MX2013000045A - Vacuna contra ehrlichia canis. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones de vacuna y/o inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunizante efectiva de una bacteria de E. canis; además, también se describen métodos de inmunización de un sujeto contra E. canis al proveer las composiciones de vacuna y/o inmunogénicas.

Description

VACUNA CONTRA EHRLICHIA CANIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas y a vacunas contra erliquiosis monocítica manina (CME) causada por la bacteria Ehrlichia canis, y a métodos asociados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La erliquiosis monocítica canina (CME) es una enfermedad rickettsial severa en perros causada por la bacteria Ehrlichia canis (E. canis). E. canis se disemina de un perro a otro por medio de la garrapata café de los perros (Rhipicephalus sanguineus). Después de un periodo de incubación de 2 a 3 semanas después de la infección, los perros pueden progresar a través de la fase aguda, subclínica y crónica de la enfermedad. En la fase aguda, los signos clínicos varían desde trombocitopenia ligera a severa, leucopenia, anemia, letargía y pérdida de peso. Después de dos meses, la mayoría de los perros entrarán a una fase subclínica que dura meses o años, durante la cual pueden persistir los valores de sangre bajos, pero los signos clínicos son mínimos. Un pequeño porcentaje de perros infectados puede desarrollar una forma severa de la enfermedad conocida como pancitopenia canina tropical (TCP). La dispersión persistente de depresión de médula ósea, hemorragias, perturbaciones neurológicas, edema periférico, y pérdida de peso severa pierde su característica de TCP. Se puede desarrollar choque hipotensivo, conduciendo a la muerte. A pesar de los reportes de composiciones inmunogénicas contra E. canis [véase, v.gr., Mahan et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 72(2): 1 19-128 (2005); US 2006/0188524A1] anteriores, no ha habido una demostración de una vacuna efectiva contra E. canis. Por lo tanto, existe la necesidad de vacunas que protejan contra CME y/o TCP.

La cita de cualquier referencia aquí no debe considerarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" a la presente solicitud.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee vacunas y/o composiciones inmunogénicas para promover una respuesta inmunológica protectora contra una causa de erliquiosis. En ciertas modalidades, una composición de vacuna y/o una composición inmunogénica comprende un agente que cuando se administra como una vacuna primaria a un sujeto produce, si acaso, una respuesta inmunológica humoral mínima en el sujeto. En modalidades particulares, la composición inmunogénica comprende un agente que cuando se administra como una vacuna primaria produce, si acaso, una respuesta inmunológica humoral mínima en el sujeto, pero sin embargo produce una respuesta inmunológica protectora. Una modalidad de este tipo es una vacuna que comprende un crecimiento de E. canis inactivada en una linea de células de médula ósea de perro. En modalidades particulares de este tipo, la vacuna además puede comprender un adyuvante. En ciertas modalidades de este tipo, el adyuvante es Cord Factor (factor de acordonamiento). En modalidades más particulares, un adyuvante de Cord Factor se disuelve en un sistema de solvente de cloroformo.

En un aspecto, la presente invención provee una composición de vacuna y/o una composición inmunogénica que comprende un antígeno de E. canis que bajo una administración inicial a un sujeto {v.gr., como una vacuna primaria) no provoca la producción de anticuerpo importante contra el antígeno. Por consiguiente, ciertas modalidades de la presente invención incluyen composiciones inmunogénicas y/o composiciones de vacuna que comprenden una cantidad inmunizante efectiva de antigeno de £. canis en la cual una administración inicial/vacuna primaria de la composición a un sujeto produce una respuesta humoral mínima. En modalidades particulares, la presente invención provee una composición inmunogénica y/o vacuna que después de administración inicial/vacunación primaria no produce una respuesta humoral medible, mientras produce una respuesta inmunológica protectora en un sujeto. En ciertas modalidades, una vacuna y/o composición inmunogénica de la presente invención en una vacunación primaria/administración inicial produce una respuesta inmunológica celular, mientras produce una respuesta humoral mínima y/o no medible (v.gr., indetectable).

Por lo tanto, en un aspecto relacionado, la presente invención provee una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunizante efectiva de un antígeno de E. canis. En ciertas modalidades de este tipo, el antígeno produce una respuesta inmunológica protectora, pero produce una respuesta humoral mínima en un sujeto cuando la vacuna se administra como una vacuna primaria. Las vacunas y/o composiciones inmunogénícas de la presente invención pueden comprender un antígeno que es generado de E. canis que crece y/o que pasa sobre una célula como se describe aquí. En ciertas modalidades, el E. canis se hace crecer y/o pasar sobre una línea de células de canino. En modalidades más particulares, la línea de células puede ser una línea de células de médula ósea de perro. En modalidades más particulares, la célula tiene el acceso a ATCC No. PTA-10545, y/o una que tiene una o más, y/o todas las características de identificación de la célula que tiene acceso a ATCC No. PTA-10545. En una modalidad particular, el antígeno de E. canis es una E. canis asociada a célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546, y/o una que tiene una o más, y/o todas las características de identificación de la E. canis asociada a célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546.

La presente invención además provee una E. canis asociada a célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546. La presente invención también provee a E. canis asociada a célula que tiene una o más, y/o todas las características de identificación de la E. canis asociada a célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546. Además, la presente invención provee una célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10545. La presente invención además provee una célula que tiene una o más, y/o todas las características de identificación de la célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10545.

Además, los antígenos de E. canis de las vacunas y/o composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden inactivar. En ciertas modalidades, el antígeno de E. canis inactivado es inactivado con formalina.

En otro aspecto, la presente invención provee vacunas y/o composiciones inmunogénicas que comprenden un adyuvante. En ciertas modalidades de este tipo, el adyuvante es un adyuvante lipofílico. En ciertas modalidades, el adyuvante lipofílico está dentro de un solvente no polar. En modalidades particulares una composición inmunogénica y/o vacuna de la presente invención comprende un antígeno que se puede combinar con un adyuvante hidrofóbico y se hace miscible con un sistema de solvente polar comprendido por la vacuna y/o una composición inmunogénica. En modalidades más particulares, el adyuvante comprende un Cord Factor tal como un 6,6'-dimicolato de trehalosa. En modalidades particulares, 6,6'-dimicolato de trehalosa está dentro de un solvente no polar. En modalidades más particulares, el adyuvante comprende 6,6'-dimicolato de trehalosa disuelto en un sistema de solvente de cloroformo. En modalidades particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 65-95% volumen/volumen de cloroformo. En modalidades más particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 80-95% volumen/volumen de cloroformo. En modalidades particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 5.0-30% volumen/volumen de metanol. En modalidades más particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 7.5-15% volumen/volumen de metanol. En modalidades particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 0.5 -5.0% volumen/volumen de agua. En modalidades más particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 0.75 -2.5% volumen/volumen de agua. En ciertas modalidades, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 90% de cloroformo: 10% de metanol: 1.0% de agua volumen a volumen, respectivamente. En modalidades particulares, la vacuna y/o composición inmunogénica comprende una E. canis asociada a células inactivadas con formalina que crecen en células depositadas que tienen el acceso a ATCC No. PTA-10545 y un adyuvante que comprende 6,6'-dimicolato de trehalosa disuelto en 90:10:1 de cloroformo:metanol:agua. Una composición que comprende un Chord Factor, tal como 6,6'-dimicolato de trehalosa, disuelto en un sistema de solvente de cloroformo es también parte de la presente invención, ya que se usa como un adyuvante.

Además, la presente invención provee bacterias E. canis que crecen en células y/o líneas de células que son particularmente adecuadas para su crecimiento. La presente invención además provee procedimientos para producir un antígeno para una vacuna y/o composición inmunogénica de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención provee procedimientos para producir antígenos de E. canis. En modalidades particulares, la E. canis se hace crecer en un macrófago. En ciertas modalidades, las bacterias £. canis se hacen crecer en una linea de células similar a macrófago. En ciertas modalidades E. canis se hace crecer en células de médula ósea de perro (DBM) para producir un antígeno de E. canis asociado a células. En modalidades particulares, las bacterias E. canis se hacen crecer en una linea de células de DBM. En modalidades particulares, esa línea de células de DBM es DBM (WCS) MCS+12, acceso a ATCC No. PTA-10545. En modalidades particulares, la E. canis está asociada a células, WS MS+3, 19517-001 , acceso a ATCC No. PTA 10546. En modalidades alternativas, E canis se hacen crecer en una línea de células de DH-82.

Un antígeno de E. canis de la presente invención puede ser una E. canis inactivada. En modalidades particulares, el antígeno de E. canis es una bacterina. En ciertas modalidades, el antígeno de E. canis inactivado está asociado a células.

La presente invención también provee métodos de inmunización de un sujeto contra E. canis. Dichos métodos pueden incluir administrar a un sujeto una composición de vacuna y/o una composición inmunogénica de la presente invención. Ciertas modalidades comprenden administrar una vacuna y/o composición inmunogénica de conformidad con la invención al sujeto por vía intradérmica. Otro método de este tipo comprende administrar una vacuna y/o composición inmunogénica de conformidad con la invención al sujeto por vía subcutánea. Otro método más de este tipo comprende administrar una vacuna y/o composición inmunogénica de conformidad con la invención al sujeto por vía oral. En modalidades particulares de este tipo, el sujeto animal es un canino. En otra modalidad, el sujeto animal es un felino (v.gr., un gato doméstico). En modalidades particulares, una segunda dosis de la composición de vacuna y/o composición inmunogénica se provee como un refuerzo. En ciertas modalidades, el refuerzo se administra aproximadamente 21 días después de la dosis inicial de la composición de vacuna.

