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MX2013001541A - Metodo para producir una particula lipidica de tetranectina-apolipoproteina a-1, la particula lipidica misma y su uso. - Google Patents

Metodo para producir una particula lipidica de tetranectina-apolipoproteina a-1, la particula lipidica misma y su uso.

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MX2013001541A
MX2013001541A MX2013001541A MX2013001541A MX2013001541A MX 2013001541 A MX2013001541 A MX 2013001541A MX 2013001541 A MX2013001541 A MX 2013001541A MX 2013001541 A MX2013001541 A MX 2013001541A MX 2013001541 A MX2013001541 A MX 2013001541A
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MX
Mexico
Prior art keywords
apolipoprotein
lipid
seq
tetranectin
popc
Prior art date
Application number
MX2013001541A
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English (en)
Inventor
Adelbert Grossmann
Monika Baehner
Martin Bader
Silke Mohl
Original Assignee
Hoffmann La Roche
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Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MX2013001541A publication Critical patent/MX2013001541A/es

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Abstract

En la presente se reporta un método para producir una partícula lipídica que comprende las siguientes etapas: i) proporcionar una primeras solución que comprende apolipoproteína desnaturalizada, ii) agregar la primera solución a una segunda solución que comprende por lo menos dos lípidos y un detergente pero no apolipoproteína, y iii) retirar el detergente de la solución obtenida en la etapa ii) y de este modo producir una partícula lipídica.

Description

METODO PARA PRODUCIR UNA PARTICULA LIPIDICA DE TETRANECTINA- APOLIPOPROTEINA A-l, LA PARTICULA LIPIDICA MISMA Y SU USO CAMPO bE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de lipoproteínas y partículas lipídicas. Se reporta aquí un método para producir una partícula lipídica que comprende una apolipoproteína, una fosfatidilcolina y un lípido así como tetramectina-apolipoproteína A-I .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las lipoproteínas de plasma son complejos solubles proteína- lípido que llevan a cabo el transporte y metabolismo de lípidos en la sangre. Se distinguen varias clases principales de lipoproteínas en base en su densidad, tamaño, composiciones químicas y funciones entre estas, las partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) de manera alternativa y denominadas como partículas lipídicas de alta densidad están constituidas de varias subclases que varían en su promedio de peso molecular desde 180 kDa hasta 360 kDa. Su contenido promedio de lípidos y proteínas es 50% en peso de cada uno. La fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés) constituye 38% del lípido total, seguido por los ésteres de colesterilo y cantidades pequeñas de otros lípidos polares y no polares, que incluyen colesterol libre. El componente, proteínico principal es apolipoproteína A-I Ref . : 237619 (Apo A-I) , que representa aproximadamente 60% del peso total de la proteína en la HDL humana.
El colesterol en el cuerpo humano, especialmente en fluidos corporales circulantes tales como sangre, no está presente como una molécula aislada sino en forma de un complejo con ciertas proteínas (lipoproteínas) . La fracción principal del colesterol forma complejos con lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) o con lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) . Las partículas de LDL comprenden apolipoproteína B como el compuesto proteináceo principal mientras que las partículas de HDL comprenden apolipoproteína A-I como el compuesto proteináceo principal.
El colestero captado por las partículas de HDL es esterificado por la enzima lecitina-colesterol-acil-transferasa (LCAT, por sus siglas en inglés) . El éster de colesterol tiene una hidrofobicidad aumentada y difunde hacia I el núcleo de la partícula de¡ HDL. La partícula de HDL- ster de colesterol se puede administrar al hígado y se puede retirar de la circulación. [ Las partículas de HDL y su polipéptido principal, apolipoproteína A-I, participan en el transporte inverso de colesterol (RCT, por sus siglas en inglés) . Aquí, la apolipoproteína A-I incrementa la salida de colesterol de las células, por ejemplo de las células de la pared de los vasos sanguíneos, la unión del lipido y la activación de la lecitina-colesterol-acetil transferasa y de esta manera, la eliminación del colesterol por medio del flujo plasmático por el hígado. Este es un proceso de transporte activo que involucra la proteína de membrana celular ATP-cásete de unión-transportador-A-I (ABCA-I, por sus siglas en inglés) .
La apolipoproteína A-I y las sustancias terapéuticas basadas en apolipoproteina, por ejemplo, partículas de HDL reconstituidas ya se han identificado a finales de la década de 1970 y a inicios de la década de 1980 del siglo pasado. Para la apolipoproteina, las partículas lipídicas que contienen A-I-Milano, de significado clínico (que significa una reducción significativa de placa en pacientes arterioscleróticos) se puede demostrar. La apolipoproteina A-I-Milano, una forma dimérica de apolipoproteina natural A-I, fue designada de acuerdo con un mutante como se encuentra de 1 modo natural de la molécula de apolipoproteina A-I. La formación de dímero se habilita por el intercambio del residuo aminoácido 173 (arginina) por cisteína seguido por formación de un enlace disulfuro.
En el documento WO 2009/131704 se reportan nanoestructuras adecuadas para secuestrado de colesterol y otras moléculas que comprenden un núcleo que comprende un material inorgánico. Los métodos para producir bicapas de unión a nanoescala que comprenden la supresión de detergentes a partir de mezclas intermedias dentro de aproximadamente una hora de obtención de la mezcla se han reportado en el documento WO 2009/097587. En el documento WO 2006/125304 se reportan composiciones farmacéuticas para tratar o evitar arteriopatía coronaria. Las composiciones que codifican para apolipoproteínas que se relacionan con el metabolismo de lípidos y enfermedades cardiovasculares se reportan en el documento de E.U.A. 2002/10142953. En el documento WO 2005/084642 se reporta una composición de apolipoproteína-coquelato . En el documento WO 2007/137400 se reporta un método y un compuesto para el tratamiento de estenosis valvular. Las formulaciones farmacéuticas, métodos y regímenes de dosificación para el tratamiento y prevención de síndromes coronarios agudos se reportan en WO 2005/041866.
En el documento de E.U.A. 6,287,590 se reporta la formación de un complejo péptido/lípido por coliofilización. Los agonistas de apolipoproteína A-I y su uso para tratar trastornos dislipidémicos se reportan en el documento de E.U.A. 6,037,323.
En el documento WO 2009/097587 se reportan bicapas unidas a nanoescala, métodos de uso y elaboración. Las formulaciones de proteínas hidrofóbicas en una composición inmunogénica que tiene una tolerabilidad mejorada se ha reportado en el documento WO 2005/065708. En el documento WO 2006/069371 se reporta un método de evitar tom de lipidacign en plasma, inhibición y/o inversión de aterosclerosis . La formación de proteoliposomas que comprenden proteínas de membrana se reporta en el documento FR 2 915 490.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente se reporta un método para producir una partícula lipídica que comprende una proteína. Se ha i encontrado que se pueden < formar partículas lipídicas partiendo de una solución que comprende la proteína desnaturalizada y dilución : rápida en una solución que comprende por lo menos un lípido y un detergente. En esta etapa, la concentración de detergente se reduce por debajo de la CMC. Con este método, se puede omitir una etapa de naturalización precedente y por lo tanto, con el método como aquí se reporta es posible una producción más rápida de partículas de lípidos.
En una modalidad, lá dilución es de aproximadamente 1:3 (v:v) a aproximadamente 1:20 (v:v) .
En una modalidad, la dilución es de aproximadamente 1:5 (v:v) a aproximadamente 1:10 (v:y).
En una modalidad, la dilución es de aproximadamente 1:5 (v:v) .
En una modalidad, el detergente se diluye en por lo menos un factor de aproximadamente 3. En una modalidad, el detergente se diluye en un factor de por lo menos aproximadamente 5.
Un aspecto como se reporta en la presente es un método para producir una partícula de lípido que comprende las siguientes etapas: i) proporcionar una primera solución que comprende proteína desnaturalizada, ii) agregar la primera solución a una segunda solución que comprende por lo ¡menos un lípido y un detergente pero la cual no comprende la proteína, y iii) retirar el detergente de la solución obtenida en la etapa ii) y de esta manera producir una partícula de lípido.
En una modalidad, la primera solución está libre de lípidos.
En una modalidad, ' la proteína es una proteína producida de manera recombinante .
En una modalidad la proteína es una apolipoproteína . En otra modalidad, la apolipoproteína es una apolipoproteína purificada..
En una modalidad, la apolipoproteína tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID NO: 01, 02 y 04 a 52 y 66 a 67 o que comprende por lo menos un fragmento contiguo que comprende por lo menos 80% de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01, 02 y 04 a 52 y 66 y 67.
En una modalidad, la apolipoproteína tiene una secuencia de aminoácidos o es por lo menos un fragmento contiguo de por lo menos 80% de una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las SEC ID NO: 01, 02 y 04 a 52 y 66 y 67.
En una modalidad, la apolipoproteína es una apolipoproteína A-I. En una modalidad, la apolipoproteína A-I es una apolipoproteína A-I humana. En una modalidad adicional, la apolipoproteína es una tetranectina-apolipoproteína A-I que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01 o la SEC ID NO: 02 o la SEC ID NO: 66 O la SEC ID NO : 67.
En una modalidad, ! la apolipoproteína tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 06 con una mutación que se selecciona de R151C y R197C.
En una modalidad, la segunda solución es un volumen que tiene por lo menos dos veces el volumen de la primera solución.
En una modalidad, la segunda solución tiene aproximadamente 3 veces a aproximadamente 20 veces el volumen de la primera solución. En una modalidad, la segunda solución tiene aproximadamente 5 veces a aproximadamente 10 veces el volumen de la primera solución.
En una modalidad, por lo menos un lípido se selecciona de fosfolípidos, ácidos grasos y lípidos esteroideos.
En una modalidad, por lo menos un lípido es por lo menos dos lípidos, que opcionalmente se seleccionan independientemente entre sí de fosfolípidos , ácidos grasos y lípidos esteroideos. En otra modalidad, por lo menos un lípido es de uno a cuatro lípidos, es decir, se selecciona del grupo que comprende un lípido, dos lípidos, tres lípidos y cuatro lípidos .
En una modalidad, la segunda solución comprende un fosfolípido, un lípido y un detergente.
En una modalidad, la segunda solución consiste de un fosfolípido, un lípido, un detergente y una sal amortiguadora.
En una modalidad, los lípidos son dos fosfolípidos diferentes. En otra modalidad, los lípidos son dos fosfatidilcolinas diferentes. En otra modalidad, la primera fosfatidilcolina y la segunda fosfatidilcolina difieren en uno o dos residuos de ácido graso o derivados de residuos de ácido graso los cuales están esterificados a la estructura principal de glicerol de la fosfatidilcolina. En una modalidad, la primera fosfatidilcolina es POPC y la segunda fosfatidilcolina es DPPC.
En una modalidad, el detergente se selecciona de detergentes basados en azúcar, detergentes basados en polioxialquileno, detergentes basados en sales biliares, detergentes sintéticos o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el detergente se selecciona de ácido cólico, Zwittergent (MR) o una sal del mismo.
En una modalidad de los métodos como se reportan en la presente la primera solución está sustancialmente libre de partículas lipídicas.
En una modalidad el método comprende, después de la etapa ii) y antes de la etapa iii) la siguiente etapa iia) que incuba la solución obtenida en la etapa ii) . En una modalidad, la incubación y/o el retiro es a una temperatura de 4°C a 45°C.
En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 16 horas.
En una modalidad, el detergente es un detergente con una CMC alta. En otra modalidad, el detergente es un detergente con una CMC de por lo menos 5 mM. En otra modalidad, el detergente es un detergente con una CMC de por lo menos 10 mM.
En una modalidad, la concentración del detergente es de por lo menos 0.5 x CMC en la segunda solución.
En una modalidad, el retiro es por diafiltración o diálisis o adsorción. La adsorción en una modalidad se selecciona de afinidad o cromatografía hidrofóbica. En una modalidad el retiro es por diálisis.
En una modalidad, ; la primera solución tiene un primer volumen, la segunda solución tiene un segundo volumen, la proteína y la primera solución tiene una concentración definida y los lípidos y el detergente en la segunda solución tienen cada uno una concentración definida y en la etapa ii) la concentración de la apolipoproteína, de los lípidos del detergente cambia/se reduce lo que permite la formación de una partícula lipídica.
En una modalidad, el método comprende la siguiente etapa: ' iv) purificar la partícula lipídica y de esta manera producir una partícula lipídica.
Un aspecto como reporta en la presente es una partícula lipídica que se obtiene por un método como aquí se describe.
Un aspecto, como se describe en la presente es una composición farmacéutica que comprende una partícula lipídica que comprende apolipoproteína obtenida con un método como aquí se reporta así como el uso de la partícula lipídica como aquí se reporta para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de arteriosclerosis .
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 01 Tetranectina-apolipoproteína A-I SEC ID NO: 02 Tetranectina-apolipoproteína A-I SEC ID NO: 03 Péptido .
SEC ID NO: 04 Apolipoproteína A-I mimético (1) SEC ID NO: 05 Apolipoproteína A-I mimético (2) SEC ID NO: 05 Apolipoproteína humana, A-I.
SEC ID NO: 07 Apolipoproteína humana A-II.
SEC ID NO: 08 Apolipoproteína humana A-IV.
SEC ID NO: 09 Apolipoproteína humana A-V.
SEC ID NO: 10 Apolipoproteína humana C-I.
SEC ID NO: 11 Apolipoproteína humana C-II.
SEC ID NO: 12 Apolipoproteína humana C-III.
SEC ID NO: 13 Apolipoproteína humana C-IV.
SEC ID NO: 14 Apolipoproteína humana D.
SEC ID NO: 15 Apolipoproteína humana E.
SEC ID NO: 16 Apolipoproteína humana F.
SEC ID NO: 17 Apolipoproteína humana H.
SEC ID NO: 18 Apolipoproteína humana L-I.
SEC ID NO: 19 Apolipoproteína humana L-II.
SEC ID NO: 20 Apolipoproteína humana L-III.
SEC ID NO: 21 Apolipoproteína humana L-IV.
SEC ID NO: 22 Apolipoproteína humana L-V.
SEC ID NO: 23 Apolipoproteína humana L-VI SEC ID NO: 24 Apolipoproteína humana M.
SEC ID NO: 25 Apolipoproteína humana 0.
SEC ID NO: 26 Apolipoproteína humana OL.
SEC ID NO: 27 Apolipoproteína humana clus SEC ID NO: 28 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 29 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 30 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 31 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 32 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 33 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 34 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 35 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 36 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 37 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 38 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 39 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 40 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 41 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 42 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 43 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 44 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 45 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 46 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 47 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 48 Apolipoprqteína.
SEC ID NO: 49 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 50 Apolipoproteína.
SEC ID NO: 51 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 52 Apolipoproteína .
SEC ID NO: 53 Dominio de trimerización de tetranectina humana . 1 SEC ID NO: 54 Dominio de trimerización de tetranectina humana acortado .
SEC ID NO: 55 Fragmento de interferón L humano.
SEC ID NO: 56 Etiqueta hexahistidina.
SEC ID NO: 57 Proteína de fusión.
SEC ID NO: 58 Cebador NI.
SEC ID NO: 59 Cebador N2.
SEC ID NO: 60 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 61 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 62 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 63 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 64 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 65 Sitio de separación de la IgA proteasa.
SEC ID NO: 66 Tetranectina-apolipoproteína A-I .
SEC ID NO: 67 Tetranectina-apolipoproteína A-I con etiqueta His.
SEC ID NO: 68 a 105 Enlazante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra los resultados de estudios in vivo en conejo llevados a cabo con 5 partículas lipídicas que difieren en su composición lipídica. Parte superior: movilización de colesterol y por lo tanto la eficacia se puede demostrar para todos los lotes preparados. Parte inferior: incremento en la enzima hepática observado para partículas lipídicas generadas mediante el uso de DPPC como fosfolípido único. ' La figura 2 muestra el análisis por SEC-MALLS de partículas lipídicas de POPC y apolipoproteína de acuerdo con la presente invención, relaciones molares 1:20 a 1:160.
La figura 3 muestra, el impacto de DPPC y POPC sobre la actividad de LCAT.
La figura 4 muestra la velocidad inicial de esterificación de colesterol en partículas lipídicas que contienen POPC y/o DPPC.
La figura 5 muestra la salida de colesterol de células espumosas derivadas de THP-1 en células no cebadas con un agonista de RXR-LXR.
La figura 6 muestra la salida de colesterol de células espumosas derivadas d THP-1 después de activación de la vía ABCA-I utilizando un agonista RXR-LXR.
La figura 7 muestra la concentración en plasma dependiente de tiempo de.' diferentes composiciones de apolipoproteína .
La figura 8 muestra el curso en tiempo y concentración de movilización de colesterol y esterificación en plasma.
La figura 9 muestra la comparación de liberación de enzima hepática por diferentes composiciones que comprenden apolipoproteína de acuerdo con la invención en ratones después de una inyección única i.v. de 100 mg/kg.
La figura 10 muestra un estudio de conejo in vivo de hemolisis espontánea en plasma.
