MX2012011167A - Metodo para prediccion de recurrencia de cancer de mama bajo tratamiento endocrino. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos, kits y sistemas para el pronóstico del resultado de enfermedad de cáncer de mama, el método comprende: (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de por lo menos 2 de los siguientes 9 genes: UBE2C, BIRC5, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST y MGP; (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico de ese paciente; y kits y sistemas para llevar a cabo ese método.

Description

METODO PARA PREDICCION DE RECURRENCIA DE CANCER DE MAMA BAJO TRATAMIENTO ENDOCRINO Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos, kits y sistemas para el pronóstico de la consecuencia de enfermedad de cáncer de mama. De manera más específica, la presente invención se refiere al pronóstico de cáncer de mama con base en mediciones de los niveles de expresión de genes marcadores en muestras de tumor de pacientes con cáncer de mama.

Antecedentes de la Invención El cáncer de mama es una de las causas principales de muerte por cáncer en mujeres en los países occidentales. De manera más específica, el cáncer de mama quita la vida a aproximadamente 40,000 mujeres y está diagnosticado en aproximadamente 200,000 mujeres cada año sólo en los Estados Unidos. En las últimas décadas, la terapia sistémica de adyuvante ha conducido a supervivencia marcadamente mejorada en cáncer de mama temprano. Esta experiencia clínica ha conducido a recomendaciones de consenso que ofrecen terapia sistémica de adyuvante para la gran mayoría de pacientes con cáncer de mama (EBCAG) . En cáncer de mama, están disponibles una multitud de opciones de tratamiento que se pueden aplicar además de la remoción quirúrgica realizada rutinariamente del tumor y la subsiguiente radiación del lecho del tumor. Tres Ref.234548 estrategias principales y conceptualmente diferentes son tratamiento endocrino, quimioterapia y tratamiento con terapias dirigidas . El prerrequisito para el tratamiento endocrino es la expresión de receptores de hormona en el tejido de tumor, es decir, ya sea receptor de estrógeno, receptor de progesterona o ambos . Están disponibles varios agentes endocrinos con modo de acción diferente y diferencias en consecuencia de enfermedad cuando se prueban en cohortes más grandes de pacientes. El tamoxifeno ha sido el soporte principal del tratamiento endocrino en las últimas tres décadas. Ensayos clínicos grandes mostraron que tamoxifeno redujo significativamente el riesgo de recurrencia de tumor. Una opción de tratamiento adicional se basa en inhibidores de aromatasa que pertenecen a una nueva clase de fármacos endocrinos. A diferencia del tamoxifeno, que es un inhibidor competitivo de unión a estrógeno, los inhibidores de aromatasa bloquean la producción del estrógeno mismo reduciendo así el estímulo de crecimiento para células tumorales positivas para receptor de estrógeno. Sin embargo, algunos pacientes experimentan una recaída a pesar del tratamiento endocrino y en particular estos pacientes podrían beneficiarse de fármacos terapéuticos adicionales. Se ha mostrado que la quimioterapia con antraciclinas , taxanos y otros agentes es eficiente en la reducción de recurrencia de enfermedad en pacientes positivos para receptor de estrógeno así como negativos para receptor de estrógeno. El estudio NSABP-20 comparó el tamoxifeno solo contra tamoxifeno más quimioterapia en pacientes positivos para receptor de estrógeno de nodo negativo y mostró que el tratamiento combinado fuera más efectivo que el tamoxifeno solo. Sin embargo, el estudio IBCSG IX que compara tamoxifeno solo contra tamoxifeno más quimioterapia no mostró ningún beneficio significativo para la adición de agentes citotóxicos . Recientemente, se ha mostrado que un anticuerpo sistémicamente administrado dirigido contra el antígeno HER2/neu sobre la superficie de células tumorales reduce el riesgo de recurrencia varias veces en pacientes con tumores que sobreexpresan Her2neu. Sin embargo, la mayoría, si no es que todos, los diferentes tratamientos con fármacos tienen numerosos efectos adversos potenciales que pueden alterar severamente la calidad de vida de los pacientes (Shapiro y Recht, 2001; Ganz et al., 2002). Esto hace obligatorio seleccionar la estrategia de tratamiento sobre la base de una evaluación de riesgo cuidadosa para el paciente individual para evitar sobre-tratamiento así como sub-tratamiento . Puesto que el beneficio de la quimioterapia es relativamente grande en tumores positivos para HER2/neu y tumores caracterizados por ausencia de HER2/neu y expresión de receptor de estrógeno (tipo basal) , comparado con tumores negativos para HER2/neu y positivos para receptor de estrógeno (tipo luminal) , la decisión de tratamiento más desafiante se refiere a tumores luminales para los cuales los factores clínicos clásicos como gradientes, tamaño del tumor o implicación de nodos linfáticos no proveen una respuesta clara a la pregunta de si usar o no quimioterapia. Las herramientas moleculares más nuevas como una prueba de 21 genes , una prueba de índice de grado genómico y otras se han desarrollado para enfrentar esta necesidad médica.

Los lineamientos del tratamiento son usualmente desarrollados por expertos de renombre en el campo. En Europa, los lineamientos de St Gallen del año 2009 recomiendan quimioterapia a pacientes con cáncer de mama positivo para HER2 así como a pacientes con enfermedad negativa para HER2 y negativa para ER. La incertidumbre acerca de la utilidad de la quimioterapia surge en pacientes con enfermedad negativa para HER2 y positiva para ER. Para tomar una decisión de tratamiento balanceada para el individuo, la probabilidad de recurrencia de cáncer se usa como el criterio más útil. Criterios clínicos como estado de nodos linfáticos, gradiente de tumor, tamaño de tumor y otros son útiles ya que proveen información acerca del riesgo de recurrencia. Muy recientemente, se ha mostrado que las pruebas de multigenes proveen información superior o adicional a los factores de riesgo clínico estándares. Es generalmente reconocido, que los marcadores de proliferación parecen proveer la información de pronóstico dominante. Ejemplos prominentes de esos predictores son la prueba Mammaprint de Agendia, el Relapse Score de Veridex y el Genomic Grade Index, desarrollado en el instituto Jules Bordet y con autorización para Ipsogen. Todas estas pruebas se basan en la determinación de los niveles de expresión de por lo menos 70 genes y todos se han desarrollado para ARN no fuertemente degradados por fijación con formalina e imbibición en parafina, sino aislados de tejido fresco (embarcados en RNALaterTM) . Otra prueba de multigenes prominente es la prueba Recurrence Score de Genomic Health Inc. La prueba determina el nivel de expresión de 16 genes relacionados con cáncer y 5 genes de referencia después de extracción de ARN de muestras de tejido fijadas con formalina y embebidas en parafina.

Sin embargo, las herramientas actuales adolecen de una falta de validez y utilidad clínica en el grupo de riesgo clínico más importante, es decir, aquellos pacientes con cáncer de mama de riesgo intermedio de recurrencia con base en parámetros clínicos estándares. Por lo tanto, se necesitan mejores herramientas para optimizar las decisiones de tratamiento basadas en el pronóstico del paciente. Para la utilidad clínica de evitar quimioterapia, se necesita una prueba con alta sensibilidad y alto valor predictivo negativo, para no sub-tratar a un paciente que finalmente desarrolla una metástasis distante después de cirugía.

Con respecto a la continua necesidad de materiales y métodos útiles para tomar decisiones clínicas sobre terapia con adyuvantes, la presente invención satisface la necesidad de métodos avanzados para el pronóstico de cáncer de mama sobre la base de datos clínicos y experimentales fácilmente accesibles .

Definiciones A menos que se defina otra cosa, términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que aquellos comúnmente entendidos por un experto en la técnica al cual compete esta invención.

El término "cáncer" no está limitado a alguna etapa, grado, característica histomorfológica, agresividad, o malignidad de un tejido afectado o agregación celular.

El término "predicción de un resultado" de una enfermedad, como se usa en la presente, significa incluir tanto una predicción de un resultado de un paciente que está bajo una terapia dada como un pronóstico de un paciente que no es tratado. El término "predicción de un resultado", en particular, se puede relacionar con el riesgo de un paciente a desarrollar metástasis, recurrencia local o muerte.

El término "predicción" , como se usa en la presente, se refiere a la evaluación de un individuo de la malignidad de un tumor, o a la tasa de supervivencia esperada, supervivencia general (OAS, por sus siglas en inglés) o supervivencia libre de enfermedad (DFS, por sus siglas en inglés) de un paciente, si el tumor se trata con una terapia dada. En contraste con esto, el término "pronóstico" se refiere a una evaluación individual de la malignidad de un tumor, o a la tasa de supervivencia esperada, supervivencia general (OAS, por sus siglas en inglés) o supervivencia libre de enfermedad (DFS, por sus siglas en inglés) de un paciente, si el tumor no es tratado.

Un "resultado" dentro del significado de la presente invención es una condición definida obtenida en el curso de la enfermedad. Este resultado de enfermedad puede ser, v.gr., una condición clínica tal como "recurrencia de enfermedad" , "desarrollo de metástasis" , "desarrollo de metástasis nodal" , desarrollo de metástasis distante" , "supervivencia", "muerte", "tasa de remisión de tumor", una etapa o grado de enfermedad o similar.

Por "riesgo" se entiende un número relacionado con la probabilidad de un sujeto o un paciente a desarrollar o llegar a un cierto resultado de enfermedad. El término "riesgo" , en el contexto de la presente invención, no significa tener alguna connotación positiva o negativa con respecto al bienestar de un paciente, sino simplemente se refiere a una probabilidad o posibilidad de que ocurra o se desarrolle una condición dada.

El término "datos clínicos" se refiere a la totalidad de datos disponibles e información relacionada con el estado de salud de un paciente que incluye, pero no se limita a, edad, sexo, peso, estado menopáusica/hormonal, datos etiopatológicos , datos de anamnesis, datos obtenidos por métodos de diagnóstico in vitro tal como histopatologla, pruebas de sangre u orina, datos obtenidos por métodos de formación de imagen, tales como rayos x, tomografía computarizada, MRI, PET, SPECT, ultrasonido, datos electrofisiológicos, análisis genético, análisis de expresión de genes, evaluación de biopsia, hallazgos intraoperatorios .

El término "nodo-positivo", "diagnosticado como nodo-positivo", "implicación de nodo" o "implicación de nodo linfático" significa un paciente que anteriormente ha sido diagnosticado con metástasis de nodo linfático. Abarcará metástasis de nodo linfático drenable, nodo linfático cercano y nodo linfático distante. Este diagnóstico previo como tal no formará parte del método inventivo. Más bien, es una precondición para seleccionar pacientes cuyas muestras se pueden usar para una modalidad de la presente invención. A este diagnóstico previo se puede haber llegado por cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitarse a remoción de nodo linfático y análisis patológico, análisis de biopsia, análisis in-vitro de biomarcadores indicativos de metástasis, métodos de formación de imagen (v.gr., toraografía computarizada, rayos X, resonancia magnética, ultrasonido), y hallazgos intraoperativos .

En el contexto de la presente invención, una "muestra biológica" es una muestra que se deriva de o ha estado en contacto con un organismo biológico. Ejemplos de muestras biológicas son: células, tejido, fluidos corporales, fluido de lavado, muestras de frotis, especímenes de biopsia, sangre, orina, saliva, esputo, plasma, suero, sobrenadante de cultivo de células, y otros.