La presente invención además provee un método para hacer las composiciones de vacuna y/o composiciones inmunogénicas de la presente invención. En ciertas modalidades, la presente invención provee un procedimiento para producir un antígeno de E. canis como se describe en la presente. Las composiciones de vacuna y/o composiciones inmunogénicas se preparan mezclando un antígeno de la presente invención con un excipiente adecuado para uso veterinario. En ciertas modalidades de este tipo, el antígeno es una bacterina de E. canis asociada a células. En modalidades particulares, el excipiente adecuado para uso veterinario es un adyuvante de Cord Factor disuelto en un sistema de solvente de cloroformo.

Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán mejor por referencia a los dibujos, descripción detallada y ejemplos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación gráfica de la media de los conteos de glóbulos blancos después del desafío contra el tiempo de animales de control (triángulos) y de animales vacunados (cuadros). La línea gruesa indica el nivel mínimo de conteo de glóbulos blancos considerado normal de conformidad con el Merck Manual (Manual de Merck).

La figura 2 es una representación gráfica de la media de los conteos de glóbulos rojos después del desafío contra el tiempo de animales de control (triángulos) y de animales vacunados (cuadros). La línea gruesa indica el nivel mínimo de conteos de glóbulos rojos considerado normal de conformidad con el Merck Manual.

La figura 3 es una representación gráfica de la media de los valores de hemoglobina después del desafío contra el tiempo de animales de control (triángulos) y de animales vacunados (cuadros). La línea gruesa indica el nivel mínimo de conteo de hemoglobina considerado normal de conformidad con el Merck Manual.

La figura 4 es una representación gráfica de la media de los valores de hematocrito después del desafío contra el tiempo de animales de control (triángulos) y de animales vacunados (cuadros). La línea gruesa indica el nivel mínimo de conteo de hematocrito considerado normal de conformidad con el Merck Manual.

La figura 5 es una representación gráfica de la media de los valores de plaquetas después del desafío contra el tiempo de animales de control (triángulos) y de animales vacunados (cuadros). La línea gruesa indica el nivel mínimo de conteos de plaquetas considerado normal de conformidad con el Merck Manual.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones inmunogénicas y vacunas que pueden reducir la incidencia de trombocitopenia, leucopenia, anemia y pérdida de peso después de un desafío con una cepa virulenta de E. canis. Los resultados de la presente son inconsistentes con los informes publicados anteriormente con respecto a perros infectados, que habían sido curados por tratamiento con antibióticos, pero que fueron susceptibles a enfermedad subsiguiente [véase, v.gr., Breitschwerdt et ai, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(2) 362-368 (1998)]. Estos informes anteriores sugieren que la inmunidad protectora no se desarrolla después de la exposición al organismo. En contraste directo, la presente invención provee métodos para la mitigación y/o prevención de erliquiosis monocítica canina (CME) y/o pancitopenia canina tropical (TCP), en un sujeto al administrar al sujeto una composición inmunogénica y/o una composición de vacuna de la presente invención. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee una vacuna eficaz contra E. canis.

Como se describe en la presente, durante el desarrollo de un modelo de desafío de E. canis, los perros rápidamente desarrollan una humoral de anticuerpo humoral a E. canis. Correlacionada con la aparición del anticuerpo anti-E. canis está una caída rápida en conteo de plaquetas, o trombocitopenia, y el inicio de algunas otras indicaciones clínicas. Sin embargo, las vacunas que inducen fuertes respuestas de anticuerpo humorales en perros no los protegen contra signos clínicos de enfermedad. De hecho, los perros vacunados que producen una fuerte respuesta de anticuerpo a E. canis pueden tener resultados clínicos peores que sus contrapartes no vacunadas después del desafío. Sin estar limitado por alguna teoría en particular, los resultados descritos aquí parecen consistentes con E. canis usando los anticuerpos producidos contra el mismo para obtener acceso al interior de las células a través del proceso de opsonización.

La presente invención además provee procedimientos para producir un antígeno para una composición inmunogénica y/o vacuna misma. En modalidades particulares, el procedimiento comprende hacer crecer E. canis en una línea de células particular para producir el antígeno. En algunas modalidades, el antígeno se mezcla con un excipiente adecuado para uso veterinario. En modalidades más particulares, la presente invención incluye una composición que comprende un crecimiento de E. canis inactivado en una línea de células de médula ósea de perro. Las composiciones inmunogénicas y/o vacunas de la presente invención además pueden incluir un adyuvante.

Aunque el mecanismo selectivo para el cual E. canis discrimina qué células infectar es poco entendido, las células adecuadas para infección comúnmente expresan los receptores de antígeno de clase II del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). Harris et al. [Vet. Immunol. Immunopathol., 96:239-243 (2003)] ha demostrado que E. canis posee un mecanismo para regular descendentemente la expresión de receptores de clase II de MHC sobre la superficie de células que infecta como un posible mecanismo para evitar inmunovigilancia. Aunque está claro que las líneas de células derivadas de especies de garrapatas no expresan receptores de clase II de MHC de mamífero, Singu et al. [Cellular Microbiology, 8(9), 1475-1487 (2006)] han demostrado que E. canis altera su expresión de proteína de superficie dependiendo de si está infectando a un hospedero vertebrado o invertebrado. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención provee células y/o líneas de células que acomodan el crecimiento de E. canis, mientras que al mismo tiempo producen un antígeno de E. canis que ha sido optimizado para uso de vacuna.

Como se usa en la presente, "sujeto" se refiere a cualquier especie que puede ser infectada por E. canis. En ciertas modalidades, el sujeto es un sujeto animal no humano. En modalidades particulares, el sujeto es ya sea un canino o un felino. En ciertas modalidades, el sujeto animal es un canino. En otras modalidades, el sujeto animal es un felino.

Como se usa en la presente, el término, "canino" incluye todos los perros domésticos, Canis lupus familiaris o Canis familiaris, a menos que se indique otra cosa.

Una "cantidad inmunizante efectiva", como se usa en la presente, puede variar dependiendo de la cepa o cepas de E. canis usadas para generar la vacuna y puede ser cualquier cantidad suficiente para producir una respuesta inmunológica protectora.

Aunque, como se usa en la presente, una "respuesta inmunológica protectora" puede ser una respuesta inmunológica en un sujeto que conduce a protección contra una o más indicaciones de infección, una "respuesta inmunológica protectora" no requiere protección completa contra cualquier indicación de infección. Más bien, una "respuesta inmunológica protectora" puede ser una respuesta inmunológica que sea suficiente de tal manera que, después del desafío, los síntomas de la infección subyacente son por lo menos reducidos, y/o que una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicos o bioquímicos subyacentes que ocasionan los síntomas son reducidos y/o eliminados. Se entiende que "reducido", como se usa en este contexto, significa relativo al estado de la infección, incluyendo el estado molecular de la infección, no sólo el estado fisiológico de la infección. Se pretende que las vacunas de la presente invención provean una respuesta inmunológica protectora.

Como se usa en la presente, "producir una respuesta humoral mínima" significa que la administración de la composición de vacuna que comprende E. canis en una vacunación primaria a un sujeto {v.gr. , un canino) no da por resultado la detección de anticuerpos para E. canis en sueros de prueba obtenidos del sujeto 21 días después de una exposición primaria a la composición de vacuna, cuando esa detección es realizada por el siguiente procedimiento: exponer una dilución 1 :40 de los sueros de prueba a E. canis fijada, lavar lo suficiente para remover todo el material no unido, añadir un anticuerpo anti-lgG apropiado fluorescentemente marcado a la especies del sujeto, lavar lo suficiente para remover todo el material no unido, y después inspeccionar visualmente para fluorescencia debido a los anticuerpos anti-lgG fluorescentemente marcados unidos a E. canis fijada por medio de anticuerpos específicos para E. canis. En modalidades particulares, la administración al sujeto de un solo refuerzo subsiguiente de la vacuna sin embargo no produce una respuesta humoral significativa contra E. canis y requiere una dilución de 1 : 160 o menos de los sueros probados obtenidos del sujeto animal después de la exposición a la composición de vacuna de refuerzo para detectar anticuerpos para E. canis en los sueros de prueba, si acaso son detectables, cuando se determina por el método realizado para la vacuna primaria anterior.

Como se usa en la presente, el término linea de células "establemente infectada" se refiere a una línea de células que se mantiene infectada por lo menos en los 10 pasajes del cultivo de células.

Antíqenos Los antígenos de E. canis de la presente invención se pueden aislar de cualquier número de fuentes o cepas de E. canis. Ejemplos de dichas cepas de E. canis incluyen, pero no se limitan a, Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 61 1 , Kogashima 1 , Louisiana, Oklahoma, Venzuela, cepa Jake de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (NCSU), y aislados de NCSU Demon, D J, y Fuzzy. En ciertas modalidades, el antígeno puede ser una bacterina de E. canis. En modalidades adicionales, el antígeno puede ser aislado o derivado de bacterias de E. canis que han sido inactivadas por cualquier método adecuado disponible. Ejemplos de dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con calor, formaldehído, formalina, bi-etilenamina, radiación y beta-propiolactona. En modalidades particulares, la bacteria E. canis puede ser inactivada mediante tratamiento con formalina.

