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MX2012006616A - Productos para el cuidado de las telas y el hogar. - Google Patents

Productos para el cuidado de las telas y el hogar.

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Publication number
MX2012006616A
MX2012006616A MX2012006616A MX2012006616A MX2012006616A MX 2012006616 A MX2012006616 A MX 2012006616A MX 2012006616 A MX2012006616 A MX 2012006616A MX 2012006616 A MX2012006616 A MX 2012006616A MX 2012006616 A MX2012006616 A MX 2012006616A
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MX
Mexico
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protease
variant
group
mutations
seq
Prior art date
Application number
MX2012006616A
Other languages
English (en)
Inventor
Glen Steven Ward
Philip Frank Souter
Jashua Roy Basler
Luis Gustavo Cascao-Pereira
David A Estell
James T Kells Jr
Alexander Pisarchik
Ayrookaran J Poulouse
Daniel Torres-Pazmino
Viktor Yuryevich Alekseyev
Original Assignee
Procter & Gamble
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C11D3/16—Organic compounds
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    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
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Abstract

La presente invención se refiere a productos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden una o más proteasas para agua fría y a procesos para elaborar y usar esos productos; esas composiciones proveen una mayor limpieza y renovación; esas proteasas para agua fría pueden derivarse de enzimas parentales que incluyen la subtilisina BPN' y la subtilisina derivada de Bacillus lentus por medio de sustitución, inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos de las enzimas parentales.

Description

PRODUCTOS PARA EL CUIDADO DE LAS TELAS Y EL HOGAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a productos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden proteasas para agua fría y también a métodos para elaborar y usar esos productos para el cuidado de las telas y el hogar.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los fabricantes de detergentes incorporan proteasas en sus productos para proveer una limpieza de manchas (tal como sangre) adecuada. Sin embargo, la sustentabilidad y las tendencias del consumidor hacia la reducción de las temperaturas de lavado dificultan cada vez más el suministro de beneficios aceptables para el consumidor, y persiste la necesidad de mejorar el perfil de limpieza y renovación de estas composiciones detergentes para lavandería. Los inventores han encontrado que la incorporación adicional de ciertas proteasas para agua fría en un producto para el cuidado de las telas y el hogar, por ejemplo, una composición detergente para lavandería que comprende un agente tonalizador, un polímero de limpieza y/o una cápsula de perfume mejora la blancura, la percepción de blancura y/o la renovación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a productos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden una o más proteasas para agua fría y a procesos para elaborar y usar esos productos. Esas composiciones proveen una mayor limpieza y renovación. Esas proteasas para agua fría pueden derivarse de enzimas parentales que incluyen la subtilisina BPN' y la subtilisina derivada de Bacillus lentus por medio de sustitución, inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos de las enzimas parentales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 provee un mapa de plásmidos de pHPLT-BPN'-v3. La Figura 2 provee un mapa de plásmidos de pHPLT-BPN'-V3+S78N.
La Figura 3 provee un mapa de plásmidos de pHPLT-BPN' partial opt.
La Figura 4 provee un mapa de plásmidos de pHPLT-BPN'-v36.
La Figura 5 provee un alineamiento de las proteasas subtilisinas maduras de referencia que incluyen: BPN' (SEQ ID NO:2) y GG36 (SEQ ID NO:755). Cada posición de aminoácidos de cada variante de proteasa descrita en la presente invención que incluye cada variante de proteasa para agua fría se numera de conformidad con la numeración de la posición de aminoácidos correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la proteasa subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO:2) tal como se muestra en la Figura 5 y se determina por medio de alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa con la secuencia de aminoácidos de la proteasa subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. Por lo tanto, a menos que se especifique de cualquier otra forma en la presente descripción, las posiciones de sustitución se proveen en relación con BPN'.
La Figura 6 provee un mapa de pHPLT-GG36.
La Figura 7 provee un mapa de pRA68.
La Figura 8 provee un mapa de pRA96.
La Figura 9 provee un mapa de pAC-FNAre.
La Figura 10 es una representación esquemática del método o construcción de la genoteca de ISD objetivo.
La Figura 1 1 provee un mapa de pAC-FNA10.
La Figura 12 provee un mapa de pHPLT- FNA DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se usa en la presente descripción, "productos para las telas y el hogar" se refiere a productos o dispositivos que están previstos, generalmente, para usarse o consumirse en la forma en que se venden y que están destinados al tratamiento de telas, superficies duras y cualquier otra superficie comprendida dentro del campo del cuidado de las telas y el hogar, por ejemplo, el cuidado ambiental que incluye modificadores ambientales y sistemas de suministro de fragancias, cuidado del automóvil, lavado de vajilla, acondicionamiento de telas (que incluyen renovadores y/o suavizantes de telas), detergentes para lavandería, cuidado y/o aditivos para lavandería y enjuague, limpieza y/o tratamiento de superficies duras que incluyen limpiadores de pisos e inodoros, y otros limpiadores para uso institucional o doméstico.
Como se usa en la presente descripción, "composición de limpieza y/o tratamiento" es un subconjunto de productos para el cuidado de las telas y el hogar que incluye, a menos que se indique de cualquier otra forma, productos para el cuidado de las telas y el hogar. Tales productos incluyen, pero no se limitan a, productos para tratar telas, superficies duras y cualquier otra superficie comprendida dentro del campo del cuidado de las telas y el hogar que incluyen el cuidado ambiental, por ejemplo, modificadores ambientales y sistemas de suministro de fragancias, cuidado del automóvil, lavado de vajilla, acondicionamiento de telas (que incluye renovadores y/o suavizantes de telas), detergentes para lavandería, cuidados y/o aditivos para lavandería y enjuague, limpieza y/o tratamiento de superficies duras que incluyen limpiadores de pisos e inodoros, agentes de lavado granulares o en polvo de gran rendimiento o para todo propósito, especialmente, detergentes de limpieza; agentes de limpieza líquidos, en gel o en pasta para todo propósito, especialmente los tipos líquidos denominados de gran rendimiento; detergentes líquidos para telas finas; agentes para el lavado manual de vajilla o agentes de bajo rendimiento para el lavado de vajilla, especialmente los del tipo de alta espuma; agentes para el lavado en lavavajillas que incluyen los diversos tipos de tabletas, granulos, líquidos y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; champús para alfombras o automóviles, limpiadores para baños que incluyen limpiadores de inodoros además de auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y los del tipo para pretratamiento o "limpiamanchas en barra" y sustratos cargados con productos tales como láminas que se añaden en la secadora.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "composición de tratamiento y/o limpieza de telas y/o superficies duras" es un subconjunto de las composiciones de limpieza y tratamiento que incluye, a menos que se indique de cualquier otra forma, agentes de lavado granulares o en polvo para todo propósito o "de gran rendimiento", especialmente, detergentes de limpieza; agentes de lavado líquidos, en gel o en pasta para todo propósito, especialmente, los de tipo líquido denominados de gran rendimiento; detergentes líquidos para telas delicadas; agentes para el lavado manual de vajilla o agentes de bajo rendimiento para el lavado de vajilla, especialmente, los del tipo de alta espuma; agentes para el lavado en lavavajillas que incluyen los diversos tipos de tabletas, gránulos, líquidos y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes líquidos para limpieza y desinfección, champús para alfombras o automóviles, limpiadores para baños que incluyen limpiadores de inodoros; productos acondicionadores de telas que incluyen suavizantes y/o renovadores de telas que pueden estar en forma liquida, sólida y/o de láminas para secadora; asi como también auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y los del tipo para pretratamiento o "limpiamanchas en barra"; y sustratos cargados con productos, tales como las láminas que se añaden en la secadora. Todos estos productos de aplicación pueden estar en forma normal, concentrada o incluso altamente concentrada hasta el punto de poder ser, en ciertos aspectos, no acuosos.
Como se usa en la presente descripción, se debe interpretar que los artículos "un" y "una(o)", cuando se usan en una reivindicación, significan uno o más de lo que se reivindica o describe.
Como se usan en la presente descripción, los términos "incluyen", "incluye" y "que ¡ncluye(n)" no son limitantes.
Como se usa en la presente descripción, el término "sólido" incluye las formas de producto en tabletas, granular, en polvo y en barra.
Como se usa en la presente descripción, el término "fluido" incluye las formas de productos líquidos, en gel, pasta y gas.
Como se usa en la presente descripción, el término "sitio" incluye telas, prendas de vestir y/o superficies duras.
A menos que se indique de cualquier otra forma, todos los niveles del componente o de la composición se refieren a una porción activa de ese componente o composición y excluyen las impurezas, por ejemplo, los solventes residuales o subproductos, los cuales pueden estar presentes en las fuentes comercialmente disponibles de tales componentes o composiciones.
Todos los porcentajes y proporciones se calculan en peso, a menos que se indique de cualquier otra forma. Todos los porcentajes y proporciones se calculan en función de la composición total, a menos que se indique de cualquier otra forma.
Debe comprenderse que todo limite numérico máximo dado en esta descripción incluye todo límite numérico inferior, como si los límites numéricos inferiores se hubieran anotado en forma explícita en la presente descripción. Todos los límites numéricos mínimos citados en esta especificación incluirán todos los limites numéricos mayores como si tales límites numéricos mayores se hubieran citado explícitamente en la presente descripción. Todos los intervalos numéricos citados en esta descripción incluirán todos los intervalos menores que caigan dentro de los intervalos numéricos mayores como si todos los intervalos numéricos menores se hubieran citado explícitamente en la presente descripción.
Productos para las telas y el hogar que comprenden una o más proteasas Se describe una composición que comprende una proteasa; esa proteasa se selecciona del grupo que consiste en: a) una proteasa para agua fría que tiene un índice de rendimiento mayor que 1 , al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1 a aproximadamente 10, de 1 a aproximadamente 8 o aun de 1 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:4, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o Método de prueba 3; una proteasa para agua fría que tiene un índice de rendimiento de al menos 1, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1 a aproximadamente 10, de 1 a aproximadamente 8 o aun de 1 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:6, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o Método de prueba 3; una proteasa para agua fría; esa proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: (i) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4; esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: P210S, P210S-N218A, S063T- S078N-S101 A-S183T-T244N, N061 A-S078N-S224A, S053G-S078N-P129T-Q185T, S063T-S078N-S101 A, S078N-P129T, S063T-S078N-S101A-S183T y S063T- S078N-S101A-T244I; (ii) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; esa vanante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-I111V-M124V-Y217Q, G097A-I111V-Y167A- Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S 101 N- G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P- G097A-S101 N-G128A-V203Y-Y217Q, S024G- N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N- G 128S-V203Y-Y217Q , V068A-A092G-Y2 7Q , N061 P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N- G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G- N061 P-G097A-S101N-G128S-Y217Q, S024G- N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101N- 1111V-G128S-Y2 7Q, S024G-N025G-S053G- T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G- S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N- G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N- G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N- S 0 N-G 28A-Y2 7Q, N025G-S053G-T055P- N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S 101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N06 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G 128A-Y217Q , ?061 ?-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128?-?217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N06 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128?-?217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G 128?-?217Q , S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-?061 P-S078N-G097A-G128?-?217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S 101 N-G 128?-?217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 ?-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G- S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G 128A-Y217Q , S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G- N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A- Y217Q, T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A- Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-G097A- S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G- ?055?-?061 P-G097A-S101 N-G128?-?217Q, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A- Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q y S24G-S53G-S78N-S101 N-G128?-?217Q; una vanante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; esa variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones X24G/R, X53G, X78N, X101 N, X128A/S y X217L/Q; esa variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A116V, G160S, I111L, I115V, N109S, N117M, P005G, Q059V, T164S, Y262M, A015Q, A015S, A098E, A098N, A098S, A098T, A098V, A098Y, A114S, A114T, A116G, A116L, A116S, A116T, A116W, A133G, A133H, A133T, A133V, A 37G, A137I, A137L, A137S, A137T, A138S, A216E, A216F, A216V, D099S, D181E, F261A, F261Q, G024F, G024I, G024Q, G024Y, G097S, G160T, G211 L, G211V, H017F, H017W, H039V, H226A, 1031 , I111V, I268V, K170R, K265R, L016Q, L016T, L135M, L209T, L209V, L233M, L257T, L257V, L267A, L267V, N025A, N025I, N025Q, N025R, N025T, N025V, N101 I, N101Q, N101S, N109A, N109G, N109H, N109L, N109M, N109Q, N109T, N117Q, N184A, N184L, N184T, N184W, N212G, N212L, N212V, N243P, N252G, N252M, P005T, P014S, P040G, P040L, P040Q, P129A, P129S, P172G, P172S, P194Q, P210A, P210S, Q185F, Q185G, Q185I, Q185M, Q185N, Q185S, Q275H, R186K, S009A, S009G, S009H, S009M, S018T, S130T, S132N, S145K, S159T, S161 I, S161 K, S161 N, S161T, S162I, S162M, S162Y, S163G, S182F, S182G, S182V, S182W, S183F, S183L, S183M, S183T, S183V, S183W, S224A, S236T, S249V, T022A, T022G, T022Q, T022V, T208V, T242S, T253N, T253S, T254A, T254S, T255L, T255S, T255V, V004A, V004P, V004W, V084C, V139C, V165M, V203F, Y021K, Y021N, Y021T, Y021V, Y167F, Y171 F, Y214F, Y262F, Y262T, A088T-L257G, A116T-A128S, N061 S-N 109G-A128S-N243V-S260P, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, S162G-K256R, A088T-N243V, G024E-A116T, K043Y, N076D-A116T, N218S-S248N, S033T-N243V, S033T-S063G, S248N-L257G, A001E-S249A, A088T-A116T, A088T-A128S, A088T-G131 H, A088T-N109G, A088T-S248N, A088T-S249A, A116T-N243V, A116T-T158S, A128S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V, A128S-S248N, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131H, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N218S, G024E-N243V, G024E-S162G, G024E-S249A, G024E-T158S, G131H, G131 H-K256R, G131 H-S249A, K043Y-A088T, K043Y-A116T, K256R, N076D-K256R, N109G, N109G-A116T, N109G-A128S, N109G-A128S-N243V- K256R, N109G-A 28S-N243V-S248A, N109G-G131H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G-S248N, N218S-L257G, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-N243V, S033T-A128S, S033T-K256R, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T-S248N, S033T-T158S, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-T158S, S248N-K256R, S249A, T158S-N243V, T158S-S249A, A088T-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-K256R, ?088?-?158S-N218S-N243V-L257G, ?088?-?116?-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G, ?088?-? 109G-A116T-G 131 ?-?153S-N2 8S-S248N-L257G, A088T-N 09G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A114S-?116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, ?116?-?158S-K256R, ?088?-?116T-G131 ?-?158S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S, A088T-N109G-A116T-G131 H-L257G, ?088?-? 109G-A116?-?158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-L257G, ?088?- N109G-N243V-S248N, A088T-N109G-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, A116T-T158S-S248N-L257G, Y006H-A116T-G131 H-S248N, A088T-A116T-G13 H-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V, A088T-A1 16T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 6T-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T 58S-N218S-N243V, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-L257G, A088T-N 109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R, A088T-N 109G-N243V-S248N-L257G, A088T-N 109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V, A088T-T 58S-N243V-K256R-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-K256R-L257G, N109G-A116T-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, N 09G-G13 H-L257G, N109G-G131H-S248N-K256R-L257G, N109G- G131 H-T158S-K256R-L257G, S003P-A116T-T158S-S248N-K256R, T158S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R, A088T-A116T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S, A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-L257G, A088T-G131 H-N243V-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T, A088T-N 109G-A 116T-G 131 H-N218S, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-N218S-N243V-K256R, A088T-N 109G-A116T-N218S-N243V-L257G, A088T-N 109G-A116T-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-G131 H-T 58S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-W241 R-S248N-K256R, A088T-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N243V, A088T- 109G-N243V-K256R, A088T-N 109G-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-S248N-K256R, A088T-N109G- T158S-N218S-K256R-L257G, ?088?-?109G-T158S-?218S-N243V-S248N-K256R, ?088?-?109G-T158S-N243V-K256R, ?088?-? 09G-T 58S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D, ?088?-?109G-T158S-S248N-L257G, ?088?-?158S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, ?088?-?158S-N243V-L257G, ?116T-G131 ?-?218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-S248N-L257G, ?1 16?-S248N-K256R-L257G, ?116T-T158S-N218S-N243V-K256R, ?116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271 R, ?116T-T158S-N243V-K256R-L257G, ?116T-T158S-N243V-S248N-L257G, G131 H-S248N, G131H-T158S-I234T-N243V-K256R, G131 H-W241 L-N243V-S248N-K256R, ?109G-A116T-G131 ?-?137V-T158S-S248N-K256R-L257G, ?109G-A116T-G131 ?-?151 S-N218S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N, N109G-A116T-S248N, N109G-A116T-T158S-L257G, N 109G-A116T-T 158S-N218S-W241 R-N243V, N109G-A 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-N218S-L257G, N109G- G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-A274T, N109G-N243V-L257G, N109G-T158S-N218S-K256R-L257G, N109G-T158S-N218S-L257G, N 109G-T158S-S248N-K256R, P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q0 9K-G020A-Y021T-T022L-G023E, S003F-A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, V004A-A088T-A116T-T 58S-N218S, V004A-N109G-A1 6T-G 31 H-S248N-K256R-L257G, V004L-A1 6T-N218S-N243V-S248N-L257G, Y006H-N 109G-N218S-N243V-S248N , A001T-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T-G 31 H-L257G, A088T-A116T-G 131 H-N218S-L257G, A088T-A116T-G 3 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-A1 6T-G 3 H-N243V-K256R-L257G, A088T-A 16T-G131 H-N243V-L257G, A088T-A116T-G131 H-N243V-S248N, A088T-A116T-G131H-T158S-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T, A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-N2 8S-S248N-L257G, A088T-A 16T-G 131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H- T158S-S248N, A088T-A116T-K256R, A088T-A1 16T-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-N243V-K256R, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A 16T-T158S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, ?088?-?1 16?-T158S-S248N-K256R, ?088?-?116T-V143A-N218S-S248N-K256R, ?088?-?116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-G131H-K256R-L257G, ?088?-G131 ?-?218S-N243V-S248N, A088T-G131 ?-?218S-S248N-L257G, A088T-G13 H-S248N-K256R-L257G, A088T-G 3 ?-? 58S-L257G, A088T-G 3 ?-? 58S-N218S-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 ?-?158S-N218S-N243V-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N, ?088?-G131 H-T158S-N243V, A088T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A088T-G131 ?-?158S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-1107T-N109G-A116T-G13 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V, A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-G 131 H-N218S-N243V-L257G , ?088?-? 109G-A116T-G 131 ?-?218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N243V, ?088?-?109G-A116T-G131 H-N243V-L257G, ?088?-? 109G-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-?116T-G131 H-S248N, ?088?-? 109G-A116T-G 131?-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G 31H-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 ?-?158S-N218S, ?088?-?109G-A116T-G131 ?-?158S-N218S-S248N-K256R, ?088?-? 109G-A116T-G131 ?-?158S-N218T-N243V, ?088?-?109G-A116T-G131 ?-?158S-N243V-K256R, A088T-N 09G-A 16T-G13 ?-?158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N, A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R, ?088?-?109G-A116T-G131 ?-?158S-S248N-K256R-L257G, ?088?-?109G-A116T-G131 ?-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 6T-N218S, A088T-N 109G-A116T-N218S-L257G, A088T-N 109G-A116T-N218S-N243V, A088T-N109G-A 16T-N2 8S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-N218T-K256R, A088T-N109G-A116T-N218T-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N243V, A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N243V-K256R-L257G-N269D, A088T-N109G-A116T-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N2 8S-N243V, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N 109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 09G-A1 6T-T 58S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N2 8S-S248N , A088T-N109G-A116T-T 58S-N243V, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R, A088T-N 109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T- 109G-G 131 H-L257G , A088T- 109G-G 131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-N 109G-G 131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G13 H-N243V, A088T-N 09G-G131 H-N243V-L257G, A088T-N109G-G131 H-N243V- S248N-K256R, A088T-N109G-G 3 H-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131H-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-G131 H-T158S-N243V, A088T-N 109G-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-N218S-K256R, A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T- 109G-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N-L257G-I268V, A088T-N109G-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-T158S-N218S-K256R, A088T-N 109G-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-I268V, A088T-N109G-T 58S-N243V-S248N-Q275R, A088T-N218S-N243V, A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N218S-S248N, A088T-N218S-S248N-L257G, A088T-N243V-K256R, A088T-N243V-L257G, A088T-S145T-T158S-S248N, A088T-T158S-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G-Q271 H, A088T-T158S-S248N, A088T-V143A-T158S-K256R, A1 16T-G131 H-K256R, A116T-G131 H-N218S, A116T-G131H- N243V, A116T-G131H-N243V-K256R, A116T-G131 H-N243V-L257G, A116T-G131 H-S248N-K256R, A116T-G 131 H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R, A116T-G 31 H-T158S-N243V-L257G, A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-G131 H-V143F-T158S-N218S, A116T-L257G, A116T-N218S, A116T-N218S-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G, A116T-N243V-K256R, A116T-N243V-S248N, A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-S248N, A116T-T158S-N218S-N243V, A116T-T158S-N218S-S248N, A116T-T158S-N243V, A116T-T158S-N243V-K256R, A116T-T158S-N243V-L257G, ?116?-?158S-N243V-S248N, ?1 6T-T158S-S248N-K256R-L257G, ?116T-V149I-?158S-N243V-S248N-K256R-Q271 ?, G131 ?-?218S-N243V-L257G, G 3 H-N243V, G131H-N243V-S248N-K256R, G131H-T158S, G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, G13 H-T158S-N243V-K256R-L257G, G131H-?158S-N243V-S248N-L257G, ?109G-A116T-G131H-?218S-K256R-L257G, ?109G-A116T-G131 ?-?218S-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, 109G-A116T-G131 H-N243V-K256R, ?109G-A1 16?-G131 H-N243V-L257G, 109G-A116T-G 131 H-N243V- S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G 131 H-S248N, N109G-A116T-G131H-S248N-I268V, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N, N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R, N109G-A 6T-N218S, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, N 109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-N243V-K256R, N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R, N109G-A 6T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S, N 109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, N1 G9G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N243V, N109G-A116T-T158S-Q275R, N109G-G131 H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131 H-N218S-K237N, N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R, N109G-G131 H-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R, N109G-G 131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131H-T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S-L257G, N 109G-N218S-N243V, N 109G-N243V-K256R-L257G, N109G-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-T158S-I268V, N109G-T158S-K256R, N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N 109G-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-T158S-N243V, N109G-T158S-N243V- 256R-L257G, N109G-T158S-N243V-S248N, N109S-A116T-S248N, N218S, N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-L257G, N243V-K256R, N243V-S248N-K256R, N243V-S248N-K256R-L257G, S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, S248N, T158S-N243V-K256R, T158S-N243V-L257G, S018F-S162L, S018P-D120N, P014T-S037T, S009T-K141 R, S161 P-S162L, N61 P-S63G-N 109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A114S-A1 16T-A128S-N243V, A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109M-A128S-S224A, A88T-N109S-A116T-A 28S-S224A-N243V, N 109Q- A128S-S224A-N243V, A88T-N 109M-A116T-A128S- S224A-N243V, S63G-A128S, N109S-A128S-S224A- N243V, A88T-N109G-A116T-N243V, N61S-N109G- N243V, N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T- N 109G-A116T-T158S-N243V-K256R, N109G-A116T, A88T-N109G, N61G-N109G-N243V, N109G-A128S- P129S-S130T-S224A-N243V, A88T-N109Q-A116T- A128S-S224A-N243V, N062L-S063N-Q217L, N062S- S063R-Q217E, N062S-S063L-Q217L, S063G, S063G- Q217L, S063N y S063N-Q217L; una proteasa para agua íria; esa proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: (i) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4; esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: E156S-P210S, P210S-N218S, Y104F-E156S-P210I, E156A-P210S-N218S, N218A, N061A-S078N-S087E-S224A, Q059V-S078N-G211 A, Q059V-S078N-V147Q, Q059V-S078N, Q059V-S078N- I108V-N252Q, S053G-S078N-P129T, S078N-G21 1A, S078N-Q185T, S078N-V147Q, S078N, S078N-S224A, S078N-S224A-A274D, S078N-I108V-V147Q, N061A- S078N-S224A, S053G-S078N-P129T-Q185T y S078N- P129T; una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2¡ esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-I1 11V-Y217Q, I111V- G128A-Y217Q, 1 1 1V-M124V-Y167A, I11 1V-M124V- Y217Q, L096T-G097A-Y217Q, N062Q-G097A-I1 1 1V, S053G-N061 P-G097A-S101 -G128S-V203Y-Y217Q, S089Y-M124V-Y217Q, V068A-I1 1V-Y217Q, G097A- I111V- 124V, G097A-L126A-Y217Q, G097A-M124V- Y217Q, I 1 1V-Y167A-Y217Q, M124V-Y167A-Y217Q, P052L-V068A-G097A, S089Y-I1 1 1V-M124V, V068A- A092G-G097A, V068A-A092G-I1 1 1V, V068A-G097A- I111V, V068A-S089Y-I1 1 1V, Y104N-G128A-Y217Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q, G097A-G128S-P210S- Y217Q, G097A-I1 1 1V-M124I-Y217Q, G097A-I11 1V- M124V-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-Y217Q, N061 P-G097A-G128A-P210S- Y217Q, N061 P-G097A-G128S-Y217Q, N061 P-G097A- I111V-M124V-Y217Q, N061P-G097A-N123Q-Y217Q, N061 P-G097A-S101 -1111 V-M124V-Y217Q, N061 P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, N061P-G102A-P129S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q, N061 P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-l 111V-M124V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101 N-N 123Q-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S101 -G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101N-I11 V-M124V-Y217Q, S053G-N061 P-G 102A-P129S-P210S-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-Y2 7Q, S053G-N06 P-N062Q-G097A-G100N-S 0 N- Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-S101 N-I1 1 1V-Y217Q, S053G-N061 P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-S078N-G097A-I1 11V-G128S-Y217Q, S078N-G097A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I1 1 1V-M124V-Y217Q, N061 P-G097A-M124I-Y217Q, N061 P-G097A-M124V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q, N061 P-N062Q-S078N-G097A-G100N-111 1 V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 -M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-N123Q-Y217Q, N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-I035V-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N- S101 N-G 28A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P- G097A-G128A-S130G-Y217Q, S024G-N025G-S053G- N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P- G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P- N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G- S053G-T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S038G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q , S024G-S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S101 N-G128A-Y217Q, ?055?-?061 P-G097A-A116S-G128?, ?055?-?061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S1 O1 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A- S101 -G128?-?217Q, N025G-S053G-T055P-S078N- G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A- S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N- G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N06 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S1 O1 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S 01 N-G 28A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S 0 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S 01 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y2 7Q , S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P-S101 N-G 28A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q y T055P-N061 P-S078N-G097A- S101 N-G128A-Y217Q; una vahante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; esa variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones X24G/R, X53G, X78N, X101 N, X128A/S y X217L/Q; esa variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A001G, A001Y, A013G, A013V, A015F, A015G, A015K, A015M, A015P, A015T, A015W, A015Y, A029G, A073S, A088C, A088I, A088L, A088T, A088V, A098D, A098K, A098P, A098R, A098W, A1 16D, A116E, A116R, A128S, A133L, A133M, A133S, A134G, A134S, A137N, A137V, A144M, A144Q, A144S, A144T, A144V, A151C, A176S, A176T, A179S, A216G, A216L, A216P, A216Q, A216S, A216T, A216Y, A228T, A230C, A231 C, A272I, A272L, A272Q, A272S, A272T, A272W, A273S, A274G, A274L, A274Q, A274T, A274V, D041 E, D099G, D099N, D120A, D120K, D120Q, D120R, D120S, D140E, D181 S, D259E, E054D, E156D, E156T, E251V, F261 G, F261 H, F261 L, F261 R, F261 S, F261T, F261V, F261W, G007A, G007S, G020A, G020D, G020S, G024N, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G053H, G053K, G053N, G053T, G097A, G097D, G097T, G131A, G131H, G131P, G131Q, G131T, G131V, G160H, G160P, G166A, G166S, G166T, G211A, G211D, G211M, G211N, G211P, G211Q, G211R, G211W, G215A, G215N, G215V, H017L, H017M, H017T, H017V, H017Y, H039A, H039C, H039N, H226F, H226I, H226M, H226S, H226V, H226Y, I035V, I079A, I079S, I079T, I079V, I079W, 1108V, I115L, I122A, I234L, I234V, K012R, K027R, K136R, K141F, K213W, K237R, K256R, K265Q, L016A, L016F, L016I, L016S, L016V, L042I, L075A, L075M, L075Q, L075V, L075Y, L082K, L082M, L082Q, L082V, L090I, L196I, L196V, L209Q, L209W, L233A, L233Q, L233V, L235I, L235K, L250I, L257A, L257H, L257Q, L257S, L257Y, L267Q, L267R, L267S, L267T, M199V, N025F, N025G, N025H, N025K, N025L, N025M, N025S, N025Y, N061F, N061H, N061P, N061S, N061T, N061V, N061W, N076G, N076W, N078S, N078T, N078V, N101A, N101H, N101L, N101T, N109K, N109R, N117A, N117E, N117H, N117K, N118G, N184G, N184H, N184I, N184S, N184V, N212A, N212F, N212I, N212K, N212P, N212Q, N212S, N212Y, N218A, N218H, N218L, N218S, N240E, N240H, N240L, N240R, N240T, N243A, N243Q, N243T, N243V, N252A, N252K, N252L, N252Q, N252R, N252S, N252T, N269Q, N269S, P014G, P014Q, P014T, P040A, P040H, P040S, P040T, P040V, P040Y, P086A, P086C, P086F, P086H, P086S, P129D, P129G, P129K, P129T, P172A, P172Q, P194A, P194G, P194L, P194M, P194S, P194V, P194Y, P210G, P210R, P210V, Q002A, Q002S, Q010A, Q010F, Q010H, Q010I, Q010L, Q010N, Q010S, Q010T, Q019A, Q019G, Q019N, Q019S, Q019T, Q019V, Q019W, Q059I, Q103L, Q103S, Q185A, Q185H, Q185L, Q185T, Q185Y, Q206P, Q206S, Q206Y, Q217I, Q217N, Q217S, Q217T, Q245K, Q275D, Q275S, Q275W, S003A, S003G, S003H, S003M, S003P, S003Q, S003T, S003V, S009I, S009L, S009P, S009T, S009W, S018A, S018G, S018I, S018L, S018M, S018N, S018P, S018V, S018W, S033T, S037Q, S037T, S037V, S038G, S038H, S038K, S038Q, S038T, S063K, S063N, S063Q, S063T, S087A, S087F, S087G, S087Q, S087T, S089L, S089M, S089N, S089Q, S089T, S089W, S130A, S130F, S130G, S130L, S130V, S145A, S145H, S145M, S145V, S159A, S159G, S159H, S159Q, S159R, S161A, S161G, S161 H, S161 L, S161 M, S161 P, S161Q, S161W, S162A, S162F, S162G, S162L, S162N, S162P, S162R, S162V, S163P, S173A, S173G, S182A, S182H, S182K, S182L, S182N, S182P, S182Q, S182T, S183A, S183G, S183H, S183Q, S188A, S188G, S188T, S188V, S191A, S204A, S204I, S204L, S204Q, S204V, S224C, S236A, S236N, S236Q, S248A, S248F, S248G, S248I, S248K, S248L, S248M, S248N, S248Q, S248T, S248V, S249A, S249C, S249H, S249Q, S249T, S249W, S249Y, S260H, S260N, S260P, S260T, T022H, T022K, T022N, T022R, T022S, T022Y, T055A, T055G, T055L, T055N, T055P, T055Q, T071S, T158H, T158S, T164N, T208C, T208L, T220S, T242N, T244A, T244G, T244H, T244I, T244Q, T244S, T244V, T244W, T253A, T253G, T253H, T253Q, T254V, T255A, T255G, T255H, T255I, T255Q, T255Y, V004G, V004N, V004R, V008A, V008C, V008M, V026I, V044I, V044L, V045H, V045K, V045L, V045M, V045Q, V045S, V045W, V045Y, V051 I, V081 L, V081 Q, V081T, V084A, V084S, V084T, V093I, V121 I, V143N, V143S, V143Y, V147C, V147I, V147L, V147T, V180I, V180L, V180T, V192A, V192S, V192T, V198I, V198L, V198M, V203H, V203I, V203L, V203N, V203Q, V203T, V203W, V203Y, V270A, V270S, V270T, W241 M, W241Y, Y006G, Y006H, Y006I, Y006K, Y006L, Y006P, Y006Q, Y006T, Y006V, Y006W, Y021A, Y021 D, Y021 E, Y021 L, Y021 Q, Y021 R, Y021 S, Y104F, Y104I, Y214L, Y214V, Y214W, Y262A, Y262G, Y262L, Y262N, Y262S, Y262W, Y263G, Y263W, A001 F, A001 K, A001 L, A001 M, A001 Q, A001 R, A001S, A001T, A001V, A013C, A013S, A015D, A015E, A015L, A015R, A048S, A073N, A073T, A074G, A074S, A085C, A085G, A085S, A085V, A088M, A088S, A092S, A098G, A1 14G, A133P, A137E, A137H, A144G, A144H, A144K, A144L, A144N, A153S, A153V, A176C, A179G, A187G, A187S, A200G, A216W, A223S, A228S, A230T, A230V, A231V, 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K237N, K237S, K256A, K256G, K256H, K256M, K256P, K256Q, K256W, K265H, L016E, L042V, L075G, L075H, L075I, L075T, L082A, L082F, L082H, L082R, L082S, L082T, L090M, L135F, L196M, L209C, L209H, L209S, L233S, L235M, L235R, L235W, L257C, L257G, L267F, M050Y, M119C, M1 19I, M124L, N025C, N025E, N025P, N061A, N061 G, N061 I, N061 K, N061 L, N061 Q, N061 R, N062S, N062T, N076A, N076P, N076Q, N076S, N076T, N076V, N078G, N078H, N078K, N078P, N078Q, N078R, N101 F, N117R, N1 17S, N118D, N1 18H, N118Q, N118R, N118S, N1 18T, N184C, N184E, N184R, N212D, N212R, N212W, N218F, N218G, N218M, N218P, N218T, N218V, N218W, N240A, N240G, N240Q, N240S, N240W, N243C, N243G, N243S, N252V, N269H, P005A, P005D, P005M, P005Q, P014A, P014M, P014R, P014V, P040F, P040R, P040W, P129E, P129R, P172E, P172K, P194H, P194R, P194W, P201A, P201 G, P210L, P239K, P239R, Q002D, Q002E, Q002G, Q002I, Q002P, Q002V, Q010D, Q010R, Q019C, Q019D, Q019E, Q019H, Q019L, Q019P, Q019R, Q059A, Q059E, Q059L, Q059S, Q059T, Q103W, Q185D, Q185K, 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G131 ?-?158S-N218S-N240H-N243V-S248N- K256R-L257G, G131 H-T158S-N218S-N243V, G131 H- ?158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S, G131 ?- ?158S-N243V-L257G, G131 ?-?158S-N243V-S248N, G131 H-T158S-S248N, K256R, N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V, N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-N218S-W241 R-N243V-K256R, N 109G-A1 16T-G 131 H-S248N-L257G, N 109G-A 116T-G131 H-T158S-N218S-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-N2 8S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N, N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N, N109G-G131 H-S248N, N109G-G131 H-T158S, N109G-G131 H-T158S-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, N 109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, N 109G-G 131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-N218S-K256R-L257G, N 109G-N218S-N243V-S248N- K256R, N109G-N218S-S248N-L257G, N109G-S248N, N109G-T158S-N218S, N109G-T158S-N218S-N243V, N109G-T158S-N243V-L257G, N218S-N243V-K256R, N218S-N243V-S248N, N218S-S248N, N218S-S248N-K256R, N243V-L257G, S003P-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N, S003P-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R, S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G1 10A-11 11 S-E1 12N-W113G-A1 14P, S248N-L257G, T158S-N218S-K256R, T158S-N2 8S-L233S-S248N, T158S-N218S-L257G, T158S-N218S-N243V-K256R, T158S-N218S-N243V-S248N, T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, T158S-N218S-S248N-L257G, T158S-N243V-S248N-L257G, V004L-A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A133V-S260N, N061S-S260P, P014T-S037T, S009T-K141 F, S009T-K141 R, S018F-S162L, S018L-Y021S, S018P-D120N, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S161 P-S162L, S161 P-S260P, T253A-S260P, A134T-S260G, I115V-N184Y, N025K-S037P, Q010L-S037P, Q019L-S260N, Q019L-S260P, S037P-T254S, S161 P-T253A, N061S-S260P, Q010L-S037P, S009T-K141 F, S018L-Y021S, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S037P-T254S, S161 P- S260P, S161 P-T253A, T253A-S260P, A133V-S260N, A134T-S260G, I115T-S183T, I1 15V-N184Y, N061 D-S260I, Q019L-S260N, Q019L-S260P, S183T-S249R, N61 D-Q206R, Y262N-Q275R, K43R-N76S, K170R-D259G, Y6F-S249C, Q19A-N109S, H17L-Q19A, Q19R-Q185R, S18Y-V203A, S161 E-S260T, S18K-V203I, V4A-T55A, N252S-L257H, S249R-Y262H, N61 L-Q206H, N184Y-Y262N, Q19R-N25D, A74S-P129Q, K27R-D120H, V4A-T55A, Y21 H-N252H, K27R-N269D, A98T-T158A, I79V-Q217H, S9L-N218S, V4A-Y6F, V203A-Q217R, T22S-T242S, N76P-N212S, S37T-S260P, T55A-V147A, V4A-Y6F, Y262N-Q275R, G160R-T244A, N25D-Q185R, G21 1V-T244A, S9L-N218S, A144H-T244A, Y21 H-N252H, A1Y-Q275R, V198L-D259G, K141 I-S248N, S183T-R186K, S161 E-Q185H, P129S-K136R, K43N-S163T, S37G-Q275H, Y6F-S249C, N62Y-T244A, S260P-Q275R, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-G131 H-S224A-N243V, S33T-N61 G- S63G-N 109G-A128S-N218S-N243V, S33T-S63G- N 109G-A128S-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G- N 109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G- N 109Q-A128S-G 131 H-G 169A-S224A-N243V-S249Q , S33T-N61 G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N 109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S33T-N61 G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-A128S-N218S, A1 G-N61 P-S63G- 109Q-A128S-G 131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N 09Q-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q , N61 P-S63G-N 109Q-A128S-G 131 H-S224A-N243V, S63G-N 109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N109G-A114S-A128S, N109G-A114S-A128S-S183L-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A, N109G-A114S-A128S-S224A-N243V, A88T-N 109G-A116T-A128S-S224A-N243V, N61 G-A88T-N 109G-A1 6T-A128S-S224A-N243V, N109G-A1 14S-A128S-N243V, N109G-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L-S224A, N61 G-N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L, S33T-N76D, N109S-A128S-S224A, N 10 Q-N 09Q-A128S-P129S-S 130T-S224A- N243V, S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109M-A128S-S224A-N243V, S63G-N109G, N109G-K256R, S63G-N76D, S33T-N109G-A128S-G169A-N218S- N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V, N062L, N062L-S063G, N062S-S063G-Q217L, N062S- S063L-Q217L, N062S-S063N, N062S-S063R, S063G, S063G-Q217L, S063G-Q217L-M222S, S063L-Q217L, S063N, S063N-Q217L, D099N-K141Y-K213Q, D099N- K141Y-K256Q, K043T-K141Y-E156Q, N062L-Q217E, N062L-Q217L, N062L-S063G-Q217E, N062L-S063L, N062L-S063N-Q217L, N062S-Q217L, N062S-S063G, N062S-S063L, N062S-S063N-Q217L, N062S-S063R- Q217E, S063G-Q217E, S063N-Q217E, S063R, S063R- Q217E y S063R-Q217L; una proteasa; esa proteasa se selecciona del grupo que consiste en (i) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4; esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: Q059V-S078N-I108V-V147Q- G21 1A-N252Q, S078N-I108V-V147Q-G211A, S078N- S087E-M124I-S224A, S078N-I108V-V147Q-N252Q, S078N-I108V-V147Q-G211A-N252Q y Q059V-S078N- I108V-V147Q-G211A-N252Q; (¡i) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2¡ esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-M124V-Y167A-Y217Q, V068A-Y167A-Y217Q, G097A-I1 1 1V-M12 V-Y167A, 11 11 V-M 124 V-Y167A-Y217Q , V068A- 11 11 V- Y 167A- Y217Q, G097A-I11 1V-M124V-Y167A-Y217Q, P052L- V068A-I11 1V, G097A-N123A-Y217Q, N061 P-N062Q- G097A-G100D-Y217Q, N061 P-S101 N-G102A-G128S- Y217Q, Y217Q, N061 P-G102A-G128S-Y217Q, N061 P- S10 N-G 102A-G 128S-Y217Q, S078N-G097A- 11 1 1 V- N123Q-Y217Q, G102A-N123Q-Y217Q, N061 P-G102A- G128S-Y217Q, S078N-G097A-I1 1 1V-N123Q-Y217Q y G102A-N123Q-Y217Q; y ) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; esa variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones: X24G/R, X53G, X78N, X101 N, X128A/S y X217L7Q; esa variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A001 D, A001 H, A001 N, A015C, A048C, A048E, A085T, A133R, A137R, A142C, A144D, A144R, A152S, A153G, A187P, A187Q, A187T, A187V, A216R, A230S, A272R, A273H, A273T, A274H, D036N, D036S, D181 H, D181T, D259N, D259P, D259S, E156G, E156H, E156L, E156Q, E156V, E251 C, F189S, F189T, F189W, F189Y, F261 E, G020C, G024D, G053M, G053R, G097R, G131 D, G131R, G157N, G160R, G160V, G166L, G166W, G211 E, G215D, G258A, G258D, G258P, I011T, I031C, I079E, I079R, I175L, I205C, K012H, K012N, K027A, K027N, K027S, K043A, K043D, K043E, K043G, K043L, K043M, K043P, K043V, K043W, K043Y, K136H, K141 H, K141 L, K141 M, K141 N, K141 Q, K141T, K141V, K170G, K170S, K237T, K237V, K256D, K256S, K256T, K256V, K265N, K265S, L042F, L042M, L082E, L209A, L209E, L209G, L209R, L233G, L235V, L257D, L257E, L257P, L257R, L257W, L267E, M050L, N056D, N056S, N061 C, N061 D, N062A, N062H, N062L, N062V, N062Y, N076D, N076L, N076M, N078D, N078F, N101 D, N101 R, N118A, N212C, N212E, N218C, N218D, N218E, N252D, N252E, P014F, P014K, P057A, P057W, P172R, P194E, P201T, P210E, Q059C, Q059D, Q059R, Q185E, Q206D, Q217A, Q217K, Q217R, Q245A, Q245D, Q245E, Q245H, Q245R, Q271 E, Q271 F, Q271R, Q271W, Q275G, Q275IR186I, R186L, R186V, R186W, S003E, S009C, S009E, S018C, S037D, S037E, S037H, S037R, S037Y, S038D, S038P, S038R, S038Y, S063L, S087D, S087R, S089C, S089E, S130C, S130R, S145D, S159C, S159P, S161 C, S173T, S182C, S188E, S188F, S188K, S188L, S188R, S188W, S190A, S190G, S190T, S204R, S236D, S236E, S248C, S248E, S260C, S260E, S260R, T022P, T055C, T055W, T071A, T158D, T158E, T158P, T158R, T158Y, T164R, T242D, T242G, T255C, V004E, V004T, V045C, V045D, V045R, V045T, V051 H, V081 R, V143C, V143E, V143G, V192G, V203C, V203D, V203E, V203M, V203R, V270G, W241 L, Y214H, Y214Q, A001E, A133E, A187L, A187N, A216C, A216H, A273Q, D099H, D259H, E156C, E195G, F189H, G131 C, G146A, G166V, G215C, G215E, I107L, K012A, K012S, K012T, K043C, K170C, K256C, K256E, K265G, K265Y, L233EM222F, M222S, N062Q, N076E, N078E, N184P, N218R, P005V, P014D, Q002K, Q002L, Q002R, Q010W, Q271C, R186H, S049C, S063C, S063D, S105T, S188C, S190C, S204E, T055R, T164G, V004D, V044T, V045I, V165C, V180S, Y006C, Y006D, Y006E, Y104T, A001 C, A187C, A230G, A273D, A273P, D036Q, F189G, F189L, F189R, G157T, G178A, I031 F, I1 1 1 M, K012F, K012L, K027T, K043R, K136G, K141G, K170Q, M222A, M222L, N062R, N117G, N269C, P005W, P129V, P239A, P239H, P239T, Q059W, Q217G, Q275A, R186A, S191 G, T164A, T220A, A001 P, A187F, A187W, A273R, D041C, D060G, D197T, F189A, G046D, G157P, K012C, K012E, K012W, L042C, M222T, N062C, P239G, P239N, Q217C, R186M, S049T, 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D140G-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A1 16T-T158S-K256R-L257G, ?088?-?1 16?-?158S-N218S-N243V-S248N-E251 K-K256R-L257G, ?088?-?108?-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, ?088?- 109G-A116T-G 131 ?-?141 ?-?218S, A088T-N109G-W241 R-S248N-K256R, G065D-A088T-G131 H-N243V-S248N, A045S-S236G, G024A-S037W, I031V-S038W, N061 D-S260I, Q010R-S037T, I1 15T-S183T, N025K-P129K, N025K-P129R, A045S-S236Y, S162L-D181 H, I031V-S038W, N025K-S037P, N025K-P129R, Y21 H-D259G, A133V-D259N, I79V-Q217H, S18K-V203I, T158A-D259P, N61 K-N252K, K43N-Q217R, Q206R-S260P, V198L-D259G, S161 E-S260T, G160A-D259G, A1Y-Q275R, A200T-H226L, Q217R-T244A, S260P-Q275R, T158I-D259N, L75I-N76D, S161 E-Q185H, Y21 H-S37E, S249R-Q275R, N76T-N212D, S260P-Q275L, G131S-K265N, V4A-S249N, N25D-Q185R, K43R-N76S, S183D-Q206R, Q10R-Q275K, K43N- S163T, N25D-V26A, S260P-Q275L, K141 I-S248N, L16Q-Q217H, K27R-N269T, P210S-N212D, N118G-V121A, G215D-D259V, N62Y-G97D, V4E-S260P, K27E- Y91 F, Y6D-T55A, N77D-N252T, N25K-H238R, V44A- Q206H, S37P-S260F, V44A-Q206R, I31 L-S33T-S63G- N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, A1 G-131 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-G 169A-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N 109G-A116T-A128S-G 131 H-S224A-N243V-S249Q, S33T-N76D-A128S-N218S, N76D-N109G-A128S-S224A, D099N, K141Y-E156Q, N062L-S063L-Q217L, N062L-S063N, N062L-S063N-Q217E, N062L-S063R, N062L-S063R-Q217L, N062S-Q217E, N062S-S063G-Q217E, N062S-S063G-Q217R, N062S-S063N-Q217R, S063G-S125A, D060G-Q217L, D120N-K141Y-K213Q, K043T-D099N-D120N-K141Y, K043T-D099N-K141Y-K256Q, K043T-K237A, N062L-S063G-Q217R, N062L-S063G-S125A, N062L-S063L-Q217E, N062L-S063N-S125A-Q217L, N062S-Q217R, N062S-S063L-Q217E, N062S-S063R-Q217L, S063G- M222S, S063G-Q217R, K141Y-D197N, N062L-Q217R, N062L-S063G-Q217L-M222S, N062L-S063L-Q217R, N062L-S063N-Q217R, N062S-Q217G, N062S-S063G- Q217G, N062S-S063G-Q217L-M222L, N062S-S063G- S125A-Q217L, N062S-S063N-Q217E, Q217G, S033G- N062S-S063G, S063G-Q217G, S063G-Q217L-M222L, S063G-S125A-Q217R, S063L-Q217R, S063N- 222S, S063N-Q217R, S063N-S125A-Q217L, S063R-Q217R, S063R-S125A-Q217L, D099N-E156Q-K256Q, E156Q, K012T-D099N-K213Q, K012T-K256Q, K043T-D099N- K141Y-K213Q, K043T-E156Q, K141Y-K213Q, N062L- Q217G, N062L-Q217L-M222L, N062L-Q217L- 222S, N062L-S063G-M222S, N062L-S063G-Q217L-M222L, N062L-S063G-Q217R-M222S, N062L-S063N-Q217L- M222S, N062L-S063N-S125A, N062L-S063R-S125A, N062L-S125A, N062S-S063G-M222S, N062S-S063G- Q217G- 222S, N062S-S063G-S125A, N062S-S063N- Q217L- 222L, N062S-S063N-S125A-Q217L, N062S- S063R-Q217G, N062S-S063R-Q217L-M222S, Q217G- M222S, Q217L-M222S, Q217R, S033G-S063G-Q217R, S063G-Q217E-M222S, S063G-S125A-Q217G, S063L- Q217E, S063N-Q217G, S063N-Q217G-M222S, S063N- Q217L-M222S, S063R-Q217L-M222S y S063R-S125A. una variante de una proteasa parental; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende de tres a seis sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en X024G/R, X053G, X078N, X101 N, X128A/S y X217L/Q, en donde la variante tiene actividad proteolitica; una variante de una proteasa; la variante tiene actividad proteolítica y comprende una secuencia de aminoácidos que comprende de dos a siete alteraciones en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones 24, 53, 78, 97, 101 , 128 y 217, en donde cada alteración es, independientemente, (i) una inserción de uno o más residuos aminoacídicos corriente arriba o corriente abajo del residuo aminoacídico que ocupa la posición, (ii) una deleción del residuo aminoacídico que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del residuo aminoacídico que ocupa la posición con un residuo aminoacídico diferente, una variante de una proteasa parental, en donde la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 15 alteraciones con respecto a la proteasa parental, en donde las alteraciones se seleccionan independientemente de una inserción, una deleción o una sustitución, y las alteraciones incluyen una sustitución de glicina en las posiciones 24 y 53, una sustitución de asparagina en las posiciones 78 y 101 , una sustitución de alanina o serina en la posición 128 y una sustitución de glutamina en la posición 217; la proteasa parental tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la SEQ ID NO:2; y la variante tiene una mayor actividad proteolítica con respecto a la proteasa parental i) una variante de una proteasa parental; esa proteasa parental tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID NO:2; esa variante tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID NO:2; esa variante comprende una sustitución de glicina en las posiciones 24 y 53, una sustitución de asparagina en las posiciones 78 y 101 , una sustitución de alanina o serina en la posición 128 y una sustitución de glutamina en la posición 217, y esa variante tiene una mayor actividad proteolítica con respecto a la proteasa parental; j) mezclas de estas, y uno o más ingredientes adicionales; esa composición es un producto para el cuidado de las telas y el hogar.
En un aspecto de esa composición, esa proteasa para agua fría tiene un índice de rendimiento mayor que 1 , al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de al menos 1 a aproximadamente 10, de al menos 1 a aproximadamente 8 o aun de al menos 1 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:4, tal como se define en el Método de prueba 2 o el Método de prueba 3, o esa proteasa para agua fría tiene un índice de rendimiento de al menos 1 , al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1.0 a aproximadamente 10, de 1.0 a aproximadamente 8 o aun de 1.0 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:6, tal como se define en el Método de prueba 2 o en el Método de prueba 3, y esa proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: a) una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:4; esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: P210S, P210S-N218A, S063T-S078N-S101A-S183T-T244N, N061A-S078N-S224A, S053G-S078N-P129T-Q 185T, S063T-S078N-S101A, S078N-P129T, S063T-S078N-S101A- S183T y S063T-S078N-S101A-T244I; ariante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A- I111V-M124V-Y217Q, G097A-I 1 V-Y167A-Y217Q, S024G- N025G-N061 P-G097A-S101 -G128S-Y217Q S024G- N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-V203Y-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128S- V203Y-Y217Q, V068A-A092G-Y217Q, N061 P-G097A-S 101 N-G 128A-P2 0S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 -G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-I1 1 1V-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G 128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G 128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N061P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A- G 128A-Y217Q , S024G-N025G-N061 P-G097A-S 101 N- G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N- G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G- N061 P-S078N-S 0 N-G 28A-Y217Q, S024G-N025G- S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G- S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P- G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N- G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A- G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A- G128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-G097A-S 101 N-G 28A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S 101 N-G 128?-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-?217Q , S024G-T055 ?-?061 P-G097A-G 128?- ?217Q , S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-N061 ?- G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N06 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128?-?217Q , S053G-T055P-G097A-S 101 N-G 28?-?217Q , S053G-T055P-N061P-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128?-?217Q, T055P-G097A-S101 ?-G128?-?217Q, ?055?-?061 P-S078N-G097A-S101 N-G 28?-?217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 ?- G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128?-?217Q, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 -G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q y S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q; una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:6; esa variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A116V, G160S, I111L, 1115V, N109S, N117M, P005G, Q059V, T164S, Y262M, A015Q, A015S, A098E, A098N, A098S, A098T, A098V, A098Y, A114S, A114T, A116G, A116L, A1 16S, A1 16T, A116W, A133G, A133H, A133T, A133V, A137G, A137I, A137L, A137S, A137T, A138S, A216E, A216F, A216V, D099S, D181E, F261A, F261Q, G024F, G024I, G024Q, G024Y, G097S, G160T, G211L, G211V, H017F, H017W, H039V, H226A, 1031V, 1111V, I268V, K170R, K265R, L016Q, L016T, L135M, L209T, L209V, L233M, L257T, L257V, L267A, L267V, N025A, N025I, N025Q, N025R, N025T, N025V, N101 I, N101Q, N101S, N109A, N109G, N109H, N109L, N109M, N109Q, N109T, N117Q, N184A, N184L, N184T, N184W, N212G, N212L, N212V, N243P, N252G, N252M, P005T, P014S, P040G, P040L, P040Q, P129A, P129S, P172G, P172S, P194Q, P210A, P210S, Q185F, Q185G, Q185I, Q185M, Q185N, Q185S, Q275H, R186K, S009A, S009G, S009H, S009M, S018T, S130T, S132N, S145K, S159T, S161 I, S161K, S161 N, S161T, S162I, S162M, S162Y, S163G, S182F, S182G, S182V, S182W, S183F, S183L, S183M, S183T, S183V, S183W, S224A, S236T, S249V, T022A, T022G, T022Q, T022V, T208V, T242S, T253N, T253S, T254A, T254S, T255L, T255S, T255V, V004A, V004P, V004W, V084C, V139C, V165M, V203F, Y021 K, Y021 N, Y021T, Y021V, Y167F, Y171 F, Y214F, Y262F, Y262T, A088T-L257G, A116T-A128S, N061 S- 109G-A128S-N243V-S260P , S009T-N 109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, S162G-K256R, A088T-N243V, G024E-A116T, K043Y, N076D-A116T, N218S-S248N, S033T-N243V, S033T-S063G, S248N-L257G, A001 E-S249A, A088T-A116T, A088T-A128S, A088T-G131H, A088T-N109G, A088T-S248N, A088T-S249A, A116T-N243V, A116T-T158S, A128S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V, A128S-S248N, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N218S, G024E-N243V, G024E-S162G, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131 H-K256R, G131 H-S249A, K043Y-A088T, K043Y-A116T, K256R, N076D-K256R, N109G, N109G-A116T, N109G-A128S, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-G131H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G- S248N, N218S-L257G, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H- S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-N243V, S033T- A128S, S033T-K256R, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T- S248N, S033T-T158S, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G- N243V, S063G-S162G, S063G-T158S, S248N-K256R, S249A, T158S-N243V, T158S-S249A, A088T-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G 131 H-A 153S-N218S-S248N-L257G , A088T-N 109G-A 116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S, A088T-N109G-A116T-G131H-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N, A088T-N109G-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, A116T-T158S-S248N-L257G, Y006H-A116T-G131 H-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V, A088T-A116T-G 131H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A 16T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-T158S-N243V- K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G 31 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-L257G , A088T-N 109G-A116T-T158S-N2 2D- N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S- N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N- L257G, A088T-N 109G-G 131 H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-K256R-L257G, N109G-A116T-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T 58S-K256R-L257G, 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A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D, A088T-N109G-T158S-S248N-L257G, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-T158S-N243V-L257G, A116T-G131H-N218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-S248N-L257G, A116T-S248N-K256R-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A116T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271R, A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, G 31H-S248N, G13 H-T158S-I234T-N243V-K256R, G 31 H-W241 L-N243V-S248N-K256R, N 09G-A116T-G131 H-A137V-T 58S-S248N-K256R-L257G, N109G-A 6T-G13 H-A15 S-N2 8S-K256R-L257G, N 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N, N109G-A116T-G13 H-T158S-N243V-S248N, N109G-A1 6T-S248N, N109G-A116T-T 58S-L257G, N 109G-A 6T-T158S-N2 8S-W2 1 R- N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G- A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, N 109G-A116T-T158S-S248N-L257G, 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G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A 16T-G 31 H- T158S-S248N, A088T-A116T-K256R, A088T-A116T-K256R- L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-N243V-K256R, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-S248N-K256R, A088T-A 16T-V143A-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-G131 H-K256R-L257G, A088T-G131 ?-?218S-N243V-S248N, A088T-G131 ?-?218S-S248N-L257G, A088T-G131H-S248N-K256R-L257G, ?088?-G131 ?-?158S-L257G, A088T-G131 ?-?158S-N218S-K256R, A088T-G131 ?-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G , ?088?-G 3 ?-? 58S-N2 8S-N243V-L257G, A088T-G 31 ?-?158S- N218S-S248N, A088T-G131 H-T158S-N243V, A088T-G131 H-?158S-N243V-S248N, A088T-G131 ?-?158S-N243V-S248N- K256R, A088T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G, ?088?- 1107T-N 09G-A116T-G131 ?-?158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-L257G, A088T-N109G-? 116T-G 131 ?-?2 8S-N243V, ?088?-? 109G-A 1 16T-G 131 ?- N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-N 109G-A116T-G 131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N243V, A088T-N109G-A116T-G131 H-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-S248N, A088T-N109G-A116T-G131 H-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218T-N243V, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A088T-N 109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 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N109G-A116T-G131 H-N218S-L257G, N 109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-N243V-K256R, N109G-A116T-G131 H-N243V-L257G, N109G-A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, N 109G-A 116T-G 131 H-S248N, N 109G-A 116T-G 131 H-S248 N-I268V, N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-A116T-N218S, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-N243V-K256R, N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-S248N-L257G, N 109G-A116T-T 58S-G21 1 V-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S, 109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V- L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N 109G-A116T-T158S-N243V, N109G-A116T-T158S-Q275R, N109G- G131 H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131 H-N218S-K237N, N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G 31 H-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131H-S248N-K256R, N109G-G131 H-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S-L257G, N109G-N218S-N243V, N109G-N243V-K256R-L257G, N109G-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-T158S-I268V, N109G-T 58S-K256R, N 109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N 109G-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-T158S-N243V, N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, N 09G-T158S-N243V-S248N, N109S-A116T-S248N, N218S, N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-L257G, N243V-K256R, N243V-S248N-K256R, N243V-S248N-K256R-L257G, S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N- 256R, S248N, T158S-N243V-K256R, T158S-N243V-L257G, S018F-S162L, S018P-D120N, P014T-S037T, S009T-K141 R, S161 P-S162L, N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N 109G-A114S-A116T-A128S-N243V, A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109M-A128S-S224A, A88T-N109S- A116T-A128S-S224A-N243V, N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V, S63G-A128S, N109S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A116T-N243V, N61S-N109G-N243V, N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R, N109G-A116T, A88T-N109G, N61G-N109G-N243V, N109G-A128S-P129S- S130T-S224A-N243V, A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A- N243V, N062L-S063N-Q217L, N062S-S063R-Q217E, N062S- S063L-Q217L, S063G, S063G-Q217L, S063N y S063N- Q217L En un aspecto de esa composición, esa variante de una proteasa parental, esa proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEQ ID NO:2 comprende las sustituciones de aminoácidos: S024G+S053G+S078N+S101 N+G128A/S+Y217Q/UD y, opcionalmente, uno o más grupos de sustituciones seleccionados de los siguientes grupos de mutaciones: A088T+N109G+A116T+G131 H+N243V+L257G, S033T+N076D, S009T+N109G+K141 R+N243V, S162G+K256R, N109G+A1 16T, N109G+L257G, S162G+L257G, N061 G+N109G+N243V, N109G+N243V+S248A, S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R, N109G+A1 16T+N243V+K256R, A088T+N109G+A1 16T+G131 H+N243V, A088T+N109G, N109G+N243V, T158S+L257G, N061 S+N109G+N243V, P040A+N109G+N243V+S248N+K256R, S009T+S018T+Y021 N+N109G+K141 R, A088T+N109G+A1 16T+T158S+N243V+K256R, A088T+N109G+A1 16T+T158S+N218S+L257G, N109G+K256R, N109G+N243V+K256R, S063G+K256R, S063G+N109G, S063G, S063G+N076D, S033T+N076D+N218S y N076D+N218S.
En un aspecto de esa composición, esa proteasa es una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:6; esa variante comprende uno o más de los siguientes grupos de sustituciones de aminoácidos: A088T+N109G+A1 16T+G131 H+N243V+L257G, S033T+N076D, S009T+N109G+A128S+K141 R+N243V, S162G+K256R, N109G+A1 16T, N109G+L257G, S162G+L257G, N061 G+N109G+N243V, N109G+A128S+N243V+S248A, S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R, N109G+A116T+N243V+K256R, A088T+N109G+A 16T+G 3 H+N243V, A088T+N109G, N109G+N243V, T158S+L257G, N061 S+N109G+N243V, P040A+N 109G+A128S+N243V+S248N+K256R, S009T+S018T+Y021 N+N109G+A128S+K141 R, A088T+N 109G+A1 16T+T158S+N243V+K256R, A088T+N109G+A1 16T+T158S+N218S+L257G, N109G+K256R, N109G+A128S+N243V+K256R, S063G+K256R, S063G+N 109G, S063G+A128S, S063G+N076D, S033T+N076D+A128S+N218S y N076D+N218S.
En un aspecto de esa composición, esa proteasa parental es una proteasa subtilisina.
En un aspecto de esa composición, esa proteasa parental es una proteasa subtilisina seleccionada del grupo que consiste en proteasas subtilisinas BPN' de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO:2), Geóbacillus stearothermophilus (clasificada anteriormente como B. stearothermophilus), B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis.
En un aspecto de esa composición, esa proteasa para agua fría es una variante de una proteasa parental; esa proteasa para agua fría comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) indicados más abajo, en donde al menos una mutación se selecciona del grupo (a): a) 1, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 33, 43, 76, 102, 109, 137, 141, 158, 169, 204, 210, 218, 243, 248, 249, 256, 257, 260 y 269; y b) 24,25,40, 52.53, 55, 58, 59,61,62, 63,68,78, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 97, 100, 101, 103, 104, 106, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 144, 145, 159, 161, 162, 167, 194, 203, 206, 213, 217, 227, 232, 239, 240, 242, 265, 267 y 275.
En un aspecto de esa composición, esa variante de una proteasa parental, esa proteasa parental tiene la SEQ ID NO:2 comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) indicados más abajo, en donde al menos una mutación se selecciona del grupo (a): (a) A1 E/T, S9/T, P14L, A15L, L16C, H17T, S18L/Í, Q19K, G20A, Y2 T, T22L, G23E, S33T, K43Y, N76D, G102A, N109A/S/G, A137V, K141 R, T158S, G169A, S204E, P210S, N218S, ?243??/, S248N/A, S249A, K256R, L257G, S260P y N269D; y (b) S24G/R/E, N25G, P40A/E, P52L, S53G, T55P, F58G, Q59S, N61 E/P/G/S, N62Q/R7S, S63G/H, V68A, S78N, P86S, S87D/G, ?88??/, S89Y, A92G, L96T, G97A, G100N/Q T, S101 N, Q103E/H, Y104N, W106F, I11 1V, A1 14G, I115V, ?1 16??", N117S, N118G, N123A/G/QA , ?124??/, S125A, L126A, G128A/S, P129E/Q/S/V, S130G, G131 S/H, S132N, A133V, A134T, A144K, S145D, S159K, S161 P, S162G/K, Y167A, P194L, V203Y, Q206D/E, K213L, Y217Q/UD, V227T, A232T, P239R V, N240K, T242R, K265N, L267V y Q275E.
En un aspecto de esa composición, esa variante de una proteasa parental tiene una carga neta total de -1 , 0 o +1 con respecto a la BPN' silvestre.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en un surfactante, un aditivo, un agente quelante, un agente inhibidor de transferencia de tinte, un dispersante, una o más enzimas adicionales, un estabilizante de enzimas, un material catalítico, un activador blanqueador, un peróxido de hidrógeno, una fuente de peróxido de hidrógeno, un perácido preformado, un agente polimérico dispersante, un agente de remoción/antiredepósito de suciedad de arcilla, un abrillantador, un supresor de espuma, un tinte, un perfume, un sistema de suministro de perfume, un agente elastizante de estructuras, un suavizante de tela, un portador, un hidrótropo, un auxiliar de procesamiento, un solvente, un pigmento y mezclas de estos.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador, un abrillantador, un agente quelante y mezclas de estos.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende una segunda proteasa no equivalente inmunológicamente seleccionada del grupo que comprende: a) subtilisinas (EC 3.4.21.62); b) proteasas de tipo tripsina o quimotripsina; c) metaloproteasas; y d) mezclas de los mismos.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende una segunda proteasa no equivalente inmunológicamente que es una proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62); esa proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) es una variante de proteasa GG36 para agua fría.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, celobiosa deshidrogenasas, xiloglucanasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mananasas, pectato liasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, liquenasas, glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, laccasas, amilasas o mezclas de estas.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en: a) lipasas de primer lavado; b) alfa-amilasas que tienen más de 90 % de identidad con las alfa-amilasas alcalinas silvestres derivadas de Bacillus esp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 DSM 12368, DSMZ núm. 12649, KSM AP1378, KSM K36 o KSM K38; c) endoglucanasas de origen microbiano; y d) mezclas de los mismos.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: a) un surfactante de alcohol etoxisulfato; b) un quelante seleccionado del grupo que consiste en DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), HEDP (ácido hidroxietano difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriaminapenta(metilenofosfónico)), ácido etilendiaminadisuccínico (EDDS), sal disódica hidratada del ácido 1 ,2-dihidroxibenceno-3,5-disulfónico y derivados de estos quelantes; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: a) un surfactante de alcohol etoxisulfato que tiene una cadena alquilica con una longitud de 10 a 14 y un grado de etoxilación de 1 a 4; b) un quelante seleccionado del grupo que consiste en DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), HEDP (ácido hidroxietano difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriaminapenta(metilenofosfónico)), ácido etilendiaminadisuccínico (EDDS), sal disódica hidratada del ácido 1,2-dihidroxibenceno-3,5-disulfónico y derivados de estos quelantes; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición, esa composición comprende, en base al peso total de la composición, un nivel de quelante de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %.
En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un agente tonalizador de telas seleccionado del grupo que consiste en a) tintes; b) conjugados de tinte y arcilla que comprenden al menos un tinte catiónico básico y una arcilla de esmectita; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición, esa composición comprende un agente tonalizador de telas seleccionado del grupo que consiste en a) tintes de moléculas pequeñas; tintes poliméricos y mezclas de estos; b) conjugados de tinte y arcilla que comprenden al menos un tinte catiónico básico y una arcilla de esmectita; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición, esa composición comprende, en base al peso total de la composición: a) de aproximadamente 0.0005 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso de esa proteasa para agua fría; y b) uno o más de los siguientes (i) de aproximadamente 0.00003 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso de agente tonalizador de telas; (¡i) de aproximadamente 0.001 % en peso a aproximadamente 5 % en peso de cápsulas de perfume y/o (iii) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso de polímero anfifilico limpiador.
En un aspecto de esa composición, esa composición tiene una forma de dosis unitaria de uno o varios compartimentos.
En un aspecto de esa composición, esa composición está en la forma de una dosis unitaria de compartimentos múltiples, en donde al menos una proteasa está en un compartimento distinto al de cualquier enzima adicional y/o quelante.
En un aspecto se describe una composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifilico limpiador y mezclas de estos, esa composición es un producto para el cuidado de las telas y el hogar.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifilico limpiador y mezclas de estos, esa proteasa para agua fría es una variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 (subtilisina BPN'); esa variante comprende uno o más de los siguientes conjuntos de mutaciones, inserciones o deleciones: S182E, N109I, N109D-Y217L-S248R, N109D-S188R-Y217L, S87D-Y217L-S248R, S87R-N109D-Y217L-S248R, S87R- N109D-S188D-Y217L-S248R, G128A-Y217Q, 1111V-M124V, M124V-Y217Q, N62Q-G97A, S89Y-M124V, V68A, V68A-A92G, V68A-G97A, V68A-I11 V, V68A-S89Y, V68A-V227T, V68A-Y217Q, W106F-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q, G97A-L126A-Y217Q, G97A-M124V-L126A-Y217Q, G97A-N 23G-Y217Q, L96T-G97A-Y217Q, M124V-L126A-Y2 7Q, N62Q-G128A-Y217Q, N62Q-G97A-Y217Q, G97N-G128A-Y217M, G97G-G128S-Y217E, G97A-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217E, G97A-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q, G97M-G128G-Y217M, G97G-G128S-Y217Q, G97S-G128S-Y217Q, G97G-G128A-Y217Q, G97S-G128A-Y217E, G97A-G128S-Y217L, G97A-G 28A-Y217N, G97Q-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217M, G97A-G128A-Y217S, G97D-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217Q, G97Q-G128G-Y217D-S87Y, G97S-G128A-Y217N, G97A-G128S-Y217T, G97D-G128S-Y217E, G97D-G128A-Y217L, G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T, G97T-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y217I, G97Q-G128S-Y217Q, G97G-G128A-Y217D, G97Q-G128A-Y217N, G97S-G128A-Y217M, G97S-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217M, G97E-G128S-Y217M, G97S-G128P-Y217Q, G97T-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q-A73T, G97E-G128S-Y217N, G97G-G128A-Y217I, G97Q-G128A-Y217D, G97Q-G128S-Y217M, G97R-G128T-Y217Q-S162P, G97S-G128S-Y217D, G97T-G128P-Y217I, G97Q-G128G-Y217E, G97C-G 28G-Y2 7N, G97D-G128S-Y217H, G97M-G128S-Y217L, G97M-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217E, G97M-G128S-Y217I, G97A-G128P-Y217A, G97R-G128S-Y217D, G97A-G128A-Y217Q-S145D, G97A-G128A-Y217Q-P239R, G97A-G128A-Y217Q-N6 E-P 129E-S 162K-K213L-N240K, G97A-G 128A-Y217Q-N61 E, G97A-G 28A- Y217Q-P40E-A144K-K213L, G97A-G128A-Y217Q-P129E, G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K, G97A-G128A-Y217Q-K213L, G97A-G128A-Y217Q-S87D, G97A-G128A-Y217Q-Q206E, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L, G97A-G128A-Y217Q-K265N, G97A-G128A-Y217Q-S24R, G97A-G128A-Y217Q-P40E, G97A-G128A-Y217Q-Q275E, G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K, G97A-G128A-Y217Q-A144K, G97A-G128A-Y217Q-S159K, G97A-G128A-Y217Q-S162K, G97A-G128A-Y217Q-N240K, G97A-G128A-Y217Q-S53G, G97A-G128A-Y217Q-S78N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-I1 11V, G97A-G128A-Y217Q-S53G-N1 17S, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N, G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I 1V, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-N117S, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N, Y217L-V068C-A069G, Y217L-I079F-A098G, Y217L-P086T-S101D-Q103S-V147I, Y217L-A088T-P129S-G146D, Y217L-V093I-G128D-P129R, Y217L-Z096.01D-A098R, Y217L-Z096.01 H-A098G, Y217L-G097S-Z097.01S-A098G-A273T, Y217L-A098S-D099G-G100D, Y217L-Z098.0 N, Y217L-D099G-Z099.0 N, Y217L-D099G-Z099.01S, Y217L-D099V-S101 D, Y217L-Z099.01S, Y217L-G100D, Y217L-S101 D-Q103H, Y217L-S101G-A151V, Y217L-S101 H-G102S, Y217L-S101 H-Q103D, Y217L-G102R-Q103C-Y104C-V192I, Y217L-Q103D, Y217L-V121 I-I122S-N123C, Y217L-V121 L-N123C, Y217L-I122S-N123S, Y217L-M124I, Y217L-M124V, Y217L-L126F-P129Z-S182N, Y217L-L126Y, Y217L-G127S-P129D, Y217L-Z127.01N-G128S-P129S, Y217L-G128H-P129Y, Y217L- G128S-P129D, Y217L-G128S-P129D-S248R, Y217L-G128S-P129G, Y217L-P129G-G131Z, Y217L-P129G-S130H-S132Z, Y217L-P129H-G131Z, Y217L-P129L, Y217L-P129S-S130H-S132Z, Y217L-P129Z, Y217L-P129Z-S130G, Y217L-P129Z-S130G-G131 H-S132H, Y217L-P129Z-S130H, Y217L-S130V-G131 D-S132I, S87T-A88L-S89G-G97A-G128A-Y217Q, N61P-S63H-G97A-G128A-Y217Q, S87G-A88V-S89A-G97A-G128A-Y217Q, P86S-S87G-A88V-G97A-G128A-Y217Q, Q59S-N61P-G97A-G128A-Y217Q, S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q, N61 P-N62S-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-P129Q-S 130G-G 131 S-Y2 7Q, L75S-N76Y-G97A-G 128A-Y217Q, G97A-G 28A-V203 Y-Y217Q, T55P-G97A-G128A-Y217Q, A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-G211 R-N212S-K213V-Y217Q, G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q, T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q, S24R-G97A-G128A-Y217Q, G97A-A98S-G128A-Y217Q, G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q, Q59E-N61 P-G97A-G128A-Y217Q, G97A-A98E-G128A-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61 P-N62S-P 194L-A232T, G97A-G 128A-Y217Q-P129Q-S130G-G 131 S-A133V-L267V, G97A-G128A-Y217Q-A134T-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R, G97A-G128A-Y2 7Q-A134T-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E, G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161 P, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q, G97A-G128A-Y217Q-I 15V-L267V, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A1 6S-N117G-N 18R, G97A-G128A-Y217Q-V203Y-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q- P52S-T55P-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61 P-A116S-N117G-N 1 18R, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-T242R, G97A-G128A-Y217Q-P40E-T55P-N269K, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-V8L-N25Y-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-G211T-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S24R-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S24R-A128S-P129G, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-N240K, G97A-G 128A-Y217Q-N25Y-P 129Q-S 130G-G 131 S , G97A-G 28A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A134T, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-P 29Q-S130G-G131 S, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V-P194S, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-I115V, G97A-G128A-Y217Q-N25Y-S87G-A88V-S89A, G97A-G128A-Y217Q-A134T-N240K, G97A-G128A-Y217Q-S24R-Q59S-N61P, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P239R, G97A-G128A-Y217Q-T55P-A116S-N117G-N118R, G97A-G128A-Y217Q-A134T-S16 P, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S101N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-N25Y-Q59S-N61P, G97A-G128A-Y217Q-N25Y-P129Q-S130G-G131S-A137T, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-N61 P-S63H, G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-N240K, G97A-G128A-Y217Q-T55P-A134T, G97A-G128A-Y217Q-N25Y-N61 P-S63H, G97A- G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-P129S, G97A-G128A-Y217Q-T55P-L75H-N76G, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y, G97A-G128A-Y2 7Q-T55P-I 5V, G97A-G 28A-Y217Q-T55P-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-A116N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-G211 R-N212S-K213V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-N61 P-S78N-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-I115V-A273S, G97A-G128A-Y217Q-N25Y-T55P, G97A-G 28?-?217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61 ?-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61 P-?240?, G97A-G128A-Y217Q-S 6 P-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S10 N, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61 P-S101 N, G97A-G 128?-?217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S 101 N-V203Y, G97A-G 128?-?217Q-?240?, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S87T-A88L-S89G-S101N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S101 N, G97A-G128A-?217Q-N61 P-S63H-A128S-P129Q, G97A-G 128?-?217Q-S89Y-P 129Q-S 130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G13 S-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-I 5V-N240K, G97A-G 28A-Y217Q-S53G-N61P-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y2 7Q-S 61 P-V203Y, G97A-G128A-Y2 7Q-S87T-A88L-S89G-N240K, G97A-G 128?-?217Q-S87T-A88L-S89G-P239R, G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-I115V-A134T, G97A-G128A-Y217Q-Y6Q- P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S89Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N-A88V-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-S63H-S78N-I111V-A134T, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101N-V203Y, G97A-G128A-Y2 7Q-S53G-N61 P-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-S78N-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61P-S78N-S87T-A88L-S89G-S10 N, G97A-G128A-Y217Q-N240K-A273S, G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N6 P-S87T-A88L-S89G, G97A-G128A-Y217Q-N61P-S63H-S78N-S161P, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-S63H-S78N-I111V, G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P129Q, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-S78N-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-N61 E-A144 , G97A-G128A-Y217Q-A134T-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S10 -V203Y. G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-N61 P-S 101 N-V203Y, G97A-G 128A-Y217Q-N61 P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-T55P-N240K, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S87T-A88L-S89G-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-P239R, G97A-G128S-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61 P-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-I11 1V-P129Q-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S 101 N-V203Y, G97A-G 128A-Y217Q-Q59S-N61 P-S87G-A88V-S89A, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101N, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-S162K, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q-S130G-G131 S, G97A-G128A-Y217Q-T55P-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q- S24G-N25G-S53G-T55P-N6 P-S78N-S87T-A88L-S89G, G97A-G 128A-Y217Q-I111V-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-I111V-A273S, G97A-G128A-Y217Q-N61 P-S87T-A88L-S89G, G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-N61P-S63H, G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-P129S-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S159K-L267V, G97A-G128A-Y217Q-P40E-S53Y-S78Y-P86S-S87G-A88V, G97A-G128A-Y2 7Q-S24R-S145D, G97A-G128A-Y217Q-I V-S159K, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129L, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61 P-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S101 N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-N61 P-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S89Y, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129V, G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A116N-N 117S-N 118G-P172H, G97A-G128A-Y217Q-I111V-A134T, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-P5S-S87G-A88V-S89A-A116G-N117R, Y217Q-N61P-A97G-G102A-A128G-P129S, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-N61P-S78N, G97A-G128A-Y217Q-S145D-S159K-N240K-Q275E, G97A-G128A-Y217Q-T55P-A128S-P 129D, G97A-G 128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-A128S-P129D, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-I111V-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-S162K, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I115V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-T55P-S78N, G97A-G128A-Y217Q-T55P-A92G, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-S87T-A88L-S89G-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-T22N-S24A-T55P, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S87T-A88L-S89G- S101N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S53G-T55P-S78N-S87T-A88L-S89G, G97A-G128A-Y217Q-P 29Q-S 130G-G 131 S-S159K, G97A-Y217Q-N61 P-N62Q-G100N-A128G, G97A-G128A-Y217Q-S24R-S78N-S182P-L267V, G97A-G 128A-Y217Q-P239R-A273S, G97A-G 128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T--A88L-S89G-S 01 N-V203Y, G97A-G 128A-Y217Q-P 129Q-S 130G-G 131 S-T242 R , G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G, G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61 P-S78N-S87T-A88L-S89G, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-A144K, G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61P-A1 6N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111 , G97A-G128A-Y217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E, G97A-G128A-Y217Q-S145D-A273S, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-A116N-N 117S-N 1 18G-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S87G-A88V-S89A-A 16N-N 1 7S-N 18G-A144T , G97A-G 128A-Y2 7Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S10 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V, G97A-Y217Q-N61P-A128G-P129S-S130P, G97A-G128A-Y217Q-T55P-N61P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130P, G97A-Y217Q-N123G-A128G, G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I, S78N-G97A-G128A-Y217Q, G97A-S101 N-G128A-Y217Q, G97A-G128A-A137V-Y217Q, N61 P-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-S130P-Y217Q, G97A-Q103N-G128A-Y217Q, S63T-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G102A-G128A-Y217Q, G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R, S87R-G97A-G128A-Y217Q, G97A- G128A-S188D-Y217Q, S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R, G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q, G97A-G128A-S248D-Y217Q, S78N-G97A-G 28A-Y217Q-L267V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161 P, S78N-G97A-G128A-Y217Q-1115V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S, S78N-G97A-G 28A-Y217Q-G211T, S78N-G97A-G128A-Y217Q, S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L, S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y, S78N-G97A-G128A-Y217Q-A138T, G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa variante de la proteasa que tiene la SEQ ID N0.2 comprende tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones dentro del grupo de posiciones que comprende las posiciones 24, 25, 40, 52. 53, 55, 58, 59, 61 , 62, 63, 68, 78, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 97, 100, 101 , 103, 104, 106, 1 11 , 114, 1 15, 1 16, 1 17, 118, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 144, 145, 159, 161 , 162, 167, 194, 203, 206, 213, 217, 227, 232, 239, 240, 242, 265, 267 y 275.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) incluidos más abajo: (a) mutaciones cargadas seleccionadas del grupo que consiste en N61E, A144K, P129E, P239R, P40E, Q103E, Q206E, Q275E, S145D, S159K, S162K, S24R, S63H, S87D y T242R; y (b) mutaciones neutras seleccionadas del grupo que consiste en A114G, A116N, A133V, A134T, A232T, A88V, A92G, F58G, G100T, G128A, G131S, G97A, I111V, I115V, K213L, K265N, L126A, L267V, L96T, M124V, N117S, N118G, N123G, N240K, N25G, N61P, N62Q, N62R, N62S, P129Q, P129V, P194L, P239V, P52L, P86S, Q59S, S101 N, S125A, S130G, S132N, S161 P, S24G, S53G, S78N, S87G, S89Y, T55P, V203Y, V227T, V68A, W106F, Y104N, Y167A y Y217Q.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 comprende una o más mutaciones y tiene una carga neta total de -1 , 0 o +1 con respecto a la BPN' silvestre.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en un surfactante, un aditivo, un agente quelante, un agente inhibidor de transferencia de tinte, un dispersante, una o más enzimas adicionales, un estabilizador de enzimas, un material catalítico, un activador blanqueador, un peróxido de hidrógeno, una fuente de peróxido de hidrógeno, un perácido preformado, un agente polimérico dispersante, un agente de remoción/antiredepósito de suciedad de arcilla, un abrillantador, un supresor de espuma, un tinte, un perfume, un sistema de suministro de perfume, un agente elastizante de estructuras, un suavizante de telas, un portador, un hidrótropo, un auxilar de procesamiento, un solvente, un pigmento y mezclas de estos.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende una tercera proteasa no equivalente inmunológicamente que es una proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62); esa proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) es una variante de proteasa GG36 para agua fría.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, celobiosa deshidrogenasas, xiloglucanasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mananasas, pectato Nasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, liquenasas, glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, laccasas, amilasas o mezclas de estas.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende una enzima adicional seleccionada del grupo que consiste en: a) lipasas de primer lavado; b) alfa-amilasas que tienen más de 90 % de identidad con alfa-amilasas alcalinas silvestres derivadas de Bacillus esp.
NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 DSM 12368, DSMZ núm. 12649, KSM AP1378, KSM K36 o KSM K38; c) endoglucanasas de origen microbiano; y mezclas de los mismos.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: a) un surfactante de alcohol etoxisulfato; b) un quelante seleccionado del grupo que consiste en DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), HEDP (ácido hidroxietano difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriaminapenta(metilenofosfónico)), ácido etilendiaminadisuccínico (EDDS), sal disódica hidratada del ácido 1 ,2-dihidroxibenceno-3,5-disulfónico y derivados de estos quelantes; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: a) un surfactante de alcohol etoxisulfato que tiene una cadena alquílica con una longitud de 10 a 14 y un grado de etoxilación de 1 a 4; b) un quelante seleccionado del grupo que consiste en DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), HEDP (ácido hidroxietano difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriaminapenta(metilenofosfónico)) ácido etilendiaminadisuccínico (EDDS), sal disódica hidratada del ácido 1 ,2-dihidroxibenceno-3,5-disulf0nico y derivados de esos quelantes; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende, en base al peso total de la composición, un nivel de quelante de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende un agente tonalizador de telas seleccionado del grupo que consiste en a) tintes; b) conjugados de tinte y arcilla que comprenden al menos un tinte catiónico básico y una arcilla de esmectita; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifilico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende un agente tonalizador de telas seleccionado del grupo que consiste en a) tintes de moléculas pequeñas; tintes polimérícos y mezclas de estos; b) conjugados de tinte y arcilla que comprenden al menos un tinte catióníco básico y una arcilla de esmectita; y c) mezclas de estos; En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifilico limpiador y mezclas de estos, esa composición comprende, en base al peso total de la composición: a) de aproximadamente 0.0005 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso de esa proteasa para agua fría; y b) uno o más de los siguientes: (i) de aproximadamente 0.00003 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso de un agente tonalizador de telas; (ii) de aproximadamente 0.001 % en peso a aproximadamente 5 % en peso de una cápsula de perfume; (¡ü) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso de un polímero anfifílico limpiador; (¡v) de aproximadamente 0.00003 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso de una variante de proteasa GG36.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición está en forma de dosis unitaria de uno o varios compartimentos.
En un aspecto de esa composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, esa composición está en la forma de una dosis unitaria de compartimentos múltiples, en donde al menos una proteasa está en un compartimento diferente al de cualquier enzima adicional y/o quelante.
Se describe un producto para el cuidado de las telas y el hogar que puede comprender una o más proteasas para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en un encapsulado que comprende un perfume, un agente tonalizador, un polímero anfifílico limpiador y mezclas de estos, en donde la cbp de cualquier aspecto de la composición mencionada anteriormente está compuesto por uno o más materiales adicionales.
En un aspecto del producto para el cuidado de las telas y el hogar mencionado anteriormente, ese producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender, en base al peso total del producto para el cuidado de las telas y el hogar, de aproximadamente 0.0005 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso, de aproximadamente 0.001 % en peso a aproximadamente 0.05 % en peso o aun de aproximadamente 0.002 % en peso a aproximadamente 0.03 % en peso de esa proteasa para agua fría.
En un aspecto del producto para el cuidado de las telas y el hogar mencionado anteriormente, ese producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender, en base al peso total del producto para el cuidado de las telas y el hogar, de aproximadamente 0.00003 % en peso a aproximadamente 0.1 % en peso, de aproximadamente 0.00008 % en peso a aproximadamente 0.05 % en peso o aun de aproximadamente 0.0001 % en peso a aproximadamente 0.04 % en peso de agente tonalizador de telas.
En un aspecto del producto para el cuidado de las telas y el hogar mencionado anteriormente, ese producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender, en base al peso total del producto para el cuidado de las telas y el hogar, de aproximadamente 0.001 % en peso a aproximadamente 5 % en peso, de aproximadamente 0.01 % en peso a aproximadamente 2 % en peso o aun de aproximadamente 0.03 % en peso a aproximadamente 0.5 % en peso de cápsulas de perfume.
En un aspecto del producto para el cuidado de las telas y el hogar mencionado anteriormente, ese producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender, en base al peso total del producto para el cuidado de las telas y el hogar, de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso, de aproximadamente 0.25 % en peso a aproximadamente 2.5 % en peso o aun de aproximadamente 0.3 % en peso a aproximadamente 1.5 % en peso de polímero anfifilico limpiador.
Proteasas para agua fría Además de las proteasas para agua fría descritas anteriormente en la sección Productos para el cuidado de las telas y el hogar, las variantes de la proteasa para agua fría adecuadas son enzimas que exhiben uno o más de los cuatro criterios siguientes: (a) un índice de rendimiento de al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9; al menos 2, de 1.1 a aproximadamente 10, de 1.1 a aproximadamente 8 o aun de 1.1 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 X (60 °F) cuando se compara con Purafect Prime (SEQ ID NO:2 con la mutación Y217L), tal como se define en el Método de prueba 2 y/o en el Método de prueba 3; (b) un índice de rendimiento de al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1.3 a aproximadamente 10, de 1.3 a aproximadamente 8 o aun de 1.3 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con ???' (SEQ ID N0:2), tal como se define en el Método de prueba 2 y/o en el Método de prueba 3; (c) un índice de rendimiento de al menos 0.9, al menos 1 .0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 0.9 a aproximadamente 10, de 0.9 a aproximadamente 8 o aun de 0.9 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con la SEQ ID NO:4, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o en el Método de prueba 3; (d) un índice de rendimiento de al menos 0.9, al menos 1 .0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 0.9 a aproximadamente 10, de 0.9 a aproximadamente 8 o aun de 0.9 a aproximadamente 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con la SEQ ID NO:6, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o en el Método de prueba 3.
Los ejemplos de dichas proteasas pueden encontrarse en los Ejemplos 2-18 y 31 de la presente especificación. Las proteasas para agua fría, tal como se definieron anteriormente, pueden usarse en productos para el cuidado de las telas y el hogar. Así, en un aspecto se describen productos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden esas proteasas para agua fría.
Proteasas GG36 de esta invención Las proteasas GG36 pueden seleccionarse de las variantes descritas en los Ejemplos 19 a 30. En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría pueden ser proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1.
Las variantes de las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 adecuadas incluyen enzimas derivadas de una proteasa parental; la secuencia de esa proteasa parental es al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:755; esa variante tiene una o más de las siguientes características: a) un índice de rendimiento en el Método de prueba 4 de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9; al menos 2; de 1.1 a aproximadamente 10, de 1.1 a aproximadamente 8 o aun de 1.1 a aproximadamente 5; un índice de rendimiento en el Método de prueba 5 de al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2; de 1.1 a aproximadamente 10, de 1.1 a aproximadamente 8 o aun de 1.1 a aproximadamente 5; c) índice de rendimiento en el Método de prueba 6 de menos 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1.0 a aproximadamente 10, de 1.0 a aproximadamente 8 o aun de 1.0 a aproximadamente 5.
Las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 adecuadas pueden derivarse de subtilisinas, particularmente, de la subtilisina de Bacillus Lentus de la SEQ ID NO:755 y, en un aspecto, pueden comprender una o más de las siguientes mutaciones: A1 R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71 G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91 N, K94N, G100S, S101A, S101 N, S101G, S101 D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L1 1 1V, E1 12V, G1 15K, G1 15R, N1 17F, G1 18I, V121 F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231 I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241 R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271 F, E271 I, E271 H. E271 P, E271T, E271V, E271 L y/o A272F.
En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 adecuadas incluyen subtlisinas, particularmente, de Bacillus Lentus de la SEQ ID NO:755; esas subtilisinas pueden comprender uno o más de los siguientes conjuntos de mutaciones, inserciones o deleciones: T022R-S024R, S009A-E271L, N018R-W241 R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R-S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241 R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R-S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271 L, S024R-E271 L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001 R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241 R-E271 L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, N062E-P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S-N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A-P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E-R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271 F, A016S-S188D, T022A-L11 1V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S101A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271 F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271 , T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S101A-S103G-V104L-S188D, S101G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271 F-Y209E, T22A-Y209E-E271 F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271 F, T22A-L111 -S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104I-G159D-A232V-Q236H- Q245R-N248D-N252K, S101G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S 01 G-S 103A-V104L-G 159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101 G-S103A-V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101 G-S103A-V104I-G159D- A232V-Q245R-N248D-E271 F, N62E-S 01 G-S 03A-V104I- G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101 G-S1 OSA-VI 04I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A- V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101G-S103A-V104I- G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101 G-S103A-V104!- A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101 G-S103A-V10 1- G159D-A232V-Q245R-N248D-E271F, S 101 G-S103A-V104I- G159E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I- G159D-A232V-Q245R-N248D-N238R, S 101 G-S103A-V 04I- A158E-A232V-Q245R-N248D-E271 F, S101 G-S103A-V104I- G159D-A232V-Q245R-N248D, S101 G-S103A-V104I-G159D- A232V-Q245R-N248D-E271 F, S101 G-S103A-V104I-G159D- A232V-Q245R-N248D-N76D, y/o S101G-S103A-V104I-G159E- A232V-Q245R-N248D-E27 F.
En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 adecuadas incluyen variantes de subtiisinas, particularmente, de Bacillus Lentus de la SEQ ID NO:755; esas variantes comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones dentro del grupo de posiciones que comprende las posiciones 1 , 2, 4, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 42, 43, 46, 52, 57, 59, 62, 68, 71 , 72, 74, 75, 76, 78, 82, 86, 89, 91 , 94, 100, 101 , 103, 104, 106, 108, 111 , 1 12, 115, 1 17, 118, 121 , 128, 129, 144, 148, 158, 159, 160, 166, 185, 186, 188, 197, 203, 209, 210, 212, 214, 215, 217, 224, 230, 231 , 236, 238, 239, 241 , 242, 243, 244, 248, 249, 250, 252, 253, 262, 263, 265, 267, 269, 271 y 272.
En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 adecuadas incluyen variantes de subtiisinas, particularmente, de Bacillus Lentus de la SEQ ID NO:755; esas variantes comprenden un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas del grupo que comprende: A1 R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, H17R, N18R, G20R, T22A, T22R, S24R, S24W, G25R, G25V, V26F, L42I, N43R, N43A, G46R, P52F, P52E, P52N, T57R, Q59A, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C. L75A, L75F, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89T, E89G, E89H, E89I, E89V, E89W, Y91 N, K94N, G100S, S101A, S101 N, S101G, S101 D, S103G, S103N, V104L, V104I, S106V, S106G, A108I, L1 11V, E112V, G115K, G115R, N1 17F, G118I, V121 F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, S144R, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, N185I, R186H, S188E, S188D, D197F, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231 I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, P239S, W241 R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, N248V, H249R, L250I, N252R, T253R, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271F, E271 I, E271 H, E271P, E271T, E271V, E271 L y A272F; y opcionalmente una o más de las siguientes mutaciones: S103A, G159D, Q236H, Q245R, N248D y N252K.
En un aspecto se describe esa proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 que es una variante de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO:755; esa variante comprende una o más mutaciones y tiene una carga neta total de -5, -4, -3, -2, -1 o 0 con respecto a la subtilisina GG36 silvestre.
En un aspecto, esas proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 son proteasas para agua fría con baja resistencia iónica. Se describen esas proteasas con baja resistencia iónica que son variantes de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO:755; esas variantes comprenden una o más mutaciones y tienen una carga neta total de -5, -4, -3, -2, -1 o 0 con respecto a la subtilisina GG36 silvestre. Estas mutaciones se seleccionan de: (a) dos o más de las siguientes mutaciones: A1 R, Q2S, V4R, V4S, S9A, R10S, P14K, A16S, T22A, T22R, S24R, G25V, V26F, L42I, P52F, P52E, P52N, N62E, N62Q, V68A, V68C, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, S78R, E89P, E89T, E89G, E89H, E89W, Y91N, K94N, G100S, S101A, S101 N, S101G, S101D, S103G, S103N, V104L, V104I, A108I, L111V, E1 12V, G115K, N117F, V121F, S128D, S128F, S128L, S128N, P129E, L148I, A158E. G159E, S160D, S166D, N185E, R186H, S188E, S188D, V203E, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, P210R, S212I, S212F, Y214F, A215N, A215D, A215E, L217E, L217N, T224A, A230E, A231 I, Q236F, N238R, N238K, P239K, P239G, P239R, N248V, H249R, L250I, L262D, Y263F, S265F, L267V, L267N. N269I, N269R, E271 F, E271I, E271 H y A272F; y/o (b) uno o más de los siguientes conjuntos de mutaciones: N062E- P129E, N062E-G159E, A016S-L148I, A158E-H249R, A016S- N062E, L111V-S188D, T022A-N062E, N062E-L148I, T022A- P129E, N062E-E271F, N062E-A158E, A016S-G159E, N062E- R186H, S128N-G159E, N062E-S188D, N062E-S128N, L148I-G159E, S103G-A158E, L111V-G159E, A158E-E271 F, A016S-S188D, T022A-L111V, S128N-A158E, A016S-A158E, V104L-A158E, S128N-R186H, G159E-Y209E, N062E-S 01A, L111V-Y209E, L148I-S188D, S101A-Y209E, T022A-S188D, A016S-T022A, S128N-P129E, A016S-Y209E, A016S-S128N, T022A-E089P, S128N-Y209E, E089P-A158E, N062E-S103G, R186H-E271F, A016S-P129E, E089P-G159E, L111V-H249R, S101A-P129E, L148I-Y209E, T022A-G159E, P129E-H249R, P129E-Y209E, V104L-P129E, S128N-S188D, L111V-A158E, T022A-A158E, N062E-Y209E, N062E-H249R, S101A-R186H, E089P-P129E, P129E-E271F, T22A-L111V-G159E, S101A-S103G-V104L-Y209E, S101A-S103G-V104L-G159E, S10 A-S103G-V104L-S188D, S 01G-S103A-V104I-G159D, T22A-S103G-G159E, T22A-S128N-E271F-Y209E, T22A-Y209E-E27 F, T22A-S101A-Y209E, S101A-Y209E-E271 F, T22A-L111V-S128N, T22A-S101A-G159E, S101A-S103G-V104L, T22A-S101A-S103G-V104L, S101A-S103G-V104L, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L-S128N, S103A-V104 G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101 G-V104I-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S10 G-S103A-V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L- G159D-Q236H-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L- G159D-A232V-Q245R-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L- G159D-A232V-Q236H-N248D-N252K, S101 G-S103A-V104L- G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101 G-S103A-V104L- G159D-A232V-Q236H-Q245R-N248D, N62E-S101 G-S1 OSA- VI 04I-G 59D-A232V-Q245R-N248D-E271 F, N62E-S10 G- S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A- S101 G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101 G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-T253R, S101 G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, T22A-S101 G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D- E271F, S 10 G-S 103A-V104 l-G 159E-A232V-Q245R-N248D- H249R, S101G-S 03A-V 04I-G159D-A232V-Q245R-N248D- N238R, S101 G-S103A-V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D- E271F, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D, S101 G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271 F, S101 G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248D-N76D y S101 G-S103A-V104I-G159E-A232V-Q245R-N248D-E271 F; En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 con baja resistencia iónica descritas anteriormente forman parte de una composición detergente diluida en agua, típicamente, en una lavadora, para formar un licor de lavado que tiene una conductividad de aproximadamente 0.1 mS/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente 0.3 mS/cm a aproximadamente 2.5 mS/cm o aun de aproximadamente 0.5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm.
En un aspecto, esas proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 son proteasas para agua fría con alta resistencia iónica. Esas proteasas con alta resistencia iónica son variantes de la subtilisina GG36 que tiene la SEQ ID NO:755¡ esas variantes comprenden dos o más mutaciones, y tienen una carga neta total de +5, +4, +3, +2, +1 o 0 con respecto a la subtilisina GG36 silvestre. Estas mutaciones se seleccionan de: a) dos o más de las siguientes mutaciones V4R, H17R, N18R, G20R, T22R, S24R, S24W, G25R, N43R, N43A, G46R, P52F, P52N, T57R, Q59A, N62Q, T71G, L75R, N76D, S78R, L82R, P86W, E89P, E89W, E89T, E89I, E89H, E89V, V104L, S106V, S106G, G115R, G1 18I, V121 F, S144R, N185I, D197F, Y209N, Y209S, L217E, A231 I, P239R, P239S, W241 R, S242R, S242L, N243R, V244R, N248I, H249R, N252R, T253R, E271T, E271V, E271 L, E271 H, E271 F, E271P, A1 R, S9A, S212F y N269R; y/o b) uno o más de los siguientes conjuntos de mutaciones T022R- S024R, S009A-E271 L, N018R-W241 R, N018R-G115R, N043R-H249R, G020R-H249R, V004R-H249R, G020R- S024R, N018R-H249R, S009A-G020R, G020R-W241R, S009A-S078R, G020R-G115R, N018R-S024R, S024R-S242R, T022R-G115R, N018R-N043R, G020R-N043R, N018R- S242R, S242R-N269R, N018R-V244R, S024R-N269R, G020R-E271L, S024R-E271L, V004R-S009A, G020R-N269R, A001R-S024R, V244R-E271L, S009A-N018R, W241R-E271L, V004R-S024R, S009A-H249R, S009A-T022R, S101 G-S1 OSA- VI 04I-G159D-A232V-Q245R-N248D-E271 F, S101 G-S103A- V104I-A158E-A232V-Q245R-N248D-E271 F, S101 G-S1 OSA- VI 04I-A158E-A232V-Q245R-N248D-H249R, S101 G-S1 OSA- VI 04I-G159D-A232V-Q245R-N248D-S24R, S101 G-S103A- V104L-G159D-A232V-Q236H-Q245R-N252K, S101G-S103A- V104L-A232V-Q236H-Q245R-N248D-N252K En un aspecto, las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 con alta resistencia iónica descritas anteriormente forman parte de una composición detergente diluida en agua, típicamente, en una lavadora, para formar un licor de lavado que tiene una conductividad de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3.5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o aun de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.
La carga de las variantes de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 se expresa con respecto a la proteasa GG36 silvestre de la subtílisina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:755. Los aminoácidos que imparten una sola carga negativa son D y E y los que imparten una sola carga positiva son R, H y K. Cualquier cambio de aminoácidos en función de la SEQ ID NO:755 que modifica una carga se usa para calcular la carga de la variante de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1. Por ejemplo, la introducción de una mutación de carga negativa a partir de una posición neutra silvestre añadirá una carga neta de -1 a la variante de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 mientras que la introducción de una mutación de carga negativa (D o E) a partir de un residuo aminoacídico positivo silvestre (R, H o K) añadirá una carga neta de -2. La suma de los cambios en la carga de todos los residuos aminoacídicos diferentes para la variante de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 en función de la proteasa silvestre GG36 de la subtilisina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:755 produce el cambio de carga de la variante de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se cree que: (a) el intervalo de carga preferido para las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 que se usarán en las soluciones detergentes para lavandería con baja conductividad es de - 5, -4, -3, -2, -1 , 0, particularmente, -2, -1 ; (b) el intervalo de carga preferido para las proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 que se usarán en las soluciones detergentes para lavandería con alta conductividad es +5, +4, +3, +2, +1 , 0, particularmente +2, +1. La selección correcta de la carga mejoró sorpresivamente los niveles del rendimiento de limpieza en agua fría.
Las soluciones con baja conductividad se definen como soluciones que tienen una conductividad de aproximadamente 0.1 mS/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente 0.3 mS/cm a aproximadamente 2.5 mS/cm o aun de aproximadamente 0.5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm.
Las soluciones con alta conductividad se definen como soluciones que tienen una conductividad de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3.5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o aun de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm.
Los ejemplos anteriores deben considerarse como ejemplos no limitantes. Una vez que las mutaciones se combinan para optimizar el rendimiento en agua fría, la carga de enzimas puede equilibrarse, además, por medio de mutaciones en otras posiciones.
Numeración de los aminoácidos de la proteasa. nomenclatura de las enzimas y definiciones adicionales La numeración de las posiciones de aminoácidos usada en esta patente es el sistema de numeración de subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens. Cada posición de aminoácidos de cada variante de proteasa que incluye cada variante de proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 se numera de conformidad con la numeración de la posición de aminoácidos correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens tal como se determina por medio de alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la variante de la proteasa con la secuencia de aminoácidos de la proteasa subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Un esquema de numeración alternativo es la numeración de la secuencia de aminoácidos especifica de la proteasa GG36 de la subtilisina de B. lentus que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:755. Ninguna de las posiciones de aminoácidos de las variantes de la proteasa que incluyen las variantes de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 descritas en la presente invención se numera con este esquema de numeración alternativo.
Para describir las variantes de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie 1 de la presente invención se usa la siguiente nomenclatura que facilita la referencia: aminoácido(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) sustituido(s).
Las mutaciones se nombran por medio del código de una letra para el aminoácido parental seguido del número de la posición formado por tres dígitos y, después, el código de una letra para la variante del aminoácido. Por ejemplo, la glicina mutante (G) en la posición 87 a la serina (S) se representa como "G087S" o "G87S". Las mutaciones múltiples se indican mediante la inserción de un "-" entre las mutaciones. Las mutaciones en las posiciones 87 y 90 se representan como "G087S-A090Y" o "G87S-A90Y" o "G87S + A90Y" o "G087S + A090Y". Para las deleciones se usa el código de una letra "Z". Para una inserción relativa a la secuencia parental, el código de una letra "Z" está en el lado izquierdo del número de la posición. Para una deleción, el código de una letra "Z" está en el lado derecho del número de la posición. Para las inserciones, el número de la posición es el número de la posición antes del o los aminoácido(s) insertado(s) más 0.01 para cada aminoácido. Por ejemplo, una inserción de los tres aminoácidos alanina (A), serina (S) y tirosina (Y) entre las posiciones 87 y 88 se muestra como "Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y." Asi, la combinación de todas las mutaciones anteriores más una deleción en la posición 100 es: "G087S- Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z." En todos los casos, se emplea la abreviatura aceptada de IUPAC para los aminoácidos, de una o tres letras. La letra única X se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos.
El término "silvestre" con respecto a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico indica que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico es una secuencia nativa o de origen natural. Como se usa en la presente descripción, el término "de origen natural" se refiere a cualquier elemento (p. ej., proteínas, aminoácidos o secuencias de ácido nucleico) encontrado en la naturaleza (es decir, no se manipuló por medio de métodos recombinantes). Como se usa en la presente descripción, la expresión "que no es de origen natural" se refiere a cualquier elemento que no se encuentra en la naturaleza (p. ej., ácidos nucleicos recombinantes producidos en el laboratorio).
Como se usan en la presente descripción con respecto a las posiciones de los residuos aminoacidicos, "que corresponde a", "corresponde a" o "corresponde" se refieren a un residuo de aminoácidos en la posición enumerada en una proteína o péptido o un residuo aminoacídico que es análogo, homólogo o equivalente a un residuo enumerado en una proteína o péptido. Como se usa en la presente descripción, "región correspondiente" se refiere, generalmente, a una posición análoga a lo largo de proteínas relacionadas o de una proteína de referencia.
Los términos "derivado de" y "obtenido de" se refieren a una proteasa producida o que se puede producir por medio de una cepa del organismo de interés, pero, además, a una proteasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esa cepa y producida en un organismo huésped que contiene esa secuencia de ADN. Además, el término se refiere a una proteasa que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que exhibe las características identificatorias de la proteasa de interés. Como ejemplo, "proteasas derivadas de Bacillus" se refiere a esas enzimas que tienen actividad proteolítica producidas en forma natural por Bacillus, y también a las proteasas serina, tales como las producidas por fuentes de Bacillus, pero que, si se usan técnicas de ingeniería genética, se producen por medio de organismos que no son de Bacillus transformados con un ácido nucleico que codifica las proteasas serina.
El término "idéntico", en el contexto de dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos, se refiere a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para obtener la correspondencia máxima, según se mide con uno de los siguientes algoritmos de análisis o comparación de secuencias.
Como se usa en la presente descripción, "genes homólogos" se refiere a un par de genes de especies diferentes pero, usualmente, relacionados que se corresponden entre sí y que son idénticos o muy similares entre si. El término abarca genes separados por especiación (es decir, el desarrollo de especies nuevas) (p. ej., genes ortólogos), además de genes que se separaron por duplicación genética (p. ej., genes parálogos).
El término forma "madura" de una proteina, polipéptido o péptido se refiere a la forma funcional de la proteina, polipéptido o péptido sin la secuencia del péptido señal y sin la secuencia del propéptido.
Como se usa en la presente descripción, "homología" se refiere a la similitud o identidad de secuencia, si bien se prefiere el significado de identidad. La homología se puede determinar con las técnicas estándar conocidas en la industria {ver, p. ej., Smith y Waterman, Adv. núm. Math. 2:482
[1981]; Needleman y Wunsch, J. Peso Biol. 48:443 [1970?; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 85:2444
[1988]; programas de software tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl) y Devereux y col., Nucí. Acid Res. 12:387-395
[1984]). Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas con alineamientos progresivos en pares. Además, se puede graficar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (ver, Feng y Doolittle, J. Peso Evol. 35.351-360
[1987]). El método es similar al descrito por Higgins y Sharp (ver, Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153
[1989]). Los parámetros de PILEUP útiles incluyen un peso de interrupción predeterminado de 3.00, un peso de longitud de interrupción predeterminado de 0.10 e interrupciones de extremo ponderadas. Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST descrito por AltschuI y col. (ver, AltschuI y col., J. Peso Biol. 215:403-410
[1990]; y Karlin y AltschuI, Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90:5873-5787
[1993]). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (ver, AltschuI y col., Meth. Enzymol. 266:460-480
[1996]). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los valores siguientes: intervalo de solapamiento =1 , fracción de solapamiento = 0.125, umbral de palabras (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y es el programa el que los establece en función de la composición de la secuencia especifica y la composición de la base de datos específica en función de la cual se busca la secuencia de interés. Sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.
Un experimentado en la industria puede determinar fácilmente el porcentaje de identidad de secuencias entre una secuencia de referencia y una secuencia de prueba de interés. El porcentaje de identidad compartido por las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos se determina por comparación directa de la información de secuencias entre las moléculas mediante el alineamiento de las secuencias y la determinación de la identidad por métodos conocidos en la industria. Un ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST (ver AltschuI y col., J. Peso Biol., 215:403-410
[1990]). El programa para realizar los análisis de BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information). Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias de puntaje alto (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda que se correlaciona o satisface algún puntaje T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. Estos aciertos de palabras próximas iniciales actúan como puntos de partida para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se expanden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan, siempre que el puntaje de alineamiento acumulado se pueda incrementar. La extensión de los aciertos de palabras se detiene cuando el puntaje de alineamiento acumulado disminuye en la cantidad X desde un valor máximo obtenido; el puntaje acumulado se reduce a cero o un valor menor o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 1 1 , los alineamientos (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, Henikoff y Henikoff, Proa Nati. Acad. Sci. EE. UU. 89: 10915
[1992]) de 50, una expectativa (E) de 10, M'5, N'-4 y una comparación de ambas cadenas.
Después, el algoritmo de BLAST analiza estadísticamente la similitud entre dos secuencias (ver, p. ej., Karlin y Altschul, supra). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma más baja (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría, en forma casual, una correlación entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a un ácido nucleico de una proteasa serina de la presente invención si la probabilidad de suma más baja en una comparación del ácido nucleico de prueba con un ácido nucleico de la proteasa serina es menor que aproximadamente 0.1 , con mayor preferencia, menor que aproximadamente 0.01 y, con la máxima preferencia, menor que aproximadamente 0.001. Se considera que si el ácido nucleico de prueba codifica un polipéptido de proteasa serina, este es similar a un ácido nucleico de proteasa serina especifico siempre que la comparación produzca una probabilidad de suma más baja menor que aproximadamente 0.5 y, con mayor preferencia, menor que aproximadamente 0.2.
Porcentaje "idéntico" o "de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especifico de residuos de ácido nucleico o residuos aminoacidicos, respectivamente, que son iguales cuando se comparan y alinean para detectar la similitud máxima, tal como se determina con el algoritmo de comparación de secuencias o por análisis visual. "Porcentaje de identidad de secuencia" o "% de identidad" o "% de identidad de secuencia o "% de identidad de secuencias de aminoácidos" de una secuencia de aminoácidos de interés con una secuencia de aminoácidos de referencia (es decir, de búsqueda) significan que la secuencia de aminoácidos de interés es idéntica (es decir, sobre la base de cada aminoácido) en un porcentaje específico a la secuencia de aminoácidos de la búsqueda en una longitud de comparación cuando las secuencias están alineadas de manera óptima. Así, una identidad de secuencia de aminoácidos de 80 % o una identidad de 80 % con respecto a dos secuencias de aminoácidos significa que 80 % de los residuos aminoacídicos en dos secuencias de aminoácidos alineadas en forma óptima son idénticos.
"Porcentaje de identidad de secuencia" o "% de identidad" o "% de identidad de secuencia" o "% de identidad de secuencias de nucleótidos" de una secuencia de ácidos nucleicos de interés con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia (es decir, de búsqueda) significan que la secuencia de ácidos nucleicos de interés es idéntica (es decir, sobre la base de cada nucleótido para una secuencia de polinucleótidos) en un porcentaje específico a la secuencia de la búsqueda en una longitud de comparación cuando las secuencias están alineadas de manera óptima. Así, una identidad de secuencia de nucleótidos de 80 % o una identidad de 80 % con respecto a dos secuencias de ácido nucleico significa que 80 % de los residuos de nucleótidos en dos secuencias de ácido nucleico alineadas en forma óptima son idénticos.
En algunas modalidades, el porcentaje de identidad de secuencia o "% de identidad de secuencia" o "% de identidad" de una secuencia de interés con una secuencia de búsqueda puede calcularse mediante el alineamiento óptimo de las dos secuencias y la comparación de las dos secuencias alineadas en forma óptima en la longitud de comparación. Se determina el número de posiciones en el alineamiento óptimo en el cual se producen residuos idénticos en ambas secuencias y, de ese modo, se provee el número de posiciones coincidentes y, después, el número de posiciones coincidentes se divide por el número total de posiciones de la longitud de comparación (que, a menos que se especifique de cualquier otra forma, es la longitud de la secuencia de búsqueda). El número resultante se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia de interés con la secuencia de búsqueda.
"Alineamiento óptimo" o "alineado en forma óptima" se refieren al alineamiento de dos (o más) secuencias que genera el puntaje de porcentaje de identidad más alto. Por ejemplo, el alineamiento óptimo de dos secuencias proteicas puede obtenerse si se alinean manualmente las secuencias de manera que el número máximo de residuos aminoacidicos idénticos en cada secuencia se alineen juntos o por medio de programas de software o procedimientos descritos en la presente descripción o conocidos en la industria. El alineamiento óptimo de dos secuencias de ácido nucleico puede obtenerse si se alinean manualmente las secuencias de manera que el número máximo de residuos de nucleótidos idénticos en cada secuencia se alineen juntos o por medio de programas de software o procedimientos descritos en la presente descripción o conocidos en la industria.
En algunas modalidades se considera que dos secuencias de polipéptidos están "alineadas de manera óptima" cuando se alinean con parámetros definidos, tales como una matriz de sustitución de aminoácidos, una penalización por existencia de interrupción (denominada, además, penalización abierta de interrupción) y penalización por extensión de interrupción definidos para obtener el puntaje de similitud máximo posible para ese par de secuencias. La matriz de puntuación BLOSUM62 {ver, Henikoff y Henikoff, supra) se usa, frecuentemente, como una matriz de sustitución de puntuación predeterminada en algoritmos de alineamiento de secuencias de polipéptidos (p. ej., BLASTP). La penalización por existencia de interrupción se impone por la introducción de una sola interrupción de aminoácidos en una de las secuencias alineadas y la penalización por extensión de interrupción se impone para cada posición de residuo en la interrupción. Los parámetros de alineamiento ilustrativos usados son: matriz de puntuación BLOSUM62, penalización por existencia de interrupción=11 y penalización por extensión de interrupción=1. La puntuación de alineamiento se define por medio de las posiciones de aminoácidos de cada secuencia en la cual comienza y termina el alineamiento (p. ej., la ventana de alineamiento) y, opcionalmente, por medio de la inserción de una interrupción o múltiples interrupciones en una o ambas secuencias para obtener el puntaje de similitud más alto posible.
El alineamiento óptimo entre dos o más secuencias se puede determinar en forma manual por inspección visual o por medio de una computadora, tal como, pero sin limitarse a, por ejemplo, el programa BLASTP para secuencias de aminoácidos y el programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico {ver, p. ej., Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997); ver además, el sitio en internet del Centro Nacional para la Información Biotecnología (NCBI)).
Agentes tonalizadores de telas apropiados Los abrillantadores ópticos fluorescentes emiten por lo menos algo de luz visible. En contraste, los agentes de tinte para las telas pueden alterar la tintura de una superficie al absorber por lo menos una porción del espectro de luz visible. Los agentes tonalizadores de telas apropiados incluyen colorantes, conjugados de colorante y arcilla, y pigmentos que cumplen con los requisitos del Método de prueba 1 incluido en la sección Método de prueba de la presente especificación. Los colorantes adecuados incluyen colorantes de moléculas pequeñas y colorantes poliméricos. Los colorantes de moléculas pequeñas adecuados incluyen colorantes de moléculas pequeñas seleccionados del grupo que consiste de colorantes que caen en las clasificaciones del índice de color (C.I., por sus siglas en inglés) de azul directo, rojo directo, violeta directo, azul ácido, rojo ácido, violeta ácido, azul básico, violeta básico y rojo básico, o mezclas de estos, por ejemplo: (1) Colorantes trisazo azul directo de la fórmula en donde al menos dos de los anillos de naftilo A, B y C están sustituidos con un grupo sulfonato; el anillo C puede estar sustituido en la posición 5 NH2 con un grupo o NHPh, X es un anillo de bencilo o naftilo sustituido con hasta 2 grupos sulfonato y puede estar sustituido en la posición 2 con un grupo OH y también puede sustituirse con NH2 un grupo o NHPh. (2) Colorantes bis-azo violeta directo de la fórmula: en donde Z es H o fenilo; el anillo A está, preferentemente, sustituido con un grupo metilo y metoxi en las posiciones indicadas por las flechas, el anillo A también puede ser un anillo de naftilo, el grupo Y es un anillo de bencilo o naftilo, que está sustituido con un grupo sulfato y puede estar mono o disustituido con grupos metilo. (3) Colorantes azul o rojo ácido de la fórmula en donde por lo menos una de X y Y debe ser un grupo aromático. En un aspecto, los dos grupos aromáticos pueden ser un grupo bencilo o naftilo sustituido, que puede estar sustituido con grupos no solubles en agua, tales como grupos alquilo, alquiloxi o ariloxi, X y Y pueden no estar sustituidos con grupos solubles en agua tales como sulfonatos o carboxilatos. En otro aspecto, X es un grupo bencilo nitro sustituido e Y es un grupo bencilo (4) Colorantes ácidos rojos de la estructura en donde B es un grupo naftilo o bencilo que puede estar sustituido con grupos no solubles en agua, tales como grupos alquilo, alquiloxi o ariloxi, B puede no estar sustituido con grupos solubles en agua tales como sulfonatos o carboxilatos. (5) Colorantes disazo de la estructura en donde X y Y, independientemente uno del otro, son cada uno hidrógeno, alquilo de C1-C4 o alcoxi de C C4, Ra es hidrógeno o arilo, Z es alquilo de CrC4; alcoxi de Ci-C4¡ halógeno; hidroxilo o carboxilo, n es 1 o 2 y m es 0, 1 o 2, así como las sales correspondientes de estos y mezclas de estos. (6) Colorantes de trifenilmetano de las siguientes estructuras y mezclas de estos.
En otro aspecto, los tintes de moléculas pequeñas adecuados incluyen tintes de moléculas pequeñas seleccionados del grupo que consiste en los números del índice de color (Society of Dyers and Colourists, Bradford, Reino Unido) de 1 ,4-naftalenodiona, 1-[2-[2-[4-[[4-(acetiloxi)butil]etilamino]-2-metilfenil]diazenil]-5-nitro-3-tienil]-etanona, ácido 1-hidroxi-2-(1-naftalenilazo)-naftalendisulfónico, ión(2-), ácido 1-hidroxi-2-[[4-(fenilazo)fenil]azo]-naftalendisulfónico, ión(2-), ácido 2-[(1E)-[4-[bis(3-metoxi-3-oxopropil)amino]-2- metilfenil]azo]-5-nitro-3-tiofencarboxílico, éster etílico, 2-[[4-[(2-cianoetil)etilamino]fenil]azo]-5-(fenilazo)-3-tiofencarbonitrilo, 2-[2-[4-[(2-cianoetil)etilamino]fenil]diazenil]-5-[2-(4-nitrofenil)diazenil]-3-t¡ofencarbon ácido 2-hidroxi-1-(1-naftalenilazo)-naftalendisulfónico, ión(2-), ácido 2-hidroxi-1-[[4-(fenilazo)fenil]azo]-naftalendisulfónico, ión(2-), 4,4'-[[4-(dimetilamino)-2,5-ciclohexadien-1-iliden]metilen]bis[N,N-dimet¡l-bencenamina, ácido 6-hidroxi-5-[(4-metoxifenil)azo]-2-naftalensulfónico, sal monosódica, ácido 6-hidroxi-5-[(4-metilfenil)azo]-2-naftalensulfónico, sal monosódica, ácido 7-hidrox¡-8-[[4-(fenilazo)fenil]azo]-1 ,3-naftalendisulfónico, ión(2-), ácido 7-hidroxi-8-[2-(1-naftalenil)diazenil]-1 ,3-naftalendisulfónico, ión(2-), ácido 8-hidroxi-7-[2-(1-naftalenil)diazen¡l]-1,3-naftalend¡sulfónico, ¡ón(2-), ácido 8-hidrox¡-7-[2-[4-(2-fenildiazenil)fenil]diazenil]-1 ,3-naftalendisulf0nico, ión(2-), negro ácido 1 , negro ácido 24, azul ácido 113, azul ácido 15, azul ácido 17, azul ácido 25, azul ácido 29, azul ácido 3, azul ácido 40, azul ácido 45, azul ácido 62, azul ácido 7, azul ácido 75, azul ácido 80, azul ácido 83, azul ácido 9, azul ácido 90, verde ácido 27, naranja ácido 12, naranja ácido 7, rojo ácido 14, rojo ácido 150, rojo ácido 151, rojo ácido 17, rojo ácido 18, rojo ácido 266, rojo ácido 27, rojo ácido 4, rojo ácido 51, rojo ácido 52, rojo ácido 73, rojo ácido 87, rojo ácido 88, rojo ácido 92, rojo ácido 94, rojo ácido 97, violeta ácido 15, violeta ácido 17, violeta ácido 24, violeta ácido 43, violeta ácido 49, azul básico 159, azul básico 16, azul básico 22, azul básico 3, azul básico 47, azul básico 66, azul básico 75, azul básico 9, violeta básico 1 , violeta básico 2, violeta básico 3, violeta básico 4, violeta básico 10, violeta básico 35, C.l. negro ácido 1 , C.l. azul ácido 10, C.l. azul ácido 113, C.l. azul ácido 25, C.l. azul ácido 29, C.l. azul ácido 290 C.l. rojo ácido 103, C.l. rojo ácido 150, C.l. rojo ácido 52, C.l. rojo ácido 73, C.l. rojo ácido 88, C.l. rojo ácido 91 , C.l. violeta ácido 17, C.l. violeta ácido 43, C.l. azul directo 1 , C.l. azul directo 120, C.l. azul directo 34, C.l. azul directo 70, C.l. azul directo 71 , C.l. azul directo 72, C.l. azul directo 82, C.l. violeta directo 51 , C.l. azul disperso 10, C.l. azul disperso 100, C.l. azul disperso 101 , C.l. azul disperso 102, C.l. azul disperso 106:1 , C.l. azul disperso 11 , C.l. azul disperso 12, C.l. azul disperso 121 , C.l. azul disperso 122, C.l. azul disperso 124, C.l. azul disperso 125. C.l. azul disperso 128, C.l. azul disperso 130, C.l. azul disperso 133, C.l. azul disperso 137, C.l. azul disperso 138, C.l. azul disperso 139, C.l. azul disperso 142, C.l. azul disperso 146, C.l. azul disperso 148, C.l. azul disperso 149, C.l. azul disperso 165, C.l. azul disperso 165:1, C.l. azul disperso 165:2, C.l. azul disperso 165:3, C.l. azul disperso 171 , C.l. azul disperso 173, C.l. azul disperso 174, C.l. azul disperso 175, C.l. azul disperso 177, C.l. azul disperso 183, C.l. azul disperso 187, C.l. azul disperso 189, C.l. azul disperso 193, C.l. azul disperso 194, C.l. azul disperso 200, C.l. azul disperso 201 , C.l. azul disperso 202, C.l. azul disperso 205, C.l. azul disperso 206, C.l. azul disperso 207, C.l. azul disperso 209, C.l. azul disperso 21 , C.l. azul disperso 210, C.l. azul disperso 211 , C.l. azul disperso 212, C.l. azul disperso 219, C.l. Azul disperso 220, C.l. azul disperso 222, C.l. azul disperso 224, C.l. azul disperso 225, C.l. azul disperso 248, C.l. azul disperso 252, C.l. azul disperso 253, C.l. azul disperso 254, C.l. azul disperso 255, C.l. azul disperso 256, C.l. azul disperso 257, C.l. azul disperso 258, C.l. azul disperso 259, C.l. azul disperso 260, C.l. azul disperso 264, C.l. azul disperso 265, C.l. azul disperso 266, C.l. azul disperso 267, C.l. azul disperso 268, C.l. azul disperso 269, C.l. azul disperso 270, C.l. azul disperso 278, C.l. azul disperso 279, C.l. azul disperso 281 , C.l. azul disperso 283, C.l. azul disperso 284, C.l. azul disperso 285, C.l. azul disperso 286, C.l. azul disperso 287, C.l. azul disperso 290, C.l. azul disperso 291 , C.l. azul disperso 294, C.l. azul disperso 295, C.l. azul disperso 30, C.l. azul disperso 301 , C.l. azul disperso 303, C.l. azul disperso 304, C.l. azul disperso 305, C.l. azul disperso 313, C.l. azul disperso 315, C.l. azul disperso 316, C.l. azul disperso 317, C.l. azul disperso 321, C.l. azul disperso 322, C.l. azul disperso 324, C.l. azul disperso 328, C.l. azul disperso 33, C.l. azul disperso 330, C.l. azul disperso 333, C.l. azul disperso 335, C.l. azul disperso 336, C.l. azul disperso 337, C.l. azul disperso 338, C.l. azul disperso 339, C.l. azul disperso 340, C.l. azul disperso 341 , C.l. azul disperso 342, C.l. azul disperso 343, C.l. azul disperso 344, C.l. azul disperso 345, C.l. azul disperso 346, C.l. azul disperso 351 , C.l. azul disperso 352, C.l. azul disperso 353, C.l. azul disperso 355, C.l. azul disperso 356, C.l. azul disperso 357C.I. azul disperso 358, C.l. azul disperso 36, C.l. azul disperso 360, C.l. azul disperso 366, C.l. azul disperso 368, C.l. azul disperso 369, C.l. azul disperso 371 , C.l. azul disperso 373, C.l. azul disperso 374, C.l. azul disperso 375, C.l. azul disperso 376, C.l. azul disperso 378, C.l. azul disperso 38, C.l. azul disperso 42, C.l. azul disperso 43, C.l. azul disperso 44, C.l. azul disperso 47, C.l. azul disperso 79, C.l. azul disperso 79:1, C.l. azul disperso 79:2, C.l. azul disperso 79:3, C.l. azul disperso 82, C.l. azul disperso 85, C.l. azul disperso 88, C.l. azul disperso 90, C.l. azul disperso 94, C.l. azul disperso 96, C.l. violeta disperso 10, C.l. violeta disperso 100, C.l. violeta disperso 102, C.l. violeta disperso 103, C.l. violeta disperso 104, C.l. violeta disperso 106, C.l. violeta disperso 107, C.l. violeta disperso 12, C.l. violeta disperso 13, C.l. violeta disperso 16, C.l. violeta disperso 2, C.l. violeta disperso 24, C.l. violeta disperso 25, C.l. violeta disperso 3, C.l. violeta disperso 33, C.l. violeta disperso 39, C.l. violeta disperso 42, C.l. violeta disperso 43, C.l. violeta disperso 45, C.l. violeta disperso 48, C.l. violeta disperso 49, C.l. violeta disperso 5, C.l. violeta disperso 50, C.l. violeta disperso 53, C.l. violeta disperso 54, C.l. violeta disperso 55, C.l. violeta disperso 58, C.l. violeta disperso 6, C.l. violeta disperso 60, C.l. violeta disperso 63, C.l. violeta disperso 66, C.l. violeta disperso 69, C.l. violeta disperso 7, C.l. violeta disperso 75, C.l. violeta disperso 76, C.l. violeta disperso 77, C.l. violeta disperso 82, C.l. violeta disperso 86, C.l. violeta disperso 88, C.l. violeta disperso 9, C.l. violeta disperso 91, C.l. violeta disperso 92, C.l. violeta disperso 93, C.l. violeta disperso 93:1 , C.l. violeta disperso 94, C.l. violeta disperso 95, C.l. violeta disperso 96, C.l. violeta disperso 97, C.l. violeta disperso 98, C.l. violeta disperso 99, C.l. negro reactivo 5, C.l. azul reactivo 19, C.l. azul reactivo 4, C.l. rojo reactivo 2, C. I. azul solvente 43, C.l. azul solvente 43, C.l. rojo solvente 14, C.l. negro ácido 24, C.l. azul ácido 113, C.l. azul ácido 29, C.l. violeta directo 7, C.l. eritrosina, violeta dianix CC, azul directo 1 , azul directo 71 , azul directo 75, azul directo 78, azul directo 80, azul directo 279, violeta directo 11 , violeta directo 31 , violeta directo 35, violeta directo 48, violeta directo 5, violeta directo 51 , violeta directo 66, violeta directo 9, azul disperso 106, azul disperso 148, azul disperso 165, azul disperso 3, azul disperso 354, azul disperso 364, azul disperso 367, azul disperso 56, azul disperso 77, azul disperso 79, azul disperso 79:1, rojo disperso 1 , rojo disperso 15, violeta disperso 26, violeta disperso 27, violeta disperso 28, violeta disperso 63, violeta disperso 77, eosina Y, etanol, 2,2'-[[4-[(3,5-dinitro-2-tienil)azo]fenil]imino]bis-, diacetato (éster), Lumogen F azul 650, Lumogen F violeta 570, N-[2-[2-(3-acetil-5-nitro-2-tienil)diazenil]-5-(dietilamino)fenil]-acetamida, N-[2-[2-(4-cloro-3-ciano-5-formil-2-tienil)diazenil]-5-(dietilamino)fenil]-acetamida, N-[5-[bis(2-metoxietil)amino]-2-[2-(5-nitro-2,1-benzisotiazol-3-il)diazenil]fenil]-acetam N-[5-[bis[2-(acetiloxi)et¡l]am¡no]-2-[(2-brom naftalimida, derivados, negro de petróleo 860, floxina B, pirazol, rosa de Bengala, 6-hidroxi-5-(4-isopropilfenilazo)-2-naftalensulfonato de sodio, negro solvente 3, azul solvente 14, azul solvente 35, azul solvente 58, azul solvente 59, rojo solvente 24, violeta solvente 13, violeta solvente 8, rojo Sudán 380, trifenilmetano y derivados de trifenilmetano o mezclas de estos.
Tintes poliméricos adecuados incluyen tintes poliméricos seleccionados del grupo que consiste de polímeros que contienen cromógenos conjugados (conjugados tinte-polímero), y polímeros con cromógenos copolimerizados dentro de la cadena principal del polímero, y mezclas de estos.
En otro aspecto, los colorantes poliméricos adecuados incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste en colorantes sustantivos para las telas comercializados con el nombre Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, EE. UU.), conjugados de colorante y polímero formados a partir de al menos un colorante reactivo y un polímero seleccionado del grupo que consiste de polímeros que comprenden una entidad seleccionada del grupo que consiste de una entidad hidroxilo, una entidad amina primaria, una entidad amina secundaria, una entidad tiol y mezclas de estas. En aun otro aspecto, los tintes poliméricos adecuados incluyen tintes poliméricos seleccionados del grupo que consiste en Liquitint® (Milliken, Spartanburg, Carolina del Sur, EE. UU.) violeta CT, carboximetilcelulosa (CMC) conjugada con un tinte azul reactivo, violeta reactivo o rojo reactivo, tal como CMC conjugada con C.l. El Azul reactivo 19, vendido por Megazyme, Wicklow, Irlanda, bajo el nombre de producto AZO-CM-CELLULOSE, código del producto S-ACMC, colorantes poliméricos de trifenil-metano alcoxilado, colorantes poliméricos de tiofeno alcoxilado, y mezclas de estos.
Los conjugados de colorante y arcilla adecuados incluyen aquellos seleccionados del grupo que comprende al menos un colorante catiónico/básico y una arcilla de esmectita, y mezclas de estos. En otro aspecto, los conjugados de arcilla de tinte incluyen arcillas de tinte seleccionadas del grupo que consiste en uno de los tintes catiónicos/básicos seleccionados del grupo que consiste en C.l. amarillo básico 1 a 108, C.l. naranja básico 1 a 69, C.l. rojo básico 1 a 118, C.l. violeta básico 1 a 51 , C.l. azul básico 1 a 164, C.l. verde básico 1 a 14, C.l. marrón básico 1 a 23, Cl negro básico 1 a 11 , y una arcilla seleccionada del grupo que consiste en arcilla montmorillonita, arcilla hectorita, arcilla saponita y mezclas de estos. En otro aspecto, los conjugados de arcilla y tinte incluyen conjugados de arcilla y tinte seleccionados del grupo que consiste en: conjugado azul básico de montmorillonita B7 C.l. 42595, conjugado azul básico de montmorillonita B9 C.l. 52015, conjugado violeta básico de montmorillonita V3 C.l. 42555, conjugado verde básico de montmorillonita G1 C.l. 42040, conjugado rojo básico de montmorillonita R1 C.l. 45160, conjugado negro básico de montmorillonita C.l. 2, conjugado azul básico de hectorita B7 C.l. 42595, conjugado azul básico de hectorita B9 C.l. 52015, conjugado violeta básico de hectorita V3 C.l. 42555, conjugado verde básico de hectorita G1 C.l. 42040, conjugado rojo básico de hectorita R1 C.l. 45160, conjugado negro básico de hectorita C.l. 2, conjugado azul básico de saponita B7 C.l. 42595, conjugado azul básico de saponita B9 C.l. 52015, conjugado violeta básico de saponita V3 C.l. 42555, conjugado verde básico de saponita G1 C.l. 42040, conjugado rojo básico de saponita R1 C.l. 45160, conjugado negro básico de saponita C.l. 2 y mezclas de estos.
Los pigmentos adecuados incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de flavantrona, indantrona, indantrona clorada que contiene de 1 a 4 átomos de cloro, pirantrona, dicloropirantrona, monobromodicloropirantrona, dibromodicloropirantrona, tetrabromopirantrona, diimida de ácido perileno-3,4,9,10-tetracarboxilico, en donde los grupos ¡mida pueden no estar sustituidos o sustituirse con alquilo de C1-C3 o con un radical fenilo o heterocíclico, y en donde los radicales fenilo y heterociclico adicionalmente pueden contener sustituyentes que no confieren solubilidad en agua, amidas de ácido antrapirimidinacarboxilico, violantrona, isoviolantrona, pigmentos de dioxazina, ftalocianina de cobre que puede contener hasta 2 átomos de cloro por molécula, policloro ftalocianina de cobre o polibromocloro ftalocianina de cobre que contiene hasta 14 átomos de bromo por molécula y mezclas de estos. En otro aspecto, los pigmentos adecuados incluyen pigmentos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en Azul ultramar (C.l. pigmento azul 29), violeta ultramar (C.l. pigmento violeta 15) y mezclas de estos.
Los agentes de tinte para telas anteriormente mencionados pueden usarse combinados (se puede usar cualquier mezcla de agentes de tinte para telas). Los agentes de tinte para telas adecuados pueden comprarse de Aldrich, Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.¡ Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suiza; BASF, Ludwigshafen, Alemania; Dayglo Color Corporation, Mumbai, India; Organic Dyestuffs Corp., East Providence, Rhode Island, EE. UU.; Dystar, Frankfurt, Alemania; Lanxess, Leverkusen, Alemania; Megazyme, Wicklow, Irlanda, Clariant, Muttenz, Suiza; Avecia, Manchester, Gran Bretaña y/o elaborarse de conformidad con los ejemplos contenidos en la presente invención.
Los agentes tonalizadores adecuados se describen con mayor detalle en la patente de los EE. UU. núm. 7,208,459 B2.
Encapsulados En un aspecto, un encapsulado comprende un núcleo, una lámina que tiene una superficie interior y una superficie exterior; esa lámina encapsula a ese núcleo.
En un aspecto de ese encapsulado, ese núcleo puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en perfumes; abrillantadores; tintes; repelentes de insectos; siliconas; ceras; saborizantes, vitaminas, agentes suavizantes de telas; agentes para el cuidado de la piel en un aspecto, parafinas; enzimas; agentes antibacterianos; blanqueadores; agentes percibidos por los sentidos; y mezclas de estos; y esa lámina puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en polietilenos; poliamidas; poliestirenos; poliisoprenos; policarbonatos; poliésteres; poliacrilatos; aminoplastos, en un aspecto ese aminoplasto puede comprender poliureas, poliuretano y/o poliureauretano; en un aspecto esa poliurea puede comprender polioximetilenurea y/o melamina formaldehido; poliolefinas; polisacáridos, en un aspecto ese polisacárido puede comprender alginato y/o quitosana; gelatina; goma laca; resinas epoxi; polímeros de vinilo; materiales inorgánicos insolubles en agua; silicona; y mezclas de estos.
En un aspecto de ese encapsulado, ese núcleo puede comprender perfume.
En un aspecto de ese encapsulado, esa lámina puede comprender melamina formaldehido y/o melamina formaldehido reticulada.
En un aspecto se describen encapsulados adecuados que pueden comprender un material de núcleo y una lámina, esa lámina rodea, al menos parcialmente, a ese material de núcleo. Al menos 75 %, 85 % o aun 90 % de esos encapsulados pueden tener una resistencia a la fractura de aproximadamente 0.2 MPa a aproximadamente 10 MPá, de aproximadamente 0.4 MPa a aproximadamente 5 MPa, de aproximadamente 0.6 MPa a aproximadamente 3.5 MPa o aun de aproximadamente 0.7 MPa a aproximadamente 3 MPa; y una fuga de agente benéfico de 0 % a aproximadamente 30 %, de 0 % a aproximadamente 20 % o aun de 0 % a aproximadamente 5 %.
En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o aun 90 % de esos encapsulados puede tener un tamaño de partícula de aproximadamente 1 miera a aproximadamente 80 mieras, de aproximadamente 5 mieras a 60 mieras, de aproximadamente 10 mieras a aproximadamente 50 mieras o aun de aproximadamente 15 mieras a aproximadamente 40 mieras.
En un aspecto, al menos 75 %, 85 % o aun 90 % de esos encapsulados puede tener un grosor de pared de la partícula de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 180 nm o aun de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 160 nm.
En un aspecto, el material de núcleo de esos encapsulados puede comprender un material seleccionado del grupo que consiste en una materia prima de perfume y/u, opcionalmente, un material seleccionado del grupo que consiste en aceites vegetales que incluyen aceites vegetales puros y/o mezclados, entre ellos, aceite de ricino, aceite de nuez de coco, aceite de semilla de algodón, aceite de uva, semilla de colza, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de palma, aceite de linaza, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de nuez de coco, aceite de palmiste, aceite de ricino, aceite de limón y mezclas de estos; ésteres de aceites vegetales, ésteres que incluyen adipato de dibutilo, ftalato de dibutilo, adipato de butilbencilo, adipato de benciloctilo, fosfato de tricresilo, fosfato de trioctilo y mezclas de estos; hidrocarburos de cadena recta o ramificada que incluyen los hidrocarburos de cadena recta o ramificada que tienen un punto de ebullición mayor que aproximadamente 80 °C; terfenilos parcialmente hidrogenados, ftalatos de dialquilo, alquil bifenilos que incluyen monoisopropilbifenilo, naftaleno alquilado que incluye dipropilnaftaleno, alcoholes de petróleo que incluyen keroseno, aceite mineral y mezclas de estos; solventes aromáticos que incluyen benceno, tolueno y mezclas de estos; aceites de silicona y mezclas de estos.
En un aspecto, el material de pared de esos encapsulados puede comprender una resina adecuada que incluye el producto de reacción de un aldehido y una amina; los aldehidos adecuados incluyen formaldehído. Las aminas apropiadas incluyen melamina, úrea, benzoguanamina, glicoluril, y mezclas de estos. Las melaminas apropiadas incluyen melamina de metilol, melamina de metilol metilado, melamina ¡mino y mezclas de estos. Las ureas adecuadas incluyen urea dimetilol, urea de dimetilol metilado, urea-resorcinol, y mezclas de estos.
En un aspecto' pueden usarse depuradores de formaldehído adecuados con los encapsulados, por ejemplo, en una lechada en cápsula y/o añadidos a un producto para el cuidado de las telas y el hogar antes, durante o después de añadir los encapsulados en ese producto para el cuidado de las telas y el hogar.
Las cápsulas adecuadas pueden elaborarse según las enseñanzas contenidas en la patentes de los EE. UU. núms. 2008/0305982 A1 y/o 2009/0247449 A1. Alternativamente, las cápsulas adecuadas pueden adquirirse de Appleton Papers Inc. de Appleton, Wisconsin EE. UU.
Además, los materiales para preparar los encapsulados mencionados anteriormente pueden obtenerse de Solutia Inc. (St Louis, Missouri, EE. UU.), Cytec Industries (West Paterson, New Jersey, EE. UU.), sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE. UU.), CP Kelco Corp. de San Diego, California, EE. UU.; BASF AG de Ludwigshafen, Alemania; Rhodia Corp. de Cranbury, New Jersey, EE. UU.; Hercules Corp. de Wilmington, Delaware, EE.
UU.; Agrium Inc. de Calgary, Alberta, Canadá, ISP de New Jersey, EE. UU., Akzo Nobel de Chicago, IL, EE. UU.; Stroever Shellac Bremen de Bremen, Alemania; Dow Chemical Company de Midland, MI, EE. UU.; Bayer AG de Leverkusen, Alemania; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, EE. UU.
Polímero anfifílico limpiador Preferentemente, el polímero anfifílico limpiador es un compuesto que tiene la siguiente estructura general: b¡s((C2H50)(C2H40)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-bis((C2H50)(C2H40)n), en donde n = de 20 a 30 y x = de 3 a 8, o variantes sulfatadas o sulfonadas de este.
Los polímeros anfifilicos alcoxilados limpiadores de grasa de la presente invención se refieren a cualquier polímero alcoxilado que tiene propiedades hidrófilas e hidrófobas equilibradas de manera tal que eliminen partículas de grasa de las telas y superficies. Las modalidades específicas de los polímeros anfifilicos alcoxilados limpiadores de grasa de la presente invención comprenden una estructura de núcleo y una pluralidad de grupos alcoxilados unidos a esa estructura de núcleo.
La estructura de núcleo puede comprender una estructura de polialquilenimina que comprende, en forma condensada, unidades de repetición de las fórmulas (I), (II); (III) y (IV): O (II) (III) (IV) en donde # indica, en cada caso, la mitad de un enlace entre un átomo de nitrógeno y la posición libre de unión de un grupo A1 de dos unidades de repetición adyacentes de las fórmulas (I), (II), (III) o (IV); * indica, en cada caso, la mitad de un enlace a uno de los grupos alcoxilato; y A1 se selecciona independientemente de un alquileno de C2-C6 lineal o ramificado; en donde la estructura de polialquilenimina consiste de 1 unidad de repetición de la fórmula (I), x unidades de repetición de la fórmula (II), y unidades de repetición de la fórmula (III) y y+1 unidades de repetición de la fórmula (IV), en donde x y y tienen, en cada caso, un valor en el intervalo de 0 a aproximadamente 150; en donde el peso molecular promedio ponderado, Mw, de la estructura de núcleo de polialquilenimina es un valor en el intervalo de aproximadamente 60 a aproximadamente 10,000 g/mol.
La estructura de núcleo puede comprender, alternativamente, una estructura de polialcanolamina de los productos de condensación de por lo menos un compuesto seleccionado de N-(hidroxialquil)aminas de las fórmulas (l.a) y/o (l.b), en donde A se selecciona independientemente de alquileno de C1-C6; R1, R1*, R2, R2*, R3, R3*, R4, R4*, R5 y R5* se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo, en donde los tres últimos radicales mencionados pueden estar opcionalmente sustituidos; y R6 se selecciona de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo, en donde los tres últimos radicales mencionados pueden estar opcionalmente sustituidos.
La pluralidad de grupos alquilenoxi unidos a la estructura de núcleo se selecciona independientemente de unidades alquilenoxi de la fórmula (V) (V) en donde * indica, en cada caso, la mitad de un enlace al átomo de nitrógeno de la unidad de repetición de las fórmulas (I), (II) o (IV); A2, en cada caso, se selecciona independientemente de ,2-propileno, 1 ,2-butileno y ,2-isobutileno; A3 es 1 ,2-propileno; R, en cada caso, se selecciona independientemente de hidrógeno y alquilo de Ci-C4; m tiene un valor promedio en el intervalo de 0 a aproximadamente 2; n tiene un valor promedio en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50; y p tiene un valor promedio en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.
Las modalidades especificas de los polímeros anfifilicos alcoxilados limpiadores de grasa pueden seleccionarse de polialquileniminas alcoxiladas que tienen un bloque interno de óxido de polietileno y un bloque externo de óxido de polipropileno, y el grado de etoxilación y el grado de propoxilación no es ni mayor ni menor que los valores limitantes específicos. Las modalidades específicas de las polialquileniminas alcoxiladas de conformidad con la presente invención tienen una relación minima de bloques de polietileno a bloques de polipropileno (n/p) de aproximadamente 0.6 y un máximo de aproximadamente 1.5(x+2y+1)1 2. Se ha descubierto que las polialquileniminas alcoxiladas que tienen una relación n/p de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.2(x+2y+1) 2 poseen propiedades especialmente benéficas.
Las polialquileniminas alcoxiladas de conformidad con la presente invención tienen una cadena principal que consiste en átomos de nitrógeno de aminas primarias, secundarias y terciarias que están ligados entre si mediante radicales alquileno A y están dispuestos de manera aleatoria. Se hace referencia a las entidades amino primarias que empiezan o terminan la cadena principal y las cadenas secundarias de la cadena principal de polialquilenimina y cuyos átomos remanentes de hidrógeno son reemplazados posteriormente por unidades alquilenoxi como unidades de repetición de las Fórmulas (I) o (IV), respectivamente. Se hace referencia a las entidades amino secundarias cuyo átomo remanente de hidrógeno es reemplazado posteriormente por unidades alquilenoxi como unidades de repetición de la Fórmula (II). Se hace referencia a las entidades amino terciarias que ramifican la cadena principal y las cadenas secundarias como unidades de repetición de la Fórmula (III).
Puesto que la ciclación puede producirse en la formación de la cadena principal de polialquilenimina, es posible, además, que las entidades amino cíclicas estén presentes en menor grado en la cadena principal. Estas polialquileniminas que contienen entidades amino cíclicas están, desde luego, alcoxiladas de la misma manera que aquellas que consisten de entidades amino primarias y secundarias no cíclicas.
La cadena principal de polialquilenimina que consiste en los átomos de nitrógeno y los grupos A1 tiene un peso molecular promedio Mw de aproximadamente 60 a aproximadamente 10,000 g/mol, preferentemente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 8000 g/mol y, con mayor preferencia, de aproximadamente 500 a aproximadamente 6000 g/mol.
La suma (x+2y+1) corresponde al número total de unidades alquilenimina presentes en una cadena principal individual de polialquilenimina y, así, está directamente relacionada con el peso molecular de la cadena principal de polialquilenimina. Sin embargo, los valores dados en la especificación se refieren al promedio numérico de todas las polialquileniminas presentes en la mezcla. La suma (x+2y+2) corresponde al número total de grupos arpiño presentes en una cadena principal individual de polialquilenimina.
Los radicales A1 que conectan los átomos amino nitrógeno pueden ser idénticos o diferentes, radicales alquileno de C2-C6 lineales o ramificados, tales como 1,2-etileno, 1,2-propileno, 1 ,2-butileno, 1 ,2-isobutíleno, 1 ,2-pentanodiil, 1 ,2-hexanodiil o hexametileno. Un alquileno ramificado preferido es 1 ,2-propileno. Los alquílenos lineales preferidos son etileno y hexametileno. Un alquileno de mayor preferencia es 1 ,2-etileno.
Los átomos de hidrógeno de los grupos amino primarios y secundarios de la cadena principal de polialquilenimina son reemplazados por unidades alquilenoxi de la Fórmula (V).
(V) En esta fórmula, preferentemente, las variables tienen uno de los significados dados a continuación: A2, en cada caso, se selecciona de 1,2-propileno, 1 ,2-butileno y ,2-isobutileno; preferentemente A2 es 1,2-propileno. A3 es 1,2-propileno; R, en cada caso, se selecciona de hidrógeno y alquilo de C1-C4, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y ter-butilo; preferentemente, R es hidrógeno. El índice m, en cada caso, tiene un valor de 0 a aproximadamente 2; preferentemente, m es 0 o aproximadamente 1; con mayor preferencia, m es 0. El índice n tiene un valor promedio en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 22 a aproximadamente 40 y, con mayor preferencia, en el intervalo de aproximadamente 24 a aproximadamente 30. El índice p tiene un valor promedio en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 11 a aproximadamente 40 y, con mayor preferencia, en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 30.
Preferentemente, la unidad alquilenoxi de la Fórmula (V) es una secuencia no aleatoria de bloques alcoxilato. Por secuencia no aleatoria se entiende que primero se adiciona el [-A2-0-]m(es decir, más cercano al enlace con el átomo de nitrógeno de la unidad de repetición de la Fórmula (I), (II), o (III)), segundo, se adiciona el [-CH2-CH2-0-]n, y tercero se adiciona el [-A3-0-]p. Esta orientación imparte a la poliatquilenimina alcoxilada un bloque interno de óxido de polietileno y un bloque externo de óxido de polipropileno.
La parte sustancial de estas unidades alquilenoxi de la Fórmula (V) se forma con las unidades etilenoxi -[CH2-CH2-0)]n- y las unidades propilenoxi - [CH2-CH2(CH3)-0]P-. Además, las unidades alquilenoxi pueden tener, adicionalmente, una pequeña proporción de unidades propilenoxi o butilenoxi -[A2-0]m-, es decir, la cadena principal de polialquilenimina saturada con átomos de hidrógeno puede hacerse reaccionar inicialmente con pequeñas cantidades de hasta aproximadamente 2 moles, especialmente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5 moles, en particular, de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.2 moles, de óxido de propileno u óxido de butileno por mol de entidades NH presentes, es decir, incipientemente alcoxiladas.
Esta modificación inicial de la cadena principal de polialquilenimina permite, de ser necesario, reducir la viscosidad de la mezcla de la reacción durante la alcoxilación. Sin embargo, generalmente, la modificación no influye en las propiedades de rendimiento de la polialquilenimina alcoxilada y, por lo tanto, no constituye una medida preferida.
Los polímeros anfifílicos alcoxilados limpiadores de grasa están presentes en los productos para el cuidado de las telas y el hogar e incluyen, sin limitarse a, detergentes de la presente invención en niveles de aproximadamente 0.05 % a 10 % en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar. Las modalidades de los productos para el cuidado de las telas y el hogar pueden comprender de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5 % en peso. Más específicamente, las modalidades pueden comprender de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 2.5 % del polímero limpiador de grasa.
Enzimas no equivalentes inmunolóqicamente y/o enzimas adicionales Los productos para el cuidado de las telas y el hogar pueden comprender una o más enzimas que proveen beneficios de cuidado de telas y/o rendimiento de limpieza. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, aunque no se limitan a, hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mana nasas, pectato liasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, laccasa y amilasas, o mezclas de estas. Una combinación típica es una mezcla de enzimas que comprende, por ejemplo, una proteasa y lipasa junto con amilasa. Cuando están presentes en un producto para el cuidado de las telas y el hogar, las enzimas adicionales mencionadas anteriormente pueden estar en un nivel de aproximadamente 0.00001 % a aproximadamente 2 %, de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 1 % o aun de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % de proteína enzimática en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar.
En un aspecto las enzimas preferidas podrían incluir una proteasa. Las proteasas adecuadas incluyen metaloproteasas y serina proteasas que incluyen serina proteasas microbianas neutras o alcalinas, tales como subtilisinas (EC 3.4.21.62). Las proteasas adecuadas incluyen las proteasas de origen animal, vegetal o microbiano. En un aspecto dicha proteasa adecuada puede ser de origen microbial. Las proteasas adecuadas incluyen mutantes modificados químicamente o genéticamente de las proteasas adecuadas mencionadas anteriormente. En un aspecto la proteasa adecuada puede ser una serina proteasa, tal como una proteasa microbial alcalina y/o una proteasa de tipo tripsina. Algunos ejemplos de proteasas neutras o alcalinas adecuadas incluyen: (a) subtilisinas (EC 3.4.21.62) que incluyen las derivadas de Bacillus, tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,312,936 B1 , 5,679,630, 4,760,025, 7,262,042 y en la patente núm. WO 09/021867. (b) proteasas de tipo tripsina o quimotripsina tales como la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) que incluyen la proteasa Fusarium descrita en la patente núm. WO 89/06270 y las proteasas quimotripsina derivadas de Cellumonas descritas en las patentes núm. WO 05/052161 y WO 05/052146. (c) metaloproteasas que incluyen las derivadas de Bacillus amyloliquefaciens descritas en la patente WO 07/044993A2.
Las proteasas preferidas incluyen las derivadas de Bacillus gibsonii o Bacillus Lentus.
Las enzimas proteasas adecuadas comercialmente disponibles incluyen las comercializadas con el nombre comercial Alcalase®, Savinase®, Primase®, Durazym®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase Ultra®, Savinase Ultra®, Ovozyme®, Neutrase®, Everlase® y Esperase® de Novozymes A/S (Dinamarca), aquellas comercializadas con el nombre comercial de Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect Ox®, FN3®, FN4®, Excellase® y Purafect OXP® de Genencor International, aquellas comercializadas con el nombre comercial de Opticlean® y Optimase® de Solvay Enzymes, aquellas comercializadas de Henkel/ Kemira, a saber, BLAP (secuencia mostrada en la Figura 29 de la patente de los EE. UU. núm. 5,352,604 con las siguientes mutaciones S99D + S101 R + S103A + V104I + G159S, mencionada de aquí en adelante como BLAP), BLAP R (BLAP con S3T + V4I + V199M + V205I + L217D), BLAP X (BLAP con S3T + V4I + V205I) y BLAP F49 (BLAP con S3T + V4I + A194P + V199M + V205I + L217D) - todos de Henkel/Kemira; y KAP (Bacillus alkalophilus subtilisina con mutaciones A230V + S256G + S259N) de Kao.
En un aspecto, el producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender una proteasa que no es equivalente inmunológicamente a la proteasa para agua fría de la presente invención. Para los propósitos de la presente invención, una proteasa equivalente inmunológicamente tendrá un grado de identidad alto (>80 %) con la BPN' y reaccionará en forma cruzada con el mismo anticuerpo. Las enzimas no equivalentes inmunológicamente adecuadas incluirán las derivadas de Bacillus Lentus, Bacillus gibsonii y la metaloproteasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens.
Las alfa-amilasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes (variantes) modificados química o genéticamente. Una alfa-amilasa alcalina preferida se deriva de una cepa de bacilo, tal como Bacillus lícheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtílis, u otras cepas de bacilo, tal como Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513, DSM 9375 (patente de los EE. UU. núm. 7,153,818) DSM 12368, DSMZ núm. 12649, KSM AP1378 (patente WO 97/00324), KSM K36 o KSM K38 (patente europea EP 1 ,022,334). Las amilasas preferidas incluyen: (a) las variantes descritas en las patentes núm. WO 94/02597, WO 94/18314, WO96/23874 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones contra la enzima enumerada como sec. con núm. de ident. 2 en la patente núm. WO 96/23874: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181 , 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391 , 408, y 444; (b) las variantes descritas en la patente de los EE. UU. núm. 5,856,164 y las patentes núms. WO99/23211 , WO 96/23873, WO00/60060 y WO 06/002643, especialmente las variantes con una o más sustituciones en las siguientes posiciones contra la enzima AA560 enumerada como sec. con núm. de ¡dent. 12 en la patente núm. WO 06/002643: 26, 30, 33, 82, 37, 106, 1 18, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231 , 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303. 304, 305, 311 , 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361 , 378, 383, 419, 421 , 437, 441 , 444, 445, 446, 447, 450, 461 , 471 , 482, 484, que contienen, además, preferentemente, las-supresiones de D183* y G184*. (c) las variantes que exhiben por lo menos 90 % identidad con la sec. con núm. de ident. 4 en la patente núm. WO06/002643, las enzimas tipo silvestre de Bacillus SP722, especialmente las variantes con supresiones en las posiciones 183 y 184 y las variantes descritas en la patente núm. WO 00/60060, que se incorpora como referencia en la presente descripción. (d) variantes que exhiben una identidad de al menos 95 % con la enzima silvestre de Bacillus esp. 707 (SEQ ID NO:7 en la patente de los EE. UU. núm. 6,093, 562), especialmente aquellas que comprenden una o más de las siguientes mutaciones M202, M208, S255, R172 y/o M261. Preferentemente, esa amilasa comprende una o más de M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, M202W, S255N y/o R172Q. En particular se prefiere a las que comprenden las mutaciones M202L o M202T.
Las alfa-amilasas disponibles comercialmente adecuadas incluyen DURAMYL®, LIQUEZYME®, TERMAMYL®, TERMAMYL ULTRA®, NATALASE®, SUPRAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, FUNGAMYL® y BAN® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Wien Austria, RAPIDASE®, PURASTAR®, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS® y PURASTAR OXAM® (Genencor International Inc., Palo Alto, California) y KAM® (Kao, 14-10 Nihonbashi Kayabacho, 1-chome, Chuo-ku Tokio 103-8210, Japón). En un aspecto, las amilasas adecuadas incluyen NATALASE®, STAINZY E® y STAINZY E PLUS® y mezclas de estas.
En un aspecto, esa enzima adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en: lipasas que incluyen las "lipasas de primer ciclo", tales como las descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,939,702 B1 y 2009/0217464. En un aspecto la lipasa es una lipasa de primer lavado, preferentemente, una variante de la lipasa silvestre de Thermomyces lanuginosus que comprende las mutaciones T231 R y N233R. La secuencia silvestre son los aminoácidos 269 (aminoácidos 23 - 291) del número de acceso de Swissprot 059952 (derivado de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa)). Las lipasas preferidas podrían incluir las que se venden con los nombres comerciales Lipex® y Lipolex®.
En un aspecto, otras enzimas preferidas incluyen las endoglucanasas de origen microbiano que exhiben actividad de endo-beta-1 ,4-glucanasa (E.C. 3.2.1.4) que incluyen un polipéptido bacteriano endógeno a un miembro del género Bacillus que tiene una secuencia con una identidad de al menos 90 %, 94 %, 97 % y aun 99 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 en 7,141 ,403B2) y mezclas de estas. Las endoglucanasas adecuadas se venden con el nombre comercial de Celluclean® y Whitezyme® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).
Otras enzimas preferidas incluyen pectato liasas comercializadas con los nombres comerciales de Pectawash®, Pectaway® y mananasas comercializadas con los nombres comerciales de Mannaway® (todas de Novozymes AIS, Bagsvaerd, Dinamarca), y Purabrite® (Genencor International Inc., Palo Alto, California).
Materiales adicionales Aunque no es esencial para los propósitos de la presente invención, la lista no limitante de materiales adicionales incluidos de aquí en adelante es adecuada para usarse en los productos para el cuidado de las telas y el hogar y, convenientemente, pueden incorporarse en ciertas modalidades de la invención, por ejemplo, para facilitar o mejorar el rendimiento de limpieza, para tratar el sustrato que se limpiará o para modificar la estética del producto para el cuidado de las telas y el hogar como en el caso de los perfumes, colorantes, tintes o lo similar. Los niveles de cualquiera de esos materiales adicionales incorporados en cualquier producto para el cuidado de las telas y el hogar son adicionales al nivel de cualquier material para incorporación mencionado anteriormente. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y los niveles de incorporación de estos dependerán de la forma física del producto para el cuidado de las telas y el hogar y de la naturaleza de la operación de limpieza en la que se usarán. Los materiales adicionales adecuados incluyen, sin limitarse a, surfactantes, aditivos, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tinte, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoción/antirredepósito de suciedad de arcilla, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, sistemas de suministro de perfume, agentes elastizantes de estructuras, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, solventes y/o pigmentos. Adicionalmente a la siguiente descripción, los ejemplos adecuados de estos otros componentes adicionales y las concentraciones de uso se encuentran en las patentes de los EE. UU. núms. 5,576,282, 6,306,812 B1 y 6,326,348 B1 , que se incorporan como referencia.