Una "muestra de tumor" es una muestra biológica que contiene células tumorales, ya sea intacto o degradado. La muestra puede ser de cualquier tejido biológico o fluido. Dichas muestras incluyen, pero no se limitan a, esputo, sangre, suero, plasma, células sanguíneas (v.gr., glóbulos blancos), tejido, muestras de biopsia de núcleo o aguja fina, fluidos corporales que contienen células, orina, fluido peritoneal, y fluido pleural, líquido cerebroespinal, fluido lagrimal, o células aisladas de los mismos. Ésta también puede incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas o fijadas tomadas para propósitos histológicos o células microdisecadas o partes extracelulares de las mismas . Una muestra de tumor que ha de ser analizada puede ser material de tejido de una lesión neoplásica tomada por aspiración o puntuación, excisión o por cualquier otro método quirúrgico que conduce a biopsia o material celular resecado. Éste comprende células tumorales o fragmentos de células tumorales obtenidas del paciente. Las células se pueden encontrar en un "frotis" de células recolectadas, por ejemplo, mediante aspiración de pezón, lavado ductal, biopsia de aguja fina o de descarga de pezón provocada o espontánea. En otra modalidad, la muestra es un fluido corporal. Dichos fluidos incluyen, por ejemplo, fluidos de la sangre, suero, plasma, linfa, fluidos ascíticos, fluidos ginecológicos, u orina pero sin limitarse a estos fluidos.

Un "gen" es un conjunto de segmentos de ácido nucleico que contiene la información necesaria para producir un producto de ARN funcional. Un "producto de gen" es una molécula biológica producida a través de transcripción o expresión de un gen, v.gr., un ARNm, ADNc o la proteína traducida.

Un "ARNm" es el producto transcrito de un gen y debe tener el significado ordinario entendido por un experto en la técnica. Una "molécula derivada de un ARNm" es una molécula que es químicamente o enzimáticamente obtenida de una plantilla de ARNm, tal como ADNc.

El término "nivel de expresión" se refiere a un nivel determinado de expresión de gen. Éste puede ser un nivel determinado de expresión de gen como un valor absoluto o comparado con un gen de referencia (v.gr., un gen de mantenimiento) , al promedio de dos o más genes de referencia, o a un valor de expresión promedio calculado (v.gr., en análisis de chip de ADN) o a otro gen informativo sin el uso de una muestra de referencia. El nivel de expresión de un gen se puede medir directamente, v.gr., al obtener una señal en donde la fuerza de la señal está correlacionada con la cantidad de transcritos de ARNm de ese gen o se puede obtener indirectamente a un nivel de proteína, v.gr., por métodos de inmunohistoquímica, CISH, ELISA o RIA. El nivel de expresión también se puede obtener por medio de una reacción competitiva a una muestra de referencia. A un valor de expresión que se determina al medir algún parámetro físico en una prueba, v.gr., emisión de fluorescencia, se le puede asignar un valor numérico que se puede usar para procesamiento posterior de información.

Un "patrón de referencia de niveles de expresión" , dentro del significado de la invención se entenderá como que es cualquier patrón de niveles de expresión que se puede usar para la comparación con otro patrón de niveles de expresión. En una modalidad preferida de la invención, un patrón de referencia de niveles de expresión es, v.gr., un patrón de niveles de expresión promedio observado en un grupo de individuos sanos, individuos con enfermedad, o individuos con enfermedad que han recibido un tipo particular de terapia, que sirven como un grupo de referencia, o individuos con resultado bueno o malo.

El término "niveles de expresión matemáticamente combinables" , dentro del significado de la invención se entenderán como que derivan un valor numérico de un nivel de expresión determinado de un gen y al aplicar un algoritmo a uno o más de esos valores numéricos para obtener un valor numérico combinado o puntuación combinada.

Un "algoritmo" es un proceso que realiza alguna secuencia de operaciones para producir información.

Una "puntuación" es un valor numérico que es derivado matemáticamente al combinar niveles de expresión mediante el uso de un algoritmo. También se puede derivar de niveles de expresión y otra información, v.gr., datos clínicos. Una puntuación se puede relacionar con el resultado de enfermedad de un paciente.

Una "función discriminante" es una función de un conjunto de variables usadas para clasifica un objeto o evento. Una función discriminante por lo tanto permite la clasificación de un paciente, muestra o evento en una categoría o una pluralidad de categorías e conformidad con datos o parámetros disponibles de ese paciente, muestra o evento. La clasificación es un instrumento estándar de análisis estadístico bien conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, un paciente puede clasificarse como "alto riesgo" o "bajo riesgo", "alta probabilidad de metástasis" o "baja probabilidad de metástasis", "que necesita tratamiento" o "que no necesita tratamiento" de conformidad con datos obtenidos de ese paciente, muestra o evento. La clasificación no se limita a "alta vs baja", pero se puede realizar en una pluralidad de categorías, gradientes o similares. La clasificación también se debe entender en un sentido más amplio como una puntuación discriminante, en donde, v.gr., una puntuación más alta representa una posibilidad más alta de metástasis distante, v.gr., el riesgo (general) de una metástasis distante. Ejemplos de funciones discriminantes que permiten una clasificación incluyen, pero no se limitan a funciones definidas por máquinas de vector de soporte (SVM, por sus siglas en inglés) , vecinos k-cercanos (k , por sus siglas en inglés) , modelos de Bayes (intacto) , modelos de regresión lineal o funciones definidas por piezas tales como, por ejemplo, en descubrimiento de subgrupo, en árboles de decisión, en análisis lógico de datos (LAD, por sus siglas en inglés) y similares. En un sentido más amplio, valores de puntuación continua de métodos matemáticos o algoritmos, tales como coeficientes de correlación, proyecciones, puntuaciones de máquina de vector de soporte, distintas de los métodos basados en similitudes, combinaciones de éstos y similares son ejemplos de propósito ilustrativo .

El término "modalidad de terapia" , "modo de terapia", "régimen" así como "régimen de terapia" se refiere a una administración oportunamente secuencial o simultánea de anti-tumor, y/o anti-vascular, y/o inmunoestimulación, y/o agentes proliferativos de células de la sangre, y/o terapia de radiación, y/o hipertermia, y/o hipotermia para terapia de cáncer. La administración de éstas se puede realizar en un modo de adyuvante y/o neoadyuvante . La composición de ese "protocolo" puede varias en la dosis del agente individual, marco de tiempo de aplicación y frecuencia de administración dentro de una ventana de terapia definida. Actualmente, varias combinaciones de varios fármacos y/o métodos físicos, y varios programas están bajo investigación.

El término "quimioterapia citotóxica" se refiere a varias modalidades de tratamiento que afectan la proliferación celular y/o supervivencia celular. El tratamiento puede incluir la administración de agentes alquilantes, antimetabolitos , antraciclinas , alcaloides de plantas, inhibidores de topoisomerasa, y otros agentes antitumorales, que incluyen anticuerpos monoclonales e inhibidores de cinasa. En particular, el tratamiento citotóxico se puede relacionar con un tratamiento con taxano. Los taxanos son alcaloides de plantas que bloquean la división celular al impedir la función de los microtúbulos . El prototipo de taxano es el producto natural paclitaxel, originalmente conocido como Taxol y derivado por primera vez de la corteza del árbol del tejo del Pacífico. Docetaxel es análogo semi-sintético de paclitaxel. Los taxanos incrementan la estabilidad de los microtúbulos , que impiden la separación de los cromosomas durante la anafase .

El término "tratamiento endocrino" o "tratamiento hormonal" (algunas veces también referido como "tratamiento anti-hormonal" ) denota un tratamiento que dirige la señalización de hormona, v.gr., inhibición de hormona, inhibición de receptor de hormona, uso de agonistas o antagonistas de receptor de hormona, uso de receptores depuradores o huérfanos, uso de derivados de hormonas e interferencia con la producción de hormona. Ejemplos particulares son terapia con tamoxifeno que modula la señalización del receptor de estrógeno, o tratamiento con aromatasa que interfiere con la producción de hormona esteroidea.

El tamoxifeno es un modulador de receptor selectivo oralmente activo de estrógeno (SERM, por sus siglas en inglés) que se usa en el tratamiento de cáncer de mama y es actualmente el fármaco de mayor venta en el mundo para ese propósito. El tamoxifeno es vendido bajo los nombres comerciales Nolvadex, Istubal y Valodex. Sin embargo, el fármaco, incluso antes de que expire su patente, fue y aún es ampliamente referido por su nombre genérico "tamoxifeno." El tamoxifeno y derivados de tamoxifeno competitivamente se unen a receptores de estrógeno en tumores y otros objetivos de tejido, lo que produce un complejo nuclear que disminuye la síntesis de ARN e inhibe los efectos del estrogeno.

Los receptores de esteroides son receptores intracelulares (típicamente citoplásmicos) que realizan transducción de señal para hormonas esteroideas. Ejemplos incluyen receptores de tipo I, en particular receptores de hormonas sexuales, v.gr., receptor de andrógeno, receptor de estrogeno, receptor de progesterona; receptor de glucocorticoide , receptor de mineralocorticoide ; y receptores de tipo II, v.gr., receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor de retinoide, receptor de hormona tiroidea.

El término "método basado en hibridación" como se usa en la presente, se refiere a métodos que imparten un proceso de combinar ácidos nucleicos de hebras simples, complementarios o análogo e nucleótidos en una molécula de doble hebra individual. Los nucleótidos o análogos de nucleótidos se unirán a su complemento bajo condiciones normales, de modo que dos hebras perfectamente complementarias se unirán una a otra fácilmente. En bioanalítica, sondas de hebras simples muy a menudo marcadas, se usan para encontrar secuencias ob etivo-complementarias . Si estas secuencias existen en la muestra, las sondas hibridarán a esas secuencias que después pueden ser detectadas debido al marcador. Otros métodos basados en hibridación comprenden métodos de microarreglo y/o biochip. En estos, las sondas son inmovilizadas sobre una fase sólida, que después es expuesta a una muestra. Si existen ácidos nucleicos complementarios en la muestra, estos hibridarán a las sondas y por lo tanto pueden ser detectados. Estos enfoques también se conocen como "métodos basados en arreglos" . Otro método basado en hibridación es PC, que se describe más adelante. Cuando se llega a la determinación de los niveles de expresión, los métodos basados en hibridación se pueden usar, por ejemplo, para determinar la cantidad de ARNm para un gen dado .

Un oligonucleótido capaz de unir específicamente secuencias de un gen o fragmentos del mismo se refiere a un oligonucleótido que híbrida específicamente a un gen o producto del mismo, tal como el ARNm o ADNc del gen o a un fragmento del mismo. Para detectar específicamente el gen o producto del gen, no es necesario detectar la secuencia del gen completa. Un fragmento de aproximadamente 20-150 bases, contendrá suficiente información específica de secuencia para permitir la hibridación específica.

El término "un método basado en PCR" , como se usa en la presente, se refiere a métodos que comprenden una reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . Este es un método de amplificar exponencialmente ácidos nucleicos, v.gr., el ADN por replicacion enzimática in vi tro. Como la PCR es una técnica in vitro, se puede realizar sin restricciones sobre la forma de ADN; y puede ser extensivamente modificada para realizar un arreglo amplio de manipulaciones genéticas . Cuando se llega a la determinación de los niveles de expresión, un método basado en PCR se puede usar, por ejemplo, para detectar la presencia de un ARNm dado por (1) transcripción inversa del acervo de ARNm completo (el denominado transcriptoma) en ADNc con la ayuda de una enzima transcriptasa inversa, y (2) detectar la presencia de un ADNc dado con la ayuda de cebadores respectivos. Este enfoque es comúnmente conocido como PCR de transcriptasa inversa (rtPCR) .