La figura 11 muestra un SEC analítico de partículas lipídicas utilizando Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7.5.
La figura 12 muestra un SEC analítico de partículas lipídicas utilizando K2HP04, 250 mM, clorhidrato de arginina 250 mM, trehalosa 7.5% á pH 7.5.
La figura 13 muestra PAGE nativa de partículas lipídicas de POPC y tetrahectina-apolipoproteína A-I en relaciones molares de 1:20 a 1:30 (carril 1: marcador nativo; carril 2: relación molar 1:320; carril 3: relación molar 1:160; carril 4 relación molar 1:80; carril 5: relación molar 1:80 (f/t) ; carril 6: relación molar 1:40; carril 7: relación molar 1:20, carril 8: apolipoproteína (formando hexámeros) ) .
La figura 14 muestra el análisis SEC-MALLS de partículas lipídicas de POPC y tetranectina-apolipoproteína A-I en relaciones molares de 1 : 20 a 1: 160.
La figura 15 muestra la superposición de cromatogramas SEC (señal UV280) de partículas lipídicas de POPC y tetranectina-apolipoproteína A-I.
La figura 16 muestra el análisis SEC-MALLS de una partícula lipídica de POPC y tetranectina-apolipoproteína A-I obtenida en una relación molar de 1:40.
La figura 17 muestra la PAGE nativa de partículas lipídicas de DPPC y tetranectina-apolipoproteína A-I obtenidas con relaciones molares de 1:20 a 1:100 (1: marcador de peso molecular; 2: tetranectina-apolipoproteína A-I sin lípido; 3: 120; 4: 1:40; 5: 1:60; 6: 1:80; 7: 1:100).
La figura 18 muestra el análisis SEC-MALLS (señal UV 280) de una partícula lipídica de una mezcla de POPC: DPPC = 3:1 y de tetranectina-apolipoproteína A-I obtenida en relaciones molares de 1:60 (curva superior) a 1:100 (curva inferior) .
La figura 19 muestra la SDS PAGE nativa de una partícula lipídica de tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando colato, ZwittergentMR 3-8, 3-10 y 3-12. Carril 1 en cada gel : apolipoproteina pura; carril 2 en cada gel: 0.1 x CMC de muestra lipidada con colato como en las referencias.
La figura 20 muestra el análisis de conjugado de proteína SEC-MALLS de partículas lipídicas de tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando 3 x CMC Zwittergent" 3-8 y POPC (relación molar de apolipoproteina : fosfolípido = 1:60).
La figura 21 muestra el análisis de conjugado de proteína SEC-MALLS de partículas lipídicas de tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando 2 x de CMC de ZwittergentMR 3-10 y POPC (relación molar dé apolipoproteína : fosfolípido = 1:50) .
La figura 22 muestra el análisis de conjugado de proteína SEC-MALLS de partícula lipídica de tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando POPC. Parte superior: partícula lipídica formada! a partir de tetranectina-apolipoproteína A-I nativa,; parte inferior: partícula lipídica formada a partir de tetranectina-apolipoproteína A-I desnaturalizada .
Las figuras 23 (a) y 23 (b) muestran los resultados de estudios de conejo in vivo realizados con tetranectina-apolipoproteína A-I lipidada con DMPC (1:100) (dimiristoil fosfatidilcolina) (a) y no lipidada en PBS (b) .
Las figuras 24 (a) y 2 (b) muestra el cromatograma SE-HPLC de partículas lipídicas que contienen apolipoproteína A-I natural Figura 24(a) y tetranectina-apolipoproteína A-I como se presentan en este documento Figura 2 (b) almacenadas a 5°C y 40°C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "apolipoproteína" indica una proteína que está comprendida en un lípido o partícula lipoproteínica, respectivamente.
El término "apolipoproteína A-I" indica un polipéptido helicoidal anfifílico con propiedades de interacción proteína- lípido y proteína-proteína. La apolipoproteína A-I se sintetiza en el hígado y el intestino delgado como prepro-apolipoproteína de 267 residuos aminoácidos lo cual se secreta como una pro-apolipoproteína que se descompone en el polipéptido maduro que tiene 243 residuos aminoácidos. La apolipoproteína A-I consiste de 6 a 8 secuencias repetidas de aminoácidos diferentes cada una que consiste de 22 residuos aminoácidos separados por una porción enlazante la cual con frecuencia es prolina y en algunos casos consiste de un tramo constituido de varios residuos. Una secuencia ejemplar de aminoácido de apolipoproteína A-I humana se reporta en la base de datos GenPept, entrada NM- 000039 o la base de datos entrada X00566; GenBank NP-000030.1 (gi 4557321). Dé, la apolipoproteína A-I humana (SEC ID NO: 06) existen variantes que se encuentran de modo natural tales como P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D, D127N, supresión de K131, K131M, W132R, E133K, R151C (el residuo aminoácido 151 cambia de Arg a Cys, apolipoproteína A-I-Paris), E160K, E163G, P167R, L168R, E171V, P189R, R197C (el residuo aminoácido 173 es un cambio de Arg a Cys, apolipoproteína A-I-Milano) y E222K. También se incluyen variantes que tienen modificaciones conservadoras de aminoácidos .
En una modalidad, la tetranectina-apolipoproteína A-I comprende un fragmento del sitio de separación de la proteasa de inmunoglobulina A (IgA proteasa) . Los sitios de reconocimiento conocidos a partir de las IgA proteasas comprenden las siguientes secuencias en donde indica la posición del enlace que se rompe: Pro-Ala-pro i Ser-Pro (SEC ID NO: 61) Pro-Pro i Ser-PRO (SEC ID NO: 62) Por-Pro i Ala-Pro ! (SEC ID NO: 63) Pro-Pro i Thr-Pro (SEC ID NO: 64) Pro-Pro l Gly-Pro . (SEC ID NO: 65) en donde los primeros tres . son los que se seleccionan y rompen con mayor frecuencia.
El término "imitación de apolipoproteína" indica un polipéptido sintético que j imita la función de la apolipoproteína respectiva. Por ejemplo, una "imitación de apolipoproteína A-I" es un polipéptido sintético que muestra función biológica comparable con respecto al retiro de colesterol, es decir, salida inversa de colesterol que la apolipoproteína A-I natural. En una modalidad, la imitación de apolipoproteína A-I comprende por lo menos una hélice alfa anfifílica con residuos aminoácidos cargados positivamente agrupados en un límite hidrofóbico-hidrofílico y residuos aminoácidos cargados negativamente agrupados en el centro de la cara hidrofílica . Con el fin de imitar la función de la apolipoproteína A-I, la imitación de apolipoproteína comprende un polipéptido repetido de 15 a 29 residuos aminoácidos, en una modalidad de 22 residuos aminoácidos (PVLDEFREKLNEELEAL QKLK (SEC ID NO: 04); PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEC ID NO: 05)).
El término "por lo menos uno" indica uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más. El término "por lo menos dos" indica "dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más.
El término "enfermedad cardiovascular" en general indica una enfermedad o condición con respecto al corazón o vasos sanguíneos tal como ateriosclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad cerebrovascuíar, enfermedad aortoíliaca, cardiopatía isquémica o vasculopatía periférica. La enfermedad puede no haber sido descubierta antes de un evento adverso como resultado de la enfermedad, tal como infarto al miocardio, apoplejía, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios, fallo cardíaco congestivo, aneurisma aórtico, que principalmente resultan en muerte del sujeto.
El término "colato" indica ácido 3a, 7a, 12a-trihidroxi-5 -colan-24-oico o una sal del mismo, especialmente la sal de sodio. La formación de partículas lipídicas se puede realizar al incubar la apolipoproteína con lípidos solubilizados en detergente en su temperatura de transición respectiva.
El término "concentración crítica de micela" y su abreviatura "CMC" las cuales pueden ser utilizadas de manera intercambiable, indican la concentración de tensioactivos o detergentes por encima dé los cuales las moléculas individuales de detergente (monómeros) se agregan espontáneamente en micelas (micelas, varillas redondas, estructuras lamelares, etc.). , El término "modificación conservadora de aminoácidos" indica modificaciones de la secuencia de aminoácidos que no afectan o alteran las características de la partícula lipídica o de la apolipoproteína de acuerdo con la invención. Las modificaciones se pueden introducir por técnicas convencionales conocidas en el ámbito tal como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las modificaciones conservadoras de aminoácidos incluyen aquellas en las cuales el residuo aminoácido es sustituido con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en el ámbito. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales; polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Una proteína "variante" se refiere por lo tanto en la presente a una molécula la cual difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de una proteína "de origen" hasta en diez, en una modalidad de aproximadamente dos a aproximadamente cinco adiciones, supresiones y/o sustituciones. Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos se pueden realizar por mutagénesis en base en elaboración de , modelos moleculares como se describe por Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 y por Queen, C. , et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 86 (1989) 10029-10033.
El término "detergente" indica una sustancia química tensioactiva . Un "detergente" generalmente es una molécula anfifática con una parte hidrofóbica no polar y una parte hidrofílica polar. El término "detergente zwiteriónico" indica un compuesto químico tensioactivo que tiene una carga general cero y que al mismo tiempo comprende por lo menos una porción cargada positivamente y por lo menos una porción cargada negativamente. En una modalidad, el detergente se selecciona de detergentes basados en azúcar, detergentes basados en. polioxialquileno, detergentes basados en sales biliares, detergentes sintéticos o una combinación de los mismos. El término "detergente basado en azúcar" indica un detergente que se selecciona a partir de n-octil-beta-D-glucppiranósido, n-nonil-beta-D-glucopiranósido, n-dodecil-beta-D-maltopiranósido o 5-ciclohexilpentil-beta-D-maltopiranósido y derivados de los mismos. El término "detergente basado en sales biliares" indica un detergente que se selecciona de colato ' de sodio, colato de potasio, colato de litio, sulfonato de 3-[(3-cloramidopropil) dimetilamonio] -il-propano (CHAPS, por sus siglas en inglés), 1 sulfonato de 3-[(3-cloramidopropil) dimetilamonio], -2 -hidroxil propano (CHAPSO, por sus siglas en inglés) y derivados de los mismos. El término "detergente basado n polioxialquileno" indica un detergente que se selecciona de Tween 20, Tritón X-100, Pluronic F68 y derivados de los mismos. El término "detergentes sintéticos" indica un detergente que se selecciona de Zwittergent ("R) 3-6, Zwittergent <MR> 3-8, Zwittergent (MR) 3-10, Zwittergent (MR! 3-12 y derivados de los mismos .
El término "partícula de lipoproteína de alta densidad" o su abreviatura, ! "partícula HDL" , los cuales se utilizan de manera intercambiable, indica un complejo lípido-proteína que comprende como componente proteináceo principal apolipoproteína A-I.
El término "inmunoanálisis" indica inmunoanálisis convencionales en fase sólida con anticuerpos monoclonales que involucra la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado sobre una fase sólida (anticuerpo de captura) , el antígeno y un anticuerpo u otro epítopo del antígeno conjugado con una enzima (anticuerpo trazador) . De esta manera se forma una especie de emparedado: fase sólida-anticuerpo de captura-antígeno-anticuerpo trazador. En la reacción catalizada por el emparedado, la actividad de la enzima conjugada de anticuerpo es proporcionada en la concentración de antígeno en el medio de incubación.
El método de emparedado estándar también se denomina inmunoanálisis de puente de antígeno doble debido a que los anticuerpos de captura y trazador se unen a epítopos diferentes del antígeno. Otros tipos de análisis son radioinmunoanálisis , inmunoanálisis por fluorescencia e inmunoanálisis unido a enzima. Los métodos para llevar a cabo estos análisis así como las aplicaciones y procedimientos prácticos se conocen por las personas expertas en el ámbito. Los inmunoanálisis se pueden : realizar como un inmunoanálisis homogéneo o heterogéneo .
El término "incrementa la salida de lípidos" y equivalentes gramaticales de la misma indica un nivel y/o velocidad aumentada de salida de lípidos, que promueve la salida de lípidos, que incrementa la salida de lípidos, que facilita la salida de lípidos, que regula por aumento la salida de lípidos, que mejora la salida de lípidos y/o que aumenta la salida de lípidos de las células o placas. En una modalidad, la salida de lípidos comprende la salida de fosfolípido, triglicérido, colesterol y/o éster de colesterol .
El término "DMPC" indica fosfolípido dimiristoil fosfatidilcolina .
El término "DPPC" indica el fosfolípido 1,2-di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina y también se le denomina como 1 , 2-dipalmitoil-fosfatidilcolina .
El término "multímero" indica un complejo que consiste de dos o más monóméros . Un multímero se forma por interacciones no covalentes entre los monóméros . Cada monómero comprende un dominio de multimerización . En una modalidad, el multímero comprende dos o tres monóméros. En otra modalidad, los dominios de multimerización interactúan vía interacciones no covalentes entre los dominios de multimerización individuales, comprendidos en cada monómero. El término "dominio de multimerización" indica secuencias de aminoácidos capaces de asociarse, covalente o no covalentemente , con dos o más moléculas monoméricas . Un dominio de multimerización es capaz de interactuar con dominios de multimerización: de secuencias de aminoácidos diferentes, similares o idénticas. En una modalidad, el dominio de multimerización es el elemento estructural trimerizante de tetranectina¦ o un derivado del mismo que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 68% idéntica con la secuencia de' aminoácidos de consenso de la SEC ID NO: 53. En una modalidad, el residuo cisteína en la posición 50 de la SEC ID NO: 53 está sustituido por un residuo aminoácido diferente, en otra modalidad por un residuo serina, o un residuo treonina, o un residuo metionina. Los polipéptidos que comprenden un dominio de multimerización pueden asociarse con uno o más polipéptidos adicionales que también 1 comprenden un dominio de multimerización. La formación de multímero puede iniciarse simplemente al mezclar los [ polipéptidos bajo condiciones adecuadas. En otra modalidad, el dominio de multimerización tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 53 en donde se han suprimido o agregado de 1 a 10 residuos a las partes N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos. En una modalidad adicional, el dominio de multimerización tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 53 en donde se han suprimido seis o nueve residuos aminoácidos desde la parte N terminal de la secuencia de aminoácidos. En otra modalidad adicional, el dominio de multimerización tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 53 en donde el residuo aminoácido N terminal o los residuos aminoácidos N terminal C y L han sido suprimidos. En una modalidad, el dominio de multimerización es el elemento estructural trimerizante tetranectina y tiene las secuencias de aminoácidos de la SEC ID NO: 54. El multímero, una modalidad es en un homómero.
Los multímeros pueden ser homómeros o heterómeros, puesto que diferentes apoliproteínas que comprenden un dominio de multimerización se pueden combinar o pueden ser incorporadas en el multímero. En una modalidad, el multímero es un homómero trimérico.
De acuerdo con una modalidad, el dominio de multimerización se obtiene a partir de tetranectina. En una modalidad, el dominio de 1 multimerización comprende el elemento estructural trimerizante tetranectina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 54. El efecto trimerizante del elemento estructural trimerizante tetranectina es causado por una estructura de serpentín helicoidal que interactúa con la estructura de serpentín helicoidal de otros elementos estructurales trimerizantes de tetranectina para formar un trímero. El elemento estructural trimerizante de tetranectina, se puede obtener a partir de tetranectina humana, a partir de tetranectina de conejo, a partir de tetranectina de ratón o de lectina tipo C de cartílagos de tiburón. En una modalidad, el elemento estructural trimerizante tetranectina comprende una secuencia que tiene por lo menos 68%, o por lo menos 75%, o por lo menos 81% o por lo menos 87% o por lo menos 92%. de identidad con la secuencia de consenso de la SEC ID NO: 53.
El término "interacciones no covalentes" indica fuerzas de unión no covalentes tales como fuerzas de interacción iónica (por ejemplo, puentes salinos) , fuerzas de interacción no iónicas (por ejemplo, enlaces de hidrógeno) o fuerzas de interacción hidrofóbicas (pr ejemplo, fuerzas de van-der-Waals o interacciones de apilamiento p) .
El término "temperatura de transición de fase" indica la temperatura que se requiere para inducir un cambio en el estado físico de los lípidos de una fase en gel ordenada, en donde las cadenas de hidrocarburo están extendidas completamente y empacadas de manera estrecha, a una fase cristalina líquida desordenada en donde las cadenas de hidrocarburo están orientadas aleatoriamente y son fluidas. La formación de las partículas de lípidos se puede llevar a cabo en o por encima de la temperatura de transición de fase de las mezclas fosfolípidos/fosfolípido que se utilicen. La temperatura de transición de fase de algunas fosfatidilcolinas y mezclas de las mismas se enumeran en la siguiente Tabla 1.
