MX2013001353A - Metodos y composiciones topicas para el cuidado de la piel. - Google Patents

Abstract

Composiciones tópicas que contienen lisado de células madre partenogenéticas humanas (hpSC), preferentemente en una dispersión liposómica, que reducen los signos visibles del envejecimiento de la piel y/o la celulitis.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES TÓPICAS PARA EL CUIDADO DE LA PIEL Referencias cruzadas a una solicitud relacionada Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. con número de serie 61 / 370 . 191 presentada el 3 de agosto de 2010 , el contenido de la cual se incorpora en su totalidad a la presente por referencia .

Declaración sobre investigación o desarrollo patrocinado por el gobierno federal No es aplicable.

Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para reducir los signos del envejecimiento de la piel, incluidos las líneas de expresión facial, arrugas, surcos, flaccidez de la piel y deshidratación cutánea. La presente invención también se refiere a composiciones y métodos para reducir la aparición de la celulitis.

Antecedentes de la invención El envejecimiento cronológico/intrínseco y el estrés provocado por fuentes extrínsecas (p. ej . , exposición a radiación ultravioleta, contaminantes medioambientales, productos químicos, humo del tabaco, temperaturas extremas) hacen que la piel humana presente líneas de expresión superficiales, arrugas y líneas más profundas (denominadas también surcos en la técnica) . Una piel en proceso de enve ecimiento se caracteriza por la pérdida de elasticidad y constricción, reducción de la función de barrera, mayor pérdida de agua transepidérmica, así como también cambios en las calidades y las cantidades de glucosaminoglucanos y proteoglucanos , y colágeno y fibras elásticas (p. ej . , una reducción en el número y el diámetro de fibras elásticas en la dermis papilar) .

Con el envejecimiento, se reducen la cantidad y la integridad estructural de los tejidos conjuntivos dérmicos, en particular el colágeno y la elastina. Entre las características visuales más marcadas de una piel facial envejecida se encuentran las líneas de expresión y las arrugas. Leyden, Br. J. Dermatol. Vol. 122, Suppl . 35, págs . 1 - 3 (1990) . Al principio, las líneas y las arrugas superficiales son temporales y se clasifican como "dinámicas", su aparición está asociada con la actividad de los músculos faciales. Las patas de gallo alrededor de los ojos son provocadas por la sonrisa y la actividad de los músculos de los párpados (orbicularis oculi) . Las líneas del ceño fruncido entre las cejas se deben a la contracción de los músculos corrugator supercilii y el músculo procerus . El movimiento muscular produce además pliegues mentolabiales que van desde la boca hasta el mentón. Con el paso del tiempo, el estrés mecánico provocado por movimientos faciales repetitivos hace que estas líneas de expresión temporales se conviertan en visibles y permanentes sin que haya expresión. Kligman et al . , Br. J. Derm. Vol . 113 , págs . 37 - 42 ( 1985 ) . Se sabe que la exposición crónica al sol y fumar aceleran el debilitamiento de la matriz dérmica, y la aparición de arrugas y líneas más persistentes que posteriormente se vuelven estáticas. Además, los pliegues nasolabiales , arrugas a los lados de la nariz que se extienden hasta la comisura de la boca, se hacen más profundos con la edad, lo cual hace que el rostro adquiera una apariencia cansada y envejecida.

En respuesta a las necesidades de reducir la aparición .de las líneas de expresión facial, arrugas y líneas más profundas, reafirmar la piel envejecida y mejorar la hidratación cutánea (retención de agua) , se ha producido una proliferación de productos antienvejecimiento para el cuidado de la piel. Se siguen necesitando productos antienvejecimiento para el cuidado de la piel más eficaces. Los métodos y las composiciones de la presente invención satisfacen esta necesidad.

La celulitis es una afección patofisiológica que provoca la destrucción del colágeno en la región pélvica, las extremidades inferiores (las piernas, aproximadamente cuatro pulgadas por encima de las rodillas) y abdomen en la mayoría de las mujeres pospubescentes . Aunque la etiología de la celulitis aún no se comprenda totalmente, se cree que la celulitis es provocada por una hernia de grasa subcutánea dentro del tejido conjuntivo fibroso. La celulitis presenta una textura de "piel de naranja" y hoyuelos, y suele ir acompañada de estrías. Un artículo de revisión reciente publicado en la revista Journal of the American Academy of Der atology afirmó que los tratamientos disponibles en la actualidad para la celulitis son únicamente parcial o temporalmente eficaces. MH Khan et al., J. Am. Acad.

Dermatol. Vol. 62, págs . 361 - 370 (marzo de 2010). Por lo tanto, siguen necesitándose composiciones tópicas reductoras de la celulitis más eficaces. La presente invención atiende esta necesidad.

Compendio de la invención Los métodos de la presente invención se refieren a composiciones tópicas que incluyen lisado de células madre partenogenéticas humanas (hpSC) que se cultivan con o sin células alimentadoras en un medio de cultivo que, en realizaciones preferidas, está exento de xenorreactivos .

Descripción detallada de la invención A menos que se indique lo contrario o que el contexto lo requiera, "porcentaje" y "%" se refieren al tanto por ciento en peso.