Más aún, los métodos basados en PCR comprenden, v.gr. , PCR en tiempo real y, particularmente adecuados para el análisis de niveles de expresión, PCR cinético o cuantitativo (qPCR) .

El término "PCR cuantitativo (qPCR) " se refiere a cualquier tipo de un método de PCR que permita la cuantificación de la plantilla en una muestra. La PCR en tiempo real cuantitativa comprende diferentes técnicas de realización o detección de producto como por ejemplo la técnica TaqMan o la técnica LightCycler. La técnica TaqMan, por ejemplo, usa una sonda fluorogénica de marcador doble. La PCR en tiempo real TaqMan mide la acumulación de un producto mediante el fluoróforo durante las etapas exponenciales de PCR, más que en el punto final como en PCR convencional. El incremento potencial del producto se usa para determinar el ciclo umbral, CT, es decir, el número de ciclos de PCR en los cuales un incremento exponencial significativo en fluorescencia es detectado, y que está directamente correlacionado con el número de copias de plantilla de ADN presente en la reacción. La disposición de la reacción es muy similar a una PCR convencional, pero se lleva a cabo en un ciclador térmico en tiempo real que permite medición de moléculas fluorescentes en los tubos de PCR. A diferencia de PCR regular, en PCR en tiempo real TaqMan una sonda se añade a la reacción, es decir, un oligonucleótido de hebra sencilla complementario a un segmento de 20-60 nucleótidos dentro de la plantilla de ADN y localizado entre los dos cebadores. Un reportero fluorescente o fluoróforo (v.gr., 6-carboxifluorosceína, acrónimo: FAM o tetraclorofluorosceína, acrónimo: TET) y extinguidor (v.gr., tetrametilrodamina, acrónimo: TAMRA, de tripéptido de dihidrociclopirroloindol "extinguidor de agujero negro" acrónimo BHQ) son covalentemente unidos a los extremos 5' y 3' de la sonda, respectivamente [2] . La estrecha proximidad entre fluoróforo y extinguidor unidos a la sonda inhibe la fluorescencia del fluoróforo. Durante PCR, al empezar la síntesis de ADN, la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa degrada esa porción de la sonda que ha alineado a la plantilla. La degradación de la sonda libera el fluoróforo de la misma y rompe la estrecha proximidad al extinguidor, lo que alivia el efecto de extinción y permite fluorescencia del fluoróforo. Por lo tanto, la . fluorescencia detectada en el ciclador térmico de PCR en tiempo real es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de plantilla de ADN presente en la PCR.

Por "arreglo" o "matriz", se entiende un arreglo de sitios direccionables o "direcciones" en un dispositivo. Los lugares pueden estar dispuestos en arreglos bidimensionales , arreglos tridimensionales u otros formatos de matriz. El número de lugares puede variar desde algunos hasta por lo menos cientos de miles. De manera más importante, cada lugar representa un sitio de reacción totalmente independiente. Los arreglos incluyen pero no se limitan a arreglos de ácido nucleico, arreglos de proteína y arreglos de anticuerpo. Un "arreglo de ácido nucleico" se refiere a un arreglo que contiene sondas de ácido nucleico, tales como oligonucleótidos , análogos de nucleótidos, polinucleótidos , polímeros de análogos de nucleótidos, morfolinos o porciones más grandes de genes. El ácido nucleico y/o análogo en el arreglo es preferiblemente de hebra sencilla. Los arreglos en donde las sondas son ologonucleótidos se refieren como "arreglos de oligonucleótidos" o "chips de oligonucleótidos" . Un "microarreglo" en la presente también se refiere a un "biochip" o "chip biológico" un arreglo de regiones que tienen una densidad de regiones completas de por lo menos aproximadamente 100/cm2 y preferiblemente por lo menos aproximadamente 1000/cm2.

"Pares de cebadores" y "sondas", dentro del significado de la invención tendrán el significado ordinario de este término que es bien conocido por un experto en la técnica de biología molecular. En una modalidad preferida de la invención, "pares de cebadores" "sondas" se entenderá que son moléculas de polinucleótidos que tienen una secuencia idéntica, complementaria, homologa u homologa al complemento de regiones de un polinucleótido objetivo que ha de ser detectado o cuantificado . En otra modalidad, los análogos de nucleótidos también se usan como cebadores y/o sondas. Las tecnologías de sonda usadas para aplicaciones de PCR cinéticas o en tiempo real podrían ser, v.gr., sistemas TaqMan® obtenibles en Applied Biosystems, sondas de extensión tales como Scorpion® Primers, sondas de hibridación dobles, Amplifluor® obtenible en Chemicon International, Inc, o aglutinantes de ranura menores.

Por "sondas individualmente marcadas" dentro del significado de la invención, se entenderán sondas moleculares que comprenden un polinucleótido, oligonucleótido o análogo de nucleótido y un marcador, útiles en la detección o cuantificación ' de la sonda. Los marcadores preferidos son moléculas fluorescentes, moléculas luminiscentes, moléculas radioactivas, moléculas enzimáticas y/o moléculas extinguidoras .

"Sondas arregladas" dentro del significado de la invención, se entenderá que son una recolección de sondas inmovilizadas, preferiblemente en un arreglo ordenado. En una modalidad preferida de la invención las "sondas arregladas" individuales pueden ser identificadas por su posición respectiva sobre el soporte sólido, v.gr., sobre un "chip" .

Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico de hebra simple, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que puede hibridar (es decir, es el complemento de) la secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla bajo condiciones de baja astringencia como se describió anteriormente.

Sumario de la Invención En términos generales, la presente invención provee un método para evaluar el riesgo de recurrencia de un paciente con cáncer de mama nodo-negativo o nodo-positivo, positivo para receptor de estrógeno y negativo para HER2/NEU, en pacientes particulares que reciben terapia con agentes endocrinos, por ejemplo cuando se trata con tamoxifeno. El estado de receptor de estrógeno es generalmente determinado mediante el uso de inmunohistoquimica, el estado de HER2/NEU (ERBB2) es generalmente determinado mediante el uso de inmunohistoquimica e hibridación in situ por fluorescencia. Sin embargo, el estado de receptor de estrógeno y el estado de HER2/NEU (ERBB2) , para los propósitos de la invención, se pueden determinar por cualquier método adecuado, v.gr., inmunohistoquímica, hibridación in situ por fluorescencia, o análisis de expresión de ARN.

La presente invención se refiere a un método para predecir un resultado de cáncer de mama en un tumor positivo para receptor de estrógeno y negativo para HER2 de un paciente con cáncer de mama, el método comprende: (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de por lo menos 2 de los siguientes 9 genes: UBE2C, BIRC5, RACGAP1, DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8, IL6ST, y MGP (b) combinar matemáticamente los valores del nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico del paciente. En una modalidad, por lo menos 1, 4, 5 ó 6 genes son seleccionados.

En una modalidad adicional de la invención, el método comprende : (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN. de los siguientes 8 genes: UBE2C, RACGAP1, DHCR7, STC2 , AZGP1, RBBP8 , IL6ST, y MGP (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico de ese paciente.

En una modalidad adicional de la invención, el método comprende : (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de los siguientes 8 genes: UBE2C, BIRC5, DHCR7, STC2 , AZGP1, RBBP8, IL6ST, y MGP; (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico de ese paciente.

En otra modalidad de la invención, BIRC5 puede ser remplazado por UBE2C o T0P2A o RACGAP1 O AURKA o NEK2 o E2F8 O PCNA o CYBRD1 O DCN o ADRA2A o SQLE o CXCL12 o EPHX2 o ASPH O PRSS16 o EGFR o CCND1 o TRIM29 o DHCR7 o PIP o TFAP2B o NT5A o APOD o PTPRT con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados, y UBE2C puede ser remplazado por BIRC5 o RACGAP1 o T0P2A o AURKA o NEK2 o E2F8 o PCNA o CYBRD1 o ADRA2A o DCN o SQLE O CCND1 o ASPH o CXCL12 o PIP O PRSS16 O EGFR o DHCR7 o EPHX2 o TRIM29 con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados, y DHCR7 puede ser remplazado por AURKA, BIRC5, UBE2C o por cualquier otro gen que pueda remplazar a BIRC5 o UBE2C con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados, y STC2 puede ser remplazado por INPP4B o IL6ST o SEC14L2 o MAPT O CHPT1 O ABAT o SCUBE2 o ESR1 o RBBP8 O PGR o PTPRT o HSPA2 o PTGER3 con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y AZGP1 puede ser remplazado por PIP o EPHX2 o PLAT o SEC14L2 o SCUBE2 o PGR con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y RBBP8 puede ser remplazado por CELSR2 o PGR o STC2 o ABAT o IL6ST con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y IL6ST puede ser remplazado por INPP4B o STC2 o MAPT O SCUBE2 o ABAT o PGR O SEC14L2 O ESR1 O GJA1 O MGP o EPHX2 o RBBP8 o PTPRT o PLAT con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y MGP puede ser remplazado por APOD o IL6ST o EGFR con la condición de que después de un remplazo 8 genes diferentes son seleccionados.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió antes, en donde la puntuación combinada es indicativa de beneficio de quimioterapia citotóxica.

Al usar el método de la invención antes de que un paciente reciba terapia con agentes endocrinos, se permite la predicción de la eficacia de la terapia con agentes endocrinos .

La tabla 2 siguiente muestra si la sobreexpresión de cada uno de los genes marcadores anteriores es indicativa de un buen resultado o un mal resultado de un paciente que recibe terapia con agentes endocrinos. El experto en la técnica por lo tanto puede construir una combinación matemática, es decir, un algoritmo que tome en cuenta el efecto de un gen dado. Por ejemplo, una suma o suma ponderada de genes cuya sobreexpresión es indicativa de un buen resultado produce un algoritmo en donde una puntuación de alto riesgo es indicativa de un buen resultado. La validez del algoritmo se puede examinar al analizar muestras de tumor de pacientes con registro clínico, en donde, v.gr., la puntuación para pacientes con buen resultado y pacientes con mal resultado se pueden determinar por separado y comparar. El experto en la técnica, un bioestadístico, sabrá aplicar métodos matemáticos adicionales, tales como funciones discriminativas para obtener algoritmos optimizados, los algoritmos pueden ser optimizados, v.gr., para sensibilidad o especificidad. Los algoritmos pueden ser adaptados a la plataforma analítica particular usada para medir la expresión de gen de genes marcadores, tales como PCR cuantitativa.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió antes, en donde la terapia con agentes endocrinos comprende tamoxifeno o un inhibidor de aromatasa .