TABLA 1: TEMPERATURAS DE TRANSICION DE FOSFATIDILCOLINAS PURAS Y DE MEZCLAS DE FOSFATIDILCOLINA El término "fosfatidilcolina" indica una molécula que consiste de una porción glicerol, dos porciones de ácido carboxílico y una porción fosfocolina, en donde la porción de glicerol está unida covalentemente a las otras porciones, cada una por . un enlace éster, es decir, dos enlaces éster carboxílicos y un enlace éster fosfórico por lo que el enlace éster fosfórico está ya sea hacia el grupo 1-hidroxilo o al grupo 3-hidroxilo de la porción glicerol. El término "porción de ácido carboxílico" indica una porción orgánica que comprende por lo menos un grupo acilo (R-C(O)O). La fosfatidilcolina puede ser de cualquier clase o fuente. En una modalidad, la fosfatidilcolina se selecciona de fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de frijol de soja, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina, dilauril fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, l-miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina, l-palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina, l-palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina, l-estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina, dioleoil fosfatidilcolina, l-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina, l-oleoil-2 -palmitoil fosfatidilcolina y análogos y derivados de los mismos.
Todos los fosfolípidos como se utilizan en la presente se pueden derivar de cualquier fuente, es decir (cuando sea apropiado) de frijol de soja, leche, huevo o incluso órganos internos de animales excluyendo humanos, que pueden ser derivados de origen natural o semisintéticos o incluso completamente sintéticos.
Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya se producidos de manera natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos aminoácidos se pueden denominar como "péptidos" mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos aminoácidos se les puede denominar como "proteínas". Un polipéptido también puede comprender componentes diferentes de aminoácidos tales como grupos carbohidrato, iones de metal o ésteres de ácido carboxílico. Los componentes diferentes a aminoácidos se pueden agregar por la célula en la cual se expresa el polipéptido o pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en la presente en términos de su estructura principal de aminoácido o el ácido nucleico que codifica para las mismas. Las adiciones tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican pero, no obstante, pueden estar presentes.
El término "POPC" indica el fosfolípido l-palmitoil-2r-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina también denominado como l-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina.
El término "rápido" indica un proceso que se completa dentro de, como máximo, 10 horas. Una dilución rápida es un proceso en el cual se agrega una primera solución a una segunda solución en como máximo 10 horas. En una modalidad, los procesos se completan en como máximo 5 horas, en una modalidad adicional en, como máximo 2 horas.
El término " sustancialmente libre" indica que una solución que comprende una proteína y uno o más lípidos contiene menos de 5% (p/p) de partículas lipídicas, menos de 2.5% de partículas lipídicas, menos de 1% de partículas lipídicas o menos de 0.5% de partículas lipídicas.
El término "variante" incluye también variantes de una apolipoproteína o una imitación de apolipoproteína como se reporta en la presente en donde, en las variantes, la secuencia de aminoácidos de la apolipoproteína o la imitación de apolipoproteína respectiva comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. La modificación puede incrementar o disminuir la afinidad de la apolipoproteína por un receptor de apolipoproteína o una enzima convertidora de apolipoproteína p puede incrementar la estabilidad de la variante de apolipoproteína en comparación con la apolipoproteína respectiva o puede incrementar la solubilidad de la variante de apolipoproteína en comparación con la apolipoproteína respectiva en soluciones acuosas o puede incrementar la producción recombinante de la variante de apolipoproteína en comparación con la apolipoproteína respectiva en/por las células hospedadoras .
LO QUE AQUI SE REPORTA Se ha encontrado que las partículas lipídicas se pueden formar directamente a partir de una solución que contiene una proteína desnaturalizada pero sin detergente y sin lípido mediante dilución rápida en una solución que contiene un detergente y por lo menos un lípido pero no proteína. La etapa de naturalización, que generalmente se requiere, se puede omitir y de esta manera se proporciona un método más sencillo y robusto para la producción de partículas lipídicas. Adicionalmente , se forma una partícula lipídica más homogénea.
METODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PARTICULAS LIPIDICAS En la presente se reporta un método para producir una partícula lipídica, el cual comprende una proteína, que comprende las siguientes etapas: i) proporcionar una primera solución que comprende proteína desnaturalizada, ii) agregar la primera solución a una segunda solución la cual comprende un lípido y un detergente pero no proteína, es decir, la cual está libre de la proteína, y iii) retirar el detergente de la solución obtenida en la etapa ii) y de esta manera producir una partícula lipídica .
En una modalidad, el método para producir una partícula lipídica, el cual comprende una apolipoproteína, comprende las siguientes etapas: i) proporcionar una primera solución que comprende apolipoproteína desnaturalizada, ii) agregar la primera solución a una segunda solución la cual comprende un lípido y un detergente pero no apolipoproteína, y iii) retirar el detergente de la solución obtenida en la etapa ii) y de esta1 manera producir una proteína lipídica .
En una modalidad, la segunda solución tiene un volumen que es por lo menos dos veces el volumen de la primera solución.
En una modalidad; la segunda solución tiene aproximadamente 3 veces a aproximadamente 20 veces el volumen de la primera solución. En una modalidad, la segunda solución tiene aproximadamente 5 veces a aproximadamente 10 veces el volumen de la primera solución.
En una modalidad, la segunda solución comprende por lo menos dos lípidos diferentes independientemente entre sí que se seleccionan de fosfolípidos, ácidos grasos y lípidos esteroideos .
En otra modalidad, por lo menos dos lípidos diferentes son dos fosfatidilcolinas diferentes. En una modalidad, la primera fosfatidilcolina es POPC y la segunda fosfatidilcolina es DPPC.
En una modalidad el detergente se selecciona de ácido cólico, Zwittergent(MR) o una sal del mismo.
Se han reportado numerosos métodos diferentes para la producción de partículas lipídicas a partir de polipéptidos como se encuentran de modo natural o producidos recombinantemente , tales como por ejemplo, apolipoproteína-I o apolipoproteína A-I deslipidada derivada de partículas HDL humanas. En la presente, por ejemplo, una mezcla acuosa de fosfolípidos tales como palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina con detergentes tales como colato de sodio se incuban con apolipoproteína A-I purificada, en donde la apolipoproteína A-I se utiliza en su forma natural, es decir, no desnaturalizada. El detergente se retira después de la formación de la partícula lipídica por diálisis o diafiltración .
El método, como se [ reporta en la presente, permite la renaturalización y lipida proteínas completamente desnaturalizadas en una etapa única. Mediante la utilización de un método como aquí se reporta se puede obtener una partícula lipídica con calidad de producto mejorada, se puede omitir el preacondicionamiento de la proteína que consume tiempo y es posible un procesamiento a gran escala para producción biofarmacéutica por primera vez.
El método, como se reporta en la presente, permite la renaturalización y lipida la proteína A-I completamente desnaturalizada, en una sola etapa. Mediante la utilización de un método como aquí se reporta se puede obtener una partícula lipídica con calidad de producto mejorada, y se puede omitir el preacondicionamiento de la' apolipoproteína A-I que consume tiempo y por primera vez es posible el procesamiento a gran escala para producción biofarmacéutica.
Los puntos principales que deben de considerarse para el desarrollo del proceso de formación de partículas lipídicas son: i) los requerimientos para actividad biológica, y ii) requerimientos técnicos relacionados con la susceptibilidad de fabricación de la partícula lipídica. Por ejemplo, para la formación de partículas lipídicas que comprenden una apolipoproteína estos requerimientos apuntan en direcciones opuestas.
Desde el punto de vista técnico, los fosfolípidos saturados que contienen porciones de ácido carboxílico con una cadena de 16 átomos de carbono y más corta pueden seleccionarse (por ejemplo, dipalmitoil-sn-glicero-3 -fosfocolina, DPPC; dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DMPC, etc.). En contraste con estos a partir de datos biológicos se puede suponer que las porciones de ácido carboxílico que contienen fosfolípidos no saturados con una cadena de por lo menos 16 átomos de carbono (por ejemplo, palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, POPC estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, SOPC) son más eficaces y no tóxicos al hígado.
La selección de la combinación de lípidos determina la eficacia y seguridad al hígado de las partículas lipídicas que comprenden una apolipoproteína . Estudios in vivo de partículas lipídicas que que contienen DMPC utilizando conejos han demostrado que los conejos tratados con 30 mg/kg muestran efectos secundarios graves pero sobreviven, mientras que conejos tratados con 100 mg/kg mueren. Los resultados indican claramente que es necesaria la lipidación para movilización de colesterol y en consecuencia para la eficacia de la molécula (figuras 23 (a) -23 (b) ) .
Pruebas funcionales in vitro confirmaron que una partícula lípídica que contiene una fosfatidilcolina única tal como DPPC o POPC activan LCAT.
También se ha demostrado que la salida de colesterol es mayor para una combinación de fosfolípidos diferentes .
TABLA 2: COMBINACIONES DE FOSFOLIPIDOS QUE DIFIEREN EN SU COMPOSICION LIPIDICA PREPARADOS PARA ESTUDIOS IN VIVO, EN CONEJOS Estos resultados también se confirmaron mediante datos in vivo que demuestran la movilización de colesterol para todas las combinaciones. No obstante, para partículas lipídicas que contienen únicamente la fosfatidilcolina única DPPC, o una combinación de DPPC y esfingomielina (SM, por sus siglas en inglés) , se puede aumentar únicamente las enzimas hepáticas (Figura 1) .
Por lo tanto, también un aspecto es una partícula lipídica que se obtiene por un método como aquí se reporta.
A partir del punto de vista técnico la formación de partículas lipídicas con DPPC pura es más conveniente en comparación con la formación de POPC pura. El riesgo de formación de precipitado se reduce al utilizar una combinación de fosfolípidos diferentes. Además, la temperatura de transición de fase de 41°C de DPPC pura puede más fácil preparar la partícula lipídica en comparación con POPC pura que tiene una temperatura de transición de fase de 4°C. Además, el producto que se obtiene es más homogéneo. Esto se puede confirmar por análisis de partículas lipídicas vía SEC-MALLS, una herramienta analítica la cual también permite la determinación de la composición proteína- lípido (análisis de conjugado de proteína) . En la figura 2 se muestra un cromatograma de muestras resueltas en una cromatografía de exclusión de; tamaño (detección a UV280) . Una heterogeneidad en la muestra se puede observar por la presentación de picos separados múltiples o semiseparados .
El número de moléculas de POPC por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza POPC puro para producir la partícula lipídica en una modalidad es 40 a 85, en una modalidad es de 50 a 80 y en una modalidad es de 54 a 75.
El número de moléculas de DPPC por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza DPPC para producir la partícula lipídica en una modalidad es 50 a 150, en una modalidad es de 65 a 135, en una modalidad es de 76 a 123 y en una modalidad es de 86 a 102.
El número de moléculas de fosfolípido por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 1:3 para producir la partícula lipídica es, en una modalidad, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 120, en una modalidad desde aproximadamente 65 hasta aproximadamente 105 y en una modalidad desde aproximadamente 72 hasta aproximadamente 96.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 1:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 50 a 120, en una modalidad desde 60 hasta 100, en una modalidad desde 71 a 92 y en una modalidad desde 71 a 85.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en: una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 50 a 105.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 60 a 95.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en .una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 60 a 90.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en luna relación molar de · 3 : 1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 60 a 88.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando, se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 62 a 80. ] El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en : una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 66 a 86.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en ¡ una ' relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, desde 64 a 70.
El número de moléculas lipídicas por monómero de apolipoproteína en la partícula lipídica cuando se utiliza una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 3:1 para producir la partícula lipídica, es, en una modalidad, de aproximadamente 66.
Para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína y POPC se utiliza una relación molar de apolipoproteína respecto a POPC en una modalidad desde 1:40 a 1:100, en una modalidad se utiliza una relación molar de 1:40 a 1:80 y en una modalidad se utiliza una relación molar de aproximadamente 1:60.
Para la producción , de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína y DPPC se utiliza una relación de apolipoproteína respecto a DPPC en una modalidad desde 1:70 a 1:100, en una modalidad se utiliza una relación molar de 1:80 a 1:90 y en una modalidad se utiliza una relación molar de aproximadamente 1:80.
Para la producción ¡ de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína, POPC y DPPC se utilÍ2a una relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC, con POPC y DPPC en una relación 'molar 1:3, en una modalidad de 1:60 a 1:100, en una modalidad se utiliza una relación molar de 1:70 a 1:90 y en una modalidad se utiliza una relación molar de aproximadamente 1:80'.
Para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína, DPPC y POPC se utiliza una relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC, con POPC y DPPC en una relación molar 1:1, en una modalidad o de 1:60 a 1:100, en una modalidad se utiliza una relación molar de 1:60 a 1:80 y en una modalidad se utiliza una relación molar de aproximadamente 1:70.
Para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína, DPPC y POPC se utiliza una relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC, con POPC y DPPC en una relación molar 3:1, en una modalidad y de 1:60 a 1:100, en una modalidad se utiliza una relación molar de 1:50 a 1:70 y en una modalidad se utiliza una relación molar de aproximadamente 1:60.
En una modalidad, el polipéptido se incuba con detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 16 horas .
En una modalidad, si se utiliza una mezcla de lípidos para producir la partícula lipídica, la mezcla tiene una temperatura de transición de fase de 4°C a 45°C, en una modalidad, de 10°C a 38°C y en una modalidad de 15°C a 35°C.
Para la formación de partículas lipídicas que comprenden apolipoproteína se conocen diferentes métodos tal como congelación y secado, congelamiento y recalientamiento, solubilización de detergente seguido por diálisis, microfluidización, sonificación y homogenización .
La partícula lipídica puede comprender, como en una modalidad, un número promedio de 1 a 10 moléculas de apolipoproteína, en una modalidad de 1 a 8 moléculas de apolipoproteína por partícula lipídica y en una modalidad de 1 a 4 moléculas de apolipoproteína por partícula lipídica.
En una modalidad, ' la partícula lipídica puede comprender un número promedio de por lo menos 1 Ó 2 Ó 3 Ó 4 Ó 5 ó 6 ó 7 u 8 ó 9 ó l0 moléculas de apolipoproteína por partícula lipídica. En una modalidad el número promedio es 1.
En una modalidad, la partícula lipídica comprende uno o más polipéptidos : adicionales además de la apolipoproteína .
Sin limitación, la partícula lipídica puede servir como un cofactor enzimático y/o un portador de lípidos, especialmente colesterol, para captar lípidos.
Como se reporta en la presente, pueden estar presentes en la partícula lipídica uno o más detergentes. Un detergente puede ser cualquier detergente farmacéuticamente aceptable tal como un detergente no iónico o iónico. El detergente no iónico puede ser un derivado de óxido de alquileno de un compuesto orgánico el cual contiene uno o más grupos hidroxilo. En una modalidad, el detergente no iónico se selecciona de alcohol etoxilado y/o propoxilado o compuestos éter o mezclas de los mismos. En otra modalidad, el éster se selecciona de ésteres de sorbitol y ácidos grasos tales como monooleato de sorbitán o monopalmitato de sorbitán, ésteres de sacarosa .oleosos, ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitol, ésteres de ácido graso de polioxietileno, éteres de alquilo de polioxietileno, éteres de esterol de polioxietileno, éteres de alquilo de polioxietileno-polioxipropoxi , copolímeros de bloque y éter cetílico, aceite de ricino polioxietileno y derivados de aceite de ricino hidrogenado y ésteres de ácido graso de poliglicerina . En una modalidad, el detergente no iónico se selecciona de Pluronic1^, PoloxamerMR, SpanMR, TweenMR, PolysorbateMR, TyloxapolMR, EmülphorMR o CremophorMR.
El detergente iónico puede ser un agente de ducto biliar. En una modalidad el detergente iónico se selecciona de ácido cólico o ácido desoxicólico o sus sales y derivados o a partir de ácidos grasos libres tales como ácido oleico, ácido linoleico y otros.
En una modalidad, el detergente iónico se selecciona de lipidos catiónicos como alquilamina de 10 a 24 átomos de carbono o alcanolamina y ésteres de colesterol catiónicos. En una modalidad, el detergente es un detergente con una CMC alta. En una modalidad adicional, el detergente es un detergente con una CMC de por lo menos 5 mM.
En una modalidad, la partícula lipídica comprende menos de 0.75% en peso de detergente.
En una modalidad, la partícula lipídica comprende menos de 0.30% en peso de detergente.
En una modalidad, la partícula lipídica comprende menos de 0.1% en peso de detergente.
En una modalidad, la partícula lipídica comprende menos de 0.05% en peso de detergente.
En una modalidad, el detergente se selecciona de detergentes basados en azúcar, detergentes basados en polioxialquileno, detergentes basados en sales biliares, detergentes sintéticos o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el detergente es ácido cólico o un Zwittergent (MR> .
En una modalidad de los métodos de acuerdo con la invención, la primera solución está sustancialmente libre de partículas lipídicas.
En una modalidad, el método comprende, después de la etapa ii) y antes de la etapa iii) la siguiente etapa iia) incubar la solución obtenida en la etapa ii) . En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 60 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 12 horas a aproximadamente 20 horas. En una modalidad, el polipéptido se incuba con el detergente durante aproximadamente 16 horas.
En una modalidad la incubación y/o el retiro es a una temperatura de 4°C a 45°C.
En una modalidad el retiro es por diafiltración o diálisis.
