MX2013001191A - Cepas de agrobacterium modificadas para incrementar la frecuencia de transformacion de plantas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan cepas de Agrobacterium que albergan genes que incrementan la transformación en un plásmido con la capacidad de réplica independiente del cromosoma de Agrobacterium, el plásmido Ti y vectores binarios de transformación de la planta, y usos de estas cepas Agrobacterium. Además, también se proporcionan las cepas Agrobacterium que tienen deficiencia en las funciones de recombinación de ADN que da como resultado la inestabilidad o reorganización de los vectores binarios de transformación de la planta, y que albergan genes que incrementan la transformación en un plásmido con la capacidad de réplica independiente del cromosoma de Agrobacterium, el plásmido Ti, y vectores binarios de transformación de la planta, y usos de estas cepas. Se incluyen además cepas de Agrobacterium que albergan genes de incremento de transformación integrados en el cromosoma de Agrobacterium en un locus que no interfiere con, o compromete de otra forma el crecimiento normal y la capacidad de transformación de la planta de las células de Agrobacterium, y los usos de estas cepas de Agrobacterium. También se describen plantas elaboradas utilizando estas cepas de Agrobacterium.

Description

CEPAS DE AGROBACTERIUM MODIFICADAS PARA INCREMENTAR LA FRECUENCIA DE TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS Referencias Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/368,965, presentada el 29 de julio del 2010. La descripción de la solicitud anterior se considera parte de la descripción de la presente solicitud.

Antecedentes de la Invención La transformación de plantas generalmente comprende las metodologías requeridas y utilizadas para la introducción de un gen extraño que se puede expresar en la planta en células de la planta, de modo que se puedan obtener plantas de progenies fértiles que mantienen y expresan en forma estable el gen extraño. Se han transformado numerosos miembros de las clasificaciones monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las cosechas agronómicas transgénicas, así como frutas y vegetales, son de interés comercial. Dichas cosechas incluyen pero no se limitan a maíz, arroz, frijoles de soya, cánula, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, cacahuates, tomates, papas, y similares. A pesar del desarrollo del sistema de transformación de plantas para introducir genes extraños que se pueden expresar en plantas en células de la planta, son deseables mejoras que permita una eficiencia de transformación incrementada, y proporcionen ventajas significativas en superar las desventajas de operación cuando se transforman plantas con genes extraños.

Se conocen diversas técnicas para introducir material genético extraño en células de la planta, para obtener plantas que mantienen y expresan en forma estable el gen introducido. Dichas técnicas incluyen aceleración de material genético recubierto en micropartículas directamente en células (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,945,050 y Patente Norteamericana No. 5,141,131). Otra tecnología de transformación incluye carburo de silicón o tecnología de WHISKERS™. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,302,523 y la Patente Norteamericana No. 5,464,765. También se ha utilizado tecnología de electroporación para transformar plantas. Ver por ejemplo, la Publicación Internacional WO 87/06614, la Patente Norteamericana No. 5,472,869, Patente Norteamericana No. 5,384,253, WO 92/09696, y WO 93/21335. Además, se puede emplear fusión de proteoplastos de planta con liposomas que contienen el ADN que será suministrado, inyección directa del ADN, así como otros métodos posibles.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, normalmente es relativamente estable a lo largo de las generaciones subsecuentes. Las células transformadas crecen dentro de las plantas en la forma usual. Pueden formar células de germen y transmitir el rasgo(s) de transformación a las plantas de progenie. Dichas plantas pueden crecerse en la forma normal, y puede cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes, tienen las propiedades fenotípicas correspondientes, por ejemplo, la capacidad de controlar la alimentación de los insectos de pestes de la planta.

También se puede utilizar un número de técnicas alternativas para insertar el ADN en una célula de la planta huésped. Dichas técnicas incluyen pero no se limitan a, transformación con T-ADN suministrado mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación. Las plantas pueden ser transformadas utilizando tecnología de Agrobacterium , tal como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,177,010, Patente Norteamericana No. 5,104,310, Solicitud de Patente Europea No. 0131624B1, y con Solicitud de Patente Europea No. 120516, Solicitud de Patente Europea No. 159418B1, Solicitud de Patente Europea No. 176112, Patente Norteamericana No. 5,149,645, con Patente Norteamericana No. 5,469,976, Patente Norteamericana No. 5,464,763, Patente Norteamericana No. 4,940,838, Patente Norteamericana No. 4,693,976, Solicitud de Patente Europea No. 116718, Solicitud de Patente Europea No. 290799, Solicitud de Patente Europea No. 320500, Solicitud de Patente Europea No. 604662, Solicitud de Patente Europea No. 627752, Solicitud de Patente Europea No. 0267159, Solicitud de Patente Europea No. 0292435, Patente Norteamericana No. 5,231,019, Patente Norteamericana No. 5,463,174, Patente Norteamericana No. 4,762,785, Patente Norteamericana No. 5,004,863, y Patente Norteamericana No. 5,159,135. El uso de vectores que contienen T-ADN para la transformación de células de la planta, ha sido investigado en forma intensa y descrito de manera suficiente en la Solicitud de Patente Europea No. 120516; y en las Publicaciones de An et | al, (1985, EMBO J. 4:277-284), Fraley et al, (1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46), y Lee y Gelvin (2008, Plant Physiol. 146: 325-332), y está bien establecido en el campo.

Es conocida la biología de transferencia de T-ADN de Agrobacterium a células de la planta. Ver por ejemplo las | Publicaciones de Gelvin (2003) Microbiol. olec. Biol. Rev. 67: 16-37; y Gelvin (2009) Plant Physiol. 150: 1665-1676. Como mínimo, al menos una repetición del límite derecho de T-ADN, pero con frecuencia tanto la repetición del límite derecho como la repetición del límite izquierdo del plásmido Ti o Ri serán | unidos como la región de flanqueo de los genes deseados para ser insertados en la célula de la planta. Las repeticiones del límite T-ADN izquierdas y derechas son secuencias de acción c/'s cruciales requeridas para transferencia de T-ADN. Se codifican varios componentes de acción-frans dentro del I genoma del Agrobacterium total. Entre éstas se encuentran principalmente las proteínas codificadas por los genes vir, los cuales normalmente se encuentran como una serie de operones en los plásmidos Ti o Ri. Varios plásmidos Ti y Ri difieren relativamente en el complemento de genes vir, por ejemplo, no estando presente siempre virF. Las proteínas codificadas por los genes vir llevan a cabo muchas diferentes funciones, incluyendo reconocimiento y señalización de la interacción de célula/bacterias de la planta, inducción de transcripción de gen vir, formación de un canal de secreción Tipo IV, reconocimiento de repeticiones de límite de T-ADN, formación de hebras-T, transferencia de hebras-T a la célula de la planta, importación de las hebras-T en el núcleo de la célula de la planta, e integración de hebras-T en el cromosoma nuclear de la planta, por nombrar solo algunas. Ver por ejemplo, la Publicación de Tzfira y Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotechnol. 17: 147-154.

Si se utilizan para transformación hebras de Agrobacterium , el ADN que será insertado en la célula de la planta puede ser clonado en plásmidos especiales, por ejemplo, ya sea en un vector intermedio (de traslado) o en un vector binario. Los vectores intermedios no tienen la capacidad de réplica independiente de células Agrobacterium , pero pueden ser manipulados o replicados en cepas de clonación molecular Escherichia coli comunes. Dichos vectores intermedios que comprenden secuencias, comúnmente son estructurados mediante las regiones de repetición del límite derecho e izquierdo de T-ADN, que pueden incluir un gen marcador selecciónatele funcional para la selección de células de la planta transformada, un enlazador de clonación, un polienlazador de clonación u otra secuencia que puede funcionar como un sitio de introducción para genes destinados para la transformación de la célula de la planta. La clonación y manipulación de genes deseados para ser transferidos a plantas, por lo tanto puede llevarse a cabo fácilmente a través de metodologías estándar en E. coli, utilizando el vector de traslado como un vector de clonación. El vector de traslado manipulado finalmente, puede ser introducido subsecuentemente en cepas de transformación de plantas Agrobacterium para trabajo adicional. El vector de traslado intermedio puede ser transferido en Agrobacterium por medio de un plásmido auxiliar (mediante conjugación bacteriana) mediante electroporación , mediante transformación de ADN directa transmitida en forma química o a través de otras metodologías conocidas. Los vectores de traslado pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri o derivados de los mismos mediante recombinación homologa que pertenece a secuencias que son homólogas entre el plásmido Ti o Ri, o derivados de los mismos, y el plásmido intermedio. Este evento de recombinación homologa (por ejemplo, integración de plásmido) proporciona de esta manera un medio para mantener en forma estable el vector de traslado alterado en Agrobacterium , con un origen de réplica y otras funciones de mantenimiento de plásmido proporcionadas por la porción del plásmido Ti o Ri del plásmido cointegrante. El plásmido Ti o Ri también comprende las regiones vir que comprenden genes vir necesarios para la transferencia del T-ADN. El plásmido que lleva la región vir comúnmente es un plásmido Ti o Ri mutado (plásmido auxiliar) del cual la región de T-ADN, incluyendo las repeticiones de límite derecho e izquierdo de T-ADN, han sido eliminadas. Los plásmidos derivados de pTi, tienen genes vir funcionales y carecen de todos, o sustancialmente todos los elementos de región-T y asociados que son referidos descriptivamente en la presente invención, como plásmidos auxiliares.

El sistema superbinario es un ejemplo especializado del sistema de recombinación homólogo/vector de traslado (revisado en la Publicación de Komari et al, (2006) En: Métodos en Biología Molecular (K. Wang, ed.) No. 343: Protocolos Agrobacterium (2o Edición, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, páginas 15-41; y Komori et al, (2007) Plant Physiol. 145: 1155-1160). La cepa huésped de Agrobacterium empleada con el sistema superbinario es LBA4404(pSB1 ). La cepa LBA4404(pSB1 ) alberga dos plásmidos de réplica independiente, pAL4404 y pSB1. pAL4404 es un plásmido auxiliar derivado del plásmido Ti que contiene un conjunto intacto de genes vir (del plásmido pT¡ACH5 Ti), pero que no tiene la región de T-ADN (y por lo tanto no tiene secuencias de repetición de límite izquierdas y derechas de T-ADN). El plásmido pSB1 suministra un conjunto parcial adicional de genes vir derivados de pTiBo542; este conjunto de gen vir parcial incluye el operón virB y el operón virC, así como los genes virG y virD1. Un ejemplo de un vector de traslado utilizado en el sistema superbinarios pSB11, que contiene un polienlazador de clonación que sirve como un sitio de introducción para genes destinados para la transformación de la célula de la planta, flanqueada por las regiones de repetición del límite derecho e izquierdo de T-ADN. El vector de traslado pSB11, no tiene la capacidad de réplica independiente en Agrobacterium , pero se mantiene en forma estable como un plásmido cointegrante cuando se integra en pSB1, por medio de recombinación homologa entre secuencias comunes presentes en pSB1 y pSB11. Por lo tanto, la región de T-ADN completamente modificada introducida en LBA4404(pSB1 ) en un vector pSB11 modificado, se activa en forma productiva y se transfiere en células de la planta mediante proteínas Vir derivadas de dos diferentes fuentes de plásmido Ti de Agrobacterium (pTiACH5 y pTiBo542). El sistema superbinario ha probado ser particularmente útil en la transformación de especies de plantas monocotiledóneas. Ver las Publicaciones de Hiei et al, (1994) Plant J. (6:271-282 y Ishida et al, (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750.

Además de los genes vir albergados por los plásmidos Ti de Agrobacterium, otros, los genes que controlan la virulencia llevada en forma cromosomal (denominados genes chv) son conocidos por controlar ciertos aspectos de las interacciones de las células Agrobacterium y células de la planta, y de esta forma afectar la frecuencia de transformación general de la planta (Pan et al, (1995) olec. Microbiol. 17:259-269). Diversos de estos genes que son llevados en forma cromosomal requeridos para la virulencia y adhesión se agrupan en conjunto en un locus cromosomal que abarca 29 kilobases (Matthysse et al., (2000) Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212).

Sin importar el sistema de plásmido particular empleado, las células de Agrobacterium transformadas, se utilizan para la transformación de células de la planta. Los explantes de la plantas (por ejemplo, piezas de hoja, segmentos de varas, raíces, aunque también protoplastos o células cultivadas por suspensión) pueden ser cultivadas en forma conveniente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium para la transferencia de ADN en la célula de la planta. Las plantas completas posteriormente pueden ser regeneradas del material de la planta infectada después de la colocación en condiciones de crecimiento y medios de cultivo adecuados, que pueden contener antibióticos o herbicidas para la selección de las células de la planta transformada. Las plantas así obtenidas, pueden ser probadas posteriormente con respecto a la presencia del ADN insertado.

Estas técnicas para introducir material genético extraño en plantas, se pueden utilizar para introducir rasgos benéficos en las plantas. Por ejemplo, cada año se gastan billones de dólares para controlar las pestes de insectos y se pierden billones adicionales por el daño que ocasionan. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas primarias utilizadas para controlar las pestes de insectos, aunque los insecticidas biológicos, tal como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han jugado un papel importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la introducción de genes de proteína insecticida Bt, ha revolucionado la agricultura moderna y ha destacado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Se han utilizado diversas proteínas Bt para crear las plantas transgénicas resistentes a insectos que han sido desarrolladas con éxito, y en muchos casos, registradas y comercializadas. Estas incluyen CryIAb, Cry Ca, CryIFa, y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón y Cry3A en papa.

Los productos comerciales que expresan las proteínas Bt, expresan una proteína simple, excepto en casos en donde se desea el espectro de dos proteínas insecticidas combinadas (por ejemplo, CryIAb y Cry3Bb en maíz, combinadas para proporcionar resistencia a pestes de lepidopteran, y gusano de raíz respectivamente) o en donde la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para retardar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en algodón, combinadas para proporcionar el manejo de resistencia a lepidoptero de tabaco).

Esto es, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos han conducido a una rápida y amplia adopción de esta tecnología, para dar surgimiento también al aspecto de que las poblaciones de pestes desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas proteínas a través de estas plantas. Se han sugerido diversas estrategias para conservar la utilidad de los rasgos de resistencia a insectos basados en Bt, que incluyen el despliegue de proteínas en una alta dosis en combinación con un refugio, alternando con, o el despliegue conjunto de diferentes toxinas (McGaughey et al. 1998, Nature Biotechnol.16: 144-146).

Si se seleccionan proteínas Bt para el uso en combinación, necesitan ejercer su efecto insecticida en forma independiente, de modo que la resistencia desarrollada a una proteína no confiere a resistencia a la segunda proteína (es decir, no existe a resistencia cruzada a las proteínas). Normalmente se realiza una evaluación robusta de la resistencia cruzada utilizando poblaciones de una especie de peste normalmente sensible a la proteína insecticida que ha sido seleccionada para resistencia a las proteínas insecticidas.

Por ejemplo, si una población de peste seleccionada para resistencia a "Proteína A" no es sensible a "Proteína B", podremos concluir que no existe resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B puede ser efectiva para retardar la resistencia a la Proteína A sola.

En la ausencia de poblaciones de insectos resistentes, se pueden realizar evaluaciones con base en otras características presumidas como relacionadas con el mecanismo de acción y el potencial de resistencia cruzada. Se ha sugerido la utilidad del enlace transmitido por receptor para identificar proteínas insecticidas, para no exhibir resistencia cruzada (Patente Norteamericana No. 6,855,873). El anticipador clave de la carencia de resistencia cruzada integral a éste método, es que las proteínas insecticidas no compiten para receptores en una especie de insectos sensibles.

En el caso de que dos toxinas Bt Cry compitan para el mismo receptor, entonces si el receptor muta en dicho insecto, de modo que una de las toxinas ya no enlace a dicho receptor, y por lo tanto ya no sea más insecticida contra el insecto, podría también ser el caso de que el insecto será resistente a la segunda toxina (que enlace en forma competitiva al mismo receptor). Sin embargo, si dos toxinas enlazan a dos diferentes receptores, podría ser una indicación de que el insecto puede no ser resistente en forma simultánea a éstas dos toxinas.

CryIFa es útil para controlar muchas especies de pestes de lepidopteran incluyendo barrenador de maíz Europea (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) y el cogollero de maíz (FAW; Spodoptera frugiperda) , y es activo contra el barrenador de azúcar de caña (SCB; Diatraea saccharalis) .

La proteína CryIFa, tal como se produce en plantas de maíz que contienen el evento TC1507, es responsable de un rasgo de resistencia a insectos líder en la industria para el control de FAW. CryIFa se despliega en forma adicional en los productos de HERCULEX®, SMARTSTAX™ , y Wl D ESTR I KE™ . I La capacidad para conducir (en forma competitiva u homologa) estudios de enlace de receptor utilizando la proteína CryIFa, está limitada debido a que la técnica más común disponible para etiquetar proteínas para detección en ensayos de enlace de receptor, desactiva la actividad insecticida de la | proteína Cry 1 Fa.

CryIAb y CryIFa son proteínas insecticidas actualmente utilizadas (por separado) en maíz transgénico para proteger a las plantas de una variedad de pestes de insectos. Una peste de maíz clave contra la que estas proteínas proporcionan I protección es el barrenador de maíz Europeo (ECB). La Solicitud de Patente Norteamericana No. 2008/0311096 se relaciona en parte con el uso de CryIAb para controlar una población ECB resistente a CryIF.

La presente solicitud describe cepas de Agrob acte ri u m I tumefaciens que han sido modificadas para incrementar la frecuencia de transformación de la planta. El uso de estas cepas proporciona sistemas de transformación de plantas novedosos para la introducción de genes extraños que se pueden expresar en plantas en células de la planta. Además, estas cepas proporcionan mejoras adicionales que permiten una eficiencia de transformación incrementada y proporcionan ventajas significativas para superar las desventajas de operación cuando se transforman plantas con genes extraños.

Breve Descripción de la Invención Las cepas Agrobacterium que albergan genes que incrementan la transformación en un plásmido con la capacidad de réplica independiente del cromosoma Agrobacterium , el plásmido Ti, y los vectores binarios de transformación de plantas y los métodos para su uso, se describen en la presente invención. Las cepas Agrobacterium tienen deficiencia de funciones de recombinación de ADN que dan como resultado la inestabilidad o reajuste de los vectores binarios de transformación de plantas, y albergan genes que incrementan la transformación en un plásmido con la capacidad de réplica independiente del cromosoma de Agrobacterium , el plásmido Ti, y los vectores binarios de transformación de la planta. También se describen cepas de Agrobacterium adicionales que albergan genes que incrementan la transformación integrados en el cromosoma de Agrobacterium en un locus que no interfiere con o de otra manera compromete el crecimiento normal y la capacidad de transformación de la planta de las células Agrobacterium y su uso.

En una modalidad de los métodos aquí descritos, una planta es transformada contactando una célula de la planta con una cepa de Agrobacterium que tiene al menos un plásmido auxiliar pTi que comprende un fragmento 14.8 Kpnl de pSB1 y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada, la región de T-ADN que comprende al menos un límite derecho de T-ADN y un ADN exógeno adyacente al límite, en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre sí.

En una modalidad adicional de los métodos aquí descritos, una planta se transforma contactando una célula de la planta con una bacteria del género Agrobacterium que tiene un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1, y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada, en donde el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 ha sido integrado en un sitio de integración neutral de un cromosoma de la bacteria.

En una modalidad adicional de los métodos aquí descritos, una cepa Agrobacterium incluye al menos un plásmido auxiliar pTi que comprende un fragmento 14.8 Kpnl de pSB1, y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada, en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre sí.

En una modalidad adicional, una cepa de Agrobacterium con propiedades de incremento de transformación incluye un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1, y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada.

En otra modalidad, un locus genómico nilA de Agrobacterium tumefaciens incluye una secuencia de polinucleótido que está integrada en el locus genómico nilA.

En una modalidad adicional, una cepa Agrobacterium con un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de SB1, está integrado en un sitio de integración neutral en el cromosoma de Agrobacterium .

En otra modalidad, una cepa de Agrobacterium LB4404 incluye un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 en un plásmido auxiliar pTi, y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada y tiene ADN exógeno adyacente al menos a un límite de T-ADN Agrobacterium , en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre sí.

En una modalidad adicional, una cepa Agrobacterium LBA4404 incluye al menos un gen vir de un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 integrado en un sitio de integración neutral en el cromosoma Agrobacterium .

