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MX2012008153A - Metodos para predecir la respuesta a terapia de cancer de mama triple negativo. - Google Patents

Metodos para predecir la respuesta a terapia de cancer de mama triple negativo.

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MX2012008153A
MX2012008153A MX2012008153A MX2012008153A MX2012008153A MX 2012008153 A MX2012008153 A MX 2012008153A MX 2012008153 A MX2012008153 A MX 2012008153A MX 2012008153 A MX2012008153 A MX 2012008153A MX 2012008153 A MX2012008153 A MX 2012008153A
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MX
Mexico
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expression
level
vegfr2
her1
kit
Prior art date
Application number
MX2012008153A
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English (en)
Inventor
Xinjun Liu
Phillip Kim
Richard Kirkland
Tani Lee
Belen Ybarrondo
Sharat Singh
Original Assignee
Nestec Sa
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Publication date
Application filed by Nestec Sa filed Critical Nestec Sa
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Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar los niveles de expresión y/o activación de componentes de vías de transducción de señales en células tumorales, tales como células de tumor de mama metastásico triple negativo. Información sobre los niveles de expresión y/o activación de componentes de vías de transducción de señales derivada del uso de la presente invención puede usarse para el diagnóstico, pronóstico de cáncer y en el diseño de tratamientos para el cáncer.

Description

METODOS PARA PREDECIR LA RESPUESTA A TERAPIA DE CÁNCER PE MAMA TRIPLE NEGATIVO Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/294,433, presentada el 12 de enero de 2010, solicitud provisional de E.U.A. No. 61/325,624, presentada el 19 de abril de 2010, solicitud provisional de E.U.A. No. 61/328,602, presentada el 27 de abril de 2010 y solicitud provisional de E.U.A. No. 61/351/838, presentada el 4 de junio de 2010, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Antecedentes de la invención El proceso de transducción de señales en células es responsable de una variedad de funciones biológicas que incluyen división y muerte celular, metabolismo, activación de células inmunes, neurotransmisión y percepción sensorial por citar sólo unos cuantos. En consecuencia, las alteraciones en la transducción de señales normal en células pueden llevar a un número de estados de enfermedad tales como diabetes, enfermedad cardiaca, autoinmunidad y cáncer.
Una vía de transducción de señales bien caracterizada es la vía de cinasa MAP, la cual es responsable de transducir la señal proveniente del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la promoción de proliferación celular en células (véase figura 1 de publicación de PCT No. WO2009/108637, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. EGF se une a una tirosina cinasa enlazada a receptor de transmembrana, el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el cual es activado por la unión de EGF. La unión de EGF a EGFR activa la actividad tirosina cinasa del dominio citoplásmico del receptor. Una consecuencia de esta activación de cinasa es la autofosforilación de EGFR en residuos de tirosina. Los residuos de tirosina fosforilados en el EGFR activado proporcionan un sitio de acoplamiento para la unión de proteínas adaptadoras que contienen dominio SH2 tales comoGRB2. En su función como un adaptador, GRB2 se une además a un factor de intercambio de nucleótidos de guanina, SOS, por medio de un dominio SH3 en GRB2. La formación del complejo de EGFR-GRB2-SOS lleva a la activación SOS de un factor de intercambio de nucleótidos de guanidina que promueve la remoción de GDP de Ras. Después de la remoción de GDP, Ras se une a GTP y se activa.
Después de la activación, Ras se une a y activa la actividad proteína cinasa de cinasa RAF, una proteína cinasa específica de serina/treonina. Lo que sigue es la activación de una cascada de proteínas cinasa que lleva a la proliferación celular. En contorno, la cinasa Raf fosforila y activa después MEK, otra serina/treonina cinasa. MEK activada fosforila y activa proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK). Entre los objetivos para fosforilación adicional por MAK están la proteína S6 cinasa ribosómica 40 (RSK). La fosforilación de RSK por MAPK se traduce en la activación de RSK, el cual a su vez fosforila proteína S6 ribosómica. Otro objetivo conocido de MAPK es el proto-oncogén, c-Myc, un gen importante para proliferación celular, que es mutado en una variedad de cánceres. MAPK fosforila y activa también otra proteína cinasa, MNK, la cual a su vez fosforila el factor de transcripción, CREB. Indirectamente, MAPK también regula la transcripción del gen Fos, el cual codifica aún para otro factor de transcripción implicado en proliferación celular. Al alterar los niveles de actividades de estos factores de transcripción, MAPK transduce la señal extracelular original proveniente de EGF en transcripción alterada de genes que son importantes para la progresión del ciclo celular.
Dado el papel central que las vías de transducción de señales juegan en el crecimiento celular, no es sorprendente que muchos cánceres se originen como resultado de mutaciones y otras alteraciones en componentes de transducción de señales que se traducen en activación aberrante de vías de proliferación celular. Por ejemplo, la sobre-expresión o hiperactividad de EGFR ha estado asociada con un número de cánceres, incluyendo glioblastoma multiforme, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Esto ha incentivado el desarrollo de terapéuticos anticáncer dirigidos contra EGFR, incluyendo gefitinib y erlotinib para cáncer pulmonar y cetuximab para cáncer de colon.
Cetuximab es un ejemplo de un inhibidor de anticuerpo monoclonal, el cual se une al dominio de unión al ligando extracelular de EGFR, de esta manera evitando la unión de ligandos que activan la tirosina cinasa EGFR. En contraste, gefitinib y erlotinib son moléculas pequeñas que inhiben la tirosina cinasa EGFR ubicada intracelularmente, en ausencia de actividad cinasa, EGFR es incapaz de sufrir autofosforilación en residuos de tirosina, lo cual es un prerrequisito para la unión de proteínas adaptadoras hacia el extremo 3', tales como GRB2. Al detener la cascada de señalización en células que se basan en esta vía para el crecimiento, se disminuye la proliferación y migración de tumores.
Además, otros estudios han demostrado que aproximadamente 70% de los melanomas humanos y una fracción más pequeña de otros tumores tienen una mutación por punto (V599E) en el gen Raf que lleva a activación persistente de la vía MAPK (véase, por ejemplo, Davies et al. Nature, 417:949-954 (2002)). Estos resultados sugieren que las mutaciones en particular en vías de transducción de señales particulares pueden ser características de tipos particulares de tumores y que estas vías de transducción de señales alteradas y específicas podrían ser un objetivo promisorio para intervención quimioterapéutica.
Dado que diferentes tratamientos contra el cáncer, particularmente quimioterapia contra el cáncer, pueden funcionar ya sea directa o indirectamente por medio ya sea de bloquear o activar las vías de transducción de señales celulares que están implicadas en proliferación o muerte celular, respectivamente, la actividad de una vía de transducción de señales dada en una forma particular de cáncer puede servir como un buen indicador de la eficacia de varios tratamientos para el cáncer. En consecuencia, además de satisfacer otras necesidades, la presente invención proporciona métodos para predecir y evaluar la efectividad de terapias anticáncer potenciales para un paciente individual. De esta forma, la presente invención proporciona métodos para ayudar a un médico a seleccionar una terapia para cáncer adecuada con la dosis correcta y en el momento correcto para cada paciente.
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar el estado (por ejemplo, niveles de expresión y/o activación) de componentes de vías de transducción de señales en células tumorales (por ejemplo, células de tumor de mama triple negativas). Información sobre los estados de expresión y/o activación de componentes de vías de transducción de señales derivado de la práctica de la presente invención se puede usar para el diagnóstico y pronóstico de cáncer, y en el diseño de tratamientos para el cáncer.
En aspectos particulares, la presente invención proporciona marcadores moleculares (biomarcadores) que hacen posible la determinación o predicción de si un cáncer particular puede responder o es probable que responda favorablemente a uno o más fármacos anticáncer tales como, por ejemplo, una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel (por ejemplo, Abraxane® o nabP) ("terapia triple").
Como se describe en la presente, se ha encontrado sorprendentemente que los biomarcadores tales como VEGFR2, c-KIT, HER1 e IGF-1 R son particularmente útiles para determinar o predecir la sensibilidad, eficacia o respuesta de células tumorales tales como células tumorales de mama triple negativas a terapia anticáncer tal como terapia triple.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer, el método comprende: a) lisar la célula tumoral para producir un extracto celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o lGF-1 R, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia indica que la célula tumoral es sensible al fármaco anticáncer.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en la determinación o predicción de la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la determinación o predicción de la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer, el método comprende: (a) lisar una célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo para producir un estrato celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R de referencia, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF-1 R en el estrato celular en comparación con el nivel de expresión de referencia es predictiva de respuesta a terapia con el fármaco anticáncer.
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en determinar o predecir la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la determinación o predicción de la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para monitorear la respuesta a terapia con un fármaco anticáncer en un sujeto que tiene un tumor de mama triple negativo y que recibe un fármaco anticáncer, el método comprende: (a) lisar una célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo para producir un estrato celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R de referencia o con un nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en un momento anterior durante la terapia; y (d) determinar si la terapia con el fármaco anticáncer debe ser continuada o ajustada con base en la comparación en la etapa (c).
En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en monitorear la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar el monitoreo de la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer. En ciertas modalidades, el ajuste de terapia en la etapa (d) comprende cambiar una dosis subsecuente del fármaco anticáncer o seleccionar un fármaco anticáncer alternativo.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán aparentes para alguien de capacidad en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y figuras.
Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra los diseños de disposición de formatos de portaobjeto ejemplares para analizar niveles de HER1 y HER2 fosforilados y totales.
La figura 2 muestra un esquema de un ensayo de proximidad ejemplar para detectar HER1 fosforilado. GO, glucosa oxidasa; HRP, peroxidasa de rábano.
La figura 3 muestra un esquema del Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER), conocido también como el Inmunoensayo de Proximidad Colaborativo (COPIA). Cuando proteínas objetivo son unidas a anticuerpos de captura específicos impresos sobre superficie de nitrocelulosa después de incubar con lisado celular, proteínas no objetivo no unidas son removidas del portaobjetos. Uno de los anticuerpos detectores contra epítopo alterno en proteína objetivo capturada se conjuga con GO. La unión de otros anticuerpos detectores específicos para sitios fosforilados en proteína objetivo (P) y otro epítopo no superpuesto (p) conjugado con HERP completa la formación del inmunocomplejo necesario para la generación de señales y posterior amplificación de señales mediada por tiramida a través de canalización de la enzima GO- HRP en presencia de glucosa. Los anticuerpos de captura y detección fueron seleccionados para minimizar la competencia entre ellos (es decir, todos los anticuerpos pueden unirse simultáneamente a su epítopo correspondiente en la proteína de transducción de señales).
La figura 4 muestra las curvas de titulación generadas a partir de CEER para ERBB2-T y ERBB2-P. Estos valores se usan como estándares para generar valores cuantitativos para muestras clínicas.
La figura 5 muestra la determinación de t-ERBB2 en células BT474. El ensayo ERBB2-CEER se llevó a cabo usando lisados celulares preparados a partir de células BT474. El ensayo p185-ERBB2 de longitud completa se determinó a partir de lisados que contenían -25 células BT474 y el nivel de t-ERBB2 se determinó al analizar lisados celulares preparados a partir de -250 células BT474 después de la remoción inmuno-magnética de p185-ERBB2.
La figura 6 muestra la expresión y fosforilación de t-ERBB2 en tumores de pacientes. ERBB2, t-ERBB2, t-ERBB2 fosforilado. Se indica la configuración de la disposición. CEER no sólo permite la diferenciación de la expresión de HERBB2 de longitud completa contra truncado en muestras clínicas, sino que también proporciona información valiosa sobre el nivel de fosforilación de una manera cuantitativa.
La figura 7 muestra un ejemplo de IP-Western para ERBB2 para muestras clínicas. Anticuerpos anti-ICD-ERBB2 fueron usados para inmuno-precipitar receptores de ERBB2 y el posterior análisis Western blot se llevó a cabo usando segundos anticuerpos anti-ICD-ERBB2 para diferenciar t-ERBB2 de longitud completa de p185-ERBB2 de longitud completa.
La figura 8 muestra que se observó una amplia variedad de expresión y activación de proteínas de vía en 174 muestras de BCA.
La figura 9 muestra un ejemplo de perfilado de vías funcional mediante CEER en una muestra de biopsia central de cáncer de mama triple negativo en comparación con células de cáncer de mama T47D y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) de control.
La figura 10 muestra los resultados de una comparación entre la supervivencia libre de progresión (PFS) para los grupos de muestra bajos y altos para cada marcador.
La figura 1 1 muestra los resultados de otra comparación entre la PFS para los grupos de muestra bajos y altos para cada marcador.
La figura 12 muestra que medir los niveles de expresión tanto de c-KIT como de VEGFR2 incrementa el valor predictivo de determinar la respuesta a terapia triple en TNMBC.
La figura 13 muestra que medir los niveles de expresión tanto de VEGFR2 como de HER1 incrementa el valor predictivo de determinar la respuesta a la terapia triple en TNMBC.
Las figuras 14A - 14C muestran la correlación entre niveles cada vez más altos de (14A) VEGFR2 total, (14B) c-KIT total y (14C) HER1 total y respuesta a la terapia triple.
Las figuras y tablas de la publicación de PCT No. WO 2010/132723 se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Descripción detallada de la invención I. Introducción Como se describió arriba, la activación de vías de transducción de señales que están implicadas en proliferación celular y la desactivación de vías que están implicadas en muerte celular son ejemplos no limitativos de características moleculares que caracterizan muchos tipos diferentes de cáncer. En muchos casos, la actividad de vías de transducción de señales particulares, y componentes de las mismas, puede servir como firmas moleculares para un tipo de cáncer dado. Estos componentes activados pueden proporcionar además objetivos útiles para intervención terapéutica. En consecuencia, el conocimiento del nivel de actividad de un sistema de transducción de señales particular dentro de una célula cancerosa antes de, durante y después del tratamiento proporciona a un médico información altamente relevante que puede ser usada para seleccionar un curso de tratamiento adecuado a adoptar. Más aún, el monitoreo continuo de vías de transducción de señales que son activas en células cancerosas al progresar el tratamiento puede proporcionar al médico información adicional sobre la eficacia del tratamiento, indicando al médico si continúa un curso de tratamiento particular o si cambia por otra línea de tratamiento, cuando, por ejemplo, las células cancerosas se hayan vuelto resistentes al tratamiento a través de aberraciones adicionales que activen ya sea la misma u otra vía de transduccion de señales.
En consecuencia, la presente invención proporciona métodos y composiciones para detectar los estados de expresión y/o activación de una o una pluralidad de moléculas de transducción de señales desreguladas en tejido de tumor o células extratumorales tales como células circulantes raras de un tumor sólido en ensayo de alta emisión multiplexado y específico. La invención proporciona también métodos y composiciones para la selección de terapias adecuadas (fármacos individuales o combinaciones de fármacos) para sub-regular apagar una vía de señalización desregulada. Así, la invención puede usarse para facilitar el diseño de terapias personalizadas para pacientes de cáncer.
En ciertas modalidades, la capacidad para detectar e identificar células tumorales en la circulación a través de la determinación de la actividad de vías de transducción de señales al nivel de células individuales es una ventaja importante de la presente invención. Las células tumorales comúnmente se encuentran en la sangre de pacientes con varias etapas iniciales de cáncer como "micrometástasis" (células tumorales diseminadas) y también se encuentran en cánceres metastásicos. El número de células tumorales en sangre dependerá de la etapa y tipo de tumor. Aunque se obtienen típicamente biopsias en tumores primarios, la mayoría de los tumores metastásicos no son sometidos a biopsia, haciendo el análisis molecular de estas muestras de tumor muy difícil. Durante la metástasis de tumor, las células tumorales más agresivas dejan el tumor primario y viajan a través de la sangre y sistema linfático para llegar a una ubicación distante. Así, las células tumorales circulantes provenientes de la sangre representan la población de células tumorales más agresiva y homogénea. Sin embargo, el número de células tumorales metastásicas en la sangre frecuentemente es muy bajo, variando de uno a varios miles de células por mililitro de sangre. La capacidad para aislar y ensayar vías de transducción de señales en estas células raras y de aplicar esta información hacia tratamientos de cáncer más efectivos es un objetivo de la presente invención.
En modalidades particulares, los inmunoensayos de alta emisión multiplexados de la presente invención (por ejemplo, Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER), conocido también como el Inmunoensayo de Proximidad Colaborativo (COPIA)) pueden detectar el nivel de expresión y/o activación de una o más moléculas de transducción de señales en células obtenidas de tejido tumoral (por ejemplo, muestras de FNA) o en células circulantes de un tumor sólido al nivel de una sola célula. De hecho, las moléculas de transducción de señales tales como EGFR pueden ser detectadas con una sensibilidad de aproximadamente 100 zeptomoles y un intervalo dinámico lineal de alrededor de 100 zeptomoles a aproximadamente 100 femtomoles. De esta forma, la detección unicelular de los niveles de expresión y/o activación de uno o varios transductores de señales en células tumorales facilitan el pronóstico y diagnóstico de cáncer así como el diseño de terapias dirigidas y personalizadas.
Con respecto a cáncer de mama, las opciones de prueba actuales no son satisfactorias debido a que el tratamiento de tumores tanto primarios como metastásicos en un paciente de cáncer de mama se basa en el diagnóstico de una vez a partir de una muestra de biopsia tomada durante una etapa inicial del cáncer. En particular, la intervención terapéutica para las etapas tanto inicial como metastásica de cáncer de mama se basa únicamente en el diagnóstico inicial a partir de la muestra de biopsia tomada durante una etapa inicial de la enfermedad debido a lo impráctico de obtener una muestra de biopsia de un paciente de cáncer metastásico. Sin embargo, los tumores de mama están evolucionando como un factor de tiempo y tratamiento de tal forma que el monitoreo temporal de los tumores de mama es crítico para un manejo óptimo de los pacientes con cáncer de mama. Por ejemplo, un cambio en el estado de activación de uno o más de la familia ErbB (HER) de tirosina cinasa receptoras puede afectar la selección de terapia en recurrencia. De hecho, la discordancia en el estado de HER-2 entre cáncer primario y metastásico es común debido a que hasta 37% de todos los pacientes de cáncer de mama cambian de un tumor primario HER-2 negativo a cáncer metastásico HER-2 positivo. Además, los pacientes podrían tener resistencia de novo o desarrollar resistencia adquirida a terapia hormonal debido a la activación de HER-1 y HER-2. En algunos casos, los pacientes pueden tener resistencia de Novo o desarrollar resistencia adquirida a terapias dirigidas a ErbB debido a la presencia de células tumorales que expresan p95HER-2. Como resultado, existe una necesidad clínica no satisfecha por ensayos para ayudar al médico a prescribir la terapia de cáncer adecuada en el momento adecuado debido a que la tecnología actual carece de sensibilidad y especificidad, no puede usarse para monitorear pacientes en terapia, y no utiliza perfilado de vías para guiar decisiones de tratamiento individualizadas.
En contraste con las opciones para pruebas de cáncer de mama disponibles actualmente, los métodos de la presente invención hacen posible el monitoreo de pacientes de cáncer de mama a través de todas las etapas de la enfermedad al proporcionar una "biopsia en tiempo real" de tumores de mama sólidos usando muestras tales como aspirados con aguja fina (FNAs) del tumor y/o células tumorales circulantes (CTCs) de la sangre. Como un ejemplo no limitativo, los ensayos de cáncer de mama descritos en la presente pueden usarse en el diagnóstico inicial de cáncer de mama en un paciente en una etapa inicial de la enfermedad. La selección de una terapia de cáncer adecuada es guiada por perfilado de los niveles de expresión y/o activación de una o más vías de señalización específicas con o sin fármacos anticáncer usando los ensayos de una sola detección o de detección doble por proximidad (por ejemplo, CEER) descritos en la presente. Adecuadamente, los métodos de la presente invención también se pueden usar para monitorear la progresión y/o regresión de la enfermedad debido a que la intervención terapéutica puede basarse en muestras tomadas en cualquier etapa de la enfermedad y analizarse usando los ensayos de una sola detección y de detección doble por proximidad (por ejemplo, CEER) descritos en la presente. De esta forma, la predicción, identificación y/o selección de terapias para cáncer adecuadas para las etapas inicial y metastásica de cáncer de mama es guiada por el diagnóstico en tiempo real y un análisis del estado de expresión y/o activación de las moléculas de vía de señalización específicas.