En una modalidad, : la primera solución tiene un primer volumen, la segunda solución tiene un segundo volumen, la proteína, tal como una apolipoproteína en la primera solución tiene una concentración definida, los lípidos y el detergente en la segunda solución tienen, cada uno, una concentración definida en donde, en la etapa ii) la concentración de la apolipoproteína de los lípidos y el detergentes cambian/se reduce, lo que permite la formación de una partícula lipídica. Con la dilución de la solución de apolipoproteína y la adición de lípidos y detergente las relaciones adecuadas de apolipoproteína respecto a lípidos por una parte y las relaciones adecuadas también de los lípidos respecto al detergente por la otra se ajustan lo que permite la formación de una partícula lipídica.
En una modalidad, el método comprende la siguiente etapa: iv) purificar la partícula lipídica y de esta manera producir una partícula lipídica.
Por ejemplo, para la producción de una partícula lipídica que comprende fosfolípidos saturados con apolipoproteína que contienen, porciones de ácido carboxílico con una cadena de 16 átomos 1 y más corta se seleccionarían desde un punto de vista técnico (por ejemplo, dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DPP; dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DMPC, etc.) . En contraste con esto a partir de los datos biológicos se puede : suponer que los fosfolípidos no saturados que contienen porciones de ácido carboxílico con una cadena de por lo menos 16 átomos de C (por ejemplo, palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, POPC; estearoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina, SOPC) son más eficaces y menos hepatotóxicos .
Las fosfatidilcolinas DPPC y POPC y mezclas de las mismas se pueden utilizar para la formación de partículas lipídicas que contengan _ una apolipoproteína. Estas fosfatidilcolinas ejemplares difieren en una porción de ácido carboxílico y tienen una porción de ácido carboxílico idéntica esterificada a la estructura principal fosfoglicerol . La elaboración de partículas lipídicas es más fácil cuando se utiliza DPPC. En contraste, POPC es más eficaz en análisis funcionales in vitro, particularmente como sustrato para la activación de la enzima lecitina colesterol aceiltranferasa (LCAT, por sus siglas en inglés) la cual es necesaria para la conversión del colesterol movilizado en éster de colesterol. Se ha encontrado que las partículas lipídicas que comprenden mezclas de dos fosf tidilcolinas como, por ejemplo, POPC y, DPPC, en relaciones molares diferentes son útiles en comparación con las partículas lipídicas que comprenden únicamente una fosfatidilcolina (véase, por ejemplo, la figura 4) .
Por ejemplo, la partícula lipídica puede contener únicamente POPC. El número de moléculas de POPC por monómero de apolipoproteína puede variar entre 54 y 75 cuando se utilizan relaciones molares de 1:40 hasta 1:80 de apolipoproteína respecto a :lípido en la elaboración de partículas lipídicas. En una modalidad, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC es de 1:40 a 1:80, en una modalidad, la relación molar es de 1:50 a 1:70, en una modalidad, la relación molar es de aproximadamente 1:60.
De esta manera, para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína y POPC, la relación molar de polipoproteína respecto a POPC en una modalidad es de 1:40 a 1:100, en una modalidad, la relación molar es de 1:40 a 1:80 y en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:60.
Por ejemplo, la partícula lipídica puede contener únicamente DPPC. El número de moléculas de DPPC por monómero de apolipoproteína puede variar entre 76 y 123 cuando las relaciones molares de 1:40 hasta 1:80 de la apolipoproteína respecto a lípido se utilizan para la producción de la partícula lipídica. En una modalidad, la relación molar de apolipoproteína respecto a DPPC es de 1:70 a 1:100, en una I modalidad, la relación molar es de 1:75 a 1:90, en una I modalidad, la relación molar es de aproximadamente 1:80.
Por ejemplo, la 'partícula lipídica se puede producir a partir de una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 1:3. El número de moléculas de fosfolípido por monómero de apolipoproteína puede variar entre 72 y 112 cuando, las relaciones molares de 1:60 hasta 1:100 de apolipoproteína respecto a lípido se utilizan en la producción de la partícula lipídica. En una modalidad, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC es de 1:70 a 1:90, en una modalidad la relación molar es de 1:75 a 1:85, en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:80.
De esta manera, para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína, POPC y DPPC, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC con POPC y DPPC en una relación molar 1:3 en una modalidad es de 1:60 a 1:100, en una modalidad, la relación molar es de 1:70 a 1:90 y en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:80.
Por ejemplo, la partícula lipídica se puede producir partiendo de una mezcla de POPC y DPPC en una relación molar de 1:1. El número de moléculas de fosfolípido por monómero de apolipoproteína puede variar entre 71 y 111 cuando las relaciones molares de 1:60 hasta 1:100 de apolipoproteína respecto a 1 lípido se utilizan en la producción de la partícula lipídica. En una modalidad, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC es de 1:60 a 1:80, en una modalidad la relación molar es de 1:65 a 1:75, en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:70.
Así, para la producción de una partícula lipídica que comprende apolipoproteína:, DPPC y POPC la relación molar de apolipoproteína respecto a1 POPC y DPPC con POPC y DPPC en una relación molar 1:1 es, en; una modalidad, de 1:60 a 1:100, en una modalidad la relación molar es de 1:60 a 1:80 y en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:70.
Por ejemplo, la , partícula lipídica se puede producir a partir de una mezcla POPC y DPPC en una relación molar de 3:1. El número de moléculas de fosfolípido por monómero de apolipoproteína puede variar entre 46 y 93 cuando se utilizan relaciones molares de 1:60 hasta 1:100 de apolipoproteína respecto a lípido en la producción de la partícula lipídica. En una modalidad, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC es de 1:50 a 1:70, en una modalidad, la relación molar es de 1:55 a 1:65, en una modalidad, la relación molar es de aproximadamente 1:60.
Así, para la producción de una partícula lipídica la cual comprende apolipoproteína, DPPC y POPC, la relación molar de apolipoproteína respecto a POPC y DPPC, por lo que POPC y DPPC están en una relación molar 3:1, en una modalidad es de 1:60 a 1:100, en una modalidad la relación molar es de 1:50 a 1:70 y en una modalidad la relación molar es de aproximadamente 1:60.
En una modalidad, la apolipoproteína se proporciona como una solución acuosa de la apolipoproteína y se puede obtener a partir de procesamiento corriente abajo después de producción recombinante o cualquier otra fuente de producción de apolipoproteína y puede comprender concentraciones diferentes de apolipoproteína con pureza variable.
Básicamente, la formación de partícula lipídica se obtiene al incubar un polipéptido con lípidos solubilizados en detergente en su temperatura de transición respectiva. La separación del detergente por diálisis resulta en la formación de partículas lipídicas que consisten de una bicapa lipídica .
Básicamente, la formación de partículas lipídicas se puede llevar a cabo por incubación de tetranectina-apolipoproteína A-I o un multímero de la misma con lípidos solubilizados en detergente a su temperatura de transición respectiva. La separación del detergente por diálisis resulta en la formación de partículas lipídicas que consisten de una bicapa lipídica rodeada por una apolipoproteína helicoidal a.
La partícula lipídica se puede purificar por una combinación de etapas de precipitación y/o cromatografía. Por ejemplo, el detergente en exceso, es decir, el detergente que no es parte de la partícula lipídica se puede retirar en una etapa de cromatografía de adsorción hidrofóbica. En una modalidad, una etapa del método para purificación de una partícula lipídica comprende la etapa de cromatografía de adsorción hidrofóbica. En otra modalidad, el material cromatográfico para la etapa de adsorción hidrofóbica se selecciona de Extracti Gel D (disponible de Pierce Biotechnology, Rockford IL, Estados Unidos) , CALBIOSORBMR (disponible de Calbiochem, San Diego, CA, Estados Unidos) , SDR 30 HyperDMR resina de cromatografía de eliminación de disolvente-detergente (disponible de PALL Corporation, Ann Arbor, MI, Estados Unidos) . La partícula lipídica se recupera del material de adsorción hidrofóbico con una solución libre de detergente.
En una modalidad se utiliza diálisis para eliminar un detergente con una CMC alta.
COMPOSICION FARMACEUTICA Y DE DIAGNOSTICO: La partícula lipídica obtenida por un método como se reporta en la presente se puede utilizar para el tratamiento y/o diagnóstico de una enfermedad o condición.
La tetranectina-apolipoproteína A-I como se reporta en la presente o la partícula lipídica como se reporta en este documento se puede utilizar para el tratamiento y/o diagnóstico y una enfermedad o condición caracterizada por concentraciones anormales de lípidos o una deposición de lípidos dentro de los componentes corporales, tales como placas en los vasos sanguíneos.
Con el fin de determinar la capacidad del complejo proteína-lípido resultante para soportar la esterificación de colesterol catalizada por LCAT, se incorpora colesterol en la partícula lipídica como se reporta aquí mediante adición rápida de una solución etanólica de colesterol. Las partículas de lípido que contienen POPC pura son mejores sustratos para LCAT que los complejos que contienen DPPC independiente de su constituyente de apolipoproteína tal como apolipoproteína A-I natural o tetranectina-apolipoproteína A-I (figura 3) .
La velocidad inicial de esterificación de colesterol en partículas lipídicas que comprenden mezclas diferentes de POPC y DPPC muestra que las mezclas son mejores sustratos de LCAT que cualquiera de las fosfatidilcolinas puras como se puede observar a partir de las velocidades iniciales de esterificación de colesterol (véase Tabla 3 y figura 4) .
TABLA 3: VELOCIDADES INICIALES DE ESTERIFICACION DE COLESTEROL EN PARTICULAS LIPIDICAS QUE COMPRENDEN MEZCLAS DIFERENTES DE FOSFOLIPIDOS Las células THP1 humanas similares a macrófagos obtenidas al exponer células de leucemia monocíticas THP-1 a miristato y acetato de forbol y cargadas con un trazador de colesterol marcado radioactivamente se exponen a los compuestos de prueba aceptores de colesterol .
La velocidad de salida inducida por los compuestos de prueba aceptores se puede calcular como la relación de radioactividad de colesterol en ese sobrenadante respecto a la suma de radioactividad en las células más su sobrenadante y se pueden comparar con células expuestas a medio que no contiene aceptores y analizadas por ajuste lineal. Se pueden realizar experimentos en paralelo utilizando células expuestas y no expuestas a agonista RXR-LXR las cuales se sabe que regulan por aumento principalmente ABCA-1 y desviación de salida hacia transporte mediado por ABCA-1.
En células no pretratadas con partículas lipídicas RXR-LXR se puede observar un incremento mayor en la salida de colesterol en comparación !con la salida obtenida con tetranectina-apolipoproteína A-I no lipidada. Se puede observar solo una influencia pequeña de la mezcla lipídica en la salida en las series probadas (figura 5) . En células pretratadas con RXR-LXR se puede observar un incremento comparable en la salida de colesterol de las partículas lipídicas de una tetranectina-apolipoproteína A-I no lipidada. El incremento general es mayor en comparación con el observado con células no pretratadas. Unicamente se puede observar una influencia pequeña en la mezcla lipídica en la salida en las series probadas (figura 6) .
Se probaron partículas lipídicas diferentes en conejos in vivo. La partícula lipídica se aplica como infusión intravenosa y se realizó muestreo de sangre en serie durante 96 h después de la aplicación. Se determinaron los valores de enzimas hepáticas, colesterol y éster de colesterol. Las concentraciones en plasma son comparables para todas las partículas lipídicas probadas que comprenden una fase de distribución inicial seguida por una declinación lineal logarítmica de las concentraciones plasmáticas (figura 7) . Como se puede observar de la Tabla 4, los parámetros farmacocinéticos son similares para todos los compuestos probados. Las vidas medias observadas son cercanas a 1.5 días .
TABLA 4: PARAMETROS FARMACOCINETICOS DETERMINADOS Como se puede observar a partir de la figura colesterol es movilizado y esterificado en plasma. Las concentraciones plasmáticas de éster de colesterol continúan aumentando incluso después ; de que la concentración de tetranectina-apolipoproteína A-I ya ha disminuido. Cuando las concentraciones plasmáticas de tetranectina-apolipoproteína A-I han disminuido a aproximadamente 0.5 mg/ml (aproximadamente 50% de la apolipoproteína A-I natural normal) aún se pueden detectar concentraciones aumentadas de éster de colesterol.
Las partículas de lípidos que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I no inducen enzimas hepáticas en conejos así como en ratones, como se puede observar a partir de la figura 1 y 9. Tampoco se pudo determinar hemolisis en muestras de plasma obtenidas dos horas después de aplicación intravenosa (figura 10) .
Por lo tanto, los aspectos de la presente invención son una composición farmacéutica y una composición de diagnóstico que comprende una partícula lipídica que comprende apolipoproteína como se reporta en la presente o una tetranectina-apolipoproteína A-I como se reporta en la presente.
La partícula lipídica como se reporta en la presente presenta propiedades mejoradas in vivo en comparación con la apolipoproteína no lipidada y otras partículas lipídicas como se muestra en la siguiente tabla 5.
TABLA 5 : PROPIEDADES IN VIVO DE DIFERENTES APOLIPOPROTEINAS Y PARTICULAS LIPIDICAS La eficiencia a la cual se movilizó colesterol en la sangre se puede determinar . al comparar la excursión respectiva de colesterol total con concentraciones de apolipoproteína después de administración de apolipoproteína in vivo. Para una determinación cuantitativa se calculó el cociente del área corregida de valor inicial bajo la curva concentración-tiempo (ABC) del colesterol total y el área bajo la curva de concentración-tiempo de apolipoproteína.
La partícula lipídica como se reporta en la presente, especialmente una partícula lipídica que comprende una tetranectina-apolipoproteína de la SEC ID NO: 01 y POPC y DPPC en una relación molar de 3:1, muestra movilización aumentada de colesterol in vivo.
TETRANECTINA-APOLIPOPROTEINA A-I Además de la partícula lipídica como se indica en lo anterior se reporta en la presente también una tetranectina-apolipoproteína A-I .
La tetranectina-apolipoproteína A-I es una proteína de fusión del elemento ¦ estructural trimerizante de tetranectina humana y la apolipoproteína A-I humana natural. La secuencia de aminoácidos de la parte de tetranectina humana se puede acortar por los primeros nueve aminoácidos comenzando con el residuo isoleucina de la posición 10, un sitio de corte que se presenta de modo natural. Como una consecuencia de este corte se ha suprimido el sitio de O-glucosilación en el residuo treonina de la posición 4. Entre el elemento estructural trimerizante de tetranectina y la apolipoproteína A-I humana1 se han eliminado cinco residuos aminoácidos "SLKGS" (SEC ID NO: 03) .
Para expresión y purificación mejorada se genera una construcción que comprende una etiqueta de purificación N-terminal, por ejemplo, una etiqueta hexahistidina que contiene un sitio de separación de IgA proteasa. Como un resultado de la separación específica permanecen dos aminoácidos (alanina y prolina) en la parte N terminal de la tetranectina-apolipoproteína A-I de acuerdo con la presente invención después de purificación y la tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la .secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01.
El elemento estructural trimerizante de tetranectina proporciona un dominio que permite la formación de un multímero de tetranectina-apolipoproteína A-I trimérico que está constituido por interacciones no covalentes entre cada uno de los monómeros individuales de tetranectina-apolipoproteína A-I.
Mediante la utilización de un método de producción diferente la etiqueta de purificación y el sitio de separación de IgA proteasa se pueden omitir lo que resulta en una tetranectina-apolipoproteína A-I de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 02.
En una modalidad, la apolipoproteína puede ser una variante que comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos o una imitación dé apolipoproteína A-I.
La apolipoproteína A-I se puede determinar enzimáticamente, por medio de espectroscopia RMN o mediante la utilización de anticuerpos monoclonales o policlonales antiapolipoproteína-A-I . Otros aspectos como se reportan en la presente por lo tanto son anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen específicamente a tetranectina-apolipoproteína A-I como se reporta en la presente. Estos anticuerpos se pueden obtener con métodos conocidos por las personas expertas en el ámbito. Además el marcado de los anticuerpos para uso en los inmunoanálisis se puede realizar con métodos conocidos por una persona experta en el ámbito.
En una modalidad, la apolipoproteína puede ser una variante que comprende sustituciones conservadoras de aminoácidos o una imitación de apolipoproteína A-I. En una modalidad, la tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 02 o la SEC ID NO: 66 o la SEC ID NO: 67, en donde X se selecciona de las SEC ID NOS: 68 a SEC ID NO: 105.
Así, en una modalidad, la tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de IVNAKKDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSP DR VKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSK LREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQE SKDLEEVKAKVQPYLDDFQKK QEEMELYRQKVEPLRAELLQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVD ALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKA KPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEC ID NO: 02) .
En una modalidad, la tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de (A, G, S , T) PIVNA KDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEP PQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDS VTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLD DFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDR ARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHL STLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEC ID NO : 66) .
