MX2012011688A

MX2012011688A - Proteinas btnl9, acidos nucleicos y anticuerpos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2012011688A
Application number: MX2012011688A
Authority: MX
Inventors: Sabine S Escobar; Joanne L Viney; Heather A Arnett; Ryan M Swanson
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2012-11-23
Also published as: WO2011127418A1; EP2927242A1; US10357561B2; ES2537814T3; AU2011237365B2; EP2556086B1; US20150344554A1; JP2013528360A; HK1215954A1; EP2556086A1; CA2795789A1; AU2011237365A1; JP2015143276A; US20130101590A1

Abstract

La invención proporciona proteínas BTNL9 novedosas que incluyen multímeros, fragmentos y variantes de una proteína BTNL9 humana. Además, se proporcionan anticuerpos que se pueden unir a proteínas y ácidos nucleicos que codifican para proteínas BTNL9. Se describen usos para las proteínas BTNL9 y agonistas o antagonistas de las mismas.

Description

PROTEINAS BTNL9, ACIDOS NUCLEICOS Y ANTICUERPOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con una proteína similar a butirofilina y fragmentos, variantes y derivados de la misma, ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas, anticuerpos que se unen a estas proteínas y agonistas y antagonistas de estas proteínas . Las composiciones farmacéuticas que contienen estas moléculas y usos de estas moléculas o composiciones que las contienen también se contemplan.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La modulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria puede ser útiles en diversos ámbitos terapéuticos. La modulación por disminución de una respuesta inmunitaria o inflamatoria puede ser deseable en tratamientos de diversas clases de enfermedades auoinmunes o inflamatorias . La modulación por aumento de cualquier respuesta inmunitaria puede ser útil, por ejemplo, para amplificar una respuesta a un antígeno particular, por ejemplo un antígeno contenido en una vacuna o un antígeno que se exprese de modo preferencial sobre una célula cancerosa o una célula que medie una enfermedad fibrótica. De esta manera, las moléculas capaces de modular una respuesta Ref . : 235491 inmunitaria o inflamatoria son de valor terapéutico potencial en una diversidad de ámbitos terapéuticos. La presente invención proporciona agentes terapéuticos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades caracterizadas por una respuesta inflamatoria y/o inmunitaria inapropiada y/o anormal. Algunos de estos agentes pueden estimular una respuesta inmunitaria. Otros pueden inhibir la inflamación y/o respuestas inmunitarias .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona proteínas BTNL9, ácidos nucleicos que las codifican y anticuerpos que se unen a las mismas. De manera más específica, las proteínas BTNL9 descritas en la presente son proteínas multiméricas y/o proteínas de fusión que se pueden aislar y/o proteínas solubles. También se proporcionan los usos para proteínas BTNL9 y para anticuerpos antagonistas y agonistas que se unen a BTNL9.

En una modalidad, la invención abarca una proteína BTNL9 multimérica soluble aislada que comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de (a) y (b) o en los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 1 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, en donde el multímero tiene por lo menos un trímero y en donde la proteína BTNL9 multimérica puede inhibir la prolieración de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. En una modalidad ligeramente diferente, la invención proporciona proteína BTNL9 multimérica soluble aislada que comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de (a) y (b) con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de por lo menos 80 aminoácidos de longitud, en donde el multímero tiene un peso molecular que es mayor de aproximadamente tres veces tan grande como la de un polipéptido monomérico de (a) y/o por lo menos aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis veces tan grande como la de un polipéptido monomérico de (a) y en donde la proteína BTNL9 multimérica puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulada por un anticuerpo anti-CD3. La proteína BTNL9 multimérica en cualquiera de estas modalidades también puede ser por lo menos un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, un decámero y/o un multímero de orden superior, lo cual también significa que la proteína BTNL9 multimérica puede ser un trímero, tetrámero, un tentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, un decámero y/o un multímero de orden superior. La proteína BTNL9 multimérica puede comprender la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 a 253, 254, 255, 256 ó 257 de la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, la proteína BTNL9 multimérica no comprende los aminoácidos 258 a 277 de la SEC ID NO: 2 y en algunas modalidades puede comprender otro polipéptido tal como, por ejemplo, una porción Fe de un anticuerpo. Tal porción Fe puede comprender: (i) la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa, o (ii) una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a la de la región Fe humana nativa que tiene un máximo de 15, un máximo de 10 o un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa. La Fe humana nativa puede ser de isotipo IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgA, IgD, igM o IgE. La proteína BTNL9 multimérica puede ser un homotetrámero, un homopentámero, un homohexámero, un homoheptámero, un homooctámero, un homononámero, un homodecámero, un homomultímero de orden superior, un heteromultíme o o una mezcla de especies. También se pueden proporcionar ácidos nucleicos que codifican para las proteínas BTNL9 multiméricas así como vectores que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que contienen los vectores y/o los ácidos nucleicos .

En otra modalidad, la invención proporciona una proteína de fusión BTNL9 que comprende: (a) un primer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión BTNL9 con los aminoácidos 35-257 es la SEC ID NO: 2, es de por lo menos 80 aminoácidos de longitud y (b) un segundo polipéptido, en donde la proteína de fusión BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. La proteína de fusión se puede aislar y/o ser una proteína soluble. El segundo polipéptido puede ser una porción Fe de un anticuerpo, en donde la porción Fe tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o sustancialmente similar 'a una secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa y contiene un máximo de 5, 10, 15 ó 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a la región Fe humana nativa. La región Fe humana nativa puede ser del isotipo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE o IgM. La proteína de fusión BTNL9 puede comprender los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2. La proteína de fusión BTNL9 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a la SEC ID NO: 18, en donde la secuencia de aminoácidos comprende un máximo de 5 , 10, 15 ó 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a la SEC ID NO: 18 y/o la proteína de fusión BTNL9 puede comprender la SEC ID NO: 18. La proteína de fusión BTNL9 puede ser por lo menos un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero o un decámero. La proteína de fusión BTNL9 puede comprender un enlazante. Tal proteína de fusión BTNL9 puede comprender un multímero, en donde el multímero tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis veces tan grande como la proteína de fusión BTNL9 monomérica. Los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de fusión BTNL9 también se proporciona, así como vectores que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que contienen los vectores y/o los ácidos nucleicos.

En otra modalidad, la invención proporciona una proteína BTNL9 soluble que comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 40-140 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 5 ó 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a los aminoácidos 40-140 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 tampoco comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 160 a 248 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 20, 15, 10 ó 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a los aminoácidos 160-248 de la SEC ID NO: 2 y en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. La proteína BTNL9 soluble puede comprender un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a los aminoácidos 40-140 de la SEC ID NO: 2. O, en otro aspecto, la secuencia de aminoácidos de la proteína BTNL9 soluble puede ser por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a los aminoácidos 40-140 de la SEC ID NO: 2. La proteína BTNL9 soluble puede ser por lo menos un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero o un decámero. La proteína BTNL9 también puede ser un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, un decámero, un multimero de orden superior o una mezclas de estas especies. La proteína BTNL9 soluble puede ser un multímero en donde el multímero tenga un peso molecular de por lo menos aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince ó dieciséis veces tan grande como el de la protelna BTNL9 soluble monomérica. La proteína BTNL9 soluble puede comprender además otro polipéptido tal como, por ejemplo, un fragmento Fe de un anticuerpo y/o un enlazante. Los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas BTNL9 solubles también se proporcionan así como vectores que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que contienen los vectores y/o los ácidos nucleicos.

De manera alternativa, una proteína BTNL9 soluble puede comprender la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 160 a 248 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 20, 15, 10 ó 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácidos en relación a los aminoácidos 160-248 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 tampoco comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 40-140 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a los aminoácidos 40-140 de la SEC ID NO: 2 y en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. La proteína BTNL9 soluble puede ser por lo menos un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, un decámero o un multímero de orden superior. La proteína BTNL9 puede comprender además otro polipéptido tal como, por ejemplo, un fragmento Fe de un anticuerpo y/o un enlazante . La proteína BTNL9 puede ser un multímero, en donde el multímero tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis veces tan grande como el de la proteína BTNL9 soluble monomérica. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de fusión de BTNL9 así como vectores que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que contienen a los vectores y/o ácidos nucleicos .

En una modalidad adicional, se proporciona una proteína de fusión BTNL9 codificada por un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido, el cual codifica para un polipéptido, (i) que contiene la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 334, 337, 340 Ó 343 a 990, 993, 996, 999 ó 1002 de la SEC ID NO: 1 o (ii) que hibridiza bajo condiciones rigurosas con el polinucleótido de (i) ; y (b) un polinucleótido que no hibridiza con un polinucleótido que consiste de la secuencia de la SEC ID NO: 1 y que codifica para un polipéptido en marco con el polipéptido codificado por el polinucleótido de (a) ; en donde la proteína de fusión puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

La proteína de fusión de BTNL9 puede comprender una secuencia enlazante y se puede aislar y/o ser una proteína soluble. La proteína de fusión BTNL9 puede ser un multímero, en donde el multímero tenga un peso molecular de por lo menos aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis veces tan grande como el de la proteína de fusión BTNL9 monomérica. Los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de fusión BTNL9 también se proporcionan así como vectores que comprenden a estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que contienen a los vectores y/o los ácidos nucleicos.

Cualquiera de las proteínas BTNL9 descritas en lo anterior o en lo siguiente se pueden aislar y/o ser solubles y pueden comprender multímeros o especies agregadas las cuales comprenden moléculas múltiples de una proteína BTNL9. El peso molecular de las especies de proteína BTNL9 monoméricas contenidas en el multímero o agregado se pueden medir por electroforesis en gel bajo condiciones reducidas o por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) realizado bajo condiciones reductoras. El peso molecular de las especies multiméricas o agregadas se puede medir por electroforesis en gel o SEC realizada bajo condiciones no reductoras. En algunas modalidades, el multímero o agregado tiene un peso molecular que es por lo menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 veces la de las especies monoméricas . La proteína BTNL9 monomérica de tal multímero o agregado comprende (a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 hasta 253, 254, 255, 256 ó 257 de la SEC ID NO: 2 o (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de (b) con los aminoácidos 35-237 de la SEC ID NO: 2 es de por lo menos 80 aminoácidos de largo o (c) un polipéptido que tiene una secuencia similar a la de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 excepto que puede contener un máximo de 20, 15, 10 ó 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 2.

En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que comprende una proteína BTNL9 y otro polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende: (a) un polinucleótido (i) que consiste de la secuencia nucleotídica del nucleótido 334, 337, 340 ó 343 a 990, 993, 996, 999 ó 1002 de la SEC ID NO: 1 o (ii) que hibridiza bajo condiciones rigurosas con el polinucleótido de (i) ; y (b) un polinucleótido que no hibridiza con un polinucleótido que consiste de la secuencia de la SEC ID NO: 1 y que codifica para un polipéptido en marco con el polipéptido codificado por el polinucleótido de (a) ; en donde la proteína de fusión puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. Los vectores que contienen estos ácidos nucleicos en las células hospedadoras que contienen los vectores y/o los ácidos nucleicos también se contemplan.

La invención proporciona un método para elaborar cualquiera de las proteínas BTNL9 descritas en lo anterior, que incluye la proteína BTNL9 multimérica, las proteínas de fusión de BTNL9 y la proteína BTNL9 soluble, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene ácidos nucleicos que codifican para la proteína BTNL9 en un medio bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y recuperar la proteína BTNL9 de la masa de células o el medio de cultivo.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria, el cual comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de (1) cualquier proteína BTNL9, que comprenda la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 o (2) una variante de la misma la cual comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 o la cual comprende una secuencia de aminoácidos que es no mayor de 5, 10, 15 ó 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3. Este método puede incluir el uso de proteína BTNL9 multimérica soluble, las proteínas de fusión de BTNL9 o la proteína BTNL9 soluble descrita en lo anterior para practicar el método. La enfermedad autoinmune o inflamatoria puede ser artritis reumatoide, una enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis, sarcoidosis, esclerosis múltiple, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma o una enfermedad fibrótica .

En un aspecto adicional, se proporciona un método para inhibir proliferación de linfocitos T, el cual comprende agregar a los linfocitos T (1) cualquier proteína de BTNL9 que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 a 253, 254, 255, 256 ó 257 de la SEC ID NO: 2 o (2) una variante de la misma la cual comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 o el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es no mayor de 5, 10, 15 ó 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde la protexna BTNL9 puede inhibir la proliferación de linfocitos T estimulada por un anticuerpo anti-CD3. Este método abarca el uso de la proteína BTNL9 multimérica soluble, las proteínas de fusión BTNL9 o la proteína BTNL9 soluble descrita en lo anterior para inhibir la proliferación de linfocitos T. Esta inhibición de la proliferación de linfocitos T puede producir in vitro o in vivo.

Otra modalidad incluye el método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-BTNL9, en donde el anticuerpo anti-BTNL9 incrementa la inhibición de proliferación de linfocitos T por la proteína BTNL9 multimérica soluble, una de las proteínas de fusión de BTNL9 y/o la proteína BTNL9 soluble, como se describe en lo anterior y en donde el anticuerpo anti-BTNL9 se une a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2.

Otra modalidad incluye un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria, como se describe en la presente, que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-BTNL9, en donde el anticuerpo anti-BTNL9 se puede unir a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-BTNL9 se puede unir a una proteína BTNL9 de superficie celular que induce una cascada de señalización intracelular vía el dominio B30.2 de BTNL9.

Un método adicional incluye un tratamiento para un paciente con cáncer que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une a una proteína BTNL9 que consiste de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2. El cáncer puede ser, por ejemplo, leucemia aguda o crónica, linfoma, linfoma no hodgkiniano, enfermedad de Hodgkin, leucemias linfocíticas , linfornas linfocíticos o cutáneos, carcinomas, sarcomas, timomas, neoplasias del mediastino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres de las vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, diversas clases de cáncer de la piel, cáncer de la vejiga, gliomas malignos, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer del páncreas, neoplasias hepatobiliares , cáncer del intestino delgado, cáncer de colon o recto o el riñon o uréter, cáncer testicular, cáncer de la uretra o pene, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, sarcoma de hueso, cánceres del sistema endocrino, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, neoplasias del sistema nervioso central y neoplasias de células planas. El anticuerpo puede ser un anticuerpo antagonista.

Finalmente, se proporciona un método para vacunar a un paciente contra un cáncer, el cual comprende administrar al paciente un antígeno que se expresa altamente sobre células cancerosas y un anticuerpo antagonista que se une a una proteína que consiste de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra las estructuras de dominio de las proteínas humanas que son parte de la familia de proteína similar a butirofilina (BTNL) , en forma diagramada. Cada óvalo o círculo representa un dominio de proteína. Los dominios están indicados como sigue: dominio similar a región variable de inmunoglobulina (similar a IgV) ; dominio similar a región constante de inmunoglobulina (similar a IgC) ; E3 , dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) ; anD , dominio transmembranal ,· y SI , dominio B30.2 ^ .

Las regiones que no están identificadas con una estructura de dominio particular se indican por una linea horizontal.

Figura 2. Esta figura indica la cantidad relativa de ARNm para BTNL9 presente en diversas células inmunitarias humanas primarias. Se aislaron células de paquetes leucocíticos de sangre completa de donadores humanos normales y se analizó el ARN por hibridación en un arreglo Affymetrix (Affymetrix GENECHIPMR HG-U133 Plus 2.0). El eje de las ordenadas indica el valor de intensidad para la expresión del ARNm para BTNL9 general utilizando ROSETTA RESOLVERMR. Los diversos tipos de células probados indican a lo largo del eje de las abcisas, como sigue: 1, células mononucleares de sangre periférica; 2, células CD3+, 3, células CD4+; 4, células CD8+; 5, linfocitos T reguladores; 6, células CD19+; 7, células citolíticas naturales (NK, por sus siglas en inglés) ; 8, linfocitos T NK; 9, monocitos; 10, macrófagos; 11, eosinófilos; 12, neutrófilos; 13, basófilos y 14, plaquetas. Los métodos se describen detalladamente en el Ejemplo 1.

Figura 3 : Esta figura muestra los niveles de expresión relativos del ARNm para BTNL9 en diversos tejidos humanos de adulto determinados por hibridación a una sonda de BTNL9 en un microarreglo . Los valores de intensidad para la expresión de ARNm para BTNL9 están indicados sobre el eje de las ordenadas. Los diversos tejidos se indican en el eje de las abcisas, como sigue: 1, glándula suprarrenal; 2, vejiga; 3, carcinoma de vejiga; 4, médula ósea; 5, células mononucleares de médula ósea; 6, cerebro; 7, mama; 8, colon; 9, células de adenocarcinoma de colon; 10, margen de apariencia normal de una biopsia de colon; 11, corazón; 12, próstata hiperplástica; 13, íleon de un paciente con linfoma no hodgkiniano; 14, margen de apariencia normal de una biopsia de íleon; 15, riñon; 16, células de carcinoma escamoso de la laringe; 17, margen de apariencia normal de una biopsia de laringe; 18, hígado, 19, pulmón; 20, ovario; 21, placenta, 22, próstata; 23, músculo esquelético; 24, piel; 25, intestino delgado; 26, bazo; 27, testículos; 28, timo y 29 tejido adiposo blanco. Los métodos se describen en el Ejemplo 1.

Figura 4 : Esta figura indica los niveles de proliferación de linfocitos CD4+ T de ratón que han sido activados con anticuerpo anti-CD3 (clon 2C11) en presencia de diversas proteínas que incluyen a las siguientes: 1) fragmento Fe de una preparación de IgG humana, a 10 µ?/???; 2) QHD , fragmento Fe de una preparación de IgG humana, a 2 µ?/p??; 3) una proteína B7-2 humana; Fe adquirida de (R & D Biosystems) a O .5 g/ml) / 4) proteína de fusión BTNL2. Fe de ratón, así 5 µg/ml; 5) 63, BTNL9. e humano, a 10 g/ml; y 6) GSS59 BTNL9. Fe humano, a 2 µ?/???. Los asteriscos sobre los carriles 4-6 indican que estos resultados son significativamente menores que los resultados de los análisis control. Los métodos se describen en el Ejemplo 3.

Figura 5 : Esta figura indica los niveles de proliferación de linfocitos CD4+ humanos que se han activado con anticuerpo anti-CD3 en presencia de diversas proteínas que incluyen a las siguientes: (1) E3, sin proteína adicional; (2) , una proteína de fusión Fe que se sabe que no tiene efecto sobre la proliferación de linfocitos T (p7.5-Fc) a 10 pg/ml; (3) p7.5-Fc a 2.5 g/ml; (4) BTNL9. Fe humano a 20 g/ml; (5) 53 BTNL9-FC humano a 10 pg/ml; (6) BTNL9.FC humano a 5 g/ml; (7) E8S9 BTNL9- Fe humano a 2.5 g/ml; y (8) proteína BTNL2. Fe de ratón a 10 µ?/???. Los asteriscos sobre los carriles 4 y 8 indican que estos datos son significativamente diferentes de los del análisis control representados en el carril 2. Los métodos se describen en el Ej emplo 4.

Figuras 6A-6E: La figura 6A a la figura 6E muestra los niveles de producción de diversas citocinas por linfocitos T CD4+ humanos en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 y diversas proteínas adicionales. Las figuras 6A, 6B, 6C, 6D y 6E muestran los niveles, respectivamente, de interleucina-2 , factor de necrosis tumoral, interferón ?, interleucina 17 e interleucina 13, según se indica. Los carriles en las gráficas con barras en las figuras 6A-6E resultan de los análisis que contienen lo siguiente: 1) O , células sin anticuerpo anti-CD3; 2) GE3 , células con anticuerpo anti-CD3 pero sin proteína adicional; células con anticuerpo anti-CD3 y una preparación de IgG 4) E3, células anticuerpo anti-CD3 más la proteína de fusión p7.5-FC; 5) , células con anticuerpo anti-CD3 y la proteína de fusión HB15-Fc la cual se sabe que no tiene efecto sobre la proliferación de linfocitos T; 6) células con anticuerpo anti-CD3 y la proteína BTNL2. Fe de ratón; y 7) células con anticuerpo anti-CD3 y proteína BTNL9. Fe humana. Los métodos se describen en el Ejemplo 5.

Figuras 7A-7B: Esta figura muestra los resultados de análisis para medir la muerte celular al medir la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) , como se explica detalladamente en el Ejemplo 7. La figura 7A muestra los resultados del análisis de DLH y la figura 7B muestra los resultados de un análisis de proliferación realizado con las mismas células. Las células en este análisis son linfocitos T CD4+ de ratón. Los diversos carriles en las figuras 7A y 7B muestran los resultados de los análisis con o sin linfocitos T activados y con o sin ingredientes adicionales, como sigue: (1) E] , linfocitos T con un anticuerpo anti-CD3; (2) linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más una preparación de IgG humana; (3) ES , linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más HB15.FC; (4) cm linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más p7.5-Fc; (5) linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más BTNL2. Fe de ratón; (6) linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más BTNL9.FC; y (7) linfocitos T con el anticuerpo anti-CD3 más B7-1-Fc murino.

En la figura 7A, el carril (8) muestra datos de un análisis de LDH realizado con medio sin linfocitos T y el carril (9) muestra datos de un análisis realizado con linfocitos T más Tritón X-100 el cual es un control positivo que representa 100% de muerte de células.

Figura 8 : Esta figura muestra los niveles de expresión de ARNm para BTNL9 en tejidos de colon de donadores normales y de donadores que tienen colitis ulcerativa (UC, por sus siglas en inglés) o enfermedad de Crohn (Crohns) según se indica. Cada punto representa datos de un donador. La diferencia en la expresión entre tejido normal y enfermo es estadísticamente significativa para tejido tanto UC como Crohns, como se indica por el asterisco.