En modalidades particulares, el antígeno de E. canis puede comprender uno o más antígenos que no serán reconocidos como extraños por un sujeto cuando uno o más antígenos se proveen a un sujeto, es decir, el sujeto no montará una respuesta humoral o montará una respuesta humoral mínima a uno o más antígenos. En algunas modalidades, uno o más antígenos de E. canis no provocarán la producción de anticuerpos, o alternativamente, provocarán la producción mínima de anticuerpos contra uno o más antígenos de E. canis. Además, dichos antígenos de E. canis provocarán una respuesta inmunológica protectora contra uno o más antígenos de E. canis. La presente invención incluye una composición inmunogénica para vacunar a un canino contra erliquiosis del tipo que comprende un agente que conduce a una respuesta inmunológica en el canino, utilizando, como un agente, uno que produce poca a nada de respuesta inmunológica humoral en el canino, pero produce una respuesta inmunológica protectora en el canino. En modalidades particulares, esta respuesta inmunológica protectora se debe por lo menos en parte a una respuesta inmunológica mediada por células.

Células Bacterias E. canis de la presente invención se pueden hacer crecer en una célula y/o línea de células apropiada. Por consiguiente, un antígeno de E. canis puede ser producido a partir de bacterias E. canis que crecen en o propagadas en una linea celular. Ejemplos de dichas células y lineas de células incluyen células primarias (v.gr. , macrófago) y/o lineas celulares/líneas de células continuas tales como aquellas listadas más adelante: Líneas de células primarias: • Macrófagos de sangre de canino, véase, v.gr., [Nyindo, et. al. Am. J. Vet. Res. 32:1651-1658 (1971 )].

· Macrófagos perifonéales, véase, v.gr., [Stephenson y Osterman, Am. J. Vet. Res. 38:1815-1819 (1977)].

Lineas de células continuas: • Línea celular híbrida de humano/perro, [véase, v.gr., Stephenson y Osterman, Am. J. Vet. Res. 41 :234-240 (1980)].

• Línea de células de macrófago de canino (DH-82), [véase, v.gr., Dawson, ef. al., J. Infecí Dis. 163:564-567 (1991 )].

• Macrófago peritoneal de ratón; línea celular híbrida de ratón/perro (MDH-SP), [véase, v.gr., Holland y Ristic, Abstr 55, p. 89, en el Programa y Resúmenes del IV Simposio Internacional sobre Rickettsias y Enfermedades Rickettsiales, Piestany Spa, Repúblicas Federales Checa y Eslovaca].

· Línea de células de macrófago de ratón, [véase, v.gr., Keysary, et. Al., J VEt Diagn Invest 13:521-523 (2001)].

• Línea de células de médula ósea de perro (células DBM), [véase, v.gr., Gaunt et. al. J. Clin Micro. 34 (6):1429-1432 (1996)].

• Línea de células de fibroblastos embrionarios de felino (FEF), [véase, v.gr., Battles ef. al., WO 2009/036177 A1].

• Líneas de células de garrapatas (IDE8 e ISE6), [véase, v.gr., Munderloh, et. al. U.S. 5,869,335].

En un aspecto de la invención, la línea de células es una línea de células similares a macrófago, que expresa receptores de superficie similares a aquellos expresados por macrófagos de canino. En modalidades relacionadas, la línea de células es una línea de células de macrófago. En modalidades particulares de este tipo, la línea de células utilizada es la línea de células DH-82, que tiene el acceso a ATCC No. CRL-10389.

La presente invención incluye E. canis que ha sido crecida en una línea de células de mamífero monociticas o de tipo macrófago. En ciertos casos, estas líneas de células han sido inmortalizadas para proveer un sustrato de crecimiento continuo y confiable para la fabricación de vacunas. Las células inmortalizadas se pueden crear a partir de células progenitoras neoplásicas tales como la línea de células DH-82 descritas por Wellman et al. [In Vitro Cell Develop Biol 24:223-228, (1988)]. Las células pueden ser inmortalizadas mediante el uso de genes virales. Se ha mostrado que el antígeno T de virus de simio 40 (SV40) es una forma muy confiable de crear células inmortalizadas e híbridos de células somáticas de macrófagos peritoneales caninos hibridados con células humanas transformadas con SV40 se usaron para hacer crecer E. canis de una manera continua por Stephenson et al. [Am J Vet Res 41 (2):234-40, (1980)]. Se puede usar una amplia gama de agentes para inmortalizar células incluyendo diferentes virus, rayos x, solventes orgánicos, compuestos de metal y ácidos nucleicos. Estos métodos han sido extensamente revisados por Rhim [Annals NY Acad of Sci. 919:16-25 (2000)]. En ciertas modalidades de la presente invención, E. canis se hace crecer en dichas líneas de células y después es inactivada para formar un antígeno de bacterina de E. canis.

En ciertas modalidades, la línea de células es una línea de células de médula ósea de perro (DBM). En modalidades particulares, la línea de células de DBM es aquella descrita por Gaunt et al. [J. Clin. Microbio. 34 (6): 1429-1432, (1996)]. En modalidades particulares, la línea de células de DBM es la cepa depositada con acceso a ATCC No. PTA-10545. En ciertas modalidades, esa línea de células es una línea de células de DBM que es establemente infectada con E. canis. En una modalidad particular de este tipo, la E. canis asociada a células es depositada y tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546. En modalidades alternativas, la línea de células es una línea de células de insecto. En modalidades particulares de este tipo, la línea de células de insecto es una línea de células de garrapata. En una modalidad particular, esa línea de células de insecto es la línea de células de garrapata IDE8, aislada de Ixodes scapularis, que es depositada en el ATCC y tiene el acceso a ATCC No. CRL- 973.

Propagación de E. canis Un cultivo de células infectado con E. canis se puede hacer crecer en matraces, y subsiguientemente pasar a matraces más grandes para obtener volúmenes más grandes de material requerido para hacer composiciones inmunogénicas y/o vacunas. Alternativamente, el cultivo de células infectado se puede hacer pasar de los matraces a botellas rodantes, matraces giratorios, cubos de células, biorreactores subsiguientes o cualquier aparato capaz de hacer crecer el cultivo de células a gran escala a fin de producir una cantidad adecuada de material requerido para mezclar una composición inmunogénica y/o una vacuna. Los cultivos infectados pueden ser congelados en un medio adecuado y usados para infección de un cultivo de células posteriormente.

Las células se pueden adherir y fijar al matraz o aparato de crecimiento, incluyendo unirse a microportadores, o alternativamente flotar en suspensión. Los métodos para remover células adherentes incluyen, pero no se limitan a, raspar manualmente del matraz usando raspadores de células mecánicos o tratando con una solución de tripsina para removerlas del matraz y subsiguientemente neutralizar la tripsina no usada con una solución de proteína. Las células después se centrifugan y se concentran y resuspenden en un medio de congelamiento adecuado. Los medios de congelamiento incluyen, pero no se limitan a, medios que contienen 10-99% de suero de ternera fetal y 1-20% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Se pueden usar otros crioconservadores adecuados que pueden ser más adecuados para las diferentes líneas de células y dar por resultado un alto nivel de viabilidad después del descongelamiento y reinicio del cultivo.

Para iniciar un cultivo infectado, las células no infectadas pueden ser removidas del congelador y cultivadas en un medio adecuado. Por ejemplo, un frasco de 1 mL que contiene 1 x 105 células DBM es rápidamente descongelado y colocado en un matraz de cultivo de tejido T-75 (área de superficie de 75 cm2) que contiene un medio adecuado para crecimiento de células DBM. En una modalidad particular, el medio es medio de crecimiento completo de Fischer. Un litro de medio de crecimiento completo de Fischer para células DBM, por ejemplo, se hace añadiendo 200 mL de suero de caballo a 770 mL de medio de Fischer. El medio es completado añadiendo 10 mL de una solución de hidrocortisona de 2 mg/mL, 10 mL de una solución de glutamina 200 mM y 10 mL de una solución HEPES 1 M.

Una vez que un cultivo de DBM alcanza un nivel de confluencia adecuado (10-90%), el cultivo está listo para ser infectado. Un frasco de cultivo infectado es removido del congelador, rápidamente descongelado y puesto en el cultivo de crecimiento. El cultivo se hace crecer a 36 ± 2°C en matraces tapados o ventilados con o sin complementación de CO2. El cultivo se mantiene de conformidad con métodos conocidos por un experto en la técnica haciendo pasar las células en un medio fresco según se requiera. Después de varias semanas, el cultivo puede ser verificado para el nivel de infección por microscopía de fluorescencia indirecta usando anticuerpos anti-E. canis u otros métodos adecuados. Los cultivos pueden alcanzar un nivel de infección de 90% o más. Un nivel más alto de infección es más deseable ya que da por resultado un rendimiento más alto de material antigénico por volumen de cultivo. El cultivo infectado se puede hacer pasar a volúmenes más grandes de cultivo por movimiento del cultivo a matraces más grandes, botellas rodantes u otros recipientes de cultivo adecuado.