En una modlaidad, la tetranectina-apolipoproteína A-I tiene la secuencia de aminoácidos de (M) HHHHHHXIV AKKDWNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTV DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDN WDSVTSTFSKLREQLGPVTQEF DNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQP YLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEM RDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKAT EHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ (SEC ID NO: 67) , en donde X puede ser cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: A/ G, S, P, AP, GP, SP, PP, GSAP (SEC ID NO: 68), GSGP (SEC ID¡ NO: 69), GSSP (SEC ID NO: 70), GSPP (SEC ID NO: 71), GGGS (SEC ID NO: 72), GGGGS (SEC ID NO: 73), GGGSGGGS (SEC ID NO: 74), GGGGSGGGGS (SEC ID NO: 75), GGGSGGGSGGGS (SEC ID NO: 76), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 77), GGGSAP (SEC ID NO: 78) , \ GGGSGP (SEC ID NO: 79), GGGSSP (SEC ID NO: 80), GGGSPP (SEC ID NO: 81), GGGGSAP (SEC ID NO: 82), GGGGSGP (SEC ID NO: 83), GGGGSSP (SEC ID NO: 84), GGGGSPP (SEC ID NO: 85), GGGSGGGSAP (SEC ID NO: 86), GGGSGGGSGP (SEC ID NO: 87) , GGGSGGGSSP (SEC ID NO: 88) , GGGSGGGSPP (SEC ID NO: 89), GGGSGGGSGGGSAP (SEC ID NO: 90), GGGSGGGSGGGSGP (SEC ID NO: 91), GGGSGGGSGGGSSP (SEC ID NO: 92), GGGSGGGSGGGSPP (SEC ID NO: 93), GGGGSAP (SEC ID NO: 94), GGGGSGP (SEC ID NO: 95), GGGGSSP (SEC ID NO: 96), GGGGSPP (SEC ID NO: 97) , GGGGSGGGGSAP (SEC ID NO: 98), GGGGSGGGGSGP (SEC ID NO: 99), GGGGSGGGGSSP (SEC ID NO: 100), GGGGSGGGGSPP (SEC ID NO: 101), GGGGSGGGGSGGGGSAP (SEC ID NO: 102), GGGGSGGGGSGGGGP (SEC ID NO: 103) , GGGGSGGGGSGGGGSSP (SEC ID NO: 104) y GGGGSGGGGSGGGGSPP (SÉC ID NO: 105) .
Si se produce un polipéptido heterólogo en cepas de E. coli, el residuo metionina amino terminal habitualmente no se separa eficientemente por proteasas y por lo tanto el residuo metionina amino terminal está presente parcialmente en el polipéptido producido.
Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el verdadero alcance de la misma se establece por las reivindicaciones anexas. Se entiende que puedan relizarse modificaciones de los procedimientos que se establecen sin por esto apartarse del espíritu de la invención.
MATERIALES Y METODOS HPLC de exclusión de tamaño: La cromatografía se llevó a cabo con una columna Tosoh Haas TSK 300 SWXL sobre un sitsema ASI-100 HPLC (Dionex, Idstein, Alemania) . Los picos de elución se monitorearon a 280 nm por un detector de arreglo de diodo UV (Dionex) . Después de disolución de las muestras concentradas a 1 mg/ml la columna se lava con un amortiguador que consiste de fosfato diácido de potasio 200 mM y cloruro de potasio 250 mM, H 7.0 hasta que se obtiene un valor inicial estable. Las corridas de análisis se realizan bajo condiciones isocráticas utilizando un caudal de 0.5 ml/min durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los cromatogramas se integraron manualmente con Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania) . Se determinó la agregación, en %, al comparar el área bajo la curva (ABC) de . formas de peso molecular alto con la ABC del pico monomérico.
Dispersión de luz dinámica (DLS) : La DLS es una técnica no invasiva para medir el tamaño de partícula, típicamente en el intervalo de tamaño de submicrómetros . En la presente invención se utilizó un aparato Zetasizer Nano [ S (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) con una cubeta de cuarzo de temperatura controlada (25°C) para monitorear el intervalo de tamaño entre 1 nm y 6 µp?. La intensidad de la luz láser retrodispersada se detectó en un ángulo de 173°. La intensidad fluctúa en una gama que depende de la velocidad de difusión de partícula lo cual a su vez está gobernado por el tamaño de partícula. De esta manera, los datos de tamaño de partícula se pueden generar a partir de un análisis de la fluctuación de la intensidad de luz dispersada (Dahneke, B.E. (ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pécora, R. , Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985) ) . La distribución de tamaño por intensidad se calculó utilizando el modo estrecho múltiple del programa DTS (Malvern) . Se llevaron a cabo experimentos con muestras no diluidas.
SEC-MALLS: SEC-MALLS es una combinación de cromatografía de exclusión de tamaño con un sistema de tres detectores: i) detección UV, ii) detección de índice de refracción y iii) detección de dispersión de luz. Para la separación por un tamaño se utilizó una columna Superóse 6 10/300, GL de GE Healthcare. El método se corre y isocráticamente con el amortiguador PBS, pH 7.4, aplicando un caudal de 0.4 ml/min. Los tres sistemas detectores se conectan en serie. La señal de la partícula lipídica completa (partícula proteína-lípido) se monitorea por el detector de índice de refracción mientras que la absorbancia UV determinada a 280 nm determina la señal inducida por la parte de proteína. La proporción de la fracción lipídica se obtiene por una resta simple de la señal UV proteínica de la señal completa. La aplicación de dispersión de luz permite la detección de la masa molecular de las especies respectivas y por lo tanto una descripción completa y detallada de la partícula lipídica.
Determinación de detergente: La determinación de detergente residual se llevó a cabo por cromatografía en fase inversa acoplada con detector de dispersión de luz evaporativa (RP-ELSD, por sus siglas en inglés) . Como una columna se utilizó luna C18 4.6 x 150 mra, 5 µp?, 100 Á de Phenomenex (Aschaffenburg, Alemania) . Después de centrifugación a través de una membrana de 10 kDa 90 µ? del flujo pasante se utilizan para separación por HPLC. La elución se realiza bajo condiciones isocráticas con una solución de metanol 74% (v/v) que contiene 0.1% de ácido trifluoroacético (v/v) . La temperatura de la columna se establece en 30 °C. La detección se realiza por un detector de dispersión de luz evaporativa aplicando una temperatura de nebulización de 30 °C, una temperatura de evaporación de 80 °C y un flujo de gas de 1.0. 1/min. La cuantificación del detergente residual se lleva a cabo por el establecimiento de una curva de calibración, en el caso de colato en el intervalo de 0.22 µ? a 7.5 µg¦ de colato.
Determinación de proteína: La concentración [de proteína se determinó al determinar la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar calculado en base en la secuencia de aminoácidos.
Técnica de ADN recombinante : Se utilizaron métodos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. , et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
EJEMPLO 1 Elaboración y descripción de plásmidos de expresión en E. coli El polipéptido de fusión tetranectina-apolipoproteína A-I se prepara por medios recombinantes . La secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión expresado en la dirección N a C terminal es como sigue: el aminoácido metionina (M) , un fragmento de una secuencia de interferón que tiene la secuencia de aminoácidos de CDLPQTHSL (SEC ID NO: 55) , . un enlazante GS, una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 56) , un enlazante GS, un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEC ID NO: 60) , y una tetranectina-apolipoproteína A-I que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 02.
Los polipéptidos de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I como se describe en lo anterior son polipéptidos precursores a partir de los cuales se libera polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína A-I por separación enzimática in vi tro utilizando IgA proteasa.
El gen de fusión que codifica para el polipéptido precursor se ensambla con métodos y técnicas recombinantes conocidas mediante conexión de los segmentos apropiados de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico elaboradas por síntesis química se verifican por secuenciado de ADN. El plásmido de expresión para la producción de tetranectina-apolipoproteína A-I de la SEC ID NO: 01 que codifica para una proteína de fusión de la SEC ID NO: 31 se prepara como sigue. Elaboración del plásmido de expresión E. coli El plásmido 4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) es un plásmido de expresión para la expresión de un núcleo-estreptavidina en E. coli. Se genera por la ligación de un fragmento de EcoRl/CelII-vector de 3142 pares de bases derivado del plásmido 1966 (1966-pBRori-URA3-LACI-T-repetido; reportado en EP-B 1 422 237) el cual es un fragmento de EcoRI/CelII que codifica para el núcleo de estreptavidina de 435 pares de bases.
El plásmido de expresión de E. coli de núcleo-estreptavidina comprende los siguientes elementos : el origen de replicación del vector pBR322 para replicación en E. coli (que corresponde a la posición de pares de bases 2517-3160 de acuerdo con Sutcliffe, G. , et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90), el gen URA3 de Saccharo yces cerevisiae que codifica para orotidina 5' -fosfato descarboxilasa (Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124) lo cual permite la selección del plásmido por complementación de cepas mutantes pyrF de 2?. coli (auxotrofía a uracilo) , el cásete de expresión de núcleo-estreptavidina, que comprende: el promotor híbrido T5 (promotor híbrido T5-PN25/03/04 de acuerdo con Bujard, H., et al. Methods . Enzymol. 155 (1987) 416-433 y Stueber, D., et al., Immunol . Methods IV (1990) 121-152) que incluye el sitio de unión ribosómico sintético de acuerdo con Stueber, D., et al. (véase antes) , el gen para núeleo-estreptavidina, - dos terminadores de transcripción derivados de bacteriófago, el terminador ?'-?? (Schwarz, E., et al . , Nature 272 (1978) 410-414) y el terminador fd (Beck E. y Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58) , el gen represor lacl de E. coli (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769).
El plásmido de expresión final para la expresión del polipéptido precursor tetranectina-apolipoproteína A-I se prepara al cortar el gen estructural núeleo-estreptavidina del vector 4980 utilizando el sitio de separación por endonucleasa de restricción EcoRI y CelII flanqueante singular e insertando el sitio de restricción EcoRII/Celll flanqueando al ácido nucleico que codifica para el polipéptido precursor en el fragmento del vector EcoRI/CelII-4980 de 3142 pares de bases.
EJEMPLO 2 Expresión de tetranectina-apolipoproteína A-I Para la expresión de la proteína de fusión se utilizó un sistema hospedador/vector de E. coli el cual permite que una sección de plásmido sin antibiótico por complementación de E. coli auxotrofía (PyrF) (EP 0972838 y documento de E.U.A. 6,291,245).
La bacteria E. coli K12 cepa CSPZ-2 (leuB, proC, trpE, th-1, ApyrF) se transforma por electroporación con el plásmido de expresión p (IFN-His6-IgA-tetranectina-apolipoproteina A-I) . Las células transformadas de E. coli primero se hacen crecer a 37 °C en placas de agar.
Protocolo de fermentación 1: Para la pre- fermentación se ha utilizado un medio M9 de acuerdo con Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; segunda edición (Diciembre 1989) suplementado con aproximadamente 1 g/1 de L-leucina, aproximadamente 1 g/1 de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 de clorhidrato de tiamina.
Para la pre-fermentación se inoculan 300 mi de medio M9 en un matraz Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores, con 2 mi de una ampolleta de blanco de siembra primario. El cultivo se realiza en un agitador giratorio durante 13 horas a 37 °C hasta que se obtiene una densidad óptica (578 nm) de 1-3.
Para la fermentación se utiliza un medio de lote de acuerdo con Riesenberg et al. (Riesenberg, D.; et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27). 27.6 g/1 de glucosa*H20, 13.3 g/1 de KH2P04, 4.0 g/1 de (NH4)HP04, 1.7 g/1 de citrato, 1.2 g/1 de MgS04*7 H20, 60 mg/1 de citrato de hierro (III), 2.5 mg/1 de CoCl2*6 H20, 15 mg/1 de MnCl2*4 H20, 1.5 mg/1 de CuCl2*2 H20, 3 mg/1 de H3B03 , 2.5 mg/1 de Na2Mo04*2 H20, 8 mg/1 Zn(CH3COO)2*2 H20, 8.4 mg/1 Titriplex III, 1.3 ml/1 de Synperonic como agente antiespumante 10%. El medio de lote se suplementa con 5.4 mg/1 de clorhidrato de tiamina y 1.2 g/1 de L-leucina y L-prolina, respectivamente. La solución 1 de alimentación contiene 700 g/1 de glucosa suplementado con 19.7 g/1 de MgS04*7 H20. La solución alcalina para la regulación de pH con una solución acuosa 12.5% (p/v) de NH3 suplementada con 50 g/1 de L-leucina y 50 g/1 de L-prolina, respectivamente. Todos los componentes se disuelven en agua desionizada.
La fermentación se lleva a cabo en un termentador Biostat C DCU3 de 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania) . Comenzando con 6'.4 1 de medio de lote de fermentación estéril más 300 mi de inoculo a partir de la prefermentación, la fermentación del lote se realiza a 37 °C, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbar y una velocidad de aireación de 10 1/min. Después de que la glucosa suplementada inicialmente ha disminuido, la temperatura se desplaza a 28 °C y la fermentación entra al modo de alimentación por lotes. Aquí el valor relativo del oxígeno disuelto (p02) se mantiene en 50% (DO-stat, véase, por ejemplo Shay, L.K., et al., J. Indus . Microbiol. Biotechnol . 2 (1987) 79-85) al agregar alimientación 1 en combinación con una velocidad de agitador en aumento constante (550 rpm a 1000 ;rpm dentro de 10 horas y de 1000 rpm a 1400 rpm dentro de 16 horas) y la velocidad de aireación (de 10 1/min a 16 1/min en 10 horas y de 16 1/min a 20 1/min en 5 horas) . El suministro con aminoácidos adicionales resulta de la adición de la solución alcalina, cuando el pH alcanza el límite de regulación inferior (6.70) después de aproximadamente 8 horas de cultivo. La expresión de la proteína terapéutica recombinante se induce por adición de IPTG 1 mM a una densidad óptica de 70.
Al final de la fermentación la tetranectina-apolipoproteína A-I citoplasmática y soluble expresada respecto a la proteína insoluble se agrega de manera que los denominados cuerpos de inclusión, cono una etapa de calentamiento en donde la totalidad del caldo de cultivo en el termentador se calienta a 50°C durante 1 o 2 horas antes de la cosecha (véase, por ejemplo, el documento EP-B 1 486 571) . Posteriormente el contenido del termentador se centrifuga con una centrífuga de flujo pasante (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa recolectada se almacena a -20 °C hasta su procesamiento adicional. Las proteínas del precursor de tetranectina-apolipoproteína A-I sintetizadas se encuentran exclusivamente en la fracción de residuos celulares insolubles en forma de agregados de proteína insoluble denominados cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) .
La proteína de fusión sintetizada se encuentra exclusivamente en la fracción de residuos celulares insolubles en forma de agregados de proteína insolubles, los denominados cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) .
Las muestras extraídas del fermentador, una antes de la inducción y las otras1 en puntos de tiempo dedicados después de la inducción de ! la expresión de proteínas se analizan por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida . De cada muestra, la misma cantidad de células (D00 jetivo = 5) se resuspenden en 5 mi de amortiguador PBS y se rompe por sonicación sobre hielo. Después, 100 µ? de cada suspensión se centrifugan (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se extrae y transfiere a un frasco separado. Esto es para diferenciar entre proteína objetivo expresada soluble e insoluble. A cada fracción de sobrenadante (= soluble) 300 µ? y a cada fracción de sedimento (= insoluble) se agregan 400 µ? de amortiguador de muestra SDS (Laemmli, Reino Unido, Nature 227 (1970) 680-685) . Las muestras se calientan durante 15 minutos a 95 °C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas en las muestras. Después de enfriar a temperatura ambiente, 5 µ? de cada muestra se transfieren a un gel de poliacrilamida 4-20% TGX Criterion Stain Free (Bio-Rad) . Adicionalmente se' colocaron en el gel 5 µ? de estándar de peso molecular (Precisión Plus Protein Estándar, Bio-Rad) y 3 cantidades (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) de estándar de cuantificación con concentración de proteína de producto conocida (0.1 µg/µl) .
La electroforesis se llevó a cabo durante 60 minutos a 200 V y posteriormente el gel se transfiere a un equipo GelDOC EZ Imager (Bio-Rad) y se procesa durante 5 minutos con radiación UV. Las imágenes de gel se analizaron el programa de análisis de Image Lab (Bio-Rad) . Con los tres estándares se calcula una curva de regresión lineal con un coeficiente de >0.99 y a partir de la misma se calculan las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original .
Protocolo de fermentación 2 : Para pre- fermentación se ha utilizado un medio M9 de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; segunda edición (diciembre 1989) ) suplementado con aproximadamente 1 g/l de L-leucina, aproximadamente 1 g/l de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 de clorhidrato de tiamina.
Para la pre- fermentación se inoculan 300 mi de medio M9 modificado, en matraces Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores, a partir de una placa de agar o con 1-2 mi de una ampolleta de banco de siembra primario. El cultivo se realiza en un agitador giratorio durante 13 horas a 37 °C hasta que se obtiene una densidad óptica (a 578 nm) de 1-3.