El término "aproximadamente", tal como se emplea en la presente con relación a una cantidad medida, se refiere a una variación en la cantidad medida que el experto en la técnica podría esperar al realizar la medición y aplicar un nivel de precaución correspondiente con el objetivo de la medición y el equipo empleado; e incluye los errores de redondeo.

Es esencial para las composiciones tópicas útiles en la práctica de los métodos de la presente invención un lisado de células madre humanas que se obtiene a partir de ovocitos humanos activados partenogenéticamente . Las células madre procedentes de ovocitos humanos activados partenogenéticamente (denominadas hpSC) son diferentes de las células madre embrionarias humanas procedentes de ovocitos fertilizados de forma normal. Los alelos que se encuentran cerca de los centromeros del ADN y en los extremos distales del ADN de hpSC heterocigóticas exhiben una homocigosidad superior a la media en comparación con células somáticas derivadas del ovocito donante. El análisis comparativo de marcadores de polimorfismo de un único nucleótido muestra que las hpSC presentan una proporción inferior de heterocigosidad tanto cerca de los centromeros como de los telómeros en comparación con la heterocigosidad en las regiones interpuestas, al compararlas con células madre embrionarias humanas activadas con la contribución de un gameto masculino. Debido a la ausencia de gameto masculino, no existen patrones de sellado donados por el genoma masculino (es decir, "sellado paterno").

La activación partenogenética de ovocitos humanos para obtener hpSC se puede llevar a cabo de acuerdo con el método que se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.732.202 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2008/0299091, incorporadas en su totalidad a la presente por referencia. Sin embargo, se conocen otros métodos de activación partenogenética de ovocitos humanos y estos se pueden emplear para obtener hpSC útiles para preparar el lisado de hpSC esencial para la composición y el método de la presente invención. Por ejemplo, el ovocito se puede activar mediante métodos químicos, mecánicos y/o eléctricos conocidos en la técnica. Es importante que la activación de los ovocitos se consiga sin la participación del gameto masculino. Sin embargo, los métodos de activación de los ovocitos partenogenéticos descritos en la patente de EE. UU. n.° 7.732.202 y la publicación de solicitud de patente de EE . UU. n.° 2008/0299091 son los métodos preferidos para la activación partenogenética de ovocitos humanos con el fin de obtener hpSC útiles para la obtención del lisado de hpSC de las composiciones y los métodos de la presente invención. El lisado de hpSC puede derivarse de una o más líneas de células madre partenogenéticas humanas .

Los ovocitos humanos activados partenogenéticamente se cultivan, preferentemente en un medio no xenogénico, hasta obtener una cantidad de células suficiente para aislar masa celular interna (ICM, por sus siglas en inglés) que, a su vez, proporciona hpSC que se cultivan para obtener las células a partir de las cuales se obtiene el lisado de hpSC útil en la práctica de la presente invención. El aislamiento de la ICM se puede realizar de forma mecánica o mediante cirugía inmunológica para eliminar el trofectodermo, con el fin de proporcionar hpSC que a su vez se multiplicarán y procesarán de acuerdo con los procesos que se describen a continuación para obtener el lisado de hpSC útil en la práctica de la presente invención.

Cabe destacar que las hpSC, a partir de las cuales se obtiene el lisado de hpSC, se cultivan en un recipiente de cultivo en un medio exento de alimentarias que, en realizaciones preferidas, es un medio no xenogénico. Es decir, las hpSC se cultivan sin células alimentarias, por ejemplo, fibroblastos, en un medio que preferentemente no incluya composiciones procedentes de un mamífero que no sea un humano, es decir, en medio no xenogénico. Una combinación de medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio de Ham, suplementada con medio esencial mínimo (que incluye aminoácidos no esenciales) y estimulada además con factor de crecimiento fibroblástico de Ham y activina A humana, es un ejemplo de un medio no xenogénico útil en el cultivo de las hpSC empleadas para obtener el lisado de hpSC útil en la práctica de la presente invención. Se sobreentenderá que la referencia a este medio de hpSC en el resto de esta descripción significa un medio de cultivo que, en realizaciones preferidas, está exento de xenorreactivos .

Para obtener un volumen de hpSC suficiente para disponer de la cantidad deseada de lisado de hpSC, se emplea preferentemente un medio no xenogenico equilibrado antes de usarlo a 37 °C en una atmósfera de un 5% de CO2 /5% de 02 o en condiciones ambientales (aproximadamente un 21% de O2) . En la técnica se conocen medios de cultivo, preferentemente exentos de xenorreactivos, útiles para cultivar hpSC a partir de las cuales se puede obtener el lisado. Un ejemplo de un medio de cultivo celular adecuado es el siguiente: - nockout™ D-MEM/F12 (Gibco) - 15% Knockout™ Serum Replacement XenoFree (Gibco) - GlutaMAX-1 (Gibco) lOOx - MEM NEAA (Gibco) 200x - 2-Mercaptoetanol (Gibco) lOOOx - 5 ng/mL de FGF básico humano (PeproTech) - 20 ng/mL de activina A humana recombinante (R&D Systems) Se transfieren hpSC de ICM blastocística a un medio de cultivo de hpSC contenido en un recipiente de cultivo. El recipiente de cultivo se pasiva, en este paso y en todos los pasos del método, con suero humano que se extrae del recipiente de cultivo antes de la transferencia. Antes de la primera transferencia, el recipiente de cultivo y las hpSC se incuban a 37 °C (5% de CO2 /5% de O2) . Las primeras células transferidas se incuban durante aproximadamente 30 min, el medio se separa y las células se lavan in si tu con PBS exento de calcio y magnesio. Posteriormente, las células se tratan con colagenasa de tipo IV a 37 °C (5% de CO2 /5% de O2) .

