MX2012012229A - Leptinas de alta afinidad y antagonistas de leptina. - Google Patents

Abstract

Las muteínas de leptina, en particular antagonistas de leptina, con afinidad de unión incrementada al receptor de leptina se proporcionan; estos compuestos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen son útiles para el tratamiento de cualquier trastorno en el que esté implicada una actividad no deseada o deletérea de la leptina endógena o una respuesta inmune innata alterada.

Description

LEPTINAS DE ALTA AFINIDAD Y ANTAGONISTAS DE LEPTINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con muteinas de leptina, en particular antagonistas de leptina, con afinidad de unión incrementada al receptor de leptina y a composiciones farmacéuticas que los contienen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La obesidad es considerada un riesgo para muchos cánceres. Los niveles de suero de leptina son a menudo elevados en gente obesa. La leptina actúa como un agente mitogénico en muchos tejidos; por lo tanto, puede actuar para promover el crecimiento de células cancerígenas. De hecho, se mostró que la leptina actúa como un factor de crecimiento para células de cáncer de próstata in vitro, induce la migración incrementada de células de cáncer de próstata y la expresión de factores de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), el factor de crecimiento transformador betal (TGF-ß?, por sus siglas en inglés), y el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF, por sus siglas en inglés), y aumenta el crecimiento de cáncer de próstata. (Somasundar et al., 2004; Frankenberry et al., 2004).

Además de jugar un papel importante en la regulación de ingesta de alimento y consumo de energía en el cerebro, la leptina también actúa como un estimulador de crecimiento potencial en células de cáncer de mama normales y neoplásticas. También se mostró recientemente que induce la proliferación celular en células de cáncer de ovarios ¡n vitro (Choi et al., 2004).

Se ha mostrado recientemente que la leptina promueve la diferenciación celular del T ayudante 1 (Th1 , por sus siglas en inglés) y modula el inicio y la progresión de respuestas autoinmunes en varios modelos animales de la enfermedad (La Cava y Matarese, 2004). Si el papel de la leptina es fundamental en las enfermedades autoinmunes mediadas por el Th1 o enfermedades inflamatorias, como el síndrome inflamatorio del intestino, entonces un efecto terapéutico puede ser anticipado al bloquear la acción periférica de la leptina (Matarese et al., 2005). También se ha mostrado que la leptina está involucrada en la patogénesis de artritis reumatoide y en el desarrollo de encéfalomielitis autoinmume experimental (EAE), un modelo de ratón para esclerosis múltiple (Peelman et al., 2005).

Consecuentemente, tanto las leptinas como los antagonistas de leptina tienen potencial terapéutico. En el pasado la leptina ha sido descartada como un fármaco potencial para el tratamiento de la obesidad, pero recientemente se ha reportado que es efectiva en conjunción con análogos de amilina (Turek et al., 2010) o chaperones químicos (Ozcan et al. 2009). Se ha mostrado de forma similar que la leptina en conjunción con la insulina causan un mejoramiento en ratones con diabetes tipo 1 (Wang et al. 2010).

La solicitud internacional PCT/IL2005/001250, incorporada en la presente en su totalidad como referencia como si se describiera completamente aquí, describe el uso de antagonistas de leptina sintéticos en los que al menos dos residuos de aminoácido de la secuencia LDFI del sitio de unión hidrofóbico en las posiciones correspondientes a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre son sustituidos con diferentes residuos de aminoácido de modo que el sitio se vuelve menos hidrofóbico. Los antagonistas de leptina son útiles en el tratamiento de, por ejemplo, el síndrome metabólico, esteatohepatitis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia, caquexia, cáncer, enfermedades autoinmunes y auto-inflamatorias como esclerosis múltiple, síndrome inflamatorio del intestino o artritis reumatoide.

Hay una necesidad no satisfecha de incrementar la afinidad de estos antagonistas de leptina y agonistas a su receptor objetivo para facilitar el tratamiento eficiente a dosis más bajas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora hemos encontrado, de conformidad con la presente invención, que la introducción de ciertas mutaciones en una leptina nativa de mamífero, o un antagonista de leptina como se describe en WO 2006/056987, incrementa la afinidad de unión de la leptina o el antagonista de leptina al receptor de leptina.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un antagonista de leptina sintético que consiste en un polipétido de leptina de mamífero modificado como se describe en WO 2006/056987, modificado adicionalmente al tener el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 23 de la leptina humana de tipo silvestre (D23) sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o tiene la treonina en la posición correspondiente a la posición 12 de la leptina humana de tipo silvestre (T 2) sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado, en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o una sal farmacéuticamente aceptable del polipéptido de leptina de mamífero modificado o su fragmento.

En ciertas modalidades, D23 es sustituida con leucina, y en particular, el antagonista de leptina sintético consiste en la secuencia de aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un antagonista de leptina sintético que comprende un polipéptido de leptina de mamífero modificado en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado, en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico, en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o una sal farmacéuticamente aceptable del polipéptido de leptina de mamífero modificado o su fragmento.

En incluso otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada que codifica dicho antagonista o agonista de leptina.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho antagonista o agonista de leptina sintético, o un fragmento del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista pueden ser usadas en el tratamiento de condiciones en las que el exceso de leptina o de señalización de leptina está implicado, como el síndrome metabólico, la esteatohepatitis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia, caquexia, cáncer, o enfermedades autoinmunes o auto-inflamatorias como la esclerosis múltiple, síndrome de intestino inflamatorio o artritis reumatoide, mientras que las composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista pueden ser usadas en el tratamiento de una enfermedad o condición en la que la señalización de leptina aberrante está implicada, seleccionada de obesidad, síndromes relacionados con la híperfagia, diabetes tipo 1 , síndrome metabólico y ateroesclerosis, o en la promoción de angiogénesis.

En incluso otro aspecto, la presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma comprende un gen que comprende una molécula de ADN que codifica un antagonista de leptina sintético de conformidad con la presente invención, o un antagonista de leptina sintético que tiene D23 y T12, el cual está unido operativamente como un promotor inducible.

El ratón transgénico de la presente invención preferiblemente exhibe resistencia a la insulina y niveles incrementados de insulina en sangre y glucosa en sangre y puede por tanto ser usado en un método de evaluación de una sustancia que tiene actividad terapéutica para una enfermedad o trastorno seleccionada del grupo que consiste en hiperglucemia, hiperlipidemia, diabetes mellitus tipo 2 y resistencia a la insulina, el método comprende los pasos de: (1 ) administrar una sustancia de prueba al ratón transgénico; (2) confirmar si dicha enfermedad o trastorno o los síntomas de la enfermedad o trastorno son suprimidos o no en el ratón transgénico; y (3) seleccionar la sustancia de prueba como la sustancia que tenga actividad terapéutica para dicha enfermedad o trastorno cuando dicha enfermedad o trastorno o los síntomas de la enfermedad o trastorno es suprimida en el ratón transgénico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa la estructura esquemática del plásmido que expresa la leptina en células de levadura. Aga2, proteína Aga2; HA, hemaglutinina.

Las figuras 2A-2C muestran el análisis de citometría de flujo del despliegue de la superficie de levadura de la leptina de ratón. El marcador epítopo c-myc fue detectado usando el anticuerpo monoclonal de ratón 9e10 y un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con FITC (figura 2A), la leptina expresada fue detectada usando el receptor de leptina humana soluble biotinilado (hLBD, por sus siglas en inglés) y el conjugado (figura 2B) de ficoeritrina-estreptavidina (SA-PE, por sus siglas en inglés) y las dos etiquetas pueden ser detectadas simultáneamente usando el sistema de citometria de flujo FACSARIA (figura 2C).

Las figuras 3A-3B muestran figuras representativas de uno de los experimentos de clasificación. La figura 3A muestra la biblioteca antes de la competencia con hLBD sin etiquetar y la figura 3B después de la competencia. Las células de levadura que no fueron puestas en competencia fueron recolectadas para dos ciclos adicionales de crecimiento y selección. FL1-H y FL2-H se refieren a los 2 filtros de emisión en los experimentos de citometria de flujo (excitación de 488nm).

Las figuras 4A-4B representan la determinación de afinidad hacia el receptor de leptina humana soluble (hLBD) en 13 clones de levadura seleccionados después del tercer ciclo de evaluación. MFI, intensidad fluorescente promedio; leptina de tipo silvestre de ratón (mlep wt, por sus siglas en inglés).

Las figuras 5A-5C muestran la SDS-PAGE de las 8 variantes del antagonista de leptina de ratón (MLA, por sus siglas en inglés) mutado en D23 y corrido en un 15% de gel en presencia (+) o ausencia (-) de ß- mercaptoetanol. La leptina de ratón de tipo silvestre (mlep wt) fue corrida como control. El tamaño de los marcadores de masa molecular (de arriba hacia abajo en kDa) fueron: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10.

Las figuras 6A-6H representan el análisis de filtración de gel de 8 variantes de MLA mutado en D23 desarrollado en una columna Superdex 75 a 0.8 ml/min en una solución amortiguadora TN, pH 8.

Las figuras 7A-7D muestran la comparación de la actividad biológica (figuras 7A, 7B) y propiedades de unión (figuras 7C, 7D) del antagonista de leptina de ratón (MLA) y MLA súper activa (SMLA, por sus siglas en inglés) (figuras 7A, 7C) y de polietilen glicol (PEG)-MLA y PEG-SMLA (figuras 7B, 7D). Fl, intensidad de fluorescencia.

Las figuras 8A-8B muestran un Western Blot (figura 8A) comparando la inhibición de la fosforilación STAT3 por SMLA y MLA en células CHO transfectadas establemente con OBRb de ratón, (figura 8B) cuantificación de las bandas en (figura 8A) representada como una gráfica de barras. Fl, intensidad de fluorescencia; D23L, SMLA. P-STAT, STAT fosforilado; t-STAT, STAT total.

Las figuras 9A-9B muestran (figura 9A) la SDS-PAGE de PEG-SMLA corrida en 12 % de gel en presencia (+) o ausencia (-) de ß-mercaptoetanol (los marcadores de masa molecular (de arriba hacia abajo en kDa) fueron: 150, 100, 75, 50, 37, 25 y 20) y (figura 9B) análisis de filtración en gel de PEG-SMLA en una columna Superdex 200 a 0.7 ml/min en una solución amortiguadora TN, pH 8.

La figura 10 muestra la comparación del efecto de PEG-MLA y PEG-SMLA (marcada como superANT) en la ganancia de peso de los ratones. Ambos materiales fueron inyectados diariamente a 6.25 mg/kg. Después de 20 días las inyecciones fueron suspendidas y el peso de los ratones fue revisado por otros 10 días.

La figura 11 muestra la comparación del efecto de PEG-MLA y PEG-SMLA en la ganancia de peso de los ratones en un experimento de respuesta a la dosis. Ambos materiales fueron inyectados a 20, 6.7, 2.2 y 0.72 mg/kg por un periodo de 17 días. Los resultados son promedio ± SEM, n = 8.

Las figuras 12A-12D muestran la comparación de la actividad biológica (figuras 12A, 12B) y propiedades de unión (figuras 12C, 12D) de HLA, SHLA, SMLA, PEG-HLA y PEG-SHLA. Fl, intensidad de fluorescencia.

Las figuras 13A-13B muestran la comparación del efecto de PEG-SMLA y PEG-SHLA en la ganancia de peso de los ratones hembra (figura 13A). Ambos materiales fueron inyectados diariamente a 6.25 mg/kg por 17 días empezando en el momento cero (flecha). En (figura 13B) vemos el promedio comparativo de la ingesta de alimento y agua. En todos los puntos marcados con * ambos tratamientos fueron significativamente (p<0.05) diferentes del vehículo pero no entre ellos. Los resultados son promedio ± SEM, n = 8. PEG-SMLA, PEG-super antagonista de leptina de ratón; PEG-SHLA, PEG-super antagonista de leptina humana.

La figura 14 representa modelos moleculares del sitio de unión II en la leptina de ratón. Los residuos en el sitio de unión II que afectan la unión a CRH2 están coloreados en amarillo. Los residuos en el sitio de unión II que afectan tanto la unión al sub-dominio CRH2 del receptor de leptina como la activación del receptor de leptina están coloreados en naranja y D23 está coloreada en verde. El residuo T12 es parte del dominio de unión II. De Iserentant et al. (2005).

Las figuras 15A-15B muestran que el antagonista de leptina súper activa induce la protección de inflamación innata mediante la inhibición de fagocitos mononucleares infiltrados. PEG-SMLA (20mg/kg) o PEG-leptina (PEG-Lep; 0.4mg/kg) fueron administradas intraperitonealmente a ratones hembra C57bl por 4 días. Esto fue seguido de inducción de hepatitis inducida por activación de la respuesta inmune innata vía la administración de Lipopolisacárido (LPS; 10ug/kg) y D-Galactosamina (DgaIN; 600mg/kg) en el tiempo cero. Estado estable, la población celular en el periodo de tiempo antes de la administración de LPS y DgaIN; 1.5 horas LPA/DGaIN, población celular en el periodo de tiempo 1.5 horas después de la administración de LPS y DgaIN; Las poblaciones de infiltrados CD45+CD1 1 b+CD1 1-F4/80+ hepáticos y la población de macrófagos residentes están representadas en la puerta P4 y la puerta P5, respectivamente; CD11 b y F4/80 son marcadores para macrófagos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN WO 2006/056987 enseña que la sustitución de al menos dos de los aminoácidos en el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posiciones 39-42 de una secuencia de leptina de mamífero no-humano o humano de tipo silvestre con otros aminoácidos de modo que el sitio se vuelva menos hidrofóbico, transforma a los agonistas de leptina de tipo silvestre en un antagonista de leptina. El antagonista tiene la misma afinidad hacia el receptor de leptina que el agonista original. Para inhibir eficientemente la acción de la leptina in vivo usando un antagonista de leptina que tiene la misma afinidad hacia el receptor de leptina que la hormona de tipo silvestre, se necesita un exceso de entre 10-100 veces del antagonista. Hay dos maneras de disminuir esta alta relación: (1) prolongar la vida media de los antagonistas por pegilación; e (2) incrementar la afinidad del antagonista hacia el receptor de leptina y subsecuentemente combinar ambos enfoques. El último enfoque fue implementado en la presente solicitud.

