MX2013008948A - Métodos y composiciones para incrementar la producción de ácido siálico y tratar condiciones de enfermedades relacionadas siálicas. - Google Patents

Abstract

Se describe en el presente métodos para expresar péptido UDP-G1cNAc 2-Epimerasa/ManNAc enzima quinasa (GNE) en una célula de un sujeto que comprende: suministrar dentro de la célula del sujeto una construcción de expresión de ácido nucleico aislado que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de ácido amino de SEQ ID NO:3, en donde en el suministro dentro de la célula del sujeto, la construcción de la expresión de ácido nucleico inicia la expresión del péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo. Asimismo, se describen métodos para producir péptido GNE en una célula que comprende la infección de la célula con una construcción del ácido nucleico aislado que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO:3.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INCREMENTAR LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SIÁLICO Y TRATAR CONDICIONES DE ENFERMEDADES RELACIONADAS SIÁLICAS Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional de los E.U. N° de serie 61/438,585, presentada el 1 de febrero de 2012, por Darvish et al., toda la descripción que se incorpora por referencia en el presente, incluyendo los dibujos.

Campo de la Invención La presente invención está en el campo de los métodos y composiciones de terapia génica para aumentar la producción de ácido siálico en un sistema biológico mediante el suministro de la región de codificación de ADN de la enzima clave de la biosintesis de ácido siálico (UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa, GNE) .

Antecedentes de la Descripción La Miopatía Corporal de Inclusión Hereditaria (MCIH) es un trastorno degenerativo del músculo esquelético progresivo de aparición en adultos jóvenes, que causa incapacidad física severa. Actualmente no existe un tratamiento terapéutico eficaz para MCIH. MCIH es un trastorno autosómico recesivo causado por mutaciones en el gen GNE . El gen GNE codifica para la enzima bifuncional UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc quinasa (GNE/MNK) . Esta es la enzima clave limitante de la velocidad que cataliza las dos primeras reacciones de la producción celular de ácido siálico. La producción de ácido siálico reducida por consiguiente conduce a la disminución de sialilación de una variedad de glicoproteínas, incluyendo las proteínas musculares críticas tales como un a-distroglicano (a-DG) , molécula de adhesión celular neural (MACN) , o neprilisina, o conducen a la expresión alterada de otros genes tales como ganliosidA (GM3) sintasa. Esto a su vez conduce a la degeneración muscular. MCIH es también conocida como Miopatía Distal con Vacuolas Limadas, Miopatía Nonaka, miopatía vacuolar que prescinde los cuádriceps o miopatía relacionada con GNE.

Breve Descripción de la Invención Se describe en el presente los métodos para expresar el péptido UDP-GlcNAc 2-Epimerase/ManNAc enzima quinasa (GNE) en una célula de un sujeto que comprende: suministrar dentro de la célula del sujeto de una construcción de expresión de ácido nucleico aislada que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento activo terapéuticamente del mismo, en el que el péptido GNE tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en donde tras el suministro dentro de la célula del sujeto, la construcción de expresión de ácido nucleico inicia la expresión del péptido GNE o un fragmento activo terapéuticamente del mismo.

También se describen métodos de administración de una enzima codificada GNE que comprende: a) crear un acceso intravenoso en un punto por debajo de una rodilla o un codo de una extremidad de un sujeto, b) aplicar un torniquete en un punto proximal al resto del cuerpo del sujeto que el punto de acceso intravenoso, c) introducir una dosis única de una construcción de expresión de ácido nucleico aislada en la extremidad a través del acceso por vía intravenosa, en donde la dosis única es de un volumen suficiente para aumentar la presión intravascular para la extravasación del polinucleótido; en donde, la construcción de ácido nucleico aislada que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico qué codifica un péptido GNE o un fragmento activo terapéuticamente del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Además, se describen métodos para producir un péptido GNE en una célula que comprende infectar a la célula con una construcción de ácido nucleico aislada que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento activo terapéuticamente del mismo, en donde péptido GNE tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es un diagrama del vector de expresión NTC8685-GNE descrito en el presente.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos del vector de NTC8685-GNE (SEQ ID NO:l).

La figura 3 es un diagrama de vector de U VC3- GNE.

La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos del vector de UMVC3-GNE (SEC ID NO:2).

La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la enzima de proteina GNE (SEQ ID NO:3).

La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de las isoformas GNE y dominio alostérico. Las mutaciones de dominio alostéricos comunes que permiten una mayor producción de ácido siálico se ilustraron (R263Q/W/L y R266Q/ ) .

La figura 7 es un gráfico de barras de la producción de ácido siálico en las células GNE-nulo CHO. En comparación con las células no tratadas ("medio", "vector vacio"), la producción de ácido siálico fue significativa mayor en las células transíectadas con plásmidos GNE.

La figura 8 es un gráfico de barras de las células GNE-nulo CHO de ácido siálico, la comparación de Vectores UMVC3 y NTC8685.

La figura 9 es un gráfico de barras de fracciones celulares de contenido de ácido siálico de células GNE-nulo CHO, comparación de Vectores UMVC3 y NTC8685.

La figura 10 es un gráfico de barras que muestra la comparación relativa de dosis in vitro de GNE vecor vs ManNAc.

Descripción Detallada de las Modalidades Se da a conocer en el presente son métodos de terapia génica y composiciones para aumentar la producción de ácido siálico en un sistema biológico mediante el suministro de la región de codificación de ADN de la enzima clave de la biosintesis de ácido siálico (UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa/N-Acetilmanosamina quinasa, GNE) . Las condiciones de enfermedad que se beneficiarán del aumento de la producción de siálico celular o funciones GNE mejoradas, incluyen, pero sin limitarse a, Miopatia Corporal de Inclusión Hereditaria (MCIH) o Miopatia Distal con Vacuolas Limadas (MDVL) . Los presentes métodos y composiciones se refieren también a la reducción o la eliminación de los ácidos siálicos no humanos (por ejemplo, N-Glicolilneuraminato, Neu5Gc) a partir de células o tejidos humanos. Los ácidos siálicos no humanos pueden contribuir a varias enfermedades humanas, y la reducción a largo plazo de los niveles celulares de ácido siálico no humano puede resultar beneficiosa en la prevención y el tratamiento de los procesos de la enfermedad (WO/2010/030666) Varki (2009) . El aumento de la producción celular de acetilneuraminato (Neu5Ac) puede reducir el contenido celular de los ácidos siálicos no humanos.

Al ser personalmente afectado por MCIH, el inventor ha desarrollado y validado un vector de terapia génica (ácido polinucleico plásmido desnudo) a través de los estudios in vitro en los últimos 7 años. A través de muchos años de búsquedas en la literatura médica y la evaluación de los datos relativos a los diversos métodos y vectores de suministro in vivo, se eligió un método de suministro elegante y fácil usando una variación de un procedimiento conocido como el "Bloque Bier" . El Bloque Bier ha sido utilizado en la práctica médica por más de 100 años (dos Reis 2008) .

Como se describe a continuación, la combinación de los procesos específicos de la enfermedad, los plásmidos, y el método de suministro tiene numerosas ventajas sobre otros descritos hasta la fecha. Estas ventajas permiten para la traducción fácil para el uso práctico en modelos animales y humanos.

Se dan a conocer en el presente los componentes de los productos farmacológicos y métodos de suministro de los productos farmacológicos a los músculos esqueléticos o de otros órganos (por ejemplo, hígado) de animales o pacientes humanos (por ejemplo, paciente afectado con MCIH) . Los productos farmacológicos pueden ser polinucleótidos que codifican las formas de la proteína GNE, polipéptidos o secuencias de aminoácidos y/o la o las proteínas recombinantes , polipéptidos o secuencias de aminoácidos codificadas por las formas de GNE de nucleótidos no modificados o modificados sin modificar o modificado. En algunas modalidades, los métodos de suministro incluyen (1) la oclusión externa o interna de los vasos (arterias, venas, y/o el sistema linfático) para lograr el aislamiento vascular de los sistemas de órganos objeto, el grupo de órganos/tejidos, o área del cuerpo, y (2) la administración del producto terapéutico con ayuda de acceso vascular (por ejemplo, intravenosa) . En algunas modalidades, el cuerpo de órganos/tejidos/área que están aislados (órganos objeto) están expuestos al compuesto que está siendo suministrado, mientras que en otras modalidades, el cuerpo de órganos/tejidos/área están protegidos de tal exposición.