Figura 9: Esta figura muestra análisis por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) analítica de fracciones acumuladas que resultan de purificación de SEC.

Figura 10: Esta figura muestra los niveles de proliferación de linfocitos T CD4" de ratón en respuesta a anticuerpo anti-CD3, con o sin proteínas adicionales indicado como sigue: (1) únicamente con anticuerpo anti-CD3; (2) sa , con anticuerpo anti-CD3 más HB15-Fc; (3) ¦ con el anticuerpo anti-CD3 más una preparación de IgG humana; (4) uno , con el anticuerpo anti-CD3 más el fragmento Fe de una preparación de IgG humana; (5) con el anticuerpo anti-CD3 más BTNL2. Fe de ratón; (6) biiii con el anticuerpo anti-CD3 más fracción 1 de BNTL9. Fe ; (7) gjsg con el anticuerpo anti-CD3 más la fracción 2 de BTNL9.FC; y (8) con el anticuerpo anti-CD3 más la fracción 3 de BTNL9. Fe . Los asteriscos dobles indican una diferencia significativa de los valores control . Los procedimientos se describen en el Ejemplo 9.

Figura 11: Esta figura muestra los niveles de proliferación de linfocitos T CD4+ humanos en presencia de un anticuerpo anti-CD3, con o sin diversas proteínas adicionales. Las marcas en los carriles son las mismas que las de la figura 10. Los procedimientos se describen en el Ej emplo 9.

Figura 12: Como se explica en el Ejemplo 10, esta figura muestra tejido de bazo humano teñido con DAPI (izquierda) , un anticuerpo anti-BTNL9 (parte media) y CD31 (derecha) .

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1: Secuencia nucleotídica de un ADNc que codifica para la proteína BTNL9 humana de longitud completa como se describe en la secuencia de referencia de NCBI NM_152547.4.

SEC ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de longitud completa de BTNL9 humana, la cual es una traducción de la secuencia nucleotídica de la secuencia de referencia NCBI NM_152547.4.

SEC ID NO: 3: Secuencia de aminoácidos de una secuencia de señal de IgK.

SEC ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de una secuencia de señal para hormona del crecimiento humana.

SEC ID NO: 5: Secuencia de ácido nucleotldico de un ADNc que codifica para la proteína BTNL9 de ratón de longitud completa, como se describe en la secuencia de referencia NCBI NM_172793.2.

SEC ID NO: 6: Secuencia de aminoácidos de longitud completa de BTNL9 de ratón, la cual es una traducción de la secuencia nucleotídica descrita en la secuencia de referencia NCBI NO. NM_172793.2.

SEC ID NO: 7: Secuencia nucleotídica de longitud completa de ADNc para BTNL9 humana empalmada de manera alternativa, como se describe por la secuencia de referencia NCBI BC062459.1.

SEC ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de longitud completa de una BTNL9 humana empalmada de manera alternativa la cual es una traducción de una secuencia nucleotídica de la secuencia de referencia NCBI BC062459.1.

SEC ID NO: 9: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 11: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 12: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 13: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 14: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 15: Secuencia de aminoácidos de un enlazante.

SEC ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 17: Secuencia de aminoácidos de un enlazante .

SEC ID NO: 18: Secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de fusión (BTNL9. Fe) que comprende la región extracelular de BTNL9 humana, un enlazante y una región Fe .

SEC ID NO: 19: Secuencia de aminoácidos de BTNL9.FC.

SEC ID NO: 20: Secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de fusión BTNL2. Fe que contiene la región extracelular de BTNL2 murina y una región Fe de IgG humana.

SEC ID NO: 21: Secuencia de aminoácidos de BTNL2. Fe codificada por la SEC ID NO: 20.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona usos para proteínas BTNL9 o inhibidores o agonistas de una proteína BTNL9 tales como anticuerpos anti-BTNL9 y/o formas variantes de una proteína BTNL9. La invención proporciona proteínas BTNL9, que incluye variantes de las mismas y usos de estas proteínas así como ácidos nucleicos que codifican para todas las anteriores. Las proteínas BTNL9 pueden alterar la función de los linfocitos T atenuando la activación, proliferación y producción de citocinas de los linfocitos T. Estos efectos pueden llevar a tratamientos eficaces de enfermedades autoinmunes o inflamatorias mediadas por linfocitos T tal como enfermedades de intestino inflamatorio y trastornos fibróticos, entre muchos otros . Los inhibidores de BTNL9 pueden funcionar para evitar que BTNL9 atenúe la activación, proliferación y secreción de citocinas de los linfocitos T y de esta manera generan un incremento general en la activación de linfocitos T. Estos efectos pueden ser útiles para tratar enfermedades tales como cáncer o para mejorar la eficacia de una vacuna. Los agonistas de BTNL9 pueden ser capaces de alterar la función de las células inmunitarias , por ejemplo, alterando el estado de activación de los linfocitos B los cuales expresan la proteína BTNL9.

DEFINICIONES Un "anticuerpo" como se indica en la presente, comprende una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina y/o una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, tetramérico que comprende una región variable de cadena ligera (VL) , una región constante de cadena ligera (CL) , una región variable de cadena pesada (VH) , una primera región constante de cadena pesada (CH1) , una región de bisagra, una segunda región constante de cadena pesada (CH2) y una tercera región constante de cadena pesada (CH3) tales como un anticuerpo IgG, IgA, IgD, IgM o IgE. De manera alternativa, un anticuerpo puede ser un fragmento tal como un fragmento Fab u, opcionalmente, un fragmento recombinante tal como un fragmento scFv. Los anticuerpos de dominio único que comprenden una región variable única, ya sea una región VH o VL también son anticuerpos como se indica en la presente . Los anticuerpos de dominio único se describen en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. US 2006/0062784, las porciones de las cuales describen anticuerpos de dominio único y las cuales se incorporan en la presente como referencia. Adicionalmente, diversas formas de moléculas monovalentes (que incluyen anticuerpos de hebra simple tales como scFv, Fab, scFv-Fc, anticuerpos de dominio y diversos formatos descritos, por ejemplo, en la solicitud internacional O 2009/089004 y en la patente de E.U.A. NO: 5,837,821, cuyas porciones descriptivas se incorporan en la presente como referencia) y moléculas multivalentes (tales como F(ab)2 y aquellas descritas por ejemplo en la solicitud internacional WO 2009/089004 y la patente de E.U.A. NO: 2,837821, cuyas porciones descriptivas se incorporan en la presente como referencia) están incluidas dentro del significado del término "anticuerpo" .

Se afirma en diferentes lugares que las especies multiméricas de una proteína tienen un peso molecular "por lo menos aproximadamente" cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciseis veces la de una especie monomérica de la proteína. Aunque el significado de esto es claro, esta frase significa específicamente la inclusión de especies que son aproximadamente cuatro, cinco, seis, etc. veces mayores que un monómero y no solo combinaciones de estas especies con especies más grandes. De modo similar, se dicen en varios lugares que un multímero es "por lo menos" un trímero, un tetrámero, etc. Esta frase significa específicamente la inclusión de especies que son trímeros, tetrámeros, etc. y no solo la combinación de las especies indicadas con especies más grandes .

El término "proteínas BTNL9" , como se indica en la presente, incluye proteínas BTNL9 humanas de longitud completa y fragmentos y/o variantes de las mismas e incluye proteínas codificadas por variantes alélicas como se encuentran de modo natural del gen para BTNL9 así como proteínas BTNL9 producidas de modo recombinante las cuales pueden contener ciertos cambios de secuencia en relación a las proteínas BTNL9 como se encuentran de modo natural.

Un "scFv" es un anticuerpo de hebra simple que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) y que no comprende una región constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, los scFv también pueden comprender un enlazante de longitud variable entre las regiones variables de cadena pesada y ligera. Aunque un scFv se puede fusionar a otras secuencias de amionácidos, la porción de una proteína a las que se hace referencia como una scFv preferiblemente no comprende ninguna cantidad sustancial de secuencia de aminoácido diferente de una región VH, una región VL y opcionalmente un enlazante que una estas secuencias.

Una "región Fe" o una "porción Fe" o un "fragmento Fe" de un anticuerpo (los cuales se considera que son los mismos en la presente) es un fragmento de cadena pesada que comprende CH2 y CH3 y una región de bisagra o una variante de tal fragmento. Un fragmento de Fe no comprende un dominio CH1 o un dominio VH. Véase, por ejemplo, Kuby, Imaunology, segunda edición, p. 110-11, W.H. Freeman and Co., Nueva York (1994) . Un fragmento puede ser del isotipo IgA, igD, igE, IgG, o IgM que incluye a IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 u otros subtipos. Las variantes de la región Fe significan en la presente que puede comprender de 1 a 30 (que incluye específicamente no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones, supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en relación a una región Fe como se encuentra de manera natural . Una región Fe como se encuentra de manera natural o "nativa" tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza en un organismo vivo, por ejemplo, una región Fe de humano o de ratón. Así, una región Fe "humana nativa" tiene una secuencia de aminoácidos que se encuentra en una región Fe humana como se encuentra de modo natural . La guía respecto a en qué lugar se pueden tolerar variaciones sin que afecte la función se pueden encontrar en en el ámbito. Por ejemplo, las alteraciones de residuos aminoácidos identificados en la patente de E.U.A. 5,807,706 y en la solicitud internacional WO 2009/089004, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia se pueden utilizar para alentar la formación de un heterodímero en comparación con la formación de un homodímero. Similarmente, las alteraciones a las regiones Fe que no evitan la unión del receptor Fe nenonatal FcRn, están abarcadas dentro de las alteraciones que se pueden presentar en variantes de Fe como se quiere indicar en la presente. La unión de una región Fe a FcRn se puede determinar a pH aproximadamente 6 utilizando un instrumento Biacore tal como un equipo Biacore 3000. Se puede acoplar FcRn humano a un chip CM5 utilizando química convencional. La proteína que contiene Fe puede ser parte de la fase móvil y la respuesta se puede medir en unidades de resonancia. Las alteraciones de las regiones Fe, se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional O 97/34631, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia. De manera alternativa, las comparaciones, por ejemplo, de las secuencia IgG dentro y entre especies pueden colocar aminoácidos altamente conservados, lo cual sugiere a una persona experta en el ámbito que la alteración de estos aminoácidos puede afectar la estructura y/o función. Están disponibles numerosas alineaciones de secuencia de las regiones de bisagra, CH2 y CH3 (las cuales juntas forman la región la región Fe) en, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, National Institutes of Health, Publicación No. 91-3242, 1991, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia. Por otra parte, los aminoácidos los cuales varían entre diversas IgG son sitios en los cuales es probable que la variación sea tolerada sin alterar la función. Similarmente, las variantes de Fe que tienen otras propiedades deseadas tales como funciones efectoras aumentadas o disminuidas, que incluyen citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y/o unión Clq lo cual lleva a fijación de complemento, están abarcados dentro de lo que se quiere indicar por variantes Fe .

El término "anticuerpo de longitud completa" se refiere a una molécula similar en estructura a un anticuerpo como se encuentra de modo natural, es decir, que contiene dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas. Véase, por ejemplo, Kabat et al., supra o K by, Iwmunology, segunda edición, p. 109-32, .H. Freeman y Co., Nueva York (1994) para una descripción de la estructura de anticuerpos como se encuentran de modo natural . Las porciones de estas referencias que describen la estructura de anticuerpos de longitud completa se incorporan en la presente como referencia. También se incluyen entre los "anticuerpos de longitud completa" anticuerpos de estructura similar a los anticuerpos de dromedario como se encuentran de modo natural que contienen únicamente dos cadenas pesadas completas (con frecuencia con una región CDR3 inusualmente larga) y sin cadenas ligeras. Muldermans et al. (2001), J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al. (2001), J. Biol . Chem. 276:26285-26290. Las porciones de estas referencias que describen la estructura de estos anticuerpos de dromedario se incorporan en la presente como referencia.

Una proteína "multimérica" tal como una proteína BTNL9 multimérica es una proteína que comprende más de una cadena polipeptídica . El término "multímero" abarca términos tales como "dímero", "trímero", o "tetrámero" los cuales especifican exactamente cuantas cadenas polipeptídicas contiene el multímero. Un "homomultímero" consiste de dos o más copias de la misma cadena polipeptídica y no contiene cadena polipeptídica diferente alguna. De modo similar, un "homodímero" consiste de dos copias de la misma cadena polipeptídica, un "homotrimero" consiste de tres copias de la misma cadena polipeptídica, etc. Un "heteromultímero" contiene por lo menos dos cadenas polipeptídicas diferentes. Si el heteromultímero tiene tres o más cadenas polipeptídicas, algunas de ellas pueden ser idénticas entre sí en la medida en que por lo menos una sea diferente de las otras. Cuando una proteína se dice que es "por lo menos un trímero, se quiere indicar que es un trímero o un multímero de orden superior. Se pueden adscribir significados similares a "por lo menos un tetrámero", "por lo menos un pentámero", etc .

Un "fragmento Fab" es un fragmento de anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una región VL y una regióN CL y una porción de una cadena pesada que comprende una región VH y una región CH1. Un fragmento Fab no comprende una región CH2 o CH3. Véase, por ejemplo, Kuby, Immunology, segunda edición, pp. 110-11 W.H. Freeman y Co., Nueva York (1994) para una descripción de lo que son los fragmentos Fab. Diferentes clases de fragmentos Fab pueden contener ya sea ninguna región de bisagra, una porción de una región de bisagra o una región de bisagra completa.

Un "scFv-Fc", como se utiliza en la presente es una proteína recombinante que es una fusión de un scFv con una región Fe. Véase Li et al. (2000) . Cáncer Inmuno1. Immunother. 49:243-252; Po ers et al. (2001), J. Immunol . Methods 251:123-135; Gilliland et al. (1996) , Tissue Antigens 47:1-20.

Una proteína o anticuerpo "recombinante" es uno que resulta de un procedimiento de manipulación genética. El término "manipulación genética" se refiere a un método de ADN o AR recombinante utilizado para crear una célula que expresa un gen en concentraciones elevadas o en concentraciones disminuidas o que expresa una forma mutante del gen. En otras palabras, la célula ha sido transíectada, transformada o transducida con una molécula polinucleotídica recombinante y de esta manera se altera de manera que provoca que la célula altera la expresión de un polipéptido deseado.

Las proteínas secretadas solubles y las proteínas expresadas sobre la superficie celular con frecuencia comprenden una "secuencia de señal" N-terminal, la cual es una secuencia hidrofóbica que media la inserción de la proteína a través de la membrana uniéndola al retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés) en una célula eucariótica. Las proteínas transmembranales tipo 1 también comprenden secuencias de señal. Las "secuencias de señal" como se indica en la presente son secuencias hidrofóbicas amino terminales las cuales habitualmente se separan enzimáticamente posterior a la inserción de parte o la totalidad de la proteína a través de la membrana ER en el lumen del ER. De esta manera, se conoce en el ámbito que una secuencia de señal puede estar presente como parte de un precursor a partir de una proteína secretada o transmembranal pero generalmente estará ausente en la forma madura de la proteína. Cuando una proteína se dice que comprende una secuencia de señal, se debe entender que, aunque una forma precursora de la proteína contiene una secuencia de señal, la forma madura de la proteína probablemente no contendrá la secuencia de señal . Las secuencias de señal contienen un residuo adyacente a e inmediatamente hacia la parte N-terminal del sitio de separación (posición -1) y otro residuo en la posición -3, los cuales son importantes para esta separación enzimática. Nielsen et al. (1997), Protein Eng. 10(1): 1-6; von Heijne (1983), Eur. J. Bioche . 133:17-21; von Heijne (1985), J. Mol. Biol . 184:99-105, las porciones de las cuales describen secuencias de señal y como identificarlas, se incorporan en la presente como referencia. Las secuencias de señal se pueden identificar como se describe por Nielsen et al. (supra) . Los ejemplos de péptidos o secuencias de señal que son funcionales en células hospedadoras de mamífero incluyen las siguientes: las secuencias de señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de E.U.A. 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor interleucina-2 descrita en Cosman et al. ((1984), Nature 312:768), el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP 0 367 566; la secuencia de señal del receptor de interleucina 1 tipo I descrito en la patente de E.U.A. 4,968,607; el péptido señal del receptor de interleucina 1 tipo II descrito en la patente de EP 0 460 846; la secuencia de señal de IgK humana (la cual es METDTLLLWVLLL VPGSTG; SEC ID NO: 3); y la secuencia de señal de la hormona del crecimiento humana (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA; SEC ID NO: 4) . Las porciones relevantes de estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Se conocen en el ámbito muchas otras secuencias de señal.

Un dominio "similar a inmunoglobulina" (similar a Ig) como se quiere indicar en la presente, se diferencia principalmente por su estructura terciaria. Véase, por ejemplo Bork et al. (1994), J. Mol. Biol. 242: 309-20; Hunkapiller and Hood (1989), Adv. Immunol . 44: 1-63; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol . 6: 381-405. No obstante, los dominios similares a inmunoglobulina variables y constantes no contienen aminoácidos a la mano o altamente conservados que se presenten en posiciones conservadas dentro de la secuencia de aminoácidos primaria. Véase, por ejemplo, abat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH Publication No. 91-3242. Los aminoácidos conservados en las regiones variables y en las regiones constantes CH1 y CH2 se describen con detalle, por ejemplo, en Harpaz y Chothia (1994), J. Mol. Biol. 238: 528-39 y Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405. Las porciones de estas referencias que describen a los residuos conservados se incorporan en la presente como referencia. La presencia de los aminoácidos altamente conservados o de variantes conservadores de los mismos que se presentan en la aseveración apropiada pueden indicar la presencia de un dominio similar a IgC o similar a IgV.

El porcentaje de identidad de dos aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos se puede determinar al comparar información de secuencia utilizando el programa de computadora GAP, es decir, el programa de Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI) Wisconsin, paquete versión 10.0, GAP (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95). Los parámetros implíticos preferidos para el programa GAP incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para carencias de identidad) para nucleótidos y la matriz de comparación de aminoácidos ponderada de Gribskov y Burgess, ((1986) como se describe en Nucleic Acids Res. 14: 6745) Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, Schwartz and Dayhoff, eds . , National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) u otras matrices de comparación comparables; (2) un castigo de 8 para cada separación y un castigo adicional de 2 para cada símbolo en cada separación para secuencias de aminoácidos, o un castigo de 50 para cada separación y un castigo adicional de 3 para cada símbolo en cada separación para secuencias nucleotídicas ; (3) sin castigo para las separaciones de extremo; y (4) sin castigo máximo para separaciones largas.

En relación con las comparaciones para determinar identidad de secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, mediante el término "intervalo de alineación" se quiere significar la porción del polinucleótido o polipéptido que coincide, parcial o completamente, con otro polinucleótido o polipéptido mediante el programa de computadora GAP (Devereux, et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95) utilizando los parámetros establecidos en el mismo. Por ejemplo, cuando un polipéptido de 20 aminoácidos se alinea con una proteína considerablemente más grande y los primeros 10 aminoácidos coinciden exactamente con la proteína más grande mientras que los últimos 10 aminoácidos no coinciden con la proteína más grande de modo alguno, el intervalo de alineación es de 10 aminoácidos. Por otra parte, si el primero y último aminoácidos del polipéptido de 20 aminoácidos coinciden con la proteína más grande y 8 otras coincidencias están dispersadas, el intervalo de alineación es de 20 aminoácidos de longitud. No obstante, tramos largos en cadenas alineadas sin aminoácidos idénticos o sustituidos de manera conservadora o nucleótidos idénticos de por lo menos, por ejemplo, 25 aminoácidos o 75 nucleótidos constituyen un valor de un intervalo de alineación, como se indica en la presente. Los intervalos de alineación para una comparación de frecuencias pueden ser de por lo menos aproximadamente 25, 50, 60, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 225, 300, 400, 450, 500 ó 600 aminoácidos o nucleótidos de longitud .

Las dos secuencias polipeptídicas o nucleotídicas se consideran "sustancialmente similares" cuando son por lo menos 90% idénticas, determinadas utilizando el programa GAP como se describe en lo anterior y tienen actividad biológica similar. En el caso de BTNL9, la actividad biológica que se va a probar en determinación de si dos secuencias son sustancialmente similares es la capacidad para inhibir la proliferación de linfocitos T activados por un anticuerpo anti-CD3.

LA FAMILIA BTNL Se ha colocado a BTNL9 dentro de la familia de proteínas similares a butirofilina (BTNL) en base en su estructura de dominio. Véase, Amett et al. (2008), Current Immunology Reviews 4: 43-52 y Arnett et al. (2009). Cytokine 46: 370-75. Las proteínas humanas en la familia BTNL incluyen BTNL2 , BTNL3, BTNL8 , BTNL9 , ERMAP y MOG y las estructuras de dominio de estas proteínas se muestran diagramáticamente en la figura 1. Como será evidente de la figura 1, BTNL2 es el único miembro de la familia que tiene cuatro dominios similares a inmunoglobulina (similares a Ig) en su región extracelular, dos dominios similares a IgV y dos similares a igC. Cada una de MOG y ERMAP tiene únicamente un dominio similar a Ig. BTNL3 , BTNL8 y BTNL9 también tienen un dominio extracelular que claramente es un dominio similar a Ig y otro dominio que es aproximadamente del tamaño correcto para ser un dominio similar a Ig, aunque carece de algunas de las características de los dominios similares a Ig. Todos los miembros de la familia BTNL tienen un dominio transmembranal . BTNL2 y MOG tienen regiones intracelulares cortas mientras que BTNL3, BTNL8, BTNL9 y ERMAP tienen regiones intracelulares más grandes que contienen un dominio B30.2. No se conoce la función de la región intracelular B30.2 aunque las mutaciones en los dominios B30.2 de algunas proteínas se han asociado con algunas enfermedades. Véase Henry et al. (1998), Mol. Biol. Evol . 15: 1696-1705, cuya descripción relevante de la cual se incorpora en la presente como referencia. Además, se han identificado asociados de unión para algunos dominios B30.2. Véase, por ejemplo Jeong et al. (2009), J. Biol. Chem. 284: 22444-22456.