La colagenasa se separa y las células remanentes se lavan con PBS exento de calcio y magnesio, después de lo cual se añade hpSC al recipiente de cultivo. Las células se dividen en una proporción de 1:3, se transfieren a recipientes de cultivo pasivados y se incuban (aproximadamente 7 días) en medio de hpSC a 37 °C (5% de CO2 /5% de O2) . Las células se dividen, se transfieren y se cultivan (aproximadamente 7 días) en medio de hpSC hasta obtener un volumen deseado de hpSC.

Para recoger y lisar las hpSC, se retira el medio de cultivo de hpSC del recipiente o los recipientes de cultivo, y las células se tripsinizan con la enzima de reemplazo de tripsina de origen no animal TrypLE™ comercializada por Gibco (LifeTechnologies Corp., Carlsbad CA) . La enzima de reemplazo se neutraliza posteriormente con medio de cultivo de«hpSC, el cual cabe destacar que está exento de inhibidores de proteinasa. La recogida y la lisis de hpSC sin utilizar inhibidores de proteinasa es una característica importante de la presente invención. El lisado de hpSC se puede formar, y en las realizaciones preferidas se forma, sin agentes detergentes. Aún más preferentemente, el lisado de hpSC se forma sonicando las hpSC o mediante ciclos repetitivos de congelación/descongelación .

Tras neutralizar la enzima tripsina de reemplazo, las hpSC y el medio acondicionado se centrifugaron para formar un agregado celular y cabe destacar que el medio acondicionado sobrenadante se separa del agregado. Las células del agregado se suspenden en solución isotónica, se incuban y se someten a tres o más, preferentemente cuatro o más, ciclos de congelación (N2 líquido) /descongelación. La suspensión resultante se centrifuga y se separa el sobrenadante, que es el lisado de hpSC de la presente invención, exento de medio acondicionado. El lisado de hpSC se puede utilizar inmediatamente o se puede crioalmacenar (p. e . , -80 °C) hasta su uso.

El lisado se puede aplicar directamente sobre la piel para reducir los signos del envejecimiento descritos anteriormente o, en realizaciones preferidas, puede estar encapsulado o contenido dentro de liposomas que están presentes con otros componentes en una composición tópica.

Los liposomas son vesículas esféricas microscópicas formadas por hidratación de fosfolípidos , incluidas lecitinas, fosfatidiletanolaminas o esfingomielinas . En las composiciones de la presente invención, fosfolípidos liposomicos y colesterol en diferentes proporciones incluidas (sin carácter limitante) 7:3, 5:1 y 50:1. Los fosfolípidos son de origen natural incluidos (sin carácter limitante) los huevos y la soya.

Los métodos para preparar liposomas son muy conocidos en la técnica. Generalmente, en condiciones de mezcla de bajo cizallamiento en agua, los fosfolípidos adoptan una disposición en capas multilaminares de esferas fosfolipídicas concéntricas en una configuración cabeza-cabeza hidrófila y cola-cola hidrófoba. Los expertos en la técnica saben que se pueden diseñar vesículas liposómicas para que atrapen y suministren (en tasas deseadas de liberación) principios activos específicos modificando el contenido lipídico, el tamaño, la carga superficial y el método de preparación. Se puede ajustar el tamaño de los liposomas dentro de un rango de tamaño de partícula y una distribución del tamaño de partícula deseados mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar liposomas con carga catiónica incorporando estearilamina como lípido cargado en una formulación. Se pueden preparar liposomas con carga aniónica y no iónicos alterando la molaridad de dipalmitoilfosfatidilglicerol como lípido cargado. Remítase también a, p. e . , M. Rosen, ed. , Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products: Technology, Applications and Formulations , págs . 285 - 303 (William Andrew, 2005) .

Los liposomas normalmente contienen un porcentaje molar de aproximadamente 5-15 de fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilglicerol , fosfatidilserina o fosfatidilinositol . (Los fosfolípidos con carga negativa ayudan a evitar que se produzca la agregación de liposomas) . En realizaciones, preferidas de la presente invención, se formulan suspensiones liposómicas para que incluyan agentes que protejan los lípidos de la piel así como también los componentes lipidíeos de las vesículas liposómicas contra el daño debido a los radicales libres y a la peroxidación lipídica (p.ej., durante el almacenamiento) . Los ejemplos no limitantes de tales agentes protectores de lípidos incluyen antioxidantes liposolubles, tales como acetato de tocoferilo, palmitato de retinilo, hidroxitolueno butilado, idroxianisol butilado, palmitato de ascorbilo y mezclas de estos.