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió antes, en donde se predice un riesgo de desarrollar recurrencia.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió antes, en donde el nivel de expresión se determina como un nivel de no expresión de proteína.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde el nivel de expresión está determinado como un nivel de expresión de ARN.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde el nivel de expresión está determinado por lo menos uno de un método basado en PCR, un método basado en microarreglo, y un método basado en hibridación.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde la determinación de los niveles de expresión está en una muestra de tumor embebida en parafina fijada con formalina o en una muestra de tumor congelada en fresco.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde el nivel de expresión de por lo menos un gen marcador está determinado como un patrón de expresión en relación con por lo menos un gen de referencia o con un valor de expresión promedio calculada.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde el paso de combinar matemáticamente comprende un paso de aplicar un algoritmo a valores representativos de un nivel de expresión de un gen dado.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde el algoritmo es una combinación lineal de los valores representativos de un nivel de expresión de un gen dado.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde un valor representativo de un nivel de expresión de un gen dado es multiplicado con un coeficiente.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde uno, dos o más umbrales están determinados para la puntuación combinada y son discriminados en riesgo alto y bajo, riesgo alto, intermedio y bajo, o más grupos de riesgo al aplicar los umbrales de la puntuación combinada.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde una puntuación combinada alta es indicativa de beneficio de una terapia más agresiva, v.gr. , quimioterapia citotóxica. El experto en la técnica entiende que una "puntuación alta" a este respecto se refiere a un valor de referencia o valor de corte. El experto en la técnica además entiende que según el algoritmo particular usado para obtener la puntuación combinada, también una puntuación "baja" por abajo de un valor de corte o de referencia puede ser indicativa de beneficio de una terapia más agresiva, v.gr., quimioterapia citotóxica. Este es el caso cuando genes que tienen una correlación positiva con alto riesgo de factor de metástasis en el algoritmo con un coeficiente positivo, de tal manera que una puntuación alta global indica alta expresión de genes que tiene una correlación positiva con alto riesgo.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde una información referente al estado nodal del paciente es procesada en el paso de combinar matemáticamente valores de nivel de expresión para los genes para dar una puntuación combinada.

De conformidad con un aspecto de la invención, se provee un método como se describió anteriormente, en donde la información referente al estado nodal es un valor numérico < 0 si el estado nodal es negativo y la información es un valor numérico > 0 si el estado nodal es positivo o desconocido. En modalidades ilustrativas de la invención, un estado nodal negativo se asigna el valor 0, a un estado nodal desconocido se asigna el valor 0.5 y a un estado nodal positivo se asigna el valor 1. Otros valores se pueden escoger para reflejar una ponderación diferente del estado nodal dentro de un algoritmo.

La invención además se refiere a un kit para realizar un método como se describió antes, el kit comprende un conjunto de oligonucleótidos capaces de unir específicamente secuencias o a secuencias de fragmentos de los genes en una combinación de genes, en donde (i) la combinación comprende por lo menos 8 genes UBE2C, BIRC5, DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8 , IL6ST y MGP; o (ii) la combinación comprende por lo menos 10 genes, BIRC5, AURKA, PVALB, NMU, STC2 , RBBP8 , PTGER3 , CXCL12, CDH1, y PIP; O (iii) la combinación comprende por lo menos 9 genes BIRC5, DHCR7, RACGAP1 , PVALB, STC2 , IL6ST, PTGER3 , CXCL12 y ABAT; o (iv) la combinación comprende por lo menos 9 genes DHCR7, RACGAP1, N U, AZGP1, RBBP8 , IL6ST y MGP .

La invención además se refiere al uso de un kit para realizar un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 17, el kit comprende un conjunto de oligonucleótidos capaz de unir específicamente secuencias o a secuencias de fragmentos de los genes en combinación de genes, en donde (i) la combinación comprende lo menos 8 genes UBE2C, BIRC5 , DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8, IL6ST y MGP, o (ii) la combinación comprende lo menos 10 genes BIRC5, AURKA, PVALB , NMU, STC2 , RBBP8 , PTGER3 , CXCL12 , CDH1 , y PIP; o (iii) la combinación comprende por lo menos 9 genes BIRC5, DHCR7, RACGAP1 , PVALB, STC2 , IL6ST, PTGER3 , CXCL12 y ABAT; o (iv) la combinación comprende por lo menos 9 genes DHCR7, RACGAP1, NMU, AZGP1, RBBP8 , IL6ST, y MGP; 19. Un producto de programa de computadora capaz de procesar valores representativos de un nivel de expresión de los genes AKR1C3 , MAP4 y SPPl al combina matemáticamente los genes para obtener una puntuación combinada, en donde la puntuación combinada es indicativa del beneficio de quimioterapia citotóxica del paciente .

La invención además se refiere a un producto de programa de computadora capaz de procesar valores representativos de un nivel de expresión de una combinación de genes al combinar matemáticamente los valores para obtener una puntuación combinada, en donde la puntuación combinada es indicativa de eficacia o beneficio de terapia con agentes endocrinos del paciente, de conformidad con los métodos anteriores .

El producto de programa de computadora puede ser almacenado en un portador de datos o implementado en un sistema de diagnóstico capaz de producir valores representativos de un nivel de expresión de un gen dado, tal como un sistema de PCR en tiempo real.

Si el producto de programa de computadora es almacenado en un portador de datos o ejecutado en una computadora, el personal de operación puede introducir los valores de expresión obtenidos para el nivel de expresión de los genes respectivos. El producto de programa de computadora entonces puede aplicar un algoritmo para producir una puntuación combinada indicativa de beneficio de quimioterapia citotóxica para un paciente dado.

Los métodos de la presente invención tienen la ventaja de proveer una predicción confiable de un resultado de enfermedad basado en el uso de únicamente un pequeño número de genes. Los métodos de la presente invención se ha encontrado que están especialmente adecuados para analizar la respuesta a tratamiento con agentes endocrinos, v.gr., por tamoxifeno, de pacientes con tumores clasificados como positivos para ESR1 y negativos para ERBB2.

Breve Descripción de las Figuras La invención se explica junto con modalidades ilustrativas y las figuras anexas: La figura 1 muestra una gráfica de Forrest de la relación de unidad de peligro ajustada con intervalo de confianza al 95% de la puntuación T5 en el cohorte combinado, así como los brazos de tratamiento individuales de los estudios ABCSG06 y 08 estudios, mediante el uso de metástasis distante como punto final.

La figura 2 muestra un análisis de Kaplan Meier de pacientes ER+, HER-, NO-3 de los cohortes ABCSG06 y 08 combinados, estratificado como riesgo alto o bajo de acuerdo con el valor de puntuación T5.

La figura 3 muestra la distribución de unión de las expresiones .

Descripción Detallada de la Invención Aquí se describen combinaciones únicas de genes marcadores que se pueden combinar en un algoritmo para la nueva prueba predictiva presentada aquí. Técnicamente, el método de la invención se puede poner en práctica mediante el uso de dos tecnologías: 1.) Aislamiento del ARN total de tejido de tumor fresco o fijado y 2.) RT-PCR cinética de los ácidos nucleicos aislados. Alternativamente, se contempla para medir niveles de expresión mediante el uso de tecnologías alternativas, v.gr., por microarreglo o por medición a un nivel de proteina.

Los métodos de la invención se basan en determinación cuantitativa de especies de ARN aisladas del tumor a fin de obtener valores de expresión y subsecuente análisis bioinformático de los valores de expresión determinados. Las especies de ARN pueden ser aisladas de cualquier tipo de muestra de tumor, v.gr. , muestras de biopsia, muestras de frotis, material de tumor extirpado, tejido tumoral congelado en fresco o tejido tumoral embebido en parafina y fijad con formalina. Primero, los niveles de ARN de genes que codifican para combinaciones específicas de los genes UBE2C, BIRC5 , DHCR7, RACGAP1, AURKA, PVALB, NMU, STC2, AZGP1, RBBP8 , IL6ST, MGP, PTGER3 , CXCL12 , ABAT, CDH1 y PIP o combinaciones específicas de los mismos, como se indica, son determinados. Con base en estos valores de expresión, una puntuación de pronóstico se calcula mediante una combinación matemática, v.gr., de conformidad con las fórmulas T5 , TI, T4 o T5b (véase más adelante) . Un valor de puntuación alto indica un riesgo alto para desarrollar una metástasis distante, un valor de puntuación bajo indica un riesgo bajo de metástasis distante. Consecuentemente, un valor alto también indica que el paciente es un paciente de alto riesgo que se beneficiará de una terapia más agresiva, v.gr., quimioterapia citotóxica.

Los ejemplos de la presente se basan en la identificación de genes de pronóstico mediante el uso de tumores de pacientes homogéneamente tratados en la preparación de adyuvante con tamoxifeno. Además, la identificación de genes pertinentes ha sido restringida a tumores clasificados como positivos para ESR1 y negativos para ErBB2 con base en los niveles de expresión de ARN. Además, genes que permiten la separación de riesgo intermedio, v.gr., tumores de grado 2 se consideraron para el desarrollo de algoritmos. Finalmente, una transferencia de plataforma de arreglos de Affymetrix HG_U133a a PCR en tiempo real cuantitativa, así como una transferencia de tipo de muestra de tejido congelado en fresco a tejido FFPE se realizó para asegurar rendimiento de algoritmo robusto, independiente de la plataforma y el tipo de tejido. Como resultado, la determinación del nivel de expresión de especies de ARN del tumor primario y el complejo subsiguiente y análisis multivariado como se describió antes provee un método superior para la predicción de la probabilidad de recurrencia de enfermedad en pacientes diagnosticados con cáncer de mama temprano negativo o positivo para nodo linfático, cuando se trata con tamoxifeno únicamente en la preparación de adyuvante. Por lo tanto, la prueba se basa en genes más nuevos que aquellos de los competidores pero provee información superior con respecto a alta sensibilidad y valor predictivo negativo, en particular para tumores considerados que presentan un riesgo intermedio de recurrencia con base en factores clínicos estándares.

El ARN total se extrajo con un método de aislamiento de Siemens, basado en esferas de sílice y completamente automatizado para ARN de una sección de tejido de FFPE entera de 10 µt? en un robot de manejo de líquido MICROLAB STARlet de Hamilton (17) . El robot, reguladores de pH y compuestos químicos son parte de un sistema molecular de kPCR Siemens VERSANT® (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY; no comercialmente disponible en los Estados Unidos) . En breve, 150 µ? de regulador de pH FFPE (regulador de pH FFPE, reactivo de investigación, Siemens Healthcare Diagnostics) se añadieron a cada sección y se incubaron durante 30 minutos a 80°C con agitación para fundir la parafina. Después de enfriar, se añadió proteinasa K y se incubó durante 30 minutos a 65 °C. Después de lisis, los residuos de tejido residuales fueron removidos del fluido de lisis por un paso de incubación de 15 minutos a 65°C con 40 µ? de esferas de óxido de hierro revestidas con sílice. Las esferas con residuos de tejido unido a superficie fueron separados con un imán y los lisados fueron transferidos a un placa de pozos de profundo (96 pozos) de 2 mi estándar. En esta, el ARN y ADN totales se unieron a 40 µ? de esferas no usadas y se incubaron a temperatura ambiente. Las condiciones caotrópicas se produjeron mediante la adición de 600 µ? de regulador de pH de lisis. Después, las esferas fueron magnéticamente separadas y los sobrenadantes fueron desecharon. Posteriormente, los ácidos nucleicos unidos a superficie se lavaron tres veces seguida por magnetización, aspiración y desecho de sobrenadantes. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyeron por incubación de las esferas con 100 µ? de regulador de pH de elución durante 10 minutos a 70°C con agitación. Finalmente, las esferas se separaron y el sobrenadante se incubó con 12 µ? de mezcla de ADNasa I (2 µ? de ADNasa I (libre de ARNasa) ; 10 µ? de regulador de pH de ADNasa I lOx; Ambion/Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) para remover ADN contaminante. Después de la incubación durante 30 minutos a 37°C, la solución de ARN total libre de ADN se puso en alícuotas y se almacenó a -80°C o se usó directamente para análisis de expresión de ARNm por PCR cinética de transcripción inversa (RTkPCR) . Todas las muestras se analizaron con RT-kPCR de un solo paso para la expresión de gen de hasta tres genes de referencia (RPL37A, CALM2 , OAZ1) y hasta 16 genes objetivos en un ABI PRISM® 7900HT (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) . El sistema de RT-PCR cuantitativo de un paso SuperScript® III Platinum® con ROX ( 6-carboxi-X-rodamina) (Invitrogen, arlsruhe, Alemania) se usó de conformidad con las instrucciones del fabricante. Sondas y cebadores respectivos se muestran en la tabla 1. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 30 minutos a 50°C, 2 minutos a 95°C seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 30 segundos a 60°C. Todas las pruebas de PCR se realizaron por triplicado. Como marcador sustituto para rendimiento de ARN, el gen de mantenimiento, valor de umbral de ciclo de RPL37A (Ct) se usó como se describe en otra parte (17) . Los niveles de expresión de genes relativos de los genes objetivos se calcularon por el método de delta-Ct mediante el uso de la fórmula: 20 - (Ct (objetivo) - media (Ct (genes de referencia))) .