Descripción Y Mejoras del Gen Terapéutico (GNE) En algunas modalidades, los productos terapéuticos descritos en esta descripción son moléculas de polinucleótidos (ADN) , mientras que en otras modalidades, que son polipéptido (proteina, fragmentos de proteínas, secuencias de aminoácidos) moléculas. En algunas modalidades, la molécula de polinucleótido, ya sea lineal o circular, puede contener varios elementos además de la secuencia de codificación que codifica para la proteína GNE, o una forma modificada de la proteína GNE, que es o se vuelve biológicamente activa dentro de un sistema biológico. La proteína GNE tiene la secuencia (Figura 3).

En algunas modalidades, los métodos terapéuticos descritos en la presente son conocidos comúnmente como "terapia génica", y comprenden la administración de la molécula de polinucleótido anteriormente. En otras modalidades, los métodos terapéuticos descritos en el presente son conocidos comúnmente como "Terapia de Reemplazo de Enzimas (TRE)", y comprenden la administración de la proteina GNE, o una forma modificada de la proteina GNE, que es o se vuelve biológicamente activa dentro de un sistema biológico .

GNE codifica para la enzima clave de la producción de ácido siálico (UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase/N-Acetilmanosamina quinasa) . Varios estados de enfermedad pueden beneficiarse de una mayor expresión de GNE. El más notable es el trastorno degenerativo del músculo progresivo gravemente debilitante conocido como miopatia relacionado GNE, iopatia Corporal de Inclusión Hereditaria (MCIH) y una de sus distintas formas conocidas como IBM2 o Miopatia Distal con Vacuolas Limadas (MDVL) .

Los componentes enzimáticos GNE o dominios (por ejemplo, series de 10 o más aminoácidos secuenciales) pueden recombinarse para mejorar las funciones deseadas del gen GNE y reducir o eliminar las funciones no deseadas. Por ejemplo, si se desea la producción de grandes cantidades de ácido siálico (NeuAc) en los organismos biológicos, por ejemplo, procariotas o eucariotas, se puede optimizar el dominio epimerasa del gen GNE para eliminar o reducir la función de dominio inhibidor alostérico. En los organismos y los animales que tienen actividad quinasa ManNAc redundante, tales como otras enzimas capaces de realizar de manera eficiente la fosforilación de ManNAc, también se puede reducir o eliminar el dominio quinasa GNE para reducir el tamaño, la dosis eficaz mínima, y/o maximizar la dosis máxima tolerable en un sistema biológico.

Aunque la enzima GNE, o diversos componentes o dominios de los mismos, también se sabe que tiene las funciones celulares, además de la producción de ácido siálico (Hinderlich, Salama et al. 2004; Broccolini, Gliubizzi et al. 2005; Krause, Hinderlich et al. 2005, Salama, Hinderlich et al. 2005; Penner, Mantey et al. 2006; ang, Sun et al. 2006; Amsili, Shlomái et al. 2007; Amsili, Zer et al. 2008; Kontou, Weidemann et al. 2008.; Kontou, Weidemann et al. 2009; Paccalet, Coulombe et al. 2010), hiposialilación de moléculas celulares críticos juegan un papel importante en el proceso de la enfermedad humana (Huizing, Rakocevic et al. 2004; Noguchi, Keira et al. 2004; Saito, Tomimitsu. et al. 2004; Tajima, Uyama et al. 2005; Ricci, Broccolini et al. 2006;, Galeano, Klootwijk et al. 2007; Sparks, Rakocevic y otros, 2007; Nemunaitis, aples et al. 2010) .

El aumento de ácido siálico y la relación de NeuAc/NeuGc en los sistemas biológicos se desea, por varias razones conocidas en sujetos humanos. Los mamíferos producen dos moléculas diferentes siálico: (1) ácido N-acetilneuramínico (NANA o Neu5Ac) , y (2) ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) . CMP-NANA se convierte en C P-Neu5Gc por CMP-NANA hidoxilasa (CMAH) . A diferencia de otros primates y mamíferos (incluyendo vaca) , los seres humanos son genéticamente deficientes en Neu5Gc debido a una mutación de inactivación Alu-mediada de CMAH (Chou, Hayakawa et al. 2002). Por lo tanto, Neu5Ac es el único ácido siálico producido por los seres humanos y muchos seres humanos producen anticuerpos contra Neu5Gc (Tangvoranuntakul, Gagneux et al. 2003). El NeuGc encuentra en las células y tejidos humanos se cree que son los alimentos o medios de cultivo celular. Los seres humanos producen anticuerpos contra NeuGc, potencialmente contribuir a la inflamación crónica, y diversos trastornos comunes en las que se cree que la inflamación crónica a ser un factor significativo (por ejemplo, cáncer, aterosclerosis , trastornos autoinmunes) (Hedlund, Padler-Karavani et al. 2008; Varki 2009). NeuGc también puede promover enfermedades humanas, tales como el síndrome urémico hemolítico (SUH) . Una de las principales causas del síndrome urémico hemolítico es toxigénicas Shiga Escherichia coli (STEC) de infección. Una toxina Shiga citotoxina subtilasa altamente tóxico (SubAB) prefiere la unión a glicanos termina en NeuGc (Lolling, Patón et al. 2009). Esta información aumenta nuestra preocupación de que NeuGc también puede aumentar la susceptibilidad humana a algunos agentes infecciosos.

Por lo tanto, se desea aumentar el contenido de NeuAc (ácido siálico humano) en los alimentos, y reducir la proporción de NeuGc encuentra en la carne y los productos lácteos. Un método potencialmente eficaz de lograr esto es para aumentar la expresión GNE, y reducir o eliminar la expresión C AH en los sistemas biológicos o organismo utilizado como alimento humano o animal (por ejemplo leche, carne, diario, y otros productos a base de animales) . CMAH puede reducirse por cualquiera de las tecnologías genéticas o metabólicas, incluyendo, pero no limitado a, la modificación genética de los animales para producir animales para derribar CMAH, la reducción de la expresión de la enzima CMAH por las tecnologías de polinucleótidos (expresado como RNA inhibidor o antisentido oligonucleótido) , o la inhibición de la enzima CMAH por análogos de sustratos metabólicos. NeuGc también se puede reducir en los sistemas biológicos por la sobreexpresion de la enzima que convierte NeuGc a NeuAc.

Con pocas excepciones, las plantas no suelen producir ácido siálico. GNE y otras enzimas de la ruta de ácido siálico se pueden utilizar en los cultivos de plantas, vegetales, frutas y para incrementar el ácido siálico en los alimentos.

Las modificaciones, adiciones y/o la eliminación de elementos de polinucleótidos (por ejemplo, promotores, potenciadores, elementos de repetición) se pueden utilizar para mejorar la expresión en diversos tejidos/órganos o etapas de desarrollo, que se pueden desear en diversos campos de la biotecnología, incluyendo, pero no limitado a, farmacológico, alimentos, y las industrias de cosméticos.

Debido a que el músculo esquelético es un tejido importante que es fácilmente accesible y que es altamente vascularizado, que podría ser utilizado como una fábrica para producir proteínas con valores terapéuticos (revisado en (Lu, Bou-Gharios et al. 2003; Ratanamart y Shaw 2006)). De hecho, se ha demostrado que las proteínas terapéuticas funcionales pueden ser sintetizados por el músculo esquelético y secretados en la circulación de la sangre en cantidad suficiente para mitigar la patología asociada con trastornos tales como la hemofilia, la enfermedad de Pompe, enfermedad de Fabry, la anemia, el enfisema y la hipercolesterolemia familiar. La capacidad para expresar proteínas recombinantes en el músculo esquelético es también una cuestión importante para el tratamiento de los trastornos neuromusculares como la de Duchenne y la distrofia muscular de cinturas. Estos trastornos son causados por mutaciones de un gen que produce una proteína muscular. Un tratamiento potencial esencial para tales trastornos es la transferencia de genes, cuyo objetivo es introducir en el músculo normal y una copia funcional del gen que está mutado.

Por lo tanto, en un aspecto, los métodos descritos en el presente son para utilizar músculo como fábrica de proteínas para sobre-producir y secretar ácido siálico. En algunas modalidades, los métodos descritos en el presente resultado en un aumento de la biosintesis de Neu5Ac en el plasma, y la reducción de la concentración de Neu5Gc a partir de células.

Descripción Y Mejora del Producto Terapéutico En algunas modalidades, el producto terapéutico es un polinucleótido, mientras que en otras modalidades, el producto terapéutico es un polipéptido. En algunas modalidades, el polinucleótido es una molécula de ADN, que puede comprender la región codificante de longitud completa de una proteina, la región codificante para un dominio de una proteina, o una región codificante para un fragmento de proteina, que es más corto que un reconocido y identificado dominio de una proteina. Por lo tanto, los polinucleótidos descritos en el presente pueden variar de oligómeros de al menos 15 pares de bases de longitud a la molécula de ADN que comprende la región codificante de longitud completa de una proteina.

En algunas modalidades, el polipéptido es una proteina de longitud completa, por ejemplo, una enzima o un receptor, mientras. que en otras modalidades, el polipéptido es un fragmento de proteína. En algunas modalidades, el fragmento de la proteina corresponde a un dominio de una proteína de longitud completa reconocida e identificada, mientras que en otras modalidades, el polipéptido es más corto que un dominio de una proteína reconocida e identificada. Por lo tanto, los polipéptidos descritos en el presente pueden variar de oligómeros de al menos 5 aminoácidos de longitud ' a las proteínas de longitud completa. En algunas modalidades, el fragmento de la proteína es un fragmento de proteína terapéuticamente activa. Por "fragmento de proteína terapéuticamente activa" se entiende que el fragmento de proteína en condiciones fisiológicas tiene la misma actividad bioquímica (por ejemplo, cataliza la misma reacción) como la proteína GNE de tipo salvaje, a pesar de que puede realizar la función a un ritmo diferente.

En algunas modalidades, el polinucleótido es una molécula de ADN lineal mientras que en otras modalidades, el polinucleótido es una molécula de ADN circular.

En algunas modalidades, el polinucleótido es un ADN circular (plásmido, miniplasmid, o minicírculo) capaz de expresar el gen GNE en el sistema biológico deseado. El vector NTC8685 descrito en esta solicitud tiene pocos beneficios, que incluyen tamaño reducido, reducido contenido de la secuencia bacteriana, y la selección libre de antibióticos. Otros vectores conocidos por los técnicos en la técnica también se pueden utilizar con los métodos descritos en el presente.

En algunas modalidades, el polinucleótido de productos terapéuticos, ya sea lineal o circular, se administra como ADN desnudo, en combinación con otras moléculas para producir diversos catiónico o. partículas aniónicas, o co-administrarse con otros agentes farmacológicos (por ejemplo, excipientes, vasodialaters, analgésicos, etc.) para maximizar la eficacia de la terapia y minimizar el malestar del paciente. En lugar de un polinucleótido, otros productos farmacológicos se pueden administrar mediante el método de suministro establecido.

A diferencia de los estudios in vitro, donde el potencial neto positivo zeta es una entrada celular más eficiente de un polineuleotide, en la transducción in vivo de músculo esquelético parece ser más eficiente el uso de un polinucleótido que tiene una carga negativa neta (PCT O/2004/062368) .

En una modalidad, promotores específicos de músculo se puede usar para reducir la posibilidad de la respuesta inmune del huésped contra el transgen y mejorar la duración de la expresión del transgen intramuscular. Los elementos esqueleto del plásmido pueden ser alterados para permitir la expresión específica del músculo. La capacidad para lograr la expresión de proteina recombinante de alto nivel y a largo plazo después de la transferencia de genes en el músculo esquelético se desea en muchos estados de enfermedad. Esto se puede lograr usando promotores y potenciadores específicos de músculo.

Varias diferentes promotores específicos de músculo se han descrito hasta la fecha. La creatina quinasa promotor muscular (MCK) y versiones truncadas son los promotores específicos de músculos más utilizados (Hauser, Robinson et al., 2000; Yuasa, Sakamoto et al., 2002; Sun, Zhang et al. 2005; Sebestyen, Hegge et al. 2007, Wang, Li et al. 2008). El sintético C5-12 promotor y promotores similares muestran promesa de ser específico del músculo durante la conducción elevada expresión de transgenes (Li, Eastman et al. 1999). Este C5-12 promotor impulsa los niveles de expresión similares a los promotores ubicuos CMV en los vectores AAV (Gonin, Arandel et al. 2005) . El C5-12 puede ser mejorada aún más mediante la adición de la MCK potenciador (promotor de E-Syn) (Wang, Li et al. 2008) . El potenciador de cadena pesada híbrido -miosina/promotor potenciador MCK híbrido OT-miosina de cadena pesada potenciador-/potenciador MCK potenciador-promotor (MHCK7) también se utilizó para alta expresión en los músculos (Salva, Himeda et al. 2007). El promotor de desmina también es descrito recientemente como un promotor de los músculos específicos de capacidad o la conducción de alto nivel de expresión en las células musculares (Pacak, Sakai et al. 2008; Talbot, addington et al. 2010) . Los elementos potenciadores aguas arriba (USAR, USEx3 / AUSEx3) de los genes, como el gen de la troponina también es un candidato prometedor para el desarrollo de promotores específicos de músculo ( O 2008124934 20081023; Blain, Zeng et al. 2010.) .

Como se describe en el presente, las secuencias de Codificación GNE, y/o los vehículos de suministro asociados utilizados con el mismo, pueden ser dirigidos hacia tipos celulares específicos, por ejemplo, células musculares, tejido muscular, y similares. Por ejemplo, el promotor asociado con la secuencia de codificación GNE se puede hacer para expresar GNE sólo en tejidos específicos o etapas de desarrollo. Alternativamente, el cásete de expresión puede ser empaquetado con otras moléculas, compuestos, o restos biológicos (por ejemplo, proteína/carbohidratos/lípidos que contienen moléculas, parte o moléculas de anticuerpo completas, parte o moléculas de citoquinas enteros, cápsides virales) para generar una mezcla biológica o biológica específica partículas diseñados para unirse a y entrar en tipos de células específicos. Esta unión o afinidad pueden facilitar la captación del ADN en la célula. Para el suministro en el músculo, en particular, partículas aniónico, no liposomal, que contiene ADN son bien adaptado. Sin embargo, catiónico (liposomal), asi como otro ADN que contiene mezclas biológicas o partículas también son adecuados para la absorción en el músculo miopático con la pared de la célula comprometida. En algunas modalidades, estas proteínas, hidratos de carbono, y/o moléculas que contienen LIPD restos de direccionamiento son, pero no se limitan a, microbiano, vegetal, microbiano, o de compuestos sintéticos (por ejemplo, anticuerpos, citoquinas, lectinas, otras moléculas grandes o pequeñas) .

En algunas modalidades, los productos de polinucleótidos descritos en la presente invención comprenden los siguientes elementos: 1) elementos de control bacterianas, que son activos en las bacterias para el propósito de la selección y el proceso de crecimiento, 2) elementos de control eucariotas, que son activos en células eucarióticas o de mamíferos para el propósito de la expresión de un producto terapéutico gen o la proteína recombinante, y 3) la región de codificación GNE, que es el producto del gen terapéutico o gen recombinante. En algunas modalidades, el marcador de selección procariótica/bacteriana se basa en la resistencia a los antibióticos (por ejemplo resistencia a la kanamicina, como está presente en el vector UMVC3, la fig. 3), o basado en el ARN (por ejemplo, ARN-OUT, presente en el vector, Fig. 1 NTC8685) . En otras modalidades, otros elementos se utilizan para la producción de plásmido eficiente (por ejemplo, origen pUC representado en tanto UMVC3, figura 3, y NTC8684, figura 1) La secuencia de nucleótidos del vector de NTC8685-GNE se expone en la figura 2 y en la SEQ ID NO: 1, mientras que la secuencia de nucleótidos del vector de UMVC3-GNE se expone en la figura 4. En modalidades adicionales, el promotor eucariota, potenciadores, intrones u otros elementos se utilizan para la transcripción y traducción eficaces de la proteina terapéutica codificada por el gen GNE.

Para minimizar la posible propagación de la resistencia a los antibióticos, marcador de selección procariotas que no se basa en la resistencia a los antibióticos es el preferido por los organismos reguladores, como la Organización Mundial de la Salud (OMS) , Administración de Alimentos y Medicamentos de E.U. (AAM) o la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos (AEEM) (Williams, Carnes et al. 2009) .

Fundamentos del uso de ADN plásmido: El uso clínico de ADN desnudo o plásmido (pADN) para expresar genes terapéuticos es un enfoque prometedor para tratar la enfermedad muscular causada por IBM2. ADN desnudo como vehículo de la terapia génica tiene un excelente historial de seguridad y la administración repetida en el mismo sujeto puede alcanzar mayores niveles de expresión. (Hagstrom, Hegge et al. 2004; Wolff, Lewis et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005; Herweijer y Wolff 2007, Braun 2008; Duan 2008; Zhang, Wooddell et al. 2009) Según el método de suministro, pADN suministrado al músculo esquelético de roedores o primates se retiene en miofibras y expresa el producto génico codificado por muchos meses (Danko, Fritz et al. 1993; Danko, Williams et al. 1997; Sebestyen, Hegge et al. 2007) . A diferencia de virus adeno-asociado (AAV) y otros vectores virales que pueden inducir la inmunidad celular o humoral (Yuasa, Yoshimura et al. 2007; Mingozzi, Meulenberg et al. 2009), pADN no suele provocar una respuesta inmune contra el vector (Hagstrom, Hegge et al. 2004; Romero, Braun et al. 2004; Glover, Lipps et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005), que hace que sea posible repetir las administraciones en el mismo sujeto. Además, en comparación con vectores virales o basado en, pADN es relativamente barato de producir en grandes cantidades y se mantiene estable durante muchos meses (Walther, Stein et al. 2003; Urthaler, Ascher et al. 2007; Voss 2007) .

Método del Suministro. Descripción y Mejora del Método de Suministro En una modalidad de la infusión hidrodinámico, un torniquete externo se coloca en la extremidad de un ser humano o animal, y el producto terapéutico se administra usando un acceso intravenoso periférico usando un volumen específico (típicamente 30-50% de la extremidad volumen por debajo del torniquete) en una cantidad específica de tiempo de flujo o volumen (normalmente 1-3 ml/segundo) . Esto es muy similar a los procedimientos médicos usados comúnmente conocido como el "bloqueo de Bier", que se ha utilizado con seguridad y eficacia durante más de un siglo para reducir la exposición y la dosis de los compuestos farmacológicos. El bloqueo de Bier se ha usado para inducir la anestesia regional intravenosa (eliminando la necesidad de anestesia general) en la cirugía del brazo o de la mano (dos Reis 2008; Vlassakov y Bhavani 2010). El método similar se utiliza en oncología por el nombre de "infusión extremidad aislado" para la administración de compuestos quimioterapéuticos a un miembro específico, lo que permite la reducción de la dosis y la exposición a los órganos internos (Corona y Thompson 2009) . La colocación de un torniquete en las extremidades también se ha utilizado con eficacia durante muchos siglos para reducir el sangrado después de un traumatismo grave, o para reducir la exposición de los órganos internos a las toxinas después de la exposición (por ejemplo, serpientes venenosas y picaduras de otros animales) .

Cuando se administra la terapia génica o biologías utilizando el mismo o muy similar de suministro, el método de suministro se describe en la literatura médica por varios nombres, incluyendo "hidrodinámica", "transvenular" , "intravenoso", "transvascular", "vascular", "retrógrado", "vena de la extremidad", "vena periférica", "intravenoso", "intravascular" , "retrógrado", "extravasación", "alta presión", "bajo presión", "miembro aislado", "aislamiento vascular", "oclusión vascular", "oclusión del flujo sanguíneo", o cualquier combinación de los mismos (Sb, Gopal et al. 2005; Sebestyen, Hegge et al. 2007; Vigen, Hegge et al. 2007; Zhang, Wooddell et al. 2009; Haurigot, . ingozzi et al. 2010; Hegge, Wooddell et al. 2010; Powers, Fan et al. 2010). Pese a las preocupaciones específicas, el síndrome post-flebitis o después del procedimiento angiopatía no se ha notado siguiente ejecución de los procedimientos de oclusión vascular siguientes canino (perro) estudios (Haurigot, Mingozzi et al. 2010).

En algunas modalidades, descrita en el presente, el método de suministro se ha mejorado. Las extremidades humanas y de animales de mismo volumen pueden estar compuestos de proporciones variables de los músculos y los tejidos no musculares (por ejemplo graso o de la cicatriz).

El músculo es a menudo más vascular y requiere un mayor flujo de sangre que los lipidos o de tejido de cicatriz. Por lo tanto, la administración de productos terapéuticos que utilizan un volumen especifico no puede conferir una óptima distribución del producto terapéutico en las extremidades de los sujetos. Las ramas con mayor músculo/te ido no muscular pueden requerir volúmenes de infusión más altas para lograr mismo beneficio terapéutico. El control de la perfusión en función del intravascular (o linea de infusión) la presión y la duración de la infusión puede transmitir una mejor distribución del producto terapéutico a la extremidad de destino. En consecuencia, las siguientes alteraciones de mejorar el método descrito este método de suministro: 1) Colocar el torniquete de presión especifica más o menos 2 - 4 x la presión sistólica (por ejemplo, 320 mm Hg para un paciente humano) . 2) Rápido aumento del flujo para lograr una presión intravascular especifica (o linea de infusión) típicamente por debajo de la presión del torniquete (por ejemplo, si la presión del torniquete se mantiene a 320mmHg, la presión de la línea de infusión mantiene 280-300 mmHg) 3) El mantenimiento de la presión de la línea de infusión mediante el control de velocidad de flujo de infusión . 4) El mantenimiento de la presión de la linea de infusión durante un periodo especifico de tiempo (15 minutos) . 5) El uso de un dispositivo diseñado específicamente para lograr de forma segura parámetros descritos anteriormente en 1 y 2. Tal dispositivo puede controlar de forma automática la velocidad de flujo y la presión de la línea de infusión en base a la presión del torniquete de conjunto. Por seguridad, tal dispositivo detendría automáticamente la infusión (velocidad de flujo de cero ml/seg) después de la detección de parámetros tales como la caída repentina en la presión de la línea de infusión, la burbuja de aire dentro de la línea de infusión, o el nivel de fluido dentro del recipiente que contiene el fluido a infundir.

Mediante la selección del sitio de administración vascular distal o proximal al sitio de la oclusión vascular, uno puede exponer o proteger a los órganos objeto, tejidos, o el área del cuerpo.

Fundamentos del uso del método de suministro HLV: Aunque comúnmente utilizado para los ensayos de vacunación con ADN, pADN suministrado por el enfoque intramuscular (IM) es ineficaz para las enfermedades musculares exigentes suministro de producto terapéutico a toda una extremidad o de todo el cuerpo (Jiao, Williams y col. 1992) . El plásmido intravenoso (IV) se elimina rápidamente por el hígado (Liu, Shollenberger et al. 2007). Sin embargo, se combina con la vena extremidad hidrodinámico (HLV) de suministro, pADN administrada IV eficaz y uniforme puede transfectar músculo esquelético de un miembro entero en animales pequeños y grandes, incluyendo los primates no-humanos (Hagstrom, Hegge et al. 2004), que resulta en daños microvasculatura reversible (Toumi, Hegge et al. 2006; Vigen, Hegge et al. 2007) . Una sola dosis puede resultar en la expresión génica a largo plazo, y la facilidad de la administración repetida hace HLV adecuado para el suministro de transgenes GNE a las extremidades de los pacientes IBM2. El uso de un torniquete, el flujo sanguíneo en un brazo o una pierna ocluida temporalmente, y una solución de ADN del plásmido se inyecta rápidamente por vía intravenosa. Esto eleva la presión dentro de la región ocluida, que conduce a la migración notablemente eficiente del vehículo gen en las miofibrillas adyacentes. El flujo de sangre se restablece a la normalidad en 10-20 minutos, sin afectar irreversible o persistentemente. Los enfoques similares intravenosos de alta presión están siendo adoptados y adaptados para el suministro de ADN, y, posiblemente, otras moléculas terapéuticas potenciales, a varios órganos. (Al-Dosari, Knapp et al. 2005; Arruda, Stedman et al. 2005; Wolff, Lewis et al. 2005; Herweijer y Wolff, 2007; Toromanoff, Cherel et al. 2008) .

IBM2/MDVL es un trastorno huérfano ideal para ser tratado por la administración de genes pADN usando HLV por las siguientes razones: La expresión baja GNE puede ser terapéutica: gen GNE es relativamente pequeño (tamaño de CADN de 2169 pb, que codifica para 722 aminoácidos) , que funciona como una enzima de proteina que se expresa en niveles bajos en el músculo esquelético. La expresión de cantidades bajas de cantidades de tipo salvaje, o muy bajos de forma sialuria de GNE, puede resultar muy eficaz e incluso curativo. Además, es posible utilizar la forma hipermórfica (Sialuria) del gen GNE lo que permite muy bajas expresiones del gen GNE para traducir a beneficio terapéutico significativo. Esto está en marcado contraste con otras enfermedades musculares tales como la de Duchenne o Becker distrofias musculares donde (o truncada mini-dystrohpin) se necesitan cantidades relativamente grandes de la distrofina para realizar el beneficio terapéutico.

El tratamiento de las extremidades solo puede ser una terapia suficiente: IB 2 afecta principalmente los músculos de los brazos y las piernas. Los músculos del tronco están afectados clínicamente más tarde en curso de la enfermedad. Los órganos vitales, incluyendo el corazón y los pulmones, no están afectados clínicamente en la gran mayoría de los pacientes. Al ahorrar brazo y función de la pierna, podemos mejorar significativamente la calidad de vida y retrasar la pérdida de la independencia.

La respuesta inmune del huésped para el transgen es poco probable: Más del 99% de los pacientes conocidos expresar proteína GNE que difiere de la de tipo salvaje por un aminoácido (mutación sin sentido) . Además, GNE está conservado evolutivamente con un 98% de homología entre los ratones y los hombres en el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, la probabilidad de respuesta inmune del huésped o la producción de anticuerpos neutralizantes contra el transgen es GNE mínimo. El acoplamiento GNE con un promotor específico de los músculos, como la creatina quinasa (CK) reduce aún más la probabilidad de respuesta de anticuerpos del huésped (Fabre, Bigey et al. 2006).

El potencial para el espectador beneficios o efectos distantes: A diferencia de distrofinopatías, donde la expresión de distrofina (proteína estructural grande) dentro de un miofibras parece beneficiar sólo el sitio de la inyección, en IBM2 es probable que Neu5Ac (molécula pequeña, 9 azúcar de carbono) no permanecerá dentro de una región limitada de la miofibras. Neu5Ac producido por una miofibra pueden beneficiarse miofibrillas vecinas y ManNAc o Neu5Ac en suero puede beneficiar a las fibras musculares establecidas al suero. Los siguientes datos apoyan esta hipótesis: (a) los modelos de ratón deficiente Sia pueden utilizar Neu5Ac presentes en el suero (Malicdan, Noguchi et al. 2009) (b) las células hiposialilatadas se hicieron sialilatadas después de su medio de cultivo fueron suplementadas con ManNAc (Schwarzkopf , Knobeloch et. al, 2002) y (c) la adición de 5 m de ManNAc o Neu5Ac, pero no GlcNAc, a los medios restauraron el contenido de ácido siálico de los fibroblastos primarios o MDVL miotubos 60-75% de control a los niveles normales (Noguchi, Keira et. al 2004) . El efecto espectador, y la posibilidad de un efecto distante, se observó en un ensayo único paciente reciente (Nemunaitis, Maples et al. 2010). El paciente recibió una inyección intramuscular GNE-lipoplex del antebrazo (Extensor radial largo del carpo, ECRL) . Se observó un aumento transitorio en la fuerza, la expresión recombinante GNE (rGNE) , y el aumento de ácido siálico superficie celular en el sitio de inyección y músculos del compartimiento adyacente. La posibilidad de efecto lejano también se propuso tras la sorprendente observación de que los grupos musculares distantes (trapecio y cuádriceps) mejoraron de forma transitoria en correlación con la expresión del transgen izquierda ECRL rGNE y el aumento de sialilación (Nemunaitis , Maples et al. 2010).

Seguridad/ oxicologia .

Con base en la información disponible, se espera que el plásmido GNE sea un vector muy seguro para su uso en pacientes IBM2. Generalmente, el ADN desnudo como vehículo de la terapia génica tiene un excelente historial de seguridad y la administración repetida en el mismo sujeto puede alcanzar mayores niveles de expresión. (Hagstrom, Hegge et al. 2004; Wolff, Lewis et al. 2005; Wolff, Budker et al. 2005; Herweijer y Wolff 2007, Braun 2008; Duan 2008; Zhang, Wooddell et al. 2009).

La seguridad de la GNE plásmido: estudios de toxicologia en roedores con GNE-plásmido están actualmente en curso. Los datos preliminares sugieren plásmido desnudo resultarán mucho más seguro que GNE-lipoplex que ya ha sido administrada a un paciente humano (Phadke, Jay et al. 2009; Nemunaitis, Maples et al. 2010). Hemos llevado a cabo un reciente estudio de toxicologia pre-GLP de 14 días de duración en 12 ratones (cepa B6; hembra FBV mixta endogámica, 6 hombres y 6 de edad 4-10 meses). Ratones machos y hembras se dividieron por igual y al azar en grupos experimentales y de control. El grupo experimental recibió plásmido alta dosis GNE (0.6 mg suspendido en solución salina normal 0.1 mi) administra por vía IV cola, y el grupo de control sólo recibió 0.1 mi de solución salina normal. Los grupos fueron divididos en 3 grupos de frecuencia de dosis de 2 ratones (1 mujer, 1 hombre) cada uno de la siguiente manera: 1) todos los días de la administración desde hace 14 dias, 2) todos los demás días de la administración, y 3) una vez por semana. Todos los animales sobrevivieron al experimento. Se observó ningún cambio significativo entre el experimento y los grupos de control con respecto a todos los parámetros medidos, que 1 incluían peso corporal, la temperatura, la alimentación y la ingesta de agua, análisis de sangre (CBC realizado en antes de la dosis el día 1 y en la necropsia en el día 15) . No se observó ningún cambio significativo en la patología macroscópica entre el experimento y los grupos de control con respecto a 12 órganos, incluyendo el cerebro, pulmón, corazón, hígado, riñon, bazo, estómago, los intestinos, la vejiga, los genitales, los ganglios linfáticos, y el músculo. La dosis diaria equivalente humano (HED) fue de 120 mg, y el importe total máximo HED 14 días fue de 1440 mg .

La seguridad de la GNE-lipoplex : En comparación con el plásmido GNE desnudo, la forma GNE-lipoplex es más tóxica. Para producir el lipoplex, el vector de plásmido fue encapsulado en un liposoma catiónico compuesta de 1,2- dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) y colesterol (GNE-lipoplex) . El vector se inyectó en ratones BALB/c, y la ingle por via intravenosa (IV) de infusión de GNE-lipoplex fue letal en el 33% de los animales en 100 g (0.1 mg) de dosis, con una pequeña proporción de los animales en la cohorte de 40 g demostrando transitoria toxicidad (Phadke, Jay et al. 2009). Basado en un póster presentado en la Conferencia de 2010 ASGCT (Phadke, Jay et al. 2010), la dosis máxima tolerada para la administración de inyecciones múltiples de GNE-lipoplex en ratones Balb/c era (1) 20 g por inyección (dosis equivalente humana (HED) = 5.2 mg) , o (2) una dosis acumulativa de 80 g (HED = 20.8 mg) . En el ensayo de escalada de dosis en curso, el paciente ha recibido varias infusiones (0.4, 0.4, 1.0 mg) de 1-3 meses de diferencia, y transitorios de grado 1, 2 taquicardia y fiebre fueron observados dentro de las 12 horas de cada infusión. Las pruebas de función hepática del paciente también se informaron como transitoriamente elevada, pero el número exacto no se informaron en el resumen (Nemunaitis, Jay et al. 2010).

Seguridad del método de administración de la Vena de la Extremidad Hidrodinámica (HLV) : El efecto secundario potencial de la forma de suministro hidrodinámica se ha estudiado en primates no humanos en la doble presión del torniquete propuestos para el estudio actual. El procedimiento se determinó que era seguro, sin efectos secundarios irreversibles o de larga duración (Vigen, Hegge et al. 2007; Hegge, Wooddell et al. 2010). Su procedimiento es similar al bloqueo de Bier utilizado para la anestesia regional y la homeostasis quirúrgica que se ha utilizado con seguridad y eficacia durante más de un siglo. La principal diferencia es que la hemorragia es innecesaria y la duración del procedimiento es típicamente 15 minutos en HLV (Hegge, Wooddell et al. 2010). Los estudios histológicos en los primates no humanos han demostrado que el procedimiento HLV produjo edema muscular transitoria, pero sin daño muscular significativa (Hagstrom, Hegge et al. 2004; Toumi, Hegge et al. 2006) . Las imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 en primates no humanos también mostraron que el procedimiento produjo edema muscular transitorio, pero no hubo alteración muscular persistente tal como un síndrome compartimental (Vigen, Hegge et al. 2007). La angiografía por resonancia magnética en primates no humanos reveló efectos vasculares consistentes con un efecto transitorio de la permeabilidad capilar, pero sin anormalidades a largo plazo de interés (Vigen et al., 2007). Estos estudios iniciales se realizaron con mucho más altas presiones de torniquete (700 mmHg) que estamos proponiendo (310 mmHg) . Además, se utilizó el volumen de inyección de 45-50% del volumen de la extremidad en estos estudios, y que se propone un volumen de inyección/extremidad del 35%. Creemos que el plásmido introduzca fibras miopáticos más eficazmente que muscular normal debido a la reducción de la integridad de las paredes de las células musculares, lo que justifica por lo tanto las presiones reducidas y volúmenes de inyección. El uso de estas presiones similares, un estudio de escalada de volumen en pacientes adultos que sufren de distrofia muscular está en marcha en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill (Powers, Fan et al. 2010) .

En resumen, el método de suministro HLV con pADN se considera una tecnología madura que ha demostrado ser eficaz y segura en primates no humanos, y está listo para ser probado en ensayos terapéuticos clínicos (Wells 2004, Al-Dosari, Knapp et al. 2005; Herweijer y Wolff 2007) . La principal desventaja de este enfoque es la incapacidad de transfectar fácilmente músculos del diafragma, el corazón, y el tronco/cuello sin métodos invasivos para sujetar temporalmente los principales vasos internos (por ejemplo, cirugía, laparoscópica, o transcutánea de globo de oclusión) . A pesar de este inconveniente es importante para muchas distrofias musculares, que no es tan importante en los pacientes afectados por IBM2. Muchos pacientes IBM2 viven en sus últimos años, su corazón y sus pulmones no se han notificado a ser clínicamente afectados, los músculos del tronco/del cuello parecen seguir siendo fuerte hasta altas horas de curso de la enfermedad, y existe un potencial significativo de espectador o el efecto lejano. Por lo tanto, el suministro HLV de pADN para el suministro de transgenes GNE a las extremidades músculos esqueléticos es una opción terapéutica atractiva para IBM2 que pueden retrasar la pérdida de autonomía física, y ofrecer una esperanza importante para muchas IBM2 pacientes.

Las secuencias Codificación GNE y composiciones relacionadas pueden contener vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables, adyuvantes o vehículos. En algunos casos, el pH de la formulación puede ser ajustado con ácidos farmacéuticamente aceptables, bases o tampones para mejorar la estabilidad de la composición formulada o su forma de suministro. Por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución inyectable estéril, suspensión o emulsión en un diluyente no tóxico parenteralmente aceptable o disolvente. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer, USP y solución de cloruro sódico isotónica. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo suave puede ser empleado, incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables .

De acuerdo con ciertas modalidades, un portador de plasma-Lyte® se puede emplear y utilizar para suministrar una secuencia Codificación GNE, en particular para la inyección parenteral. (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, Illinois). Plasma-Lyte® es una solución isotónica estéril, no pirogénica que puede utilizarse para la administración intravenosa. Cada volumen de 100 mi contiene 526 mg de cloruro de sodio, USP (NaCl); 502 mg de gluconato de sodio (C6H1/ lNa07) ; 368 mg de trihidrato de acetato de sodio, USP (C2H3Na02 ?20) ; 37 mg de cloruro de potasio, USP (KC1), y 30 mg de cloruro de magnesio, USP (MgC12 »6H20) . No contiene agentes antimicrobianos. El pH se ajusta preferiblemente con hidróxido de sodio a alrededor de 7.4 (6.5 a 8.0).

Las formulaciones inyectables utilizadas para suministrar secuencias de codificación GNE pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles, que pueden disolverse o dispersarse en estéril agua, Plasma-Lyte® u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Con el fin de prolongar la expresión de una secuencia de codificación GNE dentro de un sistema (o para prolongar el efecto de la misma) , puede ser deseable ralentizar la absorción de la composición a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión liquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción de la composición puede a continuación, depender de su velocidad de disolución, la cual, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina.

Alternativamente, la absorción retardada de una secuencia de codificación GNE administrado por vía parenteral puede llevarse a cabo por disolución o suspensión de la composición en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se pueden preparar mediante la formación de matrices microencapsuladas de la secuencia de codificación de GNE en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida . Dependiendo de la proporción de Secuencia que codifica GNE de material a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación Secuencia que codifica GNE puede ser controlado. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres ) y poli (anhídridos) . Como se describió anteriormente, las formulaciones de depósito inyectables también se pueden preparar mediante el atrapamiento la secuencia de codificación GNE en liposomas (o incluso de microemulsiones ) que son compatibles con los tejidos del cuerpo objetivo, tales como el tejido muscular.

Además de los métodos para la modulación de la producción de ácido siálico en un sistema, la presente invención abarca además métodos para producir de tipo salvaje GNE en un sistema. De1 acuerdo con tales modalidades, el sistema (por ejemplo, las células musculares de un paciente humano) puede comprender una secuencia de GNE-endógeno que codifica mutado (por ejemplo, la secuencia de GNE- 712T) . En otras palabras, la presente invención incluye proporcionar, por ejemplo, una célula o tejido muscular que alberga un (defectuoso) Secuencia que codifica GNE mutada con una secuencia que codifica GNE de tipo salvaje funcional. La secuencia de codificación GNE de tipo salvaje puede ser suministrado a un sistema de este tipo utilizando, por ejemplo, los liposomas o nanopartículas lipídicas descritas en el presente, a través de inyección parenteral.

De acuerdo con modalidades relacionadas adicionales de la presente invención, los métodos para tratar, prevenir, y/o mejorar los efectos de la inclusión La miopatia hereditaria del cuerpo (HIBM2) se proporcionan. Tales métodos comprenden generalmente proporcionar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico que codifica GNE-de tipo salvaje. En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica GNE de tipo salvaje puede, preferiblemente, ser suministrado a un paciente en relación con una nanoparticula de lipidos y un vehículo similar a la de Plasma-Lyte®, a través de inyección parenteral.

La frase "cantidad terapéuticamenté eficaz" de una secuencia de ácido nucleico de codificación GNE de tipo salvaje se refiere a una cantidad suficiente de la secuencia para expresar niveles suficientes de GNE de tipo salvaje, en una relación beneficio-riesgo razonable, a aumentar la producción de ácido siálico en las células objeto y/o para tratar de otra manera, prevenir, y/o mejorar los efectos de HIBM2 en un paciente. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de la secuencia de ácido nucleico de codificación GNE de tipo salvaje y composiciones relacionados de la presente invención será decidido por el médico encargado, dentro del alcance del juicio médico razonable.

Una de las ventajas de los métodos descritos en el presente es que, debido a que los polinucleótidos se administran a la extremidad afectada directamente, en oposición a una administración sistémica, la cantidad terapéuticamente eficaz que se administra es menor que en los métodos descritos anteriormente. Por lo tanto, los presentes métodos de reducir o eliminar muchos de los efectos secundarios que están asociados con los métodos descritos anteriormente.

El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores, incluyendo la gravedad del trastorno HIBM2 de un paciente; la actividad de la secuencia de codificación GNE específica empleada; el vehículo de administración empleado, la edad, el cuerpo peso, salud general, sexo y dieta del paciente, el tiempo de administración, vía de administración, y velocidad de excreción de la secuencia de codificación GNE específica empleada, la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o simultáneamente con la GNE específica -secuencia de codificación empleado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Tras la mejora de la condición de un paciente, una dosis de mantenimiento de una secuencia de codificación GNE puede administrarse, si es necesario. Posteriormente, la dosis o frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, a un nivel en el que se retiene el estado mejorado cuando los síntomas se han aliviado hasta el nivel deseado.

De acuerdo con todavía otras modalidades de la invención, se proporcionan nuevas composiciones para la expresión de tipo salvaje GNE en un sistema. Las composiciones incluyen preferiblemente una secuencia de ácido nucleico de codificación GNE de tipo salvaje. Como se describe en el presente, la secuencia de ácido nucleico que codifica GNE puede comprender diversos elementos de control de transcripción, tales como un promotor, secuencia de terminación, y otros. Un ejemplo no limitante de una composición abarcada por la presente invención incluye el vector de expresión pUMVC3-GNE se describe en el presente, mostrado en la figura 3. Así como se ha descrito en relación con otras modalidades de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de codificación GNE puede estar dispuesta o conectada a un vehículo apropiado para el suministro a un sistema, tal como un liposoma o nanopartículas de lípidos. Aún más, de acuerdo con tales modalidades, el vehículo de suministro puede, opcionalmente, ser decorado con agentes que son capaces de reconocer y unirse a las células o tejidos objeto, tales como células de músculo o tejido muscular.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Expresión de GNE exógeno en células CHO-Lec3.

En el siguiente ejemplo, se crearon varios vectores de expresión GNE de cADN humano. Tres formas diferentes, GNE de tipo salvaje, M712T y R266Q, fueron fuertemente expresados en las células deficientes GNE (células Lec3). Todas las enzimas demostraron los niveles de expresión de proteínas similares, aunque las actividades enzimáticas distintas. A continuación, las líneas celulares que expresan GNE transfectado produjeron ácido siálico significativamente más que las células no transíectadas .

Metodología .

Primer procedimiento : Clonación GNE. Los vectores parentales que contienen el cADN GNE fueron proporcionados por Daniel Darvish ( CIH Grupo de Investigación, Encino, CA) y se incluyen pGNE-NB8 (tipo salvaje), pGNE-MB 18 (M712T mutante) y pGNE-R266Q (R266Q mutante) . El vector de destino, pUMVC3, fue adquirido de Aldevron (Fargo, Dakota del Norte) . El vector de subclonación, Unidad (Qiagen, Valencia, CA) 1 se utiliza para el servicio de transporte mutante R266Q del vector parental para el vector de destino .

Los insertos GNE cADN (tipo salvaje y M712T) fueron producidos por la transcripción inversa del ARN aislado de la sangre total del paciente. La isoforma R266Q se produjo usando técnicas de PCR estándar de mutagénesis utilizando cebadores diseñados específicamente. cADN se amplificó a continuación usando cebadores diseñados específicamente que llevan EcoRI y colas '5 de reconocimiento BamHI, y posteriormente se subclonó en el vector de expresión pUMVC3 (Aldevron) por ligación T4 ( Invitrogen) . Las células de E. coli competentes (Invitrogen) se transformaron con el vector de expresión pUMVC3.

Los clones positivos pUMVC3-GNE se cultivaron durante la noche en 175 MIS caldo LB + 50 g/ml Kan y de cultivo de 150 MIS se utilizó para un equipo Plasmid Maxi de Qiagen (Valencia, CA) HiSpeed de acuerdo con los protocolos del fabricante.

El complejo lípido ADN. El complejo ADN: lípido utilizado en este ejemplo fue producido por la mezcla, a temperatura ambiente, 1, 2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) con el ADN de prueba (pUMVC3-GNE) . DOTAP es una partícula lipídica disponible en el mercado que se ofrece por Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama) . El DOTAP se mezcló con el ADN pUMVC3-GNE de una manera para lograr el volumen total deseado, que exhibió una relación final de 0.5 mg de ADN: 4 mM de DOTAP 1 en un volumen final de 1 µ? .

Cultivo Celular. Células CHO-Lec3 GNE deficientes fueron proporcionados por El Colegio de Medicina Albert Einstein. Las células se cultivaron a 37°C en 5% CO2 en a-MEM medios suministrados con 4 mM de L-glutamina y 10% inactivado por calor de suero bovino, fetal. Las células para las transfecciones transitorias se sembraron a 1x106 células por pocilio en placas de 6 pocilios y se cultivaron durante la noche. Las células Lec3 fueron destetadas a las condiciones séricos reducidos al reducir el FBS en un 2.5% al pasaje.

Las transfecciones transitorias. Las células Lec3 se transfectaron durante 6 horas con el complejo ADN: lipido por pocilio en OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad CA) , a continuación, se cambió el medio de crecimiento normal a-ME y las células se cultivaron durante la noche. ADN: lipidos complejos se formaron mediante la mezcla de 4 g de ADN + 10 µ? Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se recogieron por digestión con tripsina y se lavaron una vez con PBS antes de la transferencia de western posterior o enzima/ensayos de azúcar .

La cuantificación de ácido siálico. Aproximadamente 4x106 células se utilizaron para la cuantificación de la unida a la membrana de ácido siálico por el método del ácido tiobarbitúrico . Las células se resuspendieron en agua y se Usaron mediante el paso a través de una aguja de calibre 25 20 veces y se centrifugó. El sobrenadante se utilizó para la estimación de proteínas de Bradford y el sedimento restante se resuspendió en 100 µ? 2M de ácido acético y se incubó durante 1 hora a 800°C para liberar los ácidos siálicos glicoconjugado-enlazados . 137 µ? de solución de ácido periódico (2.5 mg/ml en 57 mM de H2 S04 se añadieron) y se incubó durante 15 minutos a 37 °C. A continuación, 50 µ? de solución de arsenito de sodio (25 mg / mi en HC1 0.5 M) fueron añadidos y los tubos se agitaron vigorosamente para asegurar la eliminación completa del color amarillo-marrón. Después de esta etapa, se añadieron 100 µ? de solución de ácido 2-tiobarbitúrico (71 mg/ml ajustado a H 9.0 con NaOH) y las muestras se calentaron a 100°C durante 7.5 minutos. La solución se extrajo con 1 mi de butanol/5 12M HC1 y las fases se separaron por centrifugación. La absorbancia de la fase orgánica se midió a 549 nm. La cantidad de ácido siálico se midió como nmol de ácido siálico/mg de proteína.

Segundo Procedimiento: El procedimiento siguiente es un procedimiento alternativo al descrito anteriormente.

El cultivo celular y de prueba del ensayo biológico: células Lec3 CHO (Hong 2003) obtenidas a partir de la Dra. Pamela Stanley (Colegio de Medicina Albert Einstein) se cultivaron inicialmente en medios a-MEM que contiene suero fetal bovino 10% (FBS) ( Invitrogen) , recibido pasajes posteriores de medio FBS al A-MEM por 2.5% disminuye hasta 0% de FBS, y se trataron con tripsina antes de la transfección . Cuatro conjuntos de transfecciones se prepararon por triplicado utilizando 2.0x106 células CHO, 2.5 mi de los medios Freestyle (Invitrogen), 500 µ? de a-MEM (Invitrogen), 10 µ? de Lipofectamina (Invitrogen) y 4iq de ADN (excepto para el vector de ningún establecido) y se incubaron a 37°C en el 5% CO2 - Los conjuntos preparados incluyeron vector pUMVC3GNE tipo salvaje, GNE M712T pUMVC3 vector, GNE R266Q pUMVC3 vector, vector vacio, y no hay ningún soporte de vectores. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en tampón de lisis. El contenido de ácido siálico se detectó utilizando una versión modificada del método de Leonard Warren (Warren 1959) y se mide con NanoDrop-1000 espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific) a 549 nm utilizando el módulo de UBV-Vis. Una curva estándar fue creada con concentraciones conocidas de ácido siálico y denota una clara asociación lineal entre la absorbancia y la concentración de ácido siálico.

Resultados .

Clones GNE. Los clones de CADN GNE que se probaron incluyeron un humano de tipo salvaje cADN y dos CADN mutantes humanos. Los mutantes incluyen el clon deficiente GNE M712T y la sialuria clon R266Q. Sialuria es una enfermedad humana causada por mutaciones puntuales en el sitio de unión de CMP-ácido siálico de GNE, lo que lleva a una pérdida de la inhibición por retroalimentación y la producción en masa de los ácidos siálicos. GNE CADN se subclonaron a partir de sus vectores originales para el vector de expresión, pUMVC3, por digestión de restricción de clonación. Los clones se rastrearon mediante direccional digesto de enzima de restricción para confirmar el inserto GNE estaba en la orientación correcta. Los clones positivos fueron secuenciados en ambas orientaciones para confirmar que no hay mutaciones ocurrieron durante el proceso de clonación. Los cromatogramas resultantes se comparan con la secuencia de GNE de GenBank (n° de acceso NM_005467) y del tipo salvaje no mostraron ninguna mutación, mientras que los clones M712T y R266Q contenían sólo las mutaciones puntuales esperadas. Los clones positivos pUMVC3-GNE se ampliaron mediante un procedimiento de preparación de purificación de plásmidos maxi y secuenciados para confirmar que no se han producido mutaciones. Estas poblaciones de ADN se utilizaron para todos los experimentos posteriores.

Cuantificación WT-GNE ARNm. Células CH0-Lec3 fueron cultivadas en 10% de suero y se transfectaron transitoriamente con el ADN pUMVC3-GNE-en peso durante 24 horas para cuantificar la cantidad de ARN recombinante GNE que se expresó. ARN total fue extraído y RT-PCR cuantitativa se realizó para amplificar un fragmento de 230 pb de la transcripción GNE. Diluciones seriadas de pUMVC3-GNE-peso se utilizaron para determinar que la concentración de GNE-peso expresado en las células transfectadas Lec3 era igual a 4.1 pg/µ?. El rango dinámico de la qPCR fue de 5 ng - 5 fg y no había producto de ARNm GNE detectado en el control (sin transfectar) células CHO-Lec3 (el valor de Ct para las células no transfectadas fue mayor que 42 ciclos, lo cual es menos de 5 fg) . Por lo tanto, se ha detectado la expresión recombinante GNE mRNA en células transfectadas Lec3, mientras que las células no transfectadas tenían cantidades no detectables de mRNA GNE.

Ensayos de ácido siálico. Las células Lec3 transfectadas se ensayaron también para la superficie de la expresión de ácido siálico celular. Todas las muestras Lec3 tenían aproximadamente 6.0 membrana nmol/mg de ácido siálico unido, con la excepción de Lec3 células transfectadas con el GNE1 R266Q, que tenía una cantidad 1,5 veces más alta (Figura 7) . El R266Q GNE carece de la inhibición por retroalimentación de GNE y se sabe que causa una producción excesiva de ácidos siálicos intracelulares .

Células Lec3 parecen estar undersialylated, y esto sólo se pueden superar mediante la expresión del mutante sialuria y no por la sobreexpresión sobre 100 veces de tipo salvaje GNE comparación con las células CHO de tipo salvaje. No se observaron diferencias significativas entre el tipo salvaje (peso) y M712T GNE.

Comparación de plásmidos U VC3 y NTC8685 GNE: estudios de transfección que comparan la producción de ácido siálico de los dos vectores de una buena correlación entre sí (figuras 8 y 9) . Ligeramente mayor producción de ácido siálico se observó con NTC8685 vector. Se llevarán a cabo estudios adicionales in vitro que utilizan otros tipos de células y estudios in vivo.

Producción de ácido silícico mediante la provisión de ManNAc. El nivel de producción de ácido siálico se midió por complementar los medios de cultivo de células con N-acetilmanosamina (ManNAc) . Además de la provisión de ManNAc, todas las otras variables de cultivo de células fueron idénticas a los estudios de transfección (figura 10) .

Toxicidad de Plásmido de Altas Dosis Preliminares. Hemos llevado a cabo un reciente estudio de toxicología pre-GLP de 14 días de duración en 12 ratones (cepa B6; hembra FBV mixta endogámica, 6 hombres y 6 de edad 4-10 meses) . Los ratones machos y hembras se dividieron por igual y al azar en grupos de experimento y de control (Tabla 1). La dosis máxima posible (MFD) en un modelo de ratón fue de 600 µg por inyección. Limitación se basa en la solubilidad del plásmido (6 µ?/µ?) y el volumen total por inyección (100 µ? ) . Teniendo en cuenta el peso del ratón de 30 g y el peso humano de 70 kg, la dosis equivalente humano (HED) para la dosis de 600 mg del ratón es 113.82 mg.

Tabla 1 El grupo experimental recibió plásmido de alta dosis GNE (0.6 mg en suspensión en solución salina normal 0.1 mi) administrada por vía IV por la vena de la cola, y el grupo de control recibió 0.1 mi de solución salina normal. Los grupos fueron divididos en 3 grupos de frecuencia de dosis de 2 ratones (1 mujer, 1 hombre) cada uno de la siguiente manera: 1) Administración de cada día durante 14 días, 2) Administración de cada dos días, y 3) Una vez por semana. Todos los animales sobrevivieron al experimento. No se observaron cambios significativos entre el experimento y los grupos de control con respecto a todos los parámetros medidos, que incluyeron el peso corporal, la temperatura, la alimentación y la ingesta de agua, análisis de sangre (hemograma realizado los días 1 y 15) . Tras la necropsia en el día 15, no se observó ningún cambio significativo en la patología macroscópica entre el experimento y los grupos de control con respecto a 12 órganos, incluyendo el cerebro, pulmón, corazón, hígado, riñon, bazo, estómago, los intestinos, la vejiga, los genitales, la linfa nodos, y el músculo.

Aunque las modalidades ilustrativas de la presente invención se han descrito en el presente, debe entenderse que la invención no se limita a los descritos, y que otros diversos cambios o modificaciones pueden ser hechos por un técnico en la materia sin alejarse del alcance u objeto de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para expresar un péptido UDP-GlcNAc 2-Epimerase/ManNAc enzima quinasa (GNE) en una célula de un sujeto que comprende: suministrar dentro de la célula del sujeto una construcción de expresión de ácido nucleico aislado que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en donde tras el suministro en la célula del sujeto, la construcción de expresión de ácido nucleico inicia la expresión del péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo del mismo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de expresión de ácido nucleico aislado tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula del sujeto está en una extremidad del sujeto.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa de suministro comprende un método de suministro vascular en conjunción con una oclusión vascular temporal.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el método de suministro comprende: a) inyectar el fluido en la extremidad del sujeto a través de un acceso intravascular, en donde el fluido de infusión comprende construcción de expresión de ácido nucleico, y en' donde el fluido inyectado se impregna por todos los músculos esqueléticos de la extremidad o tejido diana; y b) aplicar presión intravascular e intra-tejido incrementada mediante al aumento del volumen del fluido inyectado .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la construcción de expresión del ácido nucleico se suministra en una dosis única .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la dosis única comprende una concentración especifica del producto independientemente del volumen total que se inyecta, o de una cantidad molar especifica independientemente del volumen total que se inyécta.

8. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la construcción de la expresión del ácido nucleico aislado comprende además, un promotor/potenciador que facilita la transfección .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido que facilita la transfección comprende un polipéptido activo enzimáticamente capaz de producir ácido siálico.

10. El método de Conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido que facilita la transfección o polipéptido recombinante expresado por el construcción de expresión del ácido nucleico aislado, comprende una forma hipermórfica de GNE, producción más alta que las cantidades esperadas del ácido siálico N-acetilneuraminato.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula del sujeto comprende células diploides.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula del sujeto comprende células musculares.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto comprende humano, animal rumiante, animales para el consumo, o animales de trabajo.

14. Una molécula de ácido nucleico aislada de la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

15. Un método de suministro de una enzima codificada GNE que comprende: a) crear un acceso intravenoso en un punto por debajo de una rodilla o un codo de una extremidad de un sujeto; b) aplicar un torniquete en un punto proximal al resto del cuerpo del sujeto que el punto de acceso por vía intravenosa; c) introducir una dosis única de una construcción de expresión de ácido nucleico aislada en la extremidad a través del acceso por vía intravenosa, en donde la dosis única es de un volumen suficiente para aumentar la presión intravascular para la extravasación del polinucleotido; en donde, la construcción del ácido nucleico aislado que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento de terapéuticamente activo del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la construcción del ácido nucleico aislado comprende además un polinucleotido que facilita la transíección.

17. Un método de producción de un péptido GNE en una célula que comprende infectar la célula con una construcción de ácido nucleico aislada que comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido GNE o un fragmento terapéuticamente activo del mismo, en donde el péptido GNE tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero o una célula bacteriana.

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la construcción de expresión de ácido nucleico aislado tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.