Para la fermentación y la expresión de alto rendimiento de tetranectina-apolipoproteína A-I se utilizan los siguientes medios de lote y alimentaciones: 8.85 g/l de glucosa, 63.5 g/l de extracto de levadura, 2.2 g/l de NH4C1, 1.94 g/l de L-leucina, 2.91 g/l de L-prolina, 0.74 g/l de L-metionina, 17.3 g/l de KH2P04*H20, 2.02 g/l de MgS04*7 H20, 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, 1.0 ml/1 de Synperonic 10% como agente antiespumante . La solución de alimentación 1 contiene 333 g/l de extracto de levadura y 333 g/l de 85% de glicerol suplementado con 1.67 g/l de L-metionina y 5 g/l de L-leucina y L-prolina cada uno. La alimentación 2 es una solución de 600 g/l de L-prolina. La solución alcalina para regulación de pH es una solución de KOH 10% 1 (p/v) y se utilizó como ácido una solución de glucosa 75%. Todos los componentes se disuelven en agua desionizada.
La fermentación se llevó a cabo en un termentador Biostat C DCU3 de 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania) . Comenzando con 5.15 1 de medio de lote de fermentación estéril más de 300 mi de inoculo a partir de la pre- fermentación, la fermentación de alimentación por lotes se realizó a 25°C, pH 6.7 + 0.2, 300 mbar y una tasa de aireación de 10 l/min. Antes de que la glucosa suplementada inicialmente se agote el cultivo alcance una densidad óptica de 15 (578 nm) y la fermentación entra al modo de alimentación por lotes cuando la alimentación 1 se inicia con 70 g/h. El monitoreo de la concentración de glucosa en el cultivo de la alimentación 1 se incrementa a un máximo de 150 g/h mientras evita la acumulación de glucosa y se mantiene en un pH cercano al límite de regulación superior a 6.9. A una densidad óptica de 50 (578 nm) se inicia la alimentación 2 con una velocidad de alimentación constante de 10 ml/h. El valor relativo de oxígeno disuelto (se mantiene por encima de 50% incrementado su velocidad de agitación (500 rpm a 1500 rpm) , tasa de aireación (de 10 l/min a 20 l/min) y presión (de 300 mbar a 500 mbar) en paralelo. La expresión de la proteína terapéutica recombinante se induce por la adición de IPTG 1 mM a una densidad óptica de 90.
Siete muestras extraídas del fermentador, una antes de la inducción y las otras en los puntos de tiempo indicados después de la inducción de la expresión de proteína se analizaron por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida. De cada muestra la misma cantidad de células (D00bjetivo = 5) se resuspenden en 5 mi de amortiguador PBS y se rompen vía sonicación en hielo. Después 100 µ? de cada suspensión se centrifugan (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se extrae y se transfiere a un frasco separado. Esto es para diferenciar entre la proteína objetivo expresada soluble e insoluble. A cada fracción de sobrenadante (= soluble) se agregan 300 µ? y a cada fracción de sedimento (= insoluble) se agregan 200 µ? de amortiguador de muestra SDS (Laemmli, Reino Unido., Nature 227 (1970) 680-685). Las muestras se calientan durante 15 minutos a 95 °C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas en las muestras. Después de enfriar a temperatura ambiente se transfieren 5 µ? de cada muestra a un gel de poliacrilamida Bis-Tris 10% (Novagen) . Adicionalmente, se colocan sobre el gel 5 µ? de estándar de peso molecular (Precisión Plus Protein Estándard, Bio-Rad) y 3 cantidades (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) de estándard de cuantificación con concentración de proteína de producto conocida (0.1 µ?/µ?) .
La electroforesis se lleva a cabo durante 35 minutos a 200 V y después el gel se tiñe con colorante azul brillante R de Coomassie, se destiñe con agua calentada y se transfiere a un densitómetro óptico para digitalización (GS710, Bio-Rad) . Las imágenes de gel se analizan utilizando el programa de análisis Quantity One 1-D (Bio-Rad) . Con los tres estándares se calcula una curva de regresión lineal con un coeficiente de >0.98 y a partir de la misma se calculan las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original.
Al final de la fermentación el citoplasma y la tetranectina-apolipoproteína A-I expresada soluble se transfieren a agregados de proteína insolubles, los denominados cuerpos de inclusión (los IB, por sus siglas en inglés) con una etapa de calentamiento en donde la totalidad del caldo de cultivo en el fermentador se calienta a 50 °C durante 1 ó 2 horas antes de recolección (véase, por ejemplo el documento EP-B 1 486 571) . Después de la etapa de calentamiento las proteínas precursoras de tetranectina-apolipoproteína A-I sintetizadas se encuentran exclusivamente en la fracción de residuos celulares insolubles en forma de los IB.
El contenido del fermentador se enfría a 4-8°C, se centrifuga con una centrífuga de flujo pasante (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa cosechada se almacena a -20 °C hasta procesamiento adicional. El rendimiento de biomasa recolectada total varía entre. 39 g/1 y 90 g/1 de materia seca dependiendo de la construcción expresada.
EJEMPLO 3 Preparación de tetranectina-apolipoproteína A-I La preparación del cuerpo de inclusión se lleva a cabo por resuspensión de las células bacterianas cosechadas en una solución amortiguada de fosfato de potasio o en una solución amortiguada de Tris (0.1 M, suplementada con gS04 1 mM, pH 6.5) . Después de la adición de la desoxirribonucleasa la célula se rompe por homogeneización a una presión de 900 bar. Se agrega una solución amortiguadora que comprende NaCl 1.5 y EDTA 60 mM a la suspensión de células homogeneizadas . Después de ajuste del valor de pH a 5.0 con HC1 25% (p/v) la suspensión de cuerpo de inclusión final se obtiene después de una etapa de centrifugación adicional. La suspensión es almacena a -20°C en bolsas de plástico estériles de uso único hasta procesamiento adicional .
La suspensión de cuerpo de inclusión (aproximadamente 15 kg) se solubiliza en una solución de clorhidrato de guanidinio (150 1, 6.7 M) . Después de clarificación del solubilizado por filtración profunda, la solución se aplica a un material de cromatografía de afinidad de Zn-quelato. El polipéptido de fusión se purifica por material de cromatografía de Zn-quelato y se separa por igA proteása. Posteriormente, el polipéptido se purifica adicionalmente con una cromatografía de intercambio aniónico y una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Estas etapas se realizan en una solución que contiene urea (7 M) , es decir, bajo condiciones desnaturalizantes. Estas etapas se utilizan para la separación de los fragmentos de polipéptido, endotoxinas e impurezas adicionales. Se lleva a cabo una diafiltración en clorhidrato de guanidinio 6.7 M que contiene solución. La solución final que se obtiene contiene tetranectina-apolipoproteína A-I desnaturalizada.
EJEMPLO 4 Renaturalización y lipidación de tetranectina-apolipoproteína A-I a) Método general Se disuelve POPC o DPPC cristalina pura (Lipoid, Suiza) en un amortiguador acuoso (amortiguador de lipidación) que contiene colato en una relación molar de fosfolípido : colato de 1:1.35. Las mezclas se han incubado bajo atmósfera de nitrógeno y se protegen de la luz a temperatura ambiente (POPC) o a 55 °C (DPPC) hasta que se obtiene una solución clara. La solución clara de lípido-colato se enfría a 4°C (POPC) y se almacena a 41°C (DPPC) . La tetranectina-apolipoproteína A-I purificada se ha agregado a 4°C (POPC) o 41°C (DPPC) en la relación definida de apolipoproteína : fosfolípido. Para formación de partículas lipídicas la mezcla de reacción se incuba durante la noche a 4°C (POPC) o 41°C (DPPC) bajo una atmósfera de nitrógeno y se protege de la luz. Finalmente se extrae colato por diálisis extensa (4°C/41°C)' contra amortiguador de lipidación. Finalmente las muestras se centrifugan para eliminar el material precipitado.
Las soluciones de lípido solubilizadas de colato que contienen POPC puro o DPPC puro se han preparado como se describe en lo anterior. Las mezclas lipídicas se preparan al combinar las soluciones de lípidos en la relación deseada seguido por almacenamiento a la Tra respectiva (Tm = temperatura de transición de fase) . La formación de partículas lipídicas de tetranectina-apolipoproteína A-I se realiza como se describe para las soluciones lipídicas puras pero a la Tm respectiva de la mezcla lipídica seleccionada.
Se han probado los siguientes amortiguadores de lipidación: 1. Amortiguador de fosfato de potasio 50 mM suplementado con clorhidrato, de arginina 250 mM, sacarosa 7.51 a pH 7,5. 2. Amortiguador de fosfato ácido dipotásico 50 mM suplementado con clorhidrato; de arginina 250 mM, sacarosa 7.5%, metionina 10 mM a pH 7.5. 3. Tris-hidroxilamino metano (TRIS) 250 mM suplementado con NaCl 140 mM,' metionina 10 mM a pH 7.5. 4. Amortiguador de fosfato ácido dipotásico 50 mM suplementado con clorhidrato de arginina 250 mM, trehalosa 7%, metionina 10 mM a pH 7.5.
La homogeneidad de las partículas lipídicas formadas a partir de muestras de tetranectina-apolipoproteína A-I se han determinado por SEC analítica (figuras 11 y 12) . En general, la selección del amortiguador de lipidación tiene únicamente un efecto menor en comparación con la selección del fosfolípido. Las partículas de DPPC-lípido eluyen como un pico principal mientras que las partículas de POPC- lípido muestran un patrón de dos picos . La selección del amortiguador de lipidación es alterada por el proceso de purificación de la apolipoproteína y el suministro de apolipoproteína libre de lípido estabilizada. Se ha demostrado que la formación de partículas lipídicas es factible sin importar el amortiguador de lipidación. Entre los diversos amortiguadores probados el amortiguador de lipidación más apropiado se identificó que es Tris 250 mM, NaCl 140 mM, metionina 10 mM, pH 7.5.
Las mezclas de lipidación contienen una cantidad definida de apolipoproteína cada una y la cantidad de fosfolípido, por ejemplo, POPC se calcula en consecuencia. Todos los cálculos de la cantidad molar de lípido se basan en el monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I. b) POPC y colato TABLA 6: Formación de partículas lipídicas con tetranectina- apolipoproteína A-I como ejemplo utilizando POPC pura. Las relaciones molares de apolipoproteína: fosfolípido se calculan para el monómero de proteína. Controles: apolipoproteína incubada sin adición de lípido (Apo pura) y lípido sin apolipoproteína (sin Apo) *claro después de centrifugación Las relaciones molares de 1:40 a 1:160 permanecen claras durante todo el proceso. No se observó turbidez a través del exceso de fosfolípido ni precipitación de proteína .
Se han analizado muestras de partículas de lípidos mediante PAGE nativa (véase la figura 13) . El patrón de banda más homogéneo se encontró con la muestra 1:80 (carril 4). Además, el proceso de 1 x congelamiento/recalentamiento (-80°C) no altera la apariencia de la muestra (carril 5) . Los patrones de banda de las muestras 1:320 y 1:160 indican un producto inhomogéneo que resulta en bandas múltiples (carril 2 y 3) . Las muestras 1:40 !y también 1:20 tienen bandas adicionales debajo de la banda de producto principal (carril 6 y 7) . El patrón de desplazamiento de la tetranectina-apolipoproteína A-I pura se muestra en el carril 8 de la figura 13.
Se utilizó el análisis SEC-MALLS para obtener información más detallada acerca de la homogeneidad de las partículas lipídicas y su composición de apolipoproteína-fosfolípido (análisis de conjugado de proteína) . La figura 14 muestra el cromatograma de muestras resueltas por SEC (detección UV280) . Aquí, la muestra 1:160 se divide en tres picos separados. La muestra 1:80 parece contener por lo menos dos especies de tamaño diferente como se muestra como un pico doble. El pico obtenido de la muestra 1:20 muestra el producto más homogéneo.
El experimento se llevó a cabo utilizando tetranectina-apolipoproteína A-I (3.84 mg/ml; 10 mg por muestra) y la relación molar de apolipoproteína : fosfolípido se incrementa de 1:40 a 1:80 en las etapas de 5. A relaciones molares inferiores a 1:40 la formación de partículas lipídicas es incompleta. Las relaciones molares superiores a 1:80 se excluyen experimentalmente : después de la separación de colato por diálisis las muestras se vuelven turbias . Además, las partículas de lípido se vuelven más heterogéneas a relaciones lipídicas mayores.
TABLA 7: Formación de partículas lipídicas de tetranectina- Apolipoproteína A-I utilizando POPC puro. La relación molar de apolipoproteína: fosfolípido se ha calculado en base en el monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I *volumen antes y después de diálisis, 2.6 mi **dentro de la SD del método Durante la incubación a la temperatura de transición de -3°C todas las muestras permanecieron ópticamente claras. Después de separación del colato por diálisis se observó incremento en la turbidez de las muestras 1:40 a 1:65. El precipitado se puede separar por centrifugación y las muestras permanecen claras posteriormente .
Se utilizó análisis SEC-MALLS para obtener información detallada de la homogeneidad de las partículas lipídicas formadas y su composición de apolipoproteína-fosfolípido (análisis de proteína- conjugado) . Todas las partículas lipídicas fueron comparablemente homogéneas en cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC; figura 15) mostrando un pico posterior menor el cual es más pronunciado a relaciones molares menores. Además, existe un desplazamiento perceptible en el patrón de pico a relaciones molares mayores hacia pesos moleculares mayores . Los tiempos de retención respectivos se proporcionan en la Tabla 8.
TABLA 8: Sumario de los resultados de cromatografía de exclusión de tamaño; los porcentajes se calculan por integración del área bajo la curva (ABC) .
El análisis de proteína-conjugado (resumido en la Tabla 8) permite el cálculo del peso molecular total de la proteína (MW de proteína) y el componente lipídico (MW de lípido) para cada partícula lipídica eluida de la columna SEC. En base en los pesos moleculares de monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I (32.7 kDa) y POPC (760 Da) se puede calcular la composición de la partícula lipídica (n proteína y n POPC) . El peso molecular del componente de apolipoproteína encontrado en el pico principal de partícula lipídica en todas las relaciones molares es de aproximadamente 100 kDa que corresponde a un trímero de tetranectina-apolipoproteína A-I por partícula lipídica. La relación n (POPC) /n (monómero de proteína) proporciona el número de moléculas POPC por monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I en la partícula lipídica. El número de moléculas de POPC por monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I varía entre 54 y 75 a través de las relaciones molares de 1 : 40 hasta 1 : 80 que se han aplicado. El valor de % de proteína es un parámetro para el grado de lipidacion. Cuanto menor es el porcentaje de la proteína en la partícula lipídica mayor es el grado de lipidacion.
TABLA 9 : Sumario del análisis de conjugado de proteína de partículas lipídicas de POPC y tetranectina-apolipoproteína A-I como se muestra en , la figura DPPC y colato Antes de la lipidación se dializa tetranectina-apolipoproteína A-I contra KH2P04 250 mM, clorhidrato de arginina 250 mM, trehalosa 7%, metionina 10 mM a pH 7.5. La tetranectina-apolipoproteína A-I (3.84 mg/ml, 3 mg por muestra) se ha lipidado utilizando relaciones molares de 1:60 a 1:100 incrementado las concentraciones de lípidos en la etapa de 5. El amortiguador dé lipidación es Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, metionina 10 mM, ! pH 7.5.
TABLA 10: Generalidades de muestra! de partículas lipídicas de apolipoproteína con DPPC *calculado para monóraero proteínico Durante la formación de la partícula lipídica no se observaron ni precipitación de proteina ni turbidez a través del exceso de lípido. El rendimiento de tetranectina-apolipoproteína A-I en el producto final es mayor cuanto más DPPC se utiliza para lipidación.
Se encontró que la apolipoproteína libre de lípido residual en la muestra 1:20 sobre PAGE nativo (carril 3, figura 17). La muestra 1:40 y 1:60 tiene una apariencia más homogénea (carriles 4 y 5) sobre PAGE nativa mientras que las muestras 1:80 y 1:100 contienen bandas moleculares superiores adicionales por encima de la banda de partícula lipídica principal (carriles 6 y 7) .
Se utilizó el análisis de conjugado de proteína SEC- ALLS para caracterizar la composición de las partículas lipídicas obtenidas después de formación de partículas de lípidos DPPC (MW de DPPC: 734 Da) . Se obtuvieron picos SEC homogéneos en relaciones molares de 1:80 e inferiores. A relaciones lipídicas mayores surge un pre-pico (véase, por ejemplo, la muestra 1:90 en la Tabla 11) .