En modalidades adicionales, se proporcionan plantas que se elaboran de acuerdo al método de transformación aquí descritos.

Aún en otra modalidad, una planta de maíz transgénica fértil, o progenie de la misma, expresa cantidades insecticidas de proteína CryICa, proteína insecticida CryIF, proteína insecticida CrylAbl, y cantidades tolerantes a herbicida de proteína de AAD-1, en donde las proteínas CryICa, CryIF, CrylAbl, y las proteínas AAD1 que expresan en forma colectiva desde un solo locus de ADN recombinante incorporado en forma estable en el genoma de la planta.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Muestra un esquema de clonación para la construcción del plásmido pDAB9292.

Figura 2. Muestra un mapa del plásmido pDOW3719.

Figura 3. Muestra un esquema de clonación para la construcción del plásmido pDAB9698.

Figura 4. Muestra mapas de plásmidos de vector binario pDAB101513 y pDAB101514.

Figura 5. Muestra un mapa del plásmido del vector binario pDAB101556.

Descripción Detallada de la Invención Las cepas de Agrobacterium difieren de otras en su capacidad para transformar células de la planta. Las cepas Agrobacterium oncogénicas, tipo Silvestre son conocidas por su capacidad para inducir agallas de corona (sobre crecimientos tumorosos) en muchas plantas huésped, especialmente especies dicotiledóneas. Esta transformación de células de la planta de crecimiento normal en células de tumor no autoreguladas, viene aproximadamente como resultado de transferencia de secuencias de ADN especializadas (T-ADN), que codifican genes que se pueden expresar en plantas que codifican hormonas de plantas, del plásmido que induce tumor (Ti) en células de la planta, en donde se integran en forma estable cromosomas de la planta. El plásmido Ti de la cepa Bo542 (por ejemplo, pTiBo542) es notable en cuanto a que, cuando se colocan algunos antecedentes cromosomales de Agrobacterium , promueve la inducción de tumores de crecimiento vigoroso, especialmente grandes en algunas plantas (Hood et al, (1986) J. Bacteriol. 168: 1291-1301). Los genes responsables de este fenotipo de "supervirulencia" residen en pTiBo542 fuera de las regiones T-ADN. El trabajo adicional descubrió que un plásmido que contiene un fragmento Kpnl de "15.8" pared de kilobase (kbp) derivado de pTiBo542 y que contenía todos los operones virG, virB, y virC promovió la formación de tumor incrementada a través de la cepa A281, cuando se comparó con cepas que carecen del plásmido (Jin et al, (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425). El gen virG de pTiBo542 se considera como responsable del fenotipo supervirulento de la cepa de Agrobacterium A281. virG de pTiBo542 origina un incremento de 1.7-veces en la expresión virB comparada con virG de pTiA6, debido a diferencias entre los dos genes en las regiones promotoras, secuencias de codificación, y regiones no traducidas 3' (Chen et al., (1991) Molec. Gen. Genet. 230:302-309). Por lo tanto, el gen virG de pT¡Bo542 puede ser utilizado en forma conveniente para promover eficiencias de transferencia de T-ADN superiores, y de esta forma mayores frecuencias de transformación de la planta, especialmente cuando están presentes en un fragmento Kpnl grande del plásmido pTiBo542, que también alberga los operones virB y virC o pTiBo542.

La secuencia anotada, completa de pTiBo542 fue presentada a GENBANK con el Número de Acceso DQ058764 el 12 de Mayo del 2005. La revisión del mapa del fragmento de restricción Kpnl y las anotaciones del gen, revelan que todo el operón virB (el cual incluye los genes virB1, virB2, virB3, virB4, virB 5, virB 6, virB 7, virB 8, virB9, virBIO, y virB 11), el gen virG, el operón virC (que comprende los genes virCI y virCT) y la parte del operón virD que comprenden un gen virD1 se pueden aislar en un fragmento Kpnl que comprende 14,815 pares base (pb). Se asume que el tamaño del fragmento Kpnl de "15.8 kbp" referido en la Publicación de et al, (supra) fue estimado a partir de la movilidad en gel de agarosa del fragmento, y que el tamaño real de los fragmentos referenciados, de hecho, es 14.8 kbp. Un experto en el campo de la biología molecular, comprenderá que el estimado de tamaño de dichos fragmentos de ADN grandes por medio de movilidad de electroforesis de gel de agarosa, pueden diferir del tamaño de fragmento real determinado por el análisis de secuencia de ADN por 1 kbp o más. Para facilidad de la descripción, este fragmento derivado de pT¡Bo542 será referido en la presente invención como el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8.

Una modalidad de los métodos aquí descritos, incluye usos de propiedades que incrementan la transformación codificadaa en el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 en cepas Agrobacterium que albergan al menos un plásmido auxiliar pTi desarmado, en donde el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 se lleva en un plásmido que tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad además de IncP para transformar una planta. Una modalidad adicional incluye la cepa Agrobacterium tal como se describe para utilizarse en el método. La región de T-ADN que será introducida en una planta que utiliza esta cepa de Agrobacterium puede ser llevada en un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos un límite de T-ADN de Agrobacterium , teniendo el plásmido un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad IncP, o un grupo de incompatibilidad que es compatible con el grupo de incompatibilidad del fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 que es llevado en un plásmido que tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad diferente a IncP. La región de T-ADN del plásmido puede ser los límites de T-ADN derechos o izquierdos de Agrobacterium adyacentes.

Los plásmidos son asignados a grupos de incompatibilidad (designación genotípica: inc; designación de grupo: inc) con base en secuencias contenidas en el plásmido. El determinante ¡nc normalmente sirve para prevenir que otros plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad o uno relacionado coexistan en el mismo huésped, y ayuda a mantener un cierto número de copias del plásmido dentro de la célula. Ver por ejemplo las Publicaciones de Fernandez-Lopez, et al, (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:942-66; y Adamczyk y Jagura-Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50:425-53. Dos plásmidos son incompatibles sí, ya sea es menos estable en la presencia de otro que lo fue por sí mismo. La competición para recursos de células puede resultar cuando dos plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad se encuentran en la misma célula. Cualquier plásmido que tenga la capacidad de réplica más rápida, o proporcione alguna otra ventaja, será representado en un grado desproporcionado entre las copias permitidas por el sistema de incompatibilidad. En forma sorprendente, los plásmidos también pueden ser incompatibles cuando ambos poseen las mismas funciones para dividirse por sí mismos en células hijas.

Los plásmidos normalmente caen únicamente en muchos de los grupos de incompatibilidad existentes. Existen más de 30 grupos de incompatibilidad conocidos. Los plásmidos que pertenecen al grupo de incompatibilidad IncP, han sido estudiados profundamente, y se han construido un gran número de plásmidos que se derivan de este grupo (Schmidhauser et al., (1988) Biotechnology 10:287-332). Los plásmidos de ejemplo que contienen el grupo de incompatibilidad IncP incluyen: pMP90RK, pRK2013, pRK290, pRK404, y pRK415. Estos plásmidos pueden ser mantenidos en numerosas especies bacterianas incluyendo E. coli y Agrobacterium tumefaciens. Los ejemplos de otros grupos de incompatibilidad incluyen pero no se limitan a; IncN, IncW, IncL/M, IncT, IncU, IncW, IncY, IncB/O, IncFII, Indi, IncK, lncCom9, IncFI, IncFII, IncFIII, IncHIl, lncHI2, IncX, IncA C, IncD, IncFIV, IncFV/FO, IncFVI, lncHI2, IncHIl, I n el 2 , Incl, IncJ, IncV, IncQ, y similares, incluyendo variantes de los mismos, por ejemplo, exhibiendo una secuencia sustancial o relación funcional. La tabla 1 describe varios grupos de incompatibilidad comunes y proporciona ejemplos de plásmidos que representan estos grupos de incompatibilidad (este listado de grupos de incompatibilidad y plásmidos se proporciona a manera de ejemplo únicamente, y no pretende limitar los grupos de incompatibilidad y plásmidos útiles con las cepas de Agrobacterium y métodos aquí descritos).

Otra modalidad de los métodos aquí descritos incluye usos de propiedades de incremento de transformación codificadas en el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 en cepas Agrobacterium que tiene una deficiencia en la función RecA, y que albergan al menos un plásmido auxiliar pTi desarmado, en donde el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 es llevado en un plásmido que tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad diferente a IncP. Una modalidad adicional incluye la cepa de Agrobacterium tal como se describe para utilizarse en el método. Una región de T-ADN que será introducida en una planta utilizando esta cepa de Agrobacterium, puede ser llevada en un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium, teniendo el plásmido un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad IncP o un grupo de incompatibilidad que es compatible con el grupo de incompatibilidad del fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 que es llevado en un plásmido que tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad diferente a IncP.

Aún en otra modalidad de los métodos aquí descritos incluyen los usos de propiedades de incremento de transformación codificados en el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1, y alberga al menos un plásmido auxiliar de pTi desarmado, en donde el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 está integrado en un sitio de integración neutral localizado en forma cromosomal de una cepa de Agrobacterium diferente a la cepa de C58. Una modalidad adicional incluye la cepa de Agrobacterium tal como se describe para utilizarse en el método. Una región de T-ADN que será introducida en una planta utilizando esta cepa de Agrobacterium comprende en forma adicional un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium .

Aunque son conocidos sistemas superbinarios, por ejemplo, se debe consultar las publicaciones Internacionales Nos. WO 94/00977A1, WO 95/06722A1, y WO 95/16031 A1 , y se describen en forma adicional en la Publicación de Komari et al, (supra), y en la Publicación de Komori et al, (supra), estos sistemas poseen una cantidad de desventajas. Una desventaja de operación del sistema superbinario, la cual es superada por las cepas Agrobacterium y métodos aquí descritos, es la necesidad de formación de un plásmido cointegrante entre pSB1 y pSB11 (y sus derivados) como el medio a través del cual el límite de T-ADN alterado en derivados pSB11, se mantendrá en forma estable en Agrobacterium . Este evento de co-integración genera un par de secuencias grandes (de aproximadamente 2.3 kbp) directamente repetidas debido a la recombinación entre las regiones homologas de pSB1 y pSB11. Tal como es bien sabido en la técnica expertos en el campo de la biología molecular, las secuencias repetidas grandes, tales como éstas, son objetivos preferidos para recombinación intramolecular que conduce eventualmente a eliminaciones de ADN y otros reajustes, particularmente cuando las repeticiones son una parte de la estructura del plásmido. En el sistema superbinario de Agrobacterium , dichos reajustes pueden conducir al reajuste parcial o a la pérdida completa de la región de T-ADN introducida por los derivados pSB11, dando como resultado finalmente poca o ninguna transferencia de los genes extraños deseados intactos en las células de la planta huésped.

Una ventaja adicional del sistema superbinario descrito anteriormente, y que también es superada por las cepas Agrobacterium y los métodos aquí descritos, es que la formación de plásmido cointegrante entre los derivados pSB1 y pSB11, genera un plásmido grande (como mínimo mayor a 43 kbp) que tiene dos distintos orígenes de réplica (ori) tipo ColE1 (grupo de incompatibilidad pMB1 /ColE1 ), así como un tercer ori derivado del plásmido RK2 (grupo de incompatibilidad IncP). Aunque en circunstancias normales el ori ColEles no funcional en Agrobacterium, se conocen mutaciones genómicas que permiten el mantenimiento estable de plásmidos que tiene un ori ColE1 en Agrobacterium (Ruslyakova et al., (1999) Russian J. Genet. 35:327-331). En células que tiene dichas mutaciones, un plásmido tal como el cointegrante de derivado pSB1::pSB11 que tiene tres orígenes funcionales de réplica, puede esperarse que sea altamente inestable. Por lo tanto, el sistema superbinario tiene imperfecciones que son atendidas en forma conveniente por los elementos de las cepas de Agrobacterium y los métodos para transformar plantas aquí descritas.

La estructura de ADN del gen o genes extraños destinados para introducción y expresión en células de plantas transgénicas mediante transformación transmitida por Agrobacterium, puede tener una profunda influencia en la estabilidad del plásmido de vector binario o plásmido de vector de traslado que alberga dichos genes en las células de Escherichia coli y Agrobacterium . La inestabilidad se manifiesta particularmente cuando los genes extraños comprenden componentes de gen que son empleados múltiples veces dentro de las construcciones de gen. Por ejemplo, es común que se pueda utilizar un promotor que se puede expresar en plantas particular, para conducir la expresión de diferentes regiones de codificación de proteínas en una planta transgénica. Otros componentes de gen, tal como las regiones no traducidas 3' (3'UTR) (es decir secuencias de terminación de transcripción y de determinación de adición de poliaden ilación) e incluso regiones de codificación de proteína altamente similares pueden ser duplicadas o están presentes en múltiples copias dentro de una región de T-ADN simple. Tal como se mencionó anteriormente, estos elementos de secuencia repetidos, los cuales pueden existir en orientaciones ya sea invertidas o directamente repetidas, son objetivos para recombinaciones intramoleculares que pueden conducir a eliminaciones de ADN y otros reajustes, particularmente ya que las repeticiones son una parte de la estructura de plásmido.

Se han desarrollado múltiples cepas especializadas de E. coli, que sirven como huéspedes de clonación molecular que ayudan a superar las dificultades de inestabilidad (por ejemplo las cepas STBL2™ , STBL3™, y STBL4™ ofrecidas por INVITROGEN; Carlsbad, CA). Una característica común para todas de dichas cepas de clonación E. coli es la presencia de una mutación genómica en un gen recA. La proteína RecA es una enzima multifuncional que juega un papel importante en la recombinación homologa, reparación de ADN e inducción de la respuesta SOS bacteriana. En el proceso de recombinación homologa, la proteína funciona como una ATPasa dependiente de ADN, que promueve la sinapsis, la formación heterodúplex y el intercambio de hebra entre los ADNs homólogos. Por lo tanto, las células con deficiencia de función de RecA, son más propensas a tolerar secuencias de ADN homologas sin reajuste o eliminación.

Las cepas con deficiencia de RecA de Agrobacterium , han sido desarrolladas para ayudar a atender los problemas de inestabilidad observados cuando se clonan fragmentos de ADN grandes que contienen secuencias repetidas (Klapwicj et al., (1979) Molec. Gen. Genet. 173: 171-175; Farrand et al, (1989) J. Bacteriol. 171 :5314-5321; Lazo et al, (1991) Bio/Technology 9:963-967). Estas cepas han probado ser útiles para ayudar a estabilizar construcciones de transformación de alto peso molecular en algunos casos (Frary y Hamilton, (2001) Transgeníc Res. 10: 121-132), pero no en todos los casos (Song et al., (2003) Theor. Appl. Genet.107:958-964). Por lo tanto, los antecedentes cromosomales de Agrobacterium que tienen defectos de recA para desarrollar cepas que son altamente eficientes en la capacidad de mantenimiento del plásmido y de la transformación de las plantas, pueden ser utilizados en forma conveniente. Además de utilizar los antecedentes cromosomales de Agrobacterium que tienen defectos de recA para desarrollar cepas para el uso en los métodos aquí descritos, se puede desactivar la funcionalidad de recA en una cepa existente o producida para ser que la cepa sea útil en los métodos aquí descritos. Ver por ejemplo, la Publicación de Farrand et al. (supra). Por ejemplo, una cepa puede ser desarrollada con funcionalidad RecA, y cualesquiera adiciones cromosomales adecuadas, por ejemplo, la adición de genes vir, puede elaborarse después de que se deshabilita la funcionalidad de RecA.

Se pueden utilizar vectores BIBAC diseñados para habilitar la transformación eficiente de fragmentos de ADN grandes en células huésped de plantas y sin plantas. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,733,744, Patente Norteamericana No. 5,977,439, y Solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0123100A1. Una cepa de Agrobacterium que puede ser utilizada con vectores BIBAC es la cepa con deficiencia de RecA UIA143 desarrollada por Farrand et al, {supra). Los refinamientos para el sistema BIBAC han utilizado subconjuntos de genes albergados en el fragmento de VirBCDG de 14.8 Kpnl en combinación con otros genes vir para aumentar la capacidad de transformación de la planta de cepas de Agrobacterium diseñadas. En particular, el gen virG del fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 ha sido empleado solo o en combinación con los genes virE1 y virE2 del pTiA6 en la cepa con deficiencia de RecA UIA143. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Hamilton et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93:9975-9979; Hamilton, (1997) Gene 200: 107-116; Frary y Hamilton, (supra).

Además, un vector adecuado utilizado para transformar células de plantas utilizando los métodos aquí descritos, puede contener un gen marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere en las células de la planta transformada, resistencia a un antibiótico o un herbicida. Por consiguiente, el gen marcador seleccionable empleado en forma individual, puede permitir la selección de células transformadas, aunque el crecimiento de células que no contienen el ADN insertado, puede ser suprimido por el compuesto selectivo. El gen(s) marcador seleccionable particular utilizado puede depender del diseño o preferencia experimental, aunque se puede utilizar cualesquiera de los siguientes marcadores seleccionables, así como cualquier otro término no descrito en la presente descripción, que pudiera funcionar como un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, genes que proporcionan resistencia o tolerancia a antibióticos tales como Kanamicina, G418, Higromicina, Bleomicina, y Metotrexato, o herbicidas tales como Fosfinotricina (Bialaphos), Gifosato, Imidazolinonas, Sulfonilureas, Triazolopirimidinas, Clorosulfuron, Bromoxinil, y DALAPON.

Además de un marcador selecciónatele, también se puede utilizar un gen reportero. En algunos casos, un gen reportado puede ser utilizado sin un marcador seleccionable. Los genes reporteros son genes que normalmente no proporcionan una ventaja de crecimiento al organismo o tejido receptor. Los genes reporteros normalmente codifican para una proteína que proporciona un cambio fenotípico o propiedad enzimática. Los genes reporteros adecuados incluyen pero no se limitan a los que codifican glucuronidasa (GUS), luciferasa de luciérnaga o proteínas fluorescentes tales como proteína fluorescente verde y proteína fluorescente amarilla.

Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños también puede variar. Dicho tejido puede incluir pero no se limita a tejido embriónico, tejido calloso tipo I y II, hipocotiledóneo y merístemo. Casi todos los tejidos de planta pueden ser transformados durante la diferenciación utilizando técnicas adecuadas dentro de la experiencia en la técnica. Un experto en el campo de la transformación de plantas, comprenderá que están disponibles múltiples metodologías para la producción de plantas transformadas, y que pueden ser modificadas y especializadas para adaptar las diferencias biológicas entre diversas especies de plantas huésped.

Sin importar la técnica de transformación particular empleada, el gen extraño puede incorporarse en un vector de transferencia de gen adaptado para expresar el gen extraño en una célula de planta, incluyendo en el vector un promotor de planta. Además de los promotores de planta, se pueden utilizar en forma eficiente promotores de una variedad de fuentes en células de plantas que expresan genes extraños. Por ejemplo, los promotores de origen bacteriano, tal como el promotor de sintasa de octopina, el promotor de sintasa de nopalina, el promotor de sintasa de manopina, los promotores de origen viral, tales como promotores 35S y 19S de virus de mosaico de coliflor CaMV), un promotor de virus baciliforme de caña de azúcar, y similares, pueden ser utilizados. Los promotores derivados de plantas incluyen pero no se limitan al promotor de subunidad pequeña (ssu) de carboxilasa de ribulosa-1 ,6- bisfosfato (RUBP), promotor de betaconglicinina, promotor de faseolina, promotor de ADH (deshid rogenasa de alcohol), promotores de impacto térmico, promotor de ADF (factor de despolimerización de actina), y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de transcripción. Los potenciadores típicos incluyen pero no se limitan a, intrón 1 de deshidrogenasa de alcohol (ADH1) y ADH1-intrón 6. Se pueden utilizar promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión de gen continua en casi todos los tipos de células y en casi todos los momentos (por ejemplo, promotor de actina, promotor de ubiquitina, promotor de CaMV 35S). Los promotores específicos de tejidos son responsables de la expresión de gen en tipos de célula o tejido específicos, tal como las hojas o semillas. Los ejemplos de otros promotores que se pueden utilizar incluyen los que son activos durante una cierta etapa del desarrollo de la planta, así como activos en tejidos y órganos de la planta específicos. Los ejemplos de dichos promotores incluyen pero no se limitan a promotores que son específicos de la raíz, específicos de polen, específicos de embriones, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de endoesperma de semilla y específicos del floema.

Bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable el uso de un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como un estímulo físico (por ejemplo, promotores de gen de impacto térmico); de luz (por ejemplo, promotor de carboxilasa de ribulosa-bis-fosfato 1,5); hormona (por ejemplo, glucocorticoide); antibiótico (por ejemplo, Tetraciclina); metabolitos; y tensión (por ejemplo, sequía). Otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas también pueden ser utilizados, tales como por ejemplo, las secuencias líder no traducidas 5', secuencias de terminación de transcripción de ARN y secuencias de señal de adición de poliadenilato. Se puede utilizar cualquier vector de transferencia de gen específico de planta adecuado conocido en la técnica.

Las cosechas transgénicas que contienen rasgos de resistencia a insectos (IR) son prevalentes en plantas de maíz y algodón a lo largo de Norteamérica, y el uso de estos rasgos se expande en forma global. Las cosechas transgénicas comerciales que combinan rasgos IR y de tolerancia a herbicidas (HT) han sido desarrolladas a través de múltiples compañías de semillas. Éstas incluyen combinaciones de rasgos IR conferidas por proteínas insecticidas Bt (Bacillus thuringiensis) y rasgos HT, tal como tolerancia a inhibidores de Sintasa de Acetolactato (ALS), tal como Sulfonilureas, Imidazolinonas, Triazolopirimidina, Sulfonanilidas, y similares, inhibidores de Sintetasa de Glutamina (GS) tal como Bialafos, Glufosinato, y similares, inhibidores de Dioxigenasa de 4- HidroxiFenilPiruvato (HPPD) tales como Mesotriona, Isoxaflutole, y similares, inhibidores de Sintasa de 5- EnolPiruvilShikimate-3-Fosfato (EPSPS) tales como Glifosato y similares, e inhibidores de Carboxilasa de Acetil-Coenzima A (ACCase) tales como Haloxifop, Quizalofop, Diclofop, y similares. Son conocidos otros ejemplos en los cuales las proteínas proporcionadas en forma transgénica proporcionan tolerancia de la planta a clases químicas de herbicidas tales como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de auxina de piridiloxiacetatos (ver por ejemplo la Publicación Internacional WO 2007/053482A2), o herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (ver la Publicación Internacional WO 2005107437A2.A3). La capacidad de controlar múltiples problemas de pestes a través de los rasgos IR, es un concepto valioso de un producto comercial, y la conveniencia de este concepto de producto se incrementa si los rasgos de control de insectos y los rasgos de control de maleza se combinan en la misma planta. Además, se puede obtener un valor mejorado a través de combinaciones de una sola planta de rasgos IR conferidos por una proteína insecticida Bt con uno o más rasgos HT adicionales, tales como los mencionados anteriormente, además de uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, otra resistencia a insectos conferida por proteínas insecticidas derivadas de Bt u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos tales como ARNi y similares, resistencia a enfermedades, tolerancia a tensión, utilización de nitrógeno mejorada y similares), o rasgos de salida (por ejemplo, alto contenido de aceites, composición de aceite saludable, incremento nutricional y similares). Dichas combinaciones pueden ser obtenidas ya sea a través de crianza convencional (por ejemplo, pila de crianza) o en unión como un evento de transformación novedoso que implica la introducción simultánea de múltiples genes (por ejemplo, pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de manejar pestes de insectos y control de maleza mejorado en una planta de cosecha que proporciona beneficios secundarios al productor y/o el consumidor. Por lo tanto, las cepas de Agrobacterium y los métodos aquí descritos pueden utilizarse para proporcionar plantas transformadas con combinaciones de rasgos que comprenden un paquete agrónomo completo de calidad de cosecha mejorada con la capacidad de controlar en forma flexible y efectiva en costo cualquier número de aspectos agrónomos.

Los genes virG de diversos plásmidos pTi han sido estudiados para comprender su capacidad para potenciar la frecuencia de transformación de la planta. Liu et al., (1992, Plant olec. Biol. 20: 1071-1087) encontró que las extra copias de genes virG de múltiples fuentes (por ejemplo, de diferentes plásmidos pTi, aunque incluyendo pTiBo542) potenció la transformación temporal de algunas plantas, y la magnitud del efecto dependió de la identidad del plásmido pTi auxiliar con el cual se emparejó el gen virG particular. Un muíante de un gen virG (en forma presumible de pTiA6), nombrado virGN54D (la mutación reemplaza el aminoácido Asn54 con Asp), se expresa en forma constitutiva en Agrobacterium (la inducción de genes virG tipo silvestre requiere un pH ácido, una alta concentración de monosacárido, y la presencia de inductores fenólicos, tal como acetatosiringona). Ver por ejemplo la Publicación de Pazour et al., (1992) J. Bacteriol. 174:4169-4 74. VirGN54D de pTiA6 fue efectivo para potenciar la transformación de maíz, mientras que múltiples copias del virG tipo silvestre de origen, no fueron efectivas. Ver por Publicación de Hansen et al., (1994) J. Bacteriol. 174:4169-4174. Se ha descrito un sistema "ternario" (es decir, tres-plásmido) en donde una copia del gen V/YGN54D mutante constitutivo de pT¡15955 residió en conjunto en un plásmido derivado de pBBR1 en la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contenía el plásmido auxiliar pTi desarmado pAL4404 y un vector binario que alberga genes para la transformación de la planta. Ver la Publicación de van der Fits et al., (2000) Plant Molec. Biol. 43:495-502. El gen v/'rGN54D expresado en forma constitutiva se descubrió que incrementa en forma dramática las eficiencias de transformación tanto temporales como estables de diversas especies de planta. Los plásmidos que contienen la región de control de réplica pBRR1 no pueden clasificarse como que pertenecen a cualquier grupo de incompatibilidad conocido, y por lo tanto pueden existir junto con un amplio rango de otros plásmidos en un solo huésped. Además, las capacidades de varias combinaciones de genes vir para afectar las eficiencias de transformación de la planta en tabaco, algodón y arroz han sido probadas, específicamente: el gen virGN54D mutante derivado de pTiA6, el gen virG de pTiBo542, los genes VirE1//E2 de pTiA6, y una combinación de los últimos dos conjuntos del gen. Ver la Publicación de Park er al., (2000) Theor. Appl. Genet. 101: 1015-1020. Se observaron incrementos de las eficiencias de transformación con algunas especies de plantas y con vir adicionales de genes.

La Solicitud de Patente Europea No. 2042602A1 y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2010/0132068A1 , describen vectores binarios de cósmido y plásmidos "de refuerzo" que, cuando están presentes en una célula de Agrobacterium que alberga un plásmido auxiliar pTi, constituyen ejemplos adicionales de sistemas de plásmido ternario. Los plásmidos de refuerzo tal como se describen en esos documentos, poseen un origen de réplica del grupo de incompatibilidad IncW, y comprenden el plásmido pVGW, que tienen el gen rGN54D, y el plásmido pVGW2, el cual es un derivado de pVGW que tiene modificaciones para facilitar la clonación y selección.

Las funciones codificadas por los genes cromosomales en Agrobacterium, han sido determinados clásicamente por dos métodos genéticos. El primero, o método de genéticas directas, comprende obtener un clon molecular del gen que será estudiado, seguido de la colocación del gen clonado en un ambiente genético, en donde se puede evaluar un fenotipo de "ganancia de función". Un segundo método o "método de genéticas inversas", requiere interrupción de la estructura de los genes mediante inserción o eliminación de secuencias en o alrededor del gen en el cromosoma, seguido de la determinación de que proteínas o fenotipos han sido eliminados por la pérdida de la función de gen. Este es el método utilizado para construir el mutante con deficiencia de RecA de la cepa C58 previamente descrito. Ver la Publicación de Farrand et al., supra. Los expertos en el campo de la manipulación genética de células de Agrobacterium , comprenderán que se han descrito diversos vectores y numerosos métodos para permitir dichos experimentos de interrupción de gen. El método ha probado ser particularmente útil cuando se utiliza para identificar genes que no están implicados en la vitalidad, crecimiento y capacidad de transformación de la planta de la cepa mutada. Uno de dichos locus genéticos en la cepa Agrobacterium C58 es el locus pgl/picA. Ver las Publicaciones de Lee et al., (2001) Plant Microbe Interact. 14:577-579; y Lee (2006) En.: Método en Biología Molecular (K. Wang, ed.) No. 343: Protocolos Agrobacterium (2o Edición, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ. pp.55-66. Las células en las cuales el gen virD2 ha sido integrado en este locus cromosomal mediante recombinación homologa, se descubrió que tienen un fenotipo de transformación de planta idéntico al resultante de las cepas A. tumefaciens que albergan el gen virD2 localizado en un plásmido de réplica. Ver la Publicación de Lee et al., supra. Además, una región de T-ADN integrada en el locus pgl/picA de C58 puede ser suministrada en forma funcional a la célula de la planta (Oltmanns et al., 2010. Plant Physiol. 152: 1 158-1166).

Por lo tanto, en la cepa C58, el locus pgl/picA puede servir como un "sitio de integración neutral" para introducción de genes en el cromosoma C58. Tal como se utiliza en la presente invención, el "sitio de integración neutral" se refiere a un gen o locus cromosomal, presente en forma nativa en el cromosoma de una célula de Agrobacterium , cuya función normal no es requerida para el crecimiento de la célula o para la capacidad que tiene la célula para llevar a cabo todas las funciones requeridas para la transformación de la planta. Cuando se j interrumpen a través de la integración de la secuencia de ADN no presente normalmente con dicho gen, la célula que alberga un gen de sitio de integración neutral interrumpido puede llevar a cabo en forma productiva la transformación de la planta. A manera de ejemplo, Hoekema et al. (1984, EMBO J. 3:2485-| 2490), demostró que una región-T funcional integrada en un locus no caracterizado en el cromosoma C58 por medio de la transposición Tn3, fue transferido en forma productiva a una célula de la planta.

Las cepas de Agrobacterium aquí descritas pueden ser | utilizadas en forma conveniente para introducir uno o más genes en una planta, por ejemplo, para proporcionar propiedades insecticidas o herbicidas individuales o múltiples a la planta. Por ejemplo, las cepas de Agrobacterium pueden ser utilizadas para introducir uno o más, dos o más, tres o más, I cuatro o más, cinco o más o seis o más genes en una planta.

Utilizando las cepas de Agrobacteri um aquí descritas, el polinucleótido que contiene las secuencias de gen seleccionable se inserta en una ubicación simple en la célula de la planta cuando la célula de la planta se transforma. En términos del tamaño de las regiones de T-ADN utilizadas para insertar los genes, las regiones de R-ADN pueden ser iguales a o mayores a 15,000 pares base de nucleótido, mayores o iguales a 20,000 pares base de nucleótido, iguales o mayores a 25,000 pares base de nucleótido, iguales o mayores a 26,000 pares base de nucleótido, iguales o mayores a 27,000 pares base de nucleótido, iguales o mayores a 28,000 pares base de nucleótido, iguales o mayores a 29,000 pares base de nucleótido, o iguales o mayores a 30,000 pares base de nucleótido. Cuando se utilizan las cepas de Agrobacterium aquí descritas, las secuencias de gen seleccionables pueden tener iguales o mayores al 60%, iguales o mayores a 65%, iguales o mayores a 67%, iguales o mayores a 69.5%, iguales o mayores a 70%, iguales o mayores a 75%, o iguales o mayores a 80% de homología de secuencia y retener sus identidades de secuencia transcribibles. Los tipos de genes que pueden ser introducidos pueden codificar proteínas insecticidas, proteínas herbicidas o una mezcla de proteínas insecticidas y proteínas herbicidas. Los ejemplos de genes específicos que pueden ser introducidos incluyen los genes que codifican la proteína insecticida CryICa, la proteína insecticida CryIF, la proteína insecticida Cry1Ab1 y la proteína herbicida AAD1, la cual se puede introducir en diversas combinaciones o como un conjunto, incluyendo las cuatro. Las especies monocotiledóneas (monocot) y dicotiledóneas (dicot) pueden ser transformadas utilizando estas cepas Agrobacterium .

También en la presente invención se describen locus genómicos nilA de Agrobacterium tumefaciens, en los cuales se puede integrar una secuencia de polinucleótido. Dichas secuencias de polinucleótido integrada puede incluir cualquier gen vir u operón vir u otros genes útiles. Los ejemplos 17 a 20 muestran la identificación, caracterización y el uso de locus genómico nilA de Agrobacterium tumefaciens así como la producción de una cepa Agrobacterium tumefaciens con múltiples genes vir localizados en el cromosoma. El locus genómico nilA, o cualquier locus que comparte de 85 a 100% de identidad de secuencia de nucleótido, puede ser identificado en otras cepas Agrobacterium utilizando las técnicas para identificación y caracterización aquí descritas, y cualquiera de dichos locus nilA identificados, se pueden utilizar en una forma similar a la descrita en la presente invención para integrar vir u otros genes adecuados, que pueden, por ejemplo, incrementar la eficiencia de la transformación de la planta. Las técnicas para identificación y caracterización de dicho locus genómico aquí descritas, también se pueden utilizar para identificar otros sitios de integración neutrales en el cromosoma Agrobacterium en el cual las secuencias de polinucleótido que contienen vir u otros genes, se pueden integrar de modo que la cepa Agrobacterium permanezca con la capacidad de transformar plantas. Algunos sitios cromosomales ya conocidos que pueden ser utilizados como sitios de integración neutral, por ejemplo, el sitio RecA en una cepa con deficiencia de RecA, y el locus pgl/picA en la cepa Agrobacterium tumefaciens C58. Sin embargo, existe la necesidad de identificar nuevos sitios neutrales en las cepas Agrobacterium tumefaciens además de C58, ya que el locus pgl/picA no se detecta en algunas otras cepas, por ejemplo, la cepa LBA4404 (Oltmanns et al., supra). Los sitios cromosomales adicionales que se pueden utilizar como sitios de integración neutral se describen en la Patente Norteamericana No. 6,323,396. Por lo tanto, también se describe una cepa Agrobacterium con un gen vir integrado en un sitio de integración neutral en el cromosoma Agrobacterium . Dicha cepa Agrobacterium puede utilizar un locus genómico nilA u otro sitio de integración neutral para la integración de genes vir.

Se pueden agregar múltiples tipos de genes útiles al cromosoma en esta forma, haciendo innecesario el uso de plásmidos auxiliares-T. Por ejemplo, los genes vir adicionales y las múltiples copias de genes vir útiles de diferentes cepas pueden ser utilizados.

También se describe en la presente invención una cepa Agrobacterium que contiene genes vir o un plásmido auxiliar que tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad además de IncP y un plásmido que tiene una región T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN Agrobacterium , teniendo el plásmido un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad IncP.

Se describen además plantas elaboradas a través de los métodos aquí descritos utilizando las cepas de Agrobacterium aquí descritas. Dichas plantas se integran en forma estable a cualesquiera regiones de T-ADN introducidas utilizando los métodos aquí descritos. Además, dichas plantas expresan cualesquiera genes y exhiben cualesquiera rasgos genéticos conferidos por las regiones de T-ADN. Además, cualquier progenio de las plantas elaboradas a través de los métodos aquí descritos utilizados las cepas Agrobacterium aquí descritas, producen en forma estable cualquiera genes y exhiben cualquier rasgo genético conferido por las regiones de T-ADN encontradas en el origen.

En una modalidad específica, se describe una planta que expresa en forma estable proteínas insecticidas CryICa, proteínas insecticidas CryIF, proteínas insecticidas Cry1Ab1 y proteínas herbicidas AAD1. Esta planta, por ejemplo, puede ser maíz.

Aunque en la presente invención se describen ciertas cepas Agrobacterium de ejemplo, la funcionalidad descrita puede ser movida a las otras cepas Agrobacterium con los mismos criterios, por ejemplo, otras cepas las cuales tienen deficiencia de RecA, o se pueden elaborar con deficiencia de RecA. Los ejemplos de otras cepas que se pueden utilizar con las cepas y métodos aquí descritos incluyen, pero no se limitan a, la cepa Agrobacterium tumefaciens C58, la cepa Agrobacterium tumefaciens Chry5, las cepas Agrobacterium rhizogenes, la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA101, la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105, ta cepa Agrobacterium tumefaciens OG101 y la cepa Agrobacterium tumefaciens T37.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones referidas o mencionadas en la presente invención, están incorporadas en su totalidad como referencia hasta el grado en que no sean inconsistentes con las enseñanzas explícitas de la presente especificación.

A continuación se encuentran ejemplos que ilustran procedimientos para utilizar las cepas Agrobacterium y practicar los métodos aquí descritos. Estos ejemplos no deben construirse como limitantes. Todos los porcentajes están en peso, y todas las proporciones de mezcla de solvente son en volumen, a menos que se indique de otra manera. Todas las temperaturas están en grados Celsius.

A menos que se indique o se implique en forma específica, los términos "un", "uno, una", y "el, la" significan "al menos uno", tal como se utiliza en la presente invención.

EJEMPLO 1: Construcción de una variante de eliminación de plásmido pUCD2 La construcción de plásmido pUCD2 fue descrita por Cióse et al., (1984, Plasmid 12: 111-118), y la secuencia de ADN de 13,239 pb completa se describe por primera vez en la presente invención como la SEC ID NO:1. pUCD2 alberga cuatro genes que confieren resistencia bacteriana a antibióticos: específicamente, resistencia a Espectinomicina, Kanamicina, Tetraciclina y Ampicilina (figura 1). Se emplearon en la presente invención, y otros pasos descritos en este ejemplo, y en otros ejemplos de la presente descripción métodos de biología molecular estándar, tal como se enseña, por ejemplo en la Publicación de Sambrook et al., (1989, Clonación Molecular: Manual de Laboratorio {2° Edición, COLD SPRING HARBOR LABO RATO RY PRESS, Plainview, N.Y.) y Ausubel ef al., (1995, Protocolos Actuales en Biología Molecular, (GREENE PUBLISHING AND WILEY-INTERSCIENCE, Nueva York), y actualizaciones de las mismas. Se elaboró una primera modificación a pUCD2 disociando el ADN pUCD2 con las enzimas de restricción Sac I y Sac II y con ligadura a un fragmento de oligonucleótido en su mayoría de hebra doble que tiene "extremos pegajosos sobresalientes" adecuados compatibles con los salientes generados por Sac I- o Sac II. Este oligonucleótido de hebra doble (figura 1) fue creado endureciendo dos secuencias de oligon ucleótidos complementarias, descritas como SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3. Las secuencias de los oligonucleótidos de SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3, están diseñadas para restaurar un gen de resistencia a Kanamicina funcional al momento de la ligadura con ADN pUCD2 disociado con Sac I y Sac II. Esta manipulación creó el plásmido pDAB9290 (figura 1), que difiere de pUCD2 mediante la eliminación de la región de codificación para resistencia a Espectinomicina, la eliminación de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Kpn I desde dentro de la región de codificación para resistencia a Kanamicina, y la creación de un nuevo sitio Kpn I en la corriente descendente de la región de codificación de resistencia a Kanamicina.

El ADN del plásmido pDAB9290 fue manipulado en forma adicional para hacer inoperativos los genes que codifican la resistencia a Tetraciclina y resistencia a Ampicilina, disociando primero con las enzimas de restricción Pst I y Sal I, tratando los extremos sobresalientes dejados por estas enzimas con el equipo QUICK BLUNTING™ (NEW ENGLAND BIOLABS; Ipswich, MA) para crear extremos romos, y la autoligadura para rodear los fragmentos producidos de esta forma. El plásmido resultante (pDAB9291) retiene únicamente el gen de resistencia a antibiótico bacteriano de Kanamicina, y tiene un sitio único para disociación mediante la corriente descendente Kpn I del gen de resistencia a Kanamicina. La secuencia de pDAB9291 se describe en la SEC ID N0:4. El plásmido pDAB9291 tiene dos orígenes de réplica, uno (grupo de incompatibilidad colE1) derivado del plásmido pBR322, y un segundo derivado del plásmido pSa (grupo de incompatibilidad W). Por lo tanto, el plásmido pDAB9291 tiene la capacidad del mantenimiento de números de copias promedio en E. coli y Agrobacterium .

EJEMPLO 2: Clonación de un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 en pDAB9291 Se aisló un fragmento Kpnl 14.8 kbp que contiene los operones virG, virB y virC y virD1 del "supervirulento" pTiBo542 (figura 1) del plásmido pSB1 (Komari et al., supra; y Komori et al., supra), y se clonó en el sitio Kpn I único de pDAB9291. Los plásmidos que contienen cada una de las dos orientaciones posibles del primer fragmento fueron obtenidos, y se nombraron como pDAB9292 y pDAB9293. Se seleccionó para trabajo adicional un plásmido, pDAB9292 (figura 1). La secuencia de ADN de pDAB9292 se describe como SEC ID NO:5.

