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MX2012008215A - Construcciones de tejido bio-diseñadas por ingenieria y metodos para la produccion y uso de las mismas. - Google Patents

Construcciones de tejido bio-diseñadas por ingenieria y metodos para la produccion y uso de las mismas.

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Publication number
MX2012008215A
MX2012008215A MX2012008215A MX2012008215A MX2012008215A MX 2012008215 A MX2012008215 A MX 2012008215A MX 2012008215 A MX2012008215 A MX 2012008215A MX 2012008215 A MX2012008215 A MX 2012008215A MX 2012008215 A MX2012008215 A MX 2012008215A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
bio
engineered
cells
construction
extracellular matrix
Prior art date
Application number
MX2012008215A
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English (en)
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MX354068B (es
Inventor
Xianyan Wang
Vincent Ronfard
Dolores Baksh
Matthew Quin-Men Wong
Lan Cao
Parid Sava
Thomas Bollenbach
Esin Yesilalan
Original Assignee
Organogenesis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Organogenesis Inc filed Critical Organogenesis Inc
Publication of MX2012008215A publication Critical patent/MX2012008215A/es
Publication of MX354068B publication Critical patent/MX354068B/es

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Abstract

Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se forman a partir de células cultivadas inducidas para sintetizar y secretar componentes de matriz extracelular endógenamente producidos sin el requerimiento de componentes de matriz exógenos o soporte de red o miembros de andamio. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la invención pueden ser producidas con múltiples tipos de célula que todos pueden contribuir a la producción de la matriz extracelular. Además o alternativamente, uno de los múltiples tipos de célula puede ser suministrado a un sitio en el cuerpo a través de los componentes de matriz extracelular endógenamente producidos para obtener varios beneficios terapéuticos.

Description

CONSTRUCCIONES DE TEJIDO BIO-DISEÑ ADAS POR INGENIERÍA Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN Y USO DE LAS MISMAS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/347,725, presentada el 24 de mayo del 2010, Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/337,938, presentada el 12 de febrero del 2010, y la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/295,073, presentada el 14 de enero del 2010; cuyos contenidos totales están incorporados expresamente a la presente invención como referencia.
Antecedentes de la Invención Los huesos, cartílagos, tendones, ligamentos, músculos, tejido adiposo y estroma de médula son ejemplos de tejidos mesenquimales (por ejemplo, tejidos que se diferencian de las células madre mesenquimales).
Los tejidos mesenquimales pueden ser lesionados mediante cirugía o pueden desarrollar enfermedad por un trastorno genético o perturbación ambiental.
Por consiguiente, se necesitan nuevas terapias para reparar los tejidos enfermos o dañados.
Breve Descripción de la Invención En la presente invención se presentan construcciones bio- diseñadas por ingeniería que comprenden matriz extracelular (ECM) en formas, que se optimizan para usos terapéuticos particulares. Ciertas construcciones están comprendidas en matriz extracelular producida mediante células madre mesenquimales cultivadas (MSCs). Ciertas construcciones también comprenden las células que producen la matriz. En ciertas construcciones, las células han sido desvitalizadas. En otras construcciones las células, que producen la matriz extracelular han sido eliminadas para producir construcciones descelularizadas.
Ciertas construcciones tienen un grosor de al menos aproximadamente 30 pm. Ciertas construcciones, incluyen poros que tienen un diámetro promedio dentro del rango de 10 a 100 um. Ciertas construcciones tienen un Fmax promedio de al menos 0.4 Newtons. Ciertas construcciones tienen una resistencia a la tensión final (UTS) de al menos 0.4 egapascales. Ciertas construcciones tienen una tolerancia a la deformación plástica de al menos 0.4 veces la longitud inicial.
La ECM en las construcciones, puede ser procesada en forma adicional (por ejemplo, deshidratada, reticulada, contractada, micronizada, esterilizada, etc)' o combinada en forma adicional con otras sustancias o materiales de soporte biológicamente activos (por ejemplo, seda, un adhesivo, etc) para la preparación de productos terapéuticos.
Se presentan métodos para elaborar y modificar las construcciones bio-diseñadas por ingeniería (incluyendo métodos para controlar el grosor, tamaño de poro, y composición de la construcción.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería aquí descritas, se pueden administrar a sujetos para aumentar la vitalidad, crecimiento y/o reparación del tejido blando, incluyendo para el tratamiento de heridas crónicas o agudas.
Otras características y ventajas podrán ser apreciadas a partir de la descripción detallada que se encuentra más adelante y las reivindicaciones adjuntas.
Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1B, muestran un análisis de curso de tiempo de un rango de formación de matriz extracelular mediante MSCs entre los días 5 y 12 (figura 1A) o entre los días 12 y 18 (figura 1B). n = 9 (3 construcciones independientes por grupo con 3 medidas por construcción). Se muestra una línea de tendencia y una ecuación de pendiente.
La figura 2, muestra una correlación entre el incremento del grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería como una función de la concentración TGF-alfa incrementada. No TGF-alfa: 0 ng/mL; 1.5x: 30 ng/mL TGF-alfa; 5x: 100 ng/mL TGF-alfa; y 10x: 200 ng/mL TGF-alfa. n = 9 (3 construcciones independientes por grupo con 3 medidas por construcción), excepto para 1.5x y 10x, en donde n = 6 (2 construcciones independientes por grupo y 3 medidas por construcción).
La figura 3, muestra una correlación entre la disminución del grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería como una función de la concentración de Prostaglandina 2 incrementada (PGE2) que tiene una cantidad constante de 20 ng/mL TGF-alfa. No PGE2: 0 ng/mL; 5x: 19 ng/mL PGE2; 10x: 38 ng/mL PGE2; y 50x: 190 ng/mL PGE2. n = 9 (3 construcciones independientes por grupo con 3 medidas por construcción).
La figura 4, muestra una correlación entre el incremento del grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería como una función de la concentración TGF-alfa incrementada y la densidad de siembra celular a través de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSCs de diferentes tipos celulares (HDF: fibroblastos térmicos humanos neonatales; HUCPVC: células perivasculares de cordón umbilical humano; BM-MSC: células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; y Pre-Adipo: pre-adipocitos). Se utilizó el medio de cultivo celular definido en forma química descrito en el Ejemplo 1 (por ejemplo, 200 ng/mL TGF-alfa) y las densidades de siembra fueron de 30 x 106 células por inserto de 75 mm, lo cual es equivalente a 9.6 x 10 células por inserto de 24 mm. Las medidas de grosor de matriz recolectadas de secciones manchadas con hematoxilina y eosina se fijaron después de 18 días en cultivo. Las barras (promedio ± S.D, n = 12) representan el grosor promedio de n = 3 construcciones independientes con imágenes generadas en 4 ubicaciones separadas.
Las figuras 5A-5B, muestran secciones manchadas con hematoxilina y eosina, manchadas con Trichome/Goldner de asson (MTG), y SEM representativas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSCs de diferentes tipos celulares (HDF: fibroblastos dérmicos humanos neonatales; HUCPVC: células perivasculares de cordón umbilical humano; BM-MSC: células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; y Pre-Adipo: pre-adipocitos) después de 18 días en cultivo. Se utilizó el medio de cultivo de célula definido en forma química descrito en el Ejemplo 1 (por ejemplo, 200 ng/mL TGF-alfa) y las densidades de siembra fueron de 30 x 106 células por inserto de 75 mm, lo cual es equivalente a 9.6 x 106 células por inserto de 24 mm. Las imágenes se capturaron en una magnificación de 20x.
Las figuras 6A-6C, muestran una Fmax, representativa, una resistencia a la tensión final (UTS), y un módulo de propiedades de elasticidad de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSCs de diferentes tipos celulares (HDF-02. fibroblastos dérmicos humanos neonatales; HUC-02: células perivasculares de cordón umbilical humano; MSC-02: células madre mesenquimales derivadas de médula ósea; y PAD-02: pre-adipocitos) después de 18 días en cultivo. Se utilizó el medio de cultivo de célula definido en forma química descrito en el Ejemplo 1 (por ejemplo, 200 ng/mL TGF-alfa) y las densidades de siembra fueron de 30 x 106 células por inserto de 75 mm, lo cual es equivalente a 9.6 x 106 células por inserto de 24 mm. Las barras (promedio ± S.D, n = 9) representan el Fmax promedio, UTS, módulo de elasticidad de 3 construcciones independientes, cada una probada 3 veces.
Las figuras 7A-7B, muestran un resumen de las diferencias en la matriz extracelular y los componentes de adhesión (figura 7A; 17 genes activados > 2 veces en construcciones bio-diseñadas por ingeniería HUCPVC relativa a derivadas de HDF y factores de crecimiento (figura 7B; 8 genes activados > 2 veces en construcciones bio-diseñadas por ingeniería HUCPVC derivadas de HDF relativas o derivadas a construcciones bio-diseñadas por ingeniería) entre construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC y derivadas de HDF.
Las figuras 8A-8D, muestran resultados de una comparación de tiempo-curso de niveles IL-6, IL-8, y VEGF dentro del medio acondicionado, generados mediante diversas construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC y derivadas de HDF que resultan del análisis CBA. Las desviaciones promedio y estándar se calculan de un promedio de n = 3 muestras de promedio acondicionado. También se muestra la cuantificación de niveles HA que resultan de análisis ELISA.
La figura 9 muestra resultados de un ensayo de migración celular. Un ensayo de migración 2-D indirecta que compara el índice de cierre como una función del medio acondicionado recolectado de diversas modalidades. El ensayo se lleva a cabo en queratinocitos cultivados en un medio acondicionado recolectado de unidades HDF-02 y HUCPVC VCT-02 el Día 5 y el Día 18. La figura consiste en imágenes de campo brillantes representativas de los queratinocitos manchados con tinta Acid Fuschin después de 24 horas de inducción en el medio acondicionado, así como una representación gráfica de los valores del índice de cierre que indican el cierre máximo en las muestras del medio acondicionado HUCPVC VCT-02 del Día 5.
Las figuras 10A-10C, muestran los resultados de ensayos potenciales de linaje múltiple llevados a cabo en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC (HUC-02) y derivadas de HDF (HDF-02) y células aisladas de las mismas. La figura 10A, muestra los datos de expresión genética de células dentro de construcciones bio-diseñadas por ingeniería inducidas utilizando un medio de inducción osteogénico utilizando un panel de genes osteogénicos. La figura 10B, muestra los datos de expresión genética de células aisladas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería inducidas utilizando un medio de inducción osteogénica utilizando un panel de genes osteogénicos. La figura 10C muestra los resultados del manchado Oil Red O de células dentro de construcciones bio-diseñadas por ingeniería utilizando un medio de inducción adipogénico.
Las figuras 11A-11E, muestran las secciones histológicas representativas y la cuantificación del manchado con actina del músculo liso-alfa (aSMA) de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC al 100% (figura 11 A), construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de 50% HUCPVC-50%>H DF (figura 11B), construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de 10% HUCPVC-90% HDF (figura 11C), y 100% construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF (figura 11 D ) , después 1 semana de implantación subcutánea en ratones desprotegidos. Las áreas oscuras denotan un manchado positivo para aSMA. La figura 11E muestra la cuantificación de vasos sanguíneos dentro del área de implante tal como se determina mediante el manchado positivo aSMA. Se utilizó un total de dos animales por grupo (n = 2) para el análisis. El número de vasos positivos aSMA se contó manualmente utilizando el objetivo 40x en un microscopio. El número de vasos positivos posteriormente se normalizó al área de implante.
La figura 12, muestra imágenes histológicas independientes de construcciones bio-diseñadas por ingeniería que han sido fijadas en formalina inmediatamente después del cultivo.
La figura 13, muestra imágenes histológicas independientes de construcciones bio-diseñadas por ingeniería a las que se les ha permitido pasar por contracción controlada antes de la fijación con formalina.
Las figuras 14A-14G, muestran resultados del control de tamaños de poro dentro de matrices extracelulares de construcciones bio-diseñadas por ingeniería. La figura 14A muestra los diferentes usos de construcciones bio-diseñadas por ingenierías de acuerdo con diferentes propiedades de diámetro de poro promedio. La figura 14B, muestra el análisis cuantitativo de diámetros de poro y desviaciones estándar promedio de construcciones bio-diseñadas por ingeniería contraídas, liofilizadas mediante control en temperaturas de congelación finales de -40°C en un rango de 0.1°C por minuto, y ya sea no reticuladas, reticuladas con EDC, o reticuladas utilizando métodos DHT. La figura 14C muestra una sección histológica representativa cuantificada en la figura 14C. La figura 14D muestra una sección histológica representativa de una construcción bio-diseñada por ingeniería elevada a temperaturas de congelación final de -10°C en un rango de 0.5°C por minuto. La figura 14E, muestra secciones histológicas representativas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería contraídas mediante control y subsecuentemente, ya sea secadas con aire (panel superior) o liofilizadas a una temperatura de congelación final de -40°C (panel inferior). La figura 14F muestra construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC que tienen naturalmente poros, mientras que la figura 14G muestra que dicho diámetro de poro promedio puede ser incrementado mediante liofilización.
Las figuras 15A-15E, muestran los efectos en las propiedades biofísicas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería que resultan de suplementar el medio de cultivo definido en forma química con bFGF. La figura 15A muestra que el suplemento bFGF reduce el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería. La figura 15B muestra los resultados del análisis de respuesta de dosis bFGF, en donde los subtipos de acumulación de colágeno disminuyeron conforme incrementó el suplemento bFGF. La figura 15C muestra niveles relativos de colágeno soluble tanto en ácido como en pepsina (negro) relativo al colágeno total y a otro colágeno (gris). El glucosaminoglican sulfatado (sGAG; figura 15D) y el ácido hialuronico (HA; figura 15E) se acumularon en menores niveles en construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF relativas a los controles.
La figura 16, muestra los fibroblastos dérmicos humanos que han migrado a través de andamios de seda porosos y están colocados de manera uniforme en el andamio de seda.
Las figuras 17A-17D, muestran los andamios de seda porosos de la parte superior de las células endoteliales de la vena umbilical humana con fibroblastos dérmicos humanos desvitalizados y su correspondiente matriz extracelular, in vitro. Se desarrolló un ensayo de angiogénesis in vitro revisando la alineación de las HUVECs manchadas en modalidades de andamio de seda. Las HUVECs fueron cultivadas en los andamios de seda durante 11 días, y se capturaron las imágenes de fluorescencia. La alineación HUVEC no está visible en el andamio de seda (figura 17A) o el andamio de seda pre-acondicionado en el medio de matriz (figura 17B), pero es prominente en el andamio de seda con fibroblastos dérmicos humanos vivos (HDF) (figura 17C) y el andamio de seda con HDFs desvitalizados (figura 17D).
Descripción Detallada de la Invención Se presentan construcciones bio-diseñadas por ingeniería, que comprenden matrices extracelulares (ECM) que tienen un grosor, tamaño de poro y composición definida. Las ECM son conocidas por ser secretadas por ciertas células y están comprendidas principalmente de proteínas fibrosas, polisacáridos y otros constituyentes menores. Sus componentes incluyen elementos estructurales tales como colágeno y elastina, proteínas adhesivas tal como las glucoproteinas de fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina I y tenascinas, así como proteoglicanos tales como decorina, biglican, sulfato de condroitina y sulfato de heparina y glucosammoglicanos (GAG) tales como ácido hialurónico (HA).
Las diferentes ECMs pueden producirse a través de diferentes células. En comparación con células de fibroblastos, por ejemplo, las MSCs se ha descubierto que producen una ECM porosa. Además, ciertas proteínas asociadas con vascularización (por ejemplo, VEGFa, VEGFC, PDGF , PECAM 1 , CDH5, ANGPT1, MMP2, TIMP1, TIMP3), así como cierto factor de crecimiento y proteína de adhesión, tal como hialuronan, heparina, IL-6, IL-8, vitronectina (VTN), factor 3 de estimulación de colonia (CSF-3), NCAM1, y CXCL1, parecen ser producidos en mayores cantidades en ECM producidas por MSCs que por fibroblastos (ver por ejemplo, la figura 7).
El componente de matriz extracelular mayor predominante producido por fibroblastos es colágeno fibrilar, particularmente colágeno tipo I. Sin embargo, las células también producen otros colágenos fibrilares y no fibrilares, incluyendo colágeno tipos II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, y otros.
La red jerárquica de estos componentes ECM, proporciona un ambiente natural, en el cual las células pueden sobrevivir y funcionar en forma adecuada. Las condiciones de cultivo celular y métodos cultivados posteriormente, tal como aquí se describe, pueden aplicarse a tipos celulares que tienen la capacidad de sintetizar y secretar la matriz extracelular para producir construcciones bio-diseñadas por ingeniería que tienen propiedades biofísicas definidas.
I. Control del Control de Construcción Bio-diseñadas por Ingeniería El grosor de ECM se puede optimizar para un uso particular in vivo. Por ejemplo, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería más gruesas pueden ser útiles para sitios en el cuerpo que experimentan agitación física (por ejemplo rodilla) o para cualquier aplicación para la cual se desee que la construcción persista in vivo durante un período de tiempo prolongado.
El grosor del volumen de ECM confiere propiedades tipo tejido de cohesión que son resistentes a daño físico, tal como desgarre o desquebrajamiento. Las ECMs adecuadas deben tener un grosor, el cual es de al menos aproximadamente 30 µ?t?, 40 µ?t?, 50 pm, 60 pm, 70 µ?t?, 80 µ?t?, 90 m, 100 µ?t?, 110 µ?t?, 120 µ??, 130 pm, 140 pm, 150 µp?, 160 µ?t?, 170 pm, 180 µ??, 190 µ? , 200 µ??, 220 µ??, 240 µ?t?, 260 µ?t?, 280 pm, 300 µ??, 320 µ??, 340 pm, 360 pm, 380 µ??, 400 µp?, 450 pm, 500 µ?t?, 550 µ??, 600 µ?t?, 650 µ?t?, 700 µ? , 750 µ?t?, 800 µ? , 850 pm, 900 µ??, 950 µm o más, adecuado para utilizarse en aplicaciones de pruebas o clínicas, en donde son útiles los grosores. a. Construcciones Bio-diseñadas por ingeniería Derivadas de Célula Mesenquimal (MSC) Las células madre (mesenquimales MSCs; conocidas alternativamente como células progenitoras mesenquimales) son células con la capacidad de expandirse en el cultivo y diferenciarse en las células de tejido mesenquimal, incluyendo hueso, cartílago, tendón, ligamento, músculo, tejido adiposo y estroma de médula. Las MSCs sintetizan, secretan y/o organizan en forma ineficiente los componentes de matriz extracelular (por ejemplo, producción de matriz extracelular endógena) bajo condiciones de cultivo normales. Sin embargo, bajo las condiciones de cultivo que se describen en forma adicional en la presente invención, pueden estar contenidas por sí mismas dentro de una matriz extracelular secretada en forma eficiente sin componentes de matriz exógena (por ejemplo, componentes de matriz no producidos por células cultivadas pero introducidos a través de otros medios). Las SCs se pueden obtener de un número de Fuentes incluyendo, pero sin limitarse a huesos, médula, cordón umbilical, placenta, líquido amniótico y otros tejidos conectivos (por ejemplo músculo, tejido adiposo, huesos, tendón y cartílago). Por ejemplo, las MSC de cordón umbilical pueden aislarse de sangre de cordón umbilical, subendotelio de vena umbilical y jalea de Wharton. Las MCSs pueden ser aisladas en forma adicional de tres regiones: la zona perivascular (células perivasculares de cordón umbilical o UCPVCs), la zona intervascular, placenta, líquido amniótico, y el subamnión (Troyer y Weiss, 2007). Como alternativa, las MSC derivadas de médula ósea pueden ser recolectadas de médula ósea y comprender células no hematopoyéticas, multipotenciales, soportar la expansión de célula madre hematopoyética, y pueden diferenciarse en diversos tejidos conectivos.
Se pueden utilizar células humanas, así como las de otras especies de mamíferos, incluyendo pero sin limitarse a equ-ino, canino, porcino, bovino, ovino o roedor (por ejemplo, ratón o rata). Las células pueden ser derivadas como células primarias de tejidos relevantes, o más preferentemente de células pasadas en serie o subcultivadas de reservas o bancos de células establecidas que han sido clasificadas contra contaminación viral y bacteriana, y pueden ser probadas con respecto a pureza. Además, las células que son transfectadas en forma espontánea química o viral, o células recombinantes o células construidas en forma genética también pueden ser utilizadas en la presente invención. Asimismo, las células pueden ser recombinantes o construidas en forma genética. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas por ingeniería para producir y suministrar productos de célula recombinante tal como factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas, para un sujeto durante una cantidad de tiempo continua, o según sea necesario cuando se señala en forma biológica, química o térmica debido a las condiciones presentes en el sujeto. Se puede diseñar por ingeniería la expansión del producto de gen ya sea a largo o corto plazo. La expresión a largo plazo es deseable cuando la construcción de tejido cultivado se implanta o aplica a un sujeto para suministrar productos terapéuticos al sujeto durante un período de tiempo prolongado. De manera inversa, la expresión a corto plazo se desea en casos en donde una vez que ha sanado la herida, los productos de gen de la construcción de tejido cultivado, ya no son necesarios o ya no se desean en ese sitio. Las células también pueden ser diseñadas por ingeniería en forma genética para expresar proteínas o diferentes tipos de componentes de matriz extracelular, los cuales son ya sea "normales", pero expresados en altos niveles o modificados en alguna forma para elaborar un complejo bio-diseñado por ingeniería que comprende matriz extracelular y células vivas, lo cual es terapéuticamente conveniente para una curación de heridas mejorada, neovascularización facilitada o dirigida o formación de cicatrices o queloides minimizada.
Con el objeto de secretar en forma eficiente la matriz extracelular a un grosor deseado, las MSCs pueden ser cultivadas durante un número de días o semanas (por ejemplo, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más días) en un medio indefinido o en un medio definido en forma química. Se puede utilizar en un sistema definido en forma química que comprende células derivadas de humanos, pero no componentes o células biológicas no humanas o no definidas en forma química. Los cultivos se mantienen en un incubador para asegurar las condiciones ambientales suficientes de temperatura, humedad y mezcla de gas controlada para el cultivo de células de acuerdo con variables ambientales bien conocidas. Por ejemplo, bel incubador puede tener una temperatura de entre aproximadamente 34°C hasta aproximadamente 38°C (por ejemplo, 37 ± 1°C) con una atmósfera entre aproximadamente 5-10 ± 1% C02 y humedad relativa (Rh) entre aproximadamente 80-90%. Como alternativa, las células pueden ser cultivadas bajo condiciones hipóxicas. Las células pueden ser expuestas temporalmente a temperatura, aire y humedad ambiental, durante la alimentación, siembra y otras manipulaciones celulares.