Los métodos de la presente invención están adaptados benéficamente para resolver aspectos clave en el manejo de cáncer y proporcionan una alta norma de cuidado para los pacientes con cáncer de mama (por ejemplo, pacientes con cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC)) toda vez que: (1 ) proporcionan sensibilidad incrementada (por ejemplo, la detección unicelular puede lograrse para detectar moléculas de transducción de señales totales y/o fosforiladas tales como HER1 (EGFR), VEGFR2 y/o c-KIT); (2) proporcionan especificidad incrementada (por ejemplo, los ensayos de proximidad de tres anticuerpos incrementan la especificidad para detectar moléculas de transducción de señales totales y/o fosforiladas); (3) hacen posible perfilado de vías (por ejemplo, el estado de expresión y/o activación de una o más moléculas de transducción de señales específicas puede detectarse en FNA o CTCs de pacientes), y (4) elimina cualquier aspecto sin obtener muestras del paciente (por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos en pocas células tumorales). Aunque se puede usar cualquier muestra en los novedosos ensayos descritos en la presente, CTCs son particularmente útiles toda vez que representan las células tumorales más agresivas, cada tumor se sabe que derrama CTCs, pueden ser la única fuente de tumores residuales o tumores metastásicos difíciles de acceder y se van a encontrar en la sangre. Así, en ciertas modalidades, los métodos de la presente invención hacen posible el muestreo en serie de tejidos de tumor de mama, dando como resultado información valiosa sobre los cambios que ocurren en células tumorales como una función de tiempo y terapia y proporcionando a los médicos un medio para monitorear rápidamente las firmas de vías de cáncer en evolución.
En suma, los métodos de la presente invención proporcionan de manera adecuada la selección y monitoreo precisos de pacientes de cáncer (por ejemplo, pacientes de TNMBC) que son muy propensos a beneficiarse de terapia dirigida al llevar a cabo perfilado de vías en células tumorales usando ensayos de detección individual o proximidad a base de anticuerpos.
II. Definiciones Según se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados adscritos a ellos a menos que se indique específicamente lo contrario.
El término "cáncer" intenta incluir cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células aberrantes. El término incluye todos los cánceres conocidos y condiciones neoplásicas, ya sea caracterizados como malignos, benignos, tejido blando o sólidos, y cánceres de todas las etapas y grados incluyendo cánceres pre- y post-metastásicos. Ejemplos de diferentes tipos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, cáncer de mama; cáncer pulmonar (por ejemplo, cáncer pulmonar no microcítico); cánceres digestivos y gastrointestinales tales como cáncer colorrectal, tumores estromales gastrointestinales, tumores carcinoides gastrointestinales, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer de ductos biliares, cáncer de intestino delgado y cáncer de estómago (gástrico); cáncer esofágico, cáncer de vesícula biliar; cáncer de hígado; cáncer pancreático; cáncer de apéndice; cáncer ovárico; cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células renales); cáncer del sistema nervioso central; cáncer de piel; linfomas; coriocarcinomas; cánceres de cabeza y cuello; sarcomas osteogénicos y cánceres de sangre. Según se usa en la presente, un "tumor" comprende una o más células cancerosas. En una modalidad preferida, el tumor de mama se deriva de un sujeto con una forma invasiva o in situ de carcinoma ductal o carcinoma lobular. En otra modalidad preferida, el tumor de mama se deriva de un sujeto con cáncer de mama recurrente o metastásico.
El término "analito" incluye cualquier molécula de interés, típicamente una macromolécula tal como un polipéptido, cuya presencia, cantidad (nivel de expresión), estado de activación y/o identidad es determinado. En ciertos casos, el analito es una molécula de transducción de señales tal como, por ejemplo, HER1 (EGFR), VEGFR2 o c- IT.
El término "molécula de transducción de señales" o "transductor de señales" incluye proteínas y otras moléculas que llevan a cabo el proceso mediante el cual una célula convierte una señal o estímulo extracelular en una respuesta, incluyendo típicamente secuencias ordenadas de reacciones bioquímicas dentro de la célula. Ejemplos de moléculas de transducción de señales incluyen, pero no están limitadas a, tirosina cinasas receptoras tales como EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1 , HER2/Neu ErbB2, HER3,/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1 , VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (receptor relacionado con receptor de insulina), CSF-1 R, FGFR 1 -4, HGFR 1 -2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1 -8, EPHB -6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1 -2, RET, c-ROS, V-caderina, LTK (leucocito tirosina cinasa), ALK (cinasa de linfoma anaplásico), ROR 1 -2, MUSK, AATYK 1 -3 y RTK 106, formas truncadas de tirosina cinasas receptoras tales como receptores de HER2 truncados con dominios extracelulares amino-terminales ausentes (por ejemplo, p95ErbB2 (p95m), p1 10, p95c, p95n, etc.); dímeros de tirosina cinasa receptores (por ejemplo, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, etc.); tirosina cinasas no receptoras tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Ab1 , Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK, componentes de cascada de señalización de tirosina cinasa tales como AKT (por ejemplo, AKT1 , AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1 ), ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p1 10), PIK3R1 (p85)), PDK1 , PDK2, homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN), SGK3, 4E-BP1 , P70S6K (por ejemplo, variante de empalme de cinasa S6 p70 alfa I), proteína tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1 B, PTPN13, BDP1 , etc.), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (por ejemplo, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1 , Cdc42, PLC, PKC, p53, ciclina D1 , STAT1 , STAT3, 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2), 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3), mTOR, BAD, p21 , p27, ROCK, IP3, TSP-1 , NOS, GSK-3 , RSK 1 -3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, y paxilina; receptores de hormonas nucleares tales como receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), receptor de andrógenos, receptor de glucocorticoides, receptor de mineralocorticoides, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor retinoide, receptor de hormonas tiroides y receptores huérfanos; coactivadores y represores de receptores nucleares tales como amplificados en cáncer de mama-1 (AIB1 ) y corepresor de receptor nuclear 1 (NCOR), respectivamente; y combinaciones de los mismos.
El término "estado de activación" se refiere a si una molécula de transducción de señales particular es activada. En forma similar, el término "nivel de activación" se refiere a hasta qué grado una molécula de transducción de señales particular es activada. El estado o nivel de activación corresponde típicamente al estado o nivel de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación de una o más (por ejemplo, una pluralidad de) moléculas de transducción de señales. Ejemplos no limitativos de estados de activación (listados entre paréntesis) incluyen: HER1/EGFR (EGFRvIll, EGFR fosforilado (p-), EGFR:Shc, EGFR ubiquitinado (u-), p-EGFRvlll); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (ErbB2 truncado), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K,ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K,ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET, complejo c-Met:HGF); AKT1 (p-AKT1 ); AKT2 (P-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK), ERK1 (p-ERK1 ); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1 ); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (P-4E-BP1 ); PIK3R1 (p-PIK3R1 ); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1 R (p-IGF-1 R, IGF-1 R-.IRS, IRS-.PI3K, p-IRS, IGF-1 R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1 ); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1 , VEGFR1 :PLCy, VEGFR1 :Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:sulfato de heparina, VEGFR2:VE-cadherína), VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1 ); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIE1 (p-TIE1 ); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK^ (p-GSK-3 )¡ NFKB (p-NFKB), IKB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3);mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1 );Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STAT1 ); STAT3 (P-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); Ki67, p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun), c-Src (p-c-Src); paxilina (p-paxilina), GRB2 (p-GRB2), Shc (p-Shc), Ras (p-Ras), GAB1 (p-GAB1 ), SHP2 (P-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCy (p-PLCy), PKC (por ejemplo, p-PKCa, p-PKC , p-PKC6), aducina (p-aducina), RB1 (p-RB1 ), y PYK2 (p-PYK2).
Según se usa en la presente, el término "serie de diluciones" intenta incluir una serie de concentraciones cada vez más bajas de una muestra (por ejemplo, lisado de células) o reactivo (por ejemplo, anticuerpo) particular. Una serie de diluciones se produce típicamente mediante un proceso de mezclar una cantidad medida de una concentración inicial de una muestra o reactivo con un diluyente (por ejemplo, regulador de pH de dilución) para crear una concentración más baja de la muestra o reactivo, y repetir el proceso suficientes veces para obtener el número deseado de diluciones en serie. La muestra o reactivo puede ser diluida en serie al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 ó 1000 veces para producir una serie de diluciones que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 concentraciones descendentes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, una serie de diluciones que comprende una dilución en serie dos veces de un reactivo de anticuerpo de captura a una concentración inicial de 1 mg/ml puede producirse al mezclar una cantidad de la concentración inicial de anticuerpo de captura con una cantidad igual de un regulador de pH de dilución para crear una concentración de 0.5 mg/ml del anticuerpo de captura, y repetir el proceso para obtener concentraciones de anticuerpo de captura de 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.0325 mg/ml, etc.
El término "intervalo dinámico superior" según se usa en la presente se refiere a la capacidad de un ensayo para detectar un analito específico en tan poca como una célula o en tantas como miles de células. Por ejemplo, los inmunoensayos descritos en la presente poseen intervalo dinámico superior toda vez que detectan adecuadamente una molécula de transducción de señales particular de interés en aproximadamente 1 -10,000 células (por ejemplo, alrededor de 1 , 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 ó 10,000 células) usando una serie de diluciones de concentraciones de anticuerpo de captura.
El término "muestra" según se usa en la presente incluye cualquier espécimen biológico obtenido de un paciente. Las muestras incluyen, sin limitación, sangre entera, plasma, suero, glóbulos rojos, glóbulos blancos (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica), fluido de enjuague ductal, aspirado de pezón, linfa (por ejemplo, células tumorales diseminadas de los nodulos linfáticos), aspirado de médula ósea, saliva, orina, excremento (es decir, heces), esputo, fluido de enjuague bronquial, lágrimas, aspirado con aguja fina (por ejemplo, cosechado por aspiración con aguja fina periareolar aleatoria), cualquier otro fluido corporal, una muestra de tejido (por ejemplo, tejido tumoral) tal como una biopsia de un tumor (por ejemplo, biopsia con aguja) o un nodulo linfático (por ejemplo, biopsia de nodulos linfáticos centinelas), una muestra de tejido (por ejemplo tejido tumoral) tal como una resección quirúrgica de un tumor, y extractos celulares de los mismos. En algunas modalidades, la muestra es sangre entera o un componente fraccional de la misma tal como plasma, suero o un sedimento celular. En ciertos casos, la muestra se obtiene al aislar células circulantes de un tumor sólido de sangre entera o una fracción celular de la misma usando cualquier técnica conocida en la técnica. En otras modalidades, la muestra es una muestra de tejido de tumor incrustada en parafina fijada con formalina (FFPE), por ejemplo, de un tumor sólido del seno.
Una "biopsia" se refiere al proceso de retirar una muestra de tejido de una evaluación de diagnóstico o pronóstico, y al propio espécimen de tejido. Cualquier técnica de biopsia conocida en la técnica puede aplicarse a los métodos y composiciones de la presente invención. La técnica de biopsia aplicada generalmente dependerá del tipo de tejido que se evaluará y del tamaño y tipo del tumor (es decir, sólido o suspendido (es decir, sangre o ascites)), entre otros factores. Las técnicas de biopsia representativas incluyen biopsia excisional, biopsia incisional, biopsia con aguja (por ejemplo, biopsia con aguja central, biopsia de aspiración con aguja fina, etc.), biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea. Las técnicas de biopsia se describen, por ejemplo, en Harrison's Principies of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16a edición, 2005, capítulo 70, y a Parte V. Un experto en la técnica apreciará que las técnicas de biopsia pueden llevarse a cabo para identificar células cancerosas y/o precancerosas en una muestra de tejido dada.
Según se usa en la presente, el término "células circulantes" comprende células extratumorales que se han ya sea metastatizado o micrometastatizado a partir de un tumor sólido. Ejemplos de células circulantes incluyen, pero no están limitadas a, células de tumor circulantes, células madre cancerosas y/o células que emigran al tumor (por ejemplo, células progenitoras endoteliales circulantes, células endoteliales circulantes, células mieloides pro-angiogénicas circulantes, células dendríticas circulantes, etc.). Muestras de pacientes que contienen células circulantes pueden obtenerse a partir de cualquier fluido biológico accesible (por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, esputo, fluido de lavado bronquial, orina, aspirado de pezón, linfa, saliva, aspirado con aguja fina, etc.). En ciertos casos, la muestra de sangre entera se separa en una fracción de plasma o suero y una fracción celular (es decir, sedimento celular). La fracción celular típicamente contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y/o células circulantes de un tumor sólido tal como células tumorales circulantes (CTCs), células endoteliales circulantes (CECs), células progenitoras endoteliales circulantes (CEPCs), células madre cancerosas (CSCs), células tumorales diseminadas del nodulo linfático, y combinaciones de las mismas. La fracción de plasma o suero normalmente contiene, entre otros, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN) y proteínas que son liberadas por células circulantes de un tumor sólido.
Las células circulantes son típicamente aisladas de una muestra de paciente usando uno o más métodos de separación incluyendo, por ejemplo, separación ¡nmunomagnética (véase, por ejemplo, Racila et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E. U.A., 35:4589-4594 (1998); Bilkenroth et al., Int. J. Cáncer, 92:577-582 (2001 )), el CelTracks® System por Immunicon (Huntingdon Valley, PA), separación microfluídica (véase, por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans Nanobiosci, 3:251 -256 (2004); Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS (véase, por ejemplo, Mancuso et al., Blood, 97:3658-3661 (2001 )), centrifugación por gradiente de densidad (véase, por ejemplo, Baker et al., Clin. Cáncer Res., 13:4865-4871 (2003)), y métodos de depleción (véase, por ejemplo, Meye etal., Int. J. Oncol., 21 :521 -530 (2002)).
Las moléculas de transducción de señales de interés son extraídas típicamente justo después de que las células circulantes son aisladas para conservar su estado de activación in situ, de preferencia dentro de aproximadamente 24, 6 y 1 hora, y muy preferiblemente dentro de alrededor de 30, 15 ó 5 minutos. Las células aisladas también pueden ser incubadas con uno o más factores de crecimiento, normalmente a concentraciones nanomolares a micromolares, durante aproximadamente 1 -30 minutos para resucitar o estimular la activación de las moléculas de transducción de señales (véase, por ejemplo, Irish et al., Cell, 1 18:217-228 (2004)). Por ejemplo, para evaluar potenciales terapias anticáncer para un paciente individual, las células aisladas pueden ser incubadas con uno o más fármacos anticáncer a dosis variables. Después se puede llevar a cabo la estimulación de factor de crecimiento durante pocos minutos (por ejemplo, alrededor de 1 -5 minutos) o durante varias horas (por ejemplo, aproximadamente 1 -6 horas). La activación diferencial de vías de señalización con y sin fármacos anticáncer puede ayudar en la selección de una terapia de cáncer adecuada a la dosis adecuada para cada paciente individual. Las células circulantes también pueden ser aisladas de una muestra de paciente durante el tratamiento con fármacos anticáncer y estimularse con uno o más factores de crecimiento para determinar si se debe implementar un cambio en terapia.
El término "sujeto" o "paciente" o "individuo" incluye típicamente humanos, pero también puede incluir otros animales tales como, por ejemplo, otros primates, roedores, caninos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.
Una "disposición" o "microdisposición" comprende un conjunto y/o serie de diluciones distintos de anticuerpos de captura inmovilizados o restringidos sobre un soporte sólido tal como, por ejemplo, vidrio (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio), plástico, fragmentos, pasadores, filtros, esferas (por ejemplo, esferas magnéticas, esferas de poliestireno, etc.), papel, membrana (por ejemplo, nylon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), hatos de fibras o cualquier otro substrato adecuado. Los anticuerpos de captura son generalmente inmovilizados o restringidos en el soporte sólido mediante interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En ciertos casos, los anticuerpos de captura comprenden marcadores de captura que interactúan con los agentes de captura unidos al soporte sólido. Las disposiciones usadas en los ensayos descritos en la presente comprenden típicamente una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura y/o concentraciones de anticuerpos de captura que se acoplan a la superficie de un soporte sólido en diferentes lugares conocidos/dirigibles.
El término "anticuerpo de captura" intenta incluir un anticuerpo inmovilizado que es específico para (es decir, se une, es unido por, o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra tal como un extracto celular. En modalidades particulares, el anticuerpo de captura está restringido sobre un soporte sólido en una disposición. Los anticuerpos de captura adecuados para inmovilizar cualquiera de una variedad de moléculas de transducción de señales sobre un soporte sólido están disponibles de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), y BD Biosciences (San José, CA).
El término "anticuerpo de detección" según se usa en la presente, incluye un anticuerpo que comprende un marcador detectable que es específico para (es decir, se une, es unido por o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra. El término abarca también un anticuerpo que es específico para uno o más analitos de interés, en donde el anticuerpo puede ser unido por otra especie que comprenda un marcador detectable. Ejemplos de marcadores detectables incluyen, pero no están limitados a, marcadores de biotina/estreptavidina, marcadores de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos), marcadores químicamente reactivos, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos y combinaciones de los mismos. Anticuerpos de detección adecuados para detectar el estado de activación y/o cantidad total de cualquiera de una variedad de moléculas de transducción de señales están disponibles de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), y BD Biosciences (San José, CA). Como un ejemplo no limitativo, anticuerpos fosfo-específicos contra varias formas fosforiladas de moléculas de transducción de señales tales como EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1 , PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf y MEK están disponibles de Santa Cruz Biotechnology.
El término "anticuerpo dependiente de estado de activación" incluye un anticuerpo de detección que es específico para (es decir, se une, es unido por o forma un complejo con) un estado de activación particular de uno o más analitos de interés en una muestra. En modalidades preferidas, el anticuerpo dependiente de estado de activación detecta el estado de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación de uno o más analitos tal como una o más moléculas de transducción de señales. En algunas modalidades, la fosforilación de miembros de la familia EGFR de tirosina cinasas receptoras y/o la formación de complejos heterodiméricos entre miembros de la familia de EGFR se detecta usando anticuerpos dependientes de estado de activación. En modalidades particulares, los anticuerpos dependientes de estado de activación son útiles para detectar uno o más sitios de foforilación en una o más de las siguientes moléculas de transducción de señales (los sitios de fosforilación corresponden a la posición del aminoácido en la secuencia de la proteína humana): EGFR/HER1/ErbB1 (por ejemplo, tirosina (Y) 1068); ErbB2/HER2 (por ejemplo, Y1248); ErbB3/HER3 (por ejemplo, Y1289); ErbB4/HER4 (por ejemplo, Y1284); c-Met (por ejemplo, Y1003, Y1230, Y1234, Y1235 y/o Y1349); SGK3 (por ejemplo, treonina (T) 256 y/o serina (S) 422); 4E.BP1 (por ejemplo, T70); ERK1 (por ejemplo, T185, Y187, T202 y/o Y204); ERK2 (por ejemplo, T185, Y187, T202 y/o Y204); EK (por ejemplo, S217 y/o S221 ); PIK3R1 (por ejemplo, Y688); PDK1 (por ejemplo, S241 ); P70S6K (por ejemplo, T229, T389 y/o S421 ); PTEN (por ejemplo, S380); AKT1 (por ejemplo, S473 y/o T308); AKT2 (por ejemplo, S474 y/o T309); AKT3 (por ejemplo, S472 y/o T305); GSK-33 (por ejemplo, S9); NFKB (por ejemplo, S536); IKB (por ejemplo, S32); BAD (por ejemplo, S 12 y/o S136); mTOR (por ejemplo, S2448); Rsk-1 (por ejemplo, T357 y/o S363); Jnk (por ejemplo, T183 y/o Y185); P38 (por ejemplo, T180 y/o Y182); STAT3 (por ejemplo, Y705 y/o S727); FAK (por ejemplo, Y397, Y576, S722, Y861 y/o S910); RB (por ejemplo, S249, T252, S612 y/o S780); RB1 (por ejemplo, S780); aducina (por ejemplo, S662 y/o S724); PYK2 (por ejemplo, Y402 y/o Y881 ); PKCa (por ejemplo, S657); PKCa/ß (por ejemplo, T368 y/o T641 ); PKC5 (por ejemplo, T505); p53 (por ejemplo, S392 y/o S20); CREB (por ejemplo, S133); c-Jun (por ejemplo, S63); c-Src (por ejemplo, Y416) y paxilina (por ejemplo, Y31 y/o Y1 18).
El término "anticuerpo independiente de estado de activación" incluye un anticuerpo de detección que es específico para (es decir, se une, es unido por, o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra no obstante de su estado de activación. Por ejemplo, el anticuerpo independiente de estado de activación puede detectar formas tanto fosforiladas como no fosforiladas de uno o más analitos tal como una o más moléculas de transducción de señales.