EJEMPLO 3: Construcción de una cepa Agrobacterium con deficiencia de RecA que alberga el plásmido auxiliar pTiEHA105.

La cepa Agrobacterium UIA143 es una cepa con deficiencia de RecA que tiene el antecedente genético C58 y fue construida y descrita por Farrand et al., (supra). El gen recA cromosomal fue eliminado y reemplazado con un cartucho de gen que confiere resistencia a Eritromicina en 150 pg/mL. La cepa UIA143 no contiene plásmido Ti o un derivado de plásmido Ti.

La cepa Agrobacterium EHA105, construida y descrita por Hood et al., (1993, Transgenic Research 2:208-221), alberga un plásmido auxiliar (aquí llamado pTiEHA105) derivado del plásmido pTiBo542 "supervirulento". El plásmido de ADN pTiEHA105 se preparó a partir de la cepa EHA105 y se introdujo mediante electroporación en células de la cepa UIA143 elaborada como electrocompetente a través de métodos | estándar (Weigel y Glazebrook, (2002) Arabidopsis: Manual de Laboratorio. COLD SPRING HARBOR PRESS, Cold Spring Harbor, NY, 354 páginas; Mersereau et al., (1990) Gene 90: 149-151; Mattanovich, et al., (1989) Nucí. Acids Res. 17:6747)). Las células de la cepa UIA143 transformadas con pTiEHA105 | fueron seleccionadas por su capacidad de crecer en un medio mínimo AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264), utilizando agar purificado y manopina (2 mg/mL) como una sola fuente de carbono y nitrógeno para crecimiento (Guyon et al., (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77:2693-2697; Dessaux et al., | (1987) Molec. Gen. Genet. 208:301-308).

La presencia de pTiEHA105 fue verificada mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores designados para amplificar los fragmentos de los genes virD2 y virG pTiBo542, y caracterizado mediante análisis de manchado Southern de ADN total preparado de colonias candidatas probadas con ADN etiquetado-32P de pTiEHA101 purificado mediante centrifugación de gradiente de cloruro de cesio. Esta cepa Agrobacterium (por ejemplo UIA143 que contiene pTiEHA105) es nombrada DA2552.

EJEMPLO 4: Construcción de una cepa de Agrobacterium con deficiencia de RecA que alberga el plásmido auxiliar ?"?058? Se derivó la cepa Z707 reemplazando toda la región T-ADN del plásmido pTiC58 de la cepa Agrobacterium tumefaciens C58, con el gen npt I de Tn903, el cual confiere resistencia a Kanamicina. Toda la región vir del plásmido resultante, aquí llamado pTiC58A, se dejó intacta (Hepburn et al., (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969). El plásmido auxiliar pTiC58A de la cepa Z707 fue purificado mediante centrifugación de gradiente de cloruro de cesio y se electroporó en células UIA143 electrocompetentes. Se seleccionó un transformante sobre las bases del gen de resistencia a Kanamicina llevado por el plásmido pTiC58A y el gen de resistencia a Eritromicina llevado en forma cromosomal, y la cepa fue nombrada DA2569. Se verificó la presencia de pTiC58A en DA2569 mediante amplificación PCR, utilizando cebadores para detectar las regiones de gen vir seleccionadas, y mediante análisis de manchado Southern del ADN total preparado a partir de las colonias candidatas DA2569 probadas con ADN etiquetado-32P de pTiC58A purificado mediante centrifugación de gradiente de cloruro de cesio de células de la cepa Z707.

EJEMPLO 5: Construcción de una cepa Agrobacterium con deficiencia de RecA que alberga el plásmido auxiliar pMP90 La cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pM P90) alberga una versión eliminada de pTiC58, llamada pMP90, de la cual se ha eliminado toda la región T-ADN y se ha reemplazado con un gen que confiere resistencia a Gentamicina (Koncz y Schell, (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396). El ADN del plásmido pMP90 se preparó a través de métodos tales como centrifugación de gradiente de cloruro de cesio o el equipo MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI KIT "LOW COPY" (MACHEREY-NAGEL Inc.; Bethelem, PA) y se electropora en células UIA143. Se selecciona un transformante sobre las bases del gen de resistencia a Gentamicina llevado por plásmido pMP90 (100 pg/mL) y la cepa es nombrada DAt20538. La presencia de pMP90 en DAt20538 fue verificada mediante amplificación PCR utilizando cebadores para detectar las regiones de gen vir seleccionadas y mediante análisis de manchado Southern del ADN total preparado a partir de DAt20538.

EJEMPLO 6: Construcción de la cepa Agrobacterium con deficiencia de RecA que alberga el plásmido auxiliar pMP90RK El plásmido auxiliar pMP90 descrito en el Ejemplo 5 fue modificado en forma adicional mediante la introducción (a través de recombinación homologa de cruce doble) de un fragmento EcoR I de 42 kbp derivado del plásmido pRK2013 (Figurski y Helinski, (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79: 1648-1652). El fragmento de 42 kbp contiene los genes derivados de RK2 para réplica y movilización de plásmido (por ejemplo trfA, tral, tra2, tra3 y oriT), y un gen que confiere resistencia a Kanamicina. Esta manipulación reemplazó el gen de resistencia a Gentamicina del plásmido p P90, y el plásmido resultante fue nombrado pMP90RK (Koncz y Schell, supra). El ADN del plásmido pMP90RK se prepara a través de métodos tales como centrifugación de gradiente de cloruro de cesio o el equipo MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI KIT "LOW COPY", y se electropora en células UIA143 electrocompetentes. Se selecciona un transformante sobre las bases del gen de resistencia a Kanamicina llevado por plásmido p P90RK, y la cepa se nombra DAt20539. Se verifica la presencia de pMP90RK en DAt20539 mediante amplificación PCR utilizando cebadores para detectar las regiones de gen vir seleccionadas y mediante análisis de manchado Southern de ADN total preparado a partir de DAt20539.

EJEMPLO 7: Electroporación de ADN pDAB9292 en la cepa Agrobacterium DA2552 Se prepararon células DA2552 electrocompetentes utilizando un protocolo estándar (ver Ejemplo 3). Se descongelaron 50 pL de las células DA2552 competentes sobre hielo y se transformaron utilizando 300 a 400 ng de ADN de plásmido pDAB9292. El ADN y la mezcla celular se electroporó utilizando cubetas de electroporación enfriadas previamente (0.2 cm) y un electroporador BIO-RAD GENE PULSER (BIO-RAD Inc.; Hercules, CA.) con las siguientes condiciones: Voltaje: 2.5 kV, Longitud de pulsación; 5 msec, salida de capacitancia: 25 pFarad, Resistencia: 200 ohms. Después de la electroporación, se agregó a la cubeta 1 mL de caldo YEP (gm/L: Extracto de Levadura 10, Peptona 10, NaCI 5), y la suspensión de célula- YEP fue transferida a un tubo de cultivo de 15 mL. Las células se incubaron a una temperatura de 28° con agitación suave durante 4 horas después de lo cual se revistió el cultivo en YEP + agar que contiene Kanamicina en 50 pg/mL y Eritromicina en 150 pg/mL. Las placas se incubaron durante 2 a 4 días a una temperatura de 28° y se seleccionaron colonias y se rayaron | sobre placas de YEP + agar frescas con antibióticos tal como se indicó anteriormente, y se incubaron a una temperatura de 28° durante 1 a 3 días. Estas colonias se verificaron como Agrobacterium utilizando la prueba de ketolactosa (Bouzar ef al., (1995) En.: Métodos en Biología Molecular (K. Gartland y M. Davey, eds.) Protocolos Agrobacterium. (Vol. 44) HUMANA PRESS, Totowa, NJ. páginas 9 a 13. Se seleccionaron diversas colonias positivas para ketolactosa para iniciar con 3 mL de cultivos de semilla YEP (con antibióticos que se crecieron durante la noche) a una temperatura de 28° en agitación. Se utilizaron 300 pL de cada cultivo de semilla para inocular durante la noche 200 ml_ de cultivo YEP (con antibióticos) crecido a una temperatura de 28° en agitación en 200 rpm. Se preparó el ADN de plásmido a partir de 165 ml_ de cada 200 mL de cultivo durante la noche utilizando un equipo de PURIFICACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO MAXI XTRA MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND®. Se siguió el protocolo del fabricante, excepto que se utilizaron 30 mL de cada amortiguador RES, LYS y NEU. El ADN eluido se almacenó en 4°C.

Se utilizó digestión de enzima de restricción del ADN de plásmido con BamH I para validar la presencia de pDAB9292 en estos aislados, y las colonias que tienen los patrones correctos fueron purificadas en forma adicional utilizando dos pasajes de aislamiento de colonia simple. El ADN de plásmido se preparó de los cultivos de la noche tal como se describió anteriormente, y se utilizó análisis de digestión de restricción para verificar la presencia de pDAB9292 intacto. Se incluyó el ADN de plásmido del vector pDAB9292 utilizado originalmente en la transformación de DA2552 como un estándar digerido. Se corrieron cuatro reacciones de digestión separadas (Psf /, BamH I, Mfe I y Hind III) utilizando 750 ng para 1 pg de ADN. La reacción se dejó correr de 1 a 2 horas y se analizó mediante electroforesis de gel de agarosa (0.8% p/v) y los fragmentos de ADN se visualizaron mediante manchado de bromuro de etidio. Esta cepa Agrobacterlum (por ejemplo DA2552 que alberga pDAB9292) es nombrada DAt13192. Esta cepa proporciona las bases para un sistema de transformación de planta "ternario" con deficiencia de recombinación.

EJEMPLO 8: Electroporación de ADN pDAB9292 en la cepa Agrobacterium GV3101 (pMP90) Las células de la cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, supra) se hicieron electrocompetentes a través de un protocolo estándar (ver Ejemplo 3). Se descongelaron sobre hielo 50 µ? de las células | GV3101 (pMP90) competentes y se transformaron utilizando 300 a 400 ng de plásmido de ADN pDAB9292. El ADN y la mezcla celular se electroporó utilizando cubetas de electroporación enfriadas previamente (0.2 cm) y un electroporador BIO-RAD GENE PULSER con las siguientes condiciones: Voltaje: 2.5 kV, | Longitud de pulsación: 5 msec, Salida de capacitancia: 25 pFarad, Resistencia: 200 ohms. Después de la electroporación, se agregó a la cubeta 1 mL de caldo YEP y se transfirió la suspensión de célula-YEP a un tubo de cultivo de 15 mL. Las células se incubaron a una temperatura de 28°C con agitación | suave durante 4 horas después de lo cual se revistió en cultivo en YEP + agar que contiene Kanamicina en 50 pg/mL y Gentamicina en 100 pg/mL. Las placas se incubaron durante 2 a 4 días a una temperatura de 28° y las colonias fueron seleccionadas y rayadas sobre placas de YEP + agar frescas I con antibióticos tal como se describió anteriormente, y se incubaron en 28° durante 1 a 3 días. Estas colonias fueron verificadas como Agrobacterium , utilizando la prueba de ketolactosa. Se seleccionaron diversas colonias positivas para ketolactosa para iniciar 3 mL de cultivos de semilla YEP (con antibióticos) que se crecieron durante la noche en 28°C en agitación. Se utilizaron 300 µ?_ de cada cultivo de semilla para inocular 200 mL de un cultivo de la noche YEP (con antibióticos) crecido en 28° en agitación en 200 rpm. Se preparó el ADN de plásmido a partir de 165 mL de cada 200 mL del cultivo de la noche utilizando un equipo de PURIFICACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO MAXI XTRA MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND®. Se siguió el protocolo del fabricante, excepto que se utilizaron 30 mL de cada amortiguador RES, LYS y NEU. El ADN eluido se almacenó en 4°C.

Se utilizó digestión de enzima de restricción del ADN de plásmido con BamH I, para validar la presencia de pDAB9292 en estos aislados, y las colonias que tienen los patrones correctos fueron purificadas en forma adicional utilizando dos pasajes de aislamiento de colonia simple. El ADN de plásmido se preparó de cultivos de la noche tal como se describió anteriormente, y se utilizó análisis de digestión de restricción para verificar la presencia del pDAB9292 Intacto. El ADN de plásmido del vector pDAB9292 utilizado originalmente en la transformación GV3101 (pM P90), se incluyó como un estándar digerido. Se corrieron cuatro reacciones de digestión separadas (Pst I, BamH I, Mfe I y Hind III) utilizando 750 ng para 1 pg de ADN. La reacción se dejó correr de 1 a 2 horas, y se analizó mediante electroforesis de gel de agarosa (0.8% p/v) y los fragmentos de ADN se visualizaron mediante manchado de bromuro de etidio. El aislado A. tumefaciens GV3101 que alberga el plásmido auxiliar Ti pMP90 y pDAB9292, es llamado DAt20712.

EJEMPLO 9: Electroporación de ADN pDAB9292 en la cepa Agrobacterium LBA4404 Las células de la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Ooms ef al., (1982) Plasmid 7: 15-29) se hicieron electrocompetentes a través de un protocolo estándar (ver Ejemplo 3). Se descongelaron sobre hielo 50 µ? de las células LBA4404 competentes y se transformaron utilizando 300 a 400 ng del ADN de plásmido pDAB9292. El ADN y la mezcla celular se electroporaron utilizando cubetas de electroporación enfriadas previamente (0.2 cm) y un electroporador BIO-RAD GENE PULSER con las siguientes condiciones: Voltaje: 2.5 kV, Longitud de pulsación: 5 msec, Salida de capacitancia: 25 pFarad, Resistencia: 200 ohms. Después de la electroporación, se agregaron 1 mL de caldo YEP a la cubeta, y la suspensión de célula-YEP se transfirió a un tubo de cultivo de 15 mL. Las células se incubaron a una temperatura de 28°C con agitación suave durante 4 horas, después de lo cual el cultivo se colocó en YEP + agar que contiene Kanamicina en 50 pg/mL y Estreptomicina en 250 pg/mL. Las placas se incubaron durante 2 a 4 días en 28°C y las colonias se seleccionaron y rayaron sobre placas de YEP + agar frescas con antibióticos tal como se indicó anteriormente, y se incubaron en 28°C durante 1 a 3 días. Estas colonias se verificaron como Agrobacterium utilizando la prueba de cetolactosa, y se purificaron en forma adicional utilizando dos pasajes de aislamiento de colonia simple.

Se seleccionaron diversas colonias positas para | cetolactosa para iniciar 3 mL de cultivos de semilla YEP (con antibióticos que se crecieron durante la noche en 28°C con agitación. Se utilizaron 300 pL-de cada cultivo de semilla para inocular 200 mL de un cultivo de la noche YEP (con antibióticos) crecido en 28°C con agitación en 200 rpm. Se | preparó el ADN de plásmido a partir de 165 mL de cada 200 mL de cultivo de la noche utilizando un equipo de PURIFICACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO MAXI XTRA M AC H E R E Y- N AG E L NUCLEOBOND®. Se siguió el protocolo del fabricante, excepto que se utilizaron 30 mL de cada amortiguador RES, LYS y NEU. ¡ El ADN eluido se almacenó en 4°C.

Se verificó la presencia del plásmido pDAB9292 intacto mediante análisis de digestión de restricción. El ADN de plásmido del vector pDAB9292 utilizado originalmente en la transformación LBA4404, se incluyó como un estándar digerido. I Se corrieron tres reacciones de digestión separadas (Pst /, BamH I y Hind III) utilizando 750 ng para 1 pg de ADN. La reacción se dejó correr de 1 a 2 horas y se analizó mediante electroforesis de gel de agarosa (0.8% p/v) y los fragmentos de ADN se visualizaron mediante manchado de bromuro de etidio. El aislado A. tumefaciens LBA4404 que alberga pDAB9292 es llamado DAt20711. Esta cepa proporciona las bases para un sistema "ternario" proeficiente mediante recombinación.

EJEMPLO 10: Electroporación de ADN pDAB9292 en la cepa Agrobacterium DAt20538 Se prepararon células DAt20538 electrocompetentes utilizando un protocolo estándar (ver Ejemplo 3). Se descongelaron sobre hielo 50 pL de las células DAt20538 competentes y se transformaron utilizando 300 a 400 ng del ADN pDAB9292 de plásmido. El ADN y la mezcla celular se electroporaron utilizando cubetas de electroporación enfriadas previamente (0.2 cm) y un electroporador BIO-RAD GENE PULSER con las siguientes condiciones: Voltaje: 2.5 kV, Longitud de pulsación: 5 msec, Salida de capacitancia: 25 pFarad, Resistencia: 200 ohms. Después de la electroporación, se agregaron 1 mL de caldo YEP a la cubeta, y la suspensión de célula-YEP se transfirió a un tubo de cultivo de 15 mL. Las células se incubaron en 28°C con agitación suave durante 4 horas después de lo cual el cultivo se revistió en YEP + agar que contiene Kanamicina en 50 pg/mL y Gentamicina en 100 pg/mL. Las placas se incubaron durante 2 a 4 días en 28°C y las colonias se seleccionaron y rayaron en placas de YEP + agar frescas con antibióticos tal como se indicó anteriormente y se incubaron en 28°C durante 1 a 3 días. Estas colonias se verificaron como Agrobacterium utilizando la prueba de cetolactosa, y las colonias positivas para cetolactosa se aislaron adicionalmente utilizando dos pasajes del aislamiento de colonia simple.

Se seleccionaron colonias para iniciar con 3 mL de cultivos de semilla YEP (con antibióticos) que se crecieron durante la noche en 28°C en agitación. Se utilizaron 300 µ?_ de cada cultivo de semilla para inocular 200 mL de un cultivo de la noche YEP (con antibióticos) crecido en 28°C en agitación en 200 rpm. Se preparó el ADN de plásmido a partir de 165 mL de cada 200 mL de cultivo de la noche utilizando un equipo de PURIFICACIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO MAXI XTRA MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND®. Se siguió el protocolo del fabricante, excepto que se utilizaron 30 mL de cada amortiguador RES, LYS y NEU. El ADN eluido se almacenó a una temperatura de 4°C.

Se utilizó análisis de digestión de restricción para verificar la presencia del plásmido pDAB9292 intacto. El ADN de plásmido del vector pDAB9292 utilizado originalmente en la transformación DAt20538, se incluyó como un estándar digerido. Se corrieron cuatro reacciones de digestión separadas, tales como Pst I, BamH I, Mfe I y Hind III utilizando 750 ng para 1 g de ADN. La reacción se dejó correr de 1 a 2 horas y se analizó mediante electroforesis de gel de agarosa (0.8% p/v) y se visualizaron los fragmentos de ADN mediante manchado con bromuro de etidio. El aislado A. tumefaciens DAt20538 que alberga pDAB9292 se llamó DAt20538(pDAB9292).

EJEMPLO 11 : Construcción de vectores de transformación de planta que tienen múltiples elementos de secuencia repetidos e introducción en cepas Agrobacterium.