El grado de identidad de secuencia compartido por BTNL9 con otros miembros humanos de la familia BTNL se muestran en la Tabla 1 siguiente.

TABLA 1: Por ciento de identidad entre los miembros humanos de la familia de proteínas BTNL Como se muestra en la figura 1, BTNL3 , BTNL8 y BTNL9 tienen estructuras de dominio similares. La identidad de secuencia de la proteína BTNL9 con las proteínas BTNL3 y BTNL8 es ligeramente mayor que con otras proteínas BTNL. Las proteínas BTNL3 y BTNL8 son 69% idénticas entre sí.

Más allá de los niveles de identidad de secuencia, algunos sitios dentro de la familia de proteínas BTNL están altamente conservados, como se muestra en la Tabla 3 a continuación, la cual es una alineación de las seis proteínas similares a BTNL humanas. Debajo de la alineación se encuentra una secuencia de consenso. Si los aminoácidos de consenso se presentan en todas las proteínas en las cuales la secuencia de aminoácidos abarca la porción de alineación y la cual se presenta en los aminoácidos, se muestra en negrillas. Si sucede que todas excepto una de las proteínas en las cuales las secuencias abarcan la porción de alineación aparecen con letra normal. Si un sitio tiene en todos los casos uno de dos o más aminoácidos, cada uno de los cuales son variaciones conservadoras entre sí, estos aminoácidos se enumeran debajo de esa posición con negrillas. Si un sitio tiene la totalidad excepto una secuencia que abarque esa porción de la alineación con dos o más aminoácidos, cada uno de los cuales son variaciones conservadoras entre sí, estos aminoácidos se enumeran en la parte inferior de esa posición con letras normales. La numeración por encima de las alineaciones en la Tabla 2 es la numeración de la SEC ID NO: 2 la cual es la secuencia de aminoácidos de longitud completa de BTNL9 incluyendo la secuencia de señal, la cual finaliza en la posición 34 de la SEC ID NO: 2.

TABLA 2: ALINEACION Y SECUENCIA DE CONSENSO DE LAS PROTEINAS BTNL 40 BTNL3 ~~~«~ M AFVLILVLSF YELVSGQWQV BTNL8 ~~~M ALMLSLVLSL LKLGSGQWQV BT L9 MVDLSVSPDS LKPVSLTSSL VFLMHLLLLQ PGEPSSEVKV ERMAP MEMASS AGSWLSGCLI PLVFLRLSVH VSGHAGD , ..

MOG — ~ ~~—-~-MASL SRPSLPSCLC SFLLLLLLQV SSSYAGQFRV BT L2 YAEATLWRN ASAESVSCLV HNPVLTEEKG SVISLPEKLQ TELAS..L V ALL L S QV F A K V R 41 87 BTNL3 TGPGKFVQAL VGEDAVFSCS LFPETSAEAM EVRFFRNQF. .. HAWHLYR BTNL8 FGPDKPVQAL VGEDAAFSCF LSPKTNAEAM EVRFFRGQF. .. SSWHLYR BTNL9 LGPEYPILAL VGEEVEFPCH LWPQLDAQQM EIRWFRSQT. .. FNWHLYQ ERMAP AGKFHV, .AL LGGTAELLCP LSLWPGTVPK EVRWLRSPFP QRSQAVHIFR MOG IGPRHPIRAL VGDEVELPCR ISPGKNATGM EVGWYRPPF. .. SRWHLYR BTNL2 NGPSQPILVR VGEDIQLTCY LSPKA AQSM EVRWDRS ... HRYPAVHVYM ALL GP I AL VGEDA F C L P A M EVRW R WHLYR V V L DEV L I T I F AI IFQ I V 88 137 BTNL3 DGEDWESKQM PQYRGRTEFV KDSIAGGRVS LRLKNITPSD IGLYGCWFSS BTNL8 DG DQPFMQM PQYQGRTKLV KDSIAEGRIS LRLE ITVLD AGLYGCRISS BTNL9 EQQELPGRQM PAFRNRTKLV KDDIAYGSW LQLHSIIPSD KGTYGCRFHS ERMAP DGKDQDEDLM PEYKGRTVLV RDA.QEGSVT LQILDVRLED QGSYRCLIQV MOG NGKDQDGDQA PEYRGRTELL KDAIGEGKVT LRIRNVRFSD EGGFTCFFRD BT L2 DGDHVAGEQM AEYRGRTVLV SDAIDEGRLT LQILSARPSD DGQYRCLFEK ALL DG D QM P YRGRT LV KDSI G VT LRL I D G Y C F E E A F FL R A IS QI V F I Q L 138 187 BTNL3 QIYDEEATWE LRVAALGSLP LISIVGYVDG GIQLLCLSSG WFPQPTAKWK BTNL8 QSYYQKAIWE LQVSALGSVP LISITGYVDR DIQLLCQSSG FPRPTAKW BTNL9 DNFSGEALWE LEVAGLGSDP HLSLEGF EG GIQLRLRSSG WYPKPKVQWR ERMAP GNLSKEDTVI LQVAA P SV GSLSPSA...

MOG HSYQEEAAME LKVED P FY W.VSPGV... BTNL2 DDVYQEASLD LKWGLGSSP LITVEGQEDG EMQPMCSSDG WFPQPHVPWR ALL EA E L V P W P A D V 188 237 BTNL3 GPQGQDLSSD SRANA.DGYS LYDVEISIIV QENA.GSILC SIHLAEQSHE BTNL8 GPQGQDLSTD SRTNR.DMHG LFDVEISLTV QENA.GSISC SMRHAHLSRE BTNL9 DHQGQCLPPE FEAIW/DAQD LFSLETSVW RAGALSNVSV SIQNLLLSQK ERMAP VA LAVILPVLVL LIMVCLCLIW KQRRAKEKLL MOG LV LLAVLPVLLL QITVGLVFLC LQYRLRGKL BTNL2 DMEG TIPSS SQALTQGSHG LFHVQTLLRV TNISAVDVTC SISIPFLGEB ALL LF V L V A I L L V L V V Y I I L A F 238 287 BTNL3 VESKVLIGBT FFQ.PSPWR. ..LASILLGL LCGALCGWM GM BTNL8 VESRVQIGDT FFE.PISWH. .. IATKVLGI LCCGLFFGIV GL BTNL9 KELWQIADV FVPGASAWKS AFVATLPLLL VLAALALGVL RKQRHSREKL ERMAP YEHVTEVDNL L SDHAKE MOG AE.IENLHRT F DPHFLRVPGW BTNL2 KIATFSLSES .. RMTFLWKT LLVWGLLLAV AVGLPRKRS- ALL E I V L 288 337 BTNL3 IIVFFKSK GKIQA ELDWRRKHGQ AELRDARKHA VEVTLDPETA B L8 KIFFSKFQ WKIQA ELDWRRKHGQ AELRDARKHA VEVTLDPETA BT L9 RKQAEKRQEK LTAELEKLQT ELDWRRAEGQ AEWRAAQKYA VDVTLDPASA ERMAP KGKLHKAVKK LRSELK LKRAAA SGWRRARLHF VAVTLDPDTA MOG KITLFVIVPV LGPLVALIIC Y LHRRLAG QFLEELLFHL EALSG -BTNL2 ALL K F RR GQ R AR HA V VTL R L K AN LQ L LS A H F 338 387 BTNL3 HPKLCVS . DL TVTHRKAPQ . EVPHSEKRF TRKSWAS.Q GFQAGKHYWE BTNL8 HPKLCVS . DL KTVTHRKAPQ .EVPHSEKRF TRKSWAS . Q SFQAGKHYWE BTNL9 HPSLEVSEDG KSVSSRGAPP GPAPGHPQRF SEQTCALSLE RFSAGRHY E ERMAP HPKLILSEDQ RCV.RLGDRR QPVPDNPQRF DFWSILGSE YFTTGCHYWE MOG BTNL2 ALL HPKL VS D KTV HR APQ VP KRF T KS VAS F AGKHY E L S R R A Q S QT AL R r 388 436 BTNL3 VDVGQNVGWY VGVCRDDVDR GKN VTLSPN NGYWVLRLTT EHLYFTFNPH BT L8 VDGGHNKRIÍR VGVCRDDVDR RKEYVTLSPD HGYWVLRL G EHLYFTLNPR BTNL9 VHVGRRSRWF LGACLAAVPR A.GPARLSPA AGY VLGLWN GCEYFVLAPH ERMAP VYVGDKTKWI LGVCSESVSR . GKVTASPA NGHWLLRQSR GNEYEALTSP MOG BTNL2 ALL V VGQN RW VGVC D V R VTLSP NGYWVLRL LF L PH HR K L A E A A H F R RK 437 485 BTNL3 FISLPPSTPP TRVGVFLDYE GGTISFFNTN DQSLIYTLLT CQFEGLLRPY BTNL8 FISVFPRTPP TKIGVFLDYE CGTISFFNIN DQSLIYT.LT CRFEGLLRPY BTNL9 RVALTLRVPP RRLGVFLDYE AGELSFFNVS DGSHIFTFHD .TFSGALCAY ERMAP QTSFRLKEPP RCVGIFLDYE AGVISFYNVT KKSHIFTF.T HNFSGPLRPF MOG BT L2 ALL SL R PP RVGVFLDYE G ÍSFFN DQS IYT QF G LRPY V K KI I L Y K F N F F L R 486 526 BTNL3 IQHAMYD.EE KGTPIFICPV SWG—— BTNL8 IEYPSYN. EQ NGTPIVICPV TQESEKEASW QRASAIPE S NSESSSQATT BTNL9 FRPRAHDGGE "HPDPLTICPL P VRGTGVPEEN DSDTWLQPYE ERMAP FEPCLHDGGK NTAPLVICSE LHKSEESIVP RPEGKGHANG DVSLKVNSSL MOG — ~ BTNL2 ~~ ~~ 527 535 BTNL3 ' · BTNL8 PFLPRGEM — - BTNL9 PADPALDWW- ~ ERMAP LPPKAPELKD IILSLPPDLG PALQELKAPS F MOG ~~ BTNL2 ~~~ Una persona experta en el ámbito apreciará que la secuencia de consenso entre estas proteínas representa rasgos que pueden ser importantes para las estructuras o funciones de esas proteínas. Dado sus patrones de expresión variables, es probable que estas proteínas no tengan funciones idénticas y por lo tanto, es poco probable que todos los aminoácidos importantes para la función de cada proteína se puedan conservar dentro de la familia. No obstante, muchos de los aminoácidos conservados pueden ser importantes para mantener la estructura apropiada la cual, por supuesto, es necesaria para su función. En muchos sitios, uno de dos o más aminoácidos son variaciones conservadoras entre sí y se presentan en la totalidad o en la mayor parte de los miembros de la familia BTNL. Una persona experta en el ámbito entenderá que las variaciones conservadoras en BTNL9 probablemente no perjudiquen de manera adversa su función. Por ejemplo, en la posición 55 de la SEC ID NO: 2 (la cual tiene la misma numeración que la alineación de la Tabla 2 anterior) , diversos miembros de la familia BTLN tienen uno de tres aminoácidos hidrofóbicos diferentes, alanina (BTNL3, BTNL8 y ERMAP) , isoleucina (BTNL2) o valina (BTNL9 y MOG) . Una persona experta en el ámbito entenderá que un cambio de valina a alanina o isoleucina en esta posición de la secuencia de aminoácidos BTNL9 puede ser poco probable que afecte la función. Se pueden aplicar consideraciones similares a la totalidad de los sitios en donde las variaciones conservadoras se producen dentro de la familia. De esta manera, una proteína BTNL9 quiere indicar en la presente que incluye proteínas que comprenden la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma, en donde la secuencia puede ser alterada por variación conservadora en el sitio en donde se produce la variación conservadora entre los miembros de la familia BTNL y en donde la proteína puede inhibir la proliferación de linfocitos T medida por el método descrito en los ejemplos más adelante. Estos sitios incluyen las posiciones 47, 49, 51, 53, 54, 55, 57, 61, 67, 72, 74, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 91, 98, 100, 101, 106, 107, 108, 116, 117, 119, 120, 123, 131, 135, 147, 184, 209, 211, 215, 217, 221, 225, 244, 288, 291, 312, 316, 317, 323, 324, 327, 330, 331, 343, 349, 352, 357, 360, 365, 368, 370, 371, 373, 374, 383, 392, 393, 395, 398, 400, 403, 411, 413, 417, 428, 433, 436, 440, 443, 448, 449, 451, 460, 463, 468, 472, 477 y 485 de la SEC ID NO: 2. Además, también se pueden tolerar variaciones en otros sitios dentro de BTNL9 sin alterar su función. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras en posiciones no conservadas es poco probable que altere la función, aunque los efectos funcionales son posibles en estos sitios.

De esta manera, una proteína BTNL9, como se indica en la presente, incluye proteínas que: (1) tienen polimorfismos que se producen de modo natural o cambios en los aminoácidos introducidos de modo recombinante , (2) son por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a la SEC ID NO: 2 y/o los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, y (3) retienen la capacidad de atenuar la proliferación de linfocitos T medido por los métodos descritos en la presente o actúan como un inhibidor de BTNL9 nativa. Los polimorfismos pueden incrementar la capacidad de una proteína BTNL9 para inhibir la proliferación de linfocitos T y/o pueden hacer que una proteína BTNL9 se produzca con mayor facilidad en un procedimiento de elaboración comercial. Otro de los polimorfismos pueden producir un inhibidor de BTNL9 nativa. Estos polimorfismos se pueden presentar en sitios dentro de BTNL9 que no están conservados tales como, por ejemplo, la posición 41, 44, 45, 46, 48, 56, 58, 60 y cualquier otro sitio mostrado como no conservado en la Tabla 2.

Los patrones de expresión y funciones biológicas de las proteínas BTNL se han explorado en cierta medida en algunos casos pero no en otros . ERMAP se expresa sobre la superficie de eritrocitos y no se le ha asignado una función biológica específica. MOG es un componente de la vaina de mielina. Ni ERMAP ni MOG se considera que jueguen un papel en el sistema inmunitario aunque los anticuerpos para MOG con frecuencia se detectan en pacientes con esclerosis múltiple. BTN1 es homólogo a MOG y BTN1 se encuentra en leche de vaca. Se ha establecido la hipótesis de que el consumo humano de leche de vaca puede llevar al desarrollo de anticuerpos a BTN1 que dan reacción cruzada con MOG humana lo que genera enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiple. Véase Guggenmos et al. (2004), J. Immunol. 172: 61-68. Se ha demostrado que BTNL2 muestra que inhibe la proliferación de linfocitos T y la secreción de citocina pero no la proliferación de linfocitos B. De esta manera, se considera que BTNL2 actúa como un corregulador negativo de eventos mediados por linfocitos T. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 7,244,822, cuyas porciones relevantes de la misma se incorporan en la presente como referencia. Un polimorfismo en BTNL2 se ha relacionado claramente con sarcoidosis, lo que sugiere que BTNL2 puede jugar un papel ya sea en el inicio o la mediación o contribuir o corresponder a esta enfermedad. Valentonyte et al. (2005), Nature Genetics 37(4): 357-64. Se han establecido asociaciones más tentativas entre diversos polimorfismos de BTNL2 y colitis ulcerativa, artritis reumatoide, miositis de cuerpo de inclusión espontánea, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, lepra tuberculoide e incapacidad de respuesta de IgE específica a antígeno. Arnett et al. (2009), Cytokine 46: 370-75. BTNL3 , 8 y 9 no se les ha asignado función biológica específica alguna.

Los niveles de ARN que codifican para las diversas proteínas BTNL en diversos tipos de células y tejidos ya se han reportado. El ARN para BTNL9 se expresa de manera relativamente alta en tejido adiposo, pulmón, timo, bazo y corazón. Otros miembros de la familia BTNL tienen diferentes patrones de expresión y todos excepto, la expresión de ARN se ha detectado en células de la línea hematopoyética . Arnett et al. (2009), Cytokine 46: 370-75. Entre los diversos tipos de células asociados con la función inmunitaria que se han probado para la expresión de BTNL9, el ARN para BTNL9 se expresa de manera predominante en linfocitos B. Arnett. (2009), Cytokine 46: 370-75. La expresión de ARN para BTNL9 en células involucradas en la función inmunitaria sugiere que BTNL9 puede jugar un papel en la función inmunitaria, ya sea activando la respuesta inflamatoria o amortiguando la respuesta después de una reacción eritematosa.

PROTEINA BTNL9 La presente invención abarca versiones solubles secretadas de BTNL9 así como versiones que comprenden un dominio transmembranal que se puede expresar sobre una superficie celular. Las proteínas pueden ser aisladas, es decir, pueden ser parte de una preparación de proteína purificada en la cual la proteína BTNL9 constituye por lo menos 80% o por lo menos 90% de la proteína presente en la preparación. La invención incluye además BTNL9 codificadas por ácidos nucleicos para BTNL9 descritos en lo siguiente. Una proteína BTNL9, como se indica en la presente, abarca una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 así como fragmentos, derivados y variantes de la misma, que incluyen proteínas de fusión y multímeros, como se describe en lo anterior y en lo que sigue. La secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 incluye una secuencia de señal que inicia en la posición 1 y que finalice en la posición desde aproximadamente la posición 29 hasta aproximadamente la posición 38, opcionalmente en la posición 34. De esta manera, la secuencia de aminoácidos del BTNL9 madura comienza en una posición desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente la posición 39 de la SEC ID NO: 2. Opcionalmente, la secuencia madura de aminoácidos de BTNL9 comienza en la posición 35 de la SEC ID NO: 2.

La secuencia de señal de BTNL9 es seguida por un dominio similar a Ig que se extiende desde aproximadamente la posición 44 hasta aproximadamente la posición 150 de la SEC ID NO: 2. La siguiente región, desde aproximadamente la posición 151 hasta aproximadamente la posición 257 de la SEC ID NO: 2, se alinea con dominios similares a IgC en BTNL2 , pero carece de algunos de los rasgos de secuencia característicos encontrados comúnmente en un dominio similar a IgCl . Véase, por ejemplo, Williams y Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405; Peach et al (1995), J. Biol. Chem. 270(36): 21181-21187. El dominio transmembranal de BTNL9 comienza aproximadamente en la posición 258 de la SEC ID NO: 2 y finaliza en aproximadamente la posición 277 de la SEC ID NO: 2. La porción intracelular de BTNL9 comienza en aproximadamente la posición 278 y finaliza en la posición 535 de la SEC ID NO: 2. La región intracelular que contiene un dominio B30.2 que se extiende desde aproximadamente la posición 328 hasta aproximadamente la posición 483 de la SEC ID NO: 2. Un dominio B30.2 es un dominio globular de aproximadamente 170 aminoácidos. Henry et al. describen los dominios B30.2 con cierto detalle y proporcionan una alineación de varios dominios B30.2 y una secuencia de consenso derivada de la alineación. Las porciones de Henry et al. (1998), Mol. Biol. Evol . 15(12): 1696-1705 que se muestran (por comparación de secuencia) y que explican lo que es un dominio B30.2 se incorporan en la presente como referencia. Los dominios B30.2 también se encuentran en BTNL3, BTNL8 y ERMAP, la totalidad de las cuales son miembros de la familia de proteínas similares a butirofilina, como se describe en la presente. La alineación de las proteínas BTNL en la Tabla 2 anterior a partir de la posición 328-486 muestran un alto grado de homología, ciertamente mayor que el que se observa entre una colección más diferente de proteínas que contienen B30.2 alineadas por Henry et al. supra.

Las proteínas BTNL9, como se indica en la presente, incluyen heteromultímeros y homomultímeros que comprenden por lo menos dos proteínas BTNL9. En algunas modalidades, los multímeros biológicamente activos pueden ser homomultímeros . El tamaño de los homomultímeros se puede determinar por electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones no reductoras o por cromatografía de exclusión de tamaño. El tamaño de la proteína BTNL9 monomérica contenida en los multímeros se puede determinar por electroforesis en gel de poliacrilamida del multímero bajo condiciones reductoras. Las condiciones se puede esperar que rompan puentes disulfuro y que interfieran con interacciones no covalentes tales como enlaces de hidrógeno o interacciones de carga. De esta manera, los multímeros retenidos juntos por enlaces disulfuro o interacciones no covalentes se puede esperar que sean reducidos a monómeros bajo condiciones reductoras. En algunas modalidades, el tamaño del homomultímero de BTNL9 biológicamente activo puede ser por lo menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis veces el tamaño de la proteína BTNL9 monomérica.

Las proteínas BTNL9, como se indica en la presente, también incluyen proteínas codificadas por variantes de empalme del AR m para BTNL9 de longitud completa. El ADNc de longitud completa que codifica para BTNL9 (SEC ID NO: 1) contiene once exones los cuales se presentan en las siguientes posiciones en la SEC ID NO: 1 exón 1, posición 1-208; exón 2, posición 209-340; exón 3, posición 341-685; exón 4, posición 686-967; exón 5, posición 968-1084; exón 6, posición 1085-1117; exón 7, posición 1118-1138; exón 8, posición 1139-1159; exón 9, posición 1160-1186; exón 10, posición 1187-1213; y exón 11, posición 1214-3500.