Sin importar el tipo de células, el medio de cultivo está comprendido de una base de nutrientes normalmente suplementada en forma adicional con otros componentes. Las bases nutrientes, que generalmente suministran nutrientes tales como glucosa, sales inorgánicas, una fuente de energía, aminoácidos y vitaminas, son bien conocidas en la técnica del cultivo de células animales. Los ejemplos incluyen pero no se limitan al Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM); Medio Esencial Mínimo (MEM); M199, PMI 1640, Medio Dulbecco Modificado por Iscove (EDMEM). El Medio Esencial Mínimo (MEM) y M199 requieren suplementacion adicional con precursores fosfolípidos y aminoácidos no esenciales. Las mezclas con alto contenido de vitaminas comercialmente disponibles que suministran aminoácidos, ácidos nucleicos, cofactores de enzimas, precursores de fosfolípido, y sales inorgánicas adicionales incluyen Ham F-12, Ham F-10, NCTC 109, y NCTC 135. Las mezclas de dichos medios que son utilizadas, tal como DMEM y Ham F-12 entre una proporción de 3 a 1 a una proporción de 1 a 3, respectivamente.
Las formulaciones de medio de cultivo y la dosificación adicional con suplementos del medio para MSCs y tipos de células adicionales, tal como fibroblastos o células epiteliales, se pueden seleccionar de acuerdo con métodos de cultivo celular bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,712,163 de Parenteau, la Publicación PCT No. WO 95/31473, la Publicación PCT No. WO 00/29553, la Publicación PCT No. WO 2009/070720, Ham y cKeehan, Métodos en Enzimología, 58:44-93 (1979), Bottenstein y asociados, Meth. Enzym., 58:94-109 (1979); cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia). Por ejemplo, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC pueden ser cultivadas en un medio suplementado con agentes que promueven la síntesis de matriz y el depósito por parte de las células. El medio de cultivo definido en forma química se puede utilizar de modo que esté libre de extractos de tejido u órgano animal no definido tal como suero, extracto de pituitaria, extracto hipotalámico, extracto de placenta o extracto embriónico o proteínas y factores secretados por células de alimentación. Dichos medios pueden estar libres de componentes no definidos y componentes biológicos derivados de fuentes animales no humanas para disminuir el riesgo de contaminación e infección por virus de especies cruzadas o animales adventicios. Los equivalentes funcionales sintéticos o recombinantes pueden reemplazar el uso de dichos extractos de tejido u órgano animal.
El factor alfa de transformación de crecimiento (TGF-a), el cual se produce en macrófagos, células cerebrales y queratinocitos, e induce el desarrollo epitelial, se ha descubierto en la presente invención que estimula a las MSCs a sintetizar, secretar y organizar los componentes de matriz extracelular en un grado apreciable. TGF-a es una proteína pequeña (-50 residuo) que comparte el 30% de homología estructural con EGF y compite para el mismo sitio receptor enlazado por superficie. Se ha implicado en la curación de heridas y promueve cambios subfenotípicos en ciertas células. TGF-a o TGF-a de cadena larga se pueden suplementar al medio en un rango de aproximadamente 0.0005 pg/mL hasta aproximadamente 0.30 pg/mL, de aproximadamente 0.0050 pg/mL hasta aproximadamente 0.03 pg/mL, o de aproximadamente 0.01 pg/mL hasta aproximadamente 0.02 pg/mL. En algunas modalidades, la cantidad de TGF alfa suplementado es de 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 130 ng/mL, 140 ng/mL, 150 ng/mL, 160 ng/mL, 170 ng/mL, 180 ng/mL, 190 ng/mL, 200 ng/mL o más.
En contraste, la prostaglandina E2 (PGE2) se genera a partir de la acción de las sintasas de prostaglandina E en prostaglandina H2 (PGH2), y se ha descubierto en la presente invención que inhibe que las MSCs sinteticen, secreten y organicen matrices extracelulares cuando están presentes en dosis relativamente altas. Por lo tanto, la suplementación PGE2 (por ejemplo, la forma 16, 16 PGE2) puede utilizarse para regular el grosor de la matriz extracelular y puede fluctuar de aproximadamente 0.000038 pg/mL hasta aproximadamente 0.760 pg/mL, de aproximadamente 0.00038 pg/mL hasta aproximadamente 0.076 pg/mL, o de aproximadamente 0.038 pg/mL. En algunas modalidades, la cantidad de PGE2 suplementado es de 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 120 ng/mL, 130 ng/mL, 140 ng/mL, 150 ng/mL, 160 ng/mL, 170 ng/mL, 180 ng/mL, 190 ng/mL, 200 ng/mL o más.
En forma similar, en la presente invención se ha descubierto que el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) inhibe células, tales como fibroblastos, de que sinteticen, secreten y organicen los componentes de matriz extracelular. En particular, el colágeno soluble en pepsina, los glucosaminoglicanos sulfatados (sGAGs) y el ácido hialurónico (A) se reducen conforme incrementan los niveles bFGF, y cada componente puede ser reducido en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o más en forma relativa a un control. Dichas diferencias en la composición del componente de matriz extracelular, da como resultado en forma adicional una forma pulverizada al momento de secar con aire, y un polvo fácilmente molido cuando se liofiliza. Dichas formas pulverizadas tienen viscosidad reducida, de modo que pueden pasar a través de agujas de jeringa que tienen un calibre de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más fino. Por lo tanto, la suplementación bFGF puede utilizarse para regular el grosor y la composición de matriz extracelular desde aproximadamente 10 ng/mL, 15 ng/mL, 20 ng/mL, 25 ng/mL, 30 ng/mL, 35 ng/mL, 40 ng/mL, 45 ng/mL, 50 ng/mL, 55 ng/mL, 60 ng/mL, 65 ng/mL, 70 ng/mL, 75 ng/mL, 80 ng/mL, 85 ng/mL, 90 ng/mL, 95 ng/mL, 100 ng/mL o más.
Se puede utilizar ascorbato o un derivado (por ejemplo, ascorbato de sodio, ácido ascórbico o uno de sus derivados químicamente más estables tal como n-hidrato de sal de magnesio de fosfato de ácido L-ascórbico) como un suplemento para promover la hidratación de prolina y la secreción de procolágeno, un precursor soluble para moléculas de colágeno depositadas. El ascorbato también activa la síntesis de colágeno tipo I y tipo III. Se puede utilizar insulina como un suplemento para promover la captación de glucosa y aminoácidos para proporcionar beneficios a largo plazo en múltiples pasajes. La suplementación de insulina o el factor de crecimiento tipo insulina (IGF), es necesaria para un cultivo a largo plazo, ya que habrá una reducción eventual de la capacidad de las células para captar la glucosa y aminoácidos y la posible degradación del fenotipo celular. La insulina puede ser derivada de cualquier animal, por ejemplo bovino, fuentes humanas o mediante medios recombinantes como insulina recombinante humana. Por consiguiente, una insulina humana puede calificar como un componente definido en forma química no derivado de una fuente biológica no humana. El complemento de insulina es aconsejable para cultivo en serie y se proporciona al medio en un amplio rango de concentraciones. Un rango de concentración preferido es de entre aproximadamente 0.1 pg/ml hasta aproximadamente 500 pg/ml, en aproximadamente 5 pg/ml hasta aproximadamente 400 pg/ml, y entre aproximadamente 375 pg/ml. Las concentraciones adecuadas para el suplemento del factor de crecimiento tipo insulina, tal como IGF-1 IGF-2, y similares, puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica de los tipos de células elegidos para cultivo.
La transferrina se puede utilizar como complemento para regular el transporte de hierro. El hierro es un elemento de residuo esencial encontrado en suero, pero que puede ser tóxico en grandes cantidades si no secuestrado por transferrina. La transferrina puede ser suplementada en un rango de concentración de entre aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 50 pg/ml o aproximadamente 5 pg/ml.
Se puede utilizar triyodotironina (T3) como un suplemento para regular el metabolismo celular y se puede suplementar en un rango de concentración de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 400 pM, entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 pM, o en aproximadamente 20 pM.
Cualquiera de o tanto la etanolamina como la o-fosforil-etanolamina, que son fosfolípidos, se pueden utilizar como un suplemento para facilitar la producción de ácido graso, particularmente cuando se cultiva en un medio libre de suero. La etanolamina y o-fosforil-etanolamina se puede suplementar en un rango de concentración de entre aproximadamente 10'6 hasta aproximadamente 10"2 M o de aproximadamente 1 x 10"4 M.
Se puede utilizar el ácido selénico como un suplemento para proporcionar un elemento residual en un medio libre de suero. El ácido selénico se puede proporcionar en un rango de concentración de aproximadamente 10"9 M a aproximadamente 10"7 M o a aproximadamente 5.3 x 1 O"8 M.
El suplemento con aminoácidos puede conservar la energía celular, derivando la necesidad de la célula de sintetizar estos bloques de construcción de proteínas. Por ejemplo, la adición de prolina y glicina, así como la forma hidroxilada de prolina, hidroxiprolina, son aminoácidos básicos que elaboran la estructura del colágeno. Además, la L-glutamina de aminoácido está presente en algunas bases nutrientes y se puede arreglar en casos en donde no existe ninguna, o están presentes cantidades insuficientes. L-glutamina también se puede proporcionar en forma estable, tal como la vendida bajo la marca de GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, Y). GlutaMAX-1™ es una forma de dipéptido estable de L-alanil-L-glutam¡na y se puede utilizar en forma intercambiable con L-glutamina y se proporciona en concentraciones equimolares como un sustituto para L-glutamina. El dipéptido proporciona estabilidad para L-glutamina de la degradación con el tiempo en almacenamiento y durante incubación, lo cual puede conducir a una incertidumbre en la concentración efectiva de L-glutamina en el medio. Normalmente, el medio base es suplementado preferentemente con entre aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 6 mM, más preferentemente entre aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 5 mM, y lo más preferentemente 4 mM de L-glutamina o GlutaMAX-1™.
Los suplementos adicionales también se pueden agregar para resultados de cultivo particulares, tal como una o más prostaglandinas, factores de transformación de crecimiento (incluyendo factores alfa o beta de transformación de crecimiento), factor de crecimiento de queratinocito (KGF), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), o manosa-6-fosfato (M6P), o una combinación de los mismos. Por ejemplo, TGF-ß? y TPA cada uno son conocidos para activar la síntesis de colágeno (Raghow y asociados, J. Clin. Invest., 79: 1285-1288 (1987) y Pardes y asociados, J. Invest. Derm., 100:549 (1993)).
Además, se puede utilizar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como un suplemento para ayudar a establecer cultivos a través de escala y sembrado celular. Se puede utilizar EGF en forma nativa o forma recombinante. Las formas humanas, nativas o recombinantes, de EGF son preferidas para utilizarse en el medio cuando se fabrica un equivalente de piel que no contiene componentes biológicos no humanos. EGF es un componente opcional y se puede proporcionar en una concentración en entre aproximadamente 1 hasta 15 ng/mL o entre aproximadamente 5 hasta 10 ng/mL.
La hidrocortisona se puede utilizar como un suplemento para promover el fenotipo de queratinocito y por consiguiente aumentar las características diferenciadas, tal como el contenido de transglutaminasa de involucrina y queratinocito (Rubín y asociados., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1986)). Por consiguiente, la hidrocortisona es un aditivo deseado en casos en donde estas características son benéficas, tal como la formación de injertos de lámina de queratinocito o construcciones de piel. La hidrocortisona puede proporcionarse en un rango de concentración de aproximadamente 0.01 pg/ml hasta aproximadamente 4.0 g/ml o entre aproximadamente 0.4 pg/ml hasta 16 pg/ml.
El factor de crecimiento de queratinocito (KGF) se puede utilizar como un suplemento para soportar la epidermalización dentro de un rango de aproximadamente 0.001 pg/mL hasta aproximadamente 0.150 pg/mL, de aproximadamente 0.0025 pg/mL hasta aproximadamente 0.100 pg/mL, de aproximadamente 0.005 Mg/mL hasta aproximadamente 0.015 pg/mL, o 5 pg/mL.
Se puede utilizar manosa-6-fosfato (M6P) como un suplemento para soportar la epidermalización en aproximadamente 0.0005 mg/mL hasta aproximadamente 0.0500 mg/mL.
Se pueden utilizar polímeros neutrales como un suplemento para aumentar la consistencia del procesamiento y depósito de colágeno entre las muestras. Por ejemplo, el polietilenglicol (PEG) es conocido por promover el procesamiento in vitro del procolágeno precursor soluble producido por células cultivadas para una forma de colágeno depositado por matriz. El PEG de grado de cultivo de tejido dentro del rango de entre aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 4000 MW (peso molecular), aproximadamente 3400 hasta aproximadamente 3700 MW, en aproximadamente 5% p/v o menos, aproximadamente 0.01% p/v hasta aproximadamente 0.5% p/v, aproximadamente 0.025% p/v hasta aproximadamente 0.2% p/v, o aproximadamente 0.05% p/v. También se pueden utilizar otros polímeros neutrales de grado de cultivo tales como preferentemente dextrano T-40 o polivinilpirrolidona (PVP), preferentemente dentro del rango de 30,000-40,000 MW, en concentraciones de aproximadamente 5% p/v o menos, entre aproximadamente 0.01% p/v hasta aproximadamente 0.5%> p/v, entre aproximadamente 0.025%> p/v hasta aproximadamente 0.2% p/v, o aproximadamente 0.05% p/v. Otros agentes compatibles de colágeno y de grado de cultivo de células que aumentan el procesamiento de colágeno son bien conocidos para los expertos en la técnica, b. Substratos y/o Perfusión de Cultivo El sembrado de células en una membrana porosa (por ejemplo, inserto de cultivo) de un diámetro definido, puede aumentar el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería, aumentando el rango en el cual se producen las matrices extracelulares, ya que minimiza el área de superficie expuesta a nutrientes del medio. Los poros se comunican a través de las superficies tanto superiores como inferiores de la membrana para permitir el contacto bilateral del medio para desarrollar la construcción de tejido o para contactar únicamente desde debajo del cultivo. El medio también puede contactar únicamente la parte inferior de la construcción de tejido cultivado en formación, de modo que la superficie superior pueda ser expuesta al aire, como en el desarrollo de una piel cultivada. Normalmente, la membrana se asegura a un extremo del miembro tubular o estructura que se inserta dentro y hace interfase con una base, tal como un plato de petri o de cultivo, que puede ser cubierto con una tapa. Cuando estos tipos de envases de cultivado son empleados, se produce la construcción de tejido en una superficie de la membrana (por ejemplo, la superficie superior, que se orienta hacia arriba), y el cultivo es contactado por el medio celular tanto en las superficies superiores como inferiores. Los tamaños de poro son lo suficientemente pequeños de modo que no permiten el crecimiento de células a través de la membrana, pero aún lo suficientemente grandes para permitir el paso libre de los nutrientes contenidos en el medio de cultivo hacia la superficie inferior de la construcción bio-diseñada por ingeniería, tal como mediante acción capilar. Por ejemplo, los tamaños de poro pueden ser aproximadamente menores de 7 pm, entre aproximadamente 0.1 pm a aproximadamente 7 pm, entre aproximadamente 0.2 pm a aproximadamente 6 pm, o entre aproximadamente 0.4 pm a aproximadamente 5 pm de diámetro. El tamaño de poro máximo depende no únicamente del tamaño de la célula, sino también de la capacidad que tiene la célula de alterar su forma, y pasar a través de la membrana. Es importante que la construcción tipo tejido se adhiera a la superficie pero no incorpore o envuelva el substrato, de modo que sea removible del mismo, tal como mediante desprendimiento con una fuerza mínima. El tamaño y forma de la construcción de tejido formada está dictado por el tamaño de la superficie del envase o membrana sobre la cual crece. Los substratos pueden ser redondos, cuadrados, rectangulares o angulares o formados con ángulos de esquina redondeados, o de forma irregular. Los sustratos también pueden ser planos o contorneados como un molde para producir una construcción formada para hacer interfase con una herida, o mimetizar la estructura física del tejido nativo. Para abarcar mayores áreas de superficie del substrato de crecimiento, se siembran proporcionalmente más células en la superficie, y se necesita un mayor volumen del medio para bañar y nutrir lo suficiente las células. Cuando la construcción de tejido a base de bio-diseñadas por ingeniería se forma finalmente, se elimina mediante desprendimiento del substrato de membrana. Los substratos pueden ser tratados previamente antes del sembrado celular, con el objeto de mejorar las características de enlace del substrato, elevando la energía de la superficie. El pre-tratamiento puede incluir, pero no se limita a tratamiento COOH y NH2 Largo.
La perfusión del substrato de cultivo para ejercer una fuerza mecánica contra la capa bio-diseñadas por ingeniería en formación para mimetizar las fuerzas in vivo, puede aumentar en forma adicional el grosor y la resistencia de la construcción bio-diseñada por ingeniería. Los medios de perfusión son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a, agitar el medio utilizando una barra de agitación magnética o un impulsor motorizado subyacente o adyacente al transportador del substrato que contiene la membrana de cultivo; bombear el medio dentro o a través del plato o cámara de cultivo; agitar suavemente el plato de cultivo en una plataforma de agitación o rotación; o enrollado si se utiliza una botella de cultivo de rodillo. Se pueden ejercer otras fuerzas mecánicas impulsando, flexionando, ondulando o estirando la membrana porosa durante el cultivo, durante el cultivo, las células secretan moléculas de matriz endógena y organizan las moléculas de matriz secretadas para formar una estructura tipo tejido tridimensional, pero no exhibir fuerzas contráctiles significativas para originar que la construcción bio-diseñada por ingeniería en formación se contraiga y desprenda por sí misma del substrato de cultivo. Las superficies de crecimiento celular adecuadas en las cuales se pueden crecer las células, pueden ser cualquier material biológicamente compatible en el cual se puedan adherir las células, y proporcionar un medio de anclaje para que se forme la construcción bio-diseñada por ingeniería. Se pueden utilizar como una superficie de crecimiento celular materiales tales como vidrio; acero inoxidable; polímeros, incluyendo policarbonato, poli(sulfonas de éter) (PES), poliestireno, cloruro de polivinilo, polivinilideno, polidimethilsiloxano, fluoropolímeros, y propileno de etileno fluorinado; y substratos de silicón incluyendo sílice fusionada, polisilicón, o cristales de silicón. El material de superficie de crecimiento celular puede ser tratado o modificado químicamente, cargado en forma electroestática o recubierto con biológicos tales como poli-l-lisina o péptidos. Un ejemplo de un tratamiento químico que da como resultado una superficie cargada en forma electroestática COOH y NH2 Larga. Un ejemplo de un recubrimiento de péptido es péptido RGD. La superficie de crecimiento celular puede ser tratada con una forma sintética o humana de matriz extracelular que ayuda a la adhesión de la matriz que produce las células, de modo que las células tengan una interfase natural con la superficie de crecimiento celular para adhesión, orientación, o indicios bioquímicos. Cuando se utiliza en este aspecto una forma sintética o humana de matriz extracelular, es temporal debido a que es reemplazada con el tiempo en el cultivo por las células. La forma sintética o humana de matriz extracelular, cuando se coloca en la superficie del crecimiento celular fluctúa de las moléculas de matriz dispersas a través de superficie, al grosor molecular, o a la película delgada continua con un grosor de entre nanómetros y mícrómetros.
La fibronectina en formas naturales y sintéticas se puede utilizar para proporcionar un recubrimiento para el substrato de cultivo. Las formas de fibronectina que se pueden utilizar, incluyen pero no se limitan a: fibronectina humana, fibronectina derivada de plasma humano; fibronectina recombinante, o formas sintéticas tales como ProNectin, lo cual es una secuencia de péptido repetida derivada y sintetizada de una parte de la fibronectina humana natural. Los recubrimientos de colágeno natural, producido mediante cultivo celular o recombinante pueden ser proporcionados al substrato.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería cultivadas no dependen de los miembros sintéticos o bioreabsorbibles, tal como un miembro de malla, para la formación e integridad; sin embargo, dichos miembros pueden ser utilizados. Un miembro de malla puede ser un material tejido, tejido de punto o tipo fieltro. En sistemas en donde se utiliza un miembro de malla, las células son cultivadas en el miembro de malla y crecen en cualquier lado y dentro de los intersticios de la malla, para envolver e incorporar la malla dentro de la construcción de tejido cultivado. La construcción final formada a través de los métodos que incorporan dicha malla, dependen de la misma para el soporte físico y para el volumen.
Los andamios de seda pueden proporcionar un soporte estructural, aunque provocan una respuesta inmune mínima en el huésped o ninguna respuesta en el huésped. La porosidad del andamio de fibroína de seda porosa puede fluctuar de entre aproximadamente 10 mieras hasta aproximadamente 150 mieras, 30 mieras hasta aproximadamente 45 mieras, 50 mieras hasta 100 mieras, o 80 mieras hasta 150 mieras de diámetro.
El diámetro de poro promedio de los andamios de seda puede controlarse variando el porcentaje de solvente. Las fibras de seda se pueden mezclar con un solvente orgánico tal como etanol o D SO. Al incrementar la cantidad de solvente orgánico, el tamaño de poro de los andamios de seda puede ser disminuido en forma selectiva con base en un nivel de porosidad deseado. Por ejemplo, al disolver el 4% de seda para 1% de etanol, se obtiene como resultado un andamio de seda que tiene un diámetro de poro promedio de 50-100 mieras. Es recomendable un tamaño de poro de entre 50 y 100 mieras para una infiltración de fibroblasto mejorada, y para permitir una más rápida vascularización de la construcción in vivo. Se puede lograr un diámetro de poro promedio del andamio de seda más grande (por ejemplo, aproximadamente 80-150 mieras) disolviendo 3% de seda en 0.5% de etanol. Es recomendable un andamio de seda con un diámetro de poro promedio de aproximadamente 80-150 mieras para heridas de quemadura más severas, debido a que los poros más grandes permiten que se despejen los exudados de la herida de la cama de la herida.
