 al 0.5% Solución amortiguadora de lavado: lxPBS + Tween20 al 0.5% Estándar: TLT-1 04/09-08 biotinilado 1 mg/ml mAb: 0197-0000-0061-4A- 0.55 mg/m'l ?ß detectado: IgG anti-humano de cabra etiquetado HRP lmg/ml Prod. no. NEF802001EA Sustrato TMB: Listo para uso Cat# 4390L lote # 70904 Solución de paro: H3P04 2M Dilución de TLT-1 biotinilado lmg/ml ? 6.3ng/ml (dilución 158500x) Concentración en pozo: 0.63 ng Dilución de péptidos biotinilados Aprox conc 2-5 mg/ml (2.5 mg/ml) 2.5mg/ml ? dilución lOOOOx (25ng/pozo) : 100 µ? de cada péptido en cada pozo.
Dilución de mAb0061 0.55mg/ml ? 100ng/ml (dilución 5500x) Concentración en pozo: 10 ng Dilución de HRP IgG anti-humano de cabra mAb 1 mg/ml ? 0.2pg/ml (dilución 5000x) Sintésis de péptidos biotinilados en formato de 96 pozos Los péptidos biotinilados se sintetizaron usando síntesis de péptido de fase sólida estándar. Las soluciones de aminoácidos protegidos con Fmoc 0.3M en 1-hidroxibenzotriazol 0.3 M (HOBt) en N-metilpirrolidinona (NMP) se acoplaron usando diisopropilcarbodiimida (DIC) durante 1-4 horas. Como soporte sólido la resina LL de amida Rink (Merck) se usó en una placa de filtro de 96 microtitulaciones (Nunc) y se usó ca. 20 mg de resina por poz. La síntesis se realizó usando el sintetizador de péptido Multipep RS de Intavis, Alemania y se usó el protocolo de fabricación. La eliminación de Fmoc se hizo usando piperidina al 25% en NMP. Todos los péptidos se acoplaron con biotina en la N-terminal y se usó ácido 8-amino-3 , 6-dioxaoctanoico como un espaciador entre biotina y los péptidos. Este espaciador también se acopló como un bloque de construcción protegido por Fmoc de acuerdo con el protocol de síntesis (IRIS biotech, Alemania) Trabajo y desprotección final La desprotección final se hizo usando ácido tfrifluoracético al 90% (TFA) , triisopropilsilano al 5% y H20 al 5% durante 3 horas. Un total de 1 mi de TFA se usó por pozo. El TFA se filtró a 96 pozos de profundidad (Nunc) y el TFA se redujo en volumen por evaporación- hasta ca. 100-200 ul por pozo y se agregó dietiléter a todos los pozos con objeto de precipitar los péptidos. La suspensión del péptido en dietiléter se transfirió a la placa de filtro de 96 pozos solvinert (0.47 um, Millipore) y los péptidos se lavaron dos veces con dietiléter y se secaron. Los péptidos se volvieron a disolver en DMSO al 80% y padre al 20% dando una solución de reserva de ca. 1-3 mg/ml.
Péptidos 20mer biotinilados de la región tronco de TLT-1 (SEQ ID NO 6) 2-5mg/ml en DMSO/H20 al 75% (biotininado en N-terminal) : Número de péptido mostrado a la izquierda: 2 A 2 2619.8 bio--Oeg-L-¦N- I-L-P- P-E-¦E-E-E-E-T-H-K- I-G-•s-¦L-¦A-E 3 A 3 2620. 7 bio--Oeg-N- I-L- P-•P-E-¦E-E-¦E-E-T-H-¦K- I-•G- S--L-A-•E-N 4 A 4 2577. 7 bio--Oeg- I-L-¦P- P-E-?-¦E-E-E-T-H-K- I-G-¦s-•L-•A-¦E-¦N-A 5 A 5 2611. 7 bio--Oeg-L-P-¦P-E-E-E-E-E-•T- H-K- I-G- s-L-A--E-N-¦A-¦F 6 A 6 2585. 6 bio--Oeg- P-P-¦E-E-¦E-•E-?-¦T-¦H-¦K- I-•G-¦s-L-¦A-E-•N-•A-¦F- S 7 A 7 2603. 6 bio--Oeg- P-E-E-¦E-E-E-T-H-K- I-G- S-¦L-A-¦E-¦N-¦A-¦F-¦s-¦D 8 A 8 2603. 6 bio--Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-•I-G- s-L-A-E-N-A--F- -s- D- P 9 A 9 2545. 6 bio--Oeg-E-E-E-E-¦T-H-K- I-G- s-L-A-E-N-•A-¦F-¦s-¦D--P-•A 10 A10 2473. 6 bio--Oeg-E-•E-E-T-H-¦K-¦I-G-¦S-¦L-A-E-¦N-A-¦F- s-¦D--P-¦A--G 11 All 2431. 6 bio--Oeg-E-¦E-T-H-•K-¦I-G- s-L-A-•E-¦N-A-•F-¦s- D-¦P--A-•G- -s 12 A12 2373. 6 bio--Oeg-E-¦T-H-K- I-G- s-L-A-E-N-A-•F- s-¦D-¦P-¦A-•G-¦s-¦A 13 B 1 2358. 6 bio--Oeg-T-H-K- I-¦G- S-¦L-A-E-N-A-F-•S- D- P-¦A--G-¦S--A-¦N 14 B 2 2354. 6 bio--Oeg-H-K- I-G-¦S- L-¦A-E-N-¦A-F-S-¦D- P-¦A- G- -s-¦A-¦N-¦P 15 B 3 2330. 7 bio--Oeg-K- I-¦G-¦S-•L-¦A-¦E-N-A-¦F- s- D-¦P-A-G- S--A--N--P-¦L 16 B 4 2331. 6 bio--Oeg- I-G-¦S-L-•A-E-N-A-¦F- S- D- p-¦A-G-¦S-A-•N-¦P--L-¦E 17 B 5 2315. 5 bio--Oeg-G- s-¦L-A-•E-N-A- F- s- D-¦P-¦A-G- s-A-¦N-•P-•L--E-¦P 18 B 6 2345. 5 bio--Oeg- S-L-¦A-E-¦N-A- F-¦S- D-¦P-A-G-¦S-A-N-¦P-¦L-•E-¦P- S 19 B 7 2386. 5 bio--Oeg- L-A-E-N-¦A- F- S- D- P-A-G-S-A-N- P-¦L-E-¦P-¦s-¦Q 20 B 8 2388. 4 bio--Oeg-A-?-¦N-A- F- S- D- P-A-G-¦S-¦A-•N-P-L-¦E-¦P-•s-¦Q-•D 21 B 9 2446. 4 bio -Oeg--E-¦N--A-¦F- -s--D-¦P--A--G- -s--A--N--P--L--E--P- -s--Q--D--E 22 B10 2445. 5 bio -Oeg-¦N-¦A-¦F-¦s--D--P--A--G-¦s--A--N--P-¦L-¦E--P- -s--Q--D--E--K 23 BU 2418. 5 bio -Oeg--A--F- -s-•D--P--A- -G-•S-¦A--N--P-¦L--E-¦P- -s--Q--D--E--K- -s 24 B12 2460. 6 bio -Oeg-¦F-¦S--D--P--A--G--S--A--N--P--L--E--P- -s--Q--D--E--K- -s--I 25 C 1 2410. 5 bio -Oeg- -s-¦D--P--A--G-¦S--A--N-¦P--L--E--P--S--Q--D--E--K--S--I--P 26 C 2 2436. 6 bio -Oeg-¦D--P-¦A--G- -s--A-¦N--P--L--E--P- -s--Q--D--E--k--S--I--P--L 27 C 3 2434. 7 bio -Oeg--P--A--G- -s--A--N--P--L--E--P- -s--Q--D--E--K- -s--I--P--L--I Péptidos 16mer biotinilados de la región tronco de hTLT-1 (SEQ ID NO 6) 2-5mg/ml en DMSO/H20 al 75%: 29 C 5 2219.,3 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G 30 C 6 2193. .2 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S 31 C 7 2192. .3 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H- -I-G-S-L 32 C 8 2150. .2 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A 33 C 9 2166. .1 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E 34 C10 2183. .1 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N 35 Cll 2157. .1 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A 36 C12 2175. .2 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F 37 D 1 2133. .2 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S 38 D 2 2119. .2 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D 39 D 3 2087. .2 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P 40 D 4 2029. .2 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A 41 D 5 1985. .2 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G 42 D 6 1935. .2 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S 43 D 7 1878. .1 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A 44 D 8 1879 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N 45 D 9 1919 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P 46 DIO 1945. .1 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L 47 Dll 1961 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E 48 D12 1987 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P 49 E 1 1945 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S 50 E 2 1959 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q 51 E 3 2003 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D 52 E 4 1984. .9 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E 53 E 5 2026 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K 54 E 6 1998 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S 55 E 7 2014. 1 bio-Oeg-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I 56 E 8 2040. 1 bio-Oeg-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P 57 E 9 2096'. 2 bio-Oeg-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L 58 E10 2122. 3 bio-Oeg-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I Método mapeo del epitopo involucra enlace de mAb0061 a do series de péptido biotinilado de la región tronco de TLT-1. Los péptidos biotinilados se enlazaron a las placas de estreptavidina .
Péptido de desplazamiento: LNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPL 1) mapeo de péptido 20mer con un cambio de residuo (20,1) (ver materiales) 2) mapeo de péptido 16mer con un cambio de residuo (16,1) (ver materiales) 1. La placa se pre-lavó 3x con 250µ1 solución amortiguadora de lavado 2. Se agregaron ???µ? de solución de péptido biotinilado (de Masterplate 10000 X diluida, un péptido por pozo) 3. Se incubó a TA durante 1 hora o +5°C durante la noche 4. Se lavó 3x con solución amortiguadora de lavado 5. Se agregaron ???µ? de anticuerpo primario (dilución ver arriba) 6. Se incubó a TA durante 1 hora 7. Se lavó 3x con solución amortiguadora de lavado 8. Se agregaron ???µ? de anticuerpo secundario (dilución ver arriba) 9. Se incubó a TA durante 1 hora 10. Se lavó 3x con solución amortiguadora de lavado 11. Se agregó ???µ? de solución amortiguadora de substrato/desarrollo (Tiempo de reacción 3 min) 12. Se agregó ???µ? de H3P04 2M 13. El punto final se leyó' en 450 nm El enlace al péptido biotinilado en un pozo se registró como "enlace" cuando la absorción en 450 nm fue arriba de 3. "Sin enlace" se registró cuando la señal fue debajo de 1. Una señal en medio se registró como "enlace débil".
Resultados Los péptidos biotinilados se colocaron en pozos de la siguiente manera: Hilera A: péptido 2-12 (20mers) Hilera B: péptido 13 -24 (20mers) Hilera C: péptido 25 -27 (20mers) Hilera C: péptido 29 -36 (16mers) Hilera D: péptido 37 -48 (16mers) Hilera E: péptido 49 -58 (16mers) Resultado de la determinación triple: En resumen, los péptidos 20mer (5-16) dan lugar a señales positivas fuertes (<3) correspondientes a aminoácidos: I.GSLAENAF. Los péptidos 16mer 36-42 dan lugar a las señales positivas fuertes (<3) correspondientes a KIGSLAENAF.
Conclusión El ELISA de desplazamiento de péptido ha definido el área de enlace mínimo del epítopo para enlazarse a mAb0061 como la siguiente extensión de residuos de aminoácidos: KIGSLAENAF.
Esta extensión es efectivamente parte del epítopo definido arriba por la estructura de cristal: KIGSLA-NAFSDPA. Ejemplo 26: Ensayo de hidrólisis in vitro del polipeptido del factor Vlla.
La variante del factor Vlla y factor Vlla nativo (de tipo natural) (ambos referidos en la presente como "Factor Vlla") se colocan en ensayo en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) . El sustrato cromogénico D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia) , concentración final 1 mM, se agrega al Factor Vlla (concentración final 100 nM) en Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 M, CaC12 5 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino. La absorbancia en 405 nm se mide continuamente en un lector de placa SpectraMax 340 (Molécular Devices, EUA) . La absorbancia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pozo blanco que no contiene enzima, se usa para calcular la relación entre las actividades de Factor VHa variante y de tipo natural: Relación = (variante de factor Vlla AJOS nm) / (tipo natural del factor Vlla ?¾05 mu) · Ejemplo 27 : Ensayo de protólisis in vítro del polipéptido del factor Vlla.
Se colocaron en ensayo el factor Vlla nativo (de tipo natural) y variante del Factor Vlla (ambos referidos de aquí en adelante como "Factor Vlla") en paralelo para comparar directamente sus actividades especificas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El Factor Vlla ( 10 nM) y Factor X (0.8 microM) en 100 pL de Hepes 50 mM, pH 7.4 , que contiene NaCl 0.1 M, CaCl2 5 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, se incubaron durante 15 min. La escisión del factor X luego se detiene por la adición de 50 pL de Hepes 50 mM, pH 7.4 , que contiene NaCl 0.1 M, .EDTA 20 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino. La cantidad de Factor Xa generado es medida por adición del sustrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S- 2765, Chromogenix, Suecia) , concentración final de 0.5 mM. La absorbancia en 405 nm se mide continuamente en un lector de placa SpectraMax (TM) 340 (Molécular Devices, EUA). La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pozo blanco que no contiene FVIIa, se usa para calcular la relación entre las actividades proteoliticas del Factor Vlla variante y de tipo natural : Relación = (variante de factor VIla ¾05 nm) / (tipo natural del factor VIla A405„-) . Ejemplo 28: Ensayo de la actividad del factor Villa: ensayo cromogénico .