En el presente trabajo hemos usado mutagénesis aleatoria proclive al error PCR de un gen (agonista) de leptina seguida de selección e identificación de la alta afinidad de mutantes de leptina usando la metodología de despliegue de superficie de levadura, y la preparación subsecuente de los mutantes de alta afinidad como proteínas recombinantes en Escherichia coli.

La evaluación identificó muteínas de alta afinidad que tienen una sola mutación y muteínas que tienen múltiples mutaciones. Las muteínas con afinidad incrementada que tienen pocas mutaciones son ventajosas sobre las muteínas con múltiples mutaciones, porque después de la administración de la muteína a un mamífero es probable que sean menos inmunogénicas y por tanto es menos probable que induzcan la producción de anticuerpos neutralizantes. En la tercera evaluación, se descubrieron dos muteínas de alta afinidad con una sola mutación como se muestra más adelante: La muteína que tiene la D23 reemplazada con histidina y la muteína que tiene la T12 reemplazada con isoleucina (véase el Ejemplo 1).

Después, las mutaciones que transforman el agonista de leptina en un antagonista de leptina fueron presentadas a los mutantes de leptina que tienen alta afinidad hacia el receptor de leptina. De esta manera se produjeron tanto los agonistas de leptina como los antagonistas de leptina que tienen alta afinidad hacia el receptor de leptina. Como se muestra más adelante en el Ejemplo 3, el reemplazo por mutagénesis racional de D23 con residuos de aminoácido que no están negativamente cargados resultó en los antagonistas de leptina más potentes.

Los agonistas de leptina de WO 2006/056987 son referidas aquí como MLA (antagonista de leptina de ratón) o HLA (antagonista de leptina humana), mientras que los agonistas y antagonistas de leptinas mejorados de la presente invención son referidos aquí agregando el prefijo "súper activo"; por tanto, por ejemplo, el antagonista de leptina de ratón mejorado es referido como "SMLA" o antagonista de leptina de ratón súper activo y el antagonista de leptina humana mejorado es referido aquí como "SHLA" o antagonista de leptina humana súper activo.

La ubicación de un cierto residuo de aminoácido en las proteínas o fragmentos de las mismas descrita aquí es de conformidad a la numeración de la leptina humana de tipo silvestre como se representa en SEQ ID NO: 2 y es designada refiriéndose al código de una letra del residuo de aminoácido y su posición en la leptina humana de tipo silvestre. Por tanto, por ejemplo, el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 23 de la leptina humana de tipo silvestre, también referida aquí como D23, sería referida como D23 también en un fragmento de leptina o en una leptina de mamífero homologa de diferente tamaño de conformidad con los algoritmos de alineación bien conocidos en la técnica de la química de proteínas. Una sustitución de un residuo de aminoácido en una cierta posición con otro residuo de aminoácido es designada refiriéndose al código de una letra del residuo de aminoácido, su posición como se definió anteriormente y el código de una letra del residuo de aminoácido que reemplaza al residuo de aminoácido original. Por tanto, por ejemplo, una sustitución de D23 con glicina sería designada D23G.

Aunque la estructura 3-D de la leptina fue reportada hace 13 años (Zhang et al. 1997) hasta ahora no se ha dilucidado un complejo cristalizado entre la leptina y el receptor de leptina. La falta de dicha estructura obstaculiza la interpretación estructural válida de la D23L u otras mutaciones D23 reportadas en la presente solicitud. La interpretación sugerida está por lo tanto basada en modelos complejos teóricos reportados en los últimos años (Peelman et al. 2004, Iserentant et al. 2005, Peelman et al. 2006). Esos reportes sugirieron que la leptina tiene 3 sitios de unión que están interactuando con el receptor de leptina. El sitio I está pobremente descrito y su importancia está conectada a la formación del complejo hexamérico putativo compuesto de 2 moléculas de leptina reaccionando con 4 receptores de leptina. El sitio de unión II, que es un sitio de unión principal se encuentra en la superficie de la hélice A y C y se une al sub-dominio CRH2 del receptor de leptina. Este subdominio del receptor de leptina humana fue subclonado en nuestro laboratorio y expresado como una proteina recombinante soluble denominada dominio de unión de leptina (LBD, por sus siglas en inglés), capaz de formar el complejo de alta afinidad 1 :1 con leptinas humanas o de otros mamíferos. (Sandowski et al. 2002). Esta proteína, que es también denominada CHR2 (región de homología de citocina II) fue usada en la presente solicitud como un anzuelo para pescar a los mutantes de leptina de alta afinidad expresados en la superficie de las células de levadura como se describió anteriormente. El sitio III presumiblemente se une al dominio similar a Ig del receptor de leptina (LR, por sus siglas en inglés) (Peelman et al. 2004, Zabeau et al 2003) y es necesario para la activación del receptor de leptina. Usando un enfoque de mutagénesis y modelado molecular (Peelman et al. 2004) se mostró que D9, T12, K15, T16 y R20 ubicadas en la hélice A y Q75, N82, D85 y L86 ubicadas en la Hélice C (véase la figura 14) que están estructuralmente cercanas y ven hacia la misma orientación tienen más probabilidades de involucrarse en la interacción con CHR2. Las mutaciones de esos residuos como D9S, T12Q, K15S, T16N, R20N, Q75S, N82S, D85S y L86A, L86S, L86N y L86Q bajaron significativamente la afinidad de la leptina hacia CRH2 y afectaron tanto la unión a CRH2 como la señalización del LR. (Peelman et al. 2004, Iserentant et al. 2005). Hasta ahora no se ha publicado ningún reporte concerniente al papel putativo de D23, pero los descubrimientos de conformidad con la presente invención (véase el Cuadro 7) indican fuertemente que el reemplazamiento de D23 por cualquier aminoácido que no porta la carga negativa es suficiente para incrementar la afinidad hacia el Dominio de Unión de Leptina humana (hLBD;CHR2) y actividad biológica subsecuente. El efecto más alto fue observado con el muíante D23L en ensayos de unión y celulares (Cuadros 6 y 7 y figuras 7A-D) y confirmado en la ganancia de peso en experimentos in vivo en ratones (figura 10 y figura 11 ). Mientras el incremento en la afinidad como se determinó por los ensayos de unión fue de hasta 50 veces, los incrementos en los bioensayos in vitro fueron de sólo aproximadamente 13-14 veces, probablemente porque las células usadas en esos ensayos tienen un exceso de receptores de repuesto. El incremento de la potencia en experimentos in vivo es más difícil de calcular, pero como se muestra anteriormente, está en el intervalo de 9 a 27 veces. Como se ha evidenciado, la mutación de D23L idéntica en antagonistas de leptina ovina y humana dio resultados similares. Debe ser notado que la secuencia de aminoácidos de ratón y la secuencia humana en la Hélice A son idénticas. Además, D23 es preservada es todas las secuencias de mamífero y las secuencias de aminoácidos en la Hélice A son casi idénticas.

D23 está ubicada en el extremo C-terminal de la hélice A y está orientada en la misma dirección que R20, T16, T12 (figura 14). Su reemplazamiento por aminoácidos cargados no-negativamente probablemente suprime un efecto repulsivo aún no identificado y por lo tanto incrementa la interacción con LBD. El incremento en la afinidad ocurrió tanto en los mutantes antagonistas como en los agonistas, pero en contraste con los antagonistas, la actividad biológica de los agonistas en ensayo basado en células in vitro no fue incrementada. La razón para tal discrepancia está probablemente relacionada con el hecho de que el incremento en la afinidad de SMLA y SHLA se origina principalmente no del incremento de kon sino de la disminución de k0 f, (no se muestra) conduciendo a una ocupancia prolongada del receptor. Dicha ocupancia prolongada hace al antagonista más efectivo pero probablemente no incrementa la actividad del agonista. Esto es similar al caso de la hormona de crecimiento humana, cuyo muíante seleccionado por despliegue de fago íambién ha exhibido una afinidad incrementada hasta 400 veces hacia el receptor hGH, pero no fue más acíivo en el bioensayo celular (Lowman and Wells 1993, Pearce et al. 1999 ).

La presente invención por tanto proporciona un antagonisla de leptina sintético que comprende un polipéptido de leptina de mamífero en el que: (i) el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 o 39-41 de la leptina humana de tipo silvestre está modificado de modo que de dos a cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrofóbico son sustituidos con diferentes residuos de aminoácido de modo que el sitio se vuelve menos hidrofóbico, dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado siendo un antagonista de leptina; y (ii) el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 23 de la leptina humana de tipo silvestre (D23) es sustituido con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o la treonina en la posición correspondiente a la posición 12 de la leptina humana de tipo silvestre (T12) es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado, en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico, en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o una sal farmacéuticamente aceptable del polipéptido de leptina de mamífero modificado o su fragmento.

En ciertas modalidades, D23 es sustituida con un residuo de aminoácido cargado positivamente o hidrofóbico, en donde el residuo de aminoácido hidrofóbico puede ser leucina, glicina, alanina, triptofano, histidina o fenilalanina; y el residuo de aminoácido cargado positivamente puede ser arginina o lisina. En particular, como se muestra más adelante en el Ejemplo 2, en la muteína que tiene la afinidad más alta hacia el receptor de leptina de entre las muteínas probadas, D23 es sustituida con leucina. Por lo tanto, en ciertas modalidades, D23 es sustituida con leucina.

En otras modalidades, T12 es sustituida con isoleucina.

Las muteínas con afinidad incrementada hacia el receptor de leptina en comparación con la leptina de tipo silvestre fueron también identificadas, en lo que además de la sustitución de D23 con glicina, mutaciones adicionales habían sido introducidas. Por ejemplo, en una muteína los residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes a las posiciones L68, S97, y S132 en la leptina humana de tipo silvestre habían sido sustituidos con otros residuos de aminoácido; en otra muteína el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición G112 en la leptina de tipo silvestre había sido reemplazado con otro residuo de aminoácido; e incluso en otra muteína los residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes a las posiciones T37 y G44 en la leptina de tipo silvestre habían sido sustituidos con otros residuos de aminoácido.

Por tanto, en ciertas modalidades, además de la sustitución de D23 con un residuo de aminoácido cargado positivamente o hidrofóbico, residuos de aminoácido adicionales son sustituidos como sigue: (a) la leucina en la posición correspondiente a la posición 68 de la leptina humana de tipo silvestre (L68) es sustituida con metionina, la serina en la posición correspondiente a la posición 97 de la leptina humana de tipo silvestre (S97) es sustituida con fenilalanina y la serina en la posición correspondiente a la posición 132 de la leptina humana de tipo silvestre (S132) es sustituida con tirosina; (b) la glicina en la posición correspondiente a la posición 112 de la leptina humana de tipo silvestre (G112) es sustituida con serina; o (c) la treonina en la posición correspondiente a la posición 37 de la leptina humana de tipo silvestre (T37) es sustituida con alanina y la glicina en la posición correspondiente a la posición 44 de la leptina humana de tipo silvestre (G44) es sustituida con ácido aspártico.

Además, el antagonista de leptina sintético puede tener al menos una sustitución, opcionalmente además de una sustitución de D23, seleccionada del grupo que consiste en: T12I, L68M, S97F, S132Y, G1 12S, T37A y G44D; y cualquier combinación de dos o más de estas sustituciones.

Como se mencionó anteriormente, la sustitución de dos a cuatro de los aminoácidos en el sitio de unión hidrofóbico LDFI de la secuencia de leptina de mamífero no-humano o humano de tipo silvestre con otros aminoácidos de modo que el sitio se vuelva menos hidrofóbico, transforma a los agonistas de leptina de tipo silvestre en un antagonista de leptina. En ciertas modalidades, los dos a cuatro residuos de aminoácido son sustituidos con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina y serina, en particular alanina. En los ejemplos proporcionados más adelante, el antagonista de leptina tuvo tres de los cuatro residuos de aminoácido sustituidos con alanina. Por tanto, en ciertas modalidades, tres de los cuatro residuos de aminoácido son sustituidos con alanina; en particular L39A, D40A y F41A.

El antagonista de leptina con la afinidad más alta de entre aquellos probados tuvo a D23 reemplazada con una leucina. Por tanto, en ciertas modalidades, el antagonista de leptina sintético es la muteina en la que: (i) el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre está modificado de modo que la leucina en la posición correspondiente a la posición 39 de la leptina humana de tipo silvestre es sustituida con alanina (D39A); el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 40 de la leptina humana de tipo silvestre es sustituido con alanina (D40A); y la fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 41 de la leptina humana de tipo silvestre es sustituida con alanina (F41A); y (ii) D23 es sustituida con leucina (D23L).

En ciertas modalidades, el antagonista de leptina humana que porta la mutación D23L tiene la secuencia de aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 1 , y el antagonista de leptina de ratón que porta la mutación D23L tiene la secuencia de aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 3.

Como se usa aquí, el término "mamífero" incluye mamíferos humanos, así como mamíferos no humanos. Por tanto, de conformidad con la presente invención, la leptina nativa puede ser leptina humana o leptina de mamífero no humano como, pero no limitado a, leptina de ovino, rata, ratón, caballo y cerdo, y las secuencias LDFI representan la secuencia 39-42 LDFI de leptina humana o leptina de mamífero no humano. En ciertas modalidades, la leptina es humana, leptina de ratón o de ovino.

Como se puede ver en el Cuadro 6 más adelante, la afinidad del receptor de leptina de los agonistas y antagonistas de leptina identificados en el primer ensayo de evaluación varía de aproximadamente 1.5 veces a aproximadamente 35 veces en comparación con la leptina de ratón de tipo silvestre. La mutagénesis racional de D23 en antagonistas de leptina entonces reveló muteínas que tienen un espectro de afinidades hacia el receptor de leptina que varían de aproximadamente 18 a aproximadamente 64 (Cuadro 7). Por tanto, en ciertas modalidades, el antagonista de leptina sintético de conformidad con la presente invención se une al receptor de leptina con una afinidad que es de hasta 100 veces, 90 veces, 80 veces, 70 veces, 50 veces, 30 veces o 20 veces, más alta que aquella de la leptina de mamífero modificada que es modificada sólo en el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre de modo que de dos a cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrofóbico son sustituidos con residuos de aminoácido diferentes de modo que el sitio se vuelva menos hidrofóbico.