El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" incluye desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma ya sea de una sola o de doble cadena tales como, por ejemplo, ADNA y ARN. Los ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de estructura de enlace modificados, los cuales son sintéticos, naturales y no naturales, y los cuales tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. Ejemplos de estos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2'-0-metilribonucleotidos y ácidos nucleicos péptidos (PNAs). A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes modificadas de manera conservadora de las mismas y secuencias complementarias así como la secuencia indicada explícitamente.
El término "oligonucleótido" incluye un oligómero o polímero de cadena individual de ARN, ADN, híbrido ARN/ADN y/o un mimético del mismo. En ciertos casos, los oligonucleótidos están compuestos de nucleobases de origen natural (es decir, no modificadas, azúcares y enlaces internucleósidos (estructura de base). En ciertos otros casos, los oligonucleótidos comprenden nucleobases modificados, azúcares y/o enlaces internucleósidos.
Según se usa en la presente, el término "motivo no coincidente" o "región no coincidente" se refiere a una porción de un oligonucleótido que no tiene 100% de complementariedad con su secuencia complementaria. Un oligonucleótido puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más regiones no coincidentes. Las regiones no coincidentes pueden ser contiguas o pueden ser separadas por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 o más nucleótidos. Los motivos o regiones no coincidentes pueden comprender un solo nucleótido o pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o más nucleótidos.
La frase "condiciones de hibridación severas" se refiere a condiciones bajo las cuales un oligonucleótido hibridará a su secuencia complementaria, pero no a otras secuencias. Las condiciones severas dependen de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybrídization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica al pH de fuerza iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la cual 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a la Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, de preferencia 10 veces hibridación de fondo.
Los términos "sustancialmente idéntica" o "identidad sustancial", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje de nucleótidos especificado que son iguales (es decir, por lo menos aproximadamente 60%, de preferencia al menos alrededor de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad sobre una región especificada) cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada según se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Esta definición, cuando el contexto lo indique, se refiere también de manera análoga al complemento de una secuencia. De preferencia, la identidad sustancial existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ó 100 nucleótidos de largo.
El término "incubar" se usa indistintamente con "poner en contacto" y "exponer" y no implica ningún requisito de tiempo o temperatura específico a menos que se indique lo contrario.
Las "tirosina cinasas receptoras" o "RTKs" incluyen una familia de cincuenta y seis (56) proteínas caracterizadas por un dominio de transmembrana y un motivo de tirosina cinasa. Las RTKs funcionan en señalización de células y transmiten señales que regulan el crecimiento, diferenciación, adhesión, migración y apoptosis. La activación y/o sobreexpresión mutacional de tirosinas cinasas receptoras transforma células y comúnmente juega un papel crucial en el desarrollo de cánceres. Las RTKs se han vuelto objetivos de varios agentes dirigidos molecularmente tales como trastuzumab, cetuximab, gefitinib, erlotinib, sunitinib, imatinib, nilotinib y similares. Una vía de transducción de señales bien caracterizada es la vía de MAP cinasa, la cual es responsable de transducir la señal de factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la promoción de proliferación celular en células.
El término "supervivencia libre de progresión" o "PFS" incluye la longitud de tiempo durante y después de un tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) en la cual un paciente está viviendo con la enfermedad sin síntomas adicionales de la enfermedad.
El término "triple negativo" en el contexto de la presente invención incluye una célula tumoral (por ejemplo, una célula tumoral circulante), un tumor, o un cáncer tal como cáncer de mama metastásico o triple negativo (TN BC) en el cual no hay expresión detectable de receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR) o receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2).
III. Descripción de las modalidades La presente invención proporciona métodos para detectar el estado (por ejemplo, niveles de expresión y/o activación) de componentes de vías de transducción de señales en células tumorales derivadas de un tejido tumoral o células circulantes de un tumor sólido con un ensayo tal como un ensayo de proximidad de alta emisión específico y multiplexado como el descrito en la presente. La presente invención proporciona también métodos para seleccionar terapias adecuadas para subregular una o más vías de transducción de señales desreguladas. Así, ciertas modalidades de la invención pueden usarse para facilitar el diseño de terapias personalizadas a base de la firma molecular particular proporcionada por la recolección de proteínas de transducción de señales totales y/o activadas en el tumor de un paciente dado (por ejemplo, un tumor de mama triple negativo).
En aspectos particulares, la presente invención proporciona marcadores moleculares (biomarcadores) que hacen posible la determinación o predicción de si un cáncer particular puede responder o es probable que responda favorablemente a uno o más fármacos anticáncer tales como, por ejemplo, una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel (por ejemplo, Abraxane® o nabP) ("terapia triple"). En modalidades específicas, medir el nivel de expresión y/o activación de por lo menos uno, dos o más (por ejemplo, todos) de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R es particularmente útil para seleccionar un fármaco anticáncer adecuado y/o identificar o predecir la eficacia o una respuesta a la misma en células tales como células tumorales triple negativas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer, el método comprende: (a) lisar la célula tumoral para producir un extracto celular; (b) determinar el nivel de expresión de uno o más analitos seleccionados del grupo que consiste en VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R de referencia, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia indica que la célula tumoral es sensible al fármaco anticáncer.
En algunas modalidades, la presencia de un nivel medio a alto de expresión de VEGFR2, un nivel medio a alto de expresión de c-KIT, un nivel bajo a medio de expresión de HER1 y/o un nivel medio a alto de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia indica que la célula tumoral es resistente al fármaco anticáncer. En una modalidad particular, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2 y c-KIT en el extracto celular. En otra modalidad particular, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2 y HER1 en el extracto celular. En otra modalidad particular más, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2, c-KIT y HER1 en el extracto celular. En una modalidad particular más, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en VEGFR2, c-KIT, HER1 e IGF-1 R en el extracto celular. En ciertos casos, el método de la presente invención comprende además determinar el nivel de activación de por lo menos uno, dos o más (por ejemplo, todos) de VEGFR2, c-KIT, HER1 , IGF-1 R y/o AKT en el extracto celular. En otros casos, el método comprende además poner en contacto la célula tumoral con el fármaco anticáncer antes de la etapa (a).
En otras modalidades, la célula tumoral es una célula de cáncer de mama. En ciertos casos, la célula tumoral es una célula de aspirado con aguja fina (FNA) obtenida de un tumor tal como un tumor de mama triple negativo o una célula tumoral circulante (CTC) obtenida de una muestra de fluido corporal. La célula tumoral se aisla típicamente de una muestra que incluye sangre entera, suero, plasma, o tejido de tumor. En modalidades particulares, la muestra se contiene de un sujeto con cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer, el método comprende: (a) lisar una célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo para producir un estrato celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia es predictiva de respuesta a terapia con el fármaco anticáncer.
En algunas modalidades, la presencia de un nivel medio alto de expresión de VE3GFR2, un nivel medio a alto de expresión de c-KIT, un nivel bajo a medio de expresión de HER1 y/o un nivel medio a alto de expresión de IGF-1 R en extracto celular es predictiva de una falta de respuesta a terapia con el fármaco anticáncer. En una modalidad particular, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2 y c-KIT en el extracto celular. En otra modalidad particular, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2 y HER1 en el extracto celular. En otra modalidad particular más, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2, c-KIT y HER1 en el extracto celular. En una modalidad particular adicional, el método comprende determinar el nivel de expresión de una combinación de analitos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en VEGFR2, c-KIT, HER1 y IGF-1 R en el extracto celular. En ciertos casos, el método de la presente invención comprende además determinar el nivel de activación de por lo menos uno, dos o más (por ejemplo todos) de VEGFR2, c-KIT, HER1 , IGF-1 R y/o AKT en el extracto celular. En otros casos, el método comprende además incubar la célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo con el fármaco anticáncer antes de la etapa (a).
En otras modalidades, la célula tumoral es una célula de aspirado con aguja fina (FNA) obtenida de un tumor tal como un tumor de mama triple negativo o una célula tumoral circulante (CTC) obtenida de una muestra de fluido corporal. La célula tumoral se aisla típicamente de una muestra incluyendo sangre entera, suero, plasma o tejido de tumor. En modalidades particulares, la muestra se obtiene de un sujeto con cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC).
En algunos casos, la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2 es predictiva de una mayor duración de supervivencia libre de progresión (PFS). En otros casos, la presencia de un bajo nivel de expresión de c-KIT es predictiva de una duración más larga de PFS. En otros casos la presencia de un alto nivel de expresión de HER1 es predictiva de una duración más larga de PFS. En otros casos más, la presencia de un bajo nivel de expresión de IGF-1 R es predictiva de una duración de PFS más larga. En algunos aspectos particulares, la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2 en combinación con la presencia de un bajo nivel de expresión de c-KIT y/o un alto nivel de expresión de HER1 es predictiva de una duración más larga de PFS en comparación con el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT o HER1 solos.
En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención (por ejemplo, métodos para determinar la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer y para predecir la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer) puede comprender además la etapa (d) de proporcionar el resultado de la comparación obtenida en la etapa Je) a un usuario (por ejemplo, un médico tal como un oncólogo o un practicante general) en un formato legible. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención pueden comprender además enviar o reportar el resultado de la comparación obtenida en la etapa (c) a un médico, por ejemplo, un oncólogo un practicante general. En otros casos, los métodos de la presente invención pueden comprender además grabar o almacenar el resultado de la comparación obtenida en la etapa (c) en una base de datos de computadora u otra máquina o dispositivo adecuado para almacenar información, por ejemplo, en un laboratorio.
En modalidades particulares, el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 , y/o IGF-1 R se determina al detectar niveles de proteína totales de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R, por ejemplo, usando un inmunoensayo con anticuerpos específicos de analitos. El nivel y/o estado de expresión total puede determinarse usando cualquiera de una variedad de técnicas. Como ejemplos no limitativos, el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R se puede determinar con un solo ensayo de detección o con un ensayo de detección doble de proximidad como el descrito en la presente. En modalidades preferidas, el ensayo de detección doble de proximidad es un Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER).
En algunas modalidades, el nivel de expresión (por ejemplo total) y/ nivel de activación (por ejemplo, fosforilación) del uno o más analitos se expresa como un valor de unidad de fluorescencia relativa (RFU) que corresponde a la intensidad de señal para un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, CEER. En otras modalidades, el nivel de expresión y/o nivel de activación del uno o más analitos se cuantifica al calibrar o normalizar el valor de un RFU que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, contra una curva estándar generada para el analito de interés particular. En ciertos casos, el valor RFU puede calcularse con base en una curva estándar.
En modalidades adicionales, el nivel de expresión y/o nivel de activación del uno o más analitos se expresa como "bajo", "medio" o "alto" que corresponde a intensidad de señal cada vez más alta para un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER. En algunos casos, un nivel de expresión o activación no detectable o mínimamente detectable de un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede expresarse como "indetectable". En otros casos, un bajo nivel de expresión o de activación de un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede expresarse como "bajo". En otros casos adicionales, un nivel moderado de activación o expresión de un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede expresarse como "medio". En otros casos más, un nivel moderado a alto de expresión o activación de un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede expresarse como "medio a alto". En otros casos, un nivel de expresión o activación muy alto de un analito de interés particular que se determina usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede expresarse como "alto".
En modalidades particulares, el nivel de expresión y/o nivel de activación de referencia de un analito de interés particular se calcula a partir de una o más curvas estándares generadas a partir de una muestra tal como, por ejemplo, una línea de células cancerosas. Como un ejemplo no limitativo, para cada ensayo usado para determinar el nivel de expresión o nivel de activación de un analito de interés particular, se puede generar una curva estándar sigmoide a partir de una o varias (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, etc.) concentraciones de lisados celulares diluidos en serie preparados a partir de una línea de células cancerosas. En modalidades preferidas, la línea de células cancerosas expresa uno o más analitos de interés, por ejemplo VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R. Cada curva puede ser graficada como una función de intensidad de señal contra unidades derivadas de concentración logarítmica y la CU (Unidad Computada) puede calcularse con base en la curva estándar. El ejemplo 7 proporciona una descripción más detallada de la cuantificación de los niveles de expresión y/o activación de un analito de interés particular contra una curva estándar generada para el analito de interés particular.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión o nivel de activación de un analito de interés particular, cuando se expresa como "bajo", "medio" o "alto", puede corresponder a un nivel de expresión o activación que es al menos aproximadamente 0; 5,000; 10,000; 15,000; 20,000; 25,000; 30,000; 35,000; 40,000; 45,000; 50,000; 60,000; 70,000; 80,000; 90,000; 100,000 RFU, o más, por ejemplo, cuando se compara con un nivel de expresión y/o nivel de activación de referencia para ese analito de interés particular en un control negativo (por ejemplo, un control IgG), en una curva estándar generada para el analito de interés (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas, en un control positivo tal como un control pan-CK, en presencia de un fármaco anticáncer, y/o en ausencia de un fármaco anticáncer. En algunos casos, la correlación es específica de analito. Como un ejemplo no limitativo, un "bajo" nivel de expresión o activación determinado usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede corresponder a 10,000 RFUs en expresión o activación para un analito y 50,000 RFUs para otro analito cuando se compare con un nivel de expresión o activación de referencia.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión o activación de un analito de interés particular puede corresponder a un nivel de expresión o activación conocido como "bajo", "medio" o "alto" que es en relación con un nivel de expresión o nivel de activación de referencia para ese analito de interés particular, por ejemplo, cuando se compara con un control negativo tal como un control de IgG, cuando se compara con una curva estándar generada para el analito de interés (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas), cuando se compara con un control positivo tal como un control pan-CK, cuando se compara con un nivel de expresión o activación determinado en presencia de un fármaco anticáncer y/o cuando se compara con un nivel de expresión o activación determinado en ausencia de un fármaco anticáncer. En algunos casos, la correlación es específica de analitos. Como un ejemplo no limitativo, un "bajo" nivel de expresión o activación determinado usando, por ejemplo, un ensayo de proximidad tal como CEER, puede corresponder a un incremento de dos veces en la expresión o activación para un analito y un incremento de cinco veces para otro analito cuando se compare con un nivel de expresión o activación de referencia.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión o activación de un analito de interés particular puede corresponder a un nivel de expresión o activación que se compare con un nivel de expresión y/o nivel de activación de referencia para ese analito de interés particular en un control negativo (es decir, un control de IgG), en una curva estándar generada para el analito de interés (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas, en un control positivo tal como un control pan-CK, en presencia de un fármaco anticáncer y/o en ausencia de un fármaco anticáncer.
En ciertas modalidades, un nivel de expresión o activación más alto de un analito de interés particular se considera presente en una muestra (por ejemplo, un extracto celular), cuando el nivel de expresión o activación es de al menos aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ó 100 veces más alto (por ejemplo, alrededor de 1.5-3, 2-3, 2-4, 2- 5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, ó 5-50 veces más alto) que el nivel de expresión o activación de referencia para ese analito de interés particular en un control negativo (por ejemplo, un control de IgG), en una curva estándar generada para el analito de interés (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas, en un control positivo (por ejemplo, un control pan-CK), en presencia de un fármaco anticáncer y/o un fármaco anticáncer.
En otras modalidades, un nivel de expresión o activación más bajo de un analito de interés particular se considera que está presente en una muestra (por ejemplo, un extracto celular) cuando el nivel de expresión o activación es al menos aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ó 100 veces más bajo (por ejemplo, alrededor de 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20 ó 5-50 veces más bajo) que el nivel de expresión o activación de referencia para ese analito de interés particular en un control negativo (por ejemplo, un control de IgG), en una curva estándar generada para el analito de interés (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas), en un control positivo (es decir, un control pan-CK), en presencia de un fármaco anticáncer y/o en ausencia de un fármaco anticáncer.
En modalidades adicionales, el nivel de expresión o activación de referencia de un analito de interés particular es un valor límite. En algunos casos, el valor límite incluye un número seleccionado con base en análisis de población de un analito de interés particular que se usa para la comparación con el nivel de expresión o activación de ese analito en el extracto celular. Como un ejemplo no limitativo, un valor límite puede derivarse al dividir el nivel de expresión o activación de un analito de interés particular de una población de individuos en grupos "altos" y "bajos" y seleccionarse para estar en o cerca del nivel de expresión o activación promedio de ese analito en la población. El nivel de expresión o activación del analito de interés en el extracto celular puede compararse con el valor límite y determinarse como un nivel de expresión o activación "alto" y "bajo" de acuerdo con si el nivel de expresión o activación del analito en el extracto celular está por arriba (por ejemplo, "alto") o por abajo (por ejemplo, "bajo") del nivel límite. El ejemplo 5 proporciona una modalidad ejemplar para calcular, seleccionar y usar valores límites de acuerdo con los métodos de la presente invención. En otras modalidades, el valor límite puede derivarse de una curva estándar generada para un analito de interés particular (por ejemplo, una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas) y compararse con el nivel de expresión o activación de ese analito en el extracto celular. Los expertos en la técnica reconocerán que un valor límite puede determinarse de acuerdo con las necesidades del usuario y las características de la población analizada.
En algunas modalidades, el fármaco anticáncer comprende uno o más agentes que interfieren con la función de componentes de la vía de transducción de señales expresados y/o activados anormalmente en células cancerosas. Ejemplos no limitativos de estos agentes incluyen aquellos listados abajo en la tabla 1 de la publicación de PCT No. WO 2010/132723, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
En ciertas modalidades, el fármaco anticáncer comprende un agente antiseñalización (es decir, un fármaco citostático) que es un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina cinasa; un agente antiproliferativo; un agente quimioterapéutico (es . decir, un fármaco citotóxico); un agente terapéutico hormonal; un agente radioterapéutico; una vacuna y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o detener el crecimiento descontrolado de células aberrantes tales como células cancerosas. En algunas modalidades, las células aisladas se tratan con uno o más agentes antiseñalización, agentes antiproliferativos y/o agentes terapéuticos hormonales en combinación con por lo menos un agente quimioterapéutico.
Ejemplos de agentes anti-señalización adecuados para usarse en la presente invención incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Campath®), bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), gemtuzumab (Mylotarg®), panitumumab (Vectibix™), rituximab (Rituxan®), andtositumomab (BEXXAR®); inhibidores de tirosina cinasa tales como gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®), erlotinib (Tarceva®), lapatinib (GW-572016; Tykerb®), canertinib (CI-1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006; Nexavar®), mesilato de imatinib (Gleevec®), leflunomida (SU101 ), vandetanib (ZACTIMA™; ZD6474), pelitinib, CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW-2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 y JNJ-26483327; y combinaciones de los mismos.
Los agentes anti-proliferativos ejemplares incluyen inhibidores de mTOR tales como sirolimus (rapamicina), temsirolimus (CCI-779), everolimus (RAD001 ), BEZ235 y XL765; inhibidores de AKT tales como IL6-hidroximetil-quiro-inositol-2-(R)-2-0-metil-3-O-octadecil-sn-glicerocarbonato, acetato de 9-metoxi-2-metilelipticino, 1 ,3-dihidro-1 (1 -((4-(6-fenil-1 H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-il)fenil)metil)-4-piperidinil)-2H-bencimidazol-2-ona, 10-(4'-(N-dietilamino)butil)-2-clorofenoxazin, tiosemicarbazona de 3-formilcromona (complejo de Cu(ll)CI2), API-2, un péptido de 15 meros derivado de los aminoácidos 10-24 de proto-oncogén TCL1 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1 , y los compuestos descritos en Kozikowski eí al., J. Am. Chem. Soc, 125:1 144-1 145 (2003) y Kau et al., Cáncer Cell, 4:463-476 (2003); inhibidores de PI3K tales como PX-866, wortmanina, LY-294002, quercitina, citrato de tetrodotoxina, maleato de tioperamida, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ235 (NVP-BEZ235), TGX-1 15, ZSTK474, (-)-deguelina, NU 7026, miricetina, tandutinib, GDC-0941 bismesilato, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, perifosina, triciribina, XL-147, PIK75, TGX-221 , NU-7441 , Pl 828, XL-765 y WHI-P154; inhibidores de MEK tales como PD98059, ARRY-162, RDEA1 19, U0126, GDC-0973, PD184161 , AZD6244, AZD8330, PDO325901 y ARRY-142886; y combinaciones de los mismos.
Ejemplos no limitativos de los inhibidores de pan-HER incluyen PF-00299804, neratinib (HKI-272), AC480 (BMS-599626), BMS-690154, PF-02341066, HM781 -36B, CI-1033, BIBW-2992, y combinaciones de los mismos.