Las lecitinas útiles para obtener el lisado de hpSC encapsulado en liposomas lecitínicos útil en la práctica de la presente invención son fosfolípidos que son diésteres de ácidos grasos del áster colínico del ácido glicerofosfórico . Tales diésteres de ácidos grasos del éster colínico del ácido glicerofosfórico se denominan normalmente fosfatidilcolinas . La lecitina de soya es un diéster de ácidos grasos preferido del éster colínico del ácido glicerofosfórico para utilizar en la práctica de la presente invención, pero se pueden utilizar otras fosfatidilcolinas .

El lisado de hpSC utilizado en las composiciones y los métodos de la presente invención, cuando está contenido en liposomas, se prepara lisando entre aproximadamente 500 000 y aproximadamente 10 000 000 de hpSC/24 mL de dispersión liposómica .

En realizaciones de la presente invención referentes a composiciones antienvejecimiento tópicas, el lisado de hpSC, ya sea en una dispersión liposómica o no, está presente en una cantidad eficaz para reducir o mejorar uno o más de los signos del envejecimiento de la piel, incluidos la profundidad y el número de líneas de expresión facial y arrugas, flaccidez de la piel y/o hidratación cutánea. En composiciones antienvejecimiento tópicas, el lisado de hpSC está presente preferentemente en una dispersión liposómica en una concentración del orden de lxlO3 - lxlO9 células por gramo de dispersión liposómica, aún más preferentemente del orden de lxlO4 - lxlO8 células por gramo de dispersión liposómica.

En realizaciones de la presente invención referentes a composiciones anticelulíticas tópicas, el lisado de hpSC, ya sea en una dispersión liposómica o no, está presente en una cantidad eficaz para reducir la aparición de la textura de piel de naranja, hoyuelos y/o estrías en zonas afectadas por la celulitis y/o para reducir la aparición de líneas finas y arrugas superpuestas sobre la piel de naranja los hoyuelos característicos de la celulitis. En las composiciones anticelulíticas tópicas, el lisado de hpSC está presente preferentemente en una dispersión liposómica en una concentración del orden de lxlO3 - lxlO9 células por gramo de dispersión liposómica, aún más preferentemente del orden de lxlO4 - lxlO8 células por gramo de dispersión liposómica.

El lisado de hpSC de las composiciones y los métodos de la presente invención se puede utilizar solo o, en realizaciones preferidas, combinado con otros ingredientes farmacéutica y cosméticamente aceptables. En una realización preferida, el lisado de hpSC está combinado con una mezcla de coenzima Q10 y un tocoferol (a, ß o ?) , especialmente a-tocoferol (vitamina E) , o un tocotrienol (a, ß, ? o ?) , o una. mezcla de tocoferoles ( , ß y/o ?) , y, opcionalmente, uno o más tocotrienoles ( , ß, ? y/o ?) . La mezcla de coenzima Q y tocoferol (es) y/o tocotrienol (es ) (la combinación con la coenzima Q) puede estar, y en realizaciones particularmente preferidas está, encapsulada o contenida en liposomas.

En esta realización preferida, el lisado de hpSC está combinado además con una mezcla de bioflavonoides ( flavonoides , isoflavonoides y neoflavonoides ) , denominados también en la presente vitamina P. Los flavonoides, isoflavonoides y neoflavonoides son productos naturales derivados de 2- 20 fenilcromen-4-ona (flavona), 3-fenilcromen-4-ona y 4-fenilcoumarina , respectivamente.

En realizaciones particularmente preferidas, el bioflavonoide es isoquercetina, troxerutina o mezclas de estas .

En otras realizaciones particularmente preferidas, la composición y el método de la presente invención emplea además un complejo de vitamina B, ácido hialuronico y un ascorbato, preferentemente ascorbilfosfato de magnesio.

El complejo de vitamina B puede ser cualquier combinación de compuestos que el experto entienda por la expresión "vitamina B" , o sus sales. Un complejo de vitamina B preferido incluye inositol, cloruro de colina, D-pantotenato de calcio, nicotinamida, clorhidrato de piridoxal y ácido fólico, clorhidrato de tiamina y riboflavina en una relación ponderal de 2:1:1:1:1:1:1:0.1. El complejo de vitamina B se puede proporcionar y emplear, y en realizaciones preferidas se proporciona y emplea, en solución salina acuosa.

Cuando se utiliza, el complejo de vitamina B está presente en una concentración de entre un 0.05% y un 5%, el ácido hialuronico está presente en una concentración de entre un 0.01% y un 3%, y el ascorbato está presente en una concentración de entre un 0.01% y un 2.5%.

En realizaciones de la presente invención referentes a la reducción de la aparición de la celulitis, la composición tópica destinada a ser aplicada sobre la zona de la piel que exhibe una textura de piel de naranja, hoyuelos y/o estrías comprende un lisado de hpSC, preferentemente en una dispersión liposómica, y opcionalmente, pero preferentemente junto con una combinación de coenzima Q y vitamina P, combinados además con un principio activo anticelulítico. La expresión "principio activo anticelulítico" se refiere a un principio activo para el cuidado de la piel que funciona como un antioxidante, reduce el edema, reduce la inflamación, estimula la lipólisis, mejora/ incrementa la perfusión microvascular , fomenta la producción de colágeno y/o elas tinas. Los ejemplos no limitantes de principios activos anticelulíticos incluyen: teofilina y sus derivados; y carnitina y sus derivados; proantocianidinas ; extractos de Centella asiática; ácido ursólico; y flavonoides diméricos de Ginkgo biloba; y extracto de Coleus forskolii .