Tal como se mencionó, los ingredientes adicionales no son esenciales para los productos para el cuidado de las telas y el hogar de los solicitantes. Así, ciertas modalidades de los productos para el cuidado de las telas y el hogar de los solicitantes no contienen uno o más de los siguientes materiales adicionales: surfactantes, aditivos, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tinte, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueador, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoción/antirredepósito de suciedad de arcilla, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, sistemas de suministro de perfume, agentes elastizantes de estructuras, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, solventes y/o pigmentos. Sin embargo, cuando uno o más de los materiales adicionales están presentes, estos materiales adicionales pueden estar presentes como se detalla a continuación: Sistemas de suministro de perfume y perfumes - Las composiciones de la presente invención pueden comprender un perfume puro y/o sistemas de tecnología de perfumes que pueden combinarse para producir la experiencia de aroma deseada desde la etapa en que un producto está en el anaquel de una tienda hasta el final de su ciclo de rendimiento. Los perfumes adecuados incluyen los perfumes que son perdurables y/o de cuadrante. Los ejemplos de esos perfumes puros se describen en las patentes de los EE. UU. núms. 5,500,138; 5,500,154; 6,491 ,728; 5,500,137 y 5,780,404. Los sistemas de suministro de perfumes adecuados, los métodos para fabricar ciertos sistemas de suministro de perfumes y los usos de estos sistemas de suministro de perfumes se describen en la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2007/0275866 A1. Dicho sistema de suministro de perfumes incluye: Suministro asistido por polímeros (PAD, por sus siglas en inglés): Esta tecnología de suministro de perfume usa materiales poliméricos para suministrar materiales de perfumes. Algunos ejemplos son los polímeros cargados o neutrales, de coacervación clásica, solubles o parcialmente solubles a insolubles en agua, cargados o neutrales, cristales líquidos, termofundidos, hidrogeles, plásticos perfumados, microcápsulas, nano y microlátex, formadores de película polimérica, y adsorbentes poliméricos, etc. El PAD incluye, pero no se limita a: a.) Sistemas matriz: La fragancia se disuelve o dispersa en una matriz o partícula polimérica. Los perfumes, por ejemplo, pueden 1) dispersarse en el polímero antes de la formulación del producto o 2) adicionarse de manera separada del polímero durante o después de la formulación del producto. La difusión del perfume del polímero es un disparador común que permite la liberación del perfume, o aumenta la velocidad de liberación de este, desde un sistema de matriz polimérica que se deposita o aplica a la superficie deseada (sitio), a pesar de que se conocen muchos otros disparadores que pueden controlar la liberación del perfume. La absorción y/o adsorción en el interior o en la superficie de las partículas, películas, soluciones poliméricas, y lo similar son aspectos de esta tecnología. Son ejemplos las nano o micropartículas compuestas por materiales orgánicos (por ejemplo, látex). Las partículas adecuadas incluyen una amplia variedad de materiales que incluyen, pero no se limitan a, poliacetal, poliacrilato, poliacrílico, poliacrilonitrilo, poliamida, poliariletercetona, polibutadieno, polibutileno, tereftalato de polibutileno, policloropreno, polietileno, tereftalato de polietileno, dimetileno tereftalato policiclohexileno, policarbonato, policloropreno, polihidroxialcanoato, policetona, poliéster, polietileno, polieterimida, polietersulfona, polietilenoclorinatos, poliimida, poliisopreno, ácido poliláctico, polimetilpenteno, óxido de polifenileno, sulfuro de polifenileno, poliftalamida, polipropileno, poliestireno, polisulfona, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, así como también los polímeros o copolímeros a base de acrilonitrilo-butadieno, acetato de celulosa, etileno-vinil acetato, alcohol etilenvinílico, estireno-butadieno, vinil acetato-etileno y mezclas de estos. Los sistemas "estándar" se refieren a los que están "precargados" con la intención de mantener el perfume precargado asociado con el polímero hasta el momento de la liberación del perfume. Además, estos polímeros pueden suprimir el olor puro del producto y suministrar una emisión y/o un beneficio de duración dependiendo de la velocidad de liberación del perfume. Un desafío con dichos sistemas es alcanzar el equilibrio ideal entre 1) la estabilidad del producto (mantener el perfume dentro del portador hasta que sea necesario) y 2) la liberación oportuna (durante el uso o desde los sitios secos). Alcanzar esta estabilidad es importante, particularmente, durante el almacenamiento y el añejamiento del producto. Este desafío es evidente, particularmente, para productos de base acuosa que contienen surfactantes, tales como los detergentes líquidos de gran rendimiento para lavandería. Muchos sistemas disponibles de matriz "estándar" se convierten eficazmente en sistemas de "equilibrio" cuando se formulan en productos de base acuosa. Se puede seleccionar un sistema de "equilibrio" o un sistema de receptáculo, que tenga una estabilidad aceptable de difusión dentro del producto y activadores disponibles para el desprendimiento (p. ej., por fricción). Los sistemas de "equilibrio" son aquellos en los que el perfume y el polímero pueden agregarse de manera separada al producto y la interacción del equilibrio entre el perfume y el polímero conduce a un beneficio en uno o más de los puntos de contacto del consumidor (en comparación con un control de perfume libre que no tiene una tecnología de suministro asistido por polímeros). El polímero puede precargarse, además, con perfume; sin embargo, parte o todo el perfume puede difundirse durante el almacenamiento dentro del producto y alcanzar un equilibrio que incluye tener las materias primas de perfume deseadas (PRMs) asociadas con el polímero. Después, el polímero transporta el perfume a la superficie, y la liberación se produce, típicamente, por difusión del perfume. El uso de estos polímeros de sistemas de equilibrio tiene el potencial de disminuir la intensidad del olor puro del producto (usualmente, más en el caso de un sistema estándar precargado). El depósito de estos polímeros puede servir para "nivelar" el perfil de liberación y suministrar una duración incrementada. Como se indicó anteriormente, esta duración podrá alcanzarse al suprimir la intensidad inicial y podrá permitir que el formulador use PRM con umbral de detección de olor (ODT, por sus siglas en inglés) bajo o de más alto impacto o con un Índice de Kovats (Kl, por sus siglas en inglés) bajo para alcanzar los beneficios de FMOT sin la intensidad inicial, que es muy fuerte o distorsionada. Es importante que la liberación del perfume se produzca dentro del marco de tiempo de la aplicación para que impacte sobre el o los puntos deseados de contacto del consumidor. Las micropartículas adecuadas y los microlátex, asi como también los métodos de producción de estos, se pueden encontrar en la Farmacopea de los Estados Unidos núm. A 2005/0003980 A1. Los sistemas de matriz incluyen, además, adhesivos termofundidos y plásticos perfumados. Además, los polisacáridos modificados hidrófobamente pueden formularse en el producto perfumado para aumentar el depósito del perfume y/o modificar la liberación de este. Todos esos sistemas de matriz que incluyen, por ejemplo, polisacáridos y nanolátex pueden combinarse con otras PDT, que incluyen otros sistemas PAD, como los sistemas PAD de receptáculo, en la forma de una microcápsula de perfume (PMC, por sus siglas en inglés). Los sistemas matriz de suministro asistido por polímeros (PAD) pueden incluir los descritos en las siguientes referencias: solicitudes de patentes de los EE. UU. núm. 2004/0110648 A1 ; 2004/0092414 A1¡ 2004/0091445 A1 y 2004/0087476 A1; y patentes de los EE. UU. núm. 6,531,444; 6,024,943; 6,042,792; 6,051 ,540; 4,540,721 y 4,973,422.
Las siliconas son, además, ejemplos de polímeros que pueden usarse como PDT y pueden suministrar beneficios de perfume de una manera similar al "sistema de matriz" del suministro asistido por polímeros. Esta PDT se conoce como suministro asistido por siliconas (SAD, por sus siglas en inglés). Se pueden precargar siliconas con perfume o usarlas como un sistema de equilibrio según se describió para el PAD. Las siliconas adecuadas así como la fabricación de estas pueden encontrarse en el documento núm. WO 2005/102261; las solicitudes de patente de los EE. UU. núm. 20050124530A1 ; 20050143282A1 ; y el documento núm. WO 2003/015736. Las siliconas funcionalizadas pueden usarse, además, como se describe en la solicitud de patente de los EE. UU. núm. A 2006/003913 A1. Los ejemplos de siliconas incluyen polidimetilsiloxano y polialquildimetilsiloxanos. Otros ejemplos incluyen los que tienen grupos funcionales amina, que pueden usarse para suministrar beneficios asociados con el suministro asistido por aminas (AAD, por sus siglas en inglés) y/o suministro asistido por polímeros (PAD, por sus siglas en inglés) y/o productos de reacción de aminas (ARP, por sus siglas en inglés). Otros ejemplos pueden encontrarse en la patente de los EE. UU. 4,911 ,852; y en las solicitudes de patente de los EE. UU. núm. 2004/0058845 A1; 2004/0092425 A1 y 2005/0003980 A1.
Sistemas de receptáculo: Los sistemas de receptáculo se conocen, además, como tecnologías del tipo núcleo-vaina, o una en la cual la fragancia está rodeada por una membrana que controla la liberación del perfume, que puede servir como una vaina protectora. El material dentro de la microcápsula se conoce como núcleo, fase interna, o relleno, mientras que la pared se denomina, a veces, vaina, recubrimiento o membrana. Las micropartículas, las cápsulas sensibles a la presión o las microcápsulas son ejemplos de esta tecnología. Las microcápsulas de la invención actual se forman con una variedad de procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, polimerización de matriz y en el lugar, ¡nterfacial, secado por aspersión, extrusión, y recubrimiento. Los posibles materiales de la lámina varían ampliamente en su estabilidad con respecto al agua. Entre los más estables se encuentran los materiales a base de polioximetileneurea (PMU, por sus siglas en inglés), que pueden mantener ciertas PRM (materias primas de perfume, por sus siglas en inglés) incluso por períodos largos en solución acuosa (o producto acuoso). Dichos sistemas incluyen, pero no se limitan a, urea formaldehído o melamina formaldehído. Las microcápsulas a base de gelatina pueden estar preparadas de manera que se disuelvan rápida o lentamente en agua, dependiendo, por ejemplo, del grado de reticulación. Existen muchos otros materiales para la pared de la cápsula y varían en el grado de estabilidad de difusión del perfume observado. Sin la intención de estar limitados por la teoría, la velocidad de liberación de perfume de una cápsula, por ejemplo, una vez depositado sobre una superficie, es, típicamente, en orden inverso de la estabilidad de difusión del perfume dentro del producto. Como tales, las microcápsulas de urea formaldehído y melamina formaldehído, por ejemplo, requieren, típicamente, un mecanismo de liberación distinto o adicional a la difusión para liberación, de manera que la fuerza mecánica (p. ej., fricción, presión o esfuerzo de cizallamiento) sirva para romper la cápsula y aumentar la velocidad de liberación del perfume (fragancia). Otros disparadores incluyen el derretimiento, la disolución, la hidrólisis u otras reacciones químicas, radiación electromagnética, y lo similar. El uso de microcápsulas precargadas requiere la relación correcta entre la estabilidad dentro del producto y la liberación durante el uso y/o sobre la superficie (en el lugar), así como la selección adecuada de las PRM. Las microcápsulas en base a urea formaldehido o melamina formaldehído son relativamente estables, especialmente en soluciones de base acuosas casi neutras. Otras microcápsulas adecuadas incluyen microcápsulas que tienen láminas que comprenden materiales de uretano, acrilicos y/o alcoholes vinilicos. Estos materiales pueden requerir un activador por fricción que puede no aplicarse a todas las aplicaciones del producto. Otros materiales de las microcápsulas (p. ej., gelatina) pueden ser inestables en productos de base acuosa y pueden incluso proporcionar beneficios reducidos (en comparación con el control de perfume libre) cuando envejecen dentro del producto. Las tecnologías de raspado y aspirado son incluso otros ejemplos de PAD. Las microcápsulas de perfume (PMC) pueden incluir aquellas descritas en las siguientes referencias: solicitudes de patentes de los EE. UU. núm.: 2003/0125222 A1 ¡ 2003/215417 A1; 2003/216488 A1 ; 2003/158344 A1 ; 2003/165692 A1; 2004/071742 A1 ; 2004/071746 A1 ¡ 2004/072719 A1; 2004/072720 A1; 2006/0039934 A1 ; 2003/203829 A1 ; 2003/195133 A1 ; 2004/087477 A1 ; 2004/0106536 A1 ; y las patentes de los EE. UU. núm. 6,645,479 B1 ; 6,200,949 B1 ; 4,882,220; 4,917,920; 4,514,461 ; 6,106,875 y 4,234,627, 3,594,328 y la reemisión de patente de los EE. UU. núm. 32713.
Suministro asistido por moléculas (MAD, por sus siglas en inglés): Las moléculas o los materiales no poliméricos pueden servir, además, para mejorar el suministro de perfume. Sin pretender estar limitados por la teoría, el perfume puede no interactuar covalentemente con materiales orgánicos, lo que da como resultado un depósito y/o una liberación alterados. Los ejemplos no limitantes de estos materiales orgánicos incluyen, pero no se limitan a, materiales hidrófobos, tales como aceites orgánicos, ceras, aceites minerales, petrolato, ácidos grasos o ésteres, azúcares, surfactantes, liposomas e incluso otras materias primas de perfumes (aceites esenciales), así como también aceites naturales, que incluyen los aceites para el cuerpo y/u otros aceites. Otro ejemplo son los fijadores de perfumes. En un aspecto, los materiales no poliméricos o las moléculas tienen un CLogP mayor que aproximadamente 2. El suministro asistido por moléculas (MAD) puede incluir, además, aquellos descritos en las patentes de los EE. UU. núm. 7,119,060 y 5,506,201.
Suministro asistido por fibras (FAD, por sus siglas en inglés): La elección o uso de un sitio propiamente dicho puede servir para mejorar el suministro de perfume. De hecho, el sitio en sí mismo puede ser una tecnología de suministro de perfume. Por ejemplo, diferentes tipos de telas, tales como algodón o poliéster, tendrán diferentes propiedades con respecto a la habilidad para atraer y/o retener y/o liberar el perfume. La cantidad de perfume depositado dentro de las fibras, o sobre estas, puede alterarse por la elección de la fibra y, además, por la historia o el tratamiento de esta, como también por cualquier recubrimiento o tratamiento de la fibra. Las fibras pueden ser tejidas y no tejidas, así como también naturales o sintéticas. Las fibras naturales incluyen las producidas por plantas, animales y procesos geológicos e incluyen, pero no se limitan a, materiales de celulosa, tales como algodón, hilo, cáñamo o yute, lino, ramio, sisal, y las fibras que se usan para fabricar papel y telas. El suministro asistido por fibras puede consistir en el uso de fibras de madera, tales como pulpa termomecánica y pulpas kraft o al sulfito decoloradas o sin decolorar. Las fibras de origen animal consisten principalmente en proteínas particulares, tales como seda, nervios y tripas de animales y pelo (que incluye lana). Las fibras poliméricas a base de químicos sintéticos incluyen, pero no se limitan a, poliamida, nailon, poliéster PET o PBT, fenol formaldehído (PF), fibra de alcohol polivinílico (PVOH), fibra de cloruro de polivinilo (PVC), poliolefinas (PP y PE), y polímeros acrílicos. Todas esas fibras pueden estar precargadas con un perfume para después añadirse a un producto que puede contener, o no, perfume libre y/o una o más tecnologías de suministro de perfume. En un aspecto, las fibras pueden añadirse a un producto antes de estar cargadas con un perfume y después cargarse con un perfume al añadir un perfume que puede difundirse en la fibra, hacia el producto. Sin pretender estar limitados por la teoría, el perfume puede absorberse o adsorberse en la fibra, por ejemplo, durante el almacenamiento del producto, y después liberarse en uno o más momentos o puntos de contacto del consumidor.
Suministro asistido por aminas (AAD): El método de la tecnología de suministro asistido por aminas usa materiales que contienen un grupo amina para aumentar el depósito de perfume o modificar la liberación de perfume durante el uso del producto. No existen requerimientos en esta metodología para precomplejizar o hacer reaccionar previamente la(s) materia(s) prima(s) del perfume y la amina antes de la adición al producto. En un aspecto, los materiales AAD que contienen amina adecuados para usar en la presente descripción pueden ser no aromáticos; por ejemplo, polialquilimina, tales como polietilenimina (PEI), o polivinilamina (PVAm), o aromático, por ejemplo, antranilatos. Estos materiales pueden ser poliméricos o no poliméricos. En un aspecto, estos materiales contienen al menos una amina primaria. Esta tecnología permitirá una mayor duración y, además, una liberación controlada de notas de perfumes con ODT bajos (p. ej., aldehidos, cetonas, enonas) a través de los grupos funcionales amina, y el suministro de otras PRM, sin pretender estar limitados por la teoría, por medio del suministro asistido por polímeros para aminas poliméricas. Sin tecnología, las notas altas volátiles pueden perderse muy rápidamente y dejar una relación más alta de notas medias y de base con respecto a las notas altas. El uso de una amina polimérica permite usar concentraciones mayores de notas altas y de otras PRM para obtener duración de la frescura sin hacer que el olor puro del producto sea más intenso de lo deseado, o también permite que las notas altas y otras PRM se usen más eficazmente. En un aspecto, los sistemas de AAD son eficaces para suministrar las PRM a un pH mayor que aproximadamente el pH neutro. Sin pretender estar limitados por la teoría, los estados en que se produce la desprotonación de la mayoría de las aminas del sistema de AAD pueden dar como resultado una mayor afinidad de las aminas desprotonadas para las PRM, tales como aldehidos y cetonas, que incluyen enonas y cetonas insaturadas, tales como damasconas. En otro aspecto, las aminas poliméricas son eficaces para suministrar las PRM a un pH menor que aproximadamente el pH neutro. Sin pretender estar limitados por la teoría, los estados en que se produce la protonación de la mayoría de las aminas del sistema de AAD pueden dar como resultado una menor afinidad de las aminas protonadas para las PRM, tales como aldehidos y cetonas, y una fuerte afinidad del marco polimérico para un intervalo amplio de PRM. En dicho aspecto, el suministro asistido por polímeros puede suministrar más del beneficio de perfume; dichos sistemas son una subespecie de AAD y pueden denominarse suministro asistido por polímeros y aminas o APAD. En algunos casos, cuando el APAD se emplea en una composición que tiene un pH menor que siete, los sistemas de APAD pueden, además, considerarse suministros asistidos por polímeros (PAD). En todavía otro aspecto, los sistemas de AAD y PAD pueden ¡nteractuar con otros materiales, tales como los surfactantes aniónicos o polímeros, para formar sistemas coacervados y/o del tipo coacervados. En otro aspecto, puede usarse un material que contiene un heteroátomo distinto del nitrógeno, por ejemplo, azufre, fósforo o selenio, como alternativa para los compuestos amínicos. En todavía otro aspecto, los compuestos alternativos mencionados anteriormente pueden usarse en combinación con los compuestos amínicos. En todavía otro aspecto, una molécula simple puede comprender una porción amina y una o más porciones de heteroátomos alternativos, por ejemplo, tioles, fosfinas y selenoles. Los sistemas de AAD adecuados, asi como también los métodos para producirlos, pueden encontrarse en las solicitudes de patentes de los EE. UU. núm. 2005/0003980 A1 ; 2003/0199422 A1 ; 2003/0036489 A1 ; 2004/0220074 A1 y la patente de los EE. UU. núm. 6,103,678.
Sistema de suministro de ciclodextrinas (CP, por sus siglas en inglés): Este método tecnológico usa una ciclodextrina o un oligosacárido cíclico para mejorar el suministro de perfume. Típicamente, se forma un perfume y un complejo de ciclodextrina (CD). Estos complejos pueden ser preformados, formados en el lugar o formados sobre o en el lugar. Sin pretender estar limitados por la teoría, la pérdida de agua puede servir para cambiar el equilibrio hacia el complejo de CD-perfume, especialmente si otros ingredientes adicionales (p. ej., surfactante) no están presentes en altas concentracionés para competir con el perfume por la cavidad de ciclodextrina. Se puede alcanzar un beneficio de emisión si se produce la exposición al agua o un aumento en el contenido de humedad en un momento posterior. Además, la ciclodextrina permite al formulador del perfume aumentar la flexibilidad en la selección de las PRM. La ciclodextrina puede precargarse con perfume o añadirse por separado del perfume para obtener la estabilidad, el depósito o el beneficio de liberación deseados para el perfume. Las CD adecuadas, así como sus métodos de producción, pueden encontrarse en las solicitudes de patente de los EE. UU. núm. 2005/0003980 A1 y 2006/0263313 A1 , y en las patentes de los EE. UU. núm. 5,552,378; 3,812,011 ; 4,317,881; 4,418,144 y 4,378,923.
Acordes encapsulados en almidón (SEA, por sus siglas en inglés): El uso de la tecnología de acordes encapsulados en almidón permite modificar las propiedades del perfume, por ejemplo, al convertir un perfume líquido en un sólido mediante la adición de ingredientes tales como el almidón. El beneficio incluye la retención incrementada del perfume durante el almacenamiento del producto, especialmente, en condiciones no acuosas. Después de exponerse a la humedad, se puede activar la emisión del perfume. Además, pueden obtenerse beneficios en otros momentos, dado que el almidón permite al formulador del producto seleccionar PRM o concentraciones de PRM que no pueden usarse normalmente sin la presencia de tecnología SEA. Otro ejemplo de tecnologías incluye el uso de otros materiales orgánicos e inorgánicos, tales como sílice, para convertir el perfume de líquido a sólido. Las tecnologías SEA adecuadas, así como sus métodos de producción, pueden encontrarse en la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2005/0003980 A1 y la patente de los EE. UU. núm. 6,458,754 B1.
En un aspecto para elaborar los SEA se puede preparar una mezcla que comprende almidón, agua, ácido y un perfume; el ácido se incorpora en la mezcla en una cantidad suficiente para reducir el pH de la mezcla de almidón y agua en al menos 0.25 unidades y atomizar y secar la mezcla para formar de ese modo un perfume encapsulado. En la primera etapa del proceso de encapsulación de perfume se prepara una mezcla acuosa que comprende almidón, agua, perfume y ácido. Estos ingredientes pueden agregarse en cualquier orden, pero, se prepara primero la mezcla de almidón y agua y a continuación se agregan el ácido y el perfume, secuencialmente o juntos. Cuando se agregan en secuencia, el ácido puede añadirse antes del ingrediente para encapsulación. De manera alternativa, el ácido se añade después del ingrediente para encapsulación. La concentración de almidón en la mezcla acuosa puede ser desde un porcentaje tan bajo como 5 o 10 % en peso hasta un porcentaje tan alto como 60 o aun 75 % en peso. Generalmente, la concentración del almidón en la mezcla es de 20 a 50 % en peso, más generalmente, de aproximadamente 25 a 40 % en peso en la mezcla acuosa.
Los almidones adecuados para usarse pueden elaborarse con almidón sin refinar, almidón pregelatinizado, almidón modificado derivado de tubérculos, legumbres, cereales y granos, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de maíz ceroso, almidón de avena, almidón de mandioca, almidón de cebada cerosa, almidón de arroz ceroso, almidón de arroz dulce, almidón amioca, almidón de papa, almidón de tapioca y mezclas de estos. Los almidones modificados pueden ser especialmente adecuados para usarse en la presente invención e incluyen almidón hidrolizado, almidón diluido con ácido, almidón que tiene grupos hidrófobos tales como ésteres de almidón de hidrocarburos de(Cs cadena larga o mayor), acetatos de almidón, octenil succinato de almidón y mezclas de estos. En un aspecto, se emplean los ésteres de almidón, tales como los octenil succinatos de almidón.
El término "almidón hidrolizado" se relaciona con materiales del tipo de los oligosacáridos que se obtienen, típicamente, mediante la hidrólisis ácida o enzimática de almidones, preferentemente, almidón de maíz. Puede preferirse incluir un éster de almidón en la mezcla almidón-agua. En especial se prefieren los almidones modificados que comprenden un derivado de almidón que contiene un grupo hidrófobo o un grupo hidrófobo y un grupo hidrófilo degradado por al menos una enzima capaz de separar las uniones 1 ,4 de la molécula de almidón de los extremos no reductores para producir sacáridos de cadena corta y proporcionar resistencia alta a la oxidación y al mismo tiempo mantener porciones de peso molecular prácticamente alto de la base de almidón. La mezcla acuosa de almidón puede incluir, además, un plastificante para el almidón. Los ejemplos adecuados incluyen monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y maltodextrinas tales como glucosa, sacarosa, sorbitol, goma arábiga, gomas guar y maltodextrina.
En el proceso de la invención puede usarse cualquier ácido. Los ejemplos incluyen ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido clorhídrico, ácido sulfámico y ácido fosfónico. En un aspecto, se emplean ácidos carboxílicos orgánicos. En otro aspecto, se emplean ácidos orgánicos que comprenden más de un grupo de ácido carboxilico. Los ejemplos de ácidos orgánicos adecuados incluyen ácido cítrico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido málico, ácido succínico, ácido sebácico, ácido adipico, ácido itaconico, ácido acético y ácido ascórbico, etc. En un aspecto, se emplean ácidos saturados, tales como ácido cítrico.
Los perfumes adecuados para encapsulación incluyen los perfumes HIA que incluyen los que tienen un punto de ebullición determinado en la presión estándar normal de aproximadamente 101.3 kPa (760 mmHg) de 275 °C o menor, un coeficiente de partición P octanol/agua de aproximadamente 2000 o mayor y un umbral de detección de olor menor o igual que 50 partes por billón (ppb). En un aspecto, el perfume puede tener un logP de 2 o mayor. Los perfumes adecuados pueden seleccionarse del grupo que consiste en 3-(4-t-butilfenil)-2-metil propanal, 3-(4-t-butilfenil)-propanal, 3-(4-isopropilfenil)-2-metilpropanal, 3-(3,4-metilendioxifenil)-2-metilpropanal y 2,6-dimetil-5-heptenal, alfa-damascona, delta -damascona, iso-damascona, beta-damascenona, 6,7-dihidro-1 ,1 ,2,3,3-pentametil-4(5H)-indanona, metil-7,3-dihidro-2H-1 ,5-benzodioxepina-3-ona, 2-[2-(4-metil-3-ciclohexenil-1-il)propil]ciclopentan-2-ona, 2-sec-butilciclohexanona, y alfa -dihidro ionona, linalol, etil linalol, tetrahidrolinalol, y dihidromircenol.
Los ingredientes adecuados son distribuidos por Givaudan de Mount Olive, Nueva Jersey, EE. UU., International Flavors & Fragrances de South Brunswick, Nueva Jersey, EE. UU. o Quest de Naarden, Países Bajos.
Después de la formación de la mezcla acuosa que comprende almidón, agua, perfumes y ácido, esta se mezcla en condiciones de alto cizallamiento para formar una emulsión o dispersión de ingrediente para encapsulación en la solución acuosa de almidón.
Para la etapa final del procesamiento en la cual se atomiza y seca la mezcla acuosa que contiene el ácido y perfumes puede usarse cualquier técnica adecuada. Las técnicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las conocidas en la industria, incluyendo secado por aspersión, extrusión, métodos de enfriamiento/cristalización por rociado, recubrimiento en lecho fluidizado y el uso de catalizadores de transferencia de fase para promover la polimerización interfacial. La eficacia del rocío puede mejorarse por métodos conocidos en la industria, por ejemplo, usando torres de secado alto, aceitando un poco las paredes de la cámara o usando aire preacondicionado del cual se eliminó prácticamente la humedad.
Sistema de suministro de portadores inorgánicos (ZIC): Esta tecnología se refiere al uso de zeolitas porosas u otros materiales inorgánicos para suministrar perfumes. La zeolita cargada con perfume puede usarse con o sin ingredientes adicionales usados, por ejemplo, para recubrir la zeolita cargada con perfume (PLZ, por sus siglas en inglés) para cambiar sus propiedades de liberación de perfume durante el almacenamiento del producto, durante el uso o desde el sitio seco. La zeolita adecuada y los portadores inorgánicos asi como sus métodos de producción pueden encontrarse en la Farmacopea de los EE. UU. núm. A 2005/0003980 A1 y en las patentes de los EE. UU. núm. 5,858,959; 6,245,732 B1; 6,048,830 y 4,539,135. El sílice es otra forma de ZIC. Otro ejemplo de un portador inorgánico adecuado incluye tubos delgados inorgánicos, en donde el perfume u otro material activo está incluido dentro de la cavidad de los nano o microtubos. Preferentemente, el tubo delgado inorgánico cargado con perfume (o tubo delgado cargado con perfume o PLT (por sus siglas en inglés)) es un mineral nano o microtubular, tal como las halloysitas o las mezclas de halloysita con otros materiales inorgánicos, que incluyen otras arcillas. La tecnología de PLT puede comprender, además, ingredientes adicionales en el interior y/o exterior del túbulo con el fin de mejorar la estabilidad de difusión dentro del producto, el depósito en el sitio deseado o el control de la velocidad de liberación del perfume cargado. Pueden usarse materiales monoméricos y/o poliméricos, que incluyen la encapsulación en almidón, para recubrir, taponar, tapar o encapsular, de cualquier otra forma, el PLT. Los sistemas de PLT adecuados, asi como sus métodos de producción, pueden encontrarse en la patente de los EE. UU. núm. 5,651 ,976.
Precursores de perfumes (PP): Esta tecnología se refiere a las tecnologías de perfumes que resultan de la reacción de los materiales de perfume con otros sustratos o sustancias químicas para formar los materiales que tienen un enlace covalente entre una o más PRM y uno o más portadores. La PRM se convierte en un nuevo material denominado pro-PRM (es decir, precursor de perfume), que después puede liberar la PRM original al exponerse a un activador, tal como el agua o la luz. Los precursores de perfumes pueden suministrar propiedades mejoradas para el suministro de perfumes, que se traducen en el incremento del depósito, la duración, la estabilidad, la retención del perfume, y lo similar. Los precursores de perfume incluyen aquellos que son monoméricos (no poliméricos) o poliméricos y pueden estar preformados o formados en el lugar en condiciones de equilibrio, tales como las que pueden estar presentes durante el almacenamiento dentro del producto o en sitios húmedos o secos. Los ejemplos no limitantes de precursores de perfumes incluyen aductos de Michael (p. ej., beta-amino cetonas), ¡minas aromáticas o no aromáticas (Bases de Schiff), oxazolidinas, beta-ceto ésteres y ortoésteres. Otro aspecto incluye los compuestos que comprenden una o más porciones beta-oxi o beta-tío carbonilo capaces de liberar una PRM, por ejemplo, cetonas alfa, beta insaturadas, aldehido o éster carboxílico. El inductor típico para la liberación de perfume es la exposición al agua; aunque otros inductores pueden incluir enzimas, calor, luz, cambio de pH, autooxidación, un cambio de equilibrio, cambio en la concentración o fuerza iónica y otros. Para los productos de base acuosa son adecuados, particularmente, los precursores de perfume activados por luz. Estos precursores de perfume fotoactivos (PPP, por sus siglas en inglés) incluyen, pero no se limitan a, los que liberan derivados de cumarina y perfumes y/o precursores de perfume después de ser activados. Los precursores de perfume liberados pueden liberar una o más PRM por medio de cualquiera de los activadores mencionados anteriormente. En un aspecto, el precursor de perfume fotoactivo libera un precursor de perfume de base nitrogenada cuando se expone a un activador, tal como la luz y/o la humedad. En otro aspecto, el precursor de perfume de base nitrogenada liberado por el precursor de perfume fotoactivo libera una o más PRM seleccionadas, por ejemplo, de aldehidos, cetonas (que incluyen enonas) y alcoholes. Todavía en otro aspecto, el PPP libera un derivado de dihidroxicumarina. El precursor de perfume activado por luz puede ser, además, un éster que libera un derivado de cumarina y un alcohol para perfumes. En un aspecto, el precursor de perfume es un derivado de dimetoxibenceno tal como se describe en la Farmacopea de los EE. UU. núm. A 2006/0020459 A1. En otro aspecto, el precursor de perfume es un 3', 5'-dimetoxibenceno (DMB, por sus siglas en inglés) derivado que libera un alcohol después de la exposición a la radiación electromagnética. Todavía en otro aspecto, el precursor de perfume libera una o más PRM de ODT bajo, que incluyen alcoholes terciarios, tales como linalol, tetrahidrolinalol o dihidromircenol. Los precursores de perfumes adecuados y los métodos para producirlos pueden encontrarse en las patentes de los EE. UU. núm. 7,018,978 B2; 6,987,084 B2; 6,956,013 B2¡ 6,861 ,402 B1 ; 6,544,945 B1 ¡ 6,093,691; 6,277,796 B1 ; 6,165,953; 6,316,397 B1 ; 6,437,150 B1 ; 6,479,682 B1 ; 6,096,918; 6,218,355 B1 ; 6,133,228; 6,147,037; 7,109,153 B2; 7,071 ,151 B2; 6,987,084 B2; 6,610,646 B2 y 5,958,870, así como en las solicitudes de patente de los EE. UU. núm. 2005/0003980 A1 y 2006/0223726 A1. a.) Producto de reacción de amina (ARP, por sus siglas en inglés): Para los propósitos de la presente solicitud, ARP es una clase secundaria o especie de PP. Además, se puede usar aminas poliméricas "reactivas" en las cuales la funcionalidad amina se hace reaccionar previamente con una o más PRM para formar un producto de reacción de amina (ARP). Típicamente, las aminas reactivas son aminas primarias y/o secundarias y pueden ser parte de un polímero o un monómero (no polimérico). Los ARP pueden, además, mezclarse con otras PRM para ofrecer beneficios de suministro asistido por polímeros y/o suministro asistido por aminas. Los ejemplos no limitantes de aminas poliméricas incluyen polímeros a base de polialquiliminas, tales como polietilenimina (PEI) o polivinilamina (PVAm). Los ejemplos no limitantes de aminas monoméricas (no poliméricas) incluyen hidroxilaminas, tales como 2-aminoetanol y sus derivados sustituidos con alquilo, y aminas aromáticas, tales como antranilatos. Los ARP pueden estar premezclados con perfume o añadirse por separado en aplicaciones para usar y no enjuagar o que se retiran con enjuague. En otro aspecto, un material que contiene un heteroátomo que no es nitrógeno, por ejemplo, oxígeno, azufre, fósforo o selenio, puede usarse como alternativa para compuestos amínicos. En todavía otro aspecto, los compuestos alternativos mencionados anteriormente pueden usarse en combinación con los compuestos amínicos. En todavía otro aspecto, una molécula simple puede comprender una porción amina y una o más porciones de heteroátomos alternativos, por ejemplo, tioles, fosfinas y selenoles. El beneficio puede incluir el suministro mejorado de perfume, como también la liberación controlada de perfume. Los ARP adecuados, así como los métodos para elaborarlos, pueden encontrarse en la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2005/0003980 A1 y en la patente de los EE. UU. núm. 6,413,920 B1.
En un aspecto, el componente de perfume del producto por reacción de amina, que reacciona con la amina, se selecciona de un perfume que comprende una entidad cetona y/o una entidad aldehido. En un aspecto, dichos perfumes comprenden una cadena que contiene al menos 5 átomos de carbono. En un aspecto, los perfumes adecuados que comprenden una entidad cetona pueden seleccionarse de alfa damascona, delta damascona, iso damascona, carvone, gamma-metil-ionona, iso-E-super, 2,4,4, 7-Tetrametil-oct-6-en-3-ona, bencil acetona, beta damascona, damascenona, metil dihidrojasmonato, metil cedrilona y mezclas de estos. En un aspecto, los perfumes adecuados que comprenden una entidad aldehido pueden seleccionarse de 1 -decanal, benzaldehído, florhidral, 2,4-dimetilo-3-ciclohexeno-1-carboxaldehído; cis/trans-3,7-dimetilo-2,6-octadien-1-al; heliotropin; 2,4,6-trimetilo-3-ciclohexeno-1-carboxaldehído; 2,6-nonadienal; aldehido alfa-n-amilcinámico, aldehido alfa-n-hexilcinámico, P.T. Bucinal, liral, cimal, metilo nonil acetaldehído, hexanal, trans-2-hexenal, y mezclas de estos. En un aspecto, el perfume adecuado puede seleccionarse de aldehido undecilénico, gamma-undecalactona, heliotropina, gamma-dodecalactona, aldehido p-anísico, para-hidroxifenilbutanona, cimal, bencil acetona, alfa-ionona, p.t.bucinal, damascenona, beta ionona y metil nonil cetona y/o mezclas de estos. Típicamente, el nivel de perfume puede ser de 10 % a 90 %, de 30 % a 85 %, o incluso de 45 % a 80 % en peso del producto por reacción de amina. En un aspecto, los productos por reacción de amina adecuados son los que resultan de la reacción de polímero de poletllenoimina como polímeros Lupasol, con uno o más de los siguientes alfa damascona, delta damascona, carvona, hediona, florhidral, lilial, heliotropina, gamma-metil-lonona y 2,4-dimetil-3-ciclohexen-1-carboxaldehído; productos por reacción de amina son los que resultan de la reacción de dendrímeros Astramol con carvona y productos por reacción de amina que resultan de la reacción de etil-4-amino benzoato con 2,4-dimetil-3-ciclohexen-1-carboxaldehido. En un aspecto, los productos por reacción de amina adecuados son aquellos que resultan de la reacción de Lupasol HF con Delta damascona; LupasolG35 con alfa damascona; LupasolG100 con 2,4-dimetil-3-ciclohexen-1-carboxaldehído, etil-4-amino benzoato con 2,4-dimetil-3-ciclohexen-1-carboxaldehido.
En un aspecto, las aminas primarias y/o secundarias adecuadas que contienen compuestos se caracterizan por un índice de intensidad de olor menor que el de una solución de metilantranilato al 1 % en dipropilenglicol.
Una estructura general para un compuesto amínico primario es la siguiente: B-(NH2)n en donde B es un material portador, y n es un índice de valor de al menos 1.
Los compuestos adecuados que comprenden un grupo de amina secundaria pueden tener una estructura similar a la anterior excepto que el compuesto comprende una o más entidades -NH- además de alguna entidad -NH2. Por ello, dicho compuesto amínico puede tener la fórmula: B-(NH2)n; B-(NH)n; B-(NH)n-(NH2)n en donde B es un material portador, y cada n es, independientemente, un índice de valor de al menos 1.
En un aspecto, los portadores B pueden ser materiales inorgánicos que tienen cadenas principales sin o prácticamente sin base de carbono, o portadores orgánicos que tienen esencialmente cadenas principales con enlaces de carbono.
Los portadores inorgánicos adecuados incluyen mono o polímeros o copolímeros organosilicio orgánicos de compuestos de organosilano derivado de amino, siloxano, silazano, alumano, siloxano de aluminio o silicato de aluminio. Los ejemplos típicos de dichos portadores son: organosiloxanos con al menos una entidad amina primaria como el díaminoalquilsiloxano [H2NCH2(CH3)2Si]0, o el organoaminosilano (CeH5) 3SiNH2 (descritos en: Chemistry and Technology of Silicone, W. Noli, Academic Press Inc. 1998, Londres, págs. 209, 106). Además, los mono o polímeros o copolímeros organosilicio orgánicos que contienen una o más entidades organosililhidrazina son adecuados. Un ejemplo típico de dicho material portador es N,N'-bis(trimetilsílil) hídrazina (Me3Si)2NNH2.
Las aminas típicas adecuadas que comprenden un portador orgánico incluyen derivados aminoarilo, poliaminas, aminoácidos y derivados, aminas y amidas sustituidas, glucaminas, dendrímeros y mono-, di-, oligo-, poli-sacáridos amino sustituidos.
El compuesto aminico puede interrumpirse o sustituirse por enlazantes o grupos sustanciales de celulosa. Una fórmula general para este compuesto aminico es la siguiente: NH2n-Lm-B-Lm-R*m; en donde cada m es un índice de valor 0 o al menos 1 , y n es un índice de valor de al menos 1 como se definió en la presente descripción anteriormente. Como puede apreciarse anteriormente, el grupo amino se une a una molécula portadora como se define en las clases descritas en adelante. El grupo de amina primaria y/o secundaria está directamente unido al grupo portador o mediante un grupo L enlazante. El portador puede sustituirse, además, por un sustituyente R*, y R* puede enlazarse al portador directamente o mediante un grupo L enlazante. R* puede contener, además, grupos ramificadores como, por ejemplo, grupos amida y amina terciaria.
Para el propósito de la invención es importante que el compuesto aminico comprenda al menos un grupo amina primaria y/o secundaria para reaccionar con el aldehido y/o cetona de perfume para formar los productos de reacción. Dicha reacción se conoce, típicamente, como una reacción de base de Schiff a medida que se forma una base de Schiff. El compuesto aminico no se limita a tener solo una función amina. En efecto, con mayor preferencia, el compuesto aminico comprende más de una función amina, por ello, permite que el compuesto aminico reaccione con varios aldehidos y/o cetonas. En consecuencia, los productos de reacción que portan aldehído(s) y/o cetona(s) mezcladas pueden obtenerse, asi, y resultar en una liberación mixta de dichas fragancias.
Agentes blanqueadores - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden comprender uno o más agentes blanqueadores. Los agentes blanqueadores adecuados distintos a los catalizadores blanqueadores incluyen fotoblanqueadores, activadores de blanqueador, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados y mezclas de estos. Generalmente, cuando se usa un agente blanqueador, los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden comprender de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50 % o aun de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 25 % de agente blanqueador en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar. Algunos ejemplos de agentes blanqueadores adecuados incluyen: (1) Fotoblanqueadores, por ejemplo, ftalocianina de zinc sulfonada, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, colorantes de xanteno y mezclas de estos; (2) perácidos preformados: los perácidos preformados adecuados incluyen, pero no se limitan a, los compuestos seleccionados del grupo que consiste en ácidos percarboxílicos y sus sales, ácidos percarbónicos y sus sales, ácidos perimídicos y sus sales, ácidos peroximonosulfúricos y sus sales, por ejemplo, Oxone®, y mezclas de estos. Los ácidos percarboxílicos adecuados incluyen los perácidos hidrófobos e hidrófilos que tienen la fórmula R-(C=0)0-0-M, en donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado que tiene de 6 a 14 átomos de carbono o de 8 a 12 átomos de carbono cuando el perácido es hidrófobo, y menos de 6 átomos de carbono o aún menos de 4 átomos de carbono cuando el perácido es hidrófilo; y M es un contraión, por ejemplo, sodio, potasio o hidrógeno; (3) fuentes de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, sales inorgánicas de perhidrato, incluyendo sales de metal alcalino tales como sales sódicas de perborato (usualmente mono- o tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato y mezclas de estas. En un aspecto de la invención, las sales inorgánicas de perhidrato se seleccionan del grupo consistente de sales sódicas de perborato, percarbonato y mezclas de estas. Cuando se usan, las sales inorgánicas de perhidrato están presentes, típicamente, en cantidades de 0.05 a 40 % en peso o de 1 a 30 % en peso del producto total para el cuidado de las telas y el hogar y se incorporan, típicamente, en esos productos para el cuidado de las telas y el hogar como un sólido cristalino que puede estar recubierto. Los recubrimientos adecuados incluyen sales inorgánicas, tales como sales de silicato, carbonato o borato de metales alcalinos o mezclas de estas, o materiales orgánicos, tales como polímeros dispersables o solubles en agua, ceras, aceites o jabones grasos; y (4) activadores de blanqueador que tienen la fórmula R-(C=O)O- O-M, en donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado, que tiene, de 6 a 14 átomos de carbono o de 8 a 12 átomos de carbono cuando el activador de blanqueador es hidrófobo, y menos de 6 átomos de carbono o aún menos de 4 átomos de carbono cuando el activador de blanqueador es hidrófilo, y L es el grupo de partida. Los ejemplos de grupos salientes adecuados son ácido benzoico y derivados de este - en especial el bencenosulfonato. Los activadores de blanqueador adecuados incluyen dodecanoíl oxibenceno sulfonato, decanoil oxibenceno sulfonato, ácido decanoil oxibenzoico o sales de éste, 3,5,5-trimetil hexanoiloxibenceno sulfonato, tetraacetiletilendiamina (TAED) y nonanoiloxibenceno sulfonato (NOBS). Los activadores de blanqueador adecuados se describen también en la patente WO 98/17767. Aunque puede emplearse cualquier activador de blanqueador adecuado, en un aspecto de la invención el producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender NOBS, TAED o mezclas de estos.
Cuando está presente, el perácido y/o activador de blanqueador se incluye, generalmente, en el producto para el cuidado de las telas y el hogar en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso o aun de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 10 % en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar. Uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos pueden usarse combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos.
Las cantidades de fuentes de peróxido de hidrógeno y perácido o activador de blanqueador se pueden seleccionar de manera tal que la proporción molar del oxigeno disponible (de la fuente de peróxido) y el perácido sea de 1 :1 a 35:1 , o aún de 2:1 a 10:1.
Surfactantes - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de conformidad con la presente invención pueden comprender un surfactante o sistema surfactante, en donde el surfactante puede seleccionarse de surfactantes no iónicos, surfactantes aniónicos, surfactantes catiónicos, surfactantes anfolíticos, surfactantes zwitteriónicos, surfactantes semipolares no iónicos y mezclas de estos. Cuando está presente, el surfactante está presente, típicamente, en un nivel de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 60 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 % o aun dé aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 % en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar.
Aditivos - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden comprender uno o más aditivos o sistemas aditivos detergentes. Cuando se usa un aditivo, el producto para el cuidado de las telas y el hogar comprenderá, típicamente, al menos aproximadamente 1 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 % o aun de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 % de aditivo en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar.
Los aditivos incluyen, pero no se limitan a, sales de metales alcalinos, amonio y alcanolamonio de polifosfatos, silicatos de metales alcalinos, carbonatos de metales alcalinotérreos y alcalinos, aditivos de aluminosilicato y compuestos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o vinil metil éter, ácido 1 , 3, 5-trihídroxibenceno-2, 4, 6-trisulfónico, y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de metales alcalinos, amonio y amonio sustituido de ácidos poliacéticos, tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético, y también los policarboxilatos, tales como ácido melítico, ácido succinico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaléico, benceno 1,3,5- ácido tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, y sales solubles de estos.
Agentes quelantes - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden contener un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen agentes quelantes de cobre, hierro o manganeso y mezclas de estos. Cuando se usa un agente quelante, el producto para el cuidado de las telas y el hogar puede comprender de aproximadamente 0.005 % a aproximadamente 15 % o aun de aproximadamente 3.0 % a aproximadamente 10 % de agente quelante en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar. Los quelantes adecuados incluyen DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético), HEDP (ácido hidroxietano difosfónico), DTPMP (ácido dietilentriaminapenta(metilenofosfónico)), sal disódica hidratada del ácido 1 ,2-dihidroxibencen-3,5-disulfónico, etilendiamina, dietilentriamina, ácido etilendiaminadisuccinico (EDDS), ácido N-hidroxietiletilendiaminatriacético (HEDTA), ácido trietilentetraaminahexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilendiaminatetrapropiónico (EDTP) y derivados de estos.
Agentes inhibidores de transferencia de tinte - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes inhibidores de transferencia de tinte. Los agentes inhibidores de transferencia de tinte que son adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido políamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. Cuando están presentes en un producto para el cuidado de las telas y el hogar, los agentes inhibidores de transferencia de tinte pueden incluirse en niveles de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 5 % o aun de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 3 % en peso del producto para el cuidado de las telas y el hogar.
Abrillantadores - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden contener, además, componentes adicionales que pueden teñir los artículos que se limpian por ejemplo, abrillantadores fluorescentes. Las concentraciones adecuadas de los abrillantadores fluorescentes pueden ser desde aproximadamente 0.01 , desde aproximadamente 0.05, desde aproximadamente 0.1 o incluso desde aproximadamente 0.2 % en peso hasta 0.5 o incluso hasta 0.75 % en peso.
Dispersantes - Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden contener, además, dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen los ácidos homo o copoliméricos o sus sales, en las cuales el ácido policarboxilico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre si por no más de dos átomos de carbono.
Estabilizadores de enzimas - Las enzimas para detergentes pueden estabilizarse por diversas técnicas. Las enzimas empleadas en la presente invención pueden estabilizarse por la presencia de fuentes solubles en agua de iones calcio y/o magnesio en los productos para el cuidado de las telas y el hogar terminados que proveen esos iones a las enzimas. En el caso de productos acuosos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden proteasa, un inhibidor de proteasa reversible, tal como un compuesto de boro o compuestos tales como formiato de calcio, formiato de sodio y 1 ,2-propanodiol pueden añadirse para mejorar aun más la estabilidad.
Complejos de metal catalítico - Las composiciones de los solicitantes pueden incluir complejos de metal catalítico. Un tipo de catalizador de blanqueador que contiene metal es un sistema catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica de blanqueador definida, tales como los cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso, un catión metálico auxiliar sin actividad o con poca actividad catalítica de blanqueador, tales como los cationes de zinc o aluminio, y un secuestrante con constantes de estabilidad definidas para los cationes metálicos catalíticos y auxiliares, especialmente, ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminatetra(ácido metilenfosfónico) y sales solubles en agua de estos. Estos catalizadores se describen en la patente de los EE. UU. núm. 4,430,243.
Si se desea, las composiciones en la presente pueden catalizarse por medio de un compuesto de manganeso. Esos compuestos y las concentraciones de uso son muy conocidas en la industria e incluyen, por ejemplo, los catalizadores a base de manganeso descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5,576,282.
Los catalizadores blanqueadores de cobalto útiles en la presente invención se conocen y describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. núm. 5,597,936; 5,595,967. Estos catalizadores con base de cobalto se preparan fácilmente por medio de procedimientos conocidos, tales como los descritos, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. núms. 5,597,936 y 5,595,967.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir, además, un complejo de metal de transición de ligandos, tales como bispidonas (patente núm. WO 05/042532 A1) y/o ligandos rígidos macropolicíclicos (abreviados como "MRL"). Por una cuestión práctica y no por vía de la limitación, las composiciones y los procesos de la presente invención pueden ajustarse para proporcionar como mínimo una parte por cien millones de las especies activas de MRL en el medio de lavado acuoso, y proporcionarán, típicamente, de aproximadamente 0.005 ppm a aproximadamente 25 ppm, de aproximadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, o incluso de aproximadamente 0.1 ppm a aproximadamente 5 ppm del MRL en el liquido de lavado.
Los metales de transición adecuados en el catalizador de blanqueador de metal de transición incluyen, por ejemplo, manganeso, hierro y cromo. Los MRL adecuados incluyen 5,12-dietil-1 ,5,8,12-tetraazobiciclo[6.6.2]hexadecano.
Los MRL de metales de transición adecuados se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos, tales como se describen, por ejemplo, en la patente núm. WO 00/32601 , y en la patente de los EE. UU. núm. 6,225,464.
Solventes - Los solventes adecuados incluyen agua y otros disolventes tales como los fluidos lipofilicos. Los ejemplos de fluidos lipófilos adecuados incluyen siloxanos, otras siliconas, hidrocarburos, glicoléteres, derivados de glicerina como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventes perfluorados y de hidrofluoroéter, solventes orgánicos no fluorados poco volátiles, solventes a base de dioles, otros solventes compatibles con el medio ambiente y mezclas de estos.
Procesos para elaborar productos para el cuidado de las telas y el hogar Los productos para el cuidado de las telas y el hogar de la presente invención pueden formularse en cualquier forma apropiada y prepararse mediante cualquier proceso elegido por el formulador; los ejemplos no limitantes de estos se describen en los ejemplos de los solicitantes y en las patentes de los EE. UU. núms. 4,990,280; 20030087791 A1 ; 20030087790A1 ; 20050003983A1 ; 20040048764A1 ; 4,762,636; 6,291 ,412; 2005022789 A1 ; la patente europea núm. EP 10701 15A2 y las patentes de los EE. UU. núms. 5,879,584; 5,691 ,297; 5,574,005; 5,569,645; 5,565,422; 5,516,448; 5,489,392 y 5,486,303, todas ellas incorporadas en la presente descripción como referencia. Método de uso La presente invención incluye un método para limpiar o tratar un sitio, entre otros, una superficie o tela. En un aspecto se describe ese método que comprende las etapas opcionales de lavar y/o enjuagar esa superficie o tela, poner esa superficie o tela en contacto con cualquier producto para el cuidado de las telas y el hogar descrito en esta especificación y, después, opcionalmente, lavar y/o enjuagar esa superficie o tela.
Como se usa en la presente descripción, lavado incluye, pero no se limita a, restregado y agitación mecánica. El secado de esas superficies o telas se puede realizar por cualquiera de los medios comunes usados en el hogar o en la industria. Esos medios incluyen, pero no se limitan a, secado por aire forzado o secado al aire a temperaturas ambiente o elevadas y a presiones de 506.6 a 1.0 kPa (de 5 a 0.01 atmósfera) en presencia o ausencia de radiación electromagnética que incluye la irradiación por luz solar, infrarroja, ultravioleta y microondas. En un aspecto, ese secado se puede realizar a temperaturas superiores a la temperatura ambiente mediante el uso de una plancha, en donde, por ejemplo, esa tela puede estar en contacto directo con esa plancha por periodos relativamente cortos o incluso prolongados y en donde la presión ejercida puede ser mayor que la que de cualquier otra forma podría estar normalmente presente debido a la fuerza gravitacional. En otro aspecto, ese secado puede realizarse a temperaturas mayores que la temperatura ambiente mediante el uso de un secador. Los aparatos para secar telas son muy conocidos y se mencionan frecuentemente como secadores de ropa. Además de la ropa, esos dispositivos se usan para secar muchos otros artículos que incluyen toallas, sábanas, fundas de almohadones, pañales, etc. y, en muchos países del mundo, se considera que son una comodidad estándar que reemplaza a los tendederos para el secado de telas. La mayoría de los secadores que se usan actualmente emplean aire calentado que se pasa sobre y/o a través de la tela a medida que da vueltas en la secadora. El aire puede calentarse, por ejemplo, en forma electrónica, por medio de llama de gas o incluso por radiación de microondas. Ese aire puede calentarse hasta una temperatura de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 400 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 200 °C, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 100 °C o aun de aproximadamente 40 X a aproximadamente 85 °C y emplearse en el secador para secar una superficie y/o una tela. Como se apreciará por un experimentado en la industria, las composiciones limpiadoras de la presente invención son ideales para el lavado de prendas. Pór consiguiente, la presente invención incluye un método para el lavado de telas. El método incluye las etapas de poner la tela que se lavará en contacto con dicha solución limpiadora para lavandería que comprende como mínimo una modalidad de la composición limpiadora de los solicitantes, el aditivo de limpieza o una mezcla de estos. La tela puede comprender casi cualquier tela que habitualmente se pueda lavar en las condiciones normales del uso propio o institucional. La solución tiene, preferentemente, un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10.5. Las composiciones pueden emplearse en concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. Las temperaturas del agua varían, típicamente, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 90 °C. La proporción del agua a la tela, típicamente, varía de aproximadamente 1 :1 a aproximadamente 30:1. Métodos de prueba Método de prueba 1 A continuación, se incluye un protocolo para definir si un material colorante o pigmento es un agente tonalizador de telas para los fines de la invención: 1.) Se llenan dos recipientes de un medidor del grado de limpieza (Tergotometer) con 800 mi de agua potable de Newcastle upon Tyne, Reino Unido (agua con una dureza total -12 granos por galón estadounidense distribuida por Northumbrian Water, Pity Me, Durham, Co. Durham, Reino Unido). 2) Se introducen los recipientes en el medidor del grado de limpieza con una temperatura del agua controlada en 30 °C y una agitación configurada a 40 rpm durante todo el experimento.
) Se agregan 4.8 g de detergente IEC-B (IEC 60456 detergente base de referencia para lavadora automática de tipo B), provisto por wfk, Brüggen-Bracht, Alemania, en cada vaso. ) Después de dos minutos se agrega 2.0 mg de colorante activo al primer recipiente.
) Después de un minuto, se agrega 50 g de tela de algodón plana (suministrada por War ick Equest, Consett, County Durham, Reino Unido), cortada en muestras de 5 cm x 5 cm, para cada recipiente.
) Después de 10 minutos se drenan los recipientes y se llenan nuevamente con agua fría (16 °C), que posee una dureza de agua de 14.4 grados English Clark de dureza con una relación molar calcio a magnesio de 3:1.
) Después de enjuagar durante 2 minutos, se retira la tela. ) Se repiten las etapas 3-7 para tres ciclos adicionales y se usan los mismos tratamientos.
) Las telas se recolectan y se secan en un tendedero bajo techo por 12 horas. 0) Se analiza las muestras mediante un espectrómetro Hunter Miniscan equipado con iluminador D65 y filtro de recorte UVA, para obtener valores de Hunter a (eje rojo-verde) y Hunter b (eje amarillo-azul). 1) Se promedia los valores de Hunter a y Hunter b para cada serie de telas. Si las telas tratadas con el colorante en evaluación muestran una diferencia promedio de tono mayor que 0.2 unidades en el eje a o en el eje b, se considera que es un agente de tinte para telas para los fines de la invención. MÉTODO DE PRUEBA 2 - Para el Método de prueba 2 se realiza el ensayo de micromuestras de BMI con las composiciones detergentes 1 , 2 o 4 de las Tablas 1-3. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 1.59 g/L (6 gpg) y se ajusta hasta una temperatura de 16 °C. Después, se determina el rendimiento de las enzimas variantes según el ensayo de micromuestras de BMI descrito. Se determina el índice de rendimiento mediante la comparación del rendimiento de la vanante con el de la enzima de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. En todos los casos la dosificación de enzimas es de 1 ppm. Este método se describe con más detalle en el Ejemplo 31.
MÉTODO DE PRUEBA 3 - Para el Método de prueba 3 se realiza el ensayo de micromuestras de BMI con las composiciones detergentes 1 , 2 o 4 de las Tablas 1-3. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 1.59 g/L (6 gpg) y se ajusta hasta una temperatura de 16 °C. Después, se determina el rendimiento de las enzimas variantes según el ensayo de micromuestras de BMI descrito. Se determina el índice de rendimiento mediante la comparación del rendimiento de la variante con el de la enzima de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. En todos los casos la dosificación de enzimas es de 0.4 ppm. Este método se describe con más detalle en el Ejemplo 1.
MÉTODO DE PRUEBA 4 - Para el Método de prueba 4 se realiza el ensayo de micromuestras de BMI con la composición detergente 10 de la Tabla 19-4. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 3.17 g/L (12 gpg) y se ajusta hasta una temperatura de 16 °C. Después, se determina el rendimiento de las enzimas variantes según el ensayo de micromuestras de BMI descrito. Se determina el índice de rendimiento mediante la comparación del rendimiento de la variante con el de la enzima de la SEQ ID NO:755. En todos los casos la dosificación de enzimas es de 1.6 ppm. Se considera que las enzimas que tienen un índice de rendimiento de 1.1 o mayor son proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1 . Este método se describe con más detalle en el Ejemplo 19.
MÉTODO DE PRUEBA 5 - Para el Método de prueba 5 se realiza el ensayo de micromuestras de BMI con la composición detergente 7 de la Tabla 19-4. El detergente se disuelve én agua que tiene una dureza de 1.59 g/L (6 gpg) y se ajusta hasta una temperatura de 16 °C. Después, se determina el rendimiento de las enzimas variantes según el ensayo de micromuestras de BMI descrito. Se determina el índice de rendimiento mediante la comparación del rendimiento de la variante con el de la enzima de la SEQ ID NO:755. En todos los casos la dosificación de enzimas es de 4 ppm. Se considera que las enzimas que tienen un índice de rendimiento de 1.1 o mayor son proteasas GG36 para agua fría de la Serie 1. Este método se describe con más detalle en el Ejemplo 19.
MÉTODO DE PRUEBA 6 - Para el Método de prueba 6 se realiza el ensayo de micromuestras de BMI con la composición detergente 7 de la Tabla 19-4. El detergente se disuelve en agua que tiene una dureza de 1 .59 g/L (6 gpg) y se ajusta hasta una temperatura de 16 °C. Después, se determina el rendimiento de las enzimas variantes según el ensayo de micromuestras de BMI descrito. Se determina el índice de rendimiento mediante la comparación del rendimiento de la variante con el de la enzima de referencia; esa enzima de referencia es la enzima de la SEQ ID NO:755 que consiste en la mutación A158E. En todos los casos la dosificación de enzimas es de 4 ppm. Se considera que las enzimas que tienen un índice de rendimiento de 1.0 o mayor son proteasas GG36 para agua fría de la Serie . Este método se describe con más detalle en el Ejemplo 19.
MÉTODO DE PRUEBA 7 - Se prueba la conductividad eléctrica de una solución acuosa de conformidad con el método estándar ASTM D1125 y se reporta en unidades de miliSiemens/cm, abreviada como mS/cm en esta patente.
Experimental En la exposición de experimentos incluida a continuación se usan las siguientes abreviaturas: Pl (índice de rendimiento), ppm (partes por millón); M (molar); mM (milimolar); µ? (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); nmol (nanomoles); gr (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); pg (picogramos); L (litros); mi y mL (mililitros); pl y µ?_ (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (mieras); nm (nanómetros); U (unidades); V (voltios); MW (peso molecular); s (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) y hr(s) (hora/horas);°C (grados centígrados); csp (cantidad suficiente); ND (no realizado); rpm (revoluciones por minuto); GH (grados alemanes de dureza); H20 (agua); dH20 (agua desionizada); HCI (ácido clorhídrico); aa (aminoácido); bp (par de bases); kb (par de kilobases); kD (kilodaltons); ADNc (copia de ADN complementario); ADN (ácido desoxirribonucleico); ADNmc (ADN monocatenario); ADNbc (ADN bicatenario); dNTP (desoxirribonucleótido trifosfato); ARN (ácido ribonucleico); MgCI2 (cloruro de magnesio); NaCI (cloruro de sodio); p/v (peso a volumen); v/v (volumen a volumen); p/p (peso a peso); g (gravedad); OD (densidad óptica); ppm (partes por millón); solución tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS); SOC (bacto triptona al 2 %, extracto de bacto levadura al 0.5 %, NaCI, 10 mM, KCI 2.5 mM); caldo Terrific (TB; 12 g/l de bacto-triptona, 24 g/l de glicerol, 2.31 g/l de KH2PO4 y 12.54 g/l de K2HP04); OD2eo (densidad óptica a 280 nm); OD600 (densidad óptica a 600 nm); A4os (absorbancia a 405 nm); Vmax (la velocidad inicial máxima de una reacción catalizada por enzimas); PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamina); PBS (solución salina regulada con fosfato [NaCI 150 mM, tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25 % TWEEN®-20); PEG (polietilenglicol); PCR (reacción en cadena de la polimerasa); RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa); SDS (dodecil sulfato de sodio); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[2-etanosulfónico]); HBS (solución salina tamponada con HEPES); Tris-HCI (clorhidrato de tris[hidroximetil]aminometano); Tricina (N-[tris-(h¡droximetil)-metilj-glicina); CHES (ácido 2-(N-ciclo-hexilamino)etanosulfónico); TAPS (ácido 3-{[tr¡s-(hidrox¡met¡l)-metil]-am¡no}-propanosulfón¡co); CAPS (ácido 3-(ciclo-hexilamino)-propanosulfónico)¡ DMSO (sulfóxido de dimetilo); DTT (1 ,4-ditio-DL-treitol); SA (ácido sinapinico (ácido s, 5-dimetoxi-4-hidroxicinámico)); TCA (ácido tricloroacético); Glut y GSH (glutatión reducido); GSSG (glutatión oxidado); TCEP (Tris[2-carboxietil] fosfamina); Ci (Curies); mCi (miliCuries); pCi (microCuries); HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución); RP-HPLC (cromatografía de líquidos de alta presión y fase reversa); TLC (cromatografía de capa delgada); MALDI-TOF (desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo; Ts (tosilo); Bn (bencilo); Ph (fenilo); Ms (mesilo); Et (etilo), Me (metilo); Taq (ADN polimerasa de Thermus aquaticus); Klenow (fragmento (Klenow) grande de la ADN polimerasa I); EGTA (ácido etílenglicol-bísO-aminoetil éter) N, N, ', N'-tetraacético); EDTA (ácido etilendiaminatetraacético); bla (gen de resistencia a la ß-lactamasa o ampicilina); HDL (líquido de gran rendimiento); HDD (detergente en polvo de gran rendimiento); HSG (detergente granular de alta espuma); CEE (Europa central y oriental); WE (Europa occidental); NA cuando se usa con referencia de los detergentes (América del Norte); Japón y JPN cuando se usan con referencia a los detergentes (Japón); MTP (placa de microtitulación); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, Países Bajos); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San José, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania); Pall (Pall Corp., East Hills, NY y Bad Kreuznach, Alemania); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canadá); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, Países Bajos); P&G y Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wickiow, Irlanda); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Noruega); Dynal (Dynal, Oslo, Noruega); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences y/o Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japón); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza); Gene Oracle (Gene Oracle, Inc., Mountain View, CA); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Hemdon, VA); Sorvall (Sorvall brand, de Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Siegfried Handel (Siegfried Handel AG, Zofingen, Suiza); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Alemania); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); Néw Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintersháll AG, Kassel, Alemania); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Shell Chemicals (Shell Chemicals, Inc., Londres, Reino Unido); Stepan (Stepan, Northfield, IL); Clariant (Clariant, Sulzbach, Alemania); Industrial Zeolite (Industrial Zeolite Ltd., Grays, Essex, Reino Unido); Jungbunzlauer (Jungbunzlauer, Basel, Suiza); Solvay (Solvay, Brussels, Bélgica); 3V Sigma (3V Sigma, Bergamo, Italia); Innospec (Innospec, Ellesmere Port, Reino Unido); Thermphos (Thermphos, Vlissiggen-Ost, Países Bajos); Ciba Specialty (Ciba Specialty Chemicals, Basel, Suiza); Dow Corning (Dow Corning, Barry, Reino Unido), Enichem (Enichem Ibérica, Barcelona, España); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, Países Bajos); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); Mettler-Toledo (Mettler-Toledo Inc, Columbus, OH); RB (Reckitt-Benckiser, Slough, Reino Unido); y Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).
Para los detergentes líquidos de gran rendimiento (HDL) para lavandería de América del Norte (NA) y Europa occidental (WE) la inactivación por calor de las enzimas presentes en detergentes disponibles comercialmente se realiza mediante la colocación de detergente líquido pesado previamente (en una botella de vidrio) a baño maría a 95 °C por 2 horas. El tiempo de incubación para la inactivación por calor de los detergentes para lavado automático de vajilla (ADW) de NA y WE es de 8 horas. Los detergentes no calentados y calentados se prueban dentro de los 5 minutos después de disolver el detergente para determinar en forma precisa el porcentaje inactivado. La actividad de las enzimas se prueba por medio del ensayo con AAPF.
Para probar la actividad enzimática en detergentes inactivados por calor se preparan soluciones de trabajo a partir de las soluciones de reserva inactivadas por calor. Se añaden cantidades apropiadas de agua con la dureza adecuada (p. ej., 1.59 g/L (6 gpg) o 3.17 g/L (12 gpg)) y tampón en las soluciones detergentes para obtener las condiciones deseadas. Las soluciones se mezclan por agitación en vórtice o mediante inversión de las botellas. La siguiente tabla suministra información sobre algunos de los detergentes disponibles comercialmente y condiciones de prueba usadas en la presente descripción. En algunos experimentos de los siguientes ejemplos son útiles algunos detergentes adicionales y/u otros detergentes comercialmente disponibles.
En algunos aspectos adicionales son útiles las siguientes Los ejemplos están previstos para ser simplemente ilustrativos de la invención y, por ello, no deberían considerarse como limitantes de la invención en cualquier forma; además, describen y detallan aspectos y modalidades de la invención considerados anteriormente. Los ejemplos y la descripción detallada precedentes se proporcionan en forma de ilustración y no en forma de limitación.
Ejemplos de variantes de BPN' o Parte I Tabla de detergentes Las composiciones de los detergentes usados en los ensayos de los ejemplos de las variantes de BPN' (o Parte I) se muestran en la Tabla 1-3. Las muestras de las proteínas de las variantes de BPN' se añadieron a las composiciones detergentes tal como se describió en el Ejemplo 1 de la Parte I para ensayar las distintas propiedades probadas.
Las siguientes composiciones son composiciones líquidas para lavandería adecuadas para máquinas lavadoras automáticas de carga superior (1 , 2 y 4) y máquinas lavadoras de carga frontal (3). 1 El copolimero de injerto aleatorio es un copolimero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es de aproximadamente 6000 y la proporción en peso entre el óxido de polietileno y el acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no más de 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno.
^ Polietilenimina (MW = 600) con 20 grupos de etoxilato por -NH. 3 El polímero anfifilico alcoxilado limpiador de grasa es una polietilenimina (MW = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH Vectores, células y métodos para preparar polipéptidos de las variantes de proteasas de la invención En la industria se conocen varios métodos adecuados para generar polinucleótidos modificados de la invención que codifican variantes de las proteasas de la invención (tales como las proteasas para agua fría de la invención) que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, mutagénesis de saturación del sitio, mutagénesis por barrido, mutagénesis por inserción, mutagénesis por deleción, mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida al sitio y evolución directa, además de otros métodos de recombinación distintos. Los métodos para preparar polinucleótidos y proteínas modificadas (p. ej., variantes de la proteasa) incluyen metodologías de reordenamiento de ADN (ver, p. ej., Stemmer WP, Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU.91 (22):10747-51 (1994)); métodos basados en recombinación ilegítima de genes, p. ej., ITCHY (Ostermeier y col., Bioorg. Med. Chem.7:2139-44
[1999]); SCRATCHY (Lutz y col. Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 98:1 1248-53
[2001]); SHIPREC (Sieber y col., Nat. Biotechnol.19:456-60
[2001]); NRR (Bittker y col., Nat. Biotechnol. 20:1024-9
[2001]; Bittker y col., Proc Nati. Acad. Sci. EE. UU. 101 :7011-6
[2004]); métodos que se basan en el uso de oligonucleótidos para insertar mutaciones, deleciones y/o inserciones aleatorias y dirigidas (Ness y col., Nat. Biotechnol.20:1251-5
[2002]; Coco y col., Nat. Biotechnol. 20:1246-50
[2002]; Zha y col., Chembiochem.4:34-9
[2003]; Glaser y col., J. Immunol.149:3903-13
[1992]); ver, además, Arkin y Youvan, Biotechnology 10:297-300 (1992); Reidhaar-Olson y col., Methods Enzymol. 208:564-86 (1991).
En un aspecto se liga un polinucleótido parental de longitud completa en un plásmido de expresión apropiado y se usa el método de mutagénesis siguiente para facilitar la construcción de la proteasa modificada de la presente invención, aunque pueden usarse otros métodos. El método se basa en el método descrito por Pisarchik y col. (Pisarchik y col., Prot. Eng. Des. Select. 20:257-265
[2007]). En un aspecto la ventaja adicional provista es que la enzima de restricción se corta fuera de su secuencia de reconocimiento lo que permite la digestión de prácticamente cualquier secuencia de nucleótidos y evita la formación de una cicatriz en el sitio de restricción.
En un método se obtiene un gen de origen natural que codifica una proteasa de longitud completa y se secuencia y analiza para identificar uno o más puntos en los cuales se desea realizar una mutación (p. ej., deleción, Inserción, sustitución) en uno o más aminoácidos. La mutación del gen para cambiar su secuencia de modo que se ajuste a la secuencia deseada se realiza por medio de extensión de iniciadores de conformidad con métodos comúnmente conocidos. Los fragmentos a la izquierda y a la derecha del o los puntos de mutación deseados se amplifican por medio de PCR de modo que incluyan el sitio de restricción Eam1104l. Se realiza la digestión de los fragmentos de la izquierda y derecha con Eam1104l para generar una pluralidad de fragmentos que tienen extremos cohesivos de tres bases complementarias que después se agrupan y ligan para generar una genoteca de secuencias modificadas que contienen una o más mutaciones. Este método evita que se produzcan mutaciones por cambio de marco. Además, este método simplifica el proceso de mutagénesis porque todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse de modo que tengan el mismo sitio de restricción y no se necesitan conectores sintéticos para crear los sitios de restricción tal como se necesita en otros métodos.
Parte I - Ejemplos Ejemplo 1 Ensayos Se usaron varios ensayos tal como se indica más abajo. Cualquier desviación de los protocolos provistos más abajo se indica en los ejemplos posteriores.
A. Ensayo con TCA para determinar el contenido de proteínas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para BPN' y variantes de BPN' este ensayo comenzó con el uso de sobrenadante de cultivo bacteriano de B. subtilis filtrado de placas de microtitulación cultivadas 3-4 dias a 33-37 °C con agitación a 230-250 rpm y ventilación humidificada. Para el ensayo se usó una placa de microtitulación (MTP) de fondo plano de 96 pocilios nueva. Primero, se colocaron 100 pL pocillo de HCI 0.25 N en cada pocilio. Después, se añadieron 25 pl_ de caldo de cultivo filtrado. Se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (se usó el modo de mezclado de 5 s en el lector de placas) para proveer la lectura de la "preforma". Para la prueba se colocaron 100 pL/pocillo de ácido tricloroacético (TCA) al 30 % (p/v) en las placas y se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (se usó el modo de mezclado de 5 s en el lector de placas). El equipo usado fue un aparato Biomek FX Robot (Beckman Coulter) y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices); las MTP fueron MTP de Costar (tipo 9017).
Para realizar los cálculos se restó la preforma (sin TCA) de la lectura de la prueba con TCA para proveer una medida relativa del contenido de proteínas en las muestras. Si se desea puede crearse una curva estándar mediante la calibración de las lecturas de TCA con ensayos con AAPF de clones con factores de conversión conocidos. Sin embargo, los resultados del ensayo con TCA son lineales con respecto a la concentración de 250 a 2500 microgramos de proteína por mi (ppm) y, así, se puede graficar directamente en función del rendimiento de la enzima para elegir variantes de rendimiento adecuado. El aumento de la turbidez/dispersión de luz en las muestras coincide con la cantidad total de proteína precipitable en el sobrenadante del cultivo.
B. Ensayo de AAPF de proteasas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para determinar la actividad de proteasa de las proteasas y variantes de estas de la presente invención se midió la hidrólisis de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). Las soluciones reactivas usadas fueron: Tris/HCI 100 mM, pH 8.6 que contenía TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón de dilución Tris); tampón Tris 100 mM, pH 8.6 que contenia CaCI2 10 mM y TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón Tris/Ca); y suc-AAPF-pNA 160 mM en DMSO (solución de reserva de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar una solución de trabajo de suc-AAPF-pNA se añadió 1 mi de solución de reserva de suc-AAPF-pNA en 100 mi de tampón Tris/Ca y se mezcló bien por al menos 10 segundos. Para realizar el ensayo se añadieron 10 µ? de solución de proteasa diluida en cada pocilio seguido inmediatamente por la adición de 190 µ? de una solución de trabajo de 1 mg/ml de suc-AAPF-pNA. Las soluciones se mezclaron por 5 s y se leyó el cambio en la absorbancia en modo cinético (25 lecturas en 5 minutos) a 405 nm en un lector de MTP a 25 °C. La actividad de proteasa se expresó como AU (actividad = AOD min"1 mi"1).
C. Ensayo de micromuestras de BMI del Método de prueba 3 Se obtuvieron micromuestras manchadas con sangre, leche y tinta (BMI, por sus siglas en inglés) de 5.5 milímetros de diámetro circular de CFT. Antes de cortar las muestras, la tela (EMPA 116) se lavó con agua. Se colocó una micromuestra en cada pocilio de una placa de microtitulación no adsorbente de 96 pocilios (Corning 3641). Los detergentes usados para los ensayos incluyeron la Composición detergente 1 , la Composición detergente 2 y la Composición detergente 4. Los detergentes se diluyeron en agua Milli-Q (desionizada) hasta una concentración de trabajo de 0.788 g/L. Estos detergentes se amortiguaron con HEPES 5 mM, pH 8.2 o pH 7.2; estos tampones, cuando se añadieron al detergente, tenían un pH 8 o pH 7, respectivamente. Además, se añadieron 1.59 gramos por litro (6 granos por galón (gpg)) de dureza de agua (3:1 Ca:Mg - CaC : MgCI2-6H20). La solución detergente se equilibró previamente en un baño de agua helada para los ensayos realizados a 16 °C (temperatura ambiente para los ensayos a 32 °C) y se bombeó a un receptáculo giratorio (Beckman FX). Después, se añadieron 90 µ? de la solución detergente deseada en cada pocilio de la TP que contenia las micromuestras. En esta mezcla se añadieron 10 µ? de la solución de dilución maestra de enzimas diluida para alcanzar una concentración enzimática aproximada de 0.4 - 0.5 pg/mL. La dilución maestra se preparó a partir de los sobrenadantes de cultivo a 8 pg/mL, en donde se determinó la concentración enzimática aproximada de los sobrenadantes de cultivo y los controles parentales de BPN'-v3 o BPN'-v36 con el ensayo de actividad de proteasa con AAPF, y la concentración se basó en un estándar de BPN'-v3 o BPN'-v36 purificado de concentración conocida. La MTP se selló con cinta y se colocó en el incubador/agitador ¡EMS (Thermo/Labsystems) configurado previamente a 16 °C en una caja de producto lácteo refrigerada o a 32 °C en el banco de trabajo por 20 minutos con agitación a 1400 rpm. Después de la incubación en las condiciones apropiadas se extrajo la cinta selladora de cada placa y se transfirieron 125 µ? (150 µ? si se pipetea manualmente para análisis de menor magnitud) de la solución de cada pocilio a una MTP nueva (Corning 9017). La MTP nueva que contenía 125 µ? - 150 µ? de solución/pocilio se leyó a 600 nm (con el modo de mezclado de 5 s en el lector de placas) con un lector MTP SpectraMax (tipo 340; Molecular Devices). Además, se incluyeron controles de preforma que contenían una micromuestra y detergente, pero no enzima. El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor de la preforma (sustrato sin enzima) y se obtuvo una medida de la actividad hidrolítica. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de rendimiento tal como se describe más abajo. En la presente descripción se hace referencia a este ensayo de micromuestras de BMI realizado a 16 °C (60 °F) y pH 8 como "Método de prueba 3".
D. Ensayo de estabilidad Se determinó la estabilidad de las variantes de la proteasa en presencia de la Composición detergente 3 concentrada diluida en agua al 40 %. Los reactivos usados fueron la Composición detergente 3 diluida al 50 % en agua Milli-Q, MES 10 mM al 0.01 %, tampón de dilución maestro TWEEN®-80 pH 5.8, reactivos de AAPF: ver el protocolo del ensayo con AAPF. El equipo usado fue MTP de fondo en F (Corning 9017) para la dilución de la enzima diluida en detergente y también para las placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices), incubador/agitador iEMS (1 mm de amplitud) (Thermo Electron Corporation), cinta selladora: Nunc (236366), receptáculo giratorio (Beckman Fx).
La Composición detergente 3 se diluyó inicialmente al 50 % en agua. Este detergente se mantuvo a temperatura ambiente y se cicló a través del receptáculo giratorio. Los incubadores/agitadores iEMS (Thermo/Labsystems) se configuraron previamente a 43 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que contenían tampón de dilución maestro hasta una concentración de ~ 20 ppm (placa de dilución maestra). Después se añadieron 40 pl de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 160 µ? de la Composición detergente 3 al 50 % para producir una concentración de incubación final de 4 ppm. El contenido se mezcló y se mantuvo a temperatura ambiente y se realizaron ensayos con AAPF por triplicado inmediatamente en estas placas y se registraron como lecturas sin estrés. El ensayo con AAPF se modificó de manera que se añadieron 20 pL de muestra de la etapa anterior en 190 pL de solución de trabajo de suc-AAPF-pNA. Las placas se cubrieron inmediatamente con cinta selladora y se colocaron en agitadores iEMS a 43 °C por 30 min a 650 rpm. Después de 30 minutos de incubación se realizaron ensayos con AAPF por triplicado en estas placas de estrés y se registraron como lecturas con estrés. Se determinó la estabilidad de las muestras mediante el cálculo de la relación de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente manera: actividad residual (%) = [mOD.min"1 con estrés]*100 / [mOD. min"1 sin estrés]. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de rendimiento tal como se describe más abajo.
E. Ensayo de estabilidad con LAS/EDTA La estabilidad de las variantes de la proteasa en presencia de un surfactante aniónico representativo (LAS=alquilbencenosulfonato lineal, específicamente, dodecilbencenosulfonato de sodio-DOBS) y EDTA disódico se midió después de la incubación en condiciones definidas y la actividad residual se determinó por medio del ensayo con AAPF. Los reactivos usados fueron dodecilbencenosulfonato, sal sódica (DOBS, Sigma núm. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma núm. P-8074), EDTA disódico EDTA (Siegfried Handel núm. 164599-02), HEPES (Sigma núm. H-7523), tampón sin estrés: HEPES 50 mM (11 .9 g/l) + TWEEN®-80 al 0.005 %, pH 8.0, tampón con estrés: HEPES 50 mM (1 1.9 g/l), DOBS al 0.1 % (p/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0, sobrenadantes del cultivo de la proteasa de referencia y la variante de la proteasa que contenían 200 - 400 pg/ml de proteína. El equipo usado fue MTP de fondo en V o en U como placas de dilución (Greiner 65 101 y 650161 , respectivamente), MTP de fondo en F (Corning 9017) para el tampón sin estrés y tampón de LAS/EDTA y también para las placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices), incubador/agitador ¡EMS (1 mm de amplitud) (Thermo Electron Corporation) y cinta selladora Nunc (236366).
El incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) se configuró en 29 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que contenían tampón sin estrés hasta una concentración de ~ 25 ppm (placa de dilución maestra). Después se añadieron 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón sin estrés para producir una concentración de incubación final de 2.5 ppm. El contenido se mezcló y se mantuvo a temperatura ambiente y se realizó un ensayo con AAPF en esta placa. Después se añadieron, además, 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón con estrés (HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1 % (p/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0). Las soluciones se mezclaron y se colocaron inmediatamente en un agitador iEMS a 29 °C por 30 min a 400 rpm. Después de 30 minutos de incubación se realizó un ensayo con AAPF en la placa de estrés. Se determinó la estabilidad de las muestras mediante el cálculo de la relación de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente manera: actividad residual (%) = [mOD. min-1 con estrés]*100 / [mOD. min-1 sin estrés]. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de rendimiento tal como se describe más abajo. Índice de rendimiento El índice de rendimiento provee una comparación del rendimiento de una variante (valor real) y una enzima proteasa estándar o de referencia (valor teórico) con la misma concentración de proteínas. Los valores teóricos pueden calcularse con los parámetros de una curva de rendimiento dosis-respuesta (es decir, con una ecuación de Langmuir para generar la curva de rendimiento) de la proteasa estándar/de referencia. Un índice de rendimiento (Pl) mayor que 1 (Pl>1) identifica una variante mejorada en comparación con la proteasa estándar o de referencia (que puede ser, p. ej., una proteasa silvestre u otra variante de la proteasa), mientras que un Pl de 1 (Pl=1) identifica una variante que tiene el mismo desempeño que la proteasa estándar o de referencia, y un Pl menor que 1 (Pl<1) identifica una variante que tiene un desempeño peor que la proteasa estándar o de referencia. Así, el Pl identifica las mejores opciones (p. ej., variantes que tienen una actividad proteolitica mejorada en comparación con la de la proteasa estándar/de referencia) además de variantes que pueden ser menos deseables para usar en ciertas circunstancias (p. ej., variantes que tienen una actividad proteolitica menor que la actividad proteolitica de la proteasa estándar/de referencia).