Ejemplos no limitativos de agentes quimioterapéuticos incluyen fármacos a base de platino (por ejemplo, oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfan, melfalan, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), anti-metabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina (Gemzar®), pemetrexed (ALIMITA®), raltitrexed, etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), etc.), inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, irinotecano, topotecano, amsacrina, etopósido (VP16), fosfato de etopósido, tenipósido, etc.), antibióticos antitumorales (por ejemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, estereoisómeros de los mismos, derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes terapéuticos hormonales incluyen, sin limitación, inhibidores de aromatasa (por ejemplo, aminoglutehimida, anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®), vorozol, exemestano (Aromasin®), 4-androsten-3,6,17-triona (6-OXO), 1 ,4,6-androstatrien-3,17-diona (ATD), formestano (Lentaron®), etc.), moduladores selectivos del receptor de estrógenos (por ejemplo, bazedoxifen, clomifen, fulvestrant, lasofoxifen, raloxifeno, tamoxifen, toremifen, etc.), esteroides (por ejemplo, dexametasona), finasterida y agonistas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) tales como goserelina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos.
Ejemplos no limitativos de vacunas para cáncer útiles en la presente invención incluyen ANYARA de Active Biotech, DCVax-LB de Northwest Biotherapeutics, EP-2101 de IDM Pharma, GV1001 de Pharmexa, IO-2055 de Idera Pharmaceuticals, INGN-225 de Introgen Therapeutics y Stimuvax de Biomira Merck.
Ejemplos de agentes radioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, radionúclidos tales como 7Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111ln, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 86Re, 88Re, 2 1At, and 212Bi, conjugados opcionalmente a anticuerpos dirigidos contra antígenos tumorales.
En modalidades preferidas, el fármaco anticáncer es una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel ("terapia triple"). En algunos casos, el paclitaxel es un paclitaxel unido a albúmina de nanopartículas (nab) paclitaxel (Abraxane™ o nabP). En otras modalidades, el fármaco anticáncer comprende uno o más de los siguientes: bevacizumab (Avastin®), carboplatino, paclitaxel (por ejemplo, nabP), iniparib (BSI-201 , 4-yodo-3-nitrobenzamida), NK012 (un nanodispositivo liberador de SN-38 construido al fijar covalentemente SN-38 al copolímero de bloque PEG-PGlu, seguido por el auto-ensamble de copolímeros de bloque anfif Micos en medios acuosos), glembatumumab vedotin (también conocido como CDX-01 1 o CR01 1 -vcMMAE; anticuerpo monoclonal humano glembatumumab (CR011 ) ligado a monometil auristatina E (MMAE) que se dirige a células cancerosas que expresan glicoproteína de transmembrana NMB), o combinaciones de los mismos. En una modalidad particular, el fármaco anticáncer es una combinación de finiparib (un inhibidor de PARP), gemcitabina, (Gemzar®), y carboplatino.
En algunas modalidades, los métodos comprenden además determinar el nivel de expresión y/o activación de una o más moléculas de transducción de señales adicionales en el extracto celular. Ejemplos no limitativos de moléculas de transducción de señales adicionales que pueden interrogarse para niveles de expresión (por ejemplo, cantidad total) y/o niveles de activación (por ejemplo, fosforilación) en una muestra tal como un estrato celular incluyen tirosinas cinasas receptoras, tirosinas cinasas no receptoras, componentes de cascada de señalización de tirosina cinasa, receptores de hormonas nucleares, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos. Ejemplos específicos de moléculas de transducción de señales y vías que pueden interrogarse usando la presente invención incluyen aquellos mostrados en la tabla 2 de la publicación de PCT No. WO 2010/132723, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. En modalidades particulares, la una o más moléculas de transducción de señales adicionales se selecciona del grupo que consiste en HER2, P95HER2, HER3, HER4, PI3K, AKT, MEK, PTEN, SGK3, 4E-BP1 , ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PDK1 , P70S6K, GSK-3 , Shc, c-MET, VEGFR1 , VEGFR3, un dímero receptor y combinaciones de los mismos.
En ciertas modalidades, la presente invención comprende además determinar el nivel de expresión (por ejemplo, total) y/o nivel de activación (por ejemplo, fosforilación) de uno o más (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 o más) analitos adicionales en el extracto celular. En algunas modalidades, el uno o más (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 o más) analitos adicionales comprende una o más moléculas de transducción de señales seleccionadas del grupo que consiste en tirosina cinasas receptoras, tirosina cinasas no receptoras, componentes de cascada de señalización de tirosina cinasa, receptores de hormonas nucleares, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos.
En modalidades particulares, la presente invención comprende además determinar el nivel de expresión (por ejemplo, total) y/o activación (por ejemplo fosforilación) de uno o cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 o más de los siguientes analitos adicionales en un extracto celular: HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, AKT, MEK, PTEN, SGK3, 4E-BP1 , ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PDK1 , P70S6K, GSK-3p, Shc, c-MET, VEGFR1 , VEGFR3, PDK2, Raf, SRC, NFkB-lkB, mTOR, EPH-A, EPH-B, EPH-C, EPH-D, FLT-3, TIE-1 , TIE-2, c-FMS, Abl, FTL 3, RET, FGFR1 , FGFR2, FGFR3, FGFR4, ER, PR, NCOR, AIB1 , RON, PIP2, PIP3, p27, proteínas tirosinas fosfatasas (por ejemplo, PTP1 B, PTPN13, BDP1 , etc.), dímeros receptores y combinaciones de los mismos.
IV. Construcción de disposiciones de anticuerpos En ciertos aspectos, el nivel de expresión y/o estado de activación de uno o más (por ejemplo, una pluralidad) de analitos (por ejemplo, moléculas de transducción de señales) en un extracto celular de células tumorales tales como células de cáncer de mama se detecta usando una disposición a base de anticuerpos que comprende una serie de diluciones de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido. Las disposiciones comprenden típicamente una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura a una gama de concentraciones de anticuerpos de captura que son acoplados a la superficie del soporte sólido en diferentes lugares seleccionables. En una modalidad, la disposición comprende anticuerpos de captura para detectar y/o cuantificar la expresión y/o la activación de al menos uno o más de VEGFR2, c-KIT, HER1 , y/o IGF-1 R y uno o más controles tales como, por ejemplo, un control negativo (por ejemplo, un control de IgG), una curva estándar generada para el analito de interés y/o un control positivo (por ejemplo, un control pan-CK).
En una modalidad particular, la presente invención proporciona una disposición dirigible que tiene un superior intervalo dinámico que comprende una pluralidad de series de diluciones de anticuerpos de captura restringidos sobre un soporte sólido, en el cual los anticuerpos de captura en cada serie de diluciones son específicos para uno o más analitos que corresponden a un componente de una vía de transduccion de señales y otras proteínas objetivo. En varios aspectos, esta modalidad incluye disposiciones que comprenden componentes de vías de transduccion de señales características de tumores particulares, por ejemplo, vías de transduccion de señales activas en células de cáncer de mama. Así, la presente invención puede llevarse a la práctica adecuadamente cuando cada molécula de transduccion de señales u otra proteína de interés con un defecto de expresión o activación potencial que cause cáncer de mama se represente en una sola disposición o chip. En algunos aspectos, los componentes de una vía de transduccion de señales dada activa en una célula tumoral particular se disponen en una secuencia lineal que corresponde a la secuencia en la cual la información es relevada a través de una guía de transducción de señales dentro de una célula. Ejemplos de estas disposiciones se describen en la presente y también se muestran en las figuras 5-9de la publicación de PCT No. WO2009/108637, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Los anticuerpos de captura específicos para uno o más componentes de una vía de transducción de señales dada activa en una célula tumoral particular también pueden ser impresos de una forma aleatorizada para minimizar cualquier artefacto relacionado con superficie.
El soporte sólido puede comprender cualquier substrato adecuado para inmovilizar proteínas. Ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no están limitados a, vidrio (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, plástico, chips, pasadores, filtros, esferas, papel, membranas, grupos de fibras, geles, metal, cerámica y similares. Membranas tales como nylon (Biotrans™, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), nitrocelulosa Protran®, W atman Inc. (FlorhamPark, NJ)), y PVDF (Immobilon™, Millipore Corp. (Billerica, MA)) son adecuados para usarse como soportes sólidos en las disposiciones de la presente invención. De preferencia, los anticuerpos de captura son restringidos en portaobjetos de vidrio recubiertos con un polímero de nitrocelulosa, por ejemplo, portaobjetos FAST® Slides, los cuales están disponibles comercialmente de Whatman Inc. (Florham Park, NJ).
Aspectos particulares del soporte sólido que son deseables incluyen la capacidad para unirse a grandes cantidades de anticuerpos de captura y la capacidad para unirse a anticuerpos de captura con desnaturalización mínima. Otro aspecto adecuado es que el soporte sólido presenta mínima "absorción capilar" cuando soluciones de anticuerpos que contienen anticuerpos de captura se aplican al soporte. Un soporte sólido con mínima absorción permite que pequeñas alícuotas de solución de anticuerpos de captura aplicadas al soporte se traduzcan en pequeños puntos definidos de anticuerpo de captura inmovilizado.
Los anticuerpos de captura típicamente son restringidos directa o indirectamente (por ejemplo, mediante marcadores de captura) sobre el soporte sólido por medio de interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En algunas modalidades, los anticuerpos de captura son fijados covalentemente al soporte sólido usando un entrelazador homobifuncional o heterobifuncional mediante el uso de métodos de o condiciones de entrelazamiento estándares. Los entrelazadores adecuados están disponibles comercialmente de vendedores tales como, por ejemplo, Pierce Biotechnology (Rockford, IL).
Métodos para generar disposiciones adecuadas para usarse en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, cualquier técnica usada para construir disposiciones de proteínas o ácidos nucleicos. En algunas modalidades, los anticuerpos de captura son colocados por puntos sobre una disposición usando un microcolocador por puntos, los cuales son típicamente impresoras robóticas equipadas con terminales divididas, terminales romas o impresión por inyección de tinta. Los sistemas robóticos adecuados para imprimir las disposiciones de anticuerpos descritas en la presente incluyen el robot PixSys 5000 (Cartesian Technologies; Irvine, CA) con terminales divididas ChipMaker2 (TeleChem International; Sunnyvale, CA) así como otras impresoras robóticas disponibles de BioRobics (Wobum, MA) y Packard Instrument Co. (Meriden, CT). De preferencia, al menos 2, 3, 4, 5 ó 6 réplicas de cada dilución de anticuerpo de captura se puntean sobre la disposición.
Otro método para generar disposiciones adecuadas para usarse en la presente invención comprende colocar un volumen conocido de una dilución de anticuerpos de captura en cada disposición de disposición seleccionada al poner en contacto un despachador capilar sobre un soporte sólido bajo condiciones efectivas para extraer un volumen definido de líquido en el soporte, en donde este proceso se repite usando diluciones de anticuerpos de captura seleccionadas en cada posición de disposición seleccionada para crear una disposición completa. El método puede llevarse a la práctica para formar una pluralidad de estas disposiciones, en donde la etapa de deposición de solución se aplica a una posición seleccionada en cada uno de una pluralidad de soportes sólidos en cada ciclo de repetición. Una descripción adicional de este método puede encontrarse, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,807,522.
En ciertos casos, dispositivos para imprimir en papel pueden usarse para generar las disposiciones de anticuerpos. Por ejemplo, la dilución de anticuerpos de captura deseada puede ser cargada en la cabeza de impresión de una impresora por inyección de tinta de escritorio e imprimirse sobre un soporte sólido adecuado (véase, por ejemplo, Silzel et al., Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)).
En algunas modalidades, la disposición generada en el soporte sólido tiene una densidad de por lo menos aproximadamente 5 puntos/cm2, y de preferencia al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ó 9000, ó 10,000 puntos/cm2.
En ciertos casos, los puntos en el soporte sólido representan cada uno un anticuerpo de captura diferente. En ciertos otros casos, varios puntos en el soporte sólido representan el mismo anticuerpo de captura, por ejemplo, como una serie de dilución que comprende una serie de concentraciones de anticuerpos de captura descendente.
Ejemplos adicionales de métodos para preparar o construir disposiciones de anticuerpos sobre soportes sólidos se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,197,599, 6,777,329, 6,780,582, 6,897,073, 7,179,638 y 7,192,720; publicación de patentes de E.U.A. Nos: 20060115810, 20060263837, 20060292680 y 20070054326 y Vamum er a/., Methods Mol. Biol., 264:161 -172 (2004).
Los métodos para escanear disposiciones de anticuerpo se conocen en la técnica e incluyen, sin limitación, cualquier técnica usada para escanear disposiciones de proteínas o ácidos nucleicos. Escáners de microdisposición adecuados para usarse en la presente invención están disponibles de PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precisión (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA), y Axon Instruments (Union City, CA). Como un ejemplo no limitativo, un GSI ScanArray 3000 para detección por fluorescencia puede usarse con software ImaGene para cuantificación.
V. Ensayos de detección individual En algunas modalidades, el ensayo para detectar el nivel de expresión y/o activación de uno o más analitos de interés (por ejemplo, una o más moléculas de transduccion de señales) en un extracto celular de células tales como células tumorales es un ensayo de dos anticuerpos de alta emisión múltiple que tiene un intervalo dinámico superior. Como un ejemplo no limitativo, los dos anticuerpos usados en la disposición pueden comprender: (1 ) un anticuerpo de captura específico para un analito de interés particular; y (2) un anticuerpo de detección específico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente de estado de activación). El anticuerpo dependiente de estado de activación es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación del analito. Como alternativa, el anticuerpo de detección comprende un anticuerpo independiente de estado de activación, el cual detecta la cantidad total del analito en el extracto celular. El anticuerpo independiente de estado de activación generalmente es capaz de detectar tanto las formas activadas como no activadas del analito.
En una modalidad particular, el ensayo de dos anticuerpos para detectar el nivel de expresión o activación de un analito de interés comprende: (i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de diluciones de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección específicos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos de detección comprenden anticuerpos de dependientes de estado de activación para detectar el nivel de activación (por ejemplo, fosforilación del analito) o anticuerpos independientes de estado de activación para detectar el nivel de expresión (por ejemplo, cantidad total) del analito; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con primero y segundo miembros de un par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
Los ensayos de dos anticuerpos descritos en la presente son típicamente disposiciones a base de anticuerpos que comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura a una gama de concentraciones de anticuerpos de captura que son acoplados a la superficie de un soporte sólido en diferentes lugares dirigibles. Ejemplos de soportes sólidos adecuados para usarse en la presente invención se describen arriba.
Los anticuerpos de captura y anticuerpos de detección se seleccionan de preferencia para minimizar la competencia entre ellos con respecto a la unión a analito (es decir, ambos anticuerpos de captura y detección pueden unirse simultáneamente a sus moléculas de transducción de señales correspondientes).
En una modalidad, los anticuerpos de detección comprenden un primer miembro de un par de unión (por ejemplo, biotina) y el primer miembro del par de amplificación de señales comprende un segundo miembro del par de unión (por ejemplo, estreptavidina). Los miembros del par de unión pueden acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos de detección o al primer miembro del par de amplificación de señales usando métodos bien conocidos en la técnica. En ciertos casos, el primer miembro del par de amplificación de señales es una peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinófilo peroxidasa, glutationa peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa tiroide, desyodinasa, etc.), y el segundo miembro del par de amplificación de señales es un reactivo de tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida). En estos casos, la señal amplificada se genera por oxidación con peroxidasa del reactivo de tiramida para producir una tiramida activada en presencia de peróxido de hidrógeno (H202).
La tiramida activada es ya sea detectada directamente o detectada después de la adición de un reactivo de detección de señales tal como, por ejemplo, un fluoróforo marcado con estreptavidina o una combinación de peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. Ejemplos de fluoróforos adecuados para usarse en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 555), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un flúor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5), y similares. El marcador de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente al fluoróforo o peroxidasa usando métodos bien conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de reactivos cromogénicos adecuados para usarse en la presente invención incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotriazolin-6-sulfónico) (ABTS), 4-cloro- 1 -naftol (4CN) y/o porfirinógeno.
Un protocolo ejemplar para llevar a cabo los ensayos de dos anticuerpos descritos en la presente se proporciona en el ejemplo 3 de la publicación de PCT No.
WO2009/108637, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
En otra modalidad de un enfoque de dos anticuerpos, la presente invención proporciona un método para detectar el nivel de expresión o activación de un receptor truncado, el método comprende: (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) de un receptor de longitud completa; (ii) remover la pluralidad de esferas del extracto celular, removiendo de esta manera al receptor de longitud completa para formar un extracto celular libre del receptor de longitud completa; (iii) incubar el extracto celular libre del receptor de longitud completa con una serie de diluciones de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura específicos para una región de unión a dominio intracelular (ICD) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados; (iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección específicos para una región de unión a ICD del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los anticuerpos de detección comprenden anticuerpos dependientes de estado de activación para detectar el nivel de activación (por ejemplo, fosforilación) del receptor truncado o anticuerpos independientes de estado de activación para detectar el nivel de expresión (por ejemplo, cantidad total del receptor truncado); (v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con primero y segundo miembros de un par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (vi) detectar una señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
En ciertas modalidades, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras modalidades, la pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) comprende un par estreptavidina-biotina, en donde la biotina se fija a la esfera y la biotina se fija a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es específico para la región de unión a ECD del receptor de longitud completa).
La figura 14A de la publicación de PCT No. WO2009/108637, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos, muestra que esferas recubiertas con un anticuerpo dirigido al dominio extracelular (ECD) de un receptor de interés se une al receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2), pero no al receptor truncado (por ejemplo, p95HER2) para remover cualquier receptor de longitud completa del ensayo. La figura 14B de la publicación de PCT No. WO2009/108637 muestra que el receptor truncado (por ejemplo, p95HER2), una vez unido a un anticuerpo de captura, puede ser luego detectado por un anticuerpo de detección que sea específico para el dominio intracelular (ICD) del receptor de longitud completa (por ejemplo, HER2). El anticuerpo de detección puede ser directamente conjugado a peroxidasa de rábano (HRP). Amplificación de señal de tiramida (TSA) puede llevarse a cabo después para generar una señal que será detectada. El nivel de expresión o estado de activación del receptor truncado (por ejemplo, p95HER2) puede ser interrogado para determinar, por ejemplo, su concentración total o su estado de fosforilación, estado de ubiquitinación y/o estado de complejación.
En otra modalidad, la presente invención proporciona kits para llevar a cabo los ensayos de dos anticuerpos descritos arriba, que comprenden: (a) una serie de diluciones de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura restringidos sobre un soporte sólido; y (b) uno o una pluralidad de anticuerpos de detección (por ejemplo, anticuerpos independientes de estado de activación y/o anticuerpos dependientes de estado de activación). En algunos casos, los kits pueden contener además instrucciones para métodos de uso del kit para detectar los niveles de expresión y/o estados de activación de una o una pluralidad de moléculas de transducción de señales de células tales como células tumorales. Los kits también pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales descritos arriba con respecto a llevar a cabo los métodos específicos de la presente invención tales como, por ejemplo, primero y segundo miembros del par de amplificación de señales, reactivos de amplificación de señales de tiramida, reguladores de pH de lavado, etc.
VI. Ensayos de detección doble por proximidad En algunas modalidades, el ensayo para detectar el nivel de expresión y/o activación de uno o más analitos de interés (por ejemplo, una o más moléculas de transducción de señales) en un extracto celular de células tales como células tumorales es un ensayo de proximidad de alta emisión múltiple (es decir, tres anticuerpos) que tiene un intervalo dinámico superior. Como un ejemplo no limitativo, los tres anticuerpos usados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1 ) un anticuerpo de captura específico para un analito de interés particular; (2) un anticuerpo de detección específico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente de estado de activación) y (3) un anticuerpo de detección que detecte la cantidad total del analito (es decir, anticuerpo independiente de estado de activación). El anticuerpo dependiente de estado de activación es capaz de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación del analito, mientras que el anticuerpo independiente de estado de activación es capaz de detectar la cantidad total (es decir, las formas tanto activadas como no activadas) del analito.