En la presente invención se ilustra la utilidad de una cepa Agrobacterium tumefaciens diseñada que tiene deficiencia en función RecA en combinación con los genes vir auxiliares proporcionados por el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8. Se construyó un vector de transformación de planta binario pDAB101513 (figura 4A), en la cepa de clonación E. coli a través de una combinación STBL2™ a través de una combinación de métodos de clonación estándar (tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de Sambrook et al., (1989, supra) y Ausubel et al., (1995, supra)) y tecnología GATEWAY™ (INVITROGEN). El vector binario pDAB101513 está basado en el origen de réplica tipo IncP del plásmido RK2, y el esqueleto del vector alberga un gen bacteriano que confiere resistencia a Espectinomicina (SpcR en figura 4) en 100 \jg/mL. Las repeticiones del límite de T-ADN se derivan de la región TL de pT¡15955. Dentro del límite derecho (límite B de T-ADN en la figura 4) y los límites izquierdos triples (límite A T-ADN en la figura 4) de la región de T-ADN de plásmido pDAB101513 se colocaron 4 secuencias de codificación de proteína (CDS) optimizadas por codón-planta, que se pueden expresar en plantas, cuya transcripción es operada por un promotor de ubiquitina 1 de maíz de 1,991 pb con intronl asociado (Patente Norteamericana No. 5,510,474). Tres de las regiones de codificación que codifican proteínas Bt Cry1 separadas (CryICa, SEC ID NO:7; CryIFa, SEC ID NO:9; y CryIAb, SEC ID NO: 11), cada una comprenden aproximadamente 3,500 pb. Estas regiones de codificación se optimizaron mediante codón para expresión en plantas de maíz utilizando una tabla de inclinación de codón de maíz (Zea mays) calculada a partir del análisis de 706 regiones de codificación de proteína de maíz obtenidas de depósitos de GENBANK. La guía adicional con respecto al diseño y producción de genes sintéticos puede encontrarse por ejemplo en las Publicación Internacional WO 97/13402A1, la Patente Norteamericana No. 6,166,302, y la Patente Norteamericana No. 5,380,831. Las tres regiones de codificación de proteína B.t están relacionadas con otra en la siguiente forma: La región de codificación para cryICa (SEC ID NO: 6) y la región de codificación para cryIFa (SEC ID NO:8) comparten el 67% de homología de secuencia; las regiones de codificación para cryICa (SEC ID NO:6) y cryIAb (SEC ID NO: 10) comparten el 69.5% de homología de secuencia y las regiones de codificación para cryIFa (SEC ID NO: 8) y cryIAb (SEC ID NO: 10) comparten el 67% de homología de secuencia. Además, los 1,600 pb C-terminal de CDS para cryICa, cryIFa y cryIAb comparten el 73% de homología de secuencia. Cada una de estas regiones de estas tres regiones de codificación se termina a través de una región no traducida Per5 3' de 365 pb de maíz (3'UTR) (Patente Norteamericana No. 6,384,207). El cuarto gen comprende una región de codificación aad1 optimizada por codón-planta (SEC ID NO: 12) que codifica la proteína marcadora seleccionable AAD1 (SEC ID NO: 13) (Patente Norteamericana No. 7,838,733). La región de codificación aad1, no está relacionada con el CDS para cryICa, cryIFa, o cryIAb. La región de codificación para aad1 se diseñó utilizando una tabla de inclinación de codón-planta. Se calculó una tabla de inclinación de codón de maíz a partir de 706 secuencias de codificación de proteína de maíz obtenidas de secuencias depositadas en GENBANK. Las tablas de uso de codón para tabaco (Nicotiana tabacum, 1268 CDS), cañóla {Brassica napus, 530 CDS), algodón (Gossypium hirsutum , 197 CDS), y frijol de soya (Glycine max; ca. 1000 CDS) fueron descargadas de los datos del sitio web http://www.kazusa.or.jp/codon/. Un conjunto de codón inclinado que comprende codones utilizados frecuentemente comunes para grupos de datos tanto de maíz como de dicot, en cantidades relativas promedio reescalables adecuadas, se calculó después de omitir cualquier codón redundante utilizando menos de aproximadamente 10% de los usos de codón totales para el aminoácido en cualquier tipo de planta. El gen aad1 se termina a través de un 3'UTR de Lipasa de maíz (Patente Norteamericana No. 7,179,902). Por lo tanto, dentro de la región de T-ADN de 22,729 pb de pDAB101513, las cuatro copias de promotor ubi de maíz comprenden un total de 7,964 bases organizadas en cuatro repeticiones directas de casi 2 kbp (pares de kilobase) cada una, con cada repetición estando relacionada al 100% con la otra. Las tres copias del 3'UTR Per5 comprenden un total de 1,095 bases organizadas en tres unidades de repetición directas, cada una estando relacionada al 100% con la otra, y las tres regiones de codificación cryICa, cryIFa y cryIAb estando organizadas como repeticiones directas que tienen entre el 67% y 73% de homología con la otra. En total, la región-T de pDAB101513 comprende aproximadamente 86% de secuencias altamente repetidas, y puede ser ilustrada convenientemente como se indica a continuación: promotor RB>Ubi1: cryICa CDS:Per5 3'UTR>promotor U bi 1 : cryIFa CDS:Per5 promotor 3'UTR>Ubi1: cryIAb CDS:Per5 3'UTR>promotor U bi 1 : aad1 CDS: Lip 3'UTR>LB La naturaleza altamente repetida de esta construcción, requirió que los pasos de clonación sean completados en la cepa de clonación E. coli STBL2™, la cual está diseñada especialmente para mantener la integridad de clones que contienen las secuencias de ADN altamente repetidas.

El plásmido pDAB101513 fue introducido mediante electroporación en células electrocompetentes de la cepa A. tumefaciens EHA105 (hechas resistentes a Estreptomicina en virtud de una mutación cromosomal espontánea), y los aislados resistentes a Espectinomicina/Estreptomicina fueron verificados mediante análisis de digestión de restricción para contactar el plásmido intacto pDAB101513 antes de la preparación de las reservas de glicerol congelado y almacenamiento en -80°. Esta cepa es nombrada EHA105(pDAB101513). Se descubrió que numerosos cultivos individuales establecidos de células obtenidas de reservas de glicerol congelado de EHA105(pDAB101513) contienen versiones reorganizadas o eliminadas de plásmido pDAB101513. Para transformaciones de maíz, se recolectaron células engrosadas de la cepa EHA105(pDAB 101513) de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelado y se utilizaron directamente tal como se describe en el Ejemplo 13.

El plásmido pDAB101513 fue introducido con éxito mediante electroporación en células electrocompetentes de la cepa A. tumefaciens DA2552 (esencialmente una versión con deficiencia de RecA de la cepa EHA105) para producir la cepa DA2552(pDAB101513). Los transformantes seleccionados por medios de resistencia a Eritromicina y Espectinomicina, fueron validados mediante digestión de enzima de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Se descubrió que numerosos cultivos individuales establecidos a partir de células obtenidas de reservas de glicerol congelado, contienen el plásmido pDAB101513 intacto. Las células engrosadas de la cepa DA2552(pDAB101513) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada a partir de una reserva de glicerol congelado y utilizadas para transformaciones de maíz (Ejemplo 13).

El plásmido pDAB101513 fue introducido con éxito mediante electroporación en células electrocompetentes de la cepa A. tumefaciens DAt13192 (cepa DA2552 que alberga el plásmido pDAB9292) para producir la cepa DAt13192(pDAB101513). Los transformantes seleccionados por medio de resistencia a Eritromicina, Kanamicina y Espectinomicina fueron validados mediante digestión de enzima de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Se descubrió que numerosos cultivos individuales establecidos de células obtenidas de reservas congeladas, contienen el plásmido pDAB101513 intacto. Las células engrosadas de la cepa DAt13192(pDAB101513) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada a partir de una reserva de glicerol congelado y se utilizaron para transformaciones de maíz (ver Ejemplo 13).

En una forma similar, se construyó un derivado de pSB11 (el vector de traslado del sistema superbinario), teniendo una región de T-ADN análoga a la de pDAB101513. Los múltiples intentos para construir un plásmido superbinario a través de métodos estándar en LBA4404(pSB1 ), no tuvieron éxito. Todos los intentos dieron como resultado el aislamiento de plásmidos cointegrantes basados en PSB1 altamente reorganizados y eliminados.

EJEMPLO 12: Construcción del vector de transformación | de planta pDAB101514 que tiene múltiples elementos de secuencia repetidos e introducción en cepas Agrobacterium .

La utilidad de una cepa A. tumefaciens diseñada que tiene deficiencia en función RecA en combinación con los genes vir auxiliares proporcionados mediante el fragmento VirBCDG Kpnl | de 14.8, se ilustra en forma adicional en la presente invención. Un vector de transformación de planta binario, pDAB101514 (figura 4B), se construyó en la cepa de clonación E. coli STBL2™ a través de una combinación de métodos de clonación estándar y tecnología GATEWAY™. La estructura del vector | binario pDAB101514, es casi igual a la de pDAB101513 (Ejemplo anterior) con la excepción de los elementos de expresión utilizados para conducir la expresión del gen cryICa. La transcripción del cryICa CDS en pDAB101514, es llevada por un promotor de virus baciliforme de azúcar de caña de 1429 I pb (SCBV; Tzafrir et al., (1998) Plant Molec. Biol. 38:347-356).

El 5'UTR está comprendido esencialmente del intrón 6 del gen de deshidrogenasa de alcohol de maíz (Acceso GENBANK X04049), flanqueado por 20 bases del exón 6 y 11 bases del exón 7. La transcripción de este gen es terminada por un 3'UTR pinll (An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). Los elementos de expresión utilizados para controlar la expresión de los genes cryIFa, cryIAb y aadl , son los mismos a los empleados en pDAB101513. Por lo tanto, dentro de la región de T-ADN de 22,586 pb de pDAB101514, las tres copias de promotor u b i 1 de maíz comprenden un total de 5,973 bases organizadas en 3 repeticiones directas de casi 2 kbp cada una, con cada repetición estando relacionada al 100% con la otra. Las dos copias del 3'UTR Per5 comprenden un total de 730 bases organizadas en dos unidades de repetición directas, cada una estando relacionada al 100% con la otra, y las tres regiones de codificación, cryICa, cryIFa y cryIAb, están organizadas como repeticiones directas que tienen entre 67% y 73% de homología de secuencia de ADN con la otra. En total, la región-T de pDAB101514 comprende aproximadamente el 76% de secuencias de ADN altamente repetidas, y la organización física puede ser ilustrada en forma conveniente como se indica a continuación: promotor RB>SCBV: cryICa CDS:pinll 3'UTR> promotor U bi 1 : cryIFa CDS:Per5 promotor 3'UTR>Ubi1: cryIAb CDS:Per5 3'UTR>promotor Ubi 1 : aad1 CDS:Lip 3'UTR>LB La naturaleza altamente repetida de esta construcción requirió que los pasos de clonación sean completados en la cepa de clonación E. coli STBL2™, la cual está diseñada especialmente para mantener la integridad de clones que contienen dichas secuencias de ADN altamente repetidas.

El plásmido pDAB101514 fue introducido mediante electroporación en células electrocompetentes de la cepa A. tumefaciens EHA105 (convertida a resistente a Estreptomicina en virtud de una mutación cromosomal espontánea), y los aislados resistentes a Espectinomicina/Estreptomicina fueron verificados mediante análisis de digestión de restricción para contener el plásmido intacto pDAB101514 antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Esta cepa fue nombrada EHA105(pDAB 101514). Se descubrió que numerosos cultivos individuales establecidos de células EHA105(pDAB101514) obtenidas de reservas de glicerol congelado, contienen versiones reorganizadas o eliminadas del plásmido pDAB101514. Para transformaciones de maíz, las células engrosadas de la cepa EHA105(pDAB101514) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelado y utilizado a través de los métodos descritos en el Ejemplo 13.

El plásmido pDAB101514 fue introducido con éxito mediante electroporación en células electrocompetentes de la cepa A. tumefaciens DA2552 (esencialmente una versión con deficiencia de RecA de la cepa EHA105) para producir la cepa DA2552(pDAB101514). Los transformantes seleccionados por medio de resistencia a Eritromicina y Espectinomicina, fueron validados mediante digestión de enzimas de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Se descubrió que numerosos cultivos individuales establecidos de células (obtenidas de reservas de glicerol congelado, contienen el plásmido pDAB101514 intacto. Las células engrosadas de la cepa DA2552(pDAB101514), fueron recolectadas de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelada y utilizadas para transformaciones de maíz a través de los ¡ métodos descritos en el Ejemplo 13.

El plásmido pDAB101514 fue introducido con éxito mediante electroporación en células de la cepa A. tumefaciens DAt13192 (cepa DA2552 que alberga el plásmido pDAB9292) para producir la cepa DAt13192(pDAB 101514). Los | transformantes seleccionados por medio de resistencia a Eritromicina, Kanamicina y Espectinomicina fueron validados mediante digestión de enzimas de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenadas en -80°C. Se descubrió que I numerosos cultivos individuales establecidos de células DAt13192(pDAB101514) obtenidas de reservas congeladas, contienen el plásmido pDAB101514 intacto. Las células engrosadas de la cepa DAt13192(pDAB 101514) fueron recolectadas en una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelado y utilizadas para transformaciones de maíz a través de los métodos descritos en el Ejemplo 13.

En una forma similar, se construyó un derivado de pSB11 (el vector de traslado del sistema superbinario) que tiene una región de T-ADN análoga a la de pDAB101514. Los múltiples | intentos para construir un plásmido superbinario a través de métodos estándar en LBA4404(pSB1 ), no tuvieron éxito. Todos los intentos dieron como resultado el aislamiento de plásmidos cointegrantes basados en pSB1 altamente reorganizados y eliminados.

| EJEMPLO 13: Transformación de maíz mediante cepas de Agrobacterium que albergan los vectores binarios pDAB101513 y pDAB101514 Transformación de Maíz Transmitida por Agrobacterium Se plantaron semillas de un cruce Hi-ll F1 (Armstrong et al., (1991) | Maize Genet. Coop. Newslett. 65:92-93) en macetas de 5 galones (18.9 litros) que contienen una mezcla de 95% de medio de crecimiento sin tierra M ETRO-M IX 360 al 95% (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA) y tierra de arcilla/limo al 5%. Las plantas se crecieron en un invernadero utilizando una I combinación de lámparas de haluro de metal y sodio de alta presión con un fotoperíodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad. Se llevaron a cabo polinaciones-sib controladas para obtener embriones F2 inmaduros para transformación. Se recolectaron las orejas de maíz en aproximadamente 8 a 10 días después de la polinización, cuando los embriones inmaduros tuvieron un tamaño de entre 1.0 mm y 2.0 mm.

Infección y cocultivo. Se descascararon las orejas de maíz y la superficie se esterilizó frotando con jabón líquido, sumergiendo en 20% de blanqueador comercial (que contiene | 5% de hipoclorito) durante aproximadamente 20 minutos, posteriormente enjuagando tres veces con agua estéril. Se preparó una suspensión de células A. tumefaciens que albergan pDAB101513 o pDAB101514, vectores binarios que tienen tres genes que codifican las proteínas Bt CryICa, CryI Fa y CryIAb | y que contienen el gen marcador seleccionable de planta aad-1, transfiriendo 1 o 2 lazos de bacterias (crecidos durante 2 a 3 días en 28° en un medio de agar YEP que contiene antibióticos adecuados) en 5 mL de medio de infección líquido (Medio Basal LS (Linsmaier y Skoog, (1965) Physiologia Plantarum 18: 100-| 127), vitaminas N6 (Chu et al., (1975) Scientia Sínica 18:659- 668), 1.5 mg/L de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), 68.5 gm/L de sacarosa, 36.0 gm/L de glucosa, 6 mM de L-prolina, pH 5.2] que contiene 200 µ? de acetosiringona . La solución fue vortizada hasta que se logró una suspensión uniforme, y la I concentración fue ajusta a una densidad óptica final de aproximadamente 0.4 en 550 nm.

Se aislaron embriones inmaduros directamente en un tubo de microcentrifugación que contiene 2 ml_ del medio de infección. El medio se eliminó y reemplazó con 1 ml_ de la solución de Agrobacterium y la solución de Agrobacteriumlembr\ón fue incubada durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente los embriones fueron transferidos a un medio de cocultivo (Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L 2,4-D, 30.0 gm L de sacarosa, 6 mM de L-prolina, j 0.85 mg/L de AgN03, 2.8 gm/L de GELLAN GUM™ (PHYTO TE CHNOLOGY LABORATORIES; Lenexa, KS), pH 5.8) que contiene 200 µ? de acetosiringona y se cocultivaron durante 3 a 4 días en 20°C en la oscuridad.

Después del cocultivo, los embriones fueron transferidos a | un medio de reposo que contiene sales y vitaminas MS (Frame et al., 2011, Transformación Genética Utilizando Embriones Zigóticos Inmaduros de Maíz. En: Métodos y Protocolos de Cultivo de Embriones de Plantas: Métodos en Biología Molecular. T. A. Thorpe y E. C. Yeung, (Eds), SPRINGER | SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC. páginas 327 a 341), 6 mM de L-prolina, 100 mg/L de mio-inositol, 500 mg/L de monohidrato de ácido (2-(N-morfolino) etanosulfónico MES; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.), 30 gm/L de sacarosa, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.85 de AgN03, 250 mg/L de Cefotaxima, 2.8 gm/L de I GELLAN GUM™, pH 5.8. Aproximadamente 7 días después, los embriones fueron transferidos al mismo medio suplementado con 100 nM de Haloxifop. Los aislados transformados fueron identificados después de aproximadamente 8 semanas y se engrosaran transfiriendo a un medio de selección fresco en intervalos de 2 semanas para regeneración y análisis.

Regeneración v producción de semilla. Para la regeneración, los cultivos fueron transferidos a un medio de inducción "28" (sales y vitaminas MS, 30 gm/L de sacarosa, 5 mg/L de Bencilaminopurina, 0.25 mg/L de 2,4-D, 250 mg/L de Cefotaxima, 2.5 gm/L de GELLAN GUM™, pH 5.7) complementado con 100 nM de Haloxifop. La incubación fue durante 1 semana bajo condiciones de luz baja (14 pEm"2s"1), posteriormente 1 semana bajo condiciones de luz alta (aproximadamente 89 pEm"2s"1). Los tejidos fueron transferidos subsecuentemente a un medio de regeneración (igual que el medio de inducción excepto que carece de reguladores de crecimiento de plantas). Cuando las plántulas tuvieron de 3 cm a 5 cm de longitud, se transfirieron a tubos de cultivo de vidrio que contienen medio SHGA [(sales y vitaminas de Schenk y Hildebrandt, PHYTOTECHNOLOGIES LABR.), 1.0 gm/L de mio-inositol, 10 gm/L de sacarosa y 2.0 gm/L de GELLAN GUM™, pH 5.8] para permitir el crecimiento y desarrollo adicional de los brotes y raíces. Las plantas fueron trasplantadas a la misma mezcla de tierra tal como se describió anteriormente y fueron crecidas para florecer en el invernadero. Las muestras de los tejidos de planta fueron recolectadas y utilizas en bioensayos de insectos a través de los métodos descritos en el Ejemplo 14 y para análisis moleculares y bioquímicos. Se llevaron a cabo polinizaciones controladas para producción de semillas. Los expertos en la técnica de la transformación de maíz, comprenderán que están disponibles otros métodos para la transformación de maíz y para la selección de plantas transformadas cuando se utilizaron otros genes marcadores selecciona bles que se pueden expresar en plantas (por ejemplo genes de tolerancia a herbicida).

EJEMPLO 14: Bioensayos in vitro de muestras de hoja contra pestes de insectos de maíz La especie lepidopteran ensayada fueron la oruga nocturna de maíz (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)), barrenador de maíz Europeo, (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)), y cogollero de maíz (FAW; Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)). Los huevos de estos insectos fueron obtenidos en BENZON RESEARCH (Carlisle, PA).

Primer Bioensayo Tramo: Bioensayo de 96 depósitos de alto rendimiento se llenaron parcialmente charolas de 96 depósitos (TPP-US; St. Louis, MO) con una solución de agar al 2% (SIGMA- ALDRICH) y se dejó solidificar el agar. Utilizando una perforadora de papel manual estándar, se muestrearon discos de hoja de 1/8 pulgadas (0.31 cm) de diámetro para cada una de las dos especies de insectos (CEW y FAW) probadas en este formato. Se colocó un disco de hoja en un depósito simple de la placa de 96 depósitos; hubieron tres placas para cada insecto probado (uno para cada réplica/disco de hoja). Se utilizó un dispositivo de sembrado de huevos para administrar huevos de insectos en cada depósito de la placa de 96 depósitos. Posteriormente las placas fueron selladas con tapas adhesivas perforadas y también se cubrieron con la tapa de plástico que acompaña a las placas. Las placas se mantuvieron a una temperatura de 30°C, en una Humedad Relativa (RH) del 40%, 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad durante 3 días. Se llevó a cabo el graduado utilizando una regla de 0-1-2, en donde el 0 indicó el <25% de daño del disco de la hoja, 1 indicó el 25-50% de daño del disco de la hoja, y 2 indicó el >50% de daño del disco de la hoja dentro de cada depósito. Las calificaciones de daño para cada prueba fueron promediadas y utilizadas a lo largo del análisis de expresión de proteína para llevar a cabo los análisis de correlación. Las plantas cuya calificación de daño de insecto promedio fue de 0.67 o menos, se consideraron activas contra la peste probada.