Debe mencionarse que las variantes de la proteasa de la invención que tienen valores de índices de rendimiento menores que el de una proteasa estándar o de referencia son igualmente útiles en las aplicaciones y métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, las variantes de la proteasa de la invención que tienen valores del índice de rendimiento menores que el de una proteasa de referencia o estándar tienen actividad proteolitica y, por ello, son útiles en las composiciones de la invención, tales como, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza (que incluyen, pero no se limitan a, p. ej., composiciones detergentes de limpieza) para limpiar diversas superficies y artículos que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, lavandería, telas y loza, y en aplicaciones y composiciones para el cuidado personal tal como se describieron en otra parte de la presente descripción; dichas variantes de la proteasa son, además, útiles en productos y composiciones para el cuidado de las telas y el hogar y en productos y composiciones que no son para el cuidado de las telas y el hogar descritos en otra parte de la presente descripción y en métodos de la invención que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, métodos de limpieza, métodos para el cuidado personal, etc., descritos en otra parte de la presente descripción.
Varios términos establecidos más abajo se usan para describir la variante: las variantes no perjudiciales tienen un Pl >0.05; las variantes perjudiciales tienen un Pl menor o igual a 0.05; las variantes combinables son aquellas para las cuales la variante tiene valores de índice de rendimiento mayores o iguales a 0.2 para al menos una propiedad y >0.05 para todas las propiedades. Las variantes combinables son aquellas que pueden combinarse para suministrar proteínas con índices de rendimiento apropiados para una o más propiedades deseadas. Estos datos son útiles en la ingeniería de cualquier subtilisina/subtilasa o proteasa. Aun cuando la subtilasa o proteasa que se diseñará por ingeniería tiene un aminoácido diferente al de la subtilisina BPN' en una o más posiciones específicas, estos datos son útiles para identificar sustituciones de aminoácidos que alteran las propiedades deseadas mediante la identificación de las mejores elecciones para las sustituciones que incluyen las sustituciones del aminoácido silvestre de BPN'.
Ejemplo 2 Construcción de una genoteca de BPN' y rendimiento de limpieza de las variantes de BPN' a) Descripción del cásete de expresión de BPN'-v3 usado para construir la genoteca El cásete de expresión de BPN'-v3 (proteasa de BPN' que contiene sustituiciones G097A-G128A-Y217Q) usado para la construcción de la genoteca combinatoria se generó con el cásete de expresión de BPN' que comprende la secuencia líder híbrida del aprE-BPN' (es decir, la secuencia señal), la prosecuencia de BPN' y la secuencia madura de BPN' de B. amyloliquefaciens. La secuencia de ADN se muestra más abajo como la SEQ ID NO: 1 y codifica la proteína precursora de BPN' que se muestra más abajo como la SEQ ID NO:168.
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTA GCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGG CAGGGAAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACA ATGAGCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGG CGGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACAT TAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTAC GTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTAC GGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTG GATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCGAGCCA TCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCCGAAACA AACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCAGGAACG GTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCCCCGTCTG CTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGGCGCAGACGGATCAGGCCAATA CTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGAT GTAATCAACATGAGCCTGGGAGGACCAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAA GCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGTAGTAGCGGCAG CTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCGTCGGTTATCCAG GCAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAGACTCTTCAAATCA ACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGATGTCATGGCCCCT GGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAAGTATGGTGCGTATA ACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGGGGCGGCCGCATTGA TTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTT AGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAAGGG CTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG (SEQ ID N0 1 ) En la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 , la secuencia de ADN que codifica la proteasa madura se muestra en negritas, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder (secuencia líder híbdrida del aprE-BPN') se muestra en texto común (sin subrayar) y la secuencia de nucleótidos que codifica la prosecuencia (???') está subrayada. En la secuencia de aminoácidos (secuencia líder híbrida del aprErBPN', prosecuencia de BPN' y secuencia proteica madura de BPN') del precursor de la proteína de BPN' indicada en la SEQ ID NO:168, la parte en negritas indica la proteasa subtilisina de BPN'.
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFK QTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAY VEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDL KVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAV KVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVA SG VWVAAAG N EGTSGSSSTVGYPG KYPSVIAVG AVDSSNQRASFSS VG PE LDV APGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQV RSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID NO: 168).
La secuencia de aminoácidos de la proteasa subtilisina BPN' madura se muestra como la SEQ ID NO:2.
La secuencia de nucleótidos del gen BPN'-v3 maduro es la correspondiente a la SEQ ID NO:3 (la secuencia señal y la secuencia de propéptidos usadas en el cásete de expresión de BPN'-v3 es la misma que para el BPN' que se muestra en la SEQ ID NO: 1). La secuencia proteica de la variante de la proteasa de BPN'-v3 madura es la correspondiente a la SEQ ID NO:4 (la secuencia señal y la secuencia de propéptidos usadas en el cásete de expresión de BPN'-v3 son las mismas que para el BPN' que se ilustra en la SEQ ID NO-.168). b) Construcción de una qenoteca combinatoria con el plásmido pHPLT-BPN'-v3 El plásmido pHPLT-BPN'-v3 (ver la Figura 1 ) que contiene el cásete de expresión de BPN'-v3 descrito anteriormente se usó como ADN molde para clonación para proveer variantes derivadas de BPN'-v3. El vector pHPLT (Figura 4 en la patente de los EE. UU. núm. 6,566,112) contiene el promotor LAT de B. licheniformis ("Plat"), una secuencia que codifica el péptido señal de LAT ("preLAT"). Otros elementos plasmídicos del plásmido pUB1 10 descrito en McKenzie y col., Plasmid 15(2): 93-103 (1986), son: "ori-pUB", origen de la replicación a partir de pUB1 10; "neo", gen de resistencia a la neomicina/canamicina de pUB1 0¡ "terminador", terminador transcripcional de la amilasa de ß. licheniformis.
Una genoteca de ADN combinatoria se sintetizó en DNA 2.0 y se suministró como reacciones de ligación individuales. En algunos casos, para la transformación eficaz de B. subtilis, el ADN de las mezclas de reacción de ligación se amplificó mediante amplificación por circulo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) con el estuche lllustra Templiphi (GE Healthcare). La reacción se realizó de conformidad con el protocolo del fabricante. Se usó un microlitro de ADN amplificado diluido diez veces para transformar 50 µ?_ de células competentes de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). La mezcla de transformación se agitó a 37 °C por 1 hora. Se colocaron alícuotas de diez microlitros de la mezcla de transformación en placas de agar Luria con leche descremada (1.6 %) suplementadas con 10 g/ml de neomicina (Teknova).
Los transformantes que formaron halos en las placas de leche descremada se recogieron en placas de microtitulación que contenían 150 µ? de medio de caldo de Luria (LB) suplementado con 10 pg/ml de neomicina. Las placas se cultivaron de la noche a la mañana a 37 °C con agitación a 250-300 rpm y una humedad de 70-80 % con tapas de Enzyscreen para placas de microtitulación (Enzyscreen). Con una herramienta de replicación de 96 pasadores (Enzyscreen) se usó la placa de cultivo de la noche para inocular una placa de microtitulación nueva que contenía 180 µ? de medio de MBD (un medio definido basado en MOPS) con 2.5 pg/ml de neomicina. El medio de MBD se preparó, prácticamente, tal como se conoce en la industria (ver Neidhardt y col., J. Bacteriol. 119:736-747
[1974]), salvo que se omitió el NH4CI, FeSO4 y CaCI2 del medio de base, se usó K2HPO4 3 mM y el medio de base se suplemento con urea 60 mM y 100 mi de una solución preparada con 210 g/L de glucosa y 350 g/L de maltodextrina. Se añadió 1 g/L de extracto de Bacto-levadura BD y se ajustó el pH hasta 7.4 con KOH. Los micronutrientes se formaron con una solución de reserva 100X que en un litro contenía 400 mg de FeSO4-7H2O, 100 mg de MnS04 H20, 100 mg de ZnS0 7H20, 50 mg de CuCI2-2H20, 100 mg de CoCI2-6H20, 100 mg de NaMo04-2H20, 100 mg de Na2B4O7-10H2O, 0 mi de CaCI2 1 M y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. El medio de MBD que contenía placas de microtitulación se cultivó durante 64 horas a 37 °C, 250-300 rpm y 70-80 % de humedad con tapas de Enzyscreen (Enzyscreen) para la expresión de la variante de la proteasa. Al día siguiente los cultivos se filtraron a través de una microplaca de filtro (0.22 um; Millipore) y los filtrados resultantes que contenían las variantes de la proteasa se usaron para análisis bioquímicos.
Las variantes de la proteasa se probaron para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8 y con el ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 2 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v3 (con un valor Pl de 1) según el Método de prueba 3.
Se determinó que la siguiente variante de la proteasa subtilisina BPN' tenía un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos G097A-G128A-P210S-Y21 7Q en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dicha variante tiene un valor de Pl de 1.1 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza de micromuestra de BMI y una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor de Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) en este ensayo; la variante tiene una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos G097A-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con la SEQ ID NO:2 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y que comprende sustituciones de aminoácidos G097A-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que el de BPN' (SEQ ID NO:2) y/o BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende sustituciones X097A-X128A-X210S-X217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y, opcionalmente, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de G097A, G128A, P210S y Y217Q. Dicha variante de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden esa variante de proteasa y métodos de limpieza que emplean esa variante tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 (es decir, un valor del Pl aproximadamente equivalente al de BPN'-v3) en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, G097A-G128A-E156S-P210S-Y2 7Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A, G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S y G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID N0:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl de 1.0 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X097A, X104F, X128A, X156A/S, X210I/S, X217Q, X218A/S y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de G097A, Y104F, G128A, E156A/S, P210I/S, Y217Q y N218A/S, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID N0.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S y G097A-G128A-Y217Q-N218A, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO.2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218A y G097A-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO.2 y comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X097A, X104F, X128A, X156A/S, X210I/S, X217Q, X218A/S y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de G097A, Y104F, G128A, E156A/S, P210I/S, Y217Q y N218A/S, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la posición de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q (es decir, BPN'-v3), G097A-G128A-E156S-P210S-Y217Q y G097A-G128A-P210S-Y217Q-N218S, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica y una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-E156A-P210S-Y217Q-N218S, G097A-G128A-Y217Q-N218A y G097A-Y104F-G128A-E156S-P210I-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID N0:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 3 Generación de genotecas combinatorias y rendimiento de limpieza de variantes de BPN'-v3 + S78N a) Descripción de la variante de BPN'-v3 + S78N y secuencias génicas sintéticas derivadas de esta variante Gene Oracle sintetizó y clonó ocho genes en el plásmido parental pHPLT-BPN'-v3 + S78N (BPN'-S78N-G97A-G128A-Y217Q) (ver la Figura 2). Algunos de estos genes se usaron como molde (patrones) para crear genotecas combinatorias. La variante de BPN'-v3 + S78N se generó con métodos de biología molecular estándar conocidos en la industria. La secuencia de nucleótidos que codifica la variante de BPN'-v3 + S78N es la de la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la variante de BPN'-v3 + S78N es la de la SEQ ID NO:8. Las secuencias nucleotidicas y proteicas de genes GcM90-96 y GcM100 se muestran más abajo. b) Construcción de genotecas combinatorias CG1-CG5 y CG8 con los genes sintéticos GcM90-94 y GcMl OO Cada gen sintetizado se construyó en la molécula parental de pHPLT-BPN'-S78N-G97A-G128A-Y217Q. Los plásmidos resultantes que contenían los seis genes sintetizados GcM90-94 y GcMl OO se usaron como moldes para hacer genotecas en las posiciones respectivas (Tabla 3-1 ). Además, se sintetizaron dos genes adicionales, GcM95 y GcM96, para el análisis, pero no sirvieron como ADN parental para las genotecas. Cada uno de estos genes tiene nueve mutaciones en la parte superior de la molécula parental de pHPLT-BPN'- S78N-G97A-G128A-Y217Q.
Los plásmidos parentales (ADN molde) que contenían los genes sintéticos GcM90-94 y GcMlOO se metilaron con dos microgramos de ADN y metilasa (NEB) de conformidad con el protocolo de NEB. Después, el ADN metilado se purificó con un estuche "DNA Clean and Concentrator kit" (Zymo Research). Se prepararon genotecas combinatorias CG1-5 y CG8 con un estuche para mutagénesis dirigida a múltiples sitios "QUIKCHANGE® Multi Site-Directed Mutagénesis kit" ("estuche QCMS"; Stratagene) según el protocolo del fabricante (ver la Tabla 3-1 las combinaciones de molde e iniciador respectivas), excepto las genotecas CG3 y CG4 que usaron 86.5 ng de cada iniciador en lugar de los 50 ng recomendados en el protocolo. Todos los iniciadores usados para introducir las sustituciones deseadas en cada genoteca se enumeran en la Tabla 3-1. Estos iniciadores fueron sintetizados y suministrados por Integrated DNA Technologies. Una vez que se completaron las reacciones de QCMS para cada genoteca se realizó la digestión del ADN molde mediante la adición de 0.5 -1 µ? Dpn\ (del estuche QCMS) y se incubó a 37 °C por 1 - 4 horas seguido de otra adición de 0.5 - 1 µ? de Dpn\ y otra incubación a 37 °C por 1-4 horas. Para la transformación eficaz de B. subtilis se amplificó ADN de las mezclas de reacción de QCMS antes de la transformación y los transformantes se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2.
Se produjeron variantes adicionales de BPN'-v3+S78N en DNA 2.0. Las siguientes sustituciones se introdujeron individualmente en la molécula parental de BPN'-v3+S78N: Q59G, N62Q, V68A, S89Y, A92G, I108V, I115V, 124T, P129L, A138T, V147L, S161P, Y167A, P172V, G211T, L267V y A273S.
Todas las variantes de genotecas combinatorias descritas anteriormente y las variantes sintetizadas en DNA2.0 se probaron para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI del Método de prueba 3 en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8 y con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 2 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a la enzima de la SEQ ID NO:4 (con un valor del Pl de 1 .0).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a la enzima de la SEQ ID NO:4 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q-T244N, N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A, S053G-S078N-G097A-G 128A-P 129T-Q 185T-Y217Q, S063T-S078N-G097A-S 101 A-G128A-S183T-Y217Q, S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q, S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I y S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' y BPN'-v3 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, ,93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X040E, X053G, X059V, X061A, X062H/Q, X068A, X078N, X087E, X101A, X102A, X108V, X124I, X125A, X126V, X129T, X147Q, X159D, X183T, X185T, X211A, X224A, X244I/N, X252Q y X274D y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de X040E, X053G, X059V, X061A, X062H/Q, X068A, X078N, X087E, X101A, X102A, X108V, M124I, S125A, L126V, P129T, V147Q, S159D, S183T, Q185T, G21 1A, S224A, T244I/N, N252Q y A274D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a la enzima de la SEQ ID NO:4 (mencionada alternativamente como BPN'-v3) en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A, Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q, S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q, S078N-G097A-G128A-G21 1A-Y217Q, S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q, S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q, S078N-G097A-G128A-Y217Q, S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A y S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que la siguiente variante de BPN' tenia un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende ese conjunto de sustituciones de aminoácidos anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G21 A-Y217Q-N252Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G211A-Y217Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G21 1A-Y217Q-N252Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q y S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tienen un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-S183T-Y217Q, S063T-S078N-G097A-S101 A-G128A-S183T-Y217Q-T244N, S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q y S063T-S078N-G097A-S101A-G128A-Y217Q-T244I, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una vanante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, N061A-S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A, N061A-S078N-S087E-G097A-G128A-Y217Q-S224A, Q059V-S078N-G097A-G128A-G211A-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-G128A-Y217Q, Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-Y217Q-N252Q, S053G-S078N-G097A-G 28A-P129T-Q185T-Y217Q, S053G-S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q, S078N-G097A-G128A-G21 1A-Y217Q, S078N-G097A-G128A-P129T-Y217Q, S078N-G097A-G128A-Q185T-Y217Q, S078N-G097A-G128A-Y217Q, S078N-G097A- G128A-Y217Q-S224A y S078N-G097A-G128A-Y217Q-S224A-A274D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO: 2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de aproximadamente 1 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tienen un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S078N-G097A-G128A-V147Q-Y217Q y S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar un artículo o superficie que necesita limpieza con al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Q059V-S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G21 1A-Y217Q-N252Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-G21 1A-Y217Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V1 7Q-G21 1A-Y217Q-N252Q, S078N-G097A-I108V-G128A-V147Q-Y217Q-N252Q y S078N-S087E-G097A-M124I-G128A-Y217Q-S224A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar un articulo o superficie que necesita limpieza con al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 4 Generación y rendimiento de limpieza de variantes de BPN' Generación de variantes de BPN' LC1-LC4 por medio de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE® Se construyeron variantes de BPN' a partir de distintos plásmidos parentales con estuches para mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE®. Los plásmidos parentales (Tabla 4-1) se metilaron con el estuche de Dam metilasa de NEB en una reacción que contenia 77.5 µ!_ de H20 + 10 pL de tampón 10X + 0.25 pl_ de SAM + 2 uL de DAM metilasa + 10 uL de ADN miniprep (-150 ng/pL) a 37 °C de la noche a la mañana. El ADN plásmido metilado se purificó con un estuche de purificación de PCR QIAGEN®. Las reacciones de mutágenesis dirigidas a múltiples sitios QUIKCHANGE® se establecieron para cada molde de ADN en una mezcla de reacción que contenía 2.5 pL de tampón 5X + 0.5 pL de iniciador 1 (25 µ?) + 0.5 pL de iniciador 2 (25 µ?) + 1 pL de dNTP's + 1 pL de mezcla de enzimas + 18 pL de H20 + 1.5 pL de ADN. El programa de PCR usado fue: 95 °C por 1 min; (95 °C por 1 min, 53 °C por 1 min, 65 °C por 9:39 min) x 29 ciclos; 65 °C por 10 min, retención a 4 X. Las secuencias de iniciadores se muestran en la Tabla 4-2. En todas las reacciones se realizó la PCR con un ciclador térmico MJ Research PTC-200 Peltier. Se extrajo el ADN parental de las muestras de PCR por medio de la adición de 1 pL de Dpn\ en reacciones de mutagénesis dirigidas a sitios múltiples QUIKCHANGE® a 37 °C de la noche a la mañana. Para aumentar la frecuencia de transformación, las reacciones digeridas con Dpn\ se amplificaron por medio de amplificación por circulo rodante (RCA) con el estuche lllustra TempliPhi de conformidad con el protocolo del fabricante. Las células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) se transformaron con 1 µ?_ de cada reacción de RCA y las células transformadas se colocaron sobre placas de LA + 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina y se incubaron a 37 °C de la noche a la mañana. Se seleccionaron colonias del crecimiento de la noche a la mañana para realizar PCR de colonias para secuenciación con "puReTaq Ready-To-Go PCR Beads': (Amersham). Se usaron los siguientes iniciadores de secuenciación y PCR pHPLT F1 (/5PHOS/TACATATGAGTTATGCAGTTTG (SEQ ID NO:54)) y pHPLT seq R1 (/5PHOS/TTATCCTTTACCTTGTCTC (SEQ ID NO:55)). Los clones con las secuencias apropiadas se congelaron. Se produjeron proteínas de la variante de BPN' mediante el cultivo de transformantes de B. subtilis en placas de microtitulación de 96 pocilios a 37 °C por 68 horas en un medio a base de MOPS que contenía urea tal como se describe en el Ejemplo 2.
Se produjeron 33 variantes de BPN' adicionales indicadas correlativamente como LC5 a LC37 en DNA 2.0 con ácido nucleico de BPN' como el gen parental contenido en el plásmido de expresión pHPLT-BPN' partial opt (ver la Figura 3). Las variantes LC5 a LC37 de BPN' fueron las siguientes, respectivamente: BPN'-P52L-V68A-G97A-I1 11V, BPN'-I111V-M124V-Y167A-Y217Q, BPN -Y104N-G128A-Y217Q, BPN'-M124V-Y167A-Y217Q, BPN'-I111V-M124V-Y217Q, BPN -P52L-V68A-G97A, BPN'-G97A-I111V-M124V, BPN'-V68A-A92G-G97A, BPN'-G97A-I111V-M124V-Y167A-Y217Q, BPN'-P52L-V68A-I111V-Y217Q, BPN,-P52L-V68A-I11 1V, BPN'-V68A-A92G-I111V, BPN'-P52L-V68A-G97A-I111V-Y217Q, BPN'-V68A-G97A-I111V, ???'-697?-?1 1 ? -?217a, ???'-G97A-I111V-M124V-Y167A, BPN'-S89Y-I1 1 1 -M124V, BPN'-V68A-S89Y-I1 11V, BPN'-V68A-A92G-Y217Q, BPN -I1 11V-Y167A-Y217Q, BPN'-G97A-I11 1V-Y167A-Y217Q, BPN -G97A-I1 11 V-M124V-Y217Q, BPN'-V68A-I111V-Y167A-Y217Q, ???'-?1 1 ??-6128?-?2170, BPN'-G97A-M124V-Y217Q, BPN'-V68A-Y167A-Y217Q, ???'-?11 ??-?124?-?167?, BPN'-N62Q-G97A-I111V, BPN'- G97A-M124V-Y167A-Y217Q, ???·-097?-?_126?-?2170, BPN'-V68A-I111V-Y217Q, BPN'-S89Y-M124V-Y217Q y BPN'-L96T-G97A-Y217Q. Además, DNA 2.0 creó el plásmido pHPLT-BPN' partial opt.
Se recogieron transformantes en placas de microtitulación y se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Las variantes se probaron con respecto al rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 2 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteina con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v3 (con un valor del Pl de 1.0).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenian un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-I111V-M124V-Y217Q, G097A-I11 1V-Y167A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N06 P-G097A-S101 N-G128A-V203Y-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128S-V203Y-Y217Q y V068A-A092G-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID N0:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X024G, X025G, X052L, X053G, X055P, X061 P, X062Q, X068A, X089Y, X092G, X096T, X097A, X101 N, X104N, X111V, X124V, X126A, X128A S, X167A, X203Y y X217Q y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de S024G, N025G, P052L, S053G, T055P, N061P, N062Q, V068A, S089Y, A092G, L096T, G097A, S101N, Y104N, I111V, M124V, L126A, G128A S, Y167A, V203Y, Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, G097A-G128S-Y217Q, G097A-I11 1V-Y217Q, I111V-G128A-Y217Q, 11 1 1V-M124V-Y167A, I111V-M124V-Y217Q, L096T-G097A-Y217Q, N062Q-G097A-I 1 1 1V, S053G-N061 P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q, S089Y- 124V-Y217Q y V068A-I1 11V-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad protéolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la secuencia de la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor de Pl mayor que BPN' y un valor del Pl de 1.0 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-I1 1 1V-M124V, G097A-L126A-Y217Q, G097A-M124V-Y217Q, I 11V-Y167A-Y217Q, M124V-Y167A-Y217Q, P052L-V068A-G097A, S089Y-I11 1V-M124V, V068A-A092G-G097A, V068A-A092G-I1 1 1V, V068A-G097A-I1 11V, V068A-S089Y-I1 1 1V y Y104N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-M124V-Y167A-Y217Q, V068A-Y167A-Y217Q, G097A-I111V-M124V-Y167A, 11 11V-M124V-Y167A-Y217Q, V068A-I1 11V-Y167A-Y217Q, G097A-I11 1V-M124V-Y167A-Y217Q, P052L-V068A-I111V, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 5 Rendimiento de limpieza de variantes de BPN' Se prepararon variantes basadas en BPN' parental en DNA 2.0. Las variantes se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2 y se probaron para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8, ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8 y ensayo de micromuestras de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v3 (con un valor del Pl de 1 .0).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101 N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101 N-I111V-G128S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q, G097A-G128S-P210S-Y217Q, G097A-I111V-M124I-Y217Q, G097A-I1 11V-M124V-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-Y217Q, N061 P-G097A-G128A-P210S-Y217Q, N061 P-G097A-G128S-Y217Q, N061 P-G097A-I11 1V-M124V-Y217Q, N061 -G097A-N123Q-Y217Q, N061 P-G097A-S101 N-I11 1V-M124V-Y217Q, N061 P-G097A-S101 N-N123Q-Y217Q, N061 P-G102A-P129S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-S101 N-I1 11V-Y217Q, N061 P-S078N-G097A-I1 1 1V-M124I-Y217Q, N061 P-S078N-G102A-I1 1 1V- P129S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q, N062Q-G097A-I1 1 -Y217Q, N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-111 1 -M 12 V-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S 101 N-N 123Q-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-N062Q-G097A-S101 N-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-G128S-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-I1 1 V-M124V-Y217Q, S053G-N061 P-G102A-P129S-P210S-Y217Q, S053G-N061 P-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, S053G-N061P-N062Q-G097A-S101 N-I111V-Y217Q, S053-N061 P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-S078N-G097A-I 1 V-G128S-Y217Q, S078N-G097A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I1 1 1V-M124V-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N061 P-G097A-M124I-Y217Q, N061 P-G097A-M124V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q, N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-N123Q-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 o 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X024G, X025G, X053G, X061 P, X062Q, X078N, X097A, X100D/N/Q, X101 N, X102A, X1 1 1V, X123A/Q V, X124I V, X128A S, X129S, X210S, X217Q y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de S024G, N025G, S053G, N061 P, N062Q, S078N, G097A, G100D/N/Q, S101 N, G102A, I1 1 1V, N123A/QA , ?124??/, G128A/S, P129S, P210S y Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-N123A-Y217Q, G097A-N123V-Y217Q, N061 P-G102A-G128S-Y217Q, N061 P-S101 N-G102A-G128S-Y217Q, Y217Q, S078N-G097A-I 11V-N123Q-Y217Q y G102A-N123Q-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes vanantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N061 P-G097A-G128S-Y217Q, N061 P-G097A-S101 N-G 28A-P210S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-S101 N-I111V-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G 28A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101 N-G128S-Y217Q y S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-I11 V-G128S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID N0:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q, G097A-G128S-P210S-Y217Q, G097A-I111V-M124I-Y217Q, G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-Y217Q, N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q, N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q, N061P-G097A-M124V-Y217Q, N061P-G097A-N 23Q-Y217Q, N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q, N061P-G102A-P129S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N061P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111V-Y217Q, N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q, N061P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S101N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-S101 N-1111V-Y217Q, S053G-N061 P-S101 -G102A-P129S-Y217Q, S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q, S078N-G097A-G128S-Y217Q y S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la vanante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tienen un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N061 P-G097A-M124I-Y217Q, N061 P-G097A-S101 N-N123Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-P210S-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S10 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-I111V-M124V-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101 N-N123Q-Y217Q y S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100N- S101 N-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-N123A-Y217Q, G097A-N123V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q, N061 P-S101 N-G102A-G128S-Y217Q, Y217Q, N061 P-G102A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I111 -N123Q-Y217Q y G102A-N123Q-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende el conjunto de sustituciones de aminoácidos N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende sustituciones de aminoácidos N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128A-Y217Q, N061 P-G102A-P129S-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N06 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S- Y217Q, N061 P-G097A-G128A-P210S-Y217Q, G097A-G128S-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-I111V-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S 101 N-G128S-Y217Q, N061 P-G097A-G128S-Y217Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una vanante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la vanante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N06 P-G097A-M124I-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q, G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-P210S-Y217Q, S053G-N061 P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N062Q-G097A-I111V-Y217Q, N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q, G097A-N123Q-Y217Q, N061P-G097A-I111V-M124V-Y217Q, S078N-G097A-I111V-M124V-Y217Q, S053G-S078N-G097A-I111V-G128S-Y217Q, S078N-G097A-G128S-Y217Q, S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G 100Q-P210S-Y217Q , N061 P-G097A-N 123Q-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101N-M124I-Y217Q, S053G-N061P-G097A-M124I-Y217Q, N061P-S078N-G097A-I111V-M124I-Y217Q, N061P-G097A-M124V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-G100N-S101N-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S101 -G102A-P129S-Y217Q, N061 P-S078N-G102A-I111 -P129S-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-N062Q-G097A-S101N-I111V-Y217Q, N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101 -I111V-M124V-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q, G097A-I111V-M124I- Y217Q, Y217Q, N061 P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I1 11V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q, N061 P-S101 N-G102A-G128S-Y217Q, G097A- 123V-Y217Q, G097A-N123A-Y217Q, G102A-N123Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-S101 N-Y217Q, S078N-G097A-I1 11V-N123Q-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q y N061 P-G102A-G128S-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 0.9 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1.0 y hasta aproximadamente 5 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C¡ la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X024G, X025G, X053G, X061 P, X062Q, X078N, X097A, X100D/N/Q, X101 N, X102A, X111V, X123A/QA , ?124??/, X128A/S, X129S, X210S y X217Q y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de S024G, N025G, S053G, N061 P, N062Q, S078N, G097A, G100D/N/Q, S101 N, G102A, I1 1 1V, N123A/Q/V, M124I/V, G128A/S, P129S, P210S y Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 6 Construcción y rendimiento de limpieza de variantes de BPN' Se preparó una genoteca combinatoria de BPN' basada en BPN' parental en DNA2.0 y se suministró como una reacción de ligación. Para la transformación eficaz de B. subtilis se amplificó ADN a partir de las mezclas de reacción de ligación antes de la transformación y los transformantes se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Estas variantes se probaron para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI del Método de prueba 3 en lá Composición detergente 1 y en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8 y también con un ensayo de micromuestras de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA y la actividad de proteasa se probó con el ensayo de AAPF. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v3 (con un valor del Pl de 1.0).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S 01 N-G128A-Y217Q, N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A-G 28A-Y217Q , S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P- S101 N-G128A-Y217Q , S053G-T055P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q y T055P-N061P-S078N-G097A-S101 -G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128S-Y217Q, G097A-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A- G128A-Y217Q, S024G-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S024G-I035V-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-G128A-S130G-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S 101 ?-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S038G-S053G-S078N-S 01 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-G097A-A116S-G128A y T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1 .0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X024G, X025G, X035V, X038G, X053G, X055P, X061 P, X078N, X097A, X101 N, X116S, X128A/S, X130G, X216Q, X217Q y X249N y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de S024G, N025G, I035V, S038G, S053G, T055P, N061 P, S078N, G097A, S101 N, A116S, G128A/S, S130G, Y216Q, Y217Q y S249N, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q y T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI del Método de prueba 3 en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128S-Y217Q, G097A-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 -G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N06 P-S078N-G 28A-Y2 7Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G 28A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A- G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-I035V-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A, S024G-N025G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-G128A-S130G-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y2 7Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S 101 N-G 128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-N061 P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N061P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S038G-S053G-S078N-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A- Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A, S024G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061P-S101N-G128A- Y217Q , S053G-T055P-S078N-G097A-S 101 N-G 128?-?217Q , S101 -G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101 -G128A-Y217Q y ?055?-?061?-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la vanante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción .
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI del Método de prueba 3 en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en T055P-N061 P-G097A-A116S-G128A, S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica pueden tener una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N061 P-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N06 P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S053G-N061 P-S078N-G097A-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-T055P-G097A-G 128A-Y217Q , S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G097A-G128S-Y2 7Q, G097A-G128A-Y217Q, S024G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 -G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G 128A-Y2 7Q , S024G-N025G-N061 P-S078N-S 101 N-G128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G097A-S 0 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 -S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128A- Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-G097A-A1 16S-G128A, S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-I035V-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos de limpieza que comprenden el uso de al menos una de esas variantes, tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-G097A-S101 N-G128A, S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S10 -G128A-Y217Q-S249N, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G- T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S038G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S 01N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q y S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que la siguiente vanante de BPN' tenía un valor del Pl de aproximadamente 0.8 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende sustituciones de aminoácidos S024G-S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.8 con respecto a BPN'-v3, y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende sustituciones de aminoácidos S024G-S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1 a aproximadamente 12, mayor que 4 a aproximadamente 12, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo proteolítico de AAPF: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S024G-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S101N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061P-S101 -G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A, S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A, N061P-S101 -G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101N-G 128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G 28A-Y217Q, S024G- N025G-S053G-T055P-S078N-S101 -G128A-Y217Q, T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q-S249N, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, T055P-N061P-G097A-A116S-G128A, S024G-N025G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-G097A-S 01N-G128A- Y217Q, S053G-T055P-G097A-S 01N-G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, G097A-G128S-Y2 7Q, S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N06 P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S038G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 N- G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S053G-S078N-G097A-S 101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N- G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q, y S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-G128A-S130G-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO.2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con la proteasa de BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de AAPF; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Se determinó que la siguiente variante de BPN' tenía un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo proteolítíco de AAPF: secuencia de aminoácidos de BPN' (SEQ ID NO:2) que comprende sustituciones de aminoácidos G097A-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con la proteasa de BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 en este ensayo de AAPF; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 y que comprende sustituciones de aminoácidos G097A-G128A-Y217Q, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 7 Construcción de qenotecas de evaluación del sitio de BPN'-v36 y rendimiento de limpieza de variantes de BPN'-v36 Construcción de qenotecas de evaluación del sitio de BPN'-v36 La secuencia de aminoácidos de BPN'-v36 es la de la SEQ ID NO:6 y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de proteasa de BPN'-v36 es la de la SEQ ID NO:5.
La secuencia de aminoácidos de BPN'-v36 se puede representar por medio de referencia a la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de SEQ ID N0:2. Es decir, BPN'-v36 se puede representar como la secuencia de la subtilisina BPN' de la SEQ ID NO:2 con las seis sustituciones de aminoácidos S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q. La secuencia de aminoácidos BPN'-v36 puede designarse convenientemente como BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q o BPN'+S024G+S053G+S078N+S101 +G128A+Y217Q. A lo largo de esta especificación, a menos que se indique de cualquier otra forma, cada posición de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos se numera de conformidad con la numeración de una posición de aminoácidos correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens que se muestra en la SEQ ID NO:2 tal como se determina por medio de alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la variante con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens.
Se crearon genotecas de evaluación del sitio (SEL, por sus siglas en inglés) en cada posición de aminoácidos individuales en proteínas maduras de BPN'-v36 (es decir, BPN'-S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q) por medio de fusión por PCR.
Para cada codón que se mutará en la proteasa de BPN'-v36 se diseñó un par de iniciadores complementarios (iniciadores mutagénicos directos e inversos) parcialmente superpuestos. Cada iniciador mutagénico contenía el codón mutagénico NNS (N=A, C, G o T y S=G o C) en el centro flanqueado por al menos 15 nucleótidos en cada lado. Para crear una genoteca en una posición determinada se realizaron dos reacciones de PCR con un iniciador flanqueante de genes directo común (P4974, SEQ ID NO:60) y un iniciador inverso de NNS mutagénico o con el iniciador flanqueante de genes inverso común (P4976, SEQ ID NO:61 ) y un iniciador directo de NNS mutagénico. Las reacciones de PCR generaron dos fragmentos de PCR, uno que codifica la mitad del extremo 5' del gen muíante de BPN'-v36 (fragmento del extremo 5' del gen) y el otro que codifica la mitad del extremo 3' del gen mutante de BPN -v36 (fragmento del extremo 3').
Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador y 100 ng del ADN molde parental de BPN'-v36 (plásmido pHPLT-BPN'-v36, ver la Figura 4). Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 °C por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 (SEQ ID NO:62) y P4950 (SEQ ID NO:63) para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción BamH] y HincfiU y se ligó con el vector de pHPLT-BPN' partial opt que, además, se procesó por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por círculo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con la recomendación del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Se colocó una alícuota de la mezcla de transformación en placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 150 µ? de medio LB que contenia 10 pg/mL de neomicina. Al día siguiente, los cultivos se congelaron con glicerol al 15 % o se cultivaron en medio de MBD para análisis bioquímico, tal como se describe en el Ejemplo 2.
Rendimiento de limpieza de las variantes de BPN'-v36 Se probaron variantes de proteínas de BPN'-v36 SEL para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8 y un ensayo en micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v36 (es decir, BPN'-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 X: BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q (SEQ ID NO:6) (es decir, BPN'-v36) que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A116V, G160S, I1 1L, I115V, N109S, N117M, P005G, Q059V, T164S, Y262M, A015Q, A015S, A098E, A098N, A098S, A098T, A098V, A098Y, A114S, A114T, A116G, A116L, A116S, A116T, A116W, A133G, A133H, A133T, A133V, A137G, A137I, A137L, A137S, A137T, A138S, A216E, A216F, A216V, D099S, D181E, F261A, F261Q, G024F, G024I, G024Q, G024Y, G097S, G160T, G211 L, G211V, H017F, H017W, H039V, H226A, I031V, I111V, I268V, K170R, K265R, L016Q, L016T, L135M, L209T, L209V, L233M, L257T, L257V, L267A, L267V, N025A, N025I, N025Q, N025R, N025T, N025V, N101 I, N101Q, N101S, N109A, N109G, N109H, N109L, N109 , N109Q, N109T, N117Q, N184A, N184L, N184T, N184W, N212G, N212L, N212V, N243P, N252G, N252M, P005T, P014S, P040G, P040L, P040Q, P129A, P129S, P172G, P172S, P194Q, P210A, P210S, Q185F, Q185G, Q185I, Q185 , Q185N, Q185S, Q275H, R186K, S009A, S009G, S009H, S009M, S018T, S130T, S132N, S145K, S159T, S161 I, S161 K, S161 N, S161T, S162I, S162M, S162Y, S163G, S182F, S182G, S182V, S182W, S183F, S183L, S183M, S183T, S183V, S183W, S224A, S236T, S249V, T022A, T022G, T022Q, T022V, T208V, T242S, T253N, T253S, T254A, T254S, T255L, T255S, T255V, V004A, V004P, V004W, V084C, V139C, V165M, V203F, Y021 K, Y021 N, Y021T, Y021V, Y167F, Y171 F, Y214F, Y262F y Y262T, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que el de BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas vanantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de BPN"-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en BPN'-v36, A001G, A001Y, A013G, A013V, A015F, A015G, A015K, A015M, A015P, A015T, A015W, A015Y, A029G, A073S, A088C, A088I, A088L, A088T, A088V, A098D, A098K, A098P, A098R, A098W, A116D, A116E, A1 16R, A128S, A133L, A133M, A133S, A134G, A134S, A137N, A137V, A144M, A144Q, A144S, A144T, A144V, A151C, A176S, A176T, A179S, A216G, A216L, A216P, A216Q, A216S, A216T, A216Y, A228T, A230C, A231 C, A272I, A272L, A272Q, A272S, A272T, A272W, A273S, A274G, A274L, A274Q, A274T, A274V, D041 E, D099G, D099N, D120A, D120K, D120Q, D120R, D120S, D140E, D181S, D259E, E054D, E156D, E156T, E251V, F261 G, F261 H, F261 L, F261 R, F261 S, F261T, F261V, F261W, G007A, G007S, G020A, G020D, G020S, G024N, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G053H, G053K, G053N, G053T, G097A, G097D, G097T, G131A, G131 H, G131 P, G131Q, G131T, G131V, G160H, G160P, G166A, G166S, G166T, G21 1A, G211 D, G21 1 M, G211 N, G21 1 P, G21 1 Q, G21 1 R, G211W, G215A, G215N, G215V, H017L, H017M, H017T, H017V, H017Y, H039A, H039C, H039N, H226F, H226I, H226M, H226S, H226V, H226Y, I035V, I079A, I079S, I079T, I079V, I079W, 1108V, I115L, I122A, I234L, I234V, K012R, K027R, K136R, K141 F, K213W, K237R, K256R, K265Q, L016A, L016F, L016I, L016S, L016V, L042I, L075A, L075M, L075Q, L075V, L075Y, L082K, L082M, L082Q, L082V, L090I, L196I, L196V, L209Q, L209W, L233A, L233Q, L233V, L235I, L235K, L250I, L257A, L257H, L257Q, L257S, L257Y, L267Q, L267R, L267S, L267T, M199V, N025F, N025G, N025H, N025K, N025L, N025M, N025S, N025Y, N061 F, N061 H, N061 P, N061S, N061T, N061V, N061W, N076G, N076W, N078S, N078T, N078V, N101A, N101H, N101 L, N101T, N109K, N109R, N1 17A, N117E, N117H, N117K, N118G, N184G, N184H, N 184I, N184S, N184V, N212A, N212F, N212I, N212K, N212P, N212Q, N212S, N212Y, N218A, N218H, N218L, N218S, N240E, N240H, N240L, N240R, N240T, N243A, N243Q, N243T, N243V, N252A, N252K, N252L, N252Q, N252R, N252S, N252T, N269Q, N269S, P014G, P014Q, P014T, P040A, P040H, P040S, P040T, P040V, P040Y, P086A, P086C, P086F, P086H, P086S, P129D, P129G, P129K, P129T, P172A, P172Q, P194A, P194G, P194L, P194M, P194S, P194V, P194Y, P210G, P210R, P210V, Q002A, Q002S, Q010A, Q010F, Q010H, Q010I, Q010L, Q010N, Q010S, Q010T, Q019A, Q019G, Q019N, Q019S, Q019T, Q019V, Q019W, Q059I, Q103L, Q103S, Q185A, Q185H, Q185L, Q185T, Q185Y, Q206P, Q206S, Q206Y, Q217I, Q217N, Q217S, Q217T, Q245K, Q275D, Q275S, Q275W, S003A, S003G, S003H, S003M, S003P, S003Q, S003T, S003V, S009I, S009L, S009P, S009T, S009W, S018A, S018G, S018I, S018L, S018M, S018N, S018P, S018V, S018W, S033T, S037Q, S037T, S037V, S038G, S038H, S038K, S038Q, S038T, S063K, S063N, S063Q, S063T, S087A, S087F, S087G, S087Q, S087T, S089L, S089M, S089N, S089Q, S089T, S089W, S130A, S130F, S130G, S130L, S130V, S145A, S145H, S145M, S145V, S159A, S159G, S159H, S159Q, S159R, S161A, S161G, S161 H, S161 L, S161 M, S161 P, S161 Q, S161W, S162A, S162F, S162G, S162L, S162N, S162P, S162R, S162V, S163P, S173A, S173G, S182A, S182H, S182K, S182L, S182N, S182P, S182Q, S182T, S183A, S183G, S183H, S1 83Q, S188A, S188G, S188T, S188V, S191A, S204A, S204I, S204L, S204Q, S204V, S224C, S236A, S236N, S236Q, S248A, S248F, S248G, S248I, S248K, S248L, S248M, S248N, S248Q, S248T, S248V, S249A, S249C, S249H, S249Q, S249T, S249W, S249Y, S260H, S260N, S260P, S260T, T022H, T022K, T022N, T022R, T022S, T022Y, T055A, T055G, T055L, T055N, T055P, T055Q, T071S, T158H, T158S, T164N, T208C, T208L, T220S, T242N, T244A, T244G, T244H, T244I, T244Q, T244S, T244V, T244W, T253A, T253G, T253H, T253Q, T254V, T255A, T255G, T255H, T255I, T255Q, T255Y, V004G, V004N, V004R, V008A, V008C, V008M, V026I, V044I, V044L, V045H, V045K, V045L, V045M, V045Q, V045S, V045V, V045W, V045Y, V051 I, V081L, V081Q, V081T, V084A, V084S, V084T, V093I, V121 I, V143N, V143S, V143Y, V147C, V147I, V147L, V147T, V180I, V180L, V180T, V192A, V192S, V192T, V198I, V198L, V198M, V203H, V203I, V203L, V203N, V203Q, V203T, V203W, V203Y, V270A, V270S, V270T, W241 M, W241Y, Y006G, Y006H, Y006I, Y006K, Y006L, Y006P, Y006Q, Y006T, Y006V, Y006W, Y021A, Y021 D, Y021 E, Y021 L, Y021 Q, Y021 R, Y021S, Y104F, Y104I, Y214L, Y214V, Y214W, Y262A, Y262G, Y262L, Y262N, Y262S, Y262W, Y263G, y Y263W, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Asi, por ejemplo, la invención incluye la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende la sustitución A128S, por ejemplo, BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128S-Y217Q. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionados de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Con el Método de prueba 3 se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de BPN -S024G-S053G-S078N-S10 N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A001 F, A001K, A001 L, A001 M, A001 Q, A001 R, A001 S, A001T, A001V, A013C, A013S, A015D, A015E, A015L, A015R, A048S, A073N, A073T, A074G, A074S, A085C, A085G, A085S, A085V, A088M, A088S, A092S, A098G, A114G, A133P, A137E, A137H, A144G, A144H, A144K, A144L, A144N, A153S, A153V, A176C, A179G, A187G, A187S, A20OG, A216W, A223S, A228S, A230T, A230V, A231V, A232C, A232V, A272E, A272G, A272K, A272P, A273G, A273L, A273V, A274M, A274R, D036E, D099A, D099Q, D120E, D181A, D181 G, D259A, D259G, D259Q, D259T, E156A, E156S, E251 I, E251 L, E251Q, E251T, F058Y, F261 C, F261 D, F261 K, F261 P, G020E, G020F, G020H, G020L, G020N, G020Q, G020R, G020T, G020Y, G024A, G024P, G053A, G053D, G053E, G053F, G053L, G053Q, G053S, G053Y, G097K, G097M, G157A, G157S, G160A, G160L, G166C, G166I, G166Q, G169A, G211 K, G215H, G215L, G215S, G215T, G215W, G258S, H017I, H039S, H226L, H238N, H238Y, I01 1 L, I011V, I031 L, I079F, I079K, I079L, I079M, I079Q, I205A, 1205V, I268L, I268M, K012G, K043F, K043H, K043I, K043N, K043Q, K043T, K141A, K141 R, K141W, K170A, K213A, K213G, K213H, K213I, K213L, K213N, K213Q, K213R, K213S, K213T, K213V, K237A, K237H, K237I, K237L, K237N, K237S, K256A, K256G, K256H, K256M, K256P, K256Q, K256W, K265H, L016E, L042V, L075G, L075H, L075I, L075T, L082A, L082F, L082H, L082R, L082S, L082T, L090 , L135F, L196M, L209C, L209H, L209S, L233S, L235M, L235R, L235W, L257C, L257G, L267F, M050Y, M119C, M119I, M124L, N025C, N025E, N025P, N061A, N061 G, N061 I, N061 K, N061 L, N061Q, N061 R, N062S, N062T, N076A, N076P, N076Q, N076S, N076T, N076V, N078G, N078H, N078K, N078P, N078Q, N078R, N101 F, N117R, N1 17S, N1 18D, N1 18H, N1 18Q, N1 18R, N118S, N118T, N184C, N184E, N184R, N212D, N212R, N212W, N218F, N218G, N218M, N218P, N218T, N218V, N218W, N240A, N240G, N240Q, N240S, N240W, N243C, N243G, N243S, N252V, N269H, P005A, P005D, P005M, P005Q, P014A, P014M, P014R, P014V, P040F, P040R, P040W, P129E, P129R, P172E, P172K, P194H, P194R, P194W, P201A, P201G, P210L, P239K, P239R, Q002D, Q002E, Q002G, Q002I, Q002P, Q002V, Q010D, Q010R, Q019C, Q019D, Q019E, Q019H, Q019L, Q019P, Q019R, Q059A, Q059E, Q059L, Q059S, Q059T, Q103W, Q185D, Q185K, Q185R, Q185W, Q206G, Q206H, Q206L, Q206V, Q206W, Q217E, Q217F, Q217H, Q217L, Q217V, Q245M, Q271A, Q271D, Q271 G, Q271 L, Q271 P, Q271T, Q271Y, Q275F, Q275L, Q275P, Q275R, S003D, S003F, S003K, S003R, S009K, S018D, S018R, S037A, S037G, S037K, S037L, S037P, S038M, S063A, S063F, S063G, S063M, S063R, S063Y, S087C, S087K, S087L, S087M, S087N, S087Y, S089A, S089D, S089F, S089G, S089H, S089I, S089K, S089R, S089V, S089Y, S130D, S1 30E, S130K, S130W, S145G, S145L, S145R, S145T, S159D, S159L, S159W, S161 E, S161 R, S162C, S162E, S162W, S163A, S182E, S182R, S1 83C, S183D, S183P, S183R, S188D, S188P, S204G, S204Y, S207G, S224G, S224T, S236C, S236G, S248D, S248H, S248R, S249E, S249L, S249R, S260A, S260G, S260K, S260Q, S260V, S260Y, T022L, T055D, T055E, T055I, T055K, T055M, T055S, T055V, T055Y, T158A, T158G, T158L, T1 58Q, T158V, T164K, T164Q, T208S, T244D, T244E, T244R, T253E, T253R, T253Y, T254G, T255D, T255E, T255K, T255R, V026A, V028I, V028L, V030I, V044C, V044P, V045E, V045G, V045N, V072L, V081A, V081G, V081 H, V081 S, V084I, V084M, V095A, V095C, V143A, V143F, V143H, V143Q, V143T, V143W, V147A, V147Q, V147S, V148I, V148L, V149C, V149I, V149L, V165L, V180A. V180C, V180 , V192C, V192F, V192I, V192Q, V192Y, V203A, V203G, V203K, V203S, V270C, V270L, V270P, W241 F, Y006A, Y006M, Y006N, Y006R, Y006S, Y021 C, Y091W, Y104V, Y104W, Y262C, Y262D, Y262E, Y262H, Y262I, Y262R Y262V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes pueden tener una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionados de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI del Método de prueba 3 en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID N0.6) de BPN'-S24G-S53G-S78N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A001 D, A001 H, A001N, A015C, A048C, A048E, A085T, A133R, A137R, A142C, A144D, A144R, A152S, A153G, A187P, A187Q, A187T, A187V, A216R, A230S, A272R, A273H, A273T, A274H, D036N, D036S, D181H, D181T, D259N, D259P, D259S, E156G, E156H, E156L, E156Q, E156V, E251C, F189S, F189T, F189W, F189Y, F261 E, G020C, G024D, G053M, G053R, G097R, G131D, G131 R, G157N, G160R, G160V, G166L, G166W, G211 E, G215D, G258A, G258D, G258P, 1011T, I031C, ?079?, I079R, I175L, I205C, ?012?, ?012?, ?027?, ?027?, K027S, ?043?, K043D, ?043?, K043G, K043L, ?043 , ?043?, K043V, K043W, ?043?, ?136?, ?141 ?, K141L, ?141 ?, ?141 ?, K141Q, ?141?, K141V, K170G, K170S, ?237?, K237V, K256D, K256S, ?256?, K256V, ?265?, K265S, L042F, L042M, L082E, L209A, L209E, L209G, L209R, L233G, L235V, L257D, L257E, L257P, L257R, L257W, L267E, M050L, N056D, N056S, N061C, N061D, ?062?, ?062?, N062L, N062V, ?062?, N076D, N076L, ?076?, N078D, N078F, N101 D, N101 R, ?118?, N212C, ?212?, N218C, N218D, ?218?, N252D, ?252?, P014F, ?014?, ?057?, P057W, P172R, ?194?, ?201?, ?210?, Q059C, Q059D, Q059R, Q185E, Q206D, Q217A, Q217K, Q217R, Q245A, Q245D, Q245E, Q245H, Q245R, Q271E, Q271 F, Q271R, Q271W, Q275G, Q275I, R186I, R186L, R186V, R186W, S003E, S009C, S009E, S018C, S037D, S037E, S037H, S037R, S037Y, S038D, S038P, S038R, S038Y, S063L, S087D, S087R, S089C, S089E, S130C, S130R, S145D, S159C, S159P, S161C, S173T, S182C, S188E, S188F, S188K, S188L, S188R, S188W, S190A, S190G, S190T, S204R, S236D, S236E, S248C, S248E, S260C, S260E, S260R, ?022?, T055C, T055W, ?071?, T158D, ?158?, ?158?, T158R, ?158?, T164R, T242D, T242G, T255C, V004E, V004T, V045C, V045D, V045R, V045T, V051 H, V081 R, V143C, V143E, V143G, V192G, V203C, V203D, V203E, V203M, V203R, V270G, W241 L, ?214?, Y214Q, ?001?, ?133?, A187L, ?187?, A216C, ?216?, A273Q, D099H, D259H, E156C, E195G, F189H, G131C, G146A, G166V, G215C, G215E, I107L, ?012?, K012S, ?012?, K043C, K170C, K256C, ?256?, K265G, ?265?, L233E, M222F, M222S, N062Q, N076E, N078E, N184P, N218R, P005V, P014D, Q002K, Q002L, Q002R, Q010W, Q271C, R186H, S049C, S063C, S063D, S105T, S188C, S190C, S204E, T055R, T164G, V004D, V044T, V045I, V165C, V180S, YO06C, Y006D, Y006E, Y104T, A001C, A187C, A230G, A273D, A273P, D036Q, F189G, F189L, F189R, G157T, G178A, I031F, I111 M, K012F, K012L, K027T, K043R, K136G, K141G, K170Q, M222A, M222L, N062R, N117G, N269C, P005W, P129V, P239A, P239H, P239T, Q059W, Q217G, Q275A, R186A, S191G, T164A, T220A, A001P, A187F, A187W, A273R, D041C, D060G, D197T, F189A, G046D, G157P, K012C, K012E, K012W, L042C, M222T, N062C, P239G, P239N, Q217C, R186M, S049T, S089P, S125A, S173V y V044A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPÑ'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3); la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionados de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A216E, L090I, A098R, A098W, A098Y, A116G, A116R, A116S, A133M, I107L, I115V, M124L, N101I, N109H, N109S, N109T, N117R, P005G, Q185L, S089V, V095A, A015Y, A029G, A098D, A098E, A098G, A098N, A098S, A098T, A098V, A114S, A114T, A116E, A116L, A116T, A116V, A133H, A133L, A133S, A137G, A137I, A137L, A137S, A137V, A138S, A144S, A144V, A176S, A176T, A187T, A216F, A216P, A216Q, A216R, A216S, A216T, A216V, A216Y, D041E, D120A, D120E, D120Q, D120R, D120S, D181S, G020A, G020S, G024A, G097A, G097D, G097S, G131Q, G160S, G166I, G211L, G215N, H039N, H238N, I111 L, I111V, I122A, L075I, L075Q, L135M, L209T, L209V, L233V, L235M, L235R, L257A, 119I, N025A, N025G, N025T, N061K, N101F, N101H, N101L, N101Q, N101R, N101S, N101T, N109A, N109G, N109K, N109L, N117E, N117H, N1 17K, N1 17S, N212G, N212S, N218F, N218G, N218H, N218L, N218S, N218W, N240Q, N252M, N252R, N252S, P005T, P040A, P040G, P040T, P129D, P129S, P194S, P210R, Q019R, Q019W, Q103L, Q103W, Q185A, Q185G, Q185M, Q185R, Q185T, Q206G, Q206Y, Q217A, Q217E, Q217R, Q217S, Q217T, S003Q, S009H, S018M, S033T, S130A, S130F, S130G, S130T, S130V, S145T, S159A, S161 N, S161T, S162V, S162Y, S182L, S182W, S183F, S183L, S183V, S183W, S188K, S188W, S236Q, S236T, S248L, T022H, T022K, T208C, T253H, T255V, V044I, V121 I, V139C, V143H, V143Q, V143T, V143W, V143Y, Y006K, Y021A, Y104W, A001 F, A001G, A001 H, A001 K, A001L, A001Q, A001S, A001Y, A013V, A015G, A015K, A015R, A015S, A015T, A015W, A048S, A073N, A073S, A092S, A098K, A098P, A116D, A116W, A128S, A133P, A133T, A133V, A134G, A134S, A137H, A137N, A137T, A144D, A144K, A144L, A14 M, A144N, A144R, A179G, A179S, A187V, A216G, A216L, A216W, A223S, A230C, A272K, A272L, A272P, A272S, A272T, A272W, A273G, A273S, A274G, A274M, A274T, D120K, D140E, D181A, D181E, D181G, D181H, D181T, D259E, D259N, D259Q, E054D, E156D, E156T, E251 L, E251T, E251V, F058Y, F189W, F261K, F261Q, F261R, G007A, G007S, G020F, G020H, G020N, G020Q, G020T, G020Y, G024F, G024Q, G024R, G024T, G024V, G024W, G024Y, G053T, G097K, G097M, G097R, G097T, G131A, G131H, G131 P, G131 R, G131T, G131V, G160H, G160T, G166C, G166Q, G166S, G166T, G211A, G211 D, G211 K, G21 1 M, G211 N, G211 Q, G211 R, G211V, G211W, G215S, G215T, G215W, H017T, H017W, H017Y, H039V, H226A, H226F, H226I, H226L, H226M, H226V, I035V, I079A, I079S, 1108V, I205V, I234L, I234V, I268V, K012S, K043P, K136H, K136R, K141A, K141F, K141T, K141W, K170A, K170G, K170R, K213A, K213R, K213S, K237A, K237H, K237L, K237S, K237V, K256A, K256G, K256H, K256M, K256P, K256Q, K256R, L016A, L016Q, L016T, L016V, L042V, L075M, L075T, L082M, L082V, L135F, L196I, L209H, L209Q, L209R, L209S, L209W, L233A, L233M, L233Q, L235I, L235K, L250I, L257S, L257T, L257V, L267A, L267Q, L267T, L267V, M119C, M199V, N025C, N025E, N025F, N025I, N025K, N025L, N025M, N025Q, N025V, N025Y, N061 F, N061P, N061 S, N061T, N076G, N078S, N101A, N109M, N109Q, N109R, N117A, N117M, N117Q, N118D, N118G, N1 18H, N118Q, N118R, N118S, N184A, N184C, N184G, N184L, N184R, N184S, N184T, N184V, N184W, N212C, N212F, N212I, N212K, N212L, N212P, N212Q, N212R, N212V, N212W, N212Y, N218A, N218P, N218T, N240A, N240E, N240G, N240H, N240L, N240R, N240S, N240T, N243C, N243Q, N243T, N243V, N252A, N252G, N252K, N252Q, P014G, P014Q, P014R, P014S, P014T, P040F, P040L, P040Q, P040S, P040V, P086C, P086H, P086S, P129A, P129E, P129G, P129K, P129R, P172A, P172K, P172Q, P172S, P194A, P194G, P194H, P194L, P194M, P194Q, P194R, P194V, P194W, P194Y, P210A, P210G, P210L, P210S, P239K, P239R, Q002A, Q002S, Q010A, Q010N, Q010R, Q010T, Q019A, Q019C, Q019D, Q019G, Q019S, Q019T, Q019V, Q059I, Q059V, Q103S, Q185F, Q185H, Q185I, Q185K, Q185N, Q185S, Q185Y, Q206H, Q206L, Q206P, Q206W, Q217F, Q217H, Q217I, Q217K, Q217L, Q217N, Q217V, Q271G, Q271 R, Q271T, Q275F, Q275P, Q275R, R186A, R186I, R186K, S003A, S003F, S003G, S003H, S003K, S003R, S003T, S009T, S018N, S018T, S037G, S037T, S037V, S038G, S038Q, S063N, S063Q, S063T, S089M, S089N, S130K, S130L, S130R, S130W, S132N, S145G, S145K, S145M, S145R, S145V, S159C, S159H, S159L, S159Q, S159R, S159T, S159W, S161A, S161C, S161G, S161 H, S161 I, S161K, S161P, S161Q, S161R, S162F, S162G, S162I, S162L, S162M, S162N, S162P, S162R, S163G, S173A, S173G, S182F, S182G, S182K, S182N, S182Q, S182V, S183A, S183M, S183Q, S183R, S183T, S188A, S188F, S188G, S188P, S188R, S188T, S188V, S190C, S204A, S204G, S204I, S204L, S204Q, S204R, S204V, S207G, S224A, S224T, S236C, S236D, S236E, S236G, S236N, S248A, S248F, S248K, S248M, S248T, S249A, S249R, S249T, S249V, S249W, S249Y, S260G, S260H, S260K, S260N, T022A, T022G, T022Q, T022S, T022V, T022Y, T055A, T055K, T158A, T158S, T208L, T208S, T208V, T220S, T242D, T242N, T242S, T244E, T244G, T244I, T244R, T244V, T244W, T253A, T253G, T253N, T253S, T254S, T254V, T255H, T255I, T255K, T255L, T255Q, T255R, T255S, T255Y, V004A, V004N, V004P, V004W, V008A, V008M, V026I, V045S, V045W, V051I, V081Q, V081T, V084C, V093I, V095C, V143A, V143E, V143F, V143N, V143S, V147I, V147L, V147S, V147T, V148I, V149C, V149I, V165M, V180A, V180C, V180I, V180L, V180T, V192A, V192C, V192I, V192S, V192T, V192Y, V198L, V203A, V203F, V203K, V203L, V203M..V203N, V203Y, W241Y, Y006A, Y006G, Y006H, Y006L, Y006N, Y006P, Y006Q, Y006T, Y021 E, Y021 K, Y021 L, Y021 N, Y021Q, Y021 R, Y021S, Y021T, Y104F, Y104I, Y104V, Y171 F, Y214F, Y214L, Y214W, Y262F y Y262S, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que el de BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionados de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en BPN'-v36, A001 D, A001 M, A001N, A001 R, A001T, A001V, A013C, A013G, A013S, A015D, A015F, A015L, A015M, A015P, A015Q, A074G, A074S, A085S, A085T, A085V, A088C, A088L, A088S, A088T, A088V, A133E, A1 33G, A133R, A137E, A144G, A144H, A144Q, A144T, A151 C, A152S, A1 53G, A153S, A153V, A176C, A187G, A187Q, A187S, A200G, A228S, A228T, A230T, A230V, A231 C, A231V, A232C, A232V, A272E, A272G, A272I, A272Q, A272R, A273L, A273V, A274L, A274Q, A274R, A274V, D036E, D259A, D259G, D259P, D259S, D259T, E156A, E156S, E156V, E1 95G, E251C, E251 I, E251Q, F189Y, F261A, F261G, F261 H, F261 L, F261 P, F261 S, F261T, F261V, F261W, G020C, G020D, G020E, G020L, G020R, G024D, G024I, G024N, G024P, G024S, G053A, G053D, G053F, G053H, G053K, G053N, G053S, G053Y, G157A, G157S, G160A, G160L, G160P, G160R, G166A, G166L, G166V, G166W, G169A, G211 E, G211 P, G215A, G215D, G215E, G215H, G215V, G258D, G258S, H017F, H017I, H017L, H017M, H017V, H039C, H226S, H226Y, I011T, 1011V, I031 C, I031 L, 1031V, I079F, I079K, I079L, I079M, I079Q, I079R, I079T, I079V, I079W, I115L, I205A, I205C, I268L, K012R, K012T, K027R, K043A, K043E, K043F, K043H, K043I, K043M, K043N, K043Q, K043T, K043V, K043Y, K141 H, K141 Q, K1 1V, K170S, K213G, K213H, K213I, K213L, K213N, K213Q, K213T, K213W, K237I, K237N, K237R, K237T, K256C, K256E, K256S, K256T, K256V, K256W, K265H, K265R, L016E, L016F, L016I, L016S, L042I, L042M, L075A, L075H, L075Y, L082K, L082Q, L082T, L196M, L196V, L209A, L209C, L209E, L209G, L235W, L257C, L257H, L257Q, L257Y, L267E, L267F, L267R, L267S, 050Y, N025H, N025P, N025S, N056D, N061A, N061C, N061 D, N061G, N061 H, N061 I, N061 L, N061Q, N061 R, N061V, N061W, N062A, N062S, N062V, N076A, N076E, N076L, N076M, N076Q, N076S, N076T, N076W, N078G, N078H, N078K, N078P, N078Q, N078T, N101 D, N118A, N1 18T, N184E, N184H, N184I, N212A, N212D, N212E, N218C, N218D, N218E, N218M, N218R, N218V, N240W, N243A, N243G, N243P, N243S, N252D, N252E, N252L, N252T, N252V, N269S, P005A, P005D, P005M, P005Q, P014A, P014D, P014F, P014M, P014V, P040H, P040R, P040W, P040Y, P086A, P129T, P172E, P172G, P172R, P194E, P201A, P201G, P210E, P210V, Q002E, Q002G, Q010D, Q010F, Q010H, Q010I, Q010L, Q010S, Q019E, Q019H, Q019N, Q059A, Q059L, Q059R, Q059S, Q059T, Q185D, Q185E, Q206D, Q206S, Q206V, Q217G, Q245D, Q245E, Q245K, Q245M, Q245R, Q271A, Q271 F, Q271 P, Q271Y, Q275D, Q275H, Q275I, Q275L, Q275S, Q275W, R186H, R186L, R186V, R186W, S003D, S003E, S0O3M, S003P, S003V, S009A, S009E, S009G, S009I, S009K, S009M, S009P, S009W, S018A, S018G, S018I, S018L, S018P, S018R, S018V, S018W, S037A, S037D, S037Q, S037R, S037Y, S038D, S038H, S038K, S038M, S038R, S038T, S063A, S063G, S063K, S063M, S063R, S087A, S087D, S087F, S087G, S087Q, S087T, S089A, S089C, S089H, S089I, S089K, S089L, S089Q, S089R, S089T, S089Y, S130D, S130E, S145A, S145H, S145L, S159G, S161 E, S161 L, S161 M, S161W, S162A, S162C, S162E, S162W, S163P, S173T, S182A, S182C, S182E, S182H, S182R, S182T, S183C, S183D, S183G, S183H, S188C, S188D, S188E, S188L, S190T, S191A, S204Y, S224C, S236A, S248C, S248D, S248G, S248I, S248N, S248Q, S248R, S248V, S249C, S249H, S249L, S249Q, S260A, S260C, S260E, S260P, S260Q, S260R, S260T, T022L, T022N, T022R, T055C, T055D, T055G, T055I, T055L, T055N, T055Q, T055S, T055V, T055Y, T071A, T071 S, T158G, T158H, T158L, T158P, T158Q, T158R, T158V, T1 58Y, T164N, T164S, T244A, T244D, T244H, T244Q, T244S, T253Q, T253R, T253Y, T254A, T254G, T255A, T255D, T255E, V004E, V004G, V004R, V008C, V026A, V028L, V030I, V044C, V045D, V045E, V045H, V045M, V045Q, V045Y, V072L, V081 L, V081 S, V084A, V084I, V084M, V084T, V143C, V147C, V147Q, V149L, V165L, V180M, V192F, V192G, V1 92Q, V198I, V198M, V203C, V203E, V203H, V203I, V203Q, V203R, V203T, V203W, V270A, V270L, V270T, W241 F, W241 M, Y006C, Y006D, Y006E, Y006I, Y006M, Y006R, Y006S, Y006V, Y006W, Y021 C, Y021 D, Y021V, Y091W, Y167F, Y214V, Y262A, Y262C, Y262I, Y262M, Y262R, Y262T, Y262V y Y262W, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A001 E, A015C, A015E, A048C, A048E, A073T, A085C, A085G, A088I, A088M, A114G, A137R, A187L, A187N, A187P, A187W, A216C, A230S, A273D, A273H, A273T, D036N, D099N, D259H, E156C, E156G, E156H, E156Q, F189H, F189R, F189S, F189T, F261C, F261 D, F261E, G053E, G053M, G053Q, G131C, G131 D, G157N, G160V, G215C, G215L, G258A, H039A, 1011L, I079E, I268M, K012A, K012G, K012H, K012N, K027N, K043C, K043D, K043G, K043L, K043W, K136G, K141G, K141 L, K141 M, K141 N, K141 R, K170C, K170Q, K213V, K256D, K265G, K265N, K265Q, K265S, L082A, L082F, L082H, L082R, L082S, L090M, L233S, L235V, L257E, L257G, L257R, L257W, M222S, N025R, N062H, N062T, N076D, N076P, N078D, N078E, N078F, N078R, N078V, N269H, N269Q, P014K, P057A, P086F, P201T, Q002D, Q002I, Q002P, Q002V, Q019L, Q019P, Q059C, Q059D, Q059E, Q185W, Q271C, Q271 D, Q271 E, Q271 L, Q271W, Q275G, R186M, S009C, S009L, S018D, S037E, S037H, S037K, S037L, S037P, S038P, S063C, S063D, S063F, S063L, S063Y, S087L, S087N, S087R, S087Y, S089D, S089F, S089G, S089W, S105T, S125A, S130C, S159D, S159P, S163A, S182P, S183P, S190A, S190G, S204E, S224G, S248E, S248H, S249E, S260V, S260Y, T055M, T055R, T055W, T158D, T158E, T164G, T164K, T164Q, T220A, T242G, T253E, T255C, T255G, V004D, V044L, V044P, V045C, V045G, V045L, V045N, V045R, V045V, V081A, V081G, V081 H, V084S, V147A, V203D, V203G, V270C, V270P, V270S, W241L, Y104T, Y214Q, Y262D, Y262E, Y262G, Y262H, Y262L, Y262N, Y263G y Y263W, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de p.roteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en A001 C, A142C, A187C, A216H, A273Q, A274H, D036Q, D036S, D099S, D197T, E156L, F189A, F189L, G053L, G053R, G157P, G178A, G258P, H039S, H238Y, K012C, K012E, K012L, K012W, K136E, K265Y, L075G, L075V, L082E, L126W, L257D, L257P, M050L, M222A, M222F, M222L, N056S, N062C, N062L, N062Y, N269C, P057W, Q002K, Q002L, Q217C, Q245A, Q245H, S018C, S038Y, S049C, S087C, S087K, S145D, S191G, T022P, T055E, T164A, T164R, V045K, V051 H, V081 R, V143G, V148L, V180S, V203S, V270G, Y214H, A187F, A273P, F189G, G046D, G146A, G157T, I031 F, I175L, K012F, K027T, L042F, L233E, L233G, M222T, N062R, N184P, P005V, P005W, P129V, P239N, P239T, Q010W, Q059W, Q275A, V004T, V165C, A128H, A230G, D041 C, H067T, K027S, K043R, L090T, N062Q, N117G, P225G, P225S, P239G, P239H, Q002R, S089E, V044A, V045I, ???? ?, A273R, D041N, D099A, D099H, D099Q, F058G, ?111?, L042C, N118L, ?239?, S049N, S089P, S173V, ?242?, V044T y V045T, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 8 Rendimiento de limpieza de variantes combinatorias adicionales basadas en BPN'-v36 parental DNA 2.0 suministró las variantes combinatorias adicionales basadas en BPN'-v36 (BPN'-S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q) parental que preparó. Estas variantes se probaron para determinar su rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8, un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 7, un ensayo de micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8 y un ensayo de micromuestra de pasto en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA y la actividad de proteasa se probó con el ensayo de AAPF. Todos los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v36.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1 .3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-L257G, A1 6T-A128S, N061 S-N109G-A128S-N243V-S260P, S009T-N 109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, y S162G-K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A088T, A088T-A116T, A088T-G131 H, A088T-K256R, A088T-N109G, A088T-N243V, A088T-Q103H, A088T-S162G, A088T- S248N, A088T-S249A, A088T-T158S, A1 16T, A116T-G131 H, A1 16T-K256R, A116T-L257G, A1 16T-N243V, A1 16T-S162G, A116T-S248N, A116T-S249A, A116T-T158S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V-S248N-K256R, A128S-S162G, A128S-S248N, A128S-S249A, A128S-T158S, G024E-A1 16T, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N109G, G024E-N243V, G024E-T158S, G131 H, G131 H-K256R, G131 H-L257G, G131 H-N243V-K256R, G131 H-S162G, G131 H-S248N, G131 H-S249A, G131 H-T158S, K043Y-A088T, K043Y-K256R, K043Y-N243V, K256R, K256R-L257G, L257G, N061 G-N109G-N243V, N061 P-N109G-G131 H-N243V, N061 P-N109G-N243V, N061 S-A128S-N243V-S260P, N061 S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P, N061S-N109G-A128S-S260P, N061S-N109G-N243V, N076D-K256R, N076D-L257G, N076D-N109G, N076D-T158S, N109A-A128S-N243V-K256R, N109G, N109G-A1 16T, N109G-A128S, N109G-A128S-G131 H-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-A128S-N243V-S248A-K256R, N109G-A128S-N243V-S248N, N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, N 109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G, N 109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-S248N-K256R, N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243P-S248A-K256R, N109G-N243P-S248N-K256R, N109G-N243V, N109G-N243V-K256R, N109G-N243V-S248A-K256R, N109G-N243V-S248N, N109G-N243V-S248N-K256R, N109G-S162G, N109G-S248N-K256R, N109G-S249A, N109G-T158S, N109Q-A128S- N243V-K256R, N109S-A128S-N243V-K256R, N218S-N243V, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S248N-K256R, N243V-S249A, P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, Q103H-A1 16T, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q1 03H-N109G, Q103H-N218S, Q103H-N243V, Q103H-S162G, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, S009T-A128S-K141 R-N243V, S009T-N109G-A128S-K141 R, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V-S248N-K256R, S009T-S018T-Y021 N-A128S-K141 R-N243V, S018T-Y021 N-A128S-N243V, S018T-Y021 N-N061 S-A128S-N243V-S260P, S018T-Y021 -N061S-N109G-A128S-S260P, S018T-Y021 -N109G-A128S, S018T-Y021 N-N109G-A1 28S-N243V, S018T-Y021 N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R, S033T-N243V, S033T-Q103H, S033T-T1 58S, S063G, S063G-A088T, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G-L257G, S063G-N076D, S063G-N109G, S063G-Q103H, S063G-S162G, S063G-S248N, S063G-T158S, S162G, S162G-L257G, S162G-N243V, S162G-S248N, S248N, S248N-L257G, S249A, T158S, T158S-L257G, T1 58S-N218S, T158S-N243V, T158S-S248N y T158S-S249A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3); la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001E-A088T, A001E-A116T, A001E-A128S-G131 H-N243V, A001E-G131H-G169A-N243V, A001E-K256R, A001E-N109G, A001E-N243V, A001E-S033T, A001E-S033T-N109G-N218S, A001 E-S033T-N109G-N243V, A001E-S162G, A001E-T158S, A088T-A128S, A088T-G169A, A088T-N218S, A088T-Q206D, A116T-G169A, A116T-N218S, A116T-Q206D, A128S, A128S-G131 H, A128S-G169A, A128S-N218S, A128S-N243V, A128S-Q206D, G024E, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-K043Y, G024E-N218S, G024E-Q103H, G024E-S033T, G024E-S063G, G024E-S162G, G024E-S248N, G024E-S249A, G131 H-G169A, G131 H-N218S, G131 H-N243V, G131 H-Q206D, G169A, G169A-K256R, G169A-L257G, G169A-N218S, G169A-N243V, G169A-Q206D, G169A-S248N, G169A-S249A, K043Y, K043Y-A116T, K043Y-A128S, K043Y-G131 H, K043Y-G169A, K043Y-L257G, K043Y-N109G, K043Y-N218S, K043Y-Q103H, K043Y-S063G, K043Y-S162G, K043Y-S248N, K043Y-S249A, K043Y-T158S, N076D, N076D-A088T, N076D-A128S, N076D-G131H, N076D-N218S, N076D-N243V, N076D-Q103H, N076D-S162G, N076D-S248N, N076D-S249A, N109G-G169A, N109G-Q206D, N109G-S248N, N218S, N218S-K256R, N218S-L257G, N218S-S248N, N218S-S249A, P040E-N109G-A128S-G131 H, Q103H, Q103H-G169A, Q206D, Q206D-K256R, Q206D-L257G, Q206D-N218S, Q206D-N243V, Q206D-S248N, Q206D-S249A, S018T-Y021 N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T, S033T-A088T, S033T-A116T, S033T-A128S, S033T-A128S-G131 H-N243P, S033T-G131 H, S033T-K043Y, S033T-K256R, S033T-L257G, S033T-N076D, S033T-N076D-A128S-N218S, S033T-N076D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S033T-N109G, S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-N218S, S033T-P040E-Q103H-N109G, S033T-Q103H-A128S-G13 H, S033T-Q206D, S033T-S063G, S033T-S162G, S033T-S248N, S033T-S249A, S063G-A116T, S063G-G131 H, S063G-G169A, S063G-N109G-A128S-G131 H, S063G-N218S, S063G-N243V, S063G- Q206D, S063G-S249A, S162G-G169A, S162G-N218S, S162G-Q206D, S162G-S249A, S248N-K256R, S248N-S249A, S249A-K256R, S249A-L257G, T158S-G169A, T158S-K256R, T158S-Q206D y T158S-S162G, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolltica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones acidas seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001 E, A001E-A128S, A001E-G024E, A001E-G131H, A001 E-G169A, A001E-L257G, A001E-N218S, A001E-Q103H, A001E-S063G, A001E-S248N, A001E-S249A, G024E-N076D, K043Y-N076D, K043Y-Q206D, N076D-A116T, N076D-G169A, N076D-Q206D, Q103H-Q206D, S033T-G169A, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243P, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V, A001E-K043Y, A001E-N076D, A001E-N076D-N109G-A128S, A001E-Q206D y G024E-Q206D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones acidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1 .9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1 .0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A116T, A088T-N243V, G024E-A116T, K043Y, N076D-A116T, N218S-S248N, S033T-N243V, S033T-S063G, S248N-L257G, A001E-S249A, A088T-A116T, A088T-A128S, A088T-G131H, A088T-L257G, A088T-N109G, A088T-S248N, A088T-S249A, A116T-N243V, A116T-T158S, A128S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V, A128S-S248N, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N218S, G024E-N243V, G024E-S162G, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131 H-K256R, G131 H-S249A, K043Y-A088T, K043Y-A1 16T, K256R, N076D-K256R, N109G, N109G-A1 16T, N109G-A128S, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-G131 H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G-S248N, N218S-L257G, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-N243V, S033T-A128S, S033T-K256R, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T-S248N, S033T-T158S, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-T158S, S162G-K256R, S248N-K256R, S249A, T158S-N243V y T158S-S249A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con ???', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones -de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A001E-A128S, A001E-G131 H, A001 E-K256R, A001E-N218S, A001 E-N243V, A001 E-S033T, A001 E-S063G, A001 E-S162G, A088T, A088T-K256R, A088T-N218S, A088T-Q103H, A088T-S162G, A088T-T158S, A1 16T-A128S, A116T-G131 H, A116T-K256R, A116T-L257G, A116T-S162G, A116T-S248N, A116T-S249A, A128S-G169A, A128S-N218S, A128S-S162G, A128S-S249A, G024E, G024E-N109G, G024E-Q103H, G024E-S033T, G024E-S063G, G024E-S248N, G131 H-L257G, G131H-N243V, G131 H-S162G, G131 H-T158S, G169A, G169A-L257G, G169A-S248N, K043Y-A128S, K043Y-G131 H, K043Y-K256R, K043Y-L257G, K043Y-N109G, K043Y-N243V, K043Y-Q103H, K043Y-S063G, K043Y-S162G, 043Y-S248N, K043Y-S249A, K043Y-T158S, K256R-L257G, L257G, N061G-N109G-N243V, N061S-A128S-N243V-S260P, N061 S-N109G-A128S-N243V-S260P, N061S-N109G-A128S-S260P, N076D-A088T, N076D-A128S, N076D-G169A, N076D-N218S, N076D-N243V, N076D-S162G, N076D-S248N, N076D-T158S, N109A-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-G131 H-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A-K256R, N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-Q206D, N109G-S162G, N109G-S249A, N109G-T158S, N109Q-A128S-N243V-K256R, N109S-A128S-N243V-K256R, N218S, N218S-K256R, N218S-N243V, P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, Q103H, Q103H-A116T, Q103H-G169A, Q103H-N109G, Q103H-N218S, Q103H-S162G, S009T-A128S-K141 R-N243V, S009T-N109G-A128S-K141R, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141 R, S018T-Y021 N-N109G-A128S, S018T-Y021 -N109G-A128S-N243V, S018T-Y021 N- 109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-A088T, S033T-A116T, S033T-G131 H, S033T-K043Y, S033T-L257G, S033T-N109G, S033T-Q103H, S033T-Q206D, S033T-S162G, S033T-S249A, S063G, S063G-A088T, S063G-A116T, S063G-L257G, S063G-NO76D, S063G-N109G, S063G-N218S, S063G-Q103H, S063G-S248N, S063G-S249A, S162G, S162G-G169A, S162G-L257G, S162G-N218S, S162G-N243V, S162G-S248N, S162G-S249A, S248N, S248N-S249A, S249A-K256R, S249A-L257G, T158S, T158S-G169A, T158S-K256R, T158S-L257G, T158S-N218S y T158S-S248N, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con la proteasa de BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o f SEQ ID N0:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001E, A001E-A088T, A001E-A116T, A001E-G169A, A001E-L257G, A001E-N109G, A001E-S033T-N109G-N243V, A001E-T158S, A088T-G169A, A088T-Q206D, A116T-N218S, A128S-G131H, A128S-N243V-S248N-K256R, A128S-Q206D, G024E-K043Y, G024E-N076D, G024E-Q206D, G 31H-G169A, G131H-N218S, G131H-N243V-K256R, G131H-Q206D, G131 H-S248N, G169A-K256R, G169A-N218S, G169A-N243V, G169A-Q206D, K043Y-N076D, K043Y-N218S, N061 P-N109G-G131H-N243V, N061P-N109G-N243V, N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P, N061S-N109G-N243V, N076D, N076D-G131 H, N076D-L257G, N076D-N109G, N076D-Q103H, N076D-S249A, N109G-A128S-N243V-S248N, N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-S248N-K256R, N109G-N243P-S248A-K256R, N109G-N243P-S248N-K256R, N109G-N243V-K256R, N109G-N243V-S248A-K256R, N109G-N243V-S248N, N109G-N243V-S248N-K256R, N109G-S248N-K256R, N218S-S249A, N243V-S248N-K256R, Q103H-Q206D, Q206D, Q206D-K256R, Q206D-N218S, Q206D-S248N, Q206D-S249A, S009T-N 09G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R, S009T-S018T-Y021 -A128S-K141 R-N243V, S018T-Y021N-A128S-N243V, S018T-Y021 N-N061S-A128S-N243V-S260P, S018T-Y021N-N061S-N 109G-A128S-S260P, S018T-Y021 N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T, S033T-G169A, S033T-N076D-A128S-N218S, S033T-NO76D-N 109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S033T-N 109G-A128S-N243P-S248N-K256R, S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S063G-G131 H, S063G-G169A, S162G-Q206D y T158S-S162G, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID N0:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001 E-A128S-G131 H-N243V, A001 E-G024E, A001 E-G131 H-G169A-N243V, A001 E-Q103H, A001 E-S033T-N109G-N218S, A001 E-S248N, A116T-G169A, A116T-Q206D, G169A-S249A, K043Y-G169A, N109G-G169A, P040E-N109G-A128S-G131 H, Q206D-L257G, S033T-A128S-G131 H-N243P, S033T-A128S-G131H-N243V, S033T-P040E-Q103H-N109G, S033T-Q103H-A128S-G131 H, S063G-N109G-A128S-G131 H, S063G-Q206D, T158S-Q206D, A001E-K043Y, A001E-N076D, A001E-Q206D, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243P, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131H-G169A-N243V, A001 E-N076D-N109G-A128S, K043Y-Q206D y N076D-Q206D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID N0.2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones acidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-L257G, G024E-K256R, G024E-L257G, N109G-A116T, N109G- L257G, N243V-K256R, S033T-N109G, S033T-T158S, S063G-L257G, A001 E-L257G, A088T-A128S, A088T-G169A, A088T-K256R, A088T-N109G, A088T-N218S, A088T-N243V, A088T-S248N, A088T-T158S, A1 16T, A116T-A128S, A116T-G131 H, A116T-K256R, A116T-L257G, A116T-N218S, A116T-S162G, A116T-T158S, A128S, A128S-G169A, A128S- 256R, A128S-L257G, A128S-N218S, G024E, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-N109G, G024E-N243V, G024E-S033T, G024E-S063G, G024E-S248N, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131 H-G169A, G131 H-K256R, G131 H-N218S, G131H-S249A, G169A, G169A-L257G, G169A-N243V, K043Y-A088T, K043Y-N109G, K256R, K256R-L257G, N061G-N109G-N243V, N076D-N109G, N109G, N109G-A128S, N109G-G131 H, N109G-K256R, N109G-N218S, N109G-S162G, N109G-S248N, N109G-S249A, N109G-T158S, N218S, N218S-K256R, N218S-L257G, N218S-S248N, N243V, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N109G, S009T-S018T-Y021N-N109G-A128S-K141 R, S033T-A088T, S033T-A116T, S033T-A128S, S033T-G131 H, S033T-K043Y, S033T-K256R, S033T-L257G, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T-N243V, S033T-Q103H, S033T-S063G, S033T-S162G, S033T-S248N, S033T-S249A, S063G, S063G-A088T, S063G-A1 16T, S063G-A128S, S063G-G131 