MX2012014992A - Polipeptido que tiene actividad de beta-glucosida y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N°: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la. secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 1, o un polipéptido de variante o polinucleótido de variante del mismo, en el que el polipéptido de variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N°: 2 o el polinucleótido de variante codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N°: 2. La invención pone de relieve la secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso, además de la secuencia de aminoácidos del polipéptido funcional de longitud completa y equivalentes funcionales del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a procedimientos para usar el polipéptido en procedimientos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuadas para producir estas proteínas.

Description

POLIPÉPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD DE BETA-GLUCOSIDASA Y USOS DEL MISMO DECLARACIÓN DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO FEDERALMENTE FINANCIADO La presente invención se hizo con el apoyo del gobierno de los EE.UU. bajo la subvención n° DE-FC36-08G018079 , concedida por el Departamento de Energía. El gobierno de EE.UU. puede tener ciertos derechos en la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a secuencias que comprenden genes que codifican polipéptidos que tienen o ayudan en la actividad de degradación de materiales de hidrato de carbono. La invención pone de relieve la secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso, además de la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa, y variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a procedimientos para usar estas proteínas en procedimientos industriales. En la invención también están incluidas células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuado para producir estas proteínas. La invención también se refiere a la satisf ctoria expresión de los genes que codifican polipéptidos que tienen actividad de degradación de materiales de hidrato de carbono en un huésped. El huésped puede ser cualquier huésped adecuado, por ejemplo, Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Talaromyces, por ejemplo Talaromyces e ersonii .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los hidratos de carbono constituyen los compuestos orgánicos más abundantes en la tierra. Sin embargo, gran parte del hidrato de carbono es secuestrado en polímeros complejos que incluyen almidón (el principal hidrato de carbono de almacenamiento en semillas y grano) , y un conjunto de hidratos de carbono y lignina conocidos como lignocelulosa . Los principales componentes de hidrato de carbono de la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas. Estos polímeros complejos se denominan frecuentemente en conjunto lignocelulosa.

La bioconversion de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que se fermenta posteriormente para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como una alternativa a combustibles líquidos ha atraído una intensa atención de investigadores desde los años 70 cuando estalló la crisis del petróleo debido a la disminución de la producción de petróleo por la OPEC. El etanol se ha usado ampliamente como 10% de mezcla con gasolina en los EE.UU. o como un combustible puro para vehículos en Brasil en las dos últimas décadas. Más recientemente, el uso de E85, una mezcla de 85% de etanol, se ha implementado especialmente para aplicaciones en ciudades limpias. La importancia del combustible bioetanol aumentará en paralelo con el aumento en los precios para el petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente se están usando azúcares fermentables para producir plásticos, polímeros y otros productos de base biológica y se espera que esta industria crezca sustancialmente , aumentando así la demanda de abundantes azúcares fermentables de bajo coste que puedan usarse como materia prima en vez de materias primas basadas en petróleo.

El secuestro de tales grandes cantidades de hidratos de carbono en biomasa vegetal proporciona una abundante fuente de energía potencial en forma de azúcares, tanto azúcares de cinco carbonos como de seis carbonos, que podría utilizarse para numerosos procedimientos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial de energía de estos hidratos de carbono está actualmente infrautilizado debido a que los azúcares están bloqueados en polímeros complejos, y de ahí que no estén fácilmente accesibles para la fermentación. Los procedimientos que generan azúcares a partir de biomasa vegetal proporcionarían abundantes materias primas económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles , que incluyen etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás .

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el coste y eficiencia hidrolítica de las enzimas son factores importantes que limitan la comercialización de los procedimientos de bioconversión de biomasa. Los costes de producción de enzimas microbianamente producidas están estrechamente conectados con una productividad de la cepa productora de enzimas y el rendimiento de actividad final en el caldo de fermentación.

A pesar de la investigación continuada de las últimas décadas para entender la degradación de biomasa lignocelulósica enzimática y la producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir o manipular nuevas celulasas y hemicelulasas altamente activas. También sería altamente deseable construir composiciones de enzima altamente eficientes que pudieran realizar la biodegradación rápida y eficiente de materiales lignocelulósicos , en particular tales celulasas y hemicelulasas que tienen termoestabilidad elevada .

Tales enzimas pueden usarse para producir azúcares para la fermentación en productos químicos, plásticos tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles , que incluyen etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás, para ensilado, y también como enzima en otros procedimientos industriales, por ejemplo, en las industrias alimentarias o de pienso, textiles, de pulpa o papel o de detergentes, y otras industrias.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la capacidad para degradar (es decir, ayudar en la degradación de) un hidrato de carbono (por ejemplo, polisacáridos) , en particular, lignocelulosa . Los polinucleótidos de la invención normalmente codifican un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa .

La invención también proporciona polipéptidos naturalmente y recombinantemente producidos que tienen tal actividad, además de líneas celulares recombinantes que producen tales enzimas. Por tanto, se proporcionan procedimientos de preparación y uso de los polinucleótidos y los polipéptidos de la invención.

Por tanto, según la invención se proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N° : 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N° : 1, o un polipéptido de variante o polinucleótido de variante del mismo, en el que el polipéptido de variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N° : 2 o el polinucleótido de variante codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N° : 2.

Los polipéptidos según la invención tienen propiedades favorables, en particular una actividad de degradación de celulosa. En una realización, el polipéptido según la invención tiene actividad de beta-glucosidasa (abreviada BG) .

En el presente documento, beta-glucosidasa, también ß-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-glucosa no reductores de extremos con liberación de ß-D-glucosa. Un polipéptido tal puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido. Esta enzima también puede denominarse amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa.

En una realización, el polipéptido de variante tiene un residuo catalítico Asp276 - Glu508 (posiciones como en SEC ID N° : 2) .

En una realización, el polipéptido de variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N° : 2, un residuo catalítico Asp276 -Glu508 y actividad de BG. :' Adicionalmente, los polipéptidos pueden tener una alta termoestabilidad. Los polipéptidos según la invención pueden retener una alta actividad relativa (% de actividad inicial) en función del tiempo de incubación (h) , por ejemplo, 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, ocho horas, nueve horas, 10 h o más, 20 h o más, 30 h o más, en particular a altas temperaturas, por ejemplo, a 60°C o más, a 65°C o más, o a 70° C o más, por ejemplo, 8 horas a 65°C o 72 horas a 60°C.

La invención también proporciona un polinucleótido que comprende : (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID N° : 1; o (b) una secuencia de nucleótidos que se híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de SEC ID N°: 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de SEC ID N° : 1; o (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) o (c) que tiene al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que se degenera como resultado del código genético en una secuencia como se define en una cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

Según la invención también se proporciona un vector, tal como un vector de expresión, que incorpora una secuencia de polinucleótidos de la invención y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención.

La invención también proporciona: un procedimiento para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa, procedimiento que comprende cultivar una célula de la invención en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado; un polipéptido obtenible por un procedimiento tal; y una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa ; Los polipéptidos de la invención que tienen actividad de beta-glucosidasa pueden usarse en procedimientos industriales. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sustrato que comprende material de hidrato de carbono, procedimiento que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido o una composición de la invención.

En particular, la invención proporciona un procedimiento para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico, procedimiento que comprende poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención.

Los azúcares producidos de esta forma pueden usarse en un procedimiento de fermentación. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para producir un producto de fermentación, procedimiento que comprende: producir un azúcar fermentable usando lo anteriormente descrito; y fermentar el azúcar fermentable resultante, por lo que se produce un producto de fermentación.

Un polipéptido o una composición de la invención también pueden usarse, por ejemplo, en la preparación de un producto alimenticio, en la preparación de un detergente, en la preparación de un pienso para animales, en el tratamiento de pulpa o en la fabricación de un papel o en la preparación de una tela o textil o en la limpieza de los mismos.

La invención también proporciona: un material procesado obtenible poniendo en contacto un material vegetal o material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención; un alimento o pienso que comprende un polipéptido o una composición de la invención; y una planta o una parte de la misma que comprende un polinucleótido , un polipéptido, un vector o una célula según la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig 1: Mapa de pGBTOP para la expresión de genes en A. niger. Se representan el gen de interés (GOI) expresado a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA) . Además, se representa el flanco de glucoamilasa (3'glaA) del cásete de expresión. En la presente solicitud, un gen de interés es la secuencia codificante de TEMER06387 como se define en lo sucesivo .

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID N° : 1 expone la secuencia codificante de TEMER06387 ; SEC ID N° : 2 expone la secuencia de aminoácidos de TEMER06387; SEC ID N° : 3 expone la secuencia señal de TEMER06387; DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" deben interpretarse de forma inclusiva. Es decir, estas palabras pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente citados, cuando lo permita el contexto.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad para modificar, por ejemplo, degradar, un material de hidrato de carbono. Un material de hidrato de carbono es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o más hidratos de carbono. Las enzimas son en el presente documento una subclase de polipéptidos.

El sustrato (también llamado materia prima) en el presente documento se usa para referirse a una sustancia que comprende material de hidrato de carbono, que puede tratarse con enzimas según la invención, de manera que el material de hidrato de carbono en su interior se modifica. Además del material de hidrato de carbono, el sustrato puede contener cualquier otro componente que incluye, pero no se limita a, material de no hidrato de carbono y almidón.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad para modificar, por ejemplo, degradar, un material de hidrato de carbono. Un material de hidrato de carbono es un material que comprende, consiste en o consiste sustancialmente en uno o más hidratos de carbono. Las enzimas son en el presente documento una subclase de polipéptidos.

Normalmente, un polipéptido de la invención codifica un polipéptido que tiene al menos actividad de beta-glucosidasa, llamado provisionalmente TEMER06387, que tiene una secuencia de aminoácidos según SEC ID N°: 2, o una secuencia que es una variante del mismo, normalmente funcionalmente equivalente al polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID N° : 2, o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de ambos.

En una realización, un polipéptido de la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales distintas de la de actividad de beta-glucosidasa como se ha mencionado anteriormente, por ejemplo, una de las otras actividades de degradación de hidratos de carbonos y/o de hidrólisis de hidratos de carbonos mencionadas en el presente documento .

Hidrato de carbono en este contexto incluye todos los sacáridos, por ejemplo, polisacáridos , oligosacáridos , disacáridos o monosacáridos .

Un polipéptido según la invención puede modificar y/o degradar un material de hidrato de carbono degradando químicamente o degradando físicamente tal material o hidrolizando el hidrato de carbono. La modificación física incluye, por ejemplo, interrupción de la interacción entre microfibrillas de celulosa y/o apertura de la estructura de fibras de celulosa. La modificación química del material de hidrato de carbono puede producir la degradación de tal material, por ejemplo, mediante hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como por la acción de una liasa. La modificación física puede o puede no ir acompañada de modificación química.

Materiales de hidrato de carbono adecuados Un hidrato de carbono de no almidón adecuado para la modificación por un polipéptido de la invención es lignocelulosa . Los principales polisacáridos que comprenden diferentes residuos lignocelulósicos, que pueden considerarse una posible materia prima renovable, son celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ) . Además, alguna hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo, en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, por ejemplo, glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentosas, se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan conjuntamente.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden representar una proporción considerable de la masa seca de paredes normalmente celulares de tejidos de plantas no leñosas (aproximadamente de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto por residuos de glucosa ligados por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, además de la estequiometria de la glucosa ligada en ß (con respecto a a) , genera estructuras más propensas a enlaces de hidrógeno entre cadenas que las estructuras de almidón ligadas por a altamente ramificadas. Por tanto, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles, y forman fibras más estrechamente unidas que las fibras encontradas en el almidón. '.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía frecuentemente ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es xilosa ligada en ß-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa está frecuentemente ramificada en 0-3 y/o 0-2 y puede estar sustituida con enlaces con arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación con ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico a arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para azúcares de seis carbonos ligados por ß (tales como los ß- (1, 3) (1, 4) -glucanos y los heteroglucanos mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que tanto la glucosa como la mañosa están presentes en el esqueleto lineal, ligadas entre sí por enlaces ß) .

La composición, naturaleza de sustitución y grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferente en plantas dicotiledóneas (dicotiledóneas, es decir, planta cuyas semillas tienes dos cotiledones u hojas de semillas tales como habas, cacahuetes, almendras, guisantes, alubias) con respecto a plantas monocotiledoneas (monocotiledoneas; es decir, plantas que tienen un único cotiledón u hoja de semilla tal como maíz, trigo, arroz, pastos, cebada) . En dicotiledóneas, la hemicelulosa comprende principalmente xiloglucanos que son cadenas de glucosa ligadas en 1,4-ß con cadenas laterales de xilosilo ligadas en 1,6-ß. En monocotiledoneas, que incluyen la mayoría de las cosechas de grano, los principales componentes de la hemicelulosa son heteroxilanos . Éstos comprenden principalmente polímeros de esqueleto de xilosa ligados en. 1,4-ß con enlaces 1,3-a con arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido 4-0-metil-glucurónico, además de xilosa modificada por ácidos acéticos ligados por éster. También están presentes ß-glucanos que comprenden cadenas de glucosilo ligadas en 1,3-y 1,4-ß. En monocotiledóneas , la celulosa, heteroxilanos y ß-glucanos pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales, comprendiendo cada una aproximadamente el 15-25% de la materia seca de paredes celulares. Por tanto, plantas diferentes pueden comprender diferentes cantidades de, y diferentes composiciones de, sustancias pécticas. Por ejemplo, la remolacha azucarera contiene aproximadamente 19% de peetina y aproximadamente 21% de arabinano en una base de peso seca.

Por consiguiente, una composición de la invención puede confeccionarse en vista de la materia prima particular (también llamada sustrato) que va a usarse. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones de enzimas o tratamientos físicos pueden administrarse concpmitantemente o secuencialmente . Las enzimas pueden producirse tanto exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica . Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa de células brutas, o material vegetal (tal como hojas y tallos del maíz) , y similares, se añaden a la materia prima. Alternativamente, la masa de células brutas o medio de producción de enzimas o material vegetal puede tratarse para evitar adicionalmente el crecimiento microbiano (por ejemplo, mediante calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , luego añadirse a la materia prima. Estas mezclas de enzimas brutas pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede producirse en una fermentación que usa materia prima (tal como hojas y tallos del maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima (s) . De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden servir de materia prima lignocelulósica y añadirse a materia prima lignocelulósica .

Actividad enzimática Las endo-1, 4 - ß-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble en celooligosacáridos (celcbiosa como producto principal) , mientras que las ß -glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos , principalmente celobiosa y celotriosa, en glucosa .

Las xilanasas, junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo, a-L- arabinofuranosidasas , feruloil y acetilxilab esterasas, glucuronidasas y ß-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de parte de las hemicelulosas .

Sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la célula de la pared vegetal. Están construidas a partir de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico ligadas en a(l,4) intercaladas hasta cierto grado con L-ramnosa. En una pared celular cualquiera hay varias unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y se ha considerado generalmente que en una única molécula péctica, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son continuas entre sí.

Las pectinasas incluyen, por ejemplo, una endo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa , una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa , una xilogalacturonasa , una a-arabinofuranosidasa .