La infección del cultivo de células por E. canis se puede determinar por varios métodos incluyendo, pero sin limitarse a análisis microscópico de células teñidas con colorantes tales como colorante de Gimesa, colorante de Carneo Difquick o anaranjado de acridina. Además, los anticuerpos específicos para E. canis pueden ser ya sea directamente o indirectamente marcados con marcadores fluorescentes y vistos con un microscopio de luz fluorescente y a longitudes de onda adecuados para el marcador fluorescente particular. Se pueden usar otras técnicas para determinar el nivel de infección del cultivo incluyendo, pero sin limitarse a, reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) o PCR.

Las células no infectadas se pueden añadir al cultivo según sea necesario para mantener un cierto nivel de infección en el cultivo. Cuando un volumen adecuado de cultivo infectado es alcanzado, el cultivo puede ser inactivado por una variedad de métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos térmicos o químicos. Antes de la inactivación, el cultivo puede ser titulado para determinar la cantidad de partículas infecciosas en el cultivo como un método de determinación de cuánto cultivo post-inactivado añadir a la mezcla. Un método para titular un cultivo infectado es provisto en los siguientes ejemplos. En ciertas modalidades, se añade formalina al cultivo a una concentración final de 0.05% y el cultivo se mezcla durante 3 días a 36 ± 2°C. Otros de esos inactivadores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: etileniminas (El, BEI), beta propiolactona y fenol. También se pueden usar antibióticos para inactivar el cultivo, tales como desoxiciclina o cualquier otro antibiótico al que E. canis es sensible.

El cultivo se puede probar por cualquier número de métodos para determinar viabilidad. Dichos método incluyen pero no se limitan a retrotitulación en cultivo de células, integridad de membrana para resistir colorantes no permeables e inyección en perros y monitorear para signos típicos de infección.

Una vez inactivado, el cultivo se puede concentrar por cualquiera de un número de métodos. Por ejemplo, la concentración de la E. canis no viable se puede hacer por centrifugación, ultrafiltración o evaporación. En una modalidad particular, las células DBM que son infectadas con E. canis son inactivadas y después centrifugadas a 1400 x g durante 15 minutos para comprimir las células enteras. El sobrenadante es retirado y la pastilla de células es resuspendida en medio de Fischer sin suero. Se puede añadir gentamicina, o un conservador similar, para evitar problemas de contaminación. El cultivo es resuspendido en medio de Fischer sin suero a una decima del volumen original a fin de concentrar el cultivo inactivado y hacerlo más difícil de manejar. La cantidad de antígeno disponible en el concentrado inactivado puede ser determinado por cualquier número de métodos incluyendo cromatografía, espectroscopia o varios tipos de inmunoensayos específicos. El antígeno volumétrico se puede mezclar con diluyentes y un adyuvante para hacer una vacuna aceptable.

Composiciones inmunogénicas y vacunas Como se indicó anteriormente, las composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden un antígeno de la presente invención (v.gr., una bacterina de E. canis) además pueden incluir, pero no necesariamente uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de adyuvantes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica, v.gr., REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa) y GOODMAN AND GILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (10a ed. 2001 ). En modalidades particulares, el adyuvante puede ser uno que estimule una respuesta inmunológica mediada por células, pero que no estimule una respuesta inmunológica humoral.

Las composiciones inmunológicas y/o vacunas de la presente invención que además comprenden un adyuvante pueden comprender uno o más elementos no generalmente solubles en agua. En modalidades particulares, el adyuvante es un soluto no polar disuelto en un solvente no polar. Ejemplos de solventes no polares incluyen, pero no se limitan a hexano, benceno, tolueno, éter dietílico, cloroformo y acetato de etilo. En dicha modalidad, el solvente es un sistema de solvente de cloroformo. El cloroformo puede ser preferido en algunos casos ya que es no inflamable y más adecuado para fabricar productos biológicos veterinarios. Un adyuvante ilustrado aquí es 6,6'-dimicolato de trehalosa en sistema de solvente de cloroformo.

Los solventes no polares son típicamente no solubles en agua y por lo tanto el uso de solvente polar con una constante dieléctrica relativamente baja, pero con buena solubilidad en agua, se puede usar en el sistema de solvente para incrementar la solubilidad de la mezcla de adyuvante en una solución acuosa. Ejemplos de solventes polares incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, isopropanol, sulfóxido de dimetilo y dimetilformamida. En ciertas modalidades, el adyuvante no polar es Cord Factor [v.gr., 6,6'-dimicolato de trehalosa]. Otros adyuvantes no polares pueden ser útiles para estimular la inmunidad mediada por células incluyendo, pero sin limitarse a, fracciones hidrofóbicas de saponinas purificadas, lipopéptido bacteriano (Pam3CSI<4) y lípido monofosforílico A. En modalidades particulares, el Cord Factor se disuelve en un sistema de solvente de cloroformo. En modalidades particulares, el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 65-95% volumen/volumen de cloroformo.

Por consiguiente, ciertas modalidades de sistemas de solvente de cloroformo incluyen, pero no se limitan a, sistemas de solvente que comprende cloroformo y metanol. En un ejemplo no limitante, el sistema de solvente de cloroformo puede comprender aproximadamente 70% a 95% de cloroformo y/o aproximadamente 5% a 30% volumen/volumen de metanol. En ciertas modalidades de este tipo, el sistema de solvente de cloroforma además comprende 0.5-5.0% volumen/volumen de agua. En un ejemplo no limitante, el sistema de solvente de cloroformo puede comprender 90 partes de cloroformo en volumen, 10 partes de metanol en volumen, una parte de agua en volumen [es decir, aproximadamente 90% de cloroformo: 10% de metanol: 1.0% volumen a volumen de agua, respectivamente]. En modalidades particulares, el adyuvante puede comprender Cord Factor y/u otros adyuvantes disueltos en un sistema de solvente de cloroformo. En dicha variedad, el adyuvante es 6,6'-dimicolato de trehalosa, que se disuelve en el sistema de solvente de cloroformo: 90 ml_ de cloroformo: 10 mL de metanol: 1 mL de agua.

En modalidades particulares, la composición de vacuna puede comprender uno o más vehículos de diluyentes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables. Ejemplos no limitantes de vehículos o diluyentes que se pueden usar en formulaciones de composición de vacuna incluyen agua, soluciones de glucosa, dextrosa/solución salina, solución salina, solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS), regulador de pH de HEPES, medio de Fischer, solución de Hank y solución de Ringer. Dichas formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para incrementar la estabilidad, el suministro o solubilidad, tales como agentes reguladores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Los aditivos también pueden incluir ingredientes activos adicionales tales como agentes bactericidas o estabilizadores. Por ejemplo, la solución puede contener timerosal, gentamicina, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán u oleato de tetranolamina. Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización conocidas, convencionales.

En ciertas modalidades, se contempla que la composición de vacuna puede comprender además otros componentes activos tales como, pero sin limitarse a un componente anti-patogénico, dirigido contra, o un componente antigénico, y/o atenuado y/o aislado atenuado y/o muerto de: virus de la rabia, enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferí), virus de moquillo canino, bórdetela de canino, parvovirus de canino, adenovirus de canino, coronavirus de canino, Babesia canis, Anaplasma phagocytophilum, Giardia; leptospira interrogans tales como las serovariedades canicola, icterohaemorrhagiae, Pomona, grippotyphosa o bratislava o similares, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas modalidades, la composición de vacuna y/o inmunogénicas se puede formular en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y asegurar la uniformidad de dosis. Aquí, una dosis unitaria que pertenece a la composición de vacuna se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para un sujeto, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de antígeno de E. canis calculada para producir el efecto inmunogénico deseado en asociación con un adyuvante, portador y/o vehículo. En ciertas modalidades, la composición inmunogénica y/o vacuna es liofilizada.

En ciertas modalidades, la composición de vacuna y/o inmunogénica se puede administrar por vía parenteral, por ejemplo por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intradérmica o similar, o la composición inmunogénica y/o vacuna se puede administrar oralmente o intranasalmente en cantidades efectivas de conformidad con un programa determinado por el tiempo de exposición potencial a un portador de E. canis. De esta manera, el sujeto tratado puede tener tiempo para construir inmunidad antes de la exposición natural. Por ejemplo, un programa de tratamiento típico puede incluir inyección subcutánea por lo menos 42 días antes de la exposición potencial. En modalidades, más de una administración de la composición de vacuna se puede proveer a un sujeto. A manera de ejemplo no limitante, una primera administración a aproximadamente 42 días y una segunda a aproximadamente 21 días antes de la exposición potencial del sujeto. Sin embargo, el inicio de inmunidad podría ocurrir en un curso de tiempo más rápido.

Administración de vacunas Las vacunas de la presente invención se puede administrar como un líquido, emulsión, polvo seco, incluyendo como un polvo liofilizado, y/o una niebla a través de cualquier vía parenteral, vía intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, por escarificación, subcutánea, intramuscular o inoculada por una vía mucosa, v.gr., oral, intranasal, como un aerosol, por gotas para los ojos, por administración in ovo o implantada como un polvo seco congelado.