La fibroína de seda puede ser derivada de fuentes ya sea naturales o recombinantes. Una fuente de fibroína de seda natural preferida, se deriva de fibra de seda desgomada de un capullo de gusano de seda Bombyx Mori. Se mezcla en adiciones una solución de fibroína de seda con un solvente orgánico mezclable en agua tal como un alcohol seleccionado del grupo que consiste en alcohol etílico, alcohol metílico, alcohol isopropílico, propanol, butanol; dimetiisulfóxido (DMSO) o acetona. Posteriormente la solución de fibroína de seda se funde o vierte en un molde o directamente en un inserto de cultivo que incorpora una membrana de cultivo porosa/permeable que proporciona contacto bilateral del medio de cultivo tanto arriba como debajo de la superficie plana de la membrana y el andamio de fibroína de seda porosa. Posteriormente la solución se congela durante un tiempo, posteriormente se descongela y enjuaga para eliminar los residuos de solvente. Posteriormente los andamios de fibroína de seda porosa son pasados por autoclave, irradiados con rayos gamma o esterilizados con rayos-e para producir un andamio de fibroína de seda poroso estéril. Después de la esterilización, el andamio de fibroína de seda porosa se puede utilizar como un substrato de cultivo para células cultivadas utilizando los métodos aquí empleados. Después de cultivar las células en andamios de fibroína de seda porosa, las células también se pueden desvitalizar utilizando los métodos aquí empleados. Se pueden agregar otras características a las construcciones de andamio de fibroína de seda porosa, tal como una capa de silicona.
Los andamios de seda se pueden acondicionar con sustancias útiles para mejorar la curación de heridas. Por ejemplo, se pueden incubar andamios de seda húmedos o secos con una solución que contiene una o más proteínas, durante 5 a 10 minutos, de modo que la cantidad de proteína final absorbida este dentro del rango de 1 microgramo a 1 miligramo. Los andamios de seda y las construcciones bio-diseñadas por ingeniería que comprende andamios de seda que son parcialmente liofilizados (por ejemplo, secados por congelación durante 3 horas a una temperatura de 0°C), y congelados a una temperatura de -20°C antes de la incubación con soluciones de proteína, parecen maximizar la cantidad de proteina adsorbida. El autoclave del andamio de seda antes de utilizarse en el cultivo celular, también parece aumentar la degradación ¡n vivo y por lo tanto reduce la persistencia, c. Siembra de Células La siembra en una supeconfluencia (es decir mayor al 100% de confluencia) incrementa el rango de formación de matriz extracelular, derivando la fase de crecimiento celular. Por lo tanto, las células pueden sembrarse directamente en una superconfluencia desde el 100% de confluencia hasta aproximadamente 900% de confluencia, incluyendo dentro del rango de aproximadamente 300% hasta aproximadamente 600% de confluencia, para producir inmediatamente una matriz extracelular. La superconfluencia también se puede lograr de acuerdo con densidades de siembra celular por área de superficie de cultivo, y pueden ser por ejemplo de 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106 o más células por en2. Por ejemplo, se pueden utilizar insertos de 75 mm de diámetro, que tiene un área de superficie de cultivo aproximada de 44 cm2. La siembra de una cantidad de células superconfluentes (por ejemplo, 3 x 106 células) en dicho inserto, da como resultado una densidad de siembra inicial de aproximadamente 6.8 x 105 células/cm2. Se pueden sembrar aproximadamente 7.5 x 106 células en un inserto rectangular de 10 cm x 10 cm, para producir una siembra inicial de aproximadamente 7.5 x 105 células/cm2.
Como alternativa, las células pueden sembrarse en una sub-confluencia para proliferar antes de estimularlas para producir y organizar una matriz extracelular. Se puede lograr una densidad de célula sub-conf luente sembrando entre aproximadamente 1 x 105 células/cm2 hasta aproximadamente 6.8 x 105 células/cm2, entre aproximadamente 3 x 105 células/cm2 hasta aproximadamente 6.8 x 105 células/cm2, o aproximadamente 6.8 x 105 células/cm2 (células por área de centímetro cuadrado de la superficie), d. Contracción Controlada El grosor de una construcción bio-diseñada por ingeniería que puede mejorarse liberándola del substrato dé cultivo, de modo que se le permita contraerse sin restricción. Dicha "contracción controlada" o "contracción no restringida", puede ser monitoreada en tiempo real y puede detenerse después de que ha ocurrido una cantidad de contracción y grosor deseada. Las células vivas en la construcción bio-diseñada por ingeniería, ejercen fuerzas contráctiles en la matriz extracelular endógena, que son mitigadas mediante la adherencia de la construcción bio-diseñada por ingeniería al substrato de cultivo. En el paso de contracción no restringida, estas fuerzas contráctiles impartidas por las células, son apalancadas para incrementar la resistencia física general y el grosor de la construcción, en comparación con construcciones preparadas en forma similar que no han sido sometidas a contracción no restringida después del cultivo. La contracción controlada puede ser inducida liberando la construcción bio-diseñada por ingeniería del substrato de cultivo, tal como mediante el uso de medios físicos tales como desprendimiento o levantamiento del substrato, agitación del substrato o mediante flexión del substrato. La liberación de la construcción bio-diseñada por ingeniería también se puede lograr cambiando la temperatura del cultivo, especialmente cuando se emplea un substrato de termorespuesta, o mediante el uso de medios químicos.
La contracción controlada, se mide por tiempo, por grosor incrementado o por una disminución en el área de superficie, tal como se mide a través de la diminución en diámetro o disminución del ancho o longitud de la construcción. La contracción de la matriz mediante las células, parece organizar las fibras de la matriz endógena, de modo que incrementan la resistencia general de la matriz (por ejemplo, resistencia de retención de sutura), pero no tanto de modo que la matriz quede sin forma, distorsionada, con arrugas o pierda una característica aproximadamente plana en su configuración. En otras palabras, el aspecto plano de la matriz se conserva, pero el área de la superficie general disminuye e incrementa el grosor. Cuando se mide la contracción no restringida a través del incremento general del grosor bio-diseñado por ingeniería, incrementa un porcentaje del grosor o se utiliza una medida del grosor incrementado real. Cuando se mide la contracción no restringida a través de la disminución en el área de superficie, se utiliza un porcentaje de disminución en el área de superficie o una medida real de la disminución de la una o más disminuciones. La contracción se puede medir, midiendo el porcentaje de disminución en el área de superficie de la matriz de tejido, tal como entre 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%o, 70%, 80% o más o cualquier rango intermedio. Se puede detener la contracción, cuando sea adecuado, desvitalizando las células, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. e. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Híbridas Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC pueden comprender además tipos de células adicionales con la capacidad de sintetizar, secretar y organizar la matriz extracelular para aumentar el grosor de la matriz extracelular. Dichos tipos de célula pueden ser fibroblastos, células estromales, células de músculo liso, condrocitos y otras células de tejido conectivo de origen mesenquimal. Las células de fibroblasto pueden ser derivadas de una cantidad de fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a prepucio masculino de neonato, dermis, tendón, pulmón, codones umbilicales, cartílago, uretra, estroma, córnea, mucosa oral, e intestino. Se pueden utilizar mezclas quiméricas de células normales de dos o más fuentes, tal como una mezcla quimérica de células autólogas y alogénicas; mezclas de células normales y genéticamente modificadas o transfectadas; mezclas de células derivadas de diferentes tipo de tejido u órgano; o mezclas de células de dos o más especies o fuentes de tejido.
El al menos un tipo de célula adicional se puede agregar en forma de capas o mezcla en adiciones. Para construcciones en bio-diseñadas por ingeniería en capas, se siembra un primer tipo de célula en un substrato de cultivo celular, y subsecuentemente se siembra un segundo tipo de célula en la parte superior de la primera capa de las células. Las construcciones mezcladas en adiciones pueden ser generadas variando las proporciones de siembra iniciales de al menos dos tipos de células con base al menos en parte en los atributos de construcción deseada para efecto terapéutico. Por ejemplo, las MSCs pueden ser el primer tipo celular y comprender el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más de la mezcla de siembra de célula inicial. Los fibroblastos, tal como fibroblastos neonatales, fibroblastos dérmicos, fibroblastos papilares, fibroblastos reticulares o una combinación de los mismos, puede ser el segundo tipo celular y comprender la mezcla de la semilla de la célula inicial restante. La población de célula total en la siembra inicial, puede ser de entre 1.0 x 105 hasta 1.0 x 106 por cm2.
Para construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas mediante mezcla en adiciones, también se pueden determinar las densidades de siembra inicial con base en el número de células al momento de la siembra, en donde la masa de célula total deseada es conocida al momento de la siembra de acuerdo con: aX + bY = Z; en donde X = Y = Z y hasta + b = 1, pero b > 0 y hasta < 1. Por ejemplo, la densidad de siembra celular deseada es Z y Z = 2.1 x 105 células/cm2 (aproximadamente) y aX y bY representan el número de fibroblastos y células progenitoras mesenquimales, respectivamente, en el número total de células por centímetro cuadrado de área que será sembrada representada por Z. Por lo tanto, cuando los fibroblastos y MSCs comprenden cada uno el 50% de las células totales sembradas, la ecuación puede ser expresada como: aX + bY = Z células/cm2 en donde (0.5)(2.1 x 105 células) + (0.5)(2.1 x 105 células) = 2.1 x 105 total células/cm2. La solución de esta ecuación conduce a determinar la densidad de siembra inicial de ambos de al menos dos tipos celulares: 1.05 x 105 fibroblastos + 1.05 x 105 células progenitoras mesenquimales = 2.1 x 105 total células/cm2. Cuando se emplea esta ecuación de siembra, se puede utilizar lo siguiente: a = 0 y b= 1 ; a = 0.1 y b = 0.9; a = 0.2 y b = 0.8; a = 0.3 y b = 0.7; a = 0.5 y b = 0.5; a = 0.8 y b = 0.2.
Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería híbridas pueden ser producidas mediante fibroblastos y MSCs, en donde X es constante (es decir el número de fibroblastos se mantiene constante) cuando el número total de fibroblastos en la masa de célula total es conocido al momento de la siembra de acuerdo con: aX + bY = Z; en donde X = Y, a = 1, b > 0 y b < 1, y Z = la densidad de siembra calculada de la masa de célula total. Por ejemplo, si X = 2.1 x 105 fibroblastos y 50% MSCs se desea en la siembra, la ecuación puede expresarse como: aX + bY = Z, en donde ( 1 ) (2.1 x 105 células) + (0.5)(2.1 x 105 células) = Z células totales/cm2. La solución de esta ecuación conduce a determinar la densidad de siembra inicial de ambos de al menos dos tipos celulares: 2.1 x 105 fibroblastos + 1.05 x 105 células progenitoras mesenquimales = 3.15 x 105 células totales/cm2. Cuando esta ecuación de siembra se emplea, se puede utilizar lo siguiente: a = 1 y b= 2; a = 1 y b= 1 ; a = 1 y b = 0.9; a = 1 y b = 0.8; a = 1 y b = 0.7; a = 1 y b = 0.5; a = 1 y b = 0.2.
II. Control de Tamaño de Poro de Construcción Bio-diseñada en Ingeniería Ciertas construcciones pueden tener estructura porosa. La porosidad se puede medir mediante el área de superficie atribuida a los poros en una imagen de histología relativa al área de superficie total de la imagen. Ciertas construcciones pueden tener una porosidad de al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más.
El tamaño de poro promedio entre la matriz extracelular de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería, puede construirse por ingeniería para formar una matriz extracelular porosa y/o regular el tamaño de poro. Combinado con un tipo y/o grado de reticulación, los tamaños de poro promedio definidos pueden ser elegidos y controlados para producir construcciones que tengan diferentes rangos de persistencia in vivo y/o infiltración celular, que fluctúa de construcciones bio-diseñadas por ingeniería "rápidamente bioremodelables" a "moderadamente bioremodelables" a "bioremodelables en forma prolongada" para una capacidad de aplicación diseñada a la medida de los usos terapéuticos. Además, se pueden diseñar por ingeniería tamaños de poro más pequeños para aumentar las funciones de barrera, en donde la prevención o inhibición de la infiltración celular, tal como los tipos de célula huésped no deseables, es útil.
Se puede diseñar por ingeniería un tamaño de poro promedio (diámetro), variando la temperatura final en la cual ocurre la liofilización, también conocida como secado por congelación. En este proceso, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se congelan de modo que los aspectos acuosos de la construcción bio-diseñada por ingeniería logren un estado congelado, después de lo cual, la construcción bio-diseñada por ingeniería se somete a vacío para eliminar el agua congelada (hielo) de la construcción. La liofilización crea y abre la estructura del poro, eliminando los cristales de hielo que se forman en la matriz, y la temperatura de congelación determina el tamaño de poro promedio resultante. Por lo tanto, el llevar a cabo la liofilización en temperaturas de congelación más frías, genera tamaños de poro más pequeños, mientras que llevar a cabo la liofilización entre temperaturas de congelación más templadas, genera tamaños de poro más grandes. Por lo tanto, en una modalidad, la temperatura puede fluctuar entre -100°C y 0°C con un tamaño de poro promedio menor a 5 a 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más mieras (um) de tamaño, conforme se calienta la temperatura de congelación. En una modalidad, un tamaño de poro promedio menor a 5, 10, 15, 20, 25, o 30 um o cualquier rango entre ellos, puede ser producido a una temperatura de congelación de -40°C. En otra modalidad, los tamaños de poro promedio de al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, o más um o cualquier rango entre ellos, se puede producir a una temperatura de congelación de -10°C. La disminución del rango para alcanzar la temperatura de congelación, puede incrementar la uniformidad del tamaño de poro. Por lo tanto, la disminución del rango para congelación en 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.3, 0.1, o menos °C por minutos, o cualquier rango intermedio, puede incrementar la uniformidad de los poros en la construcción.
III. Control de Composición de Construcción Bio-diseñada por Ingeniería Las matrices extracelulares de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención comprende componentes útiles para tratar y curar heridas. a. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Desvitalizadas Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención pueden ser desvitalizadas para terminar las células sin eliminación y/o descelularizar para eliminar las células, dependiendo de su uso final en el tratamiento de un sujeto. La desvitalización o descelularización puede ocurrir ya sea en la membrana del inserto de cultivo o después de que la construcción bio-diseñada por ingeniería se elimina del inserto de cultivo.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser desvitalizadas en una cantidad de formas. Un método para desvitalizar las células en la construcción bio-diseñada por ingeniería, es eliminar toda o sustancialmente toda la humedad en la construcción, utilizando medios físicos. Los medios para eliminar la humedad incluyen deshidratación en aire, mediante congelación o mediante secado por congelación. Para deshidratar la construcción mediante secado con aire, se elimina el medio de cultivo del envase en el cual se elabora la construcción bio-diseñada por ingeniería, y la construcción bio- diseñada por ingeniería simplemente se deja deshidratar durante un tiempo suficiente para permitir que las células mueran. Las condiciones de deshidratación varían en términos de temperatura y humedad relativa. Las temperaturas de deshidratación pueden fluctuar de arriba de la temperatura de congelación, hasta la temperatura de desnaturalización del colágeno (tal como se mide mediante calorimetría de la exploración diferencial, o como "DSC") en la construcción bio-diseñada por ingeniería, por ejemplo, entre aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 60°C o temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 18°C hasta aproximadamente 22°C). Los valores de humedad relativa que son inferiores, tal como dentro del rango de aproximadamente 0% hasta aproximadamente 60%, son los prefridos; sin embargo, también se prefieren las humedades relativas comparativas con la humedad ambiental, de entre aproximadamente 10% Rh hasta aproximadamente 40% Rh. Cuando se lleva a cabo la deshidratación mediante secado con aire a temperatura y humedad ambiental, la construcción bio-diseñada por ingeniería tendrá de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 40% p/p de humedad, o menos. Como alternativa, la construcción bio-diseñada por ingeniería puede ser secada por congelación (es decir, liofilizada), en donde la construcción se congela y posteriormente se coloca en un ambiente de vacío para determinar la humedad. Por ejemplo, las construcciones bio- diseñadas por ingeniería pueden tomarse directamente fuera del cultivo y congelarse (por ejemplo, a una temperatura de entre -80°C aa 0°C o cualquier rango entre ellos), y liofilizarse durante la noche, tal como entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 15 horas, o más. Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser secadas primero por aire durante aproximadamente ocho horas y posteriormente ser congeladas y liofilizadas en forma subsecuente. Después de secar en condiciones ambientales, o mediante secado por congelación, la construcción bio-diseñada por ingeniería se desvitaliza pero aún retiene las células desvitalizadas y las células restantes. La liofilización también puede impartir cualidades diferentes a las que pueden resultar cuando se deshidrata bajo condiciones ambientales. Dichas cualidades, en una modalidad, exhiben una estructura de matriz de fibra abierta y más porosa.
También se pueden emplear medios químicos para desvitalizar las células en la construcción bio-diseñada por ingeniería. Se puede utilizar agua para terminar en forma osmótica las células. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser sumergidas en agua pura, estéril durante un tiempo suficiente para permitir que la expansión hipotónica origine que las células se Usen. Después de que las células se lisan, la construcción bio-diseñada por ingeniería puede ser desvitalizada pero aún retener las células desvitalizadas y las células restantes. Cuando se utiliza agua, también puede mezclarse con otras sustancias, tal como ácido peracético o peróxido de hidrógeno, o sales, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, se puede utilizar una solución desvitalizante de ácido peracético de entre aproximadamente 0.05% y aproximadamente 3% v/v en agua. Este agente desvitalizante también se puede amortiguar o contener una alta concentración de sal para evitar una expansión excesiva de la construcción bio-diseñada por ingeniería cuando se terminan las células. Como alternativa, los solventes orgánicos y las soluciones de solventes orgánicos pueden ser utilizadas como agentes de desvitalización en la presente invención. Los solventes orgánicos tienen la capacidad de desplazar el agua en una construcción bio-diseñada por ingeniería para terminar, por consiguiente, desvitalizar las células en la construcción bio-diseñada por ingeniería. El solvente orgánico utilizado para eliminar el agua, puede ser uno que no deje residuos cuando se elimina de la construcción que incluye, pero no se limita a alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol metílico y alcohol ¡sopropílico) y acetona. Por ejemplo, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden sumergirse en alcohol etílico estéril durante un tiempo suficiente para desplazar el agua en la construcción bio-diseñada por ingeniería y desvitalizar las células. El alcohol etílico puede ser eliminado antes de exponerse al aire durante un tiempo suficiente para permitir que se evapore el alcohol etílico absorbido en la construcción bio-diseñada por ingeniería. Después de la evaporación del solvente, la construcción retiene las células desvitalizadas y las células restantes y se deshidrata.
Otros medios para desvitalizar las células incluyen someter las construcciones bio-diseñadas por ingeniería a luz ultravioleta o radiación gamma. Estos medios pueden llevarse a cabo junto con expansión hipotónica con agua u otros medios de desvitalización química o con aire y congelación. b. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Descelularizadas La descelularización da como resultado la eliminación de células que producen matriz extracelular que generan los componentes de matriz extracelular endógenos de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la construcción completa. Un método para descelularizar utiliza inmersión o agitación suave de una serie de tratamientos químicos para eliminar las células, las células restantes y el ADN y ARN celular residual. También se pueden eliminar o reducir otros componentes de matriz extracelular no colagenosa o no elastinosa, con los agentes y métodos utilizados para descelularización, tal como glucoproteínas, glucosaminoglicanos, proteoglicanos, lípidos y otras proteínas no colagenosas presentes en el EC . Por ejemplo, la construcción bio-diseñada por ingeniería puede ser tratada primero contactándola con una cantidad efectiva de agente de quelación, preferentemente fisiológicamente alcalina para limitar en forma controlable la expansión de la célula-matriz. Los agentes de quelación aumenta la eliminación de células, desechos celulares y las estructuras de membrana de base y la matriz reduciendo la concentración de catión divalente. El tratamiento alcalino puede disociar las glucoproteínas y glucosaminoglicanos del tejido colagenoso y saponificar los lípidos. Los gentes de quelación conocidos en la técnica que se pueden utilizar, incluyen pero no se limitan a ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) y ácido etilenobis(oxietilenitrilo)tetraacético (EGTA). El EDTA se puede hacer más alcalino mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de calcio Ca(OH)2, carbonato de sodio y peróxido de sodio. Las concentraciones de EDTA y EGTA pueden ser de entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 200 mM, entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 100 mM. La concentración de NaOH puede ser de entre aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 1 M, entre aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 0.10 M, o aproximadamente 0.01 M (por ejemplo, 100 mM EDTA/10 mM NaOH en agua). Otros agentes alcalinos o básicos pueden ser determinados por un experto en la técnica, para llevar el pH de la solución de quelación dentro del rango de p]H básico efectivo. El pH final de la solución de quelación básica debe ser de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12 o entre aproximadamente 11.1 hasta aproximadamente 11.8.
La construcción bio-diseñada por ingeniería posteriormente puede ser contactada con una cantidad efectiva de solución ácida que contiene opcionalmente una sal. El tratamiento con ácido puede mejorar la eliminación de glucoproteínas, glucosaminoglicanos, proteínas no colagenosas y ácidos nucleicos. El tratamiento de sal puede controlar la expansión de la matriz colagenosa durante el tratamiento con ácido y aumentar la eliminación de algunas glucoproteínas y proteoglicanos de la matriz colagenosa. Las soluciones ácidas conocidas en la técnica pueden ser utilizadas y pueden incluir, pero no se limitan a, ácido hidroclórico (HCI), ácido acético (CH3COOH) y ácido sulfúrico (H2S0 ). Por ejemplo, se puede utilizar el ácido hidroclórico (HCI) en una concentración de entre aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 2 M, entre aproximadamente 0.75 hasta aproximadamente 1.25 , o alrededor de 1 M. El pH final de la solución ácida/sal debe ser de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1, entre aproximadamente 0 y 0.75, o entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.5. El ácido hidroclórico y otros ácidos fuertes son más efectivos para romper las moléculas de ácido nucleico, en tanto que los ácidos más débiles son menos efectivos. Las sales que pueden ser utilizadas son preferentemente sales inorgánicas e incluyen, pero no se limitan a sales de cloruro tal como cloruro de sodio (NaCI), cloruro de calcio (CaCI2), y cloruro de potasio (KCI). Por ejemplo, las sales de cloruro pueden ser utilizadas en una concentración de entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 2 M, entre aproximadamente 0.75 hasta aproximadamente 1.25 M, y de alrededor de 1 M (por ejemplo, 2 M HCI/ M NaCI en agua).