Una transferencia de plataforma de arreglos de Affymetrix HG_U133A (tejido congelado fresco) a PCR en tiempo real cuantitativa (tejido FFPE) se calculó como sigue. Material de 158 pacientes se midió mediante el uso de ambas plataformas para producir muestras pareadas. Valores de Delta-Ct se calcularon a partir de los datos de PCR. Expresiones de Log2 se calcularon a partir de los datos de Affymetrix al aplicar una unión más baja (fijar todos los valores por debajo de la unión más baja a la unión más baja) y después calcular el logaritmo de base 2. La aplicación de una unión más baja reduce el efecto de ruido de medición relativo incrementado para genes/muestras expresados bajos; una unión más baja de 20 se usó, uniones más bajas entre 0.1 y 200 también funcionaron bien. Un conjunto de sondas HG_U133a se seleccionó para cada gen medido por PCR al aumentar al máximo el coeficiente de correlación de Pearson entre el valor de delta-Ct (de PCR) y la expresión log2 (de Affymetrix) . Otras medidas de correlación también funcionaron bien, v.gr., el coeficiente de correlación de Spearman. En la mayoría de los casos, el conjunto de sondas de mejor correlación perteneció al gen pretendido, para los casos restantes el gen-PCR fue removido para procesamiento posterior. Aquellos genes que mostraron una mala correlación entre las plataformas también fueron removidos, en donde un umbral en el coeficiente de correlación de Pearson de 0.7 se usó (valores de entre 0.5 y 0.8) también funcionaron bien. La transformación de plataforma fue finalizada al calcular z-transformaciones no supervisadas para ambas plataformas y combinándolas; un solo valor de PCR-delta-Ct fue después transformado a la escala de Affymetrix mediante los siguientes pasos: (i) aplicar transformación lineal afín en donde los coeficientes fueron determinaron por z-transformación de datos de PCR, (ii) aplicar transformación lineal afín inversa en donde los coeficientes fueron determinados por z-transformación de datos de Affymetrix, (iii) invertir log2, es decir, calcular exponencial con respecto a base 2. Alternativas a las z-transformaciones duplicadas son regresión lineal o de orden más alto, regresión robusta o métodos basados en componente principal, que también funcionarán bien.

Las secuencias de los cebadores y sondas fueron como sigue: Tabla 1 Secuencias de cebadores y sondas para los genes respectivos: Gen sonda Sec cebador hacia adelante Sec cebador hacia atrás Sec ID IDu mu ABAT TCGCCCTAAGAGGCTCTTCCTC 1 GGCAACTTGAGGTCTGACTTTTG 2 GGTCAGCTCACAAGTGGTGTGA 5 3 ADRA2A TTGTCCTTTCCCCCCTCCGTGC 4 CCCCAAGAGCTGTTAGGTATCAA 5 TCAATGACATGATCTCAACCAGAA 6 APOD CATCAGCTCTCAACTCCTGGTTTAACA 7 ACTCACTAATGGAAAACGGAAAGATC 8 TCACCTTCGATTTGATTCACAGTT 9 ASPH TGGGAGGAAGGCAAGGTGCTCATC 10 TGTGCCAACGAGACCAAGAC 11 TCGTGCTCAAAGGAGTCATCA 12 AURKA CCGTCAGCCTGTGCTAGGCAT 13 AATCTGGAGGCAAGGTTCGA 14 TCTGGATTTGCCTCCTGTGAA 15 BIRC5 AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACA 16 CCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAG 17 CAACCGGACGAATGCTTTTT 18 CELSR2 ACTGACTTTCCTTCTGGAGCAGGTGGC 19 TCCAAGCATGTATTCCAGACTTGT 20 TGCCCACAGCCTCTTTTTCT 21 CHPT1 CCACGGCCACCGAAGAGGCAC 22 CGCTCGTGCTCATCTCCTACT 23 CCCAGTGCACATAAAAGGTATGTC 24 CXCL12 CCACAGCAGGGTTTCAGGTTCC 25 GCCACTACCCCCTCCTGAA 26 TCACCTTGCCAACAGTTCTGAT 27 CYBRD1 AGGGCATCGCCATCATCGTC 28 GTCACCGGCTTCGTCTTCA 29 CAGGTCCACGGCAGTCTGT 30 DCN TCTTTTCAGCAACCCGGTCCA 31 AAGGCTTCTTATTCGGGTGTGA 32 TGGATGGCTGTATCTCCCAGTA 33 10 DHCR7 TGAGCGCCCACCCTCTCGA 34 GGGCTCTGCTTCCCGATT 35 AGTCATAGGGCAAGCAGAAAATTC 36 E2F8 CAGGATACCTAATCCCTCTCACGCAG 37 AAATGTCTCCGCAACCTTGTTC 38 CTGCCCCCAGGGATGAG 39 EPHX2 TGAAGCGGGAGGACTTTTTGTAAA 40 CGATGAGAGTGTTTTATCCATGCA 41 GCTGAGGCTGGGCTCTTCT 42 ESR1 ATGCCCTTTTGCCGATGCA 43 GCCAAATTGTGTTTGATGGATTAA 44 GACAAAACCGAGTCACATCAGTAATAG 45 GJA1 TGCACAGCCTTTTGATTTCCCCGAT 46 CGGGAAGCACCATCTCTAACTC 47 TTCATGTCCAGCAGCTAGTTTTTT 48 HSPA2 CAAGTCAGCAAACACGCAAAA 49 CATGCACGAACTAATCAAAAATGC 50 ACATTATTCGAGGTTTCTCTTTAATGC 51 IL6ST CAAGCTCCACCTTCCAAAGGACCT 52 CCCTGAATCCATAAAGGCATACC 53 CAGCTTCGTTTTTCCCTACTTTTT 54 INPP4B TCCGAGCGCTGGATTGCATGAG 55 GCACCAGTTACACAAGGACTTCTTT 56 TCTCTATGCGGCATCCTTCTC 57 MAPT AGACTATTTGCACACTGCCGCCT 58 GTGGCTCAAAGGATAATATCAAACAC 59 ACCTTGCTCAGGTCAACTGGTT 60 MGP CCTTCATATCCCCTCAGCAGAGATGG 61 CCTTCATTAACAGGAGAAATGCAA 62 ATTGAGCTCGTGGACAGGCTTA .63 NEK2 TCCTGAACAAATGAATCGCATGTCCTACAA 64 ATTTGTTGGCACACCTTATTACATGT 65 AAGCAGCCCAATGACCAGATa 66 15 PCNA AAATACTAAAATGCGCCGGCAATGA 67 GGGCGTGAACCTCACCAGTA 68 CTTCGGCCCTTAGTGTAATGATATC 69 PG TTGATAGAAACGCTGTGAGCTCGA 70 AGCTCATCAAGGCAATTGGTTT 71 ACAAGATCATGCAAGTTATCAAGAAGTT 72 PIP TGCATGGTGGTTAAAACTTACCTCA 73 TGCTTGCAGTTCAAACAGAATTG 74 CACCTTGTAGAGGGATGCTGCTA 75 PIiAT CAGAAAGTGGCCATGCCACCCTG 76 TGGGAAGACATGAATGCACACTA 77 GGAGGTTGGGCTTTAGCTGAA 78 PRSS16 CACTGCCGGTCACCCACACCA 79 CTGAGGAGCACAGAACCTCAACT 80 CGAACTCGGTACATGTCTGATACAA 81 PTGER3 TCGGTCTGCTGGTCTCCGCTCC 82 CTGATTGAAGATCATTTTCAACATCA 83 GACGGCCATTCAGCTTATGG 84 PTPRT TTGGCTTCTGGACACCCTCACA 85 GAGTTGTGGCCTCTACCATTGC 86 GAGCGGGAACCTTGGGATAG 87 RACGAP1 ACTGAGAATCTCCACCCGGCGCA 88 TCGCCAACTGGATAAATTGGA 89 GAATGTGCGGAATCTGTTTGAG 90 RBBP8 ACCGATTCCGCTACATTCCACCCAAC 91 AGAAATTGGCTTCCTGCTCAAG 92 AAAACCAACTTCCCAAAAATTCTCT 93 SCÜBE2 CTAGAGGGTTCCAGGTCCCATACGTGACATA 94 TGTGGATTCAGTTCAAGTCC TG 95 CCATCTCGAACTATGTCTTCAATGAGT 96 SEC1 L2 TGGGAGGCATGCAACGCGTG 97 AGGTCTTACTAAGCAGTCCCATCTCT 98 CGACCGGCACCTGAACTC 99 SQLE TATGCGTCTCCCAAAAGAAGAACACCTCG 100 GCAAGCTTCCTTCCTCCTTCA 101 CCTTTAGCAGTTTTCTCCATAGTTTTATATC 102 TFAP2B CAACACCACCACTAACAGGCACACGTC 103 GGCATGGACAAGATGTTCTTGA 104 CCTCCTTGTCGCCAGTTTTACT 105 T0P2A CAGATCAGGACCAAGATGGTTCCCACAT 106 CATTGAAGACGCTTCGTTATGG 107 CCAGTTGTGATGGATAAAATTAATCAG 108 TRIM29 TGCTGTCTCACTACCGGCCATTCTACG 109 TGGAAATCTGGCAAGCAGACT 110 CAATCCCGTTGCCTTTGTTG 111 UBE2C TGAACACACATGCTGCCGAGCTCTG 112 CTTCTAGGAGAACCCAACATTGATAGT 113 GTTTCTTGCAGGTACTTCTTAAAAGCT 114 WNT5A TATTCACATCCCCTCAGTTGCAGTGAATTG 115 CTGTGGCTCTTAATTTATTGCATAATG 116 TTAGTGCTTTTTGCTTTCAAGATCTT 117 STC2 TCTCACCTTGACCCTCAGCCAAG 118 ACATTTGACAAATTTCCCTTAGGATT 119 CCAGGACGCAGCTTTACCAA 120 AZGP1 CACCAGCCACCAGGCCCCAG 121 TCCTGGACCGGCAAGATC 122 TAGGCCAGGCACTTCAGTTTC 123 CALM2 TCGCGTCTCGGAAACCGGTAGC 124 GAGCGAGCTGAGTGGTTGTG 125 AGTCAGTTGGTCAGCCATGCT 126 CDH1 CCTGCCAATCCCGATGAAATTGGAAAT 127 TGAGTGTCCCCCGGTATCTTC 128 TCAGCCGCTTTCAGATTTTCA 129 NMU ACCCTGCTGACCTTCTTCCATTCCGT 130 AGAAATTGGCTTCCTGCTCAAG 131 AAAACCAACTTCCCAAAAATTCTCT 132 0AZ1 TGCTTCCACAAGAACCGCGAGGA 133 CGAGCCGACCATGTCTTCAT 134 AAGCCCAAAAAGCTGAAGGTT 135 PVALB AAGTTCTTCCAAATGGTCGGCC 136 CCGACTCCTTCGACCACAA 137 CATCATCCGCACTCTTTTTCTTC 138 RPL37A TGGCTGGCGGTGCCTGGA . 139 TGTGGTTCCTGCATGAAGACA 140 GTGACAGCGGAAGTGGTATTGTAC 141 15 La tabla 2 siguiente lista los genes usados en los métodos de la invención y en las modalidades particulares T5; TI, T4, y T5b. La tabla 2 también muestra si la sobreexpresión de un gen dado es indicativa de resultado bueno o malo bajo terapia con tamoxifeno. La tabla 2 lista la función del gen, la localización de compartimento dentro de la célula y los procesos celulares en los que está implicado.