Los principales tipos de unidades estructurales son: galacturonano (homogalacturonano) , que puede estar sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2 y 0-3; ramnogalacturonano I (RGI) , en el que las unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades de ramnosa que llevan cadenas laterales de galactano ligado en (1,4) y arabinano ligado en (1,5) . Las cadenas laterales de arabinano pueden unirse directamente a ramnosa o indirectamente mediante las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades individuales de xilosilo en 0-3 de ácido galacturónico (estrechamente asociadas a RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII) , una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo, apiosa. Una unidad de RGII puede contener dos residuos de apiosilo que, bajo condiciones iónicas adecuadas, puede formar reversiblemente ásteres con borato.

Como se ha expuesto anteriormente, un polipéptido de la invención normalmente tendrá actividad de beta-glucosidasa . Sin embargo, un polipéptido de la invención puede tener una o más de las actividades expuestas anteriormente, además de o alternativas a esa actividad. Por tanto, una composición de la invención como se describe en el presente documento puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente, además de las proporcionadas por un polipéptido de la invención que tiene actividad de beta-glucosidasa.

Secuencia de polinucleótidos La invención proporciona secuencias de polinucleótidos genómicas que comprenden el gen que codifica TEMER06387, además de su secuencia codificante. Por consiguiente, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleotidos genómica según la secuencia de nucleotidos codificante según SEC ID N° : i y a variantes, tales como equivalentes funcionales, de cualquiera de los mismos.

En particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que puede hibridarse selectivamente, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas, preferentemente bajo condiciones altamente rigurosas, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia expuesta en SEC ID N° : 1.

Más específicamente, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende o consiste esencialmente en una secuencia de nucleotidos según SEC ID N°: 1.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende o consiste esencialmente en una secuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido según SEC ID N° : 2 o una variante del mismo, tal como un equivalente funcional, o un fragmento de cualquiera de los mismos .

Como se usa en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que pueden aislarse de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo, la proteína beta-glucosidasa según la presente invención.

Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y/o secuencias reguladoras. Además, el término "gen" puede referirse a una molécula de ácido nucleico aislada como se define en el presente documento.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID N° : l o una variante de la misma, tal como un equivalente funcional, puede aislarse usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de secuencias proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, usando toda o una parte de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID N° : 1 como sonda de hibridación, las moléculas de ácidos nucleicos según la invención pueden aislarse usando técnicas de hibridación y clonación convencionales (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2" ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Además, una molécula de ácido nucleico que engloba toda o una parte de SEC ID N° : 1 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados basándose en la información de secuencia contenida en SEC ID N° : 1.

Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados según técnicas de amplificación por PCR convencionales. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencias de ADN.

Además, los oligonucleótidos correspondientes a o hibridables con una secuencia de nucleótidos según la invención pueden prepararse por técnicas sintéticas convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado .

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID N° : 1.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID N° : l o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquier de tales secuencias de nucleótidos.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos de forma que pueda hibridarse con la otra secuencia de nucleótidos, por lo que se forma un dúplex estable .

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como un equivalente funcional del mismo, por ejemplo, un fragmento o dominio biológicamente activo, además de moléculas de ácidos nucleicos suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácidos nucleicos adecuados para su uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácidos nucleicos.

Un polinucleótido según la invención puede estar "aislado" . En el contexto de la presente invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias codificantes a las que es inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5 ' y uno en el extremo 31 ) en el genoma que se produce naturalmente del organismo del que se deriva. Por tanto, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye algunas o todas de las secuencias no codificantes de 5' (por ejemplo, promotoras) que están inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus autónomamente replicante o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento genómico de ADN producido por PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material vírico o medio de cultivo (cuando se produce por técriicas de ADN recombinante) , o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no se produce naturalmente como fragmento y no se encontraría en el estado natural.

Como se usa en él presente documento, está previsto que los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" incluyan moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, AR m) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico puede sintetizarse usando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato) . Tales oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o elevada resistencia a nucleasas.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido para una molécula de ácido nucleico de TEMER06387, por ejemplo, la cadena codificante de una molécula de ácido nucleico de TEMER06387. Dentro del alcance de la invención también están incluidas las cadenas complementarias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en el presente documento.

A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por la secuenciación de una molécula de ADN en el presente documento se determinaron usando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas en el presente documento se predijeron por traducción de una secuencia de ADN determinada como antes. Por tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por este enfoque automatizado, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en el presente documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son normalmente al menos aproximadamente el 90% idénticas, más normalmente al menos aproximadamente el 95% a al menos aproximadamente el 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada.

La secuencia real puede determinarse con más precisión por otros enfoques que incluyen procedimientos de secuenciación de ADN manuales muy conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real producirá un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de forma que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos en realidad codificada por la molécula de ADN secuenciada, empezando en el punto de una inserción o deleción tal.

El experto en la materia puede identificar tales bases erróneamente identificadas y sabe cómo corregir tales errores .

Una molécula de ácido nucleico según la invención puede comprender sólo una parte o un fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID N° : 1 (o de una variante de cualquiera de ellas) , por ejemplo, un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de un polipéptido TEMER06387.

La secuencia de nucleotidos determinada a partir de la clonación del gen y ADNc de TEMER06387 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en identificar y/o clonar otros miembros de la familia de TEMER06387, además de homólogos de TEMER06387 de otras especies .

La sonda/cebador normalmente comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado que. normalmente comprende una región de secuencia de nucleotidos que se híbrida preferentemente bajo condiciones altamente rigurosas con al menos de aproximadamente 12 a aproximadamente 15, preferentemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, preferentemente de aproximadamente 22 a aproximadamente 25, más preferentemente aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, o aproximadamente 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID N° : 1 o de una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de ellas.

Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de TEMER06387 pueden usarse para detectar transcritos o secuencias de TEMER06387 genómicas que codifican los mismos polipéptidos o polipéptidos homólogos, por ejemplo, en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo de marca unido a la misma, por ejemplo, el grupo de marca puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Tales sondas también pueden usarse como parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células que expresan un polipéptido TEMER06387.

Los polinucleótidos en el presente documento pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos pueden optimizarse en el uso de codones, preferentemente según los procedimientos descritos en WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943 , que se incorporan en el presente documento por referencia. El documento PCT/EP2007/055943 trata de la optimización de pares de codones. La optimización de pares de codones es un procedimiento en el que las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido han sido modificadas con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o producción mejorada del polipéptido codificado. Los pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes posteriores (codones) en una secuencia codificante.

La invención se refiere además a una construcción de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido que se ha descrito antes. "Construcción de ácidos nucleicos" se define en el presente documento como una molécula de ácido nucleico, tanto mono como bicatenaria, que se aisla de un gen que se produce naturalmente o que ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico que se combinan y yuxtaponen de un modo que de otro modo no existiría en la naturaleza. El término construcción de ácidos nucleicos es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante. El término "secuencia codificante" como se define en el presente documento es una secuencia, que se transcribe en ARNm y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invención. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por el codón de iniciación ATG en el extremo 5' del ARNm y una secuencia del codón de terminación de la traducción que termina el marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias de ADN, ADNc y de ácidos nucleicos recombinantes . Preferentemente, el ácido nucleico tiene alto contenido de GC. El contenido de GC en el presente documento indica el número de nucleótidos G y C en la construcción dividido entre el número total de nucleótidos, expresado en % . El contenido de GC es preferentemente 56% o más, 57% o más, 58% o más, 59% o más, 60% o más, o en el intervalo del 56-70% o el intervalo del 58-65%.

Preferentemente, la construcción de ADN comprende una secuencia de ADN promotora, una secuencia codificante en asociación operativa con dicha secuencia de ADN promotora y secuencias de control tales como: una secuencia de terminación de la ; traducción orientada en la dirección 5 ' hacia 31 seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferentemente TAAA, y/o - una secuencia codificante de iniciación de la traducción orientada en la dirección 5 ' hacia 31 seleccionada de la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC ; GCTCCCCTC ; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferentemente GCT TCC TTC, y/o una secuencia de iniciación de la traducción seleccionada de la siguiente lista de secuencias: 5'-mwChkyCAAA-3 ' ; 5 ' -mwChkyCACA-31 o 5 ' -mwChkyCAAG-3 ' , usando códigos de ambigüedad para nucleótidos: m (A/C) ; w (A/T) ; y (C/T) ; k (G/T) ; h (A/C/T) , preferentemente 5 ' -CACCGTCAAA-3 ' o 5 ' -CGCAGTCAAG- 3 ' .

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia codificante de iniciación de la traducción" se define como los nueve nucleótidos inmediatamente en la dirección 3 ' del iniciador o codón de iniciación del marco de lectura abierto de una secuencia codificante de ADN. El iniciador o codón de iniciación codifica la metionina AA. El codón iniciador es normalmente ATG, pero también puede ser cualquier codón de iniciación funcional tal como'GTG.

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia de terminación de la traducción" se define como los cuatro nucleótidos a partir del codón de terminación de la traducción en el extremo 3' del marco de lectura abierto o secuencia codificante de nucleótidos y orientada en la dirección de 5' hacia 3'.

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia iniciadora de la traducción" se define como los diez nucleótidos inmediatamente en la dirección 5' del codón iniciador o de iniciación del marco de lectura abierto de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido. El codón iniciador o de iniciación codifica la metionina AA. El codón iniciador es normalmente ATG, pero también puede ser cualquier codón de iniciación funcional tal como GTG. Es muy conocido en la técnica que uracilo, U, sustituya el desoxinucleótido timina, T, en ARN.

Homología e identidad Se dice que las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homologas cuando presentan un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homologas están o no estrechamente relacionadas o más distantemente relacionadas se indica por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque se cuestiona, para indicar el "porcentaje de identidad" o el "porcentaje de similitud" frecuentemente se usan indistintamente "nivel de homología" o "porcentaje de homología" .

Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan indistintamente en el presente documento. Para el fin de la presente invención, aquí se define que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias completas están alineadas para fines de comparación óptimos. Con el fin de optimizar un alineamiento entre las dos secuencias pueden introducirse huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Tal alineamiento se lleva a cabo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Alternativamente, un alineamiento puede llevarse a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo, sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases p aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada indicada .

Una comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. El experto conocerá muy bien el hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes : para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) Una visión general de comparación de secuencias en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed. ) , Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pág. 1-44 Addison esley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para un alineamiento de dos secuencias (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D'. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453) . El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos, además de secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Con el fin de la presente invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pág. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/) . Para secuencias de polipéptidos se usa BLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos se usa EDNAFULL. Pueden especificarse otras matrices. Los parámetros opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos tienen una penalización por hueco abierto de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes darán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente si se usan diferentes algoritmos.

Definición de homología global La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias enteras sobre la región alineada total que incluye cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: número de posiciones correspondientes en un alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total de un alineamiento que incluye los huecos . La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE y está etiquetada en la salida del programa como "IDENTIDAD" .

Definición de la identidad más larga La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula del siguiente modo: número de posiciones correspondientes en un alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total de un alineamiento después de la resta del número total de huecos en un alineamiento. La identidad definida como en el presente documento puede obtenerse de NEEDLE usando la opción NOBRIEF y está etiquetada en la salida del programa como "identidad más larga" . Para los fines de la invención, el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácido o nucleótido) se calcula según la definición de "identidad más larga" que puede llevarse a cabo usando el programa NEEDLE.

Las secuencias de polipéptidos de la presente invención pueden usarse adicionalmente como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda por comparación con bases de datos de secuencias, por ejemplo, para identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas BLAST. El software para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible del Centro nacional para información biotecnológica ( http : / /www . ncbi . nlm . nih . gov) . BLASTP se usa para secuencias de aminoácidos y BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST usa como valores por defecto: - Coste por hueco abierto: defecto = 5 para nucleótidos/ 11 para polipéptidos Coste por extensión de hueco: defecto = 2 para nucleótidos/ 1 para polipéptidos - Penalización por coincidencia de nucleótidos: defecto = -3 - Recompensa por coincidencia de nucleótidos: defecto = 1 - Valor esperado: defecto = 10 - Tamaño de palabra: defecto = 11 para nucleótidos/ 28 para megablasto/ 3 para polipéptidos Además, el grado de identidad local (homología) entre la consulta de secuencias de aminoácidos o la consulta de secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias homologas recuperadas se determina por el programa BLAST. Sin embargo, sólo se comparan aquellos segmentos de secuencia que dan una coincidencia por encima de un cierto umbral. Por consiguiente, el programa calcula la identidad sólo para estos segmentos de coincidencia. Por tanto, la identidad calculada de esta forma se denomina identidad local.

Hibridación Como se usa en el presente documento, está previsto que el término "hibridar selectivamente" , "se híbrida selectivamente" y términos similares describan condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, más preferentemente al menos aproximadamente el 85%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90%, preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos aproximadamente el 98% o más preferentemente al menos aproximadamente el 99% homologas entre sí siguen hibridadas entre sí. Es decir, tales secuencias de hibridación pueden compartir al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, más preferentemente al menos aproximadamente el 85%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90%, más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 98% o más preferentemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencias .

Un ejemplo no limitante preferido de tales condiciones de hibridación es hibridación en 6 x cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 1 x SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 50 °C, preferentemente a aproximadamente 55 °C, preferentemente a aproximadamente 60 °C y incluso más preferentemente a aproximadamente 65 °C.

Condiciones altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 68 °C en 5 x SSC/ 5 x disolución de Denhardt / 1,0% de SDS y lavado en 0,2 x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado puede realizarse a 42 °C.

El experto sabrá qué condiciones aplicar para condiciones de hibridación rigurosas y altamente rigurosas. Orientación adicional con respecto a tales condiciones está fácilmente disponible en la materia, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y col. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John iley & Sons, N. Y. ) .

Por supuesto, un polinucleótido que se híbrida sólo con una secuencia de poliA (tal como el tracto de poli (A) del extremo 3 ' de ARNm) , o con un estiramiento complementario de residuos de T (o U) , no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridarse específicamente con una parte de un ácido nucleico de la invención, ya que un polinucleótido tal se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un estiramiento de poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario) .

En un enfoque típico pueden cribarse bibliotecas de ADNc construidas a partir de otros organismos, por ejemplo, un hongo filamentoso, en particular de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo, del género Penicillium, tales como Penicillium decu bens .

Por ejemplo, pueden cribarse cepas de Penicillium para polinucleótidos TEMER06387 homólogos por análisis de transferencia Northern. Tras la detección de transcritos homólogos a polinucleótidos según la invención, las bibliotecas de ADNc pueden construirse a partir de ARN aislados de la cepa apropiada utilizando técnicas convencionales muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Alternativamente, una biblioteca de ADN genómico total puede cribarse usando una sonda que puede hibridarse con un polinucleótido TE ER06387 según la invención.

Secuencias de genes homologas pueden aislarse, por ejemplo, realizando PCR usando dos conjuntos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados basándose en las secuencias de nucleótidos como se enseña en el presente documento .

El molde para la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se sabe o de las que se sospecha que expresan un polinucleótido según la invención. El producto de PCR puede subclonarse y secuenciarse para garantizar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácidos nucleicos de TEMER06387, o un equivalente funcional de la misma.

El fragmento de PCR puede entonces usarse para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede marcarse y usarse para cribar una de biblioteca de ADNc de bacteriófagos o cósmidos . Alternativamente, el fragmento marcado puede usarse para cribar una biblioteca genómica.

La tecnología de PCR también puede usarse para aislar secuencias de ADNc de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, el ARN puede aislarse, siguiendo procedimientos convencionales, de una fuente de células o de tejido apropiada. Puede realizarse una reacción de transcripción inversa en el ARN usando un cebador de oligonucleótidos específico para el extremo más hacia 5' del fragmento amplificado para el cebado de la síntesis de la primera cadena.