La secuencia codificante se extiende desde la posición 232-1839 de la SEC ID NO: 1, los últimos tres codones son un codón de detención. De esta manera, la secuencia codificante comienza dentro del segundo exón. El final del segundo exón se extiende ligeramente sobrepasando el extremo de la secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de señal de BTNL9 en aproximadamente la posición 34 de la SEC ID NO: 2. El tercer exón codifica para los aminoácidos desde aproximadamente la posición 37 hasta aproximadamente la posición 151 de la SEC ID NO: 2 que incluye el dominio similar a Ig. El cuarto exón codifica para la porción de la SEC ID NO: 2 desde aproximadamente la posición 152 hasta aproximadamente la posición 245, en otras palabras, la mayor parte del siguiente dominio, el cual tiene algunos de los rasgos de un dominio similar a IgCl . Después de esto, están los exones 5-10, la totalidad de los cuales son relativamente cortos. El exón 5 codifica para el resto del dominio extracelular más el dominio transmembranal, desde aproximadamente la posición 246 hasta aproximadamente la posición 284 de la SEC ID NO: 2. Los exones 6-10 juntos codifican para aproximadamente 43 aminoácidos, desde aproximadamente la posición 285 hasta aproximadamente la posición 327 de la SEC ID NO: 2. El exón 11 codifica para el dominio B30.2, el cual se extiende desde aproximadamente la posición 328 hasta aproximadamente la posición 486 de la SEC ID NO: 2 y el resto de la proteína, codifica en la posición 535 de la SEC ID NO: 2.

Las proteínas BTNL9, como se quiere indicar en la presente, pueden ser codificadas por variantes de empalme que tienen perdidos cualesquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve exones. Por ejemplo, una proteína BTNL9 puede estar codificada por una variante de empalme que ha perdido el exón 3 o el exón 4. La proteína BTNL9 resultante puede contener un dominio similar a Ig desde aproximadamente la posición 37 hasta aproximadamente la posición 151 de la SEC ID NO: 2 pero no el siguiente dominio desde aproximadamente la posición 152 hasta aproximadamente la posición 245 de la SEC ID NO: 2. De manera alternativa, una proteína BTNL9 resultante puede contener aminoácidos desde aproximadamente la posición 152 hasta aproximadamente la posición 245 de la SEC ID NO: 2 pero no los aminoácidos desde aproximadamente la posición 37 hasta aproximadamente la posición 151 de la SEC ID NO: 2. Una proteína BTNL9 codificada por un transcrito de variante de empalme que ha perdido los exones 10 y 11 puede carecer de los aminoácidos que se extienden desde aproximadamente 319 a 535 de la SEC ID NO: 2, aunque estos aminoácidos probablemente sean sustituidos por otros aminoácidos codificados por el intrón posterior al exón 9. El transcrito de BTNL9 que carece de los exones 10 y 11 ha sido reportado en el número de envío GenBank BC062459.1, cuya secuencia se proporciona en la SEC ID NO: 7. Esta variante de empalme aparentemente utiliza los sitios de empalme crípticos encontrados en los intrones . La SEC ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NO: 7. Otras proteínas BTNL9 pueden ser codificadas por variantes de empalme que carecen de los exones 3 , 4 , 5 , 6, 7, 8, 9, 10 u 11, o cualquier combinación de estos exones. Además, las variantes de empalme pueden utilizar sitios de empalme crípticos.

En algunas modalidades, una proteína BTNL9 puede ser un fragmento soluble de una proteína transmembranal de longitud completa que comprende la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma. En algunas modalidades, una proteína BTNL9 comprende un fragmento de BTNL9 que comprende el dominio similar de inmunoglobulina que se extiende desde el residuo 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 de la SEC ID NO: 2 al residuo 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 ó 150 de la SEC ID NO: 2. Estas modalidades pueden o no incluir el siguiente dominio que se extiende desde el residuo 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ó 160 de la SEC ID NO: 2 al residuo 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 ó 260 de la SEC ID NO: 2. En modalidades adicionales, una proteína BTNL9 puede comprender un fragmento que se extiende desde el residuo 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ó 160 de la SEC ID NO: 2 al residuo 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 ó 260 de la SEC ID NO: 2. Estas modalidades pueden o no incluir el dominio precedente que se extiende desde el residuo 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 de la SEC ID NO: 2 al residuo 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 Ó 150 de la SEC ID NO: 2. Una proteína BTNL9 puede comprender un fragmento el cual incluye la mayor parte o la totalidad de la región extracelular de BTNL9. Esta proteína puede comprender una secuencia de aminoácidos que se extiende desde el residuo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 de la SEC ID NO: 2 al residuo 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 ó 260 de la SEC ID NO : 2, opcionalmente desde aproximadamente el residuo 37 hasta aproximadamente el residuo 257 de la SEC ID NO: 2. Todos estos fragmentos pueden contener variaciones en relación a la SEC ID NO: 2 y pueden contener un número definido de sustituciones, inserciones o supresiones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 2 como se describe más adelante. La totalidad de estas modalidades puede inhibir la proliferación de linfocitos T estimulada por un anticuerpo anti-CD3.

La invención abarca los epítopos de proteínas de BTNL9 que son útiles para generar anticuerpos los cuales se denominan en la presente como fragmentos inmunogénicos . Los fragmentos inmunogénicos preferiblemente tienen una longitud de por lo menos 10 aminoácidos y pueden comprender aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 2. Los epítopos pueden abarcar regiones de una proteína BTNL9 codificada por una unión de empalme la cual puede tener la ventaja de unión específica a proteínas codificadas por variantes de empalme específicas. En algunas modalidades, el epítopo se localiza dentro de la región extracelular de BTNL9, desde la posición de aminoácido 35-257 de la SEC ID NO: 2. El epítopo puede estar dentro del dominio similar a inmunoglobulina que se extiende desde aproximadamente la posición de aminoácido 44-150 de la SEC ID NO: 2 o dentro del siguiente dominio, el cual se extiende desde aproximadamente las posiciones de aminoácidos 151-257 de la SEC ID NO: 2.

Como se indica en la presente, una proteína BTNL9 puede contener una o más inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 2 o uno de los fragmentos de la SEC ID NO: 2 descritos antes. En algunas modalidades, una proteína BTNL9 contiene no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 3, 2 ó l sustituciones, inserciones o supresiones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 2 o en relación a uno de los fragmentos de la SEC ID NO: 2 descritos antes. La totalidad de las variantes de proteína BTNL9 dentro del alcance de la invención retienen la capacidad para atenuar proliferación de linfocitos T o pueden actuar como un inhibidor de esta atenuación de proliferación de linfocitos T por proteína BTNL9 no alterada según se analiza por los métodos que aquí se describen.

En algunas modalidades, las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos, que es poco probable que afecten la actividad biológica incluyen las siguientes: serina por alanina, isoleucina por valina, glutamato por aspartato, serina por treonina, glicina por alanina, treonina por alanina, asparagina por serina, valina por alanina, glicina por serina, fenilalanina por tirosina, prolina por alanina, arginina por lisina, asparagina por aspartato, isoleucina por leucina, valina por leucina, glutamato por alanina, glicina por aspartato y estos cambios pueden ser también a la inversa. Véase, por ejemplo, Neurath et al., The Proteins, Academic Press, Nueva York (1979), cuyas porciones relevantes de la misma se incorporan en la presente como referencia. Además, un intercambio de un aminoácido dentro de un grupo por otro aminoácido dentro del mismo grupo es una sustitución conservadora, en donde los grupos son los siguientes: (1) alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, norleucina y fenilalanina; (2) histidina, arginina, lisina, glutamina y asparagina; (3) aspartato y glutamato; (4) serina, treonina, alanina, tirosina, fenilalanina, triptofano y cisteína; y (5) glicina, prolina y alanina.

La guía respecto a cuales aminoácidos de BTNL9 pueden ser alterados sin afectar su función biológica se proporciona por la alineación siguiente de la secuencia de aminoácidos de BTNL9 humana (línea superior, letras en minúsculas, SEC ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos de BTNL9 de ratón (línea inferior, letras en mayúsculas, SEC ID NO: 6) que se muestra a continuación. Los residuos que se muestran en negrillas son residuos característicos de un dominio similar a IgV (para los residuos 37-150 de la SEC ID NO: 2) o de un dominio similar a IgCl (para los residuos 151-257 de la SEC ID NO: 2) o variantes conservadores de los mismos. Harpaz y Chothia (1994). J. Mol. Biol . 238: 528-539; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol . 6: 381-405; Peach et al. (1995), J. Biol. Chem. 270(36): 21181-21187, la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

TABLA 3: ALINEACION DE SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE BTNL9 HUMANA Y DE RATON 1 mvdlsvspdslkpvsltsslvflmhllllqpgepsse. vkvlgpeypila 49 l l ll II : MI :M IMI -h I lllll III ft 1 MADFSVFLGFLKQI PRCLS. IFFTYLLFLQLWEV SDKVWVLGPEBSILA 49 50 lvgeevefpchlwpqldaqqmeirwfrsqtfnwhlyqeqqelpgrqrnpa 99 50 RV IGIEIAV MEFUPCIRL ISSYOD IAIE:HM IEIIIRIWIFIRMAQVSN llhYLlYlQlElPQ IGRSSLQ IMIAQ O9Q9 100 frnrtklvkddiaygswlqlhsiipsdkgtygcrEhsdnfsgealwele 149 100 F lRlNlRlTlLFEAYD l'IlAlEG ISIVINL MHILKVLPSlDlE-GlR lYGlClRlFlLS IDINIFISIGIEMATW lElLlEl 1 ?4?9? 150 vaglgsdphislegfkeggiqlrlrssgwypkpkvq rdhqgqclppefe 199 III MIIIMIMI 1111- 1 iTlTl 1111.111 muí 150 VAGSGSDPHISLQGFSGEGIQLQCSSSGWYPKPKVQWRGHQGPCLSP IEISE I ,1e9n9 200 aivwdaqdlfslets wragalsnvsvsiqnlllsqkkelwqiadvfv 249 200 A III QN .AIQTGL MFSILIEITMSVIIMVRIGG IAIHS llVlSlCII IQNiPL lLlPQ lKllElFV hITQIlAIDlVlFlL- 2 ,4?ß9 250 pgasawksafvac... lpl . llvlaalalgvlrkqrrsreklrkqaekrq 295 250 P IRMS lPWlKl AlFlVlGT ILWL I TPL ISL 1I =V 1L1TML IAILIRYFYK ILR .1SFQ -EIKIQVK IQTGE IE·VR · 29„9 . . . . . 296 ekltaeleklqceldwrraegqae raaqkyavdvtldpasahpslevse 345 III IIIMM lllll , 300 EKLQTELDWRRSEGQAEWRAAQQYAADVTLDPATAHPSLEVSN 342 346 dgksvssrgappgpapg pqrfseqtcalslerfsagrhywevhvgrrsr 395 ll llll I I I 111111111 II III U I II Mil 343 NGKTVSSRLGVPSTAAGDPQRFSEQTCVLSRERFSSGRHYWEVHVGRRSR 392 396 wflgaclaavpragparlspaagywvlglwngceyEvlaphrvaltlrvp 445 393 W IFILIGMACMLES .V1ER MSGPIAIRILISIPIAIAIGUYWIVMMGLIWINIRC lElYlFlVlLlDP lHlRlVlAlLlAL lRlVlPl 4 _42 446 prrlgvfldyeagelsffnvsdgshiftfhdtfsgalcayfrprahdgge 495 M Tl llll ll-MIMIIMIIM IIIMM II I _ 443 PRRIGVLLDYEAGKLSFFNVSDGSHIFSFTDTFSGALRAYLRPRAHXX.SE 492 496 hpdplticpípvrgtgvpeendsdtwlqpyepadpaldww 535 493 H lPlDlPhMTlIlClSL lPlVlRlGlPQV ILE lEllDlN-Dl W lLlQlPllYElPlLD IPIAI...W IAV EAV eS „53e6 Estas secuencias, es decir, las secuencias de aminoácidos humanos y murinos que se muestran en la Tabla 3 son aproximadamente 71% idénticas. De manera interesante, la secuencia del segundo dominio extracelular (desde aproximadamente la posición 151-257 de la SEC ID NO: 2) y la mayor parte del dominio intracelular (desde aproximadamente la posición 306-535 de la SEC ID NO: 2} de BTNL9 están más altamente conservadas entre las secuencias de ratón y de humano que la secuencia del primer dominio, el dominio extracelular a Ig . Una persona experta en el ámbito apreciará que los residuos no conservados es menos probable que jueguen un papel en la determinación en la estructura terciaria general de la proteína BTNL9 que en comparación con los residuos conservados, puesto que la estructura se encuentra más conservada en la evolución que la secuencia. Bork et al. (1994). J. Mol. Biol . 242:309-20. De la manera en que se utiliza en la presente, los "residuos no conservados" son aminoácidos dentro de una proteína BTNL9 que no están conservados cuando las secuencias de proteína BTNL9 humana y ratón se comparan, como en la Tabla 3. Los aminoácidos no conservados también es menos probable que jueguen un papel directo en la función de BTNL9. Por ejemplo los residuos 50, 54, 62 y 63 de la SEC ID NO: 2 y muchos otros mostrados en la Tabla 3 no son idénticos ni similares. De esta manera, una persona experta en el ámbito se dará cuenta que la alteración de los residuos que no son idénticos o similares es menos probable que afecte la función de la proteína BTNL9 que lo que lo haría la alteración de residuos idénticos o similares.

Además, es menos probable que las sustituciones conservadoras (como aquí se describe) afecten la función proteínica en comparación con las sustituciones no conservadoras. Por otra parte, la sustitución o supresión de los residuos conservados (tales como, por ejemplo, los residuos 43, 44, 47, 48 y 49 de la SEC ID NO: 2) , especialmente residuos que están conservados en dominios similares a Ig (tales como los residuos 52, 55 y 57 de la SEC ID NO: 2), es más probable que deterioren la función biológica. Una persona experta en el ámbito también apreciará que las sustituciones que sustancialmente establecen la estructura terciaria de una proteina BTNL9 como se predice por programas tales como, por ejemplo, DALI (Holm y Sander (1993), J. Mol. Biol . 233: 123-38), es más probable que deterioren la función. Así, la técnica proporciona guía considerable respecto a qué tipo de alteraciones se puede realizar sin afectar la función. Todas las variantes y derivados de la proteína BTNL9, como se indica en la presente, pueden inhibir la proliferación de linfocitos T activados con un anticuerpo anti-CD3 o pueden inhibir la capacidad de versiones no mutadas de la proteína BTNL9 para hacerlo de esta manera.

Una proteína BTNL9 puede ser por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación es de por lo menos 50, 60, 75, 80, 90 ó 100 aminoácidos de longitud en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de linfocitos T activados con un anticuerpo anti-CD3. Como se describe en lo anterior, los malos pareamientos de secuencia con las secuencias de ratón o con otros miembros de la familia BTNL9 humanos pueden guiar a una persona experta en el ámbito a determinar en donde se pueden realizar modificaciones en la secuencia de la SEC ID NO: 2 sin afectar su función. En algunas modalidades, las inserciones, supresiones o sustituciones pueden producirse o realizarse adyacentes a los residuos que no están conservados entre BTNL9 humano y de ratón. En algunas modalidades, estas alteraciones se producen (en el caso d supresiones o sustituciones) o adyacentes (en el caso de inserciones) a uno o más de los siguientes residuos de los SEC ID NO: 2: 39, 45, 46, 50, 54, 60, 62-65, 69, 79, 80, 89, 91-95, 98, 99, 105-109, 113, 117, 119, 121, 122, 130, 136, 145, 153, 165-167, 173, 174, 188, 195, 198, 202, 203, 207, 219, 222, 227, 228, 232, 235, 240, 251, 252, 254 y 257. De manera alternativa, una proteína BTNL9 puede contener un máximo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25 Ó ' 30 sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos en relación a la SEC ID NO: 2. Las proteínas descritas en lo anterior son proteínas BTNL9 como se indica en la presente en la medida en que puedan inhibir la proliferación de linfocitos T activados por un anticuerpo anti-CD3.

Las proteínas BTNL9 pueden estar glucosiladas en grados variables o pueden no estar glucosiladas . Como una ilustración, una proteína BTNL9 de la invención puede comprender uno o más sitios de glucosilación unidos a N u 0 además de aquellos ya encontrados en una proteína que comprende la SEC ID NO: 2. La SEC ID NO: 2 contiene cinco sitios potenciales de glucosilación unido a N en las posiciones 102, 139, 224, 464 y 516. Una persona experta en el ámbito tendrá conocimiento de que los residuos asparagina que son partes de la secuencia Asn Xxx Ser/Thr (en donde Xxx es cualquier aminoácido excepto prolina) puede servir como sitios de adición para N-glucanos. Además, existen muchos residuos serina y treonina que pueden servir como sitios de glucosilación unidos a O. La glucosilación puede incrementar la vida media in vivo o alterar la actividad biológica. Las variantes de proteínas BTNL9 también incluyen proteínas que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más sitios de glucosilación unidois a N y/u 0 que están presentes en la SEC ID NO: 2 en la medida en que la proteína resultante puede inhibir la proliferación de linfocitos T. Las proteínas BTNL9 variantes también incluyen aquellas que tienen menos de uno, dos, tres, cuatro o cinco sitios de glucosilación unidos a N y/u O que los presentes en la SEC ID NO: 2 en la medida en que puedan inhibir la proliferación de linfocitos T activados con un anticuerpo anti-CD3 o que puedan inhibir la capacidad de versiones no mutadas de proteína BTNL9 para realizarlo de esta manera.

Las proteínas BTNL9, como se indica en la presente, pueden ser proteínas de fusión que comprende por lo menos un polipéptido BTNL9 el cual puede comprender una secuencia de aminoácidos que es una variante y/o un fragmento de la SEC ID NO: 2 (como se explica en lo anterior) y por lo menos otra porción. La otra porción puede ser un polipéptido diferente de una proteína BTNL9. La otra porción también puede ser una porción no proteínica tal como, por ejemplo, una porción de polietilenglicol (PEG) o una porción citotóxica, citostática, luminiscente y/o radioactiva.

Se ha demostrado que la unión de PEG incrementa la vida media in vivo de por lo menos algunas proteínas. Además, las porciones citotóxicas, citostáticas , luminiscentes y/o radioactivas se han fusionado a antibióticos para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, por ejemplo, para ubicar, para inhibir la proliferación de, o para destruir células a las cuales se puedan unir los anticuerpos. De modo similar, las proteínas BTNL9 fusionadas a estas porciones se pueden utilizar para ubicar, inhibir la proliferación de o para destruir células a las que se puede unir BTNL9, tales como linfocitos B, linfocitos T y/u otras células involucradas en respuestas inmunitarias . Entre las porciones citotóxicas, citostáticas, luminiscentes y/o radioactivas se encuentran, por ejemplo, los derivados de maitansina (tales como DMI) , enterotoxinas (tales como una enterotoxina estafilocócica) , isótopos de yodo (tales como yodo-125) , isótopos de tecnecio (tales como Tc-99m) , fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5.18), proteínas inactivantes de ribosoma (tales como bouganina, gelonina o saporina-S6) y caliqueamicina, una sustancia citotóxica que es parte de un producto comercializado bajo la marca comercial MYLOTARGMR (Wyeth-Ayerst) .

Una diversidad de polipéptidos diferentes de BTNL9 se pueden fusionar a un polipéptido BTNL9 para una diversidad de propósitos tales como, por ejemplo, incrementar la vida media in vivo de la proteína, para facilitar la identificación, aislamiento y/o purificación de la proteína, para incrementar la actividad de la proteína para promover la oligomerización de la proteína.

Muchos polipéptidos pueden facilitar la identificación y/o purificación de una proteína de fusión recombinante de la cual son una parte. Los ejemplos incluyen poliarginina, polihistidina o HATMR (Clontech) , la cual es una secuencia que se encuentra de modo natural de residuos histidina no adyacentes que posee una alta afinidad por iones metálicos inmovilizados. Las proteínas BTNL9 que comprenden estos polipéptidos se pueden purificar, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando níquel inmovilizado o resina TALONMR (Clontech) , la cual comprende iones cobalto inmovilizados. Véase, por ejemplo Knol et al. (1996), J. Biol. Chem. 27(26): 15358-15366. Los polipéptidos que comprenden poliarginina permiten la purificación eficaz por cromatografía de intercambio iónico. Otros polipéptidos útiles incluyen, por ejemplo, los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente de E.U.A. 5,011,912 y en Hopp et al. (1988), Bio/Technology 6:1204. Uno de estos péptidos es el péptido FLAGMR el cual es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite un análisis rápido y purificación fácil de la proteína de fusión recombinante expresada. Un hibridoma murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que une el péptido FLAGMR en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la patente de E.U.A. , 5,011,912. La línea de células de hibridoma 4E11 se ha depositado ante la American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que unen el péptido FLAGMR se pueden utilizar como reactivo de afinidad para recuperar un reactivo de purificación polipeptídico que comprenda al péptido FLAGMR. Otras etiquetas de proteína adecuadas y reactivos de afinidad son: 1) aquellos descritos en el sistema GST-BindMR (Novagen) , los cuales utilizan la afinidad de las proteínas de fusión glutation-S-transíerasa para glutation inmovilizado; 2) las descritas en el kit de purificación por afinidad T7-TAGMR (Novagen) , el cual utiliza la afinidad de los 11 aminoácidos de la protelna 10 del gen T7 para un anticuerpo monoclonal; o 3) los descritos en el sistema STREP-TAGMR (Novagen), los cuales utilizan la afinidad de una forma manipulada de estreptavidina para una etiqueta de proteína. Algunas de las etiquetas de proteína mencionadas en lo anterior así como otras se describen en Sassenfeld (1990), TIBTECH 8: 88-93, Brewer et al., in Purification and Analysis of Recombinant Proteins, pp. 239-266, Seetharam y Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991), y Brewer y Sassenfeld, in Protein Purification Applications, pp. 91-111, Harris y Angal (eds.), Press, Inc., Oxford Inglaterra (1990). Las porciones de estas referencias que describen etiquetas de proteína se incorporan en la presente como referencia. Adicionalmente, las fusiones de dos o más de las etiquetas descritas en lo anterior tales como, por ejemplo, una fusión de una etiqueta FLAG y una etiqueta de polihistidina se pueden fusionar a una proteína BTNL9 de la invención.

Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos diferentes de BTNL9 pueden tener otra clase de ventajas únicas tales como por ejemplo, susceptibilidad a formar dímeros, trímeros o multímeros de orden superior, una vida media in vivo aumentada y/o una actividad biológica aumentada. Un "multímero de orden superior" cuando se utiliza en conjunción, por ejemplo con un "dímero" significa un multímero que contiene más de dos cadenas polipeptídicas . Cuando se utiliza la frase similar a "un trímero o un multímero de orden superior", el multímero de orden superior contiene más de tres cadenas polipeptídicas. Así, un multímero de orden superior es aquel que tiene más cadenas polipeptídicas que el multímero con el que se le compara. Las técnicas para preparar proteínas de fusión se conocen y se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 99/31241 y en Cosman et al. ((2001). Immunity 14: 123-133). Como una ilustración, un polipéptido que comprende una región Fe de un anticuerpo, originalmente un anticuerpo IgG, o una proteína sustancialmente similar, se puede fusionar a un polipéptido BTNL9 o un fragmento del mismo. Una región Fe de un anticuerpo es un polipéptido que comprende la mayor parte o la totalidad de la bisagra más los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos. Para una discusión véase Hasemann y Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, segunda edición, 212-213 (1989). El fragmento Fe puede ser Fe de IgG humana, tal como Fe de IgGl, lgG2, IgG3 o IgG4. Un fragmento Fe puede ser un fragmento Fe humano o animal nativo. Las formas truncadas de regiones Fe, es decir, formas que pierden alguna porción de la bisagra, los dominios CH2 y/o CH3 que promueven la dimerización también se pueden utilizar. Otras porciones de los anticuerpos y otros isotipos de inmunoglobulina se pueden utilizar. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden regiones Fe de anticuerpos es probable que formen dímeros o multímeros de orden superior. Las proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de proteínas derivadas de anticuerpo se han descrito por Ashkenazi et al. ((1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:10535-39), Byrn et al. ((1990), Nature 344: 677-70), Hollenbaugh y Aruffo (en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11 (1992)). Baum et al. ((1994), EMBO J. 13: 3992-4001) y por la patente de E.U.A. 5,457,035 y la solicitud internacional O 93/10151, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia. En algunas modalidades, una región Fe alterada puede tener la ventaja de tener una afinidad menor por receptores Fe en comparación con una región Fe natural. Esto puede ser una ventaja debido a que puede disminuir la lisis de células a las cuales las proteínas de fusión recombinantes se unen por células efectoras inmunitarias . Las alteraciones a la región Fe se describen en la patente de E.U.A. 5,457,035 y en la solicitud de patente internacional WO 93/10151, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia. El ejemplo 2 a continuación describe la producción de una proteína de fusión que contiene la región extracelular de BTNL9 humana y la región Fe de un anticuerpo IgGl humano.

Una proteína de fusión recombinante que comprende una proteína BTNL9 puede comprender un polipéptido que comprende una cremallera de leucina. Entre las secuencias de cremallera de leucina conocidas están las secuencias que promueven la dimerización y secuencias que promueven la trimerización. Véase, por ejemplo, Landschulz et al. (1988), Science 240: 1759-64, cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia. Las cremalleras de leucina comprenden una secuencia repetida de siete unidades repetitivas con frecuencia con cuatro o cinco residuos lisina interpuestos con otros aminoácidos. El uso y preparación de las cremalleras de leucina se conocen en el ámbito.

Una proteína de fusión BTNL9 puede comprender uno o más enlazantes peptídicos. Generalmente, un enlazante peptídico es un tramo de aminoácidos que sirve para enlazar una pluralidad de polipéptidos para formar multímeros y proporciona la flexibilidad o rigidez necesaria para la función deseada de las porciones enlazadas de la proteína. Típicamente, un enlazante peptídico está entre aproximadamente 1 y 30 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de enlazantes peptídicos incluyen pero no se limitan a -Gly-Gly--, GGGGS (SEC ID NO: 9), (GGGGS)n (SEC ID NO: 10), GKSSGSGSESKS (SEC ID NO: 11), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID NO: 12), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEC ID NO: 13) , GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID NO: 14), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEC ID NO : 15), EGKSSGSGSESKEF (SEC ID NO: 16) y GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 17) . Las porciones enlazantes se describen, por ejemplo, en Huston, J. S., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 5879-83 (1988), Whitlow, M . , et al., Protein Engineering 6: 989-95 (1993), Newton, D. L. , et al., Bioc emistry 35: 545-53 (1996), y en las patentes de E.U.A. 4,751,180 y 4,935,233. Las porciones relevantes de estas referencias, es decir, las porciones que describen enlazantes, se incorporan en la presente como referencia .

Una proteína de fusión BTNL9 recombinante puede comprender una proteína BTNL9 que carece de su secuencia de señal normal y que en vez de esto tiene una secuencia de señal diferente que la sustituye. La selección de la secuencia de señal depende del tipo de células hospedadoras en las cuales se va a producir la proteína recombinante y una secuencia de señal diferente puede sustituir a la secuencia de señal nativa. Los ejemplos de secuencias de señal que son funcionales en células hospedadoras de mamífero incluyen lo siguientes: la secuencia de señal para interleucina 7 (IL-7) descrita en la patente de E.U.A. 4,965,195; la secuencia de señal de IgK humana (la cual es METDTLLLWVLLLWVPGSTG: SEC ID NO: 3) ; la secuencia de señal para el receptor de interleucina 2 descrito en Cosman et al. ((1984), Wature 312: 768) ; el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP 0 367 566; el péptido señal del receptor de interleucina 1 tipo I descrito en la patente de E.ü.A. 4,968,607; y el péptido señal de receptor de interleucina 1 tipo II descrito en la patente EP 0 460 846. Las porciones de estas referencias que describen estas secuencias de señal se incorporan en la presente como referencia.

ACIDOS NUCLEICOS PARA BTNL9 La invención abarca ácidos nucleicos aislados que incluyen, por ejemplo, los ADN y los ARN que codifican para proteínas BTNL9 descritas en la presente las cuales incluyen proteínas que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y fragmentos y/o variantes de las mismas. Estos ácidos nucleicos son útiles, por ejemplo, para producir proteínas recombinantes y detectar la presencia de ácidos nucleicos para BTNL9 en muestras de tejido, por ejemplo, para usos diagnósticos . Los ácidos nucleicos pueden ser ADN genómico o ADNc . Los ácidos nucleicos pueden comprender un marco de lectura abierto ininterrumpido que codifica para una proteína BTNL9. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ADN y ARN en forma tanto de hebra simple como de hebra doble asi como las secuencias complementarias correspondientes. Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que ha sido separado de secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo del cual se ha aislado el ácido nucleico en caso de los ácidos nucleicos aislados de fuentes que se encuentran de modo natural. En el caso de ácidos nucleicos sintetizados químicamente tales como los oligonucleótidos o enzimáticamente a partir de una plantilla tales como los productos de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) o los ADNc, se entiende que los ácidos nucleicos que resultan de tales procedimientos son ácidos nucleicos aislados. Una molécula aislada de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande.

Adicionalmente , la invención abarca fragmentos de un ácido nucleico que codifica para una proteína BTNL9 que puede servir (1) como sondas para detectar ácidos nucleicos para BTNL9 mediante un número de métodos bien conocidos en el ámbito, por ejemplo Southern y Northern blooting, transferencia por puntos (dot blotting) , hibridaciones de colonias, hibridaciones a un arreglo, etc., (2) como cebadores de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar ácidos nucleicos para BTNL9 o (3) como un medio para regular la expresión de ácidos nucleicos para BTNL9, por ejemplo a través de la inhibición de expresión con ácidos nucleicos antisentido (que incluye ácidos nucleicos peptídicos) , ribozimas, moléculas formadoras de hélice triple o ARN de interferencia. Los ADN que codifican para cualesquiera de estos ARN también son ácidos nucleicos para BTNL9, como se indica en la presente. Los cebadores de PCR pueden comprender, además de las secuencias de ácido nucleico para BTNL9, otras secuencias tales como sitios de separación por enzima de restricción que faciliten el uso del ácido nucleico amplificado. La PCR se describe en las siguientes referencias: Saiki et al. (1988), Science 239: 487-91; PCR Technology, Erlich, ed. , Stockton Press. (1989). Como se explica más adelante, la PCR puede ser útil para detectar expresión excesiva o insuficiente de los ARNm para BTNL9 y los cebadores de PCR se pueden tomar de diversas partes del gen para BTNL9 y también se pueden seleccionar para distinguir entre variantes de empalme diferentes. Los ARN antisentido (y los ADN que los codifican) , los ADN o los nucleótidos sintéticos y su uso para regular la expresión son bien conocidos en el ámbito y se describen, por ejemplo, en Izant y Weintraub (1984), Cell 36(4): 1007-15; Izant y eintraub (1985), Science 229(4711): 345-52; Harel-Bellan et al. (1988), J. Exp. Med. 168(6): 2309-18; Sarin et al. (1988), Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85(20): 7448-51; Zon (1988); Pharm. Res. 5(9): 539-49; Harel-Bellan et al. (1988), J. Immunol. 140(7): 2431-35; Marcus-Sekura et al. (1987), Nucleic Acids Res. 15(14): 5749-63: Gambari (2001), Curr. Pharm. Des. 7(17): 1839-62; y Lemaitre et al. (1987), Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA 84(3): 648-52. Las porciones de estas referencias que describen técnicas de modulación de la expresión de genes utilizando ácidos nucleicos se incorporan como referencia en la presente. De manera similar, los ARN de interferencia (y los ADN que los codifican) y su uso para inhibir la expresión de los genes seleccionados son bien conocidos en el ámbito y se describen, por ejemplo, en Fjose et al. (2001), Biotechnol. Ann. Rev. 7: 31-57; Bosher y Labouesse (2000), Nature Cell Biol . 2: E31-E36. Las porciones relevantes de estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Adicionalmente , las ribozimas o enzimas de ADN se pueden dirigir para separar los ARN específicos y de esta manera se pueden utilizar para inhibir expresión de genes como se describe, por ejemplo, en Lewin y Hauswirth (2001), Trends Mol. Med. 7(5): 221-28; Menke y Hobom (1997), Mol. Biotechnol. 8(1): 17-33; Norris et al. (2000), Adv. Exp. Med. Biol. 465: 293-301; Sioud (2001), Curr . Mol. Med. 1(5): 575-88: y Santiago y Khachigian (2001), J. Mol. Med. 79(12): 695-706. Las porciones de estas referencias que describen estos métodos de modulación de expresión de genes se incorporan como referencia ne la presente. Los ácidos nucleicos que pueden regular la expresión de BTNL9 pueden encontrar uso en estudios in vivo o in vitro de la función de BTNL9 o como sustancias terapéuticas, opcionalmente como agentes de genoterapia.

La presente invención también incluye ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de la SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma o ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones moderadamente rigurosas y opcionalmente condiciones altamente rigurosas con ácidos nucleicos que comprenden la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1, la cual es la secuencia nucleotídica del ADNc para BTNL9 de longitud completa, en donde el ácido nucleico codifica para una proteína que puede inhibir la proliferación de linfocitos T activados con un anticuerpo anti-CD3. Las técnicas de hibridación son bien conocidas en el ámbito y se describen por Sambrook J. E. F. Fritsch y T. Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11, (1989)) y Current Protocole in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4 (1995) ) , las porciones relevantes de las cuales se incorporan como referencia en la presente. Las condiciones moderadamente rigurosas para hibridaciones de filtro incluyen hibridación en formamida aproximadamente 50%, 6 x SSC a una temperatura de aproximadamente 42°C a 55°C y lavado a aproximadamente 60 °C en 0.5 x SSC, SDS 0.1%. Las condiciones altamente rigurosas se definen como condiciones de hibridación como se indica en lo anterior pero con lavado a aproximadamente 68 °C en 0.2 x SSC, SDS 0.1%, SSPE (lxSSPE es NaCl 0.15 M, NaH2P04 10 mM y EDTA 1.26 mM, H 7.4) que puede ser sustituido por SSC (lxSSC es NaCl 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en la hibridación y amortiguadores de lavado; lavados, opcionalmente por lo menos dos lavados se realizan durante 15 minutos después de que la hibridación es completa.

Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado se pueden ajustar según sea necesario para obtener un grado deseado de rigurosidad al aplicar los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad de las cadenas dobles, como se conocen por aquellos expertos en la técnica y como se describen adicionalmente en lo siguiente (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . Cuando se hibridizan ácidos nucleicos de secuencia conocida, se puede determinar la longitud híbrida al alinear las secuencias de los ácidos nucleicos (por ejemplo, utilizando GAP) e identificar la región o regiones de complementariedad óptima de secuencia. La temperatura de hibridación para híbridos anticipados que son menores de 50 pares de bases de longitud debe ser 5 a 10 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos con una longitud menor de 18 pares de base, Tm (en grados C) = 2(# de bases A + T) + 4 (# de bases G + C) . Para híbridos con una longitud superior a 18 pares de bases, Tm (en grados C) = 81.5 + 16.6(log10 [Na+] ) + 0.41 (% de G + C) - (600/N) , en donde N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones sodio en el amortiguador de hibridación. Cada ácido nucleico hibridizante tiene una longitud que es por lo menos 15 nucleótidos (o por lo menos 18 nucleótidos, o por lo menos 20, o por lo menos 25, o por lo menos 30, o por lo menos 40, o por lo menos 50 o por lo menos 100, Sambrook et al., supra.

Los ácidos nucleicos para BTNL9 incluyen ácidos nucleicos que comprenden los siguientes polinucleótidos : (1) la totalidad o un fragmento de la SEC ID NO: 1, en donde el fragmento codifica para una proteína BTNL9 que puede inhibir la proliferación de linfocitos T (2) un polinucleótido que incluye secuencias nucleotídicas por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 99.7% idénticas a la SEC ID NO: 1, en donde el intervalo de alineación es de por lo menos 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 ó 1200 nucleótidos de longitud y en donde la secuencia codifica para una proteína BTNL9 que puede inhibir la proliferación de linfocitos T activada con anticuerpo anti-CD3; (3) fragmentos de la SEC ID NO: 1 o secuencias sustancialmente similares que son útiles para detectar o amplificar ácidos nucleicos que codifican para proteínas BTNL9 de la invención o para regular la expresión de los ARNm para BTNL9 y/o proteínas; (4) un polinucleótido que comprende un máximo de 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25 ó 30 alteraciones de un nucleótido único en relación a la SEC ID NO: 1, en donde una alteración puede ser una inserción, supresión o sustitución de un nucleótido único y en donde el polinucleótido codifica para una proteína BTNL9 que puede inhibir la proliferación de linfocitos T activados con anticuerpo anti-CD3 o que puede servir como un antagonista de esta proteína; y (5) un polinucleótido que codifica para una proteína BTNL9 como se describe en la presente, la cual incluye fragmentos, derivados y variantes de una proteína BTNL9 humana.

METODOS DE ELABORACION DE PROTEINAS BTNL9 Las proteínas BTNL9 o anticuerpos anti -BTNL9 (o anticuerpos anti-idiotípicos) se pueden elaborar como sigue. Un ácido nucleico que codifica para una proteína BTNL9 o un anticuerpo anti-BTNL9, como se describe en la presente se puede introducir en un vector, el cual puede ser introducido en una célula hospedadora. Los vectores y células hospedadoras que comprenden ácidos nucleicos que codifican para una proteína BTNL9 o un anticuerpo anti-BTNL9 están abarcados por la invención. La célula hospedadora que contiene los ácidos nucleicos que codifican para una proteína BTNL9 o un anticuerpo anti-BTNL9 se pueden cultivar bajo condiciones tales que la proteína BTNL9 o el anticuerpo anti-BTNL9 se puede expresar. La proteína BTNL9 o el anticuerpo anti-BTNL9 expresados después se pueden obtener del medio en el cual se han cultivado las células o a partir de las células y se pueden purificar por cualquiera de muchos medios apropiados conocidos en el ámbito. Además, los métodos de manipulación genética para la producción de proteínas BTNL9 incluyen la expresión de moléculas polinucleotídicas en sistemas de expresión libres de células, en hospedadores celulares, en tejidos y en modelos animales, de acuerdo con métodos conocidos .

El vector puede incluir un marcador seleccionable y un origen de replicación para propagación en un hospedador. El vector puede incluir además secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas, tales como aquellas derivadas de genes de mamífero, microbianos, virales o de insecto, unidos operablemente al ácido nucleico que codifica para la proteína BTNL9 o el anticuerpo anti-BTNL9. Los ejemplos de estas secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores o mej oradores, sitios de unión de AR m ribozómico y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias nucleotídicas están unidas operablemente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica para la proteína objetivo. De esta manera, una secuencia nucleotídica promotora está unida operablemente a una secuencia nucleica de BTNL9 si la secuencia nucleotídica promotora dirige la transcripción de anticuerpo anti-BTNL9 o la secuencia que codifica para la proteína BTNL9. Si la proteína BTNL9 es una proteína de fusión, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una porción de la proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia de señal, puede ser parte de un vector y un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-BTNL9 o una proteína BTNL9 se puede insertar en el vector de manera que la proteína que comprende la secuencia de señal agregada más el anticuerpo anti-BTNL9 o la proteína BTNL9 es codificada por el vector.

Las células hospedadoras adecuadas para expresión de proteínas BTNL9 o anticuerpos anti-BTNL9 incluyen células procarióticas , células de levadura, células vegetales, células de insecto y células eucarióticas superiores. Las secuencias reguladoras en el vector se seleccionarán de manera que sean operables en la célula hospedadora. Las células hospedadoras procarióticas adecuadas incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella así como miembros de los géneros Pseudomonas, Estrepto yces y Staphilococcus . Para expresión en células procarióticas, por ejemplo en E. coli, la molécula polinucleotídica que codifica para una proteína BTNL9 o anticuerpo anti-BTNL9 preferiblemente incluye un residuo metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante . La metionina N-terminal opcionalmente se puede separar del polipéptido expresado. Las células hospedadoras de levadura adecuadas incluyen células de los géneros que incluyen Saccharo yces, Pichia y Kluveromyces. Los hospedadores de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris . Un sistema adecuado para expresión en una célula hospedadora de insecto se describe, por ejemplo, en la revisión por Luckow y Summers ((1988), BioTechnology 6: 47), las porciones relevantes de la cual se incorporan en la presente como referencia. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen a la línea COS-7 de células de riñon de mono (Gluzman et al. (1981), Cell 23: 175-182), células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) (Puck et al. (1958), PNAS EUA 60: 1275-1281), CV-1 (Fischer et al. (1970), Int. J. Cáncer 5: 21-27), células 293 de riñon humano (American Type Culture Collection (ATCCMR) catálogo No. CRL-10852MR) y células de carcinoma cervical humano (HeLa) (ATCCMR CCL 2) . Las porciones relevantes de las referencias a las que se hizo referencia en este párrafo se incorporan en la presente como referencia.

Los vectores de expresión para uso en hospedadores celulares generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Estos genes incluyen, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento auxotrófico. Están disponibles fácilmente una amplia variedad de estos vectores a partir de fuentes comerciales. Los ejemplos incluyen los vectores pGEM (Promega) , los vectores pSPORT y los vectores pPROEX (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) , los vectores Bluescript (Stratagene) , y los vectores pQE (Qiagen) . Los vectores de levadura con frecuencia contendrán una secuencia origen de replicación a partir de un plásmido de levadura 2 µ, una secuencia replicante de manera autónoma (ARS, por sus siglas en inglés) , una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para finalización de transcripción y un gen marcador seleccionable . Los vectores replicables tanto en levadura como en E. coli (denominados vectores lanzadera) también se pueden utilizar. Además de las características mencionadas antes de los vectores de levadura, un vector lanzadera también incluirá secuencias para replicación y selección en E. coli. La secreción directa de los polipéptidos objetivo expresada en hospedadores de levadura se puede llevar a cabo por la inclusión de una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia líder de factor de levadura en el extremo 5' de la secuencia nucleotídica para BTNL9 o la secuencia nucleotídica que codifica para el anticuerpo. Brake (1989) , Biotechnology 13:269-280.

Los ejemplos de vectores de expresión adecuados para uso en células hospedadoras de mamífero incluyen pcDNA3. l/Hygro+ (Invitrogen) , pDC409 (McMahan et al. (1991), EMBO J. 10: 2821-2832), y pSVL (Pharmacia Biotech) . Los vectores de expresión para uso en células hospedadoras de mamíferos pueden incluir secuencias de control transcripcional y traduccional derivadas de genomas virales . Las secuencias promotoras y secuencias mejoradoras utilizadas comúnmente que se pueden utilizar para expresar AR para BTNL9 incluyen pero no se limitan a aquellas derivadas de citomegalovirus humano (CMV, por sus siglas en inglés) , Adenovirus 2, virus de Polyoma y virus simio 40 (SV40) . Los métodos para la construcción de vectores de expresión de mamífero se describen, por ejemplo, en Okayama y Berg ((1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170), Cosman et al. ((1986) Mol. Immunol. 23:935-941), Cosman et al. ((1984) Nature 312: 768-771), EP-A-0367566 y WO 91/18982. Las porciones relevantes de estas referencias se incorporan en la presente como referencia .