Tabla 2. Lista de genes de algoritmos T5, TI, T4 y T5b; La tabla 3 siguiente muestra las combinaciones de genes usadas para cada algoritmo Tabla 3 : Combinación de genes para los algoritmos respectivos La tabla 4 siguiente muestra ID de conjunto de sondas Affy y mapeo de ID de diseño de TaqMan de los genes marcadores de la presente invención.

Tabla 4; símbolo de gen, ID de conjunto de sondas Affy y mapeo de ID de diseño de TaqMan; La tabla 5 siguiente muestra nombres completos, Entrez GeneID, número de acceso a banco de genes y localización cromosómica de los genes marcadores de la presente invención.

Símbolo Nombre completo Entrez Número de Localización oficial oficial GeneID acceso UBE2C Enzima 11065 U73379 20ql3.12 conjugadora de ubiquitina E2C BIRC5 5 que contiene 332 U75285 17q25 repetición y IAP baculoviral DHCR7 7-deshidro- 1717 AF034544 llql3.4 colesterol reductasa STC2 estaniocalcina 2 8614 AB012664 5q35.2 RBBP8 proteína 8 de 5932 AF043431 18qll.2 unión a retinoblastoma IL6ST transductor de 3572 M57230 5qll señal de interleucina 6 MGP proteína Gla de 4256 M58549 12pl2.3 matriz AZGP1 alfa-2- 563 BC005306 llq22.1 glicoproteína 1, unión a zinc RACGAP1 Proteína 1 29127 NM_013277 12ql3 activadora de Rae GTPasa AURKA Aurora cinasa A 6790 BC001280 20ql3 PVALB parvalbúmina 5816 NM_002854 22ql3.1 NMU neuromedina U 10874 X76029 4ql2 PTGER3 receptor 3 de 5733 X83863 lp32.1 prostaglandina E (subtipo EP3) CXCL12 quimiocina 6387 L36033 lOqll.l (motivo C-X-C) ligando 12 (factor derivado de células estromales 1) ABAT 4 -aminobutirato 18 L32961 16pl3.2 aminotransferasa CDH1 caderina 1, tipo 999 L08599 16q22.1 1, E-caderina (epitelial) PIP proteína inducida 5304 N M_002652 7q32-qt por prolactina Algoritmo T5 de ejemplo: El algoritmo T5 es un comité de cuatro miembros, en donde cada miembro es una combinación lineal de dos genes. Las fórmulas matemáticas para T5 se muestran a continuación; la notación es la misma que para TI. T5 se puede calcular a partir de los datos de expresión de gen únicamente. riskMemberl = 0.434039 [0.301..0.567] * (0.939 * BIRC5 -3.831) -0.491845 [-0.714.. -0.270] * (0.707 * RBBP8 -0.934) riskMember2 = 0.488785 [0.302..0.675] * (0.794 * UBE2C -1.416) -0.374702 [-0.570..-0.179] * (0814 * IL6ST -5.034) riskMember3 = -0.39169 [-0.541.. -0.242] * (0.674 * AZGP1 -0.777) +0.44229 [0.256..0.628] * (0.891 * DHCR7 -4.378) risk ember4 = 0.377752 [-0.543.. - 0.212] * (0.485 * MGP +4.330) -0.177669 [-0.267..-0.088] * (0.826 * STC2 -3.630) risk = riskMemberl + riskMember2 + riskMembe 3 + riskMember4 Los coeficientes a la izquierda de cada línea se calcularon como coeficientes de regresión de peligros proporcionales de COX, los números entre corchetes denotan indican límites de confianza al 95% para estos coeficientes. En otras palabras, en lugar de multiplicar el término (0.939 * BIRC5 -3.831) con 0.434039, se puede multiplicar con cualquier coeficiente entre 0.301 y 0.557 y aún dar un resultado predictivo en los límites de confianza al 95%. Los términos entre paréntesis a la derecha de cada línea denotan una transferencia de plataforma de PCR a Affymetrix: Las variables PVALB, CDH1, ... denotan expresiones basadas en PCR normalizadas por los genes de referencia (valores de delta-Ct) , el término entero dentro de los paréntesis corresponde al logaritmo (base 2) de valores de expresión de microarreglo de Affymetrix de conjuntos de sondas correspondientes.

El rendimiento del algoritmo T5 se probó en pacientes tratados con tamoxifeno o anastrozol con no más de 3 nodos linfáticos positivos y tumores ER+, HER2- quienes participaron en los ensayos clínicos aleatorizados ABCSG06 (n=332) o ABCSG08 (n=1244) . Como se muestra en la figura 1, el análisis de regresión de Cox revela, que la puntuación T5 tiene una asociación significativa con el desarrollo de metástasis distante en todos los cohortes probados.

Se realizó análisis de Kaplan Meier, después de clasificar a los pacientes de cohortes ABCSG combinados mediante el uso de un corte predefinido para puntuación T5. Los pacientes con un bajo riesgo de desarrollar una metástasis distante tuvieron una puntuación T5 = -9.3, mientras que los pacientes con alto riesgo de desarrollar una metástasis distante tuvieron una puntuación T5 por arriba de -9.3. Como se muestra en la figura 2, la separación altamente significativa de ambos grupos de riesgo se observa.

De manera importante, la puntuación T5 se evaluó y se comparó contra "Adjuvant ! Online" , una herramienta en línea para ayudar en la selección de terapia basada en entrada de parámetros clínicos tales como tamaño del tumor, grado del tumor y estado nodal. Cuando la puntuación T5 se probó por de regresión de Cox bivariada contra la puntuación de riesgo de recaída de adyuvante en línea, ambos puntuaciones permanecieron en asociación significativa con el desarrollo de metástasis distante. La regresión de Cox bivariada mediante el uso de datos dicotomizados , que fueron estratificados de conformidad con T5 (corte -9.3), respectivamente, a Adjuvant ! Online (corte 8), nuevamente produjeron asociaciones altamente significativas e independientes con el tiempo a metástasis como punto final clínico.

Tabla 6: Regresión de Cox bivariada de T5 y Adjuvant 1 Online con HR = relación de peligro, CI al 95% = intervalo de confianza al 95%, p = valor de P.

Las curvas de Kaplan Meyer ilustrativas se muestran en la figura 1 en donde Alto = Grupo de Riesgo Alto, Bajo = Grupo de Riesgo Bajo de acuerdo con un corte predefinido.

Un valor alto de la puntuación T5 indica un riesgo incrementado de ocurrencia de metástasis distante en un período dado.

Se ha mostrado que este es el caso para pacientes que han sido tratados con tamoxifeno y también para pacientes que han sido tratados con inhibidores de aromatasa.

Algoritmo TI de ejemplo: El algoritmo TI es un comité de tres miembros en donde cada miembro es una combinación lineal de hasta cuatro variables. En general, las variables pueden ser expresiones de gen o variables clínicas. En TI, la única variable que no es gen es el estado nodal codificado con 0, si el paciente es nodo linfático negativo y 1 si el paciente es nodo linfático positivo. Las fórmulas matemáticas para TI se muestran a continuación: riskMemberl = +0.193935 = [0.108..0.280] * (0.792 * PVALB -2.189) -0.240252 [-0.400..-0.080] + (0.859 * CDH1 -2.900) -0.270069 [-0.385..-0.155] * (0.821 * STC2 -3.529) +1.2053 [0.534..1.877] *nodalStatus riskMember2 = -0.25051 [- 0.437.. - 0.0S4] * (0.558 * CXCL12 +0.324) -0.421992 [-0.687..-0.157] * (0.715 * RBBP8 -1.063) +0.148497 [0.029..0.268] * (1.823 * N U -12.563) +0.293563 [0.108..0.479] * (0.989 * BIRC5 -4.536) riskMember3 = +0.308391 [0.074. .0.543] * (0.812 * AURKA -2.656) -0.225358 [-0.395.. -0.055] * (0.637 * PTGER3 + 0.492] -0.116312 [-0.202.. -0031] * (0.724 * PIP + 0.985) risk riskMemberl + riskMember2 + riskMember3 Los coeficientes a la izquierda de cada línea se calcularon como coeficientes de regresión de peligros proporcionales de Cox, los números entre corchetes denotan límites de confianza al 95% para estos coeficientes. Los términos entre paréntesis a la derecha de cada línea denotan transferencia de plataforma de PCR a Affymetrix: Las variables PVALB, CDH1, ... denotan expresiones basadas en PCR normalizadas por los genes de referencia, el término entero dentro de los paréntesis corresponde al logaritmo (base 2) de valores de expresión de microarreglo de Affymetrix de conjuntos de sonda correspondientes Algoritmo T4 de ejemplo: El algoritmo T4 es una combinación lineal de motivos. Los 10 genes principales de varios análisis de conjuntos de datos de Affymetrix y datos de PCR se agruparon a motivos. Los genes que no pertenecían a una agrupación se usaron como motivos de gen individuales. Los coeficientes de regresión de peligros proporcionales de Cox se encontraron en un análisis multivariado .

En general, los motivos pueden ser expresiones de un solo gen o significan expresiones de gen de genes correlacionados . Las fórmulas matemáticas para T4 se muestran a continuación. prolif = ((0.84 [0697..0977] * RACGAP1 -2.174) + (0.85 [0713.. 0988] * DHCR7 -3.808) + (0.94 [0.786..1.089] * BIRC5 -3.734))/3 motiv2 = ((0.83 [0.693..0.96] * IL6ST -5.295) + (1.11 [0.930.. 1.288] * ABAT -7.019) + (0.84 [0.701..0.972] * STC2 -3.857))/3 ptger3 = (PTGER3 * 0.57 [0.475..0.659] + 1.436) CXC112 = (CXCL12 * 0.53 [0.446..0.618] + 0.847) pvalb = = (PVALB * 0.67 [0.558..0.774] -0.466) Los factores y compensaciones para cada gen denotan una transferencia de plataforma de PCR a Affymetrix: Las variables RACGAP1, DHCR7 , ... denotan expresiones basadas en PCR normalizadas por CALM2 y PPIA, el término entero dentro de los paréntesis corresponde al logaritmo (base 2) de valores de expresión de microarreglo de Affymetrix de conjuntos de sonda correspondientes. Los números entre corchetes denotan límites de confianza al 95% para estos factores .

