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MX2012010721A - Generacion de progenitores mesenquimatosos clonales y lineas de celulas madre mesenquimatosas bajo condiciones sin suero. - Google Patents

Generacion de progenitores mesenquimatosos clonales y lineas de celulas madre mesenquimatosas bajo condiciones sin suero.

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MX2012010721A
MX2012010721A MX2012010721A MX2012010721A MX2012010721A MX 2012010721 A MX2012010721 A MX 2012010721A MX 2012010721 A MX2012010721 A MX 2012010721A MX 2012010721 A MX2012010721 A MX 2012010721A MX 2012010721 A MX2012010721 A MX 2012010721A
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mesenchymal
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cell
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MX2012010721A
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Maksym A Vodyanyk
Igor I Slukvin
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Wisconsin Alumni Res Found
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Publication date
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Abstract

Se describen métodos para obtener células de placa lateral positivas del receptor de Apelina multipotentes, células madre mesenquimatosas, y mesangioblastos bajo condiciones sin suero.

Description

GENERACION DE PROGENITORES MESENQUIMATOSOS CLONALES Y LINEAS DE CELULAS MADRE MESENQUIMATOSAS BAJO CONDICIONES SIN SUERO Campo de la Invención La invención se refiere en general a progenitores mesenquimatosos de primate clónales y a líneas de células madre mesenquimatosas (MSC) y métodos para identificar en general tales células, y más particularmente métodos para generar progenitores mesenquimatosos clónales y líneas MSC bajo condiciones sin suero. La invención además se refiere a una población de precursores de células endoteliales y mesenquimatosas compartidas y métodos para identificar y generar tales células. La invención además se refiere a una población de células que comprenden células mesodérmicas de placa lateral y métodos para su generación y el aislamiento de células madre pluripotentes cultivadas .
Antecedentes de la Invención Durante el desarrollo embrionario de los animales, la gastrulación forma tres capas germinales, es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo, la cual cada una da origen a una célula corporal diferente. El mesodermo se desarrolla de una línea primitiva, una estructura embrionaria temporal formada en el inicio de la gastrulación. El mesodermo naciente transicionalmente se diferencia entre el mesodermo paraxial, el mesodermo intermedio, y el mesodermo de la placa Ref.:235557 lateral. El mesodermo paraxial da origen al esqueleto axial, y a los músculos esqueléticos. El mesodermo intermedio forma el sistema urogenital. El mesodermo de la placa lateral da origen al sistema circulatorio, incluyendo las células sanguíneas, los vasos y el corazón, y forma las visceras y las extremidades. El mesodermo extraembrionario se localiza fuera del desarrollo del embrión. La evidencia sugiere que el mesodermo extraembrionario se deriva de la línea primitiva durante la gastrulación (Boucher and Pedersen, Reprod. Fértil. Dev. 8:765 (1996)) . El mesodermo extraembrionario da origen a varios tejidos que proporcionan al embrión nutrientes, un medio de la disposición de desperdicios y la protección mecánica.
Tanto los mesodermos de placa lateral y extraembrionarios pueden generar células endoteli'ales y sanguíneas y expresan FOXF1 , HAND1 , HAND2, GATA-2, BMP4 , y WNT5a, la expresión de los cuales es baja o indetectable en el mesodermo paraxial e intermedio (Mahlapuu y otros, Development. 128(2) :155 (2001); Firulli y otros, Nat . Genet. 18(3) :266 (1998); Morikawa y otros, Circ . Res. 103(12) :1422 (2008); Kelley y otros, Dev. Biol. 165:193 (1994); Silver y otros, Blood 89(4):1154 (1997); Fuj iwara y otros, Proc . Nati. Acad. Sci. 98(24) :13739 (2001); Takada y otros, Genes Dev. * 8(2) :174 (1994)) . Los diferentes marcadores para el mesodermo de placa lateral y extraembrionario permanecen sin explicación. Un hallazgo reciente de Bosse y otros sugiere que IRX3 se expresa en el mesodermo la placa lateral pero no en el mesodermo extraembrionario (Bosse y otros, Mech. Dev. 69(1-2) :169 (1997)). Para los propósitos de esta solicitud, el término placa lateral se utiliza para describir ambos tejidos.
Ciertos progenitores mesodérmicos comprometidos pueden dar origen a células de más de un linaje. Los ejemplos de tales progenitores incluyen hemangioblastos , que pueden dar origen a ambas células hematopoyéticas y endoteliales . Choi K, y otros, "A common precursor of hematopoietic and endothelial cells" , Development 125:725 (1998).
Las MSC pueden diferenciarse en al menos tres linajes de células mesenquimatosas en corriente abajo (es decir, osteoblastos, condroblastos , y adipocitos) . A la fecha, no se ha identificado un único marcador MSC. Es decir, el criterio morfológico y funcional se utiliza para identificar estas células. Ver, Horwitz E, y otros, "Clarification of thé nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement" , Cytotherapy 7:393 (2005); y Dominici M, y otros, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy 8:315 (2006). Debido a que MSC puede diferenciarse en muchos tipos celulares, la técnica contempla métodos para diferenciar las MSC para terapias con base en células, para medicina regenerativa y para medicina reconstructiva .
Típicamente, las MSC se aislan de la médula espinal de adultos, la grasa, los cartílagos y los músculos. Pittenger F, y otros, "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells" , Science 284:143-147 (1999); Zuk P, y otros, "Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies" , Tissue Eng. 7:211-228 (2001) ; and Young H, y otros, "Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors" , Anat. Rec . 264:51-62 (2001). Las MSC también ha sido aisladas de sangre periférica humana. Kassis I, y otros, "Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads" , Bone Marrow Transplant. 37:967-976 (2006). Las MSC también puede aislarse de tejido neonatal humano tal como la jalea de Wharton (Wang H, y otros, "Mesenchymal stem cells in the Wharton' s jelly of the human umbilical cord" , Stem Cells 22:1330-1337 (2004)), placenta humana (Fukuchi Y, y otros, "Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential", Stem Cells 22:649-658 (2004)); y sangre del cordón umbilical (Erices A, y otros, "Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood" , Br. J. Haematol. 109:235-242 (2000)) y tejidos fetales humanos (Campagnoli C, y otros, "Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow" , Blood 98:2396-2402 (2001) ) .
La técnica se limita a través de la inhabilidad de aislar suficientes MSC para la posterior diferenciación y uso. Cuando están disponibles donadores adecuados, los procedimientos invasivos requeridos para aislar aún un número limitado de células presenta riesgos a los donadores. También permanece la dificultad de mantener las MSC aisladas en un cultivo a largo plazo y para mantener tales cultivos libres de bacterias o contaminación viral .
Los esfuerzos para visualizar métodos para diferenciar células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) incluyen ESC humanas (hESC) para las MSC que ya sea que requieran el cultivo de las células en un medio que contiene suero potencialmente contaminante o que han sido producidas células que retienen características de hESC sin diferenciar. Por ejemplo, Barberi y otros diferenciaron hESC de las MSC en líneas celulares de la estroma de ratón mitóticamente inactivadas (es decir, células alimentadoras) con 20% de suero de bovino fetal inactivado por calor (FBS, por sus siglas en inglés) en medio MEM alfa durante 40 días. Barberi . T, y otros "Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells" , PLoS Med. 2:el61 (2005) . Las células se cosecharon y ensayaron para células CD73, y CD73+ en donde después se plaquearon en la ausencia de las células alimentadoras con 20% de FBS en EM alfa durante 7 a 10 días. Barberi y otros diferenciaron las MSC en células adipogénicas , células condrogénicas , células osteogénicas y células miogénicas .
