MX2012006593A

MX2012006593A - Anticuerpos anti-c4.4a y usos de los mismos.

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Publication number: MX2012006593A
Application number: MX2012006593A
Authority: MX
Inventors: Beatrix Stelte-Ludwig; Joerg Willuda; Lars Linden; Yong-Jiang Cao; Gabriele Leder; Axel Harrenga; Ricarda Finnern; Frank Dittmer; Anke Mayer-Bartschmid; Juergen Franz; Simone Greven; Jan Tebbe
Original assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2012-06-28
Also published as: BR112012013915A8; US20170158775A1; EP3144323A3; PL2510012T3; US20120321619A1; ZA201203498B; HRP20170973T1; IL219801A0; JP2013513369A; TW201134485A; LT2510012T; PT2510012T; JP2016104820A; AR079340A1; DK2510012T3; TWI488642B; CY1119051T1; EP3144323A2; CN102812047B; KR20120116958A

Abstract

La presente invención proporciona regiones de unión a antígeno y anticuerpos recombinantes y fragmentos funcionales que contienen dichas regiones de unión a antígeno que son específicos del polipéptido anclado a la membrana de 29 kDa denominado C4.4a, que está sobreexpresado en varios tumores, por ejemplo cáncer de pulmón, colorrectal, de páncreas, de próstata, renal y de mama. En consecuencia, estos anticuerpos se pueden usar para tratar éstos y otros trastornos y afecciones. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en el campo del diagnóstico, así como para investigaciones adicionales del papel de C4.4a en la evolución de los trastornos asociados con cáncer. La invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anteriores, vectores que contienen las mismas, composiciones farmacéuticas y kits con instrucciones de uso.

Description

ANTICUERPOS ANTI-C4.4A Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona regiones de unión a antigeno y anticuerpos recombinantes y fragmentos funcionales que contienen dichas regiones de unión a antígeno que son específicos del polipéptido anclado a la membrana de 29 kDa denominado C4.4a, que esta sobreexpresado en tumores.

De forma adicional, es muy abundante en metástasis de estos tipos de cáncer. En consecuencia, los anticuerpos se pueden usar para tratar éstos y otros trastornos y afecciones. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en el campo del diagnóstico, así como para investigaciones adicionales del papel de C4.4a en la progresión de los trastornos asociados con cáncer. La invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anteriores, vectores que contienen las mismas, composiciones farmacéuticas y kit con instrucciones de uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha probado que los tratamientos basados en anticuerpos son muy eficaces en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, incluidos los tumores sólidos. Por ejemplo, HERCEPTIN® se ha usado con éxito para tratar el cáncer de mama y RITUXAN® es eficaz en los tipos de cáncer relacionados con las células B. Crucial para el desarrollo de una terapia basada en anticuerpos con éxito es el aislamiento de anticuerpos contra proteínas de superficie celular que se ha descubierto que se expresan de forma preferente sobre las células tumorales. El polipéptido C4.4a (nombre del gen: LYPD3) es una proteína de superficie celular altamente glicosilada anclada por glicofosfatidilinositol (GPI). La C4.4a de rata se describió por primera vez como proteína de superficie celular asociada con las metástasis en células de tumor pancreático de rata metastásico (Rosel M. y col., Oncogene 1998, 17(15): 1989-2002). La C4.4a humana se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de placenta (Würfel, J. y col. Gene 2001,262:35-41). La C4.4a muestra una homología estructural con el receptor uPAR y contiene dos dominios LY6 y exhibe el típico pliegue de proteína en tres dedos (Jacobsen B. & Ploug M., Current Medicinal Chemistry 2008, 15:2559-2573). La proteína está altamente glicosilada y contiene 6 sitios predichos de N-glicosilación y varios sitios de O-glicosilación. De forma adicional, la C4.4a contiene, en total, 9 puntos disulfuro localizados en los dos dominios Ly6 (Hansen L. y col., Biochem J. 2004, 380:845-857). La C4.4a muestra una fuerte expresión en células tumorales, como cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello y melanomas. Los análisis de transferencia tipo Northern demostraron expresión de C4.4a en ~ 50 % de los tumores pulmonares primarios y en el ~75 % de las metástasis de tumor pulmonar, aunque la expresión en tejido pulmonar no enfermo no se pudo detectar (Würfel J. y col., Gene 2001 , 262:35-41). En el cáncer de pulmón amicrocítico, la C4.4a puede usarse como marcador pronóstico. En el presente documento, los datos clínicos muestran claramente que una expresión elevada de C4.4a se correlaciona con un mal pronóstico (Hansen L. y col., Lung Cáncer 2007, 58:260-266). En melanoma, un análisis detallado de la expresión reveló que la C4.4a no se expresa en melanocitos y lunares, pero sí se expresa en ~ 60 % de los melanomas malignos primarios y en el 100 % de las metástasis en ganglios linfáticos y de piel (Seiter S. y col., J Invest Dermatol. 2001 , 116(2):344-347). De forma adicional, se encontró regulación por incremento de la expresión del gen de C4.4a en tejido de cáncer de mama en comparación con el correspondiente tejido de mama normal adyacente (Fletcher G.C., Br. J. Cáncer 2003, 88(4):579-585), en varias líneas de células de cáncer de mama y en cáncer urotelial (Smith B. A. y col., Cáncer Res 2001 , 61 (4): 1678-1685). La expresión de C4.4a se demostró mediante FACS con un anticuerpo policlonal en varias líneas de células tumorales de cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama y cáncer de próstata. En estudios IHQ de muestras de cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y cáncer de mama, la glicosilación variable de C4.4a en líneas de células tumorales humanas interfiere con la unión de estos anticuerpos. Por tanto, la C4.4a tiene que estar, al menos parcialmente, no glicosilada para permitir la unión de estos anticuerpos policlonales. En pacientes de cáncer colorrectal, la expresión de C4.4a es altamente prevalente y la C4.4a se desprende de la superficie celular, lo que la convierte en un marcador pronóstico tumoral en suero. La expresión de C4.4a en el frente invasivo es un nuevo marcador pronóstico de recidiva de la enfermedad del cáncer colorrectal (K. Konishi y col., Cáncer Science 2010) No se han descrito anticuerpos diagnósticos contra C4.4a soluble en suero (Paret C. y col., British Journal of Cáncer 2007, 97:1146-1156). En tejido normal, la expresión de C4.4a está limitada a los queratinocitos de la piel, las células endoteliales del esófago y las células placentarias (Würfel J. y col., Gene 2001 , 262:35-41), lo que la convierte en una diana ideal para la terapia tumoral. El documento WO01/23553 sugiere el uso de un inhibidor de C4.4a (p.ej., un anticuerpo anti-C4.4a) que disminuye o inhibe la expresión o actividad de C4.4a para el tratamiento del cáncer.