Depósito de ATCC Un cultivo del siguiente material biológico ha sido depositado en el siguiente depósito internacional por: Board of Supervisors Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College and LSU Agricultural Center, 104 Efferson Hall Baton Rouge, Louisiana, 70803 Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209, E.U.A. bajo condiciones que satisfacen los requerimientos del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional de los Depósitos de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patentes.

Organismo Acceso a ATCC No. Fecha del depósito Células de médula ósea de perro PTA-10545 22 de diciembre de 2009 E. canis asociada a células PTA-10546 22 de diciembre de 2009 La presente invención se puede entender mejor por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proveen como ilustrativos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar en forma más completa las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben considerarse como limitantes del amplio alcance de la invención EJEMPLOS EJEMPLO 1 CUADRO 1 Composición de vacuna EJEMPLO 2 Diseño y resultados del estudio: CUADRO 2 Descripción del animal de prueba Alojamiento y cría de animales Aclimatación/acondicionamiento: los animales se tomaron de un acervo preexistente y por lo tanto no fueron necesarios tratamientos o acondicionamientos. Los animales fueron aclimatados por lo menos durante 7 días antes del inicio del estudio. Todos los animales fueron sometidos a buenas prácticas de crianza a través del estudio y el procedimiento de rutina fue estandarizado en todos los animales.

Alojamiento: los perros fueron alojados en grupos aleatoriamente en corrales (4-5 perros por corral) sin considerar grupos de tratamiento.

Dieta: se proveyó agua ad libitum a todos los animales. La alimentación cumplió los requerimientos nutricionales mínimos para animales de esta edad y cumplió con los procedimientos estándares.

CUADRO 3 Asignaciones de grupo de tratamiento Distribución aleatoria: los perros fueron categorizados por generación de número aleatorio dentro del bloque y después distribuidos con la ID de grupo enlazada. El número aleatorio más bajo dentro de los bloques fue asignado al grupo 1 y los números aleatorios más altos fueron asignados al grupo 2. Como la pérdida de peso es uno de los signos clínicos asociados con infección de E. canis, los perros también fueron bloqueados por peso durante la distribución aleatoria.

Desconocimiento en el estudio: el personal que realizó pruebas de muestra de laboratorio, realizando observaciones diarias de los animales, evaluaciones clínicas y que realizaron observaciones de necropsia desconocían las asignaciones de grupo de tratamiento hasta completarse el estudio.

Procedimientos experimentales Monitoreo de pre-vacunación/aclimatación: Muestras: se recolectaron muestras de sangre en tubos de separación de suero el día 0 del estudio antes de una primera vacunación para análisis de título de anticuerpo.

Examen físico: todos los animales recibieron un examen físico el día 3 en la instalación de prueba por el veterinario y se encontró que estaban sanos y eran adecuados para el estudio.

Observaciones diarias: durante el período de aclimatación, todos los animales fueron observados cada día por el personal de cuidados de animales.

Observaciones clínicas: signos clínicos y temperaturas rectales fueron registrados el día 0 y 21 antes de la vacunación.

Vacunación: Administración de producto biológico: la vacuna se administró por vía subcutánea, en una dosis de 1.0 mL a cada animal los días 0 y 21 usando una jeringa de 3 mL y una aguja de calibre 23 por 2.54 cm. Todas las vacunas se mantuvieron sobre hielo húmedo durante el transporte a una instalación de animales y durante la administración de la vacuna. La administración subcutánea se realizó en la región supraescapular derecha para la primera dosis y la región supraescapular izquierda para la segunda dosis.

Procedimientos de post vacunación: Reacciones del sitio de inyección: se registraron observaciones del sitio de inyección durante 7 días después de cada vacunación.

Observaciones diarias: todos los animales fueron observados diariamente durante el período de post vacunación por el personal de cuidados animales.

Serología: es día 21 se recolectaron muestras de sangre en tubos de separación de suero para análisis de título de anticuerpo.

Procedimientos de pre desafío Observaciones clínicas: signos clínicos y temperaturas rectales se tomaron los días 35, 39 y 42 (antes del desafío) del estudio para establecer valores de línea basal.

Muestras de sangre: el día 42 del estudio (antes del desafío) se recolectaron muestras de sangre en tubos de separación de suero para análisis de título de anticuerpo. Los días del estudio 35, 39 y 42 (antes del desafío) se recolectaron muestras de sangre en tubos de EDTA para CBCs de línea basal. El día 42 del estudio (antes del desafío) se recolectó sangre en tubos PAX Gene para análisis de PCR.

Los pesos corporales se registraron el día 42 del estudio (antes del desafío) para valores de línea basal.

Desafío: Material de desafío: dos frascos de material de desafío de E. canis (cultivo congelado a paso bajo pasado a perros) fueron removidos de nitrógeno líquido, descongelados rápidamente y diluidos 1 :100 (1 ml_ + 99 ml_) en medio de Fischer. El material de desafío diluido fue tapado, invertido para mezclarse y después 1 ml_ fue removido por titulación. El frasco fue sellado con una tapa de aluminio, marcada y colocada sobre hielo en un contenedor secundario a prueba de derrame para transportar a la unidad de animal.

Administración de desafío: el día 42 todos los perros fueron desafiados subcutáneamente con 2.0 ml_ de material de desafío diluido.

Confirmación de desafío/retro-titulación: una muestra del material de desafío diluido fue recolectada y usada para titulación intermedia el día de desafío en las placas de cultivo de tejido de 24 pozos.

Monitoreo de post-desafio Pesos corporales: los pesos corporales fueron registrados cada semana después del desafío.

Observaciones diarias: las observaciones de los animales fueron registradas diariamente después del desafío, excepto los días en que las observaciones clínicas y temperatura se realizaron, hasta el día 49 del estudio.

Observaciones clínicas: del día 49 del estudio hasta el final del estudio, signos clínicos (de presión, deshidratación, epistaxis y descarga nasal/ocular) se registraron diariamente y las temperaturas rectales se registraron dos veces a la semana.

Reacciones del sitio de inyección: se hicieron observaciones del sitio de inyección durante 7 días después del desafío.

Muestras de sangre: Sangre para CBCs: muestras de sangre (EDTA) se recolectaron dos veces por semana después de desafío para monitorear los perfiles de CBC.

Sangre para prueba de PGR: se recolectó sangre cada semana en tubos de PAX Gene para análisis de PCR.

Sangre para suero: se obtuvo sangre de los perros cada dos semanas después del desafío para serología.

Necropsia/disposición: todos los animales fueron humanamente sacrificados por inyección intravenosa de Beuthanasia antes de la necropsia.

Recolección y manejo de muestras: Sangre con EDTA para CBCs: se recolectó sangre por venipuntura de la vena yugular usando tubos evacuados que contenían EDTA de tripotasio. La sangre fue empacada en paquetes de hielo y procesada el mismo día para análisis de perfil de sangre.

Sangre SST para análisis de anticuerpo: se recolecto sangre por venipunción de la vena yugular usando tubos evacuados. La sangre fue centrifugada a 2500 RMP durante 10 minutos y el suero se marcó y se almacenó a -10°C o más frío.

Sangre para prueba de PCR: se recolectó sangre por venipunción de la vena yugular usando tubos de PAX Gene evacuados y se realizó análisis de PCR.

Métodos analíticos: Conteos de plaquetas: los conteos de plaquetas se determinaron por los procedimientos bien establecidos en la técnica.

Titulación de E. canis: Una muestra de retención de material de desafío diluido se probó. En resumen, se prepararon células de DBM en placas de 24 pozos a una concentración de 1.0 x 105 células por mL y se incubaron a 36 ± 2 grados Celsius durante 1 día antes de conducir la prueba. El medio se removió asépticamente de los cultivos de DBM de 1 día y se añadieron diluciones en serie de 10 veces del material de desafío, 1 mL por pozo, en cuatro pozos replicados de la placa de 24 pozos. Las placas se incubaron a 36 ± 2 grados Celsius durante 7 días. Después de 7 días, las placas fueron realimentadas con medio de crecimiento de Fischer seco, 1 mL por pozo y se regresaron a 36 ± 2 grados Celsius durante 7 días. A los 14 días de incubación, las placas se centrifugaron durante 10 minutos a 2000 RPM, el medio fue aspirado y los cultivos se fijaron con metanol al 100% (0.5 mL por pozo) durante 10 minutos. Una vez que las placas se secaron, 0.5 mL por pozo de anticuerpo monoclonal anti-E. canis de ratón (diluido 1 : 000 en 0.01 M PBS) se añadió y se incubó durante 30 minutos a 36 ± 2 grados Celsius. Las placas se lavaron 3 veces en 0.01 M PBS con un lavado final en agua. Después 0.5 mL por pozo de una IgG anti-ratón de cabra marcada (diluida 1.100 en 0.01 M PBS) se añadió y se incubó durante 30 minutos a 36 ± 2°C. Las placas se lavaron nuevamente y se observaron bajo un microscopio fluorescente. Los títulos se calcularon a 50% de puntosa finales usando el método de Spearman-Karber.