El híbrido de ARN/ADN resultante puede entonces "confeccionarse" (por ejemplo, con guaninas) usando una reacción de transferasa terminal convencional, el híbrido puede digerirse con RNasa H y la síntesis de la segunda cadena puede entonces cebarse (por ejemplo, con un cebador de poli-C) . Por tanto, las secuencias de ADNc en la dirección 5' del fragmento amplificado pueden aislarse fácilmente. Para una revisión de estrategias de clonación útiles véase, por ejemplo, Sambrook y col., arriba; y Ausubel y col., arriba.

Vectores Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, que incluyen vectores de clonación y de expresión, que comprenden un polinucleotido de la invención que codifica un polipéptido TEMER06387 o un equivalente funcional del mismo y procedimientos de crecimiento, transformación o transfección de tales vectores en una . célula huésped adecuada, por e emplo, en condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido.

Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante , por ejemplo, un vector de clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en otra realización, la invención proporciona un procedimiento de preparar polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Células huésped adecuadas se describen más adelante.

El vector en el que se inserta el cásete de expresión o polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que va a introducirse .

Un vector según la invención puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el (los) cromosoma (s) en el (los) que se ha integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido" , que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma vírico. Ciertos vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Tales vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión" .

En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos . Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente en el presente documento, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, está previsto que la invención incluya tales otras formas de vectores de expresión, tales como cósmido, vectores víricos (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicación) y vectores de fago que sirven a funciones equivalentes.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levadura, el vector o construcción de expresión está preferentemente integrado en el genoma de la célula huésped con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episómicos adecuados en los que la construcción de expresión puede incorporarse para expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los cuales incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKDl de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus) . En el caso de que las construcciones de expresión estén integradas en el genoma de la célula huésped, las construcciones están tanto integradas en loci al azar en el genoma como en loci diana predeterminados usando recombinación homologa, en cuyo caso los loci diana comprenden preferentemente un gen altamente expresado.

Por consiguiente, vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos , episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la variolovacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la seudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago tales como cósmidos y fagémidos.

Los vectores según la invención pueden usarse in vitro, por ejemplo, para la producción de AR o usarse para transíectar o transformar una célula huésped. El vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.

Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo, tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para expresión en exceso.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped que van a usarse para la expresión, que está operativamente ligado a la secuencia de ácidos nucleicos a expresar.

Dentro de un vector, tal como un vector de expresión, "operativamente ligada" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de un modo que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped) , es decir, el término "operativamente ligada" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su modo previsto. Una secuencia reguladora tal como un promotor, p tenciador u otra señal de regulación de la expresión "operativamente ligada" a una secuencia codificante está posicionada de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logre bajo condición compatible con las secuencias de control o las secuencias están dispuestas de manera que funcionen conjuntamente para su fin previsto, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y avanza por la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Por tanto, un vector o construcción de expresión para una célula huésped dada puede comprender los siguientes elementos operativamente ligados entre sí en un orden consecutivo del extremo 5' al extremo 3' con respecto a la cadena codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora que puede dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en la célula huésped dada; (2) opcionalmente , una secuencia señal que puede dirigir la secreción del polipéptido de la célula huésped dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferentemente activa de un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa; y preferentemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminador) que puede terminar la transcripción en la dirección 3' de ; la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

En la dirección 3 ' de la secuencia de nucleótidos según la invención puede estar una región sin traducir de 31 que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador) . El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo para la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferentemente se usa un terminador de levadura en células huésped de levadura y se usa un terminador fúngico filamentoso en células huésped fúngicas filamentosas. Más preferentemente, el terminador es endógeno a la célula huésped (en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido va a expresarse) . En la región transcrita puede estar presente un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá una AUG iniciadora de la traducción al principio y un codón de terminación apropiadamente posicionado al final del polipéptido a traducir.

La expresión potenciada del polinucleótido de la invención también puede lograrse- por la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, conductoras de la secreción y/o terminadoras , que pueden servir para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción del polipéptido de interés de 'la expresión huésped y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.

Se apreciará por aquellos expertos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, tales como vectores de expresión, de , la invención pueden introducirse en células huésped para producir de esta forma proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos TEMER06387, formas mutantes de polipéptidos TE ER06387, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos) . Los vectores, tales como vectores de expresión recombinantes , de la invención pueden diseñarse para la expresión de polipéptidos TEMER06387 en células procariotas o eucariotas .

Por ejemplo, los polipéptidos TEMER06387 pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus) , hongos filamentosos, células de levadura o células de mamífero. Células huésped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Ejemplos representativos de huéspedes apropiados se describen más adelante en el presente documento.

En la técnica se conocen medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped anteriormente descritas.

El término' "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en el presente documento para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácidos nucleicos de la invención que codifica un polipéptido. Tales secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, un conductor, secuencias de iniciación de la traducción óptimas (como se describe en Kozak, 1991, J. Biol . Chem. 266:19867-19870), una secuencia señal de la secreción, una secuencia de pro-péptidos , una secuencia de poliadenilación, un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control normalmente incluyen un promotor, y señales de terminación de la transcripción y traducción. Como se explica anteriormente, el término "operativamente ligada" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia de control está apropiadamente dispuesta en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de forma que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido .

Las secuencias de control pueden proveerse de ligadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido. El término "operativamente ligada" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia de control está apropiadamente dispuesta 5 en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de forma que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos, que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción, que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares tanto homólogos como heterólogos para la célula.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula fúngica filamentosa para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente ligada al extremo 3 ' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, puede usarse en la presente invención .

La secuencia de control también puede ser un terminador. Terminadores preferidos para células fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger (glaA) , antranilato sintasa de A. nidulans, alfa-glucosidasa de A. niger, gen trpC y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

La secuencia de control también puede ser una secuencia conductora adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula fúngica filamentosa. La secuencia conductora está operativamente ligada al extremo 51 de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. En la presente invención puede usarse cualquier secuencia conductora que sea funcional en la célula. Conductores preferidos para células fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae y triosa fosfato isomerasa de A. nidulans y glaA de A. niger.

Otras secuencias de control pueden aislarse, del gen IPNS de Penicillium, o gen pcbC, el gen beta- tubulina . Todas las secuencias de control citadas en el documento O 01/21779 se incorporan en la presente por referencia.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está operativamente ligada al extremo 3 ' de la secuencia de ácidos nucleicos y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula fúngica filamentosa como una señal que añade residuos de poliadenosina al AR m transcrito. En la presente invención puede usarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula. Secuencias de poliadenilación preferidas para células fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de A. niger.

Cuando el polipéptido según la invención va a ser secretado de la célula huésped en el medio de cultivación, una secuencia señal apropiada puede añadirse al polipéptido con el fin de dirigir el polipéptido sintetizado de novo a la ruta de secreción de la célula huésped. El experto en la materia sabe seleccionar una secuencia señal apropiada para un huésped especifico. La secuencia señal puede ser nativa a la célula huésped, o puede ser extraña a la célula huésped. Como ejemplo puede usarse una secuencia señal de un polipéptido nativo a la célula huésped. Preferentemente, dicho polipéptido nativo es un polipéptido altamente secretado, es decir, un polipéptido que es secretado en cantidades superiores al 10% de la cantidad total del polipéptido que se secreta. Las secuencias señal usadas preferentemente según la invención son, por ejemplo: pmeA.

Como una alternativa para una secuencia señal, el polipéptido de la invención puede fusionarse con un polipéptido portador secretado, o parte del mismo. Tal construcción quimérica se refiere a la ruta de secreción por medio de la secuencia señal del polipéptido portador, o parte del mismo. Además, el polipéptido portador proporcionará un efecto estabilizante al polipéptido según la invención y o puede potenciar la solubilidad. Tal polipéptido portador puede ser cualquier polipéptido. Preferentemente, un polipéptido altamente secretado se usa como polipéptido portador. El polipéptido portador puede ser nativo o extraño al polipéptido según la invención. El polipéptido portador puede ser nativo o puede ser extraño a la célula huésped. Ejemplos de tales polipéptidos portadores son glucoamilasa, prepro-secuencia de factor de apareamiento alfa, dominio de unión a celulosa de proteína A de unión a celulosa de Clostridiu cellulovorans, glutatión S-transferasa, dominio de unión a quitina de quitinasa Al de Bacillus circulans, dominio de unión a maltosa codificada por el gen malE de K12 de E. coli, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Un polipéptido portador preferido para la expresión de tal construcción quimérica en células de Aspergillus es glucoamilasa. La proteína y polipéptido portadores pueden contener un motivo de aminoácido específico para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido según la invención puede ser liberado por un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de tal motivo de aminoácidos es el sitio de escisión de KEX proteasa, que es muy conocido para el experto en la materia.

Una secuencia señal puede usarse para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias señal se caracterizan normalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que generalmente se escinden de la proteína madura durante la secreción en uno o más acontecimientos de escisión. Tales péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la. secuencia señal de las proteínas maduras a medida que pasan por la ruta secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como desde un huésped eucariota en el que se transforma el vector de expresión, y la secuencia señal es posteriormente o simultáneamente escindida. La proteína puede luego purificarse fácilmente del medio extracelular mediante procedimientos conocidos . Alternativamente, la secuencia señal puede ligarse a la proteína de interés usando una secuencia que facilita la purificación, tal como con un dominio GST . Por tanto, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse con una secuencia de marcador, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de marcador es un péptido de hexa-histidina tal como la marca proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. La marca de HA es otro péptido útil para la purificación que se corresponde con un epítope derivado de proteína de hemaglutinina de la gripe que se ha descrito, por ejemplo, por Wilson y col., Cell 37:767 (1984).

Preferentemente, una proteín de fusión de TEMER06387 de la invención se produce por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en marco según técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o terminados en bisel para la ligación, digestión con enzima de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para prevenir la unión no deseable y ligs. ión enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a nucleótidos protuberantes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia de genes quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel y col. John Wiley & Sons: 1992) . Además, están comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de QST) . Un ácido nucleico que codifica TEMER06387 puede clonarse en un vector de expresión tal de forma que el resto de fusión se ligue en marco con la proteína TEMER06387.

Preferentemente, la eficiencia de la integración elegida como diana en el genoma de la célula huésped, es decir, la integración en un locus diana predeterminado, aumenta aumentando las capacidades de recombinación homologa de la célula huésped. Tal fenotipo de la célula preferentemente implica un gen hdfA o hdfB deficiente como se describe en el documento WO2005/095624. El documento WO2005/095624 desvela un procedimiento preferido para obtener una célula fúngica filamentosa que comprende un aumento de la eficiencia de la integración elegida como diana.

Opcionalmente , la célula huésped comprende una respuesta a proteínas no plegadas (UPR) elevada en comparación con la célula natural para potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. La UPR puede aumentarse por técnicas descritas en los documentos US2004/0186070A1 y/o US2001/0034045A1 y/o WO01/72783A2 y/o WO2005/123763. Más específicamente, se ha modulado el nivel de proteínas de HACl y/o IRE1 y/o PTC2, y/o la proteína SEC61 se ha manipulado con el fin de obtener una célula huésped que tenga una UPR elevada.

Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada, la célula huésped se modifica genéticamente para obtener un fenotipo que muestra menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas en comparación con la célula natural con el fin de potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. Tal fenotipo puede obtenerse por deleción y/o modificación y/o inactivación de un regulador transcripcional de la expresión de proteasas. Un regulador transcripcional tal es, por ejemplo, prtT. La reducción de la expresión de proteasas por la modulación de prtT puede realizarse por técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que muestra menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas, la célula huésped muestra un fenotipo deficiente en oxalato con el fin de potenciar el rendimiento de producción de un polipéptido de interés. Un fenotipo deficiente en oxalato puede obtenerse por técnicas descritas en el documento WO2004/070022A2.

Alternativamente', o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que muestra menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas y/o deficiencia de oxalato, la célula huésped muestra una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la célula natural para potenciar el rendimiento de producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir, pero no se limitan a, expresión reducida de glucoamilasa y/o alfa-amilasa A neutra y/o alfa-amilasa B neutra, proteasa y ácido oxálico hidrolasa. Dichas diferencias fenotípicas mostradas por la célula huésped pueden obtenerse por modificación genética según las técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que muestra menor expresión de proteasas y/o secreción de proteasas y/o deficiencia de oxalato y una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la célula natural para potenciar el rendimiento de producción del polipéptido de interés, la célula huésped muestra una deficiencia en genes de toxina, inhabilitando la capacidad para la célula huésped fúngica filamentosa para expresar toxinas. Tales toxinas incluyen, pero no se limitan a, ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazónico, ácido 3-nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas y ácidos secalónicos. Tal deficiencia es preferentemente tal como se describe en el documento WO2000/039322.

Expresión (en exceso) En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención como se describen en el presente documento pueden expresarse en exceso en una cepa microbiana de la invención en comparación con la cepa microbiana parental en la que dicho gen no está expresado en exceso. La expresión en exceso de una secuencia de polinucleótidos se define en el presente documento como la expresión de dicho gen de secuencia que produce una actividad de la' enzima codificada por dichas secuencias en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1,5 veces la actividad de la enzima en la microbiana parental; preferentemente la actividad de dicha enzima es al menos aproximadamente 2 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 3 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 5 veces, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 10 veces y lo más preferentemente al menos aproximadamente 20 veces la actividad de la enzima en la microbiana parental .

El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean el polinucleótido que da lugar a ARN que comprende secuencias homologas a secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas víricas. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula huésped.

Un vector de clonación integrativo puede integrarse al azar o en un locus diana predeterminado en el (los) cromosoma (s) de la célula huésped en la que va a integrarse. En una realización preferida de la invención, un vector de clonación integrativo puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo a una secuencia de ADN en un locus diana predeterminado en el genoma de la célula huésped para elegir como diana la integración del vector de clonación para este locus predeterminado. Con el fin de promover la integración elegida como diana, el vector de clonación puede linealizarse preferentemente antes de la transformación de la célula huésped. La linealización puede realizarse preferentemente de forma que al menos un extremo, pero preferentemente cualquier extremo, del vector de clonación esté flanqueado por secuencias homologas al locus diana. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el locus diana es preferentemente al menos aproximadamente 0,1 kb, tal como aproximadamente al menos 0,2 kb, más preferentemente al menos aproximadamente 0,5 kb, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 1 kb, lo más preferentemente al menos aproximadamente 2 kb. Preferentemente, las cepas huésped parentales pueden modificarse para la frecuencia mejorada de la integración de ADN elegida como diana como se describe en los documentos WO05/095624 y/o O2007/115886.

El ejemplo de deleción proporcionado en la presente invención usa el promotor del gen como flanco de 5 ' y el gen como flanco de 3 ' para insertar un marcador de selección entre el promotor y el gen, per lo que se inutiliza (es decir, se inactiva funcionalmente) la transcripción de genes. Las secuencias de genes facilitadas anteriormente pueden usarse para hacer genes funcionalmente inactivados similares. Los genes pueden fraccionarse en dos, dando un flanco de 51 y un flanco de 3 ' , pero el gen también puede usarse para clonar un trozo mayor de ADN genómico que contiene las regiones promotoras y terminadoras del gen, que pueden actuar de flanco de 5 ' y flanco de 31.