En una modalidad adicional, el antagonista de leptina sintético de la invención está en forma pegilada y tiene un número variable de moléculas de polietilen glicol (PEG) unidas al mismo. PEG de peso molecular de aproximadamente 20 kDa es apropiado para este propósito. La pegilación de los antagonistas de leptina de la invención incrementa su estabilidad, su vida media de plasma y farmacocinética.

Las sales de los polipéptidos de leptina de mamífero modificadas de la invención también están incluidas en el alcance de la invención. Como se usa aquí, el término "sales" se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales ácidas de adición de grupos amino de la molécula de péptido. Las sales de un grupo carboxilo pueden ser formadas por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sodio, calcio, amonio, sales férricas o de zinc y similares y sales con bases orgánicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales ácidas de adición incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Dichas sales son preferiblemente usadas para modificar las propiedades farmacéuticas del polipéptido en lo que a estabilidad, solubilidad, etc., se refiere.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN aislada que codifica un antagonista de leptina de la invención. En ciertas modalidades, el antagonista tiene el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre modificada por los siguientes reemplazos: L39A, D40A y F41A y además D23 es reemplazada con leucina. En particular, la molécula de ADN comprende una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4, unida operativamente a un promotor inducible o constitutivamente activo capaz de provocar la expresión de la molécula de ADN.

En incluso otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista de leptina sintético de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, en particular el antagonista de leptina sintético de la secuencia de aminoácido como se representa en SEQ ID NO: 1. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica comprende un antagonista de leptina sintético en una forma pegilada.

Además, se ha encontrado de conformidad con la presente invención que el antagonista de leptina súper activo administrado a ratones, en los que la hepatitis fue inducida por la activación de la respuesta inmune innata, proporciona efectos protectores significativos mediados por la inhibición del macrófago mononuclear infiltrado en el órgano inflamado. Las alteraciones en la respuesta inmune innata son consideradas como eventos centrales en la patogénesis inicial de muchos trastornos auto-inflamatorios y metabólicos, ejemplos de los cuales incluyen enfermedad intestinal inflamatoria y esteatohepatitis no alcohólica. Las vías metabólicas, como la vía de la leptina, son postuladas para interactuar y modular el brazo inmune innato a través de múltiples mecanismos.

Por tanto, la composición farmacéutica que comprende un antagonista de leptina sintético de la invención es útil en el tratamiento de cualquier trastorno en el que esté implicada una actividad no deseada o deletérea de la leptina endógena o una respuesta inmune innata alterada, como por ejemplo en el síndrome metabólico, esteatohepatitis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia (al incrementar el apetito del sujeto que sufre de anorexia), caquexia, cáncer, enfermedades auto-inflamatorias y autoinmunes como esclerosis múltiple, síndrome intestinal inflamatorio o artritis reumatoide.

Por tanto, en ciertas modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes tipo II y para el tratamiento de resistencia a la insulina, especialmente la asociada con obesidad en un mamífero humano o no humano.

En otras ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede ser usada para la inhibición de crecimiento celular maligno y puede por tanto ser útil en el tratamiento de cáncer como, pero no limitado a, cáncer de mama, colon, de ovario y de próstata.

Las composiciones farmacéuticas para uso de conformidad con la presente invención pueden ser formuladas de manera convencional usando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. El/los portador(es) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la composición y no deletéreo(s) para el receptor del/de los mismo(s).

Los métodos de administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, rutas de tipo parenteral, e.g., intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, subcutáneo, mucoso (e.g., oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, infraocular), intratecal, tópico e intradérmico. La administración puede ser sistémica o local.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento del síndrome metabólico, esteatohepatitis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia, caquexia, cáncer, enfermedades autoinmunes y autoinflamatorias como esclerosis múltiple, síndrome inflamatorio del intestino o artritis reumatoide, que comprende la administración a un paciente en necesidad de una cantidad efectiva del antagonista de leptina sintético de la invención.

Incluso en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el antagonista de leptina sintético de la invención para su uso en el tratamiento de síndrome metabólico, esteatohepatítis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia, caquexia, cáncer, o enfermedades autoinmunes y autoinflamatorias como esclerosis múltiple, síndrome inflamatorio del intestino o artritis reumatoide.

Además de su uso farmacéutico potencial, los antagonistas de leptina de la invención son útiles como herramientas de investigación de las actividades biológicas de la hormona leptina.

La presente invención además proporciona un antagonista de leptina sintético que consiste en un polipéptido de leptina de mamífero modificado con un sitio de unión hidrofóbico LDFI sin modificar en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre, en donde el polipéptido de leptina ha sido modificado para mejorar su afinidad de unión a un receptor de leptina como se describe más adelante para el antagonista de leptina sintético. En otras palabras, la presente invención proporciona un antagonista de leptina sintético que consiste en un polipéptido de leptina de mamífero modificado en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado, en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico, en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o una sal farmacéuticamente aceptable del polipéptido de leptina de mamífero modificado o su fragmento. Las modificaciones particulares que mejoran la afinidad del polipéptido de leptina modificado hacia el receptor de leptina son seleccionadas del grupo que consiste en D23L, D23G, D23A, D23T, D23H, D23F, D23R, D23K y T12I. Otras sustituciones pueden también ser introducidas en el polipéptido de leptina, opcionalmente además de las sustituciones de D23 y/o T12, como L68M, S97F, S132Y, G1 12S, T37A y G44D, y cualquier combinación de dos o más de estas sustituciones.

En otros aspectos, las composiciones farmacéuticas son proporcionadas comprendiendo un portador farmacéuticamente aceptable y el antagonista de leptina sintético de la presente invención que tiene afinidad de unión mejorada a un receptor de leptina. Hasta ahora la terapia de leptina fue usada en casos limitados en los que la deficiencia genética de la leptina fue identificada (Bluher et al. 2009) o sobre una base experimental en lipodistrofia humana (Chong et al. 2010). Sin embargo, se mantiene un esfuerzo continuo para utilizar la leptina como un fármaco anti-obesidad y a pesar de las fallas se publicó recientemente un reporte que describe la combinación exitosa de terapia de leptina y amilina (Turek et al. 2010). Otro reporte mostró que el pre-tratamiento de ratones con un chaperón químico como el bufenilo (4-PBA) o ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA, por sus siglas en inglés) incrementó la sensibilidad de la leptina (Ozcan et al., 2009).

También, a la luz de un reporte reciente que muestra que en los ratones con diabetes tipo 1 tratados con leptina en combinación con insulina, el azúcar en la sangre fluctuaba menos, los niveles de colesterol fueron más bajos y había menos deposición de grasa corporal que en los ratones con diabetes tipo 1 tratados sólo con insulina (Wang et al., 2010), los agonistas de leptina de alta afinidad pueden ser usados en conjunción con insulina u otros agentes que median la homeostasis de la glucosa en el tratamiento de diabetes tipo 1.

Por tanto, la composición farmacéutica comprende uno o más agentes activos adicionales. Por ejemplo, para el tratamiento de diabetes tipo I, la composición farmacéutica puede comprender insulina además del agonista de leptina y para el tratamiento de obesidad la composición farmacéutica puede comprender un agonista de amilina como SYMLIN® (acetato de pramlintida) o un chaperón químico como el bufenilo (4-PBA) o ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA) además del agonista de leptina.

En aspectos adicionales, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de una enfermedad o condición en la que está implicada la señalización aberrante de leptina, seleccionada del grupo que consiste en obesidad, síndromes relacionados con la híperfagia, diabetes tipo 1 , síndrome metabólico y ateroesclerosis, o en la promoción de angiogénesis, que comprende la administración a un paciente en necesidad de una cantidad efectiva del antagonista de leptina sintético de la invención.

En ciertas modalidades, el método es para el tratamiento de obesidad y además comprende la administración a dicho paciente de un análogo de amilina como SYMLIN® (acetato de pramlintida) o un chaperón químico como el bufenilo (4-PBA) o ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA).

En ciertas modalidades, el método es para el tratamiento de diabetes tipo 1 y además comprende la administración a dicho paciente de insulina.

Similarmente, el agonista de leptina sintético de la invención es para usarse en el tratamiento de una enfermedad o condición en la que está implicada la señalización aberrante de leptina, seleccionada del grupo que consiste en obesidad, síndromes relacionados con la híperfagia, diabetes tipo 1 , síndrome metabólico y ateroesclerosis, o en promoción de angiogénesis. El agonista de leptina sintético puede ser para uso en el tratamiento de obesidad en conjunción con la administración de un análogo de amilina o un chaperón químico, o para el tratamiento de diabetes tipo 1 en conjunción con la administración de insulina.

Se ha encontrado de conformidad con la presente invención que la inyección de antagonistas de leptina pegilados (PEG-MLA o PEG-SMLA) indujo un efecto orexigénico muy fuerte, es decir, un efecto estimulador en el apetito tanto ratones machos como hembras, conduciendo a una ganancia de peso muy rápida originada principalmente de la acumulación de grasa (véanse Ejemplos 4 y 7). Esta ganancia de peso puede ser revertida después de suspender las inyecciones de PEG-MLA o PEG-SMLA. También se mostró aquí que los ratones machos inyectados con PEG-MLA por un periodo extendido desarrollaron gradualmente resistencia a la insulina, una diferencia significativa en el nivel de insulina y en el puntaje de la evaluación del modelo homeostático (HOMA, por sus siglas en inglés) comparado con los controles (HOMA es un método usado para cuantificar la resistencia a la insulina y la función de células beta). También se observó un incremento significativo en la glucosa en sangre, los triglicéridos en sangre y el colesterol total - una indicación de la aparición del síndrome metabólico prediabético.

Esta obesidad reversible inducida por el antagonista de leptina, asociada con hiperglucemia, hiperlipidemia y resistencia a la insulina, puede servir como un modelo reversible rápido de diabetes mellitus tipo 2 en ratones. Dicho modelo puede ser logrado al inyectar PEG-SMLA o mediante la creación de ratones transgénicos que expresan condicionalmente la secuencia de ADN que codifica el SMLA.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un ratón transgénico cuyo genoma comprende un gen que comprende una molécula de ADN que codifica un antagonista de leptina sintético de conformidad con la presente invención, el cual está unido operativamente a un promotor inducible.

En ciertas modalidades, la molécula de ADN codifica un antagonista de leptina sintético que consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1 , y preferiblemente es de SEQ ID NO: 4.

Como se indica en WO 2006/056987, para producir un antagonista de leptina funcional, al menos dos de los residuos de aminoácido en las posiciones 39-42 de una leptina de mamífero de tipo silvestre pueden ser sustituidos con uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina y serina. Por tanto, el genoma del ratón transgénico de la presente invención puede comprender un gen que codifica estos antagonistas de leptina que además tienen mutaciones en D23 o T12, como se define aquí anteriormente.

Por supuesto, también los genes que codifican los antagonistas de leptina de WO 2006/056987 pueden ser introducidos en el ratón transgénico. Por tanto, un antagonista de leptina en el que dos cualesquiera residuos de aminoácido en cualesquiera de las posiciones 39-42 de una secuencia de polipéptido de leptina de mamífero son sustituidos por alanina, por ejemplo en las posiciones 39, 40 ó 39, 41 , ó 39, 42, ó 40, 41 , ó 40, 42, ó 41 , 42.

En ciertas modalidades, la molécula de ADN aislada codifica un antagonista de leptina derivado de leptina humana. En particular, la molécula de ADN es SEQ ID NO: 5 y codifica el mutante de leptina humana doble L39A/D40A. En otra modalidad, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 6 y codifica el mutante de leptina humana doble F41A/I42A.

En otra modalidad, la molécula de ADN aislada codifica un antagonista de leptina derivado de leptina de ovino. En particular, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 7 y codifica el muíante doble L39A/D40A de leptina de ovino. Alternativamente, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 8 y codifica el mutante doble F41A I42A de leptina de ovino.

En otra modalidad de la invención, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 9 y codifica el mutante triple L39A/D40A/F41A de leptina humana. En otra modalidad, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 10 y codifica el mutante triple L39A D40A/F41A de leptina de ovino.

Incluso en otra modalidad, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 1 1 y codifica el mutante cuádruple L39A/D40A/F41A/I42A de leptina humana.

En una modalidad adicional, la molécula de ADN es de SEQ ID NO: 12 y codifica el mutante cuádruple L39A/D40A/F41A/I42A de leptina de ovino.

Es importante que el promotor que controla la expresión del gen del antagonista de leptina sea inducible, para permitir el control espaciotemporal. Por ejemplo, se desea que el gen sea encendido sólo en la etapa adulta de desarrollo y que pueda ser apagado después de que se ha logrado un cierto efecto.

Hasta la fecha, dos sistemas principales han sido exitosamente usados en ratones transgénicos, es decir, el sistema de tetraciclina inducible y el sistema de recombinasa Cre7loxP (ya sea constitutivo o inducible). Para usar estos sistemas in vivo, es necesario generar dos grupos de animales transgénicos. Una línea de ratón expresa un activador (tTA, rtTA, o recombinasa Cre) bajo el control de un genérico seleccionado o de un promotor específico para tejido. Otro grupo de animales transgénicos expresa la construcción del "aceptador", en la que la expresión del transgen del antagonista de leptina está bajo el control de la secuencia objetivo para los transactivadores tTA/rtTA (o está flanqueada por secuencias loxP). El apareo de las dos cepas de ratones permite el control espaciotemporal de la expresión del transgen.

Otros sistemas inducibles han sido descritos, por ejemplo, promotores que comprenden dominios de unión de hormonas esferoides sintéticos, y pueden ser usados de conformidad con la presente invención.

Por tanto, en ciertas modalidades, el promotor inducible es un promotor dependiente del transactivador controlado por tetraciclina y el genoma de ratón transgénico además comprende un transactivador controlado por tetraciclina. El transactivador puede ser elegido de entre dos tipos de transactivadores; uno que permite la transcripción sólo en ausencia de tetraciclina o uno que permite la transcripción sólo en su presencia.

Los métodos para producir ratones transgénicos son de conocimiento común y cualquier método apropiado puede ser elegido para producir ratones transgénicos de la presente invención, por ejemplo como se enseña en "Transgenic animal technology: a laboratory handbook, 2nd edition (Cari A. Pinkert, ed., Gulf Professional Publishing, 2002), el cual se ha incorporado aquí en su totalidad como referencia.