Serología: Una prueba de anticuerpo inmunofluorescente indirecta (IFA) se usó para la detección de anticuerpo anti-E. canis en suero de perro. En resumen 1 :20 diluciones iniciales de suero se prepararon en regulador de pH de dilución de suero. Muestras individuales se diluyeron a 1 :40, 1 :80, 1 :160 y 1 :320 y después se añadieron (10 µ? por dilución) a 12 portaobjetos de 12 pozos que contenían células de DBM infectadas con E. canis fijadas y se incubaron en una cámara humidificada durante 30 minutos a 36 ± 2 grados Celsius. Los portaobjetos se lavaron en 0.01 M PBS durante 10 minutos y 10 µ? de IgG anti-perro de cabra marcada con FITC (diluido 1 :100 en 0.01 M PBS) se añadieron a cada pozo en el portaobjetos. Los portaobjetos fueron colocados después en una cámara humidificada durante 30 minutos a 36 ± 2 grados Celsius, se lavaron en 0.01 M PBS durante 10 minutos y se leyeron por microscopía fluorescente. El título se determinó por la dilución más alta en donde la fluorescencia es visible.

PCR: se realizó PCR sobre las muestras de sangre por procedimientos bien establecidos en la técnica.

Prueba de inactivación: Se probó antígeno inactivado con formalina para verificar la inactivación competa. En resumen, células de DBM se prepararon en matraces de 150 cm2 un día antes de la incubación a 1.0 x 105 células por ml_ y 60 mL por matraz. 1.0 ml_ de cada muestra de prueba (incluyendo controles positivo y negativo) se inocularon en los matraces y se incubaron durante 8 días a 36 ± 2 grados Celsius. Dos pasajes ciegos se realizaron, cada pasaje recibiendo 10 mL del inoculo de pasaje previo. A 8 días del post-pasaje ciego 2, cada material de frasco se tiñó por inmunofluorescencia específica. La falta de fluorescencia en los cultivos es una indicación de inactivación completa.

Análisis de datos: Variables de resultado: la variable primaria para la determinación de eficacia de la formulación de vacuna se basó en la prevención de trombocitopenia severa en vacunas en comparación con controles. La pérdida en por ciento en peso, la calificación de necropsia total, valores de la sangre y signos clínicos se consideraron que soportan evidencia de protección.

Calificación de observaciones clínicas: los signos clínicos para cada perro fueron registrados y calificados diariamente durante un período de 12 semanas después del desafío.

Guia de evaluación clínica: al entrar al cuarto de aislamiento, se camina para evaluar la actitud de los animales. La calificación para depresión se puede determinar en muchos animales al caminar por primera vez. En seguida se procede con las observaciones clínicas. Después, se mide la temperatura corporal seguida por la obtención de muestras de sangre requeridas.

Muerte: 100 puntos (sin signos vitales, incluyendo perros que están moribundos y son sacrificados).

Depresión: ausente (actividad y comportamiento anormal) presente: letárgico, se echan cuando la persona está en el cuarto, y se rehusan a pararse.

Descarga nasal: normal (ausente); seria (moderada a severa), fluido claro, a menudo acuoso, bajando hasta la boca o por debajo de esta-ya sea a lo largo de los lados de la nariz o por abajo del surco nasolabial; mucopurulento (moderado a severo): mucopurulento no claro, a menudo descarga de color hasta la boca o por debajo de esta- ya sea a lo largo de los lados de la nariz o por debajo del surco nasolabial.

Descarga ocular: normal (ausente); seria (moderada a severa); fluido claro, a menudo acuoso, a mitad del camino hacia abajo por la nariz o en los bordes de los ojos encharcándose o mojando el pelo en la esquina interna o externa del ojo; mucopurulento (moderado a severo): mucopurulento, no claro, a menudo descarga de color a mitad de camino hacia abajo por la nariz o en los bordes de los ojos encharcándose o mojando el pelo en la esquina interna o externa del ojo.

Epistaxis: (sangrado de los nostrilos) normal (ausente); presente (sangrado de los nostrilos) Deshidratación: normal (ausente); presente: pliegues de la piel los hombros se pegan o se retraen en más de 3 segundos.

CUADRO 4 Sistema de calificación para signos clínicos específicos Cálculo de por ciento en pérdida de peso: cada perro se pesó antes del desafío para determinar un peso de línea basal. La pérdida de peso para cada perro se calculó cada semana después del desafío usando la siguiente fórmula: ((peso de línea basal-peso actual)/línea basal) x 100=% pérdida en peso.

Resultados y discusión Enfermedad concurrente: un perro (JWQ5, un control) había sido tratado durante el estudio. El perro desarrollo una úlcera en su ojo izquierdo y el parpado se hinchó y se cerró. Los antibióticos se evitaron para no afectar el estudio. La condición se descubrió el 13 de septiembre. En ese tiempo, el ojo de lavó a chorro con solución salina isotónica. El 15 de septiembre el perro recibió una inyección subcutánea de atropina, localmente: El 18 de septiembre, el perro fue observado por el veterinario de estar completamente recuperado. La condición probablemente fue causada por trauma (rasguño de otro perro) y no como resultado del producto de prueba de estudio o el desafío.

Prueba de pre-vacunación: los perros fueron seleccionados para la presencia de anticuerpos E. canis antes de la vacunación. Se encontró que todos los perros tenían un título de <40 cuando se probaron por prueba de anticuerpo inmunofluorescente (IFA) específica de E. canis (véase cuadros 5 y 19; día 42 es el día del desafío). Las observaciones clínicas y temperaturas rectales también se tomaron antes de la vacunación. Se encontró que todos los perros eran clínicamente normales.

CUADRO 5 Sumario de la serología media Prueba de post-vacunación: Ninguno de los perros vacunados se observó que tenían reacciones del sitio de inyección después de la vacunación. Todos los perros fueron observados diariamente para efectos adversos asociados con la vacuna después de ambas vacunaciones. Ninguno de los perros mostró signos clínicos adversos después de la vacunación.

Se tomaron muestras de sangre para serología el día 21 antes de la vacunación, inmediatamente antes de la segunda vacunación. Los títulos se midieron usando diluciones duplicadas de suero en portaobjetos de 12 pozos revestidos con células de DB infectadas con E. canis. Las diluciones empezaron a 1 :40. Ninguno de los perros en el grupo de vacuna mostró un título sobre el fondo de 1 :40 después de una sola dosis de vacüna (véase cuadro 5).

En día 42, inmediatamente antes del desafío, el desglose de los títulos de anticuerpo de E. canis de los perros vacunados fue el siguiente (cuadro 5): Títulos < 40: 0 perros Títulos = 80: 4 perros Títulos = 160: 3 perros Títulos > 320: 1 perro Todos los perros de control no vacunados siguieron siendo seronegativos (<1 :40) antes del desafío.

Desafío: todos los perros fueron desafiados el día 42 del estudio diluyendo el material del desafío descongelado 1 :100 en medio de Fischer y administrando 2 mL de desafío simultáneamente a cada perro. El material de desafío fue titulado en tiempo de administración a los perros y se encontró que tenían un título de 103 2TCID50 por dosis de 2 mL.

Evaluación clínica de post-desafío: Pérdida en peso asociada con desafío: los pesos corporales se registraron cada semana después del desafío. Los resultados se resumen en el cuadro 6.

CUADRO 6 Media de los pesos corporales (kg) después del desafío El por ciento de pérdida de peso más alta se vio en los perros de control con un medio de 16.97% de reducción en peso corporal a 7 semanas después del desafío. Ese también fue el punto en donde hubo la diferencia más grande entre los grupos de tratamiento ya que los perros vacunados solo experimentaron un 7.85% de caída en peso corporal. La pérdida de peso se examinó estadísticamente. La pérdida de peso severa se definió como >15% del peso corporal del perro. 87% (7/8) de los perros de control tuvieron pérdida de peso >15% de su peso corporal, comparado con 12% (1/8) de los perros vacunados. Esta pérdida es extremadamente significativa (p=0.0042).

Mortalidad: dos de ocho (25%) perros en el grupo de control fueron sacrificados debido a la severidad de los signos clínicos. Ninguno de los perros vacunados murió durante la prueba. La eutanasia fue una necesidad razonable del veterinario con base en los signos clínicos, pérdida de peso y valores de células sanguíneas y electrolitos. El veterinario que atendió a los perros no conocía la designación de grupo. La diferencia fue de soporte, pero no significativa debido al bajo número de perros en el estudio (p=0.2118).

Evaluación de conteo de sangre completa: también se tomaron muestras de sangre en el estudio los días 35, 39 y 42 para establecer valores de línea basal para glóbulos blancos y glóbulos rojos (WBC y RBC), hematocrito (HCT), hemoglobina (Hgb) y plaquetas. Todos los perros estuvieron en los intervalos normales para estas mediciones antes del desafío de acuerdo con Merck Veterinary Manual, octava edición [Merck and Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., E.U.A., (1998)].

Muestras de sangre recolectadas dos veces a la semana después del desafío. Los resultados de CBC incluyeron glóbulos blancos (WBC's), glóbulos rojos (RBC's), hemoglobina (Hgb), hematocrito (Hct o volumen de células empacadas) y plaquetas. Puesto que E. canis tienen un efecto drástico sobre los valores de sangre, se desarrollo un sistema de calificación que evaluaría la incidencia como "normal", anormal o clínicamente significativa (o severa). El cuadro 25 resume los valores usados en este estudio.