Igualmente, Olivier y otros diferenciaron hESC de MSC mediante el plaqueo de raspaduras (es decir, células espontáneamente diferenciadas que aparecen en el cultivo hESC en el centro o en lo bordes de las colonias) con medio DIO (DMEM, 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales) cambiado semanalmente hasta que se desarrolló un epitelio multicapa espeso. Olivier E, y otros, "Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells", Stem Cells 24:1914-1922 (2006). Después de aproximadamente 4 semanas, las MSC se aislaron a través de la disociación del epitelio con una mezcla de tripsina, colagenasa de tipo IV y dispasa de 4 a 6 horas, seguido por el re-plaqueo en medio DIO. Las MSC de Olivier y otros crecieron robustamente, tuvieron cariotipos estables, se inhibieron por contacto, se maduraron después de 20 pasajes y se diferenciaron en células adipogénicas y osteogénicas. Olivier y otros no reportaron que las células se diferenciaron en condroblastos . Por el contrario Barberi y otros, Olivier y otros no requirieron células alimentadoras para soportar la diferenciación de las hESC en las MSC. Además, las MSC de Olivier y otros fueron SSEA-4 positivas, sugiriendo que estas MSC se expresaron en marcadores de superficie celular característicos de hESC.
Pike & Shevde diferenciaron hESC de MSC a través de cuerpos embrioides (EB) incubados durante 10 a 12 días en un medio específico mesenquimatoso (medio MesenCult"' con 10% de FBS; MEM alfa con glutamina y nucleósidos; o DMEM con glucosa y glutamina, reemplazado cada 2 días) . Publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0008902. Los EB se digirieron, y las células pre-mesenquimatosas se cultivaron a 80% de confluencia. Las células se tripsinizaron y se hicieron pasar tres veces en medio específico mesenquimatoso.
Meuleman y otros reportaron MSC cultivadas en medios sin suero; sin embargo, posteriormente se descubrió que el medio de hecho contuvo suero de animal como un componente. Meuleman N, y otros, "Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum- free médium allows better expansión than classical alpha-minimal essential médium (MEM)", Eur. J. Haematol. 76:309-316 (2006); y Meuleman N, y otros, "Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free médium allows better- expansión than classical alpha-minimal essential médium (MEM)", Eur. J. Haematol. 77:168 (2007); pero ver, Korhonen M, "Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions: no breakthroughs yet" , Eur. J. Haematol. 77:167 (2007).
Estos métodos cultivaron y diferenciaron MSC en medio conteniendo suero. Las condiciones sin suero para cultivar y diferenciar MSC, si se define, reduciría la variación entre los lotes y eliminaría un riesgo de infección transmitida por sub-productos xenogénicos y patógenos. Sotiropoulou P, y otros, "Cell culture médium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research" , Stem Cells 24:1409-1410 (2006).
Por las razones anteriores, existe la necesidad de algunos métodos para obtener progenitores mesenquimatosos tempranos y MSC, especialmente cuando se derivan bajo condiciones sin suero.
El mesodermo y la cresta neural ambos pueden dar origen a precursores mesenquimatosos durante el desarrollo embrionario. Dennis, J. E., and P. Charbord, "Origin and differentiation of human and murine stroma" , Stem Cells 20:205-214 (2002); Takashima, Y, y otros, "Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation" , Cell 129:1377-1388 (2007). Aunque las condiciones para generar las MSC de origen de la cresta neural de células madre embrionarias han sido descritas, Takashima y otros, supra; Lee, G, y otros, "Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells", Nat Biotechnol 25:1468-1475 (2007) , no se sabe como generar las MSC del mesodermo.
Por las razones anteriores, existe una necesidad de nuevos métodos para obtener progenitores mesenquimatosos tempranos y MSC, particularmente bajo condiciones sin suero. Además, existe la necesidad de identificar y generar MSC derivadas de mesodermo así como progenitores mesodérmicos tempranos que pueden dar origen a las MSC durante la diferenciación de las células madre pluripotentes en MSC.
Breve Descripción de la Invención La invención en general se refiere al precursor mesenquimatoso común identificado y a la célula endotelial, es decir, mesangioblastos , derivados de células madre diferenciadas in vivo.
En un primer aspecto la invención se resume en que un método para generar una población clonal de MSC de primate incluye los pasos de cultivar una suspensión de célula individual de células de primate, heterogéneas que contienen los progenitores mesenquimatosos en un medio sin suero, semisólido conteniendo de aproximadamente 5 y aproximadamente 100 ng/ml de bFGF hasta que se ' forman las columnas independientes, y cultivar una de las colonias independientes en un medio líquido, sin suero conteniendo entre aproximadamente 100 ng/ml, o aproximadamente 5 ng/ml, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 ng/ml, de bFGF para obtener una población clonal sustancialmente pura de MSC.
La suspensión heterogénea para utilizarse en el método puede obtenerse, por ejemplo, mediante la diferenciación de las células pluripotentes de un primate (por ejemplo, humano) , tales como las células ESC o células madre pluripotentes inducidas (iPS) , en cultivo hasta que las células en el cultivo son progenitores mesenquimatosos . Esto puede lograrse a través del co-cultivo de las células pluripotentes con células de la estroma de la médula espinal en un medio que soporta la diferenciación como se describe en la presente durante al menos 2 a 5 días, o a través de la disociación de EB, cuando por sí mismas pueden obtenerse a través del cultivo de células pluripotentes utilizando métodos bien conocidos, y después suspendiendo las células con una suspensión de célula individual. Las células de la estroma de la médula espinal pueden ser células OP9 de ratón. Una suspensión heterogénea sustancialmente libre de algunas o todas las células no derivadas a través de la diferenciación in vitro de células pluripotentes (especialmente células de médula espinal co-cultivada) puede obtenerse a través de la depleción de esas células de la suspensión. Estas células pueden reducirse antes de uso, por ejemplo, a través de la unión no covalente de las células a ser consumidas para anticuerpos monoclonales paramagnéticos específicos para epítopos en las células a ser consumidas y después segregando las células unidas al anticuerpo con un magneto. Las células en una suspensión obtenida de células pluripotentes puede expresar al menos MIXL1 y T (BRACHYURY) .
El medio puede hacerse semisólido mediante la inclusión de aproximadamente 1% de metilcelulosa en el medio. El medio puede opcionalmente contener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 ng/ml de PDGF-BB. La suspensión puede cultivarse durante aproximadamente 10 a aproximadamente 20 días o más para producir las colonias .
Los progenitores mesenquimatosos se identifican como habiendo estado presentes en la suspensión si las colonias mesenquimatosas se forman durante el cultivo en un medio semisólido sin suero suplementado con bFGF. Un ejemplo de tal ensayo formador de colonia dependiente de bFGF para detectar el progenitor mesenquimatoso se describe en la Patente de E. U. A. No. 7,615,374, incorporada en la presente en su totalidad. Las colonias obtenidas en el ensayo formador de colonias puede identificarse como mesenquimatosas a través de su expresión de por lo menos una pluralidad de FOXF1, MSX1 , MSX2, SNAI1, SNAI2, SOX9 y RUNX2. Las características de las colonias incluyen características funcionales, morfológicas y fenotípicas y el perfil de expresión génico. Las características funcionales de las colonias incluyen (1) la estimulación del crecimiento a través de factores que promueven el" crecimiento celular mesenquimatoso (por ejemplo, PDGF-BB, EGF y TGF-alfa) y la supresión del crecimiento a través de factores involucrados en la diferenciación del mesodermo (por ejemplo, VEGF, TGF-beta y Activina A) ; (2) la diferenciación en linajes de células osteogénicas , condrogénicas o adipogénicas ; y (3) la diferenciación en células endoteliales . Las características morfológicas de las colonias incluyen (1) un paquete hermético de células para formar agregados redondos (es decir, esféricos) que miden 100-500 µp\ en diámetro; (2) la formación de colonias a través del establecimiento de estructuras herméticamente empacadas (núcleos) que además se desarrollan en colonias esferoides compactas; y (3) aún después de un cultivo prolongado, la falta de una capa celular exterior densa y la estructura interior irregular, que son características de los EB . Las características fenotípicas de las colonias incluyen (1) la expresión de CD44, CD56, CD105 y CD140a (PDGFRA) , CD146, pero no de los marcadores de superficie hematoendoteliales (es decir, CD31, CD43, CD45 y VE-cadherina) ; ( 2 ) la expresión de FOXF1 , MSX1, MSX2, SNAI1, SNAI2 , SOX9 y RUNX2 ; y (3) la expresión de vicentina, actina de músculo liso alfa, y desmina .