TABLA 11: RESUMEN DE ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA SEC- MALLS DE PARTICULAS LIPIDICAS DE DPPC Y TETRANECTINA- APOLIPOPROTEINA A-I El grado más alto de lipidación (porcentaje más bajo de proteína) se encuentra con las relaciones molares 1:80 a 1:90. Además, DLS muestra la formación de partícula más homogénea en relaciones 1:80 a 1:90 (>98%) a un tamaño de partícula de 14-17 nm. d) 75% de DPPC / 25% de POPC La formación de partícula lipídica se lleva a cabo de acuerdo a lo indicado en los incisos a) a c) de este ejemplo con los siguientes parámetros: Proteína: tetranectina-apolipoproteína A-I a 3.84 mg/ml, 3 mg por muestra Amortiguador de lipidación Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 nM, metionina 10 mM, pH 7.5 Lipidación: a 34°C Diálisis: a 4°C Relaciones molares probadas: 1:60 a 1:100 con incremento en las etapas lipídicas de 5 La formación de partículas lipídicas es directa y comparable con los procesos que utilizan lípidos puros. Todas las muestras permanecen claras durante el proceso y la diálisis. El rendimiento de partículas lipídicas es similar para todas las relaciones probadas (~85%) . El análisis SEC-MALLS mostró que la relación molar de 1:80 resulta en partículas lipídicas más homogéneas con 90.9% de pico principal, sin pre-pico y 9.1% post-pico. El análisis de conjugado de proteína mostró la presencia de un trímero de tetranectina-apolipoproteína A-I por partícula lipídica en las especies principales para todas las muestras (véase la figura 18 y las tablas 12 y 13) TABLA 12: SUMARIO DE LOS RESULTADOS SEC; LOS PORCENTAJES CALCULARON POR INTEGRACIÓN DE LA ABC TABLA 13: SUMARIO DE ANALISIS PROTEINA-CONJUGADO DE 75% DE DPPC/25% DE POPC Y PARTICULAS LIPIDICAS DE TETRANECTINA- APOLIPOPROTEINA A-I e) 50% de DPPC / 50% de POPC La formación de partícula lipídica se lleva a cabo de acuerdo a lo presentado en los incisos a) a c) de este ejemplo, con los siguientes parámetros: Proteína: tetranectina-lipoproteína A-I a 3.84 mg/ml, 3 mg por muestra Amortiguador de lipidación Tris-HCl 250 ttiM, NaCl 140 nM, metionina 10 m , pH 7.5 Lipidación: a 27°C Diálisis: a temperatura ambiente Relaciones molares probadas: 1:60 a 1:100 con lípido en aumento en etapas lipídicas de 5 Todas las muestras permanecieron claras durante el proceso y la diálisis. En rendimiento de partículas lipídicas fue similar para todas las relaciones probadas.
TABLA 14: SUMARIO DE RESULTADOS SEC; LOS PORCENTAJES SE CALCULAN POR INTEGRACION DE LA ABC Utilizando una mezcla lipídica de 50% de DPPC y 50% de POPC para la formación de partículas lipídicas de tetranectina-apolipoproteína A-I se obtiene el producto más homogéneo en una relación molar de 1:70 (véase tabla 14) . El producto es 89.9% puro con respecto al pico principal y contiene un trímero único de tetranectina-apolipoproteína A-I (véase la tabla 15) .
TABLA 15: SUMARIO DE ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE PARTÍCULAS LIPIDICAS CON 50% DE DPPC/50% DE POPC Y TETRANECTINA-APOLIPOPROTEINA A-I 25% de DPPC / 75% de POPC La formación de partícula lipídica se lleva a cabo de acuerdo a lo presentado en los incisos a) a c) de este ejemplo, con los siguientes parámetros: Proteína : tetranectina-apolipoproteína A-I a 3 . 84 mg/ml, 3 mg por muestra Amortiguador de lipidación Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 nM, metionina 10 mM, pH 7.5 Lipidación: a 18°C Diálisis: a temperatura ambiente Relaciones molares probadas: 1:60 a 1:100 con lípido en aumento en etapas de 5 La formación de partículas es directa y comparable con el proceso que utiliza lípidos puros. Todas las muestras permanecen claras durante el proceso y la diálisis .
TABLA 16: SUMARIO DE RESULTADOS DE SEC; LOS PORCENTAJES SE CALCULAN POR INTEGRACION DE LA ABC Utilizando una mezcla lipídica de 25% de DPPC y 75% de POPC para la formación de partículas lipídicas de tetranectina-apolipoproteína A- I se obtiene el producto más homogéneo en una relación molar de 1:60 (véase tabla 17) .
El producto es 90.2% puro con respecto al pico principal y contiene un trímero único de tetranectina-apolipoproteína A-I (véase la tabla 15) .
TABLA 17: SUMARIO DE ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE PARTÍCULAS LIPIDICAS CON 25% DE DPPC/75% DE POPC Y TETRANECTINA-APOLIPOPROTEINA A-I g) Formación de partícula lipídica utilizando Zwittergent11* La formación de partícula lipídica se lleva a cabo de acuerdo a lo indicado en los incisos a) a c) de este ejemplo con los siguientes parámetros y con la excepción de que se sustituye colato por el detergente sintético ZwittergentMR: Proteína: tetranectina-apolipoproteína A-I a 23 . 5 mg/ml Amortiguador: Tris-HCl 50 mM, clorhidrato de guanidinio 7 . 2 M, metionina 10 mM, pH 8 Amortiguador de lipidacion: Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7 . 5 100% de POPC, relación molar de apolipoproteína : fosfolípido = 1:60 TABLA 18: GENERALIDADES DE MUESTRAS DE DIVERSOS ENFOQUES Y OBSERVACIONES/PARAMETROS DE LA FORMACION DE PARTICULAS LIPIDICAS Las partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I han sido analizadas sobre PAGE nativa. La tetranectina-apolipoproteína A-I libre de lípidos se desplaza a 140 kba (carril 1 en la figura 19) mientras que las partículas de lípidos muestran un desplazamiento característico \ a un peso molecular mayor entre 232 kDa y 440 kDa.
La tetranectina-apolipoproteína A-I libre de lípidos pero sin partículas de lípidos se detectó en todas las muestras preparadas con únicamente 0.1 x CMC del detergente respectivo (figura 19, carriles 2, 8, 13 y 19). No obstante, una concentración de detergente de 0.5 x CMC fue suficiente para que Zwittergent 3-8 y 3-10 permitiera la formación de partícula lipídica con tetranectina-apolipoproteína A-I (carriles 3, 9 y 14). Con ZwittergentMR 3-12 la formación de partícula lipídica no se produjo hasta que se alcanzó una concentración de 2.0 x CMC (carril 21) .
La figura 20 muestra el cromatograma SEC-MALLS de partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando 3x CMC del ZwittergentMR 3.8 y POPC (relación molar de apolipoproteína : fosfolípido = 1:60). Los resultados del análisis de conjugado de proteína se resumen en la tabla 18. La fracción de partícula lipídica consiste de dos especies diferentes como se muestran en dos picos que se superponen en el cromatograma SEC. No obstante, estas dos especies son muy similares, diferenciándose principalmente en el número de moléculas de tetranectina-apolipoproteína A-I por partícula (4.2 para el pico 1 y 3.5 para el pico 2 ) .
TABLA 19: SUMARIO DEL ANALISIS DE PROTEINA-CONJUGADO DE PARTICULAS LIPIDICAS FORMADAS EN PRESENCIA DE Zwittergent1® 3 . 8 La figura 21 muestra el cromatograma del análisis SEC-MALLS y la tabla 19 el resumen del análisis de conjugado de proteína para partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando 2 x CMC de ZwittergentMR 3.10 y POPC (relación molar de apolipoproteína: fosfolípido = 1:60). Ambos picos contienen partículas lipídicas que comprenden 3.5 y 5 moléculas de tetranectina-apolipoproteína A-I, respectivamente.
TABLA 20: SUMARIO DEL ANALISIS DE PROTEINA-CONJUGADO DE PARTICULAS LIPIDICAS FORMADAS EN PRESENCIA DEL Zwittergent1111 3-10 Los resultados de la formación de partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando ZwittergentMR 3-12 y POPC (relación molar de apolipoproteína: fosfolípido = 1:60) se resume en la tabla 21. La fracción de partícula lipídica consiste de dos especies diferentes como se muestran en dos picos que se superponen en el cromatograma SEC. No obstante, estas dos especies son muy similares, diferenciando principalmente en el número de moléculas de tetranectina-apolipoproteína A-I por partícula.
TABLA 21: SUMARIO DEL ANALISIS DE PROTEINA-CONJUGADO DE PARTICULAS LIPIDICAS FORMADAS EN PRESENCIA DEL ZwittergentMR 3-12 Los resultados de la formación de partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I utilizando colato y POPC (relación molar de apolipoproteína: fosfolípido = 1:60) se resumen en la tabla 21. La fracción de partículas lipídicas consiste de dos especies diferentes como se muestran en dos picos que se superponen en el cromatograma SEC. No obstante, estas dos especies son muy similares, diferenciándose principalmente en el número de moléculas de tetranectina-apolipoproteína A-por partícula.
TABLA 22: SUMARIO DEL ANALISIS DE PROTEINA-CONJUGADO DE PARTICULAS LIPIDICAS FORMADAS EN PRESENCIA DE COLATO EJEMPLO 5 METODO DE DILUCION RAPIDA PARA RENATURALIZACION Y FORMACION DE PARTICULAS LIPIDICAS a) POPC y colato de sodio Tetranectina-apolipoproteína A-I se expresa en E. coli y se purifica de acuerdo con los ejemplos l y 3 (protocolo 1) . Después de purificación el amortiguador se intercambia por diafiltración a una solución que contiene Tris 250 mM, NaCl 140 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4. La concentración de proteína se ajusta a 28 mg/ml.
Se prepara una solución concentrada de lípidos al disolver 100 moles/1 de POPC en un amortiguador que contiene Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM,. colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a temperatura ambiente. La solución concentrada de lípidos se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. El amortiguador de renaturalización se prepara al diluir 77 mi de la mezcla concentrada de lípidos en 1478 mi de Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4. Este amortiguador se agita durante 7 horas adicionales a temperatura ambiente.
La renaturalización y formación de partículas lipídicas se inicia por la adición de 162 mi de tetranectina-apolipoproteína A-I en Tris 250 mM, NaCl 140 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4 a amortiguador de renaturalización. Esto resulta en una dilución 1:10 de clorhidrato de guanidinio. La solución se incuba a temperatura ambiente durante 16 horas mientras se agita constantemente. La separación del detergente se lleva a cabo por diafiltración.
TABLA 23: SUMARIO DE ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE PARTICULAS LIPIDICAS OBTENIDAS POR DILUCION RAPIDA CON POPC La tetranectina-apolipoproteína A-I se expresa en E. coli y se purifica de acuerdo con los ejemplos 1 a 3 (protocolo 2) . Después de purificación, el amortiguador se intercambia por diafiltración a una solución que contiene Tris 50 mM, L-metionina 10 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4. La concentración de proteína se ajusta a 20.4 mg/ml.
La solución concentrada de lípidos se prepara al disolver 100 moles/1 de fosfolípido (POPCrDPPC en una relación 3:1) en un amortiguador que contiene Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, L-metionina 10 mM, colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a temperatura ambiente. El amortiguador de renaturalización se prepara al diluir 3.7 mi de solución concentrada de lípidos en 35.6 mi de Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4. Este amortiguador se agita durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente.
La renaturalización y formación de partículas lipídicas se inicia por la adición de 9.8 mi de tetranectina-apolipoproteína A-I en Tris 50 mM, L-metionina 10 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 8.0 para amortiguador de renaturalización. Esto resulta en una dilución 1:5 del clorhidrato de guanidinio. La solución se incuba a temperatura ambiente durante la noche mientras se agita constantemente. La separación; del detergente se lleva a cabo por diafiltración.
TABLA 24: SUMARIO DEL ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE PARTICULAS LIPIDICAS OBTENIDAS POR DILUCION RAPIDA CON UNA MEZCLA DE POPC/DPPC/COLATO b) POPC y DPCC y colato de sodio La tetranectina-apolipoproteína A-I se expresa en E. coli y se purifica de acuerdo con los ejemplos 1 a 3. Después de purificación, el amortiguador se intercambia por diafiltración en una solución que contiene Tris 250 mM, NaCl 140 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4. La concentración de proteína se ajusta a 30 mg/ml.
Se preparan dos soluciones concentradas de lípidos separadas. La solución A se prepara al disolver 100 moles/1 de POPC en un amortiguador que contiene Tris-HC1 250 mM, NaCl 140 mM, colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a temperatura ambiente. La solución B se prepara al disolver 100 moles/1 de DPPC en Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a 41°C. Las soluciones de concentrado de lípido A y B se mezclan en una relación de 3:1 y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. El amortiguador de renaturalización se prepara al diluir 384 mi de una mezcla concentrada lipídica en 6365 mi de Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4. Este amortiguador se agita durante 24 horas adicionales a temperatura ambiente.
La renaturalización y formación de partículas lipídicas se inicia por la adición de 750 mi de una solución de tetranectina-apolipoproteína A-I en Tris 250 mM, NaCl 140 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4 al amortiguador de renaturalización. Esto resulta en una dilución 1:10 del clorhidrato de guanidinio. La solución se incuba a temperatura ambiente durante por lo menos 12 horas mientras se agita constantemente. La separación del detergente se lleva a cabo por diafiltración .
TABLA 25: SUMARIO DEL ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE LA PARTICULA LIPIDICA OBTENIDA POR DILUCION RAPIDA CON POPC:DPPC = 1:1 c) Concentraciones diferentes de clorhidrato guanidinio La tetranectina-apolipoproteína A-I de acuerdo con la invención se expresa en E. coli y se purifica sobre un proceso cromatográfico de afinidad de quelato de metal a partir de cuerpos de inclusión (véanse ejemplos 1 a 3) . Después de la purificación, el amortiguador se intercambia por diafiltración en una solución que contiene Tris 250 mM, NaCl 140 mM, clorhidrato de guanidinio 6.7 M, pH 7.4. La concentración de proteína se ajusta a 28 mg/ml .
Se prepara una solución concentrada de lípido al disolver 100 moles/1 de POPC en un amortiguador que contiene Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a temperatura ambiente. La solución concentrada de lípidos se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. El amortiguador de renaturalización se prepara al diluir una solución concentrada de lípido diluyente en Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, H 7.4. Este amortiguador se agita durante 12 horas adicionales a temperatura ambiente. Cantidades variables de tetranectina-apolipoproteína A-I se diluyen en amortiguador de renaturalización: 1:5, 1:7.5, 1:10, 1:12.5. Esto resulta en concentraciones residuales diferentes de clorhidrato de guanidinio en el amortiguador de renaturalización. Se permite que la solución se agite a temperatura ambiente o/n para iniciar la renaturalización y la formación de partículas lipídicas. La separación del detergente se lleva a cabo por diálisis.
TABLA 26: SUMARIO DEL ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA DE PARTICULAS LIPIDICAS OBTENIDAS POR DILUCION RAPIDA CON DIFERENTES RELACIONES DE DILUCION POPC y colato de sodio en presencia de urea La tetranectina-apolipoproteína A-I se expresa en E. coli y se purifica de acuerdo con los ejemplos 1 a 3. Después de la purificación el amortiguador se intercambia por diafiltración a una solución que contiene Tris 250 mM, NaCl 140 mM, urea 6.7 M, . pH 7.4. La concentración de proteína se ajusta a 28 mg/ml .
Se prepara una solución de concentrado de lipido al disolver 100 moles/1 de POPC en un amortiguador que contiene Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, colato de sodio 135 mM, pH 7.4 a temperatura ambiente. La solución concentrada de lipido se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente . El amortiguador de renaturalización se prepara al diluir 1 77 mi de la mezcla de concentrado de lipido en 1478 mi de I Tris-HCl 250 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4. Este amortiguador se agita durante 7 horas adicionales a temperatura ambiente.
La renaturalización y formación de partículas lipídicas se inicia por la adición de 162 mi de una solución de tetranectina-apolipoproteína A-I en Tris 250 mM, NaCl 140 mM, urea 6.7 M, pH 7.4 para amortiguador de renaturalización. Esto resulta en una dilución 1:10 de la urea. La solución se incuba a temperatura ambiente durante 16 horas mientras se agita constantemente. La separación del detergente se lleva a cabo por diafiltración . e) POPC y colato de sodio y apolipoproteína A-I natural En otro ejemplo un segundo método, la apolipoproteína A-I humana (apolipoproteína A-I) natural en clorhidrato de guanidinio 6.7 M, Tris 50 mM, metionina 10 mM a pH 8.0 se diluye 1:5 (v/v) en amortiguador de lipidación que resulta en una concentración de proteína de 0.6 mg/ml. El amortiguador de lipidación consiste de colato 7 mM, POPC 4 m y DPPC 1.3 mM que corresponde a una relación de lípido respecto a proteína de 240:1. Se utiliza SEC-MALLS para analizar la formación de complejo. Aproximadamente dos moléculas de apolipoproteína se encuentran en un complejo que consiste de aproximadamente 200 moléculas lipídicas.
TABLA 27: SUMARIO DEL ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINA EJEMPLO 6 FORMACION DE PARTICULAS LIPIDICAS A PARTIR DE PROTEINA DESNATURALIZADA O NATIVA El método como se reporta en el ejemplo 4 (primer método) requiere apolipoproteína nativa para formación de partículas lipídicas mientras que el método que se reporta en el ejemplo 5 (segundo método) inicia con apolipoproteína completamente desnaturalizada para formación de partículas lipídicas .