CUADRO 7 Resumen de resultados de muestras de sangre * Merck, Manual de Veterinaria Los valores clínicamente significativos (o severos) se calculan como aproximadamente 75% del extremo inferior de los intervalos normales para múltiples días. Los perros en este intervalo a menudo fueron observados como que tenían signos clínicos que pueden estar directamente correlacionados con la deficiencia de las células de la sangre relacionadas. Los valores anormales son cualquier valor debajo del nivel mínimo para el normal.

Plaquetas: conteos de plaquetas bajos son el signo clínico primario asociado con infecciones rickettsiales. Para este estudio, fue la variable primaria. E. canis es particularmente bueno en causar caídas muy severas en el número de plaquetas en perros afectados. Todos los ocho perros de control (100%) y los perros vacunados 5/8 (63%) desarrollaron trombocitopenia (conteo de plaquetas <200,000 µ??.). La figura 5 muestra la media de los conteos de plaquetas (controles vs. vacunados) después del desafío y el cuadro 12 provee un resumen de los datos. Los perros que hablan tenido conteos de plaquetas menores de 150,000 plaquetas/µ?-. de sangre para dos o más lecturas fueron considerados en la categoría severa y están en alto riesgo de sangrado bajo lesión. Los trabajadores de cuidados de animales podrían identificar fácilmente a estos perros a medida que la lesión asociada con sangrado por venipunción persiste durante una cantidad de tiempo considerable después de que se tomó la muestra. Para los perros de control, 6 de 8 (75%) tuvieron conteo de plaquetas en la categoría severa. Solo 2/8 (25%) de los perros vacunados tuvieron conteos de la categoría severa. Estadísticamente, esta diferencia no fue significativa (p=0.0768). Sin embargo, la mortalidad en por lo menos un perro de control registró los datos por que el perro murió temprano en el estudio ya que presentaba trombocitopenia severa. Si el perro no hubiera muerto, el estudio hubiera concluido que por lo menos 7/8 controles presentaron trombocitopenia severa. Puesto que la mortalidad es un signo clínico mucho más severo que la trombocitopenia, la variable primaria fue analizada de nuevo como trombocitopenia o mortalidad. Tomando en cuenta la mortalidad, la diferencia entre los controles y perros vacunados se hizo significativa (p=0.0213).

CUADRO 8 Resumen de resultados de plaquetas * Como se define por el Merck Manual como Trombocitopenia Glóbulos rojos: la figura 2 muestra la media de conteos de eritrocitos para el periodo de post-desafío. La figura 2 muestra que la media de los perros .de control estuvo por debajo de la normal para la mayor parte del período de ensayo, en donde la media de los perros vacunados permaneció en el intervalo normal para la mayor parte del período de ensayo. El cuadro 9 ilustra la severidad del desafío como 100% de los perros de control de acuerdo con la definición de anemia del Merck Manual y 63% progreso a categoría severa. Ninguno de los perros vacunados progresó a la categoría de anemia severa. Esta diferencia es muy significativa (p=0.0081).

CUADRO 9 Resumen de los resultados de glóbulos rojos * Como se define por el Merck Manual como anémico Glóbulos blancos: la figura 1 resume los resultados de los conteos de leucocitos para el período de post-desafío. La figura 1 muestra que una disminución severa en conteo de glóbulos blancos fue observada en los controles. Los datos se resumen mejor en el cuadro 10 en donde una diferencia marcada tanto para leucopenia leve como severa se observa en los perros. 38% de los perros en el grupo de control progreso a la categoría "severa" de leucopenia en donde ninguno de los perros vacunados lo hizo. Esta diferencia no es significativa (p=0.0822). El cuadro 10 y la figura 1 ilustran una diferencia entre las medias para los perros vacunados y los controles. La media de los controles cayó por abajo del nivel mínimo para el normal mientras que la medida de los perros vacunados no lo hizo. Esta tendencia siguiere que con más animales en cada grupo de estudio, la diferencia es probable que sea significativa.

CUADRO 10 Resumen de los resultados de glóbulos blancos * Como se define por el Merck Manual como leucopénico Valores de hemoglobina: la figura 3 resume los resultados de las mediciones de hemoglobina después del desafío. Consistente con otros parámetros de sangre, la figura 3 muestra que la media de los controles cayó muy por debajo de los valores mínimos para gran parte del período de post- desafío. La media del grupo de perros vacunados nunca estuvo por debajo de la normal. El cuadro 11 muestra que 100% de los perros de control tuvo valores de hemoglobina bajos, en donde solo 50% de los perros vacunados cayeron a este nivel. Ninguno de los perros vacunados progresó a la categoría severa para niveles de hemoglobina. Sin embargo, solo 25% de los controles progresó a la categoría severa y esta diferencia no fue significativa (p=0.2118).

CUADRO 11 Resumen de los resultados de la hemoglobina * Como se define por el Merck Manual como anémico Porcentajes de hematocrito: La figura 4 resume los resultados de los valores de hematocrito después del desafío. Como con las otras medidas de anemia, la figura 4 muestra que la media del control está muy por abajo de la normal para la última mitad del período de desafío, en donde la media del perro vacunado no está abajo de la normal. El cuadro 12 muestra que la vacunación de perros con el producto de prueba disminuyó la incidencia de anemia, como se midió por conteos de hematocrito, a la mitad. Sesenta y tres por ciento (5/8) de los perros de control progresaron a la categoría severa para hematocrito en donde sólo 1/8 de los perros en el grupo de perros vacunados (13%) tuvieron un valor severo. Esta diferencia fue muy cercana a la significación (p = 0.0534).

CUADRO 12 Resumen de resultados de hematocrito * Como se define por el Merck Manual como anémico Signos clínicos: Cada perro fue observado diariamente para signos clínicos indicativos de una infección seria. Los resultados se resumen en el cuadro 13. La calificación de signos clínicos se basó en observaciones hechas por personal que desconocía lo que se administraba observando a los perros por signos de depresión, descarga nasal, descarga ocular, epistaxis, deshidratación y muerte. Una calificación fue asignada a cada observación en relación con la severidad del signo clínico. La calificación total para el grupo de control fue 254 versus 28 para los animales vacunados. La media de la calificación para los controles versus los perros vacunados fue 32 y 4, respectivamente. A pesar de parecer muy indicativa de protección, la diferencia entre los grupos no fue significativa (p = 0.4364).

CUADRO 13 Resumen de calificaciones clínicas Temperaturas rectales: Las temperaturas rectales se tomaron y se registraron dos veces a la semana. Se consideró que los perros eran febriles si la temperatura rectal era >39.5 grados Celsius. Esto es consistente con el Manual del Veterinario de Merck (Merck Veterinary Manual), que lista el intervalo de temperatura normal como 38.9 ± 0.5 grados Celsius. Se sabe que E. canis causa espigas de temperatura en perros afectados. Observaciones de este estudio son consistentes con esto y se resumen en el cuadro 14. 87.5% (7/8) de los controles tuvieron espigas de fiebre en comparación con 50% (4/8) de los perros vacunados. Las espigas de fiebre se compararon estadísticamente para diferencias. Veinticinco por ciento (2/8) de los controles tuvieron fiebre durante más de dos días mientras que sólo 12.5% (1/8) de los perros vacunados lo hicieron. Esta diferencia no fue significativa (p = 0.6709).

CUADRO 14 Resumen de temperaturas rectales "Fiebre como se define a temperatura rectal= 39.5°C Reactividad del sitio de invección de desafío: Los perros fueron observados para reactividad en el sitio del desafío. Ninguno de los 16 perros en el grupo de perros vacunados o el grupo de control mostraron algún signo de reactividad en el sitio de administración de desafío.

Resultados de detección por PCR de E. canis en la sangre: Se tomaron muestras de sangre para análisis de PCR para determinar infección por E. canis inmediatamente antes del desafío. Los resultados de PCR se muestran en el cuadro 15. Como se esperaba, todos los perros se mantuvieron negativos para infección por E. canis antes del desafío. Los resultados para el análisis de PCR semanal de la sangre para infección por E. canis después del desafío están en el cuadro 15. Todos los perros de control fueron positivos para E. canis en la sangre a más de un punto en el tiempo. PCR nunca detectó E. canis en tres de los perros vacunados. Estos resultados coinciden exactamente con los resultados de las plaquetas ya que los mismos perros no desarrollaron trombocitopenia después del desafío. La diferencia entre controles y perros vacunados para un resultado positivo no fue significativa (p = 0.0822).

CUADRO 15 Porcentaje de animales infectados con E. canis después de desafío basado en PCR Semana Semana Semana Semana Semana Semana Semana Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 Serología después del desafío: La serología se realizó cada dos semanas después del desafío. La respuesta anti-E. canis de los resultados de la IFA se muestran en el cuadro 19. Los resultados de serología para los perros vacunados responde la pregunta de si los perros en este grupo que fueron negativos para PCR no habían desarrollado signos clínicos incluyendo trombocitopenia después del desafío fueron realmente expuestos a E. canis. En algún punto después del día 42 (día del desafío) los tres de estos perros tuvieron un aumento rápido en el título, indicando exposición al material de desafío. Un resumen de las medias para la serología se muestra en el cuadro 5. La importancia del título de anticuerpo para protección no está claro de este estudio. La serología parece ser un buen indicador de exposición a E. canis virulento.