Las colonias mesenquimatosas de esta manera formadas en el método además pueden cultivarse en la presencia de una proteína de matriz extracelular , tal como Matrigel8", colágeno, gelatina o fibronectina, así como una combinación de los mismos.
La invención además se resume como una población sustancialmente pura de líneas MSC derivadas clonalmente producidas de los métodos descritos anteriormente que son positivas para al menos CD44, CD56, CD 73, CD105, CD140a, y CD146, pero negativas para CD31, CD43, CD45 y VE-cadherina .
Las modalidades descritas tienen muchas ventajas, incluyendo que los progenitores mesenquimatosos y las MSC obtenidas en los métodos pueden utilizarse para tratar enfermedades asociadas con los huesos, cartílagos y células adiposas .
Es también una ventaja que puede obtenerse una población clonal de MSC de una sola colonia mesenquimatosa .
También es una ventaja que las células obtenidas en los métodos pueden fácilmente seleccionarse para además la expansión debido a que los progenitores mesenquimatosos tienen un alto potencial de proliferación y forman grandes colonias .
Es aún otra ventaja que las células obtenidas en los métodos pueden ser tolerantes o. tolerogénicas a respuestas alo-inmunitarias y auto-inmunitarias en el trasplante .
Es aún otra ventaja que las células obtenidas en los métodos pueden diferenciarse en al menos los linajes osteogénico, condrogénico y adipogénico.
Es aún otra ventaja que las colonias mesenquimatosas obtenidas en los métodos poseen un potencial angiogénico .
La invención además se resume como una población de células del mesodermo de la placa lateral positiva del receptor de Apelina derivadas in vitro (APLNR+) . Estas células pueden aislarse de poblaciones mixtas de células madre pluripotentes diferenciadas con base en la expresión del receptor de Apelina (APLNR) . Estas células pueden diferenciarse en células de la pared corporal y las visceras dan origen a las colonias mesenquimatosas mesangiogénicas y de blasto hemangiogénico en cultivos de medios semisólidos en la presencia de . bFGF. Las células APLNR+ expresan transcriptos característicos del mesodermo, específicamente del mesodermo de la placa lateral.
Es aún otra ventaja de la invención que las MSC obtenidas a través de los métodos reivindicados son de origen mesodérmico y pueden derivarse de células APLNR+ enriquecidas en células mesodérmicas de placa lateral.
Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción. La descripción de las modalidades preferidas no pretende limitar la invención para cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas. La referencia por consiguiente deberá hacerse a las reivindicaciones de la presente para interpretar el alcance de la invención.
Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1E ilustran las propiedades de dos tipos de colonias derivadas de hESC, es decir colonias mesenquimatosas derivadas de colonias de mesangioblastos (MB) y blastos derivadas de hemangioblastos (HB) . La Figura 1A describe la morfología de la colonias MB y HB seguidas por el crecimiento en medio semisólido durante 3, 5, 7, y 12 días. La Figura IB describe los cinéticos de la formación de colonia dependiente de FGF. Las barras representan la desviación estándar de cuatro experimentos independientes. Dependiendo de si las células individuales derivadas de hESC inicialmente se co-cultivan con células OP9 durante 2 días o 3 días, se asume que son ya sea MB o HB potenciales. La Figura 1C ilustra que bFGF, pero no PDGF - o VEGF solo, soportan ambas formaciones de colonias MB y HB. Los datos se representan como la media ± SD (n=4) . El asterisco indica la significancia estadística (p <0.01) entre cultivos que contienen FGF solo y FGF en combinación con cualquiera de PDGF o VEGF. La Figura ID ilustra la diferenciación potencial de colonias derivadas de MB o derivadas de HB después del co-cultivo con células OP9 durante 4 días. La citometría de flujo demuestra que las células derivadas de colonia MB recolectadas en el día 12 del cultivo clonogénico dan origen a células mesenquimatosas CD146+CD31" y endoteliales CD31+CD43~, a pesar de que las células derivadas de la colonia HB dan origen a células endoteliales CD31+CD43" y células de linaje hematopoyético CD43+. La Figura 1E ilustra el análisis de inraunotinción de clústeres de células desarrolladas de una sola colonia MB (parte superior, barra escalas, 100 µ??) y HB (parte inferior, barra escala, 50 µp\) recolectadas en el día 5 del cultivo clonogénico. Las células se identificaron como CD144+ (también conocidas como VE-cadherina) CD43" endotelial, CD43+ hematopoyética, y calponina+ CD144" mesenquimatosa . La barras a escala representan 100 µ??. Las colonias desarrolladas de los clústeres de células de una colonia de MB individual generaron células mesenquimatosas de calponina+CD144 (VE-cadherina) " y células endoteliales CD144 (VE-cadherina) +calponina" (panel superior). Las colonias desarrolladas de los clústeres de células se desarrollaron de una colonia de HB individual que generaron células endoteliales CD43+ hematopoyéticas y CD144 (VE-cadherina) +CD43" endoteliales (panel inferior) .
Las Figuras 2A-2C ilustran los análisis de microarreglo de la expresión génica en hESC co-cultivado con células OP9 del día 0 (Hl) al día 7. La Figura 2A describe un mapa de calor para los esquemas de gen seleccionados que definen capas terminales particulares y sus sub-poblaciones y derivados. La Figura 2B describe la expresión génica relativa de MIXL1, T, SNAI1, F0XF1, y S0X17 según determinado a través de PCR cuantitativa. La Figura 2C describe los pliegues del aumento en el número de células derivadas de hESC después del día 1-6 de co-cultivo de 0P9 con relación al día previo. Los datos se representan como media ± SD (n=3) .
Las Figuras 3A-3D ilustran el análisis de las células APLNR+ . La Figura 3A describe gráficas de puntos de los resultados de la citometría de flujo. La Figura 3B describe el efecto de los inhibidores de la formación del mesodermo (SB431542 (5 pg/ml) y DKK1 (150 g/ml) ) en la generación de células APLNR+ de células Hl en co-cultivos de células OP9. La Figura 3C compara la expresión del transcripto entre células APLNR+ y APLNR" . La Figura 3D describe el potencial formador de colonia de células APLNR+ y APLNR" .
Las Figuras 4A-4C ilustran los perfiles de expresión génica de células APLNR+, células APLNR", núcleos, colonias, y una línea de células madre mesenquimatosas (MSC) (a pasajes pl y p5) obtenidas de hESC Hl diferenciadas para 2 (D2) o 3 (D3) días a través del co-cultivo con células OP9. La Figura 4A describe mapas de calor para los esquemas seleccionados de genes que describen capas germinales indicadas y sus subpoblaciones/derivados . Los núcleos se recolectaron en el día 3 de los cultivos clonogénicos y las colonias completamente desarrolladas en el día 12 de los cultivos clonogénicos . EMT es la transición mesenquimatosa epitelial. VSMC son células de músculo liso vasculares. La Figura 4B muestra la falta de la expresión del marcador del neuroepitelio SOX1 a través de todas las etapas de diferenciación. Los cuerpos embrioides derivados de hESC Hl diferenciados durante 14 días se utilizaron como control positivo. La Figura 4C ilustra el análisis RT-PCR cuantitativo de transcriptos representativos en subgrupos de células indicadas. Las barras representan la expresión génica en muestras agrupadas de 3 experimentos normalizados para RPL13.