La actividad de FVIII (FVIII:C) del compuesto rFVIII se evalúa en un ensayo FVIII cromogénico usando reactivos Coatest SP (Chromogenix) como sigue: muestras rFVIII y un estándar FVIII (por ejemplo rFVIII de tipo natural purificado calibrado contra el 7° estándar de FVIII internacional de NIBSC) se diluyen en solución amortiguadora de ensayo Coatest (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1%, pH 7.3, con conservador) . Cincuenta µ? de muestras, estándares, y control negativo de solución amortiguadora se agregan a placas de microtitulación de 96 pozos (Nunc) en duplicados. El reactivo del factor IXa/factor X, el reactivo de fosfolipido y CaCl2 del kit Coatest SP se mezclan 5:1:3 (vol : vol : vol ) y 75 µ? de esto se agrega a los pozos. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, se agrega 50 µ? de la mezcla de sustrato del factor Xa S-2765/inhibidor de trombina 1-2581 y se agregan los reactivos incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de 25 µ? de ácido cítrico 1 M, pH 3. La absorbancia en 415 nm se mide en un lectro de placa de microtitulación Spectramax ( olécular Devices) con absorbancia en 620 nm usada como longitud de onda de referencia. El valor para el control negativo se sustrae de todas las muestras y una curva de calibración preparada por regresión lineal de los valores de absorbancia agrupados contra concentración de FVIII. La actividad especifica se calcula al dividir la actividad de las muestras con la concentración de la proteina determinada por HPLC. La concentración de la muestra se determina al integrar el área bajo el pico en el cromatograma correspondiente a la cadena ligera y comparar con el área del mismo pico en un análisis paralelo de un rFVIII no modificado de tipo natural, donde la concentración se determina por análisis de aminoácidos.
Ejemplo 29: Ensayo de la actividad del factor Villa: ensayo de coágulo de una etapa .
La actividad FVIII (FVIII :C) de los compuestos rFVIII se evalúa además en un ensayo de coágulo FVIII de una etapa como sigue: muestras rFVIII y un estándar FVIII (por ejemplo rFVIII de tipo natural purificado calibrado contra el 7o estándar FVIII internacional de NIBSC) se diluyeron en solución amortiguadora HBS/BSA (hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4 con BSA al 1%) hasta aproximadamente 10 U/ml, seguido por dilución 10 veces en plasma deficiente de FVIII que contiene VWF (Dade Behring) . Las muestras se diluyen posteriormente en solución amortiguadora HBS/BSA. El timpo del coágulo APTT se mide usando un instrumento ACL300R o uno ACL5000 ( Instrumentation Laboratory) usando el programa del factor sencillo. El plasma deficiente de FVIII con VWF (Dade Behring) se usa como plasma de ensayo y SynthASil, (HemosIL (TM) , Instrumentation Laboratory) como reactivo aPTT. En el instrumento del coagulo, el estándar o muestra diluida se mezcla con plasma deficiente de FVIII y reactivos aPTT a 37 °C. Se agrega cloruro de calcio y se determina el tiempo hasta la formación del coágulo al medir la turbiedad. El FVIII :C en la muestra se calcula con base en una curva estándar de las veces de formación de coágulo de las diluciones del estándar FVIII.
Ejemplo 30: Ensayo de protolisis in vitro de polipéptido del factor Xa.
Se colocaron en ensayo el factor Xa nativo preactivado (de tipo natural) y variante del Factor Xa preactivado (ambos referidos de aquí en adelante como "Factor Xa") en paralelo para comparar directamente sus actividades especificas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Denmark) . El Factor Xa (10 nM) y Protrombina (0.8 microM) en 100 µ? de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 M, CaCl2 5 mM y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, se incubaron durante 15 min. La escisión de protrombina luego se detiene por la adición de 50 µ? de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0.1 M, EDTA 20 mM y 1 mg/ml albúmina de suero de bovino. La cantidad de Trombina generada es medida por la adición del sustrato cromogénico H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-Arg-p-nitroanilida (S-2738 , Chromogenix, Suecia) , concentración final 0.5 mM. La absorbancia en 405 nm se mide continuamente en un lector de placa SpectraMax (T ) 340 (Molécular Devices, EUA) . La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustración de la absorbancia en un pozo blanco que no contiene FXa, se usa para calcular la relación entre las ctividades proteoliticas de Factor FXa variante y de tipo natural : Relación = (variante de factor Xa A405 I (tipo natural del factor Xa ?405 . Ejemplo 31 : Conjugación química de un anticuerpo anti-TLT-1 (fragmento) con un factor de coagulación.
Un compuesto de la fórmula general en donde "mAb anti-TLT-1 (fragmento)" puede ser un mAb de tamaño completo contra TLT-1 o un fragmento o un análogo intelectualmente derivado del mismo tal como pero no limitado a, un fragmento FAB o uno sc-FAB con ninguna, una o más mutaciones de punto, el ligador puede ser un polímero soluble en agua tal como pero no limitado a por ejemplo PEG, ácido polisiálico, o almidón de hidroxietilo, y FVIIa es cualquier molécula con una similitud en secuencia de >50% para FVIIa nativo con cualquier actividad retenida de FVIIa puede, por ejemplo, prepararse en un procedimiento de dos etapas.
Durante la primera etapa, un ligador, con dos diferentes grupos reactivos RS1 y RS2 puede ser enlazado al mAb anti-TLT-1 (fragmento). La reacción puede correrse con selectividad del sitio bajo o en una manera selectiva, de manera que RS1 sólo reacciona en una o pocas posiciones del mAb anti TLT-1 (fragmento) . Como un ejemplo no exclusivo, el RS1 puede ser un aldehido y reaccionar por aminación reductiva sólo con N-terminal del mAb anti TLT-1 (fragmento) por aminación reductiva, conocida para una persona entrenada en el arte. Otro ejemplo no exclusivo de RS1 puede ser' un grupo de maleimida, que puede reaccionar con un tiol libre en el mAb anti-TLT-1 (fragmento) .
Durante la segunda etapa, el grupo reactivo RS2 puede hacerse reaccionar con selectividad del sitio bajo o selectividad del sitio con una molécula FVIIa. Como un ejemplo no exclusivo, una reacción selectiva del sitio en FVIIa puede obtenerse cuando RS2 es un derivado de ácido siálico, que puede reaccionar en presencia de una enzima adecuada tal como pero no limitada a ST3Gal-III con glicanos ligados a N, que no terminan exclusivamente con ácidos siálicos . mAb ant¡-TLT1 (fragmento) L-Ugador -RS2 + FVIIe rnAbanti-TLTI (fragmento) •Ligador · FVlla El orden de unión del ligador a las dos proteínas, paticularmente el mAb anti-TLT-1 (fragmento) y la molécula FVIIa puede conmutarse, por ello une la molécula RSl-Ligador-RS2 primero a la molécula FVIIa y luego al mAb anti TLT-1 (fragmento) .
Ejemplo 32: Conjugación de fragmento anti TLT-l-FAB (Fab0084) para FVIIa para producción de de FVIIa-Fa l029.
Etapa. 1: éster de 2 , 5-dioxopirrolidinilo del ácido 3- (2, 5-dioxo-2 , 5-dihidropirrol-l-il ) propiónico .
Se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico (1.0 g, 5.9 mmol) en tetrahidrofurano (20 mi) . Se agregaron posteriormente tetrafluoroborato de 2-succinimido-l , 1, 3, 3- tetrametiluronio (TSTU, 2.14 g, 7 mmol) y etildiisopropilamína (1.24 mi, 7.1 mmol). Se agregó N,N-dimetilformamida (5 mi) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, mientras se volvió lenta. La mezcla se agitó durante 2 min. Se agregó N, N-dimetilformamida (5 mi). La mezcla se agitó durante 2.5 h a temperatura ambiente. Se diluyó con diclorometano (150 mi) y se lavó posteriormente con una solución acuosa al 10% de sulfato ácido de sodio (150 mi), una solución acuosa saturada de carbonato ácido de sodio (150 mi) y agua (150 mi). Se secó sobre sulfato de magnesio. El solvente se removió in vacuo. El producto crudo se volvió a cristalizar de acetato de etilo para dar 1.20 g de éster de 2 , 5-dioxopirrolidini-l-ilo del ácido 3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propiónico .
EM: m/z = 289, reguerido para [ + Na]+: 289 1H-RMN (CDCI3) d 2.82 (m, 4 H) ; 3.02 (t, 2 H) ; 3.94 (t, 2 H) , 6.73 (s, 2 H,) .
Etapa 2: Ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) lOkDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2-[5' ] citidilil^-neuraminico (NNC 0129-0000-3259).
Se disolvió ácido N- ( ( 3- (?-AminolO kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-?-neuraminico (100 mg, 0.009 mmol) en una mezcla de tetrahidrofurano (2 mi) y diclorometano (10 mi). Se agregó una solución de éster 2,5-dioxopirrolidini-l-ilo del ácido 3- ( 2 , 5-dioxo-2 , 5-dihidropirrol-l-il ) propiónico (50 mg, 0.18 mmol) en diclorometano (3 mi) . Se agregó etildiisopropilamina (0.005 mi, 0.028 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se agregaron diclorometano (2 mi) y etildiisopropilamina (0.5 mi). Se agregó resina de poliestireno aminometilada ( comercialmente disponible en por ejemplo Novabiochem, cargada 0.85 mmol/g, 438 mg, 0.372 mmol). La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 1 h. La resina se removió por filtración. El solvente se removió in vacuo con una temperatura de baño de 25°C. El residuo se disolvió en diclorometano (4 mi). Se agregó éter (200 mi) . La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 2 h con objeto de permitir que la precipitación formada envejezca. La precipitación se aisló por filtración y secó in vacuo para dar 38 mg del compuesto del titulo. El espectro 1H-R N e DMS0-d6 muestra la presencia de un grupo de maleimida .
Etapa 3: Unión de ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 10 kDa PEGil ) propionilamino) acetil)-02-[5'] citidilil- ?-neuraminico a un Fab anti-TLT-1.
Un análisis LC-MS de un fragmento Fab anti-TLT-1 con partes de la región de bisagra en donde un Cys impar se incorporó indicando que el Cys impar se tapó con una cisteina. Por lo tanto, la reacción previa con ácido N-((3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 10 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-?-neuraminico destapada del Cys impar tiene que realizarse por reacción con clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina .
Una solución de un fragmento Fab anti-TLT-1 con partes de la región bisagra en donde un Cys impar se incorporó (1 mg) en una solución amortiguadora de HEPES 20 mM, EDTA 5.0 mM, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.5 se colocó en dispositivo de ultracentrifugación amicon con un corte de 10 kDa. La solución amortiguadora se cargó a una solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M, que se ha ajustado hasta pH 7.35 por ultracentrifugación repetida en 4000 rpm. Después de que la solución amortiguadora se cambió, se obtuvo una solución de la proteina en la solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M, que se ha ajustado hasta pH 7.35 (4 mi). Se agregó una solución de 1 mg/ml de clorhidrato de tris (2-carboxietil ) fosfina (0.40 mi). La mezcla de reacción se agitó en 300 rpm a 20°C durante 1 h. La mezcla de reacción se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación con un corte de 10 kDa y se concentró por ultracentrifugación en 4000 rpm durante 7 min, dejando una solución de 0.700 mi detrás. Esto se aplicó a una columna PD-10 (Amersham Bioscience) , que se ha equilibrado con una solución amortiguadora de HEPES 25 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.00. La proteina se eluyó de la columna usando una solución amortiguadora de HEPES 25 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.00 (3.2 mi). Esta solución se concentró por ultracentrifugación en 4000 rpm en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa durante 7 min para proporcionar una solución de 0.750 mi. La solución se colocó en un . vial y se agregó solución amortiguadora de HEPES 25 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.00 (0.360 mi). Se agregó una solución de 1 mg/ml de ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 10 kDa PEGil) -propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil- ?-neuraminico (0.89 mi) . La mezcla de reacción se agitó suavemente en 300 rpm a 20°C durante 3.5 h. Se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa y concentró por ultracentrifugación en 4000 rpm durante 10 min a un volumen de 0.120 mi. La solución se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superóse 75 10/300 GL (GE Healthcare) a un flujo de 0.50 ml/min, utilizando una solución amortiguadora compuesta de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se ha ajustado hasta pH 8.00 como eluyente. Las fracciones se agruparon sobre la base del residuo UV en 280 nm del cromatograma . Se usó en la siguiente etapa el grupo (0.148 mg, 1.4 mi), que contiene el compuesto deseado como se juzga por SDS-PAGE y que estaba desprovisto de reactivo PEG libre como se juzga por SDS-PAGE utilizando un método de tinción específico PEG (descrito en urfurst, M. M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248.).
Etapa 4: Sialidasa inmovilizada. (C. Perfingens tipo VI-A inmovilizado en agarosa, Sigma: N-5254, 0.6-1.8 U/ml gel, 0.180 mi) se lavó con agua (2 x 0.50 mi) y posteriormente con una solución amortiguadora de MES 25 mM, CaCl2 20 mM, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 6.1 (3 x 0.50 mi) . Una solución de FVIIa (0.50 mg) en una solución amortiguadora compuesta de Gly-Gly 25 mM, CaCl2 10 mM, que se ha ajustado hasta pH 6.0 se agregó a la sialidasa inmovilizada. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente, mientras que se mezcló cuidadosamente cada 20 min. Después de 3 h, la resina inmovilizada se removió por filtración a través de una columna de giro Pierce por centrifugación en 2000 rpm durante 2 min .