En una modalidad particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel de estado de activación de un analito de interés comprende: (i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de diluciones de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprendan uno o una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y uno o una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se marcan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se marcan con un primer miembro de un par de amplificación de señales, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
En otra modalidad particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel o estado de activación de un analito de interés que es un receptor truncado comprende: (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) de un receptor de longitud completa; (ii) remover la pluralidad de esferas del extracto celular, de esta manera retirando al receptor de longitud completa para formar un extracto celular libre del receptor de longitud completa; (¡ii) incubar el extracto celular libre del receptor de longitud completa con uno o una pluralidad de anticuerpos de captura específicos para una región de unión a dominio intracelular (ICD) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados; (iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección que comprendan uno o una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y uno o una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para una región de unión ICD del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación son marcados con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se marcan con un primer miembro de un par de amplificación de señales, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales; (v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (vi) detectar la señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
En ciertas modalidades, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras modalidades, la pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la biotina está fijada a la esfera y la biotina es unida a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es específico para la región de unión a ECD del receptor de longitud completa).
En modalidades alternativas, los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden ser marcados con una porción facilitadora y los anticuerpos independientes de estado de activación pueden ser marcados con un primer miembro de un par de amplificación de señales.
En otro ejemplo no limitativo, los tres anticuerpos usados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1 ) un anticuerpo de captura específico para un analito de interés particular; (2) un primer anticuerpo de detección que detecte la cantidad total del analito (es decir, un primer anticuerpo independiente de estado de activación); y (3) un segundo anticuerpo de detección que detecte la cantidad total del analito (es decir, un segundo anticuerpo independiente de estado de activación). En modalidades preferidas, el primero y segundo anticuerpos independientes de estado de activación reconocen diferentes (por ejemplo, distintos) epítopos en el analito.
En una modalidad particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel de expresión de un analito de interés comprende: (i) incubar el extracto celular con una o una pluralidad de series de diluciones de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprenden uno o una pluralidad de primero y segundo anticuerpos independientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los primeros anticuerpos independientes de estado de activación son marcados con una porción facilitadora, los segundos anticuerpos independientes de estado de activación son marcados con un primer miembro de un par de amplificación de señales, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales; (Ni) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
En otra modalidad particular, el ensayo de proximidad para detectar el nivel de expresión de un analito de interés que es un receptor truncado comprende: (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) de un receptor de longitud completa; (ii) remover la pluralidad de esferas del extracto celular, removiendo de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular libre del receptor de longitud completa; (iii) incubar el extracto celular libre del receptor de longitud completa con uno o una pluralidad de anticuerpos de captura específicos para una región de unión a dominio intracelular (ICD) del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados; (iv) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección que comprendan uno o una pluralidad de primero y segundo anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para una región de unión ICD del receptor de longitud completa para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los primeros anticuerpos independientes de estado de activación se marcan con una porción facilitadora, los segundos anticuerpos independientes de estado de activación se marcan con un primer miembro de un par de amplificación de señales, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales; (v) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señales para generar una señal amplificada; y (vi) detectar la señal amplificada generada a partir del primero y segundo miembros del par de amplificación de señales.
En ciertas modalidades, el receptor truncado es p95HER2 y el receptor de longitud completa es HER2. En ciertas otras modalidades, la pluralidad de esferas específicas para una región de unión a dominio extracelular (ECD) comprende un par de estreptavidina-biotina, en donde la biotina está fijada a la esfera y la biotina está fijada a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es específico para la región de unión a ECD del receptor de longitud completa).
En modalidades alternativas, los primeros anticuerpos independientes de estado de activación pueden ser marcados con un primer miembro de un par de amplificación de señales y los segundos anticuerpos independientes de estado de activación pueden ser marcados con una porción facilitadora.
Los ensayos de proximidad descritos en la presente son típicamente disposiciones a base de anticuerpos que comprenden uno o una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura a una gama de concentraciones de anticuerpos de captura que son acoplados a la superficie de un soporte sólido en diferentes lugares dirigibles. Ejemplos de soportes sólidos adecuados para usarse en la presente invención se describieron arriba.
Los anticuerpos de captura, anticuerpos independientes de estado de activación y anticuerpos dependientes de estado de activación se seleccionan de preferencia para minimizar la competencia entre ellos con respecto a la unión a analito (es decir, todos los anticuerpos se pueden unir simultáneamente a sus moléculas de transducción de señales correspondientes).
En algunas modalidades, los anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de activación de uno o más de los analitos o, como alternativa, primeros anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de expresión de uno o más de los analitos comprenden además una porción detectable. En tales casos, la cantidad de la porción detectable es correlativa con la cantidad de uno o más de los analitos en el extracto celular. Ejemplos de porciones detectables incluyen, pero no están limitadas a, marcadores fluorescentes, marcadores químicamente reactivos, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos, y similares. De preferencia, la porción detectable es un fluoróforo tal como un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 647), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodamina (TRITC), un flúor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5) y similares. La porción detectable puede ser acoplada directa o indirectamente a los anticuerpos independientes de estado de activación usando métodos bien conocidos en la técnica.
En ciertos casos, los anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de activación del uno o más de los analitos o, como alternativa, primeros anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de expresión de uno o más de los analitos son marcados directamente con la porción facilitadora. La porción facilitadora puede ser acoplada a anticuerpos independientes de estado de activación usando métodos bien conocidos en la técnica. Una porción facilitadora adecuada para usarse en la presente invención incluye cualquier molécula capaz de generar un agente oxidante que se canalice hacia (es decir, se dirija hacia) y reaccione con (es decir, se una, sea aglutinado por, o forme un complejo con) otra molécula en proximidad (es decir, espacialmente cerca o lejos) a la porción facilitadora. Ejemplos de porciones facilitadoras incluyen, sin limitación, enzimas tales como glucosa oxidasa o cualquier otra enzima que catalice una reacción de oxidación/reducción que incluye oxígeno molecular (02) como el receptor de electrones, y fotosensibilizadores tales como azul de metileno, rosa bengala, porfirinas, colorantes de escuarato, ftalocianinas y similares. Ejemplos no limitativos de agentes oxidantes incluyen peróxido de hidrógeno (H202), un oxígeno en singulete o cualquier otro compuesto que transfiera átomos de hidrógeno u obtenga electrones en una reacción de oxidación/reducción. De preferencia, en presencia de un substrato adecuado (por ejemplo, glucosa, luz, etc.), la porción facilitadora (por ejemplo, glucosa oxidasa, fotosensibilizador, etc.) genera un agente oxidante (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H202), oxígeno individual, etc.) que se canaliza hacia y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señales (por ejemplo, peroxidasa de rábano (HRP), hapteno protegido por un grupo protector, una enzima inactivada por enlace de tioéter a un inhibidor enzimático, etc.) cuando las dos porciones estén cerca una de la otra.
En ciertos otros casos, los anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de activación de uno o más de los analitos o, como alternativa, primeros anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de expresión de uno o más de los analitos se marcan indirectamente con la porción facilitadora mediante hibridación entre un enlazador de oligonucleótidos conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación y un enlazador de oligonucleótidos complementario conjugado a la porción facilitadora. Los enlazadores de oligonucleótidos pueden ser acoplados a la porción facilitadora o a los anticuerpos independientes de estado de activación usando métodos bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el enlazador de oligonucleótidos conjugado a la porción facilitadora tiene 100% de complementaríedad con el enlazador de oligonucleótidos conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación. En otras modalidades, el par de enlazadores de oligonucleótidos comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más regiones no coincidentes, por ejemplo, después de la hibridación bajo condiciones de hibridación severas. Un experto en la técnica apreciará que los anticuerpos independientes de estado de activación específicos para diferentes analitos pueden ser ya sea conjugados al mismo enlazador de oligonucleótidos o a diferentes enlazadores de oligonucleótidos.
La longitud de los enlazadores de oligonucleótidos que se conjugan a la porción facilitadora o a los anticuerpos independientes de estado de activación puede variar. En general, la secuencia enlazadora puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ó 100 nucleótidos de largo. Típicamente, se generan secuencias de ácido nucleico aleatorias para acoplamiento. Como un ejemplo no limitativo, se puede diseñar una biblioteca de enlazadores de oligonucleótidos para tener tres dominios contiguos distintos: un dominio separador; dominio de firma y dominio de conjugación. De preferencia, los enlazadores de oligonucleótidos están diseñados para un acoplamiento eficiente sin destruir la función de la porción facilitadora o anticuerpos independientes de estado de activación a los cuales son conjugadas.
Las secuencias enlazadoras de oligonucleótidos pueden diseñarse para evitar o minimizar cualquier formación de estructuras secundarias bajo una variedad de condiciones de ensayo. Las temperaturas de fusión son típicamente monitoreadas de manera cuidadosa para cada segmento dentro de un enlazador para permitir su participación en los procedimientos de ensayo totales. Generalmente, la escala de temperaturas de fusión del segmento de la secuencia enlazadora es de entre 1 -10°C. Algoritmos de computadora (por ejemplo, OLIGO 6.0) para determinar la temperatura de fusión, estructura secundaria y estructura de pasador bajo condiciones iónicas definidas pueden usarse para analizar cada uno de los tres dominios diferentes dentro de cada enlazador. Las secuencias combinadas totales también se pueden analizar para su caracterización estructural y su compatibilidad con otras secuencias de enlazadores de oligonucleótidos conjugadas, por ejemplo, si hibridarán bajo condiciones de hibridación severas a un enlazador de oligonucleótidos complementario.
La región separadora del enlazador de oligonucleótidos proporciona la separación adecuada del dominio de conjugación del sitio de entrelazamiento de oligonucleótidos. El dominio de conjugación funciona para enlazar moléculas marcadas con una secuencia de enlazadores de oligonucleótidos complementaria al dominio de conjugación por medio de hibridación de ácido nucleico. La hibridación mediada por ácido nucleico puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la formación del complejo anticuerpo-analito (es decir, antígeno), proporcionando un formato de ensayo más flexible.
A diferencia de muchos métodos de conjugación de anticuerpos directos, el enlazamiento de moléculas relativamente pequeñas a anticuerpos u otras moléculas tiene un impacto mínimo en la afinidad específica de los anticuerpos hacia su analito objetivo o en la función de las moléculas conjugadas.
En algunas modalidades, el dominio de secuencia de firma del enlazador de oligonucleótidos puede usarse en complejos ensayos de proteínas múltiples. Los anticuerpos múltiples pueden conjugarse con enlazadores de oligonucleótidos con diferentes secuencias de firma. En los inmunoensayos múltiples, secuencias de oligonucleótidos reporteros marcadas con sondas adecuadas pueden usarse para detectar la reactividad cruzada entre anticuerpos y sus antígenos en el formato de ensayo múltiple.
Los enlazadores de oligonucleótidos pueden ser conjugados a anticuerpos u otras moléculas usando varios métodos diferentes. Por ejemplo, los enlazadores de oligonucleótidos pueden ser sintetizados con un grupo tiol ya sea en el extremo 5' o 3'. El grupo tiol puede ser desprotegido usando agentes reductores (por ejemplo, TCEP-HCI) y los enlazadores resultantes pueden purificarse usando una columna centrífuga desaladora. Los enlazadores de oligonucleótidos desprotegidos resultantes pueden conjugarse a las aminas primarias de anticuerpos u otros tipos de proteínas usando entrelazadores heterobifuncionales tales como S CC. Como alternativa, los grupos 5'-fosfato en los oligonucleótidos pueden ser tratados con carbodiimida soluble en agua EDC para formar ésteres de fosfato y posteriormente acoplarse a moléculas que contengan amina. En ciertos casos, el diol en el residuo de 3'-ribosa puede ser oxidado a grupos aldehido y luego conjugado a los grupos amina de anticuerpos u otros tipos de proteínas usando aminación reductora. En ciertos otros casos, el enlazador de oligonucleótidos puede ser sintetizado con una modificación de biotina ya sea en el extremo 3' o 5' y conjugarse a moléculas marcadas con estreptavidina.
Los enlazadores de oligonucleótidos pueden ser sintetizados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas en Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucí. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucí. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); y Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). En general, la síntesis de oligonucleótidos hace uso de grupos protectores y de acoplamiento de ácido nucleico comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3'. Los reactivos adecuados para síntesis de oligonucleótidos, métodos para la desprotección de ácidos nucleicos y métodos para la purificación de ácidos nucleicos se conocen por aquellos expertos en la técnica.
En ciertos casos, anticuerpos dependientes de estado de activación para detectar los niveles de activación de uno o más de los analitos o, como alternativa, según los anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de expresión de uno o más de los analitos se marcan directamente con el primer miembro del par de amplificación de señales. El miembro del par de amplificación de señales puede ser acoplado a anticuerpos dependientes de estado de activación para detectar los niveles de activación o a segundos anticuerpos independientes de estado de activación para detectar los niveles de expresión usando métodos bien conocidos en la técnica. En ciertos otros casos, anticuerpos dependientes de estado de activación o segundos anticuerpos independientes de estado de activación son marcados directamente con el primer miembro del par de amplificación de señales por medio de unión entre un primer miembro de un par de unión conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación o segundos anticuerpos independientes de estado de activación y un segundo miembro del par de unión conjugado al primer miembro del par de amplificación de señales. Los miembros del par de unión (por ejemplo, biotina/estreptavidina) pueden acoplarse al miembro del par de amplificación de señales o a los anticuerpos dependientes de estado de activación o segundos anticuerpos independientes de estado de activación usando métodos bien conocidos en la técnica. Ejemplos de miembros de pares de amplificación de señales incluyen, pero no están limitados a, peroxidasas tales como peroxidasa de rábano (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinófilo peroxidasa, glutationa peroxidasa, lactaperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa tiroide, desiodinasa y similares. Otros ejemplos de miembros de pares de amplificación de señales incluyen haptenos protegidos por un grupo protector y enzimas inactivadas por enlace de tioéter a un inhibidor enzimático.
En un ejemplo de canalización por proximidad, la porción facilitadora es glucosa oxidasa (GO) y el primer miembro del par de amplificación de señales es peroxidasa de rábano (HRP). Cuando la GO se pone en contacto con un substrato tal como glucosa, genera un agente oxidante (es decir, peróxido de hidrógeno (H202). Si la HRP está dentro de proximidad de canalización con la GO, el H202 generado por la GO es canalizado hacia y se acompleja con la HRP para formar un complejo HRP-H202, el cual, en presencia del segundo miembro del par de amplificación de señales (por ejemplo, un substrato quimioluminiscente tal como luminol o isoluminol o un substrato fluorogénico tal como tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida), ácido homovainíllico, o ácido 4-hidroxifenilacético) genera una señal amplificada. Los métodos para usar GO y HRP en un ensayo de proximidad se describen en, por ejemplo, Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999). Cuando se usa biotina-tiramida como el segundo miembro del par de amplificación de señales, el complejo HRP-H202 oxida la tiramida para generar un radical de tiramida reactivo que se une covalentemente a los residuos nucleótidos cercanos. La tiramida activada es ya sea directamente detectada o detectada después de la adición de un reactivo de detección de señales tal como, por ejemplo, un fluoróforo marcado con estreptavidina o una combinación de peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. Ejemplos de fluoróforos adecuados para usarse en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un colorante Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 555), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), un flúor CyDye™ (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5), y similares. El marcador de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente al fluoróforo o peroxidasa usando métodos bien conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de reactivos cromogónicos adecuados para usarse en la presente invención incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), ácido 2,2'-az¡no-bis(3-etilbenzotiazol¡n-6-sulfón¡co) (ABTS), 4-cloro-1 -naftol (4CN) y/o porfirinógeno.
En otro ejemplo de canalización de proximidad, la porción facilitadora es un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificación de señales es una molécula grande marcada con varios haptenos que se protegen con grupos protectores que impiden la unión de los haptenos a un socio de unión específico (por ejemplo, ligando, anticuerpo, etc.). Por ejemplo, el miembro del par de amplificación de señales puede ser una molécula de dextrano marcada con biotina protegida, cumarina y/o moléculas de fluoresceína. Los grupos protectores adecuados incluyen, pero no están limitados a, grupos protectores de fenoxi, analino, olefina, tioéter y selenoéter. Los fotosensibilizadores adicionales y moléculas de hapteno protegidas adecuados para usarse en los ensayos de proximidad de la presente invención se describen en la patente de E.U.A. No. 5,807,675. Cuando el fotosensibilizador es excitado con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxígeno en singulete). Si las moléculas de hapteno están dentro de proximidad de canalización con el fotosensibilizador, el oxígeno en singulete generado por el fotosensibilizador es canalizado hacia y reacciona con tioéteres en los grupos protectores de los haptenos para producir grupos carbonilo (cetonas o aldehidos) y ácido sulfínico, ligerando los grupos protectores de los haptenos. Los haptenos desprotegidos están luego disponibles para unirse específicamente al segundo miembro del par de amplificación de señales (por ejemplo, un compañero de unión específico que puede generar una señal detectable). Por ejemplo, cuando el hapteno es biotina, el compañero de unión específico puede ser una estreptavidina marcada con enzima. Ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, HRP, etc. Después de lavar para remover reactivos no unidos, la señal detectable puede ser generada al añadir un substrato detectable (por ejemplo, fluorescente, quimioluminiscente, cromogénico, etc.) de la enzima y detectarse usando métodos e instrumentación adecuados conocidos en la técnica. Como alternativa, la señal detectable puede ser amplificada usando amplificación de señal de tiramida y la tiramida activada detectarse ya sea directamente o detectarse después de la adición de un reactivo de detección de señales como el descrito arriba.
En otro ejemplo más de canalización de proximidad, la porción facilitadora es un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificación de señales es un complejo enzima-inhibidor. La enzima y el inhibidor (por ejemplo, dextrano marcado con ácido fosfónico) se enlazan juntos por un enlazador cortable (por ejemplo, tioéter). Cuando el fotosensibilizador es excitado con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxígeno en singulete). Si el complejo enzima-inhibidor está dentro de proximidad de canalización con el fotosensibilizador, el oxígeno en singulete generado por el fotosensibilizador es canalizado hacia y reacciona con el enlazador cortable, liberando al inhibidor de la enzima, activando de esta manera la enzima. Un substrato enzimático se añade para generar una señal detectable, o como alternativa, un reactivo de amplificación se añade para generar una señal amplificada.
En un ejemplo adicional de canalización de proximidad, la porción facilitadora es HRP, el primer miembro del par de amplificación de señales es un hapteno protegido o un complejo enzima-inhibidor como el descrito arriba, y los grupos protectores comprenden p-alcoxi fenol. La adición de fenilendiamina y H202 genera una fenilen diimina reactiva que se canaliza hacia el hapteno protegido o al complejo enzima-inhibidor y reacciona con grupos protectores p-alcoxi fenol para producir haptenos expuestos o una enzima reactiva. La señal amplificada se genera y se detecta como se describió arriba (véanse, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos: 5,532,138 y 5,445,994).
Un ejemplo de protocolo para llevar a cabo los ensayos de proximidad descritos en la presente se proporciona en el ejemplo 4 de la publicación de PCT No. WO2009/108637, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
En otra modalidad, la presente invención proporciona kits para llevar a cabo los ensayos de proximidad descritos arriba, que comprenden: (a) una serie de diluciones de uno o una pluralidad de anticuerpos de captura restringidos sobre un soporte sólido; y (b) uno o una pluralidad de anticuerpos de detección (por ejemplo, una combinación de anticuerpos independientes de estado de activación y anticuerpos dependientes de estado de activación para detectar los niveles de activación y/o una combinación de primero y segundo anticuerpos independientes de estado de activación para detectar niveles de expresión). En algunos casos, los kits pueden contener además instrucciones para métodos de usar el kit para detectar el estado de expresión y/o activación de una o una pluralidad de moléculas de transducción de señales de células tales como células tumorales. Los kits también pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales descritos arriba con respecto a llevar a cabo los métodos específicos de la presente invención tales como, por ejemplo, primero y segundo miembros del par de amplificación de señales, reactivos de amplificación de señales de tiramida, substratos para la porción facilitadora, reguladores de pH de lavado, etc.
VII. Producción de anticuerpos La generación y selección de anticuerpos no fácilmente disponibles comercialmente para analizar los niveles de expresión y activación de moléculas de transducción de señales en células tumorales de acuerdo con los inmunoensayos de la presente invención pueden lograrse de varias maneras. Por ejemplo, una forma es expresar y/o purificar un polipéptido de interés (es decir, antígeno) usando métodos de expresión y purificación de proteínas conocidos en la técnica, mientras que otra manera es sensibilizar el polipéptido de interés usando métodos de síntesis de péptidos en fase sólida conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Soli Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., vol. 289 (1997); Kiso er a/., Chem. Pharm. Bull., 38:1 192-99 (1990); Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1 :255-60, (1995); y Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996). El polipéptido purificado o sintetizado puede ser luego inyectado, por ejemplo, en ratones o conejos, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Un experto en la técnica reconocerá que muchos procedimientos están disponibles para la producción de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lañe, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Un experto en la técnica también apreciará que los fragmentos de unión o fragmentos Fab que imitan (por ejemplo, conservan las regiones de unión funcional de) anticuerpos también se pueden preparar a partir de información genética por varios procedimientos. Véase, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practica! Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); and Huse er a/., J. Immunol., 149:3914-3920 (1992).