La función exacta de C4.4a se desconoce; no obstante está regulada por incremento en los queratinocitos en migración en la cicatrización de heridas (Hansen L. y col., Biochem J. 2004, 380:845-857). A la luz de la asociación con las metástasis y la homología estructural con el uPAR, se ha propuesto que está molécula está implicada en la invasión de las células tumorales, probablemente a través de la interacción con la matriz extracelular (Rdsel M. y col., Oncogene 1998, 17(15): 1989-2002; Paret C. y col., British Journal of Cáncer 2007, 97:1146-1156). Los posibles ligandos son laminina 1 y 5, galectina 3 (Paret C, Int. J. Cáncer 2005, 115:724-733), así como agr2 y agr3 (Fletcher GC, Brit. J. Cáncer 2003, 88:579-585).

El valor predictivo de los modelos de cáncer en xenoinjertos murinos para determinar el resultado clínico de la terapia contra el cáncer con inmunotoxinas a menudo está limitado por una falta de reactividad cruzada de los anticuerpos terapéuticos con sus ortólogos murinos, lo que conduce a una reducción de la unión inespecífica al tejido normal. Por otro lado, los anticuerpos Fv neutralizantes anti-ratón que se forman en pacientes que están siendo tratados con anticuerpos murinos o quiméricos pueden tener como resultado una toxicidad limitante de la dosis o disminución de la potencia terapéutica. Por tanto, para explotar completamente el potencial de la expresión específica de C4.4a en la terapia contra el cáncer, se requieren anticuerpos dirigidos que combinen las ventajas de elevada afinidad de unión de C4.4a con un formato de anticuerpo completamente humano o humanizado y con reactividad cruzada con murinos.

Otra característica necesaria de nuevos anticuerpos es la elevada afinidad de unión a diferentes líneas celulares cancerosas que expresan C4.4a en su superficie. La C4.4a está glicosilada de forma diferente en las células tumorales (Paret C. y col., British Journal of Cáncer 2007 97:1146-1156). Por tanto, los anticuerpos anti-C4.4a eficaces deben unirse a un epítopo presentado por las células tumorales de diferentes pacientes, con independencia de la variación individual incluidas, entre otras, las variaciones en los patrones de glicosilación, que conduce a la expresión de diferentes formas de C4.4a.

En la presente memoria descriptiva se presentan anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen a C4.4a con afinidad alta, internalizan de forma eficiente y que, preferentemente, presentan reacciones cruzadas con la C4.4a de otras especies. También se proporcionan terapias basadas en anticuerpos para tratar el cáncer, en particular para tumores que expresan C4.4a, tales como cáncer de mama, del tracto respiratorio, cerebral, de órganos reproductores, del tracto digestivo, del tracto urinario, ocular, de hígado, de piel, de cabeza y cuello, de tiroides, de paratiroides, y sus metástasis distantes, así como linfomas, sarcomas y leucemias. Estas terapias usan anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que facilitan la liberación de agentes terapéuticamente activos contra células cancerosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la invención proporcionar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que son altamente selectivos para el polipéptido C4.4a anclado por GPI a la superficie celular o soluble, mediante eliminación de la porción unida por GPI, en suero de pacientes y que pueden emplearse en los procedimientos para la detección de la expresión de C4.4a, que se asocian con estados de enfermedad tales como cáncer de pulmón, de colon, de mama, de cuello de útero, de páncreas, de riñon, de cabeza y cuello o melanomas,, y en el tratamiento de dichos estados de enfermedad. Con estos fines, es un objeto de la invención proporcionar anticuerpos humanos quiméricos o humanizados, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un epítopo de C4.4a presente en diferentes formas del polipéptido C4.4a maduro de 278 aminoácidos (SEC ID N°: 1), que es presentado por las líneas celulares cancerosas que expresan C4.4a y/o que es unido por estos anticuerpos con afinidades elevadas. Como se usa en la presente memoria descriptiva, diferentes "formas" de C4.4a incluyen, entre otros, diferentes glicoformas, diferentes isoformas o polipéptidos de C4.4a que sufren diferentes modificaciones traduccionaies y postraduccionales. Es otro objeto de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que son seguros para administración humana.

Es otro objeto de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen a la C4.4a humana y presentan reactividad cruzada con la C4.4a de otras especies. Preferentemente, dicha otra especie es un roedor, tal como, por ejemplo, un ratón o una rata. Más preferentemente, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen a la C4.4a humana y presentan reactividad cruzada con la C4.4a murina.

Es otro objeto de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen a un amplio abanico de líneas celulares que expresan C4.4a. Es otro objeto de la invención proporcionar anticuerpos o sus variantes, que se unen a diferentes células cancerosas o células tumorales que expresan C4.4a y provocan actividad efectora inmunitaria (p. ej., ADCC o DCD) contra células cancerosas que expresan C4.4a, mediante el uso de uno o más anticuerpos, o sus variantes, de la invención.

Es otro objetivo de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se internalizan de forma eficiente tras la unión a una célula que expresa C4.4a. Un anticuerpo de la invención podría administrarse de forma conjunta con medicamentos conocidos y, en algunos casos, el anticuerpo podría estar modificado. Por ejemplo, un anticuerpo podría estar conjugado con un agente citotóxico, una ¡nmunotoxina, un toxóforo o un radioisótopo para potencialmente aumentar adicionalmente la eficacia.

Es otro objetivo de la invención proporcionar anticuerpos que constituyen una herramienta para el diagnóstico de afecciones malignas o displásicas en las que la expresión de C4.4a está elevada en comparación con el tejido normal o en las que la C4.4a se desprende de la superficie celular y pasa a ser detectable en suero. Se proporcionan anticuerpos anti-C4.4A conjugados con un marcador detectable. Los marcadores preferidos son un radiomarcaje, una enzima, un cromóforo o un fluorescente.