La mezcla del producto de la unión de ácido ?-((3-(?-(3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) 10 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil- ?-neuraminico para un FAB anti TLT-1 como se describe en una etapa precedente se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. La solución amortiguadora se cargó por ultracentrifugación repetida a una solución amortiguadora compuesta de MES 25 mM, CaCl2 20 mM, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 6.1.
A esta solución, se agregó una parte de la solución del derivado FVIIa (0.092 mi). La solución amortiguadora se cargó en una solución amortiguadora compuesta de MES 25 mM, CaCl2 20 mM, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 6.1 y un volumen total de (0.20 mi). Se agregó una solución de ST3-Gal-III (0.015 mi). La mezcla de reacción se agitó suavemente a 32°C durante 25 min y a partir de entonces se dejó a 32°C durante 16 h. Se agregó una solución de 10 mg/ml de ácido CMP-N-acetilneuraminico (CMP Neu/VAc, 0.70 mg, 0.070 mi) en una solución amortiguadora de MES 25 mM, CaCl2 20 mM, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 6.1. La mezcla de reacción se agitó suavemente en 32°C durante 15 min y a partir de entonces se dejó a 32°C durante 1 h. La mezcla de reacción se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) con un flujo de 0.5 ml/min utilizando una solución amortiguadora de Histidina 10 mM, CaCl2 2, NaCl 150 mM que se ha ajustado hasta pH 6.1 como eluyente. Se agruparon las fracciones que contienen el producto deseado como se juzga por SDS-PAGE sobre un gel de TRIS-Acetato . Usando una absorción molar de 11.22 en 280 nm sobre un aparato Nandrop(R), se encontró un rendimiento de 0.022 mg. El resultado de un análisis SDS-PAGE fue de acuerdo con la evaporación para el producto deseado. El producto se nombró FVIIa-Fabl029.
Ejemplo 33: Conjugación de un fragmento anti-TLT-l-FAB (Fab0084) a FVIII, FVIII-Fab3002. pesada de FVIII Etapa 1: Unión de ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2,5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 10 kDa PEGil ) propionilamino) acetil ) -O2- [ 5 ' ] citidilil- ?-neuraminico a un fragmento Fab anti TLT-l Un análisis LC-MS de un fragmento Fab anti-TLT-1 con partes de la región bisagra en donde un Cys impar se incorporó indicando que el Cys impar puede estar tapado con una cisteina. Por lo tanto, se ha realizado la reacción previa con ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 10 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -02-[5' ] citidilil^-neuramínico destapado del Cys impar por reacción con clorhidrato de tris (2-carboxietil ) fosfina (TCEP) .
El TLT-l-FAB-fragmento (1.35 mg, 27.4 nraol) en una solución 0.27 mg/ml en una solución amortiguadora compuesta de HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM que se ha ajustado hasta pH 7.5 se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. Se sometió a ultracentrifugación en 4000 rpm a 20°C durante 10 min. Se agregó solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M que se ha ajustado hasta pH 7.35 (4 mi). La mezcla se sometió a ultracentrifugación en 4000 rpm a 20°C durante 8 min. Se agregó solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M que se ha ajustado hasta pH 7.35 (4 mi) . La mezcla se sometió a ultracentrifugación en 4000 rpm a 20°C durante 8 min. Se agregó solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al. 0.02%, glicerol 1 M que se ha ajustado hasta pH 7.35 (3 mi) . La mezcla se sometió a ultracentrifugación en 4000 rpm a 20°C durante 10 min. La mezcla se colocó en un vial de reacción. Se agregó solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M que se ha ajustado hasta pH 7.35 (4 mi), asi que el volumen total de la mezcla de reacción fue en este tiempo 4.7 mi. Se agregó una solución 1 M de TCEP (0.54 mi) en una solución amortiguadora de imidazol, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, glicerol 1 M que se ha ajustado hasta pH 7.35. La mezcla de reacción se agitó en 300 rpm durante 1 h. La mezcla se dividió en dos partes cada una de las cuales se aplicó a una columna PD-10 (GE Healthtech) que se ha equilibrado con una solución amortiguadora de HEPES 25 mM con un pH 7.0. Los eluidos se combinaron (7 mi en total) y se concentraron hasta 1 mi por ultracentrifugación en 4000 rpm a 20°C durante 6-8 min en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa.
La solución se colocó en un vial de reacción. Se agregó una solución amortiguadora de HEPES 25 mM que se ha ajustado hasta pH 7.0 (0.50 mi) para obtener un volumen total de 1.5 mi. Se agregó una solución de 1 mg/ml frescamente preparada de ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) 10 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -02-[5' ] citidilil-^-neuraminico (1.2 mi, 1.2 mg, 109 nmol) en una solución amortiguadora de HEPES 25 mM que se ha ajustado hasta pH 7.0. La mezcla de reacción se agitó suavemente en 300 rpm a 20°C durante 3.2 h. Se concentró a un volumen de 0.30 mi por ultracentrifugación en 4000 rpm a 19°C durante 11 min en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. Se aplicó a una cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthtech) a un flujo de 0.50 ml/min utilizando una solución amortiguadora de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM que se ha ajustado hasta pH 8.0 como eluyente. Se usó en la siguiente etapa la fracción que contiene el producto deseado en una pureza aceptable como se juzga por análisis SDS-PAGE en presencia de N-metilmaleimida (NEM) y que estaban desprovistos de ácido N- ( ( 3- (?- ( 3- (2 , 5-dioxo-2 , 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) 10 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -02- [5' ] citidilil-^-neuramínico como se juzga por SDS-PAGE en combinación con una tinción sensible a PEG ((descrito en Kurfurst, . M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248.)). El análisis SDS-PAGE bajo condiciones de reducción estaba en cumplimiento con el resultado esperado para el producto deseado. El análisis SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción muestra algún material, en el cual una cadena del fragmento anti-TLT-l-FAB se ha perdido. Sin embargo, permanece sin resolver, si este hallazgo fue debido a problemas en el análisis o si una cadena se ha perdido realmente ya sea durante la reacción descrita o aún antes. Usando una absorbancia molar de 10.44 en 280 nm sobre un aparato Nanodrop®, se encontró una concentración de 0.1 mg/ml dando un rendimiento de 0.287 mg.
Etapa 2: La solución del producto de la unión de ácido N-( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) 10 kDa PEGil)propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-?-neuramínico a un fragmento Fab anti TLT-1 como se describe en el ejemplo precedente y una solución del FVIII eliminado del dominio B que tiene una secuencia del dominio B residual de SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR en la C-terminal de la cadena pesada (0.780 mg, 5.64 mmol) en una solución amortiguadora compuesta de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, NaCl 150 mM, Tween80 al 0.02% y glicerol 1 que se ha ajustado hasta pH 7.35 (0.018 mi) se mezclaron y colocaron en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. La solución se sometió a un cambio de solución amortiguadora para histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.05 al repetir la ultracentrifugación y adición de la solución amortiguadora. Se obtuvo un volumen total de 0.40 mi. se agregaron posteriormente una solución 0.4 mg/ml (242 U/mg, 98 U/ml, 0.0055 mi) de sialidasa de A. Urifaciens y una solución de 2.5 mg/ml de ST3Gal-III (0.033 mi) . La mezcla de reacción se agitó suavemente durante 15 min en 300 rpm a 32°C, dejó durante 2 h a 32°C durante lo cual se agitó cuidadosamente de forma ocasional, y finalmente se dejó a 32°C durante 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (0.030 mi) . Se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna Superóse 6 10/300 GL (GE Healthcare) y utilizando una solución amortiguadora de Histidina 10 mM, CaCl2 1.7 mM, Tween80 al 0.01%, NaCl 0.3 M, sacarosa 8.8 mM que se ha ajustado hasta pH 7 a un flujo de 0.50 ml/min. Se agruparon las fracciones que contienen el producto deseado como se juzga por análisis SDS-PAGE. El grupo se sometió a un cambio de solución amortiguadora usando un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa a una solución amortiguadora compuesta de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol 1 M, Tween 80 al '0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.07. Se obtuvo · un volumen total de 0.250 mi. Usando una absorción molar de 14.6 en 280 nm sobre un aparato Nanodrop, se encontró una concentración de 0.59 mg/ml, correspondiente a un rendimiento de 0.148 mg. Se agregó 10 mg/ml de solución de ácido CMP-N-acetilneuraminico (CMP Neu/VAc, 0.26 mg, 0.026 mi) en una solución amortiguadora de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.05 y una solución de ST3Gal-III (0.015 mi). La mezcla de reacción se agitó suavemente en 300 rpm a 32°C durante 15 min y luego se dejó a 32°C durante otros 45 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua (0.10 mi). Se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño usando columna Superóse 6 10/300 GL (GE Healthcare) y utilizando una solución amortiguadora de Histidina 10 mM, CaCl2 1.7 mM, Tween80 al 0.01%, NaCl 0.3 M, sacarosa 8.8 mM que se ha ajustado hasta pH 7 a un flujo de 0.50 ml/min. Se agruparon las fracciones que contienen el producto deseado como se juzga por análisis SDS-PAGE dadas y concentradas por ultracentrifugación en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon a un volumen total de aproximadamente 0.275 mi. Usando una absorción molar en 280 nm de 14.6 sobre un aparato Nanodrop®, se encontró una concentración de 0.180 ml/ml correspondiente a un rendimiento de 0.0495 mg. El análisis SDS-PAGE del producto bajo condiciones reducidas está de acuerdo con la evaporación para el producto deseado. El análisis SDS-PAGE bajo no reducidas muestra cantidades cambiadas de una banda que corresponde a un producto donde el fragmento FAB ha perdido una cadena. La apariencia de una banda correspondiente a una puede ser debido a la presencia de tal compuesto en el producto o puede ser debido a la descomposición durante la desnaturalización previa del análisis SDS-PAGE.
Ejemplo 34: Enlace a TLT-1.
Tabla 16: Reactivos Método : Se inmovilizó TLT-1 directamente a un chip CM5 a un level de aprox 2000 RU (50 ug/ml diluido en acetato de Na, pH 4.0) usando el procedimiento estándar recomendado por el proveedor y los reactivos proporcionados en la Tabla 16. Se probaron las diluciones dos veces de FVIIa-Fabl029 y FIX-Fab0135 desde 20 n hasta 0.3 nM para enlazarse a TLT-1. Solución amortiguadora de dilución y corrida: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0.005%, pH 7. . Se obtuvo la regeneración por Glicina 10 mM, pH 1.7. La determinación de constantes de enlace y cinéticas (kon, k0ff, KD) se obtuvo asumiendo una interacción 1 : 1 de TLT-1 y FVIIa-Fabl029 o FIX-Fab0135 usando el software de evaluación Biacore T100.
Resultado : Tabla 17 Conclusión : Las constantes de enlace para FVIIa-Fabl029 y FIX-Fab0135 enlazadas a TLT-1 se estimó por análisis biacore y el enlace a TLT-1 se confirmó (Tabla 17) .
Ejemplo 35: FVIIa-Fabl029 promueve la formación de coágulo de fibrina en sangre entera tipo hemofilia.
Los residuos TEG obtenido con HWB normal (NWB) , sangre de "hemofilia", y sangre de "hemofilia" complementada con (0; 0.25; 0.5; 1.0; nM) de FVI Ia-Fabl029 o rFVIIa se muestran en la Figura 11A. Se muestran en la Figura 11B los valores de tiempo R obtenidos para los residuos TEG representados. La Figura 11B, además de los valores de tiempo R para la proteina FVIIa-Fabl029 o rFVIIa, también incluyen valores de tiempo R para concentraciones equivalentes de rFVIIa. Todos los datos se obtienen de un donador representativo. El FVIIa-Fabl029 se observa para normalizar eficientemente la coagulación de HWB tipo hemofilia. Además los resultados muestran que el efecto pro-coagulante conocido de rFVIIa está potenciado además por conjugación de rFVIIa a un fragmento Fab de un anticuerpo contra TLT-1. De esta manera, el ejemplo con la proteina FVIIa- Fabl029 demuetra que el direccionamiento de rFVIIa a TLT-1 en plaquetas potencia además la actividad de derivación FVIII de rFVIIa.
Ejemplo 36: FIX-Fab0135 tiene actividad de derivación FVIII y promueve la formación de coágulo de fibrina en sangre entera tipo hemofilia A.
La sangre entera humana estabilizada cifrada (HWB, por sus siglas en inglés) se- saca de donadores normales. La formación de coágulo es medida por tromboelastografia (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EUA) . Se obtienen las condiciones tipo hemofilia A por incubación de sangre entera humana estabilidada por citrato normal (HWB) con 10 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII (Factor VIII anti-humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) durante 30 min a temperatura ambiente. Varias concentraciones (0.1; 0.2; 1.0; 5.0; 10 nM) del FIX-Fab0135 se agregan a HWB citrada tipo hemofilia A. La coagulación se inicia cuando 340 µ? de HWB normal o premezclada se transfiere a un vaso trombelastógrafo que contiene 20 µ? de CaCl2 0.2 M con 0.03 pM de TF lipidado (Innovin®, Dade Behring GmbH (Marburg, Alemania) . Los residuos TEG se siguen continuamente por hasta 120 min. Los residuos TEG obtenidos con HWB normal (HWB), sangre de "hemofilia", y sangre de "hemofilia" complementada con (0.1; 0.2; 1.0; 5.0; 10 nM) de FIX-Fab0135 se muestran en la Figura 12. También se muestran para comparación los residuos TEG obtenidos cuando FIX-Fab0135 se remplaza por rFVIIa 1 nM o rFIX 10 nM. Todos los datos se obtienen de un donador representativo.