La Figura 5 describe un diagrama esquemático del desarrollo de los linajes mesodérmicos y la diferenciación entre las MSC de células madre pluripotentes .
La Figura 6 describe un diagrama esquemático . del protocolo utilizado para diferenciación de hESC, la generación de colonias MB, y la líneas de MSC clónales.
La Figura 7 describe un diagrama esquemático del protocolo utilizado para evaluar la diferenciación potencial de las colonias mesenquimatosas y de blastos.
Descripción Detallada de la Invención A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual pertenece la invención. Aunque 1 cualesquiera métodos y materiales similares a o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en la presente. Se entiende comúnmente por un experto en la técnica que "falta de expresión" de un gen o la ausencia de un cierto marcador en una célula se refiere a la inhabilidad para detectar la expresión de tal gen o marcador Utilizando métodos conocidos en la técnica en el momento de la presentación. No se puede regular que más métodos sensibles podrían detectar niveles más bajos de expresión de tales genes o marcadores.
En la descripción de las modalidades y las reivindicaciones de la invención, se utiliza la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación.
Como se utiliza en la presente, "aproximadamente" significa dentro del 5 % de una concentración declarada.
Como se utiliza en la presente, "clonal" significa una población de células cultivadas de una sola célula, no de un agregado de células. Las células en una "población clonal" despliegan un patrón sustancialmente uniforme de marcadores de superficie celular y morfología y son genéticamente idénticas de manera sustancial.
Como se utiliza en la presente, un "cuerpo embrioide" o un "EB" , es un agregado de células derivado de células pluripotentes, tales como células ESC o iPS, en donde la agregación celular puede iniciarse por suspensión de gota, plaqueando sobre placas tratadas no del cultivo tisular o frascos giratorios (es decir, condiciones de acoplamiento bajas) ; y cualquier método que evita que las células se adhieran a la superficie para formar el crecimiento de colonia típica. EB aparecen como colecciones redondas de células y contienen tipos celulares derivados de las tres capas germinales (es decir, el ectodermo, mesodermo y endodermo) . Los métodos para generar EB son bien conocidos por un experto en la técnica. Ver, Itskovitz-Eldor J, y otros, "Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers" , Mol. Med. 5:88-95 (2000); Odorico J, y otros, Stem Cells 19:193-204 (2001); y Patente de E. U. A. No. 6,602,711, cada una de las cuales se incorpora. qux por referencia en su totalidad .
Como se utiliza en la presente, "sin suero" significa que ni el cultivo ni el medio del cultivo contienen suero o plasma, aunque puede proporcionarse suero purificado o sintético o componentes de plasma (por ejemplo, FGF) en el cultivo en cantidades reproducibles como se describe a continuación.
Como se utiliza en la presente, una "población sustancialmente pura" significa una población de células derivadas que contienen por lo menos 99% del tipo celular deseado. La purificación celular puede lograrse mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica; Por ejemplo, una población de células sustancialmente puras puede obtenerse mediante el cultivo de las células o mediante la selección de una población menos pura, como se describe en la presente .
Como se utiliza en la presente, "células pluripotentes" significa una población de células capaz de diferenciarse en las tres capas germinales y convertirse en cualquier célula en el cuerpo. Las células pluripotentes expresan una variedad de marcadores de superficie celular, tienen una morfología características de células no diferenciadas y forman teratomas cuando se introducen en un animal inmunocomprometido tal como un ratón SCID. Los teratomas típicamente contienen células o te idos característicos de las tres capaz germinales .
Como se utiliza en la presente, células "multipotentes" son más diferenciadas que las células pluripotentes, pero no están permanentemente comprometidas con un tipo de célula específico. Las células pluripotentes por consiguiente tienen una mayor potencia que las células multipotentes .
Como se utiliza en la presente, "células madre pluripotentes inducidas" o "células iPS" son células que se diferencian, células somáticas reprogramadas a pluripotencia . Las células son genéticamente idénticas de manera sustancial a su célula somática diferenciada respectiva de origen y despliegan características similares a las células de mayor potencia, tales como las células ES. Ver, Yu J, y otros, "Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells" , Science 318:1917-1920 (2007), incorporada en la presente en su totalidad.
Como se utiliza en la presente, una "célula madre mesenquimatosa" (MSC) es una célula capaz de diferenciarse entre linajes de células esqueléticas (es decir, psteablastos , condroblastos y adipocitos . Como se observó anteriormente, no se ha identificado un único marcador MSC. Es decir, el criterio morfológico y funcional bien conocido por el experto en la técnica se utiliza para identificar estas células. Ver, Horwitz y otros, supra; Dominici y otros, supra; Trivedi P & Hematti P, "Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal ' cells from human embryonic stem cells", Exp. Hematol . Jan. 5, 2008 [Epub ahead of print] ,- Trivedi P & Hematti P, "Simultaneous generation of CD34+ primitive hematopoietic cells and CD56+ mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells cocultured with murine OP9 stromal cells", Exp. Hematol. 35:146-154 (2007); y Solicitud de Publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0008902, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad. Las MSC producidas por los métodos descritos en la presente pueden caracterizarse de acuerdo con el criterio fenotípico. Por ejemplo las MSC pueden reconocerse a través de su forma ovoide mononuclear, su forma de estrella o su forma de husillo, con un núcleo de redondo a oval. El núcleo alargado oval típicamente tiene un nucléolo prominente y una mezcla de hetero- y eucromatina. Estas células tienen poco citoplasma, pero muchos procesos tenues que parece que se extienden desde el núcleo. Se cree que las MSC típicamente se tiñen de uno, dos, tres o más de los siguientes marcadores: CD106 (VCAM) , CD73, CD146, CD166 (ALCAM) , CD29, CD44 y fosfatasa alcalina, aunque son negativas para marcadores de células de linaje hematopoyético (por ejemplo, CD14 o CD45) y marcadores de la célula de linaje endotelial (por ejemplo, CD31 y VE-cadherina) . Las MSC también pueden expresar STRO-1 como un marcador.
Co o se utiliza en la presente, un "mesangioblasto" es un progenitor para las MSC así como para células endoteliales .
Como se utiliza en la presente, una "colonia mesenquimatosa" es una colonia compuesta de células mesenquimatosas que se originan de los mesangioblastos .
Como se utiliza en la presente, un "hemangioblasto" es un precursor de células sanguíneas así como de células endoteliales.
Como se utiliza en la presente, una "colonia de blastos" es una colonia compuesta de células predominantemente hematopoyéticas que se originan de los hemangioblastos .
Como se utiliza en la presente, "mesendodermo" es un tej ido que da origen al mesodermo y al endodermo .
Como se utiliza en la presente, "mesodermo" es un subgrupo de células que expresan KDR y PDGFRa a un nivel mucho mayor que P0U4F1, S0X1 , y PAX6 (cresta neural y neuroectoderma) , LAMA3 , KRT14 , y KRT10 (ectoderma de superficie) , CGA y PLACI ( trofectoderma) FOXA1, FOXA2, APOAl, TMPRSS2, TTR1, y AFP (endodermo) , y SOX2 y DPPA2 (hESC sin diferenciar) .