Los expertos en la técnica reconocerán que muchos enfoques pueden tomarse para producir anticuerpos o fragmentos de unión y tamizar y seleccionar para afinidad y especificidad para los diferentes polipéptidos de interés, pero estos enfoques no cambian el alcance de la presente invención.
Una descripción más detallada de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecíficos, fragmentos de los mismos y métodos para purificar anticuerpos se encuentra en la publicación de PCT No. WO 2010/132723, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
VIII. Métodos de administración De acuerdo con los métodos de la presente invención, los fármacos anticáncer descritos en la presente se administran a un sujeto mediante cualquier medio conveniente conocido en la técnica. Los métodos de la presente invención pueden usarse para seleccionar un fármaco anticáncer o combinación de fármacos anticáncer adecuados para el tratamiento de un tumor, por ejemplo, un tumor de mama tal como un tumor de mama metastásico triple negativo, en un sujeto. Los métodos de la presente invención también se pueden usar para predecir la respuesta de un tumor, por ejemplo, un tumor de mama tal como un tumor de mama metastásico triple negativo, al tratamiento con un fármaco anticáncer o combinación de fármacos anticáncer. Además, los métodos de la presente invención se pueden usar para determinar la sensibilidad de una célula tumoral tal como una célula tumoral triple negativa, por ejemplo, de un tumor de mama metastásico triple negativo, a tratamiento con un fármaco anticáncer o combinación de fármacos anticáncer. Un experto en la técnica apreciará que los fármacos anticáncer descritos en la presente pueden administrarse solos o como parte de un enfoque terapéutico combinado con quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y/o cirugía convencionales.
En ciertas modalidades, el fármaco anticáncer comprende un agente antiseñalización (es decir, un fármaco citostático) tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina cinasa; un agente antiproliferativo; un agente quimioterapéutico (es decir, un fármaco citotóxico); un agente terapéutico hormonal; un agente radioterapéutico; una vacuna; y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o detener el crecimiento descontrolado de células aberrantes tales como células cancerosas. En algunas modalidades, el sujeto es tratado con uno o más agentes anti-señalización, agentes anti-proliferativos y/o agentes terapéuticos hormonales en combinación con por lo menos un agente quimioterapéutico. Se describieron arriba ejemplos de anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina cinasa, agentes antiproliferativos, agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos y vacunas.
En modalidades preferidas, el fármaco anticáncer es una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel ("terapia triple"). En algunos casos, paclitaxel es un paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas (nab) (Abraxane® o nabP). En otras modalidades, el fármaco anticáncer que comprende iniparib (BSI 201 , 4-yodo-3-nitrobenzamida), NK012 (un nanodispositivo liberador de SN-38 construido al fijar covalentemente SN-38 al copolímero de bloques PEG-PGlu, seguido por el auto-ensamble de copolímeros de bloque anfifílicos en medios acuosos), glembatumumab vedotina, (también conocido como CDX-01 1 o CR01 1 -vcMMAE, anticuerpo monoclonal humano glembatumumab (CR01 1 ) enlazado a monometil auristatina E (MMAE) que se dirige a células cancerosas que expresan glicoproteína de transmembrana NMB), o combinaciones de los mismos. En una modalidad particular, el fármaco anticáncer es una combinación de iniparib (un inhibidor de PARP), gemcitabina (Gemzar®) y carboplatino.
En algunas modalidades, los fármacos anticáncer descritos en la presente pueden ser co-administrados con agentes inmunoterapéuticos convencionales incluyendo, pero no limitados a, inmunoestimuladores (por ejemplo, Bacillo Calmette-Guérin (BCG), levamisol, interleucina-2, interferón alfa, etc.), inmunotoxinas (por ejemplo, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33-caliqueamicina, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD22-exotoxína de pseudómonas), y radioinmunoterapia (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado a 111ln, 90Y o 131l, etc.).
Los fármacos anticáncer pueden ser administrados con un excipiente farmacéutico adecuado según sea necesario y se puede llevar a cabo por medio de cualquiera de los modos de administración aceptados. Así, la administración puede ser, por ejemplo, oral, bucal, sublingual, gingival, palatal, intravenosa, tópica, subcutánea, transcutánea, transdérmica, intramuscular, intraarticular, parenteral, intra-arteriolar, intradérmica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intravesical, intratecal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal o por inhalación. Por "co-administrar" se intenta decir que un fármaco anticáncer se administra al mismo tiempo, justo antes de, o justo después de la administración de un segundo fármaco (por ejemplo, otro fármaco anticáncer, un fármaco útil para reducir los efectos secundarios asociados con terapia con fármacos anticáncer, un agente radioterapéutico, un agente terapéutico hormonal, un agente inmunoterapéutico, etc.).
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco anticáncer puede administrarse repetidamente, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más veces, y la dosis puede ser administrada por infusión continua. La dosis puede tener la forma de sólido, semisolido, polvo liofilizado o formas de dosificación líquidas, tales como, por ejemplo, tabletas, pildoras, granulos, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles, espumas y similares, de preferencia en formas de dosis única adecuadas para administración simple de dosis precisas.
Según se usa en la presente, el término "forma de dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de un fármaco anticáncer calculada para producir el inicio deseado, tolerabilidad y/o efectos terapéuticos, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado (por ejemplo, una ampolleta). Además, pueden prepararse formas de dosis más concentradas, de las cuales las formas de dosis única más diluidas pueden ser después producidas. Las formas de dosis más concentradas contendrán entonces sustancialmente más que, por ejemplo, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más veces la cantidad del fármaco -anticáncer.
Los métodos para preparar estas formas de dosificación se conocen por aquellos expertos en la técnica (véase REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Las formas de dosificación incluyen típicamente un portador o excipiente farmacéutico convencional y pueden incluir además otros agentes medicinales, portadores, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de permeación tisular, solubilizadores y similares. Los excipientes adecuados pueden ser adaptados a la forma de dosificación particular y ruta de administración mediante métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado arriba).
Ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, lactosa, dextrosa, sucrosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolldona, celulosa, agua, solución salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y ácidos poliacrílicos tales como carbopoles, por ejemplo, Carbopol 941 , Carbopol 980, Carbopol 981 , etc. Las formas de dosificación pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes de suspensión; agentes conservadores tales como hidroxibenzoatos de metilo, etilo y propilo (es decir, los parabenos); agentes de ajuste de pH tales como ácidos y bases orgánicos e inorgánicos; agentes edulcorantes y agentes saborizantes. Las formas de dosificación pueden comprender también esferas poliméricas biodegradables, dextrano y complejos de inclusión de ciclodextrina.
Para administración oral, la dosis terapéuticamente efectiva puede estar en forma de tabletas, cápsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, sprays, trociscos, polvos y formulaciones de liberación prolongada. Los excipientes adecuados para administración oral incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sucrosa, carbonato de magnesio y similares.
En algunas modalidades, la dosis terapéuticamente efectiva adopta la forma de una pildora, tableta o cápsula, y de esta manera, la forma de dosificación puede contener, junto con un fármaco anticáncer, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sucrosa, fosfato dicálcico y similares; un desintegrante tal como almidón o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como un almidón, goma acacia, polivinilpirrolldona, gelatina, celulosa y derivados de los mismos. Un fármaco anticáncer también se puede formular en un supositorio dispuesto, por ejemplo, en un portador de polietilenglicol (PEG).
Las formas de dosificación líquidas pueden prepararse al disolver o dispersar un fármaco anticáncer y opcionalmente uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables en un portador tal como, por ejemplo, solución salina acuosa (por ejemplo, cloruro de sodio al 0.9% p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solución o suspensión, por ejemplo, para administración oral, tópica o intravenosa. Un fármaco anticáncer también se puede formular en un enema de retención.
Para administración tópica, la dosis terapéuticamente efectiva puede estar en forma de emulsiones, lociones, geles, espuma, cremas, jaleas, soluciones, suspensiones, pomadas y parches transdérmicos. Para administración por inhalación, un fármaco anticáncer puede ser suministrado como un polvo seco o en forma líquida por medio de un nebulizador. Para administración parenteral, la dosis terapéuticamente efectiva puede estar en forma de soluciones inyectables estériles y polvos envasados estériles. De preferencia, las soluciones inyectables se formulan a un pH de aproximadamente 4.5 a alrededor de 7.5.
La dosis terapéuticamente efectiva también se puede proporcionar en una forma liofilizada. Estas formas de dosificación pueden incluir un regulador de pH, por ejemplo, bicarbonato, para su reconstitución antes de la administración, o el regulador de pH puede incluirse en la forma de dosificación y liofilizada para su reconstitución con, por ejemplo, agua. La forma de dosificación liofilizada puede comprender además un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La forma de dosificación liofilizada puede ser proporcionada en una jeringa, opcionalmente envasada en combinación con el regulador de pH para reconstitución, de tal manera que la forma de dosificación reconstituida pueda ser inmediatamente administrada a un sujeto.
Un sujeto también puede ser monitoreado a intervalos de tiempo periódicos para evaluar la eficacia de cierto régimen terapéutico. Por ejemplo, los niveles de expresión y/o activación de ciertas moléculas de transducción de señales pueden cambiar con base en el efecto terapéutico de tratamiento con uno o más de los fármacos anticáncer descritos en la presente. El sujeto puede ser monitoreado para evaluar la respuesta y entender los efectos de ciertos fármacos o tratamientos en un enfoque individualizado. Además, los sujetos que inicialmente respondan a un fármaco anticáncer específico o combinación de fármacos anticáncer pueden volverse refractarios al fármaco o combinación de fármacos, indicando que estos sujetos han desarrollado resistencia a fármacos adquirida. Estos sujetos pueden ser descontinuados en su terapia actual y un tratamiento alternativo puede prescribirse de acuerdo con los métodos de la presente invención.
En ciertos aspectos, los métodos descritos en la presente pueden usarse en conjunto con paneles de marcadores de expresión génica que predigan la probabilidad de pronóstico y/o recurrencia de cáncer de mama en varias poblaciones. Estos paneles de genes pueden ser útiles para identificar individuos que sea poco probable que experimenten recurrencia y, de esta manera, poco probable que se beneficien de quimioterapia adyuvante. Los panales de expresión pueden usarse para identificar individuos quienes puedan evitar de manera segura quimioterapia adyuvante, sin afectar negativamente los resultados libres de enfermedad y de supervivencia general. Los sistemas adecuados incluyen, pero no están limitados a, Oncotype DX™, el cual es un panel de 21 genes de Genomic Health, Inc., MammaPrint®, el cual es un panel de 70 genes de Agendia; y un panel de 76 genes de Veridex.
Además, en ciertos otros aspectos, los métodos descritos en la presente pueden usarse en conjunto con paneles de marcadores de expresión génica que identifiquen los tumores originales para cánceres de primaria desconocida (CUP). Estos paneles génicos pueden ser útiles para identificar pacientes con cáncer metastásico que se beneficiarían con una terapia de acuerdo con aquella dada a pacientes diagnosticados inicialmente con cáncer de mama. Los sistemas adecuados incluyen, pero no están limitados a, el ensayo Aviara Cáncer TYPE ID, un ensayo de expresión a base de RT-PCR que mide 92 genes para identificar el sitio primario de origen para 39 tipos de tumores; y la Prueba de Tejido de Origen Pathwork®, que mide la expresión de más de 1600 genes en una microdisposición y compara la "firma" de expresión génica de un tumor contra aquellas de 15 tipos de tejido conocidos.
IX. Ejemplos Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reclamada.
Los ejemplos de la publicación de PCT No. WO 2010/132723 se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Ejemplo 1 Formato de portaobjetos para ensayo de proximidad ejemplar Este ejemplo ilustra una modalidad preferida de los ensayos de proximidad de la invención, conocida también como el Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER). Los ensayos de proximidad de esta modalidad usan una plataforma a base de microdisposiciones de anticuerpos que mide la expresión y activación de proteínas objetivo en células tumorales circulantes (CTCs) y/o muestras de tejido (por ejemplo, FNAs). Como un ejemplo no limitativo, los ensayos de proximidad de esta modalidad pueden usarse para analizar el nivel de expresión de proteínas y/o el estado de activación de una o más proteínas objetivo tales como HER1 en CTCs o tejido tumoral. En algunas instancias, los ensayos de proximidad de esta modalidad utilizan CTCs aislados de aproximadamente 7.5 mi de sangre entera por partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-Ep-CAM usando el CTC Profiler (Venidex). Las CTCs aisladas pueden ser luego estimuladas con factores de crecimiento (por ejemplo, EGF + Heregulina) antes del inmunoanálisis de la expresión y/o activación de la vía de ErbB subsecuente. En otros casos, los ensayos de proximidad de esta modalidad utilizan muestras de tejido tumoral que incluyen biopsias metastásicas congeladas frescas tales como, por ejemplo, muestras de cáncer de mama triple negativo.
En ciertos casos, los ensayos de proximidad de esta modalidad usan un formato de portaobjetos e incluyen varios calibradores y controles. La figura 1 muestra los diseños de disposición de formatos de portaobjetos ejemplares para analizar niveles totales y fosforilados de HER1 y HER2. Existen 16 almohadillas en cada portaobjeto con espacio para 300 puntos en cada almohadilla. Una impresora de microdisposición por contacto se usa para imprimir en los portaobjetos de nitrocelulosa de 16 almohadillas. Cada punto incluye un colorante de rastreo y ya sea un anticuerpo de captura (Ab) específico o controles impresos por triplicado en diluciones en serie. Los Abs de captura se imprimen a 1 mg/ml, 0.5 mg/ml y 0.25 mg/ml. IgG purificada se imprimió como una referencia de orientación en ensayos tanto totales como Fosfo. BSA-Fosfo se imprimió como un control de reactivo. Las reacciones de calibración analítica se llevan a cabo en 8 almohadillas y las reacciones de control de calidad internas en 2 almohadillas. Cada portaobjetos permite el procesamiento de hasta 4 muestras de pacientes desconocidas. La expresión de proteínas objetivo totales o proteínas activadas fosforiladas puede reportarse en una unidad computada (CU), una unidad a base de cálculo de curvas estándares de lisado diluido a partir de líneas celulares positivas que exprese la proteína de interés. Dos portaobjetos separados se usan para cada muestra; un portaobjetos para detectar la expresión de las proteínas objetivo en células aisladas de sangre entera ("portaobjetos de ensayo total") y el otro para la detección de fosforilación para detectar el grado de activación de proteínas objetivo ("portaobjetos de ensayo fosfo").
En una modalidad, sangre entera de pacientes e individuos de control normales se toma en tubos con EDTA. Para evitar cualquier contaminación de células dérmicas durante la extracción de sangre, nuestros procedimientos estipulan que los primeros 3 ml_ de sangre recolectada se descartan (o se recolectan en un tubo CellSave para recuentos de CTC e inmunotinción visual usando el kit CellSearch). Dos tubos con EDTA adicionales se usan después para recoger 7.5 ml_ de sangre entera en cada tubo. Los CTCs son luego aislados de cada tubo usando un dispositivo de separación de células magnético automático (Vendex AutoPrep). Las muestras enriquecidas se combinan y luego se estimulan con factores de crecimiento. Las células activadas son después lisadas y ya sea procesadas inmediatamente o almacenadas a -80°C para inmunoanálisis subsecuente. En otra modalidad, células de tejido tumoral tales como biopsias metastásicas congeladas frescas se obtienen, se lisan para producir un extracto celular y después ya sea que se procesen inmediatamente o se almacenen a -80°C para inmunoanálisis subsecuente.
Los ensayos de proximidad de esta modalidad son iniciados al incubar objetivos de proteínas en lisados celulares con anticuerpos de captura en una superficie de inmuno-microdisposición. Cualquier HER1 u otra RTK o proteína de vía de transducción de señales en lisados celulares se unen a sus anticuerpos de captura correspondientes y posteriormente inmuno-complejos únicos son formados por dos anticuerpos detectores adicionales. Uno de los anticuerpos detectores se conjuga a glucosa oxidasa (GO) y genera H202 en presencia de glucosa. Cuando el segundo anticuerpo detector conjugado a HRP es unido en proximidad dentro del inmuno-complejo, se genera una señal positiva. El proceso de amplificación de señales mediado por tiramida subsecuente incrementa la sensibilidad del ensayo. La especificidad de detección de proteínas es incrementada por la unión concurrente de tres Abs específicos a diferentes epítopos, y la sensibilidad puede ser tan alta como de una sola célula debido a al amplificación. La figura 2 muestra un esquema de un ensayo de proximidad ejemplar para detectar HER1 fosforilado.
La plataforma de microdisposición descrita en la presente ofrece el beneficio de multiplexión. La capacidad de expandir el ensayo hace posible el análisis de alto contenido con la medición de varios receptores y moléculas señalizadoras a partir de una muestra disponible limitada. La microdisposición es escalable y tiene el potencial de lograr la emisión necesaria para un ensayo de diagnóstico clínicamente útil.
Ejemplo 2 La expresión de EGFR y VEGFR2 predice la respuesta a quimioterapia con Nab-paclitaxel (nabPVcarboplatino (CVbevacizumab (B) en cáncer de mama metastásico triple negativo (TN BC) ANTECEDENTES Pacientes con cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC), en las cuales su cáncer no demuestra expresión de estrógeno, progesterona o receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), enfrentan un pronóstico deficiente (Dent, R. et al., Clin Cáncer Res: 13(15 Pt 1 ):4429-4434 (2007)). Terapias mejoradas y marcadores predictivos se requieren en este escenario.
Combinaciones de B (bevacizumab; Avastin®) y C (carboplatino) son activas en muchos tumores sólidos, incluyendo TNMBC. Nab-paclitaxel (nabP; Abraxane®) se dirige potencialmente a SPARC, una proteína de unión a albúmina secretada por tumores.
Las quimioterapias a base de taxano y platino tienen actividad significativa en el tratamiento de primera línea de cáncer de mama metastásico y son particularmente efectivas cuando se dan en combinación (Pérez, E. A., Oncologist 9(5):518-527 (2004); Pérez, E. A. et al., Oncology 69(2):1 17-121 (2005); O'Shaughnessy J., Oncologist 10(Suppl 3):20-29 (2005)). (nab)-Paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas tiene eficacia y tolerabilidad mejoradas en combinación con paclitaxel estándar (Gradishar, W. J. et al., J Clin Oncol. 23(31 ):7794-7803 (2005)).
Entre los agentes de platino, el carboplatino parece tener eficacia similar y es mejor tolerado que cisplatino cuando se combina con un taxano, con un riesgo más bajo de toxicidad no hematológica, aunque con un riesgo un poco mayor de toxicidad hematológica (Gainford, C. et al., Proc Am Soc Clin Oncol. 19: 13, Abstract 439 (2000); Pérez, E. A. et al., Cáncer 88(1 ):124-131 (2000); Pérez, E. A. et al., Oncology 69(2): 1 17-121 (2005)). La incidencia de neutropenia se reduce cuando el carboplatino se combina con paclitaxel en lugar de docetaxel (Pérez, E. A. et al., Cáncer 88(1 ):124-131 (2000); Pérez, E. A. et al., Oncology 69(2): 1 17-121 (2005)).
Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal que se dirige a factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para inhibir angiogénesis. Añadir bevacizumab a quimioterapia a base de taxanos mejora significativamente los índices de respuesta de tratamiento y la supervivencia libre de progresión (PFS) en mujeres con cáncer de mama mestastásico (Miller, K. D. et al., N. Engl J Med. 357(26):2666-2676 (2007); Miles, D. W. et al., Cáncer Res. 69(24S):495s, Abstract 41 (2009); Robert, N. J. et al., J Clin Oncol. 27(15 suppl): 42s, abstract 1005 (2009)).
OBJETIVO Este estudio usó biopsias metastásicas de inscripción (bxs) de TNMBC no tratado para (1 ) describir la expresión/activación de vías de señalización en TNMBC, y (2) correlacionar estos patrones de expresión en TNMBC con respuesta.