Bioensayo de Segundo Formato: Bioensayo de 32 depósitos se llenaron parcialmente charolas de 32 depósitos (C-D INTERNATIONAL; Pitman, NJ) con una solución de agar al 2%, y se dejó solidificar el agar. Se tomaron secciones de hoja de aproximadamente 1 pulgada cuadrada (2.54 cm)2 de cada planta y se colocaron en forma simple en depósitos de las charolas de 32 depósitos. Se colocó una pieza de hoja en cada depósito, y se probaron dos piezas de hoja por planta y por insecto. Los insectos (ECB y FAW) fueron infestados en masa utilizando una brocha de pintar, colocando 10 a 20 larvas de neonato en cada depósito. Las charolas fueron selladas con tapas adhesivas perforadas, que permitieron la ventilación durante la prueba. Se colocaron las charolas en 28°C, 40% RH, 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad durante 3 días. Después de la duración de la prueba, se tomó una calificación de porcentaje de daño simple para cada pieza de hoja. Las calificaciones de daño para cada prueba, se promediaron y utilizaron a lo largo del análisis de expresión de proteína para llevar a cabo análisis de correlación. Las plantas cuyos índices de daño de insecto promedio fueron del 25% o menos, se consideraron activas contra la peste probada.

Análisis estadístico Todos los análisis se llevaron a cabo en JMP 8.0.2 (SAS I NSTITUTE Inc., Cary, Carolina del Norte). Se utilizó un análisis ANOVA de una vía para determinar las diferencias significativas entre los tratamientos y las plantas de control negativo para los datos de daño de insecto. También se utilizó la comparación de promedios HSD Tukey-Kramer para evaluar en forma adicional las diferencias significativas entre los tratamientos. Además, se utilizó análisis de regresión lineal (ajuste de límites cuadrados) para correlacionar la expresión de proteína cuantitativa con las medidas de actividad de insectos.

Los resultados del bioensayo se resumen en la tabla 2. EJEMPLO 15: Caracterización bioquímica y molecular de tejidos de maíz transformados con pDAB 101513 Se llevaron a cabo múltiples experimentos de transformación con las cepas A. tumefaciens EHA105(pDAB101513), DA2552(pDAB 101513) y DAt13192(pDAB101513). Los números de copias de los cuatro transgenes en plantas T0 transgénicas, se estimaron mediante ensayos de sonda de hidrólisis (Bubner y Baldwin, (2004) Plant | Cell Rep. 23:263-271) utilizando oligonucleótidos específicos del gen. Los extractos de proteína de plantas con 1 a 3 copias ("Copia de Bajo nivel") de los genes, se revisaron en forma adicional para la producción de las proteínas Bt CryICa, CryIFa y CryIAb, y para la proteína AAD1, a través de métodos ELISA | que utilizan equipos de anticuerpo producidos en forma comercial (ENVIROLOGIX™ , Portland, MA). Algunas plantas se descubrió que producen las cuatro proteínas (tabla 3). Además, se bioensayaron piezas de hoja de las plantas para actividad contra tres pestes de insectos de maíz: para la oruga nocturna | de maíz (CEW, Helicoverpa zea), cogollero de maíz (FAW; Spodoptera frugiperda y barrenador de maíz Europeo (ECB, Ostrinia nubilalis) en ensayos de alimentación (EJEMPLO 14). Se descubrieron algunas plantas que tienen los cuatro transgenes en un bajo número de copias, producidos en las I cuatro proteínas, y tuvieron una actividad de insecto contra las tres pestes (tabla 4). Se obtuvieron plantas no transformadas que cumplen con estos criterios de los experimentos utilizando las cepas EHA105(pDAB101513) o DA2552(pDAB101513) (tabla 4). Por lo tanto, una característica de la cepa DAt13192, que comprende una eliminación del gen recA cromosomal, que comprende en forma adicional un conjunto total de genes vir derivados de pTiBo542 albergados en pTiEHA105, e incluso que comprenden en forma adicional un conjunto parcial de genes vir derivados de pT¡Bo542 albergados en el fragmento VirBCDG | Kpnl 14.8 de pDAB9292, y que tiene la capacidad de producir en forma eficiente plantas de maíz transformadas con regiones de T-ADN grandes comprendidas de elementos de secuencia altamente repetidos.

EJEMPLO 16: Caracterización bioquímica y molecular de | tejidos de maíz transformados con pDAB 101514 Se llevaron a cabo múltiples experimentos de transformación con las cepas A. tumefaciens EHA105(pDAB101514), DA2552 (p D AB 101514) , y DAt13192(pDAB101514). Se estimaron los números de copias | de los cuatro transgenes en plantas T0 transgénicas mediante ensayos de sonda de hidrólisis (Bubner y Baldwin, supra) utilizando oligonucleótidos específicos de gen. Los extractos de proteína de plantas con 1 a 3 copias ("Copia de Bajo nivel") de los genes, fueron revisados en forma adicional para la I producción de las proteínas Bt CryICa, CryIFa y CryIAb y para la proteína AAD1 mediante métodos ELISA utilizando equipos de anticuerpo producidos comercialmente (ENVIROLOGIX™, Portland, MA). Además, las piezas de hoja de las plantas fueron bioensayadas para actividad contra tres pestes de insectos de maíz en ensayos de alimentación (Ejemplo 14). Se descubrieron algunas plantas que tuvieron los cuatro transgenes en un bajo número de copias, produjeron las cuatro proteínas, y tuvieron actividad de insectos contra las tres pestes (tabla 5). Se obtuvieron plantas no transformadas que cumplen con estos criterios de experimentos utilizando las cepas EHA105(pDAB101514) o DA2552(pDAB 101514) . Por lo tanto, una característica de la cepa DAt13192, que comprende una eliminación del gen recA cromosomal, que comprende en forma adicional un conjunto completo de genes vir derivados de pTiBo542 albergados en pTiEHA105, e incluso comprendiendo además un conjunto parcial de genes vir derivados de pTiBo542 albergados en el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pDAB9292, es que tiene la capacidad de producir de manera eficiente plantas de maíz transformadas con regiones T-ADN grandes comprendidas de elementos de secuencia altamente repetidos.

EJEMPLO 17: Identificación y caracterización de un sitio de integración neutral en el cromosoma Agrobacterium tumefaciens LBA4404.

El locus picA/pgl inducible por la planta del cromosoma de la cepa A. tumefaciens C58 (Acceso GENBANK AE0009243) fue identificado como un gen no esencial en el cual se pueden integrar fragmentos de ADN (Rong y asociados, (1990) J. Bacteriol. 172: 5828 a 5836; Rong y asociados, (1991) J. Bacteriol. 173: 5110 a 5120). No se ha reportado un sitio de integración neutral similar en el genoma de la cepa A. tumefaciens LBA4404. Aquí describimos la identificación y secuenciación de una región genómica de LBA4404 que incluye secuencias parcialmente homologas para el locus picA/pgl C58. Las células de LBA4404 (INVITROGEN) fueron crecidas en un medio YM (gm/L: extracto de levadura, 0.4; manitol, 10; NaCI, 0.1; MgS04 7H20, 0.2; K2HP04 3H20, 0.5) a una temperatura de 30° durante la noche. El ADN genómico se preparó a partir de 1 mL de cultivo utilizando el equipo de ADN EASY (INVITROGEN) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se diseñaron cebadores de degeneración, con base en dos regiones de homología entre la secuencia de proteína PicA C58 y los homólogos identificados de Arabidopsis thaliana, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Alkaliphilus metalliredigenes , y Clostridium acetobutylicum . Se utilizó el ADN genómico LBA4404 como una plantilla para la reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando la MASTER MIX HERCULASE™ (STRATAGENE; San Diego, CA) y los cebadores de degeneración Atn/7A1Fa (5'-GACAGTCCNAATACSGAYGG-3'; SEQ ID No: 14; que corresponde a los aminoácidos 273 a 279 de la proteína PicA C58) y Atn/' 3R (5'- GTYTTSAG CGSAGSCCSCGRTCSGT-3'; SEQ ID No: 15, que corresponde a la hebra de complementariedad que codifica para los aminoácidos 364 a 369 de la proteína PicA C58). Las condiciones de termociclado utilizadas fueron: 1 ciclo de 94°C, 2 minutos; 25 ciclos de [94°C, 30 seg; 55°C, 30 seg; 72°C, 60 seg]; 1 ciclo de 72°C, 7 min. Las designaciones del nucleótido de degeneración en las secuencias de cebador que corresponden a nucleótidos de ADN tal como se indican a continuación: N = A, C, G, o T; Y = T o C; R = A o G; y S = C o G. Se aisló un producto de 285 pares base (pb), clonado en el vector pCR2.1-TOPO (I NVITROGEN) en células TOP 10 Escherichia coli (INVITROGEN), y se determinó la secuencia de ADN. Se encontró que la secuencia es homóloga, pero no idéntica, a una región del gen picA C58 (85% de identidad de secuencia), y la región genómica LBA4404 que representa, es referida en la presente invención como el fragmento nilA.

Los cebadores adicionales complementarios para el fragmento nilA LBA4404 de 285 pb fueron designados para ser utilizados como anclas para la amplificación PCR de los fragmentos genómicos que flanquean ambos extremos de la secuencia de 285 pb. Éstos fueron emparejados en las reacciones PCR con cebadores diseñados de secuencias de las regiones de flanqueo del gen picA C58. Las secuencias de los fragmentos amplificados que se originan desde dentro de la secuencia de 285 pb y que se extienden dentro de ambas regiones de flanqueo del fragmento nilA, fueron determinadas y utilizadas para diseñar otros cebadores para reacciones PCR subsecuentes. Utilizando la plantilla de ADN genómico LBA4404 con los cebadores n¡IA2F (5'-CCATCCTCATAACACCAGCT-3'; SEQ ID No: 16) y nilA2R (5'-GCAGATCATCGATACGACCA-3'; SEQ ID No: 17), se generó un fragmento PCR de aproximadamente 2 kilobase (kpb) y se clonó en pCR®-BLUNT ll/XL-TOPO® utilizando el equipo de clonación TOPO TA (I NVITROGEN) para producir el plásmido pDOW3719 (figura 2). El análisis de secuencia del fragmento de inserto de pDOW3719 produjo una secuencia de 1,796 pb (SEQ ID No: 18) que comprende un cuadro de lectura abierta más largo (ORF) que codifica una proteína putativa de 531 aminoácidos. Un ORF más corto en el mismo cuadro de lectura codifica una proteína putativa de 523 aminoácidos. La proteína putativa de 523 aminoácidos LBA4404, muestra el 88% de similitud, el 85% de identidad con la proteína PicA C58. Las secuencias para la proteína putativa de 523 aminoácidos LBA4404 y la proteína PicA C58 tienen el 81% de identidad. Por lo tanto, el fragmento nilA de LBA4404 representa un segmento genómico que incluye un gen putativo que se diverge substancialmente del gen PicA C58. En esta descripción, la secuencia genómica de 1.8 kpb representada mediante SEQ ID No: 18 es referida como el locus nilA.

El plásmido pDOW3719, que tiene el origen de réplica colE1, no se espera que se repliqué en forma autónoma en células A. tumefaciens. El ADN del plásmido pDOW3719 fue utilizado para transformar células de la cepa A. tumefaciens LBA4404 mediante electroporación. La selección para resistencia a Kanamicina (albergada en pDOW3719) identificó transformantes que habían integrado pDOW3719 en el cromosoma de LBA4404 mediante la recombinación transmitida por regiones de homología de 1.8 kpb presentes en el cromosoma LBA4404 y en pDOW3719. Dicho evento de integración da como resultado la creación de una copia lineal de la secuencia de plásmido de vector pDOW3719 flanqueada en cada lado por una región de homología de 1.8 kpb ahora duplicada. Se aislaron transformantes LBA4404 resistentes a Kanamicina y se clasificaron para la inserción de pDOW3719 mediante análisis PCR. Las preparaciones de ADN genómico de los transformantes fueron utilizadas como plantilla en reacciones PCR con 5 conjuntos de cebadores: /') cebador M13F emparejado con cebador M13R, que flanquea el inserto pDOW3719, /') cebador M13F emparejado con el cebador AS4R (que comprende bases complementarias para los residuos 1041 a 1060 de la SEQ ID No: 18), /'/'/') cebador M13F emparejado con cebador AS10R (que comprende bases complementarias para los residuos 1,320 a 1,337 de la SEQ ID No: 18), /V) cebador M13F emparejado con cebador AS11R (que comprende bases complementarias para los residuos 1,391 a 1,406 de la SEQ ID No: 18), y v) cebador M13R emparejado con cebador AS9F (que comprende las bases 634 a 649 de la SEQ ID No: 18). En reacciones de control, todos estos conjuntos de cebador amplificaron fragmentos con tamaños esperados cuando se utilizó como plantilla el ADN de plásmido pDOW3719. Sin embargo, cuando el ADN genómico de un transformante LBA4404 resistente a Kanamicina fue utilizado como plantilla, PCR utilizando el par de cebadores M13F y M13R no produjo productos amplificados, lo que indica que el ADN de plásmido | pDOW3719 intacto (no integrado) fue purificado junto con el ADN genómico. El análisis PCR de las muestras de ADN genómico con los otros cuatro pares de cebadores, mostró la producción de fragmentos de ADN con tamaño esperado. Estos resultados indican que la resistencia a Kanamicina de los | transformantes LBA4404, es conferida por el ADN pDOW3719 el cual tiene integrado en el genoma.

Se utilizó un transformante [LBA4404n/7 \-int1 ] para probar el efecto que tiene el inserto genómico en el locus nilA, con respecto a la capacidad de que la cepa transforme Arabidopsis | thaliana. El vector binario pDAB3779, el cual contiene un gen que se puede expresar en plantas que codifica la proteina PAT (que confiere resistencia al herbicida BASTA™) se transformó en células de las cepas LBA4404n/7/A-i nt1 y LBA4404, con selección para resistencia a Espectinomicina. Estas cepas I posteriormente se utilizaron para llevar a cabo experimentos de transformación de Arabidopsis utilizando los métodos de Weigel y Glazebrook (supra). No se observó diferencia en las frecuencias de transformación obtenidas con las dos cepas. Por lo tanto, una característica de las modalidades y métodos aquí descritos, es que la inserción del fragmento de ADN anterior en el locus nilA cromosomal de la cepa A. tumefaciens LBA4404 que comprende la SEQ ID No: 18, no tiene efecto en el crecimiento o capacidad de transformación de la planta de dicha cepa diseñada .

EJEMPLO 18: Construcción de un derivado suicida de pDOW3719 para integración en el locus nilA LBA4404 La inserción de un sitio de clonación múltiple en el locus nilA clonado en pDOW3719, se logró mediante PCR de extensión de traslape de división (SOE) (Horton y asociados, (1990) BioTechniques 8: 528 a 535). Las reacciones PCR SOE se llevaron a cabo utilizando la mezcla maestra HERCULASE™ de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se amplificó una porción del locus nilA utilizando ADN pDOW3719 como plantilla con el cebador ????d' (5'- CCGGCTCTTCCAGCTCCTCATGCACGAACAACG AGAAACGAGC-3'; SEQ ID No: 19) emparejado con el cebador n/7/\_MCS_SOER (5'- G AATGGTG AAACCTCTAG ATTAATTAA GGATCCCCGGGTACCGAAAAGCCCGACATTGC-3' ; SEQ ID No: 20) para producir un fragmento de aproximadamente 800 pb. Se amplificó una segunda porción del locus nilA utilizando el ADN pDOW3719 como plantilla y el cebador n/M_MCS_SOEF (5'-GCAATGTCGGGCTTTTCGGTACCCGGGGATCCTTAATTAATCTA GAGGTTTCACCATTC-3'; SEQ ID No: 21) emparejado con el cebador nilAZ' (5'- GGAATTCTCAGTGGCTTTCATGGGTTTTCTCG-3'; SEQ ID No: 22) para producir un fragmento de aproximadamente 900 pb. Los fragmentos resultantes posteriormente fueron purificados con gel (NUCLEOSPIN™, CLONTECH; Mountain View, CA), y utilizados como plantilla para amplificación con los cebadores nilA ' y nilAZ' para producir un fragmento de 1.6 kpb, en donde la secuencia se describe como SEQ ID No: 23 (nilA MCS). El fragmento resultante se digirió con Pvu I y Sap / (NEB) y se ligó para ADN pBCSK + sacBI (INVITROGEN) digerido con las mismas enzimas de restricción, utilizando ligasa de ADN T4 (NEB). Las células TOP10 E. coli fueron transformadas con la mezcla de ligadura, y los transformantes fueron seleccionados en agar de soya LB (TEKNOVA; Hollister, CA) suplementado con 30 pg/mL de Cloranfenicol. Los clones se clasificaron mediante digestión de restricción con Pvu I y Kpn I (NEB). La región del locus nilA de los clones positivos fueron verificados con secuencia, y el plásmido resultante fue nombrado pDOW3721. Una característica de pDOW3721 es que un sitio de clonación múltiple (MCS) que contiene las secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción Sph I, Kpn I, Sma I, BamH I, Pac I, Ase I y Xba I está flanqueado en un lado por 852 pb de bases derivadas de LBA4404, y en el otro lado por 745 pb de bases derivadas de LBA4404.

Por lo tanto, se puede clonar un fragmento de ADN extraño en el MCS de pDOW3721, y por lo tanto integrarse en el locus nilA cromosomal LBA4404, en virtud de la recombinación homologa transmitida por las secuencias de flanqueo derivadas de LBA4404. Los eventos de cruce simple, por medio de los cuales toda la secuencia de plásmido pDOW3721 se integra en el cromosoma LBA4404, pueden ser resueltos en eventos de cruce doble mediante contraselección en un medio que contiene sacarosa. En el medio, la sacarosa se convierte a un producto tóxico al momento de la enzimolisis mediante la proteína SacB codificada por el gen sacB (Reíd y Collmer, (1987) Gene 57: 239 a 246; Quandt y asociados, (1993) Gene 127: 15 a 21). Por lo tanto, los transformantes con la capacidad de sobrevivir en un medio de crecimiento que contiene sacarosa, tendrán que pasar por un segundo evento de cruce que elimina el esqueleto del vector de plásmido pDOW3721 del cromosoma, dejando atrás el locus nilA interrumpido que contiene el fragmento de ADN extraño integrado. Muchos reportes han mostrado durante al menos 10 años, que la transferencia de las secuencias de esqueleto de vector es muy común. La proporción de las plantas que adquirieron las secuencias del esqueleto en los transformantes, fluctuaron normalmente entre 20% y 50%, y en algunas veces tanto como el 75% o más.

Como un ejemplo de la utilidad de pDOW3721, el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 fue preparado a partir del plásmido pSB1 y ligado al ADN pDOW3721 digerido con Kpnl, utilizando ligasa de ADN T4. Las células TOP10 £. coli fueron transformadas con la mezcla de ligadura, y los transformantes fueron seleccionados en agar de soya LB suplementado con 30 pg/mL de Cloranfenicol. Los clones fueron clasificados mediante digestión de restricción con EcoR I y Hind III. El plásmido resultante fue nombrado pDOW3722.

EJEMPLO 19: Identificación de corriente ascendente y corriente descendente de secuencias de nucleótido de nilA La cepa LBA4404n/7A-int1 de A. tumefaciens , que contiene una integración genómica del plásmido pDOW3719 (figura 2 y Ejemplo 18), se utilizó para identificar secuencias adicionales colocadas en la corriente ascendente y corriente descendente de la región genómica nilA. pDOW3719 contiene un amplicon PCR de 1,796 pb del locus nilA de la cepa A. tumefaciens clonado en PCR-BLU NT ll/XL-TOPO® (I NVITROGEN). Este plásmido fue integrado en el genoma de la cepa A. tumefaciens LBA4404 mediante recombinación homologa. Las colonias que contenían el plásmido integrado fueron identificadas mediante resistencia a Kanamicina (Ejemplo 17). El plásmido integrado, y los elementos contenidos dentro del mismo, se pueden utilizar como herramientas para el aislamiento y caracterización de secuencias de nucleótido adicionales a través de una técnica de "rescate de plásmido".