Calificaciones de necropsia: Se realizaron necropsias en todos los perros en el tiempo de eutanasia y las personas que realizaron las necropsias desconocían lo que se les administró. Para la mayoría de los perros, esto fue en ocho semanas después del desafío. Para perros que habían sido sacrificados tempranamente, debido a signos clínicos severos, las necropsias se realizaron en cada tiempo de muerte. A los perros se les practicó necropsia y se les calificó inmediatamente después de ser sacrificados. La esplenomegalia es la observación que puede ser claramente asociada con infección de E. canis. El estado de vacunación parece tener un efecto sobre las observaciones de esplenomegalia (cuadro 16). Ninguno de los perros vacunados tuvo esplenomegalia en comparación con 38% (3/8) para los controles. La diferencia no fue significativa (0.0822). En perros que habían sido sacrificados antes del fin del ensayo de 8 semanas, el veterinario notó que hubo un hallazgo consistente de acumulación de fluido abdominal. Puesto que los niveles de albúmina en el suero bajos condujeron a un desequilibrio osmótico entre la circulación y los tejidos, la acumulación de fluido en la cavidad abdominal se puede producir. Para el resto del período de ensayo, se ordenaron paneles químicos para realizarse sobre las muestras de sangre quincenales siendo enviadas para prueba. Los resultados de estas pruebas para niveles de albúmina se resumen en el cuadro 17. La mitad de los controles (4/8) tuvieron una acumulación significativa de fluido en la cavidad abdominal observada en la necropsia. De los controles que tuvieron acumulación de fluido, 50% de ellos tuvo un valor severo de no más de 200 mi de fluido recuperado. Ninguno de los perros vacunados tuvo alguna acumulación de fluido (cuadro 16). Esta diferencia no fue significativa (p = 0.2118). Hubo una correlación interesante con los niveles de albúmina en el suero y conteo de plaquetas. Todos los perros que desarrollaron trombocitopenia tuvieron valores de albúmina por abajo de los normales. El estado de vacunación pareció efectuar claramente los niveles de albúmina en el suero con 6/8 controles (75%) cayendo por abajo de 75% del valor mínimo para concentración de albúmina en el suero en donde sólo 3/8 (25%) de los perros vacunados cayó a este nivel (cuadro 17).

CUADRO 16 Resumen de hallazgos de necropsia Apariencia Fluido Bazo Pul-mones Estó-mago Colon "Calificaexterna abdominal descención de dente necropsia total Por ciento de perros afectados 38% 50% 38% 13% 38% 0% 26 Por ciento de perros afectados vacunados 25% 0% 0% 13% 50% 38% 18 * Calificación de necropsia total para los 8 animales en cada grupo CUADRO 17 Resumen de resultados de albúmina en el suero * Como se define por el Merck Manual como el límite inferior ** "Clínicamente significativo" es definido como 75% del valor mínimo para más de un dia Cuadro de resumen de todos los resultados: Para intentar y capturar la severidad de todos estos resultados complejos, se creó un cuadro de resumen (cuadro 18). En este cuadro, sólo se examinaron calificaciones clínicamente significativas (severas) para cada parámetro medido en este ensayo. La media de la calificación de severidad para los controles es 14.6 comparado con 3.5 para los perros vacunados. Esta diferencia drástica destaca la eficacia del producto de prueba en todos los perros vacunados vs controles.

Conclusiones: El desafío fue efectivo y más potente que el planeado ya que 100% de los controles desarrolló trombocitopenia, títulos altos a E. canis, signos clínicos severos, pérdida de peso y dos de los perros tuvieron que ser sacrificados.

Cuando se toma en cuenta el censo debido a mortalidad, la incidencia de trombocitopenia severa, la variable primaria, se mostró que era menor en los perros vacunados que en los controles y que la diferencia fue significativa (p = 0.0213).

La vacunación pareció tener un efecto sobre la mortalidad ya que 25% de los controles y ninguno de los perros vacunados tuvieron que ser sacrificados por razones humanas después del desafío.

La pérdida de peso severa fue experimentada por los perros en el grupo de control con algunos perros perdiendo casi 25% de su peso corporal durante las ocho semanas después del desafío. La incidencia de pérdida de peso severa fue menor en perros vacunados que en controles y esa diferencia fue extremadamente significativa (p = 0.0042).

La diferencia entre perros vacunados y los controles para otros parámetros de la sangre que alcanzaron niveles severos no fue muy significativa aunque algunos fueron muy cercanos. Esos incluyeron WBCs (p = 0.08221), hematocrito (p = 0.0534) y hemoglobina (p = 0.21 18).

La detección por PCR de E. canis en la sangre coincidió exactamente con los resultados logrados para la incidencia de trombocitopenia.

Tres de los perros en el grupo vacunado nunca mostraron ningún signo clínico de infección o tuvieron un nivel detectable de E. canis en la sangre por PCR. Sin embargo, la serología indicó que estos tres perros parecieron tener una respuesta anamnésica a E. canis después del desafío, indicando que fueron expuestos al material de desafío virulento.

La acumulación de fluido en el abdomen, como resultado de deficiencias de albúmina severas en la sangre sólo se vio en los perros de control y no en los perros vacunados.

Los signos clínicos incluyendo depresión, descarga nasal, descarga ocular, epistaxis, deshidratación y muerte fueron los más severos en los perros de control en comparación con los perros vacunados, sin embargo, las diferencias no fueron significativamente diferentes entre los grupos (p = 0.4364).

Las espigas de temperatura rectal después de desafío fueron más comunes en los perros de control.

Ni la vacunación ni las inyecciones de vacuna produjeron reacción observable en los perros.

Bajo necropsia, la observación de esplenomegalia sólo se vio en los controles.

Estos resultados soportan la eficacia de la vacuna de la presente invención.

CUADRO 18 Resumen de todos los resultados en la categoría severa Pérdida de peso - > 15% de peso corporal = 3 Hemoglobina - dos o más días= 8 g/dL = 3 Glóbulos blancos - dos o más días= 4.5 x 103/ L = 3 Plaquetas - dos o más días < 100 x 103/µ?_ = 3 Glóbulos rojos - dos o más días= 4.0 x 106/µ?_ = 3 Fiebre - temperatura= 39.5 dos de más días = 2 Hematocrito/PCV- dos o más días < 28% = 3 Líquido abdominal - > 200 mi = 3 Esplenomegalia - si = 1 Albúmina - dos o más días= 1.9 g/dL = 3 PCR - positiva en cualquier tempo durante el estudio = 1 "Calificación Total para los 8 animales en cada grupo Cabe entender que esta invención no está limitada a las configuraciones, pasos de procedimiento y materiales particulares descritos aquí, ya que dichas configuraciones, pasos de procedimiento y materiales pueden variar algo. Cabe entender también que la terminología utilizada aquí se usa para el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunizante efectiva de un antígeno inactivado de E. canis; en donde el antigeno produce una respuesta ¡nmunológica protectora, pero produce una respuesta humoral mínima en un sujeto cuando la vacuna es adminsitrable como una vacuna primaria.

2. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el antígeno es generado a partir de E. canis que pasa a una célula de canino.

3. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la célula de canino es una célula de médula ósea de perro.

4. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la célula de canino tiene el acceso al ATCC No. PTA-10545.

5. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el antígeno es inactivado con formalina.

6. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la composición de vacuna además comprende un adyuvante lipófilo.

7 - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el adyuvante comprende 6,6'-dimicolato de trehalosa.

8.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque un solvente no polar comprende el adyuvante lipófilo con la vacuna.

9. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el solvente no polar es un sistema de solvente de cloroformo.

10. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 65-95% volumen/volumen de cloroformo.

11.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el sistema de solvente de cloroformo además comprende aproximadamente 5.0-30% volumen/volumen de metanol.

12. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el sistema de solvente de cloroformo comprende aproximadamente 90% de cloroformo: 10% de metanol: 1.0% de agua volumen a volumen, respectivamente.

13. - Una composición de vacuna que comprende: (a) una E. canis asociada a célula inactivada por formalina que crece en una célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10545: y (b) un adyuvante que comprende 6,6'-dimicolato de trehalosa disuelto en 90:10:1 de cloroformo:metanol:agua.

14. - Una E. canis asociada a célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10546.

15. - Una célula que tiene el acceso a ATCC No. PTA-10545.

16. - Un adyuvante que comprende 6,6'-dim¡colato de trehalosa disuelto en un sistema de solvente de cloroformo.

17. - El uso de un antígeno inactivado de E. canis, en la elaboración de una composición de vacuna para vacunar a un sujeto en contra de E. canis.

18. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde una segunda dosis de la composición de vacuna se provee aproximadamente 21 días después de una primera dosis de la composición de vacuna.

19. - Un procedimiento para producir la composición de vacuna de la reivindicación 1 , que comprende hacer crecer E. canis en una célula de canino para producir el antígeno; y después mezclar el antígeno con un excipiente adecuado para uso veterinario.

20.- Un procedimiento para producir antígeno de E. canis, qué comprende hacer crecer E. canis en la célula de la reivindicación 15 para producir el antígeno.