H, S063G-K256R, S063G-N109G, S063G-N218S, S063G-N243V, S063G-S248N, S063G-S249A, S063G-T158S, S162G-K256R, S162G-N218S, S162G-N243V, S162G-S248N, S162G-S249A, S248N, S249A, S249A-L257G, T158S, T158S-L257G y T158S-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con ???', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A001 E, A001 E-A1 16T, A001 E-G131H, A001 E-G169A, A001 E-K256R, A001 E-N109G, A001 E-S033T-N109G-N243V, A001 E-S063G, A001 E-S248N, A001 E-S249A, A001 E-T158S, A088T, A088T-A116T, A088T-G131 H, A088T-Q103H, A088T-Q206D, A088T-S162G, A088T-S249A, A116T-G169A, A1 16T-N243V, A1 16T-S248N, A116T-S249A, A128S-G131 H, A128S-N243V, A128S-S162G, A128S-S248N, A128S-S249A, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A116T, G024E-K043Y, G024E-N076D, G024E-N218S, G024E-Q103H, G024E-S162G, G131 H-L257G, G131 H-N243V, G131 H-N243V-K256R, G131 H-S162G, G131 H-S248N, G131 H-T158S, G169A-K256R, G169A-N218S, G169A-Q206D, G169A-S248N, G169A-S249A, K043Y, K043Y-A116T, K043Y-A128S, K043Y-G169A, K043Y-K256R, K043Y-L257G, K043Y-N076D, K043Y-N218S, K043Y-N243V, K043Y-S063G, K043Y-S248N, K043Y-S249A, K043Y-T158S, L257G, N061 P-N109G-G131 H-N243V, N061 P-N109G-N243V, N061S-A128S-N243V-S260P, N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P, N061S-N109G-A128S-S260P, N061S-N109G-N243V, N076D, N076D-A088T, N076D-A1 16T, N076D-G 3 H, N076D-G169A, N076D-K256R, N076D-L257G, N076D-N218S, N076D-N243V, N076D-Q103H, N076D-S249A, N076D-T158S, N109A-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-G131 H-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-A128S-N243V-S248A-K256R, N109G-A128S-N243V-S248N, N 09G-A128S-N243V-S248N-K256R, 109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G, N 109G-A128S-S162G-N243V-S248N- 256R, N109G-G169A, N109G-N243P-S248A-K256R, N109G-N243V- K256R, N109G-N243V-S248A-K256R, N109G-N243V-S248N, N109G-N243V-S248N-K256R, N109G-S248N-K256R, N109Q-A128S-N243V-K256R, N109S-A128S-N243V-K256R, N218S-N243V, N218S-S249A, Q103H, Q103H-A1 16T, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-G169A, Q103H-N218S, Q103H-N243V, Q103H-S162G, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D, Q206D-L257G, Q206D-N218S, S009T-A128S-K141 R-N243V, S009T-N109G-A128S-K141 R, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V-S248N-K256R, S009T-S018T-Y021 N-A128S-K141 R-N243V, S018T-Y021 N-A128S-N243V, S018T-Y021 N-N109G-A128S, S018T-Y021 N-N 109G-A128S-N243V, S018T-Y021 N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S018T-Y021 N-S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T, S033T-A128S-G131H-N243V, S033T-G169A, S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R, S033T-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-Q103H-A128S-G131 H, S033T-Q206D, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243V, S063G-G169A, S063G-N076D, S063G-N109G-A128S-G131 H, S063G-Q103H, S063G-S162G, S162G, S162G-G169A, S162G-L257G, S248N-K256R, S248N-L257G, S248N-S249A, S249A-K256R, T158S-G169A, T158S-K256R, T158S-N218S, T158S-S162G, T158S-S248N y T158S-S249A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con la proteasa de BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID N0:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con micromuestra de huevo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001 E-A088T, A001E-A128S, A001E-A128S-G131H-N243V, A001 E-G024E, A001E-G024E-S204E-Q206D, A001E-G131H-G169A-N243V, A001 E-K043Y, A001E-N076D, A001 E-N076D-N109G-A128S, A001E-N218S, A001 E-N243V, A001 E-Q103H, A001 E-Q206D, A001E-S033T, A001E-S033T-N1O9G- N218S, A001 E-S162G, A116T-Q206D, A128S-N243V-S248N-K256R, A128S-Q206D, G024E-Q206D, G131 H-Q206D, K043Y-G131 H, K043Y-Q103H, K043Y-Q206D, K043Y-S162G, N061S-N109G-A128S-N243V-S260P, N076D-A128S, N076D-Q206D, N076D-S162G, N076D-S248N, N109G-A128S-S248N-K256R, N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-N243P-S248N-K256R, N109G-Q206D, N243V-S248N-K256R, P040E-N109G-A128S-G131 H, Q103H-Q206D, Q206D-K256R, Q206D-N243V, Q206D-S248N, Q206D-S249A, S018T-Y021 N-N061 S-A128S-N243V-S260P, S018T-Y021 N-N061 S-N 109G-A128S-S260P, S033T-A128S-G131 H-N243P, S033T-N076D-A128S-N218S, S033T-N076D-N 109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S033T-P040E-Q 103H-N 109G, S033T-S063G-Q 103H-N 109Q-A128S-G131 H-G169A-N243P, S063G-Q206D, S162G-Q206D y T158S-Q206D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de pasto en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en T158S-L257G, K256R, L257G, S033T-N109G, S162G-K256R, S162G-L257G, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-S033T, N109G-A116T, N218S-L257G, S033T-A088T, S033T-A116T, S033T-N243V, S033T-Q103H, S162G-N218S, S162G-N243V, T158S, T158S-N218S, T158S-N243V, A088T, A088T-G169A, A088T-K256R, A088T-L257G, A088T-S162G, A088T-T158S, A1 16T-K256R, A116T-L257G, A116T-N243V, A128S-L257G, A128S-N218S, A128S-N243V, A128S-S248N, G024E-A116T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-N243V, G024E-S248N, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H-N243V, G131 H-T158S, G169A-N218S, G169A-N243V, G169A-S248N, K256R-L257G, N109G-A128S, N109G-G131 H, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G-S249A, N218S, N218S-K256R, N218S-N243V, N218S-S249A, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, Q103H-N109G, Q103H-N218S, S033T-A128S, S033T-L257G, S033T-N218S, S033T-S162G, S033T-S248N, S033T-T158S, S063G-K256R, S063G-L257G, S162G, S162G-G169A, S162G-S248N, S248N, S248N-K256R, S248N-L257G, S249A, T158S-S162G y T158S-S248N, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de pasto en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPNT-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A001 E-A088T, A001 E-A1 16T, A088T-A128S, . A088T-N243V, A088T-Q103H, A088T-S248N, A088T-S249A, A1 16T, A116T-G169A, A1 16T-N218S, A116T-S162G, A1 16T-S249A, A116T-T158S, A128S-G169A, A128S-K256R, A128S-S162G, A128S-S249A, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-K043Y, G024E-N218S, G024E-Q103H, G024E-S063G, G024E-S162G, G131 H-G169A, G131 H-K256R, G131H-N218S, G131H-S162G, G131 H-S248N, G131 H-S249A, G169A, G169A-L257G, G169A-S249A, N076D, N076D-K256R, N076D-L257G, N076D-S162G, N076D-S249A, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-S248N, N243V-S249A, Q103H-A1 16T, Q103H-G169A, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H-S162G, S033T-G131 H, S033T-G169A, S033T-K043Y, S033T-N076D, S033T-Q206D, S063G, S063G-A116T, S063G-A128S, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-S248N, S063G-S249A, S063G-T158S, S249A-L257G, T158S-G169A y T158S-K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID N0:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPIST en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de pasto en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A001 E- G169A, A001E-K256R, A001 E-N109G, A001 E-N218S, A088T-A116T, A088T-G131 H, A088T-N109G, A088T-N218S, A116T-A128S, A116T-G131H, A1 16T-S248N, A128S, A128S-G131 H, G024E, G024E-N109G, G131 H, G131 H-L257G, G169A-K256R, G169A-Q206D, K043Y, K043Y-A088T, K043Y-L257G, K043Y-N109G, N076D-A088T, N076D-G131H, N076D-G169A, N076D-N243V, N076D-T158S, N109G, N109G-S162G, N109G-T158S, N218S-S248N, Q103H-A128S, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-K256R, Q206D-L257G, Q206D-N218S, Q206D-N243V, Q206D-S248N, S033T, S033T-K256R, S033T-S063G, S033T-S249A, S063G-A088T, S063G-G131 H, S063G-G169A, S063G-N109G, S162G-Q206D, S162G-S249A, S248N-S249A, S249A-K256R, T158S-Q206D, T158S-S249A, A001 E-L257G, A001 E-N243V, A001 E-Q103H, A001 E-S063G, A001 E-S162G, A001 E-T158S, G024E-N076D, G131 H-Q206D, K043Y-A116T, K043Y-G169A, K043Y-K256R, K043Y-N076D, K043Y-S063G, K043Y-S162G, K043Y-S248N, K043Y-S249A, K043Y-T158S, N076D-A1 16T, N076D-A128S, N076D-S248N, N109G-G169A, Q103H, Q103H-G131 H, Q206D-S249A, S063G-N076D, S063G-N218S, S063G-Q103H, A001 E-A128S, A001 E-G024E, A001 E-G131 H, A001 E-N076D, A001 E-Q206D, A001 E-S033T, A001 E-S248N, A001 E-S249A, A088T-Q206D, A116T-Q206D, A128S-Q206D, G024E-Q206D, K043Y-A128S, K043Y-G131H, K043Y-N218S, K043Y-Q103H, N076D-N109G, N076D-N218S, N076D-Q103H, N109G-Q206D, Q103H-Q206D, Q206D, A001 E, A001 E-K043Y, K043Y-N243V, S063G-Q206D, N076D-Q206D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo de limpieza de micromuestra de pasto; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo proteolítico de AAPF: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 -G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S033T-N076D-A128S-N218S, A001E-S033T-N109G-N218S, S033T-N218S, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243V, A128S-G169A, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243P, S018T-Y021 N-S033T-N 109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-A128S-G131 H-N243P, P040E-N109G-A128S-G131H, S033T-A128S, S033T-N1O9G-A128S-N243V-S248N-K256R, N109G-G169A, S063G-N109G-A128S-G131 H, G169A, N109G-A128S-G131 H-N243V-S248N-K256R, S033T-A128S-G131 H-N243V, A128S-N218S, A001 E-G169A, A088T-G169A, G169A-L257G, N109G-N218S, S033T-N109G-A128S-N243P-S248N-K256R, G169A-K256R, N076D-G169A, A001E-G131 H-G169A-N243V, G169A-S249A, S033T-N109G, G169A-S248N, K043Y-G169A, K043Y-N2 8S, N2 8S-L257G, N2 8S-N243V, S063G-G169A, A001 E-A128S-G131 H-N243V, A001 E-S033T-N109G-N243V, A088T-N218S, G024E-N218S, G024E-S033T, G169A-Q206D, N076D-N218S, S033T-L257G, S162G-G169A, A001 E-N218S, A116T-N218S, G169A-N243V, N218S, P040A-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-N076D, A001 E-S033T, A128S-G131H, N218S-S248N, S018T-Y02 N-N109G-A128S, S033T-K043Y, S033T-N243V, S033T-Q206D, S0B3G-N218S, S162G-N218S, T158S-G169A, A1 16T-G169A, G131 H-G169A, N061S-N109G-A128S-S260P, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-A128S-N243V-S248A-K256R, N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-K256R, S009T-N109G-A128S-K141 R, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, S033T-A088T, S033T-S063G, S033T-S162G, T158S-N218S, A001E-N076D-N 09G-A128S, N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-S248N-K256R, S009T-N 109G-A128S-K141 R-N243V, S018T-Y021 N-N061 S-N 109G-A128S- S260P, S033T-A116T, S033T-S248N, S033T-S249A, S033T-T158S, G1 31H-N218S, N109A-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S, N109G-A128S-S162G-N243V-S248N-K256R, N109G-A128S-T158S-N243V-S248N-K256R, N218S-S249A, Q206D-N218S, S018T-Y021 N-N109G-A128S-N243V, S018T-Y021 N-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R, S033T-K256R, A116T-A128S, N061 S-N109G-A128S-N243V-S260P, N109G-A128S-N243V-S248N, S009T-N109G-A128S-K141R-N243V-S248N-K256R, G024E-A128S, N061S-N109G-A128S-N243V-S248N-K256R-S260P, N109S-A128S-N243V-K256R, S033T, S033T-G131 H, A001 E-A128S, A128S, A128S-L257G, A128S-Q206D, N109Q-A128S-N243V-K256R, S009T-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-A128S-K141 R-N243V, A088T-A128S, A128S-K256R, A128S-N243V, N061 P-N109G-N243V, N061S-A128S-N243V-S260P, S018T-Y021 N-A128S-N243V, A128S-N243V-S248N-K256R, A128S-S248N, A128S-S249A, N076D-A128S, S063G-A128S, A128S-S162G, A128S-T158S, S018T-Y021 N-N061S-A128S-N243V-S260P, S033T-Q103H-A128S-G131 H, N061S-N109G-N243V, K043Y-A128S, N061 P-N109G-G131 H-N243V, N109G-L257G, A001 E-G024E-S204E-Q206D, A001 E-L257G, A088T-N109G, G024E-N109G, K043Y-N109G, N061 G-N109G-N243V, N076D-N109G, N109G, N109G-A116T, N109G-K256R, N109G-N243V-K256R, N109G-N243V-S248A-K256R, N109G-Q206D, S063G-N109G, A001 E-A116T, A001 E-N109G, A001 E-Q206D, A088T-A116T, A088T-N243V, A1 16T-L257G, G024E-A116T, G024E-L257G, G024E-N243V, G024E-Q206D, N109G-G131 H, N109G-N243V, N109G-S162G, N109G-S248N, N109G-S248N-K256R, N109G-S249A, N109G-T158S, N243V-L257G, A001 E-A088T, A001 E-G024E, A001 E-K256R, A001 E-N076D, A001 E-N243V, A088T, A088T-L257G, A088T-Q206D, A116T, A1 16T-K256R, A116T-N243V, G024E-A088T, G024E-K043Y, G024E-K256R, G024E-N076D, G024E-S162G, G024E-S248N, K043Y-A088T, K043Y-A1 16T, K043Y-L257G, K043Y-N243V, K043Y-Q206D, K256R-L257G, N076D-A116T, N076D-L257G, N076D-N243V, N076D-Q206D, N109G-N243V-S248N, 109G-N243V-S248N-K256R, N243V-K256R, Q206D, Q206D-L257G, Q206D-N243V, Q206D-S248N, S063G-K256R, S063G-L257G, T158S-L257G, A001E, A001 E-K043Y, A001E-S162G, A001 E-S248N, A001E-S249A, A001 E-T158S, A088T-K256R, A088T-S162G, A088T-S248N, A088T-S249A, A116T-Q206D, A116T-S248N, A1 16T-S249A, G024E, G024E-G131 H, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131H-K256R, G131 H-L257G, K043Y- 256R, K043Y-N076D, K256R, L257G, N076D-A088T, N076D-K256R, N076D-S162G, N076D-S248N, N076D-S249A, N109G-N243P-S248A-K256R, N109G-N243P-S248N-K256R, N243V, Q206D-K256R, S033T-P040E-Q103H-N109G, S063G, S063G-A116T, S063G-Q206D, S162G-K256R, S162G-L257G, S162G-N243V, S162G-Q206D, S162G-S248N, S248N, S248N-L257G, S249A, S249A-L257G, T158S, T158S-N243V y T158S-Q206D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo proteolitico de AAPF: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A001 E-G13 H, A001 E-S063G, A088T-G131H, A088T-T158S, A116T-G131H, A116T-S162G, A116T-T158S, G024E-S063G, G131H-N243V, G131 H-N243V-K256R, G131 H-Q206D, G131H-S249A, K043Y, K043Y-S063G, K043Y-S248N, K043Y-S249A, K043Y-T158S, N076D, N076D-G131 H, N076D-T158S, N243V-S248N, N243V-S248N-K256R, N243V-S249A, Q103H-G169A, Q206D-S249A, S063G-N076D, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-S249A, S063G-T158S, S162G, S162G-S249A, S248N-K256R, S248N-S249A, S249A-K256R, T158S-K256R, T158S-S248N y T158S-S249A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo proteolítico de AAPF: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'- S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G131 H-S162G, G131 H-S248N, G131 H-T158S, K043Y-G131 H, K043Y-S162G, S063G-A088T, S063G-G131H, S063G-S248N, T158S-S162G, Q103H-N218S, S033T-Q103H y Q103H-A128S, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene actividad proteolítica, una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', o un valor del Pl mayor que el de BPN' (SEQ ID NO:2) en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X001 E, X009T, X018T, X021 N, X024G, X033T, X040A, X043Y, X061G/P/S, X063G, X076D, X088T, X103H, X109A/G/Q/S, X116T, X128S, X131 H, X141 R, X158S, X162G, X169A, X204E, X206D, X218S, X243P V, X248A/N, X249A, X256R, X257G, y X260P, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2 y, opcionalmente, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de A001E, S009T, S018T, Y021 N, S024G, S033T, P040A, K043Y, N061G/P/S, S063G, N076D, A088T, Q103H, N109A/G/Q/S, A116T, G128S, G131 H, K141R, T158S, S162G, G169A, S204E, Q206D, N218S, ?243?? , S248A/N, S249A, K256R, L257G y S260P. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 9 Construcción y rendimiento de limpieza de variantes de una qenoteca combinatoria basada en BPN'-v36 parental DNA 2.0 preparó una genoteca combinatoria de BPN' basada en la molécula parental de BPN'-v36 y la suministró como una reacción de ligación. Para la transformación eficaz de S. subtilis se amplificó ADN a partir de las mezclas de reacción de ligación antes de la transformación y los transformantes se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Se probaron las variantes para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8 y un ensayo en micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v36 (es decir, BPN'-S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1 .0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T- G131 H-A153S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S, A088T-N109G-A116T-G131 H-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N, A088T-N109G-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, A1 16T-T158S-S248N-L257G, Y006H-A116T-G131 H-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-G13 H-T158S-N243V, A088T-A116T-G13 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V, A088T-A1 16T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T 58S-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-A1 16T-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-V148A-N218S-N243V-K256R: L257G, A088T-N109G-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A1 16T, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A1 16T-T158S-K256R-L257G, N109G-A1 6T-K256R-L257G, N109G-A116T-N243V, N109G-A1 6T-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R-L257G, S003P-A1 16T-T158S-S248N-K256R, T158S-S248N-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-N243V- K256R, A088T-A116T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A1 16T-S248N-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S, A088T-A1 16T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-L257G, A088T-G131 H-N243V-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-L257G, A088T-N109G-A1 16T, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N218S, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G13 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-W241 R-S248N-K256R, A088T-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N243V, A088T-N109G-N243V-K256R, A088T-N109G-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R, A088T-N 109G-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D, A088T-N109G-T158S-S248N-L257G, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-T158S-N243V-L257G, A1 16T-G1 31 H-N218S-N243V-S248N, A1 16T-G131 H-S248N-L257G, A1 16T-S248N-K256R-L257G, A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R, A1 16T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q271 R, A1 16T-T158S-N243V-K256R-L257G, A1 16T-T158S-N243V- S248N-L257G, G131 H-S248N, G131 H-T158S-I234T-N243V-K256R, G1 31 H-W241 L-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-A137V-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-A151 S-N218S-K256R-L257G, N1 09G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N, N109G-A1 16T-S248N, N109G-A1 16T-T158S-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-W241 R-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 16T-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-S248N-L257G, N109G-G1 31 H-N218S-L257G, N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-G1 31 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-A274T, N109G-K256R, N109G-N243V-L257G, N109G-T158S-N218S-K256R-L257G, N109G-T158S-N218S-L257G, N 109G-T158S-S248N-K256R, P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G02OA-Y021 T-T022L-G023E, S003F-A088T-N 09G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, V004A-A088T-A1 16T-T158S-N218S, V004A-N109G-A1 16T-G13 H-S248N-K256R-L257G, V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G, Y006H-N109G-N218S-N243V-S248N, A001T-A1 16T-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T, A088T-A116T-G131 H-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-N218S-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-N243V-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-K256R-L257G, A088T-A1 6T-G131 H-T158S-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S, A088T-A1 16T-G13 H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N- K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A116T-K256R, A088T-A116T-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N218S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-N243V-K256R, A088T-A116T-N243V-L257G, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S, A088T-A1 16T-T1 58S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-T1 58S-N243V-S248N-K256R, A088T-A1 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A116T-G131H-S248N-K256R, A116T-G131H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R, A116T-G131H-T158S-N243V-L257G, A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-G131H-V143F-T158S-N218S, A116T-L257G, A116T-N218S, A116T-N218S-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G, A116T-N243V, A116T-N243V-K256R, A116T-N243V-S248N, A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-S248N, A116T-T158S, A116T-T158S-N218S-N243V, A116T-T158S-N218S-S248N, A116T-T158S-N243V, A116T-T158S-N243V-K256R, A116T-T158S-N243V-L257G, A116T-T158S-N243V-S248N, A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H, G131H-N218S-N243V-L257G, G131H-N243V, G131H-N243V-S248N-K256R, G131H-T158S, G131H-T158S-N218S-N243V-K256R, G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, G 3 H-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 6T-G 31 H-N218S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R, N109G-A116T-G131H-N243V-K256R, N109G-A116T-G131H-N243V-L257G, N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-S248N, N 109G-A116T-G13 H-S248N-I268V, N 109G-A116T-G 3 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G, N 109G-A116T-G131 H-T158S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-A116T-N218S, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-N218S-S248N-L257G, N 109G-A116T-N243V-K256R, N 109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-G21 1V-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S, N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N243V, N109G-A116T-T158S-Q275R, N109G-G131 H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131 H-N218S-K237N, N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R, N109G-G131 H-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S-L257G, N109G-N218S-N243V, N109G-N243V-K256R-L257G, N109G-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-T158S-I268V, N109G-T158S-K256R, N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-T158S-N243V, N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-T 58S-N243V-S248N, N109S-A116T-S248N, N218S, N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-L257G, N243V, N243V- K256R, N243V-S248N-K256R, N243V-S248N-K256R-L257G, S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, S248N, T158S-N243V-K256R y T158S-N243V-L257G, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A088T, A088T-A116T-G131 H-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-A274T, A088T-A116T-G131 H-N218S-K256R, A088T-A116T-G131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-A1 6T-G131H-N218S-N243V, A088T-A1 16T-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-G 131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A 16T-G131 H-N218S-S248N, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-N243V, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R, A088T-A116T-G131 H-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H-N243V-S248N-A274V, A088T-A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A 6T-G 3 H-N243V-S248N-L257G, A088T-A 6T-G13 H-S248N-K256R, A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G13 H-T158S-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R, A088T-A116T-G13 H-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-L257G, A088T-A1 16T-G 131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A116T-G 131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H- T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-K256R, A088T-A116T-L257G, A088T-A116T-N218S, A088T-A116T-N218S-N243V-K256R, A088T-A116T-N218S-N243V-N269D, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-N218S-S248N, A088T-A116T-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-S248N, A088T-A116T-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-K256R, A088T-A116T-T158S-N2 8S-N243V-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R, A088T-A 16T-T158S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A1 6T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-A1 16T-T158S-S248N, A088T-G131 D-T 58S-N243V-S248N, A088T-G131 H-A138V-N218S-L257G, A088T-G131H-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-G131 H-N218S-S248N, A088T-G131 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A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-S248N, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-K256R, A088T-N109G-A 16T-G131 H-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R, A088T- 109G-A1 16T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T- N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218T-K256R, A088T-N109G-A1 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?116T-N218S-S248N, A116T-N218S-S248N-K256R, A116T-N218S-S248N-L257G, A116T-N243V-S248N-L257G, ?1 16T-S248N-L257G, A116T-T158S-L257G-Q271 R, ?1 16?-T158S-N218S-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, ?1 16?-T158S-N218S-S248N-K256R, ?116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S, G131H, G13 H-N218S, G131 H-N218S-K256R, G131 H-N218S-N243V-K256R, G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, G131 H-N218S-N243V-S248N, G131H-N218S-N243V-S248N-K256R, G131H-N218S-S248N-K256R-L257G, G131H-N218S-S248N-L257G, G131 H-N243V-K256R, G131 H-N243V-K256R-L257G, G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, G131 H-S248N-K256R, G131 H-T158S-K256R, G131 H-T158S-K256R-L257G, G131 H-T158S-N218S-K256R, G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G, G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, G131 H-T158S-N218S- N243V-S248N, G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, G131 H-T1 58S-N218S-S248N-L257G, G131 H-T 58S-N243V-K256R, G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, G131H-T158S-S248N-L257G, G131 H-V147I-N218S-S248N-K256R, I107T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, I107T-N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G, N109G-A116T-G131 H, N109G-A116T-G131 H-A144V-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-N243V, N109G-A116T-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-N243V-S248N, N109G-A116T-G 31 H-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-S248N-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, N 09G-A116T-G131 H-T158S-N218S, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, N109G-A116T-GÍ31 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N 109G-A116T-G 131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-V147A-T158S-N218S-K256R-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-V149A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-K256R, N109G-A1 16T-N218S-K256R, N109G-A116T-N218S-N243V, N109G-A116T-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-I268V, N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 16T-N243V-S248N, N109G-A116T-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A 6T-T 58S-N218S-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-N243V-L257G, N109G-A116T-T158S-N243V-S248N, N109G-A116T-T158S-S248N, N109G-A116T-T158S-S248N-K256R, N109G-G131 H, N109G-G131 H-K256R, N109G-G131 H-N218S-K256R, N109G-G131H-N218S-K256R-L257G, N109G-G131H-N218S-N243V-L257G, N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-G131 H-N218S-S248N-L257G, N109G-G131 H-N243V, N109G-G131 H-N243V-K256R, N109G-G131 H-N243V-S248N, N109G-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-N243V-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G, N109G-G131H-T158S-N218S-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N 109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-I268V, N109G-G131H-T158S-N243V-S248N, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N, N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-K141 E-N218S-S248N-L257G, N109G-N218S, N109G-N218S-N243V-K256R, N109G-N218S-N243V-L257G, N109G-N218S-N243V-S248N-S260F, N109G-N218S-S248N, N109G-N218S-S248N-K256R, N109G-N243V-K256R, N109G-N243V-S248N, N109G-N243V-S248N-K256R, N109G-N243V-S248N-L257G, N109G-N243V-S248N-L257G-Q275R, N109G-S182F-S204F-S207L-N218S-S236F-S248N-L257G, N109G-S248N-K256R, N109G-T158S-K256R-L257G, N109G-T158S-L257G, N109G-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-T158S-N243V-K256R, N109G-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-T158S-S248N-L257G, N218S-N243V-L257G, N218S-N243V-S248N-K256R, N243V-K256R-L257G, N243V-S248N-L257G-Q271R, P057Q-A088T-N109G-A1 16T-G131H-T158S-N218S-S248N, S003P-A116T-N218S-K256R, S003P-N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, S248N-K256R-L257G, T158S-K256R-L257G, T158S-N218S-A272V, T158S-N218S-K256R-L257G, T158S-N218S-L233S, T158S-N218S-N243V, T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, T158S-N218S-N243V-L257G, T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, T158S-N218S-S248N-K256R, T158S-N243V, T158S-N243V-K256R-L257G, T 58S-N243V-S248N, T158S-N243V-S248N-K256R-N269D y V004A-N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-L257G, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S 01 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-A098S-N218S-K256R, A088T-A116T-G131 H-K256R, A088T-A116T-G131 H-K256R-L257G-L267M, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-G13 H-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N, A088T-A1 6T-G131H-N2 8S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-N243V, A088T-A116T-G 31 H-S248N, A088T-A116T-G131 H-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N218S-I268V, A088T-A1 16T-N218S-K256R, A088T-A1 16T-N218S-N243V-Q271 R, A088T-A1 16T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R, A088T-A116T-N218S-S248N, A088T-A116T-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S, A088T-A1 16T-T158S-N218S-K256R, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-A1 16T-T1 58S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S-S248N-L257G, A088T-G131 H, A088T-G131 H, A088T-G13 H-N218S-K237R-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-K256R, A088T-G131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-S248N, A088T-G131 H-N243V, A088T-G131 H-N243V-K256R, A088T-G131 H-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-N243V-S248N, A088T-G131 H-N243V-S248N, A088T- G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-S248N, A088T-G131 H-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-T 58S-N218S-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N218S-N243V-S248N-N269D, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-Q275R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N243V-S248N, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S, A088T- 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G-I268V, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N 109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N , A088T-N 109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N, A088T-N 109G-A116T-G13 H-T 58S-S248N , A088T-N 109G-A116T-G131 H-W241 L-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-A116T-N218S-S248N, A088T-N 109G-A1 16T-T158S-N218S, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N 109G-A116T-T158S-N243V-S248N, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N1O9G-G131 H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V, A088T-N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R, A088T-N109G-G131H-N243V-S248N, A088T-N109G-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S, A088T-N109G-G131 H-T158S-L233S-N243V-S248N, A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-N 109G-G 131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-G 131 H-T158S-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-V149A-K256R-L257G, A088T-N109G-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-N243V-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S, A088T-N109G-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T1 58S-N218S-S248N, A088T-N109G-T158S-S248N, A088T-N109G-T158S-S248N, A088T-N218S-N243V-K256R, A088T-N218S-N243V-L257G, A088T-N218S-N243V-S248N, A088T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N218S-S248N, A088T-N218S-S248N-L257G, A088T-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N, A088T-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K, A088T-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R, A088T-T158S-N243V-S248N, A088T-T1 58S-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-S248N-L257G, A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G, A116T-G131 H-L257G, A116T-G13 H-N2 8S-N243V, A1 16T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G 31 H-N218S-S248N, A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R, A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A1 16T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A116T-G131 H-V139I-N218S-N243V-S248N, A1 16T-K141 E-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A1 16T-K256R, A1 16T-N218S- N243V-S248N, A116T-N218T-N243V-S248N, A116T-N243V-K256R-L257G, A116T-S248N-K256R, A116T-T158S-N218S-K256R, A 16T-T158S-N218S-K256R-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A116T-T158S-N218S-S248N-L257G, G024S-G053S-N078S-G097A-N101S, G053S-A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G, G131H-K141R-T158S-N218S-K256R, G131H-K256R, G131H-N218S-K256R-L257G, G131H-N218S-N243V-S248N-L257G, G131H-N218S-S248N-K256R, G131H-N243V-S248N, G131H-N243V-S248N-L257G, G131H-T158S-N218S, G131H-T158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S-N243V, G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S, G131H-T158S-N243V-L257G, G131H-T158S-N243V-S248N, G131H-T158S-S248N, K256R, K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-W241R-N243V-K256R, N 109G-A116T-G13 H-S248N-L257G, N 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R, N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 6T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G, N 09G-A116T-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N, N109G-G131H-N218S-N243V-S248N, N109G-G131H-S248N, N109G-G131H-T158S, N109G-G131 H-T158S-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-T1 58S-N218S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-N218S-K256R-L257G, N109G-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-N218S-S248N-L257G, N109G-S248N, N109G-T158S-N218S, N109G-T158S-N218S-N243V, N109G-T158S-N243V-L257G, N218S-K256R, N218S-N243V-K256R, N218S-N243V-S248N, N218S-S248N, N218S-S248N-K256R, N243V-L257G, S003P-N109G-A116T-G1 31 H-N218S-N243V-S248N, S003P-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-K256R, S105H-W106G-I107L-I108S-N109A-G110A-I1 11 S-E1 12N-W113G-A1 14P, S248N-L257G, T158S, T158S-K256R, T158S-N218S, T158S-N218S-K256R, T158S-N218S-L233S-S248N, T158S-N218S-L257G, T158S-N218S-N243V-K256R, T158S-N218S-N243V-S248N, T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, T158S-N218S-S248N-L257G, T158S-N243V-S248N-L257G, T158S-S248N y V004L-A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI (Método de prueba 3) en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A015S-A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-A098S-G131H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A 16T-G13 H-T158S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-N218S-L257G, A088T-A1 16T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-K256R, A088T-G131 H-N218S-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131H-N218S-S248N-K256R, A088T- G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-1107T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-N1O9G-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N 09G-A 6T-G 3 H-T 58S-N243V-S248N-K256R-I268V, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 6T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-D140G-N243V, A088T-N1 O9G-G131 H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-K141 E-T158S-N218S-K256R, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N, A088T-N1 O9G-G131 H-N218S-S248N-K256R-Q271 R, A088T-N 109G-G131 H-N218S- S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T- 109G-G 131 H-V1 9L-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S, A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271 K, A088T-N109G-T158S-N218S-L257G, A088T-N109G-T158S-S248N-K256R, A088T-N218S-S248N-L257G-Q271 R, A088T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-Y104H-A1 16T-G131 H-N218S-N243V, A116T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A1 16T-G 131 H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D, A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N-Q271 R, A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A1 16T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-T158S-N218S, G131 H-N218S-L257G, G131 H-N218S-S248N, G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, G131 H-T158S-N218S-S248N-I268V, I107T-N1 O9G-G131 H-N218S-L257G, L090I-N109G-T158S-N243V, L257G, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271 R, N109G-A1 16T-N218S- W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-K141 E-L257G, N109G-G131H-N218S-N243V, N109G-T158S-N218S-N243V-L257G, N 109G-T158S-N218S-S248N-K256R, N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-K256R-L257G, S003P-N109G-G131 H-T158S-L257G, S003P-S248N-L257G, T158S-S248N-K256R-L257G, V004A-A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, Y006H-N218S-N243V-S248N, Y104H-N109G-G 131 H-N243V-S248N, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V, A088T-G131 H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-1107T-N109G-G 131 H-N218S-A223G-S248N-K256R, A088T-K213N-N243V-S248N-K256R, A088T-K256R-L257G, A088T-N109G-A 16T-G131 H-A232S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-D 140G-S248N-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-M124I-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N 109G-A116T-V148A-N218S-N243V, A088T-N 109G-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G, A088T- T158S-N218S-L257G, A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-S248N-K256R, A1 16T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A1 16T-G131 H-N218S-W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, A1 16T-G131 H-T1 58S-N218S-L257G, A116T-G131 H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, I107T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-K141 E-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N, T158S-N243V-S248N-K256R, T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-G146C, A088T-A1 16T-N218S, A088T-A1 16T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A138E-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243F-S248N, A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G, A1 16T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T1 58S-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251 K-K256R-L257G, A088T-I108T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G 31 H-K14 E-N218S, A088T-N 109G-W241 R-S248N-K256R y G065D-A088T-G131 H-N243V-S248N, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones acidas seleccionadas de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 -G128A-Y217Q secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A088T-A 16T-K256R, A088T-G131 H-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-A273T, A088T-A116T-N243V-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N- L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-N243V-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-N218S-S248N-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-I268V, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G, A1 16T-N218S-K256R-L257G, N109G-A1 16T, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-L257G, N109G-A1 16T-N243V, N109G-A1 16T-N243V-K256R, N109G-A116T-T158S-L257G, N109G-K256R, N109G-N243V-K256R-L257G, S003P-N 09G-G13 H-T158S-K256R, A088T-A116T, A088T-A1 16T-G131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-A 16T-G131 H-N218S-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G 131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T 58S-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A1 16T-N218S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-Q275R, A088T-A1 16T-T158S-A216S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-N269S, A088T-A116T-T158S-N243V, A088T-A1 16T-T158S-N243V-K256R, A088T- A116T-V147I-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-G131 H-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-I107T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-I107T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-A153S-N218S-S248N-L257G, A088T- 109G-A1 16T-G131 H-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S, A088T-N109G-A116T-G 31 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-N218S-L257G, A088T-N109G-A1 16?-N218S-N243V, A088T-N109G-A1 16T-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-N218T-K256R, A088T-N109G-A116T-N218T-K256R-L257G, ?088?-N109G-A1 16T-N243V, A088T-N109G-A1 6T-N243V-K256R-L257G, ?088?-? 109G-A1 16T-N243V-K256R-L257G-N269D, ?088?-? 109G-A1 16?-?158S, A088T-N109G-A1 16T-T158S, A088T-N109G-A116T-T158S-L257G, ?088?-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16?-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G, ?088?-?109G-A1 16?-?158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, ?088?-N109G-G131 H-A138V-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G- G131 H-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S, A088T-N109G-G131 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A088T-N109G-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-V147A-N218S-N243V-K256R, A088T-N218S-L257G-I268V, A088T-N218S-N243V, A088T-N218S-N243V-S248N, A088T-N218S-N243V-S248N-N269S, A088T-N218S-S248N-K256R, A088T-N218S-S248N-L257G-Q271 R, A088T-N243V, A088T-N243V, A088T-N243V-K256R, A088T-N243V-S248N-K256R, A088T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-S248N, A088T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G-Q271 H, A088T-T158S-N243V-S248N, A088T-T158S-N243V- S248N-L257G, A088T-T158S-S248N, A088T-V147A-K256R, A116T-G131H-K256R, A116T-G131H-N218S, A 16T-G131H-N218S-K256R-L257G, A116T-G131H-N218S-L257G, A116T-G131H-N218S-N243V, A 16T-G13 H-N218S-S248N-K256R, A116T-G131H-N218S-S248N-K256R-L257G, A116T-G131H-N243V-S248N, A116T-G131H-N243V-S248N-L257G, A116T-G131H-S248N-K256R, A116T-G131H-T158S-A231V-N243V-L257G, A116T-G131H-T158S-N218S-K256R, A116T-G131H-T158S-N218S-K256R-L257G, A116T-G131H-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G, ?116T-G131 ?-?158S-N218S-N243V-S248N-K256R, ?116T-G 3 ?-?158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G131H-T158S-N218S-S248N, ?116T-G 31H-T158S-N243V-L257G, ?116T-G131 ?-?158S-N243V-S248N-K256R, ?116T-G131 ?-?158S-S248N-K256R, A116T-G131H-T158S-S248N-L257G, A116T-G131H-V143F-T158S-N218S, A116T-K256R, A116T-N218S, A116T-N218S-K256R, A116T-N218S-N243V-L257G, ?116T-N218S-N243V-S248N-K256R, ?116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A 16T-N2 8S-N243V-S248N-L257G, A116T-N218S-S248N-L257G, A116T-N243V, ?116T-N243V-K256R-L257G, A116T-N243V-S248N, A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, ?116T-S248N-K256R-L257G, A116T-T158S-K256R-L257G, A 6T-T158S-N218S, A 6T-T158S-N218S-K256R, A116T-T158S-N218S-N243V, A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A116T-T158S-N218S-S Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con ???' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A015S-A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N, A088T, A088T-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N, A088T-A1 6T-G131H-N218S-S248N, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-N243V, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R, A088T-A116T-G131 H-N243V-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-V1 7A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-N218S-I268V, A088T-A116T-N218S-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-N269D, A088T-A1 16T-N218S-S248N, A088T-A1 16T-N218S-S248N, A088T-A116T-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N, A088T-A1 16T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S-S248N, A088T-A1 16T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-S248N-L257G, A088T- A116T-V143A-N218S-S248N-K256R, A088T-G131 H-A138V-N218S-L257G, A088T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-K256R, A088T-G131 H-N218S-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-S248N, A088T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-G13 H-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-N243V-S248N, A088T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-S248N, A088T-G131 H-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-K256R, A088T-G1 31 H-T158S-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T1 58S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N243V, A088T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N- 256R-L257G, A088T-G131H-T158S-S248N-L257G, A088T-I107T-N109G-G131 H-N218S-A223G-S248N-K256R, A088T-L257G, A088T-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-A232S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-K256R, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-N243V-S248N-N269D, A088T-N 109G-A116T-G131 H-N243V-K256R, A088T-N 109G-A116T-G 131 H- S248N, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243F-S248N, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T1 58S-N218S-N243V, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218T-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A088T-N 109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V, A088T-N 109G-A1 16T-G 131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N 109G-A116T-G 131 H-T158S-S248N, A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-V1 9A-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A 16T-K256R, A088T-N109G-A116T-N218S-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-S248N, A088T-N109G-A1 16T-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-S248N, A088T-N109G-A1 16T-T158S-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-G 131 H-N218S-S248N-K256R-L257G-Q275R, A088T-N109G-G13 H-N2 8S-S248N-K256R-Q271 R, A088T-N109G-G131 H-N243V, A088T-N109G-G131 H-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-S248N-K256R, A088T-N109G-G13 H-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S, A088T-N109G- G131H-T158S, A088T-N109G-G131H-T158S- 256R, A088T-N109G-G1 31 H-T158S-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-T1 58S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, ?088?-?109G-G131 ?-?158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131H-T158S-S248N, A088T-N109G-G1 31 ?-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-V149A-K256R-L257G, ?088?-N109G-G131H-V149L-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R, ?088?-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N218S-K256R, A088T-N109G-N218S-N243V-K256R, ?088?-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-N218S-S248N, A088T-N109G-N218S-S248N-L257G, ?088?-? 09G-N243V-K256R, ?088?-? 109G-N243V-S248N-L257G-I268V, A088T-N109G-S248N, A088T-N109G-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S, A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-Q271 H, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 09G-T158S-N2 8S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N218S-S248N-N269D, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, ?088?-? 109G-T158S-N243V-S248N-A274D, ?088?-? 109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G-N269D, A088T-N218S-K256R, A088T-N218S-N243V, A088T-N218S-N243V-K256R, A088T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N218S-S248N-L257G, A088T-N243V-S248N, A088T-N243V-S248N-K256R, A088T-N243V-S248N-L257G, A088T-S145T-T158S-S248N, A088T-S248N-K256R-L257G, A088T-S248N-L257G, A088T-T158S, A088T-T158S, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S-L257G, A088T-T158S-N218S, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N, A088T-T158S-N218S-S248N, A088T-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R, A088T-T158S-N243V-S248N-L257G, A116T, A1 16T-G131 H-L257G, A116T-G131 H-N218S-K256R, A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A1 16T-G131 H-N218S-S248N, A116T-G131 H-T158S-K256R, A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A116T-G131H-T158S-N218S-N243V-K256R, A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-L257G, A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A1 16T-G 13 H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D, A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-Q271 R, A116T-G131 H-T158S-N218T-L257G, A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A116T-G131 H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-K141 E-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-L257G, A1 16T-N218S-N243V-S248N, A116T-N218T-N243V-S248N, A116T-N243V-S248N-L257G, A1 16T-S248N, A116T-S248N-L257G, A116T-T 58S-K256R, A1 16T-T158S-N218S-L257G, A116T-T 58S-N218S-N243V-K256R, A116T-T158S- N218S-N243V-L257G, A116T-T158S-N243V, A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H, G024S-G053S-N078S-G097A-N101S, G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S, G131H-K256R, G131H-N218S-K256R-L257G, G131H-N218S-N243V-L257G, G131H-N218S-N243V-S248N-K256R, G131H-N218S-S248N-K256R, G131H-N218S-S248N-L257G, G131H-N243V, G131H-N243V-S248N, G131H-N243V-S248N-L257G, G131H-T158S-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S, G131H-T158S-N218S-K256R, G131 ?-?158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S-N243V-K256R, G131H-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S-N243V-S248N, G13 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S-S248N-I268V, G131H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S, G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, G131H-T158S-N243V-S248N, G131H-T158S-N243V-S248N-K256R, G131H-T158S-S248N, G131H-T158S-S248N-L257G, G131H-W241L-N243V-S248N-K256R, I107T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, ?107?-N109G-G131H-N218S-L257G, N109G-A 16T-G131H-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V, N109G-A116T-G 131 ?-?218S-N243V-S248N-K256R, ? 109G-A116T-G 131 ?-?218S-W241 R-N243V-K256R, N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131H-S248N-I268V, N109G-A116T-G 31H-T158S-N218S, N109G-A116T-G 131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, N 109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-A 16T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G, N 109G-A1 16T-G 131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N 109G-A116T-G1 31 H-T158S-S248N-L257G, N109G-A116T-K141 E-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A1 16T-K256R, N109G-A1 16T-N218S-N243V, N109G-A1 16T-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-N218S-S248N-L257G, N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-S248N, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A1 16T-T158S-N218S-W241 R-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-S248N, N109G-A116T-T158S-S248N-L257G, N109G-G131H-K256R, N109G-G131H-N218S-K256R, N109G-G131H-N218S-N243V, N109G-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V, N109G-G131H-N243V-S248N, N109G-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-S248N, N109G-G131 H-T158S-L257G, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N 109G-G 131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N 109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-K141 E-N218S-S248N-L257G, N109G-N218S-N243V, N109G-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-N218S-S248N-L257G, N 09G-N243V-S248N-L257G-Q275R, N109G-T158S-I268V, N109G-T158S-N218S, N109G-T158S-N218S-N243V, N109G-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-T158S-N218S-S248N-K256R, N109S-A116T-S248N, N218S-K256R, N218S-N243V-K256R, N218S-N243V-L257G, N218S-N243V-S248N, N218S-S248N, N218S-S248N-K256R, N218S-S248N-K256R-L257G, S003P-N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N- K256R-L257G, S248N-K256R-L257G, T158S-K256R, T158S-K256R-L257G, T158S-N218S-K256R-L257G, T158S-N218S-L233S-S248N, T158S-N243V, T158S-N243V-S248N-K256R-N269D, T158S-N243V-S248N-L257G, V004L-A116T-N218S-N243V-S248N-L257G y Y006H-N218S-N243V-S248N, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A088T-A098S-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-K256R, A088T-A116T-G 131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-G 13 H-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-G131H-S248N, A088T-A116T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-K256R-L257G, A088T-A116T-K256R-L257G, A088T-A116T-N218S-N243V-Q271 R, A088T-A116T-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S, A088T-A116T-T158S, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-G131 H, A088T-G131 H-L257G, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-N243V-K256R, A088T-G131H-N243V-L257G, A088T-G131H-N243V-S248N, A088T-G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G, A088T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N, A088T-G131 H-T158S-S248N-K256R, A088T-G 31 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-G 31 H-V 49L-T 58S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G 131 H-K141 E-N218S, A088T-N 109G-A 16T-G131 H-N218S-N243V-S248N-Q275R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N, A088T-N109G- A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-K256R, A088T-N1 09G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A1 16T-G1 31 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T1 58S-S248N, A088T-N109G-A116T-G131H-V149A-T158S-N218S-K256R, A088T-N109G-A116T-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-D140G-N243V, A088T-N 109G-G 131 H-A152S-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-G131H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-K256R-L257G, A088T-N109G-G131H-N218S, A088T-N109G-G13 H-N218S-N243V, A088T-N109G-G131 H-T158S-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-W241 R-S248N-L257G, A088T-N109G-G13 H-T158S-S248N-K256R, A088T-N109G-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-Q275R, A088T-N109G-T158S-S248N, A088T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N243V-L257G, A088T-S248N, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-L257G, A088T-T158S-N218S-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-T158S-N2 8S-Q245K-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K, A088T- T158S-N243V-K256R, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-T1 58S-N243V-S248N-K256R, A088T-T158S-S248N, A088T-T 58S-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-S248N-L257G, A088T-T158S-S248N-L257G, A098S-G131 H-T158S-N2 8S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A116T-G131 H-N218S-W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G131H-N243V, A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R, A116T-G131 H-V139I-N218S-N243V-S248N, A116T-N218S-S248N-K256R, A116T-T158S-L257G-Q271 , A 16T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, G053S-A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G, G131 H-N218S-L257G, G131 H-T158S, G131 H-T158S-K256R, K256R, L090I-N109G-T158S-N243V, L257G, N109G-A 16T-G131H, N109G-A116T-G13 H-N243V, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-N218S- 237R-N243V-S248N, N109G-A116T-T158S-S248N, N109G-G131 H-T158S, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S-S248N-K256R, N109G-N243V-S248N-L257G, N109G-S248N, N109G-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, S003P-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-K256R, S003P-N109G-G 131 H-T158S-L257G, S105H-W106G-I107L-1108S- 109A-G110A-11 11 S- E112N-W113G-A114P, T158S-N218S-S248N-K256R, T158S-N243V-S248N, T158S-S248N, T158S-S248N-K256R-L257G, V004A-A088T-A116T-T158S-N218S, V004A-A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, Y006H-N109G- N218S-N243V-S248N, Y104H-A116T-T158S-S248N, A088T-A1 16T-G1 31 H-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N2 8S-N243V-L257G, A088T-A116T-G 31 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 6T-N2 8S, A088T-G 131 D-T 158S-N243V-S248 N , A088T-G 131 H-N218S-K237R-K256R-L257G, A088T-G131 H-N218S-K256R, A088T-K213N-N243V-S248N-K256R, A088T-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-D140G-S248N-L257G, A088T-N109G-A 6T-G131H-L257G, A088T-N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N 109G-A116T-M124I-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N218S-S248N, A088T-N109G-G131H-K256R-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-G131H-N243V-S248N, A088T-N109G-G131 H-T158S-L233S-N243V-S248N, A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G, A088T-N 09G-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T 58S-N2 8S-N243V, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N 109G-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-S248N, A088T-S248N-K256R-L257G, A088T-S248N-L257G-I268V, A088T-T158S-N243V-L257G, A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G, A088T-Y104H-A116T-G131H-N218S-N243V, A1 16T-D140G-T 58S-N218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-T158S-K256R-L257G, A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N, A116T-G157E-T158S-N243V-S248N- K256R, A116T-S248N-K256R, G131H-N218S-S248N, G131H-N243V-K256R, G131 H-T158S-N243V-L257G, K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-N218S-N243V-L257G, N109G-A1 16T-N218S-W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N243V, N109G-A116T-T158S-S248N-K256R, N109G-N243V, N109G-T158S-K256R-L257G, N243V, P014L-A015L-L016C-H017T-S018L-Q019K-G020A-Y021T-T022L-G023E, S003P-S248N-L257G, T158S-N218S-N243V-S248N, T1 58S-S248N-K256R, Y104H-N109G-G131H-N243V-S248N, A088T-A116T-G131 H-L257G, A088T-A116T-G131 H-N218S-N243V, A088T-A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-L257G, A088T-A116T-N218S, A088T-A116T-N218S-N243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-S248N, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-A138E-N218S-N243V-K256R, A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G 31 H-T158S-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G-I268V, A088T-N109G-A116T-G131H-W241 L-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N2 8S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-S248N, A088T-N109G-G131H-N218S-L257G, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-S248N-K256R, A088T-N109G-W241 R-S248N-K256R, A088T-N218S-S248N-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T- T158S-N218S-S248N-L257G, A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A1 16T-N218S-S248N, A116T-N243V-K256R, A116T-T158S, G131 H-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A1 16T-T158S-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H, N109G-G131 H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131 H-K141E-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-A1 6T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-S248N, A088T-S248N-L257G, A088T-Y104H-N109G-G131 H-A137E-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, G065D-A088T-G131H-N243V-S248N, Y104H-N218S-L257G, A088T-A1 16T-G131H-V150A-N218S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S-K256R-L257G, A088T-I108T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G-Q271 P, A088T-N109G-A116T-V148A-N218S-N243V, A088T-Y104H-N109G-A116T-A153S-N218S-N243V-S248N-L257G-N269D y V004M-A1 16T-V148A-T158S-N243V-S248N-K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v36 y/o BPN-'v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo o micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X001 R/T, X002R, X003F/P, X004A/UM/P, X005S, X006H, X014L, X015US, X016C, X017T, X018L, X019K, X020A, X021T, X022L, X023E, X024S, X034S, X053S, X057Q, X065D, X078S, X086L, X088T, X090I, X097A, X098S, X101S, X104H, X105H/P, X106G, X107L/T, X108S/T, X109A/G/S, X110A, X111S, X112N, X113G, X114P/S, X116T, X124I, X128S, X131D/H, ?137?? , X138E V, X139I, X140G, X141 E/R, X143A/F, X144V, X145F/P/T, X146C, X147A/I, X148A, X149A/I/L, X150A, X151S, X152S, X153S, X154A, X155P, X156T, X157E/L, X158M/S, X159E, X160E, X161 L, X169S, X182F, X203I, X204F, X207L, X211V, X212D, X213N, X216S, X218S T, X223G, X231V, X232S, X233S, X234T, X235P, X236F/P, X237N/R, X240H, X241 UR, X243F/V, X245K, X248N, X251 K, X255K, X256R, X257G, X260F, X267M, X268V, X269D/S, X27 H/K/P/R, X272G/V, X273T, X274D/LJT/V y X275K/R/S y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de A001 R/T, Q002R, S003F/P, V004A/IJM/P, P005S, Y006H, P014L, A015US, L016C, H017T, S018L, Q019K, G020A, Y021T, T022L, G023E, G024S, G034S, G053S, P057Q, G065D, N078S, P086L, A088T, L090I, G097A, A098S, N101S, Y104H, S105H/P, W106G, I107L/T, I108S/T, N109A/G/S, G110A, I111S, E112N, W1 13G, A114P/S, A116T, M124I, A128S, G131 D/H, ?137??/, A138E V, V139I, D140G, 141 E/R, V143A F, A144V, S145F/P T, G146C, V147A/I, V148A, V149A/I/L, V150A, A151S, A152S, A153S, G154A, N155P, E156T, G157E/L, T158M/S, S159E, G160E, S161 L, G169S, S182F, V203I, S204F, S207L, G211V, N212D, K213N, A216S, N218S T, A223G, A231V, A232S, L233S, I234T, L235P, S236F/P, K237N/R, N240H, W241 UR, N243FA , Q245K, S248N, E251 K, T255K, K256R, L257G, S260F, L267M, I268V, N269D/S, Q271 H/K/P/R, A272GA/, A273T, A274D/L/T/V, Q275K/R/S, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción. Ejemplo 10 Construcción y rendimiento de limpieza de variantes adicionales de BPN'-v36 El ADN de las genotecas de evaluación del sitio del BPN'-v36 (descrito en el Ejemplo 7) se mutagenizó aun más por PCR propensa a error. Estas genotecas se amplificaron con los iniciadores P4973 y P4950 (descritos en el Ejemplo 7) y con ADN polimerasa Taq (Promega). Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador, 100 ng del ADN molde (SEL de la BPN'-v36) y varias cantidades de MnCI2. La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, la hibridación a 55 °C por 15 s y la extensión a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción BamHI y H¡nd\\\ y se ligó con el vector de pHPLT-BPN' partial opt que, además, se procesó por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por círculo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con la recomendación del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 pl del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Se colocó una alícuota de la mezcla de transformación sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C.
Aproximadamente 500,000 clones se analizaron previamente en las placas de leche descremada. Muy pocos de estos formaron halos (es decir, indicativo de la presencia de proteasa funcional). Se recogieron las colonias con halos, se inocularon en 150 µ? de medio de LB que contenía 10 pg/mL de neomicina y se secuenciaron (Quintara). Para analizar las secuencias de estos clones se buscaron combinaciones de mutaciones producidas muchas veces en este grupo que podrían proveer beneficios en el rendimiento. Para evaluar el rendimiento de estas combinaciones de mutaciones se crearon mutantes dobles en el fondo de BPN'-v36 por fusión por PCR tal como se describe más abajo. Para este propósito se amplificaron dos o tres fragmentos superpuestos parcialmente por medio de iniciadores mutagénicos. Las combinaciones de iniciadores usadas para generar variantes respectivas se muestran en la Tabla 10-1 y las secuencias de iniciadores se muestran en la Tabla 10-2.
Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador y 100 ng del ADN molde parental de BPN'-v36 (plásmido pHPLT-BPN'-v36) (ver la Figura 4). Se realizaron amplificaciones con ADN pólimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 5 s, hibridación a 55 X por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 y P4950 para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción BamHI y Hind\\\ y se ligó con el vector de pHPLT-BPN' partial opt que, además, se procesó por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por círculo rodante en un estuche (Ilustra Templiphi de conformidad con la recomendación del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de fi. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Una alícuota de la mezcla de transformación se colocó sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 150 µ? de medio de LB que contenía 10 pg/mL de neomicina. Al día siguiente, los cultivos se congelaron con glicerol al 15 % o se cultivaron en medio de MBD para análisis bioquímico, tal como se describe en el Ejemplo 2.
Las variantes se probaron para determinar el rendimiento de limpieza con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8, ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 7 y ensayo de micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a 16 °C y pH 8. Se determinó el contenido de proteína con el ensayo de TCA. Todos los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y se calcularon los índices de rendimiento con respecto a BPN'-v36 (es decir, BPN'-S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q).
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A133V-S260N, N061S-S260P, P014T-S037T, S009T-K141 F, S009T-K141 R, S018F-S162L, S018L-Y021S, S018P-D120N, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S161 P-S162L, S161 P-S260P y T253A-S260P, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasá que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la vanante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 -G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A134T-S260G, I115V-N184Y, N025K-S037P, Q010L-S037P, Q019L-S260N, Q019L-S260P, S037P-T254S y S161P-T253A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S 01N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A045S-S236G, G024A-S037W, I031V-S038W, N061 D-S260I, Q010R-S037T, I115T-S183T, N025K-P129K, N025K-P129R, A045S-S236Y y S162L-D181 H, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S018F-S162L, S018P-D120N, P014T-S037T, S009T-K141 R y S161P-S162L, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de las variantes se numeran por correspondencia con la de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, N061S-S260P, Q010L-S037P, S009T-K141F, S018L-Y021S, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S037P-T254S, S161P-S260P, S161 P-T253A y T253A-S260P, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN' tienen un valor del Pl de aproximadamente 0.9 con respecto a BPN'-v3 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de BPN' que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A133V-S260N, A134T-S260G, I115T-S183T, I115V-N184Y, N061D-S260I, Q019L-S260N y Q019L-S260P, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, un valor del Pl de 0.9 con respecto a BPN'-v3 y/o una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las positions de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 7 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A045S-S236G, G024A-S037W, Q010R-S037T, A045S-S236Y, I031V-S038W, N025K-S037P, S162L-D181H y N025K-P129R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'- v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 X: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en I031V-S038W, P014T-S037T, S018F-S162L, S018P-D120N y S162L-D181H, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual a aproximadamente 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v36, A133V-S260N, A134T-S260G, G024A-S037W, I115V-N184Y, N025K-P129K, N025K-P129R, N061 D-S260I, Q019L-S260P, S009T-K141 F, S009T-K141R, S018L-Y021S, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S161P-S162L, S161P-T253A y T253A-S260P, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v3 y un valor del Pl de 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.8 e igual o menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en A045S-S236G, A045S-S236Y, I115T-S183T, N025K-S037P, N061S-S260P, Q010L-S037P, Q010R-S037T, Q019L-S260N, S037P-T254S y S161P-S260P, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v36 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de BMI o huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo of X009T, X010UR, X014T, X018F/L/PA17Y, X019L, X021N/S, X024A, X025K, X031V, X037P/T/W, X038W, X045S, X061D/S, X115T V, X120N, X129K/R, X133V, X134T, X141F/R, X161P, X162UP, X181 H, X183T, X184Y, X213R, X236G/Y, X253A, X254S y X260G/I/N/P y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de S009T, Q010L/R, P014T, S018F/L P/T/Y, Q019L, Y021 N/S, G024A, N025K, 1031 V, S037P T/W, S038W, A045S, N061D/S, I115T/V, D120N, P129K/R, A133V, A134T, K141F/R, S161P, S162IJP, D181 H, S183T, N184Y, K213R, S236G/Y, T253A, T254S y S260G/I/N/P, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID N0.2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza, que comprenden al menos una de esas variantes y métodos para limpiar que usan al menos una de esas variantes tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 1 1. Generación de qenotecas combinatorias FS1-FS3 El plásmido pHPLT-BPN'-v3 que contiene el cásete de expresión de BPN' se usó como ADN molde (plásmido parental) para la clonación. DNA2.0 sintetizó tres genotecas combinatorias (FS1 , FS2 y FS3) y las suministró como reacciones de ligación individuales. En la Tabla 11-1 se muestra una lista de genotecas y sustituciones posibles. Las genotecas se diseñaron para permitir la incorporación de residuos silvestres o las sustituciones en cada sitio descrito en la Tabla 11-1.
Para la transformación eficaz de B. subtilis, el ADN de la reacción de ligación se amplificó mediante amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) con el estuche lllustra Templiphi (GE Healthcare). Las reacciones se realizaron de conformidad con el protocolo del fabricante. Se usó un microlitro de ADN amplificado diluido diez veces para transformar 50 ? de células competentes de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo).
La mezcla de transformación se agitó a 37 °C por 1 hora. Se colocaron alícuotas de diez microlitros de la mezcla de transformación en placas de agar Luria con leche descremada (1.6 %) suplementadas con 10 pg/ml de neomicina (Teknova).
Los transformantes sé recogieron en placas de microtitulación que contenían 125-150 µ? de medio de caldo de Luria suplementado con 10 pg/ml de neomicina. Las placas sé cultivaron de la noche a la mañana a 37 °C con agitación a 250-300 rpm y una humedad de 70-80 % con tapas de Enzyscreen para placas de microtitulación (Enzyscreen). Se usaron entre 7 y 10 microlitros de la placa de cultivo de la noche para inocular una nueva placa de microtitulación que contenía 190 µ? de medio BD (un medio definido basado en MOPS) con 10 pg/ml de neomicina. El medio MBD se preparó, prácticamente, tal como se conoce en la industria (ver Neidhardt y col., J. Bacteriol. 119:736-747 (1974)), salvo que se omitió el NH4CI, FeSOA y CaCI2 del medio de base, se usó K2HPO4 3 mM y el medio de base se suplemento con urea 60 mM y 100 mi de una solución preparada con 210 g/L de glucosa y 350 g/L de maltodextrina. Los micronutrientes se formaron como una solución de reserva 100X que en un litro contenía 400 mg de FeS04-7H2O, 100 mg de MnS04 H20, 100 mg de ZnS04-7H2O, 50 mg de CuCI2-2H20, 100 mg de CoCI2 6H2O, 100 mg de NaMo04-2H2O, 100 mg de Na2B4O7-10H2O, 10 mi de CaCI2 1 M y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. El medio MBD que contenía placas de microtitulación se cultivó durante 60-70 horas a 37 °C, 250-300 rpm y 70-80 % de humedad con tapas de Enzyscreen (Enzyscreen) para determinar la expresión de la proteína. Al día siguiente los cultivos se filtraron a través de una microplaca de filtro (0.22 pm; Millipore) y el filtrado resultante se usó para análisis bioquímicos. 2. Generación de variantes para mejorar la estabilidad de BPN' Para mejorar la estabilidad de BPN' se construyeron variantes con las moléculas parentales pHPLT-BPN' G97A-G128A-Y217Q-S87D o pHPLT-BPN' G97A-G128A-Y217Q-P40E, ambas sintetizadas por Gene Oracle, o con las moléculas parentales pHPLT-BPN' G97A-G128A-Y217Q-S78N y pHPLT-partial opt FNA (subtilisina de B. amyloliquefaciens BPN'-Y217L) sintetizadas por GeneArt.
La información enunciada en las Tablas 11-2 y 11-3 es un resumen de la molécula parental usada, las mutaciones añadidas y los iniciadores usados para construir las variantes provistas en la presente descripción.
Tabla 11-3: Moldes usados, mutaciones que se incorporarán e iniciadores usados en la generación de variantes para una mayor estabilidad Las cepas de Bacillus subtilis que expresaban plásmidos se sembraron sobre placas de 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina y se cultivaron de la noche a la mañana a 37 °C. Se cultivaron colonias individuales de las placas de la noche a la mañana a 37 °C con agitación a 250 rpm en 5 mL de caldo de Luria que contenía 10 ppm de neomicina. Los plásmidos se aislaron con el protocolo del estuche QIAGEN® Miniprep mediante la adición de 1 microlitro de lisozima Ready Lyse (Epicentre) por 15 minutos a 37 °C en tampón P1 para facilitar la lisis celular. Los plásmidos se secuenciaron para asegurar secuencias de ADN correctas antes de continuar. Los plásmidos se metilaron con el estuche de Dam metilasa de NEB en una reacción que contenía 77.5 pL de agua + 10 pL de tampón 10X + 0.25 pL de SAM + 2 pL de DAM metilasa + 10 pL de ADN miniprep (-150 ng/pL) a 37 °C de la noche a la mañana. El ADN plásmido metilado se purificó con un estuche DNA Clean y Concentrator Kit (Zymo) o con un estuche de purificación de PCR QIAGEN®. Las reacciones de mutágenesis dirigidas a múltiples sitios QUIKCHANGE® se establecieron para cada molde de ADN en una mezcla de reacción que contenía 2.5 pL de tampón 5X + 0.75 pL de Quik Solution + 0.5 pL de iniciador 1 (25 pM) + 0.5 pL de iniciador 2 (25 pM) + 1.5 pL de dNTP's + 1 pL de mezcla de enzimas + 16.25 pL de H20 + 2 pL de ADN. El programa de PCR usado fue: 95 °C por 1 min; (95 °C por 1 min, 53 °C por 1 min, 65 °C por 10 min) x 29 ciclos; 65 °C por 10 min, retención a 4 °C. En todas las reacciones se realizó la PCR con un ciclador térmico MJ Research PTC-200 Peltier. Se extrajo el ADN parental de las muestras de PCR por medio de la adición de 1 pL de Dpn\ en reacciones con el estuche de mutagénesis QUIKCHANGE® a 37 °C de la noche a la mañana. Para aumentar la frecuencia de transformación, las reacciones tratadas por digestión con Dpn\ se amplificaron por medio de amplificación por círculo rodante (RCA) con el estuche lllustra TempliPhi de conformidad con el protocolo del fabricante. Las células de fí. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) se transformaron con 1 pL de cada reacción de RCA y las células transformadas se colocaron sobre placas de LA + 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina y se incubaron a 37 °C de la noche a la mañana. Se seleccionaron colonias del crecimiento de la noche a la mañana para la PCR de colonias para secuenciación con "puReTaq Ready-To-Go PCR Beads" (Amersham). Los iniciadores de secuenciación y PCR usados fueron pHPLT F1 (SEQ ID NO:54) y pHPLT seq R1 (SEQ ID NO:55). Los clones con las secuencias apropiadas se congelaron. Se produjeron proteínas de la variante de BPN' mediante el cultivo de transformantes de B. subtilis en placas de microtitulación de 96 pocilios a 37 °C por 68 horas en un medio a base de OPS que contenía urea. 3. Generación de variantes de BPN' derivadas de cinco plásmidos parentales diferentes Se construyeron variantes de BPN' con un total de cinco moldes diferentes: BPN'-v3 (G97A-G128A-Y217Q), BPN'-v4 (G97A-N123G-Y217Q), BPN' variante 8, (S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-S248R-Y217Q), BPN' variante 16 (S87D-G97A-N109D-G128A-S188D-Y217Q) y BPN' variante 21 (S87R-G97A-N109R-G128A-S188R-Y217Q-S248R) tal como se muestra en la Tabla 11-4. La generación de BPN'-v4 y BPN'-v3 se describe en la solicitud de patente del PCT núm. PCT/US09/46066 (WO 09/149144) presentada el 3 de junio de 2009 e incorporada en la presente como referencia para esa descripción. Las variantes BPN' 8, 16, 21 eran variantes sintetizadas por Gene Oracle y se usaron como plásmidos parentales para construir variantes adicionales. Todas las variantes se generaron con estuches de mutagénesis QUIKCHANGE®, excepto dos (variantes 5 y 33) que se generaron por medio de PCR por fusión tal como se describe más abajo. Los iniciadores (enumerados en la Tabla 1 -5) para la generación de variantes se sintetizaron en DNA Technologies. Las mutaciones introducidas (se muestran en negritas) y los iniciadores y el molde usados se muestran en la Tabla 1 -4.
Generación de variantes de BPN' por medio de mutagénesis de QUIKCHANGE® Se sembraron cepas de Bacillus subtilis que contenían plásmidos que expresaban BPN'-v3, BPN'-v4, BPN' variante 8, BPN' variante 16 y BPN' variante 21 en placas con 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina y se cultivaron de la noche a la mañana a 37 X. Se cultivaron colonias individuales de las placas de la noche a la mañana a 37 °C con agitación a 250 rpm en 5 mL de caldo de Luria que contenía 10 ppm de neomicina. Se aislaron plásmidos que expresaban BPN'-v3, BPN'-v4, BPN' variante 8, BPN' variante 16 y BPN' variante 21 con el protocolo del estuche QIAGEN® Miniprep excepto que después de la lisis celular se añadió 1 microlitro de lisozima Ready Lyse y se incubó por 15 minutos a 37 °C. Los plásmidos se metilaron con el estuche de Dam metilasa de NEB en una reacción que contenía 77.75 pL de H20 + 10 pL de tampón 10X + 0.25 pL de SAM + 2 µ?_ de DAM metilasa + 10 pl_ de ADN miniprep a 37 X de la noche a la mañana. El ADN metilado se purificó con el estuche de purificación de PCR QIAGEN®. Las variantes 14, 18 y 19 enumeradas en la Tabla 1 1-4 se generaron con los estuches para mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE LIGHTNING™ (Stratagene) en una mezcla de reacción que contenía 2.5 pl_ de tampón 5X + 0.75 pL de Quik Solution + 0.5 pL de iniciador 1 (25 µ?) + 0.5 pL de iniciador 2 (25 µ?) + 1.5 pL de dNTP's + 1 pL de mezcla de enzimas + 16.25 pL de H2O + 2 pL de ADN. El programa de PCR usado fue el siguiente: 95 °C por 2 min; (95 °C por 20 s, 55 °C por 30 s, 64 °C por 2 min 30 s) x 29 ciclos; 64 X por 5 min, retención a 4 X.
El resto de las variantes se creó con estuches para mutagénesis dirigida a sitios múltiples QUIKCHANGE® en una mezcla de reacción que contenía 2.5 pL de tampón 5X + 0.75 pL de Quik Solution + 0.5 pL del iniciador 1 (25 µ?) + 0.5 µ?_ del iniciador 2 (25 µ?) + 1.5 L de dNTP's + 1 µ?_ de mezcla de enzimas + 16.25 µ? de H20 + 2 µ? de ADN. El programa de PCR usado fue el siguiente: 95 °C por 1 min; (95 °C por 1 min, 53 °C por 1 min, 65 °C por 10 min) x 29 ciclos; 65 °C por 10 min, retención a 4 °C. En todas las reacciones se realizó la PCR con un ciclador térmico MJ Research PTC-200 Peltier. Los iniciadores usados para las reacciones con el Quik-Change se proveen en la Tabla 11-5. Los iniciadores se muestran en la secuencia del iniciador (5' a 3').
Se extrajo el ADN parental de las muestras de PCR por medio de la adición de 1 µ? de Dpn\ en reacciones con Quik-Change a 37 °C de la noche a la mañana. Un microlitro de las reacciones tratadas con digestión por Dpn\ se amplificaron por medio de amplificación por círculo rodante (RCA) con el estuche (Ilustra TempliPhi de conformidad con el protocolo del fabricante. Las células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) se transformaron con 1 µ? de cada reacción de RCA y las células transformadas se colocaron sobre placas de LA + 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina y se incubaron a 37 °C de la noche a la mañana. Se seleccionaron colonias del crecimiento de la noche a la mañana para realizar PCR de colonias con "puReTaq Ready-To-Go PCR Beads" (Amersham). Los iniciadores de PCR usados fueron pHPLT F1 (SEQ ID NO:54) y pHPLT seq R1 (SEQ ID NO:55). Los clones con las secuencias apropiadas se congelaron. Las variantes de BPN' se expresaron mediante el cltivo de los transformantes de B. subtilis en placas de microtitulación de 96 pocilios a 37 °C por 68 horas en un medio a base de MOPS que contenía urea.
Generación de variantes de BPN' por medio de PCR de fusión Se generaron las variantes 5 y 33 por medio de PCR de fusión con fragmentos amplificados a partir de pHPLT-BPN'-v3 molde. Los iniciadores de PCR usados para generar estas variantes se incluyen en la Tabla 11-5. Para la variante 5, un fragmento de 5' del gen de BPN' se amplificó con el iniciador directo pHPLT F1 (SEQ ID NO:54) y el iniciador inverso S248D revfus. El fragmento de 3' del gen BPN' se amplificó con el iniciador directo S248D forfus que contenía la mutación de interés y el iniciador inverso pHPLT R1. Los dos productos contenían 20 bp de secuencia de superposición y se fusionaron mediante la combinación de 1 µ?_ de cada fragmento y iniciador de fusión QC FUSION_For1 y QC FUSION_Rev1 en una reacción de PCR final. Todas las reacciones de PCR se realizaron con condiciones estándar del estuche de PCR Herculase II (Stratagene). La mezcla de PCR contenía 1 pL de ADN-polimerasa, 1 pL de ADN plásmido (o fragmento de ADN para fusión), 0.5 pL de dNTP's, 1.25 pL de iniciador directo de 25 µ?, 1.25 pL de iniciador inverso de 25 pM, 10 pL de tampón 5X, 35 pL de H20 y el programa de PCR usado fue el siguiente: 95 °C por 2 min, (95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por "X" s) para 29 ciclos, 72 °C por 1 min, retención a 4 °C (la "X" es 15 segundos por 1 kB de ADN para amplificar).
Para la variante 33 se amplificó un fragmento de 5' del gen de BPN' con el molde pHPLT-BPN'-v3 y los iniciadores pHPLT F1 (SEQ ID NO:54) y GIOOE Fsrev. El fragmento de 3' que contenia la variante se amplificó con los iniciadores G100E_Fsfor y pHPLT R1. Los dos productos contenían 20 bp de secuencia de superposición y se fusionaron mediante la combinación de 1 pl de cada fragmento y iniciador de fusión QC FUSION_For1 y QC FUSION_Rev1 en una reacción de PCR final. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las indicadas anteriormente.
Los dos productos de fusión se purificaron con una columna de purificación por PCR QIAGEN® con condiciones provistas por el fabricante y se realizó la digestión de la noche a la mañana con enzimas Bgl I y Hind\\\. Se realizó la digestión del plásmido pHPLT-BPN' partial opt con las mismas enzimas y la banda del vector se extrajo con gel y se purificó sobre una columna de purificación con gel QIAGEN® según las recomendaciones del fabricante. La mezcla de enzimas de restricción contenía: 10 pL de ADN purificado, 5 pL de tampón Roche B, 0.5 pL de Hind)\\, 0.5 pL de Bgl I, 34 pL de H20 y las reacciones se realizaron a 37 °C por 8 horas seguidas por reacciones a 65 °C por 20 min. El producto de la digestión se purificó con una columna de purificación de PCR QIAGEN® y se ligó a la cadena principal del vector de corte de la noche a la mañana a 16 °C con el estuche de mezcla de ligasa Mighty ix Ligase (Tekara). Después de la incubación se amplificó 1 pL de la mezcla de ligación con el estuche lllustra TempliPhi.
Para la reacción de amplificación se mezcló 1 pL de la mezcla de reacción de ligación con 5 pL del tampón de muestra del estuche TempliPhi y se calentó por 3 minutos a 95 °C para desnaturalizar el ADN. La reacción se colocó sobre hielo para enfriarla por 2 minutos y, después, se centrifugó por un corto tiempo. Se añadieron cinco microlitros de tampón de reacción y 0.2 pL de polimerasa ph¡29 del estuche TempliPhi y las reacciones se incubaron a 30 °C en una máquina para PCR MJ Research por 4 horas. La enzima phi29 se inactivo por calor en las reacciones mediante la incubación a 65 °C por 10 min en la máquina para PCR. Las células de Bacillus subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) se transformaron con 1 µ?_ de la mezcla de reacción y los transformantes se cultivaron de la noche a la mañana a 37 °C en placas con 1.6 % de leche descremada que contenían 10 ppm de neomicina. Los transformantes se seleccionaron para realizar PCR y secuenciación de colonias con "puReTaq Ready-To-Go PCR Beads" (Amersham) y iniciadores pHPLT F1 (SEQ ID NO:54) y pHPLT seqR1 (SEQ ID NO:55). 4. Generación de variantes de BPN' a partir de qenotecas RCL4- RCL7 Genoteca RCL4 "RCL4" se refiere a un grupo de genotecas de saturación de sitios creadas por medio de fusión de PCR que aleatorizan simultáneamente tres codones contiguos en el gen que codifica BPN'-v3 (???'- G97A-G128A-Y217Q). Las posiciones de aminoácidos que corresponden a los tres codones mutados en cada genoteca se proveen en la Tabla 11-6. Dos iniciadores mutagénicos complementarios superpuestos parcialmente, cada uno de ellos contiene tres codones redundantes se usaron para introducir mutaciones dentro de cada genoteca tal como se muestra en la Tabla 11-6 más abajo. Solamente los primeros dos nucleótidos de cada codón redundante (NNX, N = A, C, T o G y X es un nucleótido no modificado) de interés se mutaron en cada iniciador (Tabla 11-6).