Como se mencionó anteriormente, el ratón transgénico de la presente invención preferiblemente exhibe resistencia a la insulina y niveles incrementados de insulina en sangre y de glucosa en sangre.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de evaluación de una sustancia que tiene actividad terapéutica para una enfermedad o trastorno seleccionada del grupo que consiste en hipergiucemia, hiperlipidemia, diabetes mellitus tipo 2 y resistencia a la insulina, el método comprende los pasos de: (1) administrar una sustancia de prueba al ratón transgénico; (2) confirmar si dicha enfermedad o trastorno es suprimida o no en el ratón transgénico; y (3) seleccionar la sustancia de prueba como la sustancia que tenga actividad terapéutica para dicha enfermedad o trastorno cuando dicha enfermedad o trastorno es suprimida en el ratón transgénico.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes: EJEMPLOS Materiales y métodos Materiales Se preparó en nuestro laboratorio, como se describió anteriormente, un dominio de unión de leptina humana recombinante (hLBD) (Sandowski et al, 2002), así como antagonistas de leptina de ratón, y de leptina de ratón y humana (Salomón et al. 2006, Niv-Spector et al. 2005). El ADNc de tipo silvestre (WT) de leptina de ratón sintético optimizado para la expresión en E. Coli fue sintetizado por Entelechon Co. Rensberg, Alemania (Salomón et al. 2006). La leptina humana y la interleucina-3 de ratón (mlL3, por sus siglas en inglés) fueron compradas de Protein Laboratories Rehovot (Rehovot, Israel). Las enzimas de restricción usadas en los experimentos de biología molecular fueron de Fermentas (Vilnius, Lituania). Los iniciadores de ADN altamente puros fueron ordenados de Syntezza (Jerusalén, Israel). La solución amortiguadora de lisis, el ácido nalixídico, el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (tiazolilo azul, MTT), la puromicina y la kanamicina fueron comprados de Sigma (Sigma, Israel). Las columnas Superdex 75 HR 10/30, 26/60 y Superdex 200 HR 10/30 y Q-Sepharose y SP-Sepharose fueron de Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Suecia). Los marcadores moleculares para la electroforesis SDS-gel y el ensayo de proteínas de Bradford fueron comprados de Bio-Rad (Bio-Rad, Israel). La Bacto-triptona fue de Laboratorios Conda (Madrid, España). El extracto de Bacto-levadura y los ácidos Bacto Casamino (-Trp, -Ura) fueron de Difco (Becton Dickinson, Maryland, EUA). La Sulfo-NHS-LC-Biotina fue comprada de Pierce (Rockford, IL, EUA). El plásmido pCT302 y la cepa EBY100 de la levadura Saccharomyces cerevisiae fue un amable regalo del Dr. E.T. Boder (de la University of Tennessee Knoxville, TN, EUA). El Ab 9e10 monoclonal fue comprado de (Covance, Emeryville.CA), el IgG anti-ratón de cabra de F(ab')2 marcado con FITC fue de (Chemicon) y el conjugado de ficoeritrina- estreptavidina (SA-PE) de (BD PharMingen, San José, CA). Los anticuerpos p-STAT-3 (Tyr705) y STAT-3 fueron de (Cell Signaling Danvers, MA, EUA) y el mPEG-propionil-ALD 20 kDa fue comprado de Jenkem Technology USA Inc. (Alien, TX). El suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) la penicilina-estreptomicina ('pen-strep'; 10,000 unidades/ml y 10,000 mg/ml) y el reactivo de quimioluminiscencia mejorado (ECL, por sus siglas en inglés) fueron de Biological Industries Ltd. (Beit Haemek, Israel). Los medios RPMI-1640 y DMEM fueron de GIBCO (Invitrogen - Carlsbad, CA.), el co-precipitante PelletPaint de (Novagen, EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania). El reactivo del ensayo de luciferasa fue de Promega (Madison, Wl, EUA), la Estreptavidina conjugada con peroxidasa fue de Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA, EUA) y el TMB fue de Dako (DakoCytomation, Dinamarca). Otros reactivos como Tris, cisteína, arginina, NaOH, HCI, ácido bórico, Tween 20, urea ultra pura, y leche descremada fueron todos de grado analítico.

Los siguientes kits fueron comprados: kit Stratagene GeneMorph®, kit de mutagénesis Stratagene QuickChange y Células azul XL-1 (Stratagene - La Jolla, CA, EUA). Kit de extracción Qiagen miniprep y Qiaquick Gel (Qiagen.Valencia, CA). Kit miniprep de plásmido de levadura Zymoprep II (Zymo Research, Orange, CA).

Los siguientes reactivos fueron preparados en nuestro laboratorio: LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCI, esterilizados), TB (80 g/L de triptona, 160 g/L de extracto de levadura, 33.3 g/L de glicerol, esterilizados), Medios YPD (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de dextrosa, esterilizados), Medios SD-CAA (20 g/L de dextrosa, 6.7 g/L de base de nitrógeno de levadura de Difco, 5 g/L de ácidos de Bacto casamino, 5.4 g/L de Na2HP04 y 8.56 g/L de NaH2P04, esterilizados), Medios SG-CAA (como en SD-CAA, pero con 20 g/L de galactosa en lugar de dextrosa), Solución amortiguadora FACS - solución amortiguadora PBS (8 g/L de NaCI, 0.2 g/L de KCI, 1.44 g/L de Na2HP04, 0.24 g/L de KH2PO4) el pH se ajustó a 7.4, suplementado con 5 % de albúmina de suero bovino y 0.05% de azida, Solución amortiguadora Lisis para la actividad de luciferasa (25 mM de Tris-Fosfato, 2mM de DTT, 2mM de CDTA, 10% de glicerol, 1 % de Triton-100, pH 7.8), solución amortiguadora TN para experimentos de filtración en gel (25 mM de Tris-HCI, pH 8 ó 9 conteniendo 300 mM de NaCI).

Biotinilación de hLBD El hLBD (0.12 mg/ml) fue dializado contra PBS (pH 7.5) e incubado con un exceso molar de 10 veces del reactivo de biotinilación, Sulfo-NHS-LC-Biotina, por 40 minutos a temperatura ambiente. El exceso de biotina que no reaccionó fue removido mediante dialización contra la solución amortiguadora PBS. La LBD biotinilada fue capaz de formar un complejo 1 :1 con leptina o antagonistas de leptina similarmente a la LBD no-biotinilada (no se muestra).

Despliegue de superficie de levadura de la leptina de ratón El cADN de tipo silvestre (WT) de leptina de ratón fue modificado por PCR para introducir los sitios de restricción Nhel y BamHI en los extremos 5' y 3' respectivamente, permitiendo la subsecuente subclonación en un vector aceptador pCT302 linealizado con Nhel y BamHI. Los iniciadores usados en PCR fueron 5'- GTACGCAAGC TAGCGCTGTTCCGATCCAGAAAGTTCAGG 3' (SEQ ID NO: 5) al extremo 5' y 5'-CGTAGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAACTG - 3' (SEQ ID NO: 6) al extremo 3'. El producto PCR de leptina de ratón fue digerido con Nhel y Bam Hl, extraído, y ligado en el vector de expresión linealizado de pCT302. Las células azul XL-1 fueron transformadas con el nuevo plásmido y cultivadas en placas de LB-agar que contienen 100 g/ml de ampicilina. Se aislaron cuatro colonias de E. coli y se confirmó que contenían el cADN de leptina de ratón mediante digestión con las enzimas de restricción Nhel y Bam Hl. Todas las colonias fueron positivas y una de ellas fue secuenciada.

La leptina de ratón fue expresada como una fusión proteinica Aga2p en la cepa EBY100 de la levadura Saccharomyces cerevisiae por inducción en el medio que contiene galactosa (Boder ET, Wittrup KD, 1997.). El marcador epítopo de hemaglutinina (HA, por sus siglas en inglés) es expresado corriente arriba al 5' de ADN que codifica leptina, mientras que el marcador epítopo c-myc está unido al 3' de la construcción de fusión de Aga2p-leptina, la estructura esquemática de la cual es presentada en la figura 1 . El marcador epítopo c-myc puede ser detectado usando un anticuerpo de ratón mAb 9e10 y un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con FITC. La detección del marcador epítopo en el C-término de la fusión Aga2p-leptina es indicativo de despliegue de la fusión de leptina de longitud completa sobre la superficie de células de levadura.

Las células de levadura transformadas con leptina de ratón de tipo silvestre pCT302 fueron cultivadas durante la noche a 30°C con agitación en 3 mi del medio de glucosa selectivo SD-CAA. Después de aproximadamente 18-20 horas, se indujo la expresión de Agalp (una proteína de levadura de membrana) + Aga2p-leptina a 30°C con agitación en 5 mi del medio de galactosa selectivo (SG-CAA, en donde 2% de galactosa reemplaza la glucosa en SD-CAA). Los cultivos fueron cosechados después de aproximadamente 20-24 horas (1-2 duplicaciones) por centrifugación, lavados con PBS que contiene 5% de albúmina de suero bovino y 0.05% de azida (solución amortiguadora FACS) e incubados por 60 minutos en hielo con anti-c-myc mAb 9e10 (dilución 1 :100) y hLBD biotinilada (concentración final de aproximadamente 50nM), lavados con PBS e incubados por 30 minutos en hielo ya sea con IgG anti-ratón de cabra F(ab')2 marcado con FITC (1 :50) o un conjugado de ficoeritrina-estreptavidina (SA-PE) (1 :50) o ambos. Las células de levadura marcadas fueron analizadas en un citómetro de flujo Beckton Dickinson FACSCalibur en el Flow Cytometry Center en el Weizmann Institute.

Construcción de la biblioteca de leptina de ratón El gen de la leptina de ratón de tipo silvestre fue sujeto a mutagénesis aleatoria usando un kit Stratagene Gene orph® para dar una tasa de mutagénesis alta. Como se describe en el estudio de Raymond et al. (1999), para obtener la mejor eficiencia de transformación, los iniciadores de recombinación homólogos fueron diseñados de modo que los insertos tuvieran un traslape de aproximadamente 50 bp en cada extremo con el vector aceptador de corte. El iniciador usado para hacer insertos con homología 5' con el vector de corte fue 5'-GTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAG CGCTGT TCCGATCCAGAAAGTTC- 3', (SEQ ID NO: 7) y el iniciador usado para hacer insertos con homología 3' con el vector de corte fue 5'-GATCTCGAGCTATTACAAGTCCT CTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAAC TG-3' (SEQ ID NO: 8). Los productos PCR fueron purificados con gel y extraídos usando un kit de extracción de gel Qiaquick (Qiagen). El producto PCR obtenido fue además amplificado usando el kit de mutagénesis aleatoria y extraído de nuevo. El producto final PCR fue transformado en la levadura junto con la leptina pCT de ratón linealízada. La recombinacíón homóloga in vivo en levadura entre el 5' y el 3' flanqueando 50 pares de bases del producto PCR con el plásmido espaciado resultó en una biblioteca de aproximadamente 5x105 variantes de leptina de ratón. Se concentraron 41 pg de inserto de ADN mutagénico y 8.2 pg de la enzima linealízada de restricción pCT302 de la cadena principal del vector con Pellet Paint (Novagen) y se transformaron en células de levadura competentes EBY100 (Boder and Wittrup 1997) mediante 5 electroporaciones (Meilhoc et al. 1990). Se obtuvo una biblioteca de 5x105 de transformados de levadura, como se estimó al cultivar alícuotas de la biblioteca y contar las colonias. La relación del fragmento de inserto total con el vector aceptador de corte fue mantenida en 5:1 para todas las transformaciones.

Preparación de levaduras electrocomponentes para recombinación homologa El método de preparación de levadura sigue de cerca el descrito por Meilhoc et al. (1990). Primero, se inocularon 50 mi de YPD con la cepa S. cerevisiae EBY100 (Boder and Wittrup 1997) a una densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) de 0.1 de un cultivo durante la noche de EBY100 en YPD. Después, las células fueron cultivadas con agitación a 30°C a una OD de 1.3 a 1.5 (aproximadamente 6 horas de crecimiento). Las células fueron cosechadas por centrifugación y suspendidas en 50 mi de agua estéril fría. Las células fueron lavadas con 25 mi de agua estéril fría y suspendidas en 2 mi de sorbitol estéril 1 M enfriado con hielo. Las células fueron cosechadas por centrifugación y suspendidas en 50 µ? de sorbitol estéril. La subsecuente electroporación de las células suspendidas se llevó a cabo usando un Bio-Rad Gene Pulser con una cubeta de 0.2 cm (voltaje de 1.5 kV, capacitancia de 25 pF) Después de la pulsación las alícuotas de células se resuspendieron inmediatamente en 1 mi de sorbitol 1 M frío y la mezcla de transformación completa fue transferida a 50 mi de medios selectivos SDC-AA que contienen kanamicina (25 pg/ml) y pen-strep (dilución 1 :100) para crecimiento a 30°C. Una pequeña alícuota de células fue removida y cultivada en placas SDC-AA para determinar la eficiencia de transformación.