El sistema de vector puede ser un único vector, tal como un único plásmido, o dos o más vectores, tales como dos o más plásmidos, que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN- antisentido .

El ADN de vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la materia para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, que incluye co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación. Procedimientos adecuados para transformar o transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma . Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Marcadores de selección preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que confieren resistencia a fármacos o que complementan un defecto en la célula huésped. Incluyen, por ejemplo, genes de marcadores versátiles que pueden usarse para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras tales como genes de acetamidasa o ADNc (los genes amdS, niaD, facA o ADNc de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) , o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, metrotrexato, fleomicina o benomilo (benA) . Alternativamente, pueden usarse marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieren cepas huésped mutantes correspondientes: por ejemplo, URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de .otras levaduras) , pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger) , argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección se deleciona de la célula huésped transformada después de la introducción de la construcción de expresión de forma que se obtengan células huésped transformadas que puedan producir el polipéptido que están libres de genes de marcador de selección.

Otros marcadores incluyen ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC) , orotidina-5 ' -fosfatodescarboxilasa (pvrA) , el gen de resistencia G418 bacteriana (éste también puede usarse en levadura, pero no en hongos) , el gen de resistencia a ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) , el gen de resistencia a nourseotricina natl de Streptomyces nursei, el gen de resistencia a piritiamina ptrA de Aspergillus oryzae y el gen uidA de E. coli, que codifica ß-glucuronidasa (GUS) . Pueden usarse vectores in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula huésped.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de tanto proteínas de fusión como de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en su interior, por ejemplo, al extremo amino de la proteína recombinante . Tales vectores de fusión normalmente sirven a tres fines: 1) para aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante que actúa de ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión, un sitio de escisión proteolítica se introduce en la unión del resto de fusión y la proteína recorabinante para permitir la separación de la proteína recómbinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión.

Como se indica, los vectores de expresión contendrán preferentemente marcadores de selección. Tales marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivo de células eucariotas y resistencia a tetracilina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias .

Los vectores preferidos para su uso en bacterias se desvelan, por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468 , que se incorpora por este documento por referencia. Otros vectores adecuados serán rápidamente evidentes para el experto .

Para la secreción de la proteína traducida . en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, la señal de secreción apropiada puede incorporarse en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido TEMER06387 pueden expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por tanto, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede añadirse al extremo N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la posterior manipulación y almacenamiento. Por tanto, pueden añadirse restos de péptidos al polipéptido para facilitar la purificación La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos según SEC ID N°: 2, y una secuencia de aminoácidos obtenible expresando el polinucleótido de SEC ID N° : 1 en un huésped apropiado. Por tanto, un péptido o polipéptido que comprende una variante de los polipéptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, está comprendida dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores están comprendidos en conjunto en el término "polipéptidos según la invención" El término "péptido de variante" o "polipéptido de variante" se define en el presente documento como un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprende una o más alteraciones tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncaciones de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido o polipéptido, respectivamente. Por consiguiente, una señal de péptido variante es una señal de péptido que comprende una o más alteraciones tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncaciones de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en la señal de péptido.

El término "polinucleotido" es idéntico al término "molécula de ácido nucleico" y en el presente documento puede leerse indistintamente. El término se refiere a una molécula de polinucleotido, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) , tanto monocatenaria como bicatenaria. Un polinucleotido puede tanto estar presente en forma aislada como estar comprendido en moléculas de ácido nucleico recombinantes o vectores, o estar comprendido en una célula huésped.

El término "polinucleotido de variante" se define en el presente documento como un polinucleotido que comprende una o más alteraciones tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncaciones de uno o más nucleótidos en una o más posiciones específicas en el polinucleotido.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como es comúnmente reconocido) y cada término puede usarse indistintamente, según requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en el presente documento están escritas de izquierda a derecha y en la dirección del extremo amino al extremo carboxi . El código de una letra de aminoácidos usados en el presente documento es comúnmente conocido en la técnica y puede encontrarse en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) Por polipéptido o proteína "aislado" está previsto un polipéptido o proteína sacado de su entorno nativo. Por ejemplo, polipéptidos y proteínas recombinantemente producidos expresados en células huésped se consideran aislados con el fin de la invención ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el procedimiento de purificación de una sola etapa desvelado en smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

El polipéptido de beta-glucosidasa TEMER06387 según la invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos conocidos en la técnica. Lo más preferentemente, para la purificación se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC").

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota que incluye, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante , los polipéptidos de la presente invención puede estar glicosilados o pueden estar no glicosilados . Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por huésped.

La invención también pone de relieve fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos según la invención .

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER06387 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° : 2) , que incluyen menos aminoácidos que el polipéptido de longitud completa, pero que presentan al menos' una actividad biológica del polipéptido de longitud completa correspondiente. Normalmente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido TEMER06387, Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos de longitud o al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos de longitud, o de una longitud hasta el número total de aminoácidos del polipéptido de la invención.

Además, otras porciones biológicamente activas, en las que otras regiones del polipéptido están delecionadas , pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención.

La invención también pone de relieve fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores del polipéptido TEMER06387.

Polipéptidos En otro aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos TEMER06387 mejorados. Los polipéptidos TEMER06387 mejorados son polipéptidos en los que al menos mejora una actividad biológica. Tales polipéptidos pueden obtenerse introduciendo mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante de TEMER06387, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden expresarse recombinantemente y cribarse para actividad biológica.

Variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención que conducen a una función de beta-glucosidasa mejorada pueden obtenerse por los génes correspondientes de la presente invención. Entre tales modificaciones están incluidas: 1. PCR propensa a error para introducir mutaciones al azar, seguido de un cribado de variantes obtenidas y aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mej oradas 2. Barajado de familias de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima beta-glucosidasa, seguido de un cribado de las variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cinéticas mejoradas Las variantes de los genes de la presente invención que conducen a un nivel elevado de ARNm y/o polipéptido, produciendo más actividad de beta-glucosidasa, pueden obtenerse por las secuencias de polinucleótidos de dichos genes. Entre tales modificaciones están incluidas: 1. Mejorar el uso de codones de tal forma que los codones se adapten (óptimamente) al huésped microbiano parental . 2. Mejorar el uso del par de codones de tal forma que los codones se adapten (óptimamente) al huésped microbiano parental 3. Adición de secuencias estabilizantes a la información genómica que codifica el polipéptido de beta-glucosidasa produciendo moléculas de ARNm con una semivida elevada Los procedimientos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas o niveles de ARNm o polipéptido elevados se describen en los documentos WO03/010183 y WO03/01311. Los procedimientos preferidos para optimizar el uso de codones en cepas microbianas parentales se describen en el documento PCT/EP2007/05594. Procedimientos preferidos para la adición de elementos estabilizantes a los genes que codifican el polipéptido de beta-glucosidasa de la invención se describen en el documento WO2005/059149.

En una realización preferida, el polipéptido TEMER06387 tiene una secuencia de aminoácidos según SEC ID N°: 2. En otra realización, el polipéptido TEMER06387 es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos según SEC ID N° : 2 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido según SEC ID N": 2, aún se diferencia en la secuencia de aminoácidos debido a variación o mutagénesis natural como se ha descrito.

En otra realización " preferida, el polipéptido TEMER06387 tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado que puede hibridarse con un ácido nucleico según SEC ID N° : 1, preferentemente bajo condiciones de hibridación altamente rigurosas.

Por consiguiente, el polipéptido TEMER06387 es preferentemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 70%, al menos el 71%, al menos el 72%, al menos el 73%, al menos el 74%, al menos el 75%, al menos el 76%, al menos el 77%, al menos el 78%, al menos el 79%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82 "o , al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o más homologa a la secuencia de aminoácidos¦ mostrada en SEC ID N° : 2 y, normalmente, retiene al menos una actividad funcional del polipéptido según SEC ID N° : 2.

Equivalentes funcionales de un polipéptido según la invención también pueden identificarse, por ejemplo, cribando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncación, del polipéptido de la invención para actividad de beta-glucosidasa . En una realización, una biblioteca variegada de variantes se genera por mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico. Puede producirse una biblioteca variegada de variantes, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de forma que un conjunto degenerado de posibles secuencias de polipéptidos sea expresable como polipéptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, para la expresión en fago) . Hay una variedad de procedimientos que pueden usarse para producir bibliotecas de posibles variantes de los polipéptidos de la invención a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. Procedimientos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y col. (1984) Science 198:1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477) .

Además, las bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención pueden usarse para generar una población variegada de polipéptidos para cribar una posterior selección de variantes. Por ejemplo, uede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencias codificantes tratando un fragmento de PCR bicatenario de la secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en las que el corte sólo se produzca aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos cortado, eliminando porciones monocatenarias de dúplex que se han vuelto a formar mediante tratamiento con SI nucleasa y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este procedimiento puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica el extremo N y fragmentos internos de diversos tamaños de la proteína de interés .

Se conocen varias técnicas en la técnica para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales de truncación y para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son aceptadas para análisis de alto rendimiento, para cribar grandes bibliotecas de genes normalmente incluyen clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM) , una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de cribado para identificar variantes de un polipéptido de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6(3) : 327-331) .

Además de la secuencia de genes TEMER06387 mostrada en SEC ID N°: 1, será evidente para el experto en la materia que los polimorfismos de la secuencia de ADN pueden existir dentro de una población dada, que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER06387. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales. , Los fragmentos de un polinucleótido según la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden servir de sondas o cebadores para una reacción de PCR.

Los ácidos nucleicos según la invención, independientemente de si codifican o no polipéptidos funcionales o no funcionales, pueden usarse como sondas de hibridación o cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que no codifican un polipéptido que tienen una actividad de TEMER06387 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica el polipéptido TE ER06387, o variantes alélicas del mismo, de una biblioteca de ADNc, por ejemplo, de microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (por ejemplo, FISH) con extensiones cromosómicas de metafase para proporcionar localización cromosómica precisa del gen TEMER06387 como se describe en Verma y col., Human Chromosomes: a Manual pf Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988) ; (3) análisis de transferencia Northern para detectar la expresión de ARNm de TEMER06387 en tejidos y/o células específicos y 4) sondas y cebadores que pueden usarse como herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable con la sonda de TEMER06387 en una muestra biológica (por ejemplo, te ido) dada.

También está englobado por la invención un procedimiento de obtención de un equivalente funcional de un gen TE ER06387. Un procedimiento tal implica obtener una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica toda o una parte de la secuencia de polipéptidos según SEC ID N°: 2 o una variante de la misma; cribar una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con la sonda marcada en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, por lo que se forman dúplex de ácido nucleico, y preparar una secuencia de genes de longitud completa de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex marcado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER06387.

En una realización, un ácido nucleico de TEMER06387 de la invención es al menos el 70%, al menos el 71%, al menos el 72%, al menos el 73%, al menos el 74%, al menos el 75%, al menos el 76%, al menos el 77%, al menos el 78%, al menos el 79%, al menos el 80%, al menos e-1 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%,, al menos el 93%, al menos el 94%,' al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o 'más homólogo a una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID N" : 1 o el complemento de la misma.

Adicionalmente se proporcionan: células huésped que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula huésped. El término "heterólogo", normalmente con respecto a la célula huésped, significa que el polinucleótido no se produce naturalmente en el genoma de la célula huésped o que el polipéptido no es naturalmente producido por esa célula.

En otra realización, la invención pone de relieve células, por ejemplo, células huésped transformadas o células huésped recombinantes que contienen un ácido nucleico englobado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la que (o en un ancestro de la cual) se ha introducido por medio de técnicas de ADN recombinante un ácido nucleico según la invención. Están incluidas células tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levadura y similares, especialmente se prefieren células de hongos filamentosos tales como Aspergillus niger o Talaromyces emersonii.

Puede elegirse una célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en un modo deseado específico. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteína pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados familiares para aquellos expertos en la materia de la molecular biología y/o microbiología para garantizar la modificación y procesamiento deseado y correcto de la proteína extraña expresada. Para este fin pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped son muy conocidas en la técnica.

Si se desea, una célula como se ha descrito anteriormente puede usarse en la preparación de un polipéptido según la invención. Un procedimiento tal normalmente comprende cultivar una célula huésped (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente) en condiciones para proporcionar la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante , por ejemplo, un vector de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en otra realización, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un polinucleótido de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped.

Preferentemente, el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión está operativamente ligada a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal. Preferentemente, la secuencia señal es nativa (homologa) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Alternativamente, la secuencia señal es extraña (heteróloga) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferentemente endógena a la célula huésped en la que se ' expresa la secuencia de nucleótidos según la invención. Ejemplos de secuencias señal adecuadas para células huésped de levadura son las secuencias señal derivadas de los genes de factor a de levadura. Similarmente , una secuencia señal adecuada para células huésped fúngicas filamentosas es, por ejemplo, una secuencia señal derivada de un gen amiloglucosidasa (AG) fúngica filamentosa, por ejemplo, el gen glaA de A. niger. Éste puede usarse en combinación con el propio promotor de amiloglucosidasa (también llamada (gluco) amilasa) , además de en combinación con otros promotores. También pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención .

Secuencias conductoras de la secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - versiones de tanto 18 como 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus) , el gen del factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen a-amilasa (Bacillus) .

Los vectores pueden transformarse o transfectarse en una célula huésped adecuada como se ha descrito anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este procedimiento puede comprender cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones que proporcionen la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.

Células huésped Por tanto, la invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferentemente, el polinucleótido es llevado en un vector para la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se elegirán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, bacterianas), fúngicas, de levadura o vegetales .

También puede elegirse un huésped heterologo en el que el polipéptido de la invención se produce en una forma que está sustancialmente libre de otras enzimas de degradación de celulosa o de degradación de hemicelulosa . Esto puede lograrse eligiendo un huésped que normalmente no produce tales enzimas.

La invención engloba procedimientos para la producción del polipéptido de la invención por medio de expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este fin, la secuencia de ADN de la invención puede usarse para amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión tales como promotores, secuencias señal de la secreción, con el fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula huésped homologa o heteróloga adecuada. Una célula huésped homologa es una célula huésped que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie que la especie de la que se deriva la secuencia de ADN.

Células huésped adecuadas son preferentemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferentemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos tales como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. En general, se prefieren células de levadura con respecto a gélulas fúngicas debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son tanto escasamente secretadas de levaduras como en algunos casos no son procesadas apropiadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levadura) . En estos casos debe seleccionarse un organismo huésped fúngico.

La célula huésped puede expresar en exceso el polipéptido, y técnicas para manipular la expresión en exceso son muy conocidas. Por tanto, el huésped puede tener dos o más copias del polinucleótido codificante (y, por tanto, el vector puede tener dos o más copias por consiguiente) .

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son aquellas de los géneros Sireptomyces y Pseudomonas. Una célula huésped de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia y Schizosaccharomyces .

Más preferentemente, una célula huésped de levadura está seleccionado del grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces arxianus var. lactis) , Hansenula poly orpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica y Schizosaccharomyces pombe.

Sin embargo, las más preferidas son células huésped fúngicas (por ejemplo, filamentosas) . Las células huésped fúngicas filamentosas preferidas están seleccionados del grupo que consiste en los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicilliu , Acremonium, Neurospora, Termoascus, Myceliophthora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces . ' Más preferentemente, una célula huésped fúngica filamentosa es de las especies que incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii , Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophthora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii , Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris.