La invención también está relacionada con polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células que expresan los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para producir los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para inhibir el crecimiento de células displásicas usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y procedimientos para tratar y detectar cáncer usando los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

La invención proporciona anticuerpos que se distinguen de los anticuerpos anti C4.4a existentes (Paret C. y col., British Journal of Cáncer 2007 97:1146-1156) en que a) se unen al C4.4a nativo, expresado en la superficie celular y completamente glicosilado, preferentemente al dominio S1 del C4.4a nativo, expresado en la superficie celular y completamente glicosilado, b) presentan reactividad cruzada con el C4.4a murino y c) se internalizan de forma eficiente en las células que expresan C4.4a. Éstos y otros objetivos de la invención se describen más extensamente en la presente memoria descriptiva.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que contiene una región de unión a antígeno que se une específicamente al C4.4a nativo, expresado en la superficie celular y completamente glicosilado, preferentemente que se une específicamente al dominio S1 (aminoácidos 1-85 de C4.4a; SEC ID N°: 1) del polipéptido C4.4a nativo, expresado en la superficie celular y completamente glicosilado. En otra forma de realización, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se internalizan en una célula que expresa C4.4a tras la unión del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, a la célula mencionada con anterioridad. En otra forma de realización, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, compiten por la unión a C4.4a con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, compiten por la unión a C4.4a humano con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, compiten por la unión a C4.4a humano y de roedor con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, otra forma de realización preferida es una en la que el C4.4a de roedor es C4.4a de ratón.

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 5 (H-CDR1), la SEC ID N°: 9 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 13 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 17 (L-CDR1), la SEC ID N°: 21 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 25 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 6 (H-CDR1), la SEC ID N°: 10 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 14 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 18 (L-CDR1), la SEC ID N°: 22 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 26 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 7 (H-CDR1), la SEC ID N°: 11 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 15 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 19 (L-CDR1), la SEC ID N°: 23 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 27 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 8 (H-CDR1), la SEC ID N°: 12 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 16 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 20 (L-CDR1), la SEC ID N°: 24 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 28 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 45 (H-CDR1), la SEC ID N°: 46 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 47 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 48 (L-CDR1), la SEC ID N°: 49 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 50 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 55 (H-CDR1), la SEC ID N°: 56 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 57 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 58 (L-CDR1), la SEC ID N°: 59 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 60 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 65 (H-CDR1), la SEC ID N°: 66 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 67 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 68 (L-CDR1), la SEC ID N°: 69 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 70 (L-CDR3).

En otra forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 75 (H-CDR1), la SEC ID N°: 76 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 77 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 78 (L-CDR1), la SEC ID N°: 79 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 80 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 85 (H-CDR1), la SEC ID N°: 86 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 87 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 88 (L-CDR1), la SEC ID N°: 89 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 90 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antigeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 95 (H-CDR1), la SEC ID N°: 96 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 97 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 98 (L-CDR1), la SEC ID N°: 99 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 100 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 105 (H-CDR1), la SEC ID N°: 106 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 107 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 108 (L-CDR1), la SEC ID N°: 109 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 110 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 115 (H-CDR1), la SEC ID N°: 116 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 117 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 118 (L-CDR1), la SEC ID N°: 119 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 120 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antigeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 125 (H-CDR1), la SEC ID N°: 126 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 127 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 128 (L-CDR1), la SEC ID N°: 129 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 130 (L-CDR3).

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región de unión a antígeno de la cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 135 (H-CDR1), la SEC ID N°: 136 (H-CDR2) y la SEC ID N°: 137 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de la cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 38 (L-CDR1), la SEC ID N°: 139 (L-CDR2) y la SEC ID N°: 140 (L-CDR3).

Un anticuerpo de la invención puede ser una IgG (p. ej., IgG^ lgG2, lgG3,lgG4), mientras que un fragmento de anticuerpo puede ser una Fab, Fab', F(ab')2 o scFv, por ejemplo. En consecuencia, un fragmento de anticuerpo de la invención puede ser, o puede contener, una región de unión a antígeno que se comporta de una o más formas como las que se describen en la presente memoria descriptiva.

La invención también está relacionada con secuencias de ácido nucleico aisladas, cada una de las cuales puede codificar un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, mencionado en lo que antecede que es específico de un epítopo de C4.4a. Los ácidos nucleicos de la invención son adecuados para la producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno recombinantes. Por tanto, la invención también se refiere a vectores y células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico de la invención.

Las composiciones de la invención se pueden usar para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Por tanto, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) de la invención y un soporte o excipiente del mismo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado con la indeseada presencia de células que expresan C4.4a. En una forma de realización preferida, el trastorno mencionado en lo que antecede es cáncer. Dicho procedimiento contiene las etapas de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención tal como se ha descrito o contemplado en la presente memoria descriptiva.

La invención también proporciona instrucciones para usar una biblioteca de anticuerpos para aislar uno o más miembros de dicha biblioteca que se une específicamente a C4.4a.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el resultado de un experimento de agrupación del epítopo realizado usando análisis de resonancia en plasmón superficial de tipo sándwich . Y corresponde a las unidades de resonancia, X es el tiempo en segundos. El chip se recubrió con uno de los anticuerpos de la invención. A indica el momento en el que se añadió C4.4a. B indica el momento en el que se añadió el otro anticuerpo de la invención. Los anticuerpos no pudieron unirse de forma simultánea a C4.4a, lo que indica solapamiento de al menos un epítopo.

La figura 2 proporciona datos de la unión de anticuerpos anti-C4.4a de la invención a C4.4a humano recombinante (a) y de ratón (b) en formato de lgG1 humano. Los valores de CE50 se determinaron mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 4. El M31-B01 (A) se une con una CE50 de 0,24 y 0,29 nM al C4.4a murino y humano, respectivamente. El M20 B02 S-A (B) se une con una CE50 de 0,3 y 0,38 nM al C4.4a murino y humano, respectivamente. X es log nM ; Y es Extinción a 360 nm.

La figura 3 proporciona datos sobre la unión específica de los anticuerpos de la invención a diferentes líneas celulares tumorales, bien transfeccionadas con hC4.4a como A549:hC4.4a (a) o líneas de células tumorales que expresan de forma nativa C4.4a, como NCI H322 (b) NCI H292 (c), H1975/BCRP (d) o BxPC3 (e). Los valores de CE50 para la unión de M31-B01 (círculos abiertos) y M20-D02 S-A (círculos cerrados) se resumen en (f). El isotipo lgG1 control (triángulos cerrados) no mostró ninguna unión a las células. Todos los datos se generaron mediante titulación con FACS. X es la concentración (log nM) e Y es la media geométrica de la fluorescencia (x103).

La Figura 4(a) proporciona datos sobre la internalización específica de anticuerpos anti- C4.4a marcados con fluoróforo en células A549:hC4.4a. La figura 4 (b) proporciona datos sobre células A549 no transfeccionadas como control negativo. A es M31-B01 (cuadrados cerrados); B es M20-D02 S-A (cuadrados abiertos); C es un isótopo control para hlgG1 (estrellas); X es el tiempo en minutos e Y es el recuento de gránulos/célula [*103]. Ambos anticuerpos anti-C4.4a se internalizan específica, eficiente y rápidamente en células tumorales portadoras de C4.4a.