Para crear cada genoteca se realizaron dos reacciones por PCR con el iniciador flanqueante de genes de extremo 3' común (P4976, CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC; (SEQ ID NO:61)) y el iniciador mutagénico o el iniciador flanqueante de genes de extremo 5' común (P4974, GCCTCACATTTGTGCCACCTA; (SEQ ID NO:60)) y el iniciador mutagénico tal como se muestra para cada genoteca en la Tabla 11-6. Estas reacciones por PCR generaron dos fragmentos por PCR; uno que codifica la mitad 5' del gen BPN'-v3 mutante (fragmento de gen de 5') y el otro que codifica la mitad 3' del gen BPN'-v3 mutante (fragmento de gen 3'). Cada reacción de amplificación por PCR contenia 30 pmol de cada iniciador y 100 ng del ADN molde parental de BPN'-v3 (plásmido pHPLT-BPN'-v3) (ver la Figura 1). Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 °C por 15 s y extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 (AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC; SEQ ID NO:62) y P4950 (CTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAA; SEQ ID NO:63) para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción BamH\ y Hind\\\ y se ligó con el vector de pHPLT-BPN' partial opt que, además, se trató por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por circulo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con la recomendación del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 pl de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Una alícuota de la mezcla de transformación se colocó sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio de LB que contenía 10 µg mL de neomicina.
Tabla 11-6: Lista de iniciadores usados para crear genotecas RCL4 Variantes de RCL5 "RCL5" se refiere a un conjunto de variantes combinatorias creadas por fusión por PCR con varios mutantes de BPN' como moléculas parentales (molde). Las mutaciones introducidas en cada plásmido parental se muestran en la Tabla 1 1-7 y los iniciadores mutagénicos usados para crear mutantes se indican en la Tabla 11-8.
Tabla 11-8: Iniciadores usados para crear variantes combinatorias de RCL5 Para crear cada mutante se realizaron dos reacciones por PCR con el iniciador flanqueante de genes de extremo 3' común (P4976, CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC; SEQ ID NO:61) y el iniciador mutagénico o el iniciador flanqueante de genes de extremo 5' común (P4974, GCCTCACATTTGTGCCACCTA; SEQ ID NO:60) y el iniciador mutagénico tal como se muestra para cada genoteca en la Tabla 11-8. Estas reacciones de PCR generaron dos fragmentos por PCR; uno que codifica la mitad 5' del gen de BPN' mutante (fragmento de gen de 5') y el otro que codifica la mitad 3' del gen BPN' mutante (fragmento de gen 3'). Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador y 100 ng de las moléculas parentales enunciadas en la Tabla 11-7. Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 °C por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 (SEQ ID NO:62) y P4950 (SEQ ID NO:63) para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizo la digestión con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó con el pHPLT-BPN' partial opt que, además, se trató por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por circulo rodante en un estuche (Ilustra Templiphi de conformidad con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtiHs Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Una alícuota de la mezcla de transformación se colocó sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 pl de medio de LB que contenia 10 µg/mL de neomicina.
Genotecas combinatorias RCL 6 "RCL6" se refiere a un grupo de genotecas combinatorias creadas por fusión por PCR con varios mutantes de BPN' como moléculas parentales (molde). Se usó una mezcla de mutantes de BPN' como molde (moléculas parentales) para construir cada una de estas genotecas. Las cinco mezclas diferentes de moléculas parentales usadas para crear estas genotecas se proveen en la Tabla 1 1-9 y las mutaciones introducidas en cada genoteca se enuncian en la Tabla 11-10.
Para crear cada mutante se realizaron dos reacciones por PCR con el iniciador flanqueante de genes de extremo 3' común (P4976, SEQ ID NO:61) y el iniciador mutagénico o el iniciador flanqueante de genes de extremo 5' común (P4974, SEQ ID NO:60) y el iniciador mutagénico tal como se muestra para cada genoteca en la Tabla 11-10. Estas reacciones por PCR generaron dos fragmentos por PCR; uno que codifica la mitad 5' del gen de BPN' mutante (fragmento de gen de 5') y el otro que codifica la mitad 3' del gen BPN' mutante (fragmento de gen 3'). Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador y 100 ng de las moléculas parentales enunciadas en la Tabla 11-9. Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 µ?_) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 X por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 (SEQ ID NO:62) y P4950 (SEQ ID NO:63) para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción BamH\ y HincftW y se ligó con el vector de pHPLT-BPN' partial opt que, además, se trató por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por circulo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Una alícuota de la mezcla de transformación se colocó sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 ig/rr\L de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio de LB que contenía 10 g/mL de neomicina.
Tabla 1-10: Mutaciones introducidas en las genotecas RCL6 Variantes combinatorias RCL 7 "RCL7" se refiere a un conjunto de variantes combinatorias creadas por fusión por PCR con varios mutantes de BPN' como plásmido parental (molde). Las mutaciones introducidas en cada plásmido parental se enumeran en la Tabla 11-11 y los iniciadores mutagénicos usados para crear mutantes se describen en la Tabla 11-10.
Para crear cada mutante se realizaron dos reacciones por PCR con el iniciador flanqueante de genes de extremo 3' común (P4976, SEQ ID NO:61) y el iniciador mutagénico o el iniciador flanqueante de genes de extremo 5' común (P4974, SEQ ID NO:60) y el iniciador mutagénico tal como se muestra para cada genoteca en la Tabla 11-10. Estas reacciones por PCR generaron dos fragmentos por PCR; uno que codifica la mitad 5' del gen de BPN' mutante (fragmento de gen de 5') y el otro que codifica la mitad 3' del gen BPN' mutante (fragmento de gen 3'). Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador y 100 ng de las moléculas parentales enunciadas en la Tabla 11-11. Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 µ?_) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 °C por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación, los fragmentos génicos de 5' y 3' se purificaron por medio del estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se mezclaron (50 ng de cada fragmento) y se amplificaron por medio de PCR otra vez más con los iniciadores P4973 (SEQ ID NO:62) y P4950 (SEQ ID NO:63) para generar el fragmento génico de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción fiamHI y HincftW y se ligó con el pHPLT-BPN' partial opt que, además, se trató por digestión con las mismas enzimas de restricción. Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por círculo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por circulo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Se colocó una alícuota de la mezcla de transformación en placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio LB que contenía 10 pg/mL de neomicina.
Ejemplo 12 Tabla de detergentes Las composiciones de los detergentes usados en los ensayos para el Ejemplo 12 de la Parte I se muestran en la Tabla 12-1 . Las muestras de las proteínas de la variante de BPN' se añadieron a las composiciones detergentes tal como se describió en el Ejemplo 1 de la Parte I para ensayar las distintas propiedades enumeradas.
El copolimero de injerto aleatorio" es un copolimero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es de aproximadamente 6.000 y la proporción en peso entre el óxido de polietileno y el acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no más de 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno.
Polietilenimina ( W = 600) con 20 grupos de etoxilato por -NH.
El polímero anfifilico alcoxilado limpiador de grasa es una polietilenimina (MW = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH.
Rendimiento de remoción de manchas de variantes combinatorias de BPN' Los experimentos para evaluar el rendimiento de remoción de manchas de las variantes combinatorias de BPN' generadas como se describió en el Ejemplo 11 se realizaron con micromuestras manchadas con BMI. El ensayo se realizó tal como se describe en el Ejemplo 1 (ensayo de micromuestras de B I). La Tabla 12-2 provee valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes generadas a partir de la genoteca RCL4 con un ensayo de micromuestras de BMI en la Composición detergente 1 a pH 8 y 16 °C y la Composición detergente 1 a pH 8 y 32 °C y ensayo de micromuestras de BMI en detergente comercial TIDE® 2X Cold (Procter & Gamble) inactivado por calor a 16 °C y pH 8. La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteina mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente líquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente TIDE® 2X Cold se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje desactivado. La actividad enzimática se probó por medio del ensayo de AAPF. Las soluciones de trabajo se prepararon a partir de la solución de reserva inactivada por calor. Se añadieron cantidades apropiadas de agua con la dureza adecuada y tampón en las soluciones detergentes para alcanzar las condiciones deseadas (Tabla 12-2). Las soluciones se mezclaron por agitación en vórtice o mediante inversión de las botellas.
Las secuencias de las variantes enunciadas en la Tabla 12-3 se refieren a BPN'-v3: G97A-G128A-Y217Q. Los valores del Pl se calculan con respecto a BPN'-v3. Todos los mutantes en esta lista tienen un valor de corte del Pl igual o mayor que 0.5 para al menos una propiedad probada. "Comp. det." significa composición detergente.
La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de los de la Tabla 12-3, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-4 provee valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes generadas a partir de RCL 5-7 y FS1-3 con el ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 (de la Tabla 1 -3) a 16 °C y pH 8, ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 (de la Tabla 1-3) a 16 °C y pH 8 y de la estabilidad medida en la Composición detergente 3 (de la Tabla 1-3). Además, se determinaron los valores del Pl para la actividad específica por hidrólisis de AAPF (Pl específico del AAPF). Todos los ensayos se realizaron tal como se describe n el Ejemplo 1. Las secuencias de las variantes enunciadas se refieren a BPN'-v3: G97A-G128A-Y217Q. Los valores del Pl se calcularon con respecto a BPN'-v3. Todos los mutantes en esta lista tienen un valor de corte del Pl igual o mayor que 0.5 para al menos una propiedad probada. Los valores del Pl menores que 0.01 se modificaron para mostrar 0.01 en negritas y cursiva.
La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de los enumerados en la Tabla 12-4, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-5 provee los valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes de BPN' (generadas tal como se describe en "Generación de variantes para mejorar la estabilidad de BPN'"; ver la Tabla 11-3) para la remoción de manchas en un ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8 (Comp. det. 1 , pH 8, 16 °C, Pl en BMI) y para la estabilidad en LAS/E DTA (Pl de la estabilidad de LAS/E DTA). Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 (ensayo de micromuestra de BMI, ensayo de estabilidad de LAS/EDTA). Las secuencias de las variantes se muestran con respecto a BPN' y FNA. Es decir, cada secuencia de variante es la secuencia de BPN' o FNA con las sustituciones de aminoácidos especificadas para la variante. Los valores del Pl se muestran con respecto a FNA parental, que es BPN'-Y217L.
La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o una mayor estabilidad con respecto a FNA; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de las listadas en la Tabla 12-5, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-6 provee los valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes de BPN' generadas a partir de la genoteca parental: BPN'-v3. G97A-G128A-Y217Q (tal como se describe en "Generación de variantes para mejorar la estabilidad de BPN"'; ver la Tabla 11-3) para la remoción de manchas en un ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a 6 °C y pH 8 y para la estabilidad de LAS/EDTA. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 (ensayo de micromuestra de BMI y ensayo de estabilidad de LAS/EDTA). El índice de rendimiento se calculó con respecto a BPN'-v3: G97A-G128A-Y217Q. Todos los mutantes en esta lista tienen un valor de corte del Pl igual o mayor que 0.5 para al menos una propiedad probada.
La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y que tiene una mayor estabilidad con respecto a BPN'-v3; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas de las de la Tabla 12-6, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-7 provee los valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes de ??? (generadas tal como se describe en "Generación de variantes de BPN' a partir de cinco plásmidos diferentes"; ver la Tabla 11-4) para la remoción de manchas en un ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 (ensayo de micromuestra de BMI). El índice de rendimiento de cada variante se calculó con respecto a BPN'-v3: G97A-G128A-Y217Q. Todos los mutantes en esta lista tienen un valor de corte del Pl igual o mayor que 0.5 para al menos una propiedad probada. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de los enumerados en la Tabla 12-7, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-8 provee los valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes de BPN' (generadas tal como se describe en "Generación de genotecas combinatorias y variantes de BPN'-v3 + S78N" tal como se describe en el Ejemplo 3) para la remoción de manchas en un ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 1 a 16 °C y pH 8. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1 (ensayo de micromuestra de BMI). El índice de rendimiento de cada variante se calculó con respecto a BPN'-S78N-G97A-G128A-Y217Q. Los valores del Pl menores que 0.01 se modificaron y se indican como "0.01 " en negritas y cursiva. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de los enumerados en la Tabla 12-8, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
La Tabla 12-9 provee los valores del índice de rendimiento (Pl) de variantes simples de BPN' (construidas por medio de fusión por PCR tal como se describe en la solicitud del PCT núm. PCT/US09/46156 presentada el 3 de junio de 2009, incorporada como referencia en la presente descripción para esa descripción) para la remoción de manchas en un ensayo de micromuestra de BMI en la Composición detergente 2 a 16 °C y pH 8 y para la estabilidad medida en la Composición detergente 3. Se determinaron los valores del Pl para la actividad específica por hidrólisis de AAPF (Pl específico del AAPF). Todos los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 1. Los valores del índice de rendimiento se calcularon con respecto a BPN silvestre. Los valores del Pl menores que 0.01 se indican como "0.01" en negritas y cursiva. "Comp. det." significa composición detergente.
Tabla 12-9: Valores del índice de rendimiento para variantes simples de BPN' La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y al menos una sustitución seleccionada de las enumeradas en la Tabla 12-9, en donde las posiciones de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Cada una de esas variantes de proteasa puede ser una variante de proteasa aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural. Además, se incluyen composiciones que incluyen composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 3 Composiciones detergentes líquidas para lavado manual En este ejemplo se proveen varias formulaciones detergentes líquidas para el lavado manual de vajilla. Las siguientes composiciones liquidas para el lavado manual de vajilla de la presente invención se proveen más abajo. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa provista en la presente descripción se incluye en una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunos aspectos alternativos serán útiles otras concentraciones, tal como determinará el formulador en base a sus necesidades.
Cuadro 13-1 : Composición detergente liquida de bajo rendimiento para el lavado de vajilla Componentes menores opcionales*: tintes, agentes opacantes, perfumes, conservantes, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, y/o estabilizadores. (1) Alquilbencenosulfonato lineal: LAS: C11.4 (2) Alquil etoxi sulfato: AExS. (3) No iónico: etoxilato de alquilo (4) Óxido de coco alquil dimetil amina (5) Alcohol: Etanol (6) Sal: NaCI (7) Hidroxietilcelulosa modificada catiónicamente (policuaternio-10 - UCARE LR-400 ex Amerchol).
Ejemplo 14 Detergentes líquidos y granulares para lavandería Este ejemplo provee varias formulaciones para detergentes líquidos para lavandería. Las siguientes formulaciones detergentes líquidas para lavandería de la presente invención se proveen más abajo. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa provista en la presente descripción se incluye en una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunos aspectos alternativos serán útiles otras concentraciones, tal como determinará el formulador en base a sus necesidades.
Composiciones detergentes liquidas para lavandería adecuadas para máquinas lavadoras automáticas de carga frontal.
Composiciones detergentes líquidas para lavandería adecuadas para máquinas lavadoras automáticas de carga superior.
Composiciones detergentes granulares producidas de conformidad con la invención adecuadas para el levado de telas.
El copolimero de injerto aleatorio es un copolimero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es de aproximadamente 6000 y la proporción en peso entre el óxido de polietileno y el acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no más de 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno.
Polietilenimina (MW = 600) con 20 grupos de etoxilato por -NH.
El polimero anfifilico alcoxilado limpiador de grasa es una polietilenimina (MW = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH Inhibidor reversible de la proteasa de la estructura: El tinte tonalizador de tiofeno etoxilado es tal como se describe en la patente de los EE. UU. núm. 7,208,459 B2.
Nota: todos los niveles de enzimas están expresados como % de materia prima de enzimas, excepto la proteasa para agua fría (de esta invención) que se expresa como % de proteína activa añadida al producto.
Ejemplo 15 Composiciones de dosis unitarias Este ejemplo provee varias formulaciones para detergentes para lavandería en dosis unitarias. Dichas formulaciones en dosis unitarias pueden comprender uno o varios compartimentos.
Las siguientes formulaciones detergentes en dosis unitarias para lavandería de la presente invención se proveen más abajo.
Polietilenimina (MW = 600) con 20 grupos de etoxilato por -NH.
Tabla 15-2: Composiciones en dosis unitarias con compartimentos múltiples Las formulaciones detergentes para lavandería en dosis unitarias con compartimentos múltiples de la presente invención se proveen más abajo. En estos ejemplos, la dosis unitaria tiene tres compartimentos, pero se pueden preparar composiciones similares con dos, tres, cuatro o cinco compartimentos.
La película usada para encapsular los compartimentos es alcohol polivinilico.
Formulaciones con compartimentos múltiples Ejemplo 16 Rendimiento de limpieza de las variantes de polipéptidos de BPN'-v36 Las variantes de polipéptidos de BPN'-v36 que comprenden dos sustituciones de aminoácidos se construyeron mediante fusión por PCR estándar con la variante de BPN'-v36 como una cadena principal o secuencia parental. Para este propósito se amplificaron dos o tres fragmentos parcialmente superpuestos por medio de iniciadores mutagénicos preparados de tal forma que el iniciador codificara una sustitución deseada. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 7 de la Parte I supra. Se construyeron las siguientes variantes mutantes dobles de BPN'-v36 (es decir, BPN'-v36 con la siguiente sustitución de dos aminoácidos): Q019R-N025D, A001Y-Q275R, V004A-S249N, V004E-S260P, V004A-T55A, Y006F-S249C, Y006D-T55A, V008L-Q275R, Q010R-Q275K, L016Q-Q217H, H017R-T158A, S183D-Q206R, P210S-N212D, S018Y-V203A, S018K-V203I, Y021 H-D259G, Y021 H-D259R, K027R-N269D, K027R-N269T, S037P-S260F, S037T-S260P, D041 E-N077D, D041 G-N077E, G166V-S183T, N252S-L257H, V044A-Q206H, V044A-Q206K, V044A-Q206R, N076T-N212D, N076P-N212S, N077D-N252D, N077D-N252T, K141 I-S248N, T158I-D259N, T158A-D259P, S161 E-Q185H, K237M-H238R, G160A-D259G, G160R-D259V, G215R-D259R, G215D-D259V, N061 D-Q206R, N061 L-Q206H, S009L-N218S, S161 E-S260T, Q019A-N109S, T022S-G166V, Y021 H-N252H, P129S-K136R, T022S-T242S, N025K-H238R, N025D-Q185R, S037G- Q275H, K043R-N076S, K043N-Q217R, K043N-S163T, T055A-V147A, N061 K-N252K, N062Y-G097D, Y021 H-V084E, Y021H-S037E, N062Y-T244A, K027E-Y091 F, A074S-P129Q, S249R-Q275R, I079V-Q217H, A098T-T158A, K027R-D120H, Q019R-Q185R, G131S-K265N, A133V-D259N, A144H-T244A, I035V-K043N, G160R-T244A, S161 P-T253A, S163T-Q245L, K170R-D259G, S183T-S249R, N184Y-Y262N, V198L-D259G, A200T-H226L, Q206R-S260P, G21 1V-T244A, Q217R-T244A, L75I-N76D, S260P-Q275L, S260P-Q275R, Y262N-Q275R, V004A-Y006F, H017L-Q019A, N025D-V026A, N1 18G-V121A, V072F-L075I, S183T-R186K, V203A-Q217R y S249R-Y262H. El rendimiento de limpieza de estas variantes se probó en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C y en un ensayo de micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C tal como se describe en el Ejemplo 1 de la Parte I. Los resultados se proveen más abajo.
Se determinó que las siguientes variantes de la proteasa de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.9 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v3, BPN'-v36, S183T-S249R, N61 D-Q206R, Y262N-Q275R, K43R-N76S, S183T-S249R, K170R-D259G, Y6F-S249C, Q19A-N109S, H17L-Q19A, Q19R-Q185R, S18Y-V203A, N61 D- Q206R, S161 E-S260T, S18K-V203I, V4A-T55A, N252S-L257H, S249R-Y262H, N61 L-Q206H, N184Y-Y262N, Q19R-N25D, S249R-Y262H, A74S-P129Q, H17L-Q19A, K27R-D120H, V4A-T55A, Y21 H-N252H, K27R-N269D, K27R-N269D, A98T-T158A, I79V-Q217H, S9L-N218S, V4A-Y6F, S161 P-T253A, V203A-Q217R, T22S-T242S, N76P-N212S, K170R-D259G, S37T-S260P, T55A-V147A, Q19R-Q185R, V4A-Y6F, Q19A-N109S, Y262N-Q275R, G160R-T244A, Q19R-N25D, N25D-Q185R, A98T-T158A, N61 L-Q206H, G21 1V-T244A, S9L-N218S, A144H-T244A, A144H-T244A, S18Y-V203A, Y21 H-N252H, A74S-P129Q, A1Y-Q275R, V198L-D259G, T55A-V147A, K141 I-S248N, S183T-R186K, S37T-S260P, K27R-D120H, T22S-T242S, S161 E-Q185H, P129S-K136R, G21 1V-T244A, N76P-N212S, K43N-S163T, S37G-Q275H, S161 P-T253A, Y6F-S249C, N184Y-Y262N, N252S-L257H, G160R-T244A, S37G-Q275H, P129S-K136R, N62Y-T244A y S260P-Q275R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2) y un valor del Pl mayor que BPN' en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), un valor del Pl igual o mayor que 0.9 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X1Y, X4A, X6F, X9L, X17L, X18K/Y, X19A/R, X21 H, X22S, X25D, X27R, X37G/T, X43N/R, X55A, X61 D/L, X62Y, X74S, X76P/S, X79V, X98T, X109S, X120H, X129Q/S, X136R, X141 I, X144H, X147A, X158A, X160R, X161 E/P, X163T, X170R, X183T, X184Y, X185H/R, X186K, X198L, X203A/I, X206H/R, X211V, X212S, X217H/R, X218S, X242S, X244A, X248N, X249C/R, X252H/S, X253A, X257H, X259G, X260P/T, X262H/N, X269D y X275H/R y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de A1Y, V4A, Y6F, S9L, H17L, S18K/Y, Q19A/R, Y21 H, T22S, N25D, K27R, S37G/T, K43N/R, T55A, N61 D/L, N62Y, A74S, N76P/S, I79V, A98T, N109S, D120H, P129Q/S, K136R, K141 I, A144H, V147A, T158A, G160R, S161 E/P, S163T, K170R, S183T, N184Y, Q185H/R, R186K, V198L, V203A/I, Q206H/R, G211V, N212S, Q217H/R, N218S, T242S, T244A, S248N, S249C/R, N252H/S, T253A, L257H, D259G, S260P7T, Y262H/N, N269D y Q275H/R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de la proteasa subtilisina de BPN' tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Y21 H-D259G, Y21 H-D259G, A133V-D259N, I79V-Q217H, S18K-V203I, T158A-D259P, N61 K- N252K, K43N-Q217R, T158A-D259P, Q206R-S260P, A133V-D259N, V198L-D259G, N61 K-N252K, S161 E-S260T, G160A-D259G, K43N-Q217R, A1Y-Q275R, A200T-H226L, Q217R-T244A, S260P-Q275R, Q206R-S260P, T158I-D259N, Q217R-T244A, L75I-N76D, S161 E-Q185H, Y21 H-S37E, S249R-Q275R, G160A-D259G, T158I-D259N, Y21 H-S37E, N76T-N212D, S260P-Q275L, G131 S-K265N, V4A-S249N, N25D-Q185R, K43R-N76S, S183D-Q206R, Q10R-Q275K, K43N-S163T, Q10R-Q275K, N25D-V26A, G131 S-K265N, S260P-Q275L, K141 I-S248N, L16Q-Q217H, S249R-Q275R, K27R-N269T, P210S-N212D, L75I-N76D, S183D-Q206R, N118G-V121A, G215D-D259V, N76T-N212D, V4A-S249N, K27R-N269T, N62Y-G97D, V4E-S260P, G215D-D259V, K27E-Y91 F, Y6D-T55A, N77D-N252T, V4E-S260P, Y6D-T55A, N77D-N252T, N25K-H238R, V44A-Q206H, L16Q-Q217H, S37P-S260F, V44A-Q206R, V44A-Q206H, V44A-Q206R y S37P-S260F, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, una mejor actividad proteolítica mayor que BPN' y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las o posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID N0.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1, al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en Y21H-D259G, S183T-S249R, N61D-Q206R, Y262N-Q275R, Y021H-D259G, K043R-N076S, S183T-S249R, A133V-D259N y I079V-Q217H, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor de Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con ???' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X021H, X043R, X061 D, X076S, X079V, X133V, X183T, X206R, X217H, X249R, X259G/N, X262N y X275R y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo deY021 H, K043R, N061D, N076S, I079V, A133V, S183T, Q206R, Q217H, S249R, D259G/N, Y262N y Q275R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor o igual a 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPN'-v3, BPN'-v36, K170R-D259G, S18K-V203I, Y6F-S249C, Q19A-N109S, H17L-Q19A, Q19R-Q185R, S18Y-V203A, N61 D-Q206R, S161 E-S260T, S18K-V203I, V4A-T55A, N252S-L257H, S249R-Y262H, N61 L-Q206H, N184Y-Y262N, Q19R-N25D, S249R-Y262H, A74S-P129Q, T158A-D259P, H17L-Q19Á, K27R-D120H, V4A-T55A, N61 K-N252K, Y21 H-N252H, K27R-N269D, K43N-Q217R, T158A-D259P, Q206R-S260P, K27R-N269D, A98T-T158A, I79V-Q217H, S9L-N218S, V4A-Y6F, S161 P-T253A, V203A-Q217R, T22S-T242S, N76P-N212S, A133V-D259N, K170R-D259G, S37T-S260P, T55A-V147A, V198L-D259G, Q19R-Q185R, V4A-Y6F, Q19A-N109S, Y262N-Q275R, G160R-T244A, Q19R-N25D, N25D-Q185R, N61K-N252K, S161 E-S260T, A98T-T158A, N61 L-Q206H, G211V-T244A, S9L-N218S, A144H-T244A, A144H-T244A, S18Y-V203A, Y21 H-N252H, A74S-P129Q, G160A-D259G, K43N-Q217R, A1Y-Q275R, A1Y-Q275R, A200T-H226L, Q217R-T244A, S260P-Q275R, V198L-D259G, T55A-V147A, Q206R-S260P, K141 I-S248N, S183T-R186K, T158I-D259N, S37T-S260P, K27R-D120H, T22S-T242S, Q217R-T244A, S161 E-Q185H, P129S-K136R, G211V-T244A, N76P-N212S, L75I-N76D, S161 E-Q185H, Y21 H-S37E, S249R-Q275R, G160A-D259G, K43N-S163T, T158I-D259N, Y21 H-S37E, S37G-Q275H, S161 P-T253A, N76T-N212D, S260P-Q275L, Y6F-S249C, N184Y-Y262N, G131 S-K265N, V4A-S249N, N25D-Q185R, N252S-L257H, K43R-N76S, S183D-Q206R, G160R-T244A, Q10R-Q275K, S37G-Q275H, K43N-S163T, Q10R-Q275K, N25D-V26A, P129S-K136R, G131 S-K265N, S260P-Q275L, K141 I-S248N, T22S-G166V, N62Y-T244A, L16Q-Q217H, S249R-Q275R, S260P-Q275R, K27R-N269T, P210S-N212D, L75I-N76D, S183D-Q206R, N1 18G-V121A, G215D-D259V, N76T-N212D, V4A-S249N, K27R-N269T, G166V-S183T, N62Y-G97D, V4E-S260P, G215D-D259V, K27E-Y91 F, Y21 H-D259R, Y6D-T55A, N77D-N252T, V4E-S260P, Y6D-T55A, N77D-N252T, Y21 H-D259R, N25K-H238R, N77D-N252D, V44A-Q206H, L16Q-Q217H, V72F-L75I, S37P-S260F, V72F-L75I, N77D-N252D, V44A-Q206R, S163T-Q245L, V44A-Q206H, V44A-Q206R, S37P-S260F, G215R-D259R, V44A-Q206K y V44A-Q206K, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 1 .0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO.2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 17 Rendimiento de limpieza de las variantes de polipéptidos de BPN'-v36 adicionales Las siguientes variantes de BPN'-v36 se sintetizaron en DNA2.0 (Menlo Park, CA) con el plásmido pHPLT-BPN'-v36 que contenia el cásete de expresión de BPN' que se usó como ADN molde (plásmido parental) para la clonación: N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N61 G-N109G-A128S-S224A, N61 G-N109G-A128S-S224A-N243V, N61G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109Q-A128S-S224A, N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V, N109S-A128S-S224A, N109S-A128S-S224A-N243V, A88T-N 09S-A 16T-A 28S-S224A-N243V, N109M-A128S-S224A, N109M-A128S-S224A-N243V, A88T-N109M-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109G-A114S-A128S, N109G-A1 4S-A128S-N243V, A88T-N109G-A1 14S-A116T-A128S-N243V, N109G-A114S-A128S-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109G-A128S-S183L, N109G-A128S-S183L-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S183L-S224A, A88T-N109G-A114S-A1 16T-A128S-S 183L-S224A-N243V, N76D-N 109G-A 28S-S224A, N101 Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, N101 Q-N109Q-A128S-P129S-S 130T-S224A-N243V, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V, S33T-A128S-N218S, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N61 G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N 109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S- N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, I31 L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N61 G-A88T-N 109G-A1 16T-A128S-N218S-N243V, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-N61 P-S63G-N109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, A1 G-N61 P-S63G-N 109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, 131 L-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, S33T-T55P-N6 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A1 16T-A128S- G131 H-S224A-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A1 16T- A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, A1G-I31 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q y A1 G-I31 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N 109G-A116T-A128S-G131 H-G 169A-S224A-N243V-S249Q.
Las vanantes se cultivaron para la expresión de proteínas tal como se describe en el Ejemplo 1 1 de la Parte I. Estas variantes se probaron para determinar su rendimiento en el ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C, el ensayo de limpieza de micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C y el ensayo de AAPF tal como se describe en el Ejemplo 1 de la Parte I. Los resultados se proveen más abajo.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1 .3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A 14S-A1 16T-A128S-N243V, A88T-N109G-A1 14S-A1 16T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109G-A128S-N243V-K256R, N109M-A128S-S224A, A88T-N109S-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109M-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 16T-N243V, N 101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109G-A116T-N243V-K256R, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V y A88T-N109Q-A1 16T-A128S-S224A-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor de Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo.
La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v36 y/o un valor del Pl igual o mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X61G/P/S, X63G, X88T, X101Q, X109G/M/Q/S, X114S, X116T, X128S, X129S, X130T, X158S, X183UV, X224A, X243V, X248A y X256R y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de N61G/P/S, S63G, A88T, N101 Q, N109G/M/Q/S, A114S, A116T, A128S, P129S, S130T, T158S, S183LJV, S224A, N243V, S248A y K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.9 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G24S-G53S-N78S-G97A-N101 S-A128S, G24S-G53S-N78S-G97A-N10 S, BPN'-v36, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V, S33T-N61 G-S63G-N 109G-A128S-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S33T-N61 G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-A128S-N218S, A1G-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N109G-A1 14S-A128S, N109G-A1 14S-A128S-S 83L-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A, N109G-A114S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V, N109G-A114S-A128S-N243V, N109G-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L-S224A, N61 G-N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L, S33T-N76D, N109S-A128S-S224A, N101Q-N109Q-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109M-A128S-S224A-N243V, S63G-N109G, N109G-K256R, S63G-N76D, S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V y S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2.
Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica, una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.9 y menor o igual a 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza de micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN -S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en I31 L-S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, A1 G-131 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N 109G-A1 6T-A128S-G 131 H-G169A- S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-S63G-N 109G-A128S-G131 H-G 169A-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, S33T-N76D-A128S-N218S, N76D-N109G-A128S-S224A y S33T-N61P-S63G-N109G-A128S-G131H-G169A-N218S-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1 .8, al menos 1 .9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1 .0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61G-A88T-N109G-A116T-A128S-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-A128S-N218S, A1 G-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 14S-A1 6T-A128S-N243V, A88T-N109G-A1 14S-A1 6T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A1 14S-A128S, N109G-A114S-A128S-S183L-S224A, N109G-A114S-A128S-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V, N61G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109G-A1 14S-A128S-N243V, N109G-A128S-N243V-S248A, 109G-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-S224A, N 109G-A128S-S183L-S224A, N61 G-N109G-A128S-S224A, N 09M-A128S-S224A, A88T- 109S-A1 16T-A128S-S224A-N243V, 109M-A128S-S224A-N243V, S63G-A128S, A88T-N109G-A1 16T-N243V, N101 Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109G-A1 16T-N243V-K256R, N109G-A116T, S63G-N109G, A88T-N109G, N109G-K256R, N61G-N109G-N243V, S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V y A88T-N109Q-A1 16T-A128S-S224A-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor de Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v36 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO:2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X1G, X33T, X55P, X61G/P/S, X63G, X76D, X88T, X101Q, X109G/M/Q/S, X114S, X116T, X128S, X129S, X130T, X131H, X158S, X169A, X183UV, X218S, X224A, X243V, X248A/N, X249Q, X256R y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo of A1G, S33T, T55P, N61G/P/S, S63G, N76D, A88T, N101Q, N109G/M/Q/S, A114S, A116T, A128S, P129S, S130T, G131H, T158S, G169A, S183UV, N218S, S224A, N243V, S248A/N, S249Q, K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que la siguiente variante de BPN'-v36 tenía valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo de limpieza con micromuestra de huevo en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las sustituciones S33T-N76D-A128S-N218S, N76D-N109G-A128S-S224A y S063G-N76D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en S33T-N76D-A128S-N218S, N76D-N109G-A128S-S224A y S063G-N076D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl mayor que 1.0, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, mayor que 1.0 a aproximadamente 10, mayor que 1.0 a aproximadamente 8 o mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo proteolítico de AAPF: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en G24S-G53S-N78S-G97A-N 101 S-A128S, 131 L-S33T-S63G-N 109G-A128S-G 169A-N218S-N243V, A1G-I31 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A116T-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-S63G-N 109G-A128S-G 169A-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-G131 H- S224A-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T- 109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-A88T-N109G-A1 16T-A128S- N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S33T-N61 G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-A128S-N218S, S33T-A128S-N218S, A1 G-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, N61P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T- 109G-A114S-A 1 16T-A128S-N243V, A88T-N 109G-A114S-A1 16T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A114S-A128S, N109G-A114S-A128S-S183L-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A, N109G-A1 14S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A116T-A128S-S224A-N243V, N61 G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109G-A114S-A128S-N243V, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L-S224A, N61G-N109G-A128S-S224A, N76D- 109G-A128S-S224A, N109M-A128S-S224A, N109G-A128S-S183L, S33T-N76D, A88T-N109S-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N109Q-A128S-S224A-N243V, N 09S-A128S-S224A, A88T-N109M-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N101 Q-N 109Q-A128S-P129S-S 130T-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109M-A 28S-S224A-N243V, S63G-A128S, N109S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 16T-N243V, N61 S-N109G-N243V, N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, N109G-A1 16T-N243V-K256R, A88T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-K256R, N109G-A1 16T, S63G-N109G, A88T-N109G, N109G-K256R, N61G-N109G-N243V, S33T- N61 P-S63G- 109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-N 109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-S224A-N243V, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V y A88T-N109Q-A116T-A128S-S224A-N243V, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 y un valor de Pl mayor que BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. La invención incluye una variante de proteasa que tiene una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), una mejor actividad proteolitica en comparación con BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36, un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v3 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 a aproximadamente 5 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Además, se provee una variante de la proteasa subtilisina que tiene una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN'-v36 y/o un valor del Pl mayor que 1.0 en comparación con BPN'-v36 en un ensayo proteolítico de AAPF; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % con la SEQ ID NO.2, en donde la variante comprende al menos una sustitución que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo de X1G, X31L, X33T, X55P, X61G/P/S, X63G, X76D, X88T, X101Q, X109G/M/Q/S, X114S, X116T, X128S, X129S, X130T, X131H, X158S, X169A, X183UV, X218S, X224A, X243V, X248A/N, X249Q y X256R y, opcionalmente, al menos una sustitución seleccionada del grupo de A1G, 131 L, S33T, T55P, N61G/P/S, S63G, N76D, A88T, N101Q, N109G/M/Q/S, A114S, A116T, A128S, P129S, S130T, G131H, T158S, G169A, S183LA/, N218S, S224A, N243V, S248A/N, S249Q y K256R, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen una mejor actividad proteolítica en comparación con BPN' (SEQ ID NO:2), BPN"-v3 y BPN'-v36 y un valor del Pl mayor que el de BPN', BPN'-v3 y BPN'-v36 en este ensayo. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que la siguiente variante de BPN'-v36 tenía un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en un ensayo proteolítico de AAPF: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101N-G128A-Y217Q que comprende sustituciones de aminoácidos G24S-G53S-N78S-G97A-N101 S o S063G-N76D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende sustituciones G24S-G53S-N78S-G97A-N101S o S063G-N76D, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Ejemplo 8 Rendimiento de limpieza de variantes polipeptidicas del polipéptido BPN'-v36 a partir de genotecas combinatorias basadas en el polipéptido de BPN'-v36 Se sintetizaron dos genotecas combinatorias (AJ1 y AJ2) en DNA2.0 (Menlo Park, CA) y se suministraron como reacciones de ligación individuales. El plásmido pHPLT-BPN'-v36 (Figura 4) que contenía el cásete de expresión de BPN' se usó como ADN molde (plásmido parental) para la construcción de las genotecas. Una lista de posiciones de aminoácidos y sustituciones posibles para cada genoteca se muestra en la Tabla 23-1. Las reacciones de ligación para cada genoteca se usaron para transformar B. subtilis y las variantes de la genoteca se cultivaron para la expresión de proteínas tal como se describió en el Ejemplo 1 1. Las variantes se probaron para determinar el rendimiento en el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 (de la Tabla 1 -3) a pH 8 y 16 °C tal como se describe en el Ejemplo 1.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor o igual a 1.0 con respecto a BPN'-v36 en el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 -G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en BPNV36, BPNV3 (G024S-G053S-N078S-G097A-N101 S), BPNV3 (G024S-G053S-N078S-G097A-N101S, BPN' v12 (G024S-G053S-N078S-G097A-N101S-A128S), N062L, N062L-S063G, N062S, N062S-S063G-Q217L, N062S-S063L-Q217L, N062S-S063N, N062S-S063R, Q217E, S063G, S063G-Q217L, S063G-Q217L-M222S, S063L-Q217L, S063N, S063N-Q217L, D099N-K141Y-K213Q, D099N-K141Y-K256Q, K043T, K043T-K141Y-E156Q, N062L-Q217E, N062L-Q217L, N062L-S063G-Q217E, N062L-S063L, N062L-S063N-Q217L, N062S-Q217L, N062S-S063G, N062S-S063L, N062S-S063N-Q2 7L, N062S-S063R-Q217E, Q217L, S063G-Q217E, S063N-Q217E, S063R, S063R-Q217E, S063R-Q217L,), D099N-K141Y-K213Q, D099N-K141Y- 256Q, K043T, K043T-K141Y-E156Q, N062L-Q217E, N062L-Q217L, N062L-S063G-Q217E, N062L-S063L, N062S-Q217L, N062S-S063G, N062S-S063L, N062S-S063N-Q217L, Q217L, S063G-Q217E, S063N-Q217E, S063R, S063R-Q217E y S063R-Q217L, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolítica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolítica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 e igual o menor que 1.0 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones ácidas seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Se determinó que las siguientes variantes de BPN'-v36 tenían un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI en la Composición detergente 4 a pH 8 y 16 °C: secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) BPN'-S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en D099N, K141Y-E156Q, N062L-S063L-Q217L, N062L-S063N, N062L-S063N-Q217E, N062L-S063R, N062L-S063R-Q217L, N062S-Q217E, N062S-S063G-Q217E, N062S-S063G-Q217R, N062S-S063N-Q217R, S063G-S125A, D060G-Q217L, D120N-K141Y-K213Q, K043T-D099N-D120N-K141Y, K043T-D099N-K141Y-K256Q, K043T-K237A, N062L-S063G-Q217R, N062L-S063G-S125A, N062L-S063L-Q217E, N062L-S063N-S125A-Q217L, N062S-Q217R, N062S-S063L-Q217E, N062S-S063R-Q217L, S063G-M222S, S063G-Q217R, D120N-E156Q-K256Q, K141Y-D197N, N062L-Q217R, N062L-S063G-Q217L-M222S, N062L-S063L-Q217R, N062L-S063N-Q217R, N062S-Q217G, N062S-S063G-Q217G, N062S-S063G-Q217L-M222L, N062S-S063G-S125A-Q217L, N062S-S063N-Q217E, Q217G, S033G-N062S-S063G, S063G-Q217G, S063G-Q217L-M222L, S063G-S125A-Q217R, S063L-Q217R, S063N-M222S, S063N-Q217R, S063N-S125A-Q217L, S063R-Q217R, S063R-S125A-Q217L, D099N-E156Q-K256Q, E156Q, K012T-D099N-K213Q, K012T-K256Q, K043T-D099N-K141Y-K213Q, K043T-E156Q, K141Y-K213Q, N062L-Q217G, N062L-Q217L-M222L, N062L-Q217L-M222S, N062L-S063G-M222S, N062L-S063G-Q217L-M222L, N062L-S063G-Q217R-M222S, N062L-S063N-Q217L-M222S, N062L- S063N-S125A, N062L-S063R-S125A, N062L-S125A, N062S-S063G-M222S, N062S-S063G-Q217G-M222S, N062S-S063G-S125A, N062S-S063N-Q217L-M222L, N062S-S063N-S125A-Q217L, N062S-S063R-Q217G, N062S-S063R-Q217L- 222S, Q217G-M222S, Q217L-M222S, Q217R, S033G-S063G-Q217R, S063G-Q217E-M222S, S063G-S125A-Q217G, S063L-Q217E, S063N-Q217G, S063N-Q217G-M222S, S063N-Q217L-M222S, S063R-Q217L-M222S y S063R-S125A, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con la secuencia de la SEQ ID NO:2. Dichas variantes tienen actividad proteolitica. La invención incluye una variante de proteasa que tiene actividad proteolitica y/o un valor del Pl igual o mayor que 0.5 y menor que 0.9 con respecto a BPN'-v36 en este ensayo; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6 y que comprende al menos un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado de ese grupo anterior, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante se numeran por correspondencia con las posiciones de aminoácidos de la secuencia de la SEQ ID NO:2. Además, se incluyen composiciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones de limpieza que comprenden al menos una de esas variantes de proteasa y métodos de limpieza que emplean al menos una de esas variantes de proteasa tal como se describe con mayor detalle en otra parte de la presente descripción.
Parte II Métodos para elaborar variantes de la proteasa GG36 para agua fría En la industria se conocen varios métodos adecuados para generar polinucleótidos modificados de la invención que codifican variantes de las proteasas GG36 para agua fría que incluyen, pero no limitan a, por ejemplo, mutagénesis de saturación del sitio, mutagénesis de barrido, mutagénesis por inserción, mutagénesis por deleción, mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida al sitio y evolución dirigida, además de otros métodos de recombinación distintos. Los métodos ilustrativos no limitantes para elaborar las variantes de la proteasa GG36 para agua fría de la Serie I se proveen en la sección anterior titulada "Vectores, células y métodos para preparar polipéptidos de las variantes de proteasas de la invención".
Ejemplo 19 Para probar la actividad enzimática en detergentes inactivados por calor se preparan soluciones de trabajo a partir de las soluciones de reserva inactivadas por calor. Se añaden cantidades apropiadas de agua con la dureza adecuada (p. ej., 1.59 g/L (6 gpg) o 3.17 g/L (12 gpg)) y tampón en las soluciones detergentes para alcanzar las condiciones deseadas. Las soluciones se mezclan por agitación en vórtice o mediante inversión de las botellas. La siguiente tabla suministra información sobre algunos de los detergentes disponibles comercialmente y condiciones de prueba usadas en la presente descripción. En algunos experimentos de los siguientes ejemplos son útiles algunos detergentes adicionales y/u otros detergentes comercialmente disponibles.
En algunos ejemplos adicionales son útiles las siguientes soluciones: La Tabla 19-3 provee composiciones detergentes granulares para lavandería producidas de acuerdo con la invención adecuadas para el lavado de telas.
En la Tabla 19-3, todos los niveles de enzimas están expresados como % de materia prima de enzimas, excepto la variante de la proteasa para agua fría (de esta invención) que se expresa como % de proteína activa añadida al producto. La Tabla 19-4 provee composiciones detergentes granulares para lavandería adecuadas para máquinas lavadoras automáticas de carga superior (composiciones detergentes 7-9) y máquinas lavadoras de carga frontal (composiciones detergentes 10-11). La variante de la proteasa GG36 y/o la variante de BPN' y/o la variante de la proteasa para agua fría de la presente invención se añade a estas formulaciones de manera separada.
En la Tabla 19-4, los ingredientes surfactantes pueden obtenerse de cualquier proveedor adecuado e incluyen, pero no se limitan a, BASF (p. ej., LUTENSOL®), Shell Chemicals, Stepan, Huntsman y Clariant (p. ej., PRAEPAGEN®). La zeolita puede obtenerse de proveedores tales como Industrial Zeolite. El ácido cítrico y el citrato de sodio pueden obtenerse de proveedores tales como Jungbunziauer. El percarbonato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio y sesquicarbonato de sodio pueden obtenerse de proveedores tales como Solvay. Los copolímeros de acrilato/maleato pueden obtenerse de proveedores tales como BASF. La carboximetilcelulosa y carboximetilcelulosa modificada hidrófobamente pueden obtenerse de proveedores tales como CPKelco. El abrillantador C.l. Fluorescent Brightener 260 puede obtenerse de 3V Sigma (p. ej., OPTIBLANC®, OPTIBLANC® 2M/G, OPTIBLANC® 2MG/LT Extra o OPTIBLANC® Ecobright. El disuccinato de S,S-et¡lendiamina tetrasódico puede obtenerse de proveedores tales como Innospec. El copolímero de tereftalato puede obtenerse de Clariant (p. ej., REPELOTEX SF 2). Además, el ácido 1-hidroxietano-1 ,1-difosfónico puede obtenerse de Thermphos. El intensificador de blanqueador en base a oxaziridinio tiene laR1 siguiente estructura, en donde = 2-butiloctil, y se produjo de acuerdo con la patente de los EE. UU. núm. 2006/0089284A1.
Las enzimas NATALASE®, TERMAMYL®, STAINZYME PLUS®, CELLUCLEAN® y MANNAWAY® pueden obtenerse de Novozymes. El tetrasulfonato de ftalocianina de zinc puede obtenerse de Ciba Specialty Chemicals (p. ej., TINOLUX® BMC). Los gránulos supresores de espuma pueden obtenerse de Dow Corning. En estas composiciones detergentes, el copolímero de injerto aleatorio es un copolímero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es de aproximadamente 6000 y la proporción en peso entre el óxido de polietileno y el acetato de polivinilo es de aproximadamente 40 a 60 y no más de 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno.
Ensayos y métodos de prueba Este ejemplo describe los distintos ensayos usados y provee más detalles de los Métodos de prueba 4-6.
Ensayo con TCA para determinar el contenido de proteínas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para GG36 y variantes de GG36, este ensayo comenzó con el uso de sobrenadantes del cultivo de B. subtilis filtrados a partir de placas de microtitulación cultivadas 2-3 días a 37 °C con agitación a 250 rpm y ventilación humidificada. Para el ensayo se usó una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocilios nueva (MTP; Costar 9017 placa de poliestireno transparente media aglutinante). Primero, se colocaron 100 pUpocillo de HCI 0.25 N en cada pocilio. Después, se añadieron 20-25 pL de sobrenadante de cultivo filtrado y la solución se mezcló en un mezclador de mesa (p. ej., Lab line Instruments, agitador de placa de titulación, modelo 4825) por 5-10 segundos. Después, se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm para proveer la lectura de la "preforma". Para la lectura de la "prueba" se añadieron 100 pUpocillo de ácido tricloroacético (TCA) al 30 % (w/v) en cada pocilio que contenía la mezcla de HCI y sobrenadante del cultivo y la placa se incubó por 10 minutos a témperatura ambiente. Después de mezclar la solución por un tiempo breve en un mezclador de mesa por no más de 2-3 s se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm. El aumento de la turbidez/dispersión de luz en las muestras coincide con la cantidad total de proteína precipitable en el sobrenadante del cultivo. Los cálculos se realizaron mediante la resta de la lectura de "preforma" (obtenida después de añadir solamente HCI y no TCA) de la lectura de "prueba" (obtenida después de la adición de TCA, tal como se describió anteriormente) para proveer una medida relativa del contenido de proteína en las muestras. Si se desea puede crearse una curva estándar mediante la calibración de las lecturas de TCA con ensayos AAPF de clones con factores de conversión conocidos. Sin embargo, los resultados de TCA son lineales con respecto a la concentración de proteínas de 50 a 500 partes por millón (ppm) de proteína (en donde 1 ppm corresponde a 1 mg/L) y, por ello, pueden graficarse directamente contra el rendimiento de enzimas para el propósito de elegir variantes con el rendimiento deseado.
Ensayo de AAPF de proteasas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para determinar la actividad de proteasa de las variantes de proteasa serina se midió la hidrólisis de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). Las soluciones reactivas usadas fueron: Tris/HCI 100 mM, pH 8.6 que contenía TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón de dilución Tris); tampón Tris 100 mM, pH 8.6 que contenía CaCI2 1 mM y TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón de Tris/Ca); y suc-AAPF-pNA 160 mM en DMSO (solución de reserva de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar una solución de trabajo de suc-AAPF-pNA se añadió 1 mi de solución de reserva de suc-AAPF-pNA en 100 mi de tampón Tris/Ca y se mezcló bien por al menos 10 segundos. Para realizar el ensayo se añadieron 10 mi de solución de proteasa diluida en cada pocilio de una MTP de 96 pocilios seguido inmediatamente por la adición de 190 pl de solución de trabajo de 1 mg/ml de suc-AAPF-pNA. Las soluciones se mezclaron por 5 s y se leyó el cambio en la absorbancia en modo cinético (25 lecturas en 5 minutos) a 405 nm en un lector de MTP a 25 °C. La actividad de proteasa se expresó como AL) (actividad = AOD min"1 mi"1).
Ensayo de inhibición de Eglin C Tal como se describe en la presente descripción, la concentración de la proteasa serina y la actividad especifica se determinó mediante titulación con un inhibidor denominado eglin c. Eglin c de la sanguijuela Hirudo medicinalis es un inhibidor de proteínas de unión estrecha de subtílisinas y proteasa ASP (Heinz y col., Biochemistry, 31 : 8755-66
[1992]) y, por ello, puede usarse para medir la concentración de la enzima proteasa que, a su vez, permite calcular la actividad específica. El gen de eglin c se sintetizó y expresó en E. coli por métodos estándar. Sus propiedades y potencia inhibitoria fueron iguales que las del eglin c adquirido en Sigma. (i) Determinación de la concentración de una solución de reserva de Eglin C Se diluyó una muestra de subtilisina de Bacillus lentus de actividad específica conocida en tampón Tris 100 mM, pH 8.6 que contenía CaCb 1 mM y TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón Tris/Ca) hasta una concentración apropiada para el ensayo de proteasa de AAPF descrita anteriormente. Además, en el tampón Tris/Ca se prepararon varias diluciones de la solución de reserva de eglin c. Se mezcló una alícuota de cada solución de eglin c diluida con un volumen igual de la solución de subtilisina de Bacillus lentus diluida. Además, se mezcló una alícuota del tampón de Tris/Ca solo, sin eglin c, con un volumen igual de la solución de subtilisina de Bacillus lentus diluida para medir la actividad de subtilisina no inhibida en ausencia de eglin c. Las soluciones mezcladas se incubaron a temperatura ambiente por 15-30 minutos y, después, se midió la actividad de proteasa de cada muestra por medio del ensayo de AAPF descrito anteriormente. En función de la actividad específica de la subtilisina de Bacillus lentus conocida se determinó la concentración de la proteasa activa en cada muestra. Después, se calculó la concentración de eglin c en cada muestra en base a la disminución de la actividad de proteasa observada en comparación con la muestra de subtilisina no inhibida que se mezcló con el tampón de Tris/Ca solo (sin eglin c). Así, con las diluciones y volúmenes conocidos de las soluciones de eglin c se determinó la concentración de eglin c en la solución de reserva. (ii) Determinación de la concentración y actividad especifica de las variantes de subtilisina Las muestras de las variantes de subtilisina se diluyeron en tampón Tris 100 mM, pH 8.6, que contenía CaCI2 1 mM y TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón Tris/Ca). Además, en el tampón de Tris/Ca se prepararon varias diluciones de la solución de reserva de c eglin de concentración conocida. Se mezcló una alícuota de cada solución de eglin c diluida con un volumen igual de una solución de variante de subtilisina. Las soluciones mezcladas se incubaron a temperatura ambiente por 15-30 minutos y, después, se midió la actividad de proteasa de cada muestra por medio del ensayo de AAPF. Con la disminución observada de la actividad de proteasa cuando se añadió cada muestra de eglin c y la concentración conocida de la eglin c se calculó la concentración de la eglin c necesaria para la inhibición completa de cada variante de la enzima subtilisina. Esta concentración es equivalente a la concentración de enzimas en la muestra. Además, se mezcló una alícuota del tampón de Tris/Ca solo, sin eglin c, con cada muestra de variante de subtilisina y la actividad de proteasa en ausencia de eglin c se midió por medio del ensayo de AAPF. Después, se calculó la actividad específica de las variantes de subtilisina con las concentraciones de enzimas tal como se determinó anteriormente.
Ensayo de micromuestras de BMI de los Métodos de prueba 4 - 6 Se obtuvieron micromuestras manchadas con sangre, leche y tinta (BMI) (EMPA116) de 5.5 milímetros de diámetro circular de CFT. En un método, la tela de BMI EMPA116 se preenjuagó en agua antes de cortarla en una placa de microtitulación de 96 pocilios (Corning 3641), una micromuestra por pocilio. En el segundo método, la tela EMPA 1 6 se corta directamente en una placa de microtitulación de 96 pocilios (Corning 3641) en donde después se enjuagan las muestras con dos lavados de agua. Los enjuagues se realizan mediante la adición de 200 µ? de agua Milli Q en cada pocilio/muestra y el mezclado de estos en un mezclador de mesa (Lab line instruments, agitador de placas de microtitulación, modelo 4825) por 15 minutos con un parámetro de 7. Se eliminó el licor de lavado y se añadieron 200 µ? de agua a la muestra para otro enjuague de 15 minutos. El agua del lavado se elimina y las muestras después se secan al aire en la placa de microtitulación.
Se diluyeron las composiciones detergentes 7-11 (Tabla 19-4) en agua Milli-Q (desionizada) hasta obtener las concentraciones de trabajo finales descritas en la Tabla 19-1. Estos detergentes se amortiguaron con carbonato de sodio 2 mM, pH 10.3. Además, se añadió una composición de dureza de agua (3:1 Ca:Mg. - CaCI2 : MgCI2-6H20) en cada solución detergente hasta obtener la concentración final descrita en la Tabla 19-5. Las soluciones detergentes se mezclaron a temperatura ambiente por 0.5 a 2 horas, se centrifugaron en tubos cónicos de polipropileno de 50 mL a 3000 xg por 5-10 minutos y se mantuvieron a temperatura ambiente para los ensayos a 32 °C o se preequilibraron en un baño de hielo para los ensayos a 16 °C. Después, se añadieron 190 pl de la solución detergente deseada en cada pocilio de la MTP que contenía micromuestras de BMI. En esta mezcla se añadieron 5 -15 pl de la solución de dilución maestra de enzimas diluida y se obtuvo una concentración de enzimas aproximada de 0.25-2 pg/ml en la reacción. La solución de dilución maestra de enzimas se preparó a partir de los sobrenadantes del cultivo filtrados (ver el ensayo de TCA descrito anteriormente) a ~2.5 - 20 pg/mL. La MTP se selló con cinta y se colocó en el incubador/agitador ¡EMS (Thermo/Labsystems) configurado previamente a 16 °C en un refrigerador por 30 minutos o a 32 °C en el banco de trabajo por 30 minutos con agitación a 1400 rpm. Después de la incubación en las condiciones apropiadas se transfirieron 120-125 pl de la solución de cada pocilio a una MTP nueva (Corning 9017). La MTP nueva que contenía 125 pl de solución/pocilio se leyó a 600 nm (con el modo de mezclado de 5 sec en el lector de placas) con el lector MTP SpectraMax. Además, se incluyeron controles de preforma que contenían una micromuestra y detergente sin enzima. El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor de la preforma (sustrato sin enzima) y se obtuvo una medida de la actividad hidrolítica. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de rendimiento. El índice de rendimiento compara el rendimiento de la variante (valor medido) y la enzima estándar (valor teórico) con la misma concentración de proteínas. Además, los valores teóricos pueden calcularse con los parámetros de una curva de redimiendo dosis-respuesta de la proteasa estándar. Un índice de rendimiento (Pl) mayor que 1 (Pl>1) identifica una variante mejorada en comparación con el estándar (p. ej., silvestre), mientras que un Pl de 1 (Pl=1) identifica una variante que tiene el mismo desempeño que el estándar y un Pl menor que 1 (Pl<1) identifica una variante que tiene un desempeño peor que el estándar. Así, el Pl identifica las mejores opciones, además de las variantes que son menos deseables para usar en ciertas circunstancias.
Ensayo de estabilidad con LAS/EDTA La estabilidad de las variantes de la proteasa en presencia de un surfactante aniónico representativo (LAS=alquilbencenosulfonato lineal, dodecilbencenosulfonato de sodio-DOBS) y EDTA disódico se mide después de la incubación en condiciones definidas y la actividad residual se determina por medio del ensayo con AAPF descrito anteriormente. Los reactivos usados fueron dodecilbencenosulfonato, sal sódica (DOBS; Sigma núm. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma núm. P-8074), EDTA disódico (Siegfried Handel núm. 164599-02), HEPES (Sigma núm. H-7523), tampón sin estrés: HEPES 50 mM (11.9 g/l) + TWEEN®-80 al 0.005 %, pH 8.0, tampón con estrés: HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1 % (w/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0, sobrenadantes del cultivo de la proteasa de referencia y la variante de la proteasa que contenían 200 - 400 pg/ml de proteina. El equipo usado fue MTP de fondo en V o en U con placas de dilución (Greiner 651101 y 650161 , respectivamente), MTP de fondo en F (Corning 9017) para el tampón sin estrés y tampón de LAS/EDTA y también para las placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices) e incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems).
El incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) se configuró en 29 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que contenían tampón sin estrés hasta una concentración de - 25 ppm (placa de dilución maestra). Para el ensayo se añadieron 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón sin estrés para producir una concentración de incubación final de 2.5 ppm. El contenido se mezcló y se mantuvo a temperatura ambiente y el ensayo de AAPF se realizó en esta placa. Además, se añadieron 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón de estrés (HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1 % (w/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0). Las soluciones se mezclaron y se colocaron inmediatamente en un agitador ¡EMS a 29 °C por 30 min a 400 rpm. Después de 30 minutos de incubación se realizó un ensayo con AAPF en la placa de estrés. Se determinó la estabilidad de las muestras mediante el cálculo de la relación de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente manera: actividad residual (%) = [mOD.min-1 con estrés]*100 / [mOD. min-1 sin estrés].
Las concentraciones del detergente final, dureza del agua y tampón se determinaron en base al sistema de ensayo que se usará (p. ej., condiciones de América del norte, Japón, Europa occidental o Europa central). En algunos aspectos, el rendimiento de remoción de manchas de las variantes de la proteasa se determina en detergentes disponibles comercialmente. La inactivación por calor de las fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática de cualquier componente de proteina mientras se retienen las propiedades de los componentes no enzimáticos. Así, este método es adecuado para preparar detergentes comerciales para usar en las pruebas de las variantes de enzimas de la presente invención.
Ensayo de microtitulación con huevo cocido Para este ensayo se prepararon placas de sustrato de yema de huevo cocida de 96 pocilios a partir de yemas de huevo de pollo. Las yemas de huevo de pollo se separaron de las claras, se extrajeron de la membrana y se diluyeron al 20 % (vol/peso) con agua Milli-Q. La yema diluida se agitó por 15 min a temperatura ambiente con un agitador magnético. Se pipetearon cuidadosamente cinco pL en el centro de cada pocilio de una placa de fondo en V de 96 pocilios (Costar núm. 3894) con una pipeta de 8 canales. Las placas se hornearon a 90 °C por 1 hora y se enfriaron a temperatura ambiente. Las placas de sustrato de yema de huevo cocida se almacenaron a temperatura ambiente y se usaron dentro de la semana de la preparación. Se prepararon detergentes para el lavado automático de vajilla tal como se describe en la presente descripción y se precalentaron hasta 50 °C. Se añadió una alícuota de 190 \ L en cada pocilio de la placa de 96 pocilios con una pipeta de 8 canales. Se añadieron diez pL de enzima diluida en cada pocilio con un dispositivo de pipeteado de 96 canales. La placa se selló cuidadosamente con un sellador de lámina adhesiva y se incubó a 50 °C con agitación por 30 min. Se transfirieron 120 pL de la mezcla de reacción a una nueva placa de fondo plano de 96 pocilios y se determinó la absorbancia/dispersión de luz a 405 nm. La absorbancia/dispersión de luz a 405 nm es proporcional a la eliminación de yema de huevo.
Indice de rendimiento El índice de rendimiento compara el rendimiento de la variante (valor medido) y la enzima estándar (valor teórico) con la misma concentración de proteínas. Además, los valores teóricos pueden calcularse con los parámetros de una curva de rendimiento dosis-respuesta de la proteasa estándar. Varios términos establecidos más abajo se usan para describir la variante: las variantes no perjudiciales tienen un Pl > 0.05; las variantes perjudiciales tienen un Pl = 0.05; las variantes combinables son aquellas para las cuales la variante tiene valores del índice de rendimiento mayores que o iguales a 0.2 para al menos una propiedad y >0.05 para todas las propiedades. Las variantes combinables son aquellas que pueden combinarse para suministrar proteínas con índices de rendimiento apropiados para una o más propiedades deseadas. Estos datos son útiles en la ingeniería de cualquier subtilisina/subtilasa. Aun cuando la subtilasa que se diseñará por ingeniería tiene un aminoácido diferente del de la subtilisina GG36 en posiciones específicas, estos datos son útiles para encontrar sustituciones que alterarán las propiedades deseadas mediante la identificación de las mejores elecciones para las sustituciones que incluyen las sustituciones para el aminoácido silvestre de GG36.
Ejemplo 20 Generación de mutantes de GG36 simples mediante genotecas de evaluación de sitios (SEL) GENEART realizó la construcción de las SEL de GG36 descritas en este ejemplo con sus métodos y plataforma tecnológica de propiedad para optimización de genes, síntesis génica, generación y análisis de genotecas (patente WO 2004/059556A3, patentes europeas núms. 0 200 362 y 0 201 184 y patentes de los Estados Unidos núms. 4,683,195, 4,683,202 y 6,472, 184). Las SEL de GG36 se produjeron en posiciones preseleccionadas por los inventores con el plásmido de expresión de B. subtilis pHPLT-GG36 (ver la Figura 6). Este plásmido de expresión de B. subtilis contiene el cásete de expresión que se muestra más abajo, el promotor de B. licheniformis LAT (Plat) y elementos adicionales de pUB1 10 (McKenzie y col., Plasmid, 15:93- 103, 1986) que incluyen un gen replicasa (reppUB), un gen de resistencia a la neomicina/canamicina (neo) y un marcador de resistencia a la bleomicina (bleo) (Figura 4 en la patente de los Estados Unidos núm. 6,566,1 12). El mapa plasmídico de pHPLT-GG36 se provee en la Figura 6. La secuencia del cásete de expresión de GG36 se provee más abajo.
La secuencia de ADN de GG36 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia madura de GG36 en mayúsculas) se provee más abajo: Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgctttcagttcatcgatcgcatc ggctgctqaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgaqcaggaagctgtcagtqagtttgtagaac aagtaqaggcaaatgacgagqtcgccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaattt gaaacqattcctqttttatccgttqagttaagcccaqaaqatqtqqacgcqcttqaqctcqatccagcgatttctta tattqaaqaqqatqcaqaaqtaacqacaatqGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCC GTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTA AAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTC GTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAAT GGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGAT TGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTAT TAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGA ATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCC CTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGA GGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAG CTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAA ACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTC GCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAG CTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCC TTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCT AAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGAC TTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAA (SEQ ID NO:756) La secuencia de proteínas de la GG36 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia de proteasa madura de GG36 en mayúsculas) se provee más abajo: vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyliqfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefeti pylsvelspedvdaleldpaisvieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVA VLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVA PSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQ AVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYG AGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQI RNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:757).
El método de mutagénesis se basó en el enfoque de mutación especifica del codón en el cual todas las sustituciones posibles de aminoácidos se crean simultáneamente en un codón de interés especifico con iniciadores de mutagénesis directos e inversos que contienen un codón redundante, NNS ((A,C,T o G), (A,C,T o G), (C o G)) en el sitio de interés. Para construir cada SEL de GG36 se realizaron tres reacciones por PCR: dos reacciones de mutagénesis (PCR1 y PCR2 primarios) para introducir el codón de interés mutado en la secuencia de ADN de GG36 madura con iniciadores de mutagénesis directos e inversos de NNS (25-45 nucleótidos de longitud) y una tercera reacción para fusionar los dos productos de mutagénesis de PCR juntos para construir el vector de expresión de pHPLT-GG36 que tiene los codones mutados deseados en la secuencia de GG36 madura.
Las secuencias del iniciador usadas en este ejemplo se proveen más abajo: La ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes, catálogo núm. F-530L) se usó para todas las PCR y las reacciones se realizaron de conformidad con los protocolos del fabricante provistos con la polimerasa. Particularmente, para la PCR primaria 1 se usó 1 pL (10 µ?) de cada iniciador de pHPLT-Bglll-Fw y un iniciador de mutagénesis inverso de NNS y para la PCR primaria 2 se usó 1 pL (10 µ?) del iniciador de pHPLT-Bglll-Rv y un iniciador de mutagénesis directo de NNS. Cada reacción incluyó, además, 1 pL del ADN molde del plásmido pHPLT-GG36 (0.1 - 1 ng/ pL). Para las PCR se usó un ciclador térmico MJ Research PTC-200 Peltier. Las reacciones produjeron dos fragmentos de aproximadamente 2 a 3 kb que tienen un traslape de aproximadamente 30 nucleótidos que rodea el codón de interés de GG36. Los fragmentos obtenidos se fusionaron en una tercera PCR similar a las descritas anteriormente con 1 µ?_ de mezcla de reacción de PCR primaria 1 , 1 pL de mezcla de reacción de PCR primaria 2 y 1 µ!_ (10 µ?) de cada iniciador directo e inverso Sacl-Fw y H/ncflll-Rv. El fragmento de 859 bp lineal amplificado que codifica el gen de la variante de GG36 se purificó (con el estuche de purificación de PCR Qiaquick QIAGEN®) y se realizó la digestión con las enzimas de restricción Sacl y Hindllll para crear extremos de adhesión en cada lado del fragmento de la fusión. Además, se purificaron aproximadamente 50 ng del plásmido pHPLT-GG36 después de la digestión con Sacl y HindWW lo que produjo un fragmento de cadena principal del vector de 3.9 kb. El fragmento del vector digerido se ligó con 50 ng del fragmento de 859 bp digerido que codifica la enzima de la variante con la ligasa de ADN T4 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante para clonar extremos de adhesión. Posteriormente, la mezcla de ligación se usó para transformar células de B. subtilis {AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32, AamyE::[xylR,pxylA-comK\) tal como se describió (WO 2002/014490).
Para expresar las proteínas de la variante para un análisis bioquímico más detallado, las cepas de 8. subtilis que portan los plásmidos de la variante de GG36 se inocularon en placas de microtitulación que contenían 150 µ? de medio de caldo Luria suplementado con 10 pg/ml de neomicina. Las placas se cultivaron de la noche a la mañana a 37 °C con agitación a 300 rpm y una humedad de 80 % con tapas de Enzyscreen para placas de microtitulación (Enzyscreen). Se usaron diez microlitros de la placa de cultivo de la noche para inocular una nueva placa de microtitulación que contenia 190 µ? de medio MBD (un medio definido basado en MOPS) con 10 ug/ml de neomicina. El medio MBD se preparó, prácticamente, tal como se conoce en la industria (ver Neidhardt y col., J. Bacteriol. 119:736-747
[1974]), salvo que se omitió el NH CI, FeSO4 y CaCI2 del medio de base, se usó K2HPO4 3 mM y el medio de base se suplemento con urea 60 mM y 100 mi de una solución preparada con 210 g/L de glucosa y 350 g/L de maltodextrina. Los micronutrientes se formaron con una solución de reserva 100X que en un litro contenía 400 mg de FeS04 7H20, 100 mg de MnS0 H20, 100 mg de ZnS047H20, 50 mg de CuCI2-2H20, 100 mg de CoCI2-6H20, 100 mg de NaMo04-2H20, 100 mg de Na2B O7 10H2O, 10 mi de CaCI2 1M y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. El medio MBD que contenía placas de microtitulación se cultivó durante 68 horas a 37 °C, 300 rpm y 80 % de humedad con tapas de Enzyscreen (Enzyscreen) para determinar la expresión de la proteína. Al día siguiente los cultivos se filtraron a través de una microplaca de filtro (0.22 pm; Millipore) y el filtrado resultante se usó para análisis bioquímicos. Los ensayos de TCA y de micromuestras de BMI para las composiciones detergentes 7-11 se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 19. Además, se calcularon los índices de rendimiento tal como se describió en el ensayo de BMI de los Métodos de prueba 4 - 6 tal como se describe con detalle en el Ejemplo 19 y se muestra en la Tabla 20-2 con respecto a GG36. En las siguientes tablas, las composiciones detergentes ("Det.") corresponden a las que se muestran en la Tabla 19-4 anterior. Además, como se indica, la posición del aminoácido se menciona en la lista de conformidad con la numeración de BPN'.
Tabla 20-3. Variantes simples de GG36 con índices de rendimiento de al menos 1.5 con respecto a la limpieza de micromuestra de BMI de GG36 a 32 *C en el detergente 7.
Variante de GG36 N62E A158E G159E Tabla 20-4. Variantes simples de GG36 con índices de rendimiento de al menos 1.2 con respecto a la limpieza de micromuestra de BMI de GG36 a 32 °C en el Detergente 10.
Variante de GG36 A1 R S78R V244R N269R E271 L Ejemplo 21 Construcción v rendimiento de limpieza de los conjuntos NHJ1 y WCE1 de variantes de GG36 Los conjuntos de variantes de GG36 NHJ1 y WCE1 descritos en la presente descripción se construyeron en DNA 2.0, Inc. con el plásmido de expresión de fí. subtilis pHPLT-GG36 descrito anteriormente (Figura 6). Las variantes se expresaron en células de B. subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) tal como se describe en el Ejemplo 20 y se caracterizaron aun más con el ensayo de TCA para determinar el contenido de proteínas, el ensayo de estabilidad de LAS/EDTA y el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI tal como se describe en el Ejemplo 19. Estos resultados se muestran en las Tablas 21-1 y 21-2. En las siguientes tablas, las composiciones detergentes ("Det.") corresponden a las que se muestran en la Tabla 19-4 anterior. Además, como se indica, la posición del aminoácido se menciona en la lista de conformidad con la numeración de BPN'.
Ejemplo 22 Construcción y rendimiento de limpieza del conjunto NHJ4 de variantes de GG36 El conjunto NHJ4 de vanantes de GG36 descritas en la Tabla 22-1 más abajo se construyó con el plásmido de expresión de B. subtilis pHPLT-GG36 (Figura 6) con fusión por PCR o el estuche de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE® ("estuche QCMS"; Stratagene) tal como se describe más abajo. a) Construcción de variantes de NHJ4 por medio de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE® Las variantes creadas con mutagénesis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE® se muestran en la Tabla 22-1. El plásmido parental pHPLT-GG36 (ADN molde) se metilo con dos microgramos de ADN y Dam metilasa (NEB) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los mutantes dirigidos al sitio se prepararon por medio de un estuche de mutagénesis dirigida a sitios múltiples QuikChange® ("estuche QCMS"; Stratagene) según el protocolo del fabricante. Las siguientes mutaciones se introdujeron en el plásmido parental.
S101A-S103G-V104L, G159E, T22A, Y209E, E271 F, S101A, S103G, L 11V, S128N, N62E y S188D, para la transformación eficiente de B. subtilis, el ADN de las mezclas de reacción de QCMS se amplificó mediante amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) con el estuche lllustra Templiphi (GE Healthcare) y la reacción se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó un microlitro de ADN amplificado diluido diez veces para transformar 50 pL de células competentes de ß. subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). La mezcla de transformación se agitó a 37 °C por 1 hora. Se colocaron alícuotas de diez microlitros de la mezcla de transformación en placas de agar Luria con leche descremada (1.6 %) suplementadas con 10 pg/ml de neomicina (Teknova). Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio LB que contenia 10 pg/mL de neomicina para la extracción del ADN plasmídico (estuche QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Los plásmidos extraídos se secuenciaron para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. b) Construcción de variantes de NHJ4 por medio de PCR de extensión Se crearon diez mutantes combinatorios de GG36 por PCR de extensión. La lista de mutaciones introducidas en el gen de GG36 contenido en el plásmido pHPLT fue la siguiente: T22A, N62E, S103G, S103G-L1 1V, S101G-S103A-V104I, S101A-S103G-V104L, S101A, S128N, G159D, G159E, Y209E y L11 V. Para crear cada mutante se amplificaron los fragmentos de PCR que contenían las mutaciones deseadas con iniciadores mutagénicos además de iniciadores directos e inversos para amplificar la variante de GG36 completa. Cada reacción de amplificación por PCR contenía 30 pmol de cada iniciador mutagénico y 100 ng del ADN molde, plásmido pHPLT-GG36. Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (NEB). La reacción de PCR (20 pL) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, hibridación a 55 °C por 1 5 s. y extensión a 72 °C por 1 min. Después de la amplificación se purificaron 2 a 4 fragmentos de PCR para cada variante por medio de gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN® y se mezclaron (50 ng de cada fragmento). Estas mezclas se usaron como moldes de ADN para la PCR de extensión para generar los fragmentos génicos de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. El fragmento de ADN de longitud completa se purificó mediante gel con el estuche de purificación con bandas de gel QIAGEN®, se realizó la digestión con las enzimas de restricción fíarnHI y HindU y se ligó con el pHPLT-GG36 que se trató por digestión con las mismas enzimas de restricción. Un microlitro de las mezclas de ligación se amplificó con amplificación por circulo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Los productos de la amplificación por círculo rodante se diluyeron 100 veces y se usaron para transformar células de B. subtilis (genotipo: AaprE, ???p?, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Se colocó una alícuota de la mezcla de transformación en placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 pg/mL de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio de caldo de Luria que contenía 10 pg/mL de neomicina para extracción de ADN plasmídico (estuche QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Los plásmidos extraídos se secuenciaron para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. Las variantes creadas por medio de PCR de extensión se muestran en la Tabla 22-1.
Para expresar el conjunto NHJ4 de las proteínas de la variante para un análisis bioquímico más detallado se inocularon las cepas de B. subtilis que portan los plásmidos de la variante en placas de microtitulación que contenían 150 pl de medio de caldo de Luría suplementado con 10 pg/ml de neomicina. Los cultivos se cultivaron para la expresión de proteínas tal como se describe en el Ejemplo 20 y se filtraron a través de una placa de microfiltro (0.22 pm; Millipore) tal como se describe también en el Ejemplo 20. El filtrado resultante se usó para análisis bioquímicos. El ensayo de inhibición de eglin c para determinar el contenido de proteínas y los ensayos de micromuestras de BMI probados en varios detergentes se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 19. Además, se calcularon los índices de rendimiento tal como se describe en la descripción del ensayo de BMI de los Métodos de prueba 4 - 6 que se detallan aun más en el Ejemplo 19. La Tabla 22-1 suministra información relacionada con estas variantes de mutación múltiples y los resultados obtenidos para ellas. Los valores de los Pl se dan con respecto a GG36. En las siguientes tablas, las composiciones detergentes ("Det.") corresponden a las que se muestran en la Tabla 19-4 anterior. Además, como se indica, la posición del aminoácido se menciona en la lista de conformidad con la numeración de BPN'.
Ejemplo 23 Construcción y rendimiento de limpieza del conjunto NHJ3 de variantes de GG36 El conjunto NHJ3 de variantes descritas en la presente descripción se basa en una variante de GG36 (mencionada como GG36-9) que contiene las siguientes mutaciones: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D y N252K (numeración de BPN'). Estas variantes se crearon con el estuche de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE® Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (estuche QCLDS; Stratagene) con el plásmido pRA68 (ver la Figura 7) como el ADN molde. El plásmido pRA68 se derivó del vector pBN3 (ver Babé y col., Biotech. núm. Biochem. 27:117-124
[1998]).
La secuencia de ADN de la variante GG36-9 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia madura de GG36-9 en mayúsculas) se provee más abajo: Gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatc ggctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattqqctttaatqaqcaqgaagctgtcaqtgaqtttqtaqaac aaqtaqaqqcaaatqacqaqqtcqccattctctctqaqqaaqaqqaaqtcqaaattgaattgcttcatqaattt gaaacgattcctqttttatccgttqagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccaqcqatttctta tattqaaqaqqatqcaqaaqtaacqacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCC GTGTGCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTA AAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTC GTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAAT GGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGAT TGGCGTACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAÁGTAT TAGGGGCGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGA ATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCC CTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGG GGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAG CTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAA ACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTC GCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAG CTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCT TGTTAAACATAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCT AAAGAAAACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGAC TTGTCAATGCCGAAGCTGCAACTCGTTAA (SEQ ID NO:762).
La secuencia de proteínas de la variante GG36-9 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia de proteasa madura de GG36-9 en mayúsculas) se provee más abajo: vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyliqfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellhefeti pyIsvelspedvdaleldpaisvieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVA VLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVA PSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQA VNSATSRGVLWAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGA GLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLVKHKNPSWSNVRIR DHL KTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID N0763) Para crear las variantes de NHJ3 con el estuche QCLSD se diseñaron iniciadores mutagénicos para cada variante según el protocolo del fabricante. La reacción de mutagénesis para cada variante consistía de 0.5 pl de tampón 10X, 0.5 pL de ADN plasmidico de pRA68 (168 ng/pL), 0.5 pl de iniciador mutagénico directo (25 µ?), 0.5 µ? de iniciador de mutagénesis inverso (25 µ?), 1 µ? de dNTPs (suministrado en el estuche de QCLSD), 1.5 ul de solución Quik (suministrada en el estuche de QCLMS), 1 µ? de mezcla de enzimas (suministrada en el estuche de QCLSD) y 40 µ? de agua desionizada destilada para preparar un volumen de reacción de 50 µ?_ según las instrucciones del fabricante. El programa de ciclado fue de 1 ciclo a 95 °C por 2 minutos, 18 ciclos de 95 °C por 20 segundos, 60 °C por 10 segundos y 68 °C por 3 minutos, 22 segundos y un ciclo final de 68 °C por 5 minutos. A continuación se usó 1 µ?_ de enzima de restricción de Dpnl suministrada en el estuche para digerir el ADN plasmídico en la reacción y, después, se usaron 2 µ?_ de la reacción para transformar células competentes de E. coli TOP 10 (Invitrogen). Los transformantes de E. coli se seleccionaron en placas de medio de caldo de Luria que contenían 50 pg/mL (ppm) de carbenicilina después del cultivo de la noche a la mañana a 37 °C. El ADN plasmídico se extrajo de 4-8 colonias de E. coli cultivadas en medio de LA que contenía 50 pg/mL (ppm) de carbenicilina con el estuche miniprep de centrifugación QIAprep spin miniprep (Qiagen). Los plásmidos se secuenciaron para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. Despúes, los plásmidos de la variante se transformaron en células de B. subtilis tal como se describe en el Ejemplo 20. Las cepas de la variante de B. subtilis se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 20 para un análisis bioquímico más detallado, tal como la determinación del contenido de proteínas por medio del ensayo de inhibición de eglin c (Ejemplo 19) y un ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI (Métodos de prueba 4 - 6, Ejemplo 19). Los resultados se proveen más abajo en las Tablas 23-1 y 23-2. Los Pl se dan con respecto a GG36. En las siguientes tablas, las composiciones detergentes ("Det ") corresponden a las que se muestran en la Tabla 19-4 anterior. Además, como se indica, la posición del aminoácido se menciona en la lista de conformidad con la numeración de BPN'.
Ejemplo 24 Construcción y rendimiento de limpieza del conjunto NHJ5 de variantes de GG36 El conjunto NHJ5 de variantes descritas en la presente descripción se basa en una variante de GG36 (mencionada como GG36-7) que contiene las siguientes mutaciones: S101G, S103A, V104I, G159D, A232V, Q245R, N248D y (numeración de BPN'). Estas variantes se crearon con el estuche de mutagénsis dirigida a múltiples sitios QUIKCHANGE® Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis ("estuche QCL S") con el plásmido pRA96 como el ADN molde (ver la Figura 8). Las mutaciones incorporadas incluían: H243R (H249R), E265F (E271 F), D157E (D 159E), A156E (A158E), A156E-D157G (A158E- D159E), T22A, N60E (N62E), N232R (N238R), D242R (D248R), T247R (T253R), S24R, N74D (N76D) {Numeración de GG36 y numeración de BPN' se muestran entre paréntesis.