Las composiciones y los métodos de la presente invención, tanto antienvejecimiento como anticelulíticos , pueden emplear además ingredientes adicionales, habituales en la técnica, que no afectan al funcionamiento de la composición ni a los resultados conseguidos mediante la práctica del método.

El Diccionario y manual internacional de ingredientes cosméticos publicado por el Consejo de Productos para el Cuidado Personal (la antigua Asociación de Cosméticos, Artículos de Higiene Personal y Fragancias) describe una gran variedad de ingredientes cosméticos y farmacéuticos no limitantes de uso común en productos cosmecéuticos , que son adecuados para emplear en las composiciones anticelulíticas y composiciones antienvejecimiento tópicas, y los métodos relacionados de la presente invención.

En realizaciones de la presente invención referentes a una composición antienvejecimiento tópica destinada a ser aplicada cuando el usuario se exponga a la luz del sol ambiental, la composición contiene preferentemente al menos un protector solar UVA, un protector solar UVB, y aún más preferentemente al menos un protector solar UVA y al menos un protector solar UVB. La expresión "protector solar UVB" se refiere a. un producto químico que absorbe, refleja o dispersa radiación ultravioleta con longitudes de onda comprendidas entre 290 y 320 nm. La expresión "protector solar UVA" se refiere a un producto químico que absorbe, refleja o dispersa radiación ultravioleta con longitudes de onda comprendidas entre 320 y 400 nm.

El protector solar UVA o UVB se puede seleccionar del grupo constituido por: ácido p-aminobenzoico hasta un 15%; avobenzona hasta un 3%; cinoxato hasta un 3%; dioxibenzona hasta un 3%; homosalato hasta un 15%; antranilato de mentilo hasta un 5%; octocrileno hasta un 10%; octilmetoxicinamato (octinoxato) hasta un 7.5%; salicilato de octilo hasta un 5%; oxibenzona hasta un 6%; padimato O hasta un 8%; ácido fenilbencimidazolsulfónico (ensulizol) hasta un 4%; sulisobenzona hasta un 10%; dióxido de titanio hasta un 25%; salicilato de trolamina hasta un 12%; óxido de zinc hasta un 25%. Otros protectores solares autorizados en países que no sean EE. UU. también son adecuados para su inclusión en composiciones de acuerdo con este aspecto de la invención.

En realizaciones de la presente invención referentes a una composición antienvejecimiento tópica destinada a ser aplicada cuando el usuario no se exponga a la luz del sol ambiental (p. ej . , por la noche antes de acostarse), la composición comprende además un retinoide seleccionado del grupo constituido por retinol, retinal, és teres del retinol, propionato de retinilo, ácido retinoico y palmitato de retinilo .

En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones anticelulíticas y/o las composiciones antienvejecimiento tópicas de la presente invención incluyen uno o más factores hidratantes naturales (FHN) , ingredientes que ayudan a evitar o minimizar la pérdida de agua transepidérmica. Los ejemplos no limitantes de FHN que se pueden emplear en la composición y el método de la presente invención incluyen aminoácidos, ceramidas, ácido hialurónico, colesterol, ácidos grasos, triglicéridos , fosfolípidos, glucoesfingolípidos , urea, ácido linoleico, glucosaminoglucanos , glicerina, mucopolisacárido y PCA sódico. Además, en tales realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden incluir, y preferentemente incluyen, uno o más lipomiméticos dérmicos, es decir, un ingrediente que emule el contenido lipídico de la piel. Los ejemplos no limitantes de ingredientes lipomiméticos dérmicos incluyen aceite de chabacano, aceite de cañóla, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de jo oba, cera de jojoba, lanolina, lecitina, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de sésamo, manteca de karité, aceite de soya y aceite de almendras dulces.

Las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar y utilizar en cualquier forma farmacéutica física conocida en las técnicas dermatológicas y cosméticas para, la administración tópica de principios activos o medicamentos. Por ejemplo, la composición de la presente invención se puede proporcionar y aplicar sobre la piel en forma de una crema, loción, gel, suero o espray que puede estar en forma de una dispersión monofásica, preferentemente una dispersión acuosa espesa o una emulsión (p. ej . , aceite en agua, agua en aceite, silicona en agua, agua en silicona) .

La formulación y composición de estas formas son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en L Schlossman, ed. Chemistry and Manufacture of Cosmetics, 4.a ed. El lisado de hpSC se formula y compone, de forma opcional pero preferente junto con la combinación de coenzima Q y vitamina P e ingredientes adicionales, con el vehículo de administración deseado o los componentes requeridos de estos, en proporciones tales que, cuando se aplique, la dosis sea suficiente para (i) reducir la apariencia de las líneas de expresión y/o arrugas, (ii) incrementar la elasticidad y la firmeza de la piel, (iii) mejorar la hidratación cutánea y, en el caso de composiciones anticelulíticas , reducir la aparición de la textura de piel de naranja y hoyuelos, en particular en los muslos . En el método de la presente invención, la forma farmacéutica se aplica al menos una vez, preferentemente más de una vez, en un periodo de 24 horas.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para reducir la apariencia de enve ecimiento, en particular, una reducción de las líneas de expresión superficiales (LES) y arrugas, aplicando las composiciones de la presente invención sobre zonas de la cara, cuello (escote) y manos que presenten signos de envejecimiento. La reducción de LES y arrugas se puede evaluar utilizando métodos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica, incluidos ensayos clínicos que utilizan un método descrito por Packman y Gans en "Topical Moisturizers : Quantification of their Effects on Superficial Facial Lines," J. Soc.