La figura 4 (c) y (d) proporciona datos sobre la ¡nternalización de M31-B01 en células A549:hC4.4a. Tras 5 minutos (c) sólo se puede observar una débil tinción de la superficie celular. Después de 90 min se pueden observar claramente (d) endosomas intensamente coloreados que contienen el anticuerpo M31-B01 internalizado, que porta el pigmento de fluorescencia dependiente de pH, e indica una ¡nternalización eficaz.

La figura 5 proporciona datos sobre la unión del epítopo M31-B01 y M20-D02 S-A determinada mediante transferencia de tipo western. A) muestra un SDS-PAGE con tinción con azul Coomassie 250 de diferentes especies de C4.4a (calles 2+7 hC4.4a , calles 3+8 mC4.4a, calles 4+9 hC4.4a dominio S1-Fc-his6, calles 5+10 dominio hC4.4a S2-Fc-his6; las calles 1 , 6 y 11 contienen marcadores de peso molecular; las calles 2-5 contienen muestras no reducidas; las calles 6-10 contienen muestras reducidas) B) y C) muestran las respectivas transferencias de tipo western con la muestra de carga idéntica a la de A). B) se incubó con M31-B01 y C) se incubó con M20-D02 S-A como anticuerpo de detección. Ambos anticuerpos muestran tinción específica dependiente de reducción, lo que indica un epítopo conformacional. No obstante, ambos se unen al C4.4a de longitud completa humano y de ratón y al dominio S1 de C4.4a humano, pero no al dominio S2 de C4.4a humano.

La figura 6 proporciona datos sobre la inhibición de la proliferación de células tumorales in vitro por un anticuerpo de la invención (B01-3) determinada mediante la medición con un analizador xCELLigence. Las células A549:hC4.4a se co-incubaron con 100 nM de un anticuerpo control de isotipo lgG1 de no unión (A) o 100 nM de B01-3 (B) en pocilios sencillos de una placa E durante el tiempo indicado en las condiciones descritas en el ejemplo 15. X es el tiempo en horas, Y es la tasa relativa de proliferación celular. Las células A549:hC4.4a incubadas con B01-3 mostraron disminución de la proliferación celular respecto a la lgG1 control.

La figura 7 muestra las secuencias de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos anticuerpos que son específicos de C4.4a, o que tienen una elevada afinidad por ella, y pueden impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Los anticuerpos de la invención, que pueden ser humanos, quiméricos o humanizados, se pueden usar en muchos contextos, que se describen de un modo más completo en la presente memoria descriptiva.

Definiciones En el presente documento, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo "humano" se define como uno que no es quimérico (p. ej., no "humanizado") y que no procede de (por completo o en parte) una especie no humana. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, humano, puede derivar de un humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. En el presente documento, un "anticuerpo humano sintético" se define como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, toda o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en los análisis de secuencias de anticuerpo humano conocidas. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo humano, o un fragmento del mismo, se puede conseguir mediante, por ejemplo, análisis de una base de datos de secuencias de anticuerpo humano o de fragmento de anticuerpo humano y la creación de una secuencia polipeptídica utilizando los datos obtenidos de ellas. Otro ejemplo de un anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpo de origen humano (p. ej., estando dicha biblioteca basada en anticuerpos obtenidos de una fuente natural humana). Ejemplos de anticuerpos humanos incluyen anticuerpos tal como se describe en Sóderlind y col., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.

Un "anticuerpo humanizado", o fragmento de unión a antígeno del mismo, se define en el presente documento como uno que (i) deriva de una fuente no humana (p. ej., un ratón transgénico que porta un sistema inmunitario heterologo), en el que el anticuerpo está basado en una secuencia de línea germinal humana; (ii) en el que los aminoácidos de las regiones estructurales de un anticuerpo humano están parcialmente intercambiadas con las secuencias de aminoácidos humanas mediante ingeniería genética es o (iii) está injertado con CDR, en el que las CDR del dominio variable son de origen no humano, mientras que una o más estructuras del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (en su caso) es de origen humano.

En el presente documento, un "anticuerpo quimérico", o fragmento de unión a antígeno del mismo, se define como uno en el que los dominios variables derivan de un origen no humano y algunos o todos los dominios constantes derivan de un origen humano.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el término "monoclonal" indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos pequeños. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en cuando a que normalmente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas. El término "monoclonal" no debe interpretarse como que requiere producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento concreto. La expresión anticuerpo monoclonal incluye específicamente anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" un antígeno de interés, por ejemplo una diana antigénica polipeptídica asociada con un tumor (en el presente documento, C4.4a) es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo es útil como agente terapéutico en cuanto a que apunta a un tejido o célula que expresa el antígeno, y no presenta reacciones cruzadas significativas con otras proteínas o no presenta reacciones cruzadas significativas con proteínas que no sean ortólogas y variantes (p. ej., formas mutantes, variantes de corte y empalme o "formas truncadas de forma proteolítica) de la diana antigénica mencionada en lo que antecede. La expresión "reconoce específicamente" o "se une específicamente a" o es "específico de/para" un polipéptido concreto o un epítopo concreto en una diana polipeptídica concreta como se usa en la presente memoria descriptiva puede ser exhibida por, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una KD monovalente por el antígeno menor de aproximadamente 10"4 M, como alternativa menor de aproximadamente 10"5 M, como alternativa menor de aproximadamente 10'6 M, como alternativa menor de aproximadamente 10"7 M, como alternativa menor de aproximadamente 10~8 M, como alternativa menor de aproximadamente 10"9 M, como alternativa menor de aproximadamente 10"10 , como alternativa menor de aproximadamente 10"11 M, como alternativa menor de aproximadamente 10"12 M, o menor. Un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" un antígeno si dicho anticuerpo puede discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígeno(s) de referencia. En su forma más general, "unión específica", "se une específicamente a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, tal como se ha determinado, por ejemplo, de acuerdo con uno de los procedimientos siguientes. Dichos procedimientos comprenden, entre otros, Western blots, ELISA-, RIA-, ECL-, pruebas IRMA y análisis peptídicos. Por ejemplo se puede llevar a cabo un ensayo ELISA estándar. La puntuación se puede llevar a cabo mediante el desarrollo de color estándar (p. ej., anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano y bencidina de tetrametilo con peróxido de hidrógeno). La reacción en ciertos pocilios se puntúa mediante la densidad óptica, por ejemplo a 450 nm. El fondo típico (= reacción negativa) puede ser DO 0,1 ; la reacción positiva típica puede ser DO 1. Esto significa que la diferencia positivo/negativo es mayor de 5 veces, 10 veces, 50 veces y, preferentemente, mayor de 100 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando, no un único antígeno de referencia sino un grupo de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tal como polvo de lecho, BSA, transferrina o similares.

"Afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula y su pareja de unión. A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción : 1 entre los miembros de un par de unión (p. ej., un anticuerpo y un antígeno interacción). Normalmente, la constante de disociación "KD" se usa para describir la afinidad entre una molécula (tal como un anticuerpo) y su pareja de unión (tal como un antígeno), es decir lo estrecha que es la unión de un ligando a una proteína concreta. Las afinidades del ligando-proteína se ven influidas por interacciones intermoleculares no covalentes entre las dos moléculas. La afinidad se puede medir mediante procedimientos habituales conocidos en la técnica, incluidos los que se describen en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización, la "KD" o " valor de KD" de acuerdo con la presente invención se mide usando ensayos de resonancia en plasmón superficial con un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) de acuerdo con el Ejemplo 3. En resumen, los anticuerpos se inmovilizaron sobre un chip sensor C 5 a través de un reactivo de captura indirecta, Fe de IgG anti-humana. Los reactivos del "Human Antibody Capture Kit" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) se usaron tal como lo describe el fabricante. Aproximadamente 5000 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo monoclonal IgG (Fe) anti-humano de ratón se inmovilizaron por célula. Los anticuerpos anti C4.4 se inyectaron para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 600 UR. Se inyectaron varias concentraciones de C4.4a humano o murino sobre anticuerpos anti-C4.4a inmovilizados. Se generaron sensogramas tras corrección de células de referencia en línea, seguida por la resta de la muestra tampón. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó sobre la base de la proporción de las constantes de asociación (kon) y disociación (koff), obtenida ajustando los sensogramas con un modelo de unión 1:1 de primer orden usando Biacore Evaluation Software. Otros dispositivos adecuados son BIACORE(R)-2000, a BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), o ProteOn XPR36 instrument (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria descriptiva, se pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina, compuestas preferentemente por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), que normalmente estar interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (en la presente memoria descriptiva abreviada como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada puede comprender, por ejemplo, tres dominios CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (en la presente memoria descriptiva abreviada como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas que se denominan regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesto, normalmente, por tres CDR y por hasta cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi, por ejemplo en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión "Regiones determinantes de la complementariedad" (CDR; p. ej., CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión a antígeno. Normalmente, cada dominio variable tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1 , CDR2 y CDR3. Cada región determinante de la complementariedad puede comprender residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" tal como definen Kabat (p. ej., aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (p. ej., aproximadamente los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26- 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada (Chothia y Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). En algunos casos, una región determinante de la complementariedad puede incluir aminoácidos de una región CDR definida de acuerdo con Rabat y de un bucle hipervariable.

En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan [alfa], [delta], [epsilon], [gamma] y [mu], respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Tal como se usan en la presente memoria descriptiva, los anticuerpos son anticuerpos convencionalmente conocidos y fragmentos funcionales de los mismos.

Un "fragmento funcional" o "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina del presente documento se define como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (p. ej., una región variable de una IgG) que conserva la región de unión a antígeno. Normalmente, una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo se encuentra en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, por ejemplo las regiones CDR-1 , -2 y/o -3; no obstante, las regiones "estructurales" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión al antígeno, tal como proporcionando un armazón para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la región variable (VL) de la cadena ligera y 5 a 109 de la región variable de la cadena pesada (VH), más preferentemente los residuos de aminoácidos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH, y, particularmente preferidos, son las cadenas completas VL y VH (las posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de acuerdo con el documento WO 97/08320). Una clase preferida de inmunoglobulinas para usar en la presente invención es IgG.

"Fragmentos funcionales", o "fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno", de la invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos de dominio único (Dab), anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (scFv); y anticuerpos multiespecíficos, tal como bi y triespecíficos, formados a partir de fragmentos de anticuerpos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Se entiende que un anticuerpo distinto a un anticuerpo "multiespecífico" o "anticuerpo multifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. El F(ab')2 o Fab puede someterse a ingeniería para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CHi y CL.

Un anticuerpo de la invención puede derivar de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en secuencias de aminoácidos que se han aislado de los anticuerpos de un gran número de voluntarios sanos. Usando la tecnología n-CoDeR®' las CRD completamente humanas se recombinan en nuevas moléculas de anticuerpo. El procedimiento de recombinación único permite que la biblioteca contenga una variedad más amplia de anticuerpos de lo que podría haber creado de forma natural el sistema inmunitario humano.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, en el presente documento se definen "formas" diferentes de antígeno, por ejemplo C4.4a, como diferentes moléculas de proteínas resultantes de diferentes modificaciones traduccio nales y postraduccionales, tales como, entre otras, diferencias en el corte y empalme del tránscrito primario de C4.4a, diferencias en la glicosilación y diferencias en la escisión proteolítica postraduccional.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptores de células T. Los determinantes epitópicos normalmente constan de grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, o combinaciones de las mismas, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos "se unen al mismo epítopo" si se muestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitivo, mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica.

Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado de un componente de la célula que lo ha expresado. Componentes contaminantes de la célula son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En formas de realización preferidas, el anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95 % en peso del anticuerpo determinado mediante, por ejemplo, el método de Lowry, espectroscopia UV-Vis o mediante electroforesis en gel SDS-capilar (por ejemplo en un Caliper LabChip GXII, GX 90 o dispositivo Biorad Bioanalyzer) y en otras formas de realización preferidas más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos internos o en el extremo N de la secuencia de aminoácidos o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, con plata. Anticuerpo natural aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. No obstante, habitualmente el anticuerpo aislado se preparará en al menos una etapa de purificación.

La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "CCDA" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida a receptores gamma Fe (FcyR) presentes en ciertas células citotóxicas (p. ej., células NK, neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora del antígeno y, posteriormente, matan la célula diana, por ejemplo con citotoxinas. Para evaluar la actividad CCDA de un anticuerpo de interés se puede realizar un ensayo de CCDA in vitro, tal como el descrito en la patente de EE.UU. n° 5.500.362 o 5.821.337 o la patente de EE.UU. n° 6.737.056 (Presta). Células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen PBMC y células NK.

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase adecuada), que se unen a su antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemente se puede realizar un ensayo CDC, como el descrito en, por ejemplo Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Las variantes polipeptídicas con alteración en las secuencias de aminoácidos de la región Fe (polipéptidos con una variante de la región Fe) y mayor o menor unión a C1q se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6.194.551 Bl y el documento WO 1999/51642.