MÉTODOS Biopsias metastásicas congeladas frescas obtenidas al inicio de la prueba se usaron para evaluar la expresión y activación de proteínas de vía de señalización (por ejemplo, HER1 (EGFR), HER2, HER3, receptor 1 de factor de crecimiento tipo insulina (IGF1 -R), c-KIT, c-MET, PI3K, AKT, MAPK, y/o VEGFR2). Se usó una plataforma de ensayo de proximidad tal como CEER para determinar la expresión y activación de proteínas de vía comprensiva. La prueba de clasificación logarítmica se usó para evaluar la asociación entre supervivencia libre de progresión (PFS) y expresión o activación de proteína de las proteínas de la vía. Las muestras de tejido de tumor usadas en este estudio se obtuvieron de una prueba clínica que está teniendo lugar titulada "A Phase II Study of Abraxane®, Carboplatin and Bevacizumab [triplet therapy] in 'Triple Negative' (Demonstrating No Expression for Estrogen, Progesterone, or Her2 Receptors) Metastatic Breast Cáncer" con el siguiente identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00479674, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
RESULTADOS EGFR total se expresó en 1 1/18 (61%) biopsias, pero fue activado en 3/18 (17%). PI3K y AKT fueron sobre-expresadas en 1 1/18 (61 %) y 8/18 (44%) pacientes, respectivamente, y fueron co-expresadas en 6/18 (33%) biopsias. En 17 biopsias metastasicas, hubo una expresión de EGFR total más alta (33 semanas vs. 22 semanas, p=0.14) y expresión más baja de VEGFR2 (33 semanas vs. 18 semanas, p=0.16). Todas las mediciones se llevaron a cabo por CEER.
CONCLUSIONES Nab-Paclitaxel/carboplatino/bevacizumab ofrece una terapia bien tolerada y efectiva para TNMBC. La sobre-expresión de EGFR total y niveles más bajos de VEGFR2 ofrecen valor predictivo para la respuesta a la terapia triple en TNMBC. Las biopsias metastásicas en tiempo real indican que ocurren cambios importantes entre tumores primarios y metastásicos, y estos cambios tienen alta influencia en la definición de marcadores predictivos de la respuesta para TNMBC.
Ejemplo 3 Perfilado de vía comprensivo para predecir la respuesta a terapia que contiene carboplatino (CVbevacizumab (B) en cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC) Antecedentes: Terapias mejoradas y marcadores predictivos se requieren en TNMBC. Las combinaciones de B (Avastin) y C (Carboplatino) son activas en muchos tumores sólidos, incluyendo TNBC. Este estudio usó biopsias primarias y metastásicas de archivo (bxs) de TNMBC no tratado (1 ) para determinar el nivel de expresión de VEGFR2 en primarias y TNMBC, (2) para describir la expresión/activación de varias proteínas de la vía de señalización en TNMBC y (3) para correlacionar estos patrones de expresión en TNMBC con respuesta.
Métodos: Especímenes de biopsia central de cáncer de mama triple negativo se recogieron y se congelaron adecuadamente a -80°C. Un método de inmunoensayo novedoso se aplicó para investigar los niveles de expresión y activación de proteínas de señalización en 1000 ng a 5000 ng de tejidos congelados. La plataforma CEER (es decir COPIA) es una plataforma de inmuno-microdisposición multiplexada que utiliza la formación de un inmuno-complejo único que requiere la co-localización de dos anticuerpos detectores para canalizar eventos para generación/amplificación de señales que se traduce en sensibilidad y especificidad analíticas extremadamente altas.
Resultados: Este estado identificó grados variables de valores CK en cada espécimen (de aproximadamente 3 a 1000 células tumorales/1000 ng a 5000 ng de lisado celular). En estos TNMBCs, los niveles de expresión de HER2 variaron de bajos a moderados (0 a 2 +, equivalente IHC) y se encontraron en 17 de 18 muestras. Una de 18 muestras tuvo niveles sustancialmente altos de expresión de HER2 (nivel IHC 3+). 50% De los especímenes no mostraron fosforilación de HER2 mientras que el otro 50% mostró niveles variables de HER2 activado. La prevalencia de expresión/activación de HER1 , HER3, IGF1-R, c-KIT, c-MET, PI3K, Shc, VEGFR2, y AKT también se analizó en estas muestras.
Conclusión: Las biopsias metastásicas en tiempo real indican que ocurren cambios importantes entre tumores primarios y metastásicos, y que estos cambios tienen alta influencia en definir marcadores de respuesta predictivos. La sobre-expresión de EGFR total y activado, y niveles de VEGFR2 más bajos ofrecen un valor predictivo para la respuesta a la terapia triple (B+C+Nab-paclitaxel) en TNMBC. Como el perfil de enfermedad comúnmente se desplaza, monitorear las alteraciones en las proteínas de vía de transduccion será útil para ajustes en la terapia.
Ejemplo 4 Perfilado funcional de varias proteínas de vía de señales en pacientes con cáncer de mama RESUMEN DEL EJEMPLO 4 Uno de los mecanismos de la resistencia de novo o adquirida es la expresión de varias formas de receptores HER2/ERBB2 truncados ("t-ERBB2") con dominios extracelulares amino-terminales ausentes. Ejemplos no limitativos de isoformas de t-ERBB2 incluyen p1 10, p95HER2 (p95m), p95c, y p95n. Los métodos para perfilar varias formas de receptores de HER2 y otras tirosina cinasas receptoras (RTKs) con potencial de transactivación en tumores primarios y metastásicos pueden proporcionar un conocimiento valioso sobre estas patogénesis de enfermedad cambiantes. Este ejemplo describe el perfilado exitoso de un panel de proteínas de vía de transduccion de señales para su expresión y activación en 230 cáncer de mama con varios estados ER/PR/HER2. En particular, los niveles de especies de t-ERBB2 totales y fosforilados en muestras de tumor de mama humanos se investigaron usando el novedoso método de inmuno-microdisposición mediada por proximidad descrita en la presente. Este ejemplo muestra que las isoformas t-ERBB2 se detectaron en tumores fuertemente ERBB2 positivos (16 de 31 muestras, 52%) y fueron fosforilados en 10 de 38 muestras (32%).
INTRODUCCIÓN Se han reportado varios mecanismos para resistencia a trastuzumab. Principalmente, la activación de otras RTKs (tales como IGF1-R) y la acumulación de formas truncadas de HER2 se han reportado frecuentemente, entre otros mecanismos. En particular, los fragmentos de la terminal carboxilo truncados amino terminalmente de HER2, conocidos colectivamente como p95HER2, son frecuentemente encontrados en líneas de células de cáncer de mama que expresan HER2 y tumores. La interferencia entre varias vías de transducción de señales y circuitos de retroalimentación proporciona mecanismos de escape para tumores bajo cierta presión terapéutica o adicción a vías y requiere de una herramienta de diagnóstico comprensiva para llevar a cabo "análisis de red de vías". Las decisiones del tratamiento hechas con base en información clínica obtenida a través de tecnología actual a base de IHC/FISH llevadas a cabo para pocos biomarcadores seleccionados no serán efectivas para tratar pacientes con enfermedad heterogénea de rápida evolución. Este ejemplo demuestra que una configuración diferente de anticuerpos detectores permite la detección diferencial de objetivos truncados (por ejemplo, p95HER2) a partir de sus contrapartes de longitud completa (por ejemplo, HER2). En particular, este ejemplo ilustra el uso de un novedoso formato de microdisposición para anticuerpos específicos y altamente sensible, Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER), para cuantificar los niveles de especies de t-HERBB2 totales y fosforiladas en muestras humanas, tanto en tejido congelado instantáneamente como en aspirados con aguja fina de tumores metastásicos. Este ejemplo demuestra además un análisis del estado funcional (expresión y activación) de HER2, p95HER2, HER1 , HER3 e IGF1 R así como las proteínas de transducción de señales hacia el extremo 3' PI3K, Shc y c-MET.
MÉTODOS Impresión de microdisposición multiplexada: Anticuerpos de captura (Abs) fueron impresos en portaobjetos de vidrio recubiertos con nitrocelulosa (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) usando impresoras no de contacto (Nanoplotter, GeSiM). El diámetro de punto fue de aproximadamente 175 pm y los portaobjetos impresos fueron mantenidos en una cámara desecada a 4°C. cada punto incluía un colorante de rastreo y Abs de captura específicos. Aproximadamente 500 pL de Abs de captura fueron impresos por triplicado y a concentraciones de dilución en serie de 1 mg/mL, y 0.25 mg/mL IgGs de ratón purificadas fueron impresas como un control negativo. Cada portaobjetos contiene controles de líneas celulares para generación de curvas estándares para cuantificación precisa de muestras en cada ejecución del portaobjetos. Muestras de control de calidad interna se ejecutan en cada portaobjetos para asegurar la calidad de datos generados a partir de cada disposición de portaobjetos.
Conjugación y purificación de anticuerpos: Abs específicos de objetivo y enzimas detectoras correspondientes fueron activados con un entrelazador bifuncional, ciclohexan-1 -carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), y acoplados a dextrano para ser conjugados poliméricos de anticuerpo-dextrano-enzima. El conjugado se purificó mediante HPLC usando una columna de exclusión por tamaño. Las actividades de Ab en los conjugados purificados se detectaron por ELISA de competencia y la actividad enzimatica se detectó mediante un ensayo funcional específico para cada enzima detectora.
Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER): Como se ilustra en la figura 3, las proteínas objetivo presentes en lisados tisulares se unen a anticuerpos de captura específicos impresos sobre la superficie de nitrocelulosa y las proteínas no objetivo que no se unen son retiradas del portaobjetos. La interacción enzimática entre un anticuerpo detector contra un epítopo alternativo en una proteína objetivo capturada conjugada a glucosa oxidasa (GO) y el otro anticuerpo detector específico para un sitio fosforilado en la proteína objetivo u otro epítopo no superpuesto conjugado a HRP se traduce en generación de señales y posterior amplificación de señales mediada por tiramida. En particular, los portaobjetos de la inmuno-microdisposición se enjuagaron dos veces con TBST (50 mM de Tris/150 mM de NaCI/0.1 % de Tween-20, pH 7.2-7.4), se bloquearon con 80 µ?_ de regulador de pH de bloqueo Whatman durante 1 hora a temperatura ambiente, y después se lavaron 2 veces con TBST. Controles de lisados celular diluidos en serie en 80 µ?_ de regulador de pH de dilución (2% de BSA, 0.1 % de Tritón X-100 TBS, pH 7.2-7.4) y muestras fueron añadidos a sub-disposiciones y diseñados para estándares en el portaobjetos, luego incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, los portaobjetos fueron lavados 4 veces, 3 minutos cada vez. Los Abs detectores fueron añadidos en 80 µ?_ de regulador de pH de reacción e incubados durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de que los Abs de detectores secundarios no unidos fueron retirados con lavado con TBST, 80 µ?_ de biotina-tiramida (400 µg/mL en etanol, Perkin Elmer Life Science) a 5 µg/ml en 50 mM de glucosa/PBS fueron añadidos e incubados durante 15 minutos en la oscuridad. El proceso de amplificación de señales mediado por tiramida canalizado por GO-HRP fue concluido por lavado con TBST 4 veces durante 3 minutos cada una. La deposición local de biotina-tiramida se detectó al añadir estreptavidina (SA)-Alexa647 (en PBS, Invitrogen) a 0.5 pg/ml (1 :4000 de dilución) en 2% de BSA/0.1 % de Triton/TBS durante 40 minutos. Una vez concluida la incubación, los portaobjetos fueron lavados 4 veces con TBST, secados y mantenidos en la oscuridad hasta el escaneo en el escáner de microdisposición.
Enriquecimiento con tErbB2 (por ejemplo, p95HER2): Receptores p185-ErbB2 de longitud completa fueron retirados de lisados celulares usando anticuerpos marcados magnéticamente específicos para el dominio extracelular (ECD) de ErbB2. El Usado celular depletado de p185-ErbB2 resultante contiene proteínas receptores t-ERBB2 que carecen del ECD y se llevaron a cabo análisis posteriores para cuantificar el nivel de expresión y activación de t-ERBB2.
Muestras clínicas: Los tejidos de cáncer de mama congelados instantáneamente se compraron de ILSBio. Todos los pacientes eran caucásicos con carcinoma ductal en etapa II o III. El estado de ErbB2-IHC estuvo disponible para todas las muestras. Las muestras de tejido congeladas rápidamente se lisaron en 100 pL de regulador de pH de lisis. Las muestras lisadas se mantuvieron sobre hielo durante 30 minutos y se centrifugaron. Las concentraciones de proteínas de los sobrenadantes se determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce), y los lisados resultantes se almacenaron a -80°C antes del análisis subsecuente. Las muestras de FNA se recolectaron de pacientes con cáncer de mama en etapa IIIB o etapa IV metastásico mesurable y progresivo, y quienes estaban a punto de iniciar terapia sistémica. Los pacientes tenían cáncer de mama invasivo confirmado histológicamente o citológicamente. Las muestras de FNA se tomaron usando agujas calibre G23. Las muestras de FNA se inyectaron inmediatamente en viales de colección que contenían regulador de pH de lisis y se transportaron durante la noche para su análisis subsecuente.
IP-Western Blotting: Los lisados celulares fueron incubados con esferas magnéticas conjugadas con anticuerpos contra el ICD de ERBB2 durante la noche en un basculador a 4°C. Los lisados enriquecidos inmuno-magnéticamente fueron resuspendidos en regulador de pH de muestra que contenía ß-mercaptoetanol, hervidos durante 5 minutos, enfriados a temperatura ambiente y cargados en un gel NuPage (Invitrogen) al 4-12%. Después de la conclusión, las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, luego lavadas, bloqueadas con 5% de absorbente de leche e incubadas con el 1 o y luego el 2° anticuerpo antes del proceso de detección usando NBT/BCIP.
Análisis de datos CEER: Cada portaobjetos fuer escaneado en tres escenarios de ganancia de fotomultiplicador (PMT) para incrementar el intervalo dinámico efectivo. Las intensidades de señales corregidas en fondo se promediaron para replicar los puntos impresos por triplicado. El valor de fluorescencia relativo del blanco de reactivo respectivo se restó de cada muestra. Se usaron varios criterios de calidad para filtrar datos de análisis adicionales incluyendo límites en la huella del punto, coeficiente de variación para réplicas de puntos, fondo de almohadilla total y la intensidad del blanco de reactivo. Para cada ensayo, se generó una curva estándar a partir de lisados celulares diluidos en serie preparados a partir de células VT474. Los datos se ajustaron en una ecuación de cinco parámetros derivada como una función de la concentración de anticuerpos de captura y PMT. Cada curva fue graficada como una función de intensidad de señal logarítmica, medida como unidad de fluorescencia relativa (RFU) contra concentración logarítmica y referenciada a la línea celular estándar, BT474. Las predicciones individuales de cada dilución y ganancia fueron promediadas en una sola predicción final.
RESULTADOS Expresión de t-ERBB2 en células y tumores humanos. Para evaluar los niveles y activación de isoformas de ERBB2 en muestras de células y tumores humanos, CEER, se empleó una novedosa plataforma de captura de anticuerpos e inmuno-microdisposición a base de proximidad (figura 3). CEER requiere la formación de un inmuno-complejo entre el anticuerpo de captura específico de objetivo y dos anticuerpos detectores adicionales. Uno de los anticuerpos detectores se conjuga con glucosa oxidasa (GO) y el otro se conjuga con peroxidasa de rábano (HRP). Los anticuerpos detectores pueden unirse ya sea a dos epítopos diferentes (lo cual determina el nivel de expresión objetivo) o a un dominio fosforilado en la proteína capturada y a un epítopo alternativo (que determina el nivel de activación de objetivo). Cuando GO en el inmuno-complejo se suministra con un substrato tal como glucosa, genera peróxido de hidrógeno (H202) que es canalizado al HERP co-localizado, incrementando de esta manera la sensibilidad analítica. Ya que la configuración del ensayo requiere una formación de inmuno-complejo exitosa entre varios anticuerpos de captura/detectores, la plataforma proporciona la especificidad necesaria para análisis simultáneos en varias proteínas objetivo. Como se muestra en la figura 3, este método es capaz de detectar ERBB2 total y fosforilado en líneas de células BT474 con sensibilidad analítica de un solo dígito. La comparación del perfilado de ERBB2 diferencial (con capturas de ERBB2-ECD y ERBB2-ICD) de células BT474 con y sin la remoción del p185-ERBB2 de longitud completa demostró que había aproximadamente 4.4% de t-ERBB2 (o -52800 receptores de tERBB2/célula) en esta línea celular amplificada con ERBB2 con aproximadamente 1 .2 X 106 receptores ERBB2/célula (figura 5).
Muestras de tumor de mama congeladas de 74 pacientes fueron calificadas para los niveles de ERBB2 usando análisis inmunohistoquímico y luego se analizaron usando CEER (tabla 3). De las 74 muestras, 24 fueron ERBB2 bajas/negativas (puntuación = 0-1 por IHC), 19 tenían expresión de ERBB2 moderada (puntuación =2), y las 31 restantes tuvieron alta expresión de ERBB2 (puntuación =3). Mediante análisis CEER, ninguno de los tumores de ERBB2 bajo o negativos expresaron un nivel significativo de ERBB2 truncado, como se esperaba. Los niveles de ERBB2 y t-ERBB2 y t-ERBB2 fosforilado en cada muestra (mostrados en las moléculas RTK/célula en referencia a células BT474) se resumen en la tabla 2. Sin embargo, 10% (2 de 19) tumores ERBB2-positivos moderados expresaron t-ERBB2, y 52% (16 de 31 ) tumores fuertemente ERBB2-positivos expresaron t-ERBB2. Además, las isoformas de t-ERBB2 fueron fosforiladas tanto en tumores moderadamente ERBB2-positivos (10%, 2 de 19 muestras) como alta expresión de ERBB2 (32%, 10 de 31 ). Hubo muestras con niveles significativos de fosforilación de tERBB2 y sólo niveles moderados de t-ERBB2 (20330 y 24913), y esto puede ser posible porque t-ERBB2 puede ser activado a través de interacción con otras RTKs. Ejemplos de perfilado de CEER-ERBB2 de tumores y análisis IP-Western de ERBB2 se proporciona en la figura 6 (las muestras están subrayadas en la tabla 2) y figura 7 (las muestras están encerradas en un cuadro en la tabla 2), respectivamente. Además, FNAs de sitios metastásicos de 8 pacientes de cáncer de mama fueron analizados. Tres muestras con enfermedad ERBB2-positiva mostraron grado variable de t-ERBB2 y t-ERBB2-fosforilado (tabla 3) mientras que las muestras de cánceres negativos para ERBB2 no mostraron la expresión de t-ERBB2. En el perfilado de RTK expandido, se detectó la expresión de IGF1 R y c-MET en 8C3-005-006, y esto puede ser la causa del nivel más alto de pt-ERBB2 a pesar de un nivel más bajo de t-ERBB2 entre muestras de FNA positivas para ERBB2.
Tabla 1 Expresión y fosforilación de t-ERBB2 en tumores de mama humanos Tabla 2 Perfilado de ERBB2 de tejido de cáncer de mama Las imágenes de la disposición CEER ejemplares se muestran para las muestras subrayadas en la figura 6 y el IP-Western blot para las muestras en cuadro se muestran en la figura 7. Los valores RTK/célula se determinan al comparar la cantidad de entrada de muestras y la cantidad equivalente de células BT474 estándares.
Tabla 3 Análisis t-ERBB2 para muestras de FNA Una amplia gama de expresión y activación de proteínas de vía en 174 muestras de BCA se observó como se muestra en la figura 8. La muestra con la señal más alta para cada marcador se indica con el color más oscuro. El CEER-HER2 mostró alta correlación con el estado de IHC-HER2. El estado de HER2 discordante entre CEER e IHC se resolvió mediante IP-Western y mostró >98% de correlación. El nivel de HER3-P mostró alto grado de correlación con la activación de HER3-T y PI3K. El perfil de cMET también demostró fuerte correlación con la activación de PI3K. 27% (12-45 de 2+ por IHC) y 21 % (1 1/53 de 0/1+ por IHC) de tejidos BCA con niveles no sobre-expresantes pero significativos de HER2 mostró más de 5% de fosforilación de receptor HER2 expresado.
CONCLUSIÓN El estado de HER2 y sus formas variantes así como otras RTKs proporciona información crítica sobre los mecanismos potenciales para pacientes de BCA HER2-positivos quienes no responden a trastuzumab debido ya sea a una resistencia primaria o adquirida. El análisis CEER descrito en la presente puede utilizarse para perfilar pacientes de BCA para sus proteínas de transducción de señales para seleccionar una terapia dirigida efectiva.