ANTICUERPOS BTNL9 Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas BTNL9 que aquí se describen, los anticuerpos antiidiotípicos que se unen a anticuerpos anti-BTNL9 y los usos de estos anticuerpos están abarcados por la invención. Un anticuerpo anti-BTNL9 se puede unir a un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o -un fragmento de la misma tal como los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2. De la manera en que se utiliza en la presente, la unión específica de un epítopo sobre una proteína BTNL9 por un primer anticuerpo significa que el primer anticuerpo se puede desplazar desde la proteína BTNL9 por otro anticuerpo que compite con el primer anticuerpo, pero no por otro de los anticuerpos anti-BTNL9 que no compite con el primer anticuerpo por unión. Se conocen en el ámbito numerosos análisis de unión competitiva.

Típicamente, la competencia de anticuerpos por la unión se puede evaluar por un análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) . Todos los anticuerpos de interés están biotinados . Los anticuerpos biotinados se combinan con células que se sabe expresan el antígeno al cual se unen los anticuerpos. Si los anticuerpos biotionados se unen a las células según se espera, se deberá observar un desplazamiento en la intensidad de fluorescencia. La preincubación de las células con una versión no marcada del mismo anticuerpo deberá eliminar por completo el desplazamiento observado en la fluorescencia. La preincubación con un anticuerpo no marcado diferente puede eliminar completa o parcialmente el desplazamiento de fluorescencia o puede no tener efecto. En este último caso, uno podría concluir que el anticuerpo no marcado no compite con el anticuerpo marcado. En el primer caso, los anticuerpos compiten por la unión y, como se indica en la presente, uno podría concluir que los epítopos se superponen total o parcialmente, dependiendo de la eliminación del desplazamiento en la fluorescencia, si es completa o parcial. Aunque los anticuerpos contemplados son aquellos que compiten, ya sea total o parcialmente con cualquier anticuerpo anti-BTNL9 proporcionado específicamente.

Además, el impacto de un anticuerpo BTNL9 sobre la activación de linfocitos T activados con anti-CD3 en presencia o ausencia de una proteína BTNL9 puede proporcionar información útil adicional acerca de las propiedades funcionales de un anticuerpo. La invención incluye anticuerpos monoclonales , cada uno de los cuales se une a un epítopo particular de BTNL9 y anticuerpos monoclonales que compiten por estos por la unión.

Los epítopos sobre la proteína BTNL9 pueden comprender configuraciones de aminoácidos y también pueden comprender aminoácidos no contiguos que se colocan en proximidad por el pliegue de una proteína BTNL9. Se pueden identificar epítopos por métodos conocidos en el ámbito que incluyen el uso de un fragmento de proteína o bibliotecas de péptidos, exploración con alanina, extracción de epítopos, corte de epítopos o cristalografía de rayos X. Véase, por ejemplo, Leinonen et al., (2002), Clin. Chem. 48(12): 2208-16; Kroger et al. (2002), Biosens. Bioelectron. 17(11-12): 937-44; Zhu et al. (2001), Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(4): 921-27; Obungu et al. (2009), Biochemistry 48: 7251-60. Las porciones relevantes de estas referencias, es decir, las porciones que describen método de mapeo de epítopos, se incorporan en la presente como referencia.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales y se pueden producir por métodos bien conocidos en el ámbito. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980) ; y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, NY, (1988); Kohler y Milstein (1980) Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, 77: 2197; Kozbor et al. (1984), J. Immunol . 133: 3001-3005 (describing the human B-cell hybridoma technique) ; Colé et al., Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) (wich describes EBV-hybridoma technique) ; Kuby, Immunology, segunda edición, p. 162-64, .H. Freeman and Co . , Nueva York (1994); las porciones relevantes de estas referencias se incorporan en la presente como referencia. Las líneas de célula de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas BTNL9 de la invención también se contemplan en la presente. Estas líneas de hibridoma se pueden producir e identificar por técnicas convencionales. El hibridoma que produce un anticuerpo de esta invención se puede cultivar in vitro o in vivo. Adicionalmente , los anticuerpos anti-BTNL9 se pueden producir en otras células cultivadas que incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (por ejemplo, NSO, NSI) y W138, células de levadura, células de insecto y células bacterianas que incluyen, por ejemplo, Escherichia coli. Tales anticuerpos se pueden producir al introducir ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos más ácidos nucleicos para permitir la expresión de estos ácidos nucleicos en las células hospedadoras deseadas. Los anticuerpos después se pueden producir al cultivar las células en las cuales se han introducido estos ácidos nucleicos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina que incluye igG, igM, igE, igA, igD y cualquier subclase de las mismas tal como, por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4.

Los anticuerpos anti-BTNL9 pueden ser anticuerpos tetraméricos de longitud completa que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras como aquellos que se encuentran en la mayoría de las especies de mamíferos. De modo alternativo, los anticuerpos anti-BTNL9 pueden ser anticuerpos de hebra simple que comprenden una región variable de cadena pesada y una ligera y, opcionalmente, también uno o más dominios similares a región constante (patente de E.ü.A. 4,946,778; Bird et al. (1988), Science 242: 423-26; Huston et al. (1988), Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-83), anticuerpos diméricos o multivalentes (véase, por ejemplo, Lantto et al. (2002), J. Gen. Virol. 83: 2001-05; Hudson y Souriau (2001), Expert Opin. Biol. Ther. 1(5): 845-55), anticuerpos tetraméricos (véase, por ejemplo Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. Quinta edición, parte II, capítulo 3, Garland Publishing (2001) ) , anticuerpos quiméricos (Hudson y Souriau, supra; Boulianne et al. (1984), Nature 312:643-46; Morrison et al (1984), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81: 6851-55; Takeda et al. (1985), Nature 314: 452-54; Neuberger et al. (1985), Nature 314: 268-70), anticuerpos completamente humanos producidos en un mamífero transgénico no humano (descritos, por ejemplo, en la patente de E.U.A. 6,150,584) o por selección in vitro (solicitud de patente de E.U.A. 2002/0058033) o anticuerpos humanizados (Morrison et al., supra; Takeda et al., supra; Boulianne et al., supra). Además, los anticuerpos pueden ser "madurados" por esquemas de selección in vitro para proporcionar un anticuerpo con propiedades alteradas tales como por ejemplo, afinidad mayor por el epítopo al cual se une. Véase, por ejemplo Jackson et al. (1995), J. Immunol. 154(7): 3310-19; Pini y Bracci (2000), Curr. Protein Pept . Sci. 1(2): 155-69; Ellmark et al. (2002), Mol. Immunol. 39(5-6); 349; O'Connell et al. (2002), J. Mol. Biol 321(1): 49-56; Huís et al. (2001), Cáncer Immunol. Immunother. 50: 163-71: Hudson y Souriau, supra; Adams y Schier (1999), J. Immunol. Methods 231(1-2): 249-60; Schmitz et al. (2000), Placenta 21 Suppl . A: S106-12. De manera alternativa, los fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab, los fragmentos F(ab')2 o los fragmentos Fv de hebra simple (los scFv) que se pueden unir específicamente a una proteína BTNL9 de la invención también están abarcados por lo que se quiere indicar en la presente como un anticuerpo anti-BTNL9. Véase Kuby, supra, pp. 1009-112 y Janeway et al., supra. para una discusión de fragmentos Fab y Fv. La invención también abarca anticuerpos antiidiotIpicos que se unen específicamente a anticuerpos que se unen específicamente a proteínas BTNL9 y que imitan los efectos de las proteínas BTNL9. Los anticuerpos antiidiotípicos encuentran los mismos usos que las proteínas BTNL9. Los métodos para generar anticuerpos antiidiotípicos son bien conocidos en el ámbito. Véase, por ejemplo Kuby et al., supra, en 371-72. Varias clases de anticuerpos biespecíficos recombinantes y no recombinantes que pueden unirse específicamente a una proteína BTNL9 de la invención y otra proteína también se contemplan. Diversas clases de anticuerpos biespecíficos y métodos para elaborarlos se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. 4,474,893; 6, 060, 285 y 6, 106, 833.

Los anticuerpos anti-BTNL9 pueden ser anticuerpos multiméricos que incluyen anticuerpos biespecíficos tetraméricos de longitud completa que contienen dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas o anticuerpos monovalentes multiméricos que contienen, por ejemplo, una cadena pesada más una cadena ligera más una región Fe. Los anticuerpos multiméricos pueden contener ciertas mutaciones en su región Fe que faciliten la formación de heterodímeros . Los anticuerpos y mutaciones se describen en la publicación de patente internacional No. solicitud internacional O 2009/089004 y en la solicitud de E.U.A. 2007/0105199, cuyas porciones las cuales describen a los anticuerpos y mutaciones se incorporan como referencia en la presente. Las regiones Fe en estos anticuerpos pueden tener secuencias humanas nativas o secuencias nativas de otras especies. De manera alternativa o adicional, las regiones Fe de los anticuerpos pueden contener mutaciones en sus regiones Fe que incrementan o disminuyen la función efectora al aumentar o disminuir la afinidad de diversos receptores Fe por la región Fe. Algunas de estas alteraciones Fe se describen en la patente de E.U.A. No. 5,457,035 y en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 93/10151, porciones relevantes de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Un anticuerpo puede contener únicamente una región variable de cadena pesada o ligera única, opcionalmente fusionado a otra porción de un anticuerpo como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. 2004/058820, de la cual las porciones que se describen estos anticuerpos de dominio único se incorporan en la presente como referencia.

Algunos anticuerpos que se encuentran de modo natural, los cuales se han encontrado en camellos y llamas son dímeros que consisten de dos cadenas pesadas y no incluyen cadenas ligeras. Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 : 26285-90 , de las cuales las porciones que describen las estructuras de estos anticuerpos se incorporan en la presente como referencia. Los anticuerpos anti-BTNL9 que tienen esta estructura están entre los anticuerpos BTNL9 de la invención.

Los anticuerpos anti-BTNL9 pueden tener una diversidad de actividades y usos. Los anticuerpos anti-BTNL9 pueden ser anticuerpos antagonistas que bloquean o inhiben la función biológica de BTNL9, por ejemplo al bloquear o antagonizar inhibición dependiente de BTNL9 de proliferación de linfocitos T, lo cual se puede analizar por los métodos descritos en los ejemplos en este documento. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos agonistas que se unen a la contraestructura de BTNL9 y que imitan la unión de BTNL9 para inhibir la activación o proliferación de linfocitos T. Los anticuerpos agonistas también pueden ser anticuerpos antiidiotípicos que se unen a anticuerpos anti-BTNL9 y que también se unen a la contraestructura BTNL9 y que imitan la actividad de BTNL9, es decir, inhiben la proliferación de linfocitos T como se describe en la presente. Los anticuerpos se pueden usar para los mismos usos que una proteína BTNL9. Los anticuerpos anti-BTNL9 pueden ser agonistas o antagonistas, por ejemplo, al estabilizar o romper la proteína BTNL9, posiblemente en combinación con otras proteínas, sobre la superficie celular. Por ejemplo, un anticuerpo agonista puede incrementar la actividad de BTNL9 al estabilizar la forma transmembrana1 de BTNL9 o al estabilizar la interacción de una proteína BTNL9 con otras proteínas BTNL9 o proteínas diferentes sobre la superficie, por ejemplo de linfocitos B u otros tipos de células. Además, un anticuerpo antagonista puede inhibir la actividad de BTNL9 al desestabilizar la forma transmembranal de BTNL9 o al desestabilizar interacciones entre moléculas múltiples de BTNL9 o interacciones de BTNL9 con otras proteínas sobre la superficie de la célula de, por ejemplo, linfocitos T u otros tipos de células. Los anticuerpos anti-BTNL9 agonistas también pueden unir formas transmembranales de BTNL9 provocando que transluzcan una señal biológica en una célula sobre la cual se expresa. Se puede utilizar un anticuerpo anti-BTNL9 antagonista para incrementar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los anticuerpos anti-BTNL9 antagonistas pueden encontrar uso, por ejemplo, en una vacuna, por ejemplo en una vacuna para inducir una respuesta a un antlgeno específico de cáncer.

Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar en análisis para detectar la presencia de proteínas, BTNL9 de la invención, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden utilizar en la purificación de proteínas BTNL9 de la invención por cromatografía de inmunoafinidad.

AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE POLIPEPTIDOS BTNL9 Además de los anticuerpos antagonistas o agonistas, se abarcan por la invención . otras moléculas relacionadas con anticuerpo que pueden unir específicamente proteínas BTNL9, tales como anticuerpos (Rónnmark et al. (2002), J. Immunol. Methods 261(1-2): 199-211, las porciones de la cual describen los anticuerpos se incorpora como referencia en la presente y los péptidos biológicamente activos descritos en la solicitud internacional WO 00/24782 (las porciones de la cual describen estos péptidos se incorporan en la presente como referencia) que pueden unirse específicamente a BTNL9 y que inhiben la actividad biológica de proteínas BTNL9. Además, los antagonistas de BTNL9 que incluyen a los ácidos nucleicos descritos en lo anterior que son útiles para modular la expresión de la proteína BTNL9 y/o AR m tal como, por ejemplo, los ARN de interferencia (o los ADN que los codifican) o los ARN o ADN antisentido.

Los antagonistas incluyen además proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan in vitro para unirse a BTNL9 o su receptor y que, opcionalmente, pueden interferir con la interacción de BTNL9 y su receptor. De manera alternativa, las proteínas pueden ser agonistas de BTNL9 que promueven o imitan la función biológica de BTNL9. Las proteínas que se unen a BTNL9 o su receptor pueden ser analizadas para determinar su capacidad para interferir con la interacción de BTNL9 con su receptor o, de manera alternativa, se puede diseñar una selección para obtener directamente estas proteínas.

Las proteínas se pueden seleccionar por varios métodos tales como, por ejemplo, presentación de fagos o presentación de la superficie de una bacteria. Véase, por ejemplo, Parmley y Smith (1989), Adv. Exp. Med. Biol . 251: 215-218; Luzzago et al. (1995), Biotechnol . Annu. Rev. 1: 149-83; Lu et al. (1995). Biotechnology (NY) 13(4): 366-372. En estos métodos, cada miembro de una biblioteca de dominios de unión se puede presentar sobre partículas de fago individuales o células bacterianas y las bacterias son fagos que se unen a una proteína de interés bajo condiciones escogidas se pueden seleccionar. Los ácidos nucleicos que codifican para los dominios de unión seleccionados se pueden obtener al hacer crecer el fago o bacteria seleccionado y al aislar los ácidos nucleicos de los mismos.

De modo alternativo, se puede seleccionar una proteína completamente in vitro. Por ejemplo, cada polipéptido individual en una biblioteca de dominios de unión potenciales se puede unir a ácidos nucleicos que los codifican y aquellos que se unen a la proteína de interés bajo condiciones seleccionadas se pueden escoger. Puesto que los polipéptidos se unen a ácidos nucleicos que los codifican, las operaciones subsecuentes tales como amplificación, clonación o secuenciado de ácidos nucleicos que codifican para dominios de unión efectivos se facilitan. En el ámbito se conocen diversos esquemas para estas selecciones que incluyen anticuerpo-ribosoraa-partículas de ARNm, presentación de ribosomas, fusión covalente de ARN-péptido o fusiones covalentes de ADN-ARN-péptido . He y Taussig (1997), Nucleic Acids . Res. 25(24): 5132-5134; Hanes y Pluckthun (1997), Proc . Nati. Acad. Sci. 94: 4937-4942; Roberts y Szostak (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 12297-12302; Lohse y Wright (2001), Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 4(2): 198-204; Kurz et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28(18): E83; Liu et al. (2000), Methods Enzymol . 318: 268-93; Nemoto et al. (1997), FEBS Lett. 414(2): 405-08; patente de E.U.A. 6,261,804; Solicitudes internacionales WO 00/32823; y O 00/34784. Las porciones de estas publicaciones que describen de que manera se pueden realizar estas selecciones se incorporan en la presente como referencia. Las proteínas se pueden seleccionar por antagonistas o agonistas.

USOS TERAPEUTICOS Se demuestra en la presente que una proteína de fusión BTNL9. Fe puede inhibir la proliferación de linfocitos T activados. BTNL9 también inhibe la producción de citocinas tales como IL-2, TNFOÍ, IFNy e IL-17 por linfocitos T activados. Se demuestra además por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) que BTNL9 se puede unir a linfocitos B y se puede unir en un grado limitado a linfocitos T. Estos hallazgos indican que BTNL9, o una molécula con la capacidad de agonizar la vía BTNL9 puede ser útil como una sustancia terapéutica para tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias que son mediadas por linfocitos T. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, asma, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, sarcoidosis y enfermedades fibróticas que incluyen aterosclerosis , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) , cirrosis, escleroderma, fibrosis por transplante de riñon y fibrosis pulmonar.

El hecho de que BTNL9 ejerce efectos sobre linfocitos T sin presentar unión robusta a linfocitos T (como se muestra en los ejemplos más adelante) se puede explicar de más de una manera. Es posible que la interacción de BTNL9 con su contraestructura sobre la superficie de los linfocitos T pueda ser de baja afinidad o de interacción de unión transitoria. Alternativamente, la molécula dímero de BTNL9-Fc que se ha utilizado para probar la unión a linfocitos T puede no ser el multímero correcto para unirse fuertemente a linfocitos T.

Las moléculas que bloquean o inhiben la vía BTNL9 pueden encontrar uso en ámbitos oncológicos . Un anticuerpo que se une ya sea a BTNL9 o su receptor y que puede bloquear o inhibir la interacción entre estas moléculas se puede utilizar como una sustancia terapéutica para tratar cáncer. También se pueden utilizar otros antagonistas de BTNL9 descritos en lo anterior. Algunos de los diversos cánceres que pueden ser tratados con un bloqueador de la vía BTNL9 incluyen leucemias aguda o crónica, linfoma, linfoma no hodgkiniano, enfermedad de Hodgkin, leucemias linfocíticas , linfornas linfocíticos o cutáneos, carcinomas, sarcomas, timomas, neoplasmas del mediastino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cánceres de las vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, diversas clases de cáncer cutáneo, cáncer de vejiga, gliomas malignos, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer del páncreas, neoplasmas hepatobiliares , cáncer del intestino delgado, colon o recto, cáncer del riñon o uréter, cáncer testicular, cáncer de la uretra o pene, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, sarcomas de hueso, cánceres del sistema endocrino, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, neoplasmas del sistema nervioso central y neoplasmas de células plasmáticas, entre muchos otros cánceres .

Como se indica en lo anterior, un antagonista de BTNL9 también puede encontrar uso como un agente para volver una vacuna más eficaz. Se puede utilizar BTNL9 con una vacuna para inducir una respuesta contra cualquier antígeno. Entre estos antígenos se encuentran antígenos que se expresan en gran medida sobre células de cáncer tales como células de los cánceres mencionados antes. Entre estos antígenos de cáncer se encuentran las siguientes proteínas humanas WTI, MUCI, LMP2 , EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE-A3 , NY-ESO-1, PSMA, GM2/GS2 sintasa, CEA, MLANA/MARTI , gplOO, survivina, antigeno específico de próstata (PSA, por sus siglas en inglés) transcriptasa inversa de telomerasa (hTERT) , puntos de ruptura de translocación de sarcoma, EPHA2, fosfatasa ácida prostática (PAP, por sus siglas en inglés) , melanoma inhibidor de apoptosis (ML-IAP) , a-fetoproteína (AFP, por sus siglas en inglés) , molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM, por sus siglas en inglés) , ERG, péptido NA17.A2 (VLPDVFIRC) , caja 3 pareada (PAX3), linfoma cinasa anaplásico (ALK, por sus siglas en inglés) , receptor de andrógeno, ciclina Bl, ácido polisiálico, proteína de unión a GTP relacionada con rho, RhoC, oncogen relacionado con mielocitomatosis viral v-myc (MYCN, por sus siglas en inglés), TRP-2, gangliósido GD3 , fucosil GM1 , mesotelina, antígeno de citoblastos de próstata (PSCA, por sus siglas en inglés), MAGE-A1, CYPIBI, PLACI, GM3 , BORIS, tetranectina (TN) , ETV6-AML1 (especialmente péptidos que incluyen el punto de ruptura), NY-BR-1, RGS5, SART3 , STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, precursor sp32 de proteína que une proacrosina (OY-TES-1) , proteína espermática 17 (Spl7) , antígeno asociado en melanoma de peso molecular alto (HMWMAA, también conocido como melanoma de proteoglucano de sulfato de condroitina) , AKAP-4, SSX2, XAGE-l, B7H3 (también conocido como CD276) , legumaina, TIE2, proteína 4 del gen asociado a próstata (PAGE-4, por sus siglas en inglés), receptor 2 de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) protamina 2 (también conocido como MAD-CT-1) , glomulina (también conocida como FAP) , PDGFR-ß, SSX2 , SSX5 , antígeno 1 relacionado a Fos, CD20, integrina a?ß3 , antígeno oncofetal 5T4, CA IX, CD5, CD19, CD22 (también conocido como Siglec-2) , CD30 (también conocido como TNFRSFI) , CD33 (también conocido como Siglec-3), CD40, CD44V6, CD55, CD56 (también conocido NCAM) , CTLA-4 (también conocido como CD152) , EGFR, GD2, HER2 , HLA-DR10 (MHC II), IGFIR, IL-6, sialil Lewis Y, TAG-72, TAL6 , TRAILR2 , VEGF, CD52 (también conocido como CAMPATH-1) , CD4, CD73, CA125 (también conocido MUC16) . CD66e, CD80 (también conocido como B7-1) , PDGFRP , antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, por sus siglas en inglés, también conocido como glutamato carboxipeptidasa 2, entre muchos otros nombres) . Los antígenos de cáncer también pueden incluir la proteína LMP2 del virus 4 de herpes humano, las proteínas E6 y E7 de papiloma virus humano y la glucoceramida globo H (como se describe en Gilewski et al. (2001), Proc . Nati. Acad. Sci. 98(6): 3270-3275, las porciones de las cuales que describen globo H se incorporan en la presente como referencia) , la subunidad a4 de las integrinas a4ß1 y a4ß7, la integrina a4ß7, BAFF, APRIL, CD2 , CD3 , CD20, CD52, CD73, CD80, CD86, la proteína de complemento C5, IgE, IL-?ß, IL-5, IL-6R, IL-12, IL-23 y el factor de necrosis tumoral (TNF OÍ, por sus siglas en inglés) .