El término inmunoconjugado (denominado de forma intercambiable "conjugado anticuerpo-fármaco" o "CAF") se refiere a un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, fragmentos de los mismos) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Los inmunoconjugados se han usado para la liberación local de agentes citotóxicos, es decir fármacos que matan o que inhiben el crecimiento o la proliferación de células, en el tratamiento del cáncer (p. ej., Liu y col., Proc Nati. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)). Los inmunoconjugados permiten la liberación dirigida de un resto de fármaco en un tumor, y la acumulación intracelular del mismo, en la que la administración sistémica de fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad en células y/o tejidos normales. Las toxinas usadas en conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina. Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos, incluida la unión a tubulina, la unión a ADN o la inhibición de topoisomerasa.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia polinucleotídica o polipeptídica referencia, respectivamente, se define como el porcentaje de residuos de ácido nucleico o de aminoácido, respectivamente, en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir espacios, en caso necesario, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Las sustituciones conservadoras no se consideran parte de la identidad de secuencia. Se prefieren las alineaciones sin espacios. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede realizar de varias formas dentro de la experiencia en la técnica usando, por ejemplo, software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para alcanzar la alineación máxima a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando.

Anticuerpos de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para inhibir el crecimiento de células de cáncer positivas a C4.4a y la progresión de la enfermedad neoplásica proporcionando inmunoconjugados anti-C4.4a. Se proporcionan anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos y variantes de los anticuerpos y fragmentos, que se unen específicamente al polipéptido C4.4a de 29 kDa (SEC ID N°: 1 , o fragmentos de los mismos). En una forma de realización preferida, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o variantes de los mismos se unen de forma específica al dominio extracelular S1 del polipéptido C4.4a. En la presente memoria descriptiva, el polipéptido C4.4a se denomina "C4.4a".

En otra forma de realización, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se internalizan en una célula que expresa C4.4a tras la unión del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a la célula mencionada con anterioridad. En otra forma de realización, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten por la unión a C4.4a con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten por la unión a C4.4a humano con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten por la unión a C4.4a humano y de roedor con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, otra forma de realización preferida es una en la que el C4.4a de roedor es C4.4a de ratón.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada o ligera que son, al menos 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % idénticas a al menos una, preferentemente correspondiente, secuencia de CDR como se representa en la tabla 7, o que comprenden secuencias variables de cadena pesada o ligera que son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % ó 95 % idénticas a una secuencia de VH o VL representada en la tabla 7, respectivamente.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a al menos una, preferentemente correspondiente, secuencia de CDR de los anticuerpos M31-B01 o M20- D02 S-A, respectivamente.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las, preferentemente correspondientes, secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos M31- B01 o M20-D02 S-A, respectivamente.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden las secuencias de CDR2 y 3 de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de CDR2 y 3 de cadena pesada y a las secuencias de CDR1 y 3 de la cadena ligera que son al menos 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias CDR1 y 3 de la cadena ligera de los anticuerpos M31-B01. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden las secuencias de CDR2 y 3 de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de CDR2 y 3 de cadena pesada y a las secuencias de CDR1 y 3 de la cadena ligera que son al menos 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias CDR1 y 3 de la cadena ligera de los anticuerpos M20-D02 S-A.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una secuencia variable de cadena pesada que es al menos, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a una secuencia de VH divulgada en la tabla 7 o la tabla 4, preferentemente de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una secuencia variable de cadena ligera que es al menos, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a una secuencia de VL divulgada en la tabla 7 o la tabla 3, preferentemente de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias variables de cadena pesada y de cadena ligera que son, al menos, 50 %, 60 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a la secuencia VH y VL de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, respectivamente.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y ligera que se adaptan a las secuencias consenso de CDR derivadas, preferentemente correspondientes, de M31-B01 o M20-D02 S-A, tal como se representa en la tabla 15. Otra forma de realización preferida son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de CDR de cadena pesada que se adaptan a las correspondientes secuencias de CDR de cadena pesada tal como están representadas por las secuencias consenso SEC ID N°; 297 (CDR H1), SEC ID N°: 298 (CDR H2) y SEC ID N°: 299 (CDR H3), y las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las correspondientes secuencias de CDR de cadena ligera tal como se representa mediante las secuencias consenso SEC ID N°: 300 (CDR L1), SEC ID N°: 22 (CDR L2) y la SEC ID N°: 301 (CDR L3), o que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada de acuerdo con las correspondientes secuencias de CDR de cadena pesada tal como se representa mediante las secuencias consenso SEC ID N°: 302 (CDR H1), SEC ID N°: 303 (CDR H2) y SEC ID N°: 304 (CDR H3), y las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las correspondientes secuencias de CDR de cadena ligera tal como se representa mediante las secuencias consenso SEC ID N°: 305 (CDR L1), SEC ID N°: 306 (CDR L2) y la SEC ID N°: 307 (CDR L3).

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden al menos una preferentemente correspondiente, secuencia de CDR de cadena pesada y/o ligera tal como se divulga en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, o, preferentemente, de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis, preferentemente correspondientes, secuencias de CDR de cadena pesada y ligera tal como se divulga en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, o, preferentemente, de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias CDR1 , CDR2 o CDR3 de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR1 y CDR2 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias de CDR1 y CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR2 y CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR- de cadena pesada o ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla o la tabla 3 y 4. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 y CDR2 y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 , CDR2, CDR3 de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4. En una forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias CDR1 , CDR2 o CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR1 y CDR2 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR1 y CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4, las secuencias CDR1 , CDR2 y CDR4 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o la tabla 3 y 4. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias CDR de cadena pesada y ligera de un anticuerpo tal como se representan en la tabla 7 o la tabla 3 y 4.

En otra forma de realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden una secuencia de VH y/o VL divulgada en la tabla 7 o la tabla 3 y 4. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden la secuencia de VH y VL de un anticuerpo representada en la tabla 7 o la tabla 3 y 4.

En una forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención son monoclonales. En otra forma de realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención son humanos, humanizados o quiméricos.

Variantes de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno contemplados en la invención son moléculas en las que la actividad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión al antígeno para C4.4a se mantiene. En una forma de realización preferida, las variantes compiten por la unión a C4.4a con un anticuerpo representado en la tabla 7, preferentemente con el anticuerpo ?31-?0 o M20-D02 S-A.

A lo largo del presente documento se hace referencia a los siguientes anticuerpos preferidos de la invención: "M31-B01 ", "M20-D02 S-A", "M60-G03" y "M36-H02", "B01-3", "B01 -5", "B01-7", "B01-10", "B01-12", "D02-4", "D02-6", "D02-7", "D02-1 1 " y "D02-13".