Evaluación de la biblioteca de leptina de ratón por citometría de flujo 50 mi de volumen de la mezcla transformada en medios selectivos SD-CAA fueron cultivados durante la noche a 30°C con agitación, diluidos a una OD6oo = 0.05 y cultivados durante la noche a 30°C a una OD6oo >1.0. Un volumen de 5 mi de SG-CAA fue entonces inoculado a una OD6oo de aproximadamente 0.5 y cultivado durante la noche a una OD6oo de 3-4. Los protocolos detallados para la evaluación de bibliotecas de polipéptidos de levadura han sido descritos (Boder and Wittrup 2000). Brevemente, 3 x 108 células de levadura inducidas fueron entonces marcadas con hLBD biotinilada a una concentración de 50 nM por 1 hora a 37°C en solución amortiguadora FACS. Para detectar la expresión del marcador epítopo c-myc C-terminal, se agregó el anticuerpo monoclonal 9e10 (a dilución 1 :100) simultáneamente en la misma incubación. Entonces las células de levadura fueron lavadas con solución amortiguadora FACS enfriada con hielo y resuspendidas en solución amortiguadora FACS que contiene exceso de hLBD no-biotinilada fría a una concentración de 2000 nM por 2 horas a 37°C. Las células fueron lavadas, marcadas por una hora con anticuerpos secundarios: estreptavidina conjugada con R-ficoeritrina (PE, por sus siglas en inglés) (1 :50) y un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con FITC (1 :50). Las células fueron lavadas y evaluadas por clasificación citométrica de flujo de color dual para levadura en un clasificador celular Beckton Dickinson FACSAria III para aislar clones con unión mejorada a hLBD soluble, relativos a la leptina de tipo salvaje. Las células de levadura recolectadas fueron cultivadas e inducidas para expresión. Se llevaron a cabo tres rondas de clasificación por citometría de flujo, con re-crecimiento y re-inducción de la expresión de la superficie entre cada clasificación. Un total de aproximadamente 1x107 células fueron examinadas durante la primera ronda de clasificación y aproximadamente 5% de la población fue recolectada. Después de una segunda ronda de clasificación, 1.6 x 105 células fueron recolectadas con 0.5-1 % de severidad y después de la tercera ronda de evaluación, 5000 células con 0.1 % de severidad fueron recolectadas. Cada biblioteca fue congelada y guardada a -80° C de conformidad con el protocolo (Chao et al. 2006).

Aislamiento y secuenciación de ADN Después de tres rondas de clasificación, las células recolectadas fueron cultivadas en placas de medios selectivos para aislar clones individuales. El ADN de 40 clones individuales fue extraído usando un kit Zymoprep (Zymo Research) de conformidad con el protocolo del fabricante. El ADN fue amplificado transformándolo en Células Azul XL-1 (Stratagene). Las células fueron cultivadas en placas LB selectivas suplementadas con 100 pg/ml de ampicilina. Las colonias de estas placas fueron cultivadas durante la noche a 37°C en medio LB más 100 µg/ml de ampicilina y el ADN fue aislado usando un kit miniprep Qiagen de conformidad con las instrucciones del fabricante y el ADN fue secuenciado.

Determinación de la afinidad hacia el receptor de leptina humana soluble (hLBD) en clones de levadura seleccionados después del tercer ciclo de evaluación Los clones de células de levadura individuales después de una tercera evaluación fueron cultivados e inducidos. 1x106 células fueron marcadas usando hLBD biotinilada a diferentes concentraciones (1000, 333, 1 1 1 , 37, 12, 4, 1.37 nM) junto con Ab anti-c-myc y Abs fluorescente secundario como se describió anteriormente. Los datos de fluorescencia de levadura c-myc positiva fueron obtenidos usando un citómetro de flujo Beckton Dickinson FACSCalibur. Para calcular la constante de disociación K<j, la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI, por sus siglas en inglés), obtenida con cada una de las concentraciones de hLBD biotinilada probadas, fue entonces presentada contra la concentración de hLBD y usando una regresión no-lineal (curva de ajuste) con la ecuación de la hipérbola, y analizada con el software Prism (Prisma, GraphPad Prism™ Versión 4.0: GraphPAD Software, San Diego, CA).

Preparación de plásmidos de expresión bacterial que codifican muteínas de leptina de ratón Se llevó a cabo PCR para introducir los sitios de restricción Nco\ y HindIII en los extremos 5'- y 3'- respectivamente, permitiendo la subsecuente subclonación de los mejores aglutinantes de leptina de ratón mutantes de ADN en el vector pMON3401 linealizado con Nco\ y HindIII. Los iniciadores usados fueron AAAAAACCATGGCTGTTCCGATCCAGAAAG (SEQ ID NO: 9) para el extremo 5' y AAAAAAAAGCTT TCAGCATTCCGGAGAAACGTCC (SEQ ID NO: 10) para el extremo 3' del mutante de leptina. El cADN de las muteínas de leptina de ratón en pCT302 fue digerido con Nco\ y Hind\\\, extraído y ligado en el vector de expresión linealizado pMon3401. Las células competentes de E. coli MON105 fueron transformadas con el nuevo plásmído de expresión y cultivadas en placas de LB-agar que contienen 75 pg/ml de espectinomicina para la selección de plásmído. Se aislaron cuatro colonias de E. coli y se confirmó que contenían el cADN de leptina de ratón mediante digestión con las enzimas de restricción Nco\/Hind\\\. Todas las colonias fueron positivas y una de ellas fue secuenciada.

Inserción de las mutaciones L39A/D40A/F41A en muteínas de leptina de ratón El procedimiento para insertar mutaciones en leptinas para crear antagonistas de leptina es descrito en la Solicitud Internacional PCT/IL2005/001250, incorporada aquí en su totalidad como referencia como si se describiera completamente aquí. Para preparar a los mutantes de leptina con actividad antagonista, los plásmidos de expresión pMon3401 que codifican las 6 muteínas de leptina de ratón seleccionadas (véase la sección anterior) fueron usados como material de partida. Los insertos de leptina fueron modificados con el kit de mutagénesis Stratagene QuickChange (La Jolla, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante, usando dos iniciadores complementarios (Cuadro 1). Los iniciadores fueron diseñados para contener cambios base (marcados en negritas), para obtener las mutaciones respectivas pero aún conservar la secuencia de aminoácido apropiada, y para modificar un sitio de restricción específico (subrayado) para la evaluación de la colonia. El procedimiento incluyó 18 ciclos PCR usando Pfu polimerasa. La construcción mutada fue entonces digerida con la enzima de restricción Dpn\, la cual es específica para ADN metilado y hemi-metilado (secuencia objetivo: 5'-Gm6ATC-3'), para digerir el molde y seleccionar mutaciones que contienen ADN sintetizado. Las células competentes XL-1 fueron transformadas con los plásmidos mutados y cultivadas en 5ml de medio LB y los plásmidos fueron aislados. Cinco colonias de cada muíante fueron evaluadas para mutación, usando el sitio de restricción diseñado específico, y revelaron al menos 80% de eficiencia. Dos colonias de cada muíante fueron secuenciadas y se confirmó que contienen la mutación pero no incorporación fallida no deseada de nucleóíidos. Las células compeleníes Moni 05 fueron eníonces íransformadas con los plásmidos y usadas para la expresión.

Inserción de mutantes D23 a plásmido que codifican el antagonista de leptina de ratón Los mutantes D23A, D23G, D23L, D23R, D23K, D23F y D23W fueron preparados como se describe en el párrafo anterior y los plásmidos de expresión pMon3401 que codifican el antagonista de leptina de ratón (MLA) fueron usados como material de partida. Los detalles de los iniciadores están en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Iniciadores usados para la preparación de mutantes de leptina humana v de ratón Iniciador Secuencia de iniciador3 Sitio de restricción SINC modificadob L39A/D40A/F41 S 5'· -CAGCGTGTTACCGGCGCGGCTGCCATCCCGGGCCTGC-3' BshTI(-) 1 1 L39A/D40A/F41 A 5'· -GCAGGCCCGGGATGGCAGCCGCGCCGGTAACACGCTG-3' BshTI(-) 12 D23G-5 S 5'· -CCATCGTTACCCGTATT AATGGCATCTCTCATACC C-3' Vspl (+) 13 D23G-3 A 5'- -GGGTATGAGAGATGCCATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 14 D23A-5 S 51· -CCATCGTTACCCGTATT AATGGCATCTCTCATACC C-3' Vspl (+) 15 D23A-3 A 5'· -GACTGGGTATGAGAGATAGCATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 16 D23L-5 S 5'-¦CCATCGTTACCCGTATT AATCTGATCTCTCATACCCAGTC-3' Vspl (+) 17 D23L-3 A 5'- -GACTGGGTATGAGAGATCAGATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 18 D23R-5 S 5'· -CCATCGTTACCCGTATT AATCGTATCTCTCATACCCAGTC-3' Vspl (+) 19 D23R-3 A 5'· -GACTGGGTATGAGAGATACGATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 20 D23K-5 S 5'- -CCATCGTTACCCGTATT AATAAGATCTCTCATACCCAG-3' Vspl (+) 21 D23K-3 A 5'· ¦CTGGGTATGAGAGATCTTATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 22 D23F-5 S 5'-¦CCATCGTTACCCGTATT AATTTCATCTCTCATACCCAGTC-3' Vspl (+) 23 D23F-3 A 5'- -GACTGGGTATGAGAGATGAAATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 24 D23W-5 S 5'· -CCATCGTTACCCGTATTAATTGGATCTCTCATACCCAGTC-3' Vspl (+) 25 D23W-3 A 5'· ¦GACTGGGTATGAGAGATCCAATTAATACGGGTAACGATGG-3' Vspl (+) 26 T12I-5 S 5" - GGATGACACCAAAATCCTGATTAAAACCATCGTTACCCG-3' Bell (-) 27 T12I-3 A 5" - CGGGTAACGATGG 1 1 1 1 AA 1 CAGGA 1 1 1 1 GGTGTCATCC-3" Bell (-) 28 D23L-5 (humana) S 5' - CAATTGTCACCAGGATTAATCTGATTTCACACACGCAG-3' Vspl (+) 29 D23L-3 (humana) A 5" - CTGCGTGTGTGAAATCAGATTAATCCTGGTGACAATTG-3' Vspl (+) 30 a S, iniciador de sentido; A, iniciador antisentido; todas las mutaciones están en letras negritas. bLas mutaciones exitosas fueron monitoreadas por desaparición (-) o aparición (+) del sitio de restricción respectivo (subrayado). CSEQ ID NO.

Expresión, replegado y purificación de muteínas de leptina de ratón Las leptinas de ratón mutadas recombinantes con un et-Ala extra (la metionina es escindida por la bacteria) en el N-término fueron expresadas en un cultivo 2.5-L, después de la inducción con ácido nalixídico, y cultivadas por 4 horas adicionales. Se prepararon entonces los cuerpos de inclusión (IBs, por sus siglas en inglés) como se describió anteriormente (Gertler et al. 1998, Salomón et al. 2006) y se congelaron. Subsecuentemente, los cuerpos de inclusión (IBs) obtenidos de 0.3L de cultivo bacterial fueron solubilizados en 50 mi de urea 4.5 M, 40 mM de base Tris que contiene 1mM de cisteina. El pH de la solución fue ajustado a 1 1.3 con NaOH. Después de 2 horas de agitación a 4 °C, tres volúmenes de Arg 0.67 M fueron agregados a una concentración final de 0.5 y agitados por 1 .5 horas adicionales. Entonces, la solución fue dializada contra 10 L de 10 mM de Tris-HCI, pH 9 por 60 horas, con cinco o seis intercambios de solución externos. Se agregó NaCI a una concentración final de 100 mM y la solución proteínica fue entonces aplicada a una tasa de flujo máxima (400-500 ml/h) sobre una columna Q-Sepharose (5 mi de volumen de grano), pre-equilibrada con los 10 mM de Tris-HCI, pH 9 que contienen 100 mM de NaCI. La fracción de ruptura, la cual contiene la respectiva muteína de leptina, fue recolectada y concentrada a 2-3 mg de proteina/ml. Entonces, se aplicaron porciones de 18 mi a una columna preparativa Superdex 75 (26/60 cm) pre-equilibradas con 25 mM de Tris-HCI, pH 9, conteniendo 300 mM de NaCI. Las fracciones que contienen la proteína monomérica como se determinó por filtración en gel sobre la columna analítica Superdex 75 HR 10/30 (1/30 cm) fueron combinadas, dializadas contra NaHC03 para asegurar una relación de proteína a sal de 4:1 y liofilizadas.

Preparación del antagonista de súper leptina humana El antagonista de leptina humana con receptor de unión de leptina mejorado fue preparado usando una estrategia similar a la usada para preparar los antagonistas de leptina de ratón mejorados. Los iniciadores usados fueron S'-CAATTGTCACCAGGATTAATCTGATTTCACACACGCAG (sitio de restricción modificado =Vspl (+)) (SEQ ID NO: 29) y 3'-CTGCGTGTGTGAAATCAGATTAATCCTGG TGACAATTG (SEQ ID NO: 30).

Purificación a gran escala de antagonistas de leptina de ratón y humana D23L/L39A/D40L/F41A El procedimiento fue esencialmente descrito en el párrafo previo con los siguientes cambios: Los IBs obtenidos de 3 L de cultivo bacterial fueron solubilizados en 400 mi de urea 4.5 M, 40 mM de base Tris que contiene 1 mM de cisteína. El pH de la solución fue ajustado a 1 1.3 con NaOH. Después de 48 horas de agitación a 4°C, tres volúmenes de Arg 0.67 M fueron agregados a una concentración final de 0.5 M. Entonces, la solución fue dializada contra 10 L de 10 mM de Tris-HCI, pH 9 por 60 horas, con cinco o seis intercambios de solución externos. Antes de la aplicación de la proteina sobre la columna Q-Sepharose (30 mi de volumen de grano) se agregó NaCI hasta los 150 mM. La filtración en gel preparativa seguida de diálisis y liofilización se condujo como se describió anteriormente. El antagonista de súper leptina humana (D23L/L39A/D40A/F41A) denominado SHLA fue preparado de conformidad con el protocolo descrito previamente para L39A/D40A/F41A humana (HLA) - (Niv-Spector et al. 2005) Determinación de pureza y contenido de monómero Se llevó a cabo SDS-PAGE de conformidad con Laemmli (1970) en un gel de poliacrilamida al 15% bajo condiciones reductivas y no reductivas. El gel fue teñido con Coomassie Brilliant Blue R. La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna Superdex 75 HR 10/30 con alícuotas de 0.2 mi de la fracción eluída de la columna Q-Sepharose usando solución amortiguadora TN (25 mM de Tris-HCI, 300 mM de NaCI, pH 8).