El término "tratamiento" de cualquier enfermedad mencionada en la presente abarca el alivio de por lo menos un síntoma de la enfermedad, una reducción de la gravedad de la enfermedad o un retraso o prevención del progreso de la enfermedad a síntomas más graves que, en algunos casos, pueden acompañar a la enfermedad o pueden llevar a por lo menos otra enfermedad. El tratamiento no significa que la enfermedad se cure por completo. Un agente terapéutico útil necesita únicamente reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o su tratamiento o un retraso en el inicio de síntomas más graves o una enfermedad más grave que pueda presentarse con alguna frecuencia posterior a la condición tratada. Por ejemplo, si la enfermedad es enfermedad de intestino inflamatorio, un agente terapéutico debe reducir el número de sitios de inflamación distintos en el intestino, el grado total de intestino afectado, reducir el dolor y/o la inflamación, reducir los síntomas tales como diarrea, constipación o vómito y/o evitar la perforación del intestino. La condición de un paciente se puede determinar por técnicas estándar tales como rayos X realizados después de un enema con bario o enteroclisis , endoscopia, colonoscopia o una biopsia. Los procedimientos adecuados varían de acuerdo con la condición y síntomas del paciente.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un medicamento utilizado para tratar una enfermedad es una cantidad que puede reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados con enfermedad o su tratamiento o retrasar el inicio de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede presentarse con cierta frecuencia después de la condición tratada.

La invención abarca un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, asma, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, sarcoidosis, enfermedades fibróticas que incluyen aterosclerosis, cirrosis, escleroderma, lupus eritematoso sistémico y fibrosis pulmonar. El tratamiento involucra utilizar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína BTNL9 o un anticuerpo agonista que se une a BTNL9 o su receptor durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida sobre los valores iniciales de un indicador que refleja la gravedad de un trastorno particular o la gravedad de síntomas causados por el trastorno o un retraso o evitar el inicio de una enfermedad más grave que siga a la condición tratada en algunos o en todos los casos . Los tratamientos de la invención se pueden utilizar antes, después o durante otros tratamientos para el trastorno en cuestión que se utilizan habitualmente o que se pueden utilizar sin otros tratamientos. Por ejemplo, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa son tratados comúnmente con sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico o corticosteroides . Estos tratamientos pueden ser utilizados antes, durante o después de los tratamientos de la invención.

De manera similar, el cáncer con frecuencia es tratado cuando los agentes quimioterapéuticos tales agentes se pueden utilizar junto con sustancias terapéuticas antagonistas de BTNL9 tales como anticuerpos anti-BTNL9 descritos en la presente. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, las siguientes sustancias terapéuticas: agentes alquilantes (por ejemplo busulfano, temozolomida, ciclofosfamida, lomustina (CCNU) , metillomustina, estreptozotocina, cis-diamina-cloroplatino, aziridinilbenzoquinona, y tiotepa) , iones inorgánicos (por ejemplo cisplatino y carboplatino) ; mostazas nitrogenadas (por ejemplo clorhidrato de melfalano, ifosfamida, clorambucilo y clorhidrato de mecloretamina) ; nitrosoureas (por ejemplo, carmustina (BCNU) ) ; antibióticos anti-neoplásicos (por ejemplo, adriamicina (doxorrubicina) , daunomicina, mitomicina C, daunorrubicina, idarrubicina, mitramicina y bleomicina) ; derivados de plantas (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, vindesina, VP-16 y VM-26) ; antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato con o sin leucovorina, 5 - fluorouracilo con o sin leucovorina, 5-fluorodesoxiuridina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, gemcitabina y fludarabina) ; podofilotoxinas (por ejemplo, etopósido, irinotecano y topotecano) ; asi como actinomicina D, dacarbazina (DTIC) y mAMSA, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, L-asparaginasa y mitoxantrona entre muchos otros conocidos en el ámbito. Véase, por ejemplo, Cáncer: Principies and Practice of Oncology, cuarta edición, DeVita et al., eds . , J. B. Lippincott Co. , Phildelphia, PA (1993), cuyas porciones relevantes se incorporan en la presente como referencia.

Para condiciones autoinmunes o inflamatorias, se pueden extraer los linfocitos T de un paciente, por ejemplo mediante aféresis y se estimulan ex vivo utilizando BTNL9, opcionalmente con otras proteínas adicionales de manera que los linfocitos T alcancen un fenotipo regulador o inhibidor. Después los linfocitos T se pueden transferir de regreso al paciente. Para estimular a los linfocitos T a que adquieran un fenotipo regulador o inhibidor de pueden incubar en presencia de una superficie, por ejemplo, con esferas o en pozos de placa de microtitulación que están recubiertos con anticuerpo anti-CD3 agonista de linfocitos T humanos, rBTNL9.Fc y rB7-l.Fc o rB7-2.Fc en presencia de TGF-beta e IL-2. De manera alternativa, la superficie se puede recubrir con una combinación de proteínas que incluye rBTNL9 o BTNL9. Fe más un anticuerpo anti-CD3 agonista o una combinación que incluye solo estas proteínas. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD3 agonista, rBTNL9. Fe y rB7-l.Fc o rB7-2.Fc puede estar, por ejemplo, en una relación en peso molecular de 2:10:2.5. El TGF-beta y la IL-2 pueden estar a concentraciones apropiadas tales, como por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 a 5 ng/ml o a aproximadamente 0.09 o 0.1 ng/ml para TGF-beta y desde aproximadamente 0.5 a 10 ng/ml o en aproximadamente 10 ng/ml para IL-2. Esto puede programar a los linfocitos T para que se vuelvan inhibidores o reguladores . Los linfocitos T se pueden incubar en un ámbito tal para, por ejemplo, en tres a siete días y después se cosechan y se suministran de regreso al mismo paciente.

Opcionalmente, los linfocitos T se pueden incubar aproximadamente tres, cuatro, cinco, seis o siete días. En algunas modalidades, los linfocitos T también se pueden dejar en reposo, es decir, se pueden cultivar en presencia, por ejemplo, de IL-2 sin que el receptor de linfocitos T o los estímulos coestimuladores y después se reestimulan como se explica en lo anterior una o cuatro o más veces. Las condiciones autoinmunes o inflamatorias tratables con este régimen incluyen, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, asma, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, sarcoidosis y enfermedades fibróticas que incluyen aterosclerosis , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) , cirrosis, escleroderma, fibrosis de transplante hepático y fibrosis pulmonar.

Cualquiera de los agentes terapéuticos descritos en lo anterior se puede administrar en forma de una composición, es decir, con uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Por ejemplo, una composición puede comprender una proteína BTNL9 soluble como se describe en la presente más un amortiguador, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de peso molecular bajo (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos) , una proteína, aminoácidos, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y/u otros estabilizantes, excipientes y/o conservadores. La composición se puede formular como un líquido o como un liofilizado. Los ejemplos adicionales de componentes que se pueden utilizar en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceutical Sciences, décima sexta edición, Mack Publishing Comapny, Easton, Pa. , (1980) , las porciones relevantes de la cual se incorporan en la presente como referencia .

Las composiciones que comprenden moléculas terapéuticas descritas en lo anterior se pueden administrar por cualquier medio apropiado que incluye, pero que no se limita a las vías parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, rectal o pulmonar (por inhalación) . Si se inyectan, una o varias de las composiciones se pueden administrar por vía intraarticular, intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección en bolo o por infusión continua. Se contempla la administración localizada, es decir, en el sitio de enfermedad así como el suministro transdérmico y la liberación sostenida a partir de implantes, parches cutáneos o supositorios. El suministro por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal o bucal, el uso de un nebulizador, inhalación en forma de aerosoles y similares. La administración por medio de un supositorio insertado en una cavidad corporal también se lleva a cabo, por ejemplo al insertar una forma sólida de la composición en una cavidad corporal seleccionada y al permitir que se disuelva. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos, preparaciones orales tales como pildoras, grageas, jarabes y goma masticable y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, aspersiones y ungüentos. En la mayor parte de los casos las moléculas terapéuticas son los polipéptidos que se pueden administrar tópicamente o por inyección o inhalación.

Las moléculas terapéuticas descritas en lo anterior se pueden administrar en cualquier dosificación, frecuencia y duración que pueda ser eficaz para tratar la condición que es tratada. La dosificación depende de la naturaleza molecular de la molécula terapéutica y la naturaleza del trastorno que es tratado. El tratamiento puede continuar en la medida en que sea necesario para obtener los resultados deseados. La periodicidad del tratamiento puede o no ser constante durante la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento inicialmente puede llevarse a cabo a intervalos semanales y posteriormente se lleva a cabo una semana sí y otra no. Los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas y meses o años están incluidos dentro de la invención. El tratamiento se puede suspender y después se puede reiniciar. Se pueden administrar dosis de mantenimiento después de un tratamiento inicial .

La dosificación se puede medir utilizando como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie cutánea (mg/m2) o como una dosis fija, sin importar la altura o el peso. Estas son unidades de dosificación estándar en el ámbito. El área superficial de la piel de una persona se calcula a partir de su altura y peso utilizando una fórmula estándar. Por ejemplo, una proteína BTNL9 terapéutica o un anticuerpo que se une a BTNL9 o su receptor se pueden administrar a una dosis desde aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o desde aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1.0 mg/kg. De manera alternativa, se puede administrar una dosis desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg. O se puede administrar una dosis de aproximadamente 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55, 60 mg, 100 mg, 200 mg o 300 mg.

La invención se describe en lo siguiente con referencia a ejemplos específicos. Estos ejemplos de ninguna manera limitan la invención de modo alguno. Se entiende, para propósitos de esta descripción que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones a la invención que se encuentren dentro del ámbito de la invención. Numerosos otros cambios se pueden realizar los cuales se sugerirán fácilmente por sí mismos a los expertos en el ámbito y los cuales están adaptados dentro del espíritu de la invención descrita en la presente y como se define en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: EXPRESION DE ARNm QUE CODIFICA PARA PROTEINA BTNL9 HUMANA EN CELULAS INMUNITARIAS HUMANAS Y TEJIDOS HUMANOS ADULTOS Los siguientes experimentos se realizaron con el fin de obtener información sobre la expresión de ARNm que codifica para BTNL9 humana en células inmunitarias humanas primarias y en diversos tejidos.

Las células inmunitarias primarias se aislan de sangre completa o paquetes leucocíticos por medio de varios métodos de selección disponibles comercialmente de Stem Cell Sciences (Palo Alto, California) o Miltenyi Biotech (Alemania) . Por ejemplo, el kit de enriquecimiento de linfocitos T humanos EASYSEPMR, en combinación con el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ (ambos de Stem Cell Sciences) se utilizaron para aislar linfocitos T CD4+ mientras que los monocitos se aislaron utilizando el kit de aislamiento de monocitos II Miltenyi. Las preparaciones celulares utilizando los reactivos disponibles comercialmente son habituales en el ámbito. Se obtienen macrófagos mediante la modulación ex vivo de monocitos seleccionados negativamente durante 7 días. Cada población de células aisladas se analizó por clasificación de célula activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) para determinar si la población de células aisladas expresa las proteínas de superficie celular que se esperan. Se aisló ARN y se determinó por el arreglo Affymetrix (Affymetrix GENECHIPMR HG-U1333 Plus 2.0). La normalización y análisis de datos para la detección de transcripto BTNL9 humana se realizó utilizando el programa ROSETTA RESOLVERMR (Rosetta Biosoftware, Cambridge, MA, USA) . Los resultados de estos análisis se muestran en la figura 2.

Entre los diversos tipos de células probados, las células que expresan CD19 sobre sus superficies celulares (carril 6 en la figura 2) , es decir, los linfocitos B, expresan las cantidades más altas de BTNL9.

La expresión de BTNL9 humana en tejidos humanos adultos se determinó por análisis de microarreglo utilizando el arreglo Affymetrix GENECHIPMR Human Genome 133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Los resultados de este análisis se muestran en la figura 3. Estos datos indican que BTNL9 humana se expresa ampliamente en muchos tejidos diferentes. Entre los tejidos que presentan la expresión de ARNm para BTNL9 más alta están aquellos de las siguientes estructuras físicas: glándulas suprerrenales (carril 1 de la figura 3), colon (carril 9 de la figura 3) , corazón (carril 11 de la figura 3), pulmón (carril 19 de la figura 3), bazo (carril 26 de la figura 3), timo (carril 28 de la figura 3) y tejido adiposo blanco (carril 29 de la figura 3) .

EJEMPLO 2: PREPARACION DE BTNL9. Fe HUMANA Y BTNL2. Fe DE RATON Lo siguiente describe de que manera se elaboró una proteína de fusión que contiene la región extracelular de BTNL9 humana y la porción Fe de un anticuerpo IgGl humano. Se construye un ADNc en un vector apropiado que codifica para el dominio extracelular de BTNL9 humana fusionada a un enlazante más el fragmento Fe de IgGl humana. La SEC ID NO: 18 proporciona la secuencia para este ADNc y la SEC ID NO: 19 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína BTNL9. Fe codifica por este ADNc. Se transfectan células Cos PKB con la construcción de expresión en mamífero BTNL9. Fe utilizando LIPOFECTAMINEMR 2000 (Invitrogen) y se cultiva en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) completo con suero bajo en Ig, 0.5%. Estos métodos se describen detalladamente en Ettehadieh et al., OVEREXPRESSION OF PROTEIN KINASE BA ENHANCES RECOMBINA T PROTEIN EXPRESSION IN TRANSIENT SYSTEMS in Animal Cell Technology: from Target to arket: Proceedings of the 17th ESACT Meeting, Tylósand, Sweden, June 10-14, 2001, Vol. 1, Lindner-Olsson et al., eds . , pp. 31-35, Springer, 2001. Las porciones de esta referencia que describen como elaborar una proteína recombinante se incorporan en la presente como referencia. Siete días después de la transfección se cosechan los sobrenadantes y la proteína BTNL9. Fe se purifica por cromatografía en columna en porteína A (MABSELECTMR SuRe column, GE Healthcare) .

Una proteína BTNL2. Fe de ratón se elabora esencialmente como se describe en la patente de E.U.A. 7,244,822, en donde esta construcción se denomina BTL-II:Fc. Esta proteína contiene la región extracelular de la proteína BTNL2 de ratón fusionada a una región Fe de IgGl humana. Las porciones de la patente de E.U.A. 7,244,822 que describen esta construcción se incorporan como referencia en la presente. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína BTNL2.Fc de ratón y la secuencia de aminoácidos de la proteína BTNL2. Fe se reportan en las SEC ID NOS: 20 y 21 de la patente de E.U.A. 7,244,822, respectivamente.

EJEMPLO 3: ANALISIS IN VITRO DE PROLIFERACION DE LINFOCITOS T CD4+ MURINOS El siguiente experimento se realiza para determinar los efectos de la proteína de fusión BTNL9 : Fe humana sobre linfocitos T CD4+ de ratón in vi tro.

Se utilizó una suspensión de esplenocitos de células solas, la cual se preparó a partir de bazos recolectados de por lo menos cinco ratones C57B1/6 hembra para purificar linfocitos T CD4+ con el kit de selección negativa EASYSEPMR CD4+ de ratón (Stem Cell Sciences) . La pureza de linfocitos T CD4+ es mayor de 90% determinado por análisis FACS . Se recubrieron placas de microtitulación tratadas con cultivo de tejido con concentraciones variables de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Clone2Cll, BD Biosciences Pharmingen, san Diego, CA, USA) y 10 µg/ml de anticuerpo de chivo anti-Fc humano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) en PBS a 4°C durante la noche. Los pozos después se lavaron con PBS y se recubrieron con la cantidad especificada de la proteína de fusión Fe indicada durante 4 horas a temperatura ambiente . Los pozos se lavaron nuevamente con PBS y después se agregaron 1-2 x 105 esplenocitos CD4+ purificados/pozo. La proliferación de los linfocitos T CD4+ se determinó por incorporación de 3H-timidina (1 µ??/????) durante las últimas 6 horas de un cultivo de 72 horas. El fragmento Fe de una preparación de IgG humana se utilizó como un control negativo. Como controles positivos también se incluyeron BTNL2. Fe de ratón, el cual previamente se ha demostrado que inhibe la proliferación de linfocitos T y B7-2-Fc humano (adquirido de R & D Biosystems) , un coestimulador positivo conocido de linfocitos T.

Los resultados se muestran en la figura 4. Los carriles 1 y 2 de la figura 4 representan análisis de control negativos que contienen 10 µg/ml y 2 µg/ml, respectivamente de fragmento Fe de una preparación de IgG humana, el carril 3 muestra resultados de un análisis de control positivo que contiene proteína B7-2-Fc humana. El carril 4 muestra los resultados de un análisis que contiene BTNL2. Fe de ratón, una molécula coestimuladora negativa. Los carriles 5 y 6 muestran los resultados para análisis que contienen 10 µg/ml y 2 µg/ml de BTNL9.Fc humana, respectivamente. Estos datos confirman el efecto estimulador de B7-2-FC humana y el efecto inhibidor de BTNL2. Fe de ratón en la proliferación de linfocitos T de ratón e indican que BTNL9. Fe humana puede inhibir la proliferación de linfocitos T de ratón.

EJEMPLO 4: ANALISIS IN VITRO DE PROLIFERACION DE LINFOCITOS T CD4+ El siguiente experimento se realizó para determinar los efectos de la proteína de fusión BTNL9 : Fe humana sobre la proliferación de linfocitos T CD4+ humanos in vi tro.

Se purificaron linfocitos T humanos de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ humanos II (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania, Catálogo #130-091-155) lo que resulta en una población de células que contienen >90% de células CD4+. Al igual que los análisis de proliferación CD4+ en ratón, las placas de microtitulación tratadas con cultivo de tejido se recubrieron previamente con concentraciones variables de mAb anti-CD3 (0KT3) y 10 µg/ml de anticuerpo de chivo anti-Fc humano (Jackson ImmunoResearch) en PBS a 4°C durante la noche. Los pozos después se lavaron con PBS y se recubrieron con la cantidad especificada de proteína Fe indicada durante 4 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron nuevamente con PBS y después se agregaron 1-2 x 105 linfocitos T CD4+ humanos purificados/pozo. Se determinó la proliferación de linfocitos T CD4+ por incorporación de 3H-timidina (1 µ??/????) durante por lo menos 6 horas del cultivo de 72 horas. Se utilizó la proteína Fe, p7.5Fc, como un control negativo dado que no se une a células CD4+ humanas y no tiene un efecto conocido sobre la proliferación de linfocitos T. Se incluyó como un control positivo a BTNL2 -Fe de ratón. Las células expuestas a anticuerpo anti-CD3 (0KT3) únicamente también se incluyeron como un control adicional.

Los resultados se muestran en la figura 5. El carril 1 muestra los resultados de un análisis que contiene anticuerpo anti-CD3 y sin proteína adicional. Los carriles 2 y 3 muestran los resultados de análisis que contienen anticuerpo anti-CD3 más la proteína de control negativo p7.5-Fc en concentraciones de 10 µ9/??1 y 2.5 µg/ml, respectivamente. Los carriles 4-7 muestran los resultados de análisis que contienen anticuerpo anti-CD3 más BTNL9.FC humana en concentraciones de 20, 10, 5 y 2.5 µ /p?1, respectivamente. El carril 8 muestra los resultados de un análisis que contiene anticuerpo anti-CD3 y BTNL2. Fe de ratón en una concentración de 10 µ9/p?1. Estos datos muestran que BTNL9. Fe humana inhibe la proliferación de linfocitos T humanos de una manera que depende de la concentración.

EJEMPLO 5: PRODUCCION DE CITOCINAS POR LINFOCITOS T HUMANOS ACTIVADOS En un análisis de proliferación anti-CD3 estándar, como se describe en lo anterior, se aislaron linfocitos T CD4+ humanos y se estimularon con anticuerpo anti-CD3, con o sin BTNL9. Fe (a una concentración que previamente se ha demostrado que inhibe la proliferación de linfocitos T) o diversas otras proteínas que contienen Fe. Después de 72 horas de estimulación se cosechan 100 µ? de sobrenadante de cada condición. Los sobrenadantes después se analizaron para concentraciones de citocina utilizando un kit disponible comercialmente adaptado, para detectar simultáneamente citocinas múltiples (IL2, IL4 , IL5 , IL10, IL13, IL17, GM-CSF, TNFa, IFNy e ILip) vendido por Meso Scale Discovery of Gaithersburg, Maryland. Los análisis de kit en principio son similares a los análisis de ELISA pero utilizan tecnología de detección multiplexada .