El ADN genómico (gADN) fue preparado de células de la cepa LBA4404n/7A-int1 mediante un protocolo de aislamiento de ADN genómico bacteriano (Sambrook y asociados, supra). Se digirió en forma individual 1 microgramo de gADN con las siguientes enzimas (todas obtenidas en NEB): Hind III, BamH I, Pst I, Ase I, y Sac II. Estas enzimas de restricción fueron elegidas específicamente para producir fragmentos de gADN que mapean la corriente ascendente y corriente descendente del locus nilA. Las enzimas de restricción Hind III, BamH I, y Pst I fueron seleccionadas debido a que sus sitios de reconocimiento son únicos dentro de la secuencia pDOW3719. Además, estos sitios de reconocimiento de enzimas están localizados en las uniones entre el fragmento de amplicon del locus nilA y el vector PCR-BLUNT ll/XL-TOPO® (figura 2). La disociación del gADN con estas enzimas y la autoligadura de los fragmentos resultantes, da como resultado de esta forma un fragmento de rescate de plásmido que contiene las secuencias genómicas no caracterizadas ligadas en forma adyacente a los sitios de enlace del cebador universal directo M13 o el cebador reverso M13 del plásmido pDOW3917. Dichos clones son aislados transformando la mezcla de ligadura en células E. coli, con selección para el gen de resistencia a Kanamicina albergado mediante pDOW3917.

Además, el plásmido pDOW3719 no contiene sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Ase I y Sac //. Por consiguiente, los fragmentos de gADN generados por estas enzimas de restricción pueden producir un fragmento de ADN quimérico que abarca toda la longitud de la secuencia de plásmido pDOW3719 integrada e incluye las regiones de gADN que flanquean ambos sitios del plásmido pDOW3719 integrado.

Los fragmentos de gADN que resultan de la digestión de enzimas de restricción tal como se describe anteriormente, fueron auto-ligadas utilizando Ligasa T4 (ROCHE APPLIED SCIENCES; Indianapolis, IN). Los productos de ligadura fueron transformados en CÉLULAS E. coli TOP10 ONESHOT® (INVITROGEN) y revestidas en un medio LB que contiene Kanamicina (50 pg/mL). Se seleccionaron colonias individuales y el ADN de plásmido fue aislado caracterizado mediante patrones de digestión de enzima de restricción de plásmido. Los clones que contienen los plásmidos que exhiben un patrón de enlace de digestión de enzima de restricción consistente en comparación con otro, fueron adelantados para utilizarse en reacciones de secuenciación.

Las secuencias de nucleótido de la corriente ascendente y corriente descendente de gADN del locus nilA, fueron determinadas utilizando una técnica de "caminata de genoma". Los cebadores de secuenciación que corresponden a la secuencia de gADN conocida (tal como se encuentran en pDOW3719) fueron designados y utilizados con el EQUIPO DE SECUENCIACIÓN DE CICLO DE TER INADOR DE TINTA CEQ™ de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (BECKMAN COULTER; Fullerton, CA). A partir de la secuencia determinada, un segundo conjunto de cebadores, localizados en la secuencia genómica desconocida previamente, fue designado y utilizado para generar datos de secuenciación adicionales. Este proceso se repitió hasta que se determinó toda la secuencia de nucleótido de gADN disponible. Esta técnica generó 2,936 pb de la corriente ascendente de secuencia del locus nilA, y los 4,361 pb de la corriente descendente de secuencia del locus nilA. En combinación con los 1,796 pb del locus nilA previamente identificado, la corriente ascendente y la corriente descendente recientemente identificadas que flanquean las regiones de secuencias anidaron una secuencia | de 9,093 pb que comprende la región genómica nilA (SEQ ID No: 24), que se extiende en ambas direcciones desde el locus nilA originalmente identificado.

EJEMPLO 20: Construcción de un vector para integración en la región genómica nilA LBA4404 | Se diseñó y construyó un vector de integración para integración transmitida por homología de las secuencias de ADN extrañas en la región genómica nilA A. tumefaciens LBA4404. Un fragmento de 6.3 kpb de la región genómica nilA que abarca el locus nilA, fue amplificada mediante PCR [ utilizando el EQUIPO PCR FAILSAFE™ (EPICENTRE®, Madison, Wl). El fragmento amplificado fue ligado en el vector PCR®8/GW/TOPO® (INVITROGEN), y los clones positivos fueron confirmados mediante digestión de enzima de restricción y verificación de secuencia de ADN. El vector resultante, pDAB9615, fue modificado en forma adicional mediante la adición de un fragmento de oligonucleótido que contiene los sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos múltiples. Estos sitios de restricción, flanqueados por regiones de 3,244 pb y 3,128 pb de la región genómica nilA, sirven como sitios de clonación para la introducción de secuencias de nucleótido extrañas. El vector resultante fue nombrado pDAB9618 (figura 3).

Se preparó un fragmento de 15,549 pb que contiene el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y un gen de resistencia a Kanamicina bacteriano mediante la digestión de ADN pDAB9292 con Kpn I más Bst1107 I. Este fragmento fue ligado posteriormente al ADN de pDAB9618 que había sido digerido con Kpn I más Swa I, para producir el vector pDAB9621 (figura 3). La reacción GATEWAY® fue utilizada posteriormente para mover la porción de pDAB9621 que contiene el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 y el gen de resistencia a Kanamicina bacteriano, flanqueado en cada lado por 3 kpb de las secuencias de región genómica nilA LBA4404, en el vector GATEWAY®PDEST™ 14 mediante reacción AN L-R CLONASE® (INVITROGEN). El plásmido resultante, pDAB9698 (figura 3, SEQ ID No: 25), fue confirmado mediante digestión de enzimas de restricción y reacciones de secuenciación de ADN. pDAB9698 sirvió como un vector de integración para la integración de los genes vir derivados de pTiBo542 del pSB1 (albergados en el fragmento VirBCDG Kpnl de 14.8) en la región cromosomal nilA de la cepa A. tumefaciens LBA4404.

EJEMPLO 21 : Integración cromosomal del fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 mediante recombinación homologa El ADN del plásmido pDAB9698, fue producido utilizando el EQUIPO DE AISLAMIENTO DE ADN DE PLÁSMIDO DE CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO DE ANIONES AX NUCLEOBOND® (MACHEREY-NAGEL). El ADN de plásmido purificado fue electroporado en CÉLULAS A. tumefaciens LBA4404 (INVITROGEN). En síntesis, se incubaron 500 ng de ADN de plásmido con las células en 4° durante 10 minutos. Esta mezcla fue pipeteada en una CUBETA GENE PULSER® de 0.2 cm enfriada con hielo (BIO-RAD) y electroporada utilizando el BIO-RAD GENE PULSER con las siguientes configuraciones: salida de capacitancia 25 Farad, extensor de capacitancia 960 pFarad, resistencia 200 ohms, y voltaje 2.5 kVolts. Inmediatamente después de la electroporación , se agregaron 950 ML de medio SOC (INVITROGEN) y la mezcla se transfirió a un tubo Falcon 2059 (BECTON DICKINSON AND CO.; Franklin Lakes, NJ). Las células transformadas fueron posteriormente incubadas en 28°C durante 5 a 6 horas. Después de la incubación, las células fueron revestidas en placas con medio YEP separadas que contienen Kanamicina (50 pg/mL). Las plantas fueron crecidas invertidas en 28°C durante 36 a 48 horas. Se recogieron las colonias simples y se propagaron en 5 mL de YEP líquido que contiene Kanamicina (50 pg/mL) durante aproximadamente 36 horas en 28°C. Estos cultivos se utilizaron para preparar cultivos de reserva de glicerol mediante mezclado vigoroso con un volumen igual de glicerol estéril al 100%, seguido de congelación y almacenamiento en -80°C.

EJEMPLO 22: Confirmación fenotípica y molecular de la integración cromosomal del fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 pDAB9698, que tiene el origen de réplica colE1, no se espera que se repliqué en forma autónoma en células A. tumefaciens. Por lo tanto, al momento de la transformación del ADN pDAB9698 en células LBA4404, la resistencia a Kanamicina estable resulta de la integración del ADN de pDAB9698 en elementos genéticos Agrobacterium de réplica autónoma. Estos integrantes de plásmido, caerán en cuatro clases que pueden utilizarse de acuerdo con diversas modalidades de las cepas Agrobacterium y métodos para su uso tal como aquí se describe. La primera clase comprende células en las cuales el ADN pDAB9698 se ha integrado en un sitio remoto de la región genómica nilA por medio de recombinación no homologa. Estas células deben ser resistentes a Kanamicina en virtud del gen de resistencia a Kanamicina adyacente al fragmento VirBCDG Kpnl 14.8, y adicionalmente deben ser resistentes a Ampicilina en virtud del gen de resistencia a Ampicilina albergado en el vector de esqueleto pDAB9698 (pDEST™14). La segunda clase comprende células en las cuales el ADN pDAB9698 se ha integrado en el plásmido auxiliar Ti pAL4404 de réplica autónoma (residente en forma nativa en LBA4404) en virtud de la recombinación homóloga transmitida por los genes VirBCDG derivados de pTiBo542 presentes en pDAB9698, y los genes VirBCDG derivados de pTiACH5 presentes en pAL4404. Estas células deben ser resistentes tanto a Kanamicina como a Ampicilina. La tercera jclase comprende células en las cuales el ADN pDAB9698 se ha integrado en la región genómica nilA LBA4404 en virtud de un evento de recombinación homóloga simple (cruce) transmitida ya sea mediante las secuencias de región genómica nilA de aproximadamente 3 kpb albergadas en pDAB9698, y que lanquean el fragmento de 15,549 pb que contienen el ragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y el gen de resistencia a <anamicina. Estas células también deben ser resistentes tanto a Kanamicina como a Ampicilina. La cuarta clase comprende células en las cuales el evento de cruce simple de células clase 3, pasan por un segundo evento de cruce transmitido por las secuencias de región genómica nilA de 3 kpb ahora duplicadas que se generan como una consecuencia del evento de cruce simple. Dependiendo de cuales de las secuencias de la región genómica nilA de 3 kpb de flanqueo generaron el evento de cruce simple, y de cuales de estas secuencias de flanqueo generan el segundo evento de cruce, las células resultantes deben ser ya sea sensibles a Kanamicina, y resistentes a Ampicilina, o resistentes a Kanamicina y sensibles a Ampicilina. Las células preferidas, tal como aquí se describen, comprenden la última clase, esto es, las células que son resistentes a Kanamicina y sensibles a Ampicilina. Estos eventos de cruce doble, los cuales no contienen el esqueleto de plásmido pDEST™14, son deseables ya que no contienen elementos genéticos superfluos, tales como el origen de réplica colE1 y el gen de resistencia a Ampicilina.

Los transformantes putativos aislados en el Ejemplo 21, fueron clasificados para un evento de integración transmitido por recombinación homologa doble deseable. Los aislados resistentes a Kanamicina que tienen el fragmento de 15,549 pb, el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y el gen de resistencia a Kanamicina (y que carecen del esqueleto de vector pDEST™14) fueron identificados mediante sensibilidad a Ampicilina. Los transformantes putativos fueron crecidos en 3 mL de YEP que contiene Kanamicina (50 pg/mL) en 28°C durante aproximadamente 36 horas. Estos cultivos posteriormente fueron rayados en un medio YEP sólido que contienen varios antibióticos simples tal como se indica (concentraciones en pg/mL): Rifampicina, 100; Kanamicina, 50; Estreptomicina, 125; Cloranfenicol, 50; Eritromicina, 200; Tetraciclina, 12.5; y Ampicilina, 100. Las placas fueron incubadas en 28° durante 48 horas, y se clasificó el crecimiento de colonia. Se identificó una cepa que fue resistente a Kanamicina, Rifampicina (marcador cromosomal), y Estreptomicina (marcador pAL4404; Ooms y asociados, supra). Además, la cepa fue sensible a Cloranfenicol, Eritromicina, y Tetraciclina. Más significativamente, la cepa fue sensible a Ampicilina. Este fenotipo de clasificación de fármaco es indicativo de un evento de recombinación homologa de cruce doble deseable, en donde el fragmento 15,549 pb que contiene el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y el gen de resistencia a Kanamicina están integrados en el cromosoma A. tumefaciens LBA4404. Esta cepa es llamada DAH6174.

La presencia de genes VirBCDG derivados de pTiBo542 en la cepa DAt16174, fue confirmado en forma adicional mediante caracterización molecular. El ADN genómico de la cepa DAt16174 fue aislado utilizando un protocolo de aislamiento de ADN genómico bacteriano (Sambrook y asociados, supra y actualizaciones de la misma). Los cebadores PCR fueron diseñados para amplificar fragmentos de traslape de los genes VirBCDG integrados en forma cromosomal. Las reacciones PCR que utilizan los cebadores descritos en la Tabla 6, se completaron utilizando el EQUIPO PCR FAILSAFE™ (EPICENTRE®) siguiendo las direcciones del fabricante. Debido al gran tamaño molecular total de los genes VirBCDG integrados, se llevaron a cabo las amplificaciones para producir cinco fragmentos de traslape. Los amplicones del tamaño esperado fueron purificados a partir de geles de agarosa utilizando el EQUIPO DE EXTRACCIÓN DE GEL QIAEX II (QIAGEN; Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Estos fragmentos fueron clonados en el vector PCR2.1®-TOPO®TA utilizando el EQUIPO PCR2.1 ©-TO O® TA CLONING® (INVITROGEN). Las colonias bacterianas que se sospecha contienen clones de los amplicones PCR, fueron confirmados mediante digestión de enzima de restricción. Las secuencias de ADN de los fragmentos de amplicon fueron determinadas utilizando el EQUIPO DE SECU ENCIACIÓN DE CICLO DE TERMINADOR DE TINTA CEQ™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los datos de secuenciación fueron analizando utilizando el software versión 4.1.4 SEQUENCHER™ (GENE CODES CORP.; Ann Arbor, MI). Las secuencias resultantes produjeron una secuencia contigua de 22 kpb que abarcó todo el fragmento de 15,549 pb que contiene el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y el gen de resistencia a Kanamicina, más ambas de las regiones genómicas nilA de flanqueo de aproximadamente 3 kpb, y se extendieron en forma adicional en las regiones genómicas nilA de corriente ascendente y corriente descendente (incluyendo de esta forma la secuencia cromosomal LBA4404 la cual no estaba contenida originalmente en pDAB9698).

La identidad Agrobacterium tumefaciens de la cepa DAH6174 fue verificada mediante la prueba de cetolactosa. Se rayaron colonias transformadas en forma putativa sobre agar de lactosa y se incubaron en 28°C durante 48 horas. Las placas fueron inundadas posteriormente con una Solución de Benedict y se monitorearon a temperatura ambiente. Los aislados que convirtieron la Solución de Benedict y el agar subyacente de color azul a amarillo, fueron confirmados de esta manera para ser Agrobacterium .

Una característica de la cepa A. tumefaciens DAH6174 es que puede ser utilizada en forma conveniente como un agente de transformación de la planta para la transferencia de genes de T-ADN desde vectores binarios que tienen orígenes de réplica, por ejemplo, de las clases IncP, IncW o VS1. En términos amplios, el vector binario introducido puede tener un origen de réplica de cualquier clase con la capacidad de réplica en Agrobacterium , mientras es compatible con el origen de réplica de pT i (y funciones asociadas) del plásmido pAL4404 que reside en DAt16174. Por lo tanto, está dentro del rango de los usos posibles de la cepa DAt16174, que más de un plásmido de vector binario pueda residir junto con la cepa DAt16174, si los plásmidos tienen orígenes de réplica compatibles (es decir, son de diferentes grupos de incompatibilidad). La selección para dichos vectores binarios introducidos no debe depender de los genes marcadores seleccionables bacterianos que confieren resistencia ya sea a Kanamicina, Rifampicina o Estreptomicina, ya que la cepa DAt16174 es resistente a estos tres antibióticos.

Los vectores binarios pueden replicarse en forma autónoma en células tanto de E. coli como de Agrobacterium . Comprenden secuencias, estructuradas por las regiones de repetición de límite derecho e izquierdo de T-ADN, que puede incluir un gen marcador seleccionable funcional para la selección de las células de la planta transformada, un | enlazador de clonación, un polienlazador de clonación, u otra secuencia que pueda funcionar como un sitio de introducción para genes destinados para la transformación de la célula de la planta. Se pueden transformar directamente en células de Agrobacterium mediante electroporación , mediante | transformación de ADN directa químicamente transmitida, introducirse mediante conjugación bacteriana, o a través de otras metodologías. El Agrobacterium utilizado como célula huésped, alberga al menos un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para proporcionar que las | proteínas Vir lleven a cabo todas las funciones de requisito implicadas en la transferencia del T-ADN en la célula de planta. El plásmido que lleva la región vir es comúnmente un plásmido Ti o Ri mutado (plásmido auxiliar) del cual la región del T-ADN, incluyendo las repeticiones del borde derecho e izquierdo de T-I ADN, han sido eliminados. Los ejemplos de cepas de Agrobacterium que contienen plásmidos auxiliares y son útiles para la transformación de la planta incluyen, por ejemplo, LBA4404, GV3101(pMP90), GV3101 (pM P90RK) , GV2260, GV3850, EHA101, EHA105, y AGL1. Numerosos ejemplos de sistemas de vector binario son revisados en la publicación de Hellens y asociados, (2000, Trends Plant Sci. 5: 446 a 451).

Además, las ventajas de transformación de la planta conferidas en la cepa LBA4404(pSB1 ) [utilizadas en el sistema superbinario] a través del operon virB derivado de pTiBo542 |(que incluye los genes virB1, virB2, virB3, virB4, virB5, virB6, virB7, virB8, virB9, virB10, y virB11), el gen virG, el operon virC (que comprende los genes virC1 y virC2) y la parte del operon virD que comprende el gen virD1 , tal como se alberga en el plásmido pSB1, se retienen en la cepa DAt16174. Debido a que |los genes vir superbinarios descritos anteriormente están integrados en el cromosoma LBA4404, la cepa DAt16174 es referida como una cepa SUPERCHROME. En contraste con el sistema superbinario, el uso de la cepa DAH6174 no requiere la formación de plásmidos superbinarios inestables a través de recombinación homologa entre pSB1 y vectores de traslado, jt a I e s como pSB11. Un beneficio adicional de la cepa jSUPERCHRO E, que los vectores binarios estándar pueden ser ntroducidos en la cepa para la transformación de la planta.

EJEMPLO 23: Caracterización bioquímica y molecular de tejido de maíz transformados con diversas cepas de Agrobacterium que albergan pDAB101556 Se construyó un vector de transformación de planta binaria, pDAB101556 (figura 5), mediante una combinación de métodos de clonación estándar y tecnología GATEWAY™. El vector binario pDAB101556 está basado en el origen de réplica tipo IncP del plásmido RK2, y el esqueleto del vector alberga un gen bacteriano que confiere resistencia a Espectinomicina en 100 pg/mL. Las repeticiones de límite de T-ADN se derivan de la región TL de pT¡15955. Dentro del Límite Derecho (RB) y los múltiples Límites Izquierdos (LB) de la región de T-ADN del plásmido pDAB101556, se colocan 2 secuencias de codificación de proteína que se pueden expresar en plantas (CDS). El primer gen (marcador seleccionable) comprende la región de codificación para la proteína marcadora seleccionable AAD1 (SEQ ID No: 13) (Patente Norteamericana No. 7,838,733), la cual está bajo el control de transcripción de un promotor de ubiquitina 1 de maíz de 1,991 pb con un intrón 1 asociado (Patente Norteamericana No. 5,510,474). Este gen es terminado por una 3'UTR de Lipasa de maíz (Patente Norteamericana No. 7,179,902). El segundo gen (marcador clasificable) comprende un CDS para una proteína fluorescente amarilla (YFP, esencialmente tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 7,951,923) cuya transcripción es controlada por un promotor de ubiquitina 1 de maíz con el intrón 1 asociado. Este gen es terminado por una 3'UTR Per5 de maíz (Patente Norteamericana No. 6,384,207).

El plásmido pDAB101556 fue introducido con éxito mediante electroporación en células de la cepa A. tumefaciens LBA4404 para producir la cepa LBA4404(pDAB 101556). Esta combinación de cepa/plásmido comprende por lo tanto, un sistema de transformación de planta binaria estándar. Los transformantes seleccionados por medio de resistencia a Estreptomicina y Espectinomicina fueron validados mediante digestión de enzimas de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Las células engrosadas de la cepa LBA4404(pDAB 101556) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelada y utilizadas para transformaciones de maíz a través de los métodos descritos en el Ejemplo 24.

El plásmido pDAB101556 fue introducido con éxito mediante electroporación en células de la cepa A. tumefaciens DAt13192 (ver Ejemplo 7) para producir la cepa DAt13192(pDAB101556). Esta combinación de cepa/plásmido comprende por lo tanto un sistema de transformación de planta ternaria con deficiencia de recombinación. Los transformantes seleccionados por medio de resistencia a Eritromicina, Kanamicina, y Espectinomicina fueron validados mediante digestión de enzimas de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congelado y almacenamiento en -80°C. Las células engrosadas de la cepa DAt13192(pDAB101556) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelada y utilizadas para transformaciones de maíz a través de los métodos descritos en el Ejemplo 24.