Ejemplo 5 Perfilado de vía comprensivo para predecir la respuesta a terapia en cáncer de mama metastásico triple negativo (TNMBC) Terapias mejoradas y marcadores predictivos se requieren en TNBC. Este estudio usó especímenes de biopsia central a partir de pacientes con cáncer de mama triple negativos tratados con B (Avastin® [bevacizumab]), C (carboplatino), y nabP (Abraxane®) ("terapia triple") para (1 ) determinar el nivel de expresión y activación de varias proteínas de vía de señalización en TNMBC (por ejemplo, VEGFR2, c-KIT, HER , etc.) y (2) correlacionar estos patrones de expresión y activación en TNMBC con respuesta.
Muestras de biopsia central de cáncer de mama triple negativo (n=17) obtenidas de pacientes antes de iniciar el tratamiento con B (Avastin® [bevacizumab]), C (carboplatino) y nabP (Abraxane®) se recolectaron y se congelaron adecuadamente a -80°C. se aplicó un método de inmunoensayo novedoso para investigar los niveles de expresión y activación de proteínas de señalización en 1000 ng a 5000 ng de tejidos congelados. El Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER) (conocido también como el Inmunoensayo de Proximidad Colaborativo (COPIA)) como el descrito en la presente es una plataforma de inmuno-microdisposición multiplexada que utiliza la formación de un inmuno-complejo único que requiere la co-localización de dos anticuerpos detectores para canalizar eventos para lograr generación/amplificación de señales que se traduce en sensibilidad y especificidad analíticas extremadamente altas. La figura 9 proporciona un ejemplo de perfilado de vías funcionales por CEER en una muestra de biopsia central de cáncer de mama triple negativo en comparación con células de cáncer de mama T47D de control y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). En particular, la expresión y activación de las siguientes proteínas de vías de señalización en TNMBC se evaluaron por CEER: EGFR (HER1 ), HER2, HER3, c-Met, IGF-1 R, c-KIT, PI3K, SHC, AKT y VEGFR2.
También se determinó la supervivencia libre de progresión (PFS). Para cada marcador, las muestras se dividieron en grupos "altos" y "bajos" con base en un valor límite. Por ejemplo, el valor límite puede ser seleccionado en o cerca de la media para igualar los tamaños de grupo (por ejemplo, 8=bajo; 9=alto). La prueba t paramétrica se usó para correlacionar la expresión y activación de proteínas con PFS. La PFS se comparó para los grupos bajo (por ejemplo, debajo de la media) contra altos (por ejemplo, por arriba de la media). La figura 10 ilustra los resultados de esta comparación entre la PFS para los grupos de muestras bajos y altos para cada marcador. En particular, la tabla de la figura 10 muestra que una baja expresión de c-KIT o de VEGFR2 está asociada con una duración significativamente más larga de PFS en comparación con niveles más altos de ese marcador (42.1 semanas de PFS para niveles de c-KIT totales bajos contra 20.7 semanas de PFS para niveles de c-KIT totales altos; 39.9 semanas de PFS para niveles de VEGFR2 totales bajos contra 20.9 semanas de PFS para niveles de VEGFR2 totales altos). La tabla de la figura 10 también muestra que una baja activación de IGF-1 R, baja activación de c-KIT, baja expresión de IGF-1 R y baja activación de HER1 estuvieron cada una asociada con duración más larga de PFS en comparación con niveles más altos de ese marcador. Además, la tabla de la figura 10 muestra que una alta expresión de HER1 está asociada con una duración más larga de PFS en comparación con niveles más bajos de ese marcador (36.8 semanas de PFS para niveles de HER1 totales altos contra 23.4 semanas de PFS para niveles de HER1 totales bajos). La tabla de la figura 1 1 ilustra un análisis similar usando una prueba de suma de clasificación de Wilcoxon no paramétrica para correlacionar la expresión y activación de proteínas con PFS. Una baja expresión de c-KIT o VEGFR2 mostró nuevamente estar asociada con una duración significativamente más larga de PFS en comparación con niveles más altos de ese marcador.
La figura 12 muestra que medir los niveles de expresión tanto de c-KIT como de VEGFR2 incrementa el valor predictivo de determinar la respuesta a la terapia triple en TNMBC. En particular, una combinación de bajos niveles de expresión de c-KIT y VEGFR2 ("ninguno alto") se encontró que estaba asociada con una duración significativamente más larga de PFS en comparación con muestras en las cuales uno o ambos marcadores fueron altos ("uno alto" o "ambos altos").
La figura 13 muestra que medir los niveles de expresión tanto de VEGFR2 como de HER1 incrementa el valor predictivo de determinar la respuesta a la terapia triple en TNMBC. En particular, una combinación de niveles de expresión de HER1 altos y VEGFR2 bajos ("ninguno malo") se encontró que estaba asociada con una duración significativamente más larga de PFS en comparación con muestras en las cuales la expresión de HER1 era baja y/o la expresión de VEGFR2 era alta ("uno malo" o "ambos malos").
Las figuras 14A - 14C ilustran la correlación entre niveles cada vez más altos de (14A) VEGFR2 total, (14B) c-KIT total y (14C) HER1 total y respuesta a terapia triple, como se indica por la longitud de PFS. En particular, niveles de VEGFR2 o c-KIT totales más bajos estuvieron asociados con respuesta a terapia triple en TNMBC, mientras que niveles de HER1 totales más altos estuvieron asociados con respuesta a terapia triple en TNMBC.
En conclusión, este ejemplo demuestra que: (1 ) existe una correlación entre los niveles activados (fosfo) y totales tanto para c-KIT como para IGF-1 R; (2) bajos niveles de expresión de VEGFR2 o c-KIT son predictivos de respuesta; (3) altos niveles de expresión de EGFR (por ejemplo, debe responder a terapias a base de platino) se correlacionen con respuesta, mientras que altos niveles de P-EGFR no; (4) en general, si la activación de vía (por ejemplo, P-c-KIT, p-IGF-1 R, p-EGFR, p-AKT, y otros) es baja (por ejemplo, tumor no altamente proliferativo), el paciente tiene una PFS más alta a terapia triple de carboplatino, Nab-Paclitaxel y Avastin; y (5) para terapéuticos en combinación, la adición de la expresión de VEGFR2 total a la expresión de c-KIT o EGFR total se traduce en mejores valores predictivos.
Ejemplo 6 Recolección v procesamiento de tejido tumoral Tejido tumoral o muestras de FNA pueden obtenerse de pacientes con cáncer para interrogación de vía de transducción de señales usando los ensayos de proximidad descritos en la presente (por ejemplo, CEER). Por ejemplo, muestras para análisis de vía pueden obtenerse a partir de tejidos congelados ya sea al seccionar o llevar a cabo un procedimiento FNA congelado. En ciertos casos, el seccionado de tejidos se lleva a cabo en especímenes congelados para análisis de perfil subsecuente. En ciertos otros casos, el procedimiento FNA relativamente no invasivo se lleva a cabo para obtener muestras de pacientes (y xenoinjertos) en un ambiente clínico.
Muestras de tejido congeladas pueden tomarse mediante los siguientes métodos: Opción #1 . Recolección de secciones de tejido: 1. Mantener un bote de ponderación de plástico en hielo seco, en el cual tendrá lugar el corte de la muestra. a. Para enfriar los materiales, mantener hojas de rasurar o cuchillas de micrótomo, fórceps finos y viales de recolección de muestras pre-etiquetados en hielo seco. 2. Tomar tejidos de cáncer humano congelados a partir de un congelador a -80°C y transferir las muestras inmediatamente sobre hielo seco. 3. Poner tejido congelado en recipiente de ponderación sobre hielo seco, cortar pequeñas piezas de tejido congelado (sección de 10 µ?? x 3) usando la hoja de afeitar o cuchilla de micrótomo, y transferir el tejido a un vial de recolección de muestras pre-enfriado y pre-etiquetado usando fórceps pre-enfriados. 4. Cerrar la tapa y mantenerlo sobre hielo seco. 5. Poner especímenes recolectados en una bolsa de plástico doble primero y luego en un recipiente de Styrofoam . (recipiente primario) con cantidad adecuada de hielo seco. a. Usar al menos 3-4 kilos (6-8 libras) de hielo seco. Usar más en los meses de verano.
NOTA: La cantidad exacta de hielo seco será determinada después de consultar con una compañía transportista. b. Consultar con la compañía transportista para el proceso de transportación internacional para permisos y documentación necesarios. c. No usar hielo húmedo, o refrigerantes (es decir, Cool Packs). 6. Asegurarse de que la requisición y lista de muestras se coloque en la caja, pero en el exterior de la bolsa doble. 7. Sellar de manera segura el recipiente y etiquetar "Tejido Congelado-No Descongelar".
Opción #2. Preparación de FNA a partir de tejidos congelados: 1. Tomar tejidos de cáncer humano del congelador a -80°C y transferir viales de muestra inmediatamente sobre hielo seco. 2. Las muestras listas para el procedimiento FNA deben ser puestas en hielo húmedo durante 10 minutos para ablandar el tejido. 3. La recolección de muestras de FNA debe llevarse a cabo al pasar una aguja calibre 23 ó 25 a través de tejido congelado ablandado 5 a 10 veces. Regresar el vial de muestra restante a hielo seco. 4. Limpiar la tapa del vial de recolección de muestra de FNA con alcohol. 5. Los tejidos de FNA congelados deben ser recolectados por inyección directa en el vial de recolección que contiene 100 µ? de "solución posterior de proteínas" (Prometheus Laboratories; San Diego, CA). Colocar los materiales tisulares recogidos al mezclar suavemente el contenido. 6. Sostener el vial de recolección de FNA firmemente con una mano y llevar a cabo inclinación con los dedos rápida (~15x) para asegurar una lisis celular completa (someter a vórtice durante 10 segundos si es posible). 7. Poner especímenes recolectados en una bolsa de plástico doble primero y después en un recipiente de Syrofoam (recipiente primario) con Cool Packs. a. Consultar con la compañía transportista para el proceso de transportación internacional para los permisos y documentación necesarios. 8. Asegurarse de que la requisición y lista de muestras se ponga en la caja, pero en el exterior de la bolsa doble. 9. Sellar en forma segura el recipiente y etiquetar con "espécimen biológico".
Ejemplo 7 Análisis de datos para la cuantificación de proteínas de vía de transducción de señales en células cancerosas Este ejemplo ilustra la cuantificación de los niveles de expresión y/o activación de uno o más analitos tales como una o más proteínas de transducción de señales en una muestra biológica (por ejemplo, sangre o tejido tumoral) contra una curva estándar generada para el analito de interés particular.
En algunas modalidades, cada portaobjetos de CEER es escaneado en tres ajustes de ganancia de fotomultiplicador (PMT) para mejorar la sensibilidad de reducir el impacto de saturación. Software Perkin Elmer ScanArray Express se usa para búsqueda de puntos y cuantificación de señales. Los identificadores para cada punto se importan de un archivo GenePix Array List (.gal). El número específico de estudio desidentificado para cada muestra clínica en un portaobjetos se incorpora en el conjunto de datos resultante.
En otras modalidades, intensidades de señales corregidas en fondo se promedian para puntos replicados impresos por triplicado. El valor de fluorescencia relativa del blanco de reactivo respectivo se resta de cada muestra. Se usan varios criterios de calidad para filtrar datos para análisis adicional incluyendo límites en la huella del punto, coeficiente de variación para réplicas de puntos, fondo de almohadilla total y la intensidad del blanco reactivo.
Para cada ensayo, puede generarse una curva estándar sigmoidal a partir de varias concentraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, etc.) de lisados celulares diluidos en serie preparados a partir de líneas celulares tales como MD-468 (HER1 positivo), SKBr3 (HER2 positivo), BT474 (HER2 y p95HER2 positivo), HCC827 (c-MET y HER1 positivo), T47D estimulada con IGF (IGF1 R positiva) y/o T47D estimulada con HERG (HER3 positiva). Cada curva puede ser graficada como una función de intensidad de señal contra unidades derivadas de concentración logarítmica, CU (Unidad Computada). Los datos pueden ajustarse a una ecuación de 5 parámetros (5PL) mediante regresión no lineal (Ritz, C y Streibig, J.C., J. Statistical Software, 12, 1 -22 (2005)), ajustando simultáneamente todas las tres diluciones del anticuerpo de captura. El ajuste se lleva a cabo usando R, un paquete de software estadístico de fuente abierta (Development Core Team, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051 -07-0, URL http://www. R-proiect.org .R (2008)). Para evitar la sobre-parametrización del modelo matemático y de esta manera mejorar la precisión, se pueden restringir cuatro parámetros, mientras que cada dilución puede ser resuelta para un punto de inflexión individual. Este proceso puede repetirse para cada ajuste de ganancia de P T de 45, 50 y 60. Esto se traduce en nueve curvas estándares generadas por ensayo, a partir de tres diluciones de anticuerpo de captura y tres escaneos PMT. La redundancia integrada en el ensayo permite que una o más de las combinaciones dilución/escaneo sean eliminadas si el ajuste de la curva estándar tiene un R2 de menos de 0.95 y de esta manera mejora predicciones subsecuentes.
Cálculo de CU (con base en curva estándar) - Las predicciones individuales para cada una de las curvas estándares (por ejemplo, 3 diluciones de anticuerpos de captura y 3 escaneos por ajuste de ganancia PMT) pueden combinarse en una sola predicción final. Para cada predicción, se calcula la pendiente del punto en la curva estándar. Esta pendiente se toma con unidades logarítmicas en el eje x, es decir, las unidades en el denominador de la pendiente son Unidades Computadas (CU) logarítmicas. Segundo, un promedio ponderado de las predicciones es calculado, en donde las ponderaciones se determinan a partir de las pendientes. Específicamente, las ponderaciones se suman, y a cada punto se le da una ponderación igual a su pendiente dividido entre las pendientes totales. Cada ensayo puede ser validado contra predicciones para control desconocidos.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta descripción se incorporan en la presente por referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada como incorporada por referencia. Aunque la anterior invención ha sido descrita en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para efectos de claridad de entendimiento, será fácilmente aparente para aquellos de capacidad ordinaria en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse a la misma ciertos cambios y modificaciones sin alejarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (47)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la sensibilidad de una célula tumoral triple negativa a terapia con un fármaco anticáncer, el método se caracteriza porque comprende: (a) lisar la célula tumoral para producir un extracto celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de referencia de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia indica que la célula tumoral es sensible al fármaco anticáncer.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el fármaco anticáncer se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, inhibidor de tirosina cinasa, agente quimioterapéutico, agente terapéutico hormonal, agente radioterapéutico, vacuna y combinaciones de los mismos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el fármaco anticáncer es una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el paclitaxel es un paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas (nab).
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el nivel de expresión de referencia se calcula a partir de una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la curva estándar se genera a partir de varias concentraciones de un extracto celular diluido en serie preparado a partir de la línea de células cancerosas.
7. El método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque la línea de células cancerosas expresa VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la presencia de un nivel medio a alto de expresión de VEGFR2, un nivel medio a alto de expresión de c-KIT, un nivel bajo a medio de expresión de HER1 y/o un nivel medio a alto de expresión de IGF-1 R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia indica que la célula tumoral es resistente al fármaco anticáncer.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión de VEGFR2 y c-KIT y/o HER1 en el extracto celular.
0. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende además determinar el nivel de activación de VEGFR2, c-KIT, HER1 , IGF-1 R y/o AKT en el extracto celular.
11 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende además determinar el nivel de expresión y/o activación de una o más moléculas de transducción de señales en el extracto celular.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la una o más moléculas de transducción de señales adicional se selecciona del grupo que consiste en HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, AKT, MEK, PTEN, SGK3, 4E-BP1 , ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PDK1 , P70S6K, GSK-3p, Shc, c-MET, VEGFR1 , VEGFR3, un dímero receptor y combinaciones de los mismos.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la célula tumoral es una célula de cáncer de mama.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la célula tumoral es una célula de tumor circulante o una célula de aspirado con aguja fina (FNA) obtenida de un tumor.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 , caracterizado porque la célula tumoral se aisla a partir de una muestra.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la muestra se obtiene de un sujeto con un cáncer de mama metastásico triple negativo.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre entera, suero, plasma o tejido de tumor.
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque comprende además poner en contacto la célula tumoral con el fármaco anticáncer antes de la etapa (a).
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque comprende además la etapa (d) de proporcionar el resultado de la comparación obtenida en la etapa (c) a un usuario en un formato legible.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R se determina al detectar los niveles de proteínas totales de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R se determina con un ensayo de detección doble por proximidad.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque el ensayo de detección doble de proximidad es un Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER).
23. Un método para predecir la respuesta de un tumor de mama triple negativo a terapia con un fármaco anticáncer, el método se caracteriza porque comprende: (a) lisar una célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo para producir un extracto celular; (b) determinar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular; y (c) comparar el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R en el extracto celular determinado en la etapa (b) con un nivel de expresión de VEGFR2, c- KIT, HER1 y/o IGF-1 R de referencia, en donde la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2, un bajo nivel de expresión de c-KIT, un alto nivel de expresión de HER1 y/o un bajo nivel de expresión de IGF- R en el extracto celular en comparación con el nivel de expresión de referencia es predictiva de respuesta a terapia con el fármaco anticáncer.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el fármaco anticáncer se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, inhibidor de tirosina cinasa, agente quimioterapéutico, agente terapéutico hormonal, agente radioterapéutico, vacuna y combinaciones de los mismos.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el fármaco anticáncer es una combinación de bevacizumab (Avastin®), carboplatino y paclitaxel.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el paclitaxel es un paclitaxel unido a albúmina en nanopartículas (nab).
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caractenzado porque el nivel de expresión de referencia se calcula a partir de una curva estándar generada a partir de una línea de células cancerosas.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la curva estándar se genera a partir de varias concentraciones de un extracto celular diluido en serie preparado a partir de la línea de células cancerosas.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque la línea de células cancerosas expresa VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado porque la presencia de un nivel medio a alto de expresión de VEGFR2, un nivel medio a alto de expresión de c-KIT, un nivel bajo a medio de expresión de HER1 y/o un nivel medio a alto de expresión de IGFR-1 R en el extracto celular es predictivo de una falta de respuesta a terapia con el fármaco anticáncer.
31 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión de VEGFR2 y c-KIT y/o HER1 en el extracto celular.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31 , caracterizado porque comprende además determinar el nivel de activación de VEGFR2, c-KIT, HER1 , IGF-1 R y/o AKT en el extracto celular.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, caracterizado porque comprende además determinar el nivel de expresión y/o activación de una o más moléculas de transducción de señales en el extracto celular.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la una o más moléculas de transducción de señales adicional se selecciona del grupo que consiste en HER2, p95HER2, HER3, HER4, PI3K, AKT, MEK, PTEN, SGK3, 4E-BP1 , ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PDK1 , P70S6K, GSK-3 , Shc, c- ET, VEGFR1 , VEGFR3, un dímero receptor y combinaciones de los mismos.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 34, caracterizado porque la célula tumoral es una célula tumoral circulante o una célula de aspirado con aguja fina (FNA) obtenida del tumor de mama triple negativo.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, caracterizado porque la célula tumoral se aisla a partir de una muestra.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la muestra se obtiene de un sujeto con un cáncer de mama metastásico triple negativo.
38. El método de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre entera, suero, plasma o tejido de tumor.
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 38, caracterizado porque la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2 es predictivo de una mayor duración de supervivencia libre de progresión (PFS).
40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, caracterizado porque la presencia de un bajo nivel de expresión de c-KIT es predictiva de una duración más larga de PFS.
41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 40, caracterizado porque la presencia de un alto nivel de expresión de HER1 es predictiva de una duración más larga de PFS.
42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 41 , caracterizado porque la presencia de un bajo nivel de expresión de VEGFR2 en combinación con la presencia de un bajo de expresión de c-KIT y/o un alto nivel de expresión de HER1 es predictiva de una duración más larga de PFS en comparación con el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT o HER1 solo.
43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 42, caracterizado porque comprende además incubar la célula tumoral obtenida del tumor de mama triple negativo con el fármaco anticáncer antes de la etapa (a).
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 43, caracterizado porque comprende además la etapa (d) de proporcionar el resultado de la comparación obtenida en la etapa (c) a un usuario en un formato legible.
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 44, caracterizado porque el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R se determina al detectar niveles proteínicos totales de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 R.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 45, caracterizado porque el nivel de expresión de VEGFR2, c-KIT, HER1 y/o IGF-1 se determina con un ensayo de detección doble por proximidad.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el ensayo de detección doble de proximidad es un Inmunoensayo Reactivo y Colaborativo Mejorado por Enzimas (CEER).
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