La construcción bio-diseñada por ingeniería posteriormente puede ser contactada con una cantidad efectiva de solución de sal la cual es preferentemente amortiguada hasta aproximadamente un pH fisiológico. La solución de sal amortiguada neutraliza el material, mientras al mismo tiempo reduce la expansión. Las sales que pueden ser utilizadas son preferentemente sales inorgánicas e incluyen, pero no se limitan a sales de cloruro de sodio (NaCI), cloruro de calcio (CaCI2), y cloruro de potasio (KCI); y sales de nitrógeno tales como sulfato de amonio (NH3SO4). Por ejemplo, las sales de cloruro se pueden utilizar en una concentración de entre aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 2 M, entre aproximadamente 0.75 hasta aproximadamente 1.25 M, o aproximadamente 1 M. Los agentes de amortiguación son conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a soluciones de fosfato y borato. Por ejemplo, se puede utilizar solución salina amortiguada por fosfato (PBS), en donde el fosfato está en una concentración de aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 0.02 M y una concentración de sal desde aproximadamente 0.07 hasta aproximadamente 0.3 M para la solución de sal (por ejemplo, 1 M de cloruro de sodio (NaCI)/10 mM de solución salina amortiguada por fosfato (PBS)). El pH debe ser de entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, entre aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8, o entre aproximadamente 7.4 hasta aproximadamente 7.6. Después del tratamiento de limpieza química, la construcción bio-diseñada por ingeniería puede ser enjuagada posteriormente libre del agente de limpieza química, contactándola con una cantidad efectiva de agente de enjuague. Se pueden contactar agentes tales como agua, soluciones salinas isotónicas (por ejemplo, PBS) y soluciones amortiguadas por pH fisiológico, con la construcción bio-diseñada por ingeniería durante un tiempo suficiente para eliminar los agentes de limpieza. Los pasos de limpieza para contactar la construcción bio-diseñada por ingeniería con un agente de quelación alcalina, y contactar la construcción bio-diseñada por ingeniería con una solución de ácido que contiene la sal, se pueden llevar a cabo en cualquier orden para lograr sustancialmente el mismo efecto de limpieza. c. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería de Multicapa y/o Reticuladas El ECM puede ser reticulado utilizando un agente de reticulación para controlar los rangos de bioremodelado y ya sea incrementar su persistencia cuando se implanta, o injertarse en un cuerpo vivo. Puede reticularse y utilizarse como una construcción de capa simple, o puede combinarse o manipularse para crear diferentes tipos de construcciones. La reticulación puede enlazar láminas bio-diseñado por ingeniería o partes de las mismas, juntas.
Algunas construcciones bio-diseñadas por ingeniería tienen dos o más láminas ECM superimpuestas que se unen juntas para formar una construcción de lámina plana. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "capas de colágeno unidas" significa compuestos de dos o más láminas bio-diseñadas por ingeniería del mismo o un diferente origen o perfiles tratados en una forma tal que las capas queden superimpuestas una sobre la otra, y se mantengan lo suficientemente juntas a través del autolaminado y/o enlace químico. Por ejemplo, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden comprender cualquier número de capas, tal como entre 2 y 20 capas o entre 2 y 10 capas, con el número de capas dependiendo de la resistencia y volumen necesario para el uso proyectado final de la construcción. Como alternativa, ya que el tamaño final de una distribución superimpuesta puede estar limitado por el tamaño de las láminas de la matriz, las capas pueden ser escalonadas en una distribución de collage para formar una construcción de lámina con un área de superficie mayor que las dimensiones que cualquier lámina de matriz individual, pero sin capas continuas a través del área de distribución .
Para formar una construcción bio-diseñada por ingeniería de capas múltiples de láminas de matriz, se puede colocar un primer miembro de soporte rígido estéril, tal como una lámina de policarbonato rígida. Si las láminas de matriz aún no están en un estado hidratado tal como después del desempeño de los procesos de desvitalización o de celularización, se hidratan en una solución acuosa, tal como agua o solución salina amortiguada por fosfato. Las láminas de matriz pueden ser secadas con trapos absorbentes estériles para absorber el agua en exceso del material. Una primera lámina de matriz puede colocarse en la lámina de policarbonato y suavizarse manualmente en la lámina de policarbonato para eliminar cualesquiera burbujas de aire, dobleces y pliegues. Una segunda lámina de matriz se puede colocar en la parte superior de la primera lámina, nuevamente eliminando en forma manual cualesquiera burbujas de aire, dobleces y pliegues. Esta generación de capas se puede repetir hasta que se obtiene el número deseado de capas para una aplicación específica.
Después de generar capas del número deseado de láminas de matriz, se pueden deshidratar juntas. La deshidratación puede llevar los componentes de matriz extracelular, tal como fibras de colágeno, en las capas juntas cuando se elimina el agua de entre las fibras de las láminas de matriz adyacentes. Las capas pueden ser deshidratadas ya sea con cara abierta en el primer miembro de soporte, o entre el primer miembro de soporte y un segundo miembro de soporte, tal como una segunda lámina de policarbonato, colocada antes de secar sobre la capa superior y sujetada al primer miembro de soporte para mantener todas las capas en una distribución plana juntas con o sin compresión. Para facilitar la deshidratación, el miembro de soporte puede ser poroso para permitir que pase aire y humedad a través de las capas de deshidratación. Las capas pueden ser secadas en aire, en un vacío, o mediante medios químicos tai como mediante acetona o un alcohol tal como alcohol etílico o alcohol isopropílico. La deshidratación mediante secado con aire puede realizarse en humedad ambiental, entre aproximadamente 0% hasta aproximadamente 60%, o menos; o aproximadamente 10% hasta aproximadamente 40% p/p de humedad, o menos. La deshidratación puede llevarse a cabo fácilmente angulando las capas de matriz superimpuestas para orientar un flujo de aire estéril de un gabinete de flujo laminar durante al menos aproximadamente 1 hora hasta 24 horas a temperatura ambiental, aproximadamente 20°C, y en humedad ambiental. La deshidratación llevada a cabo por vacío o medios químicos, deshidratará las capas a niveles de humedad inferiores a los logrados mediante secado con aire.
En un paso opcional, las capas deshidratadas son rehidratadas, o como alternativa, rehidratadas y deshidratadas nuevamente. Tal como se mencionó anteriormente, la deshidratación lleva juntos los componentes de la matriz extracelular de las capas de matriz adyacentes y la reticulación de dichas capas juntas, forma enlace químicos entre los componentes para enlazar las capas. Para rehidratar las capas, se desprenden del miembro de soporte poroso juntas y se rehidratan en un agente de rehidratacion acuosa, preferentemente agua, transfiriéndolas a un contenedor que contiene un agente de rehidratacion acuosa durante al menos aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 minutos a una temperatura entre aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 20°C para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas. Posteriormente las capas de matriz se reticulan juntas contactando las láminas de matriz en capas con un agente de reticulación, preferentemente, un agente de reticulación química que conserva la bioremodeabilidad de las capas de matriz.
La reticulación proporciona resistencia y durabilidad a la construcción y mejora sus propiedades de manejo. Se pueden utilizar varios tipos de agentes de reticulación conocidos en la técnica, tales como carbodiimidas, genipina, transglutaminasa, ribosas y otros azúcares, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), agentes oxidativos, luz ultravioleta (UV) y métodos deshidrotérmicos (DHT). Además de los agentes de reticulación química, las capas pueden unirse juntas con pegamentos a base de fibrina biocompatible o adhesivos de grado médico, tal como poliuretano, acetato de vinilo o poliepoxi. Un adhesivo biocompatible es fibroína de seda, esto es una solución de fibroína de seda al 4-8% colocada en la región de unión entre las capas adyacentes de la matriz de tejido que se activan utilizando alcohol metílico. Los pegamentos adhesivos biocompatibles se pueden utilizar para unir capas reticuladas o no reticuladas, o ambas, juntas.
Un agente de reticulación adecuado es clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Se puede agregar sulfo-N-hidroxisuccinimida al agente de reticulación EDC tal como se describe en la Publicación de Staros, J.V., Biochem. 21, 3950-3955, 1982. En el método más preferido, EDC se solubiliza en agua en una concentración de entre aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 100 mM, entre aproximadamente 1.0 mM hasta aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 1.0 mM. Además de agua, la solución salina amortiguada por fosfato o el amortiguador de (ácido 2-[N-morfolinojetanosulfónico) (MES) se puede utilizar para disolver EDC. Se pueden agregar otros agentes a la solución, tal como acetona o un alcohol, hasta el 99% v/v en agua y normalmente 50%, para hacer la reticulación más uniforme y eficiente. Estos agentes eliminan el agua de las capas para poner juntas las fibras de matriz para promover la reticulación entre dichas fibras. La proporción de estos agentes al agua en el agente de reticulación se pueden utilizar para regular la reticulación. Se prepara la solución de reticulación EDC inmediatamente antes de usarse, ya que EDC perderá su actividad con el tiempo. Para contactar el agente de reticulación con las capas de la matriz, se transfieren las capas de matriz enlazadas, hidratadas a un contenedor tal como una charola poco profunda, y el agente de reticulación se decanta suavemente en la charola asegurando que las capas de la matriz estén tanto cubiertas como flotando libremente, y que no estén presentes burbujas de aire debajo o entre las capas de la matriz. El contenedor se cubre y las capas de la matriz se dejan reticular durante entre aproximadamente 4 hasta aproximadamente 24 horas o entre 8 hasta aproximadamente 16 horas a una temperatura de entre aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 20°C. La reticulación se puede regular con temperatura, de modo que en temperaturas menores, la reticulación es más efectiva ya que se hace lenta la reacción. En contraste, la reticulación es menos efectiva a una mayor temperatura, ya que EDC es menos estable.
Después de la reticulación, el agente de reticulación se decanta y se desecha y se enjuagan las construcciones de matriz de múltiples capas reticuladas contactándolas con un agente de enjuague (por ejemplo, agua) para eliminar el agente de reticulación residual, tal como contactando las construcciones de matriz de capa múltiple reticuladas tres veces con volúmenes iguales de agua estéril de cualquier parte, entre un minuto y cuarenta y cinco minutos por cada enjuague.
Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser reticuladas utilizando métodos de reticulación deshidrotérmica (DHT), que forman enlaces covalentes entre los grupos carboxi y amino adyacentes en las fibras de proteína a través de una reacción de condensación, cuando los implantes se exponen a calor controlado, mientras que bajo un vacío (normalmente un calor seco a una temperatura de 120°C durante hasta 24 horas). En este tratamiento, las moléculas de agua se eliminan de las fibras individuales, conduciendo con frecuencia a cambios complejos en la colocación molecular de los aminoácidos en la cadena de colágeno y un posible daño oxidativo. DHT puede ser ventajoso con respecto a la reticulación química para ciertas aplicaciones de medicina regenerativa ya que este proceso no introduce químicos inflamatorios o potencialmente citotóxicos en los implantes para usos terapéuticos, lo cual podría estimular las respuestas inmune del paciente.
DHT tiene el potencial de proporcionar alta resistencia a las matrices de colágeno (-50 MPa), pero se sabe que desnaturaliza parcialmente las fibras de colágeno, debido al reposicionamiento molecular de los aminoácidos dentro de las fibras de colágeno. Entre mayor es el número de reticulaciones elaboradas en un material, normalmente se proporcionará una mayor durabilidad cuando el material se expone a enzimas digestivas. Sin embargo, también se sabe que ciertas enzimas de proteína únicamente se disocian en sitios objetivo específicos, lo cual no puede ser expuesto dentro de dominios helicoidales triples de fibras de colágeno, a menos y hasta que la proteína haya sido desnaturalizada. El nivel de desnaturalización que ocurre durante en reticulación de los implantes de colágeno, se puede minimizar con el objeto de evitar una posible rápida degradación de las matrices mediante proteasas no específicas al momento del implante en el paciente. Los niveles de reticulación DHT en las matrices de colágeno normalmente se miden mediante cambios en la temperatura de contracción, carga mecánica o sensibilidad a digestiones enzimáticas (por ejemplo, colagenasa, tripsina, etc.) de las fibras de colágeno. Los efectos del tratamiento de secado y térmico del colágeno, también se pueden observar utilizar la difracción de rayos X para observar los cambios en el empaque axial de las moléculas de colágeno en fibras conforme ocurre la deshid ratación . Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería en capas y/o reticuladas, se pueden formar en una cantidad de factores de forma, tal como construcciones tubulares, con base en técnicas bien conocidas (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,712,163 de Parenteau, la Publicación PCT No. WO 95/31473, la Publicación PCT No. WO 00/29553, y la Publicación PCT No. WO 2009/070720). d. Productos de Combinación Se pueden agregar otros materiales a ECMs para aumentar en forma adicional la bioactividad o función, cuando se administra in vivo.
Por ejemplo, se pueden incorporar agentes antimicrobianos, fármacos, factores de crecimiento, citocinas, material genético y células cultivadas dentro o sobre las construcciones bio-diseñadas por ingeniería, las capas en la misma, y/o andamios.
Cuando las construcciones bio-diseñadas por ingeniería contactan con la sangre durante su uso, tal como en el sistema circulatorio, puede hacerse no-trombogénicas, aplicando heparina a la construcción, a todas las superficies de la construcción o únicamente a un lado en una construcción de lámina plana o ya sea en forma luminal o abluminal para una construcción tubular. La heparina se puede aplicar a la construcción a través de una variedad de técnicas bien conocidas. Como ilustración, la heparina se puede aplicar a la construcción en las siguientes tres formas. Primero, se aplica una solución de alcohol isopropílico de heparina de benzalconio (BA-Hep) a la prótesis llenando verticalmente el lumen o bañando la prótesis en la solución y posteriormente secándola con aire. Este procedimiento trata el colágeno con un complejo BA-Hep enlazado en forma iónica. Segundo, se puede utilizar EDC para activar la heparina y posteriormente enlazar en forma covalente la heparina a la fibra de colágeno. Tercero se puede utilizar EDC para activar el colágeno, posteriormente enlazar en forma covalente la protamina de colágeno, y posteriormente enlazar en forma iónica la heparina a la protamina.
Los materiales sintéticos pueden ser colocados al menos sobre una superficie de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería. El material sintético puede estar en la forma de una lámina, estar sobre impuesta o escalonada al momento que la construcción bio-diseñada por ingeniería forma una capa sintética en la capa bio-diseñada por ingeniería. Una clase de materiales sintéticos, preferentemente materiales sintéticos biológicamente compatibles, comprende polímero. Dichos polímeros incluyen pero no se limitan a los siguientes poli(uretanos), poli(siloxanos) o siliconas, poli(etileno), po I i ( i n i I pirrolidona), poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(N-vinil pirrolidona), poli(metil metacrilato), poli(alcohol polivinílico), poli(ácido acrílico), poliacrilamida, poli(etileno-co-vinil acetato), poli(etilenglicol), poli(ácido metacrílico), poliláctidas (PLA), poliglucólidos (PGA), poli(láctido-co-glucólido-es) (PLGA), polianhídridos, y poliortoésteres o cualesquiera otros polímeros sintéticos similares que pueden ser desarrollados de modo que sean biológicamente compatibles. El término "polímeros sintéticos, biológicamente compatibles" también incluye copolímeros y combinaciones y cualesquiera otras combinaciones de los anteriores, ya sea juntas o con otros polímeros de manera general. El uso de estos polímeros dependerá de aplicaciones determinadas y especificaciones requeridas. Por ejemplo, los materiales sintéticos biológicamente compatibles también pueden ser biodegradables, de modo que cuando se implantan en el cuerpo de un sujeto, se biodegraden con el tiempo. Cuando se colocan en una construcción bio-diseñada por ingeniería, la construcción de combinación comprende una capa biodegradable y una capa bioremodelable. Se puede encontrar una descripción más detallada de estos polímeros y tipos de polímeros en la Publicación de Brannon-Peppas, Lisa, "Polímeros en Suministro en Fármacos Controlado", Medical Plastics y Biomaterials, Noviembre 1997, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia Un ejemplo de otro material sintético que se puede utilizar como una capa de soporte, es silicona. La capa de silicona en la forma de una membrana porosa o no porosa o una película no porosa, se aplica y adhiere a una construcción de matriz. Cuando se utiliza en curación de heridas, la capa de silicona se puede utilizar para manejar y maniobrar la construcción de matriz en una herida de la piel y sellar la periferia de la herida, para encerrar la construcción de matriz para tratar la herida. La silicona también forma una barrera de humedad para mantener la herida del secado. Después de la formación exitosa de un tejido de herida curada, normalmente alrededor de 21 días, la silicona se desprende con pinzas cuidadosamente de los bordes de la herida sanada o en curación. También se pueden agregar proteínas a las construcciones bioconstruidas. Los ejemplos de proteínas de matriz extracelular útiles incluyen pero no se limitan a colágeno, fibrina, elastina, laminina, y fibronectina, proteoglicanos. El fibrinogen, cuando se combina con trombina, forma fibrina. El hialuronan (también llamado ácido hialurónico o hialuronato) es un glucosaminoglican no sulfatado distribuido ampliamente a través de tejidos conectivos, epiteliales y neurales. Es uno de los principales componentes de la matriz extracelular, contribuye significativamente a la proliferación y migración celular, y se utiliza para reducir las adhesiones postoperatorias. Existen múltiples tipos de cada una de estas proteínas que ocurren naturalmente, así como tipos que pueden ser, se fabrican o producen en forma sintética mediante ingeniería genética. El colágeno ocurre en muchas formas y tipos. El término "proteína" incluye además, pero no se limita a fragmentos análogos, sustituciones de aminoácido conservadoras y sustituciones con aminoácidos que no ocurren naturalmente con respecto a proteína nombrada. El término "residuo" se refiere a un aminoácido (D o L) o a un mimético de aminoácido que está incorporado a una proteína a través de un enlace de amida. Por lo tanto, el aminoácido puede ser un aminoácido que ocurre naturalmente, o a menos que se limite de otra forma, puede comprender análogos conocidos o aminoácidos naturales que funcionan en una forma similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente (por ejemplo, miméticos de aminoácido). Además, un mimético de enlace de amida incluye modificaciones de esqueleto de péptido bien conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar péptidos para aumentar los efectos celulares (por ejemplo, infiltración de fibroblasto dérmico humano en un andamio de seda y mejorar la capacidad de reclutar células huésped, tal como células, epiteliales). Dichos péptidos pueden ser RGD, Gofoger, laminina 1-10, y pronectina. Más específicamente, laminina 5 y laminina 10 funcionan particularmente bien para incrementar la infiltración/migración de célula epitelial. Los péptidos también pueden ser utilizados para aumentar la migración de célula endotelial. Más particularmente, los péptidos tales como trombina y fibrinogen pueden aumentar la migración de célula endotelial, especialmente para indicaciones que se benefician de la neovascularización.
También se puede incorporar una molécula de adhesión celular en o sobre la matriz de polímero para adherir la composición de andamio al sitio de tejido local, y evitar la difusión de la construcción bio-diseñada por ingeniería. Dichas moléculas se incorporan en la matriz de polímero antes de la polimerización de la matriz o después de la polimerización de la matriz. Los ejemplos de moléculas de adhesión celular, incluyen pero no se limitan a péptido, proteínas y polisacáridos tales como fibronectina, laminina, colágeno, trombospondina 1, vitronectina, elastina, tenascina, agrecan, agrina, sialoproteína de hueso, proteína de matriz de cartílago, fibrinogen, fibrina, fibulina, mucinas, entactina, osteopontina, plasminogen, restrictina, serglicina, SPARC/osteonectina, versican, Factor de von Willebrand, sulfato de heparina de polisacárido, conexinas, colágeno, péptidos RGD (Arg-Gly-Asp) y YIGSR (Tyr-I le-Gly-Ser-Arg) y péptidos cíclicos, glucosaminoglicanos (GAGs), ácido hialurónico (HA), condroitin-6-sulfata, ligandos de integrina, selectinas, caderinas y miembros de la superfamilia de inmunoglobulina. Otros ejemplos incluyen moléculas de adhesión de célula neural (NCAMs), moléculas de adhesión intercelular (ICAMs), molécula de adhesión de célula vascular (VCAM-1), molécula de adhesión de célula endotelial-plaqueta (PECAM-1 ), L1 , y CHL1.
Proteínas v péptidos ECM v su desempeño en la función celular Proteína Secuencia SEC ID NO Desempeño Fibronectina RGDS Adhesión LDV Adhesión REDV Adhesión Vitronectina RGDV Adhesión Laminina A LRGDN Adhesión IKVAV Extensión de neurita Laminina B1 YIGSR Adhesión de células mediante receptor de laminina 67 kD PDSGR Adhesión Laminina B2 RNIAEIIKDA Extensión de neurita Colágeno 1 RGDT Adhesión de la mayor parte de las células DGEA Adhesión de plaquetas y otras células Trombospondina RGD Adhesión de la mayor parte de las células VTXG Adhesión de plaquetas A continuación se muestran ejemplos adicionales moléculas de adhesión de célula adecuada.
Las secuencias de aminoácido específicas para enlace de proteoglican de proteína de matriz extracelular.
SECUENCIA SEC Id No. PROTEINA XBBXBX* Secuencia de consenso PRRARV Fibronectina YEKPGSPPREWPRPRPGV Fibronectina RPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGR Vitronectina rlQNLLKITNLRIKFVK Laminina Las moléculas de adhesión de célula particularmente preferidas son péptido o péptidos cíclicos que contienen la secuencia de aminoácido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) que es conocida como un ligando de adhesión celular y se encuentra en diversas moléculas de matriz extracelular natural. Una matriz de polímero con dicha modificación proporciona propiedades de adhesión celular al andamio, y sostiene la supervivencia a largo de plazo de sistemas de célula de mamíferos, así como soporta el crecimiento celular.
Los factores de crecimiento también se pueden introducir en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería y/o en las estructuras de andamio. Dichas sustancias incluyen BMP, proteína morfogenética de huesos; ECM, proteínas de matriz extracelular o fragmentos de la misma; EGF, factor de crecimiento epidérmico; FGF-2, factor 2 de crecimiento de fibroblasto; NGF, factor de crecimiento de nervios; PDGF, factor de crecimiento de grado de plaqueta; PIGF, factor de crecimiento de plaquetas; TGF, factor de transformación de crecimiento, VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular, MCP1, y IL4. Las moléculas de adhesión de célula-célula (caderinas, integrinas, ALCAM, NCA , proteasas, ligandos Notch) se agregan opcionalmente a la composición de andamio. Los factores de crecimiento y ligandos de ejemplo, se proporcionan en las siguientes tablas.