M31-B01 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 41 (DNA)/SEC ID N°: 33 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 37 (ADN)/SEC ID N°: 29 (proteína).

M20-D02 S-A representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 42 (ADN)/SEC ID N°: 34 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 38 (ADN)/SEC ID N°: 30 (proteína).

M60-DG03 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 43 (ADN)/SEC ID N°: 35 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 39 (ADN)/SEC ID N°: 31 (proteína).

M36-H02 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 44 (ADN)/SEC ID N°: 36 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 40 (ADN)/SEC ID N°: 32 (proteína).

B01-3 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 53 (ADN)/SEC ID N°: 51 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 54 (ADN)/SEC ID N°: 52 (proteína).

B01-5 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 63 (ADN)/SEC ID N°: 61 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 64 (ADN)/SEC ID N°: 62 (proteína).

B01-7 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 73 (ADN)/SEC ID N°: 71 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 74 (ADN)/SEC ID N°: 72 (proteína).

B01-10 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 83 (ADN)/SEC ID N°: 81 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 84 (ADN)/SEC ID N°: 82 (proteína).

B01-12 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 93 (ADN)/SEC ID N°: 91 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 94 (ADN)/SEC ID N°: 92 (proteína).

D02-4 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 103 (ADN)/SEC ID N°: 101 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 104 (ADN)/SEC ID N°: 102 (proteína).

D02-6 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 113 (ADNJ/SEC ID N°: 111 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 114 (ADN)/SEC ID N°: 112 (proteína).

D02-7 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 123 (ADN)/SEC ID N°: 121 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 124 (ADN)/SEC ID N°: 122 (proteina).

D02-11 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 133 (ADN)/SEC ID N°: 131 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 134 (ADN)/SEC ID N°: 32 (proteína).

D02-13 representa un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 143 (ADN)/SEC ID N°: 141 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 144 (ADN)/SEC ID N°: 142 (proteína).

En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen una región de unión al antígeno que se une específicamente a y/o tiene una afinidad elevada por una o más regiones de C4.4a, cuya secuencia de aminoácidos se representa mediante la SEC ID N°: 1. Se dice que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tiene una "afinidad elevada" por un antígeno si la medición de la afinidad es menor de 250 nM (afinidad monovalente del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno). Preferentemente, un anticuerpo o región de unión a antígeno de la invención se puede unir a C4.4a con una afinidad inferior a 250 nM, preferentemente inferior a 100 nM, más preferentemente inferior a 25 nM e incluso más preferiblemente determinándose menos de 11 nM como afinidad monovalente a C4.4a humano. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo de la invención contra C4.4a puede ser de aproximadamente 220,0 nM o 1 nM (afinidad monovalente del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno).

La tabla 1 proporciona un resumen de las constantes de disociación y las tasas de disociación de anticuerpos representativos de la invención, determinadas mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) sobre C4.4a humano o murino inmovilizado directamente.

Tabla 1 : Constantes de disociación monovalentes para lgG1 anti-C4.4a mediante resonancia de lasmón superficial El formato de lgG1 se usó para la determinación de la afinidad basada en células mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) combinada con análisis Scatchard. La figura 3 f) indica la fuerza de la unión de anticuerpos IgG representativos en células tumorales A549 transfeccionadas que expresan C4.4a y células tumorales que expresan C4.4a de forma endógena. La Tabla 8 proporciona un resumen de la fuerza de la unión (CE50) de anticuerpos IgG representativos en células CHO-S:mC4.4a murinas transfeccionadas y células tumorales NCI H292 que expresan C4.4a.

Tabla 8: Valores CE50 determinados para lgG1 anti-C4.4a mediante FACS nd=no determinado Se dice que una lgG1 tiene una "afinidad elevada" por un antígeno si la medición de la afinidad mediante FACS es inferior a 100 nM (afinidad aparente de IgG). Preferentemente, un anticuerpo bivalente de la invención, o fragmento de unión a antígeno, puede unirse a C4.4a humano con una afinidad inferior a 100 nM, más preferentemente inferior a 50 nM, y todavía más preferentemente inferior a 10 nM. Otros preferidos son anticuerpos bivalentes que se unen a C4.4a con una afinidad inferior a 5 nM, y más preferentemente inferior a 1 nM, determinada como la afinidad aparente de una IgG, por el C4.4a humano. Por ejemplo, la afinidad aparente de un anticuerpo de la invención contra C4.4a puede ser de aproximadamente 4,3 nM o 0,03 nM sobre diferentes líneas celulares tumorales determinada mediante análisis FACS como se representa en la figura 3f.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se internaliza "de forma eficiente" cuando su tiempo de seminternaiización máxima (t ½) en células tumorales que expresa C4.4a es menor de 180 min o, más preferentemente, menor de 120 min y todavía más preferentemente menor de 90 min. Otros preferidos son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno con tiempos de seminternalización máxima (t ½) de 60 minutos o menores determinados mediante el protocolo descrito en el ejemplo 6, otros preferidos son menores de 50 minutos, o menores de 35 minutos. La Tabla 9 proporciona un resumen de los tiempos de internalización de anticuerpos representativos de la invención, determinado mediante el protocolo descrito en el ejemplo 6. Anticuerpos internalizables o fragmentos de unión a antígeno de la invención son adecuados como restos diana de un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF). Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es adecuado en un procedimiento in vitro o in vivo para liberar un compuesto, preferentemente un agente citotóxico, en una célula que expresa C4.4a Tabla 9: En algunas formas de realización, se aisla el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o derivado del mismo o ácido nucleico que codifica el mismo. Un componente biológico aislado (tal como una molécula de ácido nucleico o proteína, tal como un anticuerpo) es uno que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el componente se produce de forma natural, por ejemplo otros ADN y ARN extracromosómicos y cromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar Sambrook y col., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) y Robert K. Scopes y col. 1994 Protein Purification, - Principies and Practice, Springer Science and Business Media LLC. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.

Generación de anticuerpos Para aislar anticuerpos monoclonales humanos específicos de C4.4a de alta afinidad se usó una biblioteca de expresión en fagos de anticuerpos N-CoDeR completamente mediante una combinación de inmunofijaciones de células enteras y de proteínas y a través del desarrollo de herramientas específicas. Estas herramientas y procedimientos incluyen una línea celular recombinante que expresa C4.4a humano, una línea celular que expresa C4.4a murino, C4.4a recombinante humano y murino, y el desarrollo de procedimientos de inmunofijación y ensayos de detección selectiva capaces de identificar anticuerpos que se unen, de forma preferencial, al C4.4a expresado en la superficie celular y que' presentan reactividad cruzada con el C4.4a murino.