Como se utiliza en la presente, "mesodermo de placa lateral" es un subgrupo de mesodermo que expresa por lo menos FOXF1 y HAND1 pero que carece de la expresión de MEOX1 y TCF15 (mesodermo paraxial) , PAX2 y PAX8 (mesodermo intermedio) , y es capaz de por lo menos la diferenciación endotelial hematopoyética .
Se contempla que Matrigel"", laminina, colágeno (especialmente colágeno de tipo I) , fibronectina y glicosaminoglicanos todos pueden ser adecuados como una matriz extracelular, por sí mismos o en varias combinaciones.
La invención se entenderá más completamente después de la consideración de los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de MSC de Células Madre Pluripotentes Bajo Condiciones sin Suero hESCs (Hl; WiCell; Madison, WI) se mantuvieron en fibroblastos embrionarios de ratón irradiados en un medio sin suero, tal como el medio DMEM/F12 suplementado con 20% de reeemplazadnte de suero Knockout™, 2 mM de L-glutamina, lx (100 µ?) de aminoácidos no esenciales, 100 µ? de 2-mercaptoetanol y 4 ng/ml de bFGF (todos de Gibco- Invitrogen; Carlsbad, CA) . Ver Amit M, y otros, "Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture," Dev. Biol. 227:271-278 (2000), incorporada por referencia como se establece en su totalidad. Las células de estroma de médula espina OP9 de ratón (amablemente provista por el Dr. Toru Nakano y disponibles de ATCC, catálogo # CRL-2749) es mantuvieron por cuatro días en sub-cultivos en placas recubiertas con gelatina en medio MEM alfa (Gibco-Invitrogen) con 20% de suero de becerro fetal (FCS; HyClone; Logan, UT) .
Se indujeron hESCs para diferenciación por co-cultivo con células de estroma de médula espinal OP9 de ratón, como se describe previamente. Vodyanik M, y otros, "Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential," Blood 105:617-626 (2005) , incorporadas por referencia como se establece en su totalidad. En resumen, los pequeños agregados de hESC se agregaron a células 0P9 en medio MEM alfa suplementado con 10% de FCS y 100 µ? de MTG (Sigma; St. Louis, MO) . El siguiente día (día 1) del cultivo, el medio se cambió, y los cultivos, se cosecharon en los días indicados a continuación.
En el día dos del co-cultivo de hESC (Hl) con células de estroma OP9, se detectó la expresión pico de los factores de transcripción para la población de línea primitiva (mesendodermo) (GSC, EOMES, MIXL1 y T (BRACHYURY) ) y mesodermo temprano (EVX1, LHX1 y TBX6) con los microarreglos NimbleGen® (Madison, WI) .
En los días 3-5 de co-cultivo, el cultivo contuvo los progenitores mesenquimatosos , así como las células que expresan genes característicos' de endodermo y mesodermo. Entre los genes característicos para el mesodermo, solamente los genes característicos del mesodermo de placa lateral, tales como FOXF1, HAND1, NKX2-5, y GATA2 se ' expresaron consistentemente. En contrasto, los genes característicos para el mesodermo axial (CHRD, SHH) , paraxial (MEOX1, TCF15) , o intermedio (PAX2, PAX8) no se expresaron consistentemente. De esta forma, los hESC co-cultivados con células OP9 por 3-5 días dieron origen a células que expresan genes. característicos del mesodermo de placa lateral/extraembrionario . En los dias 3-5 del co-cultivo de hESC (Hl) /0P9 , las células también se caracterizaron mediante la proliferación celular máxima y la expresión sostenida de los genes involucrados en la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT, SNAI1, y SNAI2) y expansión celular (H0XB2 , H0XB3) .
En los dias 5-7 del co-cultivo de hESC (Hl) /OP9 , la diferenciación en linajes del mesodermo y endodermo específicos se observaron, cuando se detectaron los marcadores de desarrollo de las células del endodermo (AFP y SERPINAl) , mesenquimatosas (SOX9, RUNX2 , y PPARG2) , y hematoendoteliales (CDH5 y GATA1) . Ni los factores inductores del músculo (MYOD1, MYF5 , y MYF6) ni los marcadores del neuroectodermo (SOX1, PAX6 , y NEFL) o trofectodermo (CGB y PLAC) se expresaron en los siete días del co-cultivo, indicando que las células OP9 proporcionaron un entorno inductivo eficiente para la diferenciación dirigida de hESC hacia la trayectoria mesendodérmica .
En el día 2 del co-cultivo de hESC (Hl) /OP9 , se cosechó una suspensión de una sola célula del co-cultivo mediante el tratamiento enzimático sucesivo con colagenasa IV (Gibco- Invitrogen) a 1 mg/ml en medio DMEM/F12 por 15 minutos a 37°C y 0.05% de Tripsina-0.5 mM de EDTA (Gibco-Invitrogen) por 10 minutos a 37°C.
Las células se lavaron 3 veces con PBS-5 de FBS, filtraron a través de filtros de 70 µ? y 30 µ? (BD Labware; Bedford, MA) y marcaron con CD29-PE anti-ratón (AbD Serotec ; Raleigh, NC) y anticuerpos monoclonales paramagnéticos anti-PE (Miltenyi Biotec; Auburn, CA) . La suspensión celular se purificó con la clasificación de célula activada con magneto (MACS) pasándolas a través de una columna magnética LD acoplada a una unidad de separación Midi-MACS (Miltenyi Biotech) para obtener una fracción negativa de células derivadas de hESC, consumidas 0P9. La pureza se verificó utilizando anticuerpos monoclonales TRA-1-85 anti-humanos pan (R&D Systems; Minneapolis, MN) .
La suspensión de células individuales purificada se plaqueó a una densidad de 0.5-2 x 104 células/ml en un medio sin suero, semisólido, compuesto de medio sin suero StemLine™ (Sigma; St. Louis, MO) suplementado con 5-1.00 ng/ml de bFGF (PeproTech; Rocky Hill, NJ) y 1% de metilcelulosa (Stem Cell Technologies; Vancouver, Canadá) con o sin 10-20 ng/ml de PDGF-BB (PeproTech) .
PDGF-BB potenció el crecimiento de las células mesenquimatosas, pero no fue esencial para la formación de colonias. Alternativamente, las suspensiones de células se plaquearon en un medio sin suero formador de colonia semisólido conteniendo 40% de metilcelulosa ES-Cult M3120, 25% de medio de expansión sin suero (SFEM, Stem Cell Technologies) , 25% de' medio sin suero endotelial (E-SFM, Invitrogen) , 10% de BIT 9500 (Stem Cell Technologies) , GlutaMAX (diluido 1:100), Ex-Cyte (diluido 1:1000, Millipore) , 100 µ? de monotioglicerol (MTG) , 50 pg/ml de ácido ascórbico y 20 ng/ml de bFGF.
Después de 10-20 días de cultivo, se formaron grandes colonias mesenquimatosas compactas que se asemejaron a los cuerpos embrioides (EB) . A pesar de que estas colonias mesenquimatosas se detectaron tan pronto como en el día 7, se requirieron 10-20 días de cultivo para revelar las colonias activamente en crecimiento. Las hESCs o células sin diferenciar cosechadas en el día 1 o en el día 6 de co-cultivo no formaron estas colonias mesenquimatosas cuando se cultivaron bajo las mismas condiciones.