Factor de crecimiento utilizado para anqioqénesis Factores de Crecimiento Utilizados para Diseño por Ingeniería de Tejido rH, humano recombinante Liqandos inmovilizados utilizados en el diseño por ingeniería de tejido *Las secuencias se proporcionan en un código de aminoácido de una sola letra.
MMP, metaloproteinasa de matriz.
Con el objeto de mejorar la formación in vivo de los vasos sanguíneos, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería desvitalizadas pueden ser enjuagadas en proteínas tal como factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento/factor de dispersión de hepatocito (HGF/SF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y otros tipo de factores pro-angiogénicos. En un aspecto, se reconstituyeron 50 microgramos de polvo PDGF-BB humano recombinante en 0.5 mL 4 mM de HCI, y posteriormente se agregaron con 0.5 mL adicional de solución salina amortiguada por fosfato (PBS). La solución de 1 mL resultante se utilizó para enjuagar una construcción bio-diseñado por ingeniería desvitalizada antes del implante en una herida de grosor total en ratones desprotegidos y normales. Además, se reconstituyeron 50 microgramos de factor de crecimiento de fibroblasto básico humano recombinante (bFGF) en 1 mL de PBS. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enjuagadas en 1 mL de solución bFGF durante 5 minutos antes de implantarse en una herida de grosor total en ratones desprotegidos y normales. En otra modalidad, se reconstituyeron 50 microgramos de PDGF-BB humano recombinante en 0.5 mL de 4 mM de HCL y subsecuentemente se mezclaron con 0.5 mL de bFGF humano recombinante reconstituido con PBS. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enjuagadas en 1 mL de solución resultante durante cinco minutos antes del implante en una herida de grosor total en ratones desprotegidos y normales. En otra modalidad, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se producen como en el Ejemplo 12. El medio de cultivo acondicionado de cualesquiera de las múltiples alimentaciones durante el curso del tiempo del cultivo, puede ser recolectado. En particular, se recolectó y se concentró el medio de cultivo acondicionado después del día 11 (por ejemplo 100 veces). Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería desvitalizadas de la presente invención, fueron enjuagadas subsecuente en el medio acondicionado concentrado inmediatamente antes del implante.
Los suplementos también se pueden introducir en el medio de cultivo definido químicamente con el objeto de aumentar en forma selectiva los atributos de la matriz extracelular deseados y/o lograr resultados deseados in vivo. El medio de cultivo definido en forma química comprende lo siguiente: Con el objeto de incrementar la cantidad de ácido hialurónico (HA) en la construcción bio-diseñada por ingeniería y aumentar in vivo la formación de vasos sanguíneos, el medio de cultivo definido químicamente puede ser suplementado con TGFa largo 2x (40 ng/mL). Además, el medio de cultivo definido en forma química puede ser suplementado en forma adicional con 25 ng/mL de PDGF el día 5, 25 ng/mL de bFGF el día 10, y 25 ng/mL de factor de crecimiento de hepatocito (HGF) el día 15. Como alternativa, el medio de cultivo definido en forma química comprende un suplemento con TGFa largo 2x (40 ng/mL), 25 ng/mL de bFGF el día 5, 25 ng/mL de PDGF el día 10, y 25 ng/mL de bFGF el día 15. Una formulación de medio químicamente definido, alternativa y adicionales TGFa largo 2x (40 ng/mL), 25 ng/mL de pDGF el día 5, 25 ng/mL bFGF el día 10, y 25 ng/mL de HGF el día 15.
Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención se pueden producir para comprender una cantidad elevada de glucosaminoglicanos sulfatados (sGAG) suplementando el medio de cultivo definido en forma química para que comprenda TGFa largo 10x (200 ng/mL). Más particularmente, cuando, se comparan construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas suplementando el medio de cultivo definido en forma química con TGFa largo 10x (200 ng/mL) y TGFa 1X (20 ng/mL), se observó una construcción/sGAG de aproximadamente 1100 ug en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas a través del medio suplementado con TGFa largo 10x (200 ng/mL), en forma opuesta a la construcción/sGAG de 600 ug en construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas en un medio suplementado por TGFa 1X (20 ng/mL). Deberá apreciarse que los cambios en las suplementaciones del medio aquí descritos, se pueden utilizar para tratar el andamio de seda con o sin HDFs sembrado en el mismo, sin desviarse del alcance de la presente invención.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se pueden tratar con una modificación de superficie para aumentar la capacidad de adhesión y propiedades de adhesión de tejido. Se puede incluir la modificación de superficie que proporciona el "medio" de adhesión en las superficies opuestas apicales, básales, o ambas, que funcionan para incrementar el enlace de una construcción cuando se aplican profundamente a los tejidos y órganos de los pacientes in vivo. El "medio" que mejora la adhesión, puede ser uno o más de cualesquiera de los siguientes: (a) la incorporación de una pluralidad de microestructuras y/o nanoestructuras autoensambladas moldeadas y que sobresalen de la superficie bio-diseñado por ingeniería; (b) un material adhesivo biocompatible y biodegradable agregado, tal como una película, gel, hidrogel, líquido o pegamento, enlazado, recubierto o aplicado directamente en la superficie bio-diseñada por ingeniería; o, (c) una matriz de fibra pegajosa de electrohilado que se coloca o se hila en la superficie bio-diseñada por ingeniería.
El medio que mejora la adhesión puede restringirse a una superficie externa (ya sea basal o apical, dependiendo del diseño de fabricación preferido). Esta construcción de adhesivo se puede utilizar para reparar, generar volumen, reforzar o reconstruir órganos. La construcción de adhesivo no significa que se adhiere a tejidos circundantes adyacentes a la herida, si no que únicamente se adhiere directamente a la superficie del órgano que necesita curación. Sin embargo, las superficies tanto básales como apicales pueden contener un medio que mejora la adhesión, ya sea el mismo o un diferente medio en cada superficie, dependiendo del uso terapéutico proyectado de la composición (por ejemplo, para mantener con intención los tejidos u órganos internos en proximidad cercana uno al otro, o como alternativa, para adherir fuertemente el tejido de un paciente a la superficie de un dispositivo o sensor terapéutico implantable, exógeno).
Se pueden utilizar ciertos métodos de fabricación para producir las diversas modalidades, ya sea que se elaboren para contener las micro y/o nanoestructuras autoensambladas o elaborados para incluir materiales adhesivos biocompatibles y biodegradables. Por ejemplo, el implante puede ser un parche que es circular, ovalado, elíptico, triangular o de diversos tamaños de rectángulos y cuadrados dependiendo de su uso terapéutico proyectado por ejemplo rectángulos largos, angostos, para ciertas aplicaciones similares a una formato de cinta, en donde la composición tiene una longitud sustancialmente más grande que su ancho, por ejemplo, para envolturas de huesos y otros órganos, en tanto que otros usos pueden requerir parches tipo más cuadrados, por ejemplo, para reparación de hernias. El implante puede ser recortado en forma adicional por el cirujano, según sea necesario, para coincidir con el tamaño y forma particular de defecto del paciente. Además, la cinta o parche puede incluir uno o más fármacos para disuadir la infección bacteriana, tal como planta coloidal o toxinas microbianas y para disuadir el sangrado post-quirúrgico tal como fibrinogen o trombina. En una modalidad adicional, la construcción puede ser desactivada en forma mitótica mediante radiación gamma, tratamiento con mitomicina-C, o en cualquier otro medio de envío conocido en la técnica anterior, lo cual puede permitir que las células donantes continúen secretando sus factores de curación biológicos, pero puede evitar su implante a largo plazo en el paciente huésped. Al menos una parte del artículo aditivo puede tener una fuerza de adhesión igual o mayor a aproximadamente 0.05 Newton por centímetro cuadrado de área proyectada, cuando se mide de acuerdo con el estándar ASTM D4501, D4541, o D6862-04.
Los medios adhesivos incluyen una pluralidad de microestructuras autoensambladas moldeadas en la superficie basal de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas con fibroblastos y/o con una unidad de células progenitoras mesenquimales que se forman mediante las células y su matriz extracelular secretada que mimetiza la superficie de poro modificada de las membranas de injerto de cultivo del sistema de bioreactor. Esencialmente, la superficie del sistema de revestimiento actúa como un micromolde que contiene numerosas cavidades construidas o estructuras huecas, en donde las células se pueden asentar en estos huecos al momento del cultivo, y posteriormente secretar proteínas, lípidos, GAGs y otros factores de matriz para llenar estos huecos, creando de esta forma las protuberancias o "prensores" de tejido que cubren toda o una parte de las superficies básales de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería que se forman en una imagen de espejo a la topografía de nanoescala de la superficie de revestimiento al momento de la eliminación de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería del bioreactor. La topografía microfabricada de las superficies de revestimiento se puede formar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el arte, incluyendo pero sin limitarse a con litografía, nanodibujo, micrograbado, y fotolitografía seguido de grabado y nanomoldeo. Se pueden formar las protuberancias en una variedad de formas y tamaños incluyendo conos, picos, cilindros, prismas, pirámides, poligonales, ranuras con patrón, tazones de succión o las formas que mimetizan la topografía de conjunto y espatulado a nanoescala encontrada en las carnosidades de salamandra. Las protuberancias pueden incluir un segundo, un tercer conjunto o conjuntos adicionales de protuberancias que se extienden desde las protuberancias principales de la superficie basal o apical de la construcción bio-diseñada por ingeniería. Las protuberancias pueden ser una característica inherente de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería y pueden tener forma y tamaño uniformes en una superficie, o pueden distribuirse en combinaciones de formas y tamaños, dependiendo del uso proyectado y nivel de adhesividad requerido. Las protuberancias pueden distribuirse en diversos patrones y en diversas densidades en la superficie. La densidad de las protuberancias, o el número de protuberancias por área de unidad fluctúa de aproximadamente 10 protuberancias/cm2 hasta aproximadamente 1 x 1010 protuberancias/cm2. Las protuberancias se pueden distribuir en un patrón, o en forma regular, en forma irregular o aleatoria, dependiendo de la aplicación proyectada, de la cinta o parche. En algunas modalidades las protuberancias tienen una altura promedio menor a aproximadamente a 1,000 micrómetros. Las protuberancias pueden tener un promedio desde aproximadamente 0.2 µ?t? hasta aproximadamente 150 pm. Las protuberancias pueden tener un ancho de punta promedio de desde aproximadamente 0.05 pm hasta aproximadamente 150 pm. Las protuberancias pueden tener un ancho de base promedio de desde aproximadamente 0.05 pm hasta aproximadamente 150 m. Las protuberancias pueden tener un implante centro a centro promedio de desde aproximadamente 0.2 pm hasta aproximadamente 500 pm. Las protuberancias pueden tener una proporción de altura a ancho de base promedio de aproximadamente 0.1:1 hasta aproximadamente 500:1. Las protuberancias pueden tener una proporción de ancho de base a ancho de punta promedio de aproximadamente 1000: 1 hasta aproximadamente 0.1:1. En algunas modalidades, las protuberancias auto-ensambladas pueden tener la capacidad de perforar el tejido del paciente al momento de la aplicación por parte del cirujano.
Como alternativa, el medio que mejora la adhesión es un material adhesivo aplicado ya sea a la superficie del bioreactor antes del revestimiento inicial de las células, o como alternativa, aplicado directamente a la superficie de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería autoensambladas después de que el cultivo ha sido completado pero antes del empaque final (es decir, la eliminación del medio de crecimiento post-líquido pero antes del envío de las unidades). Las características importantes para adhesivos útiles en la presente invención, incluyen las que sean biodegradables, biocompatibles, flexibles, elásticas, que tengan la capacidad de formar enlaces fuertes con superficies de tejido (incluso en ambientes húmedos o mojados). El material adhesivo debe tener la capacidad de formar un enlace químico con la superficie de la construcción de matriz extracelular, tal como un enlace covalente o no covalente a través de interacciones van der Waals, electrostáticas, o de hidrógeno. El material adhesivo puede ser agregado a la superficie de la construcción ya sea mediante rociado enrollado o bañado. Se puede utilizar una variedad de materiales adhesivos conocidos en la técnica para formar una superficie de adhesivo que incluye pero no se limita a celulosa, carboximetil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o combinaciones de los mismos. Otros materiales para utilizarse en la superficie de adhesivo pueden incluir pero no se limitan a poli(sebacato de glicerol) (PGS), poli(acrilato de sebacato de glicerol) (PGSA), poli(ácido láctico-co-glucólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), poliglucólido (PGA), ácido poliláctico (PLA), poli-3-hidroxibutirato (PHB), poliaminas de fosfoéster, poliuretano, parileno-C, queratina, nanotubos de carbono, poli(anhídrido), polivinilpirrolidona, polipropilenglicol, ácido hialurónico, dextranos, colágeno, quitina, quitosan, fibroína de seda, glucosaminoglicanos, fibrina, fibrinogen o similares.
El medio para aumentar la adhesión también se puede elaborar de nanofibras o microfibras que tienen propiedades adhesivas inherentes que son electrohiladas directamente de la superficie de las construcciones auto-ensambladas después de que se ha completado el cultivo, pero antes del empaque final (es decir la eliminación del medio de crecimiento post-líquido pero antes del envío de las unidades). Las nanofibras o microfibras de electrohilado, pueden ser pero no se limitan a colágeno poli(ácido láctico-co-glucólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), poliglucólido (PGA), ácido po I i táctico (PLA), y combinaciones de los mismos. e. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería en Malla Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería también se pueden elaborar en malla antes de injertarse a un sujeto que necesita de cuidados para una herida. Cuando se utilizan en la curación de heridas, la elaboración de malla mejora la conformación a la cama de la herida, y proporciona un medio para drenar el exudado de la herida desde la parte inferior del injerto. El término "elaboración de malla" se define como un método mecánico a través del cual se perfora un tejido con ranuras para formar una distribución tipo red. Las construcciones de malla se pueden expandir estirando la piel de modo que las ranuras se abran posteriormente se aplica a la cama de la herida. Las construcciones de malla extendida proporcionan un área de herida con cobertura máxima. Como alternativa, las construcciones en malla pueden aplicarse sin expansión, simplemente como una hoja con una distribución de ranuras no expandidas. La construcción de malla se puede aplicar sola o con la propia piel del sujeto de otra área del cuerpo. Las construcciones también pueden tener perforaciones fenestraciones y poros proporcionados por otros medios. Las Fenestraciones se pueden aplicar manualmente utilizando un láser, un perforador, un bisturí, aguja o perno. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería también pueden estar abastecidas con agujeros que se comunican entre ambos planos de la construcción. Los agujeros son perforaciones que se introducen en un patrón regular o irregular. También se puede marcar o perforar manualmente un tejido con un bisturí o una aguja. f. Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Esterilizadas en forma Terminal Las construcciones pueden ser esterilizadas en forma terminal utilizando medios conocidos en la técnica. Un método preferido para esterilización es contactando las construcciones con tratamiento de ácido peracético al 0.1% (PA) neutralizado con una cantidad suficiente de hidróxido de sodio 10 N (NaOH), de acuerdo con la Patente Norteamericana No. 5,460,962, cuya descripción está incorporada a la presente invención como referencia. Se lleva a cabo la descontaminación en un contenedor en una plataforma de agitación, tal como contenedores 1 L Nalge, durante entre 16 y 20 horas (por ejemplo, 18 horas). Posteriormente las construcciones se enjuagan contactándolas con tres volúmenes de agua estéril durante 10 minutos cada enjuague. Las construcciones pueden ser esterilizadas mediante radiación gamma. Las construcciones pueden empacarse en contenedores elaborados de material adecuado para radiación gamma y sellarse utilizando en un sellador de vacío, los cuales estuvieron colocados en bolsas herméticas para radiación gamma de entre 15.0 y 40.0 kGy. La radiación gamma disminuye en forma significativa, pero no prejudicial la susceptibilidad a la degradación de la construcción, el módulo de Young y la temperatura de contracción. Las propiedades mecánicas después de radiación gamma aún son suficientes para utilizarse en un rango de aplicaciones y la radiación gamma es un medio preferido para esterilización ya que se usa ampliamente en el campo de dispositivos médicos implantes.
V. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y USOS MÉDICOS Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería, con o sin células se pueden suministrar a un sujeto, por ejemplo, para tratar un órgano o tejido dañado o enfermo, para reparar el órgano dañado y/o restaurar su funcionalidad proyectada. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención, tienen propiedades que cuando se implantan en un sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva, inducen la reparación y regeneración de tejidos adecuado en el sitio. Se puede proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de una construcción a un sujeto en una o más administraciones o aplicaciones. Debido al potencial de diferenciación de las células progenitoras mesenquimales, la inclusión de estas poblaciones de células multipotenciales mejorará el rango y calidad de curación de los huesos, cartílago tendones, ligamentos, músculo y piel). Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser angiogénicas, anti-inflamatorias, osteogénicas, adipogénicas o fibrogénicas, o una combinación de los mismos, cuando se implantan en forma adyacente, o en contacto con el tejido u órgano que será tratado según sea adecuado para dicho sitio de implante.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención tienen propiedades angiogénicas, lo que significa que inducen en el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, lo cual es importante para curar una herida y la formación de tejido de granulación de heridas cutáneas y otras aplicaciones quirúrgicas de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería. La angiogénesis se detecta por ejemplo, a través de técnica de histología estándar (tal como mediante manchado aSMA) u otros ensayos tal como aquí se describe.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención tienen propiedades anti-inflamatorias cuando se implantan, lo que significa que se minimiza la infiltración de células inflamatorias del huésped, de modo que las células del huésped más bien migrarán en la construcción bio-diseñada por ingeniería implantada para bioremodelado de la construcción y reparación del tejido huésped. La migración de la célula huésped de los tejidos huésped dentro de la construcción bio-diseñada por ingeniería implantada, se llevará a cabo como parte de la respuesta de curación regenerativa. Se pueden utilizar técnicas histológicas para determinar la infiltración celular inflamatoria y la migración de células huésped. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención también tienen propiedades osteogénicas, lo que significa que ocurrirá en el sitio de tratamiento la formación de nuevos huesos. La osteogénesis se mide mediante detección de nuevo tejido conectivo y de osificación, mayor detección de actividad celular y cambio de los tejidos recientemente formados. Las técnicas de histología estándar y otras técnicas pueden ser utilizadas para medir el efecto celular, así como la densidad ósea y el área de la superficie de los huesos en el sitio de tratamiento. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser adipogénicas que forman nuevo tejido adiposo (grasa), cuando se implantan en un sitio de tratamiento. Las propiedades fibrogénicas de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser materializadas cuando se implantan en un sitio de tratamiento. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención, se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones terapéuticas humanas y no humanas (por ejemplo, veterinaria).
La presente invención incluye usos médicos y métodos para tratar a sujetos que necesitan curación de heridas, utilizando una construcción bio-diseñada por ingeniería de la presente invención para tratar heridas quirúrgicas; heridas de quemadura; heridas crónicas; úlceras en extremidad inferior diabética; úlceras venosas; úlceras de presión (con o sin terapia de curación con presión negativa); úlceras arteriales; heridas de tunelización, tal como las de un túnel fuera de una cavidad de herida crónica; senos (por ejemplo, dehiscencias pilonidales, post-quirúrgicas) y fístulas (por ejemplo, anal, enterocutánea, vesico-vaginal, oro-antral, bronco-pleural).
Otros usos médicos y métodos para tratar a sujetos que necesitan de tratamiento incluyen aplicaciones cardiacas, aplicaciones a tejidos blandos y duros de la cavidad oral (por ejemplo, el tratamiento de tejido gingival retirado, regeneración de huesos guiada para reparar los defectos de huesos o huesos deteriorados, regeneración de tejido guiada y reparación de tejido conectivo de la cavidad oral).
Los usos médicos y métodos de tratamiento adicionales para utilizar las construcciones bio-diseñadas por ingeniería incluyen aplicaciones cosméticas, que incluyen rellenadores de tejidos blando dérmico (por ejemplo, contorno para cosmesis), aplicaciones de reconstrucción de seno (por ejemplo, aumento, levantamiento y/o mastopexia) y aplicaciones neurológicas, tal como parche para reparación de materia dura o un injerto para reparar el nervio periférico, una envoltura para manojos de nervios o un tubo para regeneración de nervios guiada.
Los usos adicionales de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería incluyen, pero no se limitan a la aplicación a líneas de sutura o heridas abiertas para mejorar el sello y reforzar las capacidades de ciertos procedimientos quirúrgicos, en donde la filtración de aire o fluidos puede ser perjudicial para la salud del sujeto, y podría requerir procedimientos quirúrgicos correctivos adicionales, para evitar complicaciones, tales como infección, formación de abscesos o sangrado interno (por ejemplo, derivación gástrica; colostomías; resecciones de estómago e intestino delgado y grueso; injertos vasculares; implantes vasculares; injertos de derivación de arteria coronaria; abdominoplastía; cirugías abdominales (por ejemplo laparotomía); secciones de Cesárea; sitios de traqueotomía; sitios de implante de catéter; sellado del pericardio; pleura, y trauma dural); aplicación como un tratamiento profiláctico para curar o prevenir la ruptura de órganos (por ejemplo, estabilización de placa vulnerable; rupturas aórticas abdominales/aneurisma; perforaciones de úlcera estomacal del intestino delgado; enfermedad de Crohn; enfermedad inflamatoria del intestino); "agujeros" que necesitan ser llenados para reparación de crecimiento celular (por ejemplo, incontinencia urinaria; reparaciones de nariz o septo; fístulas anales; ostomías; desgarres musculares; desgarres de cartílago; material de recubrimiento de articulación; reparaciones de hernia de pared de músculo y tejido blando).