Las variantes se generaron con los métodos descritos en el Ejemplo 23. Las cepas de la variante de B. subtilis se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 20 para un análisis bioquímico más detallado, tal como la determinación del contenido de proteínas por medio del ensayo de inhibición de eglin c (Ejemplo 19) y el ensayo de limpieza con una micromuestra de BMI. Los resultados se proveen más abajo en la Tabla 24-1. Los valores de los Pl se dan con respecto a GG36. En las siguientes tablas, las composiciones detergentes ("Det.") corresponden a las que se muestran en la Tabla 19-4 anterior. Además, como se indica, la posición del aminoácido se menciona en la lista de conformidad con la numeración de BPN'.
La secuencia de ADN de la variante GG36-7 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia de proteasa madura de GG36-7 en mayúsculas) se provee más abajo: gtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcgg ctgctgaaqaaqcaaaagaaaaatatttaattqqctttaatgagcaqgaaqctqtcaqtqaqtttqtaqaacaaq tagaqgcaaatgacqaggtcqccattctctctgaggaagaggaagtcgaaattgaattqcttcatqaatttqaaa cqattcctgttttatccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattga aqaqgatgcagaagtaacgacaatgGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGT GCAAGCCCCGGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGT TGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGT GGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCA TGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGT ACTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGG CGAGCGGTGGGGGCGCCATCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGC AGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCC AAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGGGGCGTTCT TGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCGGGTGCAGACTCAATCAGCTATCCGGC CCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCG CGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATCGTCGCACCAGGTG TAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTA CATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGTCCTTGTTAAACAAA AGAACCCATCTTGGTCCAATGTACGAATCCGCGATCATCTAAAGAATACGG CAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCCG AAGCTGCAACTCGT (SEQ ID NO:764) La secuencia de proteínas de la variante GG36-7 (la secuencia señal se muestra en letras minúsculas, el propéptido en minúsculas, subrayado y la secuencia de proteasa madura de GG36-7 en mayúsculas) se provee más abajo: vrskklwivastallisvafsssiasaaeeakekyligfneqeavsefveqveandevailseeeeveiellh efetipylsvelspedvdaleldpaisvieedaevttmAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGS GVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNN SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGGGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGS PSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGADSISYPARYANAMAVGATDQN NNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAVLV KQKNPSWSNVRIRDHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:765) Ejemplo 25 Construcción de la genoteca combinatoria NHJ2 Este ejemplo describe la construcción de una genoteca combinatoria de GG36 que implica una o más de las siguientes mutaciones: A16S, T22A, S101A, S103G, V104L, L1 1 1V, S128N y L148I (numeración de BPN'). El plásmido de expresión de B. subtilis pHPLT-GG36 se suministró a DNA 2.0 Inc. para la generación de una genoteca combinatoria NHJ2. DNA 2.0, Inc. suministró una reacción de ligación de la genoteca NHJ2 construida para la transformación en la cepa de B. subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcom -phleo). Las variantes generadas que contenían una o varias de las mutaciones descritas en la presente descripción se probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción.
Ejemplo 26 Construcción de qenotecas y variantes de GG36 adicionales Se construyeron genotecas y variantes adicionales con el siguiente conjunto de mutaciones: A1 R, A230E, E271 L, G1 15R, G20R, H249R, K235F, K27V/F/L, L75E, L82R, N18R, N269R, N43D, N43R, N76D, R45T, S212F, S242R, S24R, S78R, S9A, T22R, V121 E, V244R, V28E, V30E, V4R, W241 R (numeración de BPN'). Las variantes generadas que contenían una o más de estas mutaciones se probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción.
Otros conjuntos de variantes de GG36 se construyeron y probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción; los conjuntos incluyen: G20R-N43R-H249R, G20R-T22R-N43R, G20R-N43R-S242R, G20R-N43R-E271 L, G20R-N43R-V244R, G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-T22R-S78R-S212F-W241 R, S9A-G20R-N43R-S212F, S9A-N43R-S212F, G20R-N43R-S212F, G20R-T22R-N43R-S212F, S24R-S78R-S212F, S9A-N43R-S78R, S9A-N43R-S78R-S242R, S9A-G20R-N43R-S78R, G20R-S24R-N43R-S78R-S242R, T22R-S24R-S78R-S212F, S9A-G20R-N43R-S78R-S242R, G20R-N43R-S78R-H249R, G20R-N43R-S78R, S9A-S78R-S212F, S9A-T22R-N43R-S78R, S9A-G20R-S24R-N43R, S9A-T22R-S78R-S212F, V4R-S9A-T22R-S78R-S212F, G20R-S24R-N43R, A1 R-S9A-N43R, G20R-S24R-N43R-G115R, S9A-S24R-N43R, G20R-T22R-S24R-N43R, A1 R-S24R-N43R, S9A-G20R-S24R-N43R-S242R, S9A-G20R-T22R-S78R-S212F, S9A-S24R-N43R-V244R, S9A-S24R-N43R-S242R, V4R-S9A-T22R-S24R-S212F y T22R-S24R-N43R (numeración de BPN').
Ejemplo 27 Construcción y rendimiento de limpieza de la genoteca WCE2 de GG36 DNA 2.0, Inc. generó la genoteca combinatoria WCE2 por medio del plásmido de expresión de B. subtilis pHPLT-GG36. DNA 2.0, Inc. suministró una reacción de ligación de la genoteca WCE2 construida para la transformación en la cepa de ß. subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-p leo).
El conjunto de mutaciones usado para generar la genoteca WCE2 es A230E, G20R, H249R, N18R, N43R/D, N76D, R45T, S242R y S24R (numeración de BPN ). Las variantes generadas que contenían una o más de estas mutaciones se probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción.
Ejemplo 28 Construcción y rendimiento de limpieza del conjunto WCE3 de variantes de GG36 Este ejemplo describe el conjunto WCE3 de mutantes basado en las variantes de GG36, GG36-7 (Ejemplo 23) y GG36-9 (Ejemplo 22). Estas variantes son: S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R, S101 G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248D, S101G-S103A-V104I-G159D-A232V-Q245R-N248R, S101 G-S1 OSAV104I-A232V-Q245R, S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248R, S101G-S103A-V104I-G159R-A232V-Q245R-N248R y S101G, S103A, V104I, A232V, Q236H, Q245R y N252K. Se crearon con el estuche de mutagénsis dirigida a múltiples sitios QuikChange® Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (estuche QCLMS; Stratagene) con el plásmido pRA96 como el ADN molde descrito en el Ejemplo 23. Las variantes generadas se probarán para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente solicitud.
Ejemplo 29 Construcción de genotecas y variantes de GG36 adicionales Este ejemplo describe la construcción de variantes de GG36 y genotecas con una o más de las siguientes mutaciones: A16S, T22A, S24R, N62E, N76D, E89P, S101A7G, S103G/A, V104L I, L111V, S128N, P129E, A232V, L148I, A158E, G159D/E, S166D, R186H, S188D, Y209E, Q236H, N238R, Q245R, N248D/R, H249R, N252K/R, T253R, E271 F (numeración de BPN') con un plásmido de expresión de B. subtilis (p. ej., pHPLT-GG36; Figura 6). Las variantes generadas que contenían una o más de estas mutaciones se probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción.
Ejemplo 30 Construcción de genotecas y variantes de GG36 adicionales Este ejemplo describe la construcción de variantes de GG36 y genotecas en B. subtilis con una o más de las siguientes mutaciones (numeración de BPN'): A1 R, Q2S, Q2M, Q2A, Q2R, Q2W, S3R, V4R, V4S, V4C, I8A, S9A, S9F, S9W, R10S, R10A, R10H, R10M, Q12F, Q12R, P14K, P14F, P14Q, A15R, A15F, A16S, H17R, H17M, H17F, N18R, N18K, G20F, G20K, G20R, T22A, T22R, T22Y, T22V, T22Q, T22L, T22W, G23A, G23S, G23F, S24R, S24F, S24W, S24Q, S24H, S24L, G25V, G25F, G25R, V26F, K27L, K27F, K27R, K27V, V28A, V28N, V28E, A29T, V30E, L31 F, T33S, T33G, T33D, G34P, I35M, S36T, S36F, S36R, T38L, T38F, T38R, P40N, P40L, P40T, P40W, P40H, P40R, L42I, N43A, N43F, N43I, N43S, N43R, N43M, N43W, N43D, R45T, G46R, A48R, F50C, V51W, V51F, V51 H, P52F, P52E, P52N, P55Y, T57R, Q59A, Q59F, Q59R, D60P, D60Q, D60A, N62E, N62Q, G63V, G63M, G63T, G63I, G63A, G63S, G63H, G63Q, G63D, G63E, G63P, H64F, H64T, V68A, V68C, A69N, A69T, A69P, A69W, T71G, I72C, A74C, L75A, L75F, L75E, L75R, N76D, S78R, S78N, S78I, I79W, I79Q, V81R, L82F, L82T, L82V, L82R, L82M, A85M, P86W, P86L, P86I, E89P, E89T, E89G, E89H, E89L, E89V, E89W, E89F, E89I, Y91N, Y91F, A92F, K94N, S99F, S99T, S99P, S99G, S99M, G100S, G100N, G100Q, G100I, S101A, S101N, S101G, S101T, S101D, S101E, S101P, S101F, G102A, G102T, G102N, G102H, G102E, S103G, S103N, S103D, S103A, V104L, V104I, V104E, V104D, S105T, S105E, S105Q, S106G, S106T, S106E, S106D, S106A, S106V, S106F, I107M, I107F, A108I, A108G, Q109M, L111V, L111 I, E112V, E112L, E112Q, A114G, G115K, G115R, N116K, N116A, N116L, N117F, G118R, G118I, M119C, H120A, H120F, H120R, V121 F, V121 E, N123G, N123E, L124S, S128D, S128F, S128L, S128N, S128H, S128M, S128I, S128Q, P129E, S132A, S132E, A138G, S144R, V147L, L148I, A158E, G159D, G159E, G159C, S160D, S166D, S166E, Y167W, M175V, V177C, D181A, Q182R, N183I, N183D, N183M, N183F, N183R, N185E, N185V, N185I, R186H, R186K, S188E, S188D, S188R, Y192H, Y192W, A194E, A194V, A194F, D197F, I198L, I198F, V203E, V203C, T208S, Y209S, Y209N, Y209F, Y209T, Y209E, Y209H, Y209G, Y209L, P210R, P210V, P210L, G211Q, G211R, S212I, S212M, S212F, T213A, Y214F, A215N, A215D, A215E, A215H, A215F, S216F, S216A, L217E, L217N, L217D, N218D, N218P, N218E, T224A, T224G, V227I, A230E, A231 I, A231 C, A232V, L233C, V234F, K235F, Q236F, Q236N, Q236H, N238R, N238K, N238L, P239K, P239G, P239R, P239H, P239T, P239N, P239S, P239F, S240R, W241 R, S242L, S242R, N243F, N243R, V244R, Q245R, I246S, N248D, N248V, N248I, N248R, H249R, H249T, L250I, K251 R, K251S, N252I, N252F, N252R, N252K, N252H, T253I, T253R, T253F, A254C, S256N, G258R, T260V, T260I, L262D, L262H, Y263F, S265F, L267V, L267N, L267M, N269I, N269R, A270C, E271 I, E271V, E271 H, E271 M, E271 L, E271 P, E271A, E271 F, E271T, A272F, A272F, A272R, A273F, A273I y T274G. Las variantes generadas que contenían una o más de estas mutaciones se probaron para determinar su utilidad en aplicaciones de limpieza con agua fría con métodos y composiciones detergentes descritos en la presente descripción.
Ejemplo 31 Ensayo de rendimiento de limpieza en una muestra de B I a 16 "C (60F) (Método de prueba 2) El rendimiento de remoción de manchas de las variantes de la proteasa se determinó en detergentes disponibles comercialmente (a menos que se indique de cualquier otra forma). La inactivación por calor de las fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática de cualquier componente de proteína mientras se retienen las propiedades de los componentes no enzimáticos. Así, este método fue adecuado para preparar detergentes comerciales para usar en las pruebas de las variantes de enzimas de la presente invención.
Micromuestras: Se solicitaron y se recibieron micromuestras de 0.64 cm (¼") de diámetro circular de CFT (Vlaardingen, Países Bajos). Se colocaron micromuestras individuales o dos micromuestras verticalmente en cada pocilio de una MTP de 96 pocilios para exponer el área de superficie completa (es decir, no plana en el fondo del pocilio).
Ensayo de micromuestras de BMI Se obtuvieron micromuestras que contenían sangre, leche y tinta (BMI) de 0.64 cm (0.25 pulgadas) de diámetro circular de CFT. Antes de cortar las muestras, la tela (EMPA 16) se lavó con agua. Una micromuestra se colocó verticalmente en cada pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios (de aquí en adelante mencionada como MTP) para exponer el área de superficie completa (es decir, no plana en el fondo del pocilio). La solución detergente deseada se preparó tal como se describe en la presente descripción. Después de equilibrar la Thermomixer a 25 °C se añadieron 190 µ? de solución detergente en cada pocilio de la MTP que contenía micromuestras. En esta mezcla se añadieron 10 µ? de la solución de enzimas diluida para alcanzar una concentración final de enzimas e 1 pg/ml (determinada con el ensayo de TCA). La MTP se selló con cinta y se colocó en el incubador por 30 minutos con agitación a 1400 rpm. Después de la incubación en las condiciones apropiadas se transfirieron 100 µ? de la solución de cada pocilio a una MTP nueva. La MTP nueva que contenía 100 µ? de solución/pocilio se leyó a 405 nm con un lector de MTP SpectraMax. Además, se incluyeron controles de preforma, además de un control que contenía dos micromuestras y detergente, pero no enzima.
Muestra "prelavada" Este tipo de micromuestra se prelavó en agua desionizada por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la etapa de prelavado, las muestras se colocaron sobre toallas de papel para secarlas. Las muestras secadas al aire se perforaron, después, con un troquel circular de 0.64 cm (¼") en una prensa de expulsión. Por último se colocaron dos micromuestras en cada pocilio de una MTP de 96 pocilios verticalmente para exponer el área de superficie completa (es decir, no plana en el fondo del pocilio).
Detergentes Para los detergentes líquidos de gran rendimiento (HDL) para lavandería de América del Norte (NA) y Europa occidental la inactivación por calor se realizó mediante la colocación de detergente líquido pesado previamente (en una botella de vidrio) a baño maría a 95 °C por 2 horas. Todos los detergentes se adquirieron en supermercados locales. Los detergentes no calentados y calentados se probaron dentro de los 5 minutos después de disolver el detergente para determinar en forma precisa el porcentaje inactivado. La actividad de las enzimas se probó por medio del ensayo con AAPF.
Para probar la actividad enzimática en detergentes inactivados por calor se prepararon soluciones de trabajo a partir de las soluciones de reserva inactivadas por calor. Se añadieron cantidades apropiadas de dureza del agua (por ejemplo, 1.59 gramos por litro (6 gpg) para HDL de NA y 3.17 gramos por litro (12 gpg) para HDL de WE) y tampón en las soluciones detergentes para alcanzar las condiciones deseadas tal como se especifica en la Tabla 31-1 más abajo. Las soluciones se mezclaron por agitación en vórtice o mediante inversión de las botellas.
Abreviaturas: Procter & Gamble (P&G); Enzimas y equipos Las muestras de las variantes de proteasas serina de referencia se obtuvieron a partir de caldo de cultivo filtrado de cultivos cultivados en placas de MTP. El equipo usado fue un Biomek FX Robot (Beckman Coulter), un lector de MTP SpectraMAX (tipe 340; Molecular Devices), un incubador/agitador ¡EMS (Thermo/Labsystems); MTP de fondo en F (Costar tipo 9017 usado para leer placas de reacción después de la incubación) y MTP de fondo en V (Greiner 651101 usado para la predilución del sobrenadante). En este ensayo, las proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pigmento y partículas insolubles del sustrato. Asi, el índice de turbidez es una medida de la actividad de la enzima.
El rendimiento de remoción de manchas de las proteasas serina de referencia y variantes de estas en micromuestras se determinó en una escala de MTP en detergente inactivado por calor disponible comercialmente. Los reactivos usados fueron: HEPES 5 m , pH 8.0 o MOPS 5 mM, tampón con pH 7, 3:1 Ca: Mg para una dureza de agua media. (CaC : MgCl2*6H20); 3963 gramos por litro (15,000 granos por galón (gpg)) solución de reserva diluida a 1.59 g/L (6 gpg), 2 muestras de BMI (sangre/leche/tinta) por placa: muestras de algodón con BMI EMPA-116 procesadas por CFT: 2 muestras preenjuagadas y perforadas por pocilio e inactivadas por calor de detergente para agua fría TIDE® 2X no almacenado en anaquel en el cual se confirmó la falta de actividad de proteasa.
Tabla 31-2 Soluciones detergentes de trabajo El incubador se configuró con la temperatura deseada (16 °C o 32 °C). Se añadieron muestras de 10 µ? de la placa de dilución maestra de ~10 ppm en enzimas en las placas de 2 muestras de BMI con 190 µ? de soluciones de detergente de trabajo indicadas anteriormente. El volumen se ajustó para producir la concentración final de 0.5 ppm para variantes en las placas de ensayo. Las placas se transfirieron inmediatamente a incubadores iEMS y se incubaron por 30 minutos con agitación a 1400 rpm a una temperatura determinada. Después de la incubación se transfirieron 100 ? de sobrenadante a una placa nueva de 96 pocilios y se midió la absorbancia en un lector de MTP a 405 nm y/o 600 nm. Además, en la prueba se incluyeron pocilios de control que contenían 1 o 2 micromuestras y detergente sin la adición de muestras de protesa. La medición a 405 nm provee un valor más alto y determina la remoción de pigmentos mientras que la medición a 600 nm determina la turbidez y limpieza.
Cálculo de la actividad de remoción de manchas para todos los métodos de ensayo de micromuestra: El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor de la preforma (sustrato sin enzima) y se obtuvo una medida de la actividad hidrolítica. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de rendimiento. El índice de rendimiento compara el rendimiento de la variante (valor real) y la enzima estándar (valor teórico) con la misma concentración de proteínas. Además, los valores teóricos pueden calcularse con los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. índice de rendimiento El índice de rendimiento compara el rendimiento de la variante (valor real) y la proteasa estándar o de referencia (valor teórico) con la misma concentración de proteínas. Además, los valores teóricos pueden calcularse con los parámetros de la curva de aglutinación (es decir, ecuación de Langmuir) de la proteasa estándar. Un índice de rendimiento (Pl) mayor que 1 (Pl>1) identifica una variante mejorada en comparación con el estándar (p. ej., silvestre), mientras que un Pl de 1 (Pl=1) identifica una variante que tiene el mismo desempeño que el estándar y un Pl menor que 1 (Pl<1) identifica una variante que tiene un desempeño peor que el estándar. Asi, el Pl identifica las mejores opciones, además de las variantes que son menos deseables para usar en ciertas circunstancias.
Ensayo con TCA para determinar el contenido de proteínas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para BPN' (p. ej., proteasa de referencia) y variantes de BPN', este ensayo comenzó con el uso de sobrenadante de cultivo filtrado de placas de microtitulación cultivadas 3-4 días a 33 °C con agitación a 230 rpm y ventilación humidificada. Para el ensayo se usó una placa de microtitulación (MTP) de fondo plano de 96 pocilios nueva. Primero, se colocaron 100 Upocillo de HCI 0.25 N en cada pocilio. Después, se añadieron 50 pl_ de caldo de cultivo filtrado. Se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (se usó el modo de mezclado de 5 s, en el lector de placas) para proveer la lectura de la "preforma". Para la prueba se colocaron 100 pL/pocillo de ácido tricloroacético (TCA) al 15 % (w/v) en las placas y se incubaron por 5 a 30 min a temperatura ambiente. Se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (se usó el modo de mezclado de 5 s en el lector de placas).
El equipo usado fue un aparato Biomek FX Robot (Beckman Coulter) y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices); las MTP eran de Costar (tipo 9017). El equipo usado fue un aparato Biomek FX Robot (Beckman Coulter) y un lector de MTP SpectraMAX tipo 340 (Molecular Devices); y las MTP eran del tipo 9017 (Costar).
Los cálculos se realizaron mediante la resta de la preforma (sin TCA) de la lectura de la prueba con TCA para proveer una medida relativa del contenido de proteínas en las muestras. Si se desea puede crearse una curva estándar mediante la calibración de las lecturas de TCA con ensayos AAPF de clones con factores de conversión conocidos. Sin embargo, los resultados del TCA son lineales con respecto a la concentración de proteína de 50 microgramos a 500 microgramos de proteína por mi (ppm) y, asi, se puede graficar directamente contra el rendimiento de la enzima para el propósito de elegir variantes de rendimiento adecuado. El aumento de la turbidez/dispersión de luz en las muestras coincide con la cantidad total de proteina precipitable en el sobrenadante del cultivo.
Ensayo de AAPF de proteasas en placas de microtitulación de 96 pocilios Para determinar la actividad de proteasa de las proteasas y variantes de estas de la presente invención se midió la hidrólisis de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). Las soluciones reactivas usadas fueron: Tris/HCI 100 mM, pH 8.6 que contenía TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón de dilución Tris); tampón Tris 100 mM, pH 8.6 que contenía CaCI2 10 mM y TWEEN®-80 al 0.005 % (tampón Tris/Ca); y suc-AAPF-pNA 160 mM en DMSO (solución de reserva de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar una solución de trabajo de suc-AAPF-pNA se añadió 1 mi de solución de reserva de suc-AAPF-pNA en 100 mi de tampón Tris/Ca y se mezcló bien por al menos 10 segundos. Para realizar el ensayo se añadieron 10 mi de solución de proteasa diluida en cada pocilio seguido inmediatamente de la adición de 190 µ? de una solución de trabajo de 1 mg/ml de suc-AAPF-pNA. Las soluciones se mezclaron por 5 s y se leyó el cambio en la absorbencia en modo cinético (20 lecturas en 5 minutos) a 410 nm en un lector de MTP a 25 °C. La actividad de proteasa se expresó como AU (actividad = DOD min"1 mi"1).
Ensayo de estabilidad Se determinó la estabilidad de las variantes de la proteasa en presencia de la solución de composición detergente 3 concentrada al 40 % que se muestra en la Tabla 1-3 diluida en agua. Los reactivos usados fueron la composición detergente 3 que se muestra en la Tabla 1-3 diluida al 50 % en agua Milli-Q, MES 10 mM al 0.01 %, tampón de dilución maestro Tween 80 pH 5.8, reactivos de AAPF: ver el protocolo del ensayo con AAPF. El equipo usado fue MTP de fondo en F (Corning 9017) para la dilución de la enzima diluida en detergente y también para las placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices), incubador/agitador ¡EMS (1 mm de amplitud) (Thermo Electron Corporation), cinta selladora: Nunc (236366), receptáculo giratorio (Beckman Fx).
La composición detergente 3 que se muestra en la Tabla 1-3 se diluyó inicialmente al 50 % en agua. Este detergente se mantuvo a temperatura ambiente y se cicló a través del receptáculo giratorio. Los incubadores/agitadores iEMS (Thermo/Labsystems) se configuraron previamente a 43 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que contenían tampón de dilución maestro hasta una concentración de ~ 20 ppm (placa de dilución maestra). Se añadieron 40 pl de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 160 µ? de la composición detergente 3 al 50 % que se muestra en la Tabla 1-3 para producir una concentración de incubación final de 4 ppm. El contenido se mezcló y se mantuvo a temperatura ambiente y se realizaron ensayos con AAPF por triplicado inmediatamente en estas placas y se registraron como lecturas sin estrés. El ensayo con AAPF se modificó de manera que se añadieron 20 pL de muestra de la etapa anterior en 190 pL de solución de trabajo de suc-AAPF-pNA. Las placas se cubrieron inmediatamente con cinta selladora y se colocaron en agitadores iEMS a 43 °C por 30 min a 650 rpm. Después de 30 minutos de incubación se realizaron ensayos con AAPF por triplicado en estas placas de estrés y se registraron como lecturas con estrés. Se determinó la estabilidad de las muestras mediante el cálculo de la relación de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente manera: actividad residual (%) = [mOD.min-1 con estrés]*100 / [mOD. min- sin estrés].
Ensayo de estabilidad con LAS/EDTA La estabilidad de las variantes de la proteasa en presencia de un surfactante aniónico representativo (LAS=alquilbencenosulfonato lineal, dodecilbencenosulfonato de sodio-DOBS) y EDTA disódico se midió después de la incubación en condiciones definidas y la actividad residual se determinó por medio del ensayo con AAPF. Los reactivos usados fueron dodecilbencenosulfonato, sal sódica (DOBS, Sigma núm. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma núm. P-8074), EDTA disódico (Siegfried Handel núm. 164599-02), HEPES (Sigma núm. H-7523), tampón sin estrés: HEPES 50 m (11.9 g/l) + TWEEN®-80 al 0.005 %, pH 8.0, tampón con estrés: HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1 % (w/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0, sobrenadantes del cultivo de la variante de proteasa y proteasa de referencia que contenían 200 -400 pg/ml de proteína. El equipo usado fue MTP de fondo en V o en U como placas de dilución (Greiner 651101 y 650161 respectivamente), MTP de fondo en F (Corning 9017) para tampón sin estrés y tampón de LAS/EDTA y también para las placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices), incubador/agitador ¡EMS (1 mm de amplitud) (Thermo Electron Corporation) y cinta selladora: Nunc (236366).
El incubador/agitador ¡EMS (Thermo/Labsystems) se configuró en 29 °C. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron en placas que contenían tampón sin estrés hasta una concentración de ~ 25 ppm (placa de dilución maestra). Después se añadieron 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón sin estrés para producir una concentración de incubación final de 2.5 ppm. El contenido se mezcló y se mantuvo a temperatura ambiente y se realizó un ensayo con AAPF en esta placa. Además, se añadieron 20 pl de muestra de la placa de dilución maestra en placas que contenían 180 µ? de tampón con estrés (HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1 % (p/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0). Las soluciones se mezclaron y se colocaron inmediatamente en un agitador iEMS a 29 °C por 30 min a 400 rpm. Después de 30 minutos de incubación se realizó un ensayo con AAPF en la placa de estrés. Se determinó la estabilidad de las muestras mediante el cálculo de la relación de la actividad de AAPF residual e inicial de la siguiente manera: actividad residual (%) = [mOD.min-1 con estrés]* 100 / [mOD. min-1 sin estrés].
Datos del rendimiento de las variantes de BPN' Las tablas incluidas más abajo ejemplifican el rendimiento de las variantes de proteasa para agua fría de BPN' de la serie 1 descritas en esta patente tal como se ensayaron por medio del Método de prueba 2.
Tabla 31-3: Rendimiento de proteasas de mutación simple Genoteca parental: BPN' silvestre (enzima de sec. con núm. de ident.:2) Pl de referencia: calculado con respecto a BPN' silvestre para el ensayo de BMI a pH 8 y 16 °C.
Detergentes: Tide 2X Coid comercial inactivado por calor Descripción En este ejemplo se describen los resultados de los experimentos realizados para determinar la expresión de proteínas, la actividad de remoción de manchas, la estabilidad de LAS y la actividad de AAPF (pruebas de las propiedades de interés) de BPN' y variantes de BPN'. Las variantes simples de BPN' se construyeron con fusión por PCR tal como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 2009/46156 presentada el 3 de junio de 2009 incorporada en la presente descripción como referencia. Los resultados se obtuvieron con los métodos descritos en el Método de prueba 2. Tal como se describe en toda la descripción, la funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (Pl) que es la relación de rendimiento de una variante a la proteína parental. La Tabla 32-1 provee valores del índice de rendimiento (Pl) de las variantes de subtilisin de BPN'. Los índices de rendimiento menores o ¡guales a 0.1 se fijaron en 0.1 y se indican en negritas y cursiva en la tabla. Además, para la medida de la estabilidad, si el índice de rendimiento de la actividad en los ensayos de estabilidad era menor o igual a 0.1 , el índice de rendimiento de estabilidad se fijó en 0.1.
Tabla 31-3. Valores del índice de rendimiento para las variantes de BPN' Tabla 31-4 Parental: FNA (sec. con núm. de ¡dent.:2 con mutación Y217L) Medida: Pl vs. FNA para el ensayo de BMI pH8 16C Detergente: tal como se indica en la Tabla 31-1 (como detergente de NA se usó Tide 2X comercial inactivado por calor; para el detergente de WE se usó el detergente liquido para lavandería comercial inactivado por calor Henkel Persil de Europa occidental y como detergente para lavandería de Japón se usó el detergente en polvo para lavandería Tide japonés inactivado por calor).
Generación de variantes combinatorias BPN'-Y217L que implica sustituciones de residuos cargados El plásmido pAC-FNAre en la Figura 9 que contenía el gen BPN'-Y217L se envió a DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) para la generación de variantes combinatorias que contenían sustituciones que implicaban cambios de carga. Además, contenían la cepa de Bacillus subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, AspollE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) para las transformaciones. Las variantes de carga combinatorias de subtilisina BPN'-Y217L se diseñaron mediante la identificación de cuatro residuos de aminoácidos polares distribuidos en los pocilios, con la superficie expuesta y sin carga fuera del sitio activo. Estos residuos son Ser-87, Asn-109, Ser-188 y Ser-248. DNA 2.0 suministró las variantes como materia prima de glicerol.
Los transformantes de B. subtilis que contenían proteínas de la variante de BPN' se replicaron con un replicador de acero de 96 pocilios a partir de materia prima de glicerol en placas de cultivo de 96 pocilios (BD, 353075) que contenían 200 pl de medio LB + 25 pg/ml de cloranfenicol cultivadas de la noche a la mañana a 37 °C y 220 rpm en un recinto humidificado. Se usaron 200 pl del cultivo de la noche para inocular 2000 µ? de medio MBD definido + 25 g/ml de cloranfenicol en tubos de agitación plásticos de 5 mi. Se preparó MBD (un medio definido basado en MOPS)prácticamente como se conoce en la industria (ver, Neidhardt y col., J. Bacteriol., 119: 736-747
[1974]), salvo que se omitió el NH4CI, FeS04 y CaCI2 del medio de base, se usó K2HP04 3 mM y el medio de base se suplemento con urea 60 mM, 75 g/L de glucosa y soytone al 1 %. Los micronutrient.es se formaron con una solución de reserva 100X que en un litro contenía 400 mg de FeS04 7H20, 100 mg de MnS04.H20, 100 mg de ZnS04 7H20, 50 mg de CuCI2 2H20, 100 mg de CoCI2 6H2O, 100 mg de NaMo04 2H20, 100 mg de Na2B407 10H2O, 10 mi de CaCI2 1 M y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. Los tubos de agitación se incubaron a 37 °C, 220 rpm, por 60 horas. Después de 60 horas, el caldo de cultivo se centrifugó en una centrífuga a más de 8000 x RCF. La solución del sobrenadante se decantó en tubos cónicos de polipropileno de 15 mi para el almacenamiento. No se realizó purificación o concentración adicional. Las materias primas del sobrenadante se formularon en propilenglicol al 40 % para la estabilidad a largo plazo.
Descripción Este ejemplo describe las pruebas de las variantes de BPN -Y217L en ensayos de micromuestra de BMI en detergentes que representan mercados de varios lugares geográficos (p. ej., con un pH, T y/o dureza de agua diferentes) en aplicaciones para lavandería, tal como se describió en el Método de prueba 2.
Tabla 31-4: Rendimiento de variantes combinatorias de BPN'-Y217L que implica sustituciones de residuos cargados Tabla 31-5: Rendimiento de lavado de proteasas mutantes dobles seleccionadas Parental: BPN' silvestre (sec. con núm. de ¡dent.: 2) Medida: Pl de al menos 1.3 para el ensayo de BMI pH 8, 16 °C en comparación con tipo silvestre (sec. con núm. de ident.:2) Detergente: Tide 2X Cold comercial inactivado por calor Descripción Los mutantes dobles de BPN' que se muestran en la Tabla 31 -5 más abajo se produjeron en DNA 2.0 (Menlo Park, CA) con BPN' como el gen parental contenido en el plásmido de expresión pHPLT-BPN' partial opt. Además, DNA 2.0 (Menlo Park, CA) creó el plásmido pHPLT-BPN' partial opt con un gen optimizado por codones que codifica la proteasa de BPN' y el plásmido pHPLT-BPN' descrito anteriormente (ver, además, la Figura 3).
La secuencia de ADN del cassette de expresión de pHPLT- BPN' (secuencia líder híbrida de aprE-BPN', prosecuencia de BPN' y secuencia de ADN madura de BPN' de B. amyloliquefaciens) provista más abajo codifica el precursor de la proteína de BPN': GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAA TCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGA AATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGA GCACGATGAGCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGC GGGAAAGTGCAAAAGCAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACA TTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCT TACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACATGCGTACGCGCAGTCCGTGCCT TACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTAC ACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGACTCG AGCCATCCAGATCTTAAAGTCGCTGGAGGGGCTTCTATGGTGCCGTCC GAAACAAACCCGTTTCAAGATAACAATTCTCATGGCACACACGTCGCA GGAACGGTTGCGGCGTTAAACAATTCTATTGGCGTGCTTGGTGTAGCC CCGTCTGCTTCGCTCTACGCCGTTAAAGTTCTTGGCGCAGACGGATCA GGCCAATACTCATGGATTATCAACGGCATCGAATGGGCCATCGCGAAT AACATGGATGTAATCAACATGAGCCTGGGAGGACCAAGCGGCAGTGC GGCACTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCTGTTGCATCTGGTGTCGTCGT AGTAGCGGCAGCTGGGAATGAGGGAACATCCGGATCATCGAGTACCG TCGGTTATCCAGGGAAGTACCCTTCAGTGATTGCAGTGGGCGCTGTAG ACTCTTCAAATCAACGTGCCTCTTTTTCCTCCGTGGGACCGGAGCTGGA TGTCATGGCCCCTGGCGTTTCTATTCAATCGACGCTTCCAGGGAACAA GTATGGTGCGTATAACGGGACTTCCATGGCCTCGCCGCATGTAGCTGG GGCGGCCGCATTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCA AGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTC TACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAG En ta secuencia anterior, el texto en negritas indica el ADN que codifica la proteasa madura, el texto en letra estándar indica la secuencia líder (secuencia líder híbrida del aprE-BPN') y el texto subrayado indica las prosecuencias (???'). La secuencia de aminoácidos de la proteasa de BPN' madura es la SEQ ID NO:2. Mapa plasmidico.
Las proteínas de la variante de BPN" se produjeron, además, tal como se describió anteriormente. La concentración de proteínas de los sobrenadantes de cultivos se determinó por medio de precipitación por TCA tal como se describió en el ensayo de TCA del Método de prueba 2. El rendimiento de remoción de manchas de las variantes se probó en aplicaciones para lavandería en muestras de EMPA 116 (mancha de BMI, CFT) a pH 8/16 °C, pH 7/16 °C y pH 8/32 °C con métodos de ensayo descritos en el Método de prueba 2 con las siguientes modificaciones. El detergente de prueba usado fue detergente TIDE® 2X Cold inactívado por calor (Procter & Gamble). La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteína mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente líquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje inactivado. La funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (Pl) (es decir, la relación de rendimiento de una variante con respecto al BPN' parental). Los resultados se muestran en la Tabla 31-5 - en esta tabla "ND" indica "no determinado". Los datos se muestran para variantes que tienen un Pl de al menos 1.3 para el ensayo de limpieza de BMI pH 8 16 °C.
Tabla 31-6: Rendimiento de lavado de proteasas para agua fría de BPN' de la Serie 1 seleccionadas Parental: BPN' silvestre (sec. con núm. de ¡dent.: 2) Medida: Pl de al menos 1.3 para el ensayo de BMI pH 8 16 °C en comparación con tipo silvestre (sec. con núm. de ident.:2) Detergente: Tide 2X Cold comercial inactivado por calor Descripción Las genotecas de mutación múltiples de BPN' (o genotecas combinatorias) fueron producidas por Geneart o DNA 2.0 con BPN' como la proteína parental. La concentración de proteínas de los sobrenadantes de los cultivos se determinó por medio de precipitación por TCA tal como se describió en el Método de prueba 2. El rendimiento de remoción de manchas de las variantes se probó en aplicaciones para lavandería en muestras de EMPA 116 (mancha de BMI, CFT) a pH 8/16 °C, pH 7/16 °C y pH 8/32 °C con métodos descritos en el Método de prueba 2 con las siguientes modificaciones. El detergente de prueba usado fue detergente TIDE® 2X Cold inactivado por calor (Procter & Gamble) preparado tal como se describió en el Método de prueba 2. La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteína mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente líquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje inactivado. La actividad enzimática se probó por medio del ensayo de AAPF. La funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (Pl) (es decir, la relación de rendimiento de una variante con respecto al BPN' parental). Los resultados se muestran en la Tabla 31-6. Los índices de rendimiento menores o iguales a 0.1 se fijaron en 0.1 y se indican en negritas y cursiva en la tabla. Para cada variante con un índice de rendimiento de proteínas con TCA menor o igual a 0.1 , todos los valores se fijaron en 0.1.
Tabla 31-7: Rendimiento de lavado de variantes proteasas para agua fría de BPN' de la Serie 1 seleccionadas Parental: FNA (sec. con núm. de ¡dent.:2 con mutación Y217L) Medida: Pl vs. FNA para el ensayo de BMI pH 8 16 °C Detergente: Tide 2X Cold comercial inactivado por calor Descripción Las genotecas de saturación en las posiciones 97- 28-217 en BPN' (parental) se obtuvieron de DNA 2.0. La concentración de proteínas de los sobrenadantes de los cultivos se determinó por medio de precipitación por TCA tal como se describió en el Método de prueba 2. El rendimiento de remoción de manchas de las variantes se probó en aplicaciones para lavandería en muestras de EMPA 116 (mancha de BMI, CFT) a pH 8/16 °C con métodos descritos en el Método de prueba 2. La funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (Pl) (es decir, la relación de rendimiento de una variante con respecto a FNA). Los resultados se muestran en la Tabla 31-7.
Tabla 31-8: Rendimiento de lavado de variantes de proteasas para agua fría de BPN' de la Serie 1 seleccionadas Parental: BPN' v3 (sec. con núm. de ¡dent.:4) Medida: Pl vs. la parental anterior con el ensayo de BMI pH 8 16 °C Detergente: Tide 2X Coid comercial inactivado por calor Descripción Se obtuvieron genotecas de mutación múltiple de BPN' adicionales de Geneart o Gene Oracle con BPN': proteína G97A-G128A-Y217Q como la molécula parental. Los resultados de los experimentos realizados para determinar la actividad de remoción de manchas (ensayo de micromuestra para determinar el rendimiento de remoción de manchas en aplicaciones para lavandería con muestras de EMPA 116 (mancha de BMI, CFT Vlaardíngen) (BMI pH 8, BMI pH 7, BMI 32 °C), determinar las proteínas por precipitación con TCA y la estabilidad de LAS/EDTA (pruebas de las propiedades de interés) de variantes de BPN' se muestran en la Tabla 31-8. Los resultados se obtuvieron con los métodos descritos en el Método de prueba 2 con las siguientes modificaciones para el ensayo de rendimiento de remoción de manchas. El detergente de prueba usado fue detergente TIDE® 2X Coid inactivado por calor (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos). La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteína mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente liquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje inactivado. La actividad enzimática se probó por medio del ensayo de AAPF. Tal como se describe en toda la descripción, la funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (PI) que es la relación de rendimiento de una variante a la proteína parental de BPN': G97A-G128A-Y217Q (es decir, enzima de SEQ ID NO:4).
Tabla 31-9: Rendimiento de lavado de variantes proteasas para agua fría de BPN' de la Serie 1 seleccionadas Parental: BPN' v3 (G97A-G128A-Y217Q) Medida: Pl con respecto a BPN' v3 (G97A-G128A-Y217Q) en el ensayo de BMI pH 8 16 °C Detergente: Tide 2X Cold comercial ¡nactivado por calor Descripción Se obtuvieron genotecas de mutación múltiple de BPN' adicionales de Geneart o Gene Oracle con BPN': proteína G97A-G128A-Y217Q como la molécula parental. Los resultados de los experimentos realizados para determinar la actividad de remoción de manchas (ensayo de micromuestra para determinar el rendimiento de remoción de manchas en aplicaciones para lavandería con muestras de EMPA 16 (mancha de BMI, CFT Vlaardingen) (BMI pH 8, BMI pH 7, BMI 32 °C), determinar las proteínas por precipitación con TCA y la estabilidad de LAS/EDTA (pruebas de las propiedades de interés) de variantes de BPN' se muestran en la Tabla 31-9. Los resultados se obtuvieron con los métodos descritos en el Método de prueba 2 con las siguientes modificaciones para el ensayo de rendimiento de remoción de manchas. El detergente de prueba usado fue detergente TIDE® 2X Cold ¡nactivado por calor (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, Estados Unidos). La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteína mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente liquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje ¡nactivado. La actividad enzimática se probó por medio del ensayo de AAPF. Tal como se describe en toda la descripción, la funcionalidad de las variantes de BPN' se cuantificó como un índice de rendimiento (Pl) que es la relación de rendimiento de una variante a la proteína parental de BPN': G97A-G128A-Y217Q (es decir, enzima de SEQ ID NO:4).
Tabla 31-10 Parental FNA (BPN' Y217L) Medida Pl con respecto a FNA (BPN' Y217L) para el ensayo BMI pH 8 16 °C Detergente: Tide 2X comercial ¡nactivado por calor Construcción de genoteca de ISD (Inserción, Substitución, Deleción) Se usó un método basado en PCR para crear una genoteca de polinucleótidos de subtilisina de B. amyloliquefaciens BPN'-Y217L modificada (disponible comercialmente como la subtilisina PRIME PURAFECT®) que contenía inserciones, deleciones y/o sustituciones en el marco en dos regiones de BPN'-Y217L (posiciones 63-77 y 92-132 de la región madura) tal como se muestra en la Figura 10. Este método es prácticamente idéntico al descrito en Pisarchik y col., Prot. Eng. Des. Select., 20:257-265
[2007] con distintas variaciones menores. Primero, usamos la enzima de restricción Eaml para generar extremos cohesivos en nuestros fragmentos de PCR en lugar de Kasl. Además, introdujimos un codón redundante (NDT) a continuación del extremo cohesivo. Por último, colocamos iniciadores mucho más densos y desplazamos cada iniciador siguiente solamente 3 bp corriente abajo hasta alcanzar el extremo de la región objetivo.
Se usaron dos conjuntos de oligonucleótidos que cubren de manera uniforme las regiones objetivo del gen BPN'-Y217L de una proteína de longitud completa de 392 aminoácidos, en la dirección directa e inversa para amplificar los segmentos 5' y 3' de la porción del gen BPN'-Y217L La región codificante de la proteasa madura de BPN'-Y217L contiene los sitios de restricción Kpnl y Xhol para propósitos de clonación: gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtctttta agtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattg\gagaagcaa aaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggct gcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatqagcacgatgaqcqccqct aaqaagaaaqacgtcatttctqaaaaaqgcqggaaaqtqcaaaaqcaattcaaatatqtagacgcagctaqc gctacattaaacqaaaaagctgtaaaaqaattqaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcac qtaqcacacqcqtacgcgcaqtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaaqcccctqctctgcactctc aaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatctt aaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacgg aacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgca tcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcg agtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgcttt aaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaagg cacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtc gacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgt ateta tccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgca cgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctc tctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcg qcagctcagtaaaactcqagataaaaaaccqgccffqqccccqccqqf rffa/ La secuencia de aminoácidos del precursor de proteína de BPN'-Y217L se incluye más abajo. En esta secuencia, las letras en negrita indican la proteasa de BPN'-Y217L madura: mrskklwisllfalaliftmafgstssaqaagksngekkyivgfkqtmstmsaakkkdvisekggkvqkqfky vdaasatlnekavkelkkdpsvayveedhvahayaqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavid sgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvl gadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgwvvaaagnegt sgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngts masphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq.
La secuencia de aminoácidos de la proteasa ded BPN'-Y217L madura se usó como base para preparar las genotecas de variantes que se describen en la presente descripción: aqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnn shgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmsl ggpsgsaalkaavdkavasgwwaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqras fssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslen tttklgdsfyygkglinvqaaaq Cada reacción de amplificación contenia 30 pmol de cada oligonucleótido y 100 ng del ADN molde pAC-FNA10 (ver la Figura 1 1 ). Se realizaron amplificaciones con ADN polimerasa Vent (New England Biolabs). La mezcla de PCR (20 ul) se calentó inicialmente a 95 °C por 2.5 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 15 s, la hibridación a 55 °C por 15 s y la extensión a 72 °C por 40 s. Después de la amplificación los fragmentos de la izquierda y la derecha generados por medio de reacciones de PCR se purificaron con el estuche de purificación con bandas de gel Qiagen (Valencia, CA) y se mezclaron (aproximadamente 200 ng de cada fragmento). Cada mezcla contenia tres fragmentos de la izquierda dirigidos a tres codones adyacentes y tres fragmentos de la derecha dirigidos a los mismos codones. Estas mezclas se trataron por digestión con Eam1 104l, se ligaron con ADN ligasa T4 y se amplificaron por medio de iniciadores flanqueantes (P4299 C GTTGAAG AAG ATCAC GTAGC A y P3246 TTTATTTTATAAACTCATTCCCTGAT) para generar el fragmento de genes de longitud completa. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente, excepto la fase de extensión que se realizó a 72 °C por 2 min. Los fragmentos resultantes se purificaron con el estuche de purificación con banda de gel Qiagen (Valencia, CA), se trataron por digestión con Mlu\ y Xhol y se clonaron en sitios de Mlu\IXho\ en el plásmido de expresión de Bacillus subtilis pHPLT- FNA (ver la Figura 12).
El cásete de expresión de BPN'-Y217L del vector pHPLT (promotor Plat-pre-pro-BPN'-Y217L -terminador) usado tiene la secuencia de polinucleótidos que se muestra más abajo.
GCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGG AATATTTATACAATATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAAAATCGTGA AACAACAAAAACGGCTTTAGTCTAGCAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGA AGCAAAAAATTGTGGATCAGTTTGCTGTTTGCTTTAGCGTTAATCTTTACGA TGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAGGCGGCAGGGAAATCAAACGG GGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGAGCACGATGAGCG CCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGCGGGAAAGTGCAAAAG CAATTCAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGCTGTA AAAGAATTGAAAAAAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTA GCACACGCGTACGCGCAGTCCGTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGC CCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCTACACTGGATCAAATGTTAAAGTAGCGGT TATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATCCTGATTTAAAGGTAGCAGGCGG AGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGACAACAACTCTCA CGGAACTCACGTTGCCGGCACAGTTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGTG TATTAGGCGTTGCGCCAAGCGCATCACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTG CTGACGGTTCCGGCCAATACAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCG ATCGCAAACAATATGGACGTTATTAACATGAGCCTCGGCGGACCTTCTGGT TCTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGATAAAGCCGTTGCATCCGGCGTCGT AGTCGTTGCGGCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCGGCAGCTCAAGCACA GTGGGCTACCCTGGTAAATACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTGTTGA CAGCAGCAACCAAAGAGCATCTTTCTCAAGCGTAGGACCTGAGCTTGATG TCATGGCACCTGGCGTATCTATCCAAAGCACGCTTCCTGGAAACAAATACG GCGCGTTGAACGGTACATCAATGGCATCTCCGCACGTTGCCGGAGCGGC TGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCCGAACTGGACAAACACTCAAGTCCGCAG CAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTGATTCTTTCTACTATGGAAAA GGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAAACTCGAGAGAGGACGG ATTTCCTGAAGGAAATCCG I I I I I I I ATTTTAAGCTTG Las mezclas de ligación se amplificaron con amplificación por círculo rodante en un estuche lllustra Templiphi de conformidad con la recomendación del fabricante (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para generar ADN multimérico para transformación en Bacillus subtilis. Para este propósito se mezcló 1 µ? de la mezcla de ligación con 5 µ? del tampón de muestra, se calentó hasta 95 °C por 3 min y se enfrió sobre hielo. A continuación se añadieron 5 µ? del tampón de reacción y 0.2 µ? de la enzima en cada tubo, seguido de incubación a 30 °C por 10 horas. Se diluyeron los productos de la amplificación por círculo rodante 100 veces y se usaron para transformar células de fí. subtilis (AaprE, AnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Una alícuota de la mezcla de transformación se colocó sobre placas de LB que contenían 1.6 % de leche descremada y 10 ?/?-?? de neomicina y se incubó de la noche a la mañana a 37 °C. Posteriormente, las colonias con halos se inocularon en 120 µ? de medio de LB que contenía 10 pg/mL de neomicina, se cubrieron con tapas de Enzyscreen y se incubaron de la noche a la mañana a 37 °C y 70 % de humedad con agitación vigorosa (250 rpm). A la mañana siguiente los cultivos de la noche se congelaron y más tarde se analizaron en los ensayos de BMI tal como se describe en el Método de prueba 2.
Descripción Los resultados de los experimentos realizados para determinar la actividad de remoción de manchas (ensayo de micromuestra para determinar el rendimiento de remoción de manchas en aplicaciones para lavandería con muestras de EMPA 116 (mancha de BMI, CFT) a pH 8/16 °C y determinar las proteínas por medio de precipitación por TCA (pruebas de las propiedades de interés) de las variantes de BPN -Y217L se muestran en la Tabla 31-10. Los resultados se obtuvieron con los métodos descritos en el Método de prueba 2 con las siguientes modificaciones para el ensayo de rendimiento de remoción de manchas. El detergente de prueba usado fue detergente Tide 2X inactivado por calor (Procter & Gamble). La inactivación por calor de fórmulas detergentes comerciales es útil para destruir la actividad enzimática endógena de cualquier componente de proteína mientras retiene las propiedades de componentes no enzimáticos. La inactivación por calor de los detergentes se realizó mediante la colocación de cantidades pesadas previamente de detergente líquido (en una botella de gas) en un baño de agua a 95 °C por 2 horas. El detergente se adquirió en supermercados locales. Tanto los detergentes no calentados como los calentados se ensayaron dentro de los 5 minutos de disolver el detergente para determinar precisamente el porcentaje inactivado. La actividad enzimática se probó por medio del ensayo de AAPF. Tal como se describe en toda la descripción, la funcionalidad de las variantes de BPN -Y217L se cuantificó como un índice de rendimiento ("Pi" o "Pl") que es la relación entre el rendimiento de una variante y la proteina parental BPN'-Y217L.
Los datos se muestran para las variantes con un Pl de al menos 1.1 con respecto a FNA en ensayos de BMI a 16 °C.
Las dimensiones y los valores descritos en la presente descripción no deben entenderse como estrictamente limitados a los valores numéricos exactos mencionados. En lugar de ello, a menos que se especifique de cualquier otra forma, cada una de esas dimensiones significará tanto el valor mencionado como también un intervalo funcionalmente equivalente que abarca ese valor. Por ejemplo, una dimensión descrita como "40 mm" se refiere a "aproximadamente 40 mm".
Todos los documentos citados en la presente descripción, incluso toda referencia cruzada o solicitud o patente relacionada se incorporan en su totalidad en la presente descripción como referencia a menos que se excluyan o limiten expresamente de cualquier otra forma. La mención de cualquier documento no debe interpretarse como la admisión de que constituye una industria precedente con respeto a cualquier invención descrita o reivindicada en la presente descripción, o que solo, o en cualquier combinación con cualquier otra referencia o referencias, instruye, sugiere o describe tal invención. Además, en la medida que cualquier significado o definición de un término en este documento contradiga cualquier significado o definición del término en un documento incorporado como referencia, el significado o definición asignado al término en este documento deberá regir.
Aunque se han ilustrado y descrito modalidades particulares de la presente invención, será evidente para las personas con experiencia en la industria que se pueden hacer diversos cambios y modificaciones sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, se ha pretendido abarcar en las reivindicaciones anexas todos los cambios y las modificaciones que están dentro del alcance de esta invención.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una proteasa; la proteasa se selecciona del grupo que consiste en: a) una proteasa para agua fría que tiene un índice de rendimiento mayor que 1 , al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1 a 10, de 1 a 8 o aun de 1 a 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:4, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o Método de prueba 3; b) una proteasa para agua fría que tiene un índice de rendimiento de al menos 1, al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1 a 10, de 1 a 8 o aun de 1 a 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:6, tal como se define en el Método de prueba 2 y/o Método de prueba 3; c) una proteasa para agua fría; la proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: (i) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4¡ la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: P210S, P210S-N218A, S063T-S078N-S101A-S183T-T244N, N061A-S078N-S224A, S053G-S078N- P129T-Q185T, S063T-S078N-S101A, S078N-P129T, S063T- S078N-S101A-S183T y S063T-S078N-S101A-T244I; (ü) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-1111 V-M 124 V- Y217Q, G097 A-1 111 V- Y 167 A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101 N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-V203Y-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128S-V203Y-Y217Q, V068A-A092G-Y217Q, N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-I11 1V-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S10 N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 -G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S1 1 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N06 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N- S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 -S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A- Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q y S24G-S53G-S78N-S101 N-G128A-Y217Q; (¡ü) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 %, o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones X24G/R, X53G, X78N, X101 N, X128A/S y X217UQ; la variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A1 16V, G160S, 111 L, II 15V, N109S, N117M, P005G, Q059V, T164S, Y262M, A015Q, A015S, A098E, A098N, A098S, A098T, A098V, A098Y, A1 14S, A114T, A1 16G, A1 16L, A116S, A116T, A116W, A133G, A133H, A133T, A133V, A137G, A137I, A137L, A137S, A137T, A138S, A216E, A216F, A216V, D099S, D181 E, F261A, F261Q, G024F, G024I, G024Q, G024Y, G097S, G160T, G211 L, G211V, H017F, H017W, H039V, H226A, I031V, 1 11 IV, I268V, K170R, K265R, L016Q, L016T, L135M, L209T, L209V, L233M, L257T, L257V, L267A, L267V, N025A, N025I, N025Q, N025R, N025T, N025V, N101 I, N101Q, N101 S, N109A, N109G, N109H, N109L, N109M, N109Q, N109T, N117Q, N184A, N184L, N184T, N184W, N212G, N212L, N212V, N243P, N252G, N252M, P005T, POMS, P040G, P040L, P040Q, P129A, P129S, P172G, P172S, P194Q, P210A, P210S, Q185F, Q185G, Q185I, Q185M, Q185N, Q185S, Q275H, R186K, S009A, S009G, S009H, S009M, S018T, S130T, S132N, S145K, S159T, S161 I, S161 K, S161 N, S161T, S162I, S162M, S162Y, S163G, S182F, S182G, S182V, S182W, S183F, S183L, S183M, S183T, S183V, S183W, S224A, S236T, S249V, T022A, T022G, T022Q, T022V, T208V, T242S, T253N, T253S, T254A, T254S, T255L, T255S, T255V, V004A, V004P, V004W, V084C, V139C, V165M, V203F, Y021 K, Y021 N, Y021T, Y021V, Y167F, Y171 F, Y214F, Y262F. Y262T, A088T-L257G, A1 16T-A128S, N061S-N109G-A128S-N243V-S260P, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, S162G-K256R, A088T-N243V, G024E-A1 16T, K043Y, N076D-A116T, N218S-S248N, S033T-N243V, S033T-S063G, S248N-L257G, A001 E-S249A, A088T-A1 16T, A088T-A128S, A088T-G131 H, A088T-N109G, A088T-S248N, A088T-S249A, A1 16T-N243V, A1 16T-T158S, A128S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V, A128S-S248N, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N218S, G024E-N243V, G024E-S162G, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131 H-K256R, G131 H-S249A, K043Y-A088T, K043Y-A1 16T, K256R, N076D-K256R, N109G, N109G-A116T, N109G-A128S, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-G131 H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G-S248N, N218S-L257G, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-N243V, S033T-A128S, S033T-K256R, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T-S248N, S033T-T158S, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-T158S, S248N-K256R, S249A, T158S-N243V, T158S-S249A, A088T-A1 16T-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V- K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-A153S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A114S-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A1 6T-T 58S-K256R, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-L257G, A088T- N109G-A1 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N, A088T-N109G-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, A1 16T-T158S-S248N-L257G, Y006H-A1 16T-G131 H-S248N, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-N243V, A088T-A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-N243V, A088T-A1 16T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N212D-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A1 16T-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A1 16T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-K256R-L257G, N109G-A116T-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R-L257G, S003P-A116T-T158S-S248N-K256R, T158S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131 H-N243V-K256R, A088T-A116T-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-S248N-L257G, A088T-A1 16T- T158S-N218S, A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A1 16T-T158S-N218S-L257G, A088T-G131 H-N243V-L257G, A088T-G131 H- T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A 16T-G 31 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A1 16T-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R, A088T- 109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-T158S-W241 R-S248N-K256R, A088T-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N243V, A088T-N109G-N243V-K256R, A088T-N109G-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R, A088T-N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-A274D, A088T-N109G-T158S-S248N-L257G, A088T-T158S-K256R, 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16T-T158S-N218S-N243V, A1 16T-T158S-N218S-S248N, A116T-T158S- N243V, A1 6T-T158S-N243V-K256R, A1 6T-T158S-N243V-L257G, A 16T-T158S-N243V-S248N, A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271H, G131H-N218S-N243V-L257G, G131H-N243V, G131H-N243V-S248N-K256R, G131H-T158S, G131H-T158S-N218S-N243V-K256R, G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, G131H-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131H-N218S-S248N-K256R, N109G-A116T-G131H-N243V-K256R, N109G-A1 6T-G131H-N243V-L257G, N109G-A116T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-G13 H-S248N, N109G-A116T-G131 H-S248N-I268V, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131H- T158S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-A116T-N218S, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, N109G-A 16T-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 6T-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-N243V-K256R, N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N243V, N109G-A116T-T158S-Q275R, N109G-G131H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131 H-N218S-K237N, N109G-G131H-N218S- N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S145F-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R, N109G-G131 H-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R, N109G-G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V, N109G-G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S-L257G, N109G-N218S-N243V, N109G-N243V-K256R-L257G, N109G-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-T158S-I268V, N109G-T158S-K256R, N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-T158S-N243V, N 09G-T 58S-N243V-K256R-L257G, N109G-T158S-N243V-S248N, N109S-A1 16T-S248N, N218S, N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-L257G, N243V-K256R, N243V-S248N-K256R, N243V-S248N-K256R-L257G, S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, S248N, T158S-N243V-K256R, T158S-N243V-L257G, S018F-S162L, S018P-D120N, P014T-S037T, S009T-K141 R, S161 P- S162L, N61 P-S63G-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T- N109G-A114S-A1 16T-A128S-N243 V, A88T-N109G-A114S- A1 16T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A128S-S183V, N109M-A128S-S224A, A88T-N109S-A116T-A128S-S224A- N243V, N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109M-A1 16T- A128S-S224A-N243V, S63G-A128S, N109S-A128S-S224A- N243V, A88T-N109G-A1 16T-N243V, N61S-N109G-N243V, N101 Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-K256R, N109G-A116T, A88T-N109G, N61G- N109G-N243V, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V, A88T-N109Q-A1 16T-A 28S-S224A-N243V, N062L-S063N- Q217L, N062S-S063R-Q217E, N062S-S063L-Q217L, S063G, S063G-Q217L, S063N y S063N-Q217L; d) una proteasa para agua fría; la proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: (i) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: E156S-P210S, P210S-N218S, Y104F- E156S-P210I, E156A-P210S-N218S, N218A, N061A-S078N- S087E-S224A, Q059V-S078N-G211A, Q059V-S078N-V147Q, Q059V-S078N, Q059V-S078N-I108V-N252Q, S053G-S078N- P129T, S078N-G21 1A, S078N-Q185T, S078N-V147Q, S078N, S078N-S224A, S078N-S224A-A274D, S078N-I108V-V147Q, N061A-S078N-S224A, S053G-S078N-P129T-Q185T y S078N- P129T; (ii) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-I111V-Y217Q, I111V-G128A- Y217Q, I11 V-M124V-Y167A, I111V-M124V-Y217Q, L096T-G097A-Y217Q, N062Q-G097A-I111 , S053G-N061 P-G097A-S101N-G128S-V203Y-Y217Q, S089Y-M124V-Y217Q, V068A-I111V-Y217Q, G097A-I1 11V-M124V, G097A-L126A-Y217Q, G097A-M124V-Y217Q, I1 11V-Y167A-Y217Q, M 124V- Y 167 A-Y217Q, P052L-V068A-G097A, S089Y-I1 11V- M124V, V068A-A092G-G097A, V068A-A092G-I111V, V068A-G097A-I111V, V068A-S089Y-I111V, Y104N-G128A-Y217Q, G097A-G128A-P210S-Y217Q, G097A-G128S-P210S-Y217Q, G097A-I11 1V-M124I-Y217Q, G097A-I111V-M124V-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-P210S-Y217Q, G097A-N123Q-Y217Q, N061P-G097A-G128A-P210S-Y217Q, N061 P-G097A-G128S-Y217Q, N061 P-G097A-I111V-M124V-Y217Q, N061P-G097A-N123Q-Y217Q, N061 P-G097A-S101N-I111V-M124V-Y217Q, N061P-G097A-S101 -N123Q-Y217Q, N061 P-G102A-P129S-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100N-S101 N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100N-Y217Q, N061 P-N062Q-G097 A-G 100Q-P21 OS-Y217Q, N061P-N062Q-G097 A-1111 V- Y217Q, N061 P-N062Q-G097 A-S101 NIM H V-Y217Q, N061 P-S078N-G097A-I111V- 124I-Y217Q, N061 P-S078N-G102A-I111V-P129S-Y217Q, N062Q-G097A-I111 V-P210S-Y217Q, N062Q-G097A-I111 V-Y217Q, N062Q-S078N-G097A-I111V-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S 101 N-G 128A-P210S-Y217Q , S024G-N025G-S053G-N061 ?-G097A-S101 N-I111V-M124V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 ?-?123Q-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-N062Q-G097A-G100?-S101 ?-?217Q , S024G-N025G-S053G-N061 P-N062Q-G097A-S 101 ?-11 11 V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061P-G097A-G128S-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-M124I-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101 N-I111V-M124V-Y217Q, S053G-N061P-G102A-P129S-P210S-Y217Q, S053G-N061 P-G102A-P129S-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A- G100N-S101 N-Y217Q, S053G-N061 P-N062Q-G097A-S101N-I1 11V-Y217Q, S053G-N061P-S101 N-G102A-P129S-Y217Q, S053G-S078N-G097A- I111V-G128S-Y217Q, S078N-G097A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I11 1V-M124V-Y217Q, N061 P-G097A-M124I-Y217Q, N061 P-G097A-M124V-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100Q-S101 N-Y217Q, N061P-N062Q-G097A-G100Q-Y217Q, N061P-N062Q-G100N-G102A-Y217Q, N061 P-N062Q-S078N-G097A-G100N-I111 V-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-M124I-Y217Q, S053G-N061P-G097A-S101N-N123Q-Y217Q, N025G-S078N-G097A-G128A-Y217Q, N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-I035V-T055P-N061 P-S078N-G097 A- Y217Q, S024G-N025 G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-G097A-G128A-S130G-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-Y217Q, S024G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S038G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N06 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N06 P-G097A-S101 N-G128A, S024G-T055P-N061 P-S078N-S 01 -G128A- Y217Q, S024G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A- Y217Q, S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061P-G097A-A116S-G128A, T055P-N061P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061 P-S078N-S101 N-G128A-Y217Q, N061P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061P-S101N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q y T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N- G128A-Y217Q; (¡ii) una vahante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 % o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones X24G/R, X53G, X78N, X101N, X128A/S y X217L/Q; la variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A001G, A001Y, A013G, A013V, A015F, A015G, A015K, A015M, A015P, A015T, A015W, A015Y, A029G, A073S, A088C, A088I, A088L, A088T, A088V, A098D, A098K, A098P, A098R, A098W, A116D, A116E, A116R, A128S, A133L, A133M, A133S, A134G, A134S, A137N, A137V, A144M, A144Q, A144S, A144T, A144V, A151C, A176S, A176T, A179S, A216G, A216L, A216P, A216Q, A216S, A216T, A216Y, A228T, A230C, A231 C, A272I, A272L, A272Q, A272S, A272T, A272W, A273S, A274G, A274L, A274Q, A274T, A274V, D041 E, D099G, D099N, D120A, D120K, D120Q, D120R, D120S, D140E, D181 S, D259E, E054D, E156D, E156T, E251V, F261G, F261 H, F261 L, F261R, F261S, F261T, F261V, F261W, G007A, G007S, G020A, G020D, G020S, G024N, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G053H, G053K, G053N, G053T, G097A, G097D, G097T, G131A, G131 H, G131P, G131Q, G131T, G131V, G160H, G160P, G166A, G166S, G166T, G21 1A, G211 D, G211 M, G21 1 N, G211P, G211 Q, G21 1 R, G211W, G215A, G215N, G215V, H017L, H017M, H017T, H017V, H017Y, H039A, H039C, H039N, H226F, H226I, H226M, H226S, H226V, H226Y, I035V, I079A, I079S, I079T, I079V, I079W, I108V, I115L, I122A, I234L, I234V, K012R, K027R, K136R, K141 F, K213W, K237R, K256R, K265Q, L016A, L016F, L016I, L016S, L016V, L042I, L075A, L075M, L075Q, L075V, L075Y, L082K, L082M, L082Q, L082V, L090I, L196I, L196V, L209Q, L209W, L233A, L233Q, L233V, L235I, L235K, L250I, L257A, L257H, L257Q, L257S, L257Y, L267Q, L267R, L267S, L267T, 199V, N025F, N025G, N025H, N025K, N025L, N025M, N025S, N025Y, N061 F, N061 H, N061 P, N061S, N061T, N061V, N061W, N076G, N076W, N078S, N078T, N078V, N101A, N101 H, N101L, N101T, N109K, N109R, N117A, N1 17E, N1 17H, N1 17K, N118G, N184G, N184H, N184I, N184S, N184V, N212A, N212F, N212I, N212K, N212P, N212Q, N212S, N212Y, N218A, N218H, N218L, N218S, N240E, N240H, N240L, N240R, N240T, N243A, N243Q, N243T, N243V, N252A, N252K, N252L, N252Q, N252R, N252S, N252T, N269Q, N269S, P014G, P014Q, P014T, P040A, P040H, P040S, P040T, P040V, P040Y, P086A, P086C, P086F, P086H, P086S, P129D, P129G, P129K, P129T, P172A, P172Q, P194A, P194G, P194L, P194M, P194S, P194V, P194Y, P210G, P210R, P210V, Q002A, Q002S, Q010A, Q010F, Q010H, Q010I, Q010L, Q010N, Q010S, Q010T, Q019A, Q019G, Q019N, Q019S, Q019T, Q019V, Q019W, Q059I, Q103L, Q103S, Q185A, Q185H, Q185L, Q185T, Q185Y, Q206P, Q206S, Q206Y, Q217I, Q217N, Q217S, Q217T, Q245K, Q275D, Q275S, Q275W, S003A, S003G, S003H, S003M, S003P, S003Q, S003T, S003V, S009I, S009L, S009P, S009T, S009W, SO 18 A, S018G, SO 181 , S018L, S018M, S018N, S018P, S018V, S018W, S033T, S037Q, S037T, S037V, S038G, S038H, S038K, S038Q, S038T, S063K, S063N, S063Q, S063T, S087A, S087F, S087G, S087Q, S087T, S089L, S089M, S089N, S089Q, S089T, S089W, S130A, S130F, 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V084T, V093I, V121 I, V143N, V143S, V143Y, V147C, V147I, V147L, V147T, V180I, V180L, V180T, V192A, V192S, V192T, V198I, V198L, V198M, V203H, V203I, V203L, V203N, V203Q, V203T, V203W, V203Y, V270A, V270S, V270T, W241 , W241Y, Y006G, Y006H, Y006I, Y006K, Y006L, Y006P, Y006Q, Y006T, Y006V, Y006W, Y021A, Y021 D, Y021 E, Y021L, Y021Q, Y021 R, Y021 S, Y104F, Y104I, Y214L, Y214V, Y214W, Y262A, Y262G, Y262L, Y262N, Y262S, Y262W, Y263G, Y263W, A001 F, A001 K, A001 L, A001M, A001 Q, A001 R, A001 S, AOOIT, AOOIV, A013C, A013S, A015D, A015E, A015L, A015R, A048S, A073N, A073T, A074G, A074S, A085C, A085G, A085S, A085V, A088M, A088S, A092S, A098G, A1 14G, A133P, A137E, A137H, A144G, A144H, A144K, A144L, A144N, A153S, A153V, A176C, A179G, A187G, A187S, A200G, A216W, A223S, A228S, A230T, A230V, A231V, A232C, A232V, A272E, A272G, A272K, A272P, A273G, A273L, A273V, A274M, A274R, D036E, D099A, D099Q, D120E, D181A, D181 G, D259A, D259G, D259Q, D259T, E156A, E156S, E251 I, E251 L, E251Q, E251T, F058Y, 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A088T-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-K256R, A088T-T158S- N218S-N243V-K256R. A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-T158S-N218S-S248N-L257G-Q275K, A088T-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-S248N, A088T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-V147I-N218S-N243V-K256R-L257G, A116T-G131 H-L257G, A116T-G131 H-N218S-N243V, A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, A116T-G 131 H-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G131 H-N218S-S248N, A116T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A1 16T-G13 H-N243V-S248N-K256R, A 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N, A116T-G131 H-T158S-N243V-K256R, A116T-G131H-V139I-N218S-N243V-S248N, A116T-K141 E-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-N218S-N243V-S248N, A116T-N218T- N243V-S248N, A116T-N243V-K256R-L257G, A116T-S248N-K256R, A116T-T158S-N218S-K256R, A116T-T158S-N218S-K256R-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, A116T-T158S-N218S-N243V-S248N, A116T-T158S-N218S-S248N-L257G, G024S-G053S-N078S-G097A-N101S, G053S-A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-G169S-N218S-S248N-K256R-L257G, G131 H-K141R-T158S-N218S-K256R, G131H-K256R, G131H-N218S-K256R-L257G, G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, G131 H-N218S-S248N-K256R, G131H-N243V-S248N, G131 H-N243V-S248N-L257G, G131H-T158S-N218S, G131 H-T158S-N218S-N240H-N243V-S248N-K256R-L257G, G131 ?-?158S-N2 8S-N243V, G131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G-N269S, G131 H-T158S-N243V-L257G, G131H-T158S-N243V-S248N, G131H-T158S-S248N, K256R, ?109G-A116T-G131 ?-?218S-N243V, ? 09G-A116T-G131 ?-?218S-N243V-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-W241 R-N243V-K256R, N109G-A116T-G131 H-S248N-L257G, N109G-?116T-G131 ?-?158S-N218S-K256R, ?109G-A116T-G131 ?-?158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A1 16T-G13 H-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-I234T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-N218S-N243V-S248N, N109G-A116T-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-K237R-N243V-S248N, N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N, N109G-G131 H-S248N, N109G-G131 H-T158S, N109G-G131 H-T158S-L257G, N109G-G131 H- T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, ?109G-G131 ?-?158S-N218S-S248N-K256R, N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-N218S-K256R-L257G, N109G-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-N218S-S248N-L257G, N109G-S248N, N109G-T158S-N218S, N109G-T158S-N218S-N243V, N109G-T158S-N243V-L257G, N218S-N243V-K256R, N218S-N243V-S248N, N218S-S248N, N218S-S248N-K256R, N243V-L257G, S003P-N109G-A1 16T-G131H-N218S-N243V-S248N, S003P-N109G-A116T-G131 H-T158S-?218S-K256R, S105H-W106G-1107L-1108S-N 109A-G 110?-11 11 S-E112?-W113G-A114P, S248N-L257G, T158S-N218S-K256R, T158S-N218S-L233S-S248N, T158S-N218S-L257G, T158S-N218S-N243V-K256R, T158S-N218S-N243V-S248N, T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, T158S-N218S-S248N-L257G, T158S-N243V-S248N-L257G, V004L-A088T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A133V-S260N, N061 S-S260P, P014T-S037T, S009T-K141 F, S009T-K141R, S018F-S162L, S018L-Y021 S, S018P-D120N, S018T-S162P, S018T-Y021N, S018Y-K213R, S161 P-S162L, S161 P-S260P, T253A-S260P, A134T-S260G, I115V-N184Y, ?025?-S037P, Q010L-S037P, Q019L-S260N, Q019L-S260P, S037P-T254S, S161 P-?253?, N061S-S260P, Q010L-S037P, S009T-K141F, S018L-Y021 S, S018T-S162P, S018T-Y021 N, S018Y-K213R, S037P-T254S, S161 P-S260P, S161 P-?253?, T253A-S260P, A133V-S260N, A134T-S260G, I115T-S183T, 11 15V-?184?, N061 D-S260I, Q019L-S260N, Q019L-S260P, S183T-S249R, N61 D-Q206R, Y262N-Q275R, K43R-N76S, K170R-D259G, Y6F-S249C, Q19A- N109S, H17L-Q19A, Q19R-Q185R, S18Y-V203A, S161 E-S260T, S18K-V203I, V4A-T55A, N252S-L257H, S249R-Y262H, N61 L-Q206H, N184Y-Y262N, Q19R-N25D, A74S-P129Q, K27R-D120H, V4A-T55A, Y21 H-N252H, K27R-N269D, A98T-T158A, I79V-Q217H, S9L-N218S, V4A-Y6F, V203A-Q217R, T22S-T242S, N76P-N212S, S37T-S260P, T55A-V147A, V4A-Y6F, Y262N-Q275R, G160R-T244A, N25D-Q185R, G211V-T244A, S9L-N218S, A144H-T244A, Y21H-N252H, A1Y-Q275R, V198L-D259G, K141I-S248N, S183T-R186K, S161E-Q185H, P129S-K136R, K43N-S163T, S37G-Q275H, Y6F-S249C, N62Y-T244A, S260P-Q275R, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N109G-A1 16T-A128S-G131 H-S224A-N243V, S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-S63G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-G169A-S224A-N243V-S249Q, S33T-N61 G-A88T-N 109G-A116T-A128S- N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-N76D-N109G-A128S-N218S-N243V-S248N-K256R, S33T-N61G-N109G-A128S-N218S-N243V, S33T-A128S-N218S, A1 G-N61 P-S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N61 P-S63G-N109Q- A128S-G 131 H-S224A-N243V-S249Q , ?61 P-S63G-N 109Q-A128S-G 31 ?-S224A-N243V, S63G-N109Q-A128S-G131 H-S224A-N243V, N109G-A114S-A128S, N109G-A114S-A128S-S183L-S224A, N109G-A114S- A128S-S224A, N109G-A114S-A128S-S224A-N243V, ?88?- N109G-A1 16T-A128S-S224A-N243V, N61 G-A88T-N109G- A116T-A128S-S224A-N243V, N109G-A1 14S-A128S-N243V, N109G-A128S-S224A-N243V, N109G-A128S-S224A, N109G- A128S-S183L-S224A, N61 G-N109G-A128S-S224A, N109G- A128S-S183L, S33T-N76D, N109S-A128S-S224A, N101Q- N109Q-A128S-P129S-S 130T-S224A-N243V, S63G-N109Q- A128S-S224A-N243V, N109M-A128S-S224A-N243V, S63G- N109G, N109G-K256R, S63G-N76D, S33T-N109G-A128S-G169A-N218S-N243V, S33T-N109G-A128S-N218S-S224A- N243V, N062L, N062L-S063G, N062S-S063G-Q217L, N062S- S063L-Q217L, N062S-S063N, N062S-S063R, S063G, S063G- Q217L, S063G-Q217L-M222S, S063L-Q217L, S063N, S063N- Q217L, D099N-K141Y-K213Q, D099N-K141Y-K256Q, K043T-K141Y-E156Q, N062L-Q217E, N062L-Q217L, N062L-S063G- Q217E, N062L-S063L, N062L-S063N-Q217L, N062S-Q217L, N062S-S063G, N062S-S063L, N062S-S063N-Q217L, N062S- S063R-Q217E, S063G-Q217E, S063N-Q217E, S063R, S063R- Q217E y S063R-Q217L; e) una proteasa; la proteasa se selecciona del grupo que consiste en (i) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 %, o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:4; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A- N252Q, S078N-I108V-V147Q-G211A, S078N-S087E-M124I- S224A, S078N-I108V-V147Q-N252Q, S078N-I108V-V147Q- G211A-N252Q, y Q059V-S078N-I108V-V147Q-G211A- N252Q; (ii) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 %, o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A-M124V-Y167A-Y217Q, V068A-Y167A-Y217Q, G097A-I1 1 1V-M124V-Y167A, I111V-M124V-Y167A-Y217Q, V068A-I11 1V-Y167A-Y217Q, G097A-I11 1V-M124V-Y167A-Y217Q, P052L-V068A-111 1V, G097A-N123A-Y217Q, N061 P-N062Q-G097A-G100D-Y217Q, N061 P-S101 N-G102A-G128S-Y217Q, Y217Q, N061 P-G102A-G128S-Y217Q, N061 P-S101 -G102A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I1 11V-N 123Q-Y217Q, G102A-N123Q-Y217Q, N061 P-G102A-G128S-Y217Q, S078N-G097A-I11 1V-N123Q-Y217Q, y G102A-N123Q-Y217Q; y (iii) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de al menos 60 %, u 80 %, u 85 %, o 90 %, o 95 %, o 96 %, o 97 %, o 98 %, o 99 % o aun 100 % con la SEQ ID NO:2; la variante comprende tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones: X24G/R, X53G, X78N, X101 N, X128A/S y X217UQ; la variante comprende, opcionalmente, al menos un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A001D, A001H, A001 N, A015C, A048C, A048E, A085T, A133R, A137R, A142C, A144D, A144R, A152S, A153G, A187P, A187Q, A187T, A187V, A216R, A230S, A272R, A273H, A273T, A274H, D036N, D036S, D181 H, D181T, D259N, D259P, D259S, E156G, E156H, E156L, E156Q, E156V, E251C, F189S, F189T, F189W, F189Y, F261E, G020C, G024D, G053M, G053R, G097R, G131 D, G131 R, G157N, G160R, G160V, G166L, G166W, G211 E, G215D, G258A, G258D, G258P, 101 IT, 1031 C, I079E, I079R, I175L, I205C, K012H, K012N, K027A, K027N, K027S, K043A, K043D, K043E, K043G, K043L, K043M, K043P, K043V, K043W, K043Y, K136H, K141H, K141 L, K141M, K141 N, K141Q, K141T, K141V, K170G, K170S, K237T, K237V, K256D, K256S, K256T, K256V, K265N, K265S, L042F, L042 , L082E, L209A, L209E, L209G, L209R, L233G, L235V, L257D, L257E, L257P, L257R, L257W, L267E, M050L, N056D, N056S, N061 C, N061 D, N062A, N062H, N062L, N062V, N062Y, N076D, N076L, N076 , N078D, N078F, N101 D, N101R, N118A, N212C, N212E, N218C, N218D, N218E, N252D, N252E, P014F, P014K, P057A, P057W, P172R, P194E, P201T, P210E, Q059C, Q059D, Q059R, Q185E, Q206D, Q217A, Q217K, Q217R, Q245A, Q245D, Q245E, Q245H, Q245R, Q271 E, Q271 F, Q271 R, Q271W, Q275G, Q275IR186I, R186L, R186V, R186W, S003E, S009C, S009E, S018C, S037D, S037E, S037H, S037R, S037Y, S038D, S038P, S038R, S038Y, S063L, S087D, S087R, S089C, S089E, S130C, S130R, S145D, S159C, S159P, S161C, S173T, S182C, S188E, S188F, S188K, S188L, S188R, S188W, S190A, S190G, S190T, S204R, S236D, S236E, S248C, S248E, S260C, S260E, S260R, T022P, T055C, T055W, T071A, T158D, T158E, T158P, T158R, T158Y, T164R, T242D, T242G, T255C, V004E, V004T, V045C, V045D, V045R, V045T, V051H, V081R, V143C, V143E, V143G, V192G, V203C, V203D, V203E, V203M, V203R, V270G, W241 L, Y214H, Y214Q, A001 E, A133E, A187L, A187N, A216C, A216H, A273Q, D099H, D259H, E156C, E195G, F189H, G131 C, G146A, G166V, G215C, G215E, I107L, K012A, K012S, K012T, K043C, K170C, K256C, K256E, K265G, K265Y, L233EM222F, M222S, N062Q, N076E, N078E, N184P, N218R, P005V, P014D, Q002K, Q002L, Q002R, Q010W, Q271C, R186H, S049C, S063C, S063D, S105T, S188C, S190C, S204E, T055R, T164G, V004D, V044T, V045I, V165C, V180S, Y006C, Y006D, Y006E, Y104T, A001C, A187C, A230G, A273D, A273P, D036Q, F189G, F189L, F189R, G157T, G178A, 103 IF, H UM, K012F, K012L, K027T, K043R, K136G, K141G, K170Q, M222A, M222L, N062R, N117G, N269C, P005W, P129V, P239A, P239H, P239T, Q059W, Q217G, Q275A, R186A, S191 G, T164A, T220A, A001 P, A187F, A187W, A273R, D041C, D060G, D197T, F189A, G046D, G157P, K012C, K012E, K012W, L042C, M222T, N062C, P239G, P239N, Q217C, R186M, S049T, S089P, S125A, S173V, V044A, A001 E, A001 E-A128S, A001 E-G024E, A001 E-G131H, A001 E-G169A, A001 E-L257G, A001 E-218S, A001E-Q103H, A001 E-S063G, A001 E-S248N, A001 E-S249A, G024E-N076D, K043Y-N076D, K043Y-Q206D, N076D-A116T, N076D-G169A, N076D-Q206D, Q103H-Q206D, S033T-G169A, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243P, S033T-S063G-Q103H-N109Q-A128S-G131 H-G169A-N243V, A001 E-K043Y, A001 E-N076D, A001 E-N076D-N109G-A128S, A001 E-Q206D, G024E-Q206D, A001 E-A128S-G131 H-N243V, A001E-G131 H-G169A-N243V, A001 E-S033T-N109G-N218S, A116T-G169A, A116T-Q206D, G169A-S249A, K043Y-G169A, N109G-G169A, P040E-N109G-128S-G131 H, Q206D-L257G, S033T-A128S-G 31 H-N243P, S033T-A128S-G131 H-N243V, S033T-P040E-Q103H-N109G, S033T-Q103H-A128S-G131 H, S063G-N109G-A128S-G131 H, S063G-Q206D, T158S-Q206D, A001 E-N076D-N109G-A128S, A015S-A088T-N109G-G131 H-T158S-N218S-S248N, A088T-A098S-G131 H-S248N-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-G131 H-T158S-L257G, A088T-A 1 16T-G 31 H-T 158S-N218S-L257G, A088T-A 116T-G 131 H-T 158S- N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-N218S-L257G, A088T-A116T-T158S-K256R, A088T-A116T-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131H-K256R, A088T-G131 H-N218S-K256R, A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131H-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-G131 H-T158S-S248N- K256R, A088T-G131H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-1107T-N 109G-G 131 H-N218S-S248N-K256R, A088T-N 109G-A116T-G 131 H-D140G-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-G131H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-I268V, A088T-N109G-A116T-G131 H-V149A-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-D140G-N243V, A088T-N109G-G131 H-D140G-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-K141 E-T158S-N218S-K256R, A088T-N 09G-G131 H-N218S-S248N, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-K256R-Q271 R, A088T-N109G-G131 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131H-T158S-K256R, A088T-N109G-G131H-T158S-N218S-S248N-K256R, A088T-N109G-G131 H-V149L-T158S-K256R-L257G, A088T-N109G-T158S-N218S, A088T-N109G-T158S-N218S-K256R-L257G-Q271 K, A088T-N109G-T158S-N218S-L257G, A088T-N109G-T158S-S248N-K256R, A088T-N218S-S248N-L257G-Q27R, A088T- T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-N243V-K256R, A088T-Y104H-A116T-G131 H-N218S-N243V, A1 16T-G131 H-K141 E-N218S-N243V-S248N-L257G, A116T-G131 H-N218S-N243V-S248N-K256R, A116T-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G-N269D, ?116T-G131 ?