En un primer método ejemplar la tetranectina-apolipoproteína A-I desnaturalizada en clorhidrato de guanidinio 6.7 M, Tris 50 mM, metionina 10 mM a pH 8.0 se dializa extansamente contra un amortiguador que consiste de Tris 250 mM, NaCl 140 mM, metionina 10 mM a pH 7.5 a una concentración de proteína de 3.46 mg/ml . Una mezcla de POPC y colato después se agrega para proporcionar una concentración final de POPC 6 mM y colato 8 mM en la solución. Esto corresponde a una relación de 60 moléculas de POPC por molécula de monómero de tetranectina-apolipoproteína A-I (60:1). El detergente se retira posteriormente por diafiltración . El análisis de los complejos de proteína- lípido formados es por SEC-MALLS. Utilizando este método se forma un producto heterogéneo en donde aproximadamente 60% de las especies formadas comprenden más de tres monómeros de tetranectina-apolipoproteína A-I.
En un segundo método ejemplar tetranectina-apolipoproteína A-I desnaturalizada en clorhidrato de guanidinio 6.7 M, Tris 50 mM, metionina 10 mM a pH 8.0 se diluye directamente 1:10 (v/v) en amortiguador de lipidación que resulta en una concentración de proteína de 2.5 mg/ml. El amortiguador de lipidación consiste de colato 6 mM y POPC 4.5 mM que corresponde a una relación de lípido respecto a proteínas de 60:1. Utilizando este método se forma un producto homogéneo que comprende más de 90% de especies formadas únicas en donde 60 moléculas de lípido se unen por molécula de tetranectina-apolipoproteína A-I (véase la figura 22) .
TABLA 28: SUMARIO DE ANALISIS DE CONJUGADO DE PROTEINAS EJEMPLO 7 LIPIDACION DE INSULINA-F CON POPC/DPPC SOLÜBILIZADO CON COLATO O CON Zwittergent*111 La proteína seleccionada para formación de partículas lipídicas es insulina disponible comercialmente (HumalogMR, Insulin Lispro, Lilly) . El peso molecular de la proteína es 5808 Da. Para incrementar el límite de detección para insulina en la partícula lipídica la proteína se ha marcado con NHS-fluoresceína (éster N-hidroxisuccinimídico del ácido 6- [fluorescein-5 (6) carboxamido] hexanoico, Sigma Aldrich #46940-5MG-F) .
La lipidacion mediada por Zwittergent™1 y colato de insulina marcada con NHS- fluoresceína (insulina-F) se lleva a cabo como se ha indicado en el ejemplo 4 utilizando una mezcla 1:1 de POPC y DPPC. Una mezcla lipídica 0.5 mM se disuelve ya sea en 1 x CMC de colato, 2 x CMC de ZwittergentMR 3-8 o 5 x CMC de ZwittergentMR 3-10 en PBS, pH 7.4. La solubilización de los lípidos se obtiene a 45°C durante 1 h en un baño ultrasónico. Se agrega insulina-F al lípido solubilizado en una relación molar de proteína: lípido de 1:2 (ZwittergentMR 3-8) o 1:1.2 ( ZwittergentMR 3-10 y colato). Las mezclas de lipidación se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por diálisis extensa contra PBS, pH 7.4 para eliminar el detergente.
Las partículas de' lípido que se forman y las muestras control se analizan en SE-HPLC utilizando detección fluorescente (494 nm de ext, 521 nm de em) y absorción UV280. Se analizan tres muestras diferentes por enfoque de lipidación en SE-HPLC: Insulina-F disuelta en PBS, liposomas sin insulina F en PBS y partículas lipídicas que comprenden insulina-F. La insulina-F no lipidada eluye de la columna a aproximadamente 40 min de tiempo de elución y el pico se detecta por fluorescencia y detección UV280. Las muestras de insulina-F lipidadas se eluyen de las columnas en dos picos separados detectados por fluorescencia y UV280. El pico posterior (pico máximo a aproximadamente 40 min) realiza migración conjunta con la muestra control de insulina-F. El pico temprano a 15 min de tiempo de elución tiene un peso molecular mayor que la insulina-F pura y consiste de insulina-F lipidada. Las partículas lipídicas libres de proteína eluyen a 15 min de tiempo de elución.
EJEMPLO 8 APLICACION DE^ APOLIPOPROTEINA a) Impacto de DPPC y POPC sobre la actividad de LCAT Las partículas lipídicas que comprenden ya sea palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) son ya sea apolipoproteína A-l natural recombinante o tetranectina-apolipoproteína A-I y se i examinaron para su capacidad , para soportar la esterificación de colesterol por LCAT.
Se incorpora colesterol tritiado (4% en relación al contenido de fosfatidilcolina en una base molar) en la partícula lipídica por adición de una solución etanólica de colesterol. La capacidad del complejo proteína- lípido resultante para soportar esterificación de colesterol catalizada por LCAT se prueba en presencia de enzima LCAT recombinante 0.2 pg/ml (sustancia bioquímica ROAR) en 125 µ? (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaN3 1 mM, pH 7.4; 2 mg/ml de HuFAF albúmina; Beta-mercaptoetanol 4 mM) durante 1 hora a 37°C. La reacción se detiene por la adición de cloroformo :metanol (2:1) y se extraen los lípidos. Se calcula en "por ciento" de esterificación después de la separación de colesterol-éster colesterílico por CCD y conteo de centelleo. Dado que menos de 20% del trazado se incorporó en el éster formado, la velocidad de reacción se puede considerar constante bajo las condiciones experimentales. Los datos se ajustaron a la ecuación de ichaelis Menten utilizando el programa XLfit (IDBS) . Para una visualización de los resultados véase la figura 3. b) Impacto de las mezclas DPPC/POPC sobre la actividad de LCAT Se prepararon partículas de lípidos utilizando colato como detergente al mezclar apolipoproteína A-I natural recombinante con 3H-colesterol , una mezcla de DPPC/POPC y colato en relaciones molarés 1:4:80:113. Las mezclas de DPPC/POPC contienen ya sea 100% de POPC; 75% de POPC; 50% de POPC O 25% de POPC.
Después de la separación de colato por diálisis, se probó la capacidad del complejo proteína-lípido resultante para soportar esterificación de colesterol catalizada por LCAT. Se incorporó a la 3H-colesterol (4% en relación al contenido de fosfatidilcolina en una base molar) en la partícula lipídica por adición de una solución etanólica de colesterol. La capacidad del complejo proteína-lípido resultante para soportar esterificación de colesterol catalizada por LCAT se probó en presencia de 0.2 µg/ml· de enzima LCAT recombinante (ROAR bioquímica) en 125 µ? (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaN3 1 mM; pH 7.4; 2 mg/ml de albúmina HuFAF, beta-mercaptoetanol 4 mM) durante 1 hora a 37 °C. La reacción se detuvo por adición de cloroformo :metanol (2:1) y se extrajeron los lípidos. El "por ciento" de esterificación se calculó después de la separación de colesterol-éster de colesterilo por CCD y cuenta de centelleo. Dado que menos de 20% del trazador se incorporó en los ésteres, la velocidad de reacción se puede considerar como constante en las condiciones experimentales . Se ajustaron los datos por la ecuación de Michaelis Menten utilizando el programa XLfit (IDBS) y se muestran en la figura 4.
TABLA 3a: PARAMETROS CINETICOS APARENTES c) Salida de colesterol a células espumosas derivadas de THP-1 Las células THP-1 humanas similares a macrofagos se obtuvieron al exponer células de leucemia monocíticas THP-1 a miristato acetato de forbol . Posteriormente las células se cargan por cultivo adicional en presencia de LDL acetilado que contiene trazador de 3H-colesterol . Este modelo de células espumosas después se expone durante 4 h-8 h a compuestos de prueba aceptores de colesterol (véase abajo) .
Los sobrenadantes de cultivo celular se cosecharon y las células se lisaron en NP40 5%. Se calculo la salida fraccionada como la relación de radioactividad de colesterol en el sobrenadante en relación a la suma de la radioactividad en las células más sobrenadantes. La salida de las células expuestas a medio que no contiene aceptores se resta y se calcula la velocidad de . salida por ajuste lineal. La velocidad de salida se estandariza utilizando la salida de células a 10 µg/ml de apolipoproteína A-I natural como referencia (velocidad de salida relativa) . Las velocidades de salida relativa obtenidas en dos experimentos separados se grafican como función de la concentración de aceptor de colesterol y los datos se ajustan a la ecuación de Michaelis Menten .
Se llevaron a cabo experimentos en paralelo utilizando células expuestas a un agonista RXR-LXR que se sabe que regula por aumento los transportadores de ABCA-1 y que desvía el transporte de colesterol a la salida mediada por ABCA-1. Únicamente se observó una influencia ligera de la mezcla lepídica en las series probadas (figura 5 y tabla 29) .
TABLA 29: MUESTRAS DIFERENTES El pretratamiento con RXR-LXR de la células espumadas incrementa en gran medida la salida al material no lipidado con un incremento de seis veces la velocidad máxima con respecto a las células no tratadas . El impacto sobre las partículas lipídicas es mucho menor, con un incremento doble que refleja una menor contribución del transportador de ABCA-1 a la salida de colesterol (figura 6) . d) Estudio in vivo Se estudiaron cinco variantes de partículas lipídicas i) solamente POPC; ii) solamente DPPC; iii) POPC: DPPC 3:1 iv) POPC: DPPC 1:1 v) DPPC:SM 9:1 Se suministró por infusión intravenosa a conejos durante 0.5 h a 80 mg/kg (n = 3 conejos/compuesto de prueba) seguido por muestreo de sangre seriada durante 96 h posteriores a infusión.
Análisis de concentraciones de apolipoproteína con ELISA: concentraciones de medicamento datos sobre valores plasmáticos de enzimas hepáticas, colesterol y éster de colesterol.
Las concentraciones en plasma fueron muy similares para todas las composiciones probadas mostrando una pequeña fase de "distribución" inicial pronunciada seguida por una declinación lineal logarítmica de concentraciones (figura 7, tabla 3) .
TABLA 3: DATOS FARMACOCINÉTICOS Los parámetros farmacocinéticos (PK, por sus siglas en inglés) determinados fueron similares para todos los compuestos probados. También se encontró una variabilidad interindividual baja. Las vidas medias determinadas son cercanas a 1.5 días, es decir, aumentaron en comparación con apolipoproteína A-I natural. El volumen de distribución es similar al del volumen en plasma (aproximadamente 40 ml/kg en conejos) . f) Movilización de colésterol El colesterol se movilizó y esterificó en plasma.
Las concentraciones plasmáticas de éster de . colesterilo continuaron aumentando incluso después de que la tetranectina-apolipoproteína A-I ya había disminuido. Cuando las concentraciones plasmáticos de tetranectina-apolipoproteína A-I habían disminuido a 0.5 mg/ml (aproximadamente 50% de apolipoproteína A-I natural normal) aún eran detectables concentraciones aumentadas de éster de colesterol (figura 8) . g) Liberación de enzimas hepáticas Las partículas lipídicas que comprenden tetranectina-apolipoproteína A-I que contienen POPC no inducen liberación de enzimas hepáticas (figura 1) . De manera similar a conejo, una inyección i.v. única de tetranectina-apolipoproteína A-I de acuerdo con la presente invención que contiene POPC o mezclas de POPC/DPPC son inocuas en ratones.
La composición de apolipoproteína que contiene DPPC:POPC en una relación molar de 1:3 es comparable con POPC únicamente (figura 9) .
No se observó hemolisis significativa hasta dos horas después de la infusión en cualquiera de las cinco preparaciones. La hemolisis se determinó fotométricamente como color rojo en muestras de plasma obtenidas a las dos horas después de aplicación i.v. de tetranectina-apolipoproteína A-I. Se utilizó para calibración 100% de hemolisis de sangre completa (generada por 0.44% de Tritón X-100 como concentración final) (figura 10) . h) Efectos antiinflamatorios de tetranectina-apolipoproteína A-I sobre células endoteliales de vena umbilical humana El pasaje 5-10 de HUVEC (siglas en inglés para células endoteliales de vena umbilical humana) se incubaron en las preparaciones respectivas de tetranectina-apolipoproteína A-I durante 16 h y se estimularon con TNFOÍ durante las cuatro horas finales. Se detectó la expresión de superficie de VCAMl con anticuerpos específicos por FACS.
EJEMPLO 9 ESTABILIDAD DE LAS PARTICULAS LIPIDICAS apolipoproteína A-I natural que contiene una etiqueta histidina en la parte N terminal y un sitio de separación de IgA proteasa se expresó en E. coli y se purificó por cromatografía en columna como se ha informado en los ejemplos anteriores. Se retiró la etiqueta de histidina por separación por IgA proteasa. Las partículas lipídicas (partículas de HDL) se ensamblaron utilizando una relación 1:150 de proteína respecto a mezcla de fosfolípido de soja Lipoid S100. Las partículas se almacenaron en amortiguador que contiene fosfato de sodio 5 m y sacarosa 1% a un valor de pH de 7.3. SE-HPLC mostró tres picos distintos en la incubación después de lipidación e incubación durante 10 días. Después de la incubación a 40°C se puede detectar un pico predominante en un tiempo de retención de 10.8 minutos (47% de la proteína total) el cual está ausente en la muestra almacenada a 5°C. El pico a los 10.8 minutos indica la formación de montajes de peso molecular grande solubles debido a desestabilización de proteína.
Las partículas de HDL que contienen tetranectina-apolipoproteína A-I como se reporta en la presente las cuales se obtuvieron a partir de una mezcla POPC:DPPC (relación POPC respecto a DPPC de 3:1) también se incubaron a 5°C y 40°C. La incubación a temperatura elevada llevó a un ligero grado de formación pre-pico pero sin desplazamiento significativo a montajes de peso molecular altos a los 10.8 minutos (< 2% de incremento a los 11 minutos) . Esto indica estabilidad de partículas de HDL mejorada en comparación con la partícula que contiene apolipoproteína A-I natural.
EJEMPLO 10 MOVILIZACION DE COLESTEROL La eficiencia a la cual se moviliza colesterol en la sangre se puede determinar al comparar la excursión respectiva de colesterol total con concentraciones de apolipoproteína después de administración de apolipoproteína in vivo. Para una determinación cuantitativa el cociente del valor inicial corregido del área bajo la curva concentración-tiempo (ABC) del colesterol total y el área bajo la curva de concentración-tiempo de apolipoproteína se calcularon.
En este experimento se analizaron las siguientes sustancias : apolipoproteína A-I natural que contiene una etiqueta histidina en la parte N terminal y un sitio de separación de igA proteasa expresado en E. coli y purificado por cromatografía en columna como se reporta en los ejemplos anteriores; la etiqueta de histidina se retiró por separación del IgA proteasa; las partículas de lípidos (partículas de HDL) se ensamblaron utilizando una relación 1:150 de mezcla de proteína respecto a fosfolípido de frijol de soja Lipoid S100, variante de apolipoproteína A-I Milano; se ensamblaron partículas lipídicas (partículas HDL) utilizando una relación 1:40 de proteínas respecto a POPC, - tetranectina-apolipoproteína A-i como se indica en la presente; se ensamblaron partículas lipídicas (partículas HDL) utilizando una relación 1:60 de proteína respecto a POPC y DPPC (POPC y DPPC en una relación de 3:1) .
Las tres partículas de HDL se aplicaron a ratas. Los valores obtenidos para las relaciones ABC respectivas se muestran en la tabla 30.
TABLA 30: MOVILIZACION DE COLESTEROL hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención; es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para producir una partícula lipídica caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) proporcionar una primera solución que comprende proteína desnaturalizada, ii) agregar la primera solución a una segunda solución que comprende por lo menos un lípido y un detergente pero no la proteína, y iii) retirar el detergente de la solución obtenida en la etapa ii) y de esta manera producir una partícula lipídica.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda solución tiene aproximadamente 3 veces a aproximadamente 20 veces el volumen de la primera solución.
3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera solución está libre de lípidos.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID NO: 01, 02, 04 a 52, 66 a 67 o que comprende por lo menos un fragmento contiguo que comprende por lo menos 80% de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01, 02, 04 a 52, 66 o 67.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína es una tetranectina-apolipoproteína A-I tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 01 o la SEC ID NO: 02 o la SEC ID NO: 66 o la SEC ID NO: 67.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque por lo menos un lípido es dos fosfatidilcolinas diferentes.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque en la primera fosfatidilcolina es POPC y la segunda fosfatidilcolina es DPPC.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el detergente se selecciona de ácido cólico, ZwittergentMR o una sal del mismo.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende después de la etapa ii) y antes de la etapa iii) la siguiente etapa : iia) incubar la solución obtenida en la etapa ii) .
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la incubación y/o la separación es a una temperatura de 4°C a 45°C.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque la incubación es durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 60 horas .
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el detergente es un detergente con una CMC alta.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la separación es por diafiltración o diálisis o absorción.
14. Una partícula lipídica, caracterizada porque se obtiene por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una partícula lipídica de conformidad con la reivindicación 14.
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