Pegilación de SMLA y SHLA 20 kDa de mPEG-propionil-ALD fueron usados para pegilación bajo condiciones en las que el grupo amino N-terminal es preferencialmente pegilado. 150 mg de SMLA o SHLA fueron disueltos en 1 1 1 mi de solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M (pH 5) y centrifugados a 12000 rpm por 10 minutos para remover el material insoluble. Entonces NaBH3CN 0.2 M (2.7 mi) fue agregado y la proteína disuelta fue conjugada con 1.5 g de 20 kDa de mpeg-propionil-ALD que fue disuelto en 15 mi de 1 mM de HCI. Después de 20 horas de agitación a 4°C fueron agregados 160 µ? de ácido acético (17 M). La solución fue agitada por unos cuantos segundos, diluida con 1 L de ddh^O y aplicada a una tasa de flujo máxima (400-500 ml/h) sobre una columna SP-Sepharose (20 mi de volumen de grano), pre-equilibrada con 10 mM de acetato de sodio, pH 4. La columna fue entonces lavada con 400 mi de 10 mM de acetato de sodio, pH 4 y la proteína pegilada fue eluída en 10 mM de acetato de sodio, pH 5, que contiene 50 y 75 mM de NaCI. Las fracciones que contienen la proteína pegilada como se determinó por filtración en gel sobre la columna analítica Superdex 200 (10/30 cm) fueron combinadas, dializadas contra NaHC03 para asegurar una relación de proteina a sal de 2:1 y liofilizadas. Las concentraciones de proteína fueron determinadas por absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción para 0.1 % de solución de proteína pegilada de 0.200 mg/ml para SMLA y 0.887 para SHLA. Esos valores aplican a la parte de proteína del producto pegilado.

Ensayo de unión La leptina de ratón biotinilada sirvió como el ligando en todos los experimentos competitivos y las respectivas muteinas antagonistas de leptina de ratón o leptina de ratón o humano como competidores. La hLBD fue usada como la fuente de receptor. Las placas de microtitulación de 96 pocilios de poliestireno fueron recubiertas durante la noche a 4°C con 100 µ? de 40 pM de hLBD en PBS, pH 7.4. Los pocilios entonces fueron lavados una vez con PBST (PBS que contiene 0.05% de Tween 20) y bloqueados con PBS que contiene 3% de leche descremada por dos horas a temperatura ambiente. Todas las incubaciones adicionales fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente. Los pocilios fueron lavados una vez con PBST e incubados con diferentes concentraciones de leptinas sin marcar (50 µ?/pocillo) por 30 minutos y después 50 µ? de 62.5 pM de leptina de ratón biotinilada fueron agregados a cada pocilio por otras dos horas. Entonces los pocilios fueron lavados tres veces con PBST e incubados con 1 :30,000 estreptavidina-HRP en PBS que contiene 1 % de Tween 20 por una hora. Subsecuentemente, los pocilios fueron lavados tres veces con PBST y la reacción fue cuantificada en 450 nm mediante el lector de microplacas ELISA Píate Reader ELx808 - Bio-Tek Instrument Inc. (Winooski, VT, EUA) usando TMB de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Ensayos de proliferación de BAF/3 La tasa de proliferación de células de leptina sensible BAF/3 transfectadas establemente con la forma larga de hLEPR fue usada para estimar tanto la actividad agonista como antagonista de leptinas y muteínas de leptina como se describió previamente (Niv-Spector et al, 2005, Salomón et al. 2006). Para determinar la actividad antagonista, fueron agregados 0.05 ng de leptina homologa de tipo silvestre a cada pocilio, el cual también contenía diferentes concentraciones de muteínas. La absorbancia promedio en los pocilios sin leptina (control negativo) fue usada y sustraída de otros valores de absorbancia para producir los valores de absorbancia corregidos. La absorbancia promedio en los pocilios con leptina de tipo silvestre después de la sustracción del control negativo fue usada como un control positivo para calcular el porcentaje de inhibición. Las curvas de inhibición fueron dibujadas usando el programa de competencia de un sitio de regresión no lineal sigmoidal Prisma (4.0) (Prisma, GraphPad Prism™ Versión 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) y los valores de CI50 fueron calculados. Debe hacerse notar que todas las leptinas de mamífero son capaces de activar el receptor de leptina humana a un grado casi idéntico (Gertier et al. 1998, Raver et al. 2000, Niv-Spector 2005).

Determinación de la actividad biológica por activación del gen reportero de luciferasa Las líneas de células H-49, recibida del Dr. M. Einat (ARO, Israel), son células HEK-293 transfectadas establemente con tres construcciones: phOB-Rb (forma larga del receptor de leptina humana), pAH32 (construcción de reportero de luciferasa) y pgkPuro (vector de expresión que contiene el gen de resistencia de puromicina) en una relación de 4:4:1 como se describió previamente (Gertier et al. 2007). Las células H-49 fueron brevemente disociadas con tripsina y resuspendidas en DMEM suplementado con 10% de FCS, 50 pg/ml de estreptomicina, 50 unidades/ml de penicilina y 2 pg/ml de puromicina. Las células resuspendidas fueron cultivadas en placas de cultivo tisular de 24 pocilios a 5 x 105 células por pocilio en un volumen final de 500 µ?. Después de 16 horas, el medio en cada pocilio fue reemplazado con 300 µ? de DMEM. Los mutantes de leptina de ratón fueron agregados a diferentes concentraciones con concentración constante de leptina de ratón de tipo silvestre. Las diluciones fueron hechas en DMEM suplementado con 0.5% de BSA. Tres replicados fueron usados para cada concentración y un triplicado sin leptina sirvió como control negativo. Después de 18 horas de incubación a 37°C (CO2/O2 5-95), las células fueron cosechadas con 100 µ? de solución amortiguadora de lisis y congeladas a -80°C. Cada lisado celular (50 µ?) fue mezclado con reactivo de ensayo de luciferasa Promega y la actividad de luciferasa fue determinada. La luminiscencia medida fue normalizada a la cantidad de proteína en cada pocilio. La concentración de proteína fue medida por medio del ensayo de Bradford de conformidad con el protocolo del fabricante (Bio-Rad, Israel). Los resultados fueron analizados con el software Prizm, de conformidad con una curva de competencia de un sitio de regresión no lineal.

Inhibición de la fosforilación de STAT-3 Las células CHA que expresan establemente la forma larga del receptor de leptina de ratón (ObRb, por sus siglas en inglés) fueron cultivadas a un 80% de confluencia en placas de 24 pocilios y entonces en un medio privado de suero por 16 horas antes de estimulación con hormonas. Entonces las células fueron incubadas en un medio libre de suero en presencia o ausencia de varias concentraciones (0.2-12.8 ug/ml) de mutante de leptina de ratón y una concentración de leptina de ratón de tipo silvestre (0.1 pg/ml) por 20 minutos en 0.5 mi en una placa de 24 pocilios. Después de estos tratamientos, las células fueron cosechadas en 75 µ? de solución amortiguadora de lisis enfriada con hielo. Los lisados fueron clarificados por centrifugación a 12000 rpm por 10 minutos y los sobrenadantes se conservaron para análisis Western blot. Las concentraciones de proteina de los sobrenadantes fueron determinadas usando el ensayo de Bradford. Las proteínas celulares (20 g) fueron resueltas en SDS-PAGE seguido de Western blot usando anticuerpos p-STAT-3 (Tyr705) (número de catálogo 9138) y STAT-3 (número de catálogo 9132). Entonces, las bandas Western blot fueron reveladas por quimioluminiscencia mejorada (ECL, por sus siglas en inglés).

Experimentos in vivo Los ratones hembra C57B1 fueron intraperitonealmente administrados con antagonista de leptina pegilada de ratón o de humano (PEG-MLA o PEG-HLA) o PEG-MLA súper activa (PEG-SMLA) o PEG-HLA súper activa humana (PEG-SHLA) a 6.25 mg/kg/día por un periodo de 20 días. En este periodo, la ingesta de comida y la ganancia de peso fueron registradas diariamente y promediadas por un periodo de 7 días. En el día 20, 3 ratones de cada grupo fueron sacrificados y el contenido de grasa, las enzimas del hígado y las subpoblaciones de linfocítos fueron medidos. En la parte de destete del experimento, el tratamiento fue cesado después de 20 días y la reversibilidad del fenotipo deficiente de leptina fue registrada. El segundo experimento fue llevado a cabo de manera similar usando 4 dosis ya sea de PEG-MLA o PEG-SMLA: 20, 6.7, 2.2 y 0.72 mg/kg/día y duró 17 días. En todos los experimentos los animales fueron mantenidos bajo ciclos de luz-obscuridad de 12 horas, de conformidad con las regulaciones de la autoridad de cuidado animal institucional del Tel Aviv Sourasky Medical Center.

EJEMPLO 1 Evaluación de leptinas mutantes con unión mejorada al receptor de leptina humana soluble (i) Expresión funcional de leptina sobre la superficie de células de levadura La leptina de ratón fue expresada sobre la superficie de las células de levadura como una fusión a la subunidad de aglutinina Aga2p, sobre la superficie de la levadura (Boder and Wittrup KD, 1997). La expresión de la fusión Aga2p + leptina sobre la superficie de la levadura fue medida por marcado inmunofluorescente del marcador epítopo c-myc unidos al C-término de la fusión Aga2p + leptina por citometría de flujo, indicando la expresión en marco de c-myc (figura 2A). La presencia del marcador c-myc indica que la fusión de leptina en su longitud total capaz de interactuar con hLBD biotinilada es desplegada sobre la superficie de células de levadura, (figura 2B), mientras que el control negativo que despliega un EGFR irrelevante no mostró ninguna señal (no se muestra). Además, el marcado con dos colores demostró una estrecha correlación de unión de hLBD con el despliegue del epítopo c-myc (figura 2C).

CUADRO 2 Cambios de secuencia en 40 clones seleccionados después de 3 ciclos de evaluación Número de clon* Cambio de secuencia** *H- para clones de severidad más alta. L- para clones de severidad más baja. Algunos de los clones fueron secuenciados con iniciador cmyc, de modo que el extremo de la secuencia C-terminal (los 12 últimos aminoácidos en la hélice D de leptina) no fue secuenciado.

** El cambio en mutaciones más frecuente (D23) que fue encontrado en 18 clones fue subrayado. (ii) Evaluación de la biblioteca de leptina para seleccionar clones con unión mejorada a hLBD Una biblioteca de levadura desplegada de mutantes de leptina con una diversidad de 5x105 clones fue construida usando un kit de mutagénesis aleatoria Stratagene GeneMorph®. Esta biblioteca fue evaluada a través de tres rondas de clasificación por citometria de flujo, con re-cultivo y re-inducción de la expresión de superficie entre cada ciclo de clasificación, para aislar clones con unión mejorada a hLBD. La biblioteca de levadura fue evaluada por citometría de flujo de color dual para clones que desplegaron leptina (como se determinó por inmunofluorescencia indirecta o un marcador epítopo c-myc C-terminal), y se unieron a la hLBD biotinilada. El enfoque de evaluación usó pantalla de unión cinética, al marcar a la levadura hasta la saturación con hLBD marcada fluorescentemente, seguido esto de incubación en presencia de exceso de competidor hLBD no fluorescente. Los cultivos de control de tipo silvestre marcados fueron preparados en cada ciclo de clasificación para asistencia en el establecimiento de ventanas de clasificación y confirmación del progreso en el enriquecimiento de la biblioteca. Las células que exhibieron fluorescencia después de ser puestas en competencia por hBLD no biotinilada fueron recolectadas para re-cultivo (véase la figura 3, panel derecho). Cuarenta mutantes obtenidos en el tercer ciclo de selección fueron secuenciados (Cuadro 2), resultando en identificaciones de 13 secuencias distintas nuevas, con un total de 23 cambios de aminoácidos, variando desde un cambio de 1 a 6 aminoácidos (Cuadro 2). La mutación más frecuente que ocurrió en 18 de 40 clones fue el intercambio de D23 a G, a H o a N. (iii) Determinación de afinidad usando curvas de titulación de unión de equilibrio La afinidad aproximada de la superficie de los mutantes de leptina de ratón desplegados fue determinada in situ sobre la pared celular mediante titulación de las células enteras con concentraciones variantes de hLBD biotinilada. La unión de equilibrio fue medida analizando la célula de unión hLBD y la c-myc positiva en 13 clones distintos (identificados en el Cuadro 2) mediante citometría de flujo. La regresión no lineal (curva de ajuste) de estos datos indica afinidad incrementada de hasta aproximadamente 2.3 veces en 7 de los 13 mutantes de leptina (H30, H15, H22, H12, H16, H19 y H7) como se muestra en las figuras 4A-4B y Cuadros 3 y 4 (derivados de las figuras 4A y 4B, respectivamente). Esos 7 mutantes de leptina de ratón fueron seleccionados para preparación de las leptinas mutadas respectivas expresadas en E. coli.

CUADRO 3 Afinidad hacia el receptor de leptina humana soluble (hLBD) en 13 clones de levadura seleccionados después del tercer ciclo de evaluación (derivado de la Figura 4A) Número de clon" Bmax Kd mlep, wt1 1063 158.7 mlep, wt2 955.7 1 15.0 H3 1446 91.68 H7 1587 125.8 H12 960.7 130.4 H17 3599 619.6 H19 968.2 104.2 H22 852.3 122.3 H30 846.7 59.46 *Véase el Cuadro 2 CUADRO 4 Afinidad hacia el receptor de leptina humana soluble fhLBD) en 13 clones de levadura seleccionados después del tercer ciclo de evaluación (derivado de la Figura 4B) Número de clon* Bmax Kd mlep, wt1 848.7 94.978 mlep, wt2 800.8 95.65 H2 2566 243.2 H3 1348 92.76 H6 1288 99.06 H7 1 142 83.46 H12 785.2 103 H16 550.2 43.96 H19 965.7 68.41 H22 719.2 82.30 H30 741.2 40.93 L1 1678 157.7 *Véase el Cuadro 2 EJEMPLO 2 Preparación y caracterización de seis mutantes respectivos de leptina de ratón y antagonistas de leptina de ratón Siete mutantes de leptina de ratón que fueron seleccionados mediante la evaluación de despliegue de superficie de levadura (véase anteriormente y en el Cuadro 5) fueron expresados en E. coli, replegados y purificados como proteínas recombinantes por intercambio aniónico consecutivo y cromatografía de filtración en gel como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Como en los experimentos inicíales, el muíante H7 no mostró ningún incremento en la afinidad, el correspondiente muíante L39A/L40A/F41A no fue preparado. Para obtener los 6 antagonistas de leptina de ratón respectivos (MLAs), los seis mutantes fueron también insertados con las mutaciones L39A/D40A/F41A y purificados respectivamente. Las 13 proteínas fueron probadas para pureza usando SDS-PAGE y se encontraron >99% puras, y su contenido de monómero fue más de 95% (no se muestra).