Cosmet. Chem. Vol . 29, págs . 79-90 (1978) .

En un periodo de "reposo" farmacológico (p. ej . , una semana antes de comenzar el estudio) , los sujetos dejan de usar otros productos para el cuidado de la piel y se les suministra una pastilla de jabón suave para que se laven la cara. (Este "equilibrado cutáneo" crea un valor basal y ayuda a minimizar las posibles interferencias de regímenes para el cuidado de la piel previos) . El primer día después del equilibrado cutáneo de una semana, se facilitan instrucciones a todos los participantes en el estudio sobre cómo utilizar el producto de ensayo (es decir, la composición de la presente invención) . Se pide a los sujetos que se laven la cara con el jabón suministrado durante el resto del estudio. A las dos semanas, cuatro semanas y ocho semanas, se evalúa la profundidad, superficialidad y el número de LES dentro una zona definida alrededor de los ojos.

La reducción de LES así como también de las arrugas también se puede medir y evaluar mediante fotografía clínica (utilizando equipos de iluminación y posicionamiento estandarizados para garantizar la reproducibilidad) y software para el análisis de imágenes, incluidos, por ejemplo, el análisis de la tez VISIA de Canfield Scientific. Además, se puede evaluar la mejora en la aparición de las líneas de expresión y arrugas tomando réplicas hechas con Silflo al inicio y al final de un estudio y midiendo los cambios en los niveles de sombras generadas por iluminación incidente sobre la superficie de réplicas hechas con Silflo.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para mejorar la firmeza de la piel aplicando las composiciones de la presente invención sobre la cara u otras zonas que presenten flaccidez cutánea. La firmeza de la piel se puede evaluar utilizando métodos conocidos en la técnica que incluyen el uso de un balistómetro, un dispositivo que deja caer un péndulo sobre la superficie de la piel y mide la altura del primer y el segundo pico de rebote.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un método para mejorar la hidratación cutánea (expresada también como una mejora de la retención de agua o el contenido de humedad cutáneo) aplicando sobre la cara, las manos y otras superficies del cuerpo que estén expuestas al medioambiente (es decir, que no estén cubiertas por una prenda de vestir) las composiciones de la presente invención.

El contenido de humedad cutáneo se puede evaluar mediante mediciones de la impedancia en la zona de las mejillas de un sujeto utilizando un novámetro. A modo de ejemplo no limitante, al final de un periodo de equilibración de la piel de una semana (tal como se describió anteriormente) se toman dos medidas por separado en cada sujeto y se calcula el promedio.

En realizaciones de la presente invención referentes a la reducción de la aparición de la celulitis, se lleva a cabo un ensayo clínico, con evaluaciones al inicio, posteriormente a las 2 semanas, 4 semanas, y 8 semanas y 20 días. Se toman fotografías en color de la parte externa del muslo, desde la cadera hasta la rodilla en estos intervalos. Además, se toman fotografías de la piel del muslo de cerca, para mostrar las líneas finas y arrugas superpuestas en la piel de naranja/los hoyuelos característicos de la celulitis. La flaccidez de la piel se evalúa con calibres. La firmeza de la piel y la resiliencia se miden con un balistometro. Los sujetos también proporcionan una autoevaluación del grado de la celulitis y su mejora. La presente invención, en ciertas de estas realizaciones, se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 - Preparación del lisado de hpSC Medio de cultivo de hpSC: - Knockout™ D-MEM/F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco + medio de Ham - Gibco) - 15% Knockout™ Serum Replacement XenoFree (Gibco) - GlutaMAX-1™ (Gibco) lOOx - MEM NEAA (Gibco) 200x - 2-Mercaptoetanol (Gibco) lOOOx - 5 ng/mL de FGF básico humano (PeproTech) - 20 ng/mL de activina A humana recombinante (R&D Systems ) Reactivos no xenogénicos : - TrypLE (enzima de reemplazo de tripsina; Gibco) - PBS sin Ca2+ ni Mg2+ - Solución de colagenasa de tipo IV (Gibco) (1500 unidades /mL) - Solución de KC1 (0.075 M) (Sigma) Conservación y transferencia de hpSC con colagenasa: 1) Equilibrar el medio de cultivo de hpSC, PBS y colagenasa a +37 °C, con un 5% de CO2 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada . 2) 30 minutos antes de transferir hpSC, aspirar suero humano de una placa de Petri (100 mm) que ha sido acondicionada durante la noche con suero humano; añadir medio de cultivo de hpSC recién preparado a la placa que ahora está cubierta con proteínas séricas (8 mL de medio de cultivo de hpSC 20 por cada placa de Petri de 100 mm) . Introducir la placa en una incubadora a +37 °C, con un 5% de CO2 y un 5% de 02 en atmósfera humidificada . 3) 30 minutos después, aspirar el medio de cultivo de hpSC de una placa de Petri que contiene colonias de hpSC transferidas. 4) Lavar las células dos veces in si tu con PBS sin Ca2+ni Mg2+ (4 mL/placa de Petri de 100 mm) . 5) Añadir 4 mL de colagenasa de tipo IV e incubar a +37 °C, con un 5% de CO2 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada durante 6-8 minutos. 6) Tan pronto como se observen los primeros signos de enroscamiento en los bordes de las colonias, retirar la colagenasa y lavar las células con PBS exento de Ca2+ y Mg2+ (4 mL/placa de Petri de 100 mm) . 7) Añadir 3 mL de medio de cultivo de hpSC por placa de Petri (100 mm) . 8) Separar células con una pipeta de 1000 µ??? para disgregar las aglomeraciones de células pipeteando cuidadosamente. Las aglomeraciones de células finales deben contener cada una unos pocos cientos de células. 9) Dividir las células en una proporción 1:3. 10) Colocar las células sobre placas de Petri acondicionadas previamente con suero humano . 11) Incubar las placas a +37 °C, con un 5% de CO2 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada . 12) Reemplazar el medio de cultivo de hpSC cada día.