Las colonias mesenquimatosas, que se asemejan a cuerpos de embrioide, se distinguieron de EB a través de varia características: (1) formación y crecimiento bajo condiciones sin suero suplementado con bFGF y estimulación mediante factores que promueven el crecimiento de la célula mesenquimatosa (por ejemplo, PDGF-BB, EGF y TGF- ) , pero la supresión mediante factores involucrados en la diferenciación mesodérmica (por ejemplo, VEGF, TGF- ß y Activina A) en colonias mesenquimatosas; (2) falta de la capa celular exterior densa y la estructura con cavidades irregular característica de EB, aún después de un cultivo prolongado en colonias mesenquimatosas; (3) presencia de homogeneidad morfológica en células que comprenden las colonias mesenquimatosas ; y (4) formación de colonias mediante el establecimiento de estructuras herméticamente empacadas (núcleos) que además se desarrollaron en colonias esferoides compactas .
Para demostrar que la suspensiones de célula individual no forman agregados después del plaqueo en medio semisólido, la clonación de las colonias mesenquimatosas en los métodos de cultivo se ensayó y confirmó utilizando las líneas hESC quiméricas establecidas de las células retroviralmente marcadas con un gen reportero, por ejemplo, ya sea una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) o la proteína fluorescente mNaranja de histona 2B- (H2BB) . La expresión de un producto del gen reportero se indicó clonalmente. Las líneas hESC quiméricas se generaron de dos constructos lentivirales : (1) la proteína EGFP constitutivamente expresada de un promotor del factor 1 alfa de alargamiento (EFlalpha) , y (2) la proteína H2BB-mNaranja expresada constitutivamente del promotor EFlalpha. Ambos constructos se empacaron en células 293FT, y los lentivirus se utilizaron para transducir hESC Hl para producir líneas hESC Hi estables que expresaron ya sea la proteína verde EGFP o la proteína H2BB-mNaranaja naranja. Las colonias mesenquimatosas derivadas de los métodos descritos fueron de colores individuales, ya se verdes o naranjas, de esta forma indicando el origen clonal (es decir, célula individual) de las MSC.
Además, el análisis fenotípico prospectivo demostró una correlación positiva entre la frecuencia de la célula formadora de colonia mesenquimatosa (CFC) y la expresión de KDR (VEGFR2) , aunque la población KDRhighCD34+ de los precursores hemangiogénicos más tempranos estuvo carente de CFC mesenquimatosas . El análisis de las células dentro de las colonias mesenquimatosas reveló una población homogénea de células mesenquimatosas tempranas definidas por la alta expresión de CD90, CD140a y CD166, baja expresión de CD44, CD56 y CD105 y falta de expresión de CD24, CD31, CD43, CD45, CD144 (VE-cadherina) , y falta de expresión de SSEA4. Además, las colonias mesenquimatosas expresaron vimentina, actina de músculo liso alfa y desmina. Además, las colonias mesenquimatosas expresaron genes específicos para el linaje MSC, tal como FOXF1, MSX1, MSX2 , SNAI1, SNAI2, SOX9, y RU X2.
Las colonias mesenquimatosas individuales se transfirieron a cavidades de una placa de 96 cavidades, recubierta con colágeno o fibronectina pre-reíleñadas con 0.2 mi/cavidad de medio sin suero StemLine™ suplementado con 5-100 ng/ml de bFGF o medio de expansión sin suero consistiendo de 50% de medio de expansión HSC sin suero StemLine II (H-SFEM, Sigma) , y 50%d de E-SFM suplementado con GlutaMAX (diluido 1:100), ExCyte (diluido 1:2000), 100 µ? de MTG, y 10 ng/ml de bGF. Después de 3-4 días de cultivo, las células adherentes de las cavidades individuales se cosecharon mediante tratamiento con tripsina y se expandieron en platos cubiertos con colágeno o fibronectina en medio sin suero StemLine™ con 5-100 ng/ml de bFGF o medio de expansión sin suero (M-SFEM) conteniendo 50% de medio de expansión HSC sin suero StemLine™ II (HSFEM; Sigma) , 50% de E-SFM, GlutaMAX™ (1/100 dilución) , suplemento Ex-Cyte® (1/2000 dilución) , 100 u.M de TG, y 5-100 ng de bFGF.
Las MSC se expandieron por muchos pasajes. Cuando se plaquearon colonias individuales en placas recubiertas con colágeno o fibronectina, se observó un acoplamiento inmediato y un sobre-crecimiento vigoroso de las células de tipo fibroblasto. Durante los pasajes posteriores, las células crecieron intensamente durante los primeros 10 pasajes; sin embargo, el índice de crecimiento se atenuó en los pasajes 10-15 y se observó la senectud gradual durante los pasajes 15-20. Los cultivos derivados de MB-CFC individual se acumularon hasta un total de células de 1022 en el período de tiempo observado . Debido a que cada colonia se presume que se ha originado de una célula individual, en número corresponde al potencial de . expansión de un precursor mesenquimatoso derivado de hESC.
Las líneas de células establecidas de colonias individuales se mantuvieron en medio sin suero con bFGF por 10-15 pasajes a un alto grado de proliferación. Todas las líneas de células desplegaron un fenotipo mesenquimatoso, caracterizado por la expresión de CD44, CD56, CD 73, CD105, CD146, y CD140a (PDGFRA) y carentes de marcadores hematoendoteliales (es decir, CD31, CD43, CD45 y VE-cadherina) . Cuando se ensayaron en condiciones que revelan el potencial de diferenciación mesenquimatoso, las líneas de células fueron capaces de diferenciación osteogénica, condrogénica, y adipogénica. De forma interesante, estas células se asemejan a MSC de médula espinal, pero se expanden y proliferan mejor que las MSC de médula espinal. Estas células mesenquimatosas podrían diferenciarse en células del linaje condro-, osteo-, y adipogénico. Sin embargo, estas células podrían dar origen a células hematopoyéticas o endoteliales cuando se cultivan con células OP9, o cuando se cultivan en cultivos sin alimentador con factores de crecimiento hematoendoteliales (VEGF, bFGF, SCF, TPO, IL3 , IL6) , indicando un potencial de diferenciación limitado de estas células mesenquimatosas .
Las colonias mesequimatosas también se generaron de varias células madre pluripotentes inducidas (iPS) , tales como iPS (IMR90) -1, iPS(SK)-46, y iPS (FSK) -1 reprogramadas utilizando un vector lentiviral (Yu y otros, Science 318:1917-1920 (2007)), o iPS-5 4-3-7T y iPS-1 19-9-7T sin transgen (Yu y otros, Science 324:797-801 (2009)). Las colonias mesenquimatosas derivadas de células iPS que contiene el transgen desplegaron una morfología irregular o más suelta. Los iPSC sin transgen produjeron colonias mesenquimatosas esferoides típicas.
Ejemplo 2. Generación in vitro y caracterización de mesangioblastos .
Para aislar y caracterizar una población de progenitores mesodérmicos que pueden dar origen a células del linaje mesodérmico con potenciales de células madre mesenquimatosas, las células hES Hl se co-cultivaron con células OP9, como se describe en el Ejemplo 1. Después de dos o tres días de co-cultivo, cuando los genes representativos de la población de línea primitiva (mesendodermo) (MIXL1, T, EOMES) se expresó, las células derivadas de hESC de células OP9 utilizando anticuerpo CD29 anti-ratón se plaquearon en medio sin suero semisólido, esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, con 20 ng/ml de bFGF (PeproTech; Rocky Hill, NJ) . El número de células formadoras de colonia (CFC) se calculó por 1000 células TRA-1-85+ derivadas de Hl plaqueadas.