CUADRO 5 Mutaciones en los siete agonistas de leptina de ratón más activos evaluados por unión a hLBD Cambio de Clon Clon Clon Clon Clon Clon Clon Determinación de los cambios en afinidad y actividad biológica Las 13 muteínas recombinantes (siete agonistas y seis antagonistas) fueron probadas para el cambio eventual en las propiedades de unión por medio de unión a hLBD inmovilizada y para su actividad agonista o antagonista respectiva usando el ensayo de proliferación de células BAF/3 y por medio de la activación del gen reportero de luciferasa en células H-49, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Como se muestra en el Cuadro 6, la muteína más potente fue derivada del clon H30 que tiene la mutación D23H. Sin embargo, la actividad elevada también fue encontrada en proteínas derivadas de los clones H15, H16 y H19, todos teniendo la D23 mutada a Gly pero también teniendo mutaciones adicionales como se muestra en el Cuadro 3. En contraste, las proteínas derivadas del clon H12 no mostraron incremento en la afinidad o en la bioactividad. Sólo una proteína derivada del clon H22, careciendo de la mutación D23 pero teniendo sólo una mutación (T121), mostró un moderado incremento en la afinidad y bioactividad (la última encontrada sólo en el antagonista).

Para revisar si la mutación T121 puede tener un efecto aditivo al de D23, preparamos 3 mutantes dobles (T121/D23H, T121/D23R y T121/D23L) de MLA pero ni su actividad inhibidora en el bioensayo BAF/3 ni su afinidad de unión hacia hLBD fueron superiores a la D23H o D23R o D23L MLA respectivamente (no se muestra). De forma interesante, mientras que los cambios en las propiedades de unión de los agonistas y los antagonistas fueron altamente comparables, la actividad biológica fue elevada sólo en los antagonistas.

CUADRO 6 Propiedades de unión y actividad biológica en los seis imitantes de leptina de ratón y 7 mutantes de antagonista de leptina de ratón preparados en E. co/i* Leptina de ratón Mutante Ensayo de unión* Bioensayo Bioensayo de BAF/3* luciferasa* H30 35.0 ±2.00 (2) 0.3 ±0.06 (3) 0.6(1) H15 9.7 ± 1.01 (2) 0.5 + 0.08(3) 0.8(1) H22 11.7 ±0.20 (2) 0.8 ±0.21 (3) 0.7(1) H12 1.5 ± 0.00(2) 0.9 ± 0.16(3) 0.7 (1) H16 20.3 + 1.25 (2) 0.8 ±0.04 (3) 0.9(1) H19 10.4 ±2.90 (2) 0.9 ±0.19 (3) 1.5(1) H7 0.83 ± 0.17 (2) 0.5 ±0.12 (2) 0.3(1) Antagonistas de leptina de ratón Mutante Ensayo de unión* Bioensayo Bioensayo de BAF/3* luciferasa* H30 (antagonista) 34 ±3.15 (8) 5.0 ± 0.34 (5) 5.7 ± 1.42 (4) H15 (antagonista) 12.4 ±0.60 (2) 4.8 ± 1.09 (3) 4.2 ± 0.69 (3) H22 (antagonista) 11.2 ±0.80 (2) 2.4 ±0.51 (2) 3.3 ± 0.20 (3) H12 (antagonista) 1.4 ±0.48 (2) 0.8 ± 0.21 (3) 0.1 ±0.04 (3) H16 (antagonista) 11.0 ±3.90 (2) 3.3 ± 0.21 (3) 3.3 ± 0.64 (3) H19 (antagonista) 6.1 ± 1.05 (2) 3.5 ±0.26 (2) 2.9 ± 1.35 (3) *los números muestran el incremento de veces en afinidad o bioactividad en comparación con la leptina de ratón de tipo silvestre o el antagonista de leptina de ratón de tipo silvestre y son dados como promedio ± SEM. Los números de los experimentos realizados son dados en paréntesis.

EJEMPLO 3 Mutagénesis racional de D23 en MLA a siete variantes En vista de los resultados anteriores (véase arriba) que muestran que sólo la mutación D23H fue suficiente para un incremento máximo de la actividad biológica de MLA, un total de siete plásmidos mutados en los que D23 fue reemplazada por aminoácidos pequeños (G, A) o hidrofóbicos (L, F, W) o positivamente cargados fueron preparados mediante mutagénesis racional como se describe en Materiales y Métodos. Los siete mutantes fueron purificados como proteínas recombinantes por repliegue consecutivo, diálisis, intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel y se encontraron puros por SDS-PAGE y que contenían más del 98 % de monómero (figuras 5A-5C, 6A y 6H). Todos esos mutantes fueron probados para la afinidad de unión hacia hLBD y para su potencia inhibidora biológica en el ensayo de proliferación BAF/3. Los resultados resumidos en el Cuadro 7 muestran que la mutación D23L resultó en la actividad más alta. Por lo tanto fue decidido que este mutante será preparado en experimentos a gran escala, pegilado y usado para experimentos in vivo.

CUADRO 7 Resumen de actividad de mutantes de D23 antagonistas de leptina de ratón *los números muestran el incremento de veces en afinidad o bioactividad en comparación con el antagonista de leptina de ratón de tipo silvestre. Los números de los experimentos realizados son dados en paréntesis. NT -no probado (por sus siglas en inglés).

Purificación a gran escala y peqilación del antagonista de leptina de ratón D23L/L39A/D40L/F41A El prolongar el repliegue en urea 4.5 M de 2 a 48 horas antes de la diálisis (véase Materiales y Métodos) mejoró dramáticamente la producción de la fracción monomérica del antagonista de leptina de ratón D23L/L39A/D40L/F41A y la producción final de la proteína purificada a partir de los IBs correspondientes a 3 L de mezcla de fermentación varió de 400 a 500 mg. La proteína diseñada como una MLA súper activa fue >99% pura por medio de SDS-PAGE y contenía más del 95% de monómero (véase el muíante respectivo en las figuras 5A-5C y 6A). Su afinidad de unión hacia hLBD fue incrementada 64 veces y su actividad biológica in vitro en bioensayos celulares BAF/3 o H-49 fue incrementada por 13.9 y por 13.4 veces (véase el Cuadro 7 y las figuras 7A y 7C). La actividad biológica comparativa de MLA y SMLA también fue probada en un bioensayo de fosforilación STAT3 semi-cuantitativo, mostrando al menos 5 veces más actividad que la última (figuras 8A-8B). La pegilación de esta proteína llevada a cabo por el método previamente descrito para pegilación de MLA resultó en una producción más baja variando de 55 a 75 mg de proteína pegilada a partir de 400 mg de SMLA no pegilada.

La preparación final de PEG-SMLA fue pura mediante criterios SDS-PAGE y contenía aproximadamente 9% de SMLA pegilada doble, 85% de SMLA monopegilada y menos de 1 % de SMLA no pegilada (figuras 9A-9B). Aunque se muestra como un experimento representativo en las figuras 7B y 7D, la actividad biológica en células H-49 y la afinidad hacia hLBD de la SMLA pegilada fueron reducidas respectivamente por 9 y 6.2 veces en comparación con la SMLA no pegilada. Esos cambios fueron comparables con el efecto de pegilación de MLA como se muestra en las Figuras 7A y 7C (7 y 6.3 respectivamente) y en nuestra reciente publicación (Elinav et al. 2009b).

EJEMPLO 4 Experimentos de ganancia de peso en ratones Para la evaluación de la actividad in-vivo de SMLA, 6.25 mg/kg de vehículo, MLA pegilada, o SMLA pegilada fueron intraperitonealmente administradas a ratones C57bl hembras de 7 semanas de edad. Como se representa en la figura 10 y como se ha publicado antes (Elinav et al., 2009), los ratones control mantuvieron peso estable (99% ± 0.5) mientras que la PEG-MLA indujo una ganancia de peso significativa que fue estadísticamente significativa al día 5 y alcanzó un nivel de 121% ± 1.4, estabilizándose después de 8 días de tratamiento. En comparación, la PEG-SMLA indujo una ganancia de peso que tuvo su pico en 143.4% ± 3.15 (promedio ± SEM) en el día 17, y se estabilizó después de eso. Las diferencias en ganancia de peso entre PEG-MLA y PEG-SMLA fueron estadísticamente significativas desde el día 6 y en lo sucesivo. La ganancia de peso fue mediada por diferencias en el consumo de alimento que fue significativamente más alto en ratones tratados con SMLA pegilada (4.02 ± 0.17 /g/d/ratón) en comparación con tanto MLA pegilada (3.17 ± 0.56 g/d/ratón) y los ratones control (2.54 ± 0.14 g/d/ratón, P<0.01). A lo largo del experimento, los ratones se veían sanos y activos con ninguna evidencia bruta de estrés. En el día 20, 3 ratones de cada uno de los grupos fueron sacrificados. Los ratones restantes en cada grupo fueron retirados de los tratamientos y observados para resolución de la ganancia de peso. Dentro de los siguientes 17 días, (figura 10) los pesos de ratón fueron drásticamente reducidos. En un experimento adicional encaminado a una comparación relacionada con la dosis de PEG-MLA y PEG-SMLA, se compararon varias dosis diarias de ambas proteínas (20, 6.7, 2.2 y 0.73 mg/kg). Los resultados se proporcionan en la figura 11. En las 4 concentraciones, la ganancia de peso inducida por PEG-SMLA fue significativamente más alta que el respectivo efecto de PEG-MLA. El efecto máximo casi idéntico (45% de ganancias) fue obtenido por PEG-SMLA a 20 y 6.7 mg/kg. A 2.2 mg/día de PEG-SMLA el efecto fue más bajo pero todavía superior a 20 mg/kg de PEG-MLA, indicando al menos una potencia 10 veces más alta de la primera. De forma interesante, en hasta 11 días ambos tratamientos dieron resultados comparables pero después de eso el efecto de PEG-MLA se estabilizó, mientras que los ratones tratados con PEG-SMLA continuaron ganando peso hasta que en el día 16 la diferencia se volvió significativa (P<0.05). En los días 7-1 1 , la dosis más baja de PEG-SMLA (0.72 mg/kg) indujo significativamente menos ganancia de peso que 20 mg/kg de PEG-MLA, pero alcanzó el mismo valor en los días 15 y 16. Esto indica que la eficacia actual de PEG-SMLA es de hasta 27 veces más grande que la de PEG-MLA.

CUADRO 8 Ingesta promedio de alimento y agua en ratones inyectados diariamente con PEG-MLA o PEG-SMLA a- D' c' aTodos los grupos no designados con la misma letra son significativamente diferentes (p<0.05).

Ambos materiales fueron inyectados diariamente a 20, 6.7, 2.2 y 0.72 mg/kg por un periodo de 17 días. Los resultados son promedio ± SEM, n = 8 Hubo una fuerte correlación entre la ganancia de peso y la ingesta de alimento, como se muestra en el Cuadro 8. En contraste, casi no hubo diferencia en la ingesta de agua, confirmando los efectos específicos del antagonista de leptina en el apetito más que en las vías reguladoras de la sed.

EJEMPLO 5 Preparación y caracterización de antagonista de leptina de ovino y humana (HLA) con afinidad incrementada hacia el receptor de leptina Para verificar que la mutación D23L incrementa la afinidad del antagonista de leptina hacia el receptor de leptina y subsecuente actividad biológica no sólo en MLA sino también en antagonistas de leptina análogos, los correspondientes mutantes (D23L/L39A/D40A/F41A) fueron preparados por mutagénesis racional, expresados a gran escala en E. coli, purificados a homogeneidad y denominados SHLA (humana) o SOLA (de ovino). La proteína purificada fue pura como lo determinó el SDS-PAGE bajo condición reductiva y no reductiva y apareció como >98% de monómero en experimentos de filtración en gel (no se muestra). Para facilitar el uso de SHLA y SOLA para experimentos ¡n vivo, fueron pegiladas similarmente a SMLA (véase arriba) y denominadas PEG-SHLA y PEG-SOLA, respectivamente. SHLA, PEG-SHLA. SOLA y PEG-SOLA fueron probadas para unión y actividad inhibidora de conformidad con los métodos previamente descritos para MLA, SMLA y sus derivados pegilados (véase la figuras 12A-12D para proteínas humanas; los resultados para proteínas de ovino no se muestran). Como se muestra (figura 12A), SMLA y SHLA exhibieron actividad biológica idéntica, que fue > 9 veces más alta que la de HLA. Este resultado fue verificado en un experimento adicional y un incremento relativo similar en la actividad fue también observado en PEG-SHLA vs. PEG-HLA (figura 12B).

La figura 12C y la figura 12D muestran que el incremento de la actividad biológica debido a la mutación D23L se origina de el dramático (44 veces y 80 veces) incremento en la afinidad para la hLBD inmovilizada.

En un experimento de ganancia de peso in vivo preliminar en ratones (12.5 mg/kg/día, durando 2 semanas), PEG-MLA y PEG-HLA fueron comparadas y ambas mostraron un efecto idéntico en la ganancia de peso (no se muestra). Por lo tanto, para validar el efecto de la mutación D23L, un experimento in vivo comparativo similar se llevó a cabo con PEG-SHLA y PEG-SMLA. Los resultados son presentados en las figuras 13A-13B y muestran que ambos materiales exhibieron un efecto de ganancia de peso similar.

EJEMPLO 6 El antagonista de leptina superactiva induce la protección de inflamación innata mediante la inhibición de fagocitos mononucleares infiltrados PEG-SMLA (20mg/kg) o PEG-leptina (0.4mg/kg) fueron administradas intraperitonealmente a ratones hembra C57bl por 4 días. Esto fue seguido de inducción de hepatitis innata por medio de administración de Lipopolisacárido (10ug/kg) y D-Galactosamina (600mg/kg), un modelo conocido para la inducción de hepatitis inducida por activación de la respuesta inmune innata a través de la infiltración y secreción de TNF-a por fagocitos mononucleares. Como se representa en la figura 15A, la administración de PEG-leptina resultó en mortalidad mejorada significativamente en comparación con los ratones tratados con vehículo. En contraste, la administración de PEG-SMLA resultó en protección significativa, manifestándose como supervivencia mejorada de los ratones.