La figura 6A a la figura 6E muestran las concentraciones de interleucina-2- (figura 6A) , factor a de necrosis tumoral (figura 6B) , interferón-? (figura 6C) , interleucina 17 (figura 6D) e interleucina 13 (figura 6E) que se detectaron. Los carriles 1-7 en todos las figuras representa los resultados de análisis que contienen los siguientes ingredientes: (1) células sin anticuerpo anti-CD3 o alguna proteína adicional; (2) células con únicamente anticuerpo anti-CD3; (3) - (5) células con anticuerpo anti-CD3 más una preparación de IgG humana, p7.5-Fc o HB15-FC, respectivamente; (6) células con anticuerpo anti-CD3 y BTNL2. Fe de ratón; y (7) células con anticuerpo anti-CD3 y BTNL9. Fe . Al igual que BTNL2. Fe de ratón, BTNL9-FC inhibe la expresión de interleucina 17, interleucina 2, factor a de necrosis tumoral a interferón ? pero no interleucina 13 por los linfocitos T CD4+ humanos en respuesta a la estimulación por un anticuerpo anti-CD3.

EJEMPLO 6: ESTUDIOS DE UNION DE CELULAS El siguiente experimento se realizó para determinar a cuales tipos de células específicas se une BTNL9. Se generaron suspensiones de células solas de esplenocitos de ratón después se activaron con 2 µg/ml de anticuerpo anti-CD3 (2C11-ratón; 0KT3 -humano) , conconavalina A (Con A) o lipopolisacárido (LPS) bacteriano durante 48 horas. También se incluyeron como controles células no estimuladas. Las células no estimuladas y las estimuladas se tiñeron durante 60 minutos en hielo con huBTNL9. Fe o proteínas control que contienen Fe. Después de un lavado, la proteína Fe unida se detectó con anticuerpo de chivo anti-Fc humano F(ab' )2 conjugado a ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch) , utilizando FACS. Además, estas células teñidas se sometieron a tinción conjunta con CD3 o CD19 (BD Biosciences) conjugado con aloficocianina (APC) para identificar específicamente linfocitos T y linfocitos B, respectivamente, en las poblaciones de células mixtas. Las células se fijaron y se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCALIBURMR (BD Immunocytometry Systems, San José, CA, USA) .

Los datos resultantes indican que BTNL9. Fe se une a linfocitos B de ratón estimulados con LPS pero no a linfocitos B de ratón no estimulados. Datos no mostrados. Datos adicionales indican que BTNL9. Fe se une a linfocitos T de ratón estimulados únicamente en un grado limitado y no se unen de modo detectable a linfocitos T de ratón no estimulados. Esto puede indicar que la interacción de BTNL9 con los linfocitos T es transitoria y/o de baja afinidad, y por lo tanto por debajo del nivel de detección de nuestro análisis FACS .

EJEMPLO 7: LA INHIBICION DE LA PROLIFERACION DE LINFOCITOS T HUMANOS NO SE DEBE A MUERTE CELULAR Se realizó el siguiente experimento para determinar si la inhibición de la proliferación de linfocitos T humanos activados, por BTNL9. Fe , se debe a muerte celular. Se utilizó un análisis para detectar liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) posterior a estimulación con anticuerpo anti-CD3 de linfocitos T CD4+ humanos en presencia o ausencia de BTNL9. Fe o proteínas control, para detectar citotoxicidad. LDH es una enzima citoplásmica estable que es liberada al sobrenadante cuando se produce daño a la membrana plasmática y muerte celular. Se detectó LDH por medio de una reacción colorimétrica después de estimulación durante 72 horas según las instrucciones del fabricante (LDH Cytotoxicity Detection Kit, Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA) . Las células lisadas con Triton-X se utilizaron como control positivo para liberación máxima de LDH debido a muerte celular. Se utilizaron los mismos pozos de análisis experimental para detectar inhibición de proliferación de células y liberación de LDH.

La figura 7A y la figura 7B muestran los resultados de los análisis de LDH y de proliferación, respectivamente. La muestra representada en cada carril de la figura 7A y la figura 7B se describe detalladamente en la descripción breve de estas figuras en lo anterior. Estos datos indican que ni BTNL2.FC ni BTNL9. Fe provocan efectos citotóxicos a concentraciones que son suficientes para inhibir proliferación de linfocitos T estimulada por anti-CD3. De esta manera, estos datos sugieren que la inhibición de proliferación de células por estas proteínas no está acompañada por muerte celular.

EJEMPLO 8: EXPRESION ELEVADA DE BTNL9 EN TEJIDO DE COLON DE PACIENTES CON LA ENFERMEDAD DE INTESTINO INFLAMATORIO Se realizó el siguiente experimento con el fin de determinar si BTNL9 se expresa en exceso o de modo insuficiente en tejido de colon de donadores con enfermedad de intestino inflamatorio (enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa) en comparación con tejido de colon normal. Se midió la expresión de BTNL9 humana mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRIS MR 7900HT (Applied Biosystems Inc. Foster City, CA, USA) en tejidos de colon de donadores sin enfermedad de intestino inflamatorio y de donadores ya sea con colitis ulcerativa o con enfermedad de Crohn. La cantidad de expresión de ARNm para BTNL9 detectada se normalizó a la expresión del gen constitutivo (ß-actina) . Para generar ADNc, una cantidad de 20 ng de ADN total tratado con desoxiribonucleasa (libre de ADN, Ambion) de tejido enfermo o normal se sometió a transcripción inversa utilizando el kit de transcripción inversa TAQMAN"11 (Applied Biosystems Inc.) . Este ADNc se utilizó como plantilla en RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando amortiguador universal TAQMAN" (Applied Biosystems Inc.) y el conjunto de sondas huBTNL9 (adquirida de Applied Biosystems; conjunto de sondas Hs_00537320_ml) . Las condiciones de PCR son 50°C durante 2 minutos, después 95°C durante 10 minutos, posteriormente 40 ciclos bajo el siguiente régimen de temperatura: 95°C durante 15 segundos seguido por 60°C durante 1 minuto. Cada reacción de PCR se llevó a cabo por triplicado para cada muestra biológica incluida en el estudio.

Los resultados se muestran en al figura 8. Cada punto en la figura 8 representa datos de un donador. La expresión de ARNm para BTNL9 humano general en tejido de colon extirpado quirúrgicamente de donadores ya sea con colitis ulcerativa (UC, por sus siglas en inglés) o con enfermedad de Crohn (Crohns) es mayor que el tejido de colon de donadores sin enfermedad de intestino inflamatorio. La diferencia en la expresión entre tejido normal y enfermo es estadísticamente significativa en tejido tanto de UC como Crohns. Estos datos indican que el ARNm para BTNL9 se expresa a niveles mayores a los normales en donadores con ya sea colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, las dos enfermedades de intestino inflamatorio más prevalente . Estos hallazgos sugieren la posibilidad de que BTNL9 puede jugar un papel en mediar una respuesta a estas enfermedades.

EJEMPLO 9: EFECTO DEL ESTADO DE AGREGACION DE BTNL9 SOBRE SU INHIBICION DE PROLIFERACION DE LINFOCITOS T El propósito de esta experimento es determinar si el estado de agregación de BTNL9. Fe juega un papel en su capacidad para inhibir la proliferación de linfocitos T. Se obtuvieron como sigue fracciones purificadas de BTNL9. Fe en estados variables de agregación. BTNL9.Fc, el cual se obtiene de un sobrenadante de cultivo de células de mamífero que la expresan, se purificó por cromatografía en proteína A. De manera más específica, se cargó BTNL9. Fe sobre una columna de proteína A en Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4. La columna se lavó con Tris 25 mM, L-arginina 0.5 M, pH 7.5 seguido por Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4. La proteína BTNL9. Fe se eluye con citrato de sodio 50 mM, L-arginina 1 M, pH 3.5 y se titula a pH neutro con Tris 1 M, pH 8.0. Se purifica adicionalmente BTNL9. Fe por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) realizada en NaCl 154 mM, KH2P04 3.89 mM, Na2HP04 12 mM, pH 7.2 (PBS) . Cada fracción individual se analizó por SEC analítica y después se acumuló de manera conservadora junto en tres fracciones. Las fracciones acumuladas se concentraron y se formularon en PBS con EDTA 50 µ? y se analizaron por SEC analítica, los resultados de los cuales se muestran en al figura 9.

La fracción 1 acumulada muestra un pico único en SEC analítica que tiene un peso molecular de aproximadamente 958,000 daltones. De esta manera, la fracción 1 contiene casi la totalidad de las especies altamente agregadas. La fracción 2 acumulada contiene una mezcla aproximadamente 50:50 de dos clases de tamaño de moléculas, que presentan dos picos principales en SEC analítica que tienen pesos moleculares de aproximadamente 903,000 daltones y 531,000 daltones. De esta manera, la fracción 2 contiene una mezcla de especies altamente agregadas y especies agregadas de tamaño moderado. Más de 80% de la fracción 3 consiste de especies más pequeñas. El pico SEC principal de la fracción 3 tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 197,000 daltones. Estas especies pueden ser un dímero, o como máximo un trímero, puesto que el tamaño de BTNL9. Fe , determinado en un gel de poliacrilamida realizado bajo condiciones reductoras es de aproximadamente 65,000 daltones. Datos no mostrados. Este tamaño corresponde aproximadamente al peso molecular esperado para un monómero de BTNL9.Fc con cierta glucosilación. Las especies de aproximadamente 531,000 daltones en la fracción 2 pueden contener octámeros dado que es aproximadamente ocho veces el tamaño del monómero. Las especies de más de 900,000 daltones presentes en las fracciones 2 y 3 son multímeros de orden superior, posiblemente de 14 unidades.

Estas fracciones purificada de BTNL9. Fe se utilizan en análisis de proliferación de linfocitos T CD4+ de ratón y humanos, realizados como se describe en lo anterior. Los resultados de estos experimentos se muestran en al figura 10 (linfocitos T de ratón) y en la figura 11 (linfocitos T humanos) . Los resultados muestran que las fracciones 1 y 2 de BTNL9.Fc presentan inhibición estadísticamente significativa (en relación a los controles) tanto de la proliferación de linfocitos T de ratón como de humano. La fracción 1 es de alguna manera más eficaz en ambos análisis en comparación con la fracción 2, aunque la significancia estadística de esta diferencia no se determinó. Por otra parte, la fracción 3 de BTNL9. Fe no muestra inhibición de proliferación de linfocitos T tanto de ratón como de humano. De este modo, estos datos indican que los agregados de orden superior son más eficaces para inhibir la proliferación de linfocitos T en comparación con las especies más pequeñas tales como los dímeros o trímeros. En base en la identificación tentativa de las especies principales en la fracción 3 como un dímero, estos datos indican que se requiere por lo menos un trímero de BTNL9. Fe para inhibir la proliferación de linfocitos T, aunque se puede requerir un multímero de orden superior tal como por lo menos un tetrámero o pentámero. Otra manera de observar estos datos es que una especie de por lo menos ocho veces el peso molecular de una especie monomérica de una proteína BTNL9 puede inhibir efectivamente la proliferación de linfocitos T, mientras que una especie que es aproximadamente tres veces el peso molecular de una especie monomérica de la proteína BTNL9 no puede.

EJEMPLO 10: LOCALIZACION DE BTNL9 EN EL ENDOTELIO CAPILAR EN EL BAZO Se realizó el siguiente experimento para determinar si BTNL9 se expresa en tejido vascular en el bazo. Se fijó tejido de bazo humano congelado utilizando acetona 75%/etanol 25% y se tiñó en combinación con anticuerpos específicos para BTNL9 humano y CD31 humano. CD31 se expresa de manera preferencial en el endotelio vascular. Después de incubación y lavado, se agregaron anticuerpos secundarios al tejido para detección vía inmunofluorescencia. Después de un lavado final las secciones se tiñeron con DAPI y se generaron imágenes. La localización conjunta de BTNL9 y tinción con CD31 demuestra la expresión de BTNL9 en endotelio capilar en el bazo. El bazo también contiene células BTNL9+/CD31" que tiñen débilmente. Por lo tanto, estos resultados indican que BTNL9 se expresa en tejido tanto vascular como no vascular en el bazo .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para, llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína BTNL9 multimérica soluble aislada, caracterizada porque comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de los incisos (a) y (b) con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, en donde el multímero es por lo menos un trímero, y en donde la proteína BTNL9 multimérica puede inhibir la proliferación de linfocitos T estimulados por un anticuerpo anti-CD3.

2. Una proteína BTNL9 multimérica soluble aislada, caracterizada porque comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 y (b) un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de los incisos (a) y (b) con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, en donde el multímero tiene un peso molecular mayor de aproximadamente tres veces tan grande como la del polipéptido del inciso (a) , y en donde la proteína BTNL9 multimérica puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

3. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los polipéptidos de los incisos (a) y (b) son por lo menos 95% idénticos a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

4. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los polipéptidos de los incisos (a) y (b) son por lo menos 97% idénticos a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

5. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los polipéptidos de los incisos (a) y (b) comprenden la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

6. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque no comprende a los aminoácidos 258 a 277 de la SEC ID NO : 2.

7. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque los polipéptidos de los incisos (a) y (b) comprenden cada uno otro polipéptido.

8. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el otro polipéptido es una porción Fe de un anticuerpo.

9. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: (i) la porción Fe comprende la secuencia de aminoácidos de una región Fe humana nativa, o (ii) la porción Fe comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un máximo de 15 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa .

10. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la porción Fe de (ii) tiene un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácidos único en relación a la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa.

11. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la porción Fe de (ii) tiene un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa.

12. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada porque la porción Fe puede unirse al receptor Fe neonatal (FcRn) humano.

13. La. proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la región Fe humana nativa.

14. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgGl.

15. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgG2.

16. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgG4.

17. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque es un homotetrámero o homomultímero de orden superior.

18. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es un homomultímero es cual es de un orden superior que un homotetrámero .

19. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque es un heteromultímero.

20. La proteína BTNL9 multimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque la proteína BTNL9 multimérica tiene un peso molecular por lo menos aproximadamente 8 veces tan grande como el peso molecular de un polipéptido monomérico que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido monomérico con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos.

21. Una proteína de fusión BTNL9, caracterizada porque comprende : (a) un primer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión BTNL9 con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, y (b) un segundo polipéptido, en donde la proteína de fusión BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

22. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el segundo polipéptido es una porción Fe de un anticuerpo.

23. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la porción Fe tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un máximo de 15 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a una región Fe humana nativa.

24. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la porción Fe tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la región Fe humana nativa.

25. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la porción Fe tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la región Fe humana nativa.

26. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque la porción Fe se puede unir a FcRn.

27. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende la región Fe humana nativa.

28. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgGl.

29. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgG2.

30. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque la región Fe humana nativa es del isotipo IgG4.

31. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, caracterizada porque el primer polipéptido es por lo menos 95% idéntico a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

32. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el primer polipéptido comprende los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

33. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente similar a la SEC ID NO: 19, en donde la secuencia de aminoácidos comprende un máximo de 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 19.

34. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque comprende un máximo de 15 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 19.

35. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 19.

36. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque comprende un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la SEC ID NO: 19.

37. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos comprende la SEC ID NO: 19.

38. La proteína de fusión BTNL9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 37, caracterizada porque la proteína de fusión se agrega de manera que su peso molecular es por lo menos aproximadamente ocho veces el peso molecular de una especie monomérica de la proteína de fusión BTNL9.

39. Una proteína BTNL9 soluble caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 40-140 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a los aminoácidos 40-140 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 tampoco comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 160 a 248 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones o un aminoácido único en relación a los aminoácidos 160 a 248 de la SEC ID NO: 2, y en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

40. Una proteína BTNL9 soluble caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 160 a 248 de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a los aminoácidos 160 a 248 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 tampoco comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la SEC ID NO: 2 que se extiende desde la posición 40 a 140 de la SEC ID .NO: 2 0 una variante de la misma que comprende un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a los aminoácidos 40 a 140 de la SEC ID NO: 2, y en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

41. Una proteína de fusión BTNL9 codificada por un ácido nucleico, caracterizada porque el ácido nucleico comprende : (a) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido, en donde el polinucleótido (i) consiste de la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 334 a 1002 de la SEC ID NO: 1; o (ii) hibridiza bajo condiciones rigurosas con el polinucleótido del inciso (i) ,- y (b) un polinucleótido que no hibridiza con un polinucleótido que consiste de la secuencia de la SEC ID NO: 1 y que codifica para un polipéptido en marco con el polipéptido codificado por el polinucleótido del inciso (a) ; en donde la proteína de fusión puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

42. La proteína BTNL9 multimérica, la proteína de fusión BTNL9 o la proteína BTNL9 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, caracterizada porque comprende una secuencia enlazante.

43. La proteína BTNL9 multimérica, la proteína de fusión BTNL9 o la proteína BTNL9 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 16, 19 a 37 y 39 a 42, caracterizada porque la proteína se agrega de manera que el peso molecular de la proteína agregada es mayor de aproximadamente tres veces el peso molecular de una especie monomérica de la proteína.

44. La proteína BTNL9 multimérica, la proteína de fusión BTNL9, o la proteína BTNL9 soluble, de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la proteína se agrega de manera que el peso molecular de la proteína agregada es por lo menos aproximadamente ocho veces el peso molecular de una especie monomérica de la proteína.

45. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica para la proteína BTNL9 multimérica, la proteína de fusión BTNL9 o la proteína BTNL9 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44.

46. Un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que comprende una proteína BTNL9 y otro polipéptido, caracterizado porque comprende: (a) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido, en donde el polinucleótido (i) consiste de la secuencia nucleotídica de los nucleótidos 334 a 1002 de la SEC ID NO: 1; o (ii) hibridiza bajo condiciones rigurosas con el polinucleótido del inciso (i) ; y (b) un polinucleótido que no hibridiza con un polinucleótido que consiste de la secuencia de la SEC ID NO: 1 y que codifica para un polipéptido en marco con el polipéptido codificado por el polinucleótido del inciso (a) ; en donde la proteína de fusión puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

47. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 45 ó 46.

48. Una célula hospedadora caracterizada porque contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 45 ó 46 o el vector de conformidad con la reivindicación 45.

49. Un método para elaborar una proteína BTNL9 , caracterizado porque comprende: cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 48 en un medio bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico, y recuperar la proteína expresada de las células o del medio de cultivo.

50. Un método de tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria caracterizado porque comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de una proteína BTNL9 que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, (b) una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, o (c) una secuencia de aminoácidos que es no mayor de 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácido 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la enfermedad autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, una enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis, sarcoidosis, asma o una enfermedad fibrótica.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad autoinmune o inflamatoria es enfermedad de Crohn.

53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad autoinmune o inflamatoria es colitis ulcerativa.

5 . El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad autoinmune o inflamatoria es una enfermedad fibrótica.

55. Un método de inhibir la proliferación de linfocitos T caracterizado porque comprende agregar a los linfocitos T una proteína BTNL9 que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, (b) una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 es de una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, o (c) una secuencia de aminoácidos que es no mayor de 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácido 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la inhibición se produce in vitro.

57. Un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria caracterizado porqueque comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-BTNL9, en donde el anticuerpo anti-BTNL9 incrementa la inhibición de proliferación de un linfocito T por una proteína BTNL9 que comprende la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, y en donde el anticuerpo anti-BTNL9 se une a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2.

58. Un método para tratar a un paciente con cáncer caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une a una proteína BTNL9 que consiste de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemias agudas o crónicas, linfoma, linfoma no Hodgkiniano, enfermedda de Hodgkin, leucemias linfocíticas, linfornas linfocíticos o cutáneos, carcinomas, sarcomas, timomas, neoplasmas del mediastino, cáncer de mama, cáncer de próstata, canceres de las vías respiratorias y digestivas altas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón amicrócitico, cáncer de pulmón micrócitico, diversas clases de cáncer cutáneo, cáncer de la vejiga, gliomas malignos, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer del páncreas, neoplasmas hepatobiliares, cáncer del intestino delgado, colon o recto, cáncer del riñon o uréter, cáncer testicular, cáncer de la uretra o pene, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, sarcomas de hueso, canceres del sistema endocrino, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, neoplasmas del sistema nervioso central t neoplasmas de células plasmáticas.

60. El método de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo antagonista.

61. Un método para vacunar a un paciente contra un cáncer caracterizado porque comprende administrar al paciente un antígeno que se expresa en alta proporción en las células de cáncer y un anticuerpo antagonista que se une a una proteína que consiste de los aminoácidos 35 a 257 de la SEC ID NO: 2.

62. Un método para tratar a un paciente que tiene una condición autoinmune o inflamatoria, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (a) extraer linfocitos T del paciente, (b) estimular los linfocitos T con una combinación de proteínas que comprende un anticuerpo anti-CD3 y una proteína BTNL9, en donde la proteína BTNL9 comprende: (i) una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, (ii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, en donde el intervalo de alineación de la secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2 tiene una longitud de por lo menos 80 aminoácidos, o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene un máximo de 20 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2, (c) recolectar los linfocitos T estimulados; y (d) regresar los linfocitos T recolectados al paciente , en donde la proteína BTNL9 puede inhibir la proliferación de un linfocito T estimulado por un anticuerpo anti-CD3.

63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la proteína BTNL9 es la proteína BTNL9 de (b) (iii) y tiene un máximo de 10 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la proteína BTNL9 tiene un máximo de 5 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único en relación a la secuencia de aminoácidos 35-257 de la SEC ID NO: 2.

65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la proteína BTNL9 es la proteína BTNL9 de (b) (i) .

66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, caracterizado porque la condición autoinmune o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, una enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis, sarcoidosis, asma o una enfermedad fibrótica.