Dividir las células en una proporción de 1:3 en 7 días. 7 días después de la segunda transferencia de hpSC utilizando un sistema de cultivo exento de alimentarias, las células están listas para ser lisadas.

Preparación del lisado de hpSC: 1) Calibrar el medio de cultivo de hpSC, TrypLE (Gibco) y solución hipotónica (15 KCl 0.075 M) a +37 °C, con un 5% de C02 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada . 2) Aspirar el medio de cultivo de hpSC de la placa con colonias de células, y añadir 3 mL de TrypLE por placa (100 mm) e incubar a +37 °C con un 5% de CO2 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada durante 1-2 minutos. 3) Neutralizar TrypLE con medio de cultivo de hpSC (5 mL/placa de Petri de 100 mm) . 4) Triturar las aglomeraciones de células utilizando una pipeta de 5 mL estéril y colocar la suspensión celular en un tubo de centrifugación cónico de 15 mL. 5) Realizar un recuento de la cantidad de células utilizando un hemocitómetro . 6) Formar un agregado celular por centrifugación durante 3 min a 300 x g. 7) Retirar el sobrenadante del tubo de centrifugación. 8) Resuspender el agregado en 1 mL de solución hipotónica por 5xl06 células e incubar a +37 °C, con un 5% de CO2 y un 5% de O2 en atmósfera humidificada durante 30-40 minutos. 9) Criocongelar la suspensión celular (con nitrógeno líquido), descongelar en un baño de agua a 37 °C. Repetir la congelación-descongelación tres veces. Como alternativa o además, la suspensión se puede sonicar. 10) Transferir la solución a tubos de centrifugación de plástico de 1.5 mL estériles y centrifugarlos a 9000 x g y 4°C durante 5 minutos. 11) Transferir el sobrenadante a tubos de centrifugación de plástico de 1.5 mL estériles nuevos y congelarlos a -80 aC.

Almacenar a -80 °C hasta su uso.