Las células huésped según la invención incluyen células vegetales y, por tanto, la invención se extiende a organismos transgénicos tales como plantas y partes de las mismas que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. Por tanto, la planta transgénica (o genéticamente modificada) puede tener insertada (por ejemplo, establemente) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales puede realizarse usando técnicas conocidas, por ejemplo, usando un plásmido Ti o a Ri de Agrobacterlum turnefaciens . Por tanto, el plásmido (o vector) puede contener secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden emplearse derivados de los plásmidos Ti y/o Ri .

Alternativamente puede efectuarse la infección directa de una parte de una planta, tal como una. hoja, raíz o tallo. En esta técnica, la planta a infectar puede dañarse, por ejemplo, cortando la planta con una navaja o 1pinchando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. Entonces, la herida se inocula cor Agrobacterlum. La planta o parte de planta puede entonces cultivarse sobre un medio de cultivo adecuado y dejar que se desarrolle en una planta madura. La regeneración de células transformadas en plantas genéticamente modificadas puede lograrse usando técnicas conocidas, por ejemplo, seleccionando brotes transformados usando un antibiótico y sub-cultivando los brotes sobre un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de plantas y similares.

La invención también incluye células que han sido modificadas para expresar el polipéptido de beta-glucosidasa de la invención o una variante de mismo. Tales células incluyen líneas de células eucariotas superiores transitorias, o preferentemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucariotas inferiores tales como levadura y células fúngicas (por ejemplo, filamentosas) o células procariotas tales como células bacterianas.

También es posible que los polipéptidos de la invención se expresen transitoriamente en una línea celular o sobre una membrana tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus . Tales sistemas, que están adaptados para expresar los polipéptidos según la invención, también están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

Según la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede efectuarse cultivando huéspedes de expresión microbianos que han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención en un medio de fermentación nutritivo convencional.

Producción de polipéptido/enzima Las células huésped recombinantes según la invención pueden cultivarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula huésped están disponibles condiciones de cultivo que son propicias para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad de células deseada o el título del polipéptido, el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera usando procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelolítica , etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio,, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, cinc, hierro, etc.). Opcionalmente puede incluirse un inductor (por ejemplo, celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) .

La selección del medio apropiado puede basarse en la elección del huésped de expresión y/o basarse en los requisitos reguladores de la construcción de expresión. Tales medios son conocidos para aquellos expertos en la materia. El medio puede contener, si se desea, componentes adicionales que favorecen los huéspedes de expresión transformados con respecto a otros microorganismos posiblemente contaminantes.

La producción de polipéptido por el huésped transformado (fermentación) puede realizarse según cualquier procedimiento conocido. El tiempo de producción puede prolongarse durante un periodo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 días. Puede ser un procedimiento de lotes, continuo o de lotes alimentados, adecuadamente a una temperatura en el intervalo de 0-100°C o 0-80°C, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 60 °C y/o a un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 55 °C y/o a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Las condiciones apropiadas se seleccionan normalmente basándose en la elección del huésped de expresión y el polipéptido a expresar .

Después de la fermentación, si fuera necesario, las células pueden eliminarse del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de detenerse la fermentación o después de eliminarse las células, el polipéptido de la invención puede entonces recuperarse y, si se desea, purificarse y aislarse mediante medios convencionales .

Composiciones de polipéptidos/enzimas La invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Cuando el polipéptido de la invención es una celulasa, una composición de la invención comprenderá normalmente una hemicelulasa y/o una pectinasa, además del polipéptido de la invención .

Cuando el polipéptido de la invención es una hemicelulasa, una composición de la invención comprenderá normalmente una celulasa y/o una pectinasa, además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención es una pectinasa, una composición de la invención comprenderá normalmente una celulasa y/o una hemicelulasa, además del polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender una, dos o tres o más clases de celulasa, por ejemplo, una, dos o todas de una endo-1 , 4 - ß-glucanasa (EG) , una exo-celobiohidrolasa (CBH) y una ß-glucosidasa (BG) .

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene la misma actividad enzimática, por ejemplo, el mismo tipo de actividad de celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que el proporcionado por un polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que el proporcionado por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionado por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionado por una hemicelulasa/pectinasa adicional.

En el presente documento, una celulasa es cualquier polipéptido que puede degradar celulosa. Un polipéptido que puede degradar celulosa es uno que puede catalizar el procedimiento de rotura de celulosa en unidades más pequeñas, tanto parcialmente, por ejemplo, en celodextrinas , como completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Tal degradación tendrá normalmente lugar a modo de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que puede degradar hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que puede degradar una hemicelulosa es uno que puede catalizar el procedimiento de rotura de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, tanto parcialmente, por ejemplo, en oligosacáridos , como completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo, monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación tendrá normalmente lugar a modo de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una pectinasa es cualquier polipéptido que puede degradar pectina. Un polipéptido que puede degradar pectina es uno que puede catalizar el procedimiento de rotura de pectina en unidades más pequeñas, tanto parcialmente, por ejemplo, en oligosacáridos, como completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa según la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradación tendrá normalmente lugar a modo de una reacción de hidrólisis.

Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo^-l,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- (1, 3) (1,4) -glucanasa.

En el presente documento, una celobiohidrolasa es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas . Esta enzima también puede denominarse celulasa 1,4-ß-celobiosidasa, 1, 4- -celobiohidrolasa, 1,4-ß-?-glucanocelobiohidrolasa, avicelasa, exo-1, 4^-D-glucanasa, exo-glucanasa o exoglucanasa. Puede tener el código EC EC 3.2.1.91. Las celobiohidrolasas pueden subdividirse en celobiohidrolasa I (CBH I) y celobiohidrolasa II (CBH II) . CBH I se define como celobiohidrolasas que hidrolizan celulosa, predominantemente de los extremos reductores, separando celobiosa. CBH II se define como celobiohidrolasas que hidrolizan celulosa, predominantemente de los extremos no reductores, separando celobiosa.

En el presente documento, una endo-ß-?, 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que puede catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 4 - ß-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o ß-D-glucanos de cereal. Un polipéptido tal también puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Esta enzima también puede denominarse celulasa, avicelasa, ß-1,4-endoglucanohidrolasa, ß-1 , 4 -glucanasa, carboximetilcelulasa, celudextrinasa, endo-1, 4 - ß-D-g,lucanasa, endo-l, 4-ß-?-glucanohidrolasa, endo-1 , 4 - ß-glucanasa o endoglucanasa. CEA es en el presente documento una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basándose en su estructura 3D se clasifica bajo la familia de glicosil hidrolasa 5 (GH5) . Actividades conocidas para los miembros de la familia GH5 incluyen quitosanasa (EC 3.2.1.132); ß-manosidasa (EC 3.2.1.25); celulasa (EC 3.2.1.4); glucano 1 , 3^-glucosidasa (EC 3.2.1.58); liqueninasa (EC 3.2.1.73); glucano endo-1, 6- ß-glucosidasa (EC 3.2.1.75); mañano endo-ß-? , 4-manosidasa (EC 3.2.1.78); endo-ß- 1 , 4 -xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa ß - 1 , 4 -celobiosidasa (EC 3.2.1.91); endo-ß-?, 6 -galactanasa (EC 3.2.1.'-); ß-1,3-mananasa (EC 3.2.1.-); endo- -1 , 4 -glucanasa específica para xiloglucano (EC 3.2.1.151); mañano transglicosilasa (EC 2.4.1.-). CEB es en el presente documento una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basándose en su estructura 3D se clasifica bajo la familia de glicosil hidrolasa 7 (GH7) . Actividades conocidas para miembros de la familia GH7 incluyen endo-ß-1, 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4); celobiohidrolasa · [de acción reductora de extremos] (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132); endo- - 1 , 3 - 1 , 4 -glucanasa (EC 3.2.1.73) En el presente documento, una ß-glucosidasa (abreviada BG) (EC¦ 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-glucosa no reductores de extremos con liberación de ß-D-glucosa. Un polipéptido tal puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D- fucósido . Esta enzima también puede denominarse amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa , celobiasa o gentiobiasa.

En el presente documento, una ß- (1, 3) (1, 4) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4 - ß-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces en 1,3 y 1,4. Un polipéptido tal puede actuar sobre liquenina y ß-D-glucanos de cereal, pero no sobre ß-D-glucanos que sólo contienen enlaces en 1,3 ó 1,4. Esta enzima también puede denominarse liqueninasa, 1, 3-1, 4 - -D-glucano 4-glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo-ß-1, 3-1, 4-glucanasa, liquenasa o ß-glucanasa de enlace mixto. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo- 1 , 3 (4 ) -beta-glucanas . Este tipo de enzima hidroliza enlaces en 1,3 ó 1,4 en beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor participa en el enlace a hidrolizar está por sí mismo sustituido en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1, 3 -beta-glucanasa, laminarinasa, 1 , 3 - (1 , 3 ; 1, 4 ) -beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereal.

Una composición según la invención puede comprender una enzima de la familia GH61 o cualquier otra enzima que tenga actividad potenciadora de celulasa.

La actividad potenciadora de celulasa se define en el presente documento como potenciar la actividad de al menos una celulasa. Cuando la proteína beta-glucosidasa de la invención está presente en una mezcla con una o más celulasas, por ejemplo, en una mezcla con celobio idrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG) , potenciará la actividad de estas celulasas, que producirá una mayor actividad de la mezcla para degradar celulosa. Las enzimas en la familia GH61 se clasificaron originariamente como una familia de glucósido hidrolasas basándose en la medición de la actividad de endo-1 , 4 -b-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia (endoglucanasa (EC 3.2.1.4)). La estructura y modo de acción de estas enzimas son ciertamente no canónicos y no pueden considerarse como glicosidasas de buena fe. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy basándose en su capacidad para potenciar la rotura de lignocelulosa cuando se usa conjuntamente con una celulasa o una mezcla de celulasas. Una visión general de miembros conocidos de la familia GH61 se facilita en la Figura 5 de Harris, PV y col., Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa , por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa , una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa , una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

En el presente documento, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que puede catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 4-ß -D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede denominarse endo-1, 4^-xilanasa o 1 , 4 - -D-xilano xilanohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que puede hidrolizar enlaces 1 , 4 -xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos .

En el presente documento, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de 1 , 4 - ß-D-xilanos , para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Tales enzimas también pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima también puede denominarse xilano 1, 4^-xilosidasa, - 1, 4^-D-xilano xilohidrolasa, exo-1, 4-p-xilosidasa o xilobiasa.

En el presente documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que puede actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces en (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede denominarse a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En el presente documento, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que puede catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también puede denominarse alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónicp 4-0-metilado, que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. La alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1, 2 -glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1, 2- (4-O-metil) glucuronosilo .

En el presente documento, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que puede catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos. Un polipéptido tal puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo, pero, normalmente, no de triacilglicerol . Un polipéptido tal no actúa normalmente sobre mañano acetilado o pectina .

En el presente documento, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que puede catalizar una reacción de la forma: feruloil -sacárido + H(2)0 =. ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Normalmente puede catalizar la hidrólisis del grupo -hidroxi-3 -metoxicinnamoílo (feruloílo) de un azúcar esterificado, que es normalmente arabinosa en sustratos 'naturales' . El acetato de p-nitrofenol y ferulato de metilo son normalmente sustratos más pobres. Esta enzima también puede denominarse cinnamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinnamoil esterasa. También puede denominarse una enzima accesoria de hemicelulasa, ya que puede ayudar a xilanasas y pectinasas a romper la hemicelulosa y pectina de la pared' celular de planta .

En el presente documento, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que puede catalizar una reacción de la forma: cumaroil -sacárido + H(2)0 = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también puede denominarse trans-4- cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa.

Esta enzima también se encuentra dentro de EC 3.1.1.73, por lo que también puede denominarse una feruloil esterasa.

En el presente documento, una -galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores de extremos en a-D-galactósidos , que incluyen oligosacáridos de galactosa, galactomananos , galactanos y arabinogalactanos . Un polipéptido tal también puede ser . capaz de hidrolizar OÍ-D-fucósidos. Esta enzima también puede denominarse melibiasa.

En el presente documento, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores de extremos en ß-D-galactósidos . Un polipéptido tal también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos . Esta enzima también puede denominarse exo- (l->4) - ß -D-galactanasa o lactasa .

En el presente documento, una ß-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis al azar de enlaces 1 , 4 - ß-D-manosídicos en mañanos , galactomananos y glucomananos . Esta enzima también puede denominarse mañano endo-1 , 4 - ß-manosidasa o endo- 1 , 4 -mananasa .

En el presente documento, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-manosa no reductores de extremos en ß -D-mannósidos . Esta enzima también puede denominarse mananasa o manasa.

Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo, una endo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta-galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa .

En el presente documento, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis al azar de enlaces 1,4- -D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos . Esta enzima también puede denominarse poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli ( 1 , 4 - -D-galacturónido) glucanohidrolasa.

En el presente documento, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que puede catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato.

La enzima también puede conocerse como pectina esterasa, pectina desmetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa .

En el presente documento, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima que puede catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima también puede conocerse como arabinogalactano endo-1, 4^-galactosidasa, endo-l,4-p-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4 - ß-D-galactanohidrolasa .

En el presente documento, una pectina acetil esterasa se define en el presente documento como cualquier enzima que tiene una actividad de acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos GalUA de pectina.

En el presente documento, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima que puede catalizar la escisión eliminativa de éster metílico de (l?4)-a-D-galacturonano dando oligosacáridos con grupos -desoxi- 6 -0-metil-oí-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede conocerse como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturónica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o ( 1?4 ) - 6 -O-metil -a-D-galacturonano liasa.

En el presente documento, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima que puede catalizar la escisión eliminativa de ( l? ) -a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4 -desoxi-a-D-galact-4 -enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede conocerse como transeliminasa poligalacturónica, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, liasa péctica, ácido a-1, 4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1, 4 -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (l-»4 ) -a-D-galacturonano liasa .

En el presente documento, una alfa-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de residuos de a-L-ramnosa no reductores de extremos en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano . Esta enzima también puede conocerse como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa .

En el presente documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptidq que puede hidrolizar ácido péctico a partir del extremo no reductor, liberando digalacturonato . La enzima también puede conocerse como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .

En el presente documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido que puede catalizar: (1,4-a-D-galacturónido) n + H20 = (1, 4 -a-D-galacturónido) n-1 + D-galacturonato . La enzima también puede conocerse como galacturano 1, 4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, éxo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanoasa, exopoli-D-galacturonasa o poli (1 , 4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa .

En el presente documento, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido que puede catalizar la escisión eliminativa de 4- (4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato a partir del extremo reductor de pectato, es decir, pectina des-esterificada . Esta enzima puede conocerse como pectato disacáridó-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o ( l?4 ) -a-D-galacturonano disacárido- liasa reductora de extremos .

En el presente documento, ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que puede hidrolizar el enlace entre ácido galactosilurónico y ramnopirariosilo en un modo endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes que consisten en el disacárido [ácido (1, 2) -alfa-L-ramnoil-(1 , 4 ) -alfa-galactosilurónico] .

En el presente documento, ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que es cualquier polipéptido que puede escindir enlaces a-L-Rap- (1?4 ) -a-D-GalpA en un modo endo en ramnogalacturonano por eliminación beta.

En el presente documento, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación del esqueleto de ramnosa alternante y residuos de ácido galacturónico en ramnogalacturonano.