Mediante una combinación de tres enfoques no convencionales en la tecnología de expresión en fagos (PDT) se desarrollaron anticuerpos frente al marcador de superficie celular del C4.4a. En primer lugar se construyeron líneas celulares recombinantes que expresan la forma unida a la membrana del C4.4a humano y de ratón mediante transfección estable de células CHO-A y células tumorales A549 con un plásmido que codifica la forma anclada mediante GPI de longitud completa de la proteína humana o de ratón (SEC ID N°: 3) y (SEC ID N°: 4) respectivamente, para dar las líneas celulares CHO-S:hC4.4a humana, CHO-S:mC4.4a murina y A549:hC4.4a humana. En segundo lugar, se realizaron selecciones de superficie celular con las últimas líneas celulares recombinantes y la línea celular de cáncer de mama MCF-7. Se incluyó preadsorción con células CHO-S p células A549 no transfeccionadas para evitar la selección de fragmentos Fab que se unen a epítopos de las células parentales. Se realizaron selecciones adicionales con C4.4a humano, purificado, soluble, recombinante con C4.4a murino, purificado, soluble recombinante. En tercer lugar, se desarrollaron procedimientos de detección selectiva que permitieron la detección selectiva sucesiva de los resultados de los fagos obtenidos en la inmunofijación con células A549:hC4.4a enteras así como con células CHO-S:hC4.4a. La combinación de estos procedimientos específicos permitió el aislamiento de los anticuerpos únicos "M31-B01 ", "M20-D02 S-A", " 60-G03" y "M36-H02".

Estos anticuerpos únicos se caracterizaron además mediante su afinidad de unión en ELISAS, mediante unión BIAcore a C4.4a soluble, mediante su capacidad para reconocer diferentes epítopos sobre C4.4a soluble y mediante su capacidad para la reacción cruzada con C4.4a murino evaluado mediante BIAcore y FACS, y su capacidad para internalizarse en un ensayo basado en células. Los ensayos de internalización midieron de forma cuantitativa la internalización de anticuerpos anti-C4.4a marcados con fluorescencia de un modo resuelto en el tiempo.

Variantes peptídicas Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas que se proporcionan en la presente memoria descriptiva. En su lugar, la invención también abarca variantes de estos polipéptidos. Con referencia a la presente divulgación y tecnologías y referencias convencionalmente disponibles, el experto será capaz de preparar, analizar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos divulgados en la presente memoria descriptiva, mientras aprecia que las variantes que tienen la capacidad de unirse a C4.4a entran dentro del alcance de la presente invención.

Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tiene al menos una región determinante de la complementariedad (CRD) (hipervariable) alterada y/o dominio/posición estructural (FR) (variable), vis-á-vis una secuencia peptídica divulgada en la presente memoria descriptiva. Para ilustrar mejor este concepto a continuación se presenta una breve descripción de la estructura del anticuerpo.

Un anticuerpo está compuesto por dos cadenas peptídicas, en la que cada una contiene un (cadena ligera) o tres (cadena pesada) dominios constantes y una región variable (VL, VH), la última de ellas está, en cada caso, formada por cuatro regiones FR y tres CDR intercaladas. El sitio de unión a antígeno está formado por una o más CDR, aunque las regiones FR proporcionan el marco estructural de las CDR y, por tanto, desempeñan un papel importante en la unión al antígeno. Alterando uno o más residuos de aminoácidos en una región CDR o FR, el experto generará de forma rutinaria secuencias de anticuerpos mutadas o diversificadas, que se pueden someter a detección selectiva frente al antígeno, para, por ejemplo, nuevas o mejores propiedades.

Las tablas 3 (VL) y 4 (VH) delinean las regiones CDR y FR para ciertos anticuerpos de la invención y comparan aminoácidos en una posición dada entre sí y con las correspondientes secuencias consenso.

Tabla 3: Secuencias VL Secuencias VL 20-D02 S-A (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSS VGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV M31-B01 (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYWHWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGV B01- ( 1 ) ESVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYVVHWYQQLPGTAP LIiIYD N RPSGV BOl- (1) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYVVHWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGV BOl- (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYVVHWYQQLPGTAPKLLI DNNKRPSGV BOl-10 (1) QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYWHWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGV B01-12 (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGAGYWHWYQQLPGTAPKLLIYDNNQRPSGV D02- (1) ESVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV D02- (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV consenso (.1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV D02-13 (1) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGS -NPVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGV consensi (1) QSVLTO.PPSASGTPGQRVTISCXXXXXXXXXXXXXXWYQQLPGTAPKLLIYXXXXXXXGV LCDR1 -LCDR2- M20-D02 S-A (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDRLNGWVFGGGTKLTVLGQ M31-B01 (61) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDRLNGPVFGGGTKLTVLGQ B01-3 (61) PDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCAAWDDRLNGPVFGGGTKLTVLGQ B01-5 (61) PDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCAAYDDSLSGPVFGGGTKLTVLGQ BQ1-7 (61) PDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCAAFDDRLNGPVFGGGT LTVLGQ nm -i n (61) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAYDDSLSGPVFGGGTKLTVLGQ consenso (61) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAFDDRLSGPVFGGGTKLTVLGQ D02-4 (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEñDYYCAAWDDRLNGWGFGGGTKLTVLGQ D02-6 (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDRLSGWAFGGGTKLTVLGQ D02-7 (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWAFGGGTKLTVLGQ D02-11 (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDRLSGWGFGGGTKLTVLGQ D02-13 (60) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWAFGGGTKLTVLGQ (58) PDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYXXXXXXXXXXXXFGGGTKLTVLGQ LCDR3 Tabla: 4: Secuencias VH Secuencias VH M20-D02 S-A (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYQMTWIRQTPG GLEWVSGVSWNGARTH M31 BOl (1) EVQIjLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIY BOl-3 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIY BOl-S (1) EVQLLESGGGLVQPGGSIjRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIY B01-7 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIY BOl-lO (1) EVQIjLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISESGSTIY BOl-12 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSAWMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSSTY D02 -4 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYQMTWIRQTPGKGLEWVSGISWNGGSTH D02-6 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYQMTWIRQTPGKGLEWVSGISWNGGSTH D02 - 7 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYQMTWIRQTPGKGLEWVSGISWNGGSTH consenso (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYQ TWIRQTPGKGLEWVSGISWNGGSTH D02-13 (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYQMTWIRQAPGKGLEWVSGISWNGGSTH consensus (1