Después de 2-3 días en medio semisólido, las células formaron estructura herméticamente empacadas (núcleos) . Los núcleos derivados de hESC se diferenciaron en co-cultivo con células OP9 por 2 días que además se cultivaron en colonias mesenquimatosas esferoides. Los núcleos derivados de hESC que se diferenciaron en co-cultivo con células 0P9 por 3 días además se cultivaron en colonias de blastos dispersados con potencial hematopoyético y endotelial . bFGF es necesario y suficiente para la formación de ambas colonias de hESC. bFGF soportó ambas la formación de la colonia mesenquimatosa y de blastos. En contraste, en la ausencia de bFGF, ni VEGF, ni PDGF-BB (FIG. 1A) , SCF, IGF1, o HGF (datos no mostrados) , solos o en combinación, soportaron la formación de ninguna colonia. Aunque PDGF-BB (10 ng/ml) solo no soportó la formación de la colonia, PDGF-BB' en combinación con bFGF aumentó significativamente la producción y el tamaño de colonias mesenquimatosas comparado con bFGF solo (FIG. 1A) . VEGF solo (20 ng/ml) no soportó la formación de colonia pero su adición a cultivos bFGF aumentó ligeramente el número de colonias de blastos, pero inhibió la formación de colonias mesenquimatosas (FIG. 1A) . Las células que dieron origen a cada tipo de colonia constituyeron aproximadamente 2-3% del tota de células derivadas de hESC (FIG. IB) .
Para determinar si las células dentro de las colonias mesenquimatosas pueden dar origen a células del linaje hematovascular, las colonias mesenquimatosas individuales se seleccionaron de metilcelulosa en el día 5-7 y plaquearon en células OP9 en medio alfa-MEM con 10% de FBS, y las citocinas SCF (50 ng/ml) , TPO (50 ng/ml) , IL-3 (10 ng/ml) , e IL-6 (20 ng/ml) . Después de 4 días de cultivo, las células se cosecharon y analizaron mediante citometría de flujo o se tiñeron in situ con anticuerpos primarios CD144 anti-humano de conejo (VE-cadherina; 1 µg/ l; eBioscience, San Diego, CA) en combinación con CD43 anti-humano de ratón (0.5 g/ml; BD Bioscience) o de Calponina anti-humana de ratón (0.5 µg ml; Thermo Fisher Scientific) , seguido por una mezcla de los anticuerpos IgG-DyLight 594 anti-ratón de burro absorbido cruzado secundario y IgG-DyLight-488 anti-conejo de burro (ambos a '2 pg/ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) .
Las colonias mesenquimatosas originadas de precursores dan origen a células endoteliales y mesenquimatosas, es decir mesangioblastos . Como se explicó en el Ejemplo 1, las MSC expandidas de colonias mesenquimatosas en cultivos adherentes no dieron origen a células hematopoyéticas o endoteliales cuando se co-cultivaron con células OP9. En contraste, aproximadamente 70% de las colonias mesenquimatosas aisladas de cultivos formadores de colonias de los días 5-7 en medio semisólido dieron origen a células CD31+CD144 (VE-cadherina) + endoteliales cuando se co-cultivaron con células OP9. (FIG. ID y E, paneles superiores) . Las colonias, mesenquimatosas, por lo tanto, se originaron de precursores comunes para linajes endoteliales y mesenquim toso, es decir, mesangioblastos . En contraste, las colonias de blastos que contuvieron células hematopoyéticas CD31+CD43+ y podrían dar origen a células endoteliales (FIG. 1 D y E paneles inferiores) .
El potencial endotelial de colonias mesenquimatosas podría mejorarse significativamente con la adición de proteína 4 morfogénica ósea (BMP4) para el medio del ensayo clonogénico (3.2+2.4% de células CD31+CD43 sin BMP4 frente a 11.6+0.5 con 5 ng/ml de BMP4) .
Ejemplo 3: Generación y aislamiento de una población de células sustancialmente enriquecidas en células de mesodermo de placa lateral/extraembrionarias El perfil genético de las hESC Hl diferenciadas en co-cultivos OP9 demostró el compromiso selectivo hacia los linajes mesodérmico y endodérmico con ectodermo no detectable (trofo-, neuro- , o ectodermo de superficie) (FIG. 2). Las células se hicieron comprometidas con el mesendodermo en el día 2 del cultivo, cuando se detectó la expresión síncrona de los genes de línea primitiva (MIXL1, T, y EOMES) . En los días de cultivo posteriores, los genes específicos del mesodermo-y endodermo y, eventualmente , genes específicos derivados del endodermo y mesodermo se expresaron. De los genes del mesodermo, los característicos del subgrupo mesodérmico de placa lateral/extraembrionario (FOXF1, HA D1, NKX2-5, GATA2) se expresaron consistentemente, aunque la expresión de los genes de los sub-grupos axial (CHRD, SHH) , paraxial (ME0X1, TCF15) , o intermedio (PAX2, PAX8) no fueron consistentes. La expresión del receptor de apelina (APLNR) es fuertemente inducida por la regulación ascendente en los días 2-3 de la diferenciación, concurrentemente con el compromiso mesodérmico .
Para caracterizar la expresión de APLNR y las células que lo expresan, se tiñeron hESC diferenciadas en co-cultivos de OP9. con anticuerpos monoclonales específicos para el receptor de Apelina (APLNR) (R&D Systems) en combinación con anticuerpos contra CD30, KDR, PDGFRA, T, y FOXA2. Los hESC no diferenciados y las células derivadas de hESC en el día 1 del co-cultivo de OP9 fueron negativas para APLNR (FIG. 3A, paneles del Día 1) . La expresión de APLNR fue regulada de forma fuertemente ascendente en células co-cultivadas con células OP9 por 2-3 días (FIG. 3A, Día 2 y 3) . En el día 2, 15-20% de las células fueron APLNR+ y en el día 3, 60-70% de las células fueron APLNR+ . Esta regulación ascendente coincidió con el compromiso mesodérmico, como se demuestra por la regulación ascendente de los marcadores mesodérmicos , tales como KDR (VEGFR2) , T, y PDGFRA (FIG. 3A, péneles del Día 2 y 3) . El número de células APLNR+ disminuyó gradualmente en los días posteriores (FIG. 3B) . Inversamente, los marcadores hESC (por ejemplo CD30) se regularon de manera descendente sucesivamente.
A pesar de que PDGFRA se expresa solamente a bajos niveles en el día del co-cultivo, APLNR se expresa a alta densidad tan temprano como el día 2 del co-cultivo permitiendo la separación de células APLNR positivas de APLNR negativas. En los días 2, 2.5, y 3 del co-cultivo de las células H1/OP9, APLNR+ y APLNR- se separó por clasificación magnética y la expresión génica se analizó por análisis de microarreglo .
IXL1, T, y EOMES, indicativos de células de línea primitiva (mesendodermo) , todas se expresaron en células, a pesar . de que los transcriptos asociados con la cresta/neuroectoderma neural (POU4F1, SOX1, SOX2 , SOX3 , SOX10) no podrían se detectados (FIG. 4A y 4B) . Como se esperaba, las células APLNR+ se enriquecieron en transcriptos específicos de mesodermo TCF21, mientras que los transcriptos que marcan el pan-endodermo (FOXA2, APOA1) , endodermo definitivo (FOXA1, TMPRSS2) , y visceral (TTR, · AFP) se encontraron en células APLNR (FIG. 4A y 4C) .
De manera interesante, las células APLNR+ que expresan FOXF1, IRX3, BMP4 , WNT5A, NKX2.5, HAND1 , y HAND2 son representativas del mesodermo de . placa lateral/extraembrionario, pero no son marcadores del mesodermo paraxial/miogénico (MEOX1, TCF15, PAX3 , PAX7) e intermedio (PAX2, PAX8) en el embrión. Estos datos indican que más bien en lugar de una población total de células comprometidas con el desarrollo del mesendodérmico, las células APLNR+ representan el mespdermo, o probablemente su sub-población reminiscente de mesodermo de placa lateral/extraembrionario (FIG. 3C y FIG. 4A y 4C) .