En el presente documento, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que puede hidrolizar ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes en un modo exo .

En el presente documento, xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre xilogalacturonano escindiendo el esqueleto de ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa en un modo endo. Esta enzima también puede conocerse como xilogalacturonano hidrolasa.

En el presente documento, una cx-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que puede actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces en (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede denominarse a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En el presente documento, endo-arabinanasa (EC , 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que puede catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 5 -a-arabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos . La enzima también puede conocerse como endo-arabinasa, arabinano endo-1, 5-a-L-arabinosidasa, endo-l,5-a-L-arabinanasa, endo-a-?, 5-arabanasa; endo-arabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1, 5-a-L-arabinanoohidrolasa.

Una composición de la invención comprenderá normalmente al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido según la invención) . Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa. Una composición tal también puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.

Una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composición de la invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas) , además de enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros restos, tales como azúcares (glicopeptidasas) . Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención incorporada en el presente documento por referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas .

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos que incluyen fospoglicéridos , lipoproteínas , diacilgliceroles y similares. En plantas, los lípidos se usan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua e infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, además de cutina y suberina .

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructura de polímeros de lignina. Enzimas que pueden romper la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la materia conocidas por despolimerizar o romper de otro modo polímeros de lignina. También están incluidas enzimas que pueden hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (notablemente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen, pero no se limitan a, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.32) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que pueden transferir grupos glicosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además de la transferencia de un grupo glicosilo de un donante que contiene glicosilo a compuesto que contiene glicosilo, el aceptor, las enzimas también pueden transferir el grupo glicosilo a agua como aceptor. Esta reacción también se conoce como una reacción de hidrólisis, en lugar de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede usarse en la invención es una ß-glucanosiltransferasa. Una enzima tal puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3) (l,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo, ß-glucuronósido para dar un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para su uso en la invención, por ejemplo, ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición de la invención puede comprender una expansina o proteína similar a expansina tal como una swolenina (véase Salheimo y col., Eur . J. Biohem. 269 , 4202-4211, 2002) o una o proteína similar a swolenina.

Las expansinas participan en la relajación de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de las células de planta. Se ha propuesto que las expansinas rompen enlaces de hidrógeno entre celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta forma, se cree que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y la dilatación de la pared celular. La swolenina, una proteína similar a expansina, contiene un dominio de la familia 1 del módulp de unión a hidratos de carbono del extremo N (CBD) y un dominio similar a expansina del extremo C. Para los fines de la presente invención, una proteína similar a expansina o proteína similar a swolenina puede comprender uno o ambos de tales dominios y/o puede romper la estructura de paredes celulares (tal como romper la estructura de celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición de la invención puede comprender el producto de polipéptido de una proteína de integración de celulosa, escafoldina o proteína similar a escafoldina, por ejemplo, CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente.

Las escafoldinas y las proteínas de integración de celulosa son subunidades de integración multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multi-enzimático. Esto se lleva a cabo por la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un' dominio de cohesión sobre escafoldina y un dominio de dockerina sobre cada unidad enzimática. La subunidad de dockerina también lleva un módulo de unión a celulosa (CBM) que media en la unión del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína de integración de celulosa para los fines de la presente invención puede comprender uno o ambos de tales dominios .

Una composición de la invención puede comprender una proteína inducida por celulosa o proteína moduladora, por ejemplo, como se codifica por el gen cipl o cip2 o genes similares de Trichoderma reesei / Hypocrea jecorina (véase Foreman y col., J. Biol , Chem. 278 (34) , 31988-31997, 2003). El producto de polipéptido de estos genes son proteínas bimodulares que contienen un módulo de unión a celulosa y un dominio cuya función o actividad no puede relacionarse con familias de glicosil hidrolasa conocidas. Todavía, la presencia de un módulo de unión a celulosa y la c'ó-regulacíón de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indica actividades previamente no reconocidas con posible función en la degradación de biomasa.

Una composición de la invención puede estar compuesta por un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptidos o cualquier combinación de estas clases de polipéptidos.

Una composición de la invención puede estar compuesta por polipéptidos, por ejemplo, enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo, enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en medio, en el que las cepas secretan proteínas y enzimas al medio,-(4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3) ; y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos, por ejemplo, enzimas. Pueden obtenerse diferentes polipéptidos, por ejemplo, enzimas en una composición de la invención a partir de diferentes fuentes.

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y composiciones de polipéptidos según la invención pueden usarse en muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo, pueden usarse para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables pueden luego convertirse, como parte de un procedimiento de biocombustible , en biogás o etanol, butanol , isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente los polipéptidos y sus composiciones pueden usarse como enzima, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios, en composiciones de detergente, en la industria del papel y la pulpa y en formulaciones antibacterianas, en productos farmacéuticos tales como pastillas para chupar para la garganta, pastas de dientes y enjuague bucal. Algunos de los usos se ilustrarán más adelante en más detalle.

En los usos y procedimientos descritos más adelante, los componentes de las composiciones descritas anteriormente pueden proporcionarse concomitantemente (es decir, como una única composición por sí misma) o por separado o secuencialmente .

La invención también se refiere al uso del polipéptido de beta-glücosidasa según la invención y composiciones que comprenden una enzima tal en procedimientos industriales .

A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procedimientos, el polipéptido de beta-glucosidasa según la invención puede poner de relieve varias ventajas significativas con respecto a las enzimas actualmente usadas. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como menores, costes de producción, mayor especificidad hacia el sustrato, antigenicidad reducida, menores actividades secundarias no deseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y de temperatura más adecuados, no inhibición por productos derivados de lignina hidrófobos o menos inhibición de productos o, en el caso de la industria alimentaria, un mejor sabor o textura de un producto final, además de calidad alimentaria y aspectos kosher .

En principio, un polipéptido de beta-glucosidasa o composición de la invención puede usarse en cualquier procedimiento que requiera el tratamiento de un material que comprende polisacárido. Por tanto, un polipéptido o composición de la invención puede usarse en el tratamiento de material de polisacárido. En el presente documento, el material de polisacárido es un material que ^comprende o consiste esencialmente en uno, o más normalmente, más de un polisacárido.

Normalmente, las plantas y el material derivado de las mismas comprenden cantidades significativas de material de polisacárido de no almidón. Por consiguiente, un polipéptido de la invención puede usarse en el tratamiento de una planta o material fúngico o un material derivado de la misma.

Lignocelulosa Un componente importante de material de polisacárido de no almidón de planta es lignocelulosa (también denominada en el presente documento biomasa lignocelulolítica) . La lignocelulosa es material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros de hidrato de carbono (celulosa y hemicelulosas) están estrechamente unidos a la lignina por enlaces de hidrógeno y covalentes . Por consiguiente, un polipéptido de la invención puede usarse en el tratamiento de material lignocelulolítico . En el presente documento, material lignocelulolítico es un material que comprende o consiste esencialmente en lignocelulosa. Por tanto, en un procedimiento de la invención para el tratamiento de un polisacárido de no almidón, el polisacárido de no almidón puede ser un material lignocelulósico/biomasa .

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para tratar un sustrato que comprende polisacárido de no almidón, en que el tratamiento comprende la degradación y/o hidrólisis y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

La degradación en este contexto indica que el tratamiento produce la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia ; péctica, es decir, están presentes sacáridos de longitud más corta como resultado del tratamiento que lo están presentes en un polisacárido de no almidón sin tratar similar. Por tanto, degradación en este contexto puede producir la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.

Todas las plantas contienen polisacárido de no almidón, al igual que prácticamente todos los materiales de polisacárido derivados de planta. Por consiguiente, en un procedimiento de la invención para el tratamiento de sustrato que comprende un polisacárido de no almidón, . dicho sustrato puede proporcionarse en forma de una planta o un material derivado de planta o un material que comprende una planta o un material derivado de planta, por ejemplo, una pulpa vegetal, un extracto de planta, un alimento o ingrediente para el mismo, una tela, un textil o una prenda de ropa.

Biomasa lignocelulolitica adecuada para su uso en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, extractos orgánicos comerciales, escombros de construcción y demolición, residuos sólidos municipales, papel usado y desechos de jardín. Formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de de maíz, grano de maíz que incluye fibra de granos, ; productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) frecuentemente llamado "fibra", además de residuos sólidos municipales, papel usado y desechos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel usado y residuos de la molienda de pulpa y papel. "Biomasa agrícola" incluye ramas, matas, cañas, maíz y cascaras de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, pastos, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, leños, raíces, árboles jóvenes, cultivos madereros de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, verduras, cáscaras de fruta, parras, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, vainas de avena, y maderas duras y blandas (que no incluyen maderas con materiales perjudiciales) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados partir de procedimientos agrícolas que incluyen actividades agrarias y forestales, que incluyen específicamente desechos de madera forestal. La biomasa agrícola pueden ser cualquiera de la individualmente anteriormente establecida o en cualquier combinación o mezcla de los mismos. Otros ejemplos de biomasa adecuada son hojas del primer piso foliar de orquídeas, chaparral, residuos de molienda, residuos de madera urbana, residuos municipales, residuos de la tala ; de árboles, rastrojos forestales, cultivos madereros de rotación corta, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, vainas de soja, vainas de arroz, paja de- arroz, pienso de gluten de maíz, vainas de avena, caña de azúcar, hojas y tallos del maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cáscaras de maíz, pasto de pradera, pasto de gama, cola de zorra; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de frutos cítricos, vainas de semilla, residuos animales celulósicos, hierba de césped cortado, algodón, alga marina, árboles, arbustos, pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda en húmedo o seco de granos, residuos sólidos municipales, papel usado, desechos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel usado, pulpa, residuos de la molienda del papel, ramas, matas, cañas, maíz, cáscaras de maíz, un cultivo energético, un fruto, una flor, un grano, un pasto, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un leño, una raíz, un árbol joven, un arbusto, pasto varilla, un árbol, una verdura, cascara de fruta, una parra, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, vainas de avena, madura dura o blanda, material residual orgánico generado a partir de un procedimiento agrícola, residuos de madera forestal, o una combinación de cualquiera dos o más de los mismos.

Aparte de la biomasa virgen o materias primas ya procesadas en industrias alimentarias y de piensos o del papel y la pulpa, la biomasa/matéria prima puede pretratarse adicionalmente con modificación térmica, mecánica y/o química 0 cualquier combinación de tales procedimientos con el fin de potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, la materia prima puede pretratarse opcionalmente con modificación térmica, mecánica y/o química o cualquier combinación de tales procedimientos con el fin de potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, de ningún modo conocido en la técnica. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a agua (caliente), vapor (explosión de vapor) , un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de cualquiera dos o más de los mismos. Un pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento térmico, por ejemplo, entre 150-220°C durante 1 a 30 minutos.

Presacarificación Después de la etapa de pretratamiento puede utilizarse una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica incubación con una enzima o mezcla de enzimas. La etapa de presacarificación puede realizarse a muchas temperaturas diferentes, pero se prefiere que la etapa de presacarificación se produzca a la temperatura más apropiada para la mezcla de enzimas que se aplica, o el óptimo de enzimas predic as de las enzimas a aplicar. La temperatura de la etapa de presacarificación puede oscilar de aproximadamente 10°C a aproximadamente 95 °C, aproximadamente 20 °C a aproximadamente 85 °C, aproximadamente 30 °C a aproximadamente 70 °C, aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C, aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C, preferentemente aproximadamente 37°C a aproximadamente 80 °C, más preferentemente aproximadamente 60-70°C, ,' incluso más preferentemente aproximadamente 65 °C. El pH de la mezcla de presacarificación puede oscilar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero es preferentemente aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, más preferentemente aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0, incluso más preferentemente aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De nuevo, el pH puede ajustarse para maximizar la actividad enzimática y puede ajustarse con la adición de la enzima.

La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarif icación puede producirse de varios minutos a varias horas, tales como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, preferentemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, lo más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas. El tratamiento de celulasa puede producirse de varios minutos a varias horas , tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, preferentemente aproximadamente 12 horas ¦ a aproximadamente 72 horas, más preferentemente aproximadamente 24 a 48 horas.

Sacarificación La invención proporciona un procedimiento para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico, procedimiento que comprende poner en contacto un polipéptido de la invención para una composición de la invención con el material lignocelulósico.

Un procedimiento tal permite que se generen azúcares libres (monómeros) y/o oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulósic . Estos procedimientos implican convertir la biomasa lignocelulósica en azúcares libres y pequeños oligosacáridos con un polipéptido o composición de la invención .

El procedimiento de convertir un hidrato de carbono complejo tal como lignocelulcsa en azúcares permite preferentemente la conversión en azúcares fermentables . Un procedimiento tal pueden denominarse "sacarificación" . Por consiguiente, un procedimiento de la invención puede producir la liberación de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tales como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención incluye procedimientos que utilizan el polipéptido de la composición de la invención descrito anteriormente junto con otras enzimas o tratamientos físicos tales como temperatura y pH para convertir la biomasa de plantas lignocelulósicas en azúcares y oligosacáridos .

Aunque la composición se ha tratado como una mezcla única, se reconoce que las enzimas pueden añadirse secuencialmente cuando la temperatura, pH y otras condiciones pueden alterarse para aumentar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente puede determinarse un pH y temperatura óptimos para la mezcla- de enzimas.

Las enzimas se hacen reaccionar con sustrato bajo cualquier condición apropiada. Por ejemplo, las enzimas pueden incubarse a aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60oC, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C, aproximadamente 90 °C o superior. Es decir, pueden incubarse a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 95 °C, por ejemplo, en tampones de fuerza iónica baja a media y/o de pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica media" está previsto que el tampón tenga una concentración iónica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente iónico individual. El pH puede oscilar de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6 , aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7 , aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH será de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol se prefiere un medio ácido, por ejemplo, pH=4, mientras que para la producción de biogás se desea pH neutro, por ejemplo, pH=7. La incubación de combinaciones de enzimas bajo estas condiciones produce la liberación o liberación de cantidades sustanciales del azúcar de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial está previsto al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.

Los polipéptidos, tales como enzimas, pueden producirse tanto exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislarse y añadirse, por ejemplo, a materia prima lignocelulósica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa de células brutas, o material vegetal (tal como hojas y tallos del maíz) , y similares, puede añadirse a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, la masa de células brutas o medio de producción de enzimas o material vegetal puede tratarse para evitar adicionalmente el crecimiento microbiano (por ejemplo, mediante calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , luego añadirse a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzimas brutas pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede producirse en una fermentación que usa materia prima (tal como hojas y tallos del maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima (s). De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden servir por sí mismas de materia prima lignocelulósica y añadirse a materia prima lignocelulósica.

Fermentación de azúcares Los azúcar fermentables pueden convertirse en productos de fermentación de valor añadido útiles, incluyendo ejemplos no limitantes aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos para animales, productos químicos de especialidad, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, que incluyen etanol combustible. En particular, los azúcares pueden usarse como materias primas para la fermentación en productos químicos, plásticos tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles que incluyen etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás .

Por ejemplo, en el procedimiento de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, sirviendo de materia prima, de manera que convierte este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol u otros productos de fermentación útiles.

Los azúcares liberados de la biomasa pueden convertirse en productos de fermentación útiles tales como uno de aquellos que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para pienso para animales, productos químicos' de especialidad, materias primas químicas, plásticos y etanol, que incluyen etanol combustible .