De manera sorprendente los resultados muestran que la fusión de FIX a un fragmento Fab de un anticuerpo contra TLT-1 produce una proteina con actividad de derivación FVIII. El FIX-Fab0135 se observó para normalizar eficientemente la coagulación de HWB tipo hemofilia A. La propagación dependiente de FIX de la coagulación requiere ensamble de un complejo FIXa/FVIIIa en la superficie de plaquetas activadas, y la actividad de activación FX (tenasa) resultante se previene por' anticuerpos FVIII inhibidores. El presente ejemplo con FIX-Fab0135 demuetra que el direccionamiento de FIX a TLT-1 en la superficie de plaquetas genera un FIX que 4 contiene complejo con actividad pro-coagulante aún cuando FVHI se bloquea por un anticuerpo inhibidor.
Ejemplo 37 : Proteina de fusión FIX-Fab0135 dirigida a fosfolipido enriquecido con TLT-1 vesiches promueve marcadamente la activación FX inducida por FVIIa en ausencia de FVIII.
Métodos: Las vesículas de fosfolípidos enriquecidas con TLT-1, preparadas como se describe en el Ejemplo 20 se aplican en el experimento mostrado en la Figura 13 para imitar TLT-1 en la superficie de plaquetas activadas. Varias concentraciones (0.05 - 100 nM) de rFVIIa se incuban a temperatura ambiente durante 15 min i) en solución amortiguadora Hepes (Hepes 50 mM, NaCl 0.1 M, CaCl2 5 mM, 1 mg/ml de BSA pH 7.4) o en solución amortiguadora Hepes con ii) FIX 10 nM, iii) FlXa 10 nM o iv) FIX-Fab0135 10 nM. Esto luego se mezcla con FX 100 nM (Enzyme Research Laboratories, RU) y vesículas de fosfolípidos enriquecidas con TLT-1 en dilución 1:4,000 en ausencia o presencia de FVIII 5 nM e incuba durante 3 min. La reacción se detiene por adición de una solución amortiguadora de paro de volumen igual (Hepes 50 mM, NaCl 0.1 M, EDTA 20 mM, 1 mg/ml de BSA pH 7.5). La cantidad de FXa generada en las muestras luego se determina en un ensayo cromogénico al transferir 50 µ? de la mezcla a un pozo de placa de microtitulación y se agrega 25 µ? de Cromozima X (final 0.42 mg/ml) al pozo. La absorbancia en 405 nm se mide continuamente en un fotómetro Spectramax de microplaca (Molecular Devices, Sunnyvale CA, EUA) .
El FVIIa es capaz de activar FIX (0sterud y Rappaport, 1977) y el FlXa resultante luego se designa para combinar con FVIIIa y formar el componente proteolitico del asi llamado complejo de tenasa. La formación de este complejo toma lugar en la superficie de plaquetas activadas. El complejo de tenasa es responsable para una activación FX masiva que juega un papel clave en la fase de propagación del proceso de coagulación. La incapacidad para formar un complejo de tenasa activo es la diátesis central, en pacientes tanto con hemofilia A como B. En el ejemplo presente, las vesículas de fosfolípidos enriquecidas con TLT-1 se aplican para imitar la superficie de plaquetas activadas. Este sistema se usa para probar si el direccionamiento de FIX a TLT-1 en tales vesículas por medio del FIX-Fab0135 puede promover la activación FX en analogía con el complejo de tenasa sobre plaquetas activadas Adicionalmente es de interés examinar si la presencia de FVIII es obligatoria o no para esta actividad.
La Figura 13 muestra: 1) que muy poco FXa se genera en todas las concentraciones FVIIa probadas en ausencia y presencia de FVIII 5 nM bajo las condiciones del experimento sin derivados FIX agregados (o); 2) que esto es el caso también cuando FIX 10 nM se presenta en la mezcla de reacción ( ° ) ; 3) que una activación FX marcada se observa cuando FIX 10 nM se remplaza por FIX 10 nMa, sin embargo, sólo en presencia de FVIII (¦); 4) que el direccionamiento de FIX a las vesículas de fosfolipidos enriquecidas con TLT-1 por medio del FIX-Fab0135 proporciona un complejo que se activa por FVIIa en una manera dependiente de la concentración; 5) que el complejo tipo tenasa activado resultante promueve marcadamente la activación FX tanto en presencia como en ausencia de FVIII.
Estos resultados, asi como aquellos del ejemplo 36, sugieren que la proteína de fusión FIX-Fab0135 FIX proporciona un agente de derivación FVIII que promueve marcadamente la activación FXa mediada por FVIIa por un mecanismo que involucra la activación FVIIa de FIX dirigido a TLT-1 y la formación de un complejo con una actividad tipo tenasa independiente de FVIII considerable.
Ejemplo 38 : Expresión TLT-1 en plaquetas humanas .
Se ha reportado que TLT-1 únicamente se expresa en plaquetas activadas (Washington et al. (2004) Blood. 15 de Agosto 2004; 104(4): 1042-7). Para verificar esto y estimar el número de copia específico de TLT-1 en la superficie de plaqueta usamos el "kit calibrador de plaquetas" de Biocytex (Marseille, Francia) en el cual las plaquetas se tiñen por inmunofluorescencia indirecta sin lavado con anticuerpos monoclonales específicos y analizaron por citometría de flujo cuantitativa. El nivel de expresión del antígeno probado se determina usando perlas de calibración con un número definido-de sitios de enlace para la detección de anticuerpo. De acuerdo con la instrucción de los fabricantes las plaquetas en sangre entera humana cifradas se activaron por concentraciones diferentes (0.3-30 µ?) del péptido que activa el receptor activado por proteasa (PAR)-l con secuencia de aminoácido SFLLRN. Las muestras se diluyeron 1:4 en una solución amortiguadora salina proporcionada en el kit antes del etiquetado con anticuerpos enlazados a TLT-1. Los anticuerpos enlazados a TLT-1 usados fueron ya sea mAb0123 (subtipo IgGl del anticuerpo mAb0023) o mAb0136 (subtipo IgGl del anticuerpo mAb0012) . Después de 15 min de incubación con cualquiera de los anticuerpos TLT-1 (10 pg/ml) seguido por 15 min de incubación con anticuerpo de detección etiquetado FITC (proporcionado por el fabricante) las muestras se diluyeron 1:50 inmediatamente antes del análisis de citometria de flujo. El número absoluto de TLT-1 sobre la superficie de plaqueta se obtuvo al usar la cruva estándar derivada de perla .
Las plaquetas inactivadas no muestran la expresión de TLT-1 con ninguno de los dos anticuerpos usados. Sin embargo, cuando las plaquetas se activaron con SFLLRN una expresión TLT-1 incrementada se observó con una expresión máxima de moléculas de superficie 9685+1696 y 12981+-2083 detectadas por mAb0123 y mAb0136 respectivamente (Figura 14). La expresión TLT-1 de plaqueta máxima se alcanzó por estimulación doble por SFLLRN (30 µ?) y Convulxin (100 ng/ml) .
Ejemplo 39: Conjugación de fragmento FAB anti TLT-1 (Fab0084) a FVIIa por medio de un ligador 3 kDa PEG, FVIIa-FablOOl .
Etapa 1: ácido N- ( ( 3- (?- ( Fluorenilmetoxicarbonilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil- ?-neuraminico Se disolvió éster de pirrolidin-2, 5-dion-l-ilo del ácido 3- (?- (Fluorenilmetoxicarbonilamino) 3 kDa PEGil) propiónico (adquirido en Rapp Polymere GmbH, 1 g, 0.292 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (80 mi) . Se agregó una solución de sal de disodio de ácido citidin-5' -monofosfo-N-glicilneuraminico (0.276 g, 0.438 mmol) en una solución amortiguadora (20 mi) compuesta de TRIS 50 mM, que se ha ajustado hasta pH 8.9. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El THF se removió in vacuo, que tiene una temperatura de baño de 25°C. La mezcla restante se diluyó con agua hasta 60 mi y se filtró a través de un filtro 0.45 pm. La solución se dividió en tres partes cada una de las cuales se sometió a una cromatogra ía HPLC sobre una columna C4, usando un flujo de 20 ml/min y un gradiente de acetonitrilo al 0-60% en una solución amortiguadora acuosa de carbonato ácido de amonio 50 mM durante 50 min después de que se ha lavado con una solución amortiguadora acuosa de carbonato ácido de amonio 50 mM durante 10 min. Las fracciones se combinaron, que no tienen ácido citidin-5' -monofosfo-N-glicilneuramínico y que tienen una absorción en 214 nm mayor que 15-20% de la absorción máxima. Las fracciones combinadas se secaron por congelación para dar 532 mg de ácido N- ( (3- (?- (fluorenilmetoxicarbonilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-^-neuramínico. El espectro 1H-RMn fue de acuerdo con la expectativa.
Etapa 2: Ácido N- ( (3- (co-Amino3- kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-^-neuraminico Se disolvió ácido N- ( ( 3- (?- ( Fluorenilmetoxicarbonilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-^-neuraminico (532 mg, 0.135 mmol) se disolvió en N,N- dimetilformamida (9 mi). Se agregó piperidina (2.25 mi). La mezcla de reacción se agitó durante 20 min a temperatura ambiente. Se agregó éter (150 mi). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 1 h.
El precipitado formado se aisló por decantación y centrifugación. Se disolvió en diclorometano (10 mi) . Se agregó etildiisopropilamina (2.4 mi). La mezcla se agitó durante 2 min. Se agregó éter (150 mi). La mezcla se dejó durante 1.5 h con objeto de dejar que el precipitado envejezca. El precipitado se aisló por decantación y filtración. Se secó in vacuo con una temperatura de baño de 25°C para dar 343 mg de ácido ?-((3-(?-amino3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-?-neuraminico. El xH-R]yiN fue de acuerdo con la espectativa.
Etapa 3: Ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2-[5' ] citidilil-^-neuramínico (NNC- 0129-0000-3259) Se disolvió N- ( (3- (co-Amino3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil-£-neuraminico (343 mg, 0.009 mmol) en una mezcla de diclorometano (15 mi). Se agregó etildiisopropilamina (0.05 mi, 0.028 mmol). Se agregó éster de 2 , 5-dioxopirrolidini-l-ilo del ácido 3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propiónico (492 mg, 1.85 mmol) como un sólido. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se agregó diclorometano (140 mi) . Se agregó resina de poliestireno aminometilada (comercialmente disponible en por ejemplo Novabiochem, cargada 0.85 mmol/g, 4.3 g, 3.69 mmol) . La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 1 h. La resina se removió por filtración. El solvente se removió in vacuo con una temperatura de baño de 25 °C. Se agregó resina Amberlyst 15 (2 g) . La mezcla de reacción se agitó lentamente durante 20 min. La resina se removió por filtración. El solvente se removió in vacuo con una temperatura de baño de 25°C. El residuo se disolvió en diclorometano (10 mi) . Se agregó éter (200 "mi] . La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 6 h con objeto de dejar que el precipitado formado envejezca. El precipitado se aisló por decantación y centrifugación. Se secó in vacuo para dar 180 mg del compuesto del titulo. El espectro """H-RMN en DMSO-d6 muestra la presencia de un grupo de maleimida.
Etapa 4: Unión de ácido N- ( (3- (?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il) propionilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil- ?-neuraminico a un FAB anti TLT-1 Una solución de un fragmento Fab anti-TLT-l con partes de la región bisagra en donde un Cys impar se incorporó (10 mg) en una solución amortiguadora de fosfato se colocó en el dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. La solución amortiguadora se cargó a una solución amortiguadora compuesta de HEPES 100 mM que se ha ajustado hasta pH 7.3, por ultracentrifugación repetida en 4000 rpm. Después de que la solución amortiguadora se cambió, se obtuvo una solución de la proteina en la solución amortiguadora compuesta de HEPES 100 mM que se ha ajustado hasta pH 7.3, (36 mi) . Se agregó una solución de 1 mg/ml de clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (4 mi). La mezcla de reacción se agitó en 300 rpm a 20°C durante 15 min y se dejó a 20°C durante 45 min. La mezcla de reacción se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación con un corte de 10 kDa. La solución amortiguadora se cargó a una solución amortiguadora compuesta de HEPES 25 mM que se ha ajustado hasta pH 7.0 por ultracentrifugación repetida en 4000 rpm para dar una solución de 13.2 mi. Se agregó una solución de 1 mg/ml de ácido N-((3-(?- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -O2- [5' ] citidilil^-neuramínico (6.4 mi). La mezcla de reacción se agitó suavemente en 300 rpm a 20°C durante 15 min y se dejó a 20°C durante 16 h. Se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa y concentró por ultracentrifugación en 4000 rpm durante 10 min a un volumen < 5 mi. La solución se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superóse 75 16/60 GL (GE Healthcare) a un flujo de 1 ml/min, utilizando una solución amortiguadora compuesta de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se ha ajustado hasta pH 8.00 como eluyente. Las fracciones se agruparon en la base del residuo UV en 280 nm del cromatograma . Se usó en la siguiente etapa el grupo (9.9 mg, 13.7 mi], que contiene el compuesto deseado como se juzga por SDS-PAGE y que estuvo desprovisto de reactivo PEG libre como se juzga por SDS-PAGE utilizando un método de tinción especifico PEG (descrito en Kurfurst, M. M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248. ) .
Etapa 5: Sialidasa inmovilizada. (C. Perfingens tipo VI-A inmovilizado en agarosa, Sigma: N-5254, 0.6-1.8 U/ml gel, 1.52 mi) se lavó con agua (3 x 9 mi) y posteriormente con una solución amortiguadora de HEPES 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween80 al 0.005%, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.5 (3 x 9 mi). Una solución de FVIIa (8.9 mg) en una solución amortiguadora (6.59 mi) compuesta de Gly-Gly 25 mM, CaCl2 10 mM que se ha ajustado hasta pH 6.0 se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. La solución amortiguadora se cargó a una solución amortiguadora de HEPES 20 mM, CaCl2 10 mM, T een80 al 0.005%, NaCl 100 mM, que se ha ajustado hasta pH 7.5 se repite la centrifugación en 4000 rpm para dar un volumen final de 6.5 mi. Esta solución se agregó a la sialidasa inmovilizada. La mezcla de reacción se enrolló a temperatura ambiente durante 3.5 h.
El producto de la unión de ácido ?-((3-(?-(3-(2, 5-dioxo- 2 , 5-dihidropirrol-l-il ) propionilamino) 3 kDa PEGil) propionilamino) acetil) -02- [5' ] citidilil-?-neuramínico a un FAB anti TLT-1 (10 mg) obtenido como se describe en una etapa precedente en una solución amortiguadora (13. 5 mi) que consiste de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se ha ajustado hasta pH 8.00 se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un corte de 10 kDa. Se agregó solución amortiguadora compuesta de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.0. Se aplicó una ultracentrifugación en 4000 rpm durante 2 min. Se agregó otra porción de solución amortiguadora compuesta de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.0. Se aplicó una ultracentrifugación en 4000 rpm durante 10 min. Se agregó el producto de reacción de la reacción con la sialidasa inmovilizada, por filtración para remover la sialidasa inmovilizada. Se agregó otra porción de la solución amortiguadora compuesta de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.0. Se aplicó una ultracentrifugación en 4000 rpm durante 10 min para obtener un volumen total de 9 mi . Se agregó una solución de ST3Gal-III (500 µ?) . La mezcla de reacción se agitó suavemente a 32 °C durante 15 min y a partir de entonces se dejó a 32 °C durante 16 h. Se agregó una solución de 10 mg/ml de ácido CMP-N-acetilneuraminico (CMP NeuNAc, 0.70 mg, 0.89 mi) en una solución amortiguadora de histidina 20 mM, CaCl2 10 mM, glicerol al 20%, Tween 80 al 0.02%, NaCl 500 mM que se ha ajustado hasta pH 6.0. La mezcla de reacción se agitó suavemente en 32 °C durante 15 min y a partir de entonces se dejó a 32 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se sometió a una cromatografía de exclusión de tamaño sobre una columna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare) con un flujo de 2 ml/min utilizando una solución amortiguadora de Histidina 10 mM, CaCl2 10 mM, 0.01% Tween 80, 200 mM NaCI que se ha ajustado hasta pH 6 como eluyente. Se agruparon las fracciones que contienen el producto deseado como se juzga por SDS-PAGE sobre un gel de TRIS-Acetato . Usando una absorción molar de 12.86 en 280 nm sobre un aparato Nandrop®, se encontró un rendimiento de 3.2 mg. El resultado de un análisis SDS-PAGE fue de acuerdo con la evaporación para el producto deseado.
Ejemplo 40: Conjugación de fragmento FAB anti TLT-1 (Fab0084) a FVIIa 407C por medio de un ligador 3 kDa PE6, FVIIa- Fab9015. mezcló FVIIa 407C (5 mg, 0.55 mg/ml, 9 mi) en HEPES 20m , NaCl lOOmM, CaCl2 lOmM, pH 7.0 con soluciones de glutationa (reducida, 40 mM, 125 microlitros , en solución amortiguadora Hepes), glutationa (oxidada, 1.6 mM, 125 microlitros, en solución amortiguadora Hepes), para-aminobenzamidina (0.5 M, 500 microlitros, en solución amortiguadora Hepes), y glutaredoxina (Grx2, EC 1.20.4.1, 96 micromolar, 200 microlitro) . El volumen se ajustó hasta 10.0 mi, pH fue 7.0.
La mezcla resultante se incubó a 32 grados Celsius durante 5 h.
Se agregó EDTA en agua (800 microlitros, 0.25 M, pH 7.0). La solución se diluyó con agua desalada hasta que la conductividad se redujo hasta 8.3 mS/cm.(20 mi).
La solución se inyectó sobre una columna HiTrap Q FF pre-acondicionada (preacondicionada en solución amortiguadora A, 5 mi de volumen de columna) .
Solución amortiguadora A: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 Solución amortiguadora B: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Akta. La proteína se eluyó con solución amortiguadora B (10 CV) en 2 ml/min. La elución de la proteína de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Se agruparon siete fracciones. La concentración de la proteina en el grupo combinado se estimó para ser 0.49 mg/ml (abs. 280 nm) , volumen 7.5 mi, 3.8 mg FVIIa (77.6 nmol ) .
Se agregó una solución del ligador de polietilen glicol de bis-maleimida (3 kDa, Rapp Polymere Gmbh, Tubingen, Alemania, prod. no. 11300-45, lote no. 1210.764, 70 mg, 23 micromol) en HEPES 20mM, NaCl lOOmM, CaCl2 10mM, pH 7.0 (3.5 mi) . La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1 h.
Una solución de EDTA en agua (250 mM, 900 microlitros) se agregó a la mezcla. El pH se ajustó hasta 7.0. La mezcla resultante se diluyó con agua hasta que la conductividad fue 8.3 mS/cm alcanzando un volumen de 17 mi.
La solución se inyectó sobre una columna HiTrap Q FF preacondicionada (preacondicionada en Solución amortiguadora A, 5 mi de volumen de columna) .
Solución amortiguadora A: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 Solución amortiguadora B: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 de purificador Akta. La proteína se eluyó con solución amortiguadora B (10 CV) en 2 ml/min. La elución de la proteina de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Las fracciones de interés se agruparon resultando en un volumen total de 12 mi. La concentración de la proteina se midió (Abs. at 280 nm) hasta 0.30 mg/ml, 3.6 mg de proteina en total. Una solución de fragmento de anticuerpo, proteina Fab ID 0084 (6.7 mg,- 3.21 mg/ml) en solución amortiguadora Hepes (HEPES 20 mM, CaCl2 1.0 mM, NaCl 100 mM, Tween-80 al 0.005% (v/v) , pH 7.5) se mezcló con una solución de sal de sodio de hidrato de tris (3-sulfonatofenil) fosfina (techn. grade puro al 85%, 10 mg/ml, 5 mi, misma solución amortiguadora) . La mezcla resultante se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se colocó en un dispositivo de filtro Amicon Ultracentrifugal (Millipore corp., MWCO 10 kDa) y la solución amortiguadora se intercambió por adiciones repetitivas de solución amortiguadora (HEPES 20 mM, CaCl2 1.0 mM, NaCl 100 mM, 0.005% (v/v) Tween-80, pH 7.5) seguido por centrifugación .
La muestra intercambiada de solución amortiguadora del fragmento de anticuerpo se mezcló con la muestra FVIIa conjugada por el ligador y la solución resultante se intercambió por solución amortiguadora en una solución amortiguadora (Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 35 mM, benzamidina 50 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.5) y 1 posteriormente se concentró hasta 7 mi . La mezcla se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla resultante se analizó usando electroforesis en gel SDS-PAGE.
Se agregó agua (8.5 mi), solución EDTA (5.5 mi, 0.25 M) , e hidróxido de sodio (1 M) a la mezcla hasta que el pH fue 7.2 y la conductividad medida hasta 11.0 mS/cm, volumen total: 21ml.
La solución se inyectó sobre una columna HiTrap Q FF pre-acondicionada (preacondicionada en Solución amortiguadora A, volumen de columna de 5 mi) .
Solución amortiguadora A: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 Solución amortiguadora B: Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween-80 al 0.01%, pH 7.0 La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Ákta. La proteína se eluyó con solución amortiguadora B (10 CV) en 2 ml/min. Las fracciones seleccionadas se concentraron en un dispositivo de filtro Amicon Ultracentrifugal (Millipore corp., MWCO 10 kDa) y la solución amortiguadora se intercambió por adiciones repetitivas de solución amortiguadora (HEPES 20 mM, CaCl2 1.0 mM, NaCl 100 mM, Tween-80 al 0.005% (v/v) , pH 7.5) seguido por centrifugación. La muestra concentrada (5 mi) se inyectó sobre una columna Superdex Hiload 16/60 preacondicionada (GE Healthcare, pre-acondicionada en la solución amortiguadora aplicada) .
Solución amortiguadora: L-Histidina 10 mM, CaCl2 10 mM, NaCl 100mM, Tween80 al 0.01%, pH 6.0 La proteina se purificó por elución en un flujo de 0.8 ml/min durante 2 CV.
Las fracciones se seleccionaron con base en el análisis por electroforesis de gel SDS PAGE (acetato de Bis-Tris al 4-12%, solución amortiguadora corrida por MES) .
El grupo de fracciones seleccionadas se concentró usando un dispositivo de filtro Amicon Ultracentrifugal ( illipore corp., M CO 10 kDa) a un volumen total: 2.25ml. La cantidad de proteina se midió (abs. 280 nm) para ser 1.2 mg (conjugado de proteina) .
El análisis por electroforesis en gel de SDS PAGE (acetato de Bis-Tris al 4-12%) y (HPC4) Western Blotting contra 1. Anticuerpo primario - ProteinaC-etiqueta (HPC4) pAb, Conejo, cot no: A00637 (40 ug) . se disolvió en 80 ul de agua milliQ para concéntración de 0.5mg/ml. Diluido 1:1000 durante la inmunotransferencia . 2. Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra secundario (HyL) (HRP) , pAb, cat. No A00098, Lote No 11B000259. Diluido 1:1000 durante la inmunotransferencia .
Ejemplo 41: Síntesis de ácido 2- [2- [4- [2- (3-hidroxi-6-oxo- xanten-9-il) benzoil]piperazin-l-il] -2-oxo-etoxi] acético .
Se suspendió 6-hidroxi-9- [2- (piperazin-4-io-l-carbonil) fenil ] xanten-3-ona (preparado como se describe en Chang et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129, 8400) en una mezcla de bicarbonato de sodio ac. saturado (50 mi) y tetrahidrofurano (50 mi) . La mezcla se agitó durante 10 minutos. Se agrega anhídrido diglicólico. Después de 3 h, se agregó anhídrido diglicólico adicional (500 mg) . La mezcla se agita durante 20 h. La mezcla se hizo ácida con ácido clorhídrico fumante hasta pH 1. Se agregaron diclorometano (100 mi) y ácido clorhídrico (1 M, 100 mi). Se agregó salmuera (100 mi) y cloruro de sodio sólido. Se observó una cantidad masiva de sólido. El sólido se aisló por filtración, lavó con agua, y secó bajo vacio durante varios días. LC-MS: 517.1641 [M+H]+.
Ejemplo 42 : Síntesis del derivado de ácido neuraminico de monofosfato de citidilo fluorescente, ácido (2R, 5R, 6R) -2-[ [ (2R, 3S, 4R, 5R) -5- (4-amino-2-oxo-pirimidin-l-il) -3, 4-dihidroxi-tetrahidrofuran-2-il]metoxi-hidroxi-fosforil] oxi-4-hidroxi-5- [ [2- [ [5- [2- [2- [ [2- [2- [4- [2- (3-hidroxi-6-oxo-xanten-9-il)benzoil]piperazin-l-il] -2-oxo-etoxi] acetil] amino] etildisulfañil] etilamino] -5-oxo-pentanoil] amino] acetil] amino] -6- [ (2R) -1,2,3-trihidroxipropil] tetrahidropiran-2-carboxílico .
Se disolvió diclorhidrato de cistamina en NaOH 1 M (ac), 50 mi. La solución se extrajo con DCM (5x30 mi). Las fases org. combinadas se secaron (Na2S04) , filtraron, y concentraron in vacuo.
La diamina se disolvió en acetonitrilo (30 mi) . Una solución se agregó gota a gota de solución de anhídrido en acetonitrilo (30 mi) a la solución. La mezcla resultante se agitó durante 15 minutos. El sólido formado se permitió para fijarse durante 1 h. El solvente se decantó completamente.
Se mezclaron ácido .2- [2- [4- [2- ( 3-hidroxi-6-oxo-xanten-9-il) benzoil]piperazin-l-il] -2-oxo-etoxi] acético, . Oxima, y DIC en DMF (25 mi) . La mezcla se agitó durante 1 h.
El aminoácido formado se disolvió en bicarbonato de sodio ac. saturado (25 mi) . La mezcla resultante se agitó durante la noche. Se agregaron DCM (50 mi) e hidróxido de sodio ac. (50 mi) . Las fases se separaron. La fase orgánica se extrajo con hidróxido de sodio ac. (3x50 mi) . los extractos acuosos combinados se hicieron ácidos por adición de ácido clorhídrico (fumante) que provoca precipitación extensiva. La mezcla se filtró. La mezcla espesa aislada se volvió a disolver en DMF y concentró in vacuo.
El compuesto aislado crudo y Oxima se disolvieron en DMF (20 mi). Se agregó DIC (1.5 mi). La mezcla se agitó durante 2 h. Se agregó una solución de GSC en bicarbonato de sodio ac. saturado (10 mi) . La mezcla se agitó durante la noche. Se agregó DCM (50 mi) . Las fases se separaron. La fase org. Se extrajo con bicarbonato de sodio ac. saturado (2x5 mi) . Las fases acuosas combinadas se purificaron usando HPLC de fase inversa (MeCN al 0-50% en agua, NH4HC03 50 mM, columna de 5 cm) . LC-MS: 688.6752 [M+H]2+. HPLC analítico y LC-MS indicando que el compuesto no fue puro. Fue, sin embargo, usado como es.
Ejemplo 43: Conjugación de fragmento FAB anti TLT-1 (Fab0084) para FVIII, FVIII- Fab0247 Fab anti TLT-1 (0084) por medio de Cys Factor VIII BDD Ser750 El factor VIII eliminado del dominio B (turoctocoq alpha, Novo Nordisk A/S, 1.92 mi, 4.2 mg/ml) en solución amortiguadora de imidazol (Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 150 mM, glicerol 1 M, pH 7,3) y sialidasa (sialidasa Arthrobactor Ureafaciens, recombinante, 3.2 U) se mezclaron y dejaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La muestra se diluyó hasta 25 mi con solución amortiguadora.
La solución se inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (pre-acondicionada en Solución amortiguadora A, volumen de columna de 5 mi) .
Solución amortiguadora A: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, 1M glicerol, pH 7,3 Solución amortiguadora B: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 1M, glicerol 1 M, pH 7.3.
La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Ákta . La proteina se eluyó con un gradiente de solución amortiguadora B (2 CV eq + 5 lavados de muestra sin enlace + 2 CV 0-20% de B + 10 CV 20% de B + 10 CV 100% de B) en 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
El ?,?-asialo BDD-FVIII aislado (0.98mg/ml, 5 mg) se mezcló con derivado de ácido neuramínico de monofosfato de citidilo fluorescente y sialiltransferasa recombinante (His-ST3Gall). La mezcla resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
La muestra se diluyó a 40ml con solución amortiguadora A: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, T een 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3.
La solución se inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (pre-acondicionada en Solución amortiguadora A, volumen de columna de 5 mi) .
Solución amortiguadora A: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3.
Solución amortiguadora B: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 1M, glicerol 1 M, pH 7.3.
La ^proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Ákta. La proteína se eluyó con un gradiente de solución amortiguadora B (2 CV eq + 5 lavados de la muestra sin enlace + 2 CV 0-20% de B + 10 CV 20% de B + 10 CV 100% de' B) en 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon e incubaron con ácido N-acetilneuramínico de citidilmonofosfato y sialiltranferasa (ST3GalIII) durante 30 minutos. La mezcla se diluyó a 35 mi con solución amortiguadora A.
La solución se inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (pre-acondicionada en Solución amortiguadora A, volumen de columna de 5 mi) .
Solución amortiguadora A: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3.
Solución amortiguadora B: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 1M, glicerol 1 M, pH 7.3.
La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Akta. La proteina se eluyó con un gradiente de solución amortiguadora B (2 CV eq + 5 lavado de muestra sin enlace + 2 CV 0-20% de B + 10 CV 20% de B + 10 CV 100% de B) en 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y evaluaron por electroforesis en gel de SDS PAGE (acetato de Bis-Tris al 4-12%, reducido y no reducido) .
Las fracciones aisladas se mezclaron con solución amortiguadora (15 mi) que contienen tris (carboxietil) fosfina, TCEP (Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25 mM, glicerol 1M, pH 7.3, TCEP 0.7 mM) . La mezcla resultante se incubó durante 20 minutos. La solución se inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (5/50 GL, preacondicionada en Solución amortiguadora A con TCEP) .
Solución amortiguadora Al: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3, 0.7 mM TCEP) .
Solución amortiguadora A2 : Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3).
Solución amortiguadora Bl: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 1 M, glicerol 1 , pH 7.3). 10 CV eq i Al, 5 lavados de muestra sin enlace i Al, 30CV en 100% de Al, 10 CV en 100% de A2, 15 CV 100% de Bl La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora Al (45 CV) seguido por Solución amortiguadora A2 (10 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Akta. La proteína se eluyó con solución amortiguadora B (15 CV 100% de B) en 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y analizaron por SDS-PAGE (Tris-acetato) .
El compuesto del factor VIII aislado se diluyó con Solución amortiguadora A e inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (5/50 GL, pre-acondicionada en Solución amortiguadora A) .
Un flujo de Solución amortiguadora A que contiene BM(PEG)2 4.8mM (1, 8-Bismaleimidodietilenglicol, Pierce/Thermo scientific) se mantuvo durante 100 minutos. La proteína se lavó y eluyó usando el siguiente protocol: 10 CV Al, 25CV en solución amortiguadora A2 (bismaleimida) en 0.25ml/min ( lOOmin) , 10CV solución amortiguadora Al, 10CV 100% de Bl.
El fragmento de anticuerpo anti-TLT-1, 0084, fue solución amortiguadora intercambiada usando un dispositivo de filtro Amicon Ultracentrifugal M CO 30kDa en HEPES solución amortiguadora (HEPES 20mM + CaCl2 lmM, NaCl lOOmM + Tween80 al 0.005%, pH: 7.50). La concentración medida para ser: 3.4 mg/ml, 2mg) : sal de sodio de hidrato de Tris ( 3-sulfonatofenil ) fosfina (Alfa Aesar, grado técnico 85%) se agregó a una concentración resultante de 12.5 mM. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. El fragmento de anticuerpo fue solución amortiguadora intercambiada usando un dispositivo de filtro Amicon Ultracentrifugal MWCO 30kDa en solución amortiguadora de imidazol (Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3).
Las soluciones del factor VIII y fragmento de anticuerpo se mezclaron y concentraron hasta 2 mi. La solución resultante se incubó durante la noche a temperatura ambiente.
La solución se inyectó en una columna monoQ pre-acondicionada (pre-acondicionada en Solución amortiguadora A, volumen de columna de 5 mi) .
Solución amortiguadora A: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0.02%, NaCl 25mM, glicerol 1M, pH 7.3.
Solución amortiguadora B: Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al- 0.02%, NaCl 1M, glicerol 1 M, pH 7.3.
La proteina inmovilizada se lavó con Solución amortiguadora A (5 CV) usando una estación de cromatografía 100 del purificador Akta. La proteina se eluyó con un gradiente de solución amortiguadora B (2 CV eq + 5 lavados de muestra sin enlace + 2 CV 0-20% de B + 10 CV 20% de B + 10 CV 100% de B) en 1 ml/min. La elución de la proteina de interés se hizo al monitorear la absorbancia en 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y concentraron. La proteina se inyectó en una columna Superdex 200 16/60 PG pre-acondicionada (pre-acondicionada en Solución amortiguadora A) .
Solución amortiguadora A: Histidina (1.5g, 1.5 mg/ml), CaC12 * H20 (376 mg, 0.37mg/ml) , NaCl (18g, 18 mg/ml), Sacarosa (3g, 3 mg/ml), Tween 80 (lOOmg, O.lmg/ml), Diluido hasta 1000 mi con MQ, ajuste hasta pH 7.0.
Las fracciones se seleccionaron con base en análisis por SDS-PAGE y Western blotting anti-HPC4.
Ejemplo 44: Conjugación de fragmento FAB anti TLT-1 (Fab0084) para FIX.
IX ligado por medio de glicano Se mezclan el factor IX (50 microlitros) , Sialiltransferasas 3 (10 microlitros), derivado de ácido neuraminico de monofosfato de citidilo fluorescente; punta de una espátula). La mezcla se incuba a 32° Celsius durante 24 horas .
Las concentraciones finales son: Factor IX: 0.33 mg/ml, ST3Gal3: 0.08 mg/ml Analizado por SDS-PAGE (respons de fluorescencia y azul coomassie teñido) .
Se conjugan el factor IX y un fragmento de anticuerpo usando los métodos descritos en la presente, esto es, reducción mediada por una fosfina o glutationa, acoplamiento a una entidad ligadora, y conjugación seguida por la purificación y análisis.
Ejemplo 45: FVIIa-Fab9015 es superior a rFVIIa al reducir el sangrado de la cola en ratones hemofilicos transitorios.
Los ratones con genes inactivados/genes activados (KOKI) TLT-1 humanizados se hicieron hemofilicos transitoriamente por la administración de un anticuerpo FVIII monoclonal. Cinco minutos antes de la inducción del sangrado de la cola, los ratones se pre-trataron con 20, 5 o 0.8 nmol/kg de FVIIa-Fab9015 (3.625 ml/kg) , 20 nmol/kg de rFVIIa o vehículo. Se indujo sangrado de la cola por transección de 4 mm de la punta de la cola, y el sangrado resultante se observó durante 30 minutos. Se obtuvieron cuentas de plaquetas inicialmente y 30, 60 y 120 minutos después de la inducción del sangrado de la cola.
Con objeto de ser capaces de mostrar superioridad de FVIIa-Fab9015, usamos una dosis de rFVIIa (20 nmol/kg ~ 1 mg/kg) que no se esperaba que tuviera un efecto importante en el sangrado.
La pérdida de sangre reducida dependiente de las dosis TLT-l-FAb-FVIIa y el tiempo de sangrado, alcanzan importancia estadística en 20 y 5 nmol/kg. Por lo tanto 20 nmol/kg de FVIIa-Fab9015 fue significativamente más eficaz comparada con 20 nmol/kg de rFVIIa (Figura 15) .
Significativamente sin cambios en el conteo de plaquetas se observó dentro de 2 horas del tratamiento en cualquiera de los grupos de tratamiento (Figura 16) .
En Conclusión, FVIIa-Fab9015 fue superior a rFVIIa al reducir el sangrado de la cola hemofilica en ratones KOKI TLT-l. No se observaron señales de efectos adversos, por ejemplo disminución en cuentas de plaquetas.
Ejemplo 46: Aumento de la generación de trombina por localización de rFVIIa a la superficie de plaquetas activadas a través de enlace a TLT-l expresado en la superficie bajo condiciones tipo hemofilia A.
Se probó FVIIa-Fab9015 en una generación de ensayo de trombina. En breve, el plasma rico en plaquetas humanas (PRP) obtenido por centrifugación de sangre entera humana citrada en 220g durante 20 min. La fase superior que contiene plaquetas se recolectó y la muestra restante se centrifugó en 2500g durante 10 min para obtener plasma pobre en plaqueta (PPP) usada para ajustar la concentración de plaqueta para usarse en una concentration . final de 150000 plts/µ?. El PRP se hizo hemofilico por 30 min de incubación con un anticuerpo policlonal FVIII anti-humano de oveja (0.1 mg/ml) (HTI #Z0429) . Las plaquetas se activaron con ya sea péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem #1-1-2936) o una combinación del péptido y el veneno de víbora activado por GPVI Convulxin (Pentapharm # 119-02) . Se midió la trombina generada usando un método fluorogénico de Trombinaoscope®. Se mezclaron compuesto y reactivo PRP, FluCa y se agregaron a placas de pozo profundo redondo Nunc Microwell de 96 pozos. La reacción se inició por la adición del activador de plaqueta y la señal fluorescente del sustrato se detectó en un lector de placa ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific) . La concentración de trombina se calculó usando un calibrador de Trombina proporcionado por Trombinaoscope de acuerdo con sus instrucciones.
Los resultados muestran una potencia incrementada de FVIIa-Fab9015 comparado con rFVIIa (Figura 17A) . Adicionalmente los resultados revelan que este incremento en potencia fue dependiente de la etapa de activación de las plaquetas. La Figura 18 muestra la capacidad incrementada de generación de trombina cuando las plaquetas se activaron con SFLLRN (10 µ?) y que el potencial completo se alcanzó cuando las plaquetas se activaron con una combinación de SFLLRN (30µ ) y Convulxin (100ng/ml) . Cuando se activan las plaquetas con esta combinación de activadores FVIIa-Fab9015 muestra aproximadamente una potencia incrementada cuatro veces, medida como generación de trombina pico, comparada con rFVIIa en las dos concentraciones probadas (5 y 25 nM) (Figuras 17A y 17B, respectivamente) . Este incremento en capacidad de generación de trombina fue completamente dependiente sobre FVIIa-Fab9015 enlazado a TLT-1 en la superficie de la plaqueta activada ya qué la pre-incubación con TLT-1 completamente soluble invierte el aumento (Figura 19) .
Ejemplo 47 : Aumento de generación de trombina por localización de rFIX para la superficie de plaquetas activadas a través de enlace a TLT-1 expresado en la superficie bajo condiciones tipo hemofilia B.
Se probó FIX-Fab0155 en un ensayo de generación de trombina y comparado con rFIX (Benefix (R) ) . Se aislaron plaquetas humanas de sangre entera estabilizada por citrato fresco. Se agregó una parte de la solución de ACD (citrato de tri-sodio al 2.5%, ácido cítrico al 1.5% y D-glucosa al 2%) a cinco partes de sangre antes de la centrifugación en 220g durante 20 min para obtener plasma rico en plaquetas. La fase superior se recolectó y transfirió a un nuevo tubo en forma de cono y giró en 500g durante 15 min. El plasma se removió y el pletizado se disolvió en Hepes-solución amortiguadora (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KC1 2.7 mM, MgCl2 1.7 mM, D-glucosa 5 mM, NaH2P04 0.4 mM; pH 6.5) complementado con prostaglandina El (5 pg/ml) . Después de una segunda centrifugación en 500g durante 15 min el sobrenadante se descartó y las plaquetas lavadas se disolvieron en plasma deficiente del factor IX (Geroge King Bio-medical, Inc.) y la concentración de la plaqueta se ajustó hasta 300000 plts/µ?. En el ensayo de generación de trombina cuando se agregaron agonistas, variantes del factor IX y reactivo FluCa (Trombinaoscope®) a placas de pozo inferior rondo Nunc Microwell de 96 pozos junto con el plasma deficiente del factor IX que contiene plaquetas la concentración de plaqueta final fue 150000 plts/µ?. Las plaquetas se activaron con una combinación de péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem #1-1-2936) y el veneno de víbora activado por GPVI Convulxin (Pentapharm # 119-02) . La trombina generada se midió por un método fluorogénico de Trombinaoscope® en el cual la señal fluorescente del sustrato de escisión por trombina se detectó en un lector de placa ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific) . La concentración de trombina se calculó usando un calibrador de trombina proporcionado por Trombinaoscope® de acuerdo con sus instrucciones .
Los resultados muestran una potencia incrementada en 1 nM de FIX-Fab0155 comparado con rFIX (Figura 20) cuando las plaquetas se activaron con una combinación de SFLLRN (30µ?) y Convulxin (100ng/ml) . Adicionalmente los resultados revelan que este incremento en potencia fue dependiente de la expresión de TLT-1 sobre las plaquetas ya que TLT-1 soluble (100 nM) antagoniza el efecto potenciado.
Ejemplo 48 : Purificación y caracterización de FVIIa tipo natural (SEQ ID NO: 156), FVIIa 407C (SEQ ID NO: 181) y FVIIa-Fab5001 (SEQ ID NO: 180) .
La purificación de proteínas FVIIa se condujo usando un método de cromatografía de afinidad de captura con base en la resina FlA2-Sefarosa 4B anti-FVIIa, que es una resina (gel de afinidad base de GE Healthcare) con un anticuerpo acoplado, desarrollado en Novo Nordisk, que enlaza específicamente el dominio FVIIa Gla (para detalles ver referencia Jurlander B, Thim L, Klausen NK, Persson E, Kjalke M, Rexen P, Jorgensen TB, Ostergaard PB, Erhardtsen E, Bjorn SE (2001) Recombinant activated factor VII (rFVIIa) : characterization, manufacturing, and clinical development. Semin Thromb Hemost. 27: 373-84) . La purificación se condujo usando un sistema de cromatografía ' AktaExplorer (GE Healthcare, cat . no. 18-1112-41) . Los sistemas de solución amortiguadora usados para la etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Histidina 10 m , pH -6.0, CaCl2 5 mM, NaCl 25 mM y Tween-80 al 0.01% (v/v) , una solución amortiguadora de lavado compuesta de Histidina 10 mM, pH 6.0, CaCl2 5 mM, NaCl 1.0 M y Tween-80 al 0.01% (v/v) , y una solución amortiguadora de elución compuesta de Histidina 50 mM, pH 6.0, EDTA 15 mM. Los sobrenadantes celulares se ajustaron con concentración final de CaCl2 5 mM y aplicada dentro de una columna anti-HPC4 pre-equilibrada . La columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio, 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado y después con 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio. Las proteínas FVIIa se eluyeron de forma isocrática en aproximadamente 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución.
Las purificaciones adicionales de captura se eluyen con purezas bajas de las variantes FVIIa (< 90% con base sobre un método SEC-HPLC ajustado sobre un sistema Agilent 1100/2100 y usando una columna TSK G3000S XL (From Tosho) y una solución amortiguadora de corrida PBS) se condujeron usando 1) una cromatografía de intercambio de aniones (AIEC, por sus siglas en inglés) con base en una resina Poros HQ50 (de Applied Biosystems) y 2) filtraciones de gel preparativas usando columnas Superdex200 pre-empacadas (de GE Healthcare) .
Los sistemas de solución amortiguadora usados para la etapa de purificación AIEC fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de HEPES 10 mM, pH 5.9 y NaCl 150 mM, una solución amortiguadora de lavado compuesta de HEPES 10 mM, pH 5.9 y NaCl 50 mM, y una solución amortiguadora de elución compuesta de HEPES 10 mM, pH 5.9, 50 NaCl y CaCl2 30 mM. El eluido de captura se diluyó 1:6 (v:v) antes se aplicó dentro de una columna Poros HQ50 pre-equilibrada . La columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio y 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado antes de eluir las proteínas FVIIa de forma isocrática en aproximadamente 2-5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución.
Los sistemas de solución amortiguadora usados para las etapas de filtración de gel fueron una solución amortiguadora de corrida compuesta de Histidina 10 mM, pH 6.0, CaCl2 10 mM, NaCl 100 mM y Tween 80 al 0.01%. Las proteínas FVIIa se recolectaron como picos simétricos en aprox 0.02-0.08 volúmenes de columna.
Las activaciones de las preparaciones FVIIa purificadas se condujeron usando una resina compuesta de FXa derivado de plasma ¦ (de Enzima Research Lab.) acoplada a perla CNBr-Sepharose 4 FF acoplada (de GE Healthcare) .
Las proteínas FVIIa se analizaron usando SDS-PAGE/Coomassie y las determinaciones de masa molecular intactas se realizaron usando una método de Espectrometría de Masa de Tiempo de Vuelo de Ionización de Electrorocío de Cromatografía Líquida ajustado en un instrumento Agilent 6210 y una columna desalada MassPREP (de Waters) con una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de ácido fórmico al 0.1% en LC-MS H20 graduado y una solución amortiguadora de elución compuesta de ácido fórmico al' 0.1% en LC-MS ACN graduado. Todas las variantes FVIIa y de tipo natural purificadas exhiben masas moleculares intactas de ~50 kDa. Con base en los análisis LC-MS y SDS-PAGE/Coomassie de masa intacta y usando condiciones reductivas, se realizaron las identificaciones de cadena de fusión FVIIa-Fab5001.
Con base en los análisis SEC-HPLC, todas las preparaciones FVIIa exhiben una pureza de >90- 99% y parecen altamente homogéneas.
Ejemplo 49: Autoactivacion de FVII-Fab5001 usando un ensayo proteolitico en presencia del Factor de Tejido soluble.
La autoactivation se determinó como la capacidad para activar FX en presencia del Factor de Tejido soluble (sTF) . La proteina se diluyó en Hepes 50 mM (pH 7.4), NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, 1 mg/mL de BSA, y PEG8000 al 0.1% (p/v) . Los parámetros cinéticos para la activación FX se determinaron al incubar previamente 5 pM del FVII-Fab5001 (n=2) con sTF 100 nM y 25 µ? de fosfolípidos PO:PS (Haematologic technologies ) durante ' 10 min. Luego se agregó FX 30 nM en un volumen de reacción total de 100 pL en una placa de 96 pozos y la reacción se permitió incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción se apagó al agregar solución amortiguadora de paro 50 pL (Hepes 50 mM (pH 7.4), NaCl 100 mM, EDTA 80 mM) seguido por la adición de 50 pL de S-2765 2 mM. Finalmente, el incremento de absorbancia se midió continuamente en 405 nM en un lector de microplaca Spectramax 190. Los valores kcat/Km se determinaron al fijar los datos a una forma revisada de la ecuación Michaelis Menten ([S] < Km) usando regresión lineal. La cantidad de FXa generada se estimó de una curva estándar FXa.
La proteina de fusión de zimógeno FVII-Fab5001 muestra actividad proteolitica al la relativa a aquella de tnFVIIa, siendo un resultado de autoactivación de la proteina en presencia de sTF, ver Figura 21) .
Ejemplo 50: Carencia de efecto anti-agregatorio de anticuerpos anti-TLT-1, mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062.
El efecto anti-agregatorio de anticuerpos anti-TLT-1 se probó en plasma rico en plaquetas humanas (PRP) . El PRP se obtuvo por una centrifugación de 200g durante 15 min de sangre entera humana estabilizada por heparina. La fase superior que contiene plaquetas se recolectó y la muestra restante se centrifugó en 1500g durante 10 min para obtener plasma pobre en plaqueta (PPP) que se usó como una muestra de referencia en las mediciones de agregación. El PRP se incubó 3 min a 37 °C en el Instrumento de Perfil de Agregación de Plaquetas (???-8) (Bio/Data Corporation, Horsham, PA) . Una linea base estable se registró antes de la adición de anticuerpos anti-TLT-1 (10 nM) o anticuerpo de control irrelevante (10 nM) para el PRP. Las plaquetas se activaron 3 min después de la adición de los anticuerpos con péptido SFLLRN activado por el receptor-1 activado por proteasa (PAR-1) (1 o 10 µ?) (Bachem) .
Los resultados no muestran efecto inhibidor de los anticuerpos (10 nM) (mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062) comparados con el anticuerpo de control irrelevante. La agregación de plaquetas se inició con ya sea una concentración alta (10 µ?) o una intermedia (1 µ?) de SFLLRN. Los datos muestran que los anticuerpos no inhiben la agregación en ninguna de las concentraciones SFLLRN. En conclusión, estos datos muestran que los anticuerpos no inducen ni inhiben la función de la plaqueta medida como agregación.
Ejemplo 51. Efecto de FIX-mAb0145 en la formación de coágulo de fibrina inducido por TF en sangre entera humana (HWB) de un donador normal medido por tromboelastografia (TEG) .
La sangre entera humana estabilizada citrada (HWB) se saca de donadores normales. Las afecciones tipo hemofilia se obtienen por incubación de HWB con 10 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII (Factor VIII anti-humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) por 30 min a temperatura ambiente. La formación de coágulo es medida por tromboelastografia (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EUA) . Varias concentraciones (0; 0.2; 1.0; 5.0 y 10 nM) de FIX-mAb0145 o (0; 0.2; 5.0 y 10 nM) de rFIX (Novo Nordisk A/S) se agregan a HWB citrado "tipo hemofilia". El coagulación se inicia cuando 340 µ? de HWB normal o "tipo hemofilia" se transfiere a un vaso trombelastografo que contiene 20 µ? de CaCl2 0.2 M con 0.03 pM de TF lipidado (Innovin®, Dade Behring GmbH (Marburg, Alemania) . Los residuos TEG se siguen continuamente por hasta 120 min. Las siguientes variables TEG se registran: Tiempo R (se obtuvo tiempo de coagulación es decir el tiempo desde el inicio de la coagulación hasta una amplitud de 2 mm) , ángulo OÍ (desarrollo del coágulo medido como el ángulo entre el valor R y el punto de inflexión de los residuos TEG) , K (velocidad de cinéticos de coágulo para alcanzar un cierto nivel de fuerza del coágulo, amplitud = 20 mm) , y MA (amplitud máxima de los residuos TEG refleja la resistencia mecánica máxima del coágulo) . La Figura 23 muestra los valores del Tiempo R determinados de desechos TEG individuales.
El Tiempo R obtenido de los residuos TEG con HWB normal y sangre de "hemofilia" complementado con varias concentraciones de FIX-mAb0145 o rFIX se muestran en la Figura 23. El HWB de un donador normal muestra un Tiempo R de 980 seg gue se prolongó hasta 5475 seg cuando la sangre se hizo "tipo hemofilia" por la adición de un anticuerpo neutralizante FVIII. La coagulación del tiempo R acortado FIX-mAb0145 en una manera dependiente de la concentración en contraste a rFIX que estuvo sin un efecto importante cuando se agrega como un control en concentraciones equivalentes. Todos los datos se obtienen de un donador representativo.
Se observa FIX-mAbOl 45 para normalizar la coagulación de "HWB tipo hemofilia" en una manera dependiente de la concentración. De esta manera sorpresivamente los resultados muestran que la conjugación de rFIX a un anticuerpo contra TLT-1, que dirige rFIX a la superficie de plaquetas activadas, se proporciona con una actividad de derivación independiente de FVIII resultando en actividad procoagulante mejorada.
Ejemplo 52. Aumento de generación de trombina por localización de rFVIIa a la superficie de plaquetas activadas a través de enlace a superficie expresada TLT-1 bajo afecciones tipo hemofilia A.
Se probaron FVIIa-Fab9015, FVI Ia-Fabl 029 y FVIIa-FablOOl en 25 nM en un ensayo de generación de trombina. En breve, el plasma rico en plaquetas humano (PRP) se obtuvo por centrifugación de sangre entera humana citrada en 220g durante 20 min. La fase superior que contiene plaquetas se recolectó y la muestra restante se centrifugó en 2500g durante 10 min para obtener plasma pobre en plaqueta (PPP) usado para ajustar la concentración de plaqueta a una concentración final de 150000 plts/µ?. El PRP se hizo hemofilico por 30 min de incubación con un anticuerpo policlonal FVIII anti-humano de oveja (0.1 mg/ml) (HTI #Z0429). Las plaquetas se activaron con una combinación de péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (PAR-1) (30 µ?) (SFLLRN; Bachem #H-2936) y el veneno de víbora activado por GPVI Convulxin (100 ng/ml) (Pentapharm # 119-02). La trombina generada se midió usando un método fluorogénico de Trombinaoscope® en el cual PRP, reactivo FluCa y compuesto de prueba se mezclaron y agregaron a placas de pozo profundo redondo Nunc Microwell de 96 pozos (Nunc #268152). La reacción se inició por la adición de activadores de plaqueta y la señal fluorescente del sustrato se detectó en un lector de placa ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific) . La concentración de trombina se calculó usando un calibrador de trombina proporcionado por Trombinaoscope® de acuerdo con sus instrucciones .
Los resultados muestran una potencia incrementada de las tres proteínas, FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fabl029 y FVIIa-FablOOl, comparados con rFVIIa. Las FVIIa-Fab9015 y FVIIa-FablOOl (25 nM) muestran una potencia incrementada aproximadamente cuatro veces mientras que FVI Ia-Fabl029 (25 nM) tiene aproximadamente una potencia incrementada de dos veces medida como generación de trombina pico, comparada con rFVIIa (25 nM) (Figura 24).
Ejemplo 53. Purificación y caracterización de FIX expresado recombinantemente (SEQ ID 161) , FIX-Fab anti-TLT-1 y proteina de fusión Mab (FIX-Fab0155 y FIX-Mab0145) .
La purificación de las proteínas FIX se condujeron usando un método de cromatografía de afinidad de captura con base en la resina A3B6-Sefarosa 4 FF anti-FIX, que es una .resina (gen de afinidad base de GE Healthcare) con un anticuerpo acoplado, desarrollado en Novo Nordisk, que enlaza específicamente al dominio FIX Gla (ver referencia 0stergaard et al. (2011), Blood 118:2333-41). La purificación se condujo usando un sistema de cromatografía AktaExplorer (GE Healthcare, cat . no. 18-1112-41). Los sistemas de solución amortiguadora usados para la etapa de purificación fueron una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de Tris 20 mM, CaCl2 1 mM, NaCl 100 mM, Tween 80 al 0.01% (v/v) pH 7.5, una solución amortiguadora de lavado compuesta de Tris 20 mM, CaCl2 1 mM, NaCl 2.0 M, Tween 80 al 0.01% (v/v) pH 7.5 y una solución amortiguadora de elución compuesta de Tris 20 mM, EDTA 20 mM, NaCl 50 mM, Tween 80 al 0.01% (v/v) pH 7.5. Los sobrenadantes celulares se ajustaron con concentración final CaCl2 5 mM y aplicaron en una columna A3B6-Seph 4 FF pre-equilibrada . La columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio, 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado y después con 5-10 volúmenes de columna de solución amortiguadora de equilibrio. Las proteínas de fusión FIX se eluyeron de forma isocrática en aproximadamente 5 volúmenes de columna de solución amortiguadora de elución.
Las proteínas FIX se analizaron usando SDS-PAGE/Coomassie y determinaciones de masa molecular intactas se realizaron usando un método de Espectrometría de Masa de Tiempo de Vuelo de Ionización de Electrorocío de Cromatografía Líquida ajustada en un instrumento Agilent 6210 y una columna desalada MassPREP (de Waters) con una solución amortiguadora de equilibrio compuesta de ácido fórmico al 0.1% en LC-MS H20 graduado y una solución amortiguadora de elución compuesta de ácido fórmico al 0.1% en LC-MS ACN graduado. Con base en análisis LC-MS y SDS-PAGE/Coomassie de masa intactos usando condiciones reductivas, se realizaron identificaciones de cadena de las proteínas FIX. Con base en los análisis SEC-HPLC, todas las preparaciones de proteína de fusión FIX exhiben una pureza de >85-99% y parecen altamente homogéneas.
Ejemplo 54. Producción de expresión recombinante de FVIIa tipo natural (SEQ ID NO: 157) y FVIIa-407C (SEQ ID NO: 181) .
El FVIIa variante y de tipo natural se produjeron como se describe en la patente 02/077218 y Jurlander et al. (2001), Semin Thromb Hemost. 27: 373-84. Más específicamente, las moléculas FVIIa se expresaron en líneas celulares BHK adherentes. El medio de crecimiento empleado fue una variante media DMEM/F12 con 5 mg/L de vitamina Kl y suero bovino fetal al 10% (2% durante la producción) . Brevemente, las células se propagaron en matraces T-175 ventilados, fábricas celulares de 2 capas y 10 capas incubadas a 37 °C y CO2 al 5%. En confluencia, las células se disociaron usando TrypLE(TM) Express (GIBCO cat. no. 12604-013) antes de pasar a la siguiente etapa. La fase de producción se realizó como un cultivo de lote repetido en un bioreactor de 15 L con microportadores (5 g/L, Cytodex 3, GE Life Sciences) . El pH se controló en un límite superior de 7.2 al agregar C02 y en un límite inferior de 6.8 al agregar Na2C03. Se mantuvo la concentración de oxígeno disuelto arriba de 50% de saturación en aire al por inyección con oxígeno. La temperatura se mantuvo a 36.5°C. La agitación fue en 50-70 rpm. Se realizaron intercambios de cosecha/medios para mantener una concentración glutamina arriba de 1 mM. Una hora antes de un intercambio medio, la agitación se detuvo para permitir los microportadores (con células unidas) para fijarse en el fondo del reactor. A partir de entonces, aproximadamente 80% del volumen se cosechó antes de rellenarse con medio fresco hasta volumen de trabajo al 100%. Las cosechas celulares se retiraron y clarificaron por un tren filtro que consiste de dos filtros de cápsula desechables (3 pm Clarigard, Opticap XL10, Millipore, cat . no. K030A10HH 1; 0.22 pm Durapore, Opticap XL10, Millipore, cat. no. KVGLS10HH 1) antes de la purificación .
Ejemplo 55. Aumento de generación de trombina por localización de rFVIIa a la superficie de plaquetas activadas a través de enlace a la superficie expresada TLT-1 bajo afecciones tipo hemofilia A.
Se probó un FVIIa-Fab5001 en un ensayo de generación de trombina y comparado con rFVIIa en el plasma deficiente del factor VIII que- contiene plaquetas humanas lavadas. Para aislar plaquetas humanas, se agregó una parte de solución ACD (citrato de tri-sodio al 2.5%, ácido cítrico al 1.5% y D-glucosa al 2%) a cinco partes de sangre antes de la centrifugación en 220g durante 20 min para obtener plasma rico en plaquetas. La fase superior se recolectó y transfirió a un nuevo tubo en forma de cono y giró en 500g durante 15 min. El plasma se removió y el peletizado se disolvió en solución amortiguadora Hepes (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KC1 2.7 mM, MgCl2 1.7 mM, D-glucosa 5 mM, NaH2P0 0.4 mM; pH 6.5) complementado con prostaglandina El (5 pg/ml). Después de una segunda centrifugación en 500g durante 15 min el sobrenadante se descartó y las plaquetas lavadas se disolvieron en el plasma deficiente del factor VIII (Geroge King Biomedical, Inc.) y la concentración de plaqueta se ajustó hasta 300000 plts/µ?. En el ensayo de generación de trombina cuando se agregaron agonistas, variantes del factor IX y reactivo FluCa (Trombinaoscope®) a placas de pozo profundo redondo Nunc Microwell de 96 pozos junto con el plasma deficiente del factor IX que contiene plaquetas la concentración de plaquetas finales fue 150000 plts/µ?. Las plaquetas se activaron con una combinación de péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem #1-1-2936) y el veneno de víbora activado por GPVI Convulxin (Pentapharm # 119-02) . La trombina generada se midió por un método fluorogénico de Trombinaoscope® en el cual la señal fluorescente del sustrato de escisión por trombina se detectó en un lector de placa ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific) . La concentración de trombina se calculó usando un calibrador de trombina proporcionado por Trombinaoscope® de acuerdo con sus instrucciones. Los resultados muestran una potencia incrementada del FVIIa-Fab5001 comparado con rFVIIa de tipo natural (Figura 25). Adicionalmente los resultados revelan que este incremento en potencia fue dependiente de activación de plaquetas. Activar las plaquetas con una combinación de SFLLRN (30µ?) y Convulxin (100ng/ml), FVIIa-Fab5001 (25 n ) muestran una potencia incrementada aproximadamente de cuatro veces, medida como generación de trombina pico, comparada con rFVIIa de tipo natural (25 nM) .
Ejemplo 56. Análisis SPR de FVIIa-FablOOl y FVIIa-Fab5001 enlazado a TLTl .
Análisis SPR de FVIIa-FablOOl enlazado a TLTl. El FVIIa-FablOOl enlaza a TLT-1 como se prueba por el análisis SPR en un instrumento Biacore T200.
Los materiales usados se muestran en la Tabla Tabla 18 Método : Un anticuerpo anti 6Xhis se inmovilizó a un nivel de aprox 9000 RU sobre un chip CM5 (0.5 mg/ml diluido en acetato de Na, pH 5.0) usando el procedimiento estándar recomendado por el proveedor. TLTl-etiquetado his humano en una concentración de 100 ng/ml se usó como ligando. Se usó FVIIa-FablOOl en diluciones dos veces de 29.29 nM hasta 0.45 nM como analitos. La solución amortiguadora de corrida y dilución se hizo de: HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, p20 al 0.005%, pH 7. . Se obtuvo la regeneración por MgCl2 3 M. el experimento se corrió a 25°Celsius. La determinación de las constantes cinéticas y de enlace (kon, koff, KD) se obtuvo asumiendo una interacción 1:1 de TLTl y FVIIa-FablOOl usando el software de evaluación Biacore T200 (Tabla 19) . · Tabla 19: FVIIa-FablOOl enlazado a TLT-1 Conclusión : Las constantes de enlace para FVIIa-FablOOl enlazado a TLT-1 se estimaron por análisis SPR y se confirmó el enlace a TLT-1.
Análisis SPR de FVIIa-Fab5001 enlazado a TLTl. El FVIIa- Fab5001 enlaza a TLT-1 como se prueba por el análisis SPR en un instrumento Biacore T200.
Los materiales usados se muestran en la Tabla Tabla 20 Método : Un anticuerpo anti 6Xhis se inmovilizó a un nivel de aprox 9000 RU en un chip CM5 (0.5 mg/ml diluido en acetato de Na, pH 5.0) usando el procedimiento estándar recomendado por el proveedor. El TLT-1 etiquetado his humano en una concentración de 100 ng/ml se usó como ligando. FVIIa- Fab5001 en diluciones dos veces desde 15.77 nM hasta 0.49 nM se usó como analitos. La solución amortiguadora de corrida y dilución se hizo de: HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, p20 0.005%, pH 7.4. Se obtuvo la regeneración por MgCl2 3 M. El experimento se corrió a 25°Celsius. La determinación de constantes cinéticos y de enlace (kon, k0ff, KD) se obtuvo asumiendo una interacción 1:1 de TLT1 y FVII-fab usando el software de evaluación Biacore T200 (Tabla 21) .
Tabla 21: FVIIa-Fab5001 enlazado a TLT-1 Conclusión : Las constantes de enlace para FVIIa-Fab5001 enlazado a TLT-1 se estimaron por análisis SPR y se confirmó el enlace a TLT-1.
Ejemplo 57: Producción recombinante de FVIII humano.
La producción de las variantes del Factor VIII humano como se usa en la presente se ha descrito en el número de patente WO2009108806, ejemplo 1.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .
1. Una proteina procoagulante caracterizada porque comprende (i) al menos un factor de coagulación, enlazado covalentemente a (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que es capaz de enlazar específicamente (iii) TLT-1, y/o un fragmento o variante del mismo.
2. La proteína procoagulante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (i) es una serina proteasa o un derivado del mismo.
3. La proteína procoagulante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque (i) es un polipéptido FVII.
4. La proteína procoagulante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque (i) es un polipéptido FIX.
5. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque (ii) es un fragmento Fab.
6. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91,. G92, P93, Q94, 195 y L96 de SEQ ID NO: 5.
7. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de' de L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de SEQ ID NO: 5.
8. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, 195, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de SEQ ID NO: 5.
9. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de K118, 1119, G120, S121, L122, A123, E124, N 125 y A126, F127 de SEQ ID NO: 6.
10. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de E5, T6, H7, K8 , 19, G10, Sil, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19 y P20 de SEQ ID NO: 7.
11. La proteina procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epitopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste de K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de SEQ ID NO: 2.
12. La proteina procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el epitopo de (ii) comprende K133, 1134, G135, S136, L137, A138, N 140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de SEQ ID NO: 2.
13. La proteina procoagulante de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizada porque la cadena pesada de (ii) comprende: • una secuencia. CDRl de 49 hasta 53 aminoácidos (RYWMT) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR2 de 68 hasta 84 aminoácidos (EINPDSSTINYNPSLKD) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o • una secuencia CDR3 de 117 hasta 121 aminoácidos (GVFTS) de SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden ser sustituidos por un aminoácido diferente; y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: · una secuencia CDRl de 43 hasta 58 aminoácidos (RSSQSLVHRNGNTYFH) de SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o • una secuencia CDR2 de 74 hasta 80 aminoácidos (KVSNRFS) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente; y/o • una secuencia CDR3 de 113 hasta 121 aminoácidos (SQSTHVPYT) de SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido diferente.
14. La proteina procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque es un conjugado de (i) y (ii) .
15. Un proceso para preparar el conjugado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende conjugar químicamente (i), el anticuerpo monoclonal TLT-l o fragmento del mismo, con un grupo reactivo (RS1) de un ligador y hacer reaccionar (ii) , el factor de coagulación, con otro grupo reactivo (RS2) del ligador.
16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque el ligador es un polímero.
17. La proteína procoagulante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para usarse como uno un medicamento.
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