Se han realizado diversos intentos para introducir el ADN del plásmido pDAB101556 en la cepa DAt20711 (ver Ejemplo 9), un sistema ternario proeficiente de recombinación. En todos los casos, se encontró que el plásmido pDAB101556 es inestable en esta cepa y no se construyó una cepa DAt20711 (pDAB101556).

El plásmido pDAB101556 fue introducido con éxito mediante electroporación en células de la cepa A. tumefaciens DAH6174 (Ejemplo 22) para producir la cepa DAt16174(pDAB101556). Esta combinación de cepa/plásmido comprende por lo tanto un sistema de transformación de SUPERCHROME/planta binaria. Los transformantes seleccionados por medio de resistencia a Estreptomicina, Kanamicina y Espectinomicina se validaron mediante digestión de enzimas de restricción del ADN de plásmido antes de la preparación de las reservas de glicerol congeladas y almacenamiento en -80°C. Las células engrosadas de la cepa DAt16174(pDAB101556) fueron recolectadas de una placa de agar inoculada de una reserva de glicerol congelada y utilizadas para transformaciones de maíz a través de los métodos descritos en el Ejemplo 24.

EJEMPLO 24: Transformación de maíz mediante cepas de Agrobacterium que albergan el vector binario pDAB101556 Producción de Embrión Inmaduro. Las semillas de una crianza B104 fueron plantadas en macetas SVD de 3.5 pulgadas (8.89 cm) con METRO MIX 360 (SUN GRO HORTICULTURE Inc.; Bellevue, WA). Cuando las plantas alcanzaron una etapa de crecimiento de V4-V5, se trasplantaron en macetas de 4 galones que contienen una mezcla 1:1 de METRO MIX 360 y ( arcilla calcinada PROFILE GREENS GRADE (PROFILE PRODUCTS LLC; Buffalo Grove, IL), con 20 gramos de OSMOCOTE 19-6-12, y 20 gramos de IRONITE™ como aditivos. Las plantas se crecieron en un invernadero utilizando una combinación de lámparas 1000W HPS (sodio de alta presión) y | 1000W MH (haluro de metal) ajustadas en un fotoperíodo de 16:8 luz/oscuridad, si la luz exterior no excedía 450 W/m2. Con el objeto de obtener embriones inmaduros para transformación, se llevaron a cabo auto polinizaciones o sib controladas.

Se aislaron los embriones inmaduros en de 10 a 13 días ¡ posteriores a la polinización, cuando los embriones tuvieron aproximadamente un tamaño de 1.6 a 2.0 mm.

Infección y cocultivo. Las orejas de maíz fueron esterilizadas en la superficie sumergiéndolas en 20% de blanqueador comercial con detergente LIQUINOX™ (1 o 2 gotas I por 500 mL) durante 20 minutos y se enjuagaron tres veces con agua estéril. Se preparó una suspensión de células Agrobacterium que contiene vector binario pDAB101556 procedente de la bacteria que crece en el medio sólido AB a una temperatura de 20° durante 2 a 3 días, seguido del crecimiento en un medio sólido de YEP en 28° durante 1 o 2 días. Tanto el medio AB como YEP contenía suplementos de antibióticos adecuados tal como se describe en el Ejemplo 23 para cada cepa de Agrobacterium probada con el vector binario pDAB101556. Las asas de Henle de las células raspadas de una | placa YEP fueron transferidos en 10 a 15 ml_ de un medio de infección líquido que comprende: sales MS (Frame y asociados, supra), Vitaminas MS Modificadas ISU (Frame y asociados, supra), 3.3 mg/L de Dicamba-etanol, 68.4 gm/L de sacarosa, 36 gm/L de glucosa, 700 mg/L de L-prolina, pH 5.2, y que contiene | 100 a 200 µ? de acetosiringona . La solución se pipeteó suavemente hacia arriba y hacia bajo utilizando una pipeta de 5 mL estéril o un mezclador vortex hasta que se logró una suspensión uniforme, y la concentración se ajustó a una densidad óptica de aproximadamente 1.0 en 600 nm (OD6oo) | utilizando un espectrofotómetro P8452a Hewlett-Packard.

Cocultivo. Los embriones inmaduros fueron aislados directamente en un tubo de microcentrifugación que contiene 2 mL del medio de infección. El medio se eliminó y reemplazó con 1 a 2 mL del medio de infección fresco, posteriormente se I reemplazó con 1.5 mL de una solución de Agrobacterium . La solución de Agrobacterium y de embrión se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se transfirió a un medio de cocultivo que contenía sales MS, Vitaminas MS Modificadas ISU 3.3 mg/L de Dicamba-etanol , 30 gm/L de sacarosa, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mio-inositol, 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína, 15 mg/L de AgN03, 100 a 200 µ? de acetosiringona, y 2.3 gm/L de GELRITE™ (SIGMA-ALDRICH; St. Louis, MO), en pH 5.8. La incubación de cocultivo fue durante 3 días en oscuridad en 20°.

Reposo y Selección. Después del cocultivo, los embriones fueron transferidos a un medio de reposo basado en MS sin selección que contiene sales MS, Vitaminas MS Modificadas ISU, 3.3 mg/L de Dicamba-etanol, 30 gm/L de sacarosa, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mio-inositol, 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína, 15 mg/L de AgN03, 0.5 gm/L de MES, 250 mg/L de Cefotaxima, y 2.3 gm/L de GELRITE™, en pH 5.8. La incubación continuó durante 7 días en la oscuridad en 28°. Después del período de reposo de 7 días, los embriones fueron transferidos al Medio Selectivo. Para selección de los tejidos de maíz transformados con un plásmido superbinario o binario que contiene un gen marcador seleccionable aad-1 que se puede expresar en plantas, se utilizó el medio de reposo basado en MS (anterior) suplementado con Haloxyfop. Los embriones se transfirieron primero al Medio de Selección I que contiene 100 nM de Haloxyfop y se incubaron durante 2 semanas, y posteriormente se transfirieron al Medio de Selección II con 500 nM de Haioxyfop y se incubaron durante 2 semanas adicionales. Los aislados transformados se obtuvieron durante el curso de aproximadamente 5 semanas en 28° en la oscuridad. Si es necesario, los aislados recuperados fueron engrosados transfiriendo al Medio de Selección II fresco durante otras 2 semanas antes de ser transferidos al medio de regeneración .

Los expertos en la técnica de la transformación de maíz | comprenderán que están disponibles otros métodos de selección de plantas transformadas, cuando se utilizan otros genes marcadores seleccionables que se pueden expresar en plantas (por ejemplo, genes de tolerancia a herbicida).

Regeneración I. Siguiendo el proceso de selección, los | cultivos se transfirieron a un Medio de Regeneración basado en MS I que contiene sales MS, Vitaminas MS Modificadas ISU, 60 gm/L de sacarosa, 350 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de mio- inositol, 50 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína, 1 mg/L de AgN03, 250 mg/L de Cefotaxima, 2.5 gm/L de GELRITE™ y | 500 nM de Haioxyfop, en pH 5.8. La incubación continúo durante 2 semanas en 28° en la oscuridad.

Regeneración II. Los cultivos se transfirieron a un Medio de Regeneración basado en MS II que contiene sales MS, Vitaminas MS Modificadas ISU, 30 gm/L de sacarosa, 100 mg/L I de mio-inositol, 250 mg/L de Cefotaxima, 2.5 gm/L de GELRITE™, y 500 nM de Haloxyfop, en pH 5.8. Después de 3 semanas en 28°C, bajo un fotoperíodo de 16/8 horas, con condiciones de luz fluorescente blanca (aproximadamente 80 pEm 2s 1), se cortaron las plántulas y se transfirieron a un medio basado en MS o un medio de elongación de retoño/raíz (con base ½ MS) compuesto de sales MS (o sales ½ MS), Vitaminas MS Modificadas ISU, 0.5 gm/L de MES, 30 gm/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol, 2.5 gm/L de GELRITE™, en pH 5.8. Cuando las plántulas alcanzaron una longitud de 4 a 6 cm, se transfirieron a la cámara de crecimiento y eventualmente al invernadero.

Producción de semilla. Las plantas regeneradas se trasplantaron en macetas SVD de 3.5 pulgadas (8.89 cm) con METRO MIX 360 y se colocaron en una cámara de crecimiento para su endurecimiento. Cuando las plantas alcanzaron la etapa de crecimiento V3, se movieron al invernadero, y en la etapa de crecimiento V4/V5, se trasplantaron en tarros de 5 galones que contienen una mezcla 1:1 de METRO MIX 360 y arcilla calcinada PROFILE GREENS GRADE, con 20 gramos de OSMOCOTE 19-6-12, y 20 gramos de IRONITE™ como aditivos. Las plantas se crecieron en el invernadero bajo un fotoperíodo de 16:8 luz/oscuridad. Se produjo la semilla T1 llevando a cabo polinizaciones controladas (retrocruces a B104). La semilla se recolectó 6 semanas después de la polinización.

Se llevaron a cabo múltiples experimentos de transformación de maíz con las cepas A. tumefaciens LBA4404(pDAB101556), DAt 13192 (p DAB 101556) , y DAt16 74(pDAB101556) diseñadas, y los callos transgénicos seleccionados en las concentraciones de inhibición de Haloxyfop, se llevaron directamente para la regeneración de la plántula y estudios adicionales. En total, se retuvieron 16 eventos en las transformaciones LBA4404(pDAB101556), se retuvieron 49 eventos en las transformaciones DAt13192(pDAB101556), y se retuvieron 60 eventos en las | transformaciones DAt16174(pDAB101556) (Tabla 7).

Los números de de copias del transgen aad-1 en las plantas T0 transgénicas, se estimaron mediante ensayos de sonda de hidrólisis ((Bubner y Baldwin, supra) utilizando oligonucleótidos específicos del gen. Se llevaron a cabo | análisis de manchado southern de ADN disociado con Ncol preparado a partir de los eventos seleccionados a través de un método de extracción de bromuro de trimetilamonio de cetilo, utilizando un fragmento amplificado con PCR del gen aad-1 como una sonda etiquetada-32P. Además, se detectó la ¡ presencia de secuencias de vector de esqueleto integrado que se originan de pDAB101556 mediante análisis de sonda de hidrólisis.

Por lo tanto, la cepa DAt16174, una cepa SUPERCHROM E que comprende un conjunto completo de genes vir derivados de ] pTiACH5 albergados en pAL4404, y que comprende en forma adicional un conjunto parcial de genes vir derivados de pTiBo542 integrados en el cromosoma LBA4404 en el locus nilA, tiene la capacidad de producir de manera eficiente plantas de maíz transformadas. Además, aunque se tiene una eficiencia de transformación general un tanto inferior a la obtenida con la cepa ternaria, es superior la calidad de los eventos producidos mediante SUPERCHROME, con el 90% de los eventos producidos teniendo insertos de copia simple sin contaminación del esqueleto detectable.

Aunque la presente invención ha sido descrita en ciertas modalidades de ejemplo, las cuales están proyectadas como ilustración de algunos aspectos de la presente invención, la presente invención puede ser modificada en forma adicional dentro del espíritu y alcance de la presente descripción. La presente solicitud por consiguiente pretende cubrir cualesquiera variaciones, uso, o adaptaciones de la invención utilizando sus principios generales. Además, la presente solicitud está proyectada para cubrir dichas separaciones de la presente descripción, como estando dentro de la práctica conocida o acostumbrada en la técnica a la cual pertenece la presente invención, y estando dentro de los límites de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias, incluyendo publicaciones, patentes, y solicitudes de patente, aquí mencionadas están incorporadas como referencia hasta el mismo grado como si cada referencia fuera indicada en forma individual o específica como incorporada como referencia, y quedara establecida en su totalidad a la presente invención. Las referencias aquí mencionadas se proporcionan únicamente por su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo que aquí se presenta será construido como una admisión de que los inventores no están titulados para anteceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.

Tabla 1. Grupos de incompatibilidad representativos y algunos plásmidos de ejemplo que son clasificados como perteneciendo a estos grupos de incompatibilidad.

Tabla 2. Síntesis de resultados de bioensayo ¡n vitro.

Tabla 3. Producción (en ppm; partes por millón) de proteínas AAD1, Cry Ca, Cry Fa, y CryIAb en plantas de transformadas con el vector binario pDAB101513.

Tabla 4. Resultados de experimentos de transformación de maíz con cepas de A. tumefaciens que albergan el plásmido pDAB101513.

Tabla 5. Resultados de experimentos de transformación de maíz con cepas de A. tumefaciens que albergan el plásmido pDAB101514.

Tabla 6. Cebadores PCR utilizados para confirmación molecular de integración del fragmento de 15,549 pb que contiene el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y el gen de resistencia a Kanamicina en la región genómica nilA del cromosoma de la cepa Agrobacterium tumefaciens DAt16174.

Tabla 7. Análisis de eventos transgénicos producidos mediante tres cepas de Agrobacterium que albergan el plásmido pDAB101556.

Claims (48)

REIVINDICACIONES

1. Un método para transformar una planta, en donde el método comprende contactar una célula de la planta con una cepa Agrobacterium que tiene al menos un plásmido auxiliar pTi que comprende un fragmento Kpnl 14.8 de pSB1 y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada, en donde la región de T-ADN comprende al menos un límite de T-ADN derecho y ADN exógeno adyacente al límite, en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre si .

2. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 en cepas Agrobacterium tiene una deficiencia en la función RecA.

3. Un método para transformar una planta, en donde el método comprende contactar una célula de la planta con una bacteria del género Agrobacterium que tiene un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada, en donde el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 ha sido integrado en un sitio de integración neutral de un cromosoma de la bacteria.

4. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la bacteria comprende además un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium , en donde el plásmido tiene un origen de réplica de un grupo de incompatibilidad IncP.

5. El método para transformar una planta tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque la bacteria comprende además un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium .

6. El método para transformar una planta tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque la cepa Agrobacterium tiene deficiencia en la funcionalidad RecA.

7. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 6, caracterizado porque la región de T-ADN contiene tres o más secuencias de gen.

8. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 7, caracterizado porque la región de T-ADN contiene igual o más de 25,000 pares base de nucleótidos.

9. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 8, caracterizado porque la región de T-ADN está insertada en una ubicación simple en la célula de planta cuando la planta es transformada .

10. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 9, caracterizado porque la región de T-ADN comprende más de una secuencia de gen, y las secuencias de gen tienen igual o más del 60% de homología de secuencia.

11. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 10, caracterizado porque la región de T-ADN codifica una o más de una proteína insecticida, una proteína herbicida, o una mezcla de proteínas insecticidas y proteínas de tolerancia a herbicidas.

12. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 11, | caracterizado porque la región de T-ADN codifica una proteína insecticida CryICa, una proteína insecticida CryIF, y una proteína insecticida Cry1Ab1.

13. El método para transformar una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 12, | caracterizado porque la región de T-ADN codifica una proteína insecticida CryICa, una proteína insecticida CryIF, una proteína insecticida Cry1Ab1, y una proteina de tolerancia a herbicida AAD-1.

14. El método tal como se describe en cualquiera | reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizado porque la planta es un monocot.

15. El método tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizado porque el fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 es clonado en el sitio Kpn I de un I plásmido pDAB9291.

16. El método tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el plásmido auxiliar pTi es el plásmido p P90.

17. El método tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 16, caracterizado porque el plásmido auxiliar pTi es el plásmido pTiC58A.

18. El método tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque comprende en forma adicional transformar la cepa de Agrobacterium utilizando el plásmido de ADN pDAB9292.

19. El método tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 18, caracterizado porque comprende además el paso de seleccionar una célula transformada o un tejido transformado, después de someter el tejido de cultivo a transformación.

20. Una cepa de Agrobacterium que tiene al menos un plásmido auxiliar pTi que comprende un fragmento Kpnl 14.8 de pSB1 y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T- ADN desarmada, en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre si.

21. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la cepa de Agrobacterium tiene una deficiencia en la función RecA.

22. Una cepa de Agrobacterium que tiene propiedades que incrementan la transformación, caracterizada porque comprende un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada.

23. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones 20 y 21 , caracterizada porque la bacteria comprende además un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium .

24. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizada porque la bacteria comprende además un plásmido que tiene una región de T-ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacterium .

25. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en la reivindicación 24, caracterizada porque la cepa de Agrobacterium tiene deficiencia en la funcionalidad RecA.

26. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 25, caracterizada porque la región de T-ADN contiene tres o más secuencias de gen.

27. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 26, caracterizada porque la región de T-ADN contiene igual o más de 25,000 nucleótidos.

28. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizada porque la región de T-ADN comprende más de una secuencia de gen y las secuencias de gen tienen más del 60% de homología de secuencia.

29. La cepa de Agrobacteri um tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 28, caracterizada porque la región de T-ADN codifica una o más de una proteína insecticida, una proteína herbicida, o una mezcla de proteínas de insecticidas y proteínas de tolerancia a herbicidas.

30. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 29, caracterizada porque la región de T-ADN codifica una proteína insecticida CryICa, una proteína insecticida CryIF, y una proteína insecticida Cry1 Ab .

31. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 23 a la 30, caracterizada porque la región de T-ADN codifica una proteína insecticida CryICa, una proteína insecticida CryIF, una proteína insecticida Cry1Ab1, y una proteína de tolerancia a herbicida AAD-1.

32. Un locus genómico nilA de Agrobacterium tumefaciens , en donde una secuencia de polinucleótido está integrada en el locus genómico nilA.

33. El locus genómico nilA tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido comprende un gen vir.

34. Una cepa de Agrobacterium con un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de SB1 integrado en un sitio de integración neutral en el cromosoma de Agrobacterium .

35. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizada porque el sitio de integración neutral es un locus genómico nilA.

36. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 34 a la 35, caracterizada porque la cepa de Agrobacterium tiene deficiencia en la funcionalidad RecA.

37. La cepa de Agrobacterium tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 34 a la 36, caracterizada porque la cepa de Agrobacterium es Agrobacterium tumefaciens.

38. Una cepa de Agrobacterium LB4404 que comprende un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 de pSB1 en un plásmido auxiliar pTi, y un plásmido pTi que tiene al menos una región de T-ADN desarmada y tiene un ADN adyacente al menos a un límite de T-ADN de Agrobacteriu , en donde los plásmidos tienen diferentes orígenes de réplica relativos entre si.

39. Una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 19.

40. La planta tal como se describe en la reivindicación 39, caracterizada porque cualquiera de los rasgos genéticos introducidos a la planta mediante la transformación, son producidos en forma estable en la progenie de la planta.

41. Una planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones de la 4 a la 13, caracterizada porque la región de T-ADN se incorpora en forma estable en el ADN de la planta.

42. La planta tal como se describe en la reivindicación 41 , caracterizada porque cualquiera de los genes codificados por la región de T-ADN se expresan en la planta.

43. La planta tal como se describe en cualquiera reivindicaciones 41 y 42, caracterizada porque cualquiera de los genes codificados por la región T-ADN son producidos en forma estable en la progenie de la planta.

44. La planta tal como se describe en la reivindicación 41, caracterizada porque la planta expresa en forma estable proteínas insecticidas CryICa, proteínas insecticidas CryIF, proteínas insecticidas Cry1Ab1, y proteínas herbicidas AAD1.

45. La planta tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizada porque la planta es maíz.

46. La cepa de Agrobacterium LBA4404 que comprende al menos un gen vir de un fragmento VirBCDG Kpnl 14.8 aislado de pSB1 integrado en un sitio de integración neutral en el cromosoma de Agrobacterium.

47. Una planta de maíz transgénica fértil, o la progenie de la misma, caracterizada porque expresa cantidades insecticidas de proteína CryICa, proteína insecticida CryIF, proteína insecticida Cry1Ab1, y cantidades de proteína AAD-1 tolerante a herbicida, en donde las proteínas CryICa, CryIF, Cry1Ab1, y AAD-1 son expresadas en forma colectiva desde un locus simple del ADN recombinante incorporado en forma estable en el genoma de la planta.

48. La planta de maíz transgénica fértil tal como se describe en la reivindicación 47, caracterizada porque el locus simple del ADN recombinante está substancialmente libre de secuencias de esqueleto de vector de un plásmido de ADN pTi.