-?158S-N218S-S248N-Q271R, A116T-G131H-T158S-N243V-S248N, A116T-G157E-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-T158S-N218S, G131 H-N218S-L257G, G131H-N218S-S248N, G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, G131 H-T158S-N218S-S248N-I268V, ?107?-N109G-G131H-N218S-L257G, L090I-N109G-T158S-N243V, L257G, N109G-?116T-G131 ?-?158S-N218S-K256R-L257G-Q271 R, N109G-A116T-N218S-W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-K141E-L257G, N109G-G131H-N218S-N243V, N109G-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-T158S-N218S-S248N-K256R„N109G-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N218S-S248N-K256R-L257G, S003P-N109G-G131 H-T158S-L257G, S003P-S248N-L257G, T158S-S248N-K256R-L257G, V004A-A088T-G131 H-N218S-N243V-S248N-L257G, Y006H-N218S-N243V-S248N, Y104H-N109G-G131 H-Ñ243V-S248N, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-A116T-T158S-N243V, A088T-G131 H-T158S-N218S-I234T-S248N-L257G, A088T-G131H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-G131 H-V149L-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-I107T-N109G-G131H-N218S-A223G-S248N-K256R, A088T-K213N-N243V-S248N-K256R, A088T-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-A232S-N243V-K256R, A088T-N 109G-A116T-G131 H-D140G-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-N218S-N243V- S248N- 256R-L257G, A088T-N109G-A 6T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-A1 16T-G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-M124I-G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-V148A-N218S-N243V, A088T-N109G-G131 H-N218S-N243V-S248N, A088T-N109G-N218S-S248N-T255K-K256R-L257G, A088T-T158S-N218S-L257G, A088T-T158S-N218S-Q245K-S248N-K256R, A088T-T158S-N218S-S248N-K256R, A116T-G13 H-N218S-N243V-K256R, A 16T-G131 H-N218S-W241 R-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-G131 H-T158S-N218S-L257G, A1 16T-G131 H-V150A-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, I107T-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-K141 E-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-T 58S-N218S-N243V-S248N, T158S-N243V-S248N-K256R, T158S-N243V- S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-G146C, A088T-A1 16T-N218S, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A138E-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243F-S248N, A088T-T158S-V203I-N218S-K256R-L257G, A116T-D140G-T158S-N218S-N243V-S248N, A088T-A 16T-T158S-K256R-L257G, A088T-A1 1¾T-T158S-N218S-N243V-S248N-E251 K-K256R-L257G, A088T-1108T-N 109G-G 131 H-T158S-N218S-S248N-K256R-L257G, A088T-N 109G-A116T-G131 H-K141 E-N218S, A088T-N109G-W241 R-S248N-K256R, G065D-A088T-G131 H-N243V-S248N, A045S-S236G, G024A-S037W, I031V-S038W, N061D-S260I, Q010R-S037T, I115T-S183T, N025K-P129K, N025K-P129R, A045S-S236Y, S162L-D181 H, I031V-S038W, N025K-S037P, N025K-P129R, Y21 H-D259G, A133V-D259N, I79V-Q217H, S18K-V203I, T158A-D259P, N61 K- N252K, K43N-Q217R, Q206R-S260P, V198L-D259G, S161 E-S260T, G160A-D259G, A1Y-Q275R, A200T-H226L, Q217R-T244A, S260P-Q275R, T158I-D259N, L75I-N76D, S161 E-Q185H, Y21 H-S37E, S249R-Q275R, N76T-N212D, S260P-Q275L, G131S-K265N, V4A-S249N, N25D-Q185R, K43R-N76S, S183D-Q206R, Q10R-Q275K, K43N-S163T, N25D-V26A, S260P-Q275L, K14TI-S248N, L16Q-Q217H, K27R-N269T, P210S-N212D, N118G-V121A, G215D-D259V, N62Y-G97D, V4E-S260P, K27E-Y91 F, Y6D-T55A, N77D-N252T, N25K-H238R, V44A-Q206H, S37P-S260F, V44A-Q206R, I31 L-S33T-S63G- 109G-A128S-G169A-N218S-N243V, A1 G-131 L-S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N 109G-A116T-A128S-G 131 H-G 169A-S224A-N243V-S249Q , S33T-N61 G-S63G-N109G-A128S-G131 H-G169A-N218S-N243V, S33T-S63G-N 109G-A128S-G 169A-N218S-N243V, S33T-T55P-N61 P-S63G-A88T-N 109G-A116T-A128S-G131 H-S224A-N243V-S249Q, S33T-N76D-A128S-N218S, N76D-N109G-A128S-S224A, D099N, K141Y-E156Q, N062L-S063L- Q217L, N062L-S063N, N062L-S063N-Q217E, N062L-S063R, N062L-S063R-Q217L, N062S-Q217E, N062S-S063G-Q217E, N062S-S063G-Q217R, N062S-S063N-Q217R, S063G-S125A, D060G-Q217L, D120N-K141 Y-K213Q, K043T-D099N-D120N K141Y, K043T-D099N-K141Y-K256Q, K043T-K237A, N062L S063G-Q217R, N062L-S063G-S125A, N062L-S063L-Q217E, N062L-S063N-S125A-Q217L, N062S-Q217R, N062S-S063L- Q217E, N062S-S063R-Q217L, S063G-M222S, S063G-Q217R, K141Y-D197N, N062L-Q217R, N062L-S063G-Q217L-M222S, N062L-S063L-Q217R, N062L-S063N-Q217R, N062S-Q217G, N062S-S063G-Q217G, N062S-S063G-Q217L-M222L, N062S- S063G-S125A-Q217L, N062S-S063N-Q217E, Q217G, S033G- N062S-S063G, S063G-Q217G, S063G-Q217L-M222L, S063G- S125A-Q217R, S063L-Q217R, S063N-M222S, S063N-Q217R, S063N-S125A-Q217L, S063R-Q217R, S063R-S125A-Q217L, D099N-E156Q-K256Q, E156Q, K012T-D099N-K213Q, K012T K256Q, K043T-D099N-K141Y-K213Q, K043T-E156Q, K141Y K213Q, N062L-Q217G, N062L-Q217L-M222L, N062L-Q217L- M222S, N062L-S063G-M222S, N062L-S063G-Q217L-M222L, N062L-S063G-Q217R-M222S, N062L-S063N-Q217L-M222S, N062L-S063N-S125A, N062L-S063R-S125A, N062L-S125A, N062S-S063G-M222S, N062S-S063G-Q217G-M222S, N062S- S063G-S125A, N062S-S063N-Q217L-M222L, N062S-S063N- S125A-Q217L, N062S-S063R-Q217G, N062S-S063R-Q217L- M222S, Q217G-M222S, Q217L-M222S, Q217R, S033G-S063G Q217R, S063G-Q217E-M222S, S063G-S125A-Q217G, S063L- Q217E, S063N-Q217G, S063N-Q217G-M222S, S063N- Q217L-M222S, S063R-Q217L-M222S y S063R-S125A, f) una variante de una proteasa parental; la variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende de tres a seis sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: X024G/R, X053G, X078N, X101 N, X128A/S, y X217L/Q, en donde la variante tiene actividad proteolítica; g) una variante de una proteasa; la variante tiene actividad proteolitica y comprende una secuencia de aminoácidos que comprende de dos a siete alteraciones en las posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones 24, 53, 78, 97, 101 , 128 y 217, en donde cada alteración es, independientemente, (i) una inserción de uno o más residuos aminoacídicos corriente arriba o corriente abajo del residuo aminoacidico que ocupa la posición, (ii) una deleción del residuo aminoacidico que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del residuo aminoacidico que ocupa la posición con un residuo aminoacidico diferente, h) una variante de una proteasa parental, en donde la variante comprende un secuencia de aminoácidos que tiene no más de 15 alteraciones con respecto a la proteasa parental, en donde las alteraciones se seleccionan independientemente de una inserción, una deleción o una sustitución y las alteraciones incluyen una sustitución de glicina en las posiciones 24 y 53, una sustitución de asparagina en las posiciones 78 y 101 , una sustitución de alanina o serina en la posición 128 y una sustitución de glutamina en la posición 217; la proteasa parental tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con la SEQ ID NO:2; y la variante tiene una mayor actividad proteolitica con respecto a la proteasa parental; i) una variante de una proteasa parental; la proteasa parental tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID NO: 2; la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2; la variante comprende una sustitución de glicina en las posiciones 24 y 53, una sustitución de asparagina en las posiciones 78 y 101 , una sustitución de alanina o serina en la posición 128 y una sustitución de glutamina en la posición 217 y la variante tiene una mayor actividad proteolitica con respecto a la proteasa parental; j) mezclas de estas y uno o más ingredientes adicionales; la composición es un producto para el cuidado de las telas y el hogar.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteasa para agua fría tiene un índice de rendimiento mayor que 1 , al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de al menos 1 a 10, de al menos 1 a 8 o aun de al menos 1 a 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:4, tal como se define en el Método de prueba 2 o en el Método de prueba 3, o la proteasa para agua fría tiene un índice de rendimiento de al menos 1 , al menos 1.1 , al menos 1.2, al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2, de 1.0 a 10, de 1.0 a 8 o aun de 1.0 a 5 en BMI a pH 8 y 16 °C (60 °F) cuando se compara con una enzima que tiene la SEQ ID NO:6, tal como se define en el Método de prueba 2 o en el Método de prueba 3, y la proteasa para agua fría se selecciona del grupo que consiste en: a) una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:4; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: P210S, P210S-N218A, S063T-S078N-S 01A-S 83T-T244N, N061A-S078N-S224A, S053G-S078N-P129T-Q185T, S063T-S078N-S101A, S078N-P129T, S063T-S078N-S101A-S183T y S063T-S078N-S101A-T244I; b) una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:2; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: G097A- I11 1 -M124V-Y217Q, G097A-I1 11V-Y167A-Y217Q, S024G-N025G- N061P- G097A-S101N-G128S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N- G128A-V203Y-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N- G128S-V203Y-Y217Q, V068A-A092G-Y217Q, N061P-G097A-S101N-G128A- P210S-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128A-P210S- Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-G097A-S101N-G128S-Y217Q, S024G- N025G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N-I111V-G128S-Y217Q, S024G- N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-G097A- S101N-G128A-Y217Q, N025G-S038G-S053G-N061P-S078N-G097A-S101N- G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061P-S078N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-N061P-S078N-S101N-G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-N061P-S078N-G097A-S 01 -G128A-Y217Q, N025G-S053G-T055P-S078N-G097A-S 01N-G128A-Y217Q, N025G-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-T055P- N061P-S078 -G097A-S101N-G128A-Y217Q, N025G-T055P-N061P-S078N- S101N-G128A-Y217Q, N061P-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-N061P-S078N-S 01N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-G097A-S101 -G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061 P-G 128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-G097A-G 128A-Y217Q, S024G-N025G-T055P-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-N061P-S078N-G097A-S101N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061P-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-N061P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-S053G-T055P-N061 P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A-Y217Q , S024G-S053G-T055P-N061 P-S 101 N-G 128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-G097A-G128A-Y217Q, S053G-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-N061 P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q-S249N, S053G-N061 P-S078N-G097A-G128A-Y217Q, S053G-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S053G-T055P-N061 P-S 101 N-G 128A-Y217Q, S053G-T055P-S078N-G097A-S 101 N-G 128A- Y217Q , T055P-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, T055P-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-N061 P-S078N-G097A-S101 N-G128A-Y217Q, S024G-N025G-S053G-T055P-N061P-G097A-S 01 N-G128A-Y217Q, S024G-T055P-N061 P-S078N-S 10 N-G 128A-Y217Q , T055P-N061 P-S078N-G 128A-Y217Q y S24G-S53G-S78N-S101 -G128A-Y217Q; c) una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO: 6; la variante comprende un grupo de mutaciones seleccionado de los siguientes grupos de mutaciones: A116V, G160S, I111 L, II 15V, N109S, N117M, P005G, Q059V, T164S, Y262M, A015Q, A015S, A098E, A098N, A098S, A098T, A098V, A098Y, A114S, A114T, A116G, A116L, A116S, A116T, A116W, A133G, A133H, A133T, A133V, A137G, A137I, A137L, A137S, A137T, A138S, A216E, A216F, A216V, D099S, D181 E, F261A, F261Q, G024F, G024I, G024Q, G024Y, G097S, G160T, G211 L, G211V, H017F, H017W, H039V, H226A, I031V, I111V, I268V, K170R, K265R, L016Q, L016T, L135 , L209T, L209V, L233M, L257T, L257V, L267A, L267V, N025A, N025I, N025Q, N025R, N025T, N025V, N101 I, N101Q, N101 S, N109A, N109G, N109H, N109L, N109M, N109Q, N109T, N117Q, N184A, N184L, N184T, N 184W, N212G, N212L, N212V, N243P, N252G, N252M, P005T, POMS, P040G, P040L, P040Q, P129A, P129S, P172G, P172S, P194Q, P210A, P210S, Q185F, Q185G, Q185I, Q185M, Q185N, Q185S, Q275H, R186K, S009A, S009G, S009H, S009M, S018T, S130T, S132N, S145K, S159T, S161 I, S161 K, S161 N, S161T, S162I, S162M, S162Y, S163G, S182F, S182G, S182V, S182W, S183F, S183L, S183M, S183T, SI 83V, S183W, S224A, S236T, S249V, T022A, T022G, T022Q, T022V, T208V, T242S, T253N, T253S, T254A, T254S, T255L, T255S, T255V, V004A, V004P, V004W, V084C, V139C, V165M, V203F, Y021 K, Y021 N, Y021T, Y021V, Y167F, Y171 F, Y214F, Y262F, Y262T, A088T-L257G, A116T-A128S, N061 S-N109G-A128S-N243V-S260P, S009T-N109G-A128S-K141 R-N243V, S009T-S018T-Y021 N-N109G-A128S-K141 R, S162G-K256R, A088T-N243V, G024E-A1 16T, K043Y, N076D-A116T, N218S-S248N, S033T-N243V, S033T-S063G, S248N-L257G, A001 E-S249A, A088T-A116T, A088T-A128S, A088T-G131 H, A088T-N109G, A088T-S248N, A088T-S249A, A1 16T-N243V, A1 16T-T158S, A128S, A128S-K256R, A128S-L257G, A128S-N243V, A128S-S248N, A128S-T158S, G024E-A088T, G024E-A128S, G024E-G131 H, G024E-K256R, G024E-L257G, G024E-N218S, G024E-N243V, G024E-S162G, G024E-S249A, G024E-T158S, G131 H, G131 H-K256R, G131H-S249A, K043Y-A088T, K043Y-A1 16T, K256R, N076D-K256R, N109G, N109G-A116T, N109G-A128S, N109G-A128S-N243V-K256R, N109G-A128S-N243V-S248A, N109G-G131 H, N109G-K256R, N109G-L257G, N109G-N218S, N109G-N243V, N109G-S248N, N218S- L257G, N243V, N243V-K256R, N243V-L257G, N243V-S248N, N243V-S249A, Q103H-A128S, Q103H-G131 H, Q103H-K256R, Q103H-L257G, Q103H-N243V, Q103H-S248N, Q103H-S249A, Q103H-T158S, Q206D-N243V, S033T-A128S, S033T-K256R, S033T-N076D, S033T-N218S, S033T-S248N, S033T-T158S, S063G-A128S, S063G-K256R, S063G-N243V, S063G-S162G, S063G-T158S, S248N-K256R, S249A, T158S-N243V, T158S-S249A, A088T-A1 16T-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-N243V-L257G, A088T-T158S-N218S-K256R, A088T-T158S-N218S-N243V-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N 109G-A1 16T-G131 H-A153S-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-S248N-K256R- L257G, A088T-N109G-T158S-L257G, A114S-A1 6T-N218S-N243V-S248N-K256R-L257G, A1 16T-T158S-K256R, A088T-A116T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-A1 16T-T158S, A088T-N109G-A116T-G131 H-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-N243V-L257G, A088T-N109G-N243V-S248N, A088T-N109G-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-T158S-N243V-S248N-L257G, A116T-T158S-S248N-L257G, Y006H-A116T-G131 H-S248N, A088T-A116T-G131H-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-G 31H-T158S-N243V, A088T-A116T-G131H-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A1 16T-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-N243V, A088T-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N243V-S248N-L257G, A088T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-T158S-L257G, A088T-N109G-A1 16T-T 58S-N212D-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-AI 16T-T158S- N218S-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-G131 H-V148A-N218S-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-K256R, A088T-N109G-N243V-S248N-L257G, A088T-N109G-T158S-K256R A088T-N109G-T158S-N243V, A088T-T158S-N243V-K256R-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G-N269S, A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-K256R-L257G, N109G-A1 6T-N243V, N109G-A116T-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131H-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R-L257G, N109G-G131 H-T158S-K256R-L257G, S003P-A116T-T158S-S248N-K256R, T158S-S248N-K256R, A088T-A116T-G131H-N243V-K256R, A088T-A116T-G131H-S248N-K256R-L257G, A088T-A116T-G131 H-V147A-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, A088T-A116T-S248N-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S, A088T-A116T-T158S-N218S-K256R-L257G, A088T-A116T-T158S-N218S-L257G, A088T-G131H-N243V-L257G, A088T-G131 H-T158S-S248N-L257G, A088T-N109G-A116T, A088T- 109G-A1 6T-G131H-N2 8S, A088T-N109G-A1 16T-G13 H-N218S-S248N-L257G, A088T-N109G-A 16T-G131H-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-K256R, A088T-N109G-A116T-N218S-N243V-L257G, A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R, A088T-N109G-A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A088T-N109G- A1 16T-T158S-N243V-L257G, A088T-N109G-G131 H-T158S-N243V-S248N-K256R, A088T-N 09G-G131 H-T158S-W241 R-S248N-K256R, A088T-N109G-K256R-L257G, A088T-N109G-L257G, A088T-N109G-N243V, A088T-N109G-N243V-K256R, A088T-N109G-N243V-K256R-L257G, A088T-N109G-S248N-K256R, A088T- 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A088T-T158S-S248N, A088T-V143A-T158S-K256R, A116T-G131H-K256R, A116T-G131H-N218S, A116T-G131H-N243V, A116T-G131H-N243V-K256R, A116T-G131 H-N243V-L257G, A116T-G131 H-S248N-K256R, A116T-G131 H-T158S-N218S-I234T-N243V-S248N-K256R, A116T-G131H-T158S-N243V-L257G, A116T-G131H-T158S-N243V-S248N-K256R, A116T-G131H-V143F-T158S-N218S, A116T-L257G, A116T-N218S, A116T-N218S-L257G, A116T-N218S-N243V-L257G, A116T-N243V-K256R, A116T-N243V-S248N, A116T-N243V-S248N-K256R-L257G, A116T-S248N, A116T-T158S-N218S-N243V, A116T-T158S-N218S-S248N, A116T-T158S-N243V, A116T-T158S-N243V-K256R, A116T-T158S-N243V-L257G, A116T-T158S-N243V-S248N, A1 6T-T158S-S248N-K256R-L257G, A116T-V149I-T158S-N243V-S248N-K256R-Q271 H, G131H-N218S-N243V-L257G, G131H-N243V, G131H-N243V-S248N-K256R, G131 H-T158S, G131 H-T158S-N218S-N243V-K256R, G131 H-T158S-N243V-K256R-L257G, G131 H-T158S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-K256R-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-L257G, N109G-A116T-G131 H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A1 16T-G131H-N218S-S248N-K256R, N109G-A1 16T-G131 H-N243 V-K256R, N109G-A116T-G131 H-N243V-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A1 16T-G131 H-S248N, N109G-A116T-G131 H-S248N-I268V, N109G-A116T-G131 H-T158S-N218S-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T- G131 H-T158S-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N, N109G-A116T-G131 H-T158S-S248N-K256R, N109G-A116T-N218S, N109G-A1 16T-N218S-N243V-K256R, N109G-A116T-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-N218S-S248N-L257G, N109G-A116T-N243V-K256R, N109G-A1 16T-N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-S248N-L257G, N109G-A1 16T-T158S-G211V-N243V-S248N-K256R, N109G-A116T-T158S-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-L257G, N109G-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N-L257G, N109G-A116T-T158S- N218S-S248N-K256R-L257G, N109G-A116T-T158S-N243V, N109G-A116T- T158S-Q275R, N109G-G131 H-A137V-T158S-N218S-S248N, N109G-G131H- N218S-K237N, N109G-G131H-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131H- N218S-S248N-K256R, N109G-G131 H-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H- S145F-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-G131 H-S248N-K256R, N109G- G131 H-S248N-L257G, N109G-G131H-T158S-K256R, N109G-G131H-T158S- N218S-N243V-K256R, N109G-G131 H-T158S-N243V, N109G-G131H-T158S- N243V-K256R-L257G, N109G-G 31H-T158S-N243V-L257G, N109G-G131 H- T158S-S248N-L257G, N109G-G131 H-T158S-S248N-Q271 R, N109G-N218S- L257G, N109G-N218S-N243V, N109G-N243V-K256R-L257G, N109G- N243V-S248N-K256R-L257G, N109G-T158S-I268V, N109G-T158S-K256R, N109G-T158S-N218S-N243V-K256R-L257G, N109G-T158S-N2 8S-S248N- L257G, N109G-T158S-N243V, N109G-T158S-N243V-K256R-L257G, N109G- T158S-N243V-S248N, N109S-A116T-S248N, N218S, N2 8S-N243V-S248N- K256R-L257G, N218S- S248N-L257G, N243V-K256R, N243V-S248N-K256R, N243V-S248N-K256R-L257G, S105P-A116T-T158S-N218S-N243V-S248N- K256R, S248N, T158S-N243V-K256R, T158S-N243V-L257G, S018F-S162L, S018P-D120N, P014T-S037T, S009T-K141 R, S161 P-S162L, N61P-S63G- N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-N243V, A88T-N109G-A114S-A116T-A128S-S183L-S224A-N243V, N109G-A128S- S183V, N109M-A128S-S224A, A88T-N109S-A116T-A128S-S224A-N243V, N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109M-A116T-A128S-S224A-N243V, S63G-A128S, N109S-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G-A116T-N243V, N61S-N109G-N243V, N101Q-N109Q-A128S-S224A-N243V, A88T-N109G- A116T-T158S-N243V-K256R, N109G-A116T, A88T-N109G, N61G-N109G- N243V, N109G-A128S-P129S-S130T-S224A-N243V, A88T-N109Q-A116T- A128S-S224A-N243V, N062L-S063N-Q217L, N062S-S063R-Q217E, N062S- S063L-Q217L, S063G, S063G-Q217L, S063N y S063N-Q217L
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteasa es una variante de una proteasa parental que tiene la SEQ ID NO:6; la variante comprende uno o más de los siguientes grupos de sustituciones de aminoácidos: A088T+N109G+A1 16T+G131 H+N243V+L257G, S033T+N076D, S009T+N109G+A128S+K141 R+N243V, S162G+K256R, N109G+A1 16T, N109G+L257G, S162G+L257G, N061G+N109G+N243V, N109G+A128S+N243V+S248A, S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R, N 109G+A 116T+N243 V+K256R, A088T+N 109G+A 1 16T+G 131 H+N243 V, A088T+N109G, N109G+N243V, T158S+L257G, N061 S+N109G+N243V, P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R, S009T+S018T+Y021 N+N109G+A128S+K141 R, A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R, A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G, N109G+K256R, N109G+A128S+N243V+K256R, S063G+K256R, S063G+N 109G, S063G+A128S, S063G+N076D, S033T+N076D+A128S+N218S y N076D+N218S.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteasa para agua fría es una variante de una proteasa parental; la proteasa para agua fría comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) incluidos más abajo, en donde al menos una mutación se selecciona del grupo (a): a) 1 , 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 33, 43, 76, 102, 109, 137, 141 , 158, 169, 204, 210, 218, 243, 248, 249, 256, 257, 260, y 269; y b) 24, 25, 40, 52. 53, 55, 58, 59, 61 , 62, 63, 68, 78, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 97, 100, 101 , 103, 104, 106, 111 , 114, 115, 116, 1 17, 118, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 144, 145, 159, 161 , 162, 167, 194, 203, 206, 213, 217, 227, 232, 239, 240, 242, 265, 267, y 275.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la variante de una proteasa parental, dicha proteasa parental teniendo la SEQ ID NO:2, comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) incluidos más abajo, en donde una mutación se selecciona del grupo (a): (a) A1 E T, S9 T, P14L, A15L, L16C, H17T, S18UT, Q19K, G20A, Y21 N T, T22L, G23E, S33T, K43Y, N76D, G102A, N109A/S/G, A137V, K141 R, T158S, G169A, S204E, P210S, N218S, ?243?? , S248N/A, S249A, K256R, L257G, S260P, y N269D; y (b) S24G/R/E, N25G, P40A/E, P52L, S53G, T55P, F58G, Q59S, N61 E/P/G/S, N62Q/R/S, S63G/H, V68A, S78N, P86S, S87D/G, ?88?? , S89Y, A92G, L96T, G97A, GI OON/??", S101 N, Q103E/H, Y104N, W106F, 1 11 IV, A114G, II 15V, ?1 16??", N1 17S, N1 18G, N123A/G/Q/V, ?124??/, S125A, L126A, G128A/S, P129E/Q/S/V, S130G, G131S/H, S132N, A133V, A134T, A144K, S145D, S159K, S161 P, S162G/K, Y167A, P194L, V203Y, Q206D/E, K213L, Y217Q/L/D, V227T, A232T, P239RA , N240K, T242R, K265N, L267V, y Q275E.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la variante de una proteasa parental tiene una carga neta total de -1 , 0 o +1 con respecto a la BPN' tipo silvestre.
7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha composición comprende un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en: un surfactante, un aditivo, un agente quelante, un agente inhibidor de transferencia de tinte, un dispersante, una o más enzimas adicionales, un estabilizante de enzimas, un material catalítico, un activador blanqueador, un peróxido de hidrógeno, una fuente de peróxido de hidrógeno, un perácido preformado, un agente polimérico dispersante, un agente de remoción/antiredepósito de suciedad de arcilla, un abrillantador, un supresor de espuma, un tinte, un perfume, un sistema de suministro de perfume, un agente elastizante de estructuras, un suavizante de tela, un portador, un hidrótropo, un auxiliar de procesamiento, un solvente, un pigmento y mezclas de estos.
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha composición comprende una segunda proteasa no equivalente inmunológicamente que es una proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62); la proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) es una variante de proteasa GG36 para agua fría.
9. Una composición que comprende una proteasa para agua fría y un material seleccionado del grupo que consiste en: un encapsulado que comprende un perfume, una variante de proteasa GG36, un agente tonalizador, un polímero limpiador anfifílico y mezclas de estos; la composición es un producto para el cuidado de las telas y el hogar, preferentemente, la proteasa para agua fría es una variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 (subtilisina BPN'); la variante comprende uno o más de los siguientes conjuntos de mutaciones, inserciones o deleciones: S182E, N109I, N109D-Y217L- S248R, N109D-S188R-Y217L, S87D-Y217L-S248R, S87R-N109D-Y217L-S248R, S87R-N109D-S188D-Y217L-S248R, G128A-Y217Q, 11 11V-M 124V, M124V-Y217Q, N62Q-G97A, S89Y-M124V, V68A, V68A-A92G, V68A-G97A, V68A-I111V, V68A-S89Y, V68A-V227T, V68A-Y217Q, W106F-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q, G97A-L126A-Y217Q, G97A- 124V-L126A-Y217Q, G97A-N 23G-Y217Q, L96T-G97A-Y217Q, M124V-L126A-Y217Q, N62Q-G128A-Y217Q, N62Q-G97A-Y217Q, G97N-G128A-Y217M, G97G-G128S-Y217E, G97A-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217E, G97A-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q, G97M-G128G-Y217M, G97G-G128S-Y217Q, G97S-G 28S-Y217Q, G97G-G 28A-Y217Q, G97S-G128A-Y217E, G97A-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217N, G97Q-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217M, G97A-G128A-Y217S, G97D-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217Q, G97Q-G128G-Y217D-S87Y, G97S-G128A-Y217N, G97A-G128S-Y217T, G97D-G128S-Y217E, G97D-G128A-Y217L, G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T, G97T-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y217I, G97Q-G128S-Y217Q, G97G-G128A-Y217D, G97Q-G128A-Y217N, G97S-G128A-Y217M, G97S-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217M, G97E-G128S-Y217M, G97S-G128P-Y217Q, G97T-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q-A73T, G97E-G128S-Y217N, G97G-G128A-Y217I, G97Q-G128A-Y217D, G97Q-G128S-Y217M, G97R-G128T-Y217Q-S162P, G97S-G128S-Y217D, G97T-G128P-Y217I, G97Q-G128G-Y217E, G97C-G128G-Y217N, G97D-G128S-Y217H, G97M-G128S-Y217L, G97M-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217E, G97M-G128S-Y217I, G97A-G128P-Y217A, G97R-G128S-Y217D, G97A-G128A-Y217Q-S145D, G97A-G128A-Y217Q-P239R, G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S162K-K213L-N240K, G97A-G128A-Y217Q-N61E, G97A-G128A- Y217Q-P40E-A144K-K213L, G97A-G128A-Y217Q-P129E, G97A-G128A-Y217Q-N61E-P129E-S159K, G97A-G128A-Y217Q-K213L, G97A-G128A-Y217Q-S87D, G97A-G128A-Y217Q-Q206E, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P40E-S145D-S159K-K213L, G97A-G128A-Y217Q-K265N, G97A-G128A-Y217Q-S24R, G97A-G128A-Y217Q-P40E, G97A-G128A-Y217Q-Q275E, G97A-G128A-Y217Q-P129E-S145D-N240K, G97A-G128A-Y217Q-A144K, G97A-G128A-Y217Q-S159K, G97A-G128A-Y217Q-S162K, G97A-G128A-Y217Q-N240K, G97A-G128A-Y217Q-S53G, G97A-G128A-Y217Q-S78N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-I111V, G97A-G128A-Y217Q-S53G-N1 17S, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S132N, G97A-G128A-Y217Q-Y104N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-I111V, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N- N117S, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S53G-Y104N-S132N, G97A-G128A-Y217Q-S78N-Y104N-S132N, Y217L-V068C-A069G, Y217L-I079F-A098G, Y217L-P086T-S101 D-Q103S-V147I, Y217L-A088T-P129S-G146D, Y217L-V093I-G128D-P129R, 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P-N62S-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-P129Q-S 130G-G 131 S-Y217Q , L75S-N76Y-G97A-G 128A-Y217Q , G97A-G 128A-V203Y-Y217Q, T55P-G97A-G128A-Y217Q, A88V-L90I-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-G211 R-N212S-K213V-Y217Q, G23A-S24G-N25G-G97A-G128A-Y217Q, T22N-S24A-G97A-G128A-Y217Q, S24R-G97A-G128A-Y217Q, G97A-A98S-G128A-Y217Q, G97A-G128A-T158G-S159G-Y217Q, Q59E-N61P-G97A-G128A-Y217Q, G97A-A98E-G128A-Y217Q, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116?-?1 7S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S63T-P86S-S87G-A88V, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-N61P-N62S-P194L-A232T, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-?133V-L267V, G97A-G 128?-?217Q-A134T-L267V, G97A-G 28?-?217Q-S24R-P40E-P129E-S159K-K265R, G97A-G128A-Y217Q-A134T-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P129E, G97A-G128A-Y217Q-I111V-S161 P, G97A-G128A-Y217Q-T55P-P129Q, G97A-G128A-Y217Q-I 15V-L267V, G97A-G128A-Y217Q-P86S-S87G-A88V-A116S-N117G-N118R, G97A-G128A-Y217Q- V203Y-L267V, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-S78N-S101 -V203Y, G97A-G128A-Y217Q- 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P-N62Q-G100N-A128G, G97A-G128A-Y217Q-S24R-S78N-S182P-L267V, G97A-G128A-Y217Q-P239R-A273S, G97A-G128A-Y217Q-S53G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-P129Q-S130G-G131S-T242R, G97A-G128A-Y217Q-S3F-S87T-A88L-S89G-G211T, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-L75H-N76G, G97A-G128A-Y217Q-S53G-T55P-N61 P-S78N-S87T-A88L-S89G, G97A-G128A-Y217Q-S87T- A88L-S89G-A144K, G97A-G128A-Y217Q-S78N-S87T-A88L-S89G-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-Q59S-N61 ?-A1 16N-N117S-N118G, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-I111V, G97A-G128?-?217Q-S24R-S145D-P239R-Q275E, G97A-G 128?-?2 7Q-S 145D-A273S, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-K141E-T242R, G97A-G128A-Y217Q-S87T-A88L-S89G-S 101 N-V203Y, G97A-G 128?-?217Q-A116?-? 117S-N 118G-P129Q-S130G-G131S, G97A-G128A-Y217Q-S89Y-G211T, G97A-G128A-?217Q-S87G-A88V-S89A-A116?-? 117S-N 118G-A144?, G97A-G128?-?217Q-S24G-N25G-S78N-S87T-A88L-S89G-S101 N-V203Y, G97A-G128A-Y217Q-S24G-N25G-P129V, G97A-Y217Q-N61 P-A128G-P129S-S130P, G97A-G128A-?217Q-T55P-N61 P-S87T-A88L-S89G-G110C-S130?, G97A-Y2 7Q-N 123G-A128G, G97A-G128A-Y217Q-N61P-N62Q-G100N-G102A-M124I, S78N-G97A-G128A-Y217Q, G97A-S101N-G128A-Y217Q, G97A-G128A-A137V-Y217Q, N61P-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G128A-S130P-Y217Q, G97A-Q103N-G128A-Y217Q, S63T-G97A-G128A-Y217Q, G97A-G102A-G128A-Y217Q, G97A-N109D-G128A-Y217Q-S248R, S87R-G97A-G128A-Y217Q, G97A- G128A-S188D-Y217Q, S87D-G97A-G128A-Y217Q-S248R, G97A-G128A-S188D-S248R-Y217Q, G97A-G128A-S248D-Y217Q, S78N-G97A-G128A-Y217Q-L267V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-S161 P, S78N-G97A-G128A-Y217Q-1115V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-A273S, S78N-G97A-G128A-Y217Q-G211T, S78N-G97A-G128A-Y217Q, S78N-G97A-G128A-Y217Q-I111V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-V147L, S78N-G97A-G128A-Y217Q-I108V, S78N-G97A-G128A-Y217Q-S89Y, S78N-G97A-G128A-Y217Q-A 38T, G97A-G128A-Y217Q-A134T-K213L, G97A-G128A-Y217Q-G23A-S24G-N25G-P129V, G97A-G128A-Y217Q-S24R-P239R, G97A-G128A-Y217Q-S24R-S87T-A88L-S89G.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 comprende tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones dentro del grupo de posiciones que comprende las posiciones 24, 25, 40, 52. 53, 55, 58, 59, 61 , 62, 63, 68, 78, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 97, 100, 101 , 103, 104, 106, 111 , 1 14, 115, 116, 117, 1 18, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 144, 145, 159, 161 , 162, 167, 194, 203, 206, 213, 217, 227, 232, 239, 240, 242, 265, 267, y 275.
1 1. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO:2 comprende un total de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 mutaciones seleccionadas de los grupos (a) y (b) incluidos más abajo: (a) mutaciones cargadas seleccionadas del grupo que consiste en: N61 E, A144K, P129E, P239R, P40E, Q103E, Q206E, Q275E, S145D, S159K, S162K, S24R, S63H, S87D y T242R; y (b) mutaciones neutras seleccionadas del grupo que consiste en: A114G, A116N, A133V, A134T, A232T, A88V, A92G, F58G, G100T, G128A, G131S, G97A, 111 IV, I115V, K213L, K265N, L126A, L267V, L96T, 124V, N117S, N118G, N123G, N240K, N25G, N61 P, N62Q, N62R, N62S, P129Q, P129V, P194L, P239V, P52L, P86S, Q59S, S101 N, S125A, S130G, S132N, S161 P, S24G, S53G, S78N, S87G, S89Y, T55P, V203Y, V227T, V68A, W106F, Y104N, Y167A, y Y217Q.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la variante de la proteasa que tiene la SEQ ID NO: 2 comprende una o más mutaciones y tiene una carga neta total de -1 , 0 o +1 con respecto a la BPN" silvestre.
13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, caracterizada además porque dicha composición comprende un ingrediente adicional seleccionado del grupo que consiste en: surfactante, un aditivo, un agente quelante, un agente inhibidor de transferencia de tinte, un dispersante, una o más enzimas adicionales, un estabilizador de enzimas, un material catalítico, un activador blanqueador, un peróxido de hidrógeno, una fuente de peróxido de hidrógeno, un perácido preformado, un agente polimérico dispersante, un agente de remoción/antirredepósito de suciedad de arcilla, un abrillantador, un supresor de espuma, un tinte, un perfume, un sistema de suministro de perfume, un agente elastizante de estructuras, un suavizante de telas, un portador, un hidrótropo, un auxiliar de procesamiento, un solvente, un pigmento y mezclas de estos, preferentemente, la enzima adicional se selecciona del grupo que consiste en hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, celobiosa deshidrogenasas, xiloglucanasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, mananasas, pectato liasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, liquenasas glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, amilasas o mezclas de estas.
14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, caracterizada además porque dicha composición comprende una tercera proteasa no equivalente inmunológicamente que es una proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62); la proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) es una variante de proteasa GG36 para agua fría.
15. Un método para tratar y/o limpiar una superficie o tela; que comprende las etapas opcionales de lavar y/o enjuagar la superficie o tela, poner la superficie o tela en contacto con una composición de acuerdo con cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones 1-14, después, opcionalmente, lavar y/o enjuagar la superficie o tela.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090060933A1 (en) * 2004-06-14 2009-03-05 Estell David A Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
BRPI0915681A2 (pt) * 2008-06-06 2015-08-04 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo proteases microbianas variantes
AR073420A1 (es) * 2008-11-11 2010-11-03 Danisco Us Inc Variantes de serina proteasas, composiciones y metodos de limpieza que las comprenden
CN102209775A (zh) 2008-11-11 2011-10-05 丹尼斯科美国公司 包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶
CN102652175B (zh) 2009-12-09 2016-02-10 宝洁公司 织物和家居护理产品
ES2746931T3 (es) 2009-12-09 2020-03-09 Danisco Us Inc Composiciones y métodos comprendiendo variantes de proteasa
EP2363455A1 (en) 2010-03-01 2011-09-07 The Procter & Gamble Company Composition comprising co-bleach particle and amylase
JP6018044B2 (ja) * 2010-04-15 2016-11-02 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法
ES2745011T3 (es) * 2010-05-06 2020-02-27 Procter & Gamble Productos de consumo con variantes de proteasa
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
US9388370B2 (en) * 2010-06-21 2016-07-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains
US10988714B2 (en) 2010-06-21 2021-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating
BR112013028440A2 (pt) * 2011-05-05 2016-11-29 Procter & Gamble composições e métodos que compreendem variantes de serina protease
ES2707869T3 (es) * 2011-05-05 2019-04-05 Danisco Us Inc Composiciones y métodos comprendiendo variantes de serina proteasa
EP2551335A1 (en) 2011-07-25 2013-01-30 The Procter & Gamble Company Enzyme stabilized liquid detergent composition
DE102011118021A1 (de) * 2011-10-28 2013-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Leistungsverbesserte und temperaturstabile Proteasevarianten
US20130123162A1 (en) * 2011-11-10 2013-05-16 The Procter & Gamble Company Consumer products
US20140342433A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 Novozymes A/S Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same
MX2014007446A (es) * 2011-12-20 2014-08-01 Novozymes As Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican.
EP2607468A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-26 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising subtilase variants
EP2628785B1 (en) * 2012-02-17 2016-05-18 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising subtilase variants
WO2013142486A1 (en) * 2012-03-19 2013-09-26 The Procter & Gamble Company Laundry care compositions containing dyes
MX349739B (es) * 2012-03-20 2017-08-10 Firmenich & Cie Compuestos para una liberacion controlada de moleculas perfumantes activas.
DE102013207933A1 (de) 2013-04-30 2014-10-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014204596A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from bacillaceae family member
EP3013956B1 (en) * 2013-06-27 2023-03-01 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3060659B1 (en) 2013-10-03 2019-05-29 Danisco US Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
EP3052622B1 (en) 2013-10-03 2018-09-19 Danisco US Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
JP6560214B2 (ja) 2013-11-20 2019-08-14 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ開裂に対する感受性を低減した変異体α−アミラーゼ、及びその使用方法
EP3097174A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
EP3097173B1 (en) 2014-01-22 2020-12-23 The Procter and Gamble Company Fabric treatment composition
WO2015112341A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 The Procter & Gamble Company Fabric treatment composition
WO2015112338A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
WO2015138579A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 The Procter & Gamble Company Detergent composition
WO2016069544A1 (en) * 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
BR112017010239A2 (pt) 2014-11-17 2018-01-02 Procter & Gamble composições para liberação de agente de benefício
US10260024B2 (en) 2014-12-04 2019-04-16 Novozymes A/S Liquid cleaning compositions comprising protease variants
US10760036B2 (en) * 2014-12-15 2020-09-01 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
US20170369818A1 (en) 2014-12-23 2017-12-28 Lubrizol Advanced Materials, Inc. Laundry detergent compositions stabilized with an amphiphilic rheology modifier crosslinked with an amphiphilic crosslinker
WO2016106167A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Lubrizol Advanced Materials, Inc. Laundry detergent compositions
CN107438657B (zh) 2015-03-30 2020-04-21 宝洁公司 自由流动的固体颗粒状衣物洗涤剂组合物
WO2016160867A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Procter & Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3075823A1 (en) 2015-03-30 2016-10-05 The Procter and Gamble Company A spray-dried laundry detergent base particle
WO2016160869A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Procter & Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3075826B1 (en) 2015-03-30 2018-01-31 The Procter and Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
WO2016160868A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Procter & Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3075828B1 (en) 2015-03-30 2018-02-07 The Procter and Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3075824B1 (en) 2015-03-30 2018-02-21 The Procter and Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3075831A1 (en) 2015-03-30 2016-10-05 The Procter and Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
WO2016161219A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 The Procter & Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
CN107429197B (zh) 2015-04-02 2020-04-21 宝洁公司 自由流动的固体颗粒状衣物洗涤剂组合物
EP3075834B1 (en) 2015-04-02 2018-02-07 The Procter and Gamble Company Solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP3088504B1 (en) 2015-04-29 2021-07-21 The Procter & Gamble Company Method of treating a fabric
PL3088503T3 (pl) 2015-04-29 2018-10-31 The Procter & Gamble Company Sposób prania tkanin
EP3088505B1 (en) 2015-04-29 2020-06-03 The Procter and Gamble Company Method of treating a fabric
PL3088502T3 (pl) 2015-04-29 2018-10-31 The Procter & Gamble Company Sposób obróbki tkaniny
EP3088506B1 (en) 2015-04-29 2018-05-23 The Procter and Gamble Company Detergent composition
US10632443B2 (en) * 2015-06-30 2020-04-28 Firmenich Sa Delivery system with improved deposition
EP3153425B1 (en) 2015-10-06 2018-07-04 The Procter and Gamble Company Flexible box bag comprising detergent powder and a scoop
WO2017062561A1 (en) 2015-10-06 2017-04-13 The Procter & Gamble Company Flexible box bag comprising soluble unit dose detergent pouch
WO2017089093A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Unilever N.V. A liquid detergent composition
MX2018006475A (es) 2015-11-26 2018-09-28 Procter & Gamble Composiciones detergentes liquidas que comprenden proteasa y lipasa encapsulada.
DE102016204815A1 (de) 2016-03-23 2017-09-28 Henkel Ag & Co. Kgaa Proteasen mit verbesserte Enzymstabilität in Waschmittel
CA3018866C (en) 2016-03-31 2024-03-26 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
US10806769B2 (en) 2016-03-31 2020-10-20 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating cleansing composition
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
BR112018072530A2 (pt) * 2016-05-03 2019-03-26 Danisco Us Inc variantes de protease e usos das mesmas
MX2018013710A (es) 2016-05-09 2019-05-02 Procter & Gamble Composicion detergente que comprende una enzima transformadora de acido oleico.
ES2746120T3 (es) 2016-05-09 2020-03-04 Procter & Gamble Composición detergente que comprende una descarboxilasa de ácidos grasos
WO2017196794A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 The Procter & Gamble Company Detergent composition comprising an fatty acid-transforming enzyme
US10494592B2 (en) * 2016-05-20 2019-12-03 The Procter & Gamble Company Detergent composition comprising anionic/nonionic/cationic surfactant system and encapsulates
US10457900B2 (en) * 2016-05-20 2019-10-29 The Proctor & Gamble Company Detergent composition comprising an alkyl ether sulfate-rich surfactant system and coated encapsulates
DE102016210628A1 (de) 2016-06-15 2017-12-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Bacillus gibsonii Protease und Varianten davon
CN106120024A (zh) * 2016-06-27 2016-11-16 苏州宇希新材料科技有限公司 一种石墨烯纤维的制备方法
CN105887244B (zh) * 2016-06-27 2018-02-27 苏州宇希新材料科技有限公司 一种石墨烯纤维
CN106120333A (zh) * 2016-06-27 2016-11-16 苏州宇希新材料科技有限公司 一种石墨烯/亚麻复合纤维的制备方法
ES2753724T3 (es) 2016-07-14 2020-04-14 Procter & Gamble Composición detergente
HUE046263T2 (hu) 2016-10-03 2020-02-28 Procter & Gamble Egy porlasztva szárított mosószerrészecske gyártására szolgáló eljárás
WO2018067488A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 The Procter & Gamble Company Low ph laundry detergent composition
EP3301168B1 (en) 2016-10-03 2019-09-11 The Procter and Gamble Company Laundry detergent composition
WO2018067486A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 The Procter & Gamble Company Low ph laundry detergent composition
WO2018067487A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 The Procter & Gamble Company Low ph laundry detergent composition
CN109790487A (zh) 2016-10-03 2019-05-21 宝洁公司 衣物洗涤剂组合物
MX2019003839A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Procter & Gamble Composición detergente para lavandería.
ES2770626T3 (es) 2016-10-03 2020-07-02 Procter & Gamble Composición detergente para lavado de ropa con ph bajo
US20180094222A1 (en) 2016-10-03 2018-04-05 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3535374B1 (en) * 2016-11-01 2020-09-30 The Procter and Gamble Company Leuco polymers as bluing agents in laundry care compositions
EP3544575A1 (en) 2016-11-23 2019-10-02 GOJO Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
DK3330349T3 (da) 2016-12-02 2024-07-15 Procter & Gamble Rengøringssammensætninger, der indbefatter enzymer
CA3044415C (en) 2016-12-02 2022-06-07 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
US10550443B2 (en) 2016-12-02 2020-02-04 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
WO2018118917A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
WO2018118825A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339415A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339419A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339413A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339414A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339417A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339416A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339420A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339418A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3339407A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
WO2018126467A1 (zh) * 2017-01-09 2018-07-12 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶2
WO2018204812A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Lubrizol Advanced Materials, Inc. Dual activated microgel
CA3068144A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Flemming Skou Membrane cleaning solution and method of accelerated membrane cleaning using the same
WO2019191172A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 The Procter & Gamble Company Process for preparing a spray-dried laundry detergent particle
EP3546555A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 The Procter & Gamble Company Process for preparing a spray-dried laundry detergent particle
EP3546558A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3546559A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
WO2019191171A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 The Procter & Gamble Company Laundry detergent composition
EP3546557B1 (en) 2018-03-28 2020-10-07 The Procter & Gamble Company Catalase inhibition during a laundering process
EP3546554A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 The Procter & Gamble Company Spray-drying process
CA3102261C (en) 2018-06-20 2023-10-03 The Procter & Gamble Company A fabric care or home care product comprising polysaccharide derivatives
EP3594319B1 (en) 2018-07-12 2021-05-05 The Procter & Gamble Company A solid free-flowing particulate laundry detergent composition
WO2020222996A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 The Procter & Gamble Company A process for making a laundry detergent composition
EP3976775A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP3754010A1 (en) 2019-06-17 2020-12-23 The Procter & Gamble Company A solid free-flowing particulate laundry detergent composition comprises a detersive surfactant and a linear polyamine salt
EP3798290B1 (en) 2019-09-30 2022-08-17 The Procter & Gamble Company Use of an anionically-modified cellulosic polymer as a dye transfer inhibitor during a textile laundering process
WO2021102080A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Lubrizol Advanced Materials, Inc. Redeposition inhibiting polymers and detergent compositions containing same
CN114867831A (zh) 2019-12-19 2022-08-05 路博润先进材料公司 再沉积抑制性聚合物和含有所述再沉积抑制性聚合物的洗涤剂组合物
EP3936595B1 (en) 2020-07-06 2023-04-26 The Procter & Gamble Company A process for making a particulate laundry detergent composition
EP3943603A1 (en) * 2020-07-22 2022-01-26 Technische Universität Darmstadt Rapid transformation method for gram-positive bacteria
WO2022077022A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 The Procter & Gamble Company Packaged laundry detergent product
WO2022106400A1 (en) * 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
CN112908417B (zh) * 2020-12-30 2025-01-10 浙江工业大学 功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、nadh偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用
EP4108756A1 (en) 2021-06-25 2022-12-28 The Procter & Gamble Company A laundry detergent powder
EP4108754B1 (en) 2021-06-25 2025-11-12 The Procter & Gamble Company A process for making a packaged laundry detergent powder
ES2976779T3 (es) 2021-07-19 2024-08-08 Procter & Gamble Composición de limpieza que comprende esporas bacterianas
EP4212608B1 (en) 2022-01-14 2024-11-20 The Procter & Gamble Company A method of making a spray-dried laundry detergent particle
US20230242850A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 The Procter & Gamble Company Container systems with water-soluble pouches
CN118159633A (zh) 2022-02-08 2024-06-07 宝洁公司 洗涤织物的方法
EP4476310B1 (en) 2022-02-08 2025-10-08 The Procter & Gamble Company A method of laundering fabric
EP4234672A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a hueing dye particle
EP4234666A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a surfactant system
US11464384B1 (en) 2022-03-31 2022-10-11 Techtronic Cordless Gp Water soluable package for a floor cleaner
CN116926049B (zh) * 2022-04-24 2024-07-23 南京百斯杰生物工程有限公司 枯草杆菌酶突变体及其用途
PE20251535A1 (es) 2022-05-14 2025-06-05 Novozymes As Composiciones y metodos para prevenir, tratar, suprimir y/o eliminar infecciones e infestaciones fitopatogenas
EP4279570A1 (en) 2022-05-19 2023-11-22 The Procter & Gamble Company A process for making a particulate laundry detergent composition
EP4299704A1 (en) 2022-06-27 2024-01-03 The Procter & Gamble Company A method of laundering and drying fabric
EP4299701B1 (en) 2022-06-27 2025-03-26 The Procter & Gamble Company A solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP4299703A1 (en) 2022-06-27 2024-01-03 The Procter & Gamble Company A solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP4299702A1 (en) 2022-06-27 2024-01-03 The Procter & Gamble Company A solid free-flowing particulate laundry detergent composition
EP4342970A1 (en) 2022-09-21 2024-03-27 Milliken & Company Coloured fabric hueing dye agent particles
EP4342969A1 (en) 2022-09-21 2024-03-27 The Procter & Gamble Company A solid detergent cleaning composition
EP4364929A1 (en) 2022-11-01 2024-05-08 The Procter & Gamble Company Sealing jaws and water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet
EP4364930B1 (en) 2022-11-01 2025-12-17 The Procter & Gamble Company Sealing jaws and water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet
EP4382592A1 (en) 2022-12-06 2024-06-12 The Procter & Gamble Company Water-soluble unit dose article comprising a fibrous non-woven sheet and a surfactant system
EP4389866B1 (en) 2022-12-23 2025-08-13 The Procter & Gamble Company A process of making a water-soluble detergent unit dose article
ES3044227T3 (en) 2022-12-23 2025-11-26 Procter & Gamble A process of making a laundry detergent article
EP4658776A1 (en) * 2023-02-01 2025-12-10 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024163600A1 (en) * 2023-02-01 2024-08-08 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
US20240263162A1 (en) * 2023-02-01 2024-08-08 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enzymes
EP4474453A1 (en) 2023-06-05 2024-12-11 The Procter & Gamble Company A method of making a laundry detergent recycle stream composition
EP4603570A3 (en) 2023-06-28 2025-11-26 The Procter & Gamble Company A solid linear alkyl benzene sulphonate anionic detersive surfactant particle
EP4484539A1 (en) 2023-06-28 2025-01-01 The Procter & Gamble Company A method of laundering fabric
EP4484538A1 (en) 2023-06-28 2025-01-01 The Procter & Gamble Company A method of laundering fabric
EP4484134A1 (en) 2023-06-30 2025-01-01 The Procter & Gamble Company Dust extraction conducts and processes
US20250011686A1 (en) 2023-06-30 2025-01-09 The Procter & Gamble Company Biodegradable chelating agents and methods for fabric care
EP4512730A1 (en) 2023-08-23 2025-02-26 The Procter & Gamble Company Consumer products and methods for operating the same
EP4512729A1 (en) 2023-08-23 2025-02-26 The Procter & Gamble Company Container blanks, methods of folding the same, and uses of a container thereby obtained
WO2025202370A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
EP4624572A1 (en) 2024-03-27 2025-10-01 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202372A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202369A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202382A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in cleaning compositions
WO2025202379A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202374A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions

Family Cites Families (213)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US562A (en) 1838-01-09 Scale beam and weight
US6093A (en) 1849-02-06 Horatio allen
CH490889A (de) 1965-08-02 1970-05-31 Ciba Geigy Verfahren zur Einkapselung von in einer Flüssigkeit fein verteilter Substanz
JPS5233195B2 (es) 1971-09-30 1977-08-26
US4234627A (en) 1977-02-04 1980-11-18 The Procter & Gamble Company Fabric conditioning compositions
JPS5953038B2 (ja) 1979-04-07 1984-12-22 メルシャン株式会社 サイクロデキストリンの製造法
US4514461A (en) 1981-08-10 1985-04-30 Woo Yen Kong Fragrance impregnated fabric
USRE32713E (en) 1980-03-17 1988-07-12 Capsule impregnated fabric
JPS57146600A (en) 1981-03-06 1982-09-10 Japan Maize Prod Recovery of gamma-cyclodextrin
US4378923A (en) 1981-07-09 1983-04-05 Nippon Kokan Kabushiki Kaisha Binding device for elongated pipes
GR76237B (es) 1981-08-08 1984-08-04 Procter & Gamble
US4540721A (en) 1983-03-10 1985-09-10 The Procter & Gamble Company Method of providing odor to product container
US4539135A (en) 1983-06-01 1985-09-03 Colgate Palmolive Co. Perfume-containing carrier for laundry compositions
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5185258A (en) 1984-05-29 1993-02-09 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US4990452A (en) 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
US4762636A (en) 1986-02-28 1988-08-09 Ciba-Geigy Corporation Process for the preparation of granules containing an active substance and to the use thereof as speckles for treating substrates
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
US4882220A (en) 1988-02-02 1989-11-21 Kanebo, Ltd. Fibrous structures having a durable fragrance
GB8806016D0 (en) 1988-03-14 1988-04-13 Danochemo As Encapsulated photoactivator dyes for detergent use
US4911852A (en) 1988-10-07 1990-03-27 The Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent with curable amine functional silicone for fabric wrinkle reduction
US4973422A (en) 1989-01-17 1990-11-27 The Procter & Gamble Company Perfume particles for use in cleaning and conditioning compositions
US5665587A (en) 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
ES2144990T3 (es) 1989-08-25 2000-07-01 Henkel Of America Inc Enzima proteolitica alcalina y metodo de produccion.
DE4023458A1 (de) 1989-08-31 1991-03-07 Kali Chemie Ag Neue hochalkalische proteasen
CA2013485C (en) 1990-03-06 1997-04-22 John Michael Gardlik Solid consumer product compositions containing small particle cyclodextrin complexes
ATE444356T1 (de) 1992-07-23 2009-10-15 Novozymes As Mutierte -g(a)-amylase, waschmittel und geschirrspülmittel
CA2145420C (en) * 1992-09-24 2005-01-04 Stanley E. Mainzer Cleaning compositions containing novel alkaline proteases
CN1104499C (zh) 1993-02-11 2003-04-02 吉恩康国际有限公司 氧化作用稳定的α－淀粉酶
US5651976A (en) 1993-06-17 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Controlled release of active agents using inorganic tubules
US5486303A (en) 1993-08-27 1996-01-23 The Procter & Gamble Company Process for making high density detergent agglomerates using an anhydrous powder additive
US6436690B1 (en) 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
CN1177921C (zh) 1993-10-14 2004-12-01 普罗格特-甘布尔公司 含有蛋白酶的漂白组合物
ATE361355T1 (de) 1993-10-14 2007-05-15 Procter & Gamble Proteasehaltige reinigungsmittel
US5932532A (en) 1993-10-14 1999-08-03 Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising protease enzyme
ES2364774T3 (es) * 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
CA2186592C (en) 1994-03-29 2008-02-19 Helle Outtrup Alkaline bacillus amylase
US5506201A (en) 1994-04-29 1996-04-09 International Flavors & Fragrances Inc. Formulation of a fat surfactant vehicle containing a fragrance
US6599730B1 (en) 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US5879584A (en) 1994-09-10 1999-03-09 The Procter & Gamble Company Process for manufacturing aqueous compositions comprising peracids
US5691297A (en) 1994-09-20 1997-11-25 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition by controlling agglomeration within a dispersion index
US5516448A (en) 1994-09-20 1996-05-14 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition which includes selected recycle streams for improved agglomerate
US5489392A (en) 1994-09-20 1996-02-06 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition in a single mixer/densifier with selected recycle streams for improved agglomerate properties
US5500154A (en) 1994-10-20 1996-03-19 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enduring perfume
US5500138A (en) 1994-10-20 1996-03-19 The Procter & Gamble Company Fabric softener compositions with improved environmental impact
US5500137A (en) 1994-10-20 1996-03-19 The Procter & Gamble Company Fabric softening bar compositions containing fabric softener and enduring perfume
US6491728B2 (en) 1994-10-20 2002-12-10 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enduring perfume
EP0808363B1 (en) 1995-02-03 2009-05-27 Novozymes A/S A method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
US5534179A (en) 1995-02-03 1996-07-09 Procter & Gamble Detergent compositions comprising multiperacid-forming bleach activators
US5574005A (en) 1995-03-07 1996-11-12 The Procter & Gamble Company Process for producing detergent agglomerates from high active surfactant pastes having non-linear viscoelastic properties
US5569645A (en) 1995-04-24 1996-10-29 The Procter & Gamble Company Low dosage detergent composition containing optimum proportions of agglomerates and spray dried granules for improved flow properties
JP3025627B2 (ja) 1995-06-14 2000-03-27 花王株式会社 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子
US5597936A (en) 1995-06-16 1997-01-28 The Procter & Gamble Company Method for manufacturing cobalt catalysts
US5565422A (en) 1995-06-23 1996-10-15 The Procter & Gamble Company Process for preparing a free-flowing particulate detergent composition having improved solubility
US5576282A (en) 1995-09-11 1996-11-19 The Procter & Gamble Company Color-safe bleach boosters, compositions and laundry methods employing same
US5780404A (en) 1996-02-26 1998-07-14 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enduring perfume
ES2216129T3 (es) 1996-03-22 2004-10-16 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Sistema de liberacion que tiene una zeolita cargada con un inhibidor de liberacion y metodo para fabricar el mismo.
ES2216128T3 (es) 1996-03-22 2004-10-16 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Sistema de liberacion que tiene una zeolita cargada con una barrera de liberacion.
US5958870A (en) 1996-04-01 1999-09-28 The Procter & Gamble Company Betaine ester compounds of active alcohols
MA24137A1 (fr) 1996-04-16 1997-12-31 Procter & Gamble Fabrication d'agents de surface ramifies .
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
US6093691A (en) 1996-08-19 2000-07-25 The Procter & Gamble Company Rinse added fabric softening compositions and method of use for the delivery of fragrance derivatives
US6147037A (en) 1996-08-19 2000-11-14 The Procter & Gamble Company Fragrance delivery systems
EP0934389B1 (en) 1996-10-18 2003-12-10 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
US6103678A (en) 1996-11-07 2000-08-15 The Procter & Gamble Company Compositions comprising a perfume and an amino-functional polymer
ZA9711269B (en) 1996-12-19 1998-06-23 Procter & Gamble Dryer added fabric softening compositions and method of use for the delivery of fragrance derivatives.
ZA9711272B (en) 1996-12-19 1998-06-23 Procter & Gamble Dryer-activated fabric conditioning and antistatic compositions with improved perfume longevity.
ID27689A (id) 1996-12-23 2001-04-19 Quest Int Komposisi yang mengandung parfum
US5858959A (en) 1997-02-28 1999-01-12 Procter & Gamble Company Delivery systems comprising zeolites and a starch hydrolysate glass
CA2282466C (en) 1997-03-07 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Bleach compositions containing metal bleach catalyst, and bleach activators and/or organic percarboxylic acids
CN1134443C (zh) 1997-03-07 2004-01-14 普罗格特-甘布尔公司 制备交联桥大环化合物的改进方法
CA2295114A1 (en) 1997-06-27 1999-01-07 The Procter & Gamble Company Pro-fragrance linear acetals and ketals
US6645479B1 (en) 1997-09-18 2003-11-11 International Flavors & Fragrances Inc. Targeted delivery of active/bioactive and perfuming compositions
US6042792A (en) 1997-09-18 2000-03-28 International Flavors & Fragrances Inc. Apparatus for preparing a solid phase microparticulate composition
US6106875A (en) 1997-10-08 2000-08-22 Givaudan Roure (International) Sa Method of encapsulating flavors and fragrances by controlled water transport into microcapsules
US6369019B1 (en) 1997-10-22 2002-04-09 The Procter & Gamble Company Liquid hard-surface cleaning compositions
EP0913458B1 (en) 1997-10-22 2004-06-16 The Procter & Gamble Company Liquid hard-surface cleaning compositions
MA24811A1 (fr) 1997-10-23 1999-12-31 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variantes de proteases multisubstituees
ES2515218T3 (es) 1997-10-30 2014-10-29 Novozymes A/S Mutantes de alfa-amilasa
US6287839B1 (en) 1997-11-19 2001-09-11 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
SG93823A1 (en) 1998-02-13 2003-01-21 Givaudan Roure Int Aryl-acrylic acid esters
CN1247776C (zh) 1998-02-17 2006-03-29 诺维信公司 脂肪酶变体
GB9807477D0 (en) 1998-04-07 1998-06-10 Unilever Plc Coloured granular composition for use in particulate detergent compositions
DK1056739T3 (da) 1998-02-24 2003-06-02 Procter & Gamble Hidtil ukendte cykliske pro-parfumer med modificeret frigivelseshastighed af duftstofråmaterialealkohol
US6835550B1 (en) * 1998-04-15 2004-12-28 Genencor International, Inc. Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins
US6936249B1 (en) 1998-04-15 2005-08-30 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
US6479682B1 (en) 1998-04-20 2002-11-12 Givaudan Sa Compounds having protected hydroxy groups
DE69933608T2 (de) 1998-04-20 2007-08-23 Givaudan S.A. Verbindungen mit geschützten Hydroxylgruppen
ATE278762T1 (de) 1998-04-23 2004-10-15 Procter & Gamble Umhüllte parfümteilchen und diese enthaltende waschmittelzusammensetzungen
DE59910042D1 (de) 1998-05-18 2004-09-02 Ciba Sc Holding Ag Wasserlösliche Granulate von Phthalocyaninverbindungen
US6133228A (en) 1998-05-28 2000-10-17 Firmenich Sa Slow release of fragrant compounds in perfumery using 2-benzoyl benzoates, 2-alkanoyl benzoates or α-keto esters
US6413920B1 (en) 1998-07-10 2002-07-02 Procter & Gamble Company Amine reaction compounds comprising one or more active ingredient
US6831053B1 (en) 1998-10-23 2004-12-14 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising multiply-substituted protease variants
WO2000024721A2 (en) 1998-10-23 2000-05-04 The Procter & Gamble Company Fragrance pro-accords and aldehyde and ketone fragrance libraries
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6051540A (en) 1998-11-05 2000-04-18 International Flavors & Fragrances Inc. Method employing drum chilling and apparatus therefor for producing fragrance-containing long lasting solid particle
WO2000032601A2 (en) 1998-11-30 2000-06-08 The Procter & Gamble Company Process for preparing cross-bridged tetraaza macrocycles
DE69940744D1 (de) 1998-12-18 2009-05-28 Novozymes As Subtilase enzyme der i-s2 untergruppe, mit einem zusätzlichen aminosäurenrest in einer aktiven schleifenregion
US6403355B1 (en) 1998-12-21 2002-06-11 Kao Corporation Amylases
EP1428874B1 (en) 1999-03-31 2013-12-18 Novozymes A/S Lipase variant
EP2889375B1 (en) 1999-03-31 2019-03-20 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
US6939702B1 (en) 1999-03-31 2005-09-06 Novozymes A/S Lipase variant
US6861402B1 (en) 1999-06-01 2005-03-01 The Procter & Gamble Company Pro-fragrances
EP1212409B1 (en) 1999-08-20 2007-03-14 Novozymes A/S Alkaline bacillus amylase
US6200949B1 (en) 1999-12-21 2001-03-13 International Flavors And Fragrances Inc. Process for forming solid phase controllably releasable fragrance-containing consumable articles
DE10000223A1 (de) 2000-01-05 2001-07-12 Basf Ag Mikrokapselzubereitungen und Mikrokapseln enthaltende Wasch- und Reinigungsmittel
FR2806307B1 (fr) 2000-03-20 2002-11-15 Mane Fils V Preparation parfumee solide sous forme de microbilles et utilisation de ladite preparation
US6610646B2 (en) 2000-06-01 2003-08-26 The Procter & Gamble Company Enhanced duration fragrance delivery system having a non-distorted initial fragrance impression
EP1286651B1 (en) 2000-06-02 2006-08-02 Quest International Services B.V. Use of aminobenzoic acids in compositions with perfumes
GB0027328D0 (en) 2000-06-23 2000-12-27 Aventis Pharma Inc Bioengineered vehicles for targeted nucleic acid delivery
KR20030037267A (ko) 2000-07-28 2003-05-12 헨켈 코만디트게젤샤프트 아우프 악티엔 바실러스속 ａ ７－７ (ｄｓｍ １２３６８) 에서 추출한신규한 아밀분해 효소 및 상기 신규한 아밀분해 효소를함유하는 세척 및 세정제
BR0003716A (pt) 2000-08-21 2002-04-02 Meritor Do Brasil Ltda Divisao Roda
AU2002210379A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Subtilase variants
US20020094938A1 (en) 2000-11-08 2002-07-18 The Procter & Gamble Company Photo-labile pro-fragrance conjugates
US6531444B1 (en) 2000-11-09 2003-03-11 Salvona, Llc Controlled delivery system for fabric care products
ES2650636T3 (es) 2001-02-21 2018-01-19 Basf Enzymes Llc Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas
GB0106560D0 (en) 2001-03-16 2001-05-02 Quest Int Perfume encapsulates
PL210859B1 (pl) 2001-03-23 2012-03-30 Genencor Int Odmiana subtylizyny zawierająca zmieniony epitop limfocytów T, kwas nukleinowy kodujący tę odmianę subtylizyny, wektor ekspresyjny i komórka gospodarza zawierająca kwas nukleinowy oraz kompozycje zawierające tę odmianę subtylizyny
US6956013B2 (en) 2001-04-10 2005-10-18 The Procter & Gamble Company Photo-activated pro-fragrances
WO2002090479A1 (en) 2001-05-04 2002-11-14 The Procter & Gamble Company Perfumed particles and articles containing the same
DK200101090A (da) 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
GB0119710D0 (en) 2001-08-13 2001-10-03 Unilever Plc Cleaning and rinsing of textile fabrics
GB0119935D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Quest Int Perfume containing composition
BRPI0211408B1 (pt) 2001-08-20 2017-01-31 Unilever Nv composição granular, composição detergente de lavagem de roupa particulada, e, processo para a fabricação de uma composição granular
GB0120160D0 (en) 2001-08-20 2001-10-10 Unilever Plc Photobleach speckle and laundry detergent compositions containing it
US20030125220A1 (en) 2001-09-11 2003-07-03 The Procter & Gamble Company Compositions comprising photo-labile perfume delivery systems
PL209377B1 (pl) 2001-12-13 2011-08-31 Firmenich & Cie Kompozycja zapachowa lub wyrób perfumowany, sposób poprawiania, zwiększania lub modyfikowania zapachu kompozycji zapachowej lub wyrobu perfumowanego, sposób perfumowania powierzchni, sposób intensyfikowania lub przedłużania efektu dyfundowania składnika zapachowego na powierzchni, oraz związek stanowiący składnik czynny
DE10162728A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
ATE450606T1 (de) * 2002-01-16 2009-12-15 Genencor Int Mehrfachsubstituierte proteasevarianten
WO2003061817A1 (de) 2002-01-24 2003-07-31 Bayer Aktiengesellschaft Mikrokapseln enthaltende koagulate
US20030158344A1 (en) 2002-02-08 2003-08-21 Rodriques Klein A. Hydrophobe-amine graft copolymer
GB0207647D0 (en) 2002-04-03 2002-05-15 Dow Corning Emulsions
US7053034B2 (en) 2002-04-10 2006-05-30 Salvona, Llc Targeted controlled delivery compositions activated by changes in pH or salt concentration
US20030215417A1 (en) 2002-04-18 2003-11-20 The Procter & Gamble Company Malodor-controlling compositions comprising odor control agents and microcapsules containing an active material
US20030216488A1 (en) 2002-04-18 2003-11-20 The Procter & Gamble Company Compositions comprising a dispersant and microcapsules containing an active material
US6740631B2 (en) 2002-04-26 2004-05-25 Adi Shefer Multi component controlled delivery system for fabric care products
BR0305777A (pt) 2002-08-14 2004-10-05 Quest Int Composição, e, cápsulas
MXPA05001651A (es) 2002-09-04 2005-04-19 Ciba Sc Holding Ag Formulaciones que comprenden granulos solubles en agua.
ATE284942T1 (de) 2002-09-05 2005-01-15 Procter & Gamble Strukturierte flüssige weichmacherzusammensetzungen
KR100554479B1 (ko) 2002-09-11 2006-03-03 씨제이라이온 주식회사 염착 얼룩 방지 세탁용 착염
US7125835B2 (en) 2002-10-10 2006-10-24 International Flavors & Fragrances Inc Encapsulated fragrance chemicals
US7585824B2 (en) 2002-10-10 2009-09-08 International Flavors & Fragrances Inc. Encapsulated fragrance chemicals
US20040071742A1 (en) 2002-10-10 2004-04-15 Popplewell Lewis Michael Encapsulated fragrance chemicals
US7316994B2 (en) 2002-11-01 2008-01-08 The Procter & Gamble Company Perfume polymeric particles
US20040091445A1 (en) 2002-11-01 2004-05-13 The Procter & Gamble Company Rinse-off personal care compositions comprising cationic perfume polymeric particles
US7524807B2 (en) 2002-11-01 2009-04-28 The Procter & Gamble Company Rinse-off personal care compositions comprising anionic and/or nonionic perfume polymeric particles
US8187580B2 (en) 2002-11-01 2012-05-29 The Procter & Gamble Company Polymeric assisted delivery using separate addition
CA2502303C (en) 2002-11-04 2010-08-17 The Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent
TWI319007B (en) 2002-11-06 2010-01-01 Novozymes As Subtilase variants
CN1711354A (zh) 2002-11-06 2005-12-21 诺和酶股份有限公司 枯草杆菌酶变体
US7888093B2 (en) 2002-11-06 2011-02-15 Novozymes A/S Subtilase variants
JP4550587B2 (ja) 2002-12-17 2010-09-22 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 熱安定性α−アミラーゼ
US7365043B2 (en) 2003-06-27 2008-04-29 The Procter & Gamble Co. Lipophilic fluid cleaning compositions capable of delivering scent
GB0325432D0 (en) 2003-10-31 2003-12-03 Unilever Plc Ligand and complex for catalytically bleaching a substrate
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
JP5244317B2 (ja) 2003-11-19 2013-07-24 ジェネンコー・インターナショナル・インク セリンプロテアーゼ、セリン酵素をコードする核酸、およびこれらを取り込んだベクターおよび宿主細胞
GB0406819D0 (en) 2004-03-26 2004-04-28 Dow Corning Controlled release compositions
US7208459B2 (en) 2004-06-29 2007-04-24 The Procter & Gamble Company Laundry detergent compositions with efficient hueing dye
US20060003913A1 (en) 2004-06-30 2006-01-05 The Procter & Gamble Company Perfumed liquid laundry detergent compositions with functionalized silicone fabric care agents
EP4269684A3 (en) 2004-07-05 2024-02-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
US7590232B2 (en) 2004-07-21 2009-09-15 Carter John A System and method for tracking individuals
WO2006113314A1 (en) 2005-04-15 2006-10-26 The Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent compositions with modified polyethyleneimine polymers and lipase enzyme
DE602006017985D1 (de) * 2005-04-15 2010-12-16 Procter & Gamble Reinigungsmittel mit alkoxylierten polyalkyleniminen
US20060292098A1 (en) 2005-05-19 2006-12-28 Scavone Timothy A Consumer noticeable improvement in wetness protection
CN103555697A (zh) 2005-07-08 2014-02-05 诺维信公司 枯草蛋白酶变体
US20070161531A1 (en) 2005-07-08 2007-07-12 Novozymes A/S Subtilase variants
JP5507843B2 (ja) 2005-10-12 2014-05-28 ジェネンコー・インターナショナル・インク 保存安定的な中性金属プロテアーゼの使用及び生産
CA2635946C (en) 2006-01-23 2012-09-18 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
US20070275866A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Robert Richard Dykstra Perfume delivery systems for consumer goods
DK2032698T3 (da) 2006-06-23 2012-09-03 Danisco Us Inc Systematisk bedømmelse af sekvens- og aktivitetsforbindelse ved anvendelse af stedbedømmelsesbiblioteker til manipulation af flere egenskaber
CA2657272C (en) 2006-07-13 2014-10-28 Dsm Ip Assets B.V. Use of bacterial amylases in feed for bovine animals
KR20090101930A (ko) 2006-12-21 2009-09-29 노보자임스 에이/에스 약학적 사용을 위한 리파아제 변형체
MX2009013083A (es) * 2007-06-06 2010-01-18 Danisco Us Inc Genencor Div Metodos para mejorar multiples propiedades de proteina.
WO2008153882A1 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Appleton Papers Inc. Benefit agent containing delivery particle
WO2009014200A1 (ja) 2007-07-26 2009-01-29 Ngk Insulators, Ltd. ハニカム構造体用コーティング材
DE102007038031A1 (de) 2007-08-10 2009-06-04 Henkel Ag & Co. Kgaa Mittel enthaltend Proteasen
DE102007047433A1 (de) 2007-10-04 2009-04-09 Lanxess Deutschland Gmbh Flüssigwasch- und Flüssigreinigungsmittel
CN101848985B (zh) 2007-11-05 2014-12-03 丹尼斯科美国公司 具有改变性质的杆菌物种TS-23的α-淀粉酶变体
MX2010009457A (es) 2008-02-29 2010-09-24 Procter & Gamble Composicion detergente que comprende lipasa.
EP2100948A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
US20090247449A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 John Allen Burdis Delivery particle
HUE025251T2 (en) 2008-06-06 2016-02-29 Danisco Us Inc Alpha-amylase variants from bacillus subtilis and methods for its use
BRPI0913570A2 (pt) 2008-06-06 2015-12-15 Procter & Gamble composição detergente compreendendo uma variante de uma xiloglucanase da família 44
BRPI0915681A2 (pt) 2008-06-06 2015-08-04 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo proteases microbianas variantes
AR073420A1 (es) 2008-11-11 2010-11-03 Danisco Us Inc Variantes de serina proteasas, composiciones y metodos de limpieza que las comprenden
CA2743060C (en) 2008-11-11 2017-03-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising a subtilisin variant
BR112012000531A2 (pt) 2009-07-09 2019-09-24 Procter & Gamble composição detergente para lavagem de roupas catalítica que compreende teores relativamente baixos de eletrólito solúvel em água
WO2011066576A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
MX2012006095A (es) 2009-11-30 2012-07-03 Novozymes North America Inc Polipeptidos que tienen actividad glucoamilasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
ES2746931T3 (es) 2009-12-09 2020-03-09 Danisco Us Inc Composiciones y métodos comprendiendo variantes de proteasa
CN102652175B (zh) 2009-12-09 2016-02-10 宝洁公司 织物和家居护理产品
CN102933596B (zh) 2010-04-14 2015-08-05 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
ES2745011T3 (es) 2010-05-06 2020-02-27 Procter & Gamble Productos de consumo con variantes de proteasa
ES2707869T3 (es) 2011-05-05 2019-04-05 Danisco Us Inc Composiciones y métodos comprendiendo variantes de serina proteasa
BR112013028440A2 (pt) 2011-05-05 2016-11-29 Procter & Gamble composições e métodos que compreendem variantes de serina protease
US20130123162A1 (en) 2011-11-10 2013-05-16 The Procter & Gamble Company Consumer products
WO2013164404A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Spiber Technologies Ab Spider silk fusion protein structures incorporating immunoglobulin fragments as affinity ligands
SMT201800368T1 (it) 2012-05-16 2018-09-13 Immune Design Corp Vaccini per l'infezione da virus-2 herpes simplex
PT3597037T (pt) 2012-06-12 2021-06-01 Regeneron Pharma Animais não humanos humanizados com lócus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito
CA2876361C (en) 2012-06-14 2020-06-30 Portola Pharmaceuticals, Inc. Method for purification of recombinant factor xa derivatives
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
EP2931305B1 (en) 2012-12-12 2018-11-28 Promega Corporation Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents
ES2608857T3 (es) 2012-12-18 2017-04-17 Salipro Biotech Ag Partículas Salipro
EP3530284B1 (en) 2012-12-26 2023-10-25 OncoSynergy, Inc. Anti-integrin beta1 antibody compositions and methods of use thereof
US9403881B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods of use
BR112018072530A2 (pt) 2016-05-03 2019-03-26 Danisco Us Inc variantes de protease e usos das mesmas
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
GB201810710D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Smartkem Ltd Sputter Protective Layer For Organic Electronic Devices
US20240263162A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing enzymes

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