Para además confirmar la identidad del mesodermo, las células APLNR+ se analizaron para la expresión de T, un marcador del mesodermo temprano, y FOXA2, un marcador del endodermo. Como se muestra en la FIG. 3A, las células APLNR+ son T+ y mantienen la expresión de T hasta que decrece en el día 4. En contraste, las células FOXA2+, que comprenden menos de 5% del total de células en cultivo, no expresan APLNR. De esta forma, las células APLNR+ son precursores mesodérmicos T+FOXA2 en el día 2-3 del cultivo.
Para además soportar la noción de que las células APLNR+ son precursores mesodérmicos, los co-cultivos de células H1/OP9 se suplementaron con inhibidores de la formación del mesodermo SB431542 (5 g/ml) o DKK1 (150 ug/ml) . Las células APLNR+ no podrían detectarse en cultivos que recibieron los inhibidores de la formación del mesodermo (FIG. 3B) , confirmando que las células APLNR+ son mesodérmicas . Además, el potencial formador de colonias mesenquimatosas y de blasto se encontró exclusivamente dentro de la población de células APLNR+ (FIG. 3D) , además se confirma que ambas colonias mesenquimatosas mesangiogénicas y de blasto hemangiogénicas se forman por los precursores mesodérmicos APLNR+ .
Ejemplo 4. Enriquecimiento de Mesangioblastos Derivados de hESC Bajo Condiciones Sin Suero a través del aislamiento de células mesodérmicas de placa lateral/extraembrionarias APLNR+ .
Para identificar el origen de colonias mesenquimatosas y obtener una población de células enriquecidas en mesangioblastos , las células madre pluripotentes se co-cultivaron con OP9 por 2-3 días para inducir la formación del mesodermo. Después de la depleción de las células OP9 con anticuerpos CD29 específicos de ratón, las células APLNR+ y APLNR- se aislaron utilizando clasificación magnética. Los ensayos de formación de colonias en medio semisólido en presencia de bFGF demostraron que el potencial del mesangioblasto y hemangioblasto se confirmó solamente para la fracción APLNR+ (FIG. 3D) . Aproximadamente de 1 a 5% de células dentro de la fracción APLNR+ poseyeron actividad de mesangioblasto.
La invención ha sido descrita en conexión con lo que actualmente se considera como siendo las modalidades más prácticas y preferidas. Sin embargo, la presente invención ha sido presentada a manera de ilustración y no pretende ser limitada por las modalidades descritas. Por consiguiente, los expertos en la técnica notarán que la invención pretende abarcar todas las modificaciones y configuraciones alternativas dentro del espíritu y alcance de la invención como se establece en las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para generar una población clonal de células madre mesenquimatosas de primate, caracterizado porque comprende los pasos de : cultivar una suspensión de una célula individual, heterogénea de células de primate que contiene progenitores mesenquimatosas en un medio semisólido, sin suero que contiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 ng/ml de bFGF hasta que se forman las colonias independientes; y cultivar una de las colonias independientes en un medio líquido, sin suero que contiene entre 5 y aproximadamente 100 ng/ml de bFGF para obtener una población sustancialmente pura de MSC.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión heterogénea se obtiene en un método que comprende los pasos de : co-cultivar las células de primate pluripotentes con células de la estroma de la medula espinal en . un medio que soporta la diferenciación para entre 2 y 5 días hasta se forman las células diferenciadas; y suspender las células diferenciadas.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células pluripotentes se seleccionan del grupo que consiste de células madre embrionarias (ESC) y células madre pluripotentes inducidas (iPS) .
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque además comprende el paso de consumir las células no derivadas a través de la diferenciación in vitro de células pluripotentes de la suspensión heterogénea.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el paso de depleción comprende los pasos de : la unión no covalente de las células a ser consumidas a anticuerpos monoclonales paramagnéticos específicos para epítopos en las células a ser consumidas; y segregar las células unidas del anticuerpo con un magneto .
6. El método de conformidad 'con la reivindicación 2, caracterizado porque las células del estroma de la médula espinal son células OP9 de ratón.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la suspensión heterogénea se obtiene en un método que comprende los pasos de : disociar un cuerpo embrioide para células individuales ,- y suspender las células individuales .
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión de la célula individual se cultiva de entre aproximadamente 10 a 20 días.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio semisólido contiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente de 100 ng/ml de bFGF.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio semisólido contiene entre aproximadamente 5 ng/ml de bFGF.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque porque medio semisólido contiene aproximadamente 1% de metilcelulosa.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio semisólido contiene entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 20 ng/ml de PDGF-BB.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células en la suspensión de la célula individual expresan MIXL1 y T.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de primate son de origen humano .
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las MSC se cultivan en la presencia de una proteína de matriz extracelular .
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína de matriz extracelular se selecciona del grupo que consiste de Matrigel'", colágeno, gelatina y fibronectina.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las colonias mesenquimatosas expresan FOXF1, MSX1, MSX2, SNAI1, SNAI2, S0X9 y RUNX2.
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las colonias mesenquimatosas expresan CD44, CD56, CD140a, CD146, ay CD105, pero no expresan CD31, CD43, CD45 y VE-cadherina .
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende el paso de: observar por lo menos una característica mesenquimatosa de las colonias formadas durante el cultivo en un medio semisólido sin suero, por lo tanto confirmando la identificación de los progenitores mesenquimatosos en la suspensión.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una característica mesenquimatosa se selecciona del grupo que consiste de características funcionales, características morfológicas y una característica fenotípica.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la característica funcional se selecciona del grupo que consiste de (1) la estimulación del crecimiento mediante factores que promueven el crecimiento de la célula mesenquimatosa (por ejemplo, PDGF-BB, EGF y TGF-alfa) y la suspensión del crecimiento a través de factores involucrados en la diferenciación mesodérmica (por ejemplo, VEGF, TGF-beta y Activina A) y (2) diferenciación en linajes de células osteogénicas , condrogénicas o adipogénicas .
22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la característica morfológica se selecciona del grupo que consiste de (1) un agregado celular en forma redonda, herméticamente empacado que mide 100-500 µp? en diámetro; y (2) la falta de la capa celular exterior densa y la estructura interna irregular.
23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la característica fenotípica se selecciona del grupo de (1) la expresión de CD44, CD56, CD105, CD146, y CD140a, pero no la expresión de CD31, CD43, CD45 y VE-cadherina, (2) la expresión de FOXF1, MSX1, MSX2, SNAI1, SNAI2, SOX9 y RUNX2 y (3) la expresión de vimentina, actina de músculo liso alfa, y desmina.
24. El método de conformidad con la . reivindicación 19, caracterizado porque el además comprende montar las colonias para estimar un número de progenitores mesenquimatosos en la suspensión heterogénea.
25. Una población de células caracterizada porque comprende : una línea sustancialmente pura de células madre mesenquimatosas derivadas clonalmente positivas a por lo menos uno de CD44, CD56, CD73, CD146, CD140a y CD105, pero negativas para CD31, CD43, CD45 y VE cadherina.
26. La población de células de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende por lo menos 99% del células madre mesenquimatosas.
27. Un método para generar una población de células mesodérmicas de placa lateral positivas al receptor de Apelina de primate, caracterizado porque comprende los pasos, de: cultivar las células madre pluripotentes de primate en un medio que soporta la diferenciación hasta que se expresa el receptor de Apelina aislar las células mesodérmicas de la placa lateral positivas al receptor de Apelina.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células madre pluripotentes de primate se co-cultivan con células del estroma de la médula espinal durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días .
29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque aproximadamente del 1% a aproximadamente el 5% de las células positivas del receptor de Apelina tienen un potencial de hemangioblasto y mesangioblasto.
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