Para probar el efecto del antagonismo de la leptina en los macrofagos infiltrados efectores (figura 15B), las poblaciones de macrofagos hepáticos CD45+CD1 1 b+CD1 1-F4/80+, infiltrados (figura 15B, puerta P4) y residentes (figura 15B, puerta P5) fueron probadas en ratones tratados con vehículo, antagonista de leptina y agonista de leptina. Como se ve en la figura 15B, paneles inferiores, el efecto protector mediado por el antagonista de leptina estuvo acompañado por una dramática reducción en la población inducida por inflamación de macrofagos infiltrados del hígado en comparación con ratones tratados con vehículo. Un fenotipo reverso fue notado en ratones tratados con PEG-leptina, en el que la infiltración de macrofagos del hígado fue mejorada en ratones tratados con agonistas de leptina en comparación con ratones tratados con vehículo.

De forma importante, incluso a un estado estable antes de la inducción de inflamación innata (figura 15B), paneles superiores), la reducción en los macrofagos infiltrados en los ratones tratados con antagonista de leptina superactiva fue sustancialmente más baja en comparación con los ratones sin tratar. El fenotipo reverso fue visto también en estado estable en los ratones tratados con agonista de leptina, los cuales incluyeron y expandieron la infiltración de macrofagos, ya durante el estado estable.

En conjunto, estos resultados demuestran un efecto protector significativo del antagonista de leptina súper activa en inflamación inmuno-mediada innata, mediada por la inhibición de la infiltración de macrófago mononuclear en el órgano inflamado.

EJEMPLO 7 Modelo de resistencia a la insulina y diabetes tipo II en ratones Los antagonistas de leptina pegilada (PEG-MLA) e incluso más (PEG-SMLA) indujeron un efecto orexigénico muy fuerte tanto en ratones machos como hembras, conduciendo a una ganancia de peso muy rápida (hasta 40-50%), originándose principalmente de la acumulación de grasa (figura 13A). Esta ganancia de peso pudo ser revertida después de suspender las inyecciones de PEG-MLA o PEG-SMLA. En un experimento adicional, los ratones machos (n=16) inyectados con PEG-MLA (20 mg/kg/día) por 21 días gradualmente desarrollaron resistencia a la insulina y la diferencia en el nivel de insulina y el puntaje de evaluación del modelo homeostático (HOMA) comparado con los controles fue significativo (p<0.05). HOMA es un método usado para cuantificar la resistencia a la insulina y la función de células beta. En experimentos a largo plazo (de hasta 60 días) también se observó un incremento significativo en la glucosa en sangre, los triglicéridos en sangre y el colesterol total - una indicación de la aparición del síndrome metabólico prediabético. Sin embargo, hasta 2 meses de tratamiento no condujeron a daño del hígado, como fue evidenciado por el nivel de enzimas del hígado en la sangre.

En un experimento metabólico a corto plazo, ratones macho, aclimatados a una cámara metabólica, recibieron inyecciones subcutáneas matutinas ya sea de PEG-SMLA (5 mg/kg/día) o vehículo. Estas inyecciones fueron repetidas 24 horas después y los ratones estudiados en una cámara metabólica por 48 horas, empezando con la primera inyección y finalizando 24 horas después de la segunda inyección. Para el final del segundo periodo de 24 horas, los ratones que habían recibido SMLA pesaron 3 g más que aquellos que recibieron vehículo (p<0.05), tuvieron un incremento en RQ consistente con la conservación de masa de grasa (p<0.05), y una reducción en actividad (p<0.05).

En conclusión, esta obesidad reversible inducida por antagonistas de leptina, asociada con hiperglucemia, hiperlipidemia y resistencia a la insulina, puede servir como un modelo reversible rápido de diabetes mellitus tipo 2 en ratones. Dicho modelo puede ser logrado al inyectar PEG-SMLA o mediante la creación de ratones transgénicos que expresan condicionalmente la secuencia de ADN que codifica el SMLA.

Los métodos para producir ratones transgénicos son de conocimiento común y cualquier método apropiado puede ser elegido para producir los ratones transgénicos de la presente invención, por ejemplo, de conformidad con los siguientes pasos: Preparación de ADN para Microinyección o Electroporación 1 ) El ADN digerido es separado sobre un gel de agarosa: Una vez que la corrida es completada, el gel es teñido con una concentración relativamente baja de EtBr. Cuando se termina el teñido, el gel es visualizado usando UV de onda larga y se corta la banda de interés. 2) El fragmento de ADN es purificado usando por ejemplo una columna giratoria GeneClean (BIO 10VS GeneClean Spinkit). 3) El ADN es precipitado y resuspendido en un solvente apropiado.

Inyecciones pronucleares 1) Producción de huevo para invecciones Para obtener una gran cantidad (>250) de huevos para inyección, las hembras FVB/N sexualmente inmaduras son súper ovuladas usando inyecciones de Suero de yegua preñada consecutivo (PMS, por sus siglas en inglés) y hormona gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés). Las hembras son apareadas con machos sementales inmediatamente después de la inyección de HCG. 2) Cosechando los huevos Los huevos son cosechados al día siguiente desde la ampolla del oviducto de las hembras apareadas. Los huevos son tratados con hialuronidasa para remover células nodrizas, y entonces son lavados. 3) Inyectando los huevos 30-50 huevos son removidos de la incubadora al mismo tiempo para inyección. Cada huevo es individualmente inyectado con el fragmento de ADN del día bajo alta magnificación. Cuando cada huevo en ese grupo ha sido inyectado, todos los huevos son regresados a la incubadora. Este procedimiento es repetido hasta que todos los huevos han sido inyectados. Al final del periodo de inyección, los huevos que no han sobrevivido son removidos de cada grupo. 4) Implantando los huevos Los huevos inyectados son entonces implantados en grupos de 10-15 bilateralmente en el oviducto de las hembras pseudopreñadas (hembras que han sido apareadas con machos vasectomizados). A los animales se les permite recuperarse de la anestesia sobre una placa de calentamiento, y después son regresados a la sala de animales. Son mantenidos bajo condiciones estériles a través de su embarazo.

Preparaciones de cola de ADN para Análisis Southern Blot Genómico 1 ) Digestión del clip de cola Cortar aproximadamente 50-100 mgs de cola en un tubo eppendorf y digerir con proteasa. 2) Aislar el ADN con fenol/cloroformo v enjuagar en etanol 3) Cortar el ADN con enzimas de restricción apropiadas y realizar un Southern Blot Protocolo de Apareamiento 1 ) Determinar la edad de sus ratones Edad mínima de reproducción: machos: 35-42 días; hembras: 21 días. Edad máxima para la primera reproducción: machos y hembras: 6 meses. 2) Para reproducir, póngase a la hembra en la ¡aula del macho El revertir este orden puede resultar en que el macho mate a la hembra (o, en raras ocasiones, que la hembra mate al macho). Si no es posible poner a la hembra en la jaula del macho, úsese una jaula limpia, y póngase al macho en la jaula primero. Si esto se puede hacer una semana antes del apareo anticipado, esto permitirá que el macho marque su territorio, y que el nivel de feromona se eleve, lo cual ayudará en el procedimiento de reproducción.

El protocolo anterior es un ejemplo. Otros ejemplos, y más detalles, son encontrados en, por ejemplo, "Transgenic animal technology: a laboratory handbook, 2nd edition (Cari A. Pinkert, ed., Gulf Professional Publishing, 2002), el cual se ha incorporado aquí en su totalidad como referencia.

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Claims (35)

NOVEDAD PE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un antagonista de leptina sintético que comprende: (a) un polipéptido de leptina de mamífero modificado en el que: (i) el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre es modificado de forma que de dos a cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrofóbico son sustituidos con diferentes residuos de aminoácido de modo que el sitio se vuelve menos hidrofóbico, dicho polipéptido de leptina de mamífero siendo un antagonista de leptina; y (ii) el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 23 de la leptina humana de tipo silvestre (D23) es sustituido con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o la treonina en la posición correspondiente a la posición 12 de la leptina humana de tipo silvestre (T12) es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; (b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a), en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico, en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de (a) o (b).

2.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque D23 es sustituida con un residuo de aminoácido positivamente cargado o hidrofóbico.

3. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el residuo de aminoácido hidrofóbico es seleccionado de leucina, glicina, alanina, triptofano, histidina o fenilalanina; y el residuo de aminoácido positivamente cargado es seleccionado entre arginina o lisina.

4. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque D23 es sustituida con leucina.

5.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque los residuos de aminoácido adicionales son sustituidos como sigue: (a) la leucina en la posición correspondiente a la posición 68 de la leptina humana de tipo silvestre (L68) es sustituida con metionina, la serina en la posición correspondiente a la posición 97 de la leptina humana de tipo silvestre (S97) es sustituida con fenilalanina y la serina en la posición correspondiente a la posición 132 de la leptina humana de tipo silvestre (S132) es sustituida con tirosina; (b) la glicina en la posición correspondiente a la posición 112 de la leptina humana de tipo silvestre (G112) es sustituida con serina; o (c) la treonina en la posición correspondiente a la posición 37 de la leptina humana de tipo silvestre (T37) es sustituida con alanina y la glicina en la posición correspondiente a la posición 44 de la leptina humana de tipo silvestre (G44) es sustituida con ácido aspártico.

6.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque T12 es sustituida con isoleucina.

7 - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos dos a cuatro residuos de aminoácido en (i) son sustituidos con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina y serina.

8. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho residuo de aminoácido es alanina.

9. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque tres de los cuatro residuos de aminoácido adicionales son sustituidos con alanina.

10.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque: (i) el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre está modificado de modo que la leucina en la posición correspondiente a la posición 39 es sustituida con alanina; el ácido aspártico en la posición correspondiente a la posición 40 es sustituido con alanina; y la fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 41 es sustituida con alanina; y (ii) D23 es sustituida con leucina.

11.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

12. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polipéptido de leptina de mamífero es leptina humana, de ovino o de ratón.

13. - El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se une a un receptor de leptina con una afinidad que es de hasta 100 veces, 90 veces, 80 veces, 70 veces, 50 veces, 30 veces o 20 veces, más alta que aquella de la leptina de mamífero modificada que es modificada sólo en el sitio de unión hidrofóbico LDFI en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre de modo que de dos a cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrofóbico son sustituidos con residuos de aminoácido diferentes de modo que el sitio se vuelva menos hidrofóbico.

14.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque está en forma pegilada.

15.- Un antagonista de leptina sintético, que consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

16.- El antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque está en forma pegilada.

17.- Una molécula de ADN aislada, que codifica un antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 u 1 1.

18. - Una molécula de ADN aislada, que codifica un antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 15.

19. - La molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4.

20. - Una composición farmacéutica, que comprende un antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 1 u 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.

21. - Una composición farmacéutica, que comprende un antagonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 15 ó 16 y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque comprende el antagonista de leptina sintético en una forma pegilada.

23.- Un agonista de leptina sintético que comprende: (a) un polipéptido de leptina de mamífero modificado en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T12 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico; (b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a), en el que D23 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que no está negativamente cargado o T 2 es sustituida con un residuo de aminoácido diferente que es hidrofóbico, en donde dicho fragmento es en sí mismo un agonista de leptina; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de (a) o (b).

24. - El agonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque está en forma pegilada.

25. - Una molécula de ADN aislada, que codifica un agonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 23.

26.- Una composición farmacéutica, que comprende un agonista de leptina sintético de conformidad con la reivindicación 23 ó 24 y un portador farmacéuticamente aceptable.

27.- El uso del antagonista de leptina sintético de la reivindicación 15 ó 16, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición en un paciente seleccionado del grupo que consiste en síndrome metabólico, esteatohepatitis no alcohólica, ateroesclerosis, diabetes tipo II, anorexia, caquexia, cáncer, y enfermedades autoinmunes y auto-inflamatorias como esclerosis múltiple, síndrome inflamatorio del intestino o artritis reumatoide.

28.- El uso del agonista de leptina sintético de la reivindicación 23 ó 24, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición en un paciente en el que está implicada la señalización aberrante de leptina, seleccionado del grupo que consiste en obesidad, síndromes relacionados con la hiperfagia, diabetes tipo 1 , síndrome metabólico y ateroesclerosis, o en la promoción de angiogénesis.

29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la enfermedad es obesidad y un análogo de amilina como SYMLIN® (acetato de pramlintida) o un chaperón químico como el bufenilo (4-PBA) o ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA) es además administrable a dicho paciente.

30. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la enfermedad es diabetes tipo 1 y la insulina es además administrable a dicho paciente.

31. - Un ratón transgénico, cuyo genoma comprende un gen que comprende una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, la cual está unida operativamente a un promotor inducible.

32. - El ratón transgénico de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicha molécula de ADN tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4.

33. - Un ratón transgénico, cuyo genoma comprende un gen que comprende una molécula de ADN que codifica un antagonista de leptina sintético que comprende: (a) un polipéptido de leptina de mamífero modificado en el que el sitio de unión hidrofóbico en la posición correspondiente a las posiciones 39-42 de la leptina humana de tipo silvestre es modificado de modo que de dos a cuatro residuos de aminoácido de dicho sitio de unión hidrofóbico son sustituidos con residuos de aminoácido diferentes de modo que el sitio se vuelve menos hidrofóbico, dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado siendo un antagonista de leptina; (b) un fragmento de dicho polipéptido de leptina de mamífero modificado de (a), en donde dicho fragmento es en sí mismo un antagonista de leptina; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de (a) o (b).

34. - El ratón transgénico de conformidad con la reivindicación 31 ó 33, caracterizado además porque exhibe resistencia a la insulina y niveles incrementados de insulina en sangre y de glucosa en sangre.

35. - Un método de evaluación de una sustancia que tiene actividad terapéutica para una enfermedad o trastorno seleccionada del grupo que consiste en hiperglucemia, hiperlipidemia, diabetes mellitus tipo 2 y resistencia a la insulina, el método comprende los pasos de: (1) administrar una sustancia de prueba al ratón transgénico de la reivindicación 34; (2) confirmar si dicha enfermedad o trastorno es suprimida o no en el ratón transgénico; y (3) seleccionar la sustancia de prueba como la sustancia que tenga actividad terapéutica para dicha enfermedad o trastorno cuando dicha enfermedad o trastorno es suprimida en el ratón transgénico.