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de un producto de fermentación, procedimiento que comprende: a. degradar lignocelulosa usando un procedimiento como se describe en el presente documento; y b. fermentación del material resultante, por lo que se prepara un producto de fermentación.

La fermentación puede llevarse a cabo bajo condiciones aerobias o anaerobias. Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones micro-aerófilas o de oxígeno limitado.

Un procedimiento de fermentación anaerobio se define en el presente documento como un procedimiento de fermentación ejecutado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente aproximadamente 5 o menos , aproximadamente 2,5 o menos o aproximadamente 1 mmol/l/h o menos, y en el que moléculas orgánicas sirven de tanto donantes de electrones como aceptores de electrones .

Un procedimiento de fermentación de oxígeno limitado es un procedimiento en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación del oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo del gas de entrada, además de la mezcla real/propiedades de transferencia de masa del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un procedimiento bajo condiciones de oxígeno limitado, la tasa de consumo de oxígeno es al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente al menos aproximadamente 6 e incluso más preferentemente al menos aproximadamente 7 mmol/l/h.

Un procedimiento para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente la recuperación del producto de fermentación.

SFF La fermentación y sacarificación también pueden ejecutarse en un modo de sacarificación y fermentación simultánea (SFS) . Una de las ventajas de este modo es la reducción de la inhibición de azúcares en la hidrólisis enzimática (la inhibición de azúcares en celulasas se describe por Caminal B&B Vol XXVII Pp 1282-1290) .' Productos de fermentación Los productos de fermentación que pueden producirse según la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para pienso para animales, productos químicos de especialidad, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, que incluye etanol combustible (entendiéndose que el término "etanol" incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos de valor añadido específicos que pueden producirse mediante los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biog s) ; ácido láctico; un plástico; un producto químico de especialidad; un ácido orgánico, que incluye ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico; ácido acético; 1, 3 -propano-diol ; etileno, glicerol; un disolvente; un suplemento para pienso para animales; un producto farmacéutico tal como un antibiótico de ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima industrial tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogás La invención también proporciona el uso de un polipéptido o composición descrita en el presente documento en un procedimiento para la preparación de biogás . Biogás normalmente se refiere a un gas producido por la rotura biológica de materia orgánica, por ejemplo, material que contiene hidrato de carbono de no almidón, en : ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir de material biogénico y es un tipo de biocombustible . Un tipo de biogás se produce por digestión o fermentación anaerobia de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, residuos municipales y cultivos energéticos. Este tipo de biogás comprende principalmente metano y dióxido de carbono. El gas metano puede quemarse u oxidarse con oxígeno. El aire contiene 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite usar el biogás como combustible. El biogás puede usarse como combustible de bajo coste en cualquier país para cualquier fin de calentamiento, tal como para cocinar. También puede utilizarse en modernas plantas de gestión de residuos en las que puede usarse para operar cualquier tipo de motor térmico, para generar tanto potencia mecánica como eléctrica.

La primera etapa en la producción de biogás microbiano consiste en la degradación enzimática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo, hidrato de carbono de no almidón) . Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para preparación de un biogás en el que un sustrato que comprende hidrato de carbono de no almidón se pone en contacto con un polipéptido o composición de la invención, por lo que da material fermentable que puede convertirse en un biogás por un organismo tal como un microorganismo. En un procedimiento tal, un polipéptido de la invención puede proporcionarse a modo de un organismo, por ejemplo, un microorganismo que expresa un polipéptido tal.

Uso de enzimas en productos alimenticios Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden usarse en un procedimiento de procesamiento de material vegetal para degradar o modificar los constituyentes de celulosa o hemicelulosa o sustancia péctica de las paredes celulares del material vegetal o fúngico. Tales procedimientos pueden ser útiles en la preparación de producto alimenticio. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para preparar un producto alimenticio, procedimiento que comprende incorporar un polipéptido o composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también proporciona un procedimiento- de procesamiento de un material vegetal, procedimiento que comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material (vegetal) . Preferentemente, el material vegetal es una pulpa vegetal o extracto de planta, tal como zumos.

Los materiales vegetales y que contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia péctica incluyen pulpa vegetal, partes de plantas y extractos vegetales. En el contexto de la presente invención, un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que puede derivarse de material vegetal por extracción (mecánica y/o química) , procesamiento o por otras técnicas de separación. El extracto puede ser zumo, néctar, base o concentrados preparados a partir de los mismos. El material vegetal puede comprender o derivarse de verduras, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, judía de soja, guisantes) o frutas, por ejemplo, fruta de pepita o de semilla (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y ¦ otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo, polen, de pinos) o cereal (avena, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (a hidrolizar) también puede ser residuos agrícolas tales como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja de trigo, cáscaras de nueces (trituradas) o materiales reciclables, por ejemplo, papel (usado) .

Por tanto, los polipéptidos de la invención pueden usarse para tratar material vegetal que incluye pulpa vegetal y extractos vegetales . También pueden usarse para tratar alimentos líquidos o sólidos o ingredientes para alimentos comestibles, o usarse en la extracción de aceites vegetales, almidón o como un espesante en alimentos.

Normalmente, los polipéptidos de la invención se usan como una composición/preparación de enzimas como se ha descrito anteriormente. La composición se añadirá generalmente a pulpa vegetal obtenible por, por ejemplo, procesamiento mecánico tal como prensando o moliendo material vegetal. La incubación de la composición con la planta se llevará normalmente a cabo durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, preferentemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferentemente de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 55°C, por ejemplo, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25 °C, óptimamente aproximadamente 20 °C y puede usarse de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, preferentemente de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, óptimamente aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material a tratar.

Toda(s) la(s) enzima (s) o sus composiciones usadas pueden añadirse secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación de enzimas, el material vegetal puede macerarse primero (por ejemplo, a uno puro) o licuarse. Usando los polipéptidos de la invención pueden mejorarse parámetros de procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, viscosidad del extracto y/o calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención puede añadirse al zumo bruto obtenido prensando o licuando la pulpa vegetal. El tratamiento del zumo bruto se llevará a cabo de un modo similar a la pulpa vegetal con respecto a la dosificación, temperatura y tiempo de mantenimiento. De nuevo pueden incluirse otras enzimas tales como aquellas tratadas previamente. Condiciones de incubación típicas son como se describen en el párrafo previo.

Una vez se ha incubado el zumo bruto con los polipéptidos de la invención, el zumo se centrifuga o (ultra) filtra luego para producir el producto final.

Después del tratamiento con el polipéptido de la invención, el producto (final) puede tratarse con calor, por ejemplo, a aproximadamente 100 °C durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, en condiciones que inactivan parcialmente o completamente el (los) polipéptido ( s ) de la invención.

Una composición que contiene un polipéptido de la invención también puede usarse durante la preparación de purés de frutas o verduras.

En el horneado, el polipéptido puede ¦ mejorar la estructura de la masa, modificar su pegajosidad o flexibilidad, mejorar el volumen de la barra de pan y/o la estructura de la miga o conferir mejores características texturales tales como rotura, corte en rebanadas o calidad de la miga.

Por tanto, la presente invención se refiere a procedimientos para preparar una masa o un producto alimenticio basado en cereal que comprende incorporar en la masa un polipéptido o composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la masa o el producto alimenticio basado en cereal obtenido a partir de la masa con respecto a una masa o un producto alimenticio basado en cereal en el que el polipéptido no está incorporado.

La preparación del producto alimenticio basado en cereal según la invención puede comprender adicionalmente etapas conocidas en la técnica tales como hervir, secar, freír, cocer al vapor u hornear la masa obtenida.

Los productos que están hechos de una masa que está hervida son, por ejemplo, fideos hervidos, bolas de masa, productos que están hechos de masa frita son, por ejemplo, donuts, buñuelos, fideos fritos, productos que están hechos de masa cocida son, por ejemplo, bollos cocidos y fideos cocidos, ejemplos de productos hechos de masa secada son pasta y fideos secados y ejemplos de productos hechos de masa horneada son pan, galletas, pastel.

El término "propiedad mejorada" se define en el presente documento como cualquier propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto basado en cereal, que mejora por la acción del polipéptido según la invención con respecto a una masa o producto en el que el polipéptido según la invención no está incorporado. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a, aumento de la resistencia de la masa, aumento de la elasticidad de la masa, aumento de la estabilidad de la masa, maquinabilidad mejorada de la masa, resistencia a la impermeabilización mejorada de la masa, pegajosidad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, aumento del volumen de producto basado en cereal, formación de burbujas reducida del producto basado en cereal, estructura de la miga mejorada del producto horneado, esponjosidad mejorada del producto basado en cereal, aroma mejorado del producto basado en cereal, anti-endurecimiento mejorado del producto basado en cereal. Propiedades mejoradas relacionadas con el tipo de pastas y fideos de productos basados en cereales son, por ejemplo, firmeza mejorada, pegajosidad reducida, cohesividad mejorada y pérdida por coc:ción reducida.

La propiedad mejorada puede determinarse por; comparación de una masa y/o un producto basado en cereal preparado con y sin adición de un polipéptido de la presente invención. Las cualidades organolépticas pueden evaluarse usando procedimientos bien establecidos en la industria de los productos horneados y puede incluir, por ejemplo, el uso de un panel de probadores de sabor cualificados.

El término "masa" se define en el presente documento como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes suficientemente dura para amasar o estirar. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, maíz, cebada, arroz, grañones, trigo sarraceno y avena. Trigo pretende englobar aquí y más adelante todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo, aestivum, durum y/o spelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipéptido de beta-glucosidasa según la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o adyuvantes de procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o prehorneada. La preparación de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente es muy conocida en la técnica y comprende mezclar dichos ingredientes y adyuvantes de procesamiento y uno o más móldeos y opcionalmente etapas de fermentación. La preparación de inasa congelada se describe por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters .

El término "producto basado en cereal" se define en el presente documento como cualquier producto preparado a partir de una masa, tanto de carácter blando como crujiente. Ejemplos de productos alimenticios basados en cereales, tanto de un tipo blanco, claro como oscuro, que pueden producirse ventajosamente por la presente invención son pan (en particular pan blanco, integral o de centeno) , normalmente en forma de barras o bollos, pan tipo baguette francesa, pasta, fideos, donuts, panes con agujero en el medio, pastel, pan de pita, tortillas, tacos, pasteles, panqueques, galletas, galletitas, pastas de hojaldre, pan al vapor y pan crujiente, y similares.

El término "producto horneado" se define en el presente documento como cualquier producto basado en cereal preparado por horneado de la masa.- Los polisacáridos de no almidón (NSP) pueden aumentar la viscosidad de los digestos que, a su vez, puede disminuir la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento animal. El uso del polipéptido de beta-glucosidasa de la presente invención puede mejorar la utilización del fósforo, además de minerales catiónicos y polipéptido durante los digestos animales.

La adición de nutrientes específicos al pienso mejora la digestión del animal y de este modo reduce los costes de pienso. Actualmente están siendo usados muchos aditivos para pienso y continuamente se desarrollan nuevos conceptos. El uso de enzimas específicas como enzimas que degradan hidrato de carbono de no almidón podrían romper la fibra, liberando energía, además de aumentando la digestibilidad de proteínas debido a la mejor accesibilidad de la proteína cuando la proteína se rompe. De esta forma, el coste del pienso debería bajar, además, también podrían reducirse los niveles de proteína en el pienso.

Los polisacáridos de no almidón (NSP) también están presentes en prácticamente todos los ingredientes de pienso de origen vegetal. Los NSP se utilizan escasamente y, cuando se solubilizan, pueden ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y, como consecuencia, reducir cualquier efecto antinutritivo. Las enzimas que degradan hidratos de carbono de no almidón de la presente invención puede usarse para este fin en dietas basadas en cereales para aves de corral y, a un mejor grado, para cerdos y otras especies .

Un polipéptido/enzima que degrada hidrato de carbono de no almidón de la invención (de una composición que comprende el polipéptido/enzima de la invención) puede usarse en la industria de los detergentes, por ejemplo, para eliminar de la ropa para lavar de manchas basadas en hidratos de carbono. Una composición de detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la invención y, además, una o más de una celulosa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa.

Uso de enzimas en composiciones de detergente Una composición de detergente que comprende un polipéptido o composición de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, que normalmente contiene hasta aproximadamente el 70% de agua y de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 30% de disolvente orgánico o material no acuoso.

Un composición de detergente tal puede formularse, por ejemplo, como una composición de detergente para lavar ropa a mano o a máquina que incluye una composición de aditivo para lavar ropa adecuada para el pre- tratamiento de tejidos manchados y una composición de suavizante de telas añadida en el aclarado, o formularse como una composición de detergente para su uso en operaciones de limpieza de superficies duras para el hogar generales, o formularse para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.

En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con las del detergente seleccionado (por ejemplo, óptimo de pH, compatibilidad " con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y la(s) enzima(s) debe(n) estar presentes en una cantidad eficaz.

Una composición de detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo, un tensioactivo aniónico o no iónico, un coadyuvante de detergente o agente complejante, uno o más polímeros, un sistema de blanqueamiento (por ejemplo, una fuente de H202) o un estabilizador de enzimas. Un composición de detergente también puede comprender cualquier otro componente de detergente convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador que incluye una arcilla, un reforzador de espuma, un 'supresor de barro, un agente anticorrosivo, un agente de suspensión de suciedad, un agente antirredeposición de suciedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrótropo, un inhibidor del deslustrado o un perfume.

Uso de enzimas en el procesamiento de papel y pulpa Un polipéptido o composición de la presente invención puede usarse en la industria del papel y la pulpa, entre otros, en el procedimiento de blanqueo para potenciar el brillo de pulpas blanqueadas, por lo que puede reducirse la cantidad de cloro usada en las etapas de blanqueamiento, y para aumentar la ausencia de pulpas en el procedimiento de papel reciclado (Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 ( 1990) : 79-101 ; Paice, y col., Biotechnol . y Bioeng. 32 (1988) : 235-239 y Pommier y col., Tappi Journal (1989) : 187-191) . Además, un polipéptido o composición de la invención puede usarse para el tratamiento de pulpa lignocelulósica de forma que mejore l capacidad de blanqueamiento de la misma. De este modo puede reducirse la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueamiento satisfactorio de la pulpa.

Un polipéptido o composición de la invención puede usarse en un procedimiento de reducir la tasa a la que los tejidos que contienen celulosa se vuelven ásperos o de reducir la aspereza de tejidos que contienen celulosa, procedimiento que comprende tratar tejidos que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente. La presente invención se refiere además a un procedimiento de proporcionar la clarificación del color de tejidos que contienen celulosa coloreada, procedimiento que comprende tratar tejidos que contienen celulosa coloreada con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente, y un procedimiento de proporcionar una variación localizada en el color de tejidos que contienen celulosa coloreada, procedimiento que comprende tratar tejidos que contienen celulosa coloreada con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente. Los procedimientos de la invención pueden llevarse a cabo 14 tratando tejidos que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de los tejidos también puede llevarse a cabo durante el remojo o aclarado o simplemente añadiendo el polipéptido o la composición como se ha descrito anteriormente al agua en la que los tejidos están sumergidos o se sumergirán.

Otros usos de enzimas Además, un polipéptido o composición de la presente invención también puede usarse en formulación antibacteriana, además de en productos farmacéuticos tales como pastillas para chupar para la garganta, pastas de dientes y enjuague bucal .