Los usos aún adicionales de construcciones bio-diseñadas por ingeniería incluyen pero no se limitan a injertos y reparaciones de huesos (por ejemplo fracturas compuestas; osteotomías; membrana periostal artificial; tronco de cobertura para amputaciones de extremidades y apéndice; fusiones de pie y talón); reparación y regeneración de tejido cardiovascular (infarto post-miocardio; falla cardiaca congestiva); isquemia del miocardio; ataque; enfermedad arterial periférica; neuropatías; enfermedad de arteria coronaria); aplicaciones de reparación de nervios; aplicaciones de regeneración de hígado (fibrosis; hepatisis aguda, subaguda y crónica; cirrosis; falla hepática fulminante; cobertura de la superficie externa después del trasplante del lóbulo); aplicaciones de regeneración de riñon durante falla renal aguda; cierres de heridas quirúrgicas; prevención de adhesión quirúrgica abdominal; ducto cardiovascular, salival o cobertura con stent de ducto biliar.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden aplicarse o implantarse para un sitio de tratamiento contactándolas con tejido dañado o enfermo, llenando un hueco en un espacio de tejido o mediante colocación en donde no existe o ya no va a existir tejido del sujeto. La aplicación o implante de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería puede lograrse a través de contacto con presión directamente en la superficie de un órgano, envolviendo en forma circunferencial alrededor del órgano, o fijarse al sitio de tratamiento utilizando adhesivos, suturas o grapas quirúrgicas.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser suministradas también como una lámina plana, enrollada, algodonada, o inyectada en un sitio de tratamiento. La construcción bio-diseñada por ingeniería puede ser suministrada en forma intraoperable durante procedimientos de cirugía abierta, percutánea o en forma laparoscópica pasando la construcción a través de una cánula al defecto. Sin importar el modo de suministro, el dispositivo funciona para estimular los procesos de curación regenerativa, suministrando en forma local los bloques de construcción de reparación y los compuestos de señalización celular en concentraciones fisiológicas relevantes, incluyendo células junto con su formación compleja de citocina secretadas, proteínas ECM, glucosaminoglicanos, lípidos, enzimas de reorganización de matriz, y materiales de colágeno que pueden ser reorganizados para cumplir con las necesidades del órgano herido, o funcionar para reclutar localmente las células regenerativas endógenas del huésped. Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden incorporar células genéticamente modificadas que pueden funcionar para suministrar una terapia genética a base de células local para ciertos órganos de un sujeto que necesita del mismo. La construcción también puede incorporar un fármaco que funciona con un vehículo de suministro de fármacos para terapéuticos de molécula pequeña, terapéuticos biológicos o farmacéuticos para el suministro interno, local, sostenido, de liberación lenta de terapéuticos a un sujeto que necesita del mismo.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para explicar de mejor manera la práctica de la presente invención, y no deberán ser interpretados para limitar el alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar diversas modificaciones a los métodos aquí descritos, sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción Bio-diseñada por Ingeniería Producida mediante Células Madre Mesenquimales (MSCs) Se ejemplifica la generación de construcciones bio-diseñadas por ingeniería que comprenden el crecimiento de células madre mesenquimales bajo condiciones para producir una capa de matriz extracelular la cual es sintetizada y ensamblada por las células madre mesenquimales, utilizando células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVC). En forma específica, hasta hoy, los expertos en la técnica no han tenido la capacidad de definir condiciones preparatorias para permitir que las MSCs sinteticen y ensamblen los componentes de matriz extracelular a cualquier grosor apreciable. Antes de sembrar la HUCPVC, se recubrieron los insertos de cultivo con aproximadamente 5 ug/cm2 de fibronectina derivada de plasma humano. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron producidas sembrando inicialmente 3 x 106 HUCPVC por inserto de 24 mm. En forma subsecuente al sembrado de las células en un inserto de cultivo con una membrana porosa en un inserto, las células se mantuvieron en el cultivo durante 18 días, con un reemplazo con un medio de cultivo fresco los días 5, 8, 12, y 15, en el siguiente medio de cultivo definido en forma química.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería resultantes generan matrices extracelulares que tienen al menos 30 mieras de grosor. Se llevó a cabo un análisis de tiempo-curso de la formación de matriz extracelular para correlacionar el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería derivada de SC con longitudes de tiempo de cultivo. Las figuras 1A y 1B demuestran que se pueden lograr los mayores incrementos en el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería en doce días del cultivo.
Con el objeto de definir en forma adicional los factores que contribuyen a una síntesis de matriz extracelular eficiente y el ensamble mediante células madre mesenquimales, se evaluó el desempeño de TGF-alfa y prostaglandina 2. La figura 2, demuestra la correlación entre el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería en incremento como una función de la concentración TGF-alfa incrementada en el medio de cultivo después de cultivar 3 x 106 HUCPVC por inserto de 24 mm durante 18 días. La figura 3 demuestra la correlación entre el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería en disminución como una función de la concentración incrementada de prostaglandina 2 en el medio de cultivo después de cultivar 3 x 106 HUCPVC por inserto de 24 mm durante 18 días. Por consiguiente, la cantidad de matriz extracelular sintetizada y ensamblada por las células madre mesenquimales, puede ser modulada con base en los componentes del medio de cultivo, y en particular, se pueden lograr grosores apreciables de la construcción bio-diseñada por ingeniería resultante. Además, el suplemento del medio de cultivo puede hacer sinergia con las densidades de siembra incrementadas (tal como densidades superconfluentes que contienen 3 x 106 a 10 x 106 células o más por inserto de 24 mm) para producir matrices extracelulares aún más gruesas en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivada de MSC, incluyendo las derivadas de HUCPVC, MSCs derivadas de médula ósea, y pre-adipocitos (figura 4). En una modalidad específica, se llevó a cabo el sembrado de células superconfluente utilizando 30 x 106 células por inserto 75 mm, lo cual es equivalente a 9.6 x 106 células por inserto 24 mm.
Ejemplo 2: Propiedades Biofísicas de Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Producidas mediante Células Madre Mesenquimales (MSCs) Además de generar cantidades apreciables de matriz extracelular sintetizada y ensamblada mediante células madre mesenquimales para producir una construcción bio-diseñada por ingeniería que tiene el grosor significativo, dichas construcciones bio-diseñadas por ingeniería tienen propiedades biofísicas adicionales que las distinguen de las matrices extracelulares formadas por otros tipos de células.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC en superconf luencia y cultivadas durante 18 días de acuerdo con los métodos y medios de cultivo definido en el Ejemplo 1, exhibieron una diferencia significativa en la distribución de colágeno y en la morfología general de la matriz de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF cultivadas en forma similar (excepto que se utilizó 20 ng/mL TGF-alfa). En particular, la matriz extracelular contiene poros, es menos densa, y contiene agregados de manojos de colágeno (figuras 5A-5B). Por lo tanto, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC tienen una porosidad, que puede estar representada como el porcentaje de área que está representada por poros en una sección histológica relativa al área total de la sección histológica. Dicha matriz extracelular porosa es deseable para muchas indicaciones de curación de heridas, ya que permite una mayor migración e infiltración de células huésped y moléculas relacionadas con angiogénesis una vez que se injertan en una herida. Sin embargo, dichas matrices extracelulares porosas también pueden mantener la integridad mecánica para permitir a un especialista aplicar la construcción bio-diseñada por ingeniería con mínima dificultad. Por consiguiente, se llevaron a cabo pruebas mecánicas de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC y derivadas de HDF, para evaluar diversas propiedades mecánicas. En forma específica Fmax (también conocida como Max carga /fuerza Max, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 N) es la carga máxima que puede ser aplicada en un material antes de que se rompa. La resistencia última a la tensión (también conocida como UTS, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 N/cm2) es la carga de presión máxima sostenida por un espécimen antes de la ruptura. El módulo de elasticidad (también conocido como elongación, por ejemplo, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 desplazamiento/longitud inicial) es una medida de la rigidez de un material de un región lineal, mediante lo cual el material regresara a una condición de inicio si se elimina la carga. Las figuras 6A-6C muestran que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de SC tiene una integridad mecánica similar a la de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF, a pesar que tiene una matriz extracelular más porosa, con construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC que tienen la integridad mecánica y el perfil de grosor más similares.
Una construcción bio-diseñada por ingeniería que tiene una matriz extracelular porosa con fuertes propiedades mecánicas puede ser útil en forma adicional para tratar heridas, permitiendo la difusión de factores de crecimiento en el sitio de suministro que promueven la curtación de heridas. Con el objeto de caracterizar las diferencias en los componentes de matriz extracelular, los componentes de adhesión y/o los factores de crecimiento presentes entre las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC y las generadas utilizando otros tipos de células, se llevaron a cabo ensayos cuantitativos PCR (qPCR) utilizando cADN aisladas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC sembradas en superconfluencia y cultivadas durante 18 días (de acuerdo con los métodos y medio de cultivo definido en el Ejemplo 1) o derivadas de fibroblasto dérmico humano (HDF) sembradas en superconfluencia y cultivadas durante 18 días (de acuerdo con los métodos y medio de cultivo definido en el Ejemplo 1, excepto que el medio de cultivo fue suplementado con 20 ng/mL de TGF-a más largo). Los cebadores PCR de tiempo real de la Distribución de Moléculas de Adhesión ECM Humano (SuperArray PAHS-013A) y la Formación del Factor de Crecimiento Humano (SuperArray PAHS-041A) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La figura 7, muestra un resumen de las diferencias de los factores de crecimiento entre construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC y derivadas de HDF. Por ejemplo, la expresión de colágeno incrementada en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC es consistente con las características del manojo de colágeno observadas en la figura 5. La expresión incrementada de CXCL6, una molécula quimioatractiva; KDR, un indicador de la proliferación, migración, morfogénesis tubular y retoño endotelial inducido por VEGF; y laminina alfa 5 (LAMA5), un indicador de la organización de célula embriónica, también se observó en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC. Estos resultados demuestran que, además del grosor apreciable de la matriz extracelular logrado utilizando construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC, dichas construcciones también exhiben activación de genes útiles para tratar el ambiente de una herida, tal como promover los rangos de curación y angiogénesis (figura 7).
Además, los ensayos a base de proteína para detectar los niveles de IL-6, IL-8, y VEGF utilizando el sistema de formación de gránulos citométrico (CBA) Becton Dickinson, se llevaron a cabo utilizando construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC sembradas en confluencia y cultivadas durante 18 días (de acuerdo con los métodos y medios de cultivo definido en el Ejemplo 1) o construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de fibroblasto dérmico humano (HDF) sembradas en confluencia y cultivadas durante 18 días (de acuerdo con métodos y medios de cultivo definidos en el Ejemplo 1, excepto que el cultivo fue suplementado con 20 ng/mL TGFa Largo), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las figuras 8A-8C muestran una comparación tiempo-curso en los niveles de IL-6, IL-8, y VEGF dentro del medio acondicionado generado por las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC y derivadas de HDF. La expresión IL-6 en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC se elevó en forma temprana durante el tiempo-curso del cultivo, y fue de aproximadamente 9 veces la de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF el día 5 del cultivo de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC (figura 8A).
Además de su papel en la respuesta inmune, IL-6 también es secretada por osteoblastos para promover la formación de osteoclastos. La expresión IL-8 también fue sobreexpresada en forma significativa en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC relativas a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF en toda la longitud del cultivo (figura 8B). Además de su papel en la respuesta inmune, IL-8 también es secretada por las células epiteliales como un potente factor angiogénico, a través del enlace de receptores tales como CXCR1 y CXCR2. En forma similar, VEGF es otro potente factor angiogénico y se sobreexpresa en forma significativa en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC relativas a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF durante las fases tempranas del cultivo (figura 8C). Se considera que la caída en los niveles de VEGF detectables en el medio de cultivo, se deben a altos niveles de expresión KDR mediante HUCPVCs y otras MSCs, lo cual es el receptor para VEGF y secuestra las moléculas dentro la construcción bio-diseñada por ingeniería, para excluir la detección en el medio. Además, CSF-3 y vitronectina se activan en construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC relativas a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF. Se llevó a cabo en forma adicional un ensayo ELISA en muestras de un medio acondicionado de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF y derivadas de MSC en cultivo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 (por ejemplo, 10x TGF-alfa para ambas condiciones) para cuantificar la cantidad de producción de hialuronan (HA) después de 5 y 18 días. La figura 8D muestra que mientras que los niveles de HA en el medio de medio de cultivo de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF disminuyeron de 4,664 ng/mL en el día 5 a 4,085 ng/mL en el día 18, los niveles de HA en el medio de cultivo de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC se incrementaron de 4,333 ng/M1 en el día 5 a 5,615 ng/mL en el día 18. Además, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC exhibieron 38 veces más vitronectina, 21 veces más CSF-3, 15 veces más NCAM1, y 4 veces más CXCL1 en forma relativa a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF.
Finalmente, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC sembradas de superconfluencia y cultivadas durante 18 días de acuerdo con los métodos y medios de cultivo definidos en el Ejemplo 1, produjeron un medio acondicionado que tiene componentes que incrementan la capacidad de las células a migrar en forma relativa a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF cultivadas bajo condiciones idénticas, excepto que el medio de cultivo fue suplementado con 20 ng/mL TGFa Largo (figura 9).
Ejemplo 3: Propiedades Potenciales de Linaje Múltiple de Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Producidas por Células Madre Mesenquimales (MSCs) Se llevaron a cabo ensayos para determinar las propiedades potenciales multilinaje de células aisladas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas por MSCs, así como de MSCs dentro del ambiente de construcción bio-diseñada por ingeniería nativo. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de derivadas MSC se sembraron en confluencia y se cultivaron durante 18 días de acuerdo con los métodos y medios de cultivo definido en el Ejemplo 1. El día 18, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron ya sea digeridas con colagenasa para determinar los rendimientos celulares y las digestiones celulares de ensayos potenciales de linaje múltiple, o fueron directamente cultivadas en el medio de inducción. Los grupos de control MSC no inducidos de células y construcciones bio-diseñadas por ingeniería se mantuvieron para cada una de los grupos de célula inducida y construcción bio-diseñada por ingeniería, en donde el medio alfa MEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS) fue utilizado en lugar del medio de inducción. Los cambios del medio ocurrieron cada 2 a 3 días. Además, los grupos de control derivados de HDF de las células y construcciones bio-diseñadas por ingeniería se mantuvieron para cada uno de los grupos de célula inducida y construcción bio-diseñada por ingeniería.
Para el ensayo de inducción osteogénica, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron cultivadas directamente en la inducción osteogénica y las células que resultan de la digestión de colagenasa se sembraron en 20,000 células/cm2 en placas de 12 depósitos para inducción osteogénica. El medio de cultivo definido mostrado en el Ejemplo 1, fue reemplazado el día 18 de cultivo con el siguiente medio de inducción osteogénico: medio de base DMEM completo suplementado con 10'3 M de dexametasona (DEX), 1 M ß-glicerofosfato (BGP), y 50 mg/mL de ácido ascórbico (AA). El cultivo de inducción osteogénica ocurrió durante días previos al análisis de la expresión genética de Runx2 (un factor de transcripción expresado en las últimas etapas de la diferenciación osteoblástica) , ALP, y osteoclacina (OC) utilizando ARN aislado de construcciones bio-diseñadas por ingeniería o células cultivadas. Se observó un incremento de 8 veces en la expresión de ALP en la construcción bio-diseñada por ingeniería derivada de MSC relativa a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC no inducidas (figura 10A). Además, se observó un incremento de 11 veces en la expresión de Runx2 en células de construcción bio-diseñada por ingeniería derivadas de MSC aisladas que fueron inducidas en un medio de inducción osteogénico relativo a células que no fueron inducidas en un medio de inducción osteogénico (figura 10B). Por lo tanto, las MSCs dentro de una construcción bio-diseñada por ingeniería intacta o aislada de dichas construcciones, se pueden inducir hacia un linaje osteogénico basados en indicios de señalización ambiental.
Para el ensayo de inducción adipogénica, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron cultivados directamente en un medio de inducción adipogénica y las células que resultan de la digestión de colagenasa fueron sembradas en 20,000 células/cm2 en placas de 12 depósitos para inducción adipogénica. El medio de cultivo definido mostrado en el Ejemplo 1 , fue reemplazado el día 18 del cultivo con el siguiente medio de inducción adipogénica: Medio de base DMEM completo, suplementado con 10"3 M de dexametasona (DEX), 10 mg/mL de insulina, y 0.5 mM de 3-isobutil- 1 -metilxantina (IBMX). El cultivo de inducción osteogénica ocurrió durante los días previos al análisis de triglicéridos neutrales y lípidos de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería o células cultivadas utilizando un manchado de Aceite Rojo-O. Únicamente las células de la construcción bio-diseñada por ingeniería derivadas de MSC aisladas que fueron inducidas en un medio de inducción adipogénica, se observó que tienen una cantidad significativa de células manchadas en forma relativa a las células que no fueron inducidas en un medio de inducción adipogénica (figura 10C). Por lo tanto, las MSCs dentro de una construcción bio-diseñada por ingeniería intacta o aislada de dichas construcciones, pueden ser inducidas hacia un linaje adipogénico basado en indicios de señalización ambiental.
Por lo tanto, las MSCs dentro y aisladas de una construcción bio-diseñada por ingeniería intacta, se pueden inducir hacia diversos linajes celulares con base en indicios de señalización ambiental mientras que se mantiene una subpoblación con un potencial tipo tallo.
Ejemplo 4: Propiedades de Vascularización In vivo en Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Producidas por Células Madre Mesenquimales (MSCs) El propósito de este estudio fue injertar construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas a través de los métodos del Ejemplo 1 en ratones desprotegidos, y analizar su respuesta in vivo cuando se implantan en forma subcutánea. Más particularmente, se utilizó manchado de Actina alfa-Músculo Liso (aSMA) para analizar en forma cualitativa y cuantitativa la vascularización dentro de las construcciones de los ratones. Las unidades fueron injertadas en un modelo de implante subcutáneo en ratones desprotegidos Swiss hembra a las 8 semanas de edad.
Después de 1 semana del implante subcutáneo de diversas construcciones bio-diseñadas por ingeniería, se sacrificaron 5 animales de cada grupo descritos en la siguiente tabla: El área de implante se eliminó y se procesó para revisión histológica. En particular, se mancharon secciones histológicas de n = 2 animales de cada grupo con aSMA. Las figuras 11A- 11D muestran secciones representativas tomadas de secciones manchadas con aSMA de construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC al 100%, construcciones bio- diseñadas por ingeniería derivadas de HDF al 50%-HUCPVC al 50%, construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF al 10%-HUCPVC al 90%, y construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF al 100%, respectivamente. Todas las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron producidas tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que las construcciones derivadas de HDF al 100% fueron cultivadas con 20 ng/mL de TGF-alfa. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería en la figura 11A parecen tener un número más pronunciado de manchado positivo aSMA dentro del área de implante en comparación con las concentraciones de las figuras 11B-11D. El manchado aSMA está asociado en forma específica alrededor de los nuevos vasos formados, lo cual se observa claramente en la figura 11A con una magnificación de 40x. La cuantificación de aSMA reveló que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas por HUCPVC al 100% tuvieron mayores números de vasos dentro del área de implante relativa a los otros grupos (figura 11D). Sin pretender limitarse alguna teoría, las HUCPVC pueden secretar citocinas/factores de crecimiento, tal como los descritos anteriormente en los Ejemplos 2 y 3, que actúan en una forma paracrína para reclutar células endoteliales en ratón, las cuales posteriormente forman nuevos vasos. Además, la matriz y su organización asociada que es generada por las HUCPVC, puede proporcionar una matriz provisional más adecuada para el reclutamiento de células e infiltración en el área de implante, conduciendo a una mayor formación de vasos observada en 1 semana relativa a otros grupos. Además, se pueden llevar a cabo ensayos de angiogénesis estándar para confirmar en forma adicional la capacidad incrementada de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HUCPVC para promover la angiogénesis, tal como ensayar la capacidad de las construcciones para formar y/o mantener el túbulo de las células endoteliales (por ejemplo, un ensayo de formación de tubo de angiogénesis de Millipore) y análisis de expresión genética de biomarcadores de angiogénesis (por ejemplo, ensayos ELISA de angiogénesis Q-Plex y ensayos de formación de perfilador de proteoma de angiogénesis de R&D Systems). Ejemplo 5: Control de Contracción de Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Se produjeron construcciones bio-diseñadas por ingeniería sembrando fibroblastos de prepucio neonatal humano en insertos de membrana de 75 mm con membranas PES tratadas con plasma (COOH) que comprenden poros de 5 mieras. La densidad inicial del sembrado celular fue de 30 millones de células por inserto de membrana. Las células se suspendieron en un medio de cultivo definido en forma química (que no contiene componentes no humanos indefinidos) con 20 mL de suspensión sembrada directamente en el inserto, y 110 mL de medio en el depósito de cultivo para permitir la alimentación bilateral de las células. El medio contenía: una mezcla base 3:1 de D EM, 2 mM de L-Glutamina (Invitrogen Inc.) 4 mM de GlutaMAX (Gibco BRL, grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 1 x 10~4 M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat. #02400 ACS grado), 1 x 10"4 M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 ug/mL de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM de triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO), y 6.78 ng/mL de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/mL de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 ug/mL L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 ug/mL de glicina (Sigma, St. Louis, MO), 20 ng/mL de TGF-alfa (por ejemplo, 1x TGF-alfa) y 10 nM de PGE2. Las células se cultivaron en esta forma durante 18 días antes de recolectar las construcciones bio-diseñadas por ingeniería. En algunas modalidades, pueden ser preferibles 2x TGF-alfa o más. Se fijaron inmediatamente en formalina varias construcciones bio-diseñadas por ingeniería para análisis de histología para prevenir la contracción natural (figura 12), en tanto que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería restantes fueron contraídas por control tal como se describe en forma adicional más adelante.
Se utilizaron en forma específica pinzas estériles para despegar las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la membrana Transwell que se dejaran flotando en el plato de cultivo. Con el objeto de producir una construcción bio-diseñada por ingeniería porosa reteniendo aún fuertes propiedades mecánicas, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron contraídas en una manera controlada, regresando las construcciones flotantes a un incubador y permitiendo que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se contrajeran naturalmente durante dos horas. Después de dos horas, se eliminó el medio, se enjuagó en agua RODI, y se fijo en formalina para análisis de histología (figura 13). Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería que han pasado por contracción controlada (figura 12) muestran un incremento de aproximadamente 2 veces en el grosor de la construcción bio-diseñada por ingeniería promedio (por ejemplo, grosores promedio de 400-800 µ?t? versus grosores promedio de 200-300 pm) en forma relativa a los que no han pasado por contracción controlada (figura 13) .