Como el algoritmo tuvo un rendimiento aún mejor en combinación con una variable clínica, el estado nodal se añadió. En T4 el estado nodal es codificado como 0, si el paciente es nodo linfático negativo y 1 si el paciente es nodo linfático positivo. Con esto, el algoritmo T4 es: risk = -0.32 [-0.510.. -0.137] * motiv2 + 0.65 [0.411..0.886] * prolif - 0.24 [-0.398..-0.08] * ptger3 - 0.05 [-0.225..0.131] * cxcll2 + 0.09 [0.019..0.154] * pvalb + nodalStatus Los coeficientes del riesgo se calcularon como coeficientes de regresión de peligros proporcionales de Cox, los números entre corchetes denotan límites de confianza al 95% para estos coeficientes.

El algoritmo T5b es un comité de dos miembros en donde cada miembro es una combinación lineal de cuatro genes. Las fórmulas matemáticas para T5b se muestran a continuación, la notación es la misma que para TI y T5. En T5b una variable que no es gen es el estado nodal codificado como 0 si el paciente es nodo linfático negativo y 1 si el paciente es nodo linfático positivo y 0.5 si se desconoce el estado del nodo linfático. T5b está definido por: riskMemberl = 0.359536 [0.153..0.566] * (0.891 * DHCR7 -4.378) -0.288119 [-0.463..-0.113] * (0.485 * MGP + 4.330) 0.257341 [0.112..0.403] * (1.118 * NMU -5.128) -0.337663 [-0.499..-0.176] * (0.674 * AZGP1 - 0.777) riskMember2 = -0.374940 [-0.611.. -0.139] * (0.707 * RBBP8 -0.934) -0.387371 [-0.597.. -0.178] * (0814 * IL6ST -5.034) +0.800745 [0.551..1.051] * (0.860 * RACGAP1 -2.518) +0.770650 [0.323..1.219] * Nodalstatus risk = riskMemberl + riskMember2 El experto en la técnica entiende que estos algoritmos representan ejemplos particulares y que con base en la información referente a la asociación de la expresión de gen con el resultado como se da en la tabla 2, se puede establecer algoritmos alternativos mediante el uso de habilidades de rutina.

Simplificación de algoritmo al utilizar subconjuntos de genes El "algoritmo T5 de ejemplo" es un predictor de comité que consiste de 4 miembros con 2 genes de interés cada uno. Cada miembro es un predictor independiente y autocontenido de recurrencia distante, cada miembro adicional contribuye a la robustez y poder predictivo del algoritmo para predecir el tiempo para metástasis, tiempo para muerte o probabilidad de supervivencia para un paciente con cáncer de mama. La siguiente ecuación muestra el "Algoritmo de Ejemplo T5" ; para facilidad de lectura, el número de dígitos después del punto decimal ha sido truncado a 2; el intervalo entre corchetes lista el intervalo estimado de los coeficientes (media +/- 3 desviaciones estándares) .

Algoritmo T5 : +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [ - 0.57.. - 0.09] * RBBP8 +0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55.. -0.06] * IL6ST -0.28 [-0.43..-0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 -0.18 [-0.31..-0.06] * MGP -0.13 [-0.25.. -0.02] * STC2 c-indices: trainSet = 0.724.

Los nombres de genes en el algoritmo denota la diferencia de la expresión de ARNm del gen comparado con uno o más genes de mantenimiento como se describió anteriormente.

El análisis de un cohorte diferente del cohorte encontrado (234 muestras de tumor) fue sorprendente para aprender que algunas simplificaciones del "Algoritmo T5 original" aún dio un rendimiento de diagnóstico no significativamente inferior al algoritmo T5 original. La simplificación más directa fue reducir el predictor de comité a un miembro únicamente. Ejemplos para el rendimiento de los "comités de un miembro" se muestra a continuación: miembro 1 únicamente: +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57.. -0.09] * RBBP8 c- Índices: trainSet=0.653 , independentCohort = 0.681 miembro 2 únicamente: 0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55.. -0.06] * IL6ST c-indices: trainSet=0.664 , independentCohort = 0.696 miembro 3 únicamente : -0.28 [-0.43.. -0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 c-indices : trainSet=0.666. independentCohort = 0.601 miembro 4 únicamente : -0.18 [-0.31.. -0.06] * MGP -0.13 [ - 0.25.. - 0.02] * STC2 c- Índices: trainSet=0.668 , independentCohort = 0.593 El rendimiento de los comités de miembro como se muestra en una cohorte independiente de 234 muestras es reducido notablemente en comparación con el rendimiento del algoritmo completo. Sin embargo, al usar un comité que consiste de algunos miembros permite un estimado más simple, menos costoso del riesgo de recurrencia de cáncer de mama o muerte de cáncer de mama que podría ser aceptable para ciertos propósitos de diagnóstico.

La combinación gradual de más de uno pero menos de cuatro miembros a un nuevo algoritmo de predictor de comité de pronóstico, frecuentemente conduce a un incremento pequeño pero significativo en el rendimiento de diagnóstico en comparación con un comité de un miembro. Fue sorprendente aprender que hubo mejoras marcadas por alguna combinación de miembros de comité, mientras que otras combinaciones casi no mejoraron. Inicialmente, la hipótesis fue que una combinación de miembros que representaron motivos biológicos similares como los reflejados por los genes utilizados dio una mejora menor que los miembros de combinación que reflejaron diferentes motivos biológicos de manera distinta. Sin embargo, este no fue el caso. Ninguna regla se pudo identificar para predecir la combinación de algunos genes para generar un algoritmo que mostrara más poder de pronóstico que otra combinación de genes. Combinaciones prometedoras sólo se pudieron seleccionar con base en datos experimentales .

Combinaciones identificadas de miembros de comité combinados para dar algoritmos simplificados pero poderosos, se muestras a continuación: miembros 1 y 2 únicamente : +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [- 0.57.. - 0.09] * RBBP8 +0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [- 0.55.. - 0.06] * IL6ST c- Índices: trainSet=0.675 , independentCohort = 0.712 miembros 1 y 3 únicamente : +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [- 0.57.. -0.09] * RBBP8 -0.28 [-0.43.. -0.12] * AZGP1 +0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 c-indices: trainSet=0.697 , independentCohort=0.688 miembros 1 y 4 únicamente : +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57.. -0.09] * RBBP8 -0.18 [-0.31.. -0.06] * MGP -0.13 [- 0.25.. -0.02] * STC2 c-indices : trainSet=0.705 , independentCohort=0.679 miembros 2 y 3 únicamente: +0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [- 0.55.. - 0.06] * IL6ST -0.28 [-0.43.. -0.12] * AZGP1 0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 c-indices: trainSet=0.698 , independentCohort=0.670 miembros 1, 2 y 3 únicamente: 0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57.. -0.09] * RBBP8 0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55.. -0.06] * IL6ST -0.28 [-0.43.. -0.12] * AZGP1 0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 c-indices: trainSet = 0.701, independentCohort = 0.715 Sin omitir miembros de comité completos excepto un solo gen o genes de diferentes miembros de comité, también es posible pero requiere un recondicionamiento del algoritmo entero. Sin embargo, también puede ser ventajoso de realizar. El rendimiento de algoritmos simplificados generados por al omitir miembros enteros o genes individuales es en gran medida idéntico.

Variantes de algoritmo de sustitución de genes Los algoritmos descritos, tales como "algoritmo T5 de ejemplo", anteriores también pueden ser modificados al remplazar uno o más genes por uno o más de otros genes . El propósito de esas modificaciones es reemplazar genes difíciles de medir sobre una plataforma específica por un gen más directo para probar en esta plataforma. Aunque esa transferencia puede no necesariamente producir un rendimiento mejorado en comparación con un algoritmo inicial, puede dar el indicio para implantar el algoritmo de pronóstico a una plataforma de diagnóstico particular. En general, el reemplazo de un gen por otro gen mientras se conserva el poder de diagnóstico del algoritmo predictivo se puede lograr mejor al remplazar mejor un gen por un gen co-expresado con una correlación alta (mostrada, v.gr., por el coeficiente de correlación de Pearson) . Sin embargo, se debe tener en mente que la expresión de ARNm de dos genes altamente correlativos en una plataforma puede parecer muy independiente uno de otro cuando se evalúan en otra plataforma. Por consiguiente, ese reemplazo aparentemente fácil, cuando es reducido a la práctica experimentalmente, puede dar resultados decepcionantemente pobres, así como resultados sorprendentemente fuertes, siempre según la imponderabilidad de la plataforma utilizada. Al repetir este procedimiento, se pueden remplazar varios genes .

La eficiencia de ese enfoque se puede demostrar al evaluar el rendimiento predictivo de la puntuación de algoritmo T5 y sus variantes sobre los cohortes de validación. La siguiente tabla muestra el c-index con respecto a la recurrencia distante de punto final en dos cohortes de validación.

Tabla 7 Se puede ver que la omisión de uno de los genes T5 , aquí mostrados para BIRC5 por ejemplo, reduce notablemente el rendimiento predictivo. Al reemplazarlo por otro gen produce el mismo rendimiento.

Un mejor método para reemplazar un gen es recondicionar el algoritmo. Puesto que T5 consiste de cuatro miembros de comité independientes, se tiene que recondicionar sólo el miembro que contiene el gen reemplazado. Las siguientes ecuaciones demuestran reemplazos de genes del algoritmo T5 mostrado anterior condicionado en un cohorte de 234 pacientes con cáncer de mama. Sólo un miembro se muestra a continuación, para cálculo de c- índex los miembros restantes se usaron sin cambio del algoritmo T5 original. El intervalo entre corchetes lista el intervalo estimado de los coeficientes: media +/- 3 desviaciones estándares.