Los siguientes ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Materiales y Procedimientos Procedimientos de ADN Se llevaron a cabo procedimientos ADN convencionales como se ha descrito en cualquier parte (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) , a menos que se establezca de otro modo. Se amplificó ADN usando la enzima de corrección la polimerasa Physion (Finnzymes) . Las enzimas de restricción fueron de Invitrogen o New England Biolabs .

Preparación de muestras de celulasa Las celulasas que se originaron a partir de Talaromyces emersonii se expresaron en Aspergillus niger. Los filtrados concentrados de las enzimas se produjeron como se describe en el documento WO2004/030468. Después de cultivar Aspergillus niger que contenía los plásmidos de expresión apropiados, los sobrenadantes libres de células se prepararon por centrifugación del caldo de fermentación a 5000 x g durante 30 minutos a 4°C. Opcionalmente , el sobrenadante puede ajustarse a pH=5 con KOH 4 N y esterilizarse por filtración sobre un filtro de 2 µt? (parte superior de la botella) con succión para eliminar cualquier material fúngico. Además, los sobrenadantes pueden filtrarse adicionalmente sobre un filtro de microfibra de vidrio GF/A Whatmann (0 150 mm) para eliminar cualquier sólido. Los sobrenadantes se ultrafiltraron, se concentraron y se guardaron hasta que se usaron a 4°C o se congelaron a -20°C- Procedimiento para la determinación de proteína total El procedimiento fue una combinación de precipitación de proteína usando ácido tricloroacético (TCA) para eliminar sustancias perturbadoras y permitir la determinación de la concentración de proteína con la reacción de Biuret colorimétrica . En la reacción de Biuret, un ión cobre (II) se reduce a cobre (I) , que forma un complejo con los nitrógenos y carbonos de los enlaces peptídicos en una disolución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color, y de ahí la absorción a 546 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteína, según la ley de Beer-Lambert . La normalización se realizó usando BSA (albúmina de suero bovino) y el contenido de proteína se expresó en g de proteína como equivalente de BSA/1 o mg de proteína como equivalente de BSA/ml . El contenido de proteína se calculó usando protocolos de cálculo estándar conocidos en la técnica, representando la D0546 frente a la concentración de muestras con concentración conocida, seguido del cálculo de la concentración de las muestras desconocidas usando la ecuación generada a partir de la recta de calibración.

Procedimientos para la determinación de la actividad de beta-glucosidasa La actividad de beta-glucosidasa se determinó usando para-nitrofenil-beta-glucósido a concentración 1,5 mM en tampón acetato sódico 50 mM a pH 4,5. La incubación se realizó a 40 °C durante 30 min. La reacción se detuvo usando bicarbonato sódico 1 M. La actividad se calculó a partir de la extinción determinada a 405 nm, y el coeficiente de extinción molar de para-nitrofenol a condiciones alcalinas, como es conocido por aquellos expertos en la materia. La actividad se expresa como µ?t??? de pNP liberado por mi por minuto .

Un procedimiento alternativo para la determinación de la actividad de beta-glucosidasa es la incubación de la enzima con celobiosa 10 mM en tampón acetato sódico 50 mM. Después de 30 minutos a 40°C, la reacción se detiene con hidróxido sódico. Las muestras se ultrafiltraron y se analizaron usando cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) . Se aplicaron una columna CarboPac PA-20 acondicionada térmicamente a 30°C, y NaOH 200 mM a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, para separar glucosa y celobiosa. La actividad de beta-glucosidasa se expresó en µp??? de glucosa liberada por mi por minuto.

Preparación de sustrato de paja de trigo pretratado Puede obtenerse paja de trigo pretratada diluida en ácido como se describe en Linde, M. y col., Biomass and Bioenergy 32 (2008), 326-332, y puede usarse equipo como se describe en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol . 105-108, pág 69-85. La paja de trigo pretratada se lavó con agua hasta que la disolución con paja de trigo tuvo pH 6,0 o superior. El agua de lavado se separó por filtración.

Hidrólisis prolongada de celulosa Las incubaciones de combinaciones de enzima en 2% de disolución de sustrato de materia seca (ms) de paja de trigo pretratada (PTP) lavada con ácido en tampón acetato sódico 50 m a pH 4,5 se realizaron a escala de 10 mi. Las combinaciones de enzima se añadieron a dosis de proteína fija por gramo de materia seca de sustrato. Las muestras se tomaron en un momento, hasta 72 horas de incubación a 65°C. Las reacciones se terminaron en el momento dado centrifugando el residuo, pipeteando el sobrenadante y congelando las muestras hasta análisis.

El análisis de la cantidad de glucosa liberada se realizó usando RMN de flujo. Los espectros de RMN 1H se registraron en un sistema Bruker AVANCE II BEST NMR que operaba a la frecuencia de protones 500 MHz y temperatura de sonda 27 °C.

Ejemplo 1 1.1. Construcción de plásmidos de expresión La secuencia que tiene SEC ID N° : 1 se clonó en el vector pGBTOP (Fig. 1) usando sitios EcoRI y SnaBI, que comprenden el promotor de glucoamilasa y la secuencia terminadora. La parte de E. coli se eliminó por digestión con Notl antes de la transformación de CBS 513.88 de A. niger. 1.2. Transformación de A. niger WT-1 de A. niger: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende deleciones de los genes que codifican glucoamilasa (glaA) , amilasa fúngica y amilasa ácida. WT-1 de A. niger se construye usando el enfoque "LIBRE DE GEN MARCADOR" que se describe en el documento EP 0 635 574 Bl .

Las construcciones de expresión se co-transforman en la cepa WT-1 de A. niger según el procedimiento descrito por Tilburn, J. y col. (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBQ J., 4, 475-479 con las siguientes modificaciones : - Las esporas se germinan y cultivan durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz agitado en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio miñimo de Aspergillus (100 mi) . El medio mínimo de Aspergillus contiene por litro: 6 g de NaN03 , 0,52 g de KC1 , 1,52 g de KH2P04, 1,12 mi de KOH 4 M, 0,52 g de MgS04-7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos , 22 mg de ZnS04-7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04-7H20, 1,7 mg de COC12-6H20, 1,6 mg de CuSQ4-5H20, 5 mg de MnC12-2H20, 1,5 mg de Na2Mo04 · 2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HC1, 0,2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de disolución de penicilina (5000 Ul/ml) estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco) .

- Se usa Novozy 234TM (Novo Industries) en lugar de helicasa para la preparación de protoplastos; - Después de la formación de protoplastos (60-90 minutos) se añade tampón KC (KC1 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) a un volumen final de 45 mi, la suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de cubeta oscilante. Los protoplastos se resuspenden en 20 mi de tampón KC y posteriormente se añaden 25 mi de tampón STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, CaC12 50 mM) . La suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de cubeta oscilante, se lava en tampón STC y se resuspende en tampón STC a una concentración de 10E8 protoplastos/ml ; - A 200 microlitros de la suspensión de protoplastos se añaden el fragmento de ADN, disuelto en 10 microlitros de tampón TE (Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, EDTA 0,1 mM) y 100 microlitros de disolución de PEG (20% de PEG 4000 (Merck) , sorbitol 0,8 M, Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, CaC12 50 mM) ; - Después de la incubación de la suspensión de protoplastos de ADN durante Í0 minutos a temperatura ambiente, lentamente se añaden 1,5 mi de disolución de PEG (60% de PEG 4000 (Merck) Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, CaCl2 50 mM) , con mezcla repetida de los tubos. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, las suspensiones se diluyen con 5 ni de sorbitol 1,2 M, se mezclan por inversión y se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden suavemente en 1 mi de sorbitol 1,2 M y se siembran sobre medio de regeneración selectivo sólido que consiste en tanto medio mínimo de Aspergrillus sin riboflavina, tiamina-HCl, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos como glucosa. En caso de selección con acetamida, el medio contiene acetamida 10 mM como única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 M como osmótico y fuente de C. Alternativamente, los protoplastos se siembran sobre PDA (agar de dextrosa de patata, oxoide) complementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y sacarosa 1 M como osmótico. Las placas de regeneración se solidifican usando 2% de agar (agar n° 1, oxoide Lll) . Después de la incubación durante 6-10 días a 30 grados Celsius, conidiosporas de transformantes se transfieren a placas que consisten en medio selectivo de Aspergillus (medio mínimo que contiene acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de selección con acetamida o PDA complementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina en el caso de selección con fleomicina) con 2% de glucosa y 1,5% de agarosa (Invitrogen) y se incubaron durante 5-10 días a 30 grados Celsius. Se aislan transformantes individuales y esta etapa de purificación selectiva se repite una vez, tras lo cual los transformantes purificados se almacenan .

Después de la transformación, los transformantes se seleccionaron sobre medios que comprenden acetamida como única fuente de nitrógeno y se purifican las colonias. Los números de copias se estimaron por PCR cuantitativa y se seleccionaron transformantes de bajo y alto número de copias. Los transformantes de alto número de copias se cultivaron en matraces agitados en 100 mi de medio CSM-MES como se describe en el documento EP 635 574 a 34 °C a 170 rpm en un agitador con estufa de incubación usando un matraz agitado con deflectores de 500 mi. Después de 3 y 4 días de fermentación, las muestras de sobrenadante se recogieron para determinar la expresión por SDS-PAGE. 1.3 Contenido de protelna Los sobrenadantes ultrafiltrados y concentrados de las fermentaciones del matraz agitado de los transformantes que expresan beta-glucosidasa (TEMER06387) se analizaron para el contenido de proteína. Se determinó que el contenido de proteína era 4 mg de proteína como equivalente de BSA/ml .

Ejemplo 2 2.1 Preparación de muestras de celulasa Una proteína potenciadora de celulasas, TEMÉR07589 (como se describe en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente DSM caso 27666, presentada el mismo día que la presente solicitud) , y dos exoglucanasas , siendo CBHI como se describe en la solicitud de patente EP09158739.4 y CBHII (como se describe en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente DSM caso 27829, presentada el mismo día que la presente solicitud) , todas de Talaromyces emersonii , se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 para TEMER06387. El contenido de proteínas de estas muestras se determinó y varió de 20 a 60 mg de proteína como equivalente de BSA/ml . Adicionalmente , uno de los homólogos más relacionados de la beta-glucosidasa TEMER06387, que es una beta-glucosidasa de Sclerotinia sclerotiorum (XP_001591700 ; NCBI) también se preparó como se ha descrito anteriormente. Esta beta-glucosidasa se denotará BG-SS. 2.2 Hidrólisis prolongada de mezclas de 4 enzimas La beta-glucosidasa TEMER06387 se mezcló con las 3 otras proteínas celulolíticas , a cantidades relativas del 9% de TEMER06387, 37% de TEMER07589, 30¾ de CBHI y 24% de CBHII, de la proteína total en la mezcla. También se preparó una mezcla similar con BG-SS, en la que TEMER06387 sé sustituyó con BG-SS. Estas mezclas se aplicaron a hidrólisis extendida a escala de 10 mi con 2% de paja de trigo tratada con DM, a pH 445 y 65°C. La dosis de proteína total en cada una de las incubaciones fue 15 mg de proteína como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja de trigo pretratada. Las incubaciones duraron 72 horas y se tomaron muestras a varios intervalos de tiempo. Las muestras se centrifugaron, y el sobrenadante se congeló hasta análisis por RMN. La liberación de glucosa y celobiosa con el tiempo se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Liberación de glucosa y celobiosa, expresada como mmol/1, durante la incubación de 2% de paja de trigo pretratada lavada con DM, a pH 4,5 y 65 °C, por una mezcla de 4 enzimas que contenía 1 BG (TEMER06387 o BG-SS) , 1 CBHI, 1 CBHII y 1 proteína potenciadora de celulasas, a cantidades relativas del 9%, 30%, 24% y 37% de proteína total de la mezcla .

De este experimento es evidente que TEMER06387 puede hidrolizar bien celulosa a glucosa en una mezcla con otras 3 proteínas celulolíticas .

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. - Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N° : 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID N°:l, o un polipéptido de variante o polinucleótido de variante del mismo, en el que el polipéptido de variante tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N° : 2, o el polinucleótido de variante codifica un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de secuencias con la secuencia expuesta en SEC ID N° : 2.

2. - Un polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad de beta-glucosidasa.

3. - Un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID N° : i; o (b) una secuencia de nucleótidos que se híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de SEC ID N° : 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 75% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de SEC ID N° : 1; o (d) un fragmento que tiene al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) o (c) que tiene al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que se degenera como resultado del código genético a una secuencia como se define en una cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

4. - Un polinucleótido según la reivindicación 3 que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

5. - Un polinucleótido según una de las reivindicaciones 3 ó 4 que es una secuencia de ADN.

6. - Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. - Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizada porque el contenido de GC es 56% o más, 58% o más, o del 58-65%.

8. - Un vector que incorpora una secuencia de polinucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. - Una célula que comprende un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector según la reivindicación 8.

10. - Una célula según la reivindicación 9, caracterizada porque la célula es una célula eucariota.

11. - Una célula según la reivindicación 10, caracterizada porque la célula es una célula fúngica.

12. - Una célula según la reivindicación 11, caracterizada porque la célula fúngica está seleccionada del grupo que consiste en los géneros Aspergillus , Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichu , Penicillium, Acre onium, Neurospora, Termoascus, Myceliophthora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporiuw, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .

13.- Una célula según la reivindicación 12, caracterizada porque la célula fúngica es de las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans o Aspergillus ni er.

14. - Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, caracterizada porque uno o más genes están delecionados , inactivados o alterados por completo o en parte, caracterizada porque el gen codifica opcionalmente una proteasa.

15.- Una planta transgénica o parte de la misma que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 6 ó 7, un vector según la reivindicación 8 o una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, caracterizada porque opcionalmente la planta es opcionalmente una planta de sorgo, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de semilla de aceite, una planta de semilla de colza, una planta de soja, una planta de cebada, una planta de pasto o una planta de tabaco; o una planta de los géneros Anacardium, Arachis, ragus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Car hamus, Cocos, Coifea, ferae, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Qcallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, eolus, Pistachio, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Sorghum, Theobro us, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vi na o Zea.

16. - Un procedimiento para la preparación de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 que tiene actividad de degradación de material de hidrato de carbono y/o de hidrólisis de hidrato de carbono, procedimiento que comprende cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado.

17. - Una composición que comprende: (i) un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o un polipéptido que pertenece a la familia GH61.

18. - Una composición según la reivindicación 17, caracterizada porque la celulasa es una celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una endo-p-1,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una" ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4) -glucanasa .

19. - Una composición según una de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizada porque la hemicelulasa es una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

20. - Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.. caracterizada porque la pectinasa es una endo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo-arabinanasa. .

21. - Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 que comprende una ligninasa, una expansina, un polipéptido similar a expansina, una swolenina o el producto de polipéptido de un gen que codifica una proteína integradora de celulosa o una proteína inducida por celulosa.

22. - Un procedimiento para el tratamiento de un sustrato que comprende material de hidrato de carbono, opcionalmente un material vegetal, procedimiento que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y/o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21.

23. - Un procedimiento según la reivindicación 22, en el que el sustrato es un material vegetal y el material vegetal se proporciona en forma de una planta de pulpa vegetal, un extracto vegetal, un alimento o ingrediente derivado del mismo, o una tela, textil o prenda de ropa que comprende un material vegetal.

24. - Un procedimiento según la reivindicación 22 y/o reivindicación 23, caracterizado porque el tratamiento comprende la degradación y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

25.- Uso de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 y/o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 para producir azúcar a partir de un material ligno-celulósico.