Ejemplo 2 - Crema antienve ecimiento de noche Fase A Jabón de ácido esteárico 0.50 - 5.00 Alcohol graso 0.50 - 4.00 onoestearato de glicerilo 1..00 - 4..00 Oleato de sorbitán 0. .20 - 2 , .50 Polisorbato 80 0. .20 - 2 , .50 Aceite de cártamo 0. .50 - 2 .00 Palmitato de retinilo 0. .10 - 0, .30 Fase B Carbómero 0. ,10 - 0, .70 Conservantes 0. ,50 - 3 , .00 Glicerina (u otros humectantes) 0. ,50 - 5, .00 Agente quelante (p. e . , EDTA) 0. ,02 - 0. .08 Ácido hialurónico 0. .05 - 1 , .00 PCA sódico 0. .10 - 1. .00 Fase C Dispersión liposómica del lisado de hpSC del Ejemplo 1 3. .00 - 8 , .00 Emulsión liposómica que contiene coenzima Q10 + vitamina E 2. .00 - 6 .00 Bioflavonoides 1. .00 - 3 .00 Complejo de vitamina B 0, .50 - 4 .00 Ejemplo 3 - Loción antienvej ecimiento hidratante de día con protector solar Fase A Jabón de ácido esteárico 0.50 - 5.00 Alcohol graso 0.50 - 3.00 Monoestearato de glicerilo 1.00 - 3.50 Oleato de sorbitán 0.20 - 2.50 Polisorbato 80 0.20 - 2.50 Benzoato de alquilo C12-C15 2.00 - 8.00 Aceite de cártamo 0.50 - 4.00 Metoxicinamato de octilo 3. 00 - 7 .00 Avobenzona 1. 00 - 3 .00 Oxibenzona 2. 00 - 6 .00 Fase B Carbómero 0. 10 - 0 .70 Conservantes 0. 50 - 3 .00 Glicerina (u otros humectantes) 0. 50 - 5 .00 Agente quelante (p. ej . , EDTA) 0. 02 - 0 .08 Ascorbilfosfato de magnesio 0. 25 - 1 .00 Fase C Dispersión liposomica del lisado de hpSC del Ejemplo 1 3. 00 - 8 .00 Emulsión liposomica que contiene coenzima Q10 + vitamina E 2. 00 - 6 .00 Bioflavonoides 1. 00 - 3 .00 Complejo de vitamina B 0. 50 - 4 .00 Vitamina D3 0. 01 - 0 .50 Las formulaciones de los Ejemplos 2 y 3 se preparan combinando y calentando, en recipientes independientes, los ingredientes de las Fases A y B para crear de este modo, respectivamente, la fase oleosa y la fase acuosa de una emulsión. Ambas fases se pueden calentar hasta aproximadamente 75 aC. Se añade la Fase A a la Fase B. La mezcla de A/B resultante se mezcla a 75 aC con una homomezcladora Silverson (o un dispositivo de mezcla similar con el que estén familiarizados los expertos en la técnica) hasta que sea homogénea y después se deja enfriar. A aproximadamente 38 SC, se añade la Fase C a A/B y se mezcla utilizando una mezcladora de barrido con bajo cizallamiento hasta que sea homogénea.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para reducir los signos del envejecimiento que comprende el paso de aplicar sobre la piel una composición antienve ecimiento tópica que comprende un lisado de células madre partenogenéticas humanas. El método de la reivindicación 1 donde la composición antienvejecimiento tópica comprende además al menos un antioxidante. El método de la reivindicación 2 donde dicho antioxidante se selecciona entre el grupo de la coenzima Q10 y sus análogos, ácido ascórbico y sus sales, ésteres ascorb licos de ácidos grasos, tocoferol y sus ésteres, ácidos hidroxibenzoicos butilados y sus sales, y retinoides . El método de la reivindicación 1 donde el lisado de células madre partenogenéticas humanas está presente en la composición antienvejecimiento tópica en una dispersión liposómica. El método de la reivindicación 4 donde el lisado de células madre partenogenéticas humanas está presente en una dispersión liposómica en una concentración comprendida entre lxlO3 y lxlO9 células madre partenogenéticas humanas por gramo de dispersión liposómica . El método de la reivindicación 5 donde la dispersión liposomica comprende además al menos un agente protector de lípidos. El método de la reivindicación 6 donde el agente protector de lípidos es un antioxidante liposoluble seleccionado del grupo constituido por acetato de tocoferilo, palmitato de retinilo, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, palmitato de ascorbilo y mezclas de estos. El método de la reivindicación 7 donde la composición antienvejecimiento tópica comprende además uno o más de los siguientes: un segundo antioxidante, una vitamina o derivado vitamínico, o un péptido estimulante de colágeno/elastina de cadena corta. El método de la reivindicación 1 o 4 donde para obtener el lisado de células madre partenogenéticas humanas, las células madre partenogenéticas humanas se cultivan en un medio exento de alimentarias. El método de la reivindicación 8 donde las células madre partenogenéticas humanas se recogen y lisan sin utilizar inhibidores de proteinasa. El método de la reivindicación 1 o 4 donde la composición antienve ecimiento tópica comprende además una emulsión liposomica, comprendiendo la emulsión liposomica coenzima Q10 y vitamina E o uno de sus derivados . El método de la reivindicación 11 donde la dispersión liposómica que contiene el lisado de células madre partenogenéticas humanas está presente en la composición antienvejecimiento tópica en una cantidad de entre un 1% y un 20% en peso de la composición, y la emulsión liposómica que contiene una combinación de coenzima Q10 y vitamina E o uno de sus derivados está presente en la composición tópica en una cantidad de entre un 2% y un 6% en peso de la composición. El método de la reivindicación 12 donde al composición antienvejecimiento tópica comprende además un complejo de vitamina B. El método de la reivindicación 13 donde la composición antienve ecimiento tópica comprende (a) entre un 1% y un 20% en peso de una dispersión liposómica que contiene el lisado de células madre partenogenéticas humanas (b) entre un 2% y un 6% en peso de una emulsión liposómica que contiene una combinación de coenzima Q10 y vitamina E o uno de sus derivados (c) entre un 0.5% y un 5% en peso de complejo de vitamina B; (d) entre un 0.1% y un 5% en peso de vitamina P. El método de la reivindicación 14 donde la composición antienvejecimiento tópica comprende además uno o más de los siguientes: un retinoide, un FH , un lipomimético dérmico y/o un protector solar. Un método para reducir la aparición de la celulitis aplicando a la piel de una mujer pospubescente que presenta una textura de "piel de naranja", hoyuelos y/o estrías una composición anticelulítica tópica que comprende un lisado de células madre partenogenéticas humanas que comprende además al menos uno de los siguientes: un antioxidante, un ingrediente antiedema, un antiinflamatorio, un ingrediente que estimula la lipólisis, un ingrediente que mejora/incrementa la perfusión microvascular, un ingrediente que fomenta la producción de colágeno y/o elastinas. El método de la reivindicación 16 donde el lisado de células madre partenogenéticas humanas está presente en la composición anticelulítica en una dispersión liposomica . El método de la reivindicación 17 donde la composición anticelulítica comprende además una emulsión liposomica, comprendiendo la emulsión liposomica coenzima Q10 y vitamina E o uno de sus derivados.