Miembro 1 de T5 : Miembro original 1: +0.41 [0.21..0.61] * BIRC5 -0.33 [-0.57.. -0.09] * RBBP8 c-indices: trainSet=0.724 , independentCohort = 0.705 reemplazar BIRC5 por T0P2A en miembro 1 : +0.47 [0.24..0.69] * TOP2A -0.34 [ - 0.58.. - 0.10] * RBBP8 c-indices: trainSet =0.734, independentCohort = 0.694 reemplazar BIRC5 por RACGAPl en miembro 1: +0.69 [0.37..1.00] *RACGAP1 -0.33 [-0.57.. -0.09] * RBBP8 c-indices : trainSet =0.736, independentCohort = 0.743 reemplazar RBBP8 por CELSR2 en miembro 1 : +0.38 [0.19..0.57] * BIRC5 -0.18 [-0. 1..0.05] * CELSR2 c-indices: trainSet =0.726, independentCohort = 0.680 reemplazar RBBP8 por PGR en un miembro : +0.35 [0.15..0.54] * BIRC5 -0.09 [ -0.23..0.05] * PGR c-indices : trainSet = 0.727, independentCohort = 0.731 Miembro 2 de T5 : Miembro original 2 : +0.38 [0.15..0.61] * UBE2C -0.30 [-0.55.. -0.06] * IL6ST c- índices: trainSet = 0.724, independentCohort = 0.725 reemplazar UBE2C por RACGAPl en miembro 2 : +0.65 [0.33..0.96] *RACGAP1 -0.38 [ -0.62.. - 0.13 ] * IL6ST c-indices : trainSet = 0.735, independentCohort = 0.718 reemplazar UBE2C por TOP2A en miembro 2 : +0.42 [0.20..0.65] * TOP2A -0.38 [-0.62.. -0.13] * IL6ST c-indices : trainSet = 0.734, independentCohort = 0.700 reemplazar IL6ST por INPP4B en miembro 2 : +0.40 [0.17..0.62] * UBE2C -0.25 [-0.55..0.05] * INPP4B c-indices: trainSet = 0.725, independentCohort = 0.686 reemplazar IL6ST por MAPT en miembro 2 : +0.45 [0.22..0.69] * UBE2C -0.14 [-0.28..0.01] * MAPT c-indices: trainSet = 0.727, independentCohort = 0.711 Miembro 3 de T5 : Miembro original 3 : -0.28 [-0.43.. -0.12] * AZGPl 0.42 [0.16..0.68] * DHCR7 c-indices: trainSet = 0.724, independentCohort = 0.705 reemplazar AZGPl por PIP en el miembro 3 : -0.10 [-0.18.. -0.02] * PIP +0.43 [0.16..0.70] * DHCR7 c- índices: trainSet = 0.725, independentCohort = 0.692 reemplazar AZGPl por EPHX2 en miembro 3 : -0.23 [-0.43.. -0.02] * EPHX2 0.37 [0.10..0.64] * DHCR7 c- Índices: trainSet = 0.719, independentCohort = 0.698 reemplazar AZGPl por PLAT en miembro 3 : -0.23 [-0.40.. -0.06] * PLAT +0.43 [0.18..0.68] * DHCR7 c- Índices: trainSet = 0.712, independentCohort = 0.715 reemplazar DHCR7 por AUR A en miembro 3 : -0.23 [-0.39..-0.06] * AZGPl +0.34 [0.10..0.58] * AURKA c-indices: trainSet = 0.716, independentCohort = 0.733 Miembro 4 de T5 : Miembro original 4 : -0.18 [-0.31.. -0.06] * MGP -0.13 [-0.25.. - 0.02] * STC2 c- índices: trainSet = 0.724, independentCohort = 0.705 remplazar MGP por APOD en el miembro 4 : -0.16 [-0.30..-0.03] * APOD -0.14 [-0.26.. -0.03] * STC2 c-indices : trainSet = 0.717, independentCohort = 0.679 reemplazar MGP por EGFR en el miembro 4 : -0.21 [-0.37..-0.05] * EGFR -0.14 [-0.26.. -0.03] * STC2 c-indices : trainSet = 0.715, independentCohort = 0.708 reemplazar STC2 por INPP4B en miembro 4 : -0.18 [-0.30.. -0.05] * MGP -0.22 [-0.53..0.08] * INPP4B c-indices : trainSet = 0.719, independentCohort = 0.693 reemplazar STC2 por SEC14L2 en miembro 4 : -0.18 [-0.31.. -0.06] *MGP -0.27 [ - 0.49.. -0.06] * SEC14L2 c-indices: trainSet = 0.718, independentCohort = 0.681 Se puede ver que los reemplazos de genes individuales experimentalmente identificados para una cuantificación con PCR cinética normalmente afectan el rendimiento predictivo del algoritmo T5, evaluado por el c-index únicamente de manera insignificante.

La siguiente tabla (Tabla 8) muestra candidatos a gen de reemplazo para los genes de algoritmo T5. Cada candidato a gen se muestra en una celda de la tabla: el nombre del gen es seguido por el coeficiente de correlación de Pearson absoluto entre paréntesis de la expresión del gen original en el algoritmo T5 y el candidato de reemplazo, y la ID del conjunto de sondas HG-U133A.

Tabla 8 La siguiente tabla (Tabla 9) lista las secuencias de cebador y sonda de qRT-PCR usadas para la tabla de anterior.

Tabla 9 Una segunda alternativa para selección supervisada de posibles candidatos a reemplazo de gen se basa en datos de Affymetrix únicamente. Este tiene la ventaja de que se puede hacer únicamente con base en datos ya publicados (v.gr., de www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) . La siguiente tabla (Tabla 10) lista los candidatos de reemplazo del conjunto de sondas de HG-U133a para los conjuntos de sondas usados en los algoritmos TI - T5. Esto se basa en los datos de condicionados de estos algoritmos. El encabezado de columna contiene el nombre del gen y la ID de conjunto de sonda en negritas. Después, los 10 conjuntos de sonda mejor correlacionados se listan, en donde cada celda de la tabla contiene la ID del conjunto de sondas, el coeficiente de correlación entre paréntesis y el nombre del gen.

Tabla 10 Después de la selección de un gen o un conjunto de sondas se tiene que definir un mapeo matemático entre los valores de expresión del gen para remplazar aquellos del gen nuevo. Existen varias alternativas que se describen aquí con base en los valores de "delta-Ct de reemplazo de BIRC5 por RACGAPl" de ejemplo. En los datos condicionados, la distribución de unión de las expresiones parece similar en la figura 3.

El coeficiente de correlación de Pearson es 0.73. Un enfoque es crear una función de mapeo de RACGAPl a BIRC5 por regresión. La regresión lineal es la primera elección y da en este ejemplo BIRC5 = 1.22 * RACGAPl -2.85.

Mediante el uso de esta ecuación se puede remplazar fácilmente la variable de BIRC5 en v.gr., el algoritmo T5 por el lado de mano derecha. En otros ejemplos, la regresión robusta, regresión polinomial o pre-transformaciones no lineales univariadas pueden ser adecuadas.

El método de regresión asume ruido de medición en BIRC5, pero no ruido en RACGAPl. Por lo tanto, el mapeo no es simétrico con respecto a capacidad de intercambio de las dos variables. Un enfoque de mapeo simétrico se basaría en dos z-transformaciones univariadas. z = (BIRC5 - media (BIRC5) ) / d.e. (BIRC5) y z = (RACGAPl - media (RACGAPl)) / d.e. (RACGAPl) 2 = (BIRC5 - 8.09) / 1.29 = (RACGAP1 - 8.95) / 0.77 BIRC5 = -1.67 * RACGAP1 + 6.89 Nuevamente, en otros ejemplos, otras transformaciones pueden ser adecuadas: normalización por mediana y/o MAD, mapeos no lineales u otros.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para predecir un resultado de cáncer de mama en un tumor positivo para receptor de estrógeno y negativo para HER2 de un paciente con cáncer de mama, caracterizado porque comprende: (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de por lo menos 2 de los siguientes 9 genes: UBE2C, BIRC5 , RACGAP1, DHCR7 , STC2, AZGP1, RBBP8 , IL6ST y MGP; (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico de ese paciente.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de por lo menos 3, 4, 5 ó 6 de los siguientes 9 genes: UBE2C, BIRC5 , RACGAP1 , DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST y MGP

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende: (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de los siguientes 8 genes: UBE2C, RACGAP1 , DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8 , IL6ST y MGP; (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa de un pronóstico de ese paciente.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende: (a) determinar en una muestra de tumor de ese paciente los niveles de expresión de ARN de los siguientes 8 genes: UBE2C, BIRC5, DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8, IL6ST y MGP; (b) combinar matemáticamente los valores de nivel de expresión para los genes de ese conjunto cuyos valores fueron determinados en la muestra de tumor para dar una puntuación combinada, en donde esa puntuación combinada es indicativa dé un pronóstico de ese paciente.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque BIRC5 puede ser reemplazado por UBE2C o T0P2A o RACGAPl o AURKA o NEK2 O E2F8 O PCNA O CYBRD1 O DCN O ADRA2A O SQLE O CXCL12 O EPHX2 O ASPH O PRSS16 O EGFR O CCND1 o TRIM29 o DHCR7 o PIP o TFAP2B o WNT5A o APOD o PTPRT con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y UBE2C puede ser reemplazado por BIRC5 o RACGAP1 o TOP2A o AURKA o NEK2 o E2F8 o PCNA o CYBRD1 o ADRA2A o DCN o SQLE O CCND1 o ASPH o CXCL12 o PIP o PRSS16 o EGFR o DHCR7 o EPHX2 o TRIM29 con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y DHCR7 puede ser reemplazado por AURKA, BIRC5 , UBE2C o por cualquier otro gen que pueda reemplazar a BIRC5 o UBE2C con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y mientras que STC2 puede ser reemplazado por INPP4B o IL6ST o SEC14L2 o MAPT o CHPT1 o ABAT o SCUBE2 o ESR1 o RBBP8 o PGR o PTPRT o HSPA2 o PTGER3 con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y AZGPl puede ser reemplazado por PIP o EPHX2 o PLAT o SEC14L2 o SCUBE2 o PGR con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y RBBP8 puede ser reemplazado por CELSR2 o PGR o STC2 o ABAT o IL6ST con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y IL6ST puede ser reemplazado por INPP4B o STC2 o MAPT O SCUBE2 o ABAT o PGR O SEC14L2 o ESR1 O GJA1 o MGP o EPHX2 o RBBP8 o PTPRT o PLAT con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados; y MGP puede ser reemplazado por APOD o IL6ST o EGFR con la condición de que después de un reemplazo 8 genes diferentes son seleccionados .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el paciente ha recibido terapia con agentes endocrinos o se contempla que recibe tratamiento endocrino.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la terapia con agentes endocrinos comprende tamoxifeno o un inhibidor de aromatasa.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se predice un riesgo de desarrollar recurrencia de cáncer de mama o muerte relacionada con cáncer.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el nivel de expresión se determina como un nivel de expresión de ARN mensajero.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel de expresión es determinado por lo menos por uno de un método basado en PCR, un método basado en microarreglo, y un método basado en hibridación.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque esa determinación de niveles de expresión está en una muestra de tumor embebida en parafina fijada en formalina o en una muestra de tejido congelada.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de expresión de por lo menos un gen marcador se determina como un patrón de expresión en relación con por lo menos un gen de referencia o a un valor de expresión promedio computarizado .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso de combinar matemáticamente comprende un paso de aplicar un algoritmo a valores representativos de niveles de expresión de genes dados .

1 . El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el algoritmo es una combinación lineal de los valores representativos de niveles de expresión de genes dados.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque un valor para un valor representativo de un nivel de expresión de un gen dado es multiplicado con un coeficiente.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque uno, dos o más umbrales se determinan para la puntuación combinada, que discrimina en riesgo alto y bajo, riesgo alto, intermedio y bajo, o más grupos de riesgo al aplicar el umbral en la puntuación combinada.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque una puntuación combinada alta es indicativa de beneficio de quimioterapia citotóxica .

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque información referente al estado nodal del paciente es procesada en el paso de combinar matemáticamente valores de nivel de expresión para que los genes den una puntuación combinada.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18, caracterizado porque la información referente al estado nodal es un valor numérico si el estado nodal es negativo y la información es un valor numérico diferente si el estado nodal es positivo y un número diferente o idéntico si se desconoce el estado nodal.

20. Un kit para llevar a cabo un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el kit comprende un conjunto de olxgonucleótidos capaces de unir específicamente secuencias o a secuencias de fragmentos de los genes en una combinación de genes, en donde la combinación comprende por lo menos los dos de los 9 genes UBE2C, BIRC5 , RACGAP1 , DHCR7 , STC2 , AZGP1, RBBP8 , IL6ST y MGP;

21. Un producto de programa de computadora capaz de procesar valores representativos de niveles de expresión de un conjunto de genes, al combinar matemáticamente esos valores para dar una puntuación combinada, caracterizado porque esa puntuación combinada es indicativa de eficacia de terapia con agentes endocrinos de ese paciente, de conformidad con los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.