En otra modalidad, después de dos horas de incubación flotante, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enjuagadas en forma subsecuente en una solución EDC 1 mM a una temperatura de 4°C durante la noche, aunque la construcción podría ser enjuagada en forma alternativa en 0.2 mM de EDC, 0.5 mM de EDC, 5 mM de EDC, o 10 mM de EDC en platos de cultivo sin desviarse del alcance de la presente invención. Después de la reticulación EDC, la construcción se enjuagó tres veces con agua desionizada de osmosis inversa (RODI) se drenó y se dejó plan. Después de enjuagar con agua RODI, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enfriadas de temperatura ambiente (~20°C) en un rango de 0.5°C por minuto durante 2 horas, hasta que se alcanzó una temperatura de congelación final de -40°C. Después de que la construcción bio-diseñada por ingeniería alcanzó una construcción de temperatura de -40°C, la construcción bio-diseñada por ingeniería fue endurecida a una temperatura de -40°C durante al menos 2 horas. Todas las construcciones bio- diseñadas por ingeniería se sometieron posteriormente a un ambiente de vacío menor a 200 mTorr en un aparato de liofilización y se trataron durante 24 horas a una temperatura de 0°C. También se podrá apreciar que el ciclo de congelación puede llevarse a cabo en un aparato de liofilización habilitado en forma adecuada o en cualquier congelador, tal como un congelador de rango-control. Se podrá apreciar en forma adicional que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden ser sometidas a un ambiente de vacío desde 0 mTorr y 350 mTorr sin desviarse dentro el alcance de la presente invención. En una modalidad alternativa, la construcción se dejo secar con aire durante 8 horas después de la reticulación EDC sin pasar por liofilización (es decir, secado por congelación).
En otra modalidad, después de dos horas de incubación flotante, el medio fue eliminado, y las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enjuagadas en amortiguador MES hasta que las construcciones ya no tenían color rosa. Posteriormente las construcciones fueron enjuagadas en agua desionizada por osmosis inversa (RODI) durante aproximadamente una hora drenarse y colocarse en forma plana. Después de enjuagar con agua RODI, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron enfriadas de temperatura ambiente (~ 20°C) en un rango de 0.5°C por minuto durante 2 horas, hasta que se alcanzó una temperatura de congelación final de -40°C. Después de que la construcción bio-diseñada por ingeniería alcanzó una temperatura de -40°C, la construcción bio-diseñada por ingeniería fue endurecida a una temperatura de -40°C durante 2 horas. Todas las construcciones se sometieron posteriormente a un ambiente de vacío menor a 200 mTorr en un aparato de liofilización durante 24 horas a una temperatura de 0°C. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron colocados en forma subsecuente en un horno de vacío durante 24 horas a una temperatura de 100°C hasta para formar reticulaciones deshidrotérmicas (DHT) en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería. En algunas modalidades, la liofilización puede ser preferida en la ausencia de pasos de reticulación.
Ejemplo 6: Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería que tiene Función de Barrera y Osteogénica In Vivo Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería como las producidas utilizando los métodos del Ejemplo 5 (es decir EDC reticulado, DHT reticulado y construcciones bio-diseñadas por ingeniería no reticuladas, referidas colectivamente en este Ejemplo con las "construcciones de prueba") además de un control negativo (sin construcción) y hasta un control positivo (una membrana de barrera bioabsorbible estándar 25 x 25 mm de Bioguide, que comprende una membrana de colágeno tipo I y III colágeno de porcino Osteohealt, One Luitpold Drive, P.O. Box 9001, Shirley, NY 11967) se implantaron en cada uno de los cuatro cuadrantes de la quijada de minicerdos Gottingen (maxilar derecho, maxilar izquierdo, mandibular derecho y mandibular izquierdo).
En forma específica se alojaron en conjunto cuatro minicerdos adultos macho en una habitación separada a lo largo del estudio a una temperatura de 22 +/- 2°C. Cada cerdo fue anestesiado durante 8 horas, durante tiempo en el cual se prepararon y trataron los defectos en los huesos. El procedimiento quirúrgico para aplicar cada construcción tomo aproximadamente 2 horas. El segundó y cuatro diente premolar se extrajeron después de 1) elevación de una aleta gingival de grosor total, 2) separación de las raíces utilizando una sierra de odontólogo de cuchillas múltiples, y 3) incisión de ligamento periodontal con un bisturí Orban. Antes de las extracciones, la placa bucal del hueso alveolar que rodea el diente, se penetró con una sierra de odontólogo redondo en diversos puntos y se cortó utilizando una sierra de odontólogo de fisura de carburo conectando los agujeros redondos de la sierra de odontólogo. La placa bucal se eliminó quirúrgicamente utilizando cinceles de huesos y tijeras de huesos para crear defectos de huesos (1.2 cm2 cada uno). Todas las construcciones fueron secciones de 25 x 25 mm y se colocaron en 4 sitios maxilares y 4 sitios mandibulares seleccionados en forma aleatoria para extender los bordes mesiales, distales y apicales del defecto en 2-3 mm. Se utilizaron ligaduras para atar los bordes de la construcción al tejido blando gingival del huésped circundante. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo en condiciones asépticas y utilizando anestesia general e intubación endotraqueal proporcionada por los servicios veterinarios LASC.
Después de 4, 8 y 12 semanas, los animales designados fueron sacrificados y/o se recuperaron los sitios de prueba/control junto con el hueso adyacente en secciones de bloque y se fijaron en solución de formalina al 10%. La mitad de las secciones de bloque en cada grupo fueron descalcificadas utilizando un agente de descalcificación. Después de la descalcificación y deshidratación, los bloques se sumergieron en parafina, y subsecuentemente se cortaron secciones de 5 micrómetros y se mancharon con hematoxilina-eosina para microscopio de luz e identificación de la composición celular del infiltrado inflamatorio, así como para revisión histopatológica e histomorfológica. Las secciones también se mancharon con tricromo de Masson para detectar nuevos depósitos de colágeno y formación de huesos nuevos. La otra mitad de las secciones de bloque se fijaron en una solución de formalina al 4% después de raspar el tejido blando colocado, deshidratarse en grados ascendentes de alcohol e incrustarse en metilmetacrilato para manchado futuro con azul de toluidina para evaluación de depósitos de colágeno y huesos nuevos. La estructura de hueso alveolar y las composiciones de tejido formados recientemente se revisaron mediante tomografía microcomputarizada cuantitativa (MicroCT) después de tratamiento. Se llevaron a cabo exploraciones MicroCT Scans utilizando un sistema Scanco microCT 80 (Scanco Medical, Bassersdorf, Suiza) localizado en el Laboratorio de Biomecánicas de Desarrollo y Ortopédicas de la Universidad de Bostón en el Departamento de Ingeniería Mecánica (Boston University Orthopaedic and Development Biomechanics laboratory at the Department of Mechanical Engineering) . Inmediatamente antes de la exploración, se eliminaron del almacenamiento las quijadas de 4 minicerdos y se dejaron calibrar a temperatura ambiente.
Los sitios de prueba tratados con construcciones de prueba mostraron una mayor actividad celular y cambio de tejidos recientemente formados, es decir, tejidos conectivos y osteoides). A las 8 semanas, el tejido conectivo saludable y el tejido osteoide formado recientemente altamente organizado, llenó las áreas con imperfección y los contornos del hueso bucal fueron casi completamente reformados. A las 12 semanas, los sitios de prueba tratados con construcciones de prueba mostraron una curación casi total con una formación de hueso nuevo bien conectada con el hueso viejo, en tanto que ciertas secciones mostraron curación continua con ciertos osteoclastos en la superficie de los huesos lo que indica el cambio de hueso. Ejemplo 7: Control de Tamaño de Poro de Construcciones Biosideseñadas por Ingeniería El tamaño de poro promedio dentro de la matriz extracelular de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería de la presente invención, se puede construir para formar una matriz extracelular densa o porosa. Combinado con el tipo y/o grado de reticulación, el tamaño de los poros promedio definidos puede elegirse y controlarse para producir construcciones que tienen diferentes rangos de persistencia in vivo y/o infiltración celular, que fluctúan de construcciones bio-diseñadas por ingeniería "rápidamente biorremodelables" a "moderadamente biorremodelables" a "biorremodelables en forma prolongada" para una aplicabilidad diseñada a la medida para usos terapéuticos (figura 14A). Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF producidas de acuerdo con los métodos del Ejemplo 5, se analizaron después de 18 días en cultivo para determinar las características de distribución y tamaño de poro. La figura 13 demuestra que dichas construcciones bio-diseñadas por ingeniería que no han sido Mof ¡Tizadas, esencialmente no tienen poros. Sin embargo, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería fueron sometidas en forma adicional a contracción controlada, reticulación y estaban ya sea no reticuladas o reticuladas con EDC, o reticuladas utilizando métodos DHT de acuerdo con los métodos del ejemplo 5. Se utilizó la herramienta Magic Wand del programa de análisis de imagen Scandium® (Olympus), para analizar estadísticamente las longitudes de los poros y las áreas en las secciones histológicas representativas. Ya que los poros no son círculos precisos, el diámetro de poro se calculó nuevamente asumiendo el área medida de un poro determinado derivada de un círculo. Se utilizaron dos imágenes de histología por grupo para generar las medidas. La figura 14B muestra que la elevación a una temperatura de congelación final de -40°C, en un rango de 0.5°C por minuto, dio como resultado tamaños de poro promedio de entre 15 y 20 pm. Además, la figura 14C demuestra en forma adicional que el tamaño de poro promedio se determina a través de la temperatura de congelación final sin importar el estado de reticulación. En contraste, la figura 14D muestra que la elevación de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería a una temperatura de congelación final de -10°C, la cual es una temperatura de congelación más templada que -40°C, en un rango de 0.5°C por minuto, dio como resultado tamaños de poro promedio de al menos 50 pm (por ejemplo, que fluctúan de entre 30 pm y 100 pm). La figura 14E demuestra en forma adicional que el tamaño de poro promedio es independiente de la contracción controlada. En forma específica, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de HDF producidas de acuerdo con los métodos del Ejemplo 5, y que fueron simplemente secadas con aire después de la contracción controlada, produjeron una matriz densa con poros muy pequeños, si es que los había). En contraste, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería que fueron procesadas como las mostradas en la figura 14B, produjeron tamaños de poro promedio de entre 15 y 20 pm. En forma similar, el tamaño de poro promedio de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería derivadas de MSC generadas de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 (figura 14F), pueden incrementarse al momento de la contracción, enjuague, controlada, congelación de temperatura ambiental a -20°C y liof ilización (figura 14G).
Ejemplo 8: Control del Grosor de Construcción Bio-diseñadas por Ingeniería y Composición ECM Se sembraron HDFs en una superconf luencia (es decir, 30 x 10e células por inserto de 75 mm) y se cultivaron durante 18 días de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1, excepto que se utilizó 20 ng/mL de TGF-alfa. También se suplemento heparina en el medio en 5 pg/mL. Para probar el efecto del factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF; Peprotech Inc.) construcciones bio-diseñadas por ingeniería resultantes, se suplemento el bFGF y se mantuvo en el medio de cultivo ya sea al momento de la siembra inicial o después de 5 días de cultivo. La figura 15A muestra que el suplemento del medio de cultivo definido en forma química con 20 ng/mL de bFGF redujo, en forma significativa los grosores de la construcción bio-diseñadas por ingeniería que fueron más fácilmente desprendibles cuando se manejaron con fórceps en forma relativa a los controles. El suplemento con heparina no tuvo efecto en los grosores de la construcción bio-diseñadas por ingeniería. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas utilizando 2 ng/mL de bFGF, tuvieron grosores similares a los controles no tratados.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF más delgadas, indicaron que la matriz extracelular contenía menos proteína de matriz, menos glucosaminoglicanos, o ambos. La figura 15B muestra los resultados del análisis de respuesta de dosis bFGF en donde la acumulación de colágeno disminuyó, conforme incrementó el suplemento bFGF. Ya que las poblaciones de colágeno se forman en secuencias durante la producción de matriz extracelular (es decir, colágeno soluble en ácido reticulado en forma reversible), entonces el colágeno soluble en pepsina que es reticulado en forma irreversible debe ser aislado mediante reticulaciones de corte con pepsina, y posteriormente el colágeno soluble en SDS, el cual es altamente reticulado y no es soluble en ácido-norpepsina) , cada una de estas poblaciones de colágeno fueron extraídas de construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF y de control, es menor en forma relativa a los controles y existe una deficiencia especialmente significativa en la acumulación de colágeno soluble en pepsina (figura 15B). La heparina sola no afecta la acumulación de colágeno.
Se ensayaron en forma independiente cantidades de colágeno solubles en ácido y pepsina y se cuantif icaron utilizando un ensayo de colágeno Sircol en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería analizadas en la figura 15B. Ya que el colágeno soluble en SDS no es triple helicoidal, el ensayo Sircol no detecta esta clase de colágeno. La figura 15C muestra niveles relativos de colágeno tanto soluble en pepsina como en ácido (color negro) en forma relativa al colágeno total y otro colágeno (color gris). La cantidad combinada de colágeno soluble en ácido y pepsina en construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementado con 20 ng/mL o 100 ng/mL de bFGF, fue de 20% y 35%, respectivamente, de las cantidades de control.
Se llevó a cabo en forma subsecuente calorimetría de exploración diferencial (DSC) para determinar el número total de reticulaciones de proteína en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF relativas a los controles. El área pico en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF ya sea al momento de la siembra o después de 5 días en cultivo, disminuyeron o en cero en forma relativa a los controles suplementados con heparina sola, indicando menos reticulaciones en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF.
Además de los cambios en las cantidades de colágeno, el glucosaminoglican sulfatado (sGAG), el cual es responsable del enlace de los factores de crecimiento y ayudan a regular la hidratación de ECM, así como ácido hialurónico (HA), se acumularon en menores niveles en construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF relativas a los controles (figuras 15D y 15E). Los ensayos de manchado histológico confirmaron en forma independiente que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF fueron menos densas, contenían menos sGAG (manchado con azul Alcian), y contenían menos fibras elásticas (manchado van Gieson).
Las alteraciones en la composición de matriz extracelular originaron que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF, para cambiar a polvo cuando se deshidratan, indicando que dichas construcciones pueden ser fácilmente micronizadas mediante molido. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería producidas utilizando 20 ng/mL se desquebrajaron cuando se liofilizaron en un secador por congelación de temperatura controlada desquebrajados durante la liofilización, aunque los fragmentos permanecieron como unidades de control. Sin embargo, los fragmentos también fueron menos gruesos y significativamente más porosos que las unidades de control. Inmediatamente antes de la liofilización, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF se colocaron en un congelador a una temperatura de -80°C durante 2 horas. Se podrá apreciar que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF pueden mantenerse en un congelador en una temperatura que fluctúa de -10°C a -80°C en cualquier parte, desde 1 hora hasta 3 días sin desviarse del alcance de la presente invención. Como alternativa, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF pueden tomarse fuera del cultivo y colocarse directamente en el liof ilizador. Todas las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF se sometieron posteriormente a un ambiente de vacío menor a 200 mTorr en un aparato de liof ilización y se trataron durante 24 horas a una temperatura de 0°C. También se podrá apreciar que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería pueden someterse a un ambiente de vacío de entre 0 mTorr y 350 mTorr sin desviarse del alcance de la presente invención. En otra modalidad, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF pueden ser secadas con aire durante la noche a temperatura ambiente en lugar de tratarse en un liof ilizador.
Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería suplementadas con bFGF liofilizadas o en polvo secadas con aire, así como los controles, se micronizaron mediante molido, ya sea utilizando una maja y mortero a temperatura ambiente, o un molino de tejido en el cual se mantuvieron las construcciones congeladas en nitrógeno líquido. Se rehidrataron cantidades similares de construcciones molidas en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en un tubo de microcentrif ligación durante 10 minutos antes de observar la consistencia del fluido. Las construcciones suplementadas con bFGF rehidratadas fueron significativamente menos viscosas y flotaron más libremente que las muestras de control. Esto se tradujo en una capacidad mejorada de las construcciones suplementadas con bFGF rehidratadas, de pasada a través de una aguja de jeringa (es decir, pueden pasar a través de agujas de calibre 23 y calibre 27, pero no agujas de calibre 30, mientras que los controles no pueden pasar a través de ningún calibre de agujas de jeringa. Ya que el microscopio de exploración de electrones con una magnificación de 1000x ha determinado que las partículas en las construcciones suplementadas con bFGF molidas en forma relativa a los controles tienen tamaño similar, se considera que la viscosidad de las partículas de control impide su paso a través de las agujas de jeringa. Se considera en forma adicional que se puede lograr un tamaño de partícula más fino o consistente utilizando molinos de tejido más finos, de modo que las construcciones suplementadas con bFGF rehidratadas, pueden pasar a través de agujas de jeringa con calibre aún más fino.
Ejemplo 9: Andamios de Seda Porosa para Utilizarse con las Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Se fabricaron andamios a base de seda porosa a partir de fibra de seda desgomada de una larva de gusano de seda Bombyx morí. Las fibras de seda se disolvieron en 9 M de una solución LiBr en 6 a 10% en peso de concentración durante 6 a 10 horas mientras se agitó bajo condiciones ambientales. La solución se dializó contra agua utilizando una membrana de diálisis de celulosa durante 3 días, cambiando el agua cada 10 horas. La solución acuosa de fibroína se concentró manteniendo la solución en una membrana de diálisis de celulosa. Las porciones insolubles se eliminaron mediante centrifugación en 20,000 rpm durante 30 minutos. La concentración final de la solución de seda fue de aproximadamente 7.5 a 8%.
La solución de reserva de seda posteriormente se utilizó para preparar una solución de trabajo de seda con una concentración de 6% a 8%. La solución de trabajo se utilizó para elaborar un andamio de seda porosa. La solución de operación se mezcló inicialmente con una solución de etanol del 1 al 6% con diversas proporciones de volumen para elaborar las concentraciones de seda finales que fluctúan de 3% a 5% y las concentraciones finales de etanol que fluctúan de 0.5% a 2%. La mezcla se vertió subsecuentemente en un plato de petri y se colocó en un congelador a una temperatura de -20°C durante al menos 10 horas. Después de que transcurrieron las 10 horas, la solución de seda se colocó a temperatura ambiente y se dejó descongelar, dando como resultado un andamio de seda porosa. Los andamios de seda descongelados fueron enjuagados en forma subsecuente en agua de RODI durante 3 días para eliminar el residuo del solvente. Después de enjuagarse, se puede eliminar de la superficie de los andamios una capa delgada superior. Los andamios de seda pueden ser esterilizados mediante autoclave del andamio final, o utilizando una solución de seda de autoclave mezclada con una solución de etanol filtrada estéril, o utilizando una solución de seda filtrada estéril mezclada con una solución de etanol filtrada estéril .
Con el objeto de mejorar la formación de vaso sanguíneo in vivo, los andamios de seda porosa se pueden enjuagar en proteínas tales como factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento de hepatocito/factor de dispersión (HGF/SF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y otros tipos de factores pro-angiogénicos. En un aspecto, se reconstituyeron 50 microgramos de polvo PDGF-BB humano recombinante en 0.5 mi 4mM de HCI, y posteriormente se agregaron con 0.5 mi adicionales de solución salina amortiguada por fosfato (PBS). La solución de 1 mL resultante se utilizó para enjuagar un andamio de seda de 6x6 mm antes del implante en un herida con grosor total en ratones desprotegidos y normales. Además, se reconstituyeron 50 microgramos de factor de crecimiento de fibroblasto básico humano recombinante (bFGF) en 1 mL de PBS. Se enjuagaron andamios de seda porosa de 6x6 mm en la solución de 1 mL de bFGF durante 5 minutos antes del implante en una herida de grosor total en ratones desprotegidos y normales. Asimismo, se reconstituyeron 50 microgramos de PDGF-BB humano recombinante en 0.5 mi 4m de HCL y subsecuentemente se mezclaron con 0.5 ml_ de bFGF humano recombinante reconstituido con PBS. Los andamios de seda porosa fueron enjuagados en 1 ml_ de solución restante durante cinco minutos antes del implante en una herida de grosor total en ratones desprotegidos y normales. Además, los andamios de seda pueden ser cultivados con células en un medio de cultivo definido químicamente que comprende suplemento con 25 ng/ml de PDGF el día 5, 25 ng/ml de bFGF el día 10 y 25 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocito (HGF) el día 15. Como alternativa, el medio de cultivo definido químicamente comprende suplemento con 25 ng/ml de bFGF el día 5, 25 ng/ml de PDGF el día 10, y 25 ng/ml de bFGF el día 15 ó 25 ng/ml de pDGF el día 5, 25 ng/ml de bFGF el día 10 y 25 ng/ml de HGF el día 15. Asimismo, el medio de cultivo acondicionado aplicado a las construcciones bio-diseñadas por ingeniería el día 11 del ejemplo 10, puede ser concentrado (por ejemplo 100 veces) y los andamios de seda pueden ser enjugados en el medio acondicionado.
En una modalidad, los fibroblastos dérmicos humanos se sembraron en el andamio de seda porosa. En forma específica, los fibroblastos dérmicos humanos fueron sembrados inicialmente en aproximadamente 30 x 106 y se cultivaron en un medio químicamente definido durante 11 días. Como alternativa, se podrá apreciar que los HDFs se pueden sembrar en la parte superior del andamio de seda en una densidad de siembra inicial de aproximadamente 5 x 106. El medio químicamente definido comprendió: una mezcla base de 3:1 de DMEM, medio de Hams F-12 (Quality Biologies, Gaithersburg, MD), 4 mM de GlutaMAX (Gibco BRL, grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology , Lake Placid, NY), 1 x 10" M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat. #02400 grado ACS), 1 x 10~4 M de o-fosf oril-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 ug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 13.5 pg/mL de triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de L-ácido ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 ug/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 ug/ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO), 20 ng/ml de TGF-alfa y 10 nM PGE2. Tal como se puede apreciar en la figura 16, los fibroblastos dérmicos humanos tuvieron la capacidad de migrar a través de los andamios de seda y ser colocados de manera uniforme a través de toda la lámina de seda.
Se pueden elaborar diversas modificaciones para construir mediante ingeniería las características deseadas en las construcciones bio-diseñadas por ingeniería resultantes cultivadas en los andamios de cera porosa.
En otra modalidad, los andamios de seda que tienen HDFs cultivados, se desvitalizaron enjuagando los andamios de seda que comprenden HDFs cultivados con agua WFI. Para indicaciones que requieren una respuesta angiogénica mejorada, los andamios de seda que tienen un diámetro de poro promedio de 50 a 100 mieras, sembrados con HDFs, y que dan como resultado construcciones bio-diseñadas por ingeniería desvitalizadas con agua WFI, han mostrado ser un tratamiento efectivo. Más específicamente, la figura 17(d) muestra células endoteliales de la vena umbilical humana manchadas en la parte superior de los andamios de seda con fibroblastos desvitalizados in vitro. Las células endoteliales manchadas forman túbulos alineados en la parte superior de los andamios de seda, una indicación de que los andamios de seda con fibroblastos desvitalizados permiten una adhesión y persistencia de célula endotelial efectiva.
En otra modalidad, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería que contienen andamios de seda porosa y HDFs desvitalizados, fueron reticuladas en forma subsecuente con EDC con el objeto de elaborar una construcción de tejido bio-diseñadas por ingeniería con persistencia in vivo mejorada (por ejemplo, en una cama de herida de quemadura).
Los andamios de seda también pueden ser impregnados con moléculas útiles. Los andamios de seda fueron sumergidos en un medio de cultivo definido químicamente, acondicionado previamente recolectados (post-cultivo) de construcciones de tejido bio-diseñadas por ingeniería producidas en forma endógena para mejorar los andamios de seda. En forma más específica, se cultivaron aproximadamente 30 millones de fibroblastos dérmicos humanos en la parte superior de una membrana porosa de 0.4 micrómetros y se cultivaron en un medio definido químicamente durante 11 días. El medio definido químicamente comprende: una mezcla a base de 3:1 de DMEM, un medio de Hams F-12 (Quality Biologies, Gaithersburg, MD), 4 mM de GlutaMAX (Gibco BRL, grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 1 x 10~4 M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat. #02400 ACS grade), 1 x 10"4 M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 ug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 13.5 pM de triyodotironina (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de L-ácido ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 ug/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 ug/ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO), 20 ng/ml de TGF-alfa y 10 nM de PGE2. Después de 11 días en cultivo, el medio acondicionado fue recolectado, y los andamios de seda fueron enjuagados en el medio acondicionado durante 12 horas.
También se puede aplicar un soporte de silicona a uno o ambos lados del andamio de seda para actuar como una barrera para evitar la infección, permitiendo al mismo tiempo el transporte de moléculas gaseosas, tal como oxígeno. Por ejemplo, los andamios de seda con fibroblastos dérmicos humanos desvitalizados se trataron con un recubrimiento de silicona. El recubrimiento de silicona fue optimizado variando la proporción de concentración de monómero a concentración de reticulador durante la polimerización de la silicona. La proporción del monómero al reticulador, puede fluctuar de aproximadamente 5 a 1 a aproximadamente 20 a 1. Para una esponja de seda húmeda, la proporción óptima de monómero reticulador es de aproximadamente 5 a 1. Además, la construcción bio-diseñadas por ingeniería producida por sí misma puede ser recubierta subsecuentemente con un soporte de silicona.
Se puede lograr el aumento de la migración de célula epitelial bañando los andamios de seda en una solución de solución salina amortiguada con fosfato y laminina 5 durante aproximadamente 1 hora. Dependiendo de perfil de porosidad del andamio de seda, el andamio puede ser sumergido en la solución de laminina 5 durante hasta 4 horas. El andamio de seda con laminina 5 conjugada puede emplearse in vivo para mejorar la migración de célula epitelial.
Ejemplo 10: Construcciones en Capas de HDFs y MSCs Se sembraron fibroblastos de prepucio neonatal humano (originados en Organogénesis, Inc. Cantón, MA) en un frasco tratado con cultivo de 5 x 105 células/162 cm2 tejido (Costar Corp., Cambridge, MA, cat # 3150) y se crecieron en un medio de cultivo. El medio de crecimiento consistió en: un medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (formulación con alto contenido de glucosa, sin L-glutamina, BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con 10% de suero de becerro recién nacido (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) y 4 mM de L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células se mantuvieron en un incubador en 37 ± 1°C con una atmósfera de 10 ± 1% C02. El medio se reemplazó con un medio preparado recientemente cada dos o tres días. Después de 8 días en cultivo, las células habían crecido hasta la confluencia, esto es, las células habían formado una monocapa empaquetada a lo largo de la parte inferior del frasco de cultivo de tejido, y el medio se aspiró del frasco de cultivo. Para enjuagar la monocapa, se agregó solución salina amortiguada por fosfato filtrada estéril a la parte inferior de cada frasco de cultivo y posteriormente se aspiró de los frascos. Las células fueron liberadas de frasco agregando 5 mL de tripsina-glutamina de verseno (BioWhittaker, Walkersville, MD) a cada frasco y meciéndose suavemente para asegurar la cobertura total de la monocapa. Los cultivos se regresaron al incubador. Tan pronto como las células fueron liberadas, se agregaron 5 mi de SBTI (Inhibidor de Tripsina de Frijol Soya) a cada frasco y se mezclaron con la suspensión para detener la acción de la tripsina-verseno. La suspensión celular se eliminó de los frascos y se dividió de manera equitativa entre tubos de centrifugación cónica, estériles. Las células se recolectaron mediante centrifugación en aproximadamente 800 a 1000 x g durante 5 minutos.
Las células se resuspend ieron utilizando un medio fresco hasta una concentración de 3.0 x 106 células/ml, y se sembraron en insertos tratados con cultivo de tejido con un diámetro de 24 mm, tamaño de poro de 0.4 mieras (TRANSWELL®, Corning Costar), en una charola de seis depósitos en una densidad de 1.0 x 106 células/inserto. Se podrá apreciar que si se utiliza un inserto de 75 mm, se debe emplear una densidad de siembra celular de 10 x 1 O6 células. Si se utiliza un inserto con 24 mm de diámetro, se debe emplear un inserto de aproximadamente 1 x 106 células/24 mm. Se podrá apreciar que la cantidad de HUCPVC se agregó a la suspensión como un porcentaje de la cantidad de fibroblastos. Por ejemplo, para elaborar una construcción en capas de 24 mm que contiene 50% HUCPVC, 5 x 105 HUCPVC se sembraron en la parte superior los fibroblastos de prepucio neonatal humano 1.0 x 106 sembrados previamente en la parte superior de la membrana porosa. Tanto los fibroblastos como las HUCPVC fueron sumergidos en 3 mi de un medio de producción de matriz, que comprende: Las células se mantuvieron en una incubadora en 37 ± 1°C con una atmósfera de 10 ± 1% C02 y se cultivaron en el medio de producción de matriz durante 11 días con cambios del medio elaborados en forma periódica, cada 3 a 4 días.
Se incrustaron en parafina las muestras fijadas en formalina y se perforaron secciones de 5 micrómetros y posteriormente se mancharon con hematoxilina-eosina (H&E) de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Utilizando rodajas manchadas con H&E, se realizaron las medidas de grosor para diez campos microscópicos elevados en forma aleatoria utilizando una pieza óptica de 10X cargada con un retículo de 10 mm/100.
Ejemplo 11: Producción de Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Mediante Mezcla en Adiciones de HDFs y MSCs Se formó una construcción que tiene una capa de matriz extracelular producida mediante fibroblastos y HUCPVC en un sistema de medio de cultivo químicamente definido en forma total. Se sembraron fibroblastos dérmicos neonatales humanos 1 x 10s en una población de célula mezclada con 9 x 1 O5 células progenitoras mesenquimales en un inserto de cultivo de 24 mm. Se podrá apreciar que la densidad de siembra inicial de los fibroblastos puede fluctuar de aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 9 x 105, y que la densidad de siembra inicial de las células progenitoras mesenquimales también puede fluctuar de aproximadamente 1 x 10s hasta aproximadamente 9 x 105 dentro del alcance de la presente invención. Se obtuvieron HUCPVC en el pasaje 2, y se expandieron al pasaje 7 antes de sembrarse inicialmente al momento del inserto de cultivo. Se podrá apreciar que las HUCPVC se pueden utilizar en cualquier otro número de pasajes siempre que se conserve la multipotencialidad de las células.
El medio de producción de matriz químicamente definida contenía: Se cultivaron fibroblastos y células progenitoras mesenquimales en el medio de producción de matriz durante 11 días, con cambios del medio elaborados periódicamente, cada 3 a 4 días, dando como resultado una matriz extracelular producida en forma endógena.
Ejemplo 12: Producción de una Capa Epidérmica en Construcciones Bio-diseñadas por Ingeniería Se sembraron células progenitoras epidérmicas humanas (HEP's; queratinocitos) en la parte superior de las construcciones bio-diseñadas por ingeniería descritas en cualesquiera de los ejemplos 1 a 8. Se sembraron las HEP después de que las construcciones bio-diseñadas por ingeniería han estado en cultivo durante aproximadamente 11 días. Se prefiere una densidad de sembrado de aproximadamente 3.5 x 105 a 1.2 x 106 células/construcción, sin embargo también se contemplan de acuerdo con la presente invención, otras densidades de sembrado inicial. El día 11, las construcciones de piel con HEP, se trataron con un medio que contiene aproximadamente: En el día 13, se indujo la diferenciación de los HEP utilizando un medio de diferenciación que contiene lo siguiente: En el día 15, se cambió la formulación del medio para inducir la cornificacion de la capa epitelial en desarrollo en un medio que contiene aproximadamente: Se cambió el medio de cornificacion cada 2 a 3 días. Las construcciones bio-diseñadas por ingeniería se maduraron y mantuvieron durante de 22 a 35 días y se alimentaron con un medio de mantenimiento con cambios cada 2 a 3 días con un medio de mantenimiento fresco que contiene: Cuando las construcciones bio-diseñadas por ingeniería están completamente formadas, las construcciones bio-diseñadas por ingeniería cultivadas exhiben una capa bio-diseñadas por ingeniería mezclada de proteínas de matriz extracelular producidas en forma endógena, fibroblastos y/o células progenitoras mesenquimales con una capa epitelial diferenciada colocada en la parte superior de la construcción bio-diseñadas por ingeniería.
Ejemplo 13: Grabado de Construcción de Tejido Bio-diseñadas por Ingeniería Para Mejorar la Infiltración Celular Se pueden modificar las construcciones de tejido bio-diseñadas por ingeniería para aumentar la adhesión celular y la infiltración celular dentro de la red profunda de los poros en las construcciones de tejido producidas en forma endógena. Dichas construcciones producidas en forma endógena pueden ser producidas sembrando inicialmente aproximadamente 30 millones de fibroblastos dérmicos humanos en la parte superior de una membrana porosa de 0.4 micrómetros y cultivada en un medio químicamente definido durante 11 días. El medio químicamente definido comprende: una mezcla a base de 3:1 de DMEM, medio de Hams F-12 (Quality Biologies, Gaithersburg , MD), 4 mM de GlutaMAX (Gibco BRL, grand Island, NY) y aditivos: 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 1 x 10"4 M de etanolamina (Fluka, Ronkonkoma, NY cat. #02400 ACS grade), 1 x 10"4 M de o-fosforil-etanolamina (Sigma, St. Louis, MO), 5 ug/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM de triyodotironína (Sigma, St. Louis, MO) y 6.78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, Wl), 50 ng/ml de L-ácido ascórbico (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0.2 ug/ml de L-prolina (Sigma, St. Louis, MO), 0.1 ug/ml de glicina (Sigma, St. Louis, MO), 20 ng/ml de TGF-alfa y 10 nM de PGE2. Después de 11 días de cultivo, la superficie de las construcciones de tejido bio-diseñadas por ingeniería se pueden grabar para eliminar los residuos celulares. Esto se puede realizar aplicando una solución de ácido acético al 1% con el objeto de eliminar una capa delgada de colágeno de la superficie superior de la construcción bio-diseñadas por ingeniería. El grabado puede permitir una infiltración celular mejorada, lo cual puede ser conveniente en una indicación de quemadura.

Claims (74)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción bio-diseñada por ingeniería que comprende células madre mesenquimales crecidas bajo condiciones para producir una capa de matriz extracelular, la cual es sintetizada y ensamblada mediante células madre mesenquimales.
2. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque las células madre mesenquimales se derivan de médula ósea, cordón umbilical, placenta, líquido amniótico, músculo, tejido adiposo, huesos, tendones o cartílagos.
3. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque las células madre mesenquimales son células madre mesenquimales de cordón umbilical.
4. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque las células madre mesenquimales de cordón umbilical son aisladas de sangre de cordón umbilical, subendotelio de vena umbilical o jalea de Wharton.
5. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque las células madre mesenquimales de cordón umbilical son células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVC).
6. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizada porque las células madre mesenquimales son células madre mesenquimales humanas.
7. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizada porque las células madre mesenquimales son células transfectadas, células recombinantes o células genéticamente diseñadas por ingeniería.
8. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizada porque comprende además células que no son células madre mesenquimales, en donde opcionalmente las no células madre mesenquimales son fibroblastos.
9. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque los fibroblastos se derivan de tejido seleccionado del grupo que consiste en prepucio macho de neonato, dermis, tendón, pulmón, uretra, cordón umbilical, estroma córnea, mucosa oral e intestino.
10. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizada porque los fibroblastos son fibroblastos humanos.
11. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizada porque las células madre mesenquimales y fibroblastos se mezclan en adiciones.
12. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizada porque las células madre mesenquimales y fibroblastos están presentes en al menos dos capas separadas.
13. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la matriz extracelular tiene al menos 60 mieras de grosor.
14. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería tiene poros dentro del rango de 10 mieras y 150 mieras de diámetro, en donde opcionalmente los poros están dentro del rango de entre 50 mieras y 100 mieras o de entre 80 mieras y 100 mieras.
15. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería tiene una Fmax promedio de al menos 0.4 Newtons.
16. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería tiene una resistencia a la tensión última (UTS) de al menos 0.4 Megapascales.
17. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería tiene una tolerancia a la deformación plástica de al menos 0.4 veces la longitud inicial.
18. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17, caracterizada porque las células de la construcción bio-diseñada por ingeniería están desvitalizadas.
19. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería es descelularizada.
20. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería es deshidratada.
21. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20, caracterizada porque la matriz extracelular es reticulada con un agente de reticulación.
22. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizada porque el agente de reticulación se selecciona del grupo que consiste en: carbodiimidas, genipina, transglutaminasa, ribosa y otros azúcares, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), agentes oxidativos y luz ultravioleta (UV).
23. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería comprende además uno o más de Hialuronan, CSF-3, Vitronectina, heparina, NCAM1, CXCL1, IL-6, IL-8, VEGFA, VEGFC, PDGF , PECAM1, CDH5, ANGPT1, MMP2, TI P1 y TIMP3.
24. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 23, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería comprende además un agente antimicrobiano, un fármaco farmacéutico, un factor de crecimiento, una citocina, un péptido, o una proteína.
25. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 24, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería se contrae en al menos una disminución del 50% en área de superficie, liberando la construcción bio-diseñada por ingeniería del substrato de cultivo.
26. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 25, caracterizada porque comprende además un andamio de fibroína de seda porosa en el cual se cultivan las células madre mesenquimales que crecen bajo condiciones para producir una capa de matriz extracelular.
27. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizada porque el andamio de fibroína de seda porosa tiene poros dentro del rango de entre 10 mieras y 150 mieras de diámetro.
28. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizada porque el andamio de fibroína de seda porosa tiene dos lados y está recubierto con silicona en al menos un lado.
29. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 26 a la 28, caracterizada porque el andamio de fibroína de seda porosa comprende además un agente antimicrobiano, un fármaco farmacéutico, un factor de crecimiento, una citocina, un péptido o una proteína.
30. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería comprende además un medio que aumenta el adhesi o.
31. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 30, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería está esterilizada en forma terminal.
32. Una construcción bio-diseñada por ingeniería de capas múltiples, caracterizada porque se unen juntas al menos dos construcciones bio-diseñadas por ingeniería tal como se describen en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31.
33. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizada porque las construcciones bio-diseñadas por ingeniería unidas están reticuladas con un agente de reticulación.
34. Un método para producir una construcción bio-diseñada por ingeniería que tiene una matriz extraceluiar con un tamaño de poro promedio incrementado, caracterizado porque comprende: a) sembrar células con la capacidad de sintetizar componentes de matriz extraceluiar dentro de un envase de cultivo; b) cultivar las células para sintetizar, secretar y organizar componentes de la matriz extraceluiar; c) liofilizar al menos los componentes de matriz extraceluiar resultantes, en donde la liofilización comprende congelar los componentes de matriz extraceluiar a una temperatura de congelación final, y secar subsecuentemente los componentes de matriz extraceluiar, para producir de esta forma una construcción de matriz extraceluiar bio-diseñada por ingeniería que tiene una matriz extracelular con un tamaño de poro promedio incrementado.
35. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el tamaño de poro promedio de la matriz extracelular porosa, se incrementa incrementando la temperatura de congelación final.
36. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 34 ó 35, caracterizado porque el tamaño de poro promedio de la construcción bio-diseñada por ingeniería, incrementa de al menos 10 mieras hasta al menos 50 mieras conforme incrementa la temperatura de congelación final de aproximadamente -40°C hasta aproximadamente -10°C.
37. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 36, caracterizado porque las células que producen la matriz extracelular son derivadas de prepucio de macho neonato, dermis, tendón, pulmón, cordones umbilicales, cartílago, uretra, estroma cornea, mucosa oral, intestino, médula ósea, placenta, líquido amniótico, músculo, tejido adiposo o huesos.
38. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 37, caracterizado porque las células que producen la matriz extracelular son fibroblastos dérmicos humanos o células perivasculares de cordón umbilical humano.
39. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 38, caracterizado porque las células que producen la matriz extracelular son células transf ectadas, células recombinantes o células genéticamente diseñadas por ingeniería.
40. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 38, caracterizado porque la construcción bio-diseñada por ingeniería comprende al menos un tipo de célula, además del tipo de célula que produce la matriz extracelular.
41. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque se selecciona al menos un tipo de célula adicional del grupo que consiste en fibroblastos, células estromales y células madre mesenquimales.
42. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 40 ó 41, caracterizado porque se mezclan en adiciones las células que producen la matriz extracelular y al menos un tipo de célula adicional.
43. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 42, caracterizado porque las células que producen la matriz extracelular y al menos un tipo de célula adicional, están presentes en al menos dos capas separadas.
44. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 43, caracterizado porque las células de cada tipo celular se siembran en una densidad combinada de entre 1 x 105 células/cm2 a 6.6 x 105 células/cm2.
45. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 43, caracterizado porque las células de cada tipo celular se siembran en una densidad combinada con una confluencia mayor al 100%.
46. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 45, caracterizado porque la matriz extracelular tiene al menos 60 mieras de grosor antes de la liofilización.
47. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 46, caracterizado porque las células de la construcción bio-diseñada por ingeniería son desvitalizadas o descelularizadas antes de la liofilización.
48. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 47, caracterizado porque se alcanza una temperatura de congelación final de aproximadamente -40°C, para producir tamaños de poro promedio de al menos 10 mieras.
49. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 48, caracterizado porque se alcanza una temperatura de congelación final de aproximadamente -10°C, para producir tamaños de poro promedio de al menos 30 mieras.
50. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 49, caracterizado porque la matriz extracelular de la construcción bio-diseñada por ingeniería, se retícula con un agente de reticulación.
51. El método tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizado porque el agente de reticulación se selecciona del grupo que consiste en: carbodiimidas, genipina transglutaminasa, ribosa y otros azúcares, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), agentes oxidativos, dehidrotérmico (DHT) y luz ultravioleta (UV).
52. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 51, caracterizado porque la construcción bio-diseñada por ingeniería se contrae en una disminución de al menos 50% en área de superficie, liberando la construcción bio-diseñada por ingeniería del substrato de cultivo antes de la liofilización.
53. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 52, caracterizado porque comprende además cultivar las células que producen la matriz extracelular en un andamio de fibroína de seda porosa.
54. El método tal como se describe en la reivindicación 53, caracterizado porque el andamio de fibroína de seda porosa tiene poros dentro del rango de entre 10 mieras y 150 mieras de diámetro.
55. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 53 ó 54, caracterizado porque el andamio de fibroína de seda porosa tiene dos lados, y está recubierto con silicona en al menos un lado.
56. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 55, caracterizada porque el andamio de fibroína de seda porosa comprende además un agente antimicrobiano, un fármaco farmacéutico, un factor de crecimiento, una citocina, un péptido o una proteína.
57. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 56, caracterizado porque se unen juntas al menos construcciones bio-diseñadas por ingeniería.
58. El método tal como se describe en la reivindicación 57, caracterizado porque el enlace ocurre a través de un medio que aumenta la adhesión o reticulando con un agente de reticulación.
59. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 58, caracterizado porque la construcción bio-diseñada por ingeniería es esterilizada en forma terminal después de la liofilización.
60. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 59, caracterizado porque las células se cultivan en un medio químicamente definido.
61. El método tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque el medio químicamente definido está libre de extractos de órgano o tejido animal indefinidos.
62. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 60 ó 61, caracterizado porque el medio químicamente definido comprende TGF-alfa.
63. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 62, caracterizado porque las células se cultivan en una membrana porosa.
64. El método tal como se describe en la reivindicación 63, caracterizado porque la membrana porosa comprende poros que tienen un tamaño menor a 6 mieras.
65. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 34 a la 64, caracterizado porque el rango para alcanzar la temperatura de congelación final, se disminuye para incrementar la uniformidad de los tamaños de poro promedio.
66. El método tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque el rango para alcanzar la temperatura de congelación final es de entre 0.1°C y 0.5°C por minuto.
67. Una construcción bio-diseñada por ingeniería que comprende: células que producen una matriz extracelular; una matriz extracelular endógena producida a través de las células que producen la matriz extracelular; en donde las células que producen la matriz extracelular son desvitalizadas.
68. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería tiene poros dentro del rango de entre 10 mieras y 150 mieras de diámetro, en donde opcionalmente los poros están dentro de un rango de entre 50 mieras y 100 mieras, o entre 80 mieras y 100 mieras.
69. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 68, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería se forma a través de células cultivadas en un medio químicamente definido.
70. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 69, caracterizada porque el medio químicamente definido comprende TGF-alfa.
71. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 69 a la 70, caracterizada porque el medio químicamente definido comprende además un factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF).
72. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 71, caracterizada porque la matriz extracelular de la construcción bio-diseñada por ingeniería es reticulada con un agente de reticulación.
73. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en la reivindicación 72, caracterizada porque el agente de reticulación se selecciona del grupo que consiste en: carbodiimidas, genipina transglutaminasa, ribosa y otros azúcares, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), agentes oxidativos, dehidrotérmico (DHT) y luz ultravioleta (UV).
74. La construcción bio-diseñada por ingeniería tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 67 a la 73, caracterizada porque la construcción bio-diseñada por ingeniería está en forma pulverizada.
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