MX2013003534A - Uso terapéutico de un agonista de receptor de tipo toll y terapia de combinación. - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida en general a formulaciones de un agonista de receptores de tipo Toll (TLR), preferiblemente a un agonista de TLR8, y a su uso en el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo terapias de combinación para tratar el cáncer.

Description

USO TERAPÉUTICO DE UN AGONISTA DE RECEPTOR TIPO TOLL Y TERAPIA DE COMBINACIÓN REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a, y el beneficio de, la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/388,953, presentada el 1 de octubre de 2010, solicitud provisional de E.U.A. No. 61/388,967, presentada el 1 de octubre de 2010, y solicitud provisional de E.U.A. No. 61/390,447, presentada el 6 de octubre de 2010, el contenido de las cuales es incorporado aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a formulaciones de un agonista de TLR, preferiblemente un agonista de TLR8, y una terapia de combinación que comprende la administración de un agonista de TLR8 y un agente anticanceroso para usarse en el tratamiento de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La estimulación del sistema inmunológico, que incluye la estimulación de cualquiera o ambas de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa, es un fenómeno complejo que puede dar como resultado ya sea resultados fisiológicos adversos o protectores para el hospedero. En los últimos años ha existido un aumento en el interés por los mecanismos subyacentes a la inmunidad innata, que se cree que inicia y soporta la inmunidad adaptativa. Este interés ha sido motivado en parte por el descubrimiento reciente de una familia de proteínas receptoras de reconocimiento de patrón altamente conservadas conocidas como receptores tipo TOII (TLRs) que se cree están implicadas en la inmunidad innata como receptores para patrones moleculares asociados a patógeno (PAMPs). Las composiciones y métodos útiles para modular la inmunidad innata son por lo tanto de gran interés, ya que pueden afectar enfoques terapéuticos a condiciones que implican cáncer, enfermedad infecciosa, autoinmunidad, inflamación, alergia, asma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto versus hospedero (GvHD), e inmunodeficiencia.

Los receptores tipo toll (TLRs) son una familia de proteínas de transmembrana de tipo I cuya activación ¡n vivo inicia una respuesta inmunológica innata que implica citocinas específicas, quimiocinas y factores de crecimiento. Aunque todos los TLRs pueden activar ciertas moléculas de señalización intracelular tales como factor nuclear kappa beta (NF-kB) y proteína cinasas activadas por mitógeno (MAP cinasas), el conjunto específico de citocinas y quimiocinas liberadas parece ser único para cada TLR. Los TLR7, 8, y 9 comprenden una subfamilia de TLRs que están ubicados en compartimientos endosomales o lisosomales de células inmunes tales como células dendríticas y monocitos. A diferencia de TLR7 y 9 que son altamente expresados en células dendríticas de plasmacitoides (pDC), TLR8 es expresado principalmente en DC mieloide (DCm) y monocitos. Esta subfamilia media el reconocimiento de ácidos nucleicos microbianos, tales como ARN de cadena sencilla. Los agonistas de TLR8 estimulan la producción de varias citocinas inflamatorias incluyendo interleucina-6, interleucina-12, factor-alfa de necrosis tumoral, y el interferón-gama. Dichos agonistas también promueven la expresión incrementada de moléculas coestimulantes tales como CD40, CD80, CD83, y CD86, moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor, y receptores de quimiocina. Los interferones de tipo I, IFNa e IFNp, también son producidos por células bajo la activación con agonistas de TLR8.

Los compuestos sintéticos de imidazoquinolina pequeños, de peso molecular bajo (menos de 400 Daltons) que se parecen a los nucleótidos de purina y guanosina fueron los primeros agonistas de TLR7 y TLR8 que se identificaron. Varios de estos compuestos han demostrado propiedades antivíricas y contra el cáncer. Por ejemplo, el agonista de TLR7 imiquimod (ALDARA™) fue aprobado por la U.S. Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Fármacos de los E.U.A.) como un agente tópico para el tratamiento de lesiones de la piel causadas por ciertas cepas del virus de papiloma humano. El imiquimod también puede ser útil para el tratamiento de cánceres de la piel primarios y tumores cutáneos tales como carcinomas de células básales, queratoacantomas, queratosis actínicas y enfermedad de Bowen. El agonista de TLR7/8 resiquimod (R-848) está siendo evaluado como un agente tópico para el tratamiento de herpes genital humano.

Doxorubicina es un fármaco usado en quimioterapia humana. Es un antibiótico de antraciclina, estrechamente relacionado con el producto natural daunomicina, y como todas las antraciclinas funciona al intercalar ADN. La doxorubicina se usa comúnmente en el tratamiento de una amplia gama de cánceres, incluyendo malignidades hematológicas, muchos tipos de carcinoma, y sarcomas de tejido blando.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida generalmente a una terapia de combinación que comprende la administración de un agonista de TLR8 benzo[b]azepina y una o más modalidades de tratamiento adicionales tales como un agente anticanceroso (v.gr., doxorubicina) para usarse en el tratamiento, alivio o prevención de cáncer, preferiblemente tumores sólidos (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas), y para otros usos incluyendo el tratamiento de leucemias, el tratamiento de ciertas condiciones o enfermedades de la piel, tales como dermatitis atópica, el tratamiento de enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades virales, y para usarse como adyuvantes en vacunas formuladas para usarse en terapia de cáncer y en el tratamiento de enfermedad infecciosas. De manera específica, la presente invención está dirigida a métodos y composiciones que comprenden un agonista de TLR8 benzo[b]azepina, VTX-2337, y doxorubicina. En modalidades preferidas, VTX-2337 y doxorubicina se usan para el tratamiento de cáncer y el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma y linfoma, o cualquier combinación de los mismos.

Preferiblemente, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.001 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, o de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml. En ciertas modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, o de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml. En ciertas modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, o aproximadamente 50 mg/ml. Preferiblemente, la formulación comprende aproximadamente 1-30%, 5-15%, o 5-10% en peso/volumen (p/v) de una ciclodextrina, preferiblemente una ß-ciclodextrina, y muy preferiblemente éter sulfobutílico ß-ciclodextrina. En ciertas modalidades, la formulación comprende 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, o 30% p/v de una ciclodextrina, preferiblemente una ß-ciclodextrina, y muy preferiblemente éter sulfobutílico ß-ciclodextrina. En una modalidad particular, la formulación es una solución acuosa que comprende VTX-2337 a una concentración de por lo menos 2 mg/ml. En una modalidad adicional, la formulación comprende 15% p/v de una ciclodextrina, preferiblemente una D-ciclodextrina, y muy preferiblemente? -ciclodextrina de éter sulfobutílico. En modalidades preferidas, la formulación es conveniente para inyección en un mamífero, preferiblemente un humano. En modalidades particulares, la inyección es por vía subcutánea, por vía intramuscular o por vía transdérmica. En ciertas modalidades, la formulación es conveniente para la administración intravenosa.

Preferiblemente, la formulación reconstituida es adecuada para inyección en un mamífero, preferiblemente un humano. En modalidades particulares, la inyección es por vía subcutánea, por vía intramuscular o por vía transdérmica. En ciertas modalidades, la formulación es conveniente para la administración intravenosa.

La presente invención además provee métodos para el tratamiento de cáncer al administrar a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, doxorubicina y agonista de TLR8 VTX-2337, que contiene una ciclodextrina. En una modalidad preferida, VTX-2337 se administra en combinación con una o más modalidades de tratamiento adicionales, en donde las modalidades se seleccionan de un agente quimioterapéutico, una citocina, un anticuerpo, terapia hormonal o terapia de radiación. En una modalidad, VTX-2337 se administra como parte de un régimen para el tratamiento de un tumor sólido. En una modalidad adicional, el tumor sólido es una forma de cáncer seleccionado de entre cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal o linfoma, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, VTX-2337 se administra como parte de un régimen para el tratamiento de un linfoma. En una modalidad, el linfoma es linfoma de Hodgkin. En otra modalidad, el linfoma es linfoma no Hodgkin. En otra modalidad, VTX-2337 se usa como un adyuvante de vacuna para el tratamiento de cáncer. En ciertas modalidades de los métodos para el tratamiento de cáncer, VTX-2337 se administra por inyección o por vía intravenosa. En modalidades particulares, la inyección es por vía subcutánea, vía intramuscular o vía transdérmica. En una modalidad particular, la formulación se administra por inyección subcutánea.

En ciertas modalidades de los métodos para tratar cáncer, VTX-2337 se administra al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg (v.gr., aproximadamente 0.05-0.075 mg/kg, o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg) de peso corporal del sujeto. En ciertas modalidades, VTX-2337 se administra a una dosis de aproximadamente .02 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, o aproximadamente 5 mg/kg. Por ejemplo, suponiendo que el sujeto tiene un peso corporal de aproximadamente 70 kg, VTX-2337 se administra a una dosis de aproximadamente 1.4 mg-700 mg (v.gr., 3.5 mg-5.25 mg, o aproximadamente 2.8-350 mg). En ciertas modalidades adicionales, VTX-2337 se administra al sujeto sobre una base semanal o quincenal.

La presente invención también provee un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenados con una VTX-2337 líquida o hidrolizada y un agente anticanceroso (v.gr., doxorubicina) de la invención para el tratamiento de cáncer o uno o más síntomas del mismo. La VTX-2337 líquida o hidrolizada y un agente anticanceroso (v.gr., doxorubicina) pueden ser empacados en los mismos o diferentes contenedores del kit. Preferiblemente, la formulación de VTX-2337 comprende aproximadamente 1-30%, 5-15%, o 5-10% p/v de una ciclodextrina, preferiblemente una ß-ciclodextrina, y muy preferiblemente D-ciclodextrina de éter sulfobutílico. En ciertas modalidades, la formulación VTX-2337 comprende 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% o 30% p/v de una ciclodextrina, preferiblemente una D-ciclodextrina, y muy preferiblemente ß-ciclodextrina de éter sulfobutílico. En una modalidad particular, la formulación es una formulación acuosa de VTX-2337. Preferiblemente, VTX-2337 es formulada a una concentración de por lo menos 2 mg/ml y la formulación, ya sea acuosa o una formulación liofilizada reconstituida, es adecuada para inyección subcutánea en un mamífero, preferiblemente un humano.

En una modalidad, VTX-2337 es formulada a una concentración de por lo menos 2 mg/ml. Más aún, la formulación es adecuada para administración al sujeto, en donde el sujeto es preferiblemente un humano, por inyección y es por inyección subcutánea, intramuscular o transdérmica. En ciertas modalidades, VTX-2337 se administra al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg, a una dosis de aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg o a una dosis de aproximadamente 0.05-0.075 mg/kg. En ciertas modalidades adicionales, VTX-2337 se administra al sujeto sobre una base semanal o quincenal.

En una modalidad preferida, VTX-2337 se administra en combinación con una o más modalidades de tratamiento adicionales, en donde las modalidades se seleccionan de un agente quimioterapéutico, una citocina, un anticuerpo, terapia hormonal o terapia de radiación. La presente invención también provee métodos para el tratamiento de enfermedad infecciosa que es causada por un virus, en donde el virus es un virus de hepatitis.

En una modalidad preferida, doxorubicina se formula para inyección, muy preferiblemente administración intravenosa. En ciertas modalidades, VTX-2337 de la invención se formula para administración por vía intradérmica, transdérmica, subcutánea o intramuscular.

En ciertas modalidades de los métodos para tratar cáncer, doxorubicina se administra al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto.

La presente invención también provee un método de tratamiento de cáncer con una formulación de dosis baja de un agonista de TLR8 benzo[b]azepina. El método que comprende administrar a un sujeto que necesita el mismo un agonista de TLR8 benzo[b]azepina a una dosis por abajo de 0.007 mg/kg/semana, v.gr., entre 0.002 mg/kg/semana a 0.006 mg/kg/semana. En una modalidad, el agonista de TLR8 benzo[b]azepina es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina-4-carboxamida. El método puede incluir administrar agonista de TLR8 benzo[b]azepina como el único ingrediente activo o además incluir administrar un segundo agente terapéutico tal como un fármaco anti-canceroso en combinación con la formulación de dosis baja del agonista de TLR8 benzo[b]azepina. El segundo agente terapéutico puede ser otro agonista de TLR8 benzo[b]azepina o una molécula de fármaco descrita aquí (v.gr., doxorubicina, gemcitabine o ciclofosfamida). El método también se puede llevar a cabo en combinación con una o más modalidades de tratamiento adicionales (v.gr., terapia de radiación) en un régimen para el tratamiento de cáncer.

En otro aspecto, la invención también provee una forma de dosis subcutánea que comprende un agonista de TLR8 benzo[b]azepina para el tratamiento de cáncer en un sujeto, en donde en la forma de dosis subcutánea, al administrarse a un humano a una dosis de 2-4 mg/m2 del agonista, provee una AUCo-¡nf del agonista de aproximadamente 55 a aproximadamente 90 h*ng/ml_, v.gr., aproximadamente 60 a aproximadamente 80 h*ng/ml_.

En otro aspecto, la invención también provee una forma de dosis subcutánea que comprende un agonista de TLR8 benzo[b]azepina para el tratamiento de cáncer en un sujeto, en donde en la forma de dosis subcutánea, al administrarse a un humano a una dosis de 2-4 mg/m2 del agonista, provee una Cmáx del agonista de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 ng/mL, v.gr., aproximadamente 15 a aproximadamente 25 ng/mL.

La invención también provee una composición farmacéutica que incluye una formulación líquida o liofilizada de agonista de TLR8 benzo[b]azepina (v.gr., VTX-2337) y un agente anticanceroso (v.gr., doxorubicina). La formulación del agonista y el agente anticanceroso puede estar en la misma composición farmacéutica o en diferentes composiciones, en cuyo caso, la formulación del agonista y el agente anticanceroso se puede administrar concurrentemente o secuencialmente.

La descripción anterior expone en forma más bien amplia las características más importantes de la presente invención de modo que la descripción detallada de la misma que sigue se pueda entender, y de modo que las presentes contribuciones a la técnica se puedan apreciar mejor. Otros objetos y características de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada considerada junto con los ejemplos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A es un conjunto de imágenes de FACS adquiridas sobre células hematolinfoides de ratones NSG-HIS. Los ratones NSG recibieron células madre CD34+ hematopoyéticas derivadas de sangre del cordón. Se muestra el nivel de injerto de células humanas (CD45+, CD45+CD14+, CD45+CD33). Los ratones se trataron con 0.5 ó 5 mg/kg de VTX-2337. Se muestra la maduración de células CD14+ (CD83, CD86).

La figura 1 B es un conjunto de gráficas de barras que muestran un cambio en el nivel de marcadores de activación (CD86+, MHC Clase II) sobre monocitos (CD45+ CD14+), mDC (CD45+ CD11c+) y pDC (CD45+ CD123+) 6 horas después de la administración SC de VTX-2337 a ratones NSG-HIS.

La figura 1C es un conjunto de gráficas de barras que muestran un cambio en los niveles de citocina en el plasma (INF-g, TNF-alfa, IL-12 y IL- 10) 6 horas después de la administración SC de VTX-2337 a ratones NSG-HIS.

La figura 2 es un conjunto de gráficas de barras que muestran un cambio en los niveles de citocina en el plasma (IFN-g, IL-10, TNF-alfa) en ratones que no recibieron tratamiento (CTRL), Doxil a la dosis máxima tolerada (MTD, 50 mg/m2) o 5 mg/kg VTX-2337 5 días después del tratamiento con Doxil.

La figura 3A es un esquema que muestra el protocolo para tratar a ratones NSG-HIS con Doxil, VTX-2337 o su combinación en un modelo de cáncer de ovario en ratón humanizado (NSG-HIS) que usó las línea de células de cáncer de ovario humano OVCAR5 para generar tumores.

La figura 3B es una gráfica de líneas que muestra cambios de tamaño en tumores de ratones NSG-HIS tratados con Doxil a 50 mg/m2, VTX-2337 a 0.5 mg/kg, o su combinación con el tiempo después de la inoculación con células OVCAR5.

La figura 3C es un conjunto de imágenes de IHC que muestran tumores infiltrados con células CD45+ de ratones tratados con Doxil a 50 mg/m2, VTX-2337 a 0.5 mg/kg, o su combinación en un modelo de cáncer de ovario humanizado.

La figura 3D es un conjunto de gráficas de barras que muestran un cambio en el nivel de células T CD3+, CD8+, CD3+CD8+ activadas con CD69+ que infiltran tumor, y macrófagos activados por CD40+ (CD45+CD1 1b+), pDC (CD45+CD123+), y mDC (CD45+CD11c+) en ratones tratados con Doxil a 50 mg/m2, VTX-2337 a 0.5 mg/kg, o su combinación en un modelo de cáncer de ovario humanizado.

La figura 4A es una gráfica de líneas que muestra cambios en conteos por minuto (cpm) de células OVCAR5 líticas marcadas con 51Cr lisadas por TIL, expandidas de ratones tratados con Doxil o la combinación de VTX-2337 y Doxil, en respuesta a una relación variable de TIL efector sobre células OVCAR5 objetivo.

La figura 4B es una gráfica de líneas que muestra cambios en el tamaño del tumor con el tiempo en ratones NSG-HIS que fueron inoculados con células OVCAR 5 y después tratadas con TILS adoptivamente transferidas de ratones en el experimento descrito en las figuras 3A-3D.

La figura 4C es un conjunto de gráficas de líneas que muestran cambios en los conteos de células OVCAR5 líticas marcadas con 51Cr lisadas por TIL de los ratones tratados con Doxil o la combinación de VTX-2337 y Doxil, en ausencia o presencia de un anticuerpo neutralizante anti MHC clase I (MHCI).

La figura 4D es un conjunto de gráficas de barras que muestran un cambio en el nivel de IFNg liberado por TIL incubado con células OVCAR5 o células de melanoma.

La figura 5A es una gráfica de barras que muestra un cambio en el porcentaje de células apoptóticas teñidas con anexina-V y 7AAD en células OVCAR5 tratadas con medio acondicionado de PBMCs humanas que habían sido incubadas con regulador de pH solo, esferas de CD3/CD28, o 1 pg/mL de VTX-2337.

La figura 5B es una gráfica de barras que muestra un cambio en el número de células vivas en células OVCAR5 tratadas con medio acondicionado de PBMCs humanas que habían sido incubadas con regulador de pH solo, esferas de CD3/CD28 o 1 ug/mL de VTX-2337.

La figura 5C es una imagen que muestra una película de Western blot que muestra expresión de TN Faifa-receptor 1 sobre células OVCAR5.

La figura 5D es un conjunto de gráficas que muestran imágenes FACS de células OVCAR5 tratadas con TNFalpha (10 ng/ml) o Doxil (1 Mg/ml) o su combinación y el cambio resultante en el porcentaje de células apoptóticas teñidas por anexina-V y 7AAD.

La figura 5E es una imagen que muestra una película de Western blot de expresión de FLIPL sobre células OVCAR 5 tratadas con 0.5 o 2.5 pg/mL de Doxil.

La figura 5F es un conjunto de gráficas que muestran imágenes FACS de células OVCAR5 que fueron pre-cultivadas con 10 pg/ml de cicloheximida (cyclx) durante 24 hr y después tratadas con 10 o 50 ng/ml de TNFalfa, y un cambio resultante en el porcentaje de células apoptóticas teñidas por anexina-V y 7AAD.

La figura 6 es un conjunto de gráficas que muestran la potencia y selectividad de VTX-2337 en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de 15 donadores sanos y también en células HEK293 transfectadas con TLR8 o TLR7 y un gen reportero impulsado por NF- B.

La figura 7 es un conjunto de gráficas que muestran que VTX-2337 estimula una gama de citocinas y quimiocinas en sangre entera humana.

La figura 8 es un conjunto de gráficas que muestran que VTX- 2337 activa monocitos y células dendríticas mieloides (mDCs) pero no células dendríticas plasmacitoides (pDCs).

La figura 9 es una gráfica que muestra farmacocinética de VTX-2337 después de administración subcutánea. Las marcas numéricas "1-8" en esta figura corresponde a Cohortes 1-8 respectivamente.

Las figuras 10A y 10B son gráficas que muestran respuestas farmacodinámicas consistentes sobre múltiples ciclos de tratamiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en la descripción adjunta siguiente. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales preferidos. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción. En la especificación, las formas singulares también incluyen el plural a menos que el contexto determine claramente otra cosa. A menos que sea definido de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica al que compete esta invención. En caso de conflicto, la presente especificación dominará.

La presente invención provee composición y métodos de uso de agonista de TLR8 benzo[b]azepina, (v.gr., VTX-2337) y otra modalidad terapéutica (tal como un agente anticanceroso, v.gr., doxorubicina) para tratar, aliviar o prevenir cáncer u otros trastornos descritos aquí. VTX-2337 es un agonista de TLR8 de molécula pequeña novedoso, potente y selectivo. Las formulaciones de VTX-2337 se describen en la publicación internacional del PCT W010/014913. Las formulaciones de la presente invención son adecuadas para usarse en métodos para el tratamiento de un cáncer humano como se describe aquí.

A menos que se indique de otra manera, se entenderá que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitativa. En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a varios términos, que serán definidos para tener las definiciones establecidas a continuación.

Un "sujeto" en el contexto de la presente invención es preferiblemente un mamífero. El mamífero puede ser un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no está limitado a estos ejemplos. Un sujeto puede ser de sexo masculino o femenino. Un sujeto puede ser uno que ha sido anteriormente diagnosticado o identificado como que tiene cáncer, y opcionalmente ya ha sufrido, o está sufriendo, una intervención terapéutica para el cáncer tal como tratamiento con Doxil o terapia de radiación. Alternativamente, un sujeto también puede ser uno que no ha sido anteriormente diagnosticado como que tiene cáncer, pero que está en riesgo de desarrollar dicha condición. Por ejemplo, un sujeto puede ser uno que presente uno o más síntomas parar cáncer.

Los términos "enfermedad," "trastorno" y "condición" son utilizados intercambiablemente en la presente, y se refieren a cualquier interrupción de la función normal del cuerpo, o de la aparición de cualquier tipo de patología. El agente etiológico que causa la interrupción de la fisiología normal puede o no puede ser conocido. Además, aunque dos pacientes puedan ser diagnosticados con el mismo trastorno, los síntomas particulares demostrados por esos individuos pueden o no pueden ser idénticos.

Los términos "tratar" y "tratamiento" como son utilizados en la presente se refieren a la reducción en la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas, la eliminación de los síntomas y/o la causa fundamental, la prevención de la ocurrencia de síntomas y/o su causa fundamental, y de la mejora o el remedio del daño. Por ejemplo, el tratamiento de un paciente mediante la administración de un agente anticanceroso de la invención abarca la quimioprevención en un paciente susceptible de desarrollar cáncer (v.gr., a un riesgo más alto, como resultado de predisposición genética, factores ambientales, o similares) y/o en sobrevivientes de cáncer en riesgo de recurrencia de cáncer, así como tratamiento de un paciente con cáncer al inhibir o causar regresión de un trastorno o enfermedad.

El término "aliviar" o "mitigar", como se usa aquí ,se refiere al alivio de por lo menos un síntoma de la enfermedad, trastorno o condición.

El término "prevenir", como se usa aquí, incluye ya sea prevenir o desacelerar el inicio de una progresión de enfermedad clínicamente evidente en conjunto o prevenir o desacelerar el inicio de una etapa evidente preclínica de una enfermedad en individuos en riesgo. Esto incluye el tratamiento profiláctico de los mismos en riesgo de desarrollar una enfermedad.

Al referirse a un compuesto de la invención, los solicitantes pretenden que el término "compuesto" abarque no sólo la entidad molecular especificada sino también sus análogos farmacéuticamente aceptables, farmacológicamente activos, incluyendo, pero no limitado a, sales, ésteres, amidas, profármacos, conjugados, metabolitos activos, y otros de tales derivados, análogos y compuestos relacionados.

Por los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" de un compuesto de la invención se entiende una cantidad suficiente pero no tóxica del fármaco o del agente para proveer el efecto deseado.

Por " farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente ni de otro modo indeseable, es decir, el material puede ser incorporado en una composición farmacéutica administrada a un paciente sin causar ningún efecto biológico indeseable ni que interactúe de una manera dañina con cualquiera de los otros componentes de la composición en la que está contenido. Cuando el término " farmacéuticamente aceptable" es utilizado para referirse a un portador o excipiente farmacéutico, es implícito que el portador o excipiente ha cumplido con los estándares necesarios de pruebas toxicológicas y de fabricación o que está incluido en la Guía de Ingredientes Inactivos preparada por la Administración de Alimentos y Fármacos de EEUU. "Farmacológicamente activo" (o simplemente "activo") como en un derivado o análogo "farmacológicamente activo", se refiere a un derivado o análogo que tiene el mismo tipo de actividad farmacológica que el compuesto progenitor y aproximadamente equivalente en grado.

Por "según sea necesario," como en "administración según sea necesario" o "en necesidad del mismo" se entiende que una formulación se administra a un paciente cuando se observan síntomas, o cuando se espera que aparezcan los síntomas, o en cualquier tiempo que el paciente y/o médico que provee el tratamiento considera apropiado tratar (terapéuticamente o profilácticamente) síntomas no deseables (v.gr., síntomas que surgen con el cáncer).

Agonistas de TLR de la Invención 1.1 Formulación Las formulaciones de VTX-2337 comprenden un compuesto activo con la siguiente estructura. Las formulaciones de la presente invención son adecuadas para administración subcutánea a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, pero se puede usar para administrarse por otros medios.

Las formulaciones de VTX-2337 de la presente invención comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término excipiente como es utilizado en la presente se refiere ampliamente a una sustancia biológicamente inactiva utilizada en combinación con los agentes activos de la formulación. Un excipiente puede ser utilizado, por ejemplo, como un agente de solubilización, un agente estabilizador, un diluyente, un vehículo inerte, un conservador, un aglutinante, un desintegrante, un agente de revestimiento, un agente saborizante, o un agente colorante. Preferiblemente, por lo menos un excipiente es e$cogido para proveer una o más propiedades físicas beneficiosas a la formulación, tales como una estabilidad y/o la solubilidad aumentada de los agentes activos. VTX-2337, como se describe aquí, es el agente activo primario en las formulaciones de la presente invención. Sin embargo, VTX-2337 se puede formular con otros agentes activos, v.gr., otros agonistas de TLR, agentes anticancerosos o agentes antivirales, como se describe aquí.

Un excipiente "farmacéuticamente aceptable" es uno que ha sido aprobado por una agencia reguladora estatal o federal para usarse en animales, y preferiblemente para usarse en humanos, o es listada en la Farmacopea de E.U.A., la Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para usarse en animales, y preferiblemente para usarse en humanos.

Ejemplos de excipientes incluyen ciertas proteínas inertes tales como albúminas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como ácido aspártico (que alternativamente puede ser referido como aspartato), ácido glutámico (que alternativamente puede ser referido como glutamato), lisina, arginina, glicina, e histidina; ácidos grasos y fosfolípidos tales como alquiisulfonatos y caprilato; agentes tensoactivos tales como dodeciisulfato de sodio y polisorbato; agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS®, o polietilenglicol (PEG); carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, mañosa, maltosa, trehalosa, y dextrinas, incluyendo ciclodextrinas; polioles tales como manitol y sorbitol; gentes quelatadores tales como EDTA; y contraiones formadores de sal tales como sodio.

Las formulaciones de VTX-2337 pueden contener una ciclodextrina que incrementa la solubilidad acuosa del agonista de TLR. Las ciclodextrinas son oligómeros cíclicos no higroscópicos, cristalinos de D-D-glucopiranosa. A consecuencia de una falta de rotación alrededor de los enlaces que conectan las unidades de glucopiranosa, las ciclodextrinas no son de forma cilindrica, sino toroidal. A causa de esta rotación restringida, tienen una estructura rígida con una cavidad central cuyo tamaño varía según el número unidades de glucopiranosa en la molécula. Las tres ciclodextrinas más comunes son D-ciclodextrina, ? -ciclodextrina y D-ciclodextrina, que consisten de seis, siete u ocho unidades de glucopiranosa, respectivamente. Debido al arreglo de grupos de hidroxilo dentro de la molécula de ciclodextrina y la forma de la molécula, la superficie interna de la cavidad es hidrofóbica, mientras la superficie exterior es hidrofílica. Los grupos hidroxilo primarios están situados en el lado más estrecho (interior) de la molécula toroidal, mientras los grupos hidroxilo secundarios están situados en el bordea más ancho (exterior). Este arreglo permite que las ciclodextrinas acomoden una gran variedad de pequeñas moléculas hidrofóbicas dentro de la cavidad hidrofóbica formando un complejo de inclusión.

Las ciclodextrinas convenientes para usarse en las formulaciones de la invención son conocidas en la técnica. Por éjemplo, TRAPPSOL™ y otras ciclodextrinas son hechas por CTD, Inc. (High Springs, FL), y CAPTISOL® (éter sulfobutílico D-ciclodextrina ) está presente en materiales inyectables comercialmente disponibles tales como ABILIFY IM™, GEODON y VFEND IV. Preferiblemente, CAPTISOL® se usa en las formulaciones de la presente invención.

Se pueden usar otros agentes solubilizantes en agua. Ejemplos de otros de tales agentes incluyen Poloxámero, Povidona K17, Povidona K12, Tween 80, etanol, Cremofor/Etanol, polietilen glicol 300, polietilen glicol 400, y propilen glicol. En modalidades preferidas, las formulaciones de la invención contienen menos de 10% de v/v de tales agentes. En ciertas modalidades, los agentes solubilizantes a base de aceite tales como lipiodol o aceite de cacahuate se usan.

En ciertas modalidades, las formulaciones de VTX-2337 se pueden preparar como un líquido o en forma sólida tal como un polvo, tableta, pildora o cápsula. Las formulaciones líquidas pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. En una modalidad, la formulación es una solución acuosa. En otra modalidad, la formulación final es liofilizada. En otras modalidades, la formulación comprende un sistema coloidal de suministro de fármaco. Tales sistemas de suministro de fármaco incluyen, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas.

En una modalidad, VTX-2337 es una formulación líquida o liofilizada adecuada para inyección en un mamífero, preferiblemente un humano. En una modalidad, la formulación es estéril. En otra modalidad, la formulación es una formulación liofilizada estéril que es adecuada para inyección bajo reconstitución con una cantidad de un vehículo acuoso. En una modalidad, la formulación líquida o liofilizada se prepara como una forma de dosis unitaria como se describe más adelante. Las formulaciones pueden o no contener un conservador añadido.

En ciertas modalidades, VTX-2337 además comprende uno o más adyuvantes. Ejemplos de adyuvantes convenientes incluyen potenciadores de la respuesta inmune tales como derivados microbianos (por ejemplo, productos bacterianos, toxinas tal como la toxina de cólera y la toxina lábil al calor de E. coli, lípidos, lipoproteínas, ácidos nucleicos, peptidoglicanos, carbohidratos, péptidos), células, citocinas, (por ejemplo, células dendríticas, IL-12, y GM-CSF) hormonas, y pequeñas moléculas. Los adyuvantes contemplados incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes a base de aceites (por ejemplo, el adyuvante de Freund), oligonucleótidos de CpG, adyuvantes de sal de aluminio, adyuvantes de sal de calcio, emulsiones y formulaciones a base de agente tensoactivo (por ejemplo, MF59, AS02, montanida, ISA-51 , ISA-720, y QA21).

De conformidad con ciertas modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/ml. En algunas modalidades, el agonista de TLR benzo[b]azepina es formulado a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. E;n otras modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, o de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. En ciertas modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de entre 0.5 y 10 mg/ml, entre 0.5 y 5 mg/ml, o entre 1 y 5 mg/ml. En otras modalidades, VTX-2337 es formulada a una concentración de entre 10-20 mg/ml, 20-30 mg/ml, o entre 30-50 mg/ml. En modalidades específicas, VTX-2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, o aproximadamente 40 mg/ml.

Las formulaciones de VTX-2337 opcionalmente se puede preparar como formas de dosis unitarias. "Forma de dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para el uso pretendido, es decir, como una sola administración al sujeto que ha de ser tratado. Cada unidad contiene una cantidad predeterminadas del agente(s) activo formulado con el excipiente(s) farmacéuticamente aceptable apropiado. Por ejemplo, una dosis unitaria por frasco puede contener un cierto volumen, tal como 1 mi, 2 mi, 3 mi, 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7 mi, 8 mi, 9 mi, 10 mi, 15 mi o 20 mi, que tiene una concentración particular del agente activo. Una dosis unitaria puede comprender un solo agente activo, es decir, VTX-2337 como se describe aquí, sus derivados y análogos, o mezclas de los mismos con otros agentes activos (v.gr., un agente anticanceroso tal como doxorubicina) para usarse en terapias de combinación. En modalidades preferidas, la forma de dosis unitaria comprende aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml de VTX-2337. Las formulaciones están contenidas opcionalmente en contenedores de una dosis o múltiples dosis, por ejemplo, en ampolletas o frascos sellados, y pueden estar en una condición liofilizada. Soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas de conformidad con métodos reconocidos en la técnica. Ejemplos de formas de dosis unitaria incluyen, pero no se limitan a: tabletas; capletas; cápsulas, tales como cápsulas de gelatina elástica blanda; cachets; trociscos; pastillas; dispersiones; supositorios; pomadas; cataplasmas (emplastos); pastas; polvos; vendajes; cremas; yesos; soluciones; parches; aerosoles (v.gr., aspersores o inhaladores nasales); geles; formas de dosis líquidas adecuadas para administración oral o mucosal a un paciente, incluyendo suspensiones (v.gr., suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua, o emulsiones de agua en aceite líquido), soluciones, y elixires; formas de dosis liquidas adecuadas para administración subcutánea a un sujeto; y sólidos estériles (v.gr., sólidos cristalinos o amorfos) que pueden ser reconstituidos para proveer formas de dosis líquidas adecuadas para administración subcutánea a un sujeto.

Información adicional con respecto a los métodos para formar las composiciones y las formulaciones y los ingredientes que comprenden las composiciones y las formulaciones de acuerdo con la presente invención puede ser encontrada en referencias estándar en el campo, tal como por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA. 1.2 Métodos de Uso La combinación de VTX-2337 y una o más modalidades de tratamiento adicionales (v.gr., agentes anticancerosos tales como doxorubicina) es útil en métodos para el tratamiento de cáncer. Preferiblemente, las formulaciones de VTX-2337 se usan en combinación con una o más modalidades de tratamiento adicionales en un régimen para el tratamiento de cáncer. En ciertas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma y linfoma, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad particular, el cáncer es a linfoma. En una modalidad, el linfoma es linfoma no Hodgkin.

Métodos para probar eficacia de agonista de TLR8 para tratar cáncer o la combinación de un agente anticanceroso y un agonista de TLR8 para tratar cáncer, incluyen, pero no se limitan a pruebas in vitro tales como aquellas que usan células PBMC, HEK humanas, o IHC y FACS para infiltrar células, y lisis de células tumorales, y pruebas in vivo tales como aquellas que usan ratones NSG-HIS o un ratón humanizado (NSG-HIS) al que se han inyectado líneas de células de ovario, o pacientes humanos. 1.2.1 Terapia de combinación La terapia de combinación abarca, además de la administración de VTX-2337, el uso adjunto de una o más modalidades que ayudan a la prevención o tratamiento de cáncer. Dichas modalidades incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, inmunoterapéuticos, agentes anti-angiogénicos, citocinas, hormonas, anticuerpos, polinucleótidos, agente terapéuticos de radiación y fotodinámicos. En modalidades específicas, la terapia de combinación se puede usar para prevenir la recurrencia de cáncer, inhibir la metástasis, o inhibir el crecimiento y/o diseminación de cáncer o metástasis. Como se usa aquí, "en combinación con" significa que la formulación de VTX-2337 de la invención se administra como parte de un régimen de tratamiento que comprende una o más modalidades de tratamiento adicionales como se describe con más detalle en las siguientes secciones.

En ciertas modalidades, VTX-2337 se administra antes de, concurrentemente con, o después de la administración de una o más de otras modalidades. En ciertas modalidades, VTX-2337 se administra antes de o después (v.gr., 5 días después) de la administración de un agente anticanceroso (v.gr., doxorubicina). En una modalidad, VTX-2337 se formula con una o más de otras modalidades. En otra modalidad, la una o más de otras modalidades es administrada en una composición farmacéutica separada. De conformidad con esta modalidad, una o más de otras modalidades se pueden administrar a un sujeto por la misma o diferente vía de administración que aquellas usadas para administrar VTX-2337. 1.2.1.1 Combinación con doxorubicina En ciertas modalidades, la formulación que comprende VTX-2337 se administra en combinación con doxorubicina. Preferiblemente, la doxorubicina está en una forma liposomal pegilada. La estructura química de doxorubicina se muestra a continuación: 1.2.1.2 Combinación con otros agentes anticancerosos En ciertas modalidades, la formulación que comprende VTX-2337 de la invención se administra en combinación con uno o más agentes anticancerosos, preferiblemente un agente quimioterapéutico. Dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes grupos de compuestos: antibióticos citotóxicos, antimetabolitos, agentes anti-mitóticois, agentes alquilantes, compuestos de platino, compuestos de arsénico, inhibidores de ADN topoisomerasa, taxanos, análogos de nucleósido, alcaloides vegetales y toxinas; y derivados sintéticos de los mismos. Los siguientes son ejemplos no limitantes de compuestos particulares dentro de estos grupos. Los agentes alquilantes incluyen mostazas nitrogenadas tales como ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida y clorambucil; nitrosoureas tales como carmustine (BCNU) y lomustine (CCNU); alqilsulfonatos tales como busulfán y treosulfán; y triazenos tales como dacarbazina. Los compuestos que contienen platino incluyen cisplatin, carboplatin, aroplatin y oxaliplatin. Los alcaloides vegetales incluyen alcaloides de vinca tales como vincristine, vinblastine, vindesine y vinorelbine; y taxoides tales como paclitaxel y docetaxol. Los inhibidores de ADN topoisomerasa incluyen epipodofilinas tales como etopósido, tenipósido, topotecan, 9-aminocamptotecina, camptotecina, y crisnatol; y mitomicinas tales como mitomicina C. Los anti-folatos incluyen inhibidores de DHFR tales como metotrexato y trimetrexato; los inhibidores de IMP deshidrogenasa tales como ácido micofenólico, tiazofurin, ribavirin, hidroxiurea y EICAR; e inhibidores de ribonucleótido reductasa tales como deferoxamina. Los análogos de pirimidina incluyen análogos de uracilo tales como 5-fluorouracilo, floxuridina, doxifluridina, y ratitrexed; y análogos de citosina tales como citarabine (ara C), citosina arabinósido y fludarabine. Los análogos de purina incluyen mercaptopurina y tioguanina. Los antimetabolitos de ADN incluyen 3-HP, 2'- desoxi-5-fluorouridina, 5-HP, alfa-TGDR, glicinato de afidicolina, ara-C, 5-aza-2'-desoxicitidina, beta-TGDR, ciclocitidina, guanazol, inosina glicodialdehido, macebecina II, y pirazoloimidazol. Los agentes antimitóticos incluyen alocolchicina, halicondrina B, colchicina, derivado de colchicina, dolstatin 10, maitansina, rhizoxin, tiocolchicina y tritil cisteína.

Otros ejemplos de agentes quimioterapéuticos para usarse con las formulaciones de agonista de TLR benzo[b]azepina de la invención incluyen inhibidores de isoprenilación; neurotoxinas dopaminérgicas tales como ion de 1-metil-4-fenilpiridinio; inhibidores de ciclo celular tales como estaurosporina; actinomicinas tales como actinomicina D y dactinomicina; bleomicinas tales como bleomicina A2, bleomicina B2, y peplomicina; antraciclinas tales como daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), ¡darubicina, epirubicina, pirarubicina, zorubicina y mitoxantrona; inhibidores de MDR tales como verapamilo; e inhibidores de Ca2+ATPasa tales como tapsigargina.

Las composiciones que comprenden uno o más agentes quimioterapéuticos {v.gr., FLAG, CHOP) también se contemplan para usarse en combinación con VTX-2337 de la invención. FLAG comprende fludarabine, citosina arabinósido (Ara-C) y G-CSF. CHOP comprende ciclofosfamida, vincristine, doxorubicina y prednisona. Cada una de las listas anteriores es ilustrativa, y no pretende ser limitante.

En una modalidad, VTX-2337 se administra en combinación con uno o mas de los siguientes: IFNa, IL-2, Dacarbazine (Bayer), Temozolomide (Schering), Tamoxifén (AZ), Carmustine (BMS), Melfalán (GSK), Procarbazine (Sigma-Tau), Vinblastine, carboplatin, cisplatin, taxol, ciclofosfamida, doxorubina, Rituxan (Genentech/Roche), Herceptin (Genentech/Roche), Gleevec, Iressa (AZ), Avastin (Genentech/Roche) o Tarceva (Genentech/Roche).

En otra modalidad, VTX-2337 de la invención se administra en combinación con uno o más de los siguientes: una enediina tal como calicheamicina y esperamicina; duocarmicina, metotrexato, doxorubicina, melfalán, clorambucil, Ara-C, vindesine, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo.

Toxinas y agentes quimioterapéuticos adecuados que se pueden usar en combinación con formulaciones de agonista de TLR benzo[b]azepina de esta invención se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a. Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7a. Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985). Otras toxinas y/o agentes quimioterapéuticos adecuados son conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplos adicionales de agentes anticancerosos que se pueden usar en combinación con VTX-2337 de esta invención incluyen sin limitación los siguientes: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; anthramicina; asparaginasa; asperlin; azacitidine; azetepa; azotomicina; batimastat; ben2odepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafide; bizelesin; sulfato de bleomicina; brequinar sodio; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemide; carbetimer; carboplatin; carmustine; clorhidrato de carubicina; carzelesin; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatin; cladribine; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabine; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; decitabine; dexorrnaplatin; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucin; enloplatin; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustine; fosfato de estramustine sódico; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabine; fenretinide; floxuridina; fosfato de fludarabine; fluorouracilo; flurocitabine; fosquidona; fostriecin sodio; gemcitabine; clorhidrato de gemcitabine; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo interleucina II o rlL2 recombinante), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-n1 ; interferón alfa-n3; interferón beta-I a; interferón gamma-I b; iproplatin; clorhidrato de irihotecan; acetato de lanreotide; letrozol; acetato de leuprólido; clorhidrato de liarozol; lometrexol sodio; lomustine; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansine; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomide; mitocarcin; mitocromin; mitogillin; mitomalcin; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatin; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustine; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer sodio; porfiromicina; prednimustine; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurin; riboprina; rogletimide; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; sparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustine; espiroplatin; estreptonigrin; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfin; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprine; tioguanina; tiotepa; tiazofurin; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribine; trimetrexate; trimetrexato glucuronato; triptorelína; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreótido; verteporfin; sulfato de vinblastine; sulfato de vincristine; vindesine; sulfato de vindesine; sulfato de vinepidine; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosine; tartrato de vinorelbine; sulfato de vinrosidine; sulfato de vinzolidine; vorozole; zeniplatin; zinostatin; clorhidrato de zorubicina.

Otros agentes anti-cancerosos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustine; amidox; amifostine; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelide; anastrozol; andrografólido; inhibidores de angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante; antiandrógeno, carcinoma prostético; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de gen de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustine; axinastatina 1 ; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrona; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatin III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosponna; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafide; bistrateno A; bizelesin; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostin C; derivados de camptotecina; viruela de canarios IL-2; capecitabine; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorlns; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribine; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatin A4; análogo de combretastatin; conagenina; crambescidin 816; crisnatol; criptoficina 8; deruvados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinones; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabine; factor citolítico; citostatin; dacliximab; decitabine; deshidrodidemnin B; deslorelína; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnin B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitídina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselén; ecomustine; edelfosine; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristeride; análogo de estramustine; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabine; fenretinide; filgrastim; finasteride; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabine; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecin; fotemustine; gadolinio texafirina; nitrato de galio; galocitabine; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabine; inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulin; hexametileno bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; ¡darubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor de receptor de factor-1 de crecimiento similar a la insulina; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladine; isobengazol; ¡sohomohalicondrin B; itasetrón; jasplakinolide; kahalalide F; triacetato de lamelarin-N ; lanreótido; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatin; letrozol; factor inhibidor de leucemia; alfa interferón de leucocitos; leuprólido+estrógeno+progesterona; leuprorelína; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipofílico; compuestos de platino lipofílico; lisoclinamida 7; lobaplatin; lombricine; lometrexol; lonidamine; losoxantrona; lovastatin; loxoribine; lurtotecan; lutetium texafirin; lisofillina; péptidos liticos; maitansine; manostatin A; marimastat; masoprocol; maspin; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelin; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristone; miltefosine; mirimostim; ARN de doble cadena discordante; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafide; mitotoxina; factor de crecimiento de fibroblastos; saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; monofosforilo lípido A+pared celular de miobacteria sk; mopidamol; inhibidor de gen de resistencia a fármacos múltiple; terapia 1 -basada en supresor de tumores múltiples; agente anti-canceroso de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular de micobacterias; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelin; nagrestip; naloxona+pentazocine; napavin; nafterpin; nartograstim; nedaplatin; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores e óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulin; 06-bencilguanina; octreótido; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrona; ondansetrona; oracin; inductor de citocina oral; ormaplatin; osaterona; oxaliplatin; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactin; pazeliptine; pegaspargasa; peldesine; pentosán polisulfato sódico; pentostatin; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfato; picibanil; clorhidrato de pilocarpine; pirarubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inhibidor de activador de plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfimer sódico; porf ¡rom ¡ciña; prednisona; propil bis-acridone; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; inmunomodulador de proteína A-based; inhibidor de proteína cinasa C; inhibidores de proteína cinasa C, microalgal; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridine; conjugado de polietoxileno de hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de ras proteína farnesil transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; retelliptine demetilado; renio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; Rll retinamida; rogletimide; rohitukine; romurtide; roquinimex; rubiginona B1 ; ruboxyl; safingol; saintopin; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1 ; semustine; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleótidos de sentido; inhibidores de transducción de señal; moduladores de transducción de señal; proteína de unión de antígeno de cadena sencilla; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermin; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustine; esplenopentina; espongistatin 1 ; escualamina; inhibidores de células madre; inhibidores de división celular; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista de péptido intestinal vasocativo superactivo; suradista; suramin; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustine; metyoduro de tamoxifén; tauromustine; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfin; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastine; tiocoraline; trombopoietin; mimético de trombopoyetina; timalfasin; agonista de receptor de timopoietin; timotrinan; hormona estimulante de la tiroides; estaño etil etiopurpurina; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentin; toremifeno; factor de células madre totipotenciales; inhibidores de traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribine; trimetrexato; triptorelin; tropisetrona; turostérido; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de receptor de crecimiento derivado de senos urogenitales; antagonistas de receptor de uroquinasa; vapreotido; variolin B; sistema de vector, terapia de genes de eritrocitos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfin; vinorelbine; vinxaltine; vitaxin; vorozol; zanoterona; zeniplatin; zilascorb; y zinostatina estimalamer. 1.2.1.3 Combinación con terapia de radiación En otra modalidad, VTX-2337 de la invención se administra junto con un régimen de radiación para el tratamiento de cáncer. Los métodos abarcan regímenes que comprenden terapia de radiación de haz externo, implantación interstitial de radioisótopos (1-125, paladio, iridio), radioisótopos tal como estrontio-89, terapia de radiación torácica, terapia de radiación intraperitoneal P-32, y/o terapia de radiación total abdominal y pélvica. Cualquier radionúclido citotóxico adecuado o isótopo terapéutico se puede usar en el régimen de terapia de radiación. En ciertas modalidades, el isótopo es un isótopo alfa-emisor tal como 225Ac, 224Ac, 21 At, 212Bi, 2 3Bi, 212Pb, 22 Ra, o 223Ra. En otras modalidades, el radionúclido citotóxico es un isótopo beta-emisor tal como 186Re, 188Re, 90Y, 13 , 67Cu, 177Lu, 53Sm, 166Ho o 64Cu. En algunas modalidades, el radionúclido citotóxic es un isótopo que emite electrones de baja energía de Auger tales como 125l, 123l o 77Br. En otras modalidades el isótopo es 198Au, 32P, y similares.

En ciertas modalidades, la cantidad del radionúclido administrado al sujeto es entre aproximadamente 0.001 mCi/kg y aproximadamente 10 mCi/kg. En algunas modalidades, la cantidad del radionúclido administrado al sujeto es entre aproximadamente 0.1 mCi/kg y aproximadamente 1.0 mCi/kg. En otras modalidades, la cantidad del radionúclido administrado al sujeto es entre aproximadamente 0.005 mCi/kg y 0.1 mCi/kg. 1.2.1.4 Combinación con anticuerpos terapéuticos En otra modalidad, VTX-2337 de la invención se administra en combinación con uno o más agentes inmunoterapéuticos, tales como un anticuerpo o una vacuna. En algunas modalidades, los anticuerpos tienen usos terapéuticos y/o profilácticos in vivo contra cáncer.

Ejemplos no limitantes de anticuerpos terapéuticos y profilácticos que se pueden usar en combinación con un agonista de formulación de TLR benzo[b]azepina de la invención incluyen MDX-010 (Medarex, NJ) que es un anticuerpo anti-CTLA-4 humanizado actualmente en clínica para el tratamiento de cáncer de próstata; SYNAGIS® (Medlmmune, MD) que es un anticuerpo monoclonal de virus anti-sincicio respiratorio humanizado (RSV) para el tratamiento de infección de RSV; y HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA) que es un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado para el tratamiento de cáncer de mama metastático. Otros ejemplos son anti-CD18 F(ab')2 humanizado (Genentech); CDP860 que es un anti-CD18 F(ab')2 humanizado (Celltech, UK); PRO542 que es un anticuerpo anti-HIV gp120 fusionado con CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); Ostavir que es un anticuerpo de virus anti-Hepatitis B humano (Protein Design Lab/Novartis); PROTOVIR™ que es un anticuerpo anti-CMV lgG1 humanizado (Protein Design Lab/Novartis); MAK-195 (SEGARD) que es un anti-TNF-a F(ab')2 de murino (Knoll Pharma/BASF); IC14 que es un anticuerpo anti-CD14 (ICOS Pharm); un anticuerpo lgG1 anti-VEGF humanizado (Genentech); OVAREX™ que es un anticuerpo anti-CA 125 de murino (Altarex); PANOREX™ que es un anticuerpo de antígeno de superficie celular lgG2a anti-17-?? de murino (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo IgG anti-idiotipo (GD3 epítope) de murino (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo anti-EGFR IgG quimérico (ImClone System); VITAXIN™ que es un anticuerpo anti-aV 3 integrina humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Campath 1 H/LDP-03 que es un anticuerpo lgG1 anti-CD52 humanizado (Leukosite); Smart M195 que es un anticuerpo anti-CD33 IgG humanizado (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que es un anticuerpo lgG1 anti-CD20 quimérico (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHÓCIDE™ que es un anticuerpo anti-CD22 IgG humanizado (Immunomedics); Smart ID10 que es un anticuerpo anti-HLA humanizado (Protein Design Lab); ONCOLYM™ (Lym-1) es un anticuerpo anti-HLA DIAGNOSTIC REAGENT de murino radiomarcado (Techniclone); ABX-IL8 es un anticuerpo anti-IL8 humano (Abgenix); anti-CD11a es un anticuerpo lgG1 humanizado (Genentech/Xoma); ICM3 es un anticuerpo anti-ICAM3 humanizado (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ es un anticuerpo anti-CD20 de murino radiomarcado (IDEC/Schering AG)¡ IDEC-131 es un anticuerpo anti-CD40L humanizado (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 es un anticuerpo anti-CD23 primatizado (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 es una IgG anti-CD3 humanizada (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo de factor 5 anti-complemento (C5) humanizado (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo anti-TNF-a humanizado (CAT/BASF); CDP870 es un fragmento Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo lgG1 anti-CD4 primatizado (IDEC Pharm/SmithKIine Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo IgG anti-CD4 humano (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 es un anticuerpo lgG4 anti-TNF-a humanizado (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo anti-a437 humanizado (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A es un anticuerpo IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech); ANTOVA™ es un anticuerpo IgG anti-CD40L humanizado (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan); MDX-33 es un anticuerpo anti-CD64 (FcvR) humano (Medarex/Centeon); SCH55700 es un anticuerpo lgG4 anti-IL-5 humanizado (Celltech/Schering); SB-240563 y SB-240683 son anticuerpos anti-IL-5 e IL-4 humanizados, respectivamente, (SmithKIine Beecham); rhuMab-E25 es un anticuerpo lgG1 anti-lgE humanizado (Genentech/Norvartis Tanox Biosystems); ABX-CBL es un anticuerpo IgM anti CD-147 de mURINo (Abgenix); BTI-322 es un anticuerpo IgG anti-CD2 de rata (Medimmune/Bio Transplant); Orthoclone/OKT3 es un anticuerpo lgG2a anti-CD3 de murino (ortho Biotech); SIMULECT™ es un anticuerpo lgG1 anti-CD25 quimérico (Novartis Pharm); LDP-01 es un anticuerpo IgG anti^-integrin humaNIZADO (LeukoSite); Anti-LFA-1 es un F(ab')2 anti-CD18 de murino (Pasteur-Merieux/lmmunotech); CAT-152 es un anticuerpo anti-TGF-32 humano (Cambridge Ab Tech); y Corsevin M es un anticuerpo anti-Factor VII quimérico (Centocor). Los reactivos inmunoreactivos antes listados, así como cualesquiera otros reactivos inmunoreactivos, pueden ser administrados de acuerdo con cualquier régimen conocido por los expertos en la técnica, incluyendo los regímenes recomendados por los proveedores de los reactivos inmunoreactivos. 1.2.1.5 Combinación con otros agente terapéuticos Además de agentes anticancerosos y anticuerpos terapéuticos, VTX-2337 de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes anti-angiogénicos (v.gr., en métodos para el tratamiento de tumores sólidos y para el tratamiento y prevención de metástasis) y agentes anti-hormonales (particularmente en método$ para el tratamiento de cánceres dependientes de hormona tales como cáncer de mama y cáncer de próstata).

En una modalidad, VTX-2337 de la invención se administra en combinación con uno o más agentes anti-angiogénicos. Dichos agentes incluyen, sin limitación, angiostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, Serpin (Serine Protease Inhibitor) anti-hrombina, 29 kDa N-terminal y fragmentos de fibronectina proteolíticos C-terminales de 40 kDac, fragmento proteolítico de fibrolactina de 16 kDa, fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor-4 de plaquetas, un péptido de 13 aminoácidos correspondiente a un fragmento de factor4- de plaquetas (Maione et al., 1990, Cáncer Res. 51 :2077-2083), un péotido de 14 aminoácidos correspondiente a un fragmento de colágeno I (Tolma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497-511), un péptido de 19 aminoácidos correspondiente a un fragmento de Thrombospondin I (Tolsma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497-511), un péptido de 20 aminoácidos correspondiente a un fragmento de SPARC (Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57:1329-1334), o cualesquiera fragmentos, miembros de familia o variantes de los mismos, incluyendo sales farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otros péptidos que inhiben angiogénesis y corresponden a fragmentos de laminina, fibronectina, procolágeno, y EGF también se han descrito {see, v.gr., Cao, 1998, Prog Mol Subcell Biol. 20:161-176). Los anticuerpos monoclonales y pentapéptidos cíclicos, que bloquean ciertas integrinas que se unen a proteínas RGD (es decir, poseen el motivo de péptido Arg-Gly-Asp), se ha demostrado que tienen actividades anti-vascularización (Brooks et al., 1994, Science 264:569-571 ; Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2:529-533). Más aún, la inhibición del receptor de activador deplasminógeno de uroquinasa por antagonistas de receptor inhibe la angiogénesis, crecimiento de tumor y metástasis (Min et al., 1996, Cáncer Res. 56: 2428-33; Crowley et al., 1993, Proc Nati Acad Sci. 90:5021-25).

En otra modalidad, VTX-2337 de la invención se usa en asociación con una modalidad de tratamiento hormonal. Dichas modalidades de tratamiento incluyen la administración de antagonistas hormonales (v.gr., flutamida, bicalutamida, tamoxifén, raloxifén, acetato de leuprólido (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inhibidores de biosíntesis y procesamiento de hormona, y esteroides (v.gr., dexametasona, retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, deshidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógeno, testosterona, progestinas), derivados de vitamina A (v.gr., ácido retinoico todo-trans (ATRA)); análogos de vitamina D3¡ antigestagenos (v.gr., mifepristona, onapristona), y antiandrógenos (v.gr., acetato de ciproterono).

En otra modalidad, VTX-2337 de la invención se usa en asociación con una modalidad de tratamiento que utiliza compuestos de polinucleótido, tales como polinucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas de interferencia de ARN, polinucleótidos de triple hélice y similares. 1.2.1.6 Combinación con agentes inmuno-reguladores En ciertas modalidades, VTX-2337de la invención se administra en combinación con un agente inmunoregulador. En algunas modalidades, el agonista de TLR benzo[b]azepina se formula con el agente inmunoregulador. Un "agente inmunoregulador" es una sustancia que suprime, enmascara, o mejora el sistema inmunológico del sujeto a quien es administrado. Los agentes ilustrativos son aquellos que suprimen la producción de citocina, sub-regulan o suprimen la expresión de auto-antígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de dichos agentes incluyen 2-amino-6-aril-5-pirimidinas sustituidas (véase, patente de E.U.A. No. 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si hay una reacción adversa a la azatioprina); bromocriptina; gíutaraldehído (que enmascara los antígenos de MHC, como se describe en la Pat. de E.U.A. No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos de MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteroides tales como glucocorticosteroides, v.gr., prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; citocina o antagonistas de receptor de citocina incluyendo anticuerpos anti-interferón-?, -ß, o -a; anticuerpos a nti-f actor-a de necrosis tumoral; anticuerpos anti-factor-ß de necrosis tumoral; anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos anti-IL-2 receptor; anticuerpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfocitos; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3; estreptocinasa; TGF-ß; estreptodornasa; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; y rapamicina. Ejemplos de citocinas incluyen, pero no son limitadas a linfocitocinas, monocinas, y hormonas tradicionales de polipéptido. Incluidas entre las citocinas son hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana de N-metionilo, y hormona de crecimiento de bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral-a; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervio tales como NGF-a; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantre (TGFs) tales como TGF-a y TGF-a; factor-I y -II de crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones; factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocitos-macrófago-CgP (GM-CSP); y granulocito+CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1 , IL-la, IL-2, 1 L-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1 I, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como es utilizado en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

En ciertas modalidades, los métodos incluyen además administrar al sujeto uno o más agentes inmunoreguladores, preferiblemente una citocina. Las citocinas preferidas son seleccionadas del grupo que consiste en interleucina-1 IL (IL-1 ),-2, IL-3, IL-12, IL-15, IL-18, G-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, y el interferón ?. 1.2.1.7 Combinación con compuestos para aumentar la función de monocitos o macrófagos En ciertas modalidades, un compuesto que incrementa la función de los monocitos o macrófagos {v.gr., por lo menos aproximadamente 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 9% o más) se puede usar junto con las formulaciones de agonista de TLR benzo[b]azepina de la invención. Dichos compuestos son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, citocinas tales como interleucinas {v.gr., IL-12), e interferones {v.gr., alfa o gamma interferón).

En ciertas modalidades, el compuesto que incrementa la función de monocitos o macrófagos es formulada con VTX-233 y por lo tanto se administra concurrentemente son VTX-2337.

En otras modalidades, el compuesto que incrementa la función de monocitos o macrófagos se administra por separado de VTX-2337 y se puede administrar concurrentemente (dentro de un período de horas uno de otro), durante el mismo curso de terapia, o secuencialmente con VTX-2337. En dichas modalidades, el compuesto que aumenta la función de monocitos o macrófagos es administrado preferiblemente a un sujeto humano. En una modalidad, el sujeto humano tiene un conteo en sangre de leucocito, monocito, neutrófilo, linfocito, y/o basófilo que está dentro del normal para humanos. Los intervalos normales para leucocitos de sangre humana (total) es aproximadamente 3.5-10.5 (109/L). Los intervalos normales para neutrófilos humanos es aproximadamente 1.7-7.0 (109/L), monocitos es aproximadamente 0.3-0.9 (109/L), linfocitos es aproximadamente 0.9-2.9 (109/L), basófilos es aproximadamente 0-0.3 (109/L), y eosinófilos es aproximadamente 0.05-0.5 (109/L). En otras modalidades, el sujeto humano tiene un conteo de leucocitos en la sangre que es menor que el intervalo normal para humanos, por ejemplo por lo menos aproximadamente 0.01 , 0.05, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 o 0.8 (109/L) leucocitos. 1.2.2 Cánceres objetivos El tipo de cáncer que es tratado por los métodos de la presente invención es un cáncer sólido tal como cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal o linfoma, o cualquier combinación de los mismos. Otros tipos de cánceres que pueden ser tratados por los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a sarcomas y carcinomas humanos, v.gr., fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, hepatoma, carcinoma de ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, v.gr., leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia); leucemia crónica (leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstróm, y enfermedad de cadena pesada. 1.3 Administración y dosificación VTX-2337 de la invención es preferiblemente formulada para inyección, muy preferiblemente administración subcutánea. En ciertas modalidades, VTX-2337 de la invención es formulada para administración por vía intradérmica, transdérmica, intravenosa o intramuscular.

Las formulaciones de la presente invención contienen una cantidad de VTX-2337 que es efectiva para el uso pretendido. Las dosis particulares también son seleccionadas con base en varios otros factores incluyendo la edad, el sexo, la especie y la condición del paciente. Las cantidades efectivas también pueden ser extrapoladas de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas in vitro o e modelos animales.

En ciertas modalidades, la dosis de VTX-2337 se mide en unidades de mg/kg de peso corporal. En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg/kg de peso corporal magro (es decir, peso corporal menos contenido de grasa corporal). En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg/m2 de área de superficie corporal. En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg por dosis administrada a un paciente. Cualquier medición de dosis puede ser utilizada en conjunto con las composiciones y métodos de la invención y las unidades de dosis pueden ser convertidas por medios estándar en la técnica.

Ejemplos de regímenes de dosis que pueden ser utilizados en los métodos de la invención incluyen, pero no son limitados a, diario, tres veces a la semana (intermitente), semanal, o cada 14 días. En ciertas modalidades, los regímenes de dosis incluyen, pero no se limitan a, dosificación mensual o dosificación cada 6-8 semanas. En una modalidad preferida, un agonista de formulación de TLR benzo[b]azepina de la presente invención se administra por inyección subcutánea cada semana o cada quince días en combinación con una modalidad de tratamiento adecuada para el tratamiento de cáncer en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano.

Dosis ilustrativas de VTX-2337 incluyen cantidades de miligramo por kilogramo del sujeto. En una modalidad, la dosis es de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal. En una modalidad específica, la dosis es aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto.

En ciertas modalidades de los métodos para tratar cáncer, VTX- 2337 se administra solo o en la terapia de combinación para tratamiento de cáncer al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto. En modalidades particulares, el agonista de TLR benzo[b]azepina se administra a una dosis de aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del sujeto. Én ciertas modalidades adicionales, VTX-2337 se administra al sujeto sobre una base semanal o quincenal. En modalidades específicas, una dosis diaria es por lo menos 0.05 mg, 0.50 mg, 1.0 mg, 5.0 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg o por lo menos 50 mg.

En algunas modalidades, la dosis para el agonista de TLR8 benzo[b]azepina (v.gr., VTX-2337) administrado solo o en la terapia de combinación para tratamiento de cáncer es entre 0.1-10 mg/m2 ( v.gr, 0.1-0.3 mg/m2, 0.1-3.9 mg/m2, 0.1-1 mg/m2, 0.1-2 mg/m2, 0.1-4 mg/m2, 2-4 mg/m2, 2.5-3.5 mg/m2, 2-6 mg/m2, 2-8 mg/m2). Éste incluye 0.1 mg/m2, 1 mg/m2, 2 mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 6 mg/m2, 7 mg/m2, 8 mg/m2 y puntos intermedios. Cabe notar que 2.5-3.5 mg/m2 corresponden a - 0.05-0.075 mg/kg si se supone que un área de superficie corporal de 1.5 m2 corresponde a un peso corporal de 70 kg. La frecuencia de administración es preferiblemente una vez cada 7 a 21 días (v.gr., una vez cada 7, 10, 14, 18, 21 días). En algunas modalidades, la frecuencia de administración es preferiblemente 1 , 2, o 3 veces cada 7 a 21 días (v.gr., una vez cada 7, 10, 14, 18, 21 días). El agonista de TLR benzo[b]azepina se puede dar hasta progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable. En algunas modalidades, 2-20 las dosis se dan (v.gr., 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 dosis). La vía de administración preferida es subcutánea.

En ciertas modalidades de los métodos para tratar cáncer, doxorubicina se administra sola o en la terapia de combinación de la invención al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto o no más de 50 mg/m2 del área de superficie corporal del sujeto.

Las dosis recomendadas para administración ¡ntradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, epidural o intravenosa están en el intervalo de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal por día. Las dosis adecuadas para administración tópica están en el intervalo de aproximadamente 0.001 miligramo a aproximadamente 50 miligramos, dependiendo del área de administración. Los expertos en la técnica apreciarán que las dosis son generalmente más altas y/o la frecuencia de administración mayor para el tratamiento inicial en comparación con regímenes de mantenimiento.

La doxorubicina es preferiblemente formulada parar inyección, muy preferiblemente administración intravenosa. En ciertas modalidades, la doxorubicina es formulada para administración por vía intradérmica, transdérmica, subcutánea o intramuscular.

En ciertas modalidades, la dosis de doxorubicina se mide en unidades de mg/kg de peso corporal. En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg/kg de peso corporal magro (es decir, peso corporal menos contenido de grasa corporal). En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg/m2 de área de superficie corporal. En otras modalidades, la dosis se mide en unidades de mg por dosis administrada a un paciente. Cualquier medición de dosis puede ser utilizada en conjunto con las composiciones y métodos de la invención y las unidades de dosis pueden ser convertidas por medios estándares en la técnica.

En ciertas modalidades, la doxorubicina se administra antes de, concurrentemente con o después de la administración de VTX-2337.

En ciertas modalidades de los métodos para tratar cáncer, doxorubicina se administra al sujeto a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto. 1.3.1 Regímenes ilustrativos para el tratamiento de cáncer En modalidades particulares, formulaciones de VTX-2337 de la invención se usan en combinación con un régimen de tratamiento existente para el tratamiento de cáncer en un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. De conformidad con esta modalidad, el agonista de formulación de TLR benzo[b]azepina se puede administrar antes de, después de, o concurrentemente con un agente(s) anticanceroso adecuado para el tratamiento de cáncer. Preferiblemente, la administración de VTX-2337 es coordinada con la dosis y tiempo del agente(s) anticanceroso dependiendo del tipo de cáncer, la historia y condición del sujeto, y el agente(s) anticanceroso particular de elección.

En una modalidad, el régimen comprende 5-fluorouracilo, cisplatin, docetaxel, HERCEPTIN®, gemcitabine, IL-2, paclitaxel, y/o VP-16 (etopósido) para el tratamiento de cáncer de mama. En otra modalidad, el régimen comprende paclitaxel, docetaxel, mitoxantrona, y/o un antagonista de receptor de andrógeno (v.gr., flutamida) para el tratamiento de cáncer de próstata. En otra modalidad, el régimen comprende fludarabine, citosina arabinósido, gemtuzumab (MYLOTARG), daunorubicina, metotrexato, vincristine, 6-mercaptopurina, idarubicina, mitoxantrona, etopósido, asparaginasa, prednisona y/o ciclofosfamida para el tratamiento de leucemia.

En una modalidad, el régimen comprende dexametasona para el tratamiento de mieloma. En una modalidad, el régimen comprende dacarbazina para el tratamiento de melanoma. En una modalidad, el régimen comprende irinotecan para el tratamiento de cáncer colorrectal. En una modalidad, el régimen comprende paclitaxel, docetaxel, etopósido y/o cisplatin para el tratamiento de cáncer de pulmón. En una modalidad, el régimen comprende ciclofosfamida, CHOP, etopósido, bleomicina, mitoxantrona y/o cisplatin para el tratamiento de -linfoma no Hodgkin. En una modalidad, el régimen comprende cisplatin para el tratamiento de cáncer gástrico. En una modalidad, el régimen comprende gemcitabine para el tratamiento de cáncer pancreático.

La duración de tratamiento con el agente anticanceroso puede variar de acuerdo con el agente terapéutico particular usado. En ciertas modalidades, la administración es discontinua, es decir, las dosis diarias son divididas en varias administraciones parciales. De conformidad con ciertas modalidades, el método de tratamiento comprende por lo menos un ciclo, preferiblemente más de un ciclo, durante el cual se administra un solo agente secuencio o secuencia de agentes terapéuticos. Un período de tiempo apropiado para un ciclo se puede determinar de acuerdo con métodos de rutina por el experto en la técnica, así como el número total de ciclos, y el intervalo entre ciclos.

En una modalidad específica, el régimen comprende gemcitabine a una dosis que varía de 100 a 1000 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende dacarbazina a una dosis que varía de 200 a 4000 mg/m2/ciclo. En una modalidad preferida, la dosis de dacarbazina varía de 700 a 1000 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende fludarabine a una dosis que varía de 25 a 50 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende citosina arabinósído (Ara-C) a una dosis que varía de 200 a 2000 mg/m2/c¡clo. En otra modalidad, el régimen comprende docetaxel a una dosis que varía de 1.5 a 7.5 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende paclitaxel a una dosis que varía de 5 a 15 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende cisplatin a una dosis que varía de 5 a 20 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende 5-fluorouracil a una dosis que varía de 5 a 20 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende doxorubicina a una dosis que varía de 2 a 8 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende epipodofilotoxina a una dosis que varía de 40 a 160 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende ciclofosfamida a una dosis que varía de 50 a 200 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende irinotecan a una dosis que varía de 50 a 75, 75 a 100, 100 a 125, o 125 a 150 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende vinblastine a una dosis que varía de 3.7 a 5.4, 5.5 a 7.4, 7.5 a 11 , o 11 a 18.5 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende vincristine a una dosis que varía de 0.7 a 1.4, o 1.5 a 2 mg/m2/ciclo. En otra modalidad más, el régimen comprende metotrexato a una dosis que varía de 3.3 a 5, 5 a 10, 10 a 100, o 100 a 1000 mg/m2/ciclo.

En una modalidad, el régimen abarca el uso de una dosis baja de un agente quimioterapéutico. De conformidad con esta modalidad, el tratamiento inicial de un sujeto con VTX-2337 de la invención incrementa la sensibilidad de un tumor a desafío subsiguiente con un agente anticanceroso. Por lo tanto, el agente anticanceroso se puede administrar al sujeto a una dosis que está cerca o debajo del intervalo inferior de dosis aceptables para ese agente administrado solo. En una modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de docetaxel a 6 a 60 mg/m2/día o menos. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de paclitaxel a 10 a 135 mg/m2/día o menos. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de fludarabine a 2.5 a 25 mg/m2/día o menos. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de citosina arabinósido (Ara-C) a 0.5 a 1.5 g/m2/día o menos. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de gemcitabine a de 10 a 100 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de cisplatin, v.gr., PLATINOL o PLATINOL-AQ (Bristol Myers), a una dosis que varía de 5 a 10, 10 a 20, 20 a 40, o 40 a 75 mg/m /ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de cisplatin que varía de 7.5 a 75 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de carboplatin, v.gr., PARAPLATIN (Bristol Myers), a una dosis que varía de 2 a 4, 4 a 8, 8 a 16, 16 a 35, o 35 a 75 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de docetaxel, v.gr., TAXOTERE (Rhone Poulenc Rorer) a una dosis que varía de 6 a 10, 10 a 30, o 30 a 60 mg/m2/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de paditaxel, v.gr., TAXOL (Bristol Myers Squibb), a una dosis que varía de 10 a 20, 20 a 40, 40 a 70, o 70 a 135 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de 5-fluorouracilo a una dosis que varía de 0.5 a 5 mg/kg/ciclo. En otra modalidad, el régimen comprende la administración subsiguiente de doxorubicina, v.gr., ADRIAMYCIN (Pharmacia & Upjohn), DOXIL (Alza), RUBEX (Bristol Myers Squibb), a una dosis que varía de 2 a 4, 4 a 8, 8 a 15, 15 a 30, o 30 a 60 mg/kg/ciclo.

Los programas de administración anteriormente descritos se proveen para propósitos ilustrativos únicamente y no deben considerarse limitantes. 1.4 Kits La presente invención provee un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenados con un líquido o liofilizado VTX-2337 y/o doxorubicina. En modalidades preferidas, la formulación líquida o liofilizada es estéril. En una modalidad, el kit comprende una formulación líquida o liofilizada de la invención, en uno o más contenedores, y uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer o una enfermedad infecciosa. Uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos pueden estar en el mismo contenedor como VTX- 2337 o en uno o más de otros contenedores. Preferiblemente, VTX 2337 es formulada a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, o de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, y la formulación es adecuada para inyección, preferiblemente inyección subcutánea. Preferiblemente, el kit contiene VTX-2337 en forma de dosis unitaria. Muy preferiblemente, la forma de dosis unitaria está en una forma adecuada para proveer una dosis unitaria de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg o aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto que ha de ser tratado.

En ciertas modalidades, el kit además comprende instrucciones para usarse en el tratamiento de cáncer (v.gr., usando las formulaciones líquidas de la invención solas o en combinación con otro agente profiláctico o terapéutico), así como efectos colaterales e información de dosis para una o más vías de administración. Opcionalmente asociado con tales contenedores está un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, tal aviso refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o la venta para administración humana.

Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente son incorporados en la presente como referencia como si cada una de tal publicación o documento estuviera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada en la presente como referencia. La cita de publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que cualquiera es técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o fecha de la misma.

La invención es definida además por referencia a los ejemplos siguientes, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que muchas modificaciones, tanto a los materiales como a los métodos, pueden ser puestas en práctica sin apartarse del propósito e interés de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Quimioterapia con agonista de TLR8 v Doxil activa potencialmente la respuesta inmunológica anti-tumoral humana en un modelo de ratón del sistema inmunológico humano Debido a diferencias entre los sistemas inmunológicos de ratón y humano, muchos de los efectos de los fármacos inmunomoduladores no pueden ser estudiados en forma completa en modelos de ratón singeneicos. Un modelo de ratón novedoso que tiene tumor con el sistema inmunológico humano (HIS) fue generado para estudiar interacciones entre quimioterapia y terapia inmunomoduladora. Los efectos individuales y las interacciones entre doxorubicina, un fármaco que induce muerte de células tumorales ¡nmunogénicas y activa las células presentadoras de antígeno, y VTX-2337, un agonista de TLR8, que induce activación potente y polarización de tipo 1 de DCs mieloides humanas se probaron y mostraron actividad reducida sobre leucocitos de murino. Ratones inactivados (knock out) para Nod/SCID/ILRDc (NSG) fueron inoculados con células de sangre del cordón CD34+ humanas de donadores humanos de HLA-A2+; trasplantadas s.c. con tumores de cáncer de ovario HLA-A2+ OVCAR5 humanos; y tratados con doxorubicina liposomal pegilada (Doxil o PLD); VTX-2337; o los dos agentes en combinación. Los ratones NSG-HIS presentaban un sistema hematopoyético humano completo, incluyendo monocitos humanos, macrófagos y DCs plasmacitoides y mieloides así como subconjuntos de células T. En ratones NSG-HIS, VTX-2337 indujo activación dependiente de la dosis de células CD14+ y CD1 1 c+ humanas in vivo dentro de 6 hr. La regulación ascendente dependiente de la dosis, transitoria, de citocinas Th1 humanas pero también IL-10 se observó en el plasma de ratones tratados con VTX-2337, alcanzando picos dentro de 6 hr y descendiendo dentro de 24 hr. Doxil solo también indujo activación ligera de CD1 1c+ DCs in vivo y regulación ascendente ligera de citocinas Th1. La combinación de dos fármacos indujo activación potente de CD1 1c+ DCs y monocitos, e incrementó marcadamente citocinas Th1 pero no IL-10. Tumores HLA-A2+ OVCAR5 fueron exitosamente injertados, presentando infiltración por leucocitos humanos. El tratamiento con VTX-2337 y Doxil independientemente indujo leucocitos humanos infiltrantes de tumor y restringió el crecimiento de xenoinjertos de tumor de ovario humano de una manera dependiente de la dosis, mientras la combinación de los dos fármacos indujo la frecuencia más alta de leucocitos humanos infiltrantes de tumor y restringió de manera potente el crecimiento de tumores de ovario. La activación combinada de inmunidad innata y adaptativa por VTX-2337 y Doxil, así como sensibilización de células tumorales por Doxil a mecanismos inmunoefectores adaptativos e innatos fue la base de las interacciones observadas que suprimen el crecimiento tumoral. Los NSG-HIS proveyeron una herramienta adecuada para establecer interacciones durante quimioterapia con agonista de TLR8 y Doxil, y los resultados garantizan las pruebas clínicas.

Materiales y Métodos Reactivos: Formulación de VTX-2337: 40 mg/mL de 2-amino-N,N-dipropil-8- (4-(pirrolidina-1 -carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina-4-carboxamida, que es formulada como un complejo de inclusión con 15% p/v Captisol® (éter sulfobutílico de ß-ciclodextrina) en 10 mM de regulador de pH de citrato (pH=6.5). La formulación fue diluida después con cloruro de sodio estéril al 0.9% a las concentraciones apropiadas antes de usarse.

PLD (es decir, Doxil, fabricado por Ben Venue Laboratories Inc Bedford OH 4414146) fue comprado de la farmacia del hospital de la Universidad de Pennsylvania.

Generación de ratones NSG-HIS: Todos los estudios con ratones in vivo fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Pennsylvania de conformidad con los lineamientos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Ratones NOD-sc d /L2r ""' (NSG) obtenidos de las instalaciones de xenoinjertos de la Universidad de Pennsylvania fueron previamente irradiados (250 Rads), seguido el día siguiente por inyección intravenosa (i.v.) de células de sangre de cordón humanas con células T agotadas que contenían 1-2x105 CD34+ (LONZA, 2C-101). Después de aproximadamente 3 meses, los niveles de injerto y reconstitución del sistema hematopoyético humano fueron verificados recolectando sangre y con tinción con hCD45 (BD Pharmingen, clone 2D1 cat# 557833 APC-CY7).

Medición de citocinas: En algunos experimentos, los NSG-HIS fueron inyectados subcutáneamente (s.c.) con 0.5 o 5 mg/kg VTX-2337 solo o en combinación con intraperitoneal (i.p.), PLD a la dosis máxima tolerada (MTD, 50 mg/m2). En otros experimentos, PBMC humanas fueron estimuladas in vitro con VTX-2337. En todos los experimentos, el plasma o los sobrenadantes de medio fueron recolectados 6 horas después de la administración de VTX-2337. Los niveles de citocinas inducidos por VTX-2337 o VTX-2337 más la administración de PLD se midieron tanto in vitro como in vivo por Rules Based Medicine (Austin, TX) usando una tecnología basada en Luminex que evalúa los niveles de 96 analitos humanos ya sea en muestras de sobrenadantes de cultivo o plasma recolectados de animales tratados.

Tratamiento de ratones NSG-HIS que tienen tumor OVCAR5: Células OVCAR5 se inyectaron s.c. (5x106 células) en ratones NSG-HIS a los que se injertó HLA-A2+ CD34+. En ratones de control no tratados, los tumores se desarrollaron progresivamente ocasionando muerte del animal dentro de 90 días del desafío con tumor. Los tumores se midieron dos veces por semana, y el volumen se calculó como sigue: (longitud x longitud) x (ancho)/2. Los ratones que tenían tumor fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento (n=8-1 O/grupo) cuando los volúmenes de tumor medios alcanzaron aproximadamente 50 mm3, o -30 días después de la implantación de células tumorales. Los grupos de tratamiento consistieron de un control de vehículo, PLD (50 mg/m2 i.p. dado cada dos semanas), VTX-2337 (0.5 mg/kg s.c. dado un día sí y un día no tres veces para cada ciclo), o la combinación de PLD y VTX-2337, con tratamiento con VTX-2337 empezando 5 días después de PLD. Los ciclos de tratamiento fueron de 14 días de duración y tres ciclos de tratamiento se administraron a cada grupo. Durante el curso de cada tratamiento, los grupos a los qué se dio PLD recibieron el fármaco de quimioterapia el día 1 , mientras que los grupos que recibieron VTX-2337 solo o en combinación con PLD recibieron VTX-2337 los días 5, 7 y 9 del ciclo.

Citometría de flujo: Para análisis de citometría de flujo de leucocitos, los tumores, médula ósea o bazose trituraron y se colocaron en cajas de Petri de 6 cm, se transfirieron en tubos de 15 mi, y se incubaron durante 2 hr en una solución que contenía 2 mg/ml de colagenasa (Sigma #C9407) y ADNasa (Sigma #D5025-15KO) en RPMI (Cellgro #1640CV) bajo rotación continua. La suspensión se hizo pasar a través de un colador de células de 70-pm usando un émbolo de jeringa, se lavó, se centrifugó, y la pastilla se resuspendió en PBS, 2% FBS (GIBCO # 10437). Después de la disociación, 3-5x106 células se tiñeron con 0.5 Mg/ml de Ab durante 30 min. a 4°C, se lavaron y se analizaron por citometría de flujo FACS-Canto (BD Pharmingen). Las células se tiñeron usando hCD45 humana (BD Pharmingen clon 2D1 catálogo# 557833 APC-CY7), hCD3 (Biolegend clon UCHT1 #300429 PerCP/Cy5.5), hCD4 (BD Pharmingen clon RPA-T4 #555349 APC), hCD8 (eBioscience clon RPA-T8 #1 1-0088 FITC), hCD1 1 b (BD Pharmingen clon ICRF44 #555388 PE ), hCD1 1 c (Biolegend, clon 3.9 #301608 Pe-Cy7), hCD123 (BD Pharmingen clon 7G3 #558714 PerCP-Cy5.5), hCD14 (eBioscience clon 61 D3 #25-0149 PE-Cy7), hCD40 (eBioscience clon 5C3 #1 1-0409 FITC) hCD80 (Biolegend clon 2D10 #305216 AF647) y hCD86 [BD Pharmingen clon 2331 (FUN-1 ) #555658 PE].

Expansión de células T in vitro, selección de reactividad v estudio de transferencia adoptivo: Los leucocitos de infiltración de tumor (TlLs) fueron inicialmente expandidos de fragmentos de tumores de diferentes grupos de tratamiento colocados en cultivo con una alta concentración de interleucina 2 humana recombinante (rhlL-2, 600 lU/ml) como se reporta en otra parte (véase, v.gr., Dudley, M.E., et al. 2003. J Immunother 26:332-342 y Riddell, S.R., y Greenberg, P.D. 1990. J Immunol Methods 128:189-201). En resumen, fragmentos de tumores (~2x2 mm) de diferentes grupos de tratamiento se colocaron en medio AIMV (GIBCO#12055) complementado con 5% de suero humano (Valley Biomedical Inc #1017) y 600 I.U./ml de hlL-2 (PeproTech #AF-200-02). La mitad del medio fue reemplazada cada 3 días hasta que se logró el crecimiento exponencial; después los cultivos se dividieron según era necesario para mantener la concentración celular dentro de un intervalo de ~5x105-1x106 células por mL. Una vez que se obtuvo un número suficiente de células, todos los cultivos se evaluaron para reactividad de OVCAR5 in vitro. TlLs reactivos específicos de OVCAR5 después se expandieron usando técnicas que habían sido descritas anteriormente (véase, v.gr., Dudley, M.E., et al. 2003. J Immunother 26:332-342). En resumen, 2 ? 108 células alimentadoras irradiadas, alogeneicas (PBMC humanas con HLA-A2+) se combinaron con 30 pg/mL de anticuerpo OKT3 (eBioscience clon OKT3 #16-0037-85), 600 lU/mL rhlL-2 (PeproTech #AF-200-02), y 1 ? 106 TIL, se mezclaron, y se pusieron en alícuotas en matraces de cultivo de tejido de 175 cm2. Los matraces se incubaron directamente a 37 °C en 5% de CO2. El día 5, la mitad del medio fue reemplazada por una mezcla 1 :1 de AIM V que contenía 600 lU/mL de rhlL-2. El medio se añadió a estos matraces según era necesario para mantener la densidad de las células a alrededor de 0.5-1 x 106 células/mL. Cada pozo inicial se consideró que era un cultivo de TIL independiente y se mantuvo por separado de los otros. En el estudio de transferencia adoptivo, ratones NSG a los que se injertó CD34+ no humano se desafiaron s.c. con 5 ? 106 células OVCAR5 30 a 40 días después de inyección intravenosa (i.v.) de 1x107 células T expandidas.

Liberación de citocina y pruebas citotóxicas: La actividad y especificidad de TIL se determinaron por análisis de secreción de citocina y CTL directo. Para la prueba de interferón-? (IFNy), TIL y líneas de células T de control se lavaron dos veces antes de la prueba de co-cultivo para remover rhlL-2. 1 ? 105 TILs y 1 ? 105 células estimuladoras se colocaron en cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos. LCultivos de TIL fueron estimulados generalmente con OVCAR5 y dos líneas de células tumorales de melanoma HLA-A2+ de control (526mel y 624mel). En algunos pozos, para asegurar la actividad dependiente de MHC, las células objetivo fueron tratadas previamente con anticuerpo neutralizante anti-HLA A, B, y C (eBioscience clon w6/32 #16-9983-85). Después del co-cultivo durante la noche, los sobrenadantes se cosecharon y la secreción de IFNy fue cuantificada por ELISA (Biolegend #430102). En la prueba de CTL, OVCAR5 fueron pulsados con cromo-55, y diferentes relaciones de "NLobjetivo se colocaron en placas de 96 pozos y se incubaron durante 4 hr. En algunos pozos, OVCAR5 fueron previamente incubados con anticuerpo neutralizante anti HLA-A, B y C. Después de la incubación, 30 µ? de medio de los co-cultivos se aplicaron como manchas sobre Lumaplate y se dejaron secar durante la noche. La radioactividad fue detectado por contador de escintilación de líquidos Wallac 1450 Microbeta Plus.

Viabilidad de células Anexina V/7AAD: Para detectar apoptosis, las células tumorales se tiñeron con anexina V/7AAD (BD Pharmingen #559763). Las células apoptóticas se analizaron por citometría de flujo de conformidad con el protocolo del fabricante. En resumen, células OVCAR5 que crecieron y se sometieron a diferentes tratamientos se recolectaron y se comprimieron en pastillas a 1200 rpm y después se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se re-suspendieron en un regulador de pH de unión (Pharmingen #51-66121 E) a una concentración de 1 ? 106 células/mL; 100 pL de la solución (1 ? 105 células) se transfirieron a cada uno de dos tubos de cultivo de 5 mL. Cinco pL de anexina V-PE (Pharmingen #51-65875Y) se añadieron a cada 100 pL de solución, se sometieron a acción de remolino suavemente, se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, se lavaron con PBS, se incubaron con 5 pL de 7AAD (BD Pharmingen #51 -68981 E) durante 10 minutos, y se analizaron por FACS dentro de 1 hr.

Extracción de proteína v análisis de Western blott: Proteína celular total se extrajo sobre hielo durante 30 min en un regulador de pH de lisis [Reactivo de Extracción de Proteína de Mamífero M-PER #78501 ThermoScientific]. 50 pg de proteína de cada muestra fue después desnaturalizada en 2X de regulador de pH de carga a 100°C durante 5 min, separada en gel de electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), y transferida a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron después en 5% de leche descremada durante 2 hr a temperatura ambiente y después se incubaron con el primer anticuerpo (Cell Signalíng #3210 conejo) durante la noche a 4°C. Las membranas se lavaron después con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) 0.5% de Tween 20 (Sigma) tres veces y se incubaron con el anticuerpo secundario (BioRad 172-1019) durante 2 hr a temperatura ambiente. Las bandas de proteína se visualizaron usando ECL (Amersham #RPN2132) con X-películas (Bioexpress # F-9023).

Agonista de TLR8 que activa mecanismos de efector anti-tumor en PBMC humanas in vitro VX-2337 es un agonista de TLR8 selectivo y potente que activa de manera efectiva tanto mDC humanas como monocitos. Su actividad está restringida principalmente a estas poblaciones, y otras poblaciones de leucocitos humanos no son activadas directamente, aunque la activación indirecta puede asegurar la activación de monocitos y DC. Para probar los efectos globales de activación por TLR8 sobre leucocitos humanos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios humanos normales (n=6) se incubaron con VTX-2337 en un amplio intervalo de concentración durante 24 horas. Los niveles elevados de TNFa, I FNY e IL-12p70 fueron inducidos en respuesta a la activación de TLR8 por VTX-2337, de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, una caract5erística única de activación por TLR8 de PBMC es la inducción de mediadores de efectores que se sabe que juegan un papel crítico en respuesta inmunológica a cáncer mediada por células. Como resultado, los agonistas de TLR8 son útiles para inmunoterapia humana.

Agonista de TLR8 que activas de manera potente APCs humanas e impulsa la activación inmunológica de Th1 in vivo en ratones NSG-HIS La actividad de VTX-2337 se evaluó en un modelo de murino novedoso en donde ratones NSG son reconstituidos con células de sangre de cordón CD34+ humanas. Una vez que las células madre hematopoyéticas humanas reconstituyen la médula ósea y empieza la hematopoyesis, los animales muestran dentro de tres a cuatro meses una reconstitución completa del sistema unmunológico humano, incluyendo células B, CD3, CD4, CD8, NK, mDC, pDC y monocitos. Debido a los efectos inmunoestimulantes vistos en PBMCs humanas por estimulación por VTX-2337, se esperaba que los ratones NSG-HIS respondieran altamente a VTX-2337. De hecho, la administración de VTX-2337 a estos ratones replicó los efectos inmunoestimulantes ya demostrados en PBMC humanas con un incremento dependiente de la dosis en expresión de superficie de moléculas coestimulantes múltiples, incluyendo CD83, CD86 y MHC clase II sobre monocitos CD1 1c, mDCs y CD123 pDCs de CD14+ humanos injertados. También se demostraron niveles de sangre incrementados de citocinas humanas, que se sabe que son importantes en la respuesta inmunológica a tumores y ya asociadas con la activación por TLR8. Éstas incluyen IFNy, TNFa y IL-12p40.

La estructura de la proteína TLR8 proteína varía a través de las especies, y aunque VTX-2337 tiene actividad en ratones, la molécula fue optimizada para potencia y selectivamente contra TLR8 humana.

Debido a la selectividad de VTX-2337 para TLR8 humana, NSG-HIS se escogió como un modelo de ratón hospedero reconstituido con sistema hematopoyético humano, para estudiar los efectos de VTX-2337 sobre leucocitos humanos in vivo. Un alto nivel de injerto de células hematolinfoides humanas se vio en ratones NSG-HIS 14 a 22 semanas después de la transferencia de células CD34+ de sangre de cordón humanas administradas por vía IV a ratones NSG a 6 semanas de edad, como se evalúa por cuantificación de (h)CD45 humana en varios compartimientos (figura 1A); células hCD45+ representaron 35-75% del total de células en la sangre, 40-68% del total de células en el bazo, y 40-70% del total de células en la médula ósea.

Para demostrar la actividad def VTX-2337 in vivo, VTX-2337 se administró a 0.5 ó 5 mg/kg s.c. para reconstituir completamente ratones NSG-HIS semanas después del trasplante. Las células del bazo se recolectaron seis horas más tarde para evaluar los niveles de marcadores de activación. Los ratones tratados ya sea con 0.5 o 5 mg/kg VTX-2337 demostraron un incremento marcado en CD83, CD86 así como expresión de MHC clase II en monocitos (CD45+CD14+), DC mieloides (mDC, CD45+CD1 1c+) y DC plasmacitoides (pDC, CD45+CD123+) en comparación con ratones de control no tratados (figura 1 B).

El perfil de citocina humana se examinó en plasma de ratón después de una sola administración s.c. de VTX-2337 (0.5 ó 5 mg/kg) usando una prueba basada en Luminex (figura 1C). Un incremento dependiente de la dosis en la concentración de citocinas polarizantes de Th1 incluyendo IFNy, TNFa e IL-12p40 se vio a las seis horas. Un incremento significativo de los niveles de IL-10 en el plasma también se detectó en animales tratados con VTX-2337 en comparación con los controles. Por lo tanto, la activación directa inducida por VTX-2337 del compartimiento de monocitos/DC humanos y una activación de Th1 potente subsiguiente del sistema inmunológico humano in vivo, aunque la producción de IL-10 incrementada también se vio.

La activación de TLR8 después de PLD produce respuesta de citocina de Th1 Un programa de administración "en fase" se probó, en donde por PLD a dosis máxima tolerada (MTD, 50 mg/m2, i.p.) se administró primero a ratones NSG de 20-28 semanas de edad con hCD34+ injertadas, para infligir daño a células tumorales y liberación de antígeno inmunogénico; VTX-2337 (0.5 mg/kg) se administró cinco días más tarde, para activar APCs. Los niveles de citocinas múltiples se midieron en el plasma 6 horas después de inyección de VTX-2337. NSG-HIS no tratados presentaron interferón gamma no detectable (IFNy) en el plasma. De manera similar, el tratamiento con PLD solo no indujo ningún IFNy; sin embargo, la combinación de VTX-2337 y PLD (figura 2) indujo niveles significativos de IFNy, que fueron similares a aquellos inducidos por VTX-2337 solo (figura 1C). Además, el tratamiento de combinación con VTX-2337 y PLD indujo regulación ascendente de TNFa sobre los controles no tratados, que fue similar ya sea a PLD o VTX-2337 solos. Por lo tanto, la administración después de PLD permitió que VTX-2337 indujera una respuesta de Th1. De manera importante, aunque PLD así como VTX-2337 indujo regulación ascendente de IL-10 cuando se dio sola (figura 2), este efecto fue atenuado combinando los dos fármacos (figura 2). En general, estos datos indican que un intervalo de 5 días entre la administración de PLD y VTX-2337 mantuvieron el perfil de citocina de Th1 inducido por VTX+2337 y además, redujeron los niveles de IL-10. Por lo tanto, esta combinación indujo una respuesta de citocina óptima. La administración simultánea de PLD y VTX-2337 produjo interacciones negativas, ya que suprimió la respuesta de IFNy.

Un incremento de los niveles en el plasma de TNFa e IL-10 demostró que el tratamiento de ratones NSG-HIS con PLD indujo activación inmunológica. Esta activación inmunológica es consistente con doxorubicina que induce "muerte celular antigénica" tanto en células normales como tumorales, y soporta que la activación de TLR8 por VTX-2337 incrementa la respuesta anti-tumoral. La administración de VTX-2337 y PLD® dio por resultado una reducción en los niveles en el plasma del mediador anti-inflamatorio IL-10 e incrementó los niveles de IFNy y TNFa.

Activación de TLR8 que incrementa la actividad antitumoral de PLD in vivo Esta combinación de MTD PLD y VTX-2337 a 0.5 mg/kg, una dosis en ratones comparable con la que está siendo evaluada en estudios oncológicos clínicos, se usó subsiguientemente para tratar ratones NSG-HIS que tenían tumor. El régimen de tratamiento se diseñó para sacar ventaja de las actividades farmacodinámicas de PLD y VTX-2337, usando múltiples ciclos de tratamiento de 14 días. A ratones NSG-HIS que tenían tumor se les dio inicialmente PLD para inducir muerte celular del tumor. Esto fue seguido 5 días más tarde por múltiples tratamientos con VTX-2337 para activar células depuradoras inmunes, incluyendo mDC, monocitos y macrófagos que removían células tumorales moribundas. Como se esperaba, PLD en el MTD dio por resultado una reducción significativa en la tasa de crecimiento de tumor en relación con el control de vehículo, mientras que un pequeño efecto en la tasa de crecimiento del tumor se vio con VTX 2337 sola. La combinación de los dos agentes produjo una disminución marcada en la tasa de crecimiento del tumor sobre PLD solo en tres ciclos de tratamiento de 14 días.

En el curso del estudio del efecto de combinar PLD con VTX-2337 sobre cáncer de ovario humano, ratones NSG-HIS-A2 a los que se injertó hCD34 fueron inoculados con línea de célula de cáncer de ovario humanas OVCAR5 (5x106) que concordaban con HLA-A2+. Una vez que los tumores se establecieron bien, los grupos de ratones (n=8-9/grupo) se trataron ya sea con vehículo, Doxil solo, VTX-2337 solo o la combinación de VTX-2337 y Doxil. De manera interesante, a pesar de los efectos inmunomoduladores de VTX-2337, ratones tratados con el agonista de TLR8 solo presentaron crecimiento de tumor similar que los ratones de control no tratados. Como se esperaba, los ratones tratados con PLD a MTD (50 mg/m2, i.p.) mostraron crecimiento tumoral reducido en relación con los ratones de control no tratados. De manera importante, hubo una interacción positiva fuerte entre los dos fármacos; el efecto de PLD fue incrementado significativamente por la combinación con VTX-2337 (P=0.04) (figura 3B), que suprimió casi por completo el crecimiento tumoral.

Durante el paso de caracterizar adicionalmente esta interacción de fármaco, los tumores fueron recolectados de cada grupo de tratamiento al final del estudio y fueron evaluados para infiltración de leucocitos por inmunohistoquímica y citometría de flujo. Relativamente pocas células CD45+ humanas estaban presentes en tumores del grupo de control (figura 3C), mientras que todos los tratamientos produjeron infiltración de CD45+ incrementada. Los tumores de ratones tratados con la combinación de PLD y VTX-2337 mostraron el mayor incremento en células CD45+ infiltrantes humanas en relación ya sea con PLD o VTX-2337 solo (figura 3C). La citometría de flujo se usó para caracterizar adicionalmente la composición y estado de maduración de poblaciones de leucocitos humanos que infiltran tumores en los diferentes grupos. PLD solo no indujo cambios significativos en linfocitos infiltrantes de tumor sobre la línea basal. De manera interesante, el agonista de TLR8 indujo un incremento significativo en células CD3+ T totales, en el por ciento de células CD8+ T, así como en el por ciento de células CD69+ (activadas) CD3+CD8+ T. La combinación de PLD y agonista de TLR8 indujo cambios similares. Además, se encontró un incremento en macrófagos CD40+ (activados) infiltrantes de tumor (CD45+CD11 b+), pDC (CD45+CD123+), y mDC (CD45+CD11c+) en ratones tratados con VTX-2337, PLD solo o su combinación (figura 3D). De manera interesante, hubo un incremento relativo en la relación de macrófagos infiltrantes de tumor a pDC y relación de mDC a pDC en ratones tratados con la combinación en relación con cada fármaco solo.

Activación de TLR8 que promueve el desarrollo de CTLs específicas de tumor después de PLD Los resultados anteriores indican una fuerte interacción positiva entre PLD y VTX-2337 contra tumores. El rechazo mediado por células CD8+ T es un componente crítico de respuesta inmunológica antitumoral y podría ser uno de los mecanismos que median la interacción anterior. De manera importante, la combinación de VTX-2337 más PLD produjo supresión de tumor efectiva.

Durante el curso de investigar esta interacción, la calidad del infiltrado de células T se analizó en respuesta a PLD, VTX-2337 o su combinación. TlLs de tumores recolectados de ratones NSG-HIS-A2 tratados ya sea con cualquier fármaco solo, combinación de PLD y VTX*2337 o control/vehículo se aislaron y se expandieron usando rhlL-2 (600 lU/mL). Las células T se aislaron de bazos de ratones NSG-HIS-A2 que no contenían tumor como controles.

Los TlLs expandidos ex vivo fueron transferidos adoptivamente (los días 30 y 40 después de inoculación de tumor) en ratones NSG que tenían tumores OVCAR5. TlLs aislados ya sea de los controles de vehículo o donadores tratados con PLD, así como células T de bazos de ratones que no tenían tumor, adoptivamente transferidas a receptores que tenían tumor, no controlaron el crecimiento tumoral en ratones receptores (figura 4B). Sin embargo, TlLs de ratones tratados con la combinación de PLD y VTX-2337 ("PLDA TX-2337" o "VTX-2337/Doxil") fueron capaces de controlar de manera efectiva el crecimiento de tumores OVCAR5 en ratones receptores (figura 4B). Estos resultados confirman que in vivo, PLD y agonista de TLR8 en combinación producen una respuesta inmunológica anti-tumor de células T efectiva.

Los TlLs se probaron para presencia de CTL específico de tumor in vitro. TIL de ratones donadores tratados con la combinación de PLD y VTX-2337 lisaron de manera efectiva células objetivo OVCAR5 marcadas con 51 Cr (figura 4A), mientras que TlLs de ratones donadores tratados con PLD solo tuvieron menos actividad ítica. Su capacidad para lisar células objetivo fue considerablemente mayor que TlLs del grupo tratado con control/vehículo. En todos los grupos de tratamiento, la lisis de células objetivo por TIL se atribuyó a CTL que respondió a antígenos restringidos por MHC-I, como la adición de anticuerpo neutralizante anti-MHC clase I o redujo la muerte por el CTL (figura 4C). TIL se co-cultivaron ya sea con células OVCAR5 o una línea de células de melanoma. Los TlLs de donadores tratados tanto con PLD como con PLD/VTX-2337 liberaron considerablemente más IFNy en respuesta a células OVCAR5 que las células de melanoma (figura 4D). TIL de ratones de control no tratados produjo IFNy específico mínimo en respuesta a estimulación de OVCAR5. Los linfocitos expandidos de los bazos de ratones que no tenían tumor no mostraron actividad citolítica o producción de IFNy en respuesta a células OVCAR5.

CTLs (células T citotóxicas o linfocitos citotóxicos) de ratones tratados con PLDA TX-2337 tuvieron un nivel mucho más alto de actividad citotóxica que aquellos de ratones tratados con PLD solo, confirmando que la activación de TLR8 de APCs incrementa el desarrollo de células T específicas anti-tumor. La actividad de CTL fue restringida por MHC clase I y específica para OVCAR5, como se demuestra por la adición de mAb a MHC clase I y la falta de actividad hacia células objetivo HLA-A2* irrelevantes. Usando experimentos de transferencia adoptiva, se demostró que el incremento en la actividad de CTL específica de tumor que resultó del tratamiento con PLD/VTX-2337 confirió actividad anti-tumoral ¡n vivo. En ratones NSG que tenían tumor no reconstituidos adoptivamente transferidos con 1x107 células T el día 30 y 40 días después del desafío con OVCAR5, las células infiltrantes de tumor expandidas de ratones a los que se administró VTX-2337/PLD®fueron capaces de controlar de manera efectiva el crecimiento tumoral. De manera interesante, células derivadas de los tumores de ratones tratados con PLD® solo no fueron más efectivas que las células de ratones tratados de control.

Los resultados además demuestran que la activación de APC por VTX-2337 incrementa el desarrollo de respuestas inmunológicas adaptativas inducidas por antraciclinas. Aunque el desarrollo de CTL específico de tumor es un componente importante del efecto terapéutico de VTX-2337 cuando se da con PLD, la liberación de mediadores con actividad anti-tumoral puede ser complementaria. La liberación de altos niveles de IFNy puede activar células NK, incrementando la lisis de células tumorales. La liberación de IL-12 por VTX-2337 también tiene implicaciones importantes en el desarrollo de una respuesta inmunológica exitosa a tumores. Se reporta que este mediador activa la células NK, potencia las vías anti-angiogénicas, y aumenta las respuestas de Th1 y CTL, y también tiene actividad anti-tumor directa que es incrementada por TNFa. Por lo tanto, los mediadores inducidos por la activación selectiva de TLR8 por VTX-2337 fueron evaluados por actividad directa sobre células de tumor OVCAR5.

Mediación de TNFa en parte de la interacción entre activación de TLR8 y PLD Se realizaron experimentos para demostrar que TNFa es responsable de la actividad antitumoral incrementada vista con la combinación de Doxil/VTX-2337. PBMCs humanas elutriadas frescas fueron activadas ya sea con VTX-2337 (1 ug/ml) o esferas anti CD3/28 y el medio fuer recolectado después de 6 horas. Células OVCAR5 fueron expuestas al medio de cultivo y una evaluación de apoptosis se condujo a las 24 horas, mientras que la viabilidad de las células se evaluó a 48 horas.

Además de los CTLs específicos de tumor, la activación de TLR8 también puede invocar respuestas anti-tumorales innatas, incluyendo la liberación de mediadores solubles tales como miembros de la familia de TNF, que pueden actuar directamente sobre células tumorales para inducir apoptosis. Puesto que la activación de TLR8 está asociada con la producción de altos niveles de TNFa, como se muestra en las figuras 1A-1C, TNFa es un posible mediador de los efectos de VTX-2337. La expresión del receptor 1 de TNFa (TNFR1) en células 0VCAR5 se probó y fue documentada por Western blot (figura 5C). Durante la prueba de sensibilidad de células OVCAR5 a TNFa, las células se incubaron durante 24 horas con 20 ng/ml de TNFa, una dosis que ejerce efectos citotóxicos directos. A pesar de expresar TNFR1 , las células OVCAR5 fueron resistentes a apoptosis mediada por TNFa, como se mide por tinción de anexina-V y 7AAD (figura 5D).

Las células tumorales pueden resistir apoptosis mediada por TNFa a través de la sobreexpresión de proteína inhibidora de tipo enzima convertidora de IL-1 h de tipo FADD (FLICE), o FLIP. FLIP, que puede existir en una forma larga (FLIPL, 55 KDa) y una forma corta (FLIPS, 28 KDa), puede bloquear la apoptosis inducida por miembros de la familia TNFa incluyendo TNFa y TRAIL en diferentes tipos de células. La células OVCAR5 expresaron FLIPL, la forma de 55 Kd de FLIP (figura 5E, franja de CTRL: células no tratadas de control).

Puesto que la doxorubicina desencadena muerte celular y su actividad in vivo es incrementada por VTX-2337, se ha probado que la doxorubicina hace a las células OVCAR5 más sensibles a apoptosis inducida por TNFa. Las células OVCAR5 fueron pre-incubadas ya sea con medio de control o medio que contiene PLD a 1 pg/mL durante 24 hr, entonces se incubaron ya sea con medio de control o medio que contenía TNFa (20 ng/ml) durante 12 hr. TNFa y Doxil solos indujeron apoptosis mínima, aunque un incremento significativo en apoptosis se detectó cuando las células se trataron con la combinación de estos dos agentes (figura 5D). Se encontró que el tratamiento de células OVCAR5 con PLD inhibe la expresión de FLIP, mostrada por Western blot (figura 5E).

TNFa fue marcadamente regulada ascendentemente in vivo por VTX-2337 o tratamiento de combinación como se muestra en la figura 1 C y la figura 2. La activación de la familia de receptores de TNFa sobre células tumorales puede conducir a la activación de caspasa 8, dando por resultado apoptosis. Se encontró que las células OVCAR5 expresaron el receptor 1 de TNFa, pero fueron casi completamente resistentes a TNFa solo. Sin embargo, un incremento en apoptosis fue detectado cuando las células OVCAR5 se trataron con agentes de combinación en comparación con agentes individuales. La doxorubicina mata células por intercalación en ADN, que altera la replicación del ADN, inhibe la traducción conduciendo a biosíntesis macromolecular alterada, y daña al ADN a través de la producción de ROS. También se demostró la inhibición de expresión de FLIP por células OVCAR5 que fueron pretratadas con PLD, lo que sugiere que la alteración de nueva síntesis de proteína haga a estas células tumorales más sensibles a la apoptosis mediada por miembros de la familia de TNF.

En resumen, la muerte de células tumorales mediada por doxorubicina no es inmunológicamente silenciosa, sino que es mediada por activación del sistema inmunológico y el desarrollo de una respuesta inmunológica adaptativa que participa en control de células tumorales. Sin embargo, la actividad de doxorubicina también puede alterar el desarrollo de una respuesta inmunológica protectiva debido a toxicidad del sistema ¡nmunológico. Inesperadamente, se encontró que la adición del agonista de TLR8 VTX-2337 en el régimen de tratamiento incrementa los efectos anti-tumorales de PLD® en un modelo de murino de cáncer de ovario novedoso usando ratones NSG-HIS que tenían tumor. Se encontró que el tratamiento con VTX-2337 incrementó la migración de células inmunes en tumores e incrementó el desarrollo de CTLs específicos de tumor que fueron capaces de lisar células OVCAR5 in vitro y controlar el crecimiento de tumor in vivo. La activación de TLR8 también conduce a la liberación de múltiples mediadores incluyendo TNFa, IL-12 y IFNy que tienen actividades anti-tumórales y además pueden incrementar la respuesta anti-tumoral. Los altos niveles de TNFa que resultan de la activación de TLR8 pueden actuar directamente sobre células OVCAR5 para inducir apoptosis, mientras que las células se hacen más sensibles a esta vía apoptótica debido a los efectos de doxorubicina sobre la síntesis de proteína. En forma colectiva, estos resultados demuestran que la inmunoterapia puede incrementar la efectividad de tratamientos de cáncer actuales en cáncer de ovario. Un estudio de VTX-2337 en combinación con PLD® como tratamiento de segunda línea para pacientes con cáncer de ovario recurrente avanzado esta en curso.

EJEMPLO 2 Potencia v selectividad de VTX-2337 La concentración efectiva media-máxima (EC50) para la activación por VTX-2337 de TLR8 y TLR7 se evaluó en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de 15 donadores sanos y también en células HEK293 transfectadas con TLR8 o TLR7 y un gen reportero impulsado por NF-??. Como se muestra en la figura 6, en PBMCs, VTX-2337 estimuló la producción de TNFa , un marcador de activación de TLR8 con una EC50 de 74 nM y la producción de IFNa, un marcador de activación de TLR7, con una EC50 >3,333 nM, que indica que VTX-2337 es > 45 veces más selectiva para TLR8 en relación con TLR7. Los datos de los transfectantes TLR7 y TLR8 HEK293 se correlacionaron estrechamente con los datos obtenidos usando las PBMCs con EC50s de 70 nM para TLR8 y 2,005 nM para TLR7. También se observó que VTX-2337 no tuvo actividad sobre TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6 o TLR9 a concentraciones de hasta 25 µ?.

EJEMPLO 3 VTX-2337 que estimula una gama de citocinas y quimiocinas en sangre entera humana Las propiedades inmunoestimuladoras de VTX-2337 se caracterizaron usando el panel de analito múltiple humano (MAP), versión 1.8 (Rules Based Medicine), a niveles cuantitativos de 98 diferentes analitos asociados con procesos inflamatorios incluyendo citocinas, quimiocinas, y otras proteínas hechas por leukocitos en respuesta a activación de TLR7/8. Se recolectó sangre entera de 6 voluntarios humanos normales y se activó in vitro con concentraciones de VTX-2337 de 0.1 , 0.3, 1.0 y 3.0 µ? usando el Sistema de Cultivo de Leucocitos Instanáneo. El co-cultivo con VTX-2337 dio por resultado incrementos dependientes de la dosis en un número de inmunomediadores incluyendo TNFa, IL-12p40, IL-? ß, y ???-1 ß, as como se muestra en la figura 7.

EJEMPLO 4 Activación por VTX-2337 de monocitos y células dendríticas mieloides (mDCs) pero no de células dendríticas plasmacitoides (pDCs) Para evaluar la especificidad celular de VTX-2337, PBMCs humanas de donadores sanos fueron estimuladas con 0.8 µ? de VTX-2337 y la producción intracelular de citocinas en subconjuntos de células específicas presentes en PBMCs se evaluaron por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 8, los datos se expresan como porcentajes de células positivos para IL-12, TNFa, y IFNa en monocitos (CD14+), pDC (CD123+), y mDC (CD11c+). Cada punto de datos representa la respuesta de un donador individual (n=10). La barra horizontal representa la media del grupo. Los niveles intracelulares de IL-12 y TNFa se evaluaron en monocitos tratados con VTX-2337 y mDCs, pero no pDCs, consistentes con el patrón de expresión celular de TLR8.

EJEMPLO 5 Estudio clínico de fase I de VTX-2337 Un estudio de escalación de dosis se llevó a cabo para evaluar la seguridad, tolerabilidad, y farmacología de VTX-2337 cuando se administró a sujetos adultos con tumores sólidos o linfoma avanzados. Los objetivos primarios del estudio fueron evaluar la seguridad y farmacocinética de VTX-2337 e identificar cualesquiera toxicidades de limitación de dosis. Los objetivos secundarios del estudio fueron evaluar la respuesta farmacodinámica a VTX-2337 y determinar la dosis máxima tolerada (MTD) para un solo ciclo de tratamiento con VTX-2337.

Procedimientos de estudio: VTX-2337 se administró cada semana por medio de inyección subcutánea los días 1 , 8 y 15 de un ciclo de dosis de 28 días para dos ciclos. Usando un esquema de escalación de dosis de Fibonacci modificado, cohortes sucesivos recibieron dosis que variaban de 0.1 mg/m2 a 3.9 mg/m2 de VTX-2337. Se recolectaron muestras de plasma para análisis farmacocinético después de la primera dosis del primer ciclo de tratamiento y para análisis farmacodinámico después de la primera dosis del primer y segundo ciclos de tratamiento.

Las respuestas clínicas fueron evaluadas por RECIST y sujetos con CR (es decir, respuesta completa), PR (es decir, respuesta parcial), o SD (es decir, enfermedad estable) se dejó que recibieran ciclos de tratamiento adicionales.

Datos demográficos de pacientes: Treinta y tres sujetos con varias malignidades de etapa tardía se evaluaron en 8 cohortes sucesivos. La distribución de cánceres evaluados fue la siguiente: colorrectal (n=9, o 27% de sujetos inscritos), pancreático (n=6/18%), melanoma (n=5/15%), colangiocarcinoma (n=2 / 6%), células renales (n=2 / 6%) y 1 sujeto cada uno (3%) con cáncer hepatocelular, mama, endometrial, próstata, ovario, quiste adenoide de la lengua, células básales metastáticas, carcinoma neuroendocrino del duodeno e hígado, un tumor de origen desconocido.

Se recolectaron muestras a 0.5, 1 , 1.5, 2, 4, 8 y 24 horas después de la administración subcutánea de la dosis de VTX-2337 y los niveles en el plasma de VTX-2337 se cuantificaron por LC-MS/MS. VTX-2337 fue rápidamente absorbido en la circulación sistémica con la Tmáx media ocurriendo entre 0.5 y 0.8 horas después de la dosificación. VTX-2337 también fue aclarado rápidamente de la circulación con una vida media promedio (ti/2) que varió entre 1.7 y 6.7 horas. Los niveles en el plasma pico (Cmáx) y la exposición sistémica total incrementaron ambas al incrementar la dosis. Se calcularon los valores de dosis normalizada (DN) para Cmáx y AUC(o--). En general, en los intervalos de dosis evaluados, la farmacocinética de VTX-2337 pareció ser lineal. Los resultados farmacocinéticos se muestran en la figura 9 y el cuadro 1 siguiente.

CUADRO 1 Para evaluar la respuesta farmacodinámica (PD) a VTX-2337, se recolectó sangre a 0, 4, 8, 24 horas después de administración subcutánea de la primera dosis del primer ciclo de VTX-2337. Los niveles en el plasma de inmunomediadores se cuantificaron usando el panel de analitos múltiples humano (MAP), versión 1.8 (Rules Based Medicine). Los incrementos dependientes de la dosis en un número de biomarcadores, incluyendo G-CSF, MCP-1, ???-1 ß y TNFa, se observaron entre 4 y 8 horas después de la dosificación con niveles generalmente regresando a la línea basal por 24 horas. Los niveles de mediadores en plasma recolectado de 9 voluntarios sanos se muestran para comparar con la población oncológica. Las respuestas farmacodinámicas después de la administración subcutánea de VTX-2337 se demuestran en el cuadro 2 siguiente.

Las respuestas farmacodinámicas a VTX-2337 se midieron después de la primera dosis del primer y segundo ciclos de tratamiento con VTX-2337 (día 1 y día 29) para evaluar si la administración repetida produciría efectos comparables. Las barras en las figuras 10A y 10B representan niveles en el plasma de G-CSF y ???-1 ß de pacientes individuales en cada cohorte que recibió múltiples ciclos de VTX-2337. No hubo aumento ni desensibilización amplia de respuesta inmunológica después de un ciclo de tratamiento con VTX-2337. En otras palabras, las respuestas farmacodinámicas son consistentes en múltiples ciclos de tratamiento.

Perfil de evento adverso: VTX-2337 fue generalmente seguro y bien tolerado. Los eventos adversos relacionados con fármaco más comunes fueron reacciones en el sitio de inyección, fiebres leves y síntomas similares a la influenza. Estas observaciones no fueron inesperadas después de la administración de un agente inmunomodulador. No se observaron efectos adversos hematológicos o gastrointestinales relacionados con fármacos.

En resumen, se observó que la administración subcutánea semanal del agonista de TLR8 VTX-2337 novedoso generalmente fue seguro y bien tolerado; los niveles en el plasma de VTX-2337 y respuestas de PD a VTX-2337 incrementaron de una manera dependiente de la dosis; y que la administración subcutánea de VTX-2337 estimuló la producción de múltiples mediadores inflamatorios incluyendo citocinas y quimiocinas consistentes con la activación de una respuesta inmunológica innata.

Incorporación por referencia La descripción entera de cada uno de los documentos de patente y artículos científicos referidos aquí se incorporan por referencia para todos los propósitos.

Equivalentes La invención puede ser modalizada en otras formas específicas sin apartarse de la esencia o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores por lo tanto se han de considerar en todos los aspectos ilustrativas y no limitantes sobre la invención descrita aquí. El alcance de la invención por lo tanto está indicado por las reivindicaciones anexas y no por la descripción anterior, y todos los cambios que están dentro del significado y alcance de equivalencia de las reivindicaciones se pretende que sean abarcados aquí.

Claims (47)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Una composición farmacéutica para usarse en una terapia de combinación de tratamiento de cáncer que comprende una formulación que incluye un agonista de TLR8 benzo[b]azepina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la terapia de combinación además comprende una o más modalidades de tratamiento adicionales.

2. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el agonista de TLR8 es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina*4-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

3. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el cáncer es un cáncer sólido seleccionado del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer colorrectal, linfoma, y cualquier combinación de los mismos.

4. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque una o más modalidades de tratamiento adicionales comprenden administrar una cantidad efectiva de un agente anti-canceroso.

5.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada además porque el agente anticanceroso es doxorubicina, gemcitabine, ciclofosfamida o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

6.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque el agonista de TLR8 y el agente anticanceroso se administran concurrentemente o secuencialmente.

7. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque el agonista de TLR8 y el agente anticanceroso se administran por separado por 5 días.

8. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el cáncer es cáncer de ovario, y el agente anticanceroso es una forma liposomal pegilada de doxorubicina.

9. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la doxorubicina se administra por vía intravenosa.

10. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el cáncer es cáncer de mama, y el agente anticanceroso es gemcitabine o ciclofosfamida.

11. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada además porque el sujeto es un mamífero.

12. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , caracterizada además porque la formulación es inyectada por una vía subcutánea, una vía intravenosa, una vía intramuscular o una vía transdérmica.

13. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , caracterizada además porque la formulación es administrada por vía subcutánea.

14. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 caracterizada además porque una o más modalidades de tratamiento adicionales se seleccionan de un agente quimioterapéutico, una citocina, un anticuerpo, una terapia hormonal, y una terapia de radiación.

15. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 caracterizada además porque el agonista de TLR8 es dosificado a una concentración de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal del sujeto.

16. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 caracterizada además porque el agonista de TLR8 es dosificado a una concentración de aproximadamente 0.02 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.075 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/ kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, o aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal del sujeto.

17.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 caracterizada además porque el agonista de TLR8 es dosificado a una concentración de aproximadamente 2.5 a 3.5 mg/m2 de área de superficie corporal del sujeto.

18. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada además porque el agonista de TLR8 es dosificado a una concentración de entre 0.002 mg/kg y 0.006 mg/kg de peso corporal del sujeto.

19. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada además porque el agonista de TLR8 se administra al sujeto sobre una base semanal o quincenal.

20. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-9 y 11-19, caracterizada además porque doxorubicina se administra a una dosis de aproximadamente 0.02 a 10 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0.04 a 5 mg/kg de peso corporal del sujeto.

21. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente de 1% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 5% a 15%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente10% en peso/volumen de una ciclodextrina.

22. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, o aproximadamente 30% en peso/volumen de una ciclodextrina.

23. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente 15% p/v de una ciclodextrina.

24. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizada además porque la ciclodextrina es una beta-ciclodextrina.

25.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el cáncer es linfoma, y una o más modalidades de tratamiento comprenden una terapia de radiación.

26. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el linfoma es linfoma no Hodgkin.

27. - Una composición farmacéutica para tratar cáncer que comprende un agonista de TLR8 benzo[b]azepina a una dosis entre 0.002 mg/kg/semana y 0.006 mg/kg/semana.

28.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque el agonista de TLR8 benzo[b]azepina es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina-4-carboxamida.

29.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque el agonista de TLR8 es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepi a-4-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

30. - Una composición farmacéutica que comprende un agente anticanceroso y una formulación e un agonista de TLR8 benzo[b]azepina.

31. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el agonista de TLR8 es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina-4-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

32.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el agente anticanceroso es doxorubicina, gemcitabine, ciclofosfamida o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

33.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque doxorubicina está en una forma liposomal pegilada.

34. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación tiene una concentración de aproximadamente 0.01 a 50 mg/ml del agonista de TLR8.

35. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación tiene una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, o de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml del agonista de TLR8.

36.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación tiene una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, o de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml del agonista de TLR8.

37.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación tiene una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml, aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, o aproximadamente 50 mg/ml del agonista de TLR8.

38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente de 1% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 5% a 15%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente10% en peso/volumen de una ciclodextrina.

39. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, o aproximadamente 30% en peso/volumen de una ciclodextrina.

40. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la formulación además comprende aproximadamente 15% p/v de una ciclodextrina.

41. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-40, caracterizada además porque la ciclodextrina es una beta-ciclodextrina.

42.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque la beta-ciclodextrina es éter sulfobutílico de beta-ciclodextrina.

43. - Un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenados con una forma líquida o liofilizada de una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 30-42.

44. - El paquete o kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque la composición farmacéutica está en una formulación acuosa.

45. - Un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más primeros contenedores llenados con una forma líquida o liofilizada de una formulación de un agonista de TLR8 benzo[b]azepina y uno o más segundos contenedores llenados con un agente anti-canceroso.

46. - El paquete o kit de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque el agonista de TLR8 es 2-amino-N,N-dipropil-8-(4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil)-3H-benzo[b]azepina-4-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

47.- El paquete o kit de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque el agente anticanceroso es doxorubicina, gemcitabine, ciclofosfamida o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.