MX2013009472A

MX2013009472A - Metodos para mejorar respuestas inmunitarias especificas de inmunogenos por vacunas vectoriales.

Info

Publication number: MX2013009472A
Application number: MX2013009472A
Authority: MX
Inventors: Thomas W Dubensky Jr; Jared M Odegard; Scott H Robbins
Original assignee: Immune Design Corp
Priority date: 2011-02-15
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2013-10-28
Also published as: EP2675473A1; TW201309799A; WO2012112691A1; IL227796A0; US20120263754A1; JP2014510721A; AU2012217723A1; CA2826920A1; BR112013020875A2; SG192759A1; EA201391183A1

Abstract

En la presente se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria específica en un sujeto mediante la administración al sujeto de una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión recombinante o una partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante, cuyo vector comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un inmunógeno de interés. Los métodos comprenden además administrar una composición adyuvante ya sea simultánea o secuencialmente con la composición inmunogénica.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR RESPUESTAS INMÜNITARIAS ESPECÍFICAS DE INMUNÓGENOS POR VACUNAS VECTORIALES DECLARACIÓN CON RESPECTO AL LISTADO DE SECUENCIAS Esta solicitud contiene, como una parte separada de la descripción, un listado de secuencias en formato legible en computadora (nombre del archivo: 46440A_SeqListing.txt; creado el 14 de febrero de 2012; archivo de texto de 151,611 bytes - ASCII) que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

Antecedentes Campo técnico La presente descripción se refiere generalmente a métodos para mejorar la respuesta inmunitaria especifica a un inmunógeno mediante la administración simultáneá;;' · o secuencial de un adyuvante.

Descripción de la técnica relacionada : ;:: .

El sistema inmunitario de un huésped proporciona el medio para preparar de manera rápida y específica una respuesta de protección a los microorganismos patogénicos y también para contribuir al rechazo de tumores malignos . Generalmente se ha descrito a las respuest s inmunitarias como que incluyen respuestas humorales, en ¾as que los anticuerpos específicos de antígenos se producen por linfocitos B diferenciados, y respuestas mediadas por células, en las que varios tipos de linfocitos T eliminan antígenos por una variedad de mecanismos . Por ejemplo, las células T auxiliares de CD4 (también denominadas CD4+) que pueden reconocer antígenos específicos pueden responder liberando mediadores solubles tales como citocinas para incorporar células adicionales del sistema inmunitario para participar en una respuesta inmunitaria . Las células T citotóxicas CD8 (también denominadas CD8+) también pueden reconocer antígenos específicos y pueden unirse a y destruir o dañar una partícula o célula que tiene antígeno.En particular, las respuestas inmunitarias mediadas por células que incluyen una respuesta de linfocito T citotóxico (CTL) puede ser importante para . ,1a eliminación de células tumorales y células infectadas por virus . ¦ : ·!"·¦' 'i Cáncer incluye un amplio intervalo de enfermedades y afecta a aproximadamente uno cada cuatro individuos en todo el mundo. Una respuesta de CTL es un rasgo clave de vacunas eficaces contra el cáncer; la colaboración eficaz de la célula T de CD4 también probablemente cumpla un rol crítico en la activación de células T de CD8 productivas ::y proporciona beneficio clínico. La vacuna basada en células dendríticas (DC) autólogas, Sipuleucel-T (PROVENGE®): fué1 aprobada recientemente por la FDA para el tratamiento de cáncer de próstata metastásico, resistente a la castración, pese a que el beneficio de supervivencia asociado con este tratamiento son apenas 4.1 meses, lo que deja una significativa necesidad de mejora (véase, por ej . , Kantoff, et ál., New Engl. J. Med. 363(5) :411 (2010)). La vacuna basada en vector poxvirus, ProstVac® VF también muestra un beneficio de supervivencia significativo en la Fase II (véase, por ej . , Kantoff, et ál., J. Clin. Oncol . 28(7):1099 (2010)). Las terapias inmunológicas activas tales como Sipuleucel-T yProstVac® VF se han tolerado generalmente mejor que los regímenes quimioterapéuticos " que comprenden el estándar de cuidado actual para la enfermedad resistente a la castración (véase, por ej . , Petrylak, et ál., N. Engl. J. Med. 351(15) :1513 (2004); Sylwester, et ál., J. Exp. Med. 202 (5): 673 (2005) ). Estos éxitos clínicos demuestran que la respuesta inmunitaria se puede aprovechar en un marco de cáncer para proporcionar mejores resültádós en los pacientes y mayor supervivencia.

Muchos xenoantígenos (es decir, que no son pfopips) son poco inmunogénicos y requieren la administración' de un adyuvante para proporcionar una respuesta inmunitaria satisfactoria a un antígeno.Los adyuvantes también se pueden usar para predisponer una respuesta inmunitaria hacia una respuesta humoral o una respuesta mediada por células y también se pueden usar determinados adyuvantes para predisponer la respuesta del anticuerpo a un isotipo de anticuerpo particular o predisponer una respuesta celular hacia un subconjunto de células T particular. La elección de adyuvante y/o modo de administración de un adyuvante para inducir o potenciar la respuesta inmunitaria a inmunógenos pueden ser aspectos importantes de desarrollo de vacuna terapéutica y profiláctica.

Existe una necesidad de vacunas, incluyendo vacunas mejoradas, contra microorganismos de enfermedades infecciosas, tales como virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , malaria, bacterias resistentes a antibióticos, para las cuales es importante inducir una sólida respuesta mediada por células y/o humoral para la exitosa prevención y tratamiento de la infección. Además, pese a los impactos positivos sobre la supervivencia de pacientes con cáncer, no se ha demostrado de manera concluyente una, clara relación entre la inmunidad especifica de tumores inducida por vacunas y el beneficio del paciente, lo que indica que existe una posibilidad y necesidad considerables ¦ de ¿una mejor potencia de vacunas contra el cáncer.

Breve descripción de la invención Se proporcionan métodos en la presente para inducir una respuesta inmunitaria a un inmunógeno que se introduce en un sujeto mediante la administración por separado de (a) una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante, cuyo vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno de interés y (b) al menos un adyuvante .Administrar un adyuvante de esta forma potencia (o mejora) la respuesta inmunitaria al inmunógeno, en comparación con la respuesta inmunitaria específica obtenida en ausencia de administración del adyuvante .

En una modalidad, se proporciona un método en la presente para inducir una respuesta inmunitaria especifica para un inmunógeno en un sujeto que comprende administrarle simultánea o secuencialmente al sujeto (a) una primera composición que comprende una partícula de vector, la partícula de vector comprende un vector de expresión recombinante donde el vector de expresión recombinante comprende un polinucleótido que codifica el inmunógeno' j y donde el polinucleótido está unido operativamente a al menos una secuencia de expresión reguladora y (b) una segunda composición que comprende un adyuvante farmacéuticamente adecuado, donde cada una de la primera composición y la segunda composición comprende además "un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, la primera composición y la segunda composición se administran simultáneamente, donde la primé'rá composición se administra al sujeto en un primer sitio y la segunda composición se administra al" sujeto en un segundo sitio, donde el primer sitio y el segundo sitio son diferentes . En determinadas modalidades, la primera composición se administra en el primer sitio mediante una primera vía y la segunda composición se administra en el segundo sitio mediante una segunda vía. En modalidades particulares, la primera vía y la segunda via son diferentes y cada una se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, intrahasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica. En otras modalidades particulares, cada una de la primera via y la segunda via es la misma y se selecciona de parenteral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, percutánea, transdérmica y tópica.

En otra modalidad del método para inducijr i ,¾ña. respuesta inmunitaria especifica para un inmunógeno en un sujeto, la primera composición y la segunda composición se administran secuencialmente . En una modalidad particular, "la primera composición se administra al sujeto en un primer sitio y la segunda composición se administra al sujeto en un segundo sitio, donde el primer sitio y el segundo sitio son iguales o diferentes . En aun otra modalidad particular^ primera composición se administra en el primer sitio mediante una primera vía y la segunda composición se administra en el segundo sitio mediante una segunda vía. En determinadas modalidades, la primera vía y la segunda vía son diferentes y cada una se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica. En aun otras modalidades particulares, cada una de la primera vía y la segunda vía es la misma y se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica. En aun otra modalidad determinada, el primer sitio y el segundo sitio son los mismos y donde la primera vía y la segunda vía son diferentes y cada vía se selecciona de parenteral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, percutánea, transdérmica y tópica. En una modalidad particular, ;:: la primera composición se administra antes de ; :¾!Ia administración de la segunda composición . En otra modalidad particular, la segunda composición se administra antes;;; de la administración de la primera composición.

Con respecto a los métodos descritos anteriormente y en la presente, el vector de expresión recombinante se selecciona de un genoma de vector lentiviral, genoma i(de vector de poxvirus, genoma de vector de virus de la vacuna:, ; ! ,. . ; -ÍH ! genoma de vector de adenovirus, genoma de vector de virus asociado con adenovirus, genoma de vector de virus del herpes, genoma de vector de virus alfa y ADN plásmido.En una modalidad más particular, la partícula de vector es una partícula de vector lentiviral que comprende el genoma de vector lentiviral; una partícula de vector de poxvirus que comprende el genoma de vector de poxvirus; una partícula de vector de virus de la vacuna que comprende el genoma de vector de virus de la vacuna; una partícula de vector de adenovirus que comprende el genoma de vector de adenovirus; una partícula de vector de virus asociado con adenovirus que comprende el genoma de vector de virus asociado con adenovirus; una partícula de vector de virus del herpes que comprende el genoma de vector de virus del herpes o una partícula de vector de virus alfa que comprende el genoma de vector del virus alfa. En aun otra modalidad específica, la partícula de vector es la partícula de vector lentiviral que comprende el genoma del vector lentiviral . En modalidades específicas, la partícula de vector administra el vector de expresión recombinante a una célula presentadora de antígenos y en determinadas modalidades particulares, la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica . En determinadas modalidades, la partícula de vector lentiviral comprende también una membrana que comprende una glicoproteína E2 del virus Sindbis que tiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la SEQ ID N0:1, donde el residuo 160 está ausente o es un aminoácido que no es ácido glutámico y donde la glicoproteina E2 no es parte de una proteina de fusión con una proteína E3 de virus Sindbis.En modalidades específicas, la partícula de vector administra el vector de expresión recombinante a una célula presentadora de antígenos y en determinadas modalidades particulares, la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

También con respecto a los métodos descritos anteriormente y en la presente, el inmunógeno es un antígeno asociado a tumores. En modalidades particulares, el antígeno asociado a tumores se selecciona de un antígeno de carcinoma de células renales, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de mesotelioma, un antígeno de cáncer pancreático, un antígeno de melanoma, un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de pulmón o un antígeno ;de cáncer de ovarios. En modalidades más particulares, ...e.l antígeno de cáncer de próstata es fosfatasa de ácido prostático, antígeno prostético específico, NKX3 ;.1 p antígeno prostático específico de membrana. En aun otras modalidades particulares, el antígeno de carcinoma ,dé células renales es anhidrasa carbónica IX. En otras modalidades específicas, el inmunógeno es de un microorganismo infeccioso que se selecciona de un virus, una bacteria, un hongo o un parásito.

En determinadas modalidades de los métodos descritos anteriormente y en la presente, la respuesta inmunitaria inducida comprende una respuesta inmunitaria de linfocito T citotóxico . En aun otras modalidades, la respuesta inmunitaria inducida comprende la producción de un anticuerpo especifico de inmunógenos.

Con respecto a los métodos descritos anteriormente y en la presente, en determinadas modalidades, el adyuvante es un adyuvante relacionado con lipido Ano tóxico. En una modalidad más especifica, el adyuvanterelacionado con lipido A no tóxico es adyuvante lipídico glucopiranosil A (GLA) .En otra modalidad particular, GLA se formula en una emulsión estable de agua en aceite.

En aun otras modalidades determinadas de los métodos descritos anteriormente y en la presente, la segunda composición que comprende el adyuvante inhibe la inducción de la respuesta inmunitaria al inmunógeno cuando (a) " la segunda composición se administra junto con la primera composición como una única composición o (b) la primera composición y la segunda composición se administran simultáneamente en el mismo lugar y por la misma vía.

Tal como se usa en la presente, el término "aislado" significa que un material se retira de su ambiente original (por ej . , el ambiente natural si es de origen natural) . Bor ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal ácido nucleico podría ser parte de un vector. Un ácido nucleico, que puede ser parte de un vector, puede aun estar aislado en el sentido que el ácido nucleico no es parte del ambiente natural del ácido nucleico. Un polipéptido o proteina aislados, o fragmento de estos, podría ser un componente de una composición y aun estar aislado en el sentido de que la composición no es parte del ambiente natural del polipéptido . El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptidos ; un gen incluye regiones que anteceden y siguen a la región de codificación "líder y remolque" así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos 'de codificación individuales (exones).En la presente se puede hacer referencia a los aminoácidos de acuerdo con ."'.-los códigos de una letra y tres letras, que son conocimiento común de libros de texto en la técnica y por lo tanto los expertos en la técnica están familiarizados con estos. Él término "polipéptido de fusión" usado en la presente también se puede usar de manera intercambiable con "proteína de fusión" y, salvo que se indique específicamente lo contrario, los dos términos no pretenden indicar moléculas que tienen propiedades o características distinguibles .

Tal como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la", incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario . Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una pluralidad de dichos antígenos y la referencia a "una célula" o "la célula" incluyen referencia a una o más células y equivalentes de estas (por ej . , pluralidad de células) conocidas por los expertos en la técnica, y asi sucesivamente . De manera similar, la referencia a "un compuesto" o "una composición" incluye una pluralidad de tales compuestos o composiciones y se refiere a uno o más compuestos o composiciones, respectivamente, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. El término "alrededor de" al hacer referencia a un número o intervalo numérico significa que el número o intervalo numérico ; al que se hace referencia es una aproximación dentro de variabilidad experimental (o dentro del error experimental estadístico) y por lo tanto el número o intervalo numérico puede variar entre 1% y 15% del número o intervalo numérico expuesto. El término "que comprende" (y términos relacionados tales como "comprenden" o "comprende" o "gúe tiene" o "que incluye") no pretende excluir que en otras modalidades determinadas, por ejemplo, una modalidad de cualquier composición de materia, composición, método o proceso o similares, descrita en la presente, puede "consistir en" o "consistir esencialmente en" los rasgos descritos.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 ilustra la respuesta inmunitaria especifica de antigeno al epitopo AHI y al péptido modificado AH1A5 cuando un vector lentiviral que codifica el AH1A5 se administró subcutáneamente a ratones BALB/C y un adyuvante se administró intraperitonealmente . Un vector lentiviral que codifica AH1A5 (SinVarl FU AH1A5 (1 pg de p24)) se administró subcutáneamente (s.c.) a grupos de ratones BALB/C. Los grupos se inyectaron intraperitonealmente con adyuvantes, GLA (10 pg) o Poly(I:C) (50 pg) , o se inyectaron con PBS (sin adyuvante ). Luego de 10 días, las células del bazo se aislaron de los animales y la respuesta de la célula T CD8 se evaluó mediante la determinación del nivel de TNF-oi IFN-? por ICS seguido de FACS.Los valores mostrados son el porcentaje promedioi SEM de células T CD8 que son positivas paraIFN-?. También se muestran datos de células del; bazo obtenidas de ratones que no se inyectaron con el vector lentiviral (no sometidos a experimentación) .

La Figura 2 ilustra el efecto de dos adyuvantes, GLA y lipopolisacárido (LPS) en la respuesta inmunitaria al epitopo AH1A5 de la célula T CD8.E1 vector lentiviral que codifica AH1A5 (SinVarl FU AH1A5 (1 pg de p24)) se mezcló con PBS (grupo de control), 4 pg de GLA, 20 pg de GLA, o 4 pg de LPS y luego se administró subcutáneamente (s.c.) a grupos de ratones BALB/C. Luego de.10 días, las células del bazo se aislaron de animales en cada grupo y la respuesta de la célula T CD8 se evaluó mediante la determinación del nivel de TNF-a e IFN-? por tinción de citocina intracelular (ICS) seguido de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) .Los valores mostrados son el porcentaje promedioi SEM de células T CD8 que son positivas. paraIFN-?. ambién se muestran datos de células del bazo obtenidas de ratones que no se inyectaron con el , vegtpr lentiviral (sin LV) .

La Figura 3 ilustra las respuestas de célula ? CD8 en comparación con tres epitopos según se determina por 1. el porcentaje de células que expresan IFN-?, TNF-a e IL-2 por tinción de citocina intracelular. ',„' '.

Descripción detallada En la presente se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria (una respuesta humoral (es decir; una respuesta de células B) o respuesta mediada por céluf s (incluyendo respuesta a células T citotóxicas) o ambas) a un inmunógeno que se introduce en un sujeto mediante la administración de una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante, cuyo vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno de interés. Tal como se describe en la presente, el vector de expresión recombinante se incluye (es decir, incorpora) en una célula o una partícula (por ej . , una partícula de virus) que tiene o expresa el inmunógeno . El vector de expresión recombinante también comprende al menos una (es decir, una o más) secuencias de expresión de regulación que está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifican el inmunógeno . Los métodos descritos en la presente también comprenden administrar al menos un adyuvante que potencia (o mejora) la respuesta inmunitaria al inmunógeno (es decir, la respuesta inmunitaria específica al inmunógeno es potenciada en una' fó'rma estadística, biológica y/o clínicamente significativa en comparación con la respuesta inmunitaria específica obtenida en el sujeto en ausencia de la administración :del adyuvante) . ··· : f : Los métodos son particularmente útiles en casos en que un adyuvante particular inhibe (es decir, perjudica, reduce, abroga, suprime, minimiza o de alguna forma afecta de manera adversa) la respuesta inmunitaria específica ... al inmunógeno expresado de interés cuando se ponen en práctica determinados protocolos de administración . Por ejemplo, un adyuvante administrado en la misma composición que la partícula de vector que comprende el vector de expresión recom inante que codifica el inmunógeno puede inhibir o potenciar de manera no eficaz la respuesta inmunitaria específica al inmunógeno o un adyuvante administrado simultáneamente en el mismo sitio y por la misma vía que la partícula de vector puede inhibir o potenciar de manera no eficaz la respuesta inmunitaria al inmunógeno . Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, bajo las circunstancias antes mencionadas, una respuesta inmunitaria específica para el inmunógeno se puede suprimir o minimizar por la inducción de una respuesta inmunitaria contra uno o más componentes de la partícula de vector . Esteresultadó no deseado se puede abrogar usando los métodos descritos eri la presente donde la composición adyuvante se administra secuencialmente y/o si se administra simultáneamente. que' la composición inmunogénica, se administra mediante una vía diferente y/o en un sitio diferente que la composición inmunogénica .

Tal como se describe en más detalle en la presenté, se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria específica a un inmunógeno de interés mediafi£e la administración al sujeto de una partícula de vectpr' qüe comprende un vector de expresión recombinante que codifica el inmunogeno y administrar simultánea o secuencialmente un adyuvante. En modalidades particulares, la particulade vector que comprende el vector de expresión recombinante y el adyuvante se administran simultáneamente (o casisimultáneamente) en diferentes sitios y/o por diferentes vías. En aun otras modalidades, la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante y el adyuvante se administra secuencialmente en un intervalo de tiempo que es suficiente para permitir que el adyuvante potencie la respuesta inmunitaria especifica al inmunogeno codificado de interés.

Sin pretender limitarse a la teoría, cuando dos o más inmunógenos están presentes en una composición inmunogénica, puede ocurrir interferencia inmunitaria por la cual un hospedador inmunizado produce una respuesta inmunitaria a un inmunogeno y la respuesta inmunitaria a un segundo inmunogeno se inhibe, minimiza, perjudica ·!'.'.·' o suprime. De manera alternativa o adicional, una partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante y/o el vector que codifica un inmunogeno de interés y el adyuvante pueden presentar cierto nivel de incompatibilidad química que da como resultado una respuesta inmunitaria no deseada (por ej . , bajo nivel o falta de respuesta . ai inmunogeno de interés) .Además, sin pretender limitarse pór: ninguna teoría en particular y a modo de ejemplo, un adyuvante administrado en la misma composición o simultáneamente y en el mismo sitio que el vector de expresión recombinante o como una partícula de vector (por ej . , una partícula de virus) que comprende un vector de expresión recombinante para expresar un inmunógeno (o inmunogenos) de interés, puede inducir o potenciar una respuesta inmunitaria específica a uno o más componentes de partícula de vector y comprende la respuesta inmunitaria al inmunógeno particular de interés. De manera alternativa o adicional, el adyuvante puede inducir una respuesta inmunitaria innata, tal como de modo no taxativo, inducir la producción de interferón tipo 1, que puede comprender la capacidad del vector de administrar de forma exitosa el inmunógeno de interés. Tal como se describe en la presente, este problema se ha solucionado mediante la administración de la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante y el adyuvante en diferentes . sitios y/o mediante diferentes vías o mediante la administración de la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante y el adyuvante secuencialmente con suficiente tiempo entre la administración de la partícü'la de vector y la administración del adyuvante de forma tal que el adyuvante potencie suficientemente la respuesta inmunitaria a uno o más inmunogenos de interés.

Métodos para inducir una respuesta inmunitaria En una modalidad, en la presente se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria especifica para un inmunógeno mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una composición que comprende una partícula de vector que comprende un .vector de expresión recombinante, cuyo vector de expresión recombinante' comprende un polinucleótido que codifica el inmunógeno (también denominado en la presente una primera composición o una composición inmunogénica) , donde el polinucleótido está unido operativamente a al menos una secuencia de expresión de regulación . Simultánea o secuencialmente, una segunda composición que comprende un adyuvante farmacéuticamente adecuado (también denominado en la presente composición adyuvante) se administra al sujeto. El adyuvante se administra en un momento y en una forma suficiente para que el adyuvante potencie la respuesta inmunitaria al inmunógeno; es decir, el nivel de la respuesta inmunitaria específica para el inmunógeno :.;.(½s decir, respuesta humoral, respuesta mediada por células o tanto una respuesta humoral como una respuesta mediada por células) es mayor (o potenciado) en una forma estadística, clínica y/o biológicamente significativa en comparación con el nivel de la respuesta inmunitaria específica' ;»al inmunógeno cuando el inmunógeno se administra en ausencia del adyuvante. En aquellos casos en que un antigeno no es capaz de inducir una respuesta inmunitaria especifica detectable en ausencia de un adyuvante, la inducción de una respuesta inmunitaria especifica detectable representa la potenciación de la respuesta inmunitaria.

Los métodos descritos en la presente para inducir y/o potenciar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno son particularmente útiles cuando el adyuvante, si se administra en la misma composición que la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante y/o simultáneamente por la misma via en el mismo sitio, inhibe (es decir, afecta desfavorablemente, no logra potenciar, minimiza, interfiere con, perjudicá, reduce, suprime o abroga) la respuesta inmunitaria al inmunógeno . Tal como se describe en más detalle en la presente, la inhibición de la respuesta inmunitaria al inmunógeno se puede evitar mediante la administración .de1 adyuvante y el vector de expresión recombinante en dos composiciones separadas y ya sea en diferentes momentos, n diferentes sitios y/o mediante diferentes vías ::de administración. Por consiguiente, salvo que se especifique lo contrario en la presente, la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante que codifica uno o más inmunógenos de interés y el adyuvante no se combinan entre sí en una única composición. En ;otr¾s palabras, la composición que comprende la partícula de vector que comprende el vector de expresión recombinante que codifica un inmunógeno (es decir, composición inmunogénica) no tiene un adyuvante y la composición que comprende el adyuvante no tiene el vector de expresión recombinante o no tiene la partícula de vector que comprende el vector que codifica el inmunógeno de interés. En otras modalidades particulares de los métodos descritos en la presente, cuando una composición que comprende el vector que codifica un inmunógenoy una composición que comprende el adyuvante se administran al mismo tiempo (es decir, simultáneamente) , cada composición se administra en un sitio diferente . Cuando cada composición, se administra en un sitio diferente, cada composición se puede administrar por la misma vía o vías diferentes . De manera alternativa, cada composición se puede administrar mediante una vía diferente en el mismo sitio.

Por consiguiente, en modalidades más particulares, cuando la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran al mismo tiempo al sujeto, la composición inmunogénica se administra mediante una vía: (es decir, una primera vía) y la composición adyuvante se administra mediante una segunda vía diferente. Las vías de administración de las cuales se pueden seleccionar independientemente la primera y segunda vía incluyan,; j.a modo no taxativo, tópica, oral, enteral, nasa (es decir, intranasal), por inhalación, intratecal, rectal, vaginal, intraocular, subconjuntival, sublingual, intradérmica, transdérmica o parenteral, incluyendo inyección o infusión subcutánea, percutánea, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intranodal, intraesternal, intracavernosa, intrameatal o intrauretral . En determinadas modalidades más particulares, la primera y segunda vías son diferentes y se selecciona cada una de parenteral, oral, enteral, sublingual, intranasal, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, percutánea, transdérmica y tópica. En una modalidad más especifica r la primera y segunda vías son diferentes y se seleccionan de intramuscular, subcutánea, percutánea, intratumoral, intranodal, intranasal y oral. Las composiciones inmunogénica y adyuvante se formulan adecuadamente pará' su administración por vías diferentes tal como se describe,,; .en la técnica y se discuten en más detalle en la presente.

En otras modalidades especificas, cuando cada una- de la composición inmunogénica y la composición adyuvante; se administra al mismo tiempo al sujeto,, las composiciones" se pueden administrar en diferentes sitios del sujeto. Los diferentes sitios están físicamente separados entre si lo suficiente como para permitir la inducción o potenciación de la respuesta inmunitaria al inmunógeno . Cuando cada composición se administra en un sitio diferente, las composiciones se pueden administrar por la misma vía o se pueden administrar por vías diferentes. A modo de ejemplo y a efectos de ilustración solamente, la composición inmunogénica se puede administrar subcutánea o intramuscularmente en una extremidad (por ej . , brazo) del sujeto y la composición adyuvante se puede administrar subcutánea o intramuscularmente, respectivamente, en una extremidad diferente (por ej . , pierna) del sujeto. A modo de ejemplo adicional, la administración de cada composición simultáneamente en diferentes sitios pero por la misma via puede incluir la administración de la composición inmunogénica en una extremidad (por ej . , brazo o pierna) y la administración de la composición adyuvante a otra (o una segunda) extremidad del mismo tipo. En otras modalidades particulares, cuando la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran simultáneamente en el mismo sitio, las via de administración de cada una , dé "las composiciones inmunogénicas y adyuvantes son diferentes y cada una se selecciona de oral, enteral, parehteíál, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratümoral, intranódica, percutánea, transdérmica, sublingual " · y tópica. A modo de ejemplo, una composición se,; puede administrar oralmente para ingerirse y la segunda composición se puede administrar sublingualmente. A modo!" de otro ejemplo, una composición se puede administrar intramuscularmente en un sitio y la segunda composición administrarse subcutánea o percutáneamente casi en el mismo lugar (por ej . , el mismo brazo o la misma pierna).

La elección de una vía de administración dependerá de una cantidad de factores incluyendo la composición administrada, la edad del sujeto y la masa corporal del sujeto. La vía de administración y el sitio de administración se eligen típicamente para maximizar la cantidad de un ingrediente activo en una composición administrada al sujeto en la forma más segura. Los sitios típicos para la administración intramuscular de una composición inmunogénica y/o composición adyuvante incluyen el músculo del muslo anterolateral y el músculo deltoide.En seres humanos, la inyección intramuscular del músculo deltoide se usa típicamente por expertos en la técnica para administrar una vacuna a adultos y en determinados casol', niños y adolescentes y niños entre 1 y 2 años de edad. El músculo vasto lateral en el muslo anterolateral :es típicamente recomendado para la inyección intramuscular de niños (es decir, menores de un año de edad) y también puede ser el sitio de administración intramuscular en : niños mayores y adultos. De manera alternativa, el sitio de una inyección intramuscular en seres humanos puede ser el áreá ·: :· : ?.' ventrogluteal . Los expertos en la técnica comprenden que la administración subóptima de una vacuna puede ocurrir si la composición inmunogénica se administra en un sitio dorsogluteal o cuadrante exterior superior del glúteo.

A modo de ejemplo, los sitios típicos de administración subcutánea de una composición inmunogénica o adyuvante incluyen tejido graso sobre el músculo del muslo anterolateral o tejido graso sobre el tríceps. El músculo del muslo es el sitio preferido para la administración subcutánea de una composición a un niño humano. La administración percutánea puede ser al músculo deltoide o el músculo del muslo anterolateral.

En otra modalidad, la primera composición que comprende una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica al menos un inmunógeno y la segunda composición que comprende un adyuvante se administran secuencialmente . En determinadas modalidades, la composición inmunogénica se administra antes de la composición adyuvante (es decir, la composición adyuvante se administra luego de la administración de la composición inmunogénica) .En otras modalidades determinadas, ;,: la composición adyuvante se administra antes de la administración de la composición inmunogénica (es decir, la composición inmunogénica se administra luego de la administración de la composición adyuvante). ' :¦'·¦"; En una modalidad más particular, cuando cada una de la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran secuencialmente al sujeto que lo necesita, cada administración está separada por horas o por días. En determinadas modalidades, la composición inmunogénica se administra al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o al menos 12 horas o al menos 18 horas antes de la administración de la composición adyuvante. En otras modalidades particulares, la composición inmunogénica se administra al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete días antes de la administración de la composición adyuvante. En aun otras modalidades determinadas, la composición adyuvante se administra antes de la composición inmunogénica y se administra al menos una, al menos ,dos ,, . al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al é.nps diez o al menos 12 horas o al menos 18 horas antes de la administración de la composición inmunogénica . En aun otras modalidades específicas, la composición adyuvante ... se administra antes de la composición inmunogénica y se administra al menos un, al menos dos, al menos tres, '': ¿1 menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al. menos siete días antes de la administración de la composición inmunogénica . Un experto en la técnica puede determinar el intervalo de tiempo óptimo entre la administración de cada composición mediante estudios de ensayo clínico y preclínico adecuadamente diseñados. El intervalo de tiempo óptimo puede depender del inmunógeno de interés y/o el adyuvante particular administrado.

En aun otras modalidades, cada una de la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran secuencialmente al sujeto que lo necesita, más de una vez (por ej . , dos veces, tres veces o cuatro veces). En una modalidad específica, la composición adyuvante se puede administrar la misma cantidad de veces que la composición inmunogénica . En aun otra modalidad, la composición adyuvante se puede administrar una menor cantidad de veces que la composición inmunogénica . A modo de ejemplo no taxativo, cuando la composición inmunogénica se administra más de una vez, la composición adyuvante se puede administrar solo antes o después de la administración de. la primera administración de la composición inmunogénica y.» no antes o después de ninguna administración posterior (es decir, segunda, tercera o cuarta) de la composición inmunogénica . En aun otra modalidad específica', la composición adyuvante se puede administrar más veces de lo que se administra la composición inmunogénica. ' : En otras modalidades, la composición adyuvante se puede administrar una vez más que la composición inmunogénica . Por ejemplo, si el adyuvante es capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata (o no especifica) , la composición adyuvante se puede administrar a un intervalo de tiempo suficiente antes de la administración de la composición inmunogénica para- inducir o estimular una respuesta inmunitaria innata. La composición adyuvante también puede entonces administrarse simultáneamente (cuya administración simultánea puede ser en un sitio diferente o mediante una vía diferente) o secuencialmente con la primera administración de la composición inmunogénica. - ¦ Cuando la composición adyuvante y la composición inmunogénica se administran secuencialmente, cada una de las composiciones se puede administrar por la misma vía o se pueden administrar por vías diferentes . Las vías t de administración para el suministro ; de cada una de ' la composición adyuvante e inmunogénica se puede seleccionar independientemente incluye, de modo no taxativo, administración tópica, oral, enteral, nasal (es ;decif, intranasal) , por inhalación, intratecal, rectal, vaginal, intraocular, subconjuntival, sublingual, intradérmica;, int ratumoral, intranodal, transdérmica o paren;teral':, incluyendo inyección o infusión subcutánea, percutánea intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavérnós:a intrameatal o intrauretral . En determinadas modalidades, la primera y segunda vías son diferentes y se selecciona cada una de parenteral, oral, enteral, sublingual, intranasal, intramuscular, intradérmica, intratumoral, intranodal, subcutánea, percutánea, transdérmica y tópica.

Cuando la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran al sujeto por la misma vía, cada una de las composiciones se puede administrar en el mismo sitio al sujeto o se puede administrar en diferentes sitios al sujeto. En otras modalidades especificas, cuando la composición adyuvante y la composición inmunogénica se administran secuencialmente, cada composición se puede administrar por una vía diferentes pero en sitios lo suficientemente cercanos como para considerarse el mismo sitio. A modo de ejemplo no taxativo, una composición inmunogénica se puede administrar de manera intramusuculár en una extremidad del sujeto (por ej . , un brazo (rnúscülo deltoide) o una pierna (músculo del muslo) ) y antes o después de la administración de la composición inmunogénica, la composición adyuvante se administra subcutáneamente en el mismo sitio en la extremidad dé:l sujeto (por ej . , el mismo brazo (músculo deltoide) o la misma pierna (músculo del muslo) , respectivamente) .A modo de un segundo ejemplo no taxativo, una composición adyuvante se puede administrar de manera intramusuclar :én una extremidad del sujeto (por e . , un brazo (músculo deltoide) o una pierna (músculo del muslo) ) y antes o después de la administración de la composición adyuvante, la composición inmunogénica se administra subcutáneamente en el mismo sitio en la extremidad del sujeto (por ej . , el mismo brazo (músculo .deltoide) o la misma pierna (músculo del muslo) , respectivamente) .

Tal como se discute en la presente, la elección de sitio y vía de administración puede depender de factores que incluyen, de modo no necesariamente taxativo, la edad, estado de salud y/o tamaño del sujeto a ser inmunizado; el vector de expresión recombinante o la partícula de vector que comprende el vector; uno o más inmunogenos codificados por el vector de expresión recombinante y/o el adyuvante. La afección, enférmedad o trastorno a ser tratado o prevenido mediante la administración de una composición inmunogénica y el tipo de respuesta inmunitaria deseada pueden ser factores adicionales considerados por un experto en 'la técnica para determinar la vía de administración y el sitio de administración para maximizar el beneficio terapéutico y/o profiláctico de las composiciones inmunogénicas y adyuvantes.

Durante el transcurso de un protocolo o régimen' de inmunización, se puede monitorear el nivel de la respuesta inmunitaria al inmunógeno . Por lo tanto, la cantidad de veces que cada una de la composición inmunogénica y la composición adyuvante se administran al sujeto se puede determinar monitoreando el nivel de la respuesta inmunitaria al inmunógeno luego de cada administración de la composición inmunogénica . Las técnicas y métodos para monitorear una respuesta inmunitaria se ponen en práctica de manera rutinaria en la técnica y se describen en la presente y en la técnica.

Inmunogenos y composiciones inmunogénicas Tal como se describe en la presente, la respuesta inmunitaria a uno o más inmunogenos se potencia cuando se administra una composición adyuvante al hospedador de acuerdo con los métodos descritos en detalle en la presente. Un inmunógeno que se puede usar en estos métodos incluye cualquier inmunógeno para el cual se desea la inducción de una respuesta inmunitaria especificó. El inmunógeno, particularmente cuando se administra secuencial o simultáneamente tal como se describe en la presente oc0n un adyuvante, es capaz de inducir una respuesta humoral ¡(es decir, una respuesta de célula B) o una respuesta mediadapor células (incluyendo una respuesta de célula T citotóxica) o ambas. r: Una respuesta inmunitaria mediada por células incluye una respuesta de linfocito T citotóxico, cuya respuestas puede destruir o dañar una célula (por ej . , una célula tumoral, célula bacteriana, célula de virus, parásito o fúngica) o partícula infecciosa (por ej . , una partícula de virus) que produce o expresa el inmunógeno . Cualquier antígeno asociado con una enfermedad o trastorno para el cual una respuesta humoral o respuesta inmunitaria mediada por células o ambas es beneficiosa para el sujeto inmunizado se puede usar como un inmunógeno . En modalidades particulares, estos inmunógenos puede administrarse a células presentadoras de antígenos, particularmente células dendriticas, usando las partículas de vector descritas en la presente que comprenden un vector de expresión recombinante .

Los antígenos asociados con muchas enfermedades y trastornos se conocen bien en la técnica. Se puede saber con anterioridad que un antígeno se asocia con la enfermedad o trastorno o se puede identificar por cualquier .método conocido en la técnica. Por ejemplo, un antígeno asoci'ádo con un tipo de cáncer del cual sufre un paciente puede ser conocido, tal como un antígeno asociado con un tumor o- se puede identificar a partir del tumor mismo mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos ;en ;la técnica. En determinadas modalidades, el inmunógeno es -un antígeno asociado con . un tumor (también denominado [ en ;,l'a presente antígeno tumoral) derivado de una célula cancerosa (es decir, célula tumoral) y uno o más de tales antigenos tumorales pueden ser útiles para el tratamiento inmunoterapéutico del cáncer. A modo de ejemplo no taxativo, los antigenos asociados a tumores pueden derivar del cáncer de próstata, mamas, colorrectal, pulmón, pancreático, renal, mesotelioma, ovarios o melanoma . Estos y otros antigenos asociados' a tumores se describen en la presente y en la técnica.

Los ejemplos de antígenos derivados de tumores o células tumorales incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 (u otros antigenos MAGE tales como los que se describen en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO99/40188); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (también denominado NY ESO 1); SAGE y HAGE (véase, por ej . , publicación de solicitud de patente internacional No. WO 99/53061) o GAGE (Robbins et ál., Curr. Opin. Immunol . 8:628-36 (1996); Van den Eynde et ál., Int. J. Clin. Lab. Res. 27 : 81-86 . (1997:) ; Van den Eynde et ál., Curr. Opin. Immunol. 9:648-93 (1997;); Corréale et ál. J. Nati. Cáncer Inst. 89: 293 ( 1997) :) . Estos ejemplos no taxativos de antigenos tumorales se expresan en un amplio intervalo de tipos tumorales tales como mélanóma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vej iga . Véase, por ej . , la patente estadounidense No. 6, 544, 518.Los antigenos asociados con el tumor de cáncer de próstata incluyen, por ejemplo, antigeno prostático especifico de membrana (PSMA) , antígeno prostético especifico (PSA) , fosfatasa de ácido prostético, NKX3.1 y antigeno epitelial 6-transmembrana de la próstata (STEAP) (Hubert et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96 14523-28, 1999); véase también, por ej . , Reiter et ál., Proc. Nat . Acad. Sci. USA 95:1735-40, 1998; Nelson, et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:3114-19 (1999); WO 98/12302; patentes estadounidenses No. 5,955,306; 5,840,871 y 5,786,148; publicación de solicitud de patente internacional No. WO 98/20117; WO 00/04149; WO 98/137418).

Otros antigenos asociados a tumores útiles como inmunógenos incluyen Plu-1 (J. Biol. Chem. 274:15633-45, 1999), HASH -1, HasH-2, Cripto (Salomón et ál., Bioessays 199, 21:61-70; patente estadounidense No. 5,654,140) y Criptin (patente estadounidense No. 5, 981, 215) .Además, un antigeno tumoral puede ser una hormona peptidica propia, tal como una hormona de liberación de la hormona de gonadotrofina de longitud completa (GnRH, publicación de solicitud de patente internacional No.WO 95/20600), un péptido corto de 10 aminoácidos de longitud, útil; en;: el tratamiento de muchos tipos de cáncer.

Los antigenos tumorales que pueden ser útiles como inmunógenos tal como se describe en la presente y por lo tanto útiles para tratar cualquier cáncer incluyen antigenos tumorales derivados de cánceres caracterizados por expresión de antigeno asociado a tumores, tal como expresión de HER-2/neu . Los antigenos asociados a tumores que pueden usarse como inmunógenos incluyen antigenos tumorales específicos de linaje tales como los antígenos de linaje de melanocito-melanoma MART-l/Melan-A, gplOO, gp75, mda-7, tirosinasa y proteína relacionada con la tirosinasa . Los antígenos asociados a tumores ilustrativos incluyen, de modo no taxativo, antígenos tumorales derivados de o que comprenden uno o más cualquiera de p53, Ras, c-Myc, serina/treonina cinasas citoplasmáticas (por ej . , A-Raf, B-Raf y C-Raf , cinasas dependientes de ciclina), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, GplOO, PSA, PSM, Tirosinasa, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, fosfoinositida 3-cinasas (PI3K), receptores de TRK, PRAME, P15, RUI, RU2, SART-1, SART-3, antígeno de tumor de ilms (WT1) , AFP, ß-catenina/m, Caspasa-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, factor regulador de interferón 4' (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARor, transductor de señal de calcio asociado al tumor 1 (TACSTDl) TACSTD2, tirosina cinasa del receptor (por ej., receptor del factor "dé crecimiento epidérmico (EGFR) (en particular, EGFRvIII), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) , receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) ), tirosina cinasa citoplasmática (por ej . , familia src, familia syk-ZAP70) , cinasa unida a integrina (ILK) , transductores de señal y activadores de la transcripción STAT3, STAT5 y STAT6, factores inducible .de hipoxia (por ej . , HIF-la y HIF-2a) , factor nuclear Kappa B (NF-??) , receptores Notch (por ej . , Notchl-4), c-Met, dianas de mamíferos de rapamicina (mTOR) , WNT, cinasas reguladas por señal extracelular (ER ) y sus subunidades de regulación PMSA, PR-3, MDM2, Mesotelina, carcinoma de célula renal - 5T4, SM22-alfa, anhidrasas carbónicas I (CAI) y IX (CAIX) (también denominadas G250) , STEAD, TEL/A L1, GD2, proteinasa3, hTERT, puntos de ruptura de translocación de sarcoma, EphA2 , ML-IAP, EpCAM, ERG :(gen de fusión TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor fÉ de andrógenos, ciclina Bl, ácido polisiálico, MYCN, RhoC, GDÍ3, fucosil GM1, mesothelian, PSCA, sLe, PLACI, GM3, BORÍS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, proté'íha de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, legumaina, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, AD-CT-2, antígenb ' 1 relacionado con fos, e idiotipo.

Los inmunógenos también incluyen antigenos tumoralés que comprenden regiones epitópicas o péptidos epitiópieos derivados de genes mutados en células tumorales o de genes transcriptos a diferentes niveles en células tumorales en comparación con células normales, tales como enzima telomerasa, survivina, mesotelina, ras mutado, rearreglo bcr/abl, Her2/neu, p53 mutada o de tipo salvaje, citocromo P450 1B1 y secuencias de intrón expresadas anormalmente tales como N-acetilglucosaminiltransferasa-V; rearreglos clónales de genes de inmunoglobulina que generan idiotipos únicos en mielomas y linfornas de células B; antigenos tumorales que comprenden regiones epitópicas o péptidos epitópicos derivados de procesos oncovirales, tales como proteínas del virus de papiloma humano E6 y E7; proteína del virus Epstein bar LMP2; proteínas oncofetales no mutadas con una expresión selectiva de tumores, tal como antígeno carcinoembrionario y alfa-fetoproteína . Véase también Boon et ál., Ann. Rev. Immunol . 12:337-65 (1994); Renkvist et ál., Cáncer Immunol. Immunother. ,50:3-15 (2001) .

Un inmunógeno se puede obtener o derivar : de:: :un microorganismo patogénico o de un microorganismo patogénico oportunístico e incluye un virus, hongo, parásito y bacteria. En determinadas modalidades, los inmunógenos incluyen proteínas de longitud completa derivadas de -tal microorganismo . En otra modalidades determinadas, un inmunógeno comprende uno o más fragmentos inmunogénicos que contienen uno o más epitopos de tales proteínas. En aun otras modalidades, un inmunógeno comprende un polipéptido de fusión que comprende uno, dos o más fragmentos inmunogénicos de una proteína derivada de un microorganismo . En otras modalidades, un polipéptido de fusión puede ser un polipéptido quimérico que comprende uno o más fragmentos inmunogénicos derivados de cada una de dos o más proteínas presentes en un microorganismo particular .Las proteínas de fusión y proteínas quiméricas pueden comprender, además del polipéptido o péptido inmunogénico, al menos un polipéptido o péptido que a veces se denomina proteína portadora en la técnica inmunológica, que potencia la respuesta inmunitaria al inmunógeno de interés .

Los organismos patogénicos ilustrativos cuyos antígenos se contemplan como inmunógenos para usarse en las composiciones inmunogénicas y que se codifican por ::l'os vectores y partículas de vector descritas en la presente incluyen virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de herpes simple (HSV) , virus respiratorio sincitial ' (RSV) , citomegalovirus (CMV) , virus Epstein-Barr (EBV) , virus—de estomatitis vesicular por influenza A, B y C (VSV) , virus de estomatitis vesicular (VSV) , especies de Staphylococcus incluyendo Staphylococcus aureus resistente a la meticil^na (MRSA) y especies de Streptococcus incluyendo Streptococcus pneumoniae . Tal como lo entenderá un experto en la técnica, las proteínas derivadas de estos y otros microorganismos patogénicos para usarse como inmunógenos tal como se describe en la presente se conocen en la técnica y las secuencias de aminoácidos de tales proteínas (y especies de estas) y secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas se pueden identificar en publicaciones y en bases de datos públicas tales como GENBANK, Swiss-Prot y TrEMBL.

Los antígenos derivados de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que pueden ser inmunógenos y que se usan tal como se describe en la presente incluyen cualquiera, de., las proteínas estructurales de virión de VIH (por ej . , gpl20, gp41, pl7, p24), proteasa, transcriptasa inversa o proteínas de VIH codificadas por tat, rev, nef, vif, vpr y vpu.Los expertos en la técnica conocen las proteínas de VIH y fragmentos inmunogénicos de estas y se pueden encontrar en una cantidad de bases de datos públicas (véase, por e¡j . Vider-Shalit et ál., AIDS 23 ( 11 ): 1311-18 (2009); Watkins, em. Inst. Oswaldo Cruz. 103 (2 ): 119-29 (2008); Gao et ál., Expert Rev. Vaccines (4 Suppl) : S161-68 ( 2004 ) ) i (Véase también, por ej . , Klimstra et ál., 2003. J. Virol. 77:12022-32; Bernard et ál., Virology 276:93-103 (2000) ; Byrnes et ál., J. Virol. 72: 7349-56 (1998); Lieberman et ál., AIDS Res Hum. Retroviruses 13(5): 383-92 ( 199;7 ); Menendez-Arias et ál., Viral Immunol. 11(4): 167-181 (1998) .

Los antígenos derivados del virus de herpes simple (por ej . , HSV 1 y HSV2) que se contemplan para su uso como inmunógenos en las composiciones descritas en la presente y codificadas por los vectores y partículas de vector descritas en la presente incluyen, de modo no taxativo, proteínas expresadas de genes tardíos de HSV. El grupo tardío de genes codifica predominantemente las proteínas que forman la partícula de virión. Tales proteínas incluyen las cinco proteínas de (UL) que forman el cápsido viral: UL6, UL18, UL35, UL38 y la proteína de cápsido principal UL19, UL45 y UL27, cada una de las cuales se puede usar como inmunógeno tal como se describe en la presente (véase, por ej., McGeoch et ál . , Virus Res. 117:90-104 (2006); Mettenleiter et ál., Curr. Opin. Microbiol. 9: 423-29 (2006) ) . Otras proteínas de HSV ilustrativas contempladas para usarse como inmunógenos en la presente incluyen las proteínas ICP27 (Hl, H2) , glicoproteína B (gB) y glicoproteína D (gD) .El genoma de HSV comprende al menos, ,74 genes, cada uno codifica una proteína que posiblemente se podría usar como un inmunógeno para inducir una respuesta de célula T (incluyendo una respuesta de CTL), respuesta de célula B o tanto una respuesta de CTL como una respuestahde célula B.

Los antígenos derivados de citomegalovirus (C V)' ¾iie se contemplan para uso en determinadas modalidades de las presentes composiciones inmunogénicas incluyen proteínas estructurales de CMV, antígenos virales expresados durante las fases inmediatamente temprana y temprana de replicación del virus, glicoproteínas I y III, proteina de cápsido, proteína de cubierta, proteína de matriz inferior pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 e IE2 (UL123 y UL122) , productos de proteína del grupo de genes de UL128-UL150 (Rykman, et ál., J. Virol. 2006 ene; 80 (2) : 710-22) , glicoproteína de membrana B (gB) , gH, gN yppl50.Tal como lo entendería un experto en la técnica, las proteínas CMV para usarse como inmunogenos descritos en la presente se pueden identificar en bases de datos públicas tales como GenBank, Swiss-Prot y TrEMBL (véase por ej . , Bennekov et ál., Mt . Sinai J. Med. 71 (2): 86-93 (marzo de 2004) PMID 15029400,-Loewendorf et ál . , J. Intern.' Med. 267 (5) : 483-501 (2010); Marschall et ál., Future Microbio! . 4 : 731-42 (2009) ) . ' ' "¦' ¦ Los antígenos derivados del virus Epstein-Barr (EBV) que se contemplan para usarse en determinadas modalidades incluyen proteínas EBV líticas gp350 y gpllO, proteínas EBV producidas durante infección de ciclo latente incluyendo antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA)-l, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, proteína líder EBNA (EBNA-LP) y proteínas de membrana latente (LMP)-l, LMP-2A y LMP-2B (véase, por ej . , Lockey et ál., Front. Biosci. 13:5916-27 (2008)). Los antígenos derivados de virus sincitial respiratorio (RSV) que se contemplan para usarse como inmunógenos tal como se describe en la presente incluyen cualquiera de las once proteínas codificadas por el genoma RSV o fragmentos inmunogénicos de estas NS1, NS2, N (proteína de nucleocápside) , M (poteína de matriz) SH, G y F (proteínas de cubierta viral), M2 (proteína de matriz secundaria), M2-1 (factor de elongación), 2-2 (regulación de transcripción), ARN polimerasa y fosfoproteína P.

Los antígenos derivados de virus de estomatitis vesicular (VSV) que se contemplan para usarse como inmunógenos incluyen cualquiera de las cinco proteínas principales codificadas por el genoma VSV y fragmentos inmunogénicos de estas: proteína grande (L) , glicoproteína (G) , nucleoproteína (N) , fosfoproteína (P) y proteína de matriz (M) (véase, por e . , Rieder et ál . , J. Intérferon Cytokine Res. (2009) ( 9) : 99-509; Roberts et ál., Adv. Virus Res. (1999) 53:301-19). '. I ' \ Los antígenos derivados de un virus de la influenza que se contemplan para usarse en determinadas modalidades incluyen hemaglutinina (HA) , neuraminidasa ' (NA)', nucleoproteína (NP) , proteínas de matriz Mi y M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 y PB2. Véase, por ej . , Nature 437 (7062) : 1162-66. ' :" : Los ejemplos de inmunógenos que son antígenos virales también incluyen, de modo no taxativo, polipéptidos de adenovirus, polipéptidos de alfavirus, polipéptidos de calicivirus (por ej . , un antigeno de cápside de calicivirus) , polipéptidos de coronavirus, polipéptidos de virus del moquillo, polipéptidos del virus del Ébola, polipéptidos de enterovirus, polipéptidos de flavivirus, polipéptidos del virus de la hepatitis (AE) (un antígeno nuclear o de superficie de hepatitis B, glicoproteinas, proteínas nucleares o no estructurales El o E2 del virus de la hepatitis C) , polipéptidos de herpesvirus (tal como se discute en la presente e incluyendo una glicoproteína del virus del herpes simple y del virus de la varicela zoster) , polipéptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipéptidos del virus de la leucemia, polipéptidos del virus Marburg, polipéptidosde ortomixovirus, polipéptidos del virus de papiloma, polipéptidos del virus de parainfluenza (por ej . , los polipéptidos de hemaglutinina y neuraminidasa ) , polipéptidos de paramixovirus, polipéptidos de parvovirus, polipéptidos de pestivirus, polipéptidos del picornavirus (por ej . , un polipéptidos de cápside ,., de poliovirus) , polipéptidos de poxvirus (por ej . , un polipéptidos del virus de la vacuna) , polipéptidos del virus de la rabia (por ej . , una glicoproteína G del virus de la rabia), polipéptidos de reovirus, polipéptidos de retrovirus y polipéptidos de rotavirus.

En determinadas modalidades, los antigenos bacterianos que pueden ser útiles como inmunógenos para inducir una respuesta inmunitaria incluyen antigenos que tienen una parte o partes del polipéptido expuestas en la superficie celular externa de la bacteria. Las partes de los inmunógenos de polipéptido expuestas en la superficie celular son accesibles para células inmunes y/o anticuerpos en el hospedador y por lo tanto pueden ser inmunógenos útiles codificados por los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente.

Los antigenos derivados de las especies Staphylococcus incluyen Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) que son contemplados para usarse como inmunógenos incluyen reguladores de virulencia, tales como el sistema Agr, Sar y Sae, el sistema Arl, homólogos Sar (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, 'SarZ '. y TcaR) , el sistema Srr y TRAP. Otras proteínas Staphylpcó¿cüs que pueden servir como inmunógenos incluyen proteínas Clp, HtrA, MsrR, aconitasa, CcpA, SvrA, Msa, CfvA y CfvB (véase, por ej . , Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay) .Los genomas de dos especies de Staphylococcus aureus (N315 y Mu50) se han secuenciado y están públicamente disponibles, por ejempio en PATRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Résourc'e Integration Center, Snyder et ál., Nucleic Acids Res. (2007) 35 (emisión de base de datos) 401-406. PMID: 17142235) . Tal como lo entenderá un experto en la técnica, las proteínas de Staphylococcus para usarse como inmunógenos también se pueden identificar en otras bases de datos públicas tales como GenBank, Swiss-Prot y TrEMBL.

Los antígenos derivados de Streptococcus pneumoniae contemplados para usarse como inmunógenos en determinadas modalidades descritas en la presente incluyen pneumolisina, PspA, proteína A de unión a la colina (CbpA) , NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA y proteínas de pilina (RrgA; RrgB; RrgC) .Las proteínas inmunogénicas de Streptococcus pneumoniae también se conocen en la técnica y se contemplan para usarse como inmunógenos (véase, por e . , Zysk et ál., Infect. Immun. 2000 68 ( 6) : 3740-43) . La secuencia de genoma completa de una cepa virulenta de Streptococcus pneumoniae se ha secuenciado (véase, por ej . , Tettelin H, et ál. , Science (2001) 293 ( 5529) : 498-506) y, tal como lo entenderá un experto en la técnica, las proteínas de S. pneumoniae para usarse en las composiciones descritas en la presente también se pueden identificar en otras bases de. datos públicas tales como GenBank, Swiss-Prot y TrEMBL.Las proteínas de interés particular de inmunógenos de acuerdo con la presente descripción incluyen factores de virulencia y proteínas que se predice se exponen a la superficie' dél pneumococci (véase, por ej . , Tettelin H., et ál. supra; Frolet et ál., BMC Microbiol. (2010) Jul 12;10:190; Rigden, et ál., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. (2003) 38 (2) : 143-68; Jedrzejas, Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2001) 65(2) :187-207).

Los ejemplos de antígenos bacterianos que se pueden usar como inmunógenos incluyen, de modo no taxativo, polipéptidos Actinomyces, polipéptidos Bacillus, polipéptidos Bacteroides, polipéptidos BordeteÜa, polipéptidos Bartonella, polipéptidos Borrelia (por ej . , B. burgdorferi OspA) , polipéptidos Brucella, polipéptidos Campylobacter, polipéptidos Capnocytophaga, polipéptidos Chlamydia, polipéptidos Corynebacterium, polipéptidos Coxiella, polipéptidos Dermatophilus, polipéptidos Enterococcus , polipéptidos Ehrlichia, polipéptidos Escherichia, polipéptidos Francisella, polipéptidos Fusobacterium, polipéptidos Haemobartonella, polipéptidos Haemophilus (por ej . , proteína de membrana exterior de H. influenzae tipo b) , polipéptidos Helicobacter, polipéptidos Klebsiella, polipéptidos de bacterias de forma L, polipéptidos Leptospira, polipéptidos Listeria, polipéptidos Mycobacteria, polipéptidosMycoplasma , polipéptidos Neisseria, polipéptidos Neorickettsja,, polipéptidos Nocardia, polipéptidos Pasteurella, polipéptidos Peptococcus, polipéptidos Peptostreptococcüs:, polipéptidos Pneumococcus (es decir, polipéptidos S. pneumoniae) (véase descripción en la presente), polipéptidos Proteus, polipéptidos Pseudomonas, polipéptidos Rickettsia, polipéptidos Rochalimaea, polipéptidos Salmonella, polipéptidos Shigella, polipéptidos Staphylococcus, polipéptidos streptococcus del grupo A (por ej . , proteínas M de S. pyogenes), polipéptidos streptococcus del grupo B (S. agalactiae) , polipéptidos Treponema y polipéptidos Yersinia (por ej . , antígenos Fl y V de Y. pestis) .

Los ejemplos de antigenos fúngicos que pueden ser inmunógenos incluyen, de modo no taxativo, polipéptidos Absidia, polipéptidos Acremonium, polipéptidos Alternaría, polipéptidos Aspergillus, polipéptidos Basidiobolus, polipéptidos Bipolaris, polipéptidos Blastomyces , polipéptidos Candida, polipéptidos Coccidioides , polipéptidos Conidiobolus, polipéptidos Cryptpcoccus, polipéptidos Curvalaria, polipéptidos Epidermophyton, polipéptidos Exophiala, polipéptidos Geotrichum, polipéptidos Histoplasma, polipéptidos Madurella, polipéptidos Malassezia, polipéptidos Microsporum, polipéptidos Moniliella, polipéptidos Mortierella, polipéptidos Mucor, polipéptidos Paecilomyces, polipéptidos Penicillium, polipéptidos Phialemonium, polipéptidos Phialophora, polipéptidos Prototheca, polipéptidos Pseudallescheria, polipéptidos Pseudomicrodochium, polipéptidos Pythium, polipéptidos Rhinosporidium, polipéptidos Rhizopus, polipéptidos Scolecobasidium, polipéptidos Sporothrix, polipéptidos Stemphylium, polipéptidos Trichophyton, polipéptidos Trichosporon y polipéptidos Xylohypha.

Los ejemplos de antigenos de parásito protozoarios incluyen, de modo no taxativo, polipéptidos Babésia, polipéptidos Balantidium, polipéptidos Besnoitia, polipéptidos Cryptosporidium, polipéptidos Eimeria, polipéptidos Encephalitozoon, polipéptidos Entamoeba, polipéptidos Giardia, polipéptidos Hammondia, polipéptidos Hepatozoon, polipéptidos Isospora, polipéptidos Leishmania, polipéptidos Microsporidia, polipéptidos Neospora, polipéptidos Nosema, polipéptidos Pentatrichomonas, polipéptidos Plasmodium. Los ejemplos de antigenos;,; · ' de parásitos helminto incluyen, de modo no taxativo, polipéptidos Acanthocheilonema, polipéptidos Aelurostrongylus, polipéptidos Ancylostoma, polipéptidos Angiostrongylus, polipéptidos Ascaris, polipéptidos Brugia, polipéptidos Bunostomum, polipéptidos Cepillaría, polipéptidos Chabertia, polipéptidos Cooperia, polipéptidos Crenosoma, polipéptidos Dictyocaulus, polipéptidos Dioctophyme, polipéptidos Dipetalonema, polipéptidos Diphyllobothrium, polipéptidos Diplydium, polipéptidos Dirofilaria, polipéptidos Dracunculus, polipéptidos Enterobius, polipéptidos Filaroides, polipéptidos Haemonchus, polipéptidos Lagochilascaris, polipéptidos Loa, polipéptidos Mansonella, polipéptidos Muellerius, polipéptidos Nanophyetus, polipéptidos Necator, polipéptidos Nematodirus, polipéptidos Oesophagostomum, polipéptidos Onchocerca, polipéptidos Opisthorchis, polipéptidos Ostertagia, polipéptidos Parafilaria, polipéptidos Paragonimus, polipéptidos Parascaris, polipéptidos Physaloptera, polipéptidos Protostrongylus, polipéptidos Setaria, polipéptidos Spirocerca, polipéptidos Spirometra, polipéptidos Stephanofilaria, polipéptidos Strongyloides, polipéptidos Strongylus, polipéptidos Thelazia, polipéptidos Toxascaris, polipéptidos Toxocara, polipéptidos Trichinella, polipéptidos Trichostrongylus , polipéptidos Trichuris, polipéptidos Uncinaria polipéptidos Wuchereria. (por ej . , P. falcipf¾um circumsporozoito (PfCSP) ) , proteina de superficie esporozoito 2 (PfSSP2), extremo carboxilo de antigeno, de estado hepático 1 (PfLSAl extremo c) , y proteina exportada 1 (PfExp-1), polipéptidos de Pneumocystis, polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma, polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma y polipéptidos de Trypanosoma.

Los ejemplos de antigenos de ectoparásitos incluyen, de modo no taxativo, polipéptido (incluyendo antigenos protectores asi como alérgenos) de pulgas; garrapatas, incluyendo garrapatas duras y garrapatas blancas; moscas, tales como mosquitas, mosquitos, jejenes, moscas negras, tabánidos, moscas de los cuernos, moscas del venado, moscas tsetse, moscas de establo, moscas que causan miasis y mosquitos mordedores; hormigas; arañas, piojos; ácaros y chinches del campo, tales como chinches and vinchuca.

La inducción de una respuesta inmunitaria, que incluye ya sea una respuesta humoral (es decir, una respuesta a células B) o una respuesta mediada por células (que incluye una respuesta a linfocitos T cictótóxicos (CTL) ) o ambas puede también contribuir a la fagocitosis o muerte de organismos adicionales tales como Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, M. leprae y Listeria innocula.Una respuesta inmunitaria a . "::CTL contribuye con la muerte de P. aeruginosa, M. tuberculosis, M. leprae y L. innocula (véase, por ej . , Oykhman et ál. J. Biomed. Biotechnol. (2010: 249482); publicado en línea el 23 de junio de 2010). Por consiguiente, los inmunógenos útiles para las composiciones inmunogénicas descritas en la presente y que pueden codificarse mediante los vectores de expresión recombinante y las partículas de vector · <que comprenden los vectores pueden también derivar de estas bacterias . Las secuencias de aminoácidos de numerosos polipéptidos codificados por el genoma bacteriano de cualquiera de las especies de bacterias y expresados por las bacterias pueden identificarse fácilmente en la técnica y en bases de datos de secuencias de proteínas públicamente disponibles. (Véase también, por ej . , Stover et ál., Nature 406: 959 (2000) ) .

Los inmunógenos tal como se describen en la presente pueden obtenerse o derivar de hongos o parásitos . Los ejemplos de parásitos que inducen una respuesta inmunitaria, que incluyen una respuesta inmunitaria a CTL, incluyen Schistosoma mansoni , Entameoba histolytica , Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparum (véase, por e . , Oykhman, supra) .Por consiguiente, los antígenos de proteína derivados u obtenidos de estos parásitos pueden ser útiles como inmunógenos para inducir una respuesta inmunitaria contra un parásito respectivo . Los inmunógenos pueden también obtenerse o derivar de especies de hongos, ;:que incluyen de modo no taxativo, Cryptococcus neoformans . y Candida albicans (véase, por ej., Oykhman, supra).

Los polipéptidos que comprenden al menos un fragmento inmunogénico de un polipéptido inmunogénico (por ej . , cualquiera de los antígenos asociados a un tumor- ; o antígenos microbianos descritos en la presente y/o: en: la técnica) pueden usarse como inmunógenos y codificarse. ,,por los vectores de expresión recombinante descritos , en " la presente. Un fragmento inmunogénico comprende al menos un epítopo de célula T o al menos un epitopo de célula B.El fragmento inmunogénico puede consistir en al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más aminoácidos contiguos de un polipéptido inmunogénico. Los fragmentos inmunogénicos pueden comprender una cantidad suficiente de aminoácidos contiguos que forman un epítopo lineal y/o pueden comprender una cantidad suficiente de aminoácidos contiguos que permiten que el fragmento se pliegue en la misma (o suficientemente similar) conformación tridimensional que el polipéptido de longitud completa de donde deriva el fragmento y presentar un epítopo o epítopos no lineales (también denominados en la técnica como epítopos conformacionales) . La conformación tridimensional de un fragmento de polipéptido es suficientemente similar al polipéptido de longitud completa cuando la capacidad de unirse y el nivel de unión de un anticuerpo que¦ : se «üine específicamente al polipéptido de longitud completa es sustancialmente similar para el fragmento quepara el polipéptido de longitud completa.

Los ensayos para evaluar si el fragmento inmunogénico se pliega en una conformación comparable al polipéptido:: de longitud completa incluyen, por ejemplo, la capacidad de la proteína de reaccionar con anticuerpos mono o policlorta'lés que son específicos para epítopos naturales o no plegados, la retención de otras funciones de unión al ligando, y la sensibilidad o resistencia del fragmento de polipéptido a la digestión con proteasas (véase, por ej . , Sambrook et ál., Molecular Cloning.-A Laboratory Manual, 3era ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)). Los métodos adicionales para identificar regiones epitópicas incluyen métodos descritos en Hoffmeister et ál., Methods29: 270-281 (2003); Maecker et ál.,J. Immunol. Methods 255:27-40 (2001). Los ensayos para identificar epitopos se describen en la presente y son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en Current Protocole in Immunology, Coligan et ál. (Eds) , John Wiley & Sons, Nueva York, NY (1991).

La identificación de una región inmunogénica y/o epitopo de un inmunógeno de interés puede determinarse ¦¦ : : : '8-*; ? : fácilmente de forma empírica por un experto en la técnica' o por análisis informáticos y modelos informáticos, .usando métodos y técnicas que se practican de forma rutinariá rpór expertos en la técnica. Los métodos empíricos incluyen, ; a modo de ejemplo, sintetizar fragmentos de polipéptidos que comprenden una longitud particular de aminoácidos contiguos de una proteina, o generar fragmentos mediante el usó '" de una o más proteasas y luego determinar la inmunogenicidad de los fragmentos usando cualquiera de los numerosos ensayos de unión o métodos de inmunoensayo practicados de forma rutinaria en la técnica. Los ejemplos de métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo (fragmento policlonal, monoclonal o de unión al antigeno de este) para unir específicamente a un fragmento incluyen, de modo no taxativo, ELISA, radioinmunoensayo, inmunotransferencia, ensayos de unión competitivos, análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y resonancia de plasmones superficiales.

La determinación de las estructuras tridimensionales de un polipéptido, o fragmento inmunogénico de este, de interés puede llevarse a cabo mediante metodologías de rutina para determinar si el fragmento inmunogénico retiene el posicionamiento espacial de los aminoácidos como se encuentran en el polipéptido de longitud completa .Véase, por ejemplo, Bradley et ál., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et ál., Science 310:638 (2005); Diétz ét ál., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson t ál., Nature 450:176 (2007);· Qian et ál., Nature 4,50:25.9 (2007) .También se encuentran disponibles en la técnica herramientas de software, por ejemplo, PSORT o PSORT II, y Spscan (Paquete de Análisis de Secuencias de Wiscbnsin, Genetics Computer Group) que son útiles para predecir los segmentos de transmembrana y topología de membrana .de • polipéptidos que se sabe o se cree que atraviesan .\ixiá membrana celular (véase, por ejemplo, Nakai et ál., tre'nd's Biochem. Sci. 24:34-36 (1999)).

Individualmente, o en combinación con las técnicas descritas anteriormente, y dado un ejemplo de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de interés, un experto en la técnica puede identificar epítopos potenciales del polipéptido (véase, por ej . , Jameson and olf, Comput. Appl. Biosci. 4:181-86 (1988)). A modo de otro ejemplo, Hopp y oods describen el método de hidrofilicidad, que se basa en demostraciones empíricas de la estrecha correlación entre la hidrofilicidad de regiones de polipéptido y su antigenicidad (véase, por ej . , Hopp, Pept . Res. 6:18.3 90 (1993); Hofmann et ál., Biomed. Biochim. Acta 46:855-66 (1987)). Los programas informáticos están también disponibles para identificar epítopos de células B o células T.Un programa BASIC denominado EPIPLOT predice sitios antigénicos de células B en proteínas de sus estructuras primarias calculando y graficando los perfiles de flexibilidad, hidrofilicidad y antigenicidad usando 13 escalas diferentes (véase, por ejemplo, Menendez ét ál., Comput. Appl. Biosci. 6:101-105 (1990) ) .Véase también, por ejemplo, Van Regenmortel, Methods: a compánion to Meth'ods in Enzymology, 9: 465-472 (1996); Pellequer et ál., "Epitope predictions from the primary structure of proteins," In Peptide antigens: a practical approach (ed. G.B. Wisdom) , pp. 7-25; Oxford University Press, Oxford (1994); Van Regenmortel, "Molecular dissection of protein antigens" In Structure of antigens (ed. M.H.V. Van Regenmortel), Tomo 1, pp. 1-27. CRC Press, Boca Ratón (1992) .

Los epitopos de células T de un inmunógeno pueden también identificarse usando un programa de búsqueda de motivos de péptidos basado en algoritmos desarrollados por Rammensee, et ál. (Immunogenetics 50: 213-219 (1999)); por Parker, et ál. (supra), o usando métodos tales como , los descritos por Doytchinova and Flower en Immunol. Cell Biol. 80(3):270-9 (2002); Blythe et ál., Bioinformatics 18:434-439 (2002); Guan et ál., Applied Bioinformatics .2:63-66 (2003); Flower et ál., Applied Bioinformatics 1:167-176 (2002); Mallios, Bioinformatics 17: 942-48 (2001); Schirle et ál., J. Immunol. Meth. 257:1-16 (2001).

Las regiones epitópicas de microbianos y antigenos: y antigenos tumorales que pueden usarse como inmunógénos::;. en los métodos descritos en la presente también se describén en la técnica. Véase a modo de ejemplo, Lamb et ál:, Rev. Infect. Dis. Mar - Apr: Suppl 2:s4¾3 - 447 (1989); Lambret ál., EMBO J. 6:1245-49 (1987); Lamb et ál . , Lepr'. Rev. Suppl 2:131-137 (1986); Mehra et ál . , Proc. Nati.' Acád. Sci. USA 83:7013 -27 (1986); Horsfall et ál., Iiruriunpl . Today 12:211-13 (1991); Rothbard et ál., Curr.:~ Tbp. Microbiol. Immunol. 155:143-52 (1990); Singh et: ál.:, Bioinformatics 17:1236-37 (2001); DeGroot et ál., Vaccine 19:4385-95 (2001); DeLalla et ál., J. Immunol. 163:1725-29 (1999); Cochlovius et ál., J. Immunol. 165:4731- 41 (2000); Consogno et ál., Blood 101:1039-44 (2003); Roberts et ál., AIDS Res. Hum. Retrovir. 12:593-610 (1996); Kwok et ál., Trends Immunol . 22:583-88 (2001); Novak et ál,, J. Immunol. 166:6665-70 (2001).

En determinadas instancias cuando las lineas de células T específicas del antígeno o clones están disponibles, por ejemplo linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) , linfocitos T citotóxicos específicos de virus o bacterias (CTL) , estas células pueden usarse para analizar la presencia de epítopos relevantes usando células diana preparadas con antígenos específicos . Dichas dianas pueden prepararse usando bibliotecas de péptidos sintéticos seleccionados o aleatorios, que podrían usarse Í3¾'ra sensibilizar las células diana por lisis mediante 'los CTL. Otro enfoque para identificar un epítopo relevante cuando las líneas de células T o clones están disponibles es usar metodologías de ADN recombinante . Las bibliotecas' de ADNc o genes de dianas susceptibles a CTL se preparan en primer lugar y se transfectan en células diana "rio susceptibles . Esto permite la identificación y clonación dgl gen que codifica el precursor de proteína del péptido que contiene el epítopo CTL.El segundo paso en este proctesó T s preparar genes truncados a partir del gen clonado relevante, para restringir la región que codifica para el al menos un epítopo CTL.Este paso es opcional si el gen no es muy grande. El tercer paso es preparar péptidos sintéticos de, por ejemplo, aproximadamente 10-20 aminoácidos de largo, que se superponen por5-10 residuos, que se usan para sensibilizar dianas para el CTL. Cuando se muestra que un péptido o péptidos contienen el epítopo relevante, y si se desea, péptidos más pequeños pueden prepararse para establecer el péptido de mínimo tamaño que contiene el epitopo . Estos epitopos están típicamente, pero no necesariamente, contenidos dentro de 9-10 residuos para epitopos CTL y hasta 20 o 30 residuos para epitopos de linfocitos T colaboradores (HTL) .

De manera alternativa, los epitopos pueden definirse por elución directa de péptidos que no están covalenteménte unidos por moléculas de complejo de histocompatibilidad particular (MHC) seguido secuenciación de aminoácidos de los péptidos eluidos (véase, por ejemplo, Engelhard et ál., Cáncer J. 2000 May; 6 Suppl 3 : S272-80) . Brevemente, los péptidos eluidos se separan usando un método de purificación tal como HPLC :y fracciones individuales se someten a prueba para detectar su capacidad de sensibilizar dianas para la lisis de. CTL .o para inducir la proliferación de secreción de citociná "en HTL. Cuando se identifica que una fracción contiene el péptido, se purifica adicionalmente y se somete a análisis de secuencias . La secuencia de péptidos puede también determinarse usando espectrometría de masas en tándem. Luego se prepara un péptido sintético y se somete a prueba con el CTL o HTL para corroborar que se identificó la secuencia correcta y el péptido.

Los epítopos pueden también identificarse usando análisis informáticos, tales como el programa Tsites (véase, por ej . , Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et ál., Mol. Iramunol. 33:145-155, 1996), que busca motivos de péptidos que tienen el potencial de elicitar respuestas Th.Los péptidos CTL con motivos adecuados para unirse a MHC clase I o clase II de murino y humano pueden identificarse de acuerdo con BIMAS (Parker et ál., J. Immunol . 152:163, 1994) y otros análisis1; 'de predicción de unión a péptidos HLA. Brevemente, "las secuencias de proteínas, por ejemplo de componentes ; o antígenos microbianos, o componentes de células tumoxalés'' o antígenos tumorales se examinan para detectar la presencia de motivos de unión a MHC. Estos motivos de unión, que existen para cada alelo de MHC, son residuos de aminoácidos conservados, generalmente en las posiciones 2 (o 3) y 9 (o 10) para péptidos de unión de clase I de MHC que: .tienen típicamente 9-10 residuos de largo. Los péptidos sintétidós se preparan luego que comprenden aquellas secuencias que portan los motivos de unión a MHC, y posteriormente dichos péptidos se someten a prueba para detectar su capacidad de unirse a moléculas de MHC. El ensayo de unión a MHC puede llevarse a cabo ya sea usando células que expresan altas cantidades de moléculas de MHC vacías (no ocupadas) (ensayo de unión celular) o usando moléculas de MHC purificadas . Por último, los péptidos de unión a MHC se someten a prueba para detectar su capacidad de inducir una respuesta de CTL en individuos no sometidos a experimentación, ya sea in vitro usando linfocitos humanos o in vivo usando animales transgénicos a HLA. Estos CTL se someten a prueba usando células diana sensibilizadas con péptidos, y dianas que naturalmente procesan el antígeno, tales como células infectadas virales o células tumorales . Para confirmar además la inmunogenicidad, se puede someter a prueba un péptido usando un modelo de ratón transgénico HLA A2 ;;;y o cualquiera de una variedad de ensayos de estimulación in vitro. ; En determinadas modalidades, un inmunógeno (es! decir, un antigeno asociado con un tumor o antígeno de un microorganismo de enfermedad infecciosa) incluye especies de polipéptidos que tienen una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos conocida y disponible en la técnica para "él inmunógeno respectivo. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidas y pueden ocurrir naturalmente en el polipéptido o pueden introducirse cuando el polipéptido se produce recombinantemente . Las sustituciones, eliminaciones y adiciones de aminoácidos pueden introducirse en un polipéptido usando métodos de mutagénesis conocidos y practicados rutinariamente (véase, por ej . , Sambrook et ál. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3era ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)). Los procedimientos de mutagénesis específicos del sitio (o específicos del segmento) y dirigidos a oligonucleótidos pueden emplearse para proporcionar ' un polinucleótido alterado que tiene codones particulares modificadosde acuerdo con la sustitución, eliminación o inserción deseada. Las variantes de eliminación otruncación de inmunógenos puede también construirse usando sitios., de endonucleasa de restricción conveniente adyacentes a la eliminación deseada. ras la restricción, las salientespueden llenarse y el ADN volver a ligarse; De manera alternativa, pueden usarse técnicas de mutagénesis aleatorias, tales como la mutagénesis de escaneo de alanina, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores y mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para preparar variantes de polipéptido inmunógeno (véase, por ej . , Sambrook et ál., supra) La's variantes de un inmunogeno particular (o fragmentó de polipéptido de este) incluye un inmunogeno de polipéptido que tiene al menos 85%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para cualquiera de los ejemplos de secuencias de aminoácidos conocidos en la técnica.

Estas variantes de inmunogeno de polipéptido retienen una o más actividades o funciones biológicas del inmunogeno respectivo . En particular, las variantes de un inmunogeno retienen, de forma estadísticamente, clínicamente o biológicamente significativa, la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria (por ej . , una respuesta humoral (es decir, respuesta de células B) , respuesta mediada por células (es decir, respuesta de células T (que incluyen una respuesta de linfocitos T citotóxicos) ) o ambas respuestas humoral y respuesta mediada por células en un sujeto. Dadas las varias técnicas y métodos de biología molecular, expresión de proteínas y aislamiento de protei;nas practicadas rutinariamente en la técnica para introducir mutaciones en un polipéptido, preparar fragmentos '" dé polipéptido, aislar los fragmentos y variantes y analizar los mismos, las variantes de polipéptidos de inmunogeno y fragmentos que tengan las actividades biológicas deseadlas pueden llevarse a cabo fácilmente y sin experimentación indebida.

Una variedad de criterios conocidos por los expertos en la técnica indica si un aminoácido que está sustituido en una posición particular en un péptido o polipéptido es conservativo (o similar) . Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos similares o aminoácidos conservativos es una donde un residuo de aminoácidos se remplaza con un residuo de aminoácidos que tenga una cadena lateral similar. Los aminoácidos similares pueden incluirse en las siguientes categorías: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ej . , lisina, arginina, histidina) ; aminoácidos con cadenas laterales ácidas (por ej . , ácido aspártico, ácido glutámico) ; aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas (por ej . , glicina, asparagina, glutamina, !serina, treonina, tirosina, cisteina, histidina); aminoácidos con cadenas laterales no polares (por ej . , alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) ; aminoácidos con cadenas laterales beta-ramificadas (por ej . , treonina, valina, isoleucina) y aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (por e , tirosina, fenilalanina, triptófano) .La prolina, que es considerada más difícil de clasificar, comparte propiedades con aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (por ej . , leucina, valina, isoleucina y alaninaf.En determinadas circunstancias, la sustitución de . áéido glutámico por glutamina o ácido aspártico por asparágaha puede considerarse una sustitución similar en que glutárüiha y asparagina son derivados de amida de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente . Tal como se entiende en la técnica la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados de estos del polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido (por ej . , usando GENEWORKS, Align, el algoritmo BLAST, u otros algoritmos descritos en la presente y practicados en la técnica) .

Tal como se describe en la presente para fragmentos inmunogénicos, los ensayos para evaluar si una respectiva variante se pliega en una conformación comparable al polipéptido no variante o fragmento incluye, por ejemplo, la capacidad de la proteina de reaccionar con anticuerpos mono o policlonales que son específicos para epítopos naturales o no plegados, la retención de funciones de unión al ligando, y la sensibilidad o resistencia de la prot ína mutante a la digestión con proteasas (véase, por ej . , Sambrook et ál., supra ). Dichas variantes pueden identificarse, caracterizarse y/o realizarse de acuerdo con métodos descritos en la presente u otros métodos conocidos en la técnica, que se practican rutinariamente por expertos en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas que se administran a un sujeto de acuerdo con métodos descritos en la pi÷es,epte pueden incluir al menos un excipiente farmacéuticamente (o fisiológicamente) adecuado . Cualquier excipiente o portador fisiológicamente o farmacéuticamente adecuado (es decir, un material no tóxico que no interfiere con la actividad del ingrediente activo) conocido para los expertos en la técnica para usar en composiciones farmacéuticas puede emplearse en las composiciones inmunogénicas descritas en la presente. Los ejemplos de excipientes incluyen diluyentes y portadores que mantienen la estabilidad e integridad de proteínas . Los excipientes para uso terapéutico son conocidos y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21a Ed . Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)), y se describen en más detalle en la presente.

Adyuvantes y composiciones adyuvantes Los métodos descritos en la presente comprenden administrar a un sujeto al menos un adyuvante que pretende potenciar (o mejorar, aumentar) la respuesta inmunitia i&ijal inmunógeno (es decir, aumentar el nivel de la respuesta inmunitaria específica al inmunógeno de . forma estadísticamente, biológicamente o clíni:cam<gn¡te significativa en comparación con el nivel de la respuesta inmunitaria específica en ausencia de administrar ... el adyuvante) . Los métodos y técnicas para determinar el nivel de una respuesta inmunitaria se describen en más detalle -en la presente y se practican rutinariamente en la técnica.

Los ejemplos de adyuvantes que pueden usarse en los métodos descritos en la presente incluyen, pero no necesariamente de modo no taxativo, lo siguiente . Los adyuvantes que pueden usarse en los métodos descritos en la presente incluyen adyuvantes que pueden ser útiles para potenciar la respuesta de CTL al inmunogeno (o a la célula o partícula que contiene inmunogeno) y/o potenciar la respuesta a la célula T CD4 de memoria. Los adyuvantes deseados aumentan la respuesta al inmunogeno sin provocar cambios conformacionales en el inmunogeno que pueda afectar de manera adversa la forma cualitativa de la respuesta .Los adyuvantes adecuados incluyen sales de aluminio, tales como alumbre (sulfato de aluminio de potasio) , u otros adyuvantes que contienen aluminio; adyuvantes relacionados con lípido A no tóxico tal como, de modo no táxátiyq, lípido A no tóxico de monofosforilo (véase, por ej . , Tomai et ál., J. Biol. Response Mod. 6:99-107 (1987) ) , GLA descrito en la presente; lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado (MPL) (véase, por ej . , solicitud de patenté: :de Reino Unido No. GB 2220211); adyuvantes tales como; QS21 y QuilA, que comprenden un glicósido triterpénico o sapoñina aislados de la corteza del árbol de Quillaja saponaria Molina encontrado en América del Sur (véase, por éj; . , Kensil et ál., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvánt Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente estadounidense No. 5, 057, 540) .Otros adyuvantes adecuados incluyen emulsiones de aceite en agua (tales como aceite de maní o escualeno) , opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como lipido A monofosforilo (véase, por ej . , Stoute et ál., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante adecuado es CpG (Bio orld Today, Nov. 15, 1998). Otros adyuvantes adecuados incluyen agonistas del receptor tipo Toll y miméticos de lipido A tales como 4-fosfatos de glucosaminida de amino-alquilo (AGP) (véase, por ej . , RC527 descrito en Baldridge et ál., Expert Opin. Biol. Ther., 4 (7) : 1129-1138 (2004), y RC-544 descrito en Persing et ál . , Trends in Microbiology, 10(10) (suppl. ) :S32-S37 (2002)).

Tal como se describe en la presente, un adyuvante adecuado es una sal de aluminio, tal como hidróxido*' ;de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio . Dichos adyuvantes pueden usarse con o sin otros ageftt'es inmunoestimulantes específicos tales como MPL o ; QS21, aminoácidos monoméricos o poliméricos tal como poliglutámico o polilisina . Otra clase de adyuvantes adecuados son formulaciones de emulsión de aceite en agua (también denominadas en la presente emulsiones establea;, de aceite en agua). Dichos adyuvantes pueden usarse opcionalmente con otros agentes inmunoestimulantes específicos como péptidos de muramilo (por acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- DP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 * dipalmitoil-sn- -glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida™) , u otros componentes de pared de célula bacteriana . Las emulsiones de aceite en agua incluyen (1) MF59 ( O 90/14837), que contiene 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85 (que contienen opcionalmente varias cantidades de MTP-PE) formulados en partículas de submicrones usando un microfluidizador tal como microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics , Newton Mass.); (2) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado con plurónico y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicrónes'H' o mezclado en vórtex para generar una emulsión con tamaño- de partículas más grandes, y (3) sistema adyuvante Ribi (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% ...de escualeno, 0.2% de Tween 80 y uno o más componentes : de pared de células bacterianas del grupo que consiste ,. en monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM)<'f >y esqueleto de pared celular (CWS) , preferentemente ¡VÍPL+fZWS (Detox™) .También como se describe anteriormente : ib's adyuvantes adecuados incluyen adyuvantes de saponina, tal como Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) o partículas generadas de estos tal como ISCOM (complejos inmunoestimulantes) y ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen Adyuvante Completo de Freund (CFA) (que es adecuado para el uso no humano pero no para el uso humano) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) .Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 y IL-12) , factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF) .

Otro adyuvante que puede usarse en las composiciones descritas en la presente se identifica mediante la fórmula química (I) y se denomina lípido A de glucopiranosil (GLA) : independientemente del grupo de hidrógeno, fosfato y sales de fosfato. El sodio y el potasio son ejemplos de contraiones para las sales de fosfato. Los restos Rl, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo de hidrocarbilo que tiene 3 a 23 carbonos, representados por C3-C23.Para mayor claridad se explicará que cuando un resto "se selecciona independientemente de" un grupo especifico que tiene varios miembros, debería entenderse que el miembro seleccionado para el primer resto no tiene impacto o limita de forma alguna la opción del miembro seleccionado para el segundo resto. Los átomos de carbono a los cuales Rl, R3, R5 y R6 se unen son asimétricos, y por lo tanto pueden existir en su forma estereoquímica R o S.En una modalidad todos estos átomos de carbono están en su forma estereoquímica R, mientras que en otra modalidad todos estos átomos están en su forma estereoquímica S.

"Hidrocarbilo" se refiere a un resto químico completamente formado por hidrógeno y carbono, donde la disposición de los átomos de carbono puede ser una> cadena lineal o ramificada, no cíclica o cíclica, y los enlaces entre átomos de carbono adyacentes pueden ser todos enlaces simples, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo saturado, o puede haber enlaces dobles o triples presentes entre dos átomos de carbono adyacentes cualesquiera, :: es decir, para proporcionar un hidrocarbilo insaturado, y el número de átomos de carbono en el grupo hidrocarbilo es de entre 3 y 24 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un alquilo, donde los alquilos de cadena lineal representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras que los alquilos ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, isopentilo, y similares . Los hidrocarbilo cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares; mientras que los hidrocarbilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares . Los hidrocarbilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (mencionados como "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente, si el hidrocarbilo es no cíclicc ; y cicloalquenilo y cicloalquinilo, respectivamente, si el hidrocarbilo es al menos parcialmente cíclico) .Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metií-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2, 3-dimetil-2-butenilo, y similares; mientras que los alquinilos representativos^' de cadena recta y ramificadaincluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo, y similares.

El adyuvante de la fórmula (I) puede obtenerse mediante métodos sintéticos conocidos en la técnica, por ejemplo, la metodología sintética descrita en la publicación internacional PCT No.WO 2009/035528, la cual se incorpora a la presente como referencia, asi como las publicaciones identificadas en WO 2009/035528, donde cada una de esas publicaciones también se incorpora a la presente como referencia . Determinados adyuvantes pueden también obtenerse comercialmente . Un adyuvante preferido es el producto No.699800 identificado en el catálogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster AL (véase El en combinación con E10, más adelante) .

En varias modalidades de la invención, el adyuvante tiene la estructura química de la fórmula (I) pero los restos Al, A2, Rl, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de subconjuntos de las opciones proporcionadas previamente para estos restos, donde dichos subconjuntos se identifican a continuación como El, E2, etc.

El: Al es fosfato o sal de fosfato y A2 es hidrógeno.

E2: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C3-C21; y R2 y R4 son hidrocarbilo C5-C23. : " : E3: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C5-C17; y R2 y R4 son hidrocarbilo C7-C19. ' "'i E4: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C15; y R2 y R4 son hidrocarbilo C9-C17.

E5: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C13; y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C15.

E6: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C9-C15; y R2 y R4 son hidrocarbilo C11-C17.

E7: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C7-C13; y R2 y R . son hidrocarbilo C9-C15.

E8: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo C11-C20; y R2 y R4 son hidrocarbilo C12-C20.

E9: Rl, R3, R5 y R6 son alquilo Cll y R2 y R4 son hidrocarbilo C13.

E10: Rl, R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.

En determinadas modalidades, cada uno de E2 a E10 se combina con la modalidadEl, y/o los grupos hidrocarbilo' ide E2 a E9 son grupos alquilo, preferentemente grupos. : alquilo de cadena lineal. El adyuvante de fórmula (I),: p.uede formularse como parte de una composición farmacéutica, opcionalmente con un coadyuvante, cada uno expuesto : más adelante. Con respecto a esto, se hace referencia a la publicación de patente estadounidense No.2008/0131466" :1a cual proporciona formulaciones, tal como una formulación acuosa (AF) y formulaciones de emulsión estables (S:E) para el adyuvante GLA, donde dichas formulaciones puede usarse para cualquiera de los adyuvantes de fórmula (I).

En otra modalidad, el adyuvante es un adyuvante de tipo lipido A sintético tal como se describe en la solicitud internacional PCT No. WO 2010/141861, y tiene una estructura que se selecciona de la siguiente fórmula química (II) : o una sal farmacéuticamente aceptable dé: este, donde:Ll, L2, L3, L4, L5 y L6 son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de -O-, -NH- y -(CH2)-; L7, L8, L9 y LIO son iguales o diferentes, y en cualquier aparición pueden estar ausentes o ser -C(=0)-; Yl[ es»; Un grupo funcional ácido; Y2 y Y3 son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente de -OH, -SH, y¾ün grupo ácido funcional; Y4 es -OH o -SH; Rl, R3, R5 y ' R6 'son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo de alquilo C8-C13; y R2 y R4 son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente del grupo de alquilo C6-C11.

Opcionalmente, tal como se describe en más detalle más adelante y en la presente, dos o más adyuvantes diferentes pueden usarse simultáneamente, tal como a modo de ejemplo no taxativo, una sal de aluminio con MPL, una sal de aluminio con QS21, MPL con QS21, y sal de aluminio alumna, QS21, y MPL j untos .Asimismo, puede usarse adyuvante incompleto de Freund (véase, por ej . , Chang et ál., Advanced Drug Delivery Revie s 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinación con cualquiera de una sal de aluminio, QS21 y MPL y todas las combinaciones de estos.

En determinadas modalidades, el adyuvante de la fórmula (I) puede formularse en una composición farmacéutica (o composición adyuvante) , opcionalmente -con un coadyuvante tal como se describe anteriormente, cada uno tal como se describe más adelante o cualquier otro adyuvante descrito en la presente o disponible ' en" la técnica. Con respecto a esto, se hace referencia a la publicación de patente estadounidense No .2008/0131466 la cual proporciona formulaciones, tal como una formulación acuosa (AF) y formulaciones de emulsión estables (SE) para el adyuvante GLA, donde dichas formulaciones pueden. ; _us¾r,se. con respecto a cualquiera de los adyuvantes de fórmula (?')'.

Tal como se proporciona en la presente, el adyuvante de fórmula I puede usarse en combinación con un segundo adyuvante, mencionado en la presente como un coadyuvante. En tres ejemplos de modalidades, el coadyuvante puede ser un sistemas de administración, o puede ser un inmunopotenciador, o puede ser una composición que funciona como un sistema de administración y un inmunopotenciador (véase, por ej . , O'Hagan et ál., Pharm. Res. 21 ( 9) : 1519-30 (2004)). El coadyuvante puede ser un inmunopotenciador que actúa por medio de una biomolécula miembro de la familia de receptores tipo Toll . Por ejemplo, el coadyuvante puede seleccionarse por su modo de acción primario, tal 'como ! un agonista de TLR4, o un agonista de TLR8 o un agonista de TLR9. De manera alternativa, o complementaria, el coadyuvante puede seleccionarse por sus propiedades como portador; por ejemplo, el coadyuvante puede ser una emulsión, un liposoma, una microparticula o alumbre.

En una modalidad, el coadyuvante es alumbre; dónde este término se refiere a sales de aluminio, tales como fosfato de aluminio (A1P04) e hidróxido de aluminio (Al (OH) 3 ). Cuando se usa alumbre como el coadyuvante, el alumbre puede estar presente, en una dosis de vacuna, en una cantidad de alrededor de 100 a 1, 000 ug, o 200 a 800 µg, o 300 a 700 g o 400 a 600 pg.El adyuvante de la fórmula (1), está comúnmente presente en una cantidad menor que la cantidad del alumbre, y en varias modalidades especificas el adyuvante de la fórmula (1) , con base en el peso, está presente en 0.1-1%, o 1-5%, o 1-10%, o 1-100% con respecto al peso del alumbre.

En una modalidad particular, el adyuvante es una emulsión que tiene propiedades adyuvantes de vacunas . Dichas emulsiones incluyen emulsiones de aceite en agua. El adyuvante incompleto de Freund (IFA) es uno de esos adyuvantes . Otra emulsión de aceite en agua adecuada es el adyuvante MF-59™ que contiene escualeno, monooleato de polioxietlleno sorbitán (también conocido como . el tensioactivo Tween™ 80) y trioleato de sorbitán. El escualeno es un compuesto orgánico natural que se obtiene originalmente del aceite de hígado de tiburón, aunque también puede obtenerse de fuentes vegetales (principalmente aceites vegetales) , incluidas las semillas de amaranto, salvado de arroz, germen de trigo y aceitunas . Otros adyuvantes adecuados son los adyuvantes ontanide™ (Seppic Inc., Fairfield NJ) incluidos Morítahíd'e™ ISA 50V, que es un adyuvante basado en aceitemineral , Montanide™ ISA 206 y Montanide™ IMS 1312. Mientras · que el aceite mineral puede estar presente en el coadyuvante,,.; en una modalidad el o los componentes de aceite , ¡de;..¿jijas composiciones de vacuna de la presente invención son aceites metabolizables .

Los ejemplos de inmunopotenciadores que pueden usarse en la práctica de los métodos descritos en la presente como coadyuvantes incluyen: MPL™; MDP y derivados; oligonucleótidos; ARN de cadena doble; patrones moleculares asociados a patógenos alternativos (PAMPS); saponinas; inmunopotenciadores de molécula pequeña (SMIP) ; citocinas y quimiocinas .

En una modalidad, el coadyuvante es adyuvante MPL™, que se encuentra comercialmente disponible de GlaxoSmithKline (desarrollado originalmente por Ribi IramunoChem Research, Inc. Hamilton, T) .Véase, por ejemplo, Ulrich y Myers, Capitulo 21 de Vaccine Design:The .Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds . Plenum Press, Nueva York (1995) . El adyuvante AS02™ y el adyuvante AS04™ están relacionados con el adyuvante MPL™ y también son adecuados como coadyuvantes para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente. El adyuvante AS02™ es una emulsión de aceite en agua que contiene los adyuvantes MPL™ yQS-21™ (un adyuvante de saponina expuesto en otra parte de la presente) . El adyuvante AS04™ contiene el adyuvante MPL™ y alumbre. El adyuvante MPL™ se prepara a partir de lipopolisacárido (LPS) de Salmonella minnesota R595 mediante el tratamiento de la LPS con hidrólisis suave de ácido y base seguidac.de la purificación del LPS modificado. ¦ ¦ ¦» : En otra modalidad, el coadyuvante es una saponina tal como las derivadas de la corteza de la especie de árboles Quillaja saponaria, o una saponina modificada, véase por ejemplo, las patentes estadounidenses No .5, 057 , 540; 5,273,965; 5,352,449; 5,443,829; y 5, 560, 398. El producto adyuvante QS-21™ vendido por Antigenics, Inc. Lexington, MA es un ejemplo de un coadyuvante que contiene saponina que puede utilizarse con el adyuvante de la fórmula (l).Un coadyuvante alternativo, relacionado con las saponinas, es la familia de adyuvantes ISCOM™, originalmente desarrollada por Iscotec (Suecia) y formada típicamente a partir de saponinas derivadas de la Quillaja saponaria o de análogos sintéticos, colesterol y fosfolípidos, formando con todos ellos una estructura similar a un panal.

En aun otra modalidad, el coadyuvante es una citocina que funciona como coadyuvante (véase, por ej . , Lin et "al., Clin. Infect. Dis. 21 ( 6) : 1439-49 (1995); Taylor, : Infect. Immun. 63 (9) : 3241-44 (1995) ; y Egilmez, Cap. 14 in ' Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, John Wiley & Sons, Inc. (2007)). En varias modalidades, la citocina puede ser, por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitps y macrófagos (G -CSF) (véase, por ej . , Change et ál., Hematology 9(3):207-15 (2004); Dranoff, Immunol. ¦ :¾év. 188:147-54 (2002), y la patente estadounidense 5, 679,; 6): o un interferón, tal como un interferón tipo ; i-I : ¿fpor ejemplo, interferón-a (IFN-a) o interferón-ß (IFN-ß) ) , o un interferón tipo II, por ejemplo, interferón-y (IFN-?) ) véase, por e . , Boehm et ál., Ann. Rev. Immunol. 15:749-95 (1997); y Theofilopouloset ál., Ann. Rev. Immunol. 23:307-36 (2005); una interleucina, incluidas específicamente la interleucina-?a (IL-la) , interleucina-?ß (IL-?ß) , interleucina-2 (IL-2) (véase, por ej . , Nelson, J. Immunol. 172 ( 7 ): 3983-88 (2004); interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-12 (IL-12) (véase, por ej . , Portielje et ál., Cáncer Immunol. Immunother. 52(3) :133-44 (2003); y Trinchieri, Nat . Rev. Immunol. 3(2): 133-46 (2003)); interleucina-15 (11-15), interleucina-18 (IL-18); ligando de tirosina cinasa de hígado fetal 3 (Flt3L), o factor de necrosis tumoral a (TNF ).El adyuvante de la fórmula (I) puede coformularse con la citocina antes de la combinación con el antígeno de vacuna, o el antígeno, el adyuvante de la fórmula (I) y el coadyuvante de citOcina pueden formularse por separado y combinarse después.

Una composición que comprende el inmunógeno o : una composición que comprende un vector de expresión recombinante que codifica el inmunógeno o una partícula de vector que comprende el vector se envasan y suministran en vialesseparados que los que contienen el adyuvante. Las etiquetas adecuadas se envasan típicamente con cada composición que indica la aplicación terapéutica pretendida . La elección de un adyuvante y/o excipiente depende de la estabilidad del inmunógeno, vector de expresión recombinante y/o partícula de vector; la víade administración; el cronograma de dosificación y la eficacia del adyuvante para las especies vacunadas . Para la administración en humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es uno que se aprobó o esaprobable para la administración en humanos por los organismos reguladores pertinentes . Por ejemplo, tal como se discute en la presente y es conocido en la técnica, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración en humanos.

Los adyuvantes útiles para usar en los métodos descritos en la presente son adyuvantes fisiológica ofarmacéuticamente adecuados para el sujeto al qué sé' le administra el adyuvante . Las composiciones adyuvantes comprenden al menos un adyuvante (es decir, uno o más adyuvantes) y, opcionalmente, al menos un excipiente fisiológica ofarmacéuticamente aceptable (o aceptable) . Cualquier excipiente o portador fisiológicamente o farmacéuticamente adecuado (es decir, un material;.;, no tóxico que no interfiere con la actividad del ingrediente activo) conocido para los expertos en la técnica para . usar en composiciones farmacéuticas puede emplearse en -las composiciones adyuvantes descritas en la presente. Los ejemplos de excipientes incluyen diluyentes y portadores que mantienen la estabilidad e integridad del o los componentes del adyuvante . Los excipientes para uso terapéutico son conocidos y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21a Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)), y se describen en más detalle en la presente.

Vectores de expresión recombinante En una modalidad, se proporcionan vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos un inmunogeno que induce una respuesta inmunitaria al inmunogeno. Para obtener la transcripción y traducción eficaz del inmunogeno, las secuencias de polinucleótido codificante en cada vector deberían incluir al menos una secuencia de control de expresión adecuada (también denominada un rasgo o secuencia de expresión reguladora) (por ej . , promotora, potenciadóra, líder), que se describe en más detalle en la presente, ,. que está operativamente unida a la o las secuencias:: :de polinucleótidos codificantes . Por lo tanto, se proporcionan estos vectores de expresión recombinante para dirigir- :1a expresión del inmunogeno o para dirigir la coexpresión de al menos dos inmunógenos en cualquier célula hospeda'Ü'rira adecuada que se transformó, transdujo o transíectó¦ con el vector de expresión recombinante o donde se introdujo una partícula de vector que contenia el vector de expresión recombinante .

Los vectores de expresión recombinante descritos en la presente pueden codificar uno o más inmunógenos (es decir, al menos uno, al menos dos, al menos tres inmunógenos, etc.), los inmunógenos se describen en más detalle en la presente. En modalidades particulares, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos de un microorganismo infeccioso (por ej . , un virus, bacteria, hongo o parásito) puede codificarse por un vector de expresión recombinante . En otra modalidad especifica, un vector de expresión recombinante descrito en la presente puede codificar al menos uno, dos, tres o más antígenos asociados a un tumor. Estos antígenos asociados a un tumor se describen en más detalle en la presente y pueden ser, por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor de un antígeno de carcinoma de células renales, un antígeno de cáncer , de próstata (por ej . , fosfatasa de ácido prostético, antigeno prostético específico, NKX3.1, y antígeno prostético específico de membrana), un antígeno de mesotelioma/: ; un antígeno de cáncer pancreático, un antígeno de melartoma;; ; un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de : cáncer colorrectal, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de ovario o cualquier antígeno asociado' con ; un tumor o cáncer descrito en la presente y en la técnica'.

Los vectores de expresión recombinante pueden usarse para la expresión de cualquiera de uno o más inmunógenos descritos en la presente. En modalidades particulares, el vector de expresión recombinante se administra a una célula adecuada (por ejemplo, una célula que presenta antigenos es decir, una célula que muestra un complejo de péptido/MHC en su superficie celular, tal como una célula dendritica) o tejido (por ej . , tejido linfoide) que inducirá la respuesta inmunitaria deseada (es decir, una respuesta humoral especifica (es decir, respuesta a células B) y/o inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células especificas, que puede incluir una respuesta a CTL específica de inmunógeno) . Los vectores de expresión recombinante pueden por lo tanto también incluir, por ejemplo, elementos reguladores transcripcionales específicos de tejido linfoide (TRE) tales corno un linfocito B, linfocito T o TRE específico de células dendríticas . Los TRE específicos de tejido linfoide son conocidos en la técnica (véase, por ej., Thompson ; et ,.ß?. (1992), Mol. Cell. Biol . 12, 1043-1053; Todd et ál. :( 19Ó3) , J. Exp. Med. 177, 1663-1674; Penix et ál. (1993), J. Éxp. Med. 178, 1483-1496) . , ,„.; En una modalidad particular, el vector de expresión recombinante es ADN de plásmido o ADN de cósmido . El : ADl ' de plásmido o ADN de cósmido que contienen uno o más polinucleótidos que codifican un inmunógeno tal como se describe en la presente se construyen fácilmente usando técnicas estándar conocidas en la técnica. El genoma de vector puede construirse típicamente en forma de plásmido que pueden luego transfectarse en una línea celular productora o empaquetadora . El plásmido generalmente comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias. En la técnica se conocen bien tales plásmidos .Además, los vectores que incluyen un origen procariota de replicación también pueden incluir un gen cuya expresión otorga un marcador detectable o seleccionable tal como resistencia al fármaco. Los productosde resistencia al fármaco bacteriano típicos son aquellos que otorgan resistencia a ampicilina o tetraciclina . Para que el análisis confirme que las secuencias de nucleótidos correctas se incorporan en plásmidos, el plásmido puede replicarse en E;. ¦ Cóii, purificarse y analizarse mediante digestión de endónuciieasa de restricción y/o su secuencia de nucleótidos determinada por métodos convencionales.

En otras modalidades particulares, el ve;ctp£.; : de expresión recombinante es un vector viral. Los ejemplos: de vectores virales de expresión recombinante incluyen i un genoma de vector lentiviral, genoma de vector de poxvi'rus, genoma de vector de virus de la vacuna, genoma de vector de adenovirus, genoma de vector de virus asociado con adenovirus, genoma de vector de virus del herpes y genoma de vector de virus alfa. Los vectores virales pueden estar vivos, atenuados, condicionados a replicacion o deficientes de replicacion, y típicamente es un vector no patogénico (defectuoso) competente de replicacion.

A modo de ejemplo, en una modalidad específica, cuando el vector viral es un genoma de vector de virus de la vacuna, el polinucleótido que codifica un inmünógeno de interés puede insertarse en un sitio no esencial de un vector viral de la vacuna . Dichos sitios no esenciales se describen, por ejemplo, en Perkus et ál., Virology 152:285 (1986); Hruby et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:3411 (1983); Weir et ál., J. Virol. 46:530 (1983)). Los promotores adecuados para usar con los virus de la vacunaincluyen de modo no taxativo P7.5 (véase, por ej . , Cochran et ál., J. Virol. 54:30 (1985); Pll (véase, : por ej . , Bertholet, et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA! 82: 2096 (1985)); y CAE-1 (véase, por e . , Patel et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:9431 (1988)). Las cepas altamente atenuadas del virus déla vacunason más aceptables para usar en humanos e incluyen . Lister, NYVAC, que contiene eliminaciones de genoma específicas (véase, por ej . ,; Guerra et ál., J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia et ál., AlDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47 (1992)), o'MVA (véase, por ej . , Gheradi et ál., J. Gen. Virol. 86:2925-36 (2005); Mayr et ál., Infection 3:6-14 ( 1975) ) .Véase también Hu et ál. (J. Virol. 75:10300-308 (2001), que describe el uso de un virus de la enfermedad tipo Yaba como un vector para la terapia del cáncer); patente estadounidense Nos. 5, 698,530 y 6, 998, 252.Véase también, por ej . , la patente estadounidense No. 5, 43, 964.Véase también las patentes estadounidenses No. 7,247,615 y 7,368,116.

En determinadas modalidades, un vector de adenovirus o vector de virus asociado a adenovirus puede usarse para expresar un inmunógeno de interés . Se describieron varios sistemas de vectores de adenovirus y métodos para administrar los vectores (véase, por ej . , Molin et ál., J. Virol. 72:8358-61 (1998); Narumi et ál., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998); Mercier et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004); patentes estadounidenses No.6, 143,290; 6, 596, 535; 6, 855, 317; 6, 936,257; 7,125, ;717; 7,378,087; 7,550,296) .

Los genomas de vector retroviral pueden incluir : los basados en el virus de leucemia de murino (MuLV) , virus :de leucemia de mono gibón (GaLV) , retrovirus ecotrópicos, virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) , virus dé" la inmunodeficiencia humana (VIH) , y combinaciones (véase,„por ej., Buchscher et ál., J. Virol. 66:2731-39 (1992); Johánn et ál., J. Virol. 66:1635-40 (1992); Sommerfelt et ál., Virology 176:58-59 (1990); Wilson et ál., J. Virol. 63:2374-78 (1989); Miller et ál., J. Virol. 65:2220-24 (1991); Miller et ál., Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990); Kolberg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta et ál., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991) ) .

En una modalidad más especifica, el vector viral de expresión recombinante es un genoma del vector lentiviral . El genoma puede derivar de cualquiera de una gran cantidad de vectores adecuados basados en el genoma lentiviral disponibles, que incluyen aquellos identificados para las aplicaciones de terapia génica de humanos (véase, por e . , Pfeifer et ál., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet . 2:177-211 (2001)). Los genomas de vector lentiviral adecuados incluyen los basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) , VIH-2, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de anemia infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) , y virus maedi/visna . Una característica deseable de lentivirus ;es que son capaces de infectar tanto células que se dividen como células que no se dividen, aunque las células diana no necesitan ser células que se dividen o estimularse pá;rá dividirse. En general, el genoma y glicoproteínas ge membrana se basarán en diferentes virus, de modo que ilá partícula de vector viral resultante esté seudotipada .Los rasgos seguros del genoma del vector se incorporan de forma deseable. Los rasgos seguros incluyen LTR autoinactivante y un genoma no de integración . Los ejemplos de vectores contiene una señal de empaquetadura (psi) , un elemento que responde a Rev (RRE), donante de corte, aceptor de corte, tracto central poli-purina (cPPT) y elemento WPRE.En determinados ejemplos de modalidades, el genoma de vector viral comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma VIH-1 o el genoma SIV.La construcción de genoma viral puede comprender secuencias de las LTR 5' y 3' de un lentivirus, y en particular puede comprender las secuencias R y U5 de 5' LTR de un lentivirus y un LTR 3' inactivado o autoinactivante de un lentivirus . Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de VIH, SIV, FIV o BIV. Típicamente, las secuencias LTR son secuencias LTR de VIH.

El genoma del vector puede comprender un LTR 3' inactivado o autoinactivante (véase, por ej . , Zufferey et ál., J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi et ál., J. Viról. 72:8150, 1998; los cuales se incorporan en su totalidad) . Un vector autoinactivante tiene generalmente una eliminación de las secuencias de potenciador y promotor Üe ' r'l'a repetición terminal larga 3' (LTR), que se copia en la LTR 5' durante la integración del vector. En una instancia, "el elemento U3 del LTR 3' contiene una eliminación de su secuencia de potenciador, la caja TATA, sitios Spl y NF-kappa B.Como resultado de la LTR 3' autoinactivante, el provirus que se genera tras la entrada y transcripción inversa comprenderá un LTR 5' inactivado . El fundamento es mejorar la seguridad reduciendo el riesgo de movilización del genoma vector y la influencia de la LTR en promotores celulares cercanos. La LTR 3' autoinactivante puede construirse por cualquier método conocido en la técnica.

Opcionalmente, la secuencia U3 del LTR 5' lentiviral puede remplazarse con una secuencia de promotor en la construcción viral, tal como una secuencia de promotor heteróloga . Esto puede aumentar la titulación del virus recuperado de la linea celular empaquetadora . También puede incluirse una secuencia de potenciador . Puede usarse cualquier combinación de potenciadora/promotora que aumenta la expresión del genoma ARN viral en la linea celular empaquetadora . En un ejemplo, se usa la secuencia de potenciador/promotor CMV (véase, por ej . , patentes estadounidenses Nos. 5,385,839 y 5,168,062). . .

En determinadas modalidades, el riesgo de mutagénesis de inserción se minimiza al construir el genoma del ;vector lentiviral para que sea defectuoso de integració . Puede aplicarseuna variedad de enfoques para producir un genoma de vector no de integración. Estos enfoques implican diseñar una o más mutaciones en el componente de enzima integrasa del gen pol, de modo que codifique una proteína con una integrasa inactiva. El propio genoma del vector puede modificarse . para evitar la integración por, por ejemplo, mutación o eliminación de uno o ambos sitios de unión, o hacer que el tracto de polipurina 3' LTR-proximal (PPT) sea no funcional mediante eliminación o modificación. Además, hay enfoques no genéticos disponibles; estos incluyen agentes farmacológicos que inhiben una o más funciones de integrasa . Los enfoques no son mutuamente exclusivos, es decir, más de uno de estos pueden usarse al mismo tiempo. Por ejemplo, los sitios de integrasa y de unión pueden ser no funcionales, o el sitio PPT e integrasa puede ser no funcional, o los sitios de unión y el sitio PPT pueden ser no funcionales, o todos estos pueden ser no funcionales .

La integrasa está implicada en la escisión ,de ÁDN viral de cadena doble y extremo romo y unión de los extremos a 5' -fosfatos en las dos cadenas de un sitio diana cromosómico. La integrasa tiene tres dominios funcionales; Él dominio del extremo N, que contiene un motivo de unión a 2inc (HHCC) ; el núcleo de dominio central, que contiene él núcleo catalítico y un motivo DD35E conservado (D64,; Dllé, E152 en VIH-1) ; y un dominio del extremo C, que tiene propiedades de unión al ADN. Las mutaciones puntuales introducidas en integrasa son suficientes para alterar la función normal. Se han construido y caracterizado varias mutaciones de integrasa (véase, por ej . , Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, Thesis submitted to University College London, Abril 2009, pp, 82-97; Engelman et ál., J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale et ál., Mol. Therapy, 13: 1121, 2006). La secuencia que codifica la proteína integrasa puede eliminarse o mutarse para inactivar la proteina, preferentemente sin afectar significativamente la actividad de la transcriptasa inversa o direccionamiento nuclear, evitando asi solo la integración del provirus en el genoma de célula diana. Las mutaciones aceptables pueden reducir la catálisis , de integrasa, transferencia de cadena, unión a sitios att, unión a ADN cromosómico de hospedador y otras funciones . Por ejemplo, una sustitución de ácido aspártico simple a asparagina en el residuo 35 de VIHo SIV integrasa suprime completamente la integración de ADN viral. Las eliminaciones de integrasa se limitarán generalmente al dominio del extremo C.La eliminación de la secuencia codificadora para los residuos 235-288 provoca una integrasa no funcional útil (véase, por ej . , Engelman et ál., J. Virol. 69:2729, 1995) .Como ejemplos adicionales, pueden generarse mutaciones, por ejemplo, Asp64 (las cantidades de residuo se dan para VIH-1, las cantidades de residuo correspondiente para integrasa de otros lentivirus o retrovirus pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica) (por ej . , D64E, D64V) , Aspll6 (por ej . , D116N) , Asnl20 (por ej . , N120K) , Glul52, Glnl48 (por ej . , Q148A) , Lysl56, Lysl59, Trp235 (por ej . , W235E) , Lys264 (por e . , K264R), Lys266 (por ej . , K266R) , Lys273 (por ej . , K273R) . Pueden construirse otras mutaciones y someterse a prueba para detectar integración, expresión transgénica y cualquier otro parámetro deseable. Los ensayos para estas funciones son conocidos . Las mutaciones pueden generarse mediante cualquier variedad de técnicas, que incluyen mutagénesis dirigida al sitio y síntesis química de secuencia de ácido nucleico. Se puede realizar una mutación o más de una de estas mutaciones pueden estar presentes en la integrasa . Por ejemplo, una integrasa puede tener mutaciones en dos aminoácidos, tres aminoácidos, cuatro aminoácidos y así sucesivamente. ¦, De manera alternativa o en combinación con el ;uso;:de mutante(s) de integrasa, los sitios de unión (att) en U3 'y U5 pueden también mutarse.Las integrasa se une a. estos sitios y el dinucleótido de extremo 3' se escinde en ambos extremos del genoma del vector. Un dinucleótido CA se ubica en el extremo 3' empotrado; el CA es requerido para el procesamiento, mutación de la integración de bloques de nucleótidos en el cromosoma hospedador . El A del dinucleótido CA es el nucleótido más critico para la integración, y las mutaciones en ambos extremos del genoma brindarán los mejores resultados (véase, por ej . , Brown et ál., J. Virol. 73:9011 (1999)). En una ejemplificación, el CA en cada extremo cambia a TG.En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo cambia a TG en un extremo y GT en el otro extremo. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo se elimina; en otras ejemplificaciones, el A del CA se elimina en cada extremo.

La integración puede también inhibirse por mutación o eliminación del tracto de polipurina (PPT) (véase, por ej . , WO 2009/076524), ubicada próxima a la LTR 3'. El PPT es una secuencia de polipurina de alrededor de 15 nucleótidos que puede servir como sitios de unión al cebador para la síntesis de ADN de cadena positiva. En esta instancia, las mutaciones o eliminaciones de PPT se dirigen al proceso de transcripción inversa. Sin pretender limitarse al mecanismo particular, al mutar o eliminar PPT, se reduce radicalmente la producción de ADN lineal, y esencialmente solo se producen círculos de ADN 1-LTR.La integración requiere un genoma del vector de ADN lineal de cadena doble y sin este la integración se elimina esencialmente . al como sé especifica en la presente, un PPT puede ser no funcional por mutación o por eliminación . Típicamente, se elimina todo el PPT de alrededor de 15 nt, aunque en algunas modalidades, pueden realizarse eliminaciones más cortas de 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt y 2 nt. Cuando se realizan mutaciones, típicamente se realizan mutaciones múltiples, especialmente en la mitad 5' del PPT (véase, por ej . , McWilliams et ál., J. Virol. 77:11150, 2003), aunque las mutaciones simples y dobles en las primeras cuatro bases aun reducen la transcripción . Las mutaciones realizadas en el extremo 3' del PPT generalmente 'tienen efecto más dramático (véase, por ej . , Powell et ál., J. Virol. 70:5288, 1996).

I Estos diferentes enfoques para realizar un genoma de vector no de integración pueden usarse de forma individual o en combinación .Más de un enfoque puede usarsé para construir un vector de seguridad mediante mecanismos redundantes . Por lo tanto, las mutaciones o eliminaciones de PPT pueden combinarse con mutaciones o eliminaciones del sitio att o con mutaciones de integrasa o las mutaciones eliminaciones de PPT pueden combinarse tanto con : as mutaciones o eliminaciones del sitio att como con mutaciones de integrasa. De manera similar, las mutaciones ó eliminaciones del sitio att y mutaciones de integrasa pueden combinarse entre sí o con las mutaciones o eliminaciones de PPT.

Tal como se describe en la presente, las construcciones del vector lentiviral contienen un promotor para la expresión en células de mamíferos . Los promotores, que se describen en más detalle en la presente, incluyen, por ejemplo, el promotor de ubiquitina C humano (UbiC) , el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) , y el promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV) .La región U3 puede comprender una secuencia de PPT (tracto de polipurina) inmediatamente corriente arriba. En determinadas modalidades especificas, cualquiera de al menos tres regiones U3 diferentes (en el extremo 3') puede incluirse en el vector lentiviral (véase la SEQ ID NOS : 21-23 ) . Las construcciones contienen eliminaciones en las regiones U3.La construcción SIN tiene una eliminación de alrededor de 130 nucleótidos en la U3 (véase, por ej . Miyoshi, et ál . J. Virol. 72: 8150, 1998; Yu et ál .¦, Proc. Nati.. Acad. Sci. USA 83: 3194, 1986), que retira la caja TATA, suprimiendo asi la actividad promotora de LTR.Las eliminaciones en las construcciones 703 y 704 aumentan la expresión de los vectores lentivirales (véase, por ej . , Bayer et ál;.,, Mol. Therapy 16: 1968, 2008) .Además, la construcción 704 contiene una eliminación del PPT 3', que reducé':? i la integración del vector (véase, por ej . , WO 2009/076524) .Véase también la solicitud de .patente estadounidense No. 12/842, 609 y la solicitud de , patgrite internacional No. PCT/US10/042870, que se incorporan en ;su totalidad mediante esta referencia.

Secuencias de regulación de la expresión Tal como se describe en la presente, el vector de expresión recombinante comprende al menos una secuencia de regulación de la expresión. En determinadas modalidades, cuando el vector de expresión recombinante comprende un genoma de vector viral, se desea la expresión de al menos un inmunógeno en células diana particulares . Típicamente, por ejemplo, en un vector lentiviral la secuencia de polinucleótidos que codifica el inmunógeno se ubica entre las secuencias 5' LTR y 3' LTR. Además, la o las secuencias de nucleótidos codificantes están preferentemente unidas operativamente en una relación funcional con otras secuencias o rasgos genéticos o de regulación, por ejemplo, secuencias de regulación de la transcripción incluyendo promotoras o potenciadoras, que regulan la expresión del inmunógeno en una forma particular . En determinados! ca'sós, las secuencias de regulación transcripcionales útiles ... son las que están altamente reguladas con respectó a: la actividad, tanto temporal como espacialmente . En la técnica se conocen elementos de control de expresión que se pueden usar para regular la expresión de los polipéptlidos codificados e incluyen, de modo no taxativo, secuencias :de promotores inducibles, promotores constitutivos, de señales de secreción, de potenciadores y otras secuencias" de regulación .

El polinucleótido que codifica el inmunogeno y cualquier otra secuencia, que se puede expresar están típicamente en una relación funcional con las secuencias de regulación promotora/potenciadora interna. Con respecto a las construcciones de vector lentiviral, un promotor/potenciador "interno" es uno que está ubicado entre las secuencias 5' LTR y la 3' LTR en el vector viral y que está operativamente unido a la secuencia de polinucleótidos codificante de interés. El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinación de promotor/potenciador conocidos por aumentar la expresión de un gen con el que está en una relación funcional . Una "relación funcional" y "unida operativamente" significa, de modo no taxativo, que la secuencia está en la ubicación y orientación correcta con respecto al promotor y/o potenciador de forma tal que la secuencia de interés se expresará cuando el promotor . y/o potenciador entre en contacto con las moléculas apropiadas.

La elección de un promotor/potenciador interno: 'se basa en el patrón de expresión deseado del inmunogeno y las propiedades específicas de los promotores/potenciadores conocidos . Por lo tanto, el promotor interno puede ¦ ser constitutivamente activo. Los ejemplos no taxativos de promotores constitutivos que se pueden usar incluyen el promotor de ubiquitina (véase, por e . , patente estadounidense No.5510474; WO 98/32869); C V (véase, por ej . , Thomsen et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:659, 1984; patente estadounidense No. 5168062); beta actina (Gunning et ál. 1989 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:4831-4835) y pgk (véase por ejemplo, Adra et ál. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et ál. 1984 Gene 32:409-417; y Dobson et ál. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637).

De manera alternativa, el promotor puede ser un promotor especifico de tejido. En algunas modalidades, el promotor es un promotor especifico de célula diana. Por ejemplo, el promotor puede ser de cualquier producto expresado por células dendriticas, incluyendo CDllc, CD103, TLR, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, receptor de ma osa, Dectina-1, Clec9A, MHC clase II. Además, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresión inducible del inmunógeno . En la técnica se conoce una cantidad de sistemas para la expresión inducible, incluyendo el sistema 'que responde a la tetraciclina, el sistema represor-operador lac, asi como promotores que responden a una variedad de cambios ambientales o fisiológicos, incluyendo choqué:: :de calor, iones de metal, tales como promotor: s-,.:de metalotioneina, interferones, hipoxia, esteroides,; tales como progesterona o promotor del receptor ..¡¡¡., ¡de glucocorticoides, radiación, tal como promotor VEGF. ambién se puede usar una combinación de promotores para obtener la expresión deseada de cada una de las secuencias de polinucleótidos que codifican inmunogenos . El experto en la técnica será capaz de seleccionar un promotor en función del patrón de expresión deseado de la secuencia de polinucleótidos en el organismo o la célula diana de interés .

Un vector de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, puede comprender al menos un promotor que responde a la ARN polimerasa II o III. Este promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de polinucleótidos de interés y también se puede unir a una secuencia de terminación. Además, se puede incorporar más de un promotor de ARN polimerasa II o III. Los expertos en la técnica conocen los promotores de ARN polimerasa II y III. Un intervalo adecuado de promotores de ARN polimerasa III se pueden encontrar, por ejemplo, en Paule and: ' WhaLt'e, Nucleic Acids Res., Vol . 28, pp 1283-1298 (2000);.Los promotores de ARN polimerasa II o III también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o manipulado genéticamente que puede dirigir la ARN polimerasa II o|";'III para transcribir secuencias de codificación de ARN corriente abajo.Además, el promotor o promotores de "ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte ::del genoma de vector viral pueden ser inducibles . Cualquier promotor Pol II o III inducible adecuado se puede usar con los métodos descritos en la presente. Los promotores Pol II o III particularmente adecuados incluyen los promotores que responden a la tetraciclina proporcionados en Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000) y en eissner et al., Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001) .

Un potenciador interno también puede estar presente en el vector de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, para aumentar la expresión de la secuencia de polinucleótidos de interés. Por ejemplo, se puede usar el potenciador CMV (véase, por ej . , Boshart et ál . , Cell 41:521, 1985) . Muchos potenciadores en genomas virales, tales como VIH, CMV y en genomas de mamíferos se han identificado y caracterizado (véase, por ej . , bases de datos disponibles al público tales como GenBank).Un potenciador se puede usar en combinación con un promotor heterólogo . Un experto en la técnica será capaz [, [de seleccionar el promotor apropiado en función del patrón de expresión deseado. ' Al dirigirse a la administración de un vecto de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, a una célula diana particular, el- genoma de vector generalmente contendrá un promotor que es reconocido por la célula diana y que está unido operativamente a la sécu hcia de interés, componentes virales (cuando el vector es un vector viral) y otras secuencias discutidas en la presente. Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ácido nucleico que permite que ocurra la unión de una ARN polimerasa y transcripción . Los promotores pueden ser inducibles, constitutivos, temporalmente activos o específicos de tejidos. La actividad de los promotores inducibles es inducida por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos . Los promotores inducibles pueden ser una herramienta útil en la manipulación genética debido a que la expresión de genes a los que están unidos operativamente se puede encender o apagar en determinadas etapas de desarrollo de un organismo, su fabricación o en un tejido particular:..Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores regulados químicamente y promotores regulados físicamente . Los promotores químicamente regulados típicos incluyen, de modo no taxativo, promotores regulados por alcohol (por ej . , promotor de genes de alcohol deshidrogenasa I (alcA) ) , promotores regulados por tetraciclina (por ej . , promotor que responde a la tetraciclina) , promotor regulado por esteroides (por ej . , promotor basado en el receptor de glucocorticoides (GR) en ratas, promotor basado en el receptor de estrógenos (ER) humano, promotor basado en el receptor de ecdisona de polilla y los promotores basados en la superfamilia del receptor de esteroides/retinoide/tiroide) , promotores regulados por metales (por ej . , promotores basados en el gen de metalotioneina) , y promotores relacionados con la patogénesis (por ej . , promotores basados en proteina relacionada con patógenos (PR)de maiz y Arabidopsis ) . Los promotores regulados físicamente típicos incluyen, de modo no taxativo, promotores regulados por temperatura' (por ej . , promotores de choque de calor) y promotores regulados por luz (por ej . , promotor SSU de soja). Otros ejemplos de promotores se describen en otra parte, por ejemplo, en patentes y solicitudes de patente publicadas que se pueden identificar buscando en las bases de datos de la Oficina de Marcas y Patentes estadounidense.

Un experto en la técnica será capaz de seleccionar un promotor apropiado en función de las circunstancias específicas . En la técnica se conocen muchos promotores diferentes y métodos para unir operativamente el promcjftpr a la secuencia de polinucleótidos a ser expresados . anto : las secuencias de promotor natural y muchos promotores heterólogos se pueden usar para dirigir la expresión en la célula de empaquetamiento y la célula diana. Los promotores heterólogos se usan típicamente porque generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína deseada en comparación con el promotor, natural .

El promotor se puede obtener, por ejemplo;, de: los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40).E1 promotor también puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero heterólogo, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque de calor o el promotor normalmente asociado con la secuencia natural con la condición de que tales promotores sean compatibles con la célula diana. En una modalidad, el promotor es el promotor viral de origen natural en un sistema de expresión viral. En algunas modalidade's, el promotor es un promotor específico de célula dendrítica . El promotor específico de la célula dendrítica puede ser, por ejemplo, promotor CDllc.

La transcripción puede aumentar insertando H" una secuencia de potenciador en el o los vectores. os potenciadores son elementos de ADN que típicamente actúan en cis, en general, de alrededor de 10 a 300 bp ; de longitud, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias de potenciador de genes de mamífero (globina, élasta'sa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) y de virus de célula eucariota . Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado posterior del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado posterior del origen de replicación y potenciadores de adenovirus . El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de polinucleótidos específicos de antígenos, pero está situado preferentemente en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de . la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran con frecuencia en las regiones 5' y ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariot'as o virales y se conocen en la técnica.

Una construcción de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, también puede contener elementos genéticos adicionales . Los tipos,,., de elementos que se pueden incluir en la construcción no : se limitan de forma alguna y se pueden elegir para lograr¦ un resultado particular . Por ejemplo, se puede incluir.:· , una señal que facilita la entrada nuclear del vecto : de expresión recombinante o genoma viral en la célula diana. Un ejemplo de tal señal es la señal flap de VIH-l.Se pueden incluir secuencias de regulación adicionales para facilitar la caracterización del sitio de integración de prcvirüs. en la célula diana. Por ejemplo, una secuencia supresora ' de ámbar de tARN se puede incluir en- la construcción. También se puede incluir una secuencia de aislamiento, por ejemplo de ß-globina de gallina, en la construcción de genoma viral. Este elemento reduce la posibilidad de silenciar un provirus integrado en la célula diana debido a los efectos de metilación y heterocromatinización. Además, el aislador puede proteger las secuencias internas de polinucleótido del potenciador, promotor y exógenasde los efectos de posición positivos o negativos del ADN circundante en el sitio de integración del cromosoma . Además , la construcción recombinante, incluyendo el genoma de vector, puede contener uno o más elementos genéticos diseñados para potenciar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, un elemento que responde al virus de hepatitis de la marmota (WRE) se puede ubicar en la construcción (véase, ;por" éj., Zufferey et ál. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et ál., 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190). ; ' Cuando el vector de expresión recombinante es un genoma de ' vector viral, el genoma de vector . viral típicamente está construido en una forma de plásmido que se puede transfectar en una línea celular empaquetadora o productora para la producción de la construcción de genoma de vector viral. El plásmido generalmente comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias. En la técnica se conocen bien tales plásmidos .Además, los vectores que incluyen un origen procariota de replicación también pueden incluir un gen cuya expresión otorga un marcador detectable o seleccionable tal como resistencia al fármaco. Los productos tipicosde resistencia al fármaco bacteriano son aquellos que otorgan resistencia a ampicilina o tetraciclina .

En determinadas configuraciones, los vectores de expresión recombinantes contienen secuencias de polinucleótidos que codifican factores estimuladores/de maduración de células dendriticas (DC).Los ejemplos de moléculas es imuladoras incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible de fármacos (ÍCD40) y similares . Estos polinucleótidos están típicamente bajo control de uno o más elementos de regulación que dirigen la expresión de las secuencias de codificación en las células dendriticas . La maduración de células dendríticas contribuye a la vacunación exitosa (véase, por ej . , Banchereau et.. ál., Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler et ál., Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor et ál., Ñat.:.: Med. 10:475-480 (2004)). La maduración puede transformar DC de células activamente implicadas en la captura de antígenos en células especializadas para cebar células T.Por. ejemplo, la unión de CD40 por CD40L en células T auxiliares ; <3p4 : es una señal crítica de la maduración de DC, que; da*', como resultado una activación potente de células T CD8+. Dichas moléculas estimuladoras también se denominan factores e maduración o factores estimuladores de la maduración . Los puntos de control inmunes representan barreras considerables a la activación de inmunidad celular funcional en cáncer y los anticuerpos antagonistas específicos para los ligandos inhibidores sobre células T que incluyen CTLA4 y muerte programada-1 (PD-1) - son ejemplos de agentes dirigidos que se están evaluando éh' la clínica. Un mecanismo de tolerancia considerable en las infecciones crónicas y cáncer es el agotamiento funcional de las células T específicas de antígenos que expresan altos niveles de PD-1. Como se ha demostrado que la potencia de la inmunización terapéutica fue mejorada considerablemente por la combinación con control de punto de control inmune, como ejemplo no taxativo, los expertos en la técnica pueden comprender que un enfoque alternativo para inhibir el punto de control inmune es inhibir ' la expresión de ligandos uno y dos (PD-L1/L2) de muerte programada (PD).Una forma de lograr la inhibición es mediante la expresión de moléculas de ARN tales como... las descritas en la presente, que reprimen la expresión de ,PD-L1/L2 en las DC transducidas con un genoma de vector viral, tal como el genoma de vector lentiviral que codifica una o más de las moléculas relevantes . La maduración de las ;DC o la. expresión de elementos particulares tales como puntos de control inmunes, por ejemplo ligandos PD-1, se pueden caracterizar por análisis de citometría de flujo de regulación por aumento del marcador de superficie tal como MHC II y al determinar el perfil de quimiocinas y citocinas expresadas, por ejemplo, realizando técnicas y métodos descritos en la presente.

Una secuencia que codifica un producto detectable, generalmente una proteína, se puede incluir para permitir la identificación de células que expresan el inmunógeno deseado. Por ejemplo, una proteína marcadora fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde (GFP) , ' se incorpora en la construcción de expresión recombinante junto con una secuencia de polinucleótidos de interés (es decir, que codifica al menos uno inmunógeno) . En otros casos, la proteína puede ser detectable por un anticuerpo o la proteína puede ser una enzima que actúa en un sustrato para proporcionar un producto detectable o puede; ser i un producto de proteína que permite la selección de una célula diana transfectada o transducida, por ejemplo; otorga resistencia al fármaco, tal como resistencia a la higromicina . La selección típica de genes que codifica proteínas que otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas adecuadas para su uso en células eucariotas,, por ejemplo, neomicina, metotrexato, blasticidina, entre otros conocidos en la técnica o complementan defectos auxotróficos o suministran nutrientes críticos retenidos por el medio. El marcador seleccionábale puede estar opcionalmente presente en un plásmido separado e introducirlo mediante cotransfección.

Con respecto a las partículas de vector descritas en la presente, una o más unidades de expresión multicistriónica se pueden usar que incluyen dos o más de una secuencia de polinucleótidos que codifica un inmunogeno y una secuencia que codifica una molécula de membrana tal como se describe en la presente o uno o más factore.s . de maduración de DC necesarios para la producción de la partícula de vector deseada en las células empaquetadoras . El uso de vectores multicistrónicos reduce la cantidad total de moléculas de ácido nucleico necesarias y por lo tanto puede evitar las posibles dificultades asociadas con la coordinación de la expresión de múltiples genomas de vector. En un vector multicistrónióo,; |¡. los diversos elementos a ser expresados están , unidos operativamente a uno o más promotores (y otros elementos; de control de expresión según sea necesario) . En ; algunas configuraciones, un vector multicistrónico comprended/una secuencia que codifica al menos un - inmunogeno (es decir, uno o más) de interés, una secuencia que codifica,:: un producto indicador y una secuencia que codifica uno o más componentes de partícula de vector. En determinadas modalidades donde la construcción recombinante comprende un polinucleótido que codifica un inmunógeno, la construcción opcionalmente codifica un factor de maduración de DC.En determinadas modalidades adicionales, un vector multicistrónico comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica cada uno de un inmunógeno, un factor de maduración de DC y opcionalmente componentes virales cuando el vector de expresión es un vector de expresión viral.

Cada componente a ser expresado en un vector de expresión multicist ónico se puede separar, por ejemplo, por un elemento de sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) o un elemento viral 2?, para permitir la expresión separada de las diversas proteínas del mismo promotor. En la técnica se conocen los elementos IRES y elementos 2A (véase, por ej . , patente estadounidense No. 4,937^190 de Felipe et ál. 2004. Traffic 5: 616-626). En una modalidad, los oligonucleótidos tales como secuencias del s'itifj; de escisión de furina (RAKR) (véase, por ej . , Fang et al. '2005 Nat. Biotech. 23: 584-590) unido con secuencias tipo 2Á del virus de la enfermedad de la fieb (F DV) ; virus de . la rinitis equina A (ERAV) y virus thosea asigna (TaV)' (véase, por e .. , Szymczak et ál. 2004 Nat. Biotechnol. 22: Z b',89-594) se usan para separar elementos genéticos en un vector multicistrónico. La eficacia de un vector multicistrónico particular se puede evaluar fácilmente detectando la expresión de cada uno de los genes usando protocolos estándar .

En una ejemplificación especifica, un genoma de vector viral comprende: una secuencia de promotor/potenciador de citomegalovirus (CMV) ; las secuencias R y U5 del LTR 5' de VIH, una secuencia empaquetadora (?) ; la señal VIH-1 flap; un potenciador interno; un promotor interno; un gen de interés; el elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota; una secuencia supresora de ámbar de tAR ; un elemento U3 con una eliminación de su secuencia'' de potenciador; el aislador de la ß-globina de gallina y las secuencias R y U5 del LTR 3' de VIH. En algunas ejemplificaciones, el genoma de vector comprende un LTR 5 ' lentiviral intacto y un LTR 3' de auto inactivación- ; ·( véase-, por ej . , I akuma et ál. Virology 15 : 120 , 1999 ) . , , La construcción del genoma de vector se puede lograr usando cualquier técnica de manipulación genética adecuada en la técnica, incluyendo, de modo no taxativo, las técnicas estándar de digestión de endonucleasa —de restricción, ligación, transformación, purificación ' de plásmidos y secuenciación de ADN, por ejemplo tal como se describe en Sambrook et ál. (ediciones 1989 200:1 ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor ' Laboratory Press, Y) ; Coffin et ál. (Retroviruses . Cold Spring Harbor Laboratory Press, .Y. (1997))/ y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed. , Oxford University Press, (2000) , cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

También se pueden usar vectores construidos para la expresión transitoria en células de mamíferos. La expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse de manera eficaz en una célula hospedadora, de forma tal que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su "vez, sintetiza altos niveles del polipéptido codificado por el polinucleótido específico de inmunógenos en el vector de expresión . Véase Sambrook et ál., supra, pp. 16.17-16.22, 1989. Otros vectores y métodos adecuados para la adaptación a la expresión de polipéptidos se conocen en la técnica y se pueden adaptar fácilmente a las circunstancias específicas.

Al usar las enseñanzas proporcionadas en la presente y el conocimiento en la técnica, un experto en la técnica reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión particular se puede evaluar mediante la transíección de células empaquetadoras con un vector que comprende: :una secuencia de polinucleótido que codifica una ;pro¾eina indicadora y calcular la expresión usando una técnica adecuada, por ejemplo, calcular la fluorescencia de un conjugado de proteina fluorescente . En la técnica se conocen otros genes indicadores adecuados.

Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un inmunógeno se puede usar para la producción del inmunógeno . Los vectores de expresión recombinantes incluyen al menos una secuencia de expresión reguladora, tal como un promotor o potenciador, que está unido operativamente al polinucleótido que codifica el inmunógeno . Cada uno de los vectores de expresión se puede usar para transformar, transducir o transfectar una célula hospedadora apropiada para la producción recombinante de un inmunógeno correspondiente . Las células hospedadoras adecuadas, para, la producción del inmunógeno incluyen procariotas, levadura y células eucariota superiores (por ej . , CHO y COS). Cada uno de los inmunógenos se puede aislar de la célula hospedadora respectiva o cultivo de célula hospedadora usando cualquiera de una variedad de métodos de asilamie;nto ; (por ej . , filtración, diafiltración, cromatografía (incluyendo cromatografía de afinidad, cromatografía líquida : de ;: alta presión) y electroforesis preparativa) conocidos puestos práctica rutinariamente en la técnica : de las proteínas. En determinadas modalidades, tal como se! describe en la presente, el inmunógeno aislado puede formularse luego con un excipiente farmacéuticamente adecuado para proporcionar una composición inmunogénica .

Los métodos particulares para producir polipéptidos recombinantemente son generalmente conocidos y usados de manera rutinaria . Por ejemplo, los procedimiento de biología molecular se describen en Sambrook et ál. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Sambrook et ál., 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001) ) .El secuenciaciónde ADN se puede realizar como se describe en Sanger et ál . (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)) y el manual de secuenciación Amersham International pie e incluyendo mejoras a este.

Partículas de vector En otra modalidad, se proporcionan partículas':: :de vector. Una partícula de vector comprende uno cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos' en la presente que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos un inmunógeno. En otras modalidades determinadas, una partícula de vector comprende un 'sistema de expresión recombinante que comprende un vector de expresión recombinante (también denominado primer vector de expresión recombinante) que comprende una secuencia;::, jde polinucleótidos que codifica al menos un inmunógeno que induce una respuesta inmunitaria especifica . En la presente también se proporcionan métodos para administrar un polinucleótido que codifica al menos un inmunógeno (tal como se describe en la presente) a una célula diana. En modalidades particulares, la célula diana es una célula inmune que es una célula presentadora de antigenos; en modalidades más especificas y tal como se describe en la presente, la célula diana es una célula dendritica . Tales métodos comprenden poner en contacto (es decir, permitir la interacción) de la célula diana con un vehículo que administra el polinucleótido . En modalidades particulares, descritas en detalle en la presente, los métodos para administrar el polinucleótido comprenden poner en contacto la célula mediante la administración a un sujeto de una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante que contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica el inmunógeno. Las partículas de vector, "los vectores de expresión recombinantes, polinucleótidos- e inmunógenos se discuten en más detalle en la presente. ¦ Las células dendríticas (DC) soncélulas presentadoras de antígenos esenciales para el inicio y control:: ;de respuestas inmunitarias . Las DC se pueden desarrollar: a través de dos vías: una vía es independiente de monóci'ttís y la segunda vía deriva de monocitos (Mo-DC).Los monocit'o's 'de sangre, tras el cultivo con GM-CSF e IL-4 adquieren una morfología dendrítica y fuertes capacidades de iniciar la inmunidad adaptativa (véase, por ej . , Bender, et ál., J. Immunol. ethods 196(2), 121 (1996); Sallustó et ál . , J. Exp. Med. 179(4), 1109 (1994), incluyendo in vivo en los seres humanos (véase, por ej . , Dhodapkar, et ál., J. Clin. Invest 104(2), 173 (1999); Schuler-Thurner, et ál.,J. Immunol. 165(6), 3492 (2000)). Se pueden lograr respuestas de célula T específica de inmunógenos eficaces usando una vacuna de partícula de vector, en particular un sistema de partícula de vector lentiviral que administra inmunógenos de manera eficaz directamente a Mo-DC in vivo, sin necesidad de manipulación celular ex vivo. Mo-DC humano expresa altos niveles de dos receptores de lectina del tipo C, receptor de mañosa (MMR) y molécula no integrina de captura 3 de adhesión intercelular específica de ¡ DC ¡".(¡DC-SIGN) .Tal como se describe en más detalle en la presente, la expresión de inmunógenos se puede dirigir a Mo-DC usando un vector lentiviral recombinante manipulado genéticamente para dirigirse a DC-SIGN.

Una membrana que se dirige a DC-SIGN, SVQmu,;::: ¡que consiste en una glicoproteína de virus Sindbis ¦¦ SIN) manipulada genéticamente que se une selectivamente ¦ áí-jDC-SIGN se ha modificado tal como se describe (véase descripción en la presente y solicitud de : patente estadounidense No.12/842, 609 y solicitud internacional de patente No. PCT/ÜS10/042870) . El vector lentiviral indujo respuestas inmunitarias de célula T de CD8 altamente funcionales tras una única inmunización en ratones (véase, por ej . , Dai, et ál., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A (2009); Yang, et ál., Nat . Biotechnol. 26(3), 326 (2008)). Este prototipo ha avanzado significativamente por dos modificaciones principales . Este vector lentiviral descrito en la presente comprende una membrana de glicoproteina (denominada SINvarl) en función del SIN natural, un arbovirus conocido por infectar DC dérmicas, mediante , el receptor de DC-SIGN (véase, por ej . , Gardner, et ál., J. Virol. 74(24), 11849 (2000); Klimstra, et ál., J. Virol. 77(22), 12022 (2003)) que se modifica para evitar unir los receptores de sulfato de heparán muy extendidos (véase,., por ej., Klimstra et ál., J. Virol. 72(9), 7357 (1998) )'i"' : La membrana SINvarl otorga mayor productividad y función · in vivo en comparación con la membrana SVGmu origina"! LEI vector también es redundantemente incapaz de integrarse a través de la combinación de una Integrasa : mutante (polD64V) , haciendo que no sea funcional (véase, por ej . , Apolonia, et ál., Mol. Ther. 15(11), 1947 (2007)) y° una estructura principal de vector eliminada de la región U3 del LTR (hasta att) y el tracto de polipurina LTR 31 (PPT) . Por lo tanto, además de una Integrasa inhabilitada, la composición . de la estructura principal de vector evita que la transcripción del genoma de vector de longitud completa (mutación de auto inactivación) dé como resultado circuios de ADNdc episomal de transcripción inversa de único LTR en las DC infectadas, que . no son una plantilla para la integración cromosómica (véase, por ej.,Bayer, et ál., Mol. Ther. 16(12), 1968 (2008); Breckpot et ál., J. Vir l. (2010); Ma et ál., Mol. Ther. 10(1) : 139 (200 )) .Aproximadamente 75% del genoma de VIH original se retiró de DC-NILV, incluyendo todas las proteínas accesorias y reguladoras excepto por Rev. Luego de una única inyección, DC-NILV induce respuesta de célula' '?' de CD8 específica de antígeno de tumor altamente robusto. La potencia de la vacunación de lentivector depende al menos en parte de la unión de receptores de reconocimiento de patrón TLR3 y TLR7 (véase, por ej . , Beignon et !ál'. ! J. Virol. (2009); Breckpot et ál., supra) .DC-NILV. · uede inducir respuestas inmunitarias de magnitud equivalentie : en su homólogo de integración y se pueden usar en un . régimen de estímulo primario homólogo.

En determinadas modalidades, la partícula de vector es una partícula de vector viral y en otras modalidades determinadas, la partícula de vector es una partícula- que deriva de una bacteria tal como, por ejemplo, tisteria monocytogenes, Salmonella spp., Mycobacterium ¦ bovis, Escherichia coli, Shigella spp., yYersinia spp. (véase, por ej .. , Paterson, Semin. Immunol (2010) 22:183; Loessner, Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4:157; Daudel, Expert Rev. Vaccines (2007) 6:97). Los ejemplos de partículas de vector viral es una partícula de vector lentiviral que comprende un genoma de vector lentiviral; una partícula de vector de poxvirus que comprende un genoma de vector de poxvirus una partícula de vector de virus de la vacuna que comprende un genoma de vector de virus de la vacuna; una partícula de vector de adenovirus que comprende un genoma de vector de adenovirus; una partícula de vector de virus asociado con adenovirus que comprende un genoma de vector de virus asociado con adenovirus; una partícula de vector de virus del herpes que comprende un genoma de vector de virus del herpes (por ej . , virus I o II del herpes simple) o una partícula de vector de virus alfa que comprende un genoma de vector del virus alfa.

En una modalidad más particular, la partícula de vector es una partícula de vector lentiviral que comprende un genoma de vector lentiviral (que se describe en detalle anteriormente) . En la presente se proporcionan método¾ ; y composiciones para dirigirse a células y dirigirse ; a células dendríticas (DC) en particular usando una partícula de vector lentiviral (que también se puede denominar virión, partícula de lentivirus) para administrar una secuencia que codifica al menos un inmunógeno a DC . La partícula de vector lentiviral comprende una variante de glicoproteína de membrana derivada del virus Sindbis E2 y una construcción de expresión recombinante que comprende el genoma que incluye las secuencias de interés y opcionalmente otros componentes . La variante de glicoproteína presenta una menor unión al sulfato de heparán en comparación con la glicoproteína de HR, una cepa de virus Sindbis de referencia . La glicoproteína de membrana facilita la infección de células dendríticas por las partículas de vector lentiviral. "Facilita" la infección, tal como se usa en la presente, es lo mismo que facilita la transducción y se refiere al rol de la glicoproteína de membrana, actuando solo o junto con otras moléculas, para promover o potenciar la entrada mediada por receptor de un retrovirus seudotipado o partícula de lentivirus: en una célula diana.

En general, las partículas de vector lentiviral ;son producidas por una línea celular que contiene uno q; ;más vectores plásmidos y/o elementos integrados que juntos codifican los componentes necesarios para generar partículas de vector funcional . Estas partículas de vector lentiviral típicamente no son capaces de replicarse, '. es decir, solo son capaces de una única ronda de infección.!Con más frecuencia, se usan vectores de múltiples plásmidos o casetes de expresión individuales integrados establemente en el cromosoma de célula productora para separar los diversos componentes genéticos que generan las partículas de vector lentiviral; sin embargo, se puede usar un único vector de plásmido que tiene todos los componentes lentivirales . En una ej emplificación, la línea celular empaquetadora se transfecta con uno o más plásmidos .que contienen el genoma de vector viral, incluyendo LTR, una secuencia empaquetadora que actúa en cis y las secuencias de interés (es decir, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un inmunógeno) , al menos un plásmido que codifica los componentes estructurales y enzimáticos" del virus (por ej . , gag y pol) y al menos un plásmido que codifica una glicoproteína de membrana de Arboyiru$..:Las partículas virales brotan a través de la membrana celular y comprenden un núcleo que incluye típicamente dos génbm'Ssí de ARN que contienen las secuencias de interés y una glicoproteína de membrana de Arbovirus que se dirige a células dendríticas . En determinadas modalidades, la glicoproteína de Arbovirus es una glicoproteína de virus Sindbis E2 y la glicoproteína está manipulada genéticamente para tener una menor unión al sulfato de heparán en comparación con E2 de la cepa de referencia HR.Esto generalmente implica al menos un cambio de aminoácidos en comparación con la secuencia de glicoproteína. E2 de HR. Además, la glicoproteína E2 puede manipularse genéticamente para aumentar la especificidad de direccionamiento a células dendriticas.

Sin pretender estar limitados por la teoría, se cree que la unión de la partícula viral a una superficie celular induce endocitosis, llevar al virus a un endosoma, desencadenar la fusión de membrana y permitir que el núcleo del virus ingrese al citosol.Para determinadas modalidades, que utilizan partículas de vector lentiviral de integración, luego de la transcripción inversa y migración del producto al núcleo, el genoma del virus se integra en el genoma de célula diana, incorporando las secuencias de interés en el genoma de la célula diana. Para reducir ;la posibilidad de mutagénesis de inserción y promover la expresión transitoria de uno o más inmunógenos designados, sin embargo, otras modalidades usan partículas de' vector lentiviral de no integración (es decir, las que' no' :se integran en el genoma de célula diana) , pero en su lugar expresan las secuencias de interés de un episoma.En cualquier caso, las DC infectadas expresan entonces las secuencias de interés (por e . , un inmunógeno y opcionalmente una molécula de estimulación) . El inmunógeno se puede procesar luego por células dendriticas y presentarse a células T y B, generando una re'spuesta inmunitaria específica de antígenos.La vía específica descrita anteriormente no es necesaria siempre que la célula dendritica sea capaz de estimular una respuesta inmunitaria especifica de antigenos.

Las partículas virales se pueden administrar a un sujeto para proporcionar un efecto profiláctico o terapéutico . Luego de la infección de células dendríticas y la expresión del producto de inmunógeno, se genera una respuesta inmunitaria a los productos.

Membrana de vector viral Los virus transmitidos por antrópodos (Arbovirus) ,. son virus que son transmitidos a un hospedador, tales como humanos, caballos o aves por un vector de artrópodo infectado tales como un mosquito. Los arbovirus se dividen también en subfamilias de virus incluyendo alfavirus y flavivirus, que tienen un genoma de ARN de única cadena de polaridad positiva y una membrana que contiene glicoproteína . Por ejemplo, el virus de fiebre del ¡dengue, virus de fiebre amarilla y virus del Nilo del occidente corresponden a la familia flavivirus y virus Sindbis, v rus del bosque Semliki y virus de la encefalitis equina de Venezuela, son miembros de la familia de alfavirus [ (véase, por ej., Wang et ál., J. Virol. 66, 4992 (1992)) . La membrana de virus Sindbis incluye dos glicopr téáínas transmembrana (véase, por ej . , ukhopadhyay et ál. Nature Rev. Microbiol. 3, 13 (2005) ):E1, que se cree es responsable de la fusión y E2, que se cree es responsable por la unión a las células. Se sabe que las glicoproteínas de membrana de virus Sindbis seudotipan otros retrovirus, incluyendo oncoretrovirus y lentivirus.

Tal como se discute en la presente, una glicoproteina de membrana de arbovirus se puede usar para seudotipar un genoma de vector basado en lentivirus . Un lentivirus "seudotipado" es una partícula lentiviral que tiene una o más glicoproteínas de membrana que son codificadas por un virus que es diferente del genoma lentiviral . La glicoproteina de membrana se puede modificar, mutar o manipular genéticamente tal como se describe en la presente. Por lo tanto, las partículas de vector lentiviral descritas en la presente incluyen lentivirus seudotipados con una glicoproteina de membrana de arbovirus, por e . , una glicoproteina de membrana de alfavirus o flayivi¾ús, por e . , una glicoproteina E2 que se puede modificar, mutar o manipular genéticamente . Los lentivirus también sé pueden seudotipar con otras membranas, incluyendo VSV-G, virus de la influenza, arenavirus, rabdovirus, ortomixovirus, V..IH1, VIH2 y SIV.

La membrana de virus Sindbis y otros alfavirus se incorpora en la bicapa lipídica de la membrana de partícula viral y típicamente incluye múltiples copias de dos glicoproteínas El y E2.Cada glicoproteína tiene regiones que abarcan la membrana; E2 tiene un dominio citoplasmático de alrededor de 33 residuos mientras que la cola citoplasmática de El es muy corta (alrededor de 2 residuos ). Tanto El como E2 tienen ácidos palmiticos unidos en o cerca de las regiones que abarcan membrana. E2 se sintetiza inicialmente como una proteina de precursor que se escinde por furina y otras proteinasas de serina dependientes de Ca2+ en E2 y una pequeña glicoproteína denominada E3. Ubicada entre secuencias que codifican E2 y El hay una secuencia que codifica una proteína denominada 6K.E3 y 6K son secuencias de señal que sirven para translocar las glicoproteínas E2 y El, respectivamente, a la membrana . En el genoma del virus Sindbis, la región de codificación para las proteínas de membrana de Sindbis incluye una secuencia que codifica E3, E2, 6K y El . Tal ¾bmo se usa en la presente, "membrana" de un virus de arbovirus incluye al menos E2 y también puede incluir El, 6K; y E:3;.Un ejemplo de secuencia de glicoproteínas de membrana de virus Sindbis, cepa HR, se presenta como SEQ ID NO: 17. Las secuencias de glicoproteínas de membrana pará otros arbovirus se pueden encontrar en bases dé datos públicamente disponibles, tales como GenBank.Por ejemplo, las secuencias que codifican las glicoproteínas ,de ¦ virus del Dengue se pueden encontrar en Acceso GQ252677.1 (entre otras en GenBank) y en las bases de dato de variación de virus en NCBI (accesos GenBank y bases de dato de variación de virus se incorporan mediante esta referencia para secuencias de glicoproteina de membrana) y un ejemplo de secuencia que codifica glicoproteinas de membrana de virus de encefalitis equina de Venezuela en Acceso NP_040824.1 (incorporado mediante esta referencia para secuencias de glicoproteinas de membrana) .

Pese a que uno o más receptores celulares en células dendriticas para alfavirus y virus Sindbis en particular, no se han identificado definitivamente a la fecha, un receptor parece ser DC-SIGN (véase, por ej . , Klimstra et ál., J. Virol. 77:12022, 2003). El uso de los términos "unión", "ligación", "direccionamiento" y similares se usan de manera intercambiable y no se pretende que indiquen un mecanismo de la interacción entre la glicoproteina . de membrana de virus Sindbis y un componente celular. DC-SIGN (ICAM-3 (moléculas de adhesión intercelular 3) no integrina de captura especifica de células dendriticas; también denominada CD209) es un receptor tipo lectina tipo C capaz de una rápida unión y endocitosis de materiales (véase,,,,por ej . , Geijtenbeek et ál. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004 ).E2 parece dirigirse a virus a células dendritidás a través de DC-SIGN. Tal como se muestra en la presenté,;:: las células que expresan DC-SIGN se transducen por partículas de vector viral seudotipadas con virus E2 de Sindbis mejor (al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces mejor) que las células isogénicas que no expresan DC-SIGN.E1 mecanismo de cómo la glicoproteina E2 facilita la infección viral parece implicar DC-SIGN, posiblemente a través de la unión directa a DC-SIGN o provocando un cambio en conformación u algún otro mecanismo . Independientemente del mecanismo exacto, el direccionamiento por E2 se prefiere para células que expresan DC-SIGN, a saber células dendríticas. , ' El virus Sindbis también parece unirse a celul s a través de sulfato de heparán (véase, por ej . , limstra : et ál.; J. Virol. 72: 7357, 1998; Burmes et ál., J. Virol. 72: 7349, 1998). Debido a que el sulfato de heparán y otros glicosaminoglianos de superficie celular se encuentran'!!! en .·;. ;··e?.: . la superficie de la mayoría de los tipos celulares*- ¦ se desea reducir la interacción entre el sulfato de heparán y glicoproteínas de membrana de Sinbis.Esto se puede lograr reduciendo la unión de la membrana de virus Sindbis ; al sulfato de heparán o aumentando la unión, por éj . , aumentando la avidez de la membrana de virus Sindbis1 a células dendríticas o ambas. Como resultado, la unión: ; no específica a otras moléculas, que se puede expresar por otros tipos celulares y que puede ocurrir incluso s -; i la membrana es específica de DC-SIGN, se ve reducida, y la especificidad mejorada puede servir para evitar efectos secundarios no deseados, tales como efectos secundarios que pueden reducir la respuesta inmunitaria deseada o efectos secundarios asociados con transducción no específica u otros tipos de células. De manera alternativa o adicional a las ventajas de transducción relativamente específica de células que expresan DC-SIGN, las partículas virales seudotipadas con glicoproteína de membrana E2 de virus Sindbis pueden ofrecer otras ventajas sobre partículas virales seudotipadas con glicoproteínas tales como VSV-G. Los ejemplos de tales ventajas incluyen menor lisis . mediada por el complemento y/o menor direccionamiento celular neuronal, ambos de los cuales se cree que se asocian con la administración de partículas virales seudotipadas de VSV-G.

En varias ejemplificaciones, las partículas dé ve¾tor lentiviral se unen específicamente a células que éxpr"esan DC-SIGN y tienen una unión reducida o abrogada al.\ sulfa o de heparán.Es decir, una glicoproteína E2 de membrana :de virus Sindbis se puede modificar para ; dirigir preferentemente el virus a células dendríticas que expresan DC-SIGN con respecto a otros tipos de células .Tales glicoproteínas de membrana preferentemente se 'unen': a células dendríticas, especialmente células dendríticas que expresan DC-SIGN, con respecto a otros tipos de células que expresan de forma ubicua sulfato de heparina tal como células mieloide o linfoide.Tal como se describe a continuación, esta unión preferencial idealmente da como resultado infección preferencial de células dendriticas, especialmente las que expresan DC-SIG . Según la información obtenida de estudios estructurales y modelado molecular entre otros estudios, se diseñan y generan secuencias variantes de proteínas de membrana, especialmente glicoproteinas E2 y El, de forma tal que las glicoproteinas mantengan sus funciones como proteínas de membrana, pero tengan la especificidad de unión, avidez o nivel de unión deseados. Se pueden crear secuencias variantes candidatas para cada glicoproteína y someterse a ensayo usando , los métodos descritos a continuación u otros métodos conocidos en la técnica, para identificar las glicoproteína de membrana con las características más deseables.

Determinadas secuencias variantes de Sindbis : ;E2 tienen al menos una modificación de aminoácidos en el residuo 160 en comparación con la SEQ ID N0:1.E1 :residüo 160 se elimina o cambia a un aminoácido que no es ácido glutámico. Una modificación es más comúnmente una sustitución de al menos un aminoácido, ! pero alternativamente puede ser una adición o eliminación! de i.uho o más aminoácidos . Preferentemente, cualesquiera aminoácidos adicionales son pocos y no comprenden un epitopo antigénico (por ej . , secuencia etiqueta de hemaglutinina) , que puede comprometer la seguridad. En los casos en que hay dos o más modificaciones, ambas pueden ser del mismo tipo (por ej . , sustitución) o diferentes tipos (por, ej . , una sustitución y una eliminación) . Múltiples modificaciones pueden estar dispersadas o ubicarse contiguas en la secuencia de proteina .

A modo de ejemplo, las secuencias variantes comprenden al menos una modificación de aminoácidos en la región de alrededor del residuo 50 a alrededor del residuo 180 de la SEQ ID NO: 1. Dentro de esta región hay aminoácidos que están implicados en la unión al sulfato de heparán.-Al reducir la carga positiva neta de E2, la interacción electrostática con sulfato de heparán se puede reducir, lo que da como resultado una menor unión al sulfato_; de heparán. Los aminoácidos con carga positiva candidatos en esta región incluyen lisinas en los residuos 63 , 70 !':7|6 , 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 y arginina en los residuos 65 , 92, 128, 137, 157, 170, 172 (véase, "p!or ej., Bear et ál., Virology 347:183-190, 2006) (véase: SEQ :ID N0:1).A1 menos varios de estos aminoácidos están directamente implicados en la unión de E2 al sulfato de heparán. La carga positiva neta se puede reducir pr eliminación de lisina o arginina o sustitución de lisina.o arginina con un aminoácido de carga neutra o negativa Pór ejemplo, una o más de estas lisinas y argininas pueden remplazarse con ácido glutámico o aspártico. Determinadas modalidades tienen al menos una sustitución de lisina 70, 76 o 159. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de la glicoproteina E2 se establecen en SEQ ID NOS : 3 (por ej . , residuos 66 a 488), 4 (por ej . , residuos 66 a 488) y 5 (por ej . , residuos 66 a 486). En los casos en que E2 se expresa como una poliproteina con E3, la lisina ubicada adyacente al sitio de escisión E3/E2 natural se mantiene, es decir, la secuencia de reconocimiento y el sitio de escisión no. se alteran. De manera alternativa, la secuencia de sitio. , de escisión de endopeptidasa natural es remplazada por una secuencia de reconocimiento para una endopeptidasa diferente.

Determinadas variantes de E2 también se modifican en una forma que impacta positivamente en la unión a células dendriticas . La modificación del ácido glutámico encontrado en el residuo 160 en la secuencia HR de referencia p e|de mejorar la unión a las células dendriticas (véase, por éj. , Gardner et ál., J. Virol. 74, 11849, 2Q00) .ÍLas modificaciones, tales como una eliminación del resiiduo ;..1:60 o la sustitución del residuo 160 se encuentran en determinadas variantes. En variantes particulares, : un aminoácido sin carga es sustituido por Glu, en otras variantes, un aminoácido no ácido es sustituido1 ::;pbr Glu . Típicamente, Glul60 es remplazado por uno o más de los aminoácidos pequeños o alifáticos, incluyendo glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina.

Otras variantes comprenden dos o más modificaciones de aminoácidos . Típicamente en estas variantes una de las modificaciones es Glul60 y la/s otra/s modificación/es son cambios de una o más de las lisinas y argininas en . la región que abarca el residuo alrededor de 50 a alrededor' de 180 de la SEQ ID NO : 1. Determinadas de las variantes comprenden una modificación de Glul60 a un residuo no ácido o una eliminación y una o más modificaciones de Usina 70, lisina 76 o lisina 159 con un aminoácido no básico . Algunas variantes específicas comprenden una Glul60 a Gly, Lys 70 a Glu y Lys 159 a Glu; una Glu 160 a Gly, Lys 70, 76 y 159 a Glu; una eliminación de Glu 160 y Lys 70 y 159 a Glu y una eliminación de Glu 160 y Lys 70, 76 y 159 a 'Gluií jSe comprende que la numeración de las posiciones usadas en la presente se realizan con referencia a la SEQ ID NO: lf; ;de forma tal que, por ej . , si un aminoácido se elimina: o inserta, la numeración se ajusta por consiguiente:. Éor ejemplo, si el residuo 1 está ausente, entonces la posición 160 se refiere a la posición 159. .' En determinadas modalidades, la proteína : E2 :se expresa primero como una poliproteína en fusión ;Coi¾:,;al menos E3 o en fusión con una secuencia líder . Independientemente de si la secuencia líder es E3 u otra secuencia, E2 en la membrana viral debería estar libre de E3 u otra secuencia líder. En otras palabras, preferentemente E2 no es una proteína de fusión E3/E2 (por ej . , la proteína de fusión E3/E2 denominada SVGmu).En determinadas modalidades, E2 se expresa como parte de la poliproteína E3-E2-6K-E1. El virus Sindbis expresa naturalmente E2 como parte de una poliproteína y las regiones de unión para E3/E2, E2/6K y 6K/E1 tienen secuencias reconocidas y escindidas por endopeptidasas . Normalmente , la unión E3/E2 es escindida por furina o una endopeptidasa de serina tipo furina entre los residuos 65 y 66. La furina tiene especificidad por residuos de arginina emparejados que están separados por dos aminoácidos . Para mantener la escisión de E3/E2 por furina, los residuos 62-66 (RSKRS; SEQ ID NO: 26) debería mantener los dos residuos de arginina con una separación ; dé -dos aminoácidos y el residuo de serina. De manera alternativa, se puede usar una secuencia de escisión diferente en; vé¾'dé la secuencia de escisión de furina E3/E2 o cualquiera;;; de las otras secuencias de escisión. Se pueden incorporar sitios de reconocimiento y escisión para endopeptidasas incluyendo, de modo no taxativo, endopeptidasas aspártícas {por ej . , catepsina D, quimocina, proteasa dé iH ) ,' endopeptidasas de cisteína (bromelaína, papaína, calpaína) , metaloendopeptidasas, (por e . , colagenasa, termolisina) , endopeptidasa de serina (por ej . , quimotripsina, factor IXa, factor X, trombina, tripsina), estreptocinasas . Se conocen las secuencias del sitio de reconocimiento y escisión para estas enzimas.

También se pueden modificar aminoácidos en E2, que no sean los ya mencionados . Generalmente, una secuencia E2 variante tendrá al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia E2 de referencia o puede tener al menos 82%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95% o al menos 98% de identidad de secuencia . Por lo tanto, cualquiera de las glicoproteinas E2 variantes descritas anteriormente, con cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente (incluyendo, de modo no taxativo, la mutación en la posición 160 o en una o. más ;de las lisinas y argininas en la región que abarca el 'residuo alrededor de 50 a alrededor de 180, por ej . , 70, .76 ,..y./o 159) , puede tener al menos 80% de identidad de secuencia' de aminoácidos a cualquiera de las secuencias E2 de referencia, por ej . , la secuencia de glicoproteina E2 madura de SEQ ID NO: 1, 3 (por ej . , residuos66 a 488);, : 4 (por ej . , residuos 66 a 488) o 5 (por ej . , residuos 66. a 486). La glicoproteina variante debería presentar función biológica, tal como la capacidad de facilitar la infección de células dendríticas por una partícula viral que tiene una membrana que comprende E2.Los experimentos han identificado regiones de glicoproteinas de membrana que parecen tener un rol importante en varios aspectos de montaje viral, unión a la superficie celular e infección. Al hacer las variantes, la siguiente información se puede usar como directrices. La cola citoplasmática de E2, aproximadamente residuos 408 a 415, es importante para el montaje de virus (véase, por ej . , West et ál. J. Virol. 80: "4458-4468, 2006; incorporado en su totalidad) .Otras regiones están implicadas en formar una estructura secundaria (aproximadamente residuos 33-53) e implicadas en el transporte y estabilidad de proteínas (aproximadamente residuos 86-119) (véase, por ej . , Navaratmarajah et;al., ; J. Virol. 363:124-147, 2007; incorporado en su totalidad) . La variante puede retener carácter hidrofóbico de una región que abarca la membrana, aproximadamente residuos 370-380. La variante puede retener uno o ambos residuos de sitios.! de glicosilación unidos a N NIT (residuos 196-198) y ,. NFT (residuos 318-320) y puede retener uno o más de los sitios que están palmitoilados (C-396, C416 y C417) (véase, ,,.por ej., Strauss et ál., Microbiol. Rev. 58, 491-562, 1994;:pp. 499-509 que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia) . Por otro lado, muchas regiones,;de E2 se pueden modificar sin un evento perj udicial^fior ejemplo, inserciones de transposones en muchas ubicaciones diferentes en E2 igual dieron como resultado un virus viable (véase, por ej . , Navaratmarajah, supra) .

En determinadas modalidades, se puede incorporar un péptido etiqueta en las proteínas E3, 6K o El. A algunos efectos, se puede incorporar una etiqueta a E2, pero una etiqueta no es deseable para usarse en un producto para la administración a pacientes humanos. Un péptido etiqueta,- que es una secuencia corta (por ej . , 5-30 aminoácidos), se puede usar para facilitar la detección de la expresión de membrana y su presencia en partículas virales. A efectos de detección, una secuencia etiqueta será típicamente detectable por anticuerpos o productos químicos . Otro uso.de una etiqueta es facilitar la purificación de partículas virales. Un sustrato que contiene un compañero de unión para la etiqueta se puede usar para absorber el virus. La elución del virus se puede lograr mediante tratamiento con.;., una porción que desplaza la etiqueta del compañero de unión o cuando la secuencia etiqueta está unida con una secuencia de escisión, el tratamiento con la endopeptidasa apropiada convenientemente permitirá la liberación del virus .¦ (Véase, por ejemplo, catálogo QiaGEN®, sistema de proteasa^ "del Factor Xa). La remoción del péptido etiqueta es generalmente deseada a efectos de seguridad del uso de las partículas virales en sujetos animales. Si la etiqueta no se ret ra, puede ocurrir una respuesta inmunitaria a la etiqueta.

Las etiquetas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, FLAG (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 35) (patente estadounidense No. 4,703,004, incorporada en su totalidad), para las cuales los anticuerpos están comercialmente disponibles, proteina de unión a quitina, proteina de unión a maltosa, glutationa-S-transferasa, poly(His) (patente estadounidense No. 4,569,794, incorporada en su totalidad), tioredoxiina, HA (hemaglutinina) -etiqueta, entre otras . Poly (His) se puede adsorber en medio de afinidad que contiene iones de metal unidos, tales como, níquel o cobalto y eluidos con un medio de pH bajo.

Las partículas de vector se pueden evaluar para determinar la especificidad de la glicoproteína de membrana incorporada en el virus que se dirige a las células dendríticas . Por ejemplo, una población mezclada de células de médula ósea se puede obtener de un sujeto y cultivarse in vitro.De manera alternativa, se pueden obtener : y usar líneas celulares isogénicas que expresan o no expresan DC-SIGN.El virus recombinante se puede administra a'' 'la población mezclada de células de médula ósea o líneas celulares isogénicas y la expresión de un gen indicador incorporado en el virus se puede someter a ensayo en las células cultivadas . Determinadas modalidades pueden emplear un análisis de dilución limitante, donde la población mezclada de células se separa en partes separadas, ::que luego se incuban por separado con cantidades decrecientes de virus (por ej . , 2 veces, 5 veces, 10 veces menos virus en cada parte). En algunas modalidades, al menos alrededor de 50% o al menos alrededor de 60%, 70%, 80% o 90%, o al menos alrededor de 95% de células infectadas en la población celular mezclada son células dendriticas que expresan DC-SIGN.En determinadas modalidades, la relación de células dendriticas infectadas a células no dendriticas infectadas (o células que no expresan DC-SIGN) es de al menos alrededor de 2:1, al menos alrededor de 3:1, al menos alrededor de 4:1, al menos alrededor de 5:1, al menos alrededor de 6:1, al menos alrededor de 7:1, al menos alrededor de 8:1, al menos alrededor de 9:1, al menos alrededor de 10:1, al menos alrededor de 20:1, al menos alrededor de 30:1, al menos alrededor de 40:1, al menos alrededor de 50:1, al menos alrededor de 100:1, al menos alrededor de 200:1, al menos alrededor de 500:1, al menos alrededor de 1000:1, al menos alrededor de 5000:1, al menos alrededor de 10,000:1 o más. Para la dilución limitante, típicamente se ve mayor selectividad a mayores diluciones (es decir, menores cantidades) de virus -de entrada. ::: : La actividad de partículas virales seudotipadas se puede determinar por cualquiera de una variedad' °;¾[e técnicas. Por ejemplo, un método preferido para mediar : la eficacia de infectividad (IU, unidades infecciosas) es mediante la administración de partículas virales a células y medir la expresión de un producto codificado por el genoma de vector. Se puede usar cualquier producto que se puede someter a ensayo. Un tipo conveniente de producto es una proteína fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde (GFP) .Otros productos que se pueden-usar incluyen proteínas expresadas en una superficie celular (por ej . , detección por unión de anticuerpos), enzimas y similares. Si el producto es un antígeno y las células son células dendríticas, la infectividad/ac ividad se puede evaluar mediante la determinación de una respuesta inmunitaria. Además, es posible determinar efectos secundarios en un mamífero. La capacidad de dirigirse específicamente a células dendríticas también se puede evaluar directamente, por ejemplo, en cultivo celular"" tal como se describe a continuación. : .· Las partículas de vector, que incluyen las partículas virales descritas en la presente también se pueden preparar y evaluar para determinar su selectividad y/o su capacidad para facilitar la penetración de la membrana : celular diana. Las partículas virales que tienen una membrana" con glicoproteínas no modificadas se pueden usar como controles para la comparación . Brevemente, las células que receptor para una glicoproteína de membrana son por el virus usando un ensayo de infección estándar . Luego de un tiempo especificado, por ejemplo 48 horas después de la infección, las células se pueden recoger y el porcentaje de células infectadas por el virus se puede determinar por citometria de flujo, por ejemplo. La selectividad se puede puntuar calculando el porcentaje de células infectadas por virus. De manera similar, el efecto de una glicoproteina de membrana variante en titulación viral se puede cuantificar dividiendo el porcentaje de células infectadas por virus gue comprenden una membrana variante por el porcentaje de células infectadas por virus que comprenden la glicoproteina de membrana (no modificada) de tipo salvaje correspondiente . Una variante particularmente adecuada tendrá la mejor combinación de selectividad y titulación infecciosa . Una vez que se selecciona una variante, se pueden realizar ensayos de concentración viral ' '"para confirmar que estos virus se pueden concentran ,„ 51? comprometer la actividad. Los sobrenadantes se recogen y concentran mediante ultracentrifugación . Las titulaciones : de virus se pueden determinar mediante dilución limitada ' de solución madre viral e infección de células que expresan el receptor para la glicoproteina de membrana, medir; ¦ la expresión de un producto expresado por virus tal como . se describe anteriormente. ¦ - ¦ La entrada de una partícula de vector lentiviral ¦ en una célula diana es otro tipo de evaluación de actividad. Se ha usado proteina de fusión BlaM-Vpr (beta-lactamasa Vpr) para evaluar la penetración viral de VIH-1; se puede usar una fusión de BlaM y una glicoproteina de membrana de virus Sindbis, tal como El o una proteina de fusión E2/E1 para evaluar la eficacia de una proteina de membrana para facilitar la fusión y penetración en una célula diana. Se pueden preparar partículas virales, por ejemplo, mediante transfección transitoria de células empaquetadoras con uno o más vectores que comprende los elementos virales, BlaM- Vpr y la membrana variante de interés (y una molécula de afinidad si corresponde) .Los virus resultantes se pueden usar para infectar células que expresan una molécula la molécula de direccionamiento (o molécula de afinidad) se une específicamente en ausencia o presencia de un inhibidor libre de unión (tal como un anticuerpo) . Luego las' células se pueden lavar con medio independiente de C02 y cargarse con tinte CCF2 (Aurora Bioscience) . Luego de la incubación a temperatura ambiente para permitir la compleción de la reacción de escisión, las células se pueden fijar mediante paraformaldehídó y analizarse por citometría de flujo; y microscopía . La presencia de células azules indica la penetración de virus en el citoplasma; se esperarían menos células azules cuando se agrega el anticuerpo de , ; bl gue.o (véase, por ej . , Cavrois et ál., Nat . Biotechnol. 20:1151- 54, 2002) .

Para investigar si la penetración depende de un pH bajo y para identificar las glicoproteina de membrana con la deseada dependencia de pH, NH4C1 u otro compuesto que altera el pH se puede agregar en el paso de infección (NH4C1 neutralizará los compartimientos ácidos de endosomas ) . En el caso de NH4C1, la desaparición de células azules indicará que la penetración de virus depende de pH bajo.Además, para confirmar que la actividad depende del pH, se pueden agregar agentes lisosomotrópicos, tales como cloruro de amonio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina Al, monensina, nigericina, etc., al amortiguador de incubación . Estos agentes elevan el pH dentro de los compartimientos endosomales (véase, por ej . , Drose et ál . , J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). El efecto · inhibidor de estos agentes revelará el rol de pH para la fusión y entrada viral. Las diferentes cinéticas de entrada entre virus' que presentan diferentes moléculas fusogénicas se puede comparar y el más adecuado se puede seleccionar arí'bna aplicación particular.

Pueden utilizarse ensayos de entrada basados eri: PCR para monitorear la transcripción inversa y calcular la cinética de la síntesis de ADN viral como indicación de la cinética de la entrada viral. Por ejemplo, las partículas virales que comprenden una molécula de proteína de membrana particular se incuban con células diana, tales como células 293T, DC, o cualquier otra célula que se haya manipulado genéticamentepara expresar, o que exprese naturalmente, el compañero (receptor) de unión adecuado para la molécula de proteína de membrana. Inmediatamente o luego de un incremento de tiempo (para permitir que ocurra la infección) , los virus no unidos se retiran y las alícuotas de las células se analizan para detectar ácidos nucleicos virales. El ADN se extrae de estas alícuotas y se somete a análisis de amplificación, generalmente en un ensayo "semi cuantitativo, cebado con cebadores específicos de LTR. La aparición de productos de ADN específicos de LTR indica 1 el éxito de entrada viral.

Luego de la infección viral con la partícula de vector viral, el inmunógeno se expresa mediante las células dendríticas diana. Si entran en contacto ex vivo, -¿ las células dendríticas diana se transfieren de nueva. al paciente, por ejemplo por. inyección, donde interactúan. con células inmunitarias que son capaces de generar, l! una respuesta inmunitaria contra el antígeno deseado. ; En modalidades preferidas, el virus recombinante se inyecta. ;al paciente donde transduce las células dendríticas dian>-!e el lugar. Las células dendríticas expresan luegol. '.el ? . 1 antígeno particular asociado con una enfermedad o tr;ast©.r;no a tratar, y el paciente es capaz de fijar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o trastorno.

El genoma del vector viral puede contener una secuencia de polinucleótidos que codifica más de un inmunógeno, y tras la transducción de una célula dendrítica diana, genera respuestas inmunitarias a cada inmunógeno administrado a la célula. En algunas modalidades, los inmunógenos se relacionan con una única enfermedad o trastorno. En otras modalidades, los inmunógenos se relacionan con enfermedades o trastornos múltiples.

En algunas de las partículas de vector, los factores de maduración DC que activan y/o estimulan la maduración de las DC se administran junto con la secuencia codificante ; de inmunógenos de interés. En determinadas modalidades alternativas, las DC se activan por la administración de factores de maduración de DC antes de, de forma simultánea con o luego de la administración de las partícúlás", Ide ··;: ·: ·?? ¡ : vector. Los factores de maduración de DC , pueden proporcionarse de forma separada de la administración de las partículas de vector. : ;»¦¦' \ Tal como se describe en la presente, uno ; o ...más factores de maduración de DC o modulación inmune ; pueden codificarse por una o más secuencias contenidas ' en' la partícula de vector y expresadas luego de que la partícula entra o infecta una célula dendrítica. Las secuencias .¡que codifican factores de modulación inmunitaria pueden también proporcionarse en un vector separado que se cotransfecta con la partícula de vector que codifica uno o más inmunógenos en una línea celular de empaquetamiento.

Los métodos descritos en la presente pueden usarse para inmunoterapia adoptiva en un sujeto. Tal como se describe anteriormente, se identifica un inmunógeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Un polinucleótido que codifica el o los inmunógenos deseados se obtiene y empaqueta en una partícula de vector. Las células dendríticas diana se obtienen del paciente y se transducen con la partícula de vector que contiene' un polinucleótido que codifica el inmunógeno deseado.. .Las células dendríticas se transfieren luego de vuelta al paciente .

Las partículas de vector (por ej . , las partículas de vector viral descritas en la presente) pueden inyectarse in vivo, donde las partículas infectan DC y administran la secuencia de nucleótidos que codifican inmunógenos , de interés. La cantidad de partículas virales es al menos 3X106 unidades infecciosas (IU), y pueden ser l ¡menos 1X107 IU, al menos 3X107 IU, al menos 1X108 IU, ál menos 3X108 IU, al menos 1X109 IU o al menos 3X109 IU'. ; En intervalos selectivos, las DC de los órganos linfo'ides del destinatario pueden usarse para medir la expresión, por ejemplo, observando la expresión del marcador, tal como GFP o luciferasa si se coexpresan por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión recombinante incluido en la partícula de vector. Las técnicas de monitoreo de ácido nucleico y mediciones de actividad de transcriptasa inversa (RT) pueden también usarse para analizar la biodistribución de partículas de vector cuando la partícula de vector es una partícula, de vector lentiviral. Las células T de células mononucleares de sangre periférica, ganglios linfáticos, bazos o tejido infectado por el patógeno diana o maligno de destinatarios tratados con partículas de vector (que incluye partícula de vector lentiviral) pueden calcularse para determinar · la magnitud y durabilidad de respuesta a la estimulación del antígeno. Las células de tejido que no son DC, tales como células epiteliales y células linfoides, pueden analizarse para detectar la especificidad de administración de genes in vivo.

Respuesta inmunitaria Tal como se describe en la presente, se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria a.- : un inmunógeno. Las células del sistema inmunitario que están implicadas en una respuesta inmunitaria se denominan, generalmente, células inmunitarias e incluyen un lihfo'ípito y una célula no linfoide tal como célula accesoria: ;::Los linfocitos son células que específicamente reconocen y responden a xenoantígenos, y las células accesorias son aquellas que no son específicas para determinados antígenos pero están implicadas en las fases cognitivas y de activación de respuestas inmunitarias . Por ejemplo, los fagocitos mononucleares (macrófagos) , otros leucocitos (por ej . , granulocitos , que incluyen neutrófilos, eosinófilos, basófilos) y células dendríticas funcionan como células accesorias en la inducción de una respuesta inmunitaria. La activación de los linfocitos por un xenoantígeno conlleva a la inducción u obtención de numerosos mecanismos efectores que funcionan para eliminar el antígeno. Las células accesorias tales como fagocitos mononucleares que afectan o están implicadas en los mecanismos efectores también se denominan células efectoras.

Las clases principales de linfocitos incluyen" los linfocitos B (células B) , linfocitos T (células T)Y y células destructoras naturales (NK) , que son li fó<$i;tQS granulares grandes. Las células B son capaces de producir anticuerpos. Los linfocitos T se subdividen además; en células T auxiliares (CD4+ (también denominadas CD4 en ; la presente y en la técnica) ) y células T citolíticas; o citotóxicas (CD8+ (también denominadas CD8 en la présente y en la técnica) ) . Las células auxiliaressecretan ci;to©ánas que promueven la proliferación y diferenciación ' dé ^las células T y otras células, que incluyen células B y macrófagos, y seleccionan y activan leucocitos inflamatorios. Otro subgrupo de células T, denominadas células T reguladoras o células T supresoras, suprimen de forma activa la activación del sistema inmunitario y evitan la auto reactividad patológica, es decir, las enfermedades autoinmunitarias .

Los métodos descritos en la presente para inducir una respuesta inmunitaria pueden inducir una respuesta humoral, también denominada respuesta de células B en la presente y en la técnica, o pueden inducir una respuesta inmunitaria mediada por células que implica varios tipos de células T (es decir, linfocitos T) . Una respuesta humoral incluye la producción de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno (o inmunógeno) . Los anticuerpos son producidos .por linfocitos B diferenciados conocidos como ' células plasmáticas. En una respuesta mediada por células, :: los varios tipos de linfocitos T actúan para elimina ; un antígeno mediante una cantidad de mecanismos. Por ejemplo, las células T auxiliaresque son capaces de reconocer antígenos específicos pueden responder al [ liberar mediadores solubles tales como citocinas para seleccío ar más células del sistema inmunitario para que participen! en una respuesta inmunitaria. Además, las célula^:; T citotóxicas son capaces de reconocer específicamente ¦ un antigeno y pueden responder mediante la unión y destrucción o daño a una célula o partícula que tiene antígeno.

Una respuesta inmunitaria en un hospedador o sujeto puede determinarse por cualquier cantidad de métodos inmunológicos conocidos descritos en la presente y familiares para los expertos en la técnica. Tal como se describe en la presente, los métodos y técnicas para determinar la presencia y nivel de una respuesta inmunitaria incluye, por ejemplo, transferencia de energía de resonancia fluorescente, polarización de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo, ensayos de proximidad por centelleo, ensayo del gen indicador, sustrato enzimático inactivado por fluorescencia, sustrato enzimático cromogénico y electroquimioluminiscencia, inmunoensayos, (tales como ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas ; (ELISA) , radioinmunoensayo, inmunotransferencia, inmunohistoquimica, y similares) , resonancia de plasmones superficiales, ensayos basados en células tales como los que usan genes indicadores, y ensayos funcionales (por ej . , ensayos que calculan la función inmunitaria y capacidad de respuesta inmunitaria) .

Dichos ensayos incluyen, de modo no t!axat-i o, determinación in vivo o in vitro de la presencia yhivél- de anticuerpos solubles, mediadores solubles talés 'como citocinas (por ej . , IFN-?, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-6, IL-23, TNF- y TGF-ß) , linfocinas, quimiocinas, hormonas, factores de crecimiento, y similares, asi como también otros mediadores pequeños solubles de péptido, carbohidrato, nucleótido y/o lipido. Los inmunoensayos también incluyen determinar cambios en el estado de la activación celular al analizar propiedades funcionales o estructurales modificadasde células del sistema inmunitario, por ejemplo, proliferación celular, motüidad alterada, inducción de actividades especializadas tales como expresión génica especifica o comportamiento citolitico; maduración celular, tal como maduración , de células dendriticas en respuesta a estímulos; alteración de la relación entre una respuesta Thl y una respuesta Th2; diferenciación celular por células del sistema inmunitario, que incluye perfiles de expresión de antígenos" ¦ de superficie modificadoso la aparición de la apoptosis (muerte celular programada) . Los procedimientos para realizar estos ensayos y similares pueden encontrarse,»1 por ejemplo, en Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998) . Véase también Current Protocols in Immunology; Weir, Handbóc-ls of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston'¿" MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods§4 in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) y referencias citadasalli) .

La determinación de la presencia y/o nivel de anticuerpos que se unen específicamente a un inmunógeno de interés puede determinarse usando cualquiera de los varios inmunoensayos practicados rutinariamente en la técnica, que incluyen de modo no taxativo, ELISA, inmunoprecipita.ción, inmunotransferencia, inmunoelectroforesis de contracorriente, radioinmunoensayos , ensayos de transferencia dot, ensayos de inhibición o competición, y similares (véase, por ej . , patentes estadounidenses Nos. 4,376,110 y 4,486,530; Harlow et ál., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ) . Los inmunoensayos pueden también realizarse para determinar la clase e isotipo de un anticuerpo que se : une específicamente a un inmunógeno. Los anticuerpos (policlonales y/o monoclonales o fragmentos de Unióñ al antígeno de estos) que se unen específicamente a un inmunógeno y que pueden usarse como controles;:: : en inmunoensayos que detectan una respuesta inmünitiaria específica a un anticuerpo en un sujeto inmunizado, pueden prepararse generalmente por cualquiera de varias técnicas conocidas para expertos en la técnica. Véase, por e . , Harlow et ál., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold' Sp ing Harbor Laboratory (1988); Peterson, ILAR J. 46:31:4^19 (2005); (Kohler et ál., Nature, 256:495-97 (1976); Kohler et ál., Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1975); Coligan et ál. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); patentes estadounidenses Nos. 4,902,614, 4,543,439, y 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett et ál. (eds.) (1980); Antibodies:. A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); véase también, por ej . , Brand et ál., Planta Med. 70:986-92 (2004); Pasqualini et ál., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 101:257-59 (2004) . El inmunógeno o fragmentos inmunogénicos de estos, o, una célula o partícula que tiene el inmunógeno o fragmento inmunogénico de este puede usarse para inmunizar un animal para la producción de anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales . ; ¦ ·: Los niveles de citocinas pueden determinarse . de acuerdo con métodos descritos en la presente y praptíqiádos en la técnica, que incluyen por ejemplo, ELISA, ELISPOT, tinción intracelular de citocinas y citometría de .flujo y combinaciones de estos (por e . , tinción intracelula : de citocinas y citometría de flujo). La proliferación; ; de células inmunitarias y expansión clonal que resulte de; na provocación o estimulación específicas de antígenos ' de!';,'una respuesta inmunitaria puede determinarse al ! aislar linfocitos, tales como células de bazo o células de nodulos linfáticos, al estimular las células con antigeno y al calcular la producción de citocinas, proliferación celular y/o viabilidad celular, tal como por incorporación de ensayos no radiactivos o timidina tritiada, tales como ensayos MTT y similares. El efecto de un inmunógeno descrito en la presente en el balance entre una respuesta inmunitaria Thl y una respuesta inmunitaria Th2 puede examinarse, por ejemplo, determinando niveles de citocinas Thl, tales como IFN-, IL-12, IL-2 y TNF-ß, y citocinas Tipo 2, tales como IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 y IL-13. " ' El nivel de una respuesta inmunitaria CTL y el nivel de una respuesta de células T CD4 de memoria puede determinarse mediante cualquiera de los numerosos métodos inmunológicos descritos en la presente y practicados rutinariamente en la técnica. El nivel de una respuesta inmunitaria CTL puede determinarse antes ! dé ; la administración de cualquiera de las composiciones, vectores o partículas de vector descritos en la presente y usados luego para comparar con el nivel de respuesta i m'uni á.ria CTL en un punto de tiempo adecuado tras una' o más administraciones de las composiciones, vectores- ; o partículas de vector que proporcionan ayuda de células T CD4 de memoria. Los ensayos de citotoxicidád para determinar la actividad de CTL pueden realizarse usando cualquiera de las varias técnicas y métodos practicados rutinariamente en la técnica (véase, por ej . , Henkart et ál., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA) , páginas 1127-50, y referencias citadas allí).

Por ejemplo, cuando la composición que comprende el adyuvante y la composición que comprende las partículas de vector que contienen el polinucleótido que codifica el inmunógeno se administran de acuerdo con los métodos descritos en la presente, el nivel de respuesta inmunitaria a CTL o respuesta a células T CD8+, se potencia (mejora) en comparación a administrar el adyuvante en la misma composición que la partícula de vector. Por ejemplo, se puede observar un 50% de mejora al calcularse mediante ensayos de células T funcionales tales como tinción ' de citocinas intracelulares; ELISPOT; o cálculo de secreción de citocinas solubles mediante Luminex durante 1-4 semanas tras la administración de ambas composiciones. ; Tal como se usa en la presente, se dice: que ; un compañero de unión o un anticuerpo es "inmunoespecífícó, " "específico para" o que "se une específicamente':" á: : un inmunógeno de interés si el anticuerpo reacciona a ün nivel detectable con el inmunógeno o fragmento inmunogénico !de este, preferentemente con una constante de afinidad ::;Ka, mayor que o igual a alrededor de 104 -l, o mayor que: o igual a alrededor de 105 M-1, mayor que o igual a alrededor de 106 M-1, mayor que o igual a alrededor de 107 M-1, o mayor que o igual a alrededor de 108 M-1. La afinidad de un anticuerpo para su antigeno análogo se expresa comúnmente como una constante de disociación KD, y un anticuerpo se une específicamente al inmunógeno de interés si se une a una KD menor que o igual a 10-4 M, menor que o igual a alrededor de 10-5 M, menor que o igual a alrededor' dé" 10-6 M, menor que o igual a 10-7 M, o menor que o igual a 10-8 M.

Las afinidades de compañeros de unión o anticuerpos pueden determinarse fácilmente usando .técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard' et ál. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949))' y¦¦ por resonancia de plasmones superficiales (SPR; BIAcore™, Biosensor, Piscataway, NJ) . Para la resonancia de plasmones superficiales, las moléculas diana se inmovilizan', en í una fase sólida y se exponen a un compañero de unión, : (o ligando) en una fase móvil que se ejecuta junto a una célula de flujo. Si ocurre la unión del ligando a la diana inmovilizada, cambia el índice de refracción · local, provocando un cambio en el ángulo SPR, que; puede monitorearse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las velocidades de cambio de la señal SPR pueden analizarse para proporcionar constantes de velocidades aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores dan la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ej . , Wolff et ál., Cáncer Res. 53:2560-2565 (1993)).

Puede obtenerse una muestra biológica del sujeto para determinar la presencia y nivel de una respuesta inmunitaria a un inmunógeno en el sujeto que recibió una composición que comprende una partícula de vector que contiene un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleó ido que codifica al menos un inmunógeno y, una composición que comprende un adyuvante de acuerdo con . los métodos descritos en la presente. Una "muestra biológica" tal como se usa en la presente puede ser una muestra de sangre (de la cual se puede preparar suero o plasma) , muestra de biopsia, fluidos corporales (por ej . , lavado pulmonar, ascitis, lavados mucosales, líquido sinóvaál) , médula ósea, ganglios linfáticos, explante de' tejido, cultivo de órganos o cualquier otro tejido o preparación celular del sujeto o una fuente biológica.

Con respecto a todos los inmunoensayos y; métodos descritos en la presente para determinar una respuesta inmunitaria, un experto en la técnica también apreciará y comprenderá fácilmente qué controles se incluyen de .manera adecuada al practicar estos métodos. Las concentraciones de componentes de reacción, amortiguadores', temperatura y periodo de tiempo suficiente para permitir la interacción de los componentes de reacción pueden determinarse y/o ajustarse de acuerdo con métodos descritos en la presente y con los cuales los expertos en la técnica son familiares.

Métodos de uso y composiciones Una vez que se identificó y seleccionó un antigeno como inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria, se identifica y selecciona una secuencia de polinucleótidos que codifica el inmunógeno deseado. El vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de polinucleótidos o una partícula de vector que comprende el vector se formula luego en una composición inmunogénica con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente adecuado. Tal como se describe en la presente, se formula un adyuvante con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente adecuado. Tanto la composición inmunogénica como. , la composición adyuvantes se formulan de forma adecuada para el inmunógeno y adyuvante, respectivamente, y para : la ¿ruta (o modo) de administración.

Tal como se describe en la presente, el al meno:s : un inmunógeno o composición inmunogénica se administra en : un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente "ijp ra inducir una respuesta inmunitaria eficaz, que puede ser una respuesta humoral eficaz y/o una respuesta inmunitaria mediada por células eficaz (que puede incluir una respuesta de células T citotóxica) . Tal como se describe en la presente el adyuvante o composición adyuvantes administrados al sujeto potencia o mejora la respuesta inmunitaria al menos a un inmunógeno.

Las composiciones inmunogénicas , vectores de expresión recombinante y partículas de vector pueden por ende ser útiles en métodos para evitar (es decir, reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de) y/o tratar una enfermedad o trastorno, por ejemplo, una enfermedad infecciosa o cáncer. La enfermedad infecciosa a evitar o tratar es causada por el microorganismo de la enfermedad infecciosa (por ej . , virus, bacteria, parásito u hongo) de donde deriva el inmunógeno. Cuando la enfermedad, o trastorno a tratar es un cáncer, el inmunógeno' es' un antígeno asociado a un tumor que se cree es o se isabe-'Se expresa mediante uno o más de las células cancerosas particulares. Cada uno de los varios inmunógenos que pSede administrarse a un sujeto y cada uno de los organismos infecciosos o cánceres relacionados se describen en detalle en la presente.

Los ejemplos de inmunógenos y adyuvantes que' pueden usarse en estos métodos se describen en más detallé éflpjLá presente. En modalidades particulares especificas, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos de un microorganismo infeccioso (por ej . , un virus, bacteria, hongo o parásito) puede codificarse mediante una secuencia de nucleótidos incorporada en un vector de expresión recombinante que se incorpora en una partícula de vector y se incluye en la composición inmunogénica . A modo de ejemplo, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos, incluye al menos uno, dos o tres o más antígenos de VIH, que se describen en más detalle en la presente y en la técnica. En otra modalidad específica, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos codificados por un vector de expresión recombinante y usados en los métodos descritos en la presente, puede incluir al menos uno, dos, tres o más antígenos asociados a tumores. Estos antígenos asociados a tumores se describen en más detalle en la presente y pueden ser, por ejemplo, un antígeno asociado a tumores de un antígeno de carcinoma: de células renales (por ej . , carbónico anhidrasa IX (CAIX) ) , un antígeno de cáncer de próstata (por ej . , fosfátala: de ácido prostático, antígeno prostático específico, ???37G, y antígeno prostático específico de membrana) , un ant;ígerio: de mesotelioma, un antígeno de cáncer pancreático, un antígeno de melanoma, un antígeno de cáncer de mama, un antígeno; de cáncer colorrectal, un antígeno de cáncer de pulmón> ¦ un antígeno de cáncer de ovario, o cualquier antígeno asociado con un cáncer o tumor descrito en la presente y en la técnica .

Según lo entiende un experto en la técnica médica, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a la gestión médica de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (es decir, paciente) (véase, por ej . Stedman's Medical Dictionary) . En general, una dosis adecuada y régimen de tratamiento proporcionan el inmunógeno y adyuvante en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. El beneficio terapéutico y/o profiláctico incluye, por ejemplo, un mejor resultado clínico, tanto tratamiento terapéutico y medidas profilácticas opreventivas, donde el objeto es evitar o ralentizar o retardar (reducir) un trastorno o cambio fisiológico indeseado, o evitar o ralentizar o retardar (reducir) la expansión o gravedad de dicha enfermedad o trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados de tratar un sujeto incluyen, de modo no taxativo, moderación, reducción o alivio de síntomas que resultan de o están asociados con la enfermedad o trastorno a tratar; menores aparición de síntomas ; mejor calidad de vida; estado sin enfermedad más prolongado (es decir, disminuir la probabilidad o propensión a que un , sujeto presentesíntomas según lo cual se realiza un diagnóstico, de una enfermedad) ; disminución del alcance de la enferméidád; estado de la enfermedad estabilizado (es decir, ; qué : no empeora) ; retraso o enlentecimiento del progreso de la enfermedad; mejora o paliación del estado de la enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total) , ya sea detectable o indetectable; y/o supervivencia general. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no estuviera recibiendo tratamiento. Los sujetos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la enfermedad o trastorno asi como también los sujetos propensos a tener o en riesgo de desarrollar la enfermedad o trastorno. Los sujetos que necesitan tratamiento profiláctico incluyen dos sujetos en los que se debe evitar la enfermedad, trastorno o afección (es decir, disminuir la probabilidad de aparición o recurrencia de la enfermedad o trastorno) .

Los vectores de expresión recombinante y partículas de vector pueden administrarse a un sujeto en un portador o excipiente adecuado o farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables: son vehículos biológicamente compatibles, por ej . , solución salina fisiológica, que se describen en más detalle en ¦ la presente, que son adecuados para la administración á un humano u otro sujeto no humano que incluye un' sujeto mamífero no humano. Una cantidad terapéuticamente;. efida.z proporciona una cantidad del polinucleótido que es capaz'' :de producir un resultado médicamente deseable (es decir,- :se expresa una cantidad suficiente de inmunógeno para inducir o potenciar la respuesta inmunitaria especifica del inmunógeno (respuesta mediada por células y/o humoral, que incluye la respuesta de células T citotóxicas) de forma estadística y/o biológicamentesignificativa ) en un animal humano o no humano. Tal como se sabe en la técnica médica, la dosificación de cualquier paciente depende de diversos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, edad, compuesto particular a administrar, sexo, hora y ruta de administración, salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. Las dosis variarán, pero una dosis preferida para la administración de una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante es suficiente para proporcionar aproximadamente 106 a 1012 copias de la molécula de polinucleótido del vector.

Las composiciones farmacéuticas, que incluyen composiciones inmunogénicas y adyuvantes descritas e ,1a presente, pueden administrarse de forma adecuadá a! 'la enfermedad a tratar (o evitar) tal como lo determinaron expertos en la técnica médica. Una dosis adecuada y . una duración, y frecuencia de administración adecuadas, se determinarán mediante tales factores como la condicióndel paciente, el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, la forma particular del ingrediente activo y el método de administración. En general, una dosis y régimen de tratamiento adecuados proporciona la o las composiciones en una cantidad suficiente "para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico (tal como se describe en la presente, que incluye un mejor resultado clínico, tal como remisiones parciales o completas más frecuentes, o supervivencia general y/o sin enfermedad más prolongada o una menor gravedad de síntomas). Para uso profiláctico, una dosis debería ser suficiente para evitar, retardar la aparición o disminuir la gravedad de una enfermedad asociada con la enfermedad o trastorno.

En general, la cantidad de un inmunógeno, que incluye polipéptidos de fusión tal como se describe en la presente, presente en una dosis, o producidos en el lugar mediante un polinucleótido codificante presente en una dosis, varía de alrededor de 0.01 pg a alrededor de 1000 yg por kg de hospedador. Generalmente se prefiere el uso . dé : la dosificación mínima que es suficiente para proporcionar terapia eficaz. Los pacientes pueden generalmente monitorearse para detectar la efectividad terapéutileá o profiláctica usando ensayos adecuados para la afección tratada o evitada, cuyos ensayos serán familiares para los expertos en la técnica y que se describen en la presente. Cuando se administran en forma de líquido, los támañpí?'! de dosis adecuadas variarán con el tamaño del paciente/ ::,pero típicamente variarán de alrededor de 1 mi a alrededor de-500 mi (que comprende de alrededor de 0.01 \iq a alrededor de 1000 pg por kg) para un sujeto de 10-60 kg. Las dosis óptimas pueden determinarse generalmente usando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. La dosis óptima puede depender de la masa corporal, peso o volumen sanguíneo del sujeto. Tal como se describe en la presente, la' dosis adecuada puede también depender de la condiciondel paciente (por ej . , humano), es decir, etapa de la enfermedad, estado general de salud, así como también edad, género y pe$o, y otros factores familiares para un experto en la técnica médica.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier forma adecuada de administración, que incluye, por ejemplo, administración tópica, oral, enteral, nasal (es decir, intranasal), inhalación, intira't cal, rectal, vaginal, intraocular, subconjuntival, sublingual, intradérmica, intranodal, intratumoral, transdérmica. o parenteral, que incluye inyección o infusión subcutánea, percutánea, intravenosa, intramuscular, intrasternal, intracavernosa, intrameatal o intrauretral . Los métodos! de administración se describen en más detalle en la presenté.

Para la administración parenteral, el por ádor comprende preferentemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un amortiguador. Bara<- | la administración oral, pueden emplearse cualquiera de los excipientes anteriores o un portador o excipiente sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, caolín, glicerina, dextrinas de almidón, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, etil celulosa, glucosa, sucrosa y/o carbonato de magnesio.

Puede formularse una composición inmunogénica y una composición que comprende la construcción de vector recombinante o la partícula de vector para la administración por cualquier via que proporcione una dosis eficaz del inmunógeno. Dichos métodos de administración incluyen administración oral o administración por inyección y puede ser en forma de líquido. Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno .más de lo siguiente: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de! sodio isotónico, aceites fijos que pueden servir como el solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes a tibacterianos; antioxidantes; agentes quelantes; amortiguadores y agentes para ajustar la tonicidad tal como cloruro de sodi.p , o dextrosa. Una preparación parenteral puede meterse1" "en ampollas, jeringas descartables o viales de dosis múltiple de vidrio o plástico. Se prefiere el uso de solución salina fisiológica, y una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.

Para composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico tal como los vectores de expresión recombinante descritos en la presente, la molécula de ácido nucleico puede estar presente dentro de una variedad de sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen ácido nucleico, y sistemas de expresión de mamífero, virales y bacterianos tales como, por ejemplo, partículas de vector y construcciones de expresión recombinante tal como ¦ se proporciona en la presente. Las técnicas para incorporar un polinucleótido (por ej . , ADN) en dichos sistemas de expresión son conocidas por los expertos en la técnica.' En otras determinadas modalidades, el ADN puede también' estar "desnudo," tal como se describe, por ejemplo, en Ulmer et ál., Science 259:1745-49, 1993 y revisado por Cohén, Science 259:1691-1692, 1993. La absorción de AD desnudo puede aumentarse recubriendo el ADN en perlas biodegradables, que se transportan de manera eficaz a. las células . ] Las moléculas de ácido nucleico pueden administ;£a;rse a una célula de acuerdo con cualquiera de los; váSriós métodos descritos en la técnica (véase, por ej . , Akhta¾ ] et ál., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics , ed. Akhtar, 1995, Maurer et ál., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et ál., ACS Symp. No. 752:184-92 (2000); patente estadounidense No. 6,395,713; publicación de solicitud de patente internacional No. WO 94/02595); Seibo et ál., Int. J. Cáncer 87:853-59 (2000);' Seibo et ál., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); publicación de solicitud de patente estadounidense Nos. 2001/0007666 y 2003/077829). Dichos métodos de administración conocidos por los expertos en la técnica incluyen, de modo no taxativo, encapsulación¦ en liposomas, por iontoforesis , o por incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables; hidrogeles; ciclodextrinas (véase, por ej . , González et ál., Bíoconjug. Chem. 10:1068-74 (1999); Wang et ál., publicación : de solicitud internacional Nos. WO 03/47518 y WO 03!/461;8;5) ; microesferas de poli ( láctico-co-glicólico) ácido (PLGA)' y PLCA (también útiles para la administración de pépticjos y polipéptidos y otras sustancias) (véase, por ej . , patente estadounidense No. 6,447,796; publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2002/130430); nanocápsulas biodegradables; y microesferas bioadhesivas , o por vectores proteináceos (publicación de solicitud internacional No'. WO 00/53722) . En otra modalidad, las moléculas dé acido nucleico pueden también formularse o formar complejos con polietilenimina y derivados de esta, tal como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina ( PEI-PEG-triGAL) (véase también, por ej . , publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2003/0077829) .

En modalidades particulares de los métodos descritos en la presente, el sujeto es un animal humano o no humano. Un sujeto que necesita los tratamientos descritos en la presente puede presentar síntomas o secuelas de una enfermedad, trastorno o afección descrita en la presente o puede estar en riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno o afección. Los animales no humanos que se pueden tratar incluyen mamíferos, por ejemplo, primates no; humanos (por ej . , monos, chimpancés, gorilas y similares), roedores (por ej . , ratas, ratones, gerbos, hámsters, huróhés, conejos), lagomorfos, cerdos (por ej . , cerdos, cerdos miniatura) , equinos, caninos, felinos, bovinos u otros animales domésticos, de granja y zoológico.

Las composiciones que se proporcionan en la presente pueden estar en varias formas, por ej . , en forma .sólida, líquida, en polvo, acuosa o liofilizada. Los ejemplos: de excipientes y portadores farmacéuticos adecuados ; á¡ra administrar una partícula de vector, incluyendo una partícula de vector viral y una partícula de vector bacteriano, composiciones inmunogénicas y vectores de expresión recorabinantes se conocen en la técnica. Tales excipientes, portadores y/o aditivos se pueden formular por métodos convencionales y se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. Los agentes estabilizantes tales como lípidos, inhibidores de nucleasa, polímeros y; agentes quelantes que se pueden incluir en las composiciones descritas en la presente pueden ayudar a conservar las composiciones y componentes de las composiciones de degradarse dentro del cuerpo.

Las partículas de vector, incluyendo una partícula de vector viral y una partícula de vector bacteriano, composiciones inmunogénicas, composiciones adyuvantes y vectores de expresión recombinante que se proporcionan , en la presente se pueden empaquetar como kits. Opcionalmehte los kits pueden incluir uno o más componentes tales como instrucción para uso, dispositivos y reactivos adiciónales y componentes tales como tubos, recipientes, por "ej . , viales y jeringas para la puesta en práctica 'dé "'. los métodos. Los ejemplos de kits opcionalmente pueden : incluir instrucciones para uso, un dispositivo o reactivos para detectar una partícula de vector, el vector de expresión de recombinación o el inmunógeno en un sujeto y un dispositivo para administrar la composición o composiciones1 a1- 'un sujeto .

En la presente también se contemplan kits que comprenden polinucleótidos que codifican un inmunogeno. Tal kit también puede incluir al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento de virus y un vector que codifica una variante de glicoproteina E2 del virus Sindbis. Algunos kits contendrán al menos un plásmido que codifica componentes que empaquetan virus, un vector que codifica una variante de glicoproteina E2 del virus Sindbis y un vector que codifica al menos un factura de maduración de DC.

También se contemplan en la presente kits que comprenden un vector viral que codifica una secuencia de interés (que típicamente codifica un antigeno o inmunogeno) y opcionalmente, una secuencia de polinucleótidos · que codifica un factor de maduración de DC. En algunos kits,' el kit incluye al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento de virus y un vector que codijficái; ;una variante de glicoproteina E2 del virus Sindbis.

Un kit también puede contener instrucciones."' ;Las instrucciones típicamente describen métodos para la administración, incluyendo métodos para determinar : el estado adecuado del sujeto, la cantidad de dosificación adecuada y el método de administración adecuado, .para administrar la composición. Las instrucciones también pueden incluir direcciones para monitorear al sujeto por la duración del tiempo de tratamiento.

Los kits que se proporcionan en la presente también pueden incluir un dispositivo para administrar una composición inmunogénica que comprende una partícula de vector que comprende un vector de expresión recombinante y/o una composición adyuvante a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicaciones o vacunas se puede incluir en los kits que se proporcionan en la presente. Los ejemplos de dispositivos incluyen, de modo no taxativo, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador líquido, tal como un cuentagotas para los ojos. Típicamente, el dispositivo para administrar una composición es compatible con los componentes activos, ;del kit. Por ejemplo, un dispositivo de inyección sin aguja [tal como un dispositivo de inyección a alta presión se puede incluir en kits con partículas de vector, polinucleótidos y polipéptidos no dañados por inyección a alta presión, ;;; pero típicamente no se incluyen en kits que incluyen partículas de vector, polinucleótidos y polipéptidos que sé ' pueden dañar por inyección a alta presión. '.

Otras modalidades y usos serán evidentes Ipara : un experto en la técnica en vista de las descripciones ; de; la presente. Los ejemplos que siguen se proporcionan meramente como ilustrativos de diversas modalidades y no se considerará que limitan la invención de forma alguna.

Ejemplos Ejemplo 1 Rrespuesta inmunitaria a un inmunógeno: administración de adyuvante y vector lentiviral que codifican el inmunógeno en diferentes sitios Este Ejemplo describe el efecto en la respuesta inmunitaria de célula T de CD8 a un inmunógeno cuando un adyuvante se administra por separado y en un sitio diferente de un vector lentiviral que codifica ' el inmunógeno.

El vector usado para estos experimentos, denominado vector lentiviral de no integración que se dirige a' células dendriticas (DC-NILV), es un lentivector autoinactivante, defectuoso de integración que usa una glicoproteina , de membrana de virus Sindbis modificada para ingresar selectivamente a las DC. Una membrana de glicoproteína (denominada SINvarl) se desarrolló tal como se describe anteriormente (véase, por ej . , solicitud de patente estadounidense No. 12/842,609; solicitud de ¡patente internacional No. PCT/US2010/042870) y se usó pára: :::l:os experimentos descritos en la presente. Brevemente, ¦¦ la glicoproteina de membrana natural del virus Sindbis (SIN) . El vector es redundantemente incompetente para la integración. Setenta y cinco por ciento del genoma de VIH parental se retiró del DC-NILV, incluyendo todas las proteínas de regulación y accesorias, excepto por Rev.

La respuesta inmunitaria específica de antígenos se determinó cuando DC-NILV que codifica AH1A5 (1 ug de p24) se administró subcutáneamente a ratones BALB/c y , un adyuvante se administró intraperitonealmente . AH1A5 (SPSYAYHQF; SEQ ID NO:25) es un péptido alterado! del alta afinidad de AHI ( SPSYVYHQF, SEQ ID NO: 35), que es el epítopo de célula T de CD8 inmunodominante de las células de carcinoma de colon CT26 y deriva de la proteína gp70 de un virus de leucemia murina endógena (véase, por ej . , Huang et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93:9730 ( 1996) ),.,„, Las respuestas de célula T de CD8 se calcularon en comparación con AH1A5 y su péptido AHI relacionado de menor afinlidad. Los ratones se inyectaron intraperitonealmente con los adyuvantes GLA (10 pg) en PBS o Poly(I:C) (50 \ig) en PBS o se inyectaron con PBS solo (sin adyuvante). Luego de ¦ 10 días, las células de bazo se aislaron de los animales y. las respuestas inmunitarias se evaluaron calculando . la frecuencia de células T de CD8 que secretan IFN-? mediante tinción de citocina intracelular (ICS) seguido ": :de clasificación celular activada por fluorescencia . (FACS).

Los resultados se presentan en la Figura 1. También se muestran datos de células del bazo obtenidas de ratones a los que no se les inyectó el vector lentiviral (no sometidos a experimentación) .

Estos datos indican que los adyuvantes administrados en un segundo sitio de inyección pueden aumentar la respuesta inmunitaria inducida por una vacuna vectorial. Además, este efecto potenciador fue evidente para GLA, un agonista del receptor tipo Toll 4.

Ejemplo 2 Respuesta inmunitaria a un inmunógeno: coadminsitración de un adyuvante mezclado con un vector lentiviral que codifica el inmunógeno Este Ejemplo describe el efecto en la respuesta inmunitaria de célula T de CD8 a un inmunógeno cuando, un adyuvante se mezcla con un vector lentiviral que codifica el inmunógeno y tanto el adyuvante como el vector se administran juntos.

Se determinó el efecto de los dos adyuvantes, GLÁ y lipopolisacárido (LPS) en la respuesta inmunitaria al epítopo AH1A5 de célula T de CD8. DC-NILV que codifica AH1A5 (1 µg de p24) se mezcló con PBS (grupo de control)/ 4 g de GLA, 20 \iq de GLA, o 4 de lipopolisacárido · (LPS) y luego se administró subcutáneamente (s.c.) a grupo- de ratones BALB/c. Luego de 10 días, las células de bazo se aislaron de animales en cada grupo y la respuesta de célula T de CD8 se evaluó determinando el nivel de TNF-a e IFN-y mediante tinción de citocina intracelular (ICS) seguido de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . Los resultados se presentan en la Figura 2. También se muestran datos de células del bazo obtenidas de ratones a los que no se les inyectó el vector lentiviral (no DC-NILV) .

Estos datos indican que cuando GLA se coadministra con la vacuna de lentivector, como es la práctica normal para adyuvantes de vacuna, esto sorprendentemente, da™ como resultado una inhibición de respuestas inmunitarias inducidas por vacuna, destacando la importancia de separar la administración del vector de vacuna y adyuvante como en el Ejemplo 1. El efecto inhibidor no fue un atributo único de GLA, pero también se observa con el adyuvante LPS lo que sugiere que los adyuvantes en general son incompatibles para coadministrarse con las vacunas vectoriales. ; Ejemplo 3 Respuesta inmunitaria a un inmunógeno: administración de un adyuvante y vector lentiviral que codifican el inmunógeno mediante una vía diferente y pertinente desde el puntó : de vista clínico ' ' "" ' Este Ejemplo describe el efecto en la respuesta inmunitaria de célula T de CD8 a un inmunógeno cuando un vector lentiviral que codifica el inmunógeno se administra subcutáneamente y un adyuvante se administra intramuscularmente .

Las respuestas de célula T de CD8 contra tres epitopos se determinaron en ratones C57BL/6 que se inmunizaron con DC-NILV que codifica un antigeno de polipéptido recombinante que incluye cada uno de los epitopos. Los epitopos fueron de glicoproteina del virus de la coriomeningitis linfocitica (GP33: secuencia AVYNF TM) , ovalbúmina de gallina (OVA257: secuencia SIINFEKL.) ,, y proteina Gag del virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV Gag: secuencia AAVKNWMTQTL) . Los : ratones recibieron DC-NILV (1 \iq de p24) subcutáneamente asi como la administración intramuscular de un intervalo de 'dosis de GLA (0.16 - 20 µg) en una emulsión estable de aceite, en agua (SE) o SE solo (0 pg) . El día 12, las células del'b'azo se aislaron de los animales y la respuesta a células °?' de CD8 se evaluaron determinando el porcentaje de células que expresan IFN-?, TNF-a e IL-2 por tinción de citócina intracelular . Los resultados se presentan en la Figura "3: Estos datos indican que GLA también es eficaz para potenciar inmunización de vector subcutáneo cuándd':| se administra mediante la vía intramuscular, un sitio ' de inyección que es más relevante desde el punto de vista clínico que la vía intraperitoneal descrita en el Ejemplo 1. Los datos también muestran que la aplicación en el segundo sitio de adyuvante de GLA es eficaz para potenciar respuestas inmunitarias a través de un amplio intervalo de dosis .

Las diversas modalidades descritas anteriormente se pueden combinar para proporcionar modalidades adicionales. Los ejemplos de modalidades incluyen: 1A. Un método para inducir una respuesta inmunitaria a un inmunógeno en un sujeto, dicho método comprende administrar (a) una primera composición que comprende una partícula de vector que comprende un polinucleótido que codifica el inmunógeno y (b) una segunda composición que comprende un adyuvante. Se entiende que la primera' y segunda composición son composiciones separadas. También' se entiende que el polinucleótido que codifica el inmunógeno es preferentemente parte de un vector de expresión recombinante tal como se describe en la presente. Por lo tanto, la partícula de vector comprende un vecto de expresión recombinante que comprende un polinucleótido ' que codifica el inmunógeno.

Otros ejemplos de modalidades incluyen kittf¦ : o paquetes, que pueden comprender, en recipientes separáSos, la composición que comprende la partícula de vector y la composición que comprende el adyuvante, opcionalmente con instrucciones para los métodos o usos descritos en la presente. Por lo tanto, estos ejemplos de modalidades incluyen IB. Un kit que comprende (a) una primera composición que comprende una partícula de vector que comprende un polinucleotido que codifica el inmunógeno y (b) una segunda composición que comprende un adyuvante. Se entiende que la primera y segunda composición son composiciones separadas.

Estos aspectos de la invención incluyen todas las modalidades que siguen: 2. Una composición que comprende una partícula, de vector que comprende un polinucleotido que codifica': un inmunógeno para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria al inmunógeno, caracterizada porque" ' · la composición es para la administración con una composición separada que comprende un adyuvante. Se entiende que este tipo de modalidad incluye el uso de tal partícula de vector para la preparación de una medicación para su uslo é'h : la inducción de una respuesta inmunitaria al inmunógeno, caracterizada porque la composición es para :: : la administración con una composición separada que comprende un adyuvante. Toda la descripción en la presente con respecto a los métodos para inducir una respuesta inmunitaria y los tipos de composiciones y partículas de vector para su uso en tales métodos, aplica a tales composiciones para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria, asi como a usos en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria. 3. Una composición que comprende un adyuvante para su uso en potenciar una respuesta inmunitaria, incluyendo una respuesta inmunitaria no especifica, caracterizada porque la composición es para la administración con 1 una composición separada que comprende una partícula de vector que comprende un polinucleótido que codifica un inmunógeno. Se espera que el adyuvante potencie la r.espuesta inmunitaria inducida por la partícula de vector.,,.; Se entiende que este tipo de modalidad incluye el uso dental adyuvante para la preparación de un medicamento para sii uso en la inducción de una respuesta inmunitaria al ini jnógéno, caracterizado porque la composición es para la administración con una composición separada que comprende la partícula de vector. Toda la descripción en la présente con respecto a los métodos para inducir una respuesta inmunitaria y los tipos de composiciones y partículas 'de vector para su uso en tales métodos, aplica a tales composiciones para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria, asi como a usos en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria. 4. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la partícula de vector es una célula, partícula de vector de virus o partícula tipo virus, opcionalmente¦ una partícula de vecto lentiviral seudotipada con una glicoproteína de un arbovirus. 5. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la partícula de vector es una partícula de vector lentiviral seudotipada con una glicoproteína de un alfavirus, opcionalmente un virus Sindbis y opcionalmente un virus Sindbis que comprende una mutación en la posición 160. 6. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde el adyuvante es un ligando de TLR, por ej . , ligando [TLRA , TLR8 o TLR9] . 7. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde el adyuvante es un agonista de TLR4, opcionalmente ; un adyuvante relacionado con lipido A no tóxico, opcionalmente un lipido A monofosforilo o lipido A monofosforilo 3 D'é-iO- acilado (MPL) o un mimético de lípido A o GLA de fórmula I tal como se describe anteriormente o GLA de fórmula (la) : o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, donde: R1, R3, R5 y R6 son alquilo Cn-C2o y 2 y R*-son alquilo Ci2-C2o en una modalidad más específica, GLA tiene la fórmula (la) establecida anteriormente donde R1, R3, R5 y R6 son alquilo Cn y R2 y R4 son alquilo C12-is e una modalidad más específica adicional, GLA tiene la. fórmula (la) establecida anteriormente donde R1, R3, R5 y R6;:: ;son alquilo Cn y R2 y R4 son alquilo Ci3 o el GLA tiene: üna estructura que se selecciona de la siguiente ; fórmula química (Ib) : ' : : ?': (Ib) o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, donde: Li, L2, L3, L4, L5 y L6 son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de -O-, -NH-y -((¾)-; L7/ L8, L9 y Lio son iguales o diferentes y en cualquier aparición pueden estar ausentes o ser -C(=0)-; Yi es un grupo funcional ácido; Y2 y Y3 son iguales o diferentes y se selecciona cada uno independientemente de -OH, -SH ' y .un grupo funcional ácido; Y4 es -OH o -SH; Rlf R3, R5 y R6 son iguales o diferentes y se selecciona cada -uno independientemente del grupo de alquilo Ce-C^y R2 y R4".son iguales o diferentes y se selecciona cada uno ' '" ' independientemente del grupo de alquilo Cg-Cn- En ejemplos de modalidades, el GLA está presente en una cantidad- de 0.1-10 pg/inyección o en una cantidad de 0.2-5 pg/inyección o en una cantidad de 0.5-2.5 pg/inyección, donde ;;:una ¦ ; ' : 'ß,?!? ·¦ inyección se administra a una persona de al menos 50 Kgr de masa corporal. · ¦ ¦-¦ ¦ 8. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la composición que comprende un adyuvante está sustancialmente desprovista de antigenos inmunogénicos. 9. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la composición que comprende un adyuvante comprende un segundo coadyuvante, opcionalmente una emulsión de aceite en agua . 10. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde las dos composiciones se administran simultáneamente en diferentes sitios, opcionalmente por diferentes vías' de administración . 11. Cualquiera de las modalidades que anteceden d nde las dos composiciones se administran secuencialmente opcionalmente en diferentes sitios y opcionalmente^; por diferentes vías de administración. 12. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la vía de administración es parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumo.ral, intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa o tópica. 13. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la composición que comprende la partícula de vector se administra subcutánea o intradérmicamente . 14. Cualquiera de las modalidades 12-13 donde la composición que comprende el adyuvante se administra subcutánea o intramuscularmente o por vías preferidas oralmente . 15. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde la partícula de vector se une preferentemente a células dendríticas. Opcionalmente la partícula de · vector preferentemente infecta células dendríticas, por ej . ' la relación de células dendríticas infectadas a células no dendríticas infectadas (o células que no expresan DC-SiGN) es de al menos alrededor de 2:1, al menos alrededor de 3:l, al menos alrededor de 4:1, al menos alrededor de; 5:i:,; al menos alrededor de 6:1, al menos alrededor de 7:1, al menos alrededor de 8:1, al menos alrededor de 9:1, ál menos alrededor de 10:1, al menos alrededor de 20:1, al menos alrededor de 30:1, al menos alrededor de 40:1, ál menos alrededor de 50:1, al menos alrededor de 100:1, al menos alrededor de 200:1, al menos alrededor de 500:1, al menos alrededor de 1000:1, al menos alrededor de 5000:1, al me os alrededor de 10,000:1 o más. 16. Cualquiera de las modalidades que anteceden donde el inmunógeno es un antígeno asociado con tumor, por ej . , un antígeno de carcinoma de células renales, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de mesotelioma, un antígeno de cáncer pancreático, un antígeno de melanoma, un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de pulmón o un antígeno de cáncer de ovario, opcionalmente fosfatasa de ácido prostético, antígeno prostético específico, NKX3:1 o antígeno prostético específico de membrana u opcionalmente anhidrasa carbónica IX. 17. Cualquier de las modalidades que anteceden .dónde el inmunógeno es de un microorganismo infeccioso, por ej . , un antígeno viral, un antígeno bacteriano, antígeno fúngico o antígeno parasitario. 18. Cualquiera de las modalidades que anteceden dónde ' la respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpo específica de inmunógenos o una respuesta de células T específica de inmunógenos. '. !" '! 19. La modalidad 18 incluye una respuesta ! de anticuerpo específica de inmunógenos mensurable, o... una respuesta de célula T específica de inmunógenos mensurable. 20. También se espera usar los métodos, composiciones y usos que anteceden que implican inducir una respuesta inmunitaria, por e . , para tratar o prevenir el cáncer, en el caso de una respuesta inmunitaria a un antigeno asociado con tumor o para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa, en el caso de una respuesta inmunitaria a un antigeno viral, antigeno bacteriano, antigeno fúngico o antigeno parasitario. 21. Una composición que comprende cualquiera de las partículas de vector que anteceden que comprende un polinucleótido que codifica un inmunogeno para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer, caracterizado porque la composición es para administración con una composición que comprende cualquiera de los adyuvantes que anteceden. 22. Una composición que comprende cualquiera de^ ^-OS adyuvantes que anteceden para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer, caracterizado porque la composición es para administración con una composición que comprende cualquiera de las partículas de vector que anteceden'" que comprenden un polinucleótido que codifica un inmunogeno'. ' . 23. Una composición que comprende cualquiera de- las partículas de vector que anteceden que comprenden: ;un polinucleótido que codifica un inmunógeno para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa, caracterizado porque la composición es para administración con una composición que comprende cualquiera de los adyuvantes que anteceden. 24. Una composición que comprende cualquiera de¦ los adyuvantes que anteceden para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa, caracterizado porque la composición es para administración con una composición que comprende cualquiera de las partículas de vector que anteceden que comprenden un polinucleótido · que codifica un inmunógeno. 25. Una composición que comprende cualquiera de los adyuvantes que anteceden para su coadministración' con :una composición separada que comprende cualquiera . de„, .las partículas de vector que anteceden.

Se entiende que estas modalidades incluyen el uso: de las composiciones respectivas en la preparación de ¦ un medicamento para tales usos.

Todas las patentes estadounidenses, publicaciones de solicitud de patente estadounidense, solicitud de . patente estadounidense, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones que no son patentes a las que se hace referencia en esta memoria descriptiva y/o enumeradas en la Hoja de datos de solicitud se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Los aspectos de las modalidades se pueden modificar, en caso de ser necesario, para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar aun más modalidades.

Estos y otros cambios se pueden hacer a las modalidades en vista de la descripción detallada que antecede. En general, en las siguientes reivindicaciones, no debería considerarse que los términos usados limitan' las reivindicaciones a las modalidades específicas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, pero se debería considerar que incluyen todas las modalidades posibles junto con el alcance total de los equivalentés a los que tienen derecho tales reivindicaciones Por consiguiente, las reivindicaciones no están limitadas i por la descripción. : · ::·;

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para inducir una respuesta inmunitaria especifica para un inmunógeno en un sujeto, dicho método comprende administrarle simultánea o secuencialmente al sujeto (a) una primera composición que comprende una partícula de vector, la partícula de vector comprende un vector de expresión recombinante donde el vector de expresión recombinante comprende un polinucleótido que codifica el inmunógeno y donde el polinucleótido está unido operativamente a al menos una secuencia de expresión reguladora y (b) una segunda composición que comprende un adyuvante farmacéuticamente adecuado, donde cada una de la primera composición y la segunda composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. El, método de la reivindicación 1, donde [ la primera composición y la segunda composición se actóiinijg rian simultáneamente y donde la primera composición se administra al sujeto en un primer sitio y la segunda composición se administra al sujeto en un segundo sitio, donde el primer sitio y el segundo sitio son diferentes !

3. El método de la reivindicación 2, donde ; la primera composición se administra en el primer sitio mediante una primera vía y la segunda composición' i se administra en el segundo sitio mediante una segunda · ví¾.,¦

4. El método de la reivindicación 3, donde la primera vía y la segunda vía son diferentes y cada una ' se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica.

5. El método de la reivindicación 3, donde cada una de la primera vía y la segunda vía es la misma y se selecciona de parenteral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, percutánea, transdérmica y tópica.

6. El método de la reivindicación 1, donde la primera composición y la segunda composición se administran secuencialmente .

7. El método de la reivindicación 6, donde la primera composición se administra al sujeto en un primer sitio y la segunda composición se administra al sujeto en el segundo sitio, donde el primer sitio y el segundo -sitio son iguales o diferentes.

8. El método de la reivindicación 7, dondej la primera composición se administra en el primer -sitio mediante una primera vía y la segunda composición se administra en el segundo sitio mediante una segunda vía i

9. El método de la reivindicación 8, donde; la primera vía y la segunda vía son diferentes y cada una se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral , intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica.

10. El método de la reivindicación 8, donde cada una de la primera vía y la segunda vía es la misma y se selecciona de parenteral, enteral, oral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, intranasal, transdérmica, por inhalación, mucosa y tópica.

11. El método de la reivindicación 8, donde el primer sitio y el segundo sitio son los mismos y donde la primera vía y la segunda vía son diferentes y cada vía se selecciona de parenteral, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intratumoral, intranodal, percutánea, transdérmica y tópica.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde la primera composición se administra antes de la administración de la segunda composición.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde la segunda composición se administra ;an.te,s de la administración de la primera composición.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el vector de expresión recombinantfe ; se selecciona de un genoma de vector lentiviral, genoma' de vector de poxvirus, genoma de vector de virus de la vacuna, genoma de vector de adenovirus, genoma de vector :de virus asociado con adenovirus, genoma de vector de virus".'. ,del herpes, genoma de vector de virus alfa y ADN plásmido.

15. El método de la reivindicación 14, donde la partícula de vector es una partícula de vector lentiviral que comprende el genoma de vector lentiviral; una partícula de vector de poxvirus que comprende el genoma de vector de poxvirus; una partícula de vector de virus de la vacuna que comprende el genoma de vector de virus de la vacuna;, una partícula de vector de adenovirus que comprende el genoma de vector de adenovirus; una partícula de vector de virus asociado con adenovirus que comprende el genoma de vector de virus asociado con adenovirus; una partícula de vector de virus del herpes que comprende el genoma de vector de virus del herpes o una partícula de vector de virus alfa que comprende el genoma de vector del virus alfa.

16. El método de la reivindicación 16, donde' la partícula de vector es la partícula de vector lentiviral y comprende el genoma del vector lentiviral. . i -rx l

17. El método de la reivindicación ' 15 o reivindicación 16, donde la partícula de vector lentiviral comprende también una membrana que comprende ., una glicoproteína E2 del virus Sindbis que tiene al ;menos un cambio de aminoácido en comparación con laSEQ ID ,NQ:1, donde el residuo 160 está ausente o es un aminoácido ;qjü¿ no es ácido glutámico y donde la glicoproteína E2 no es parte de una proteína de fusión con una proteína E3 de. -virus Sindbis .

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde la partícula de vector administra el vector de expresión recombinante a una célula presentadora de antígenos .

19. El método de la reivindicación 18, donde la célula presentadora de antígenos es una célula dendritica.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, donde el inmunógeno es un antígeno asociado con un tumor .

21. El método de la reivindicación 20, donde el antígeno asociado con tumor se selecciona de un antígeno de carcinoma de células renales, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de mesotelioma, un antígeno de cáncer pancreático, un antígeno de melanoma, un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de pulmón o un antígeno de cáncer de ovarios. ¡ . ",„'.',

22. El método de la reivindicación 21, idondé el antígeno de cáncer de próstata es fosfatasa de '"ácido prostético, antígeno prostético específico, KX3.1 o antígeno prostético específico de membrana. ¦ -¦· >

23. El método de la reivindicación 21, donde, el antígeno de carcinoma de células renales es anhidrasa carbónica IX.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, donde el inmunógeno es de un microorganismo infeccioso que se selecciona de un virus, una bacteria, un hongo o un parásito.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, donde la respuesta inmunitaria inducida comprende una respuesta inmunitaria de linfocitos T citotóxicos.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde la respuesta inmunitaria inducida comprende la producción de un anticuerpo especifico de inmunógenos.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el adyuvante es un adyuvante relacionado con lipidico A no tóxico. , ... ,

28. El método de la reivindicación 27, donde el adyuvante relacionado con lipidico A no tóxico es adyuvante lipidico glucopiranosil A (GLA) .

29. El método de la reivindicación 28, donde GLA se formula en una emulsión de aceite en agua estable.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-29, donde la segunda composición que comprende el adyuvante inhibe la inducción de la respuesta inmunitaria al inmunógeno cuando '<¦¦ (a) la segunda composición se administra junto con la primera composición como una única composición p (b), la primera composición . y la segunda composición se administran simultáneamente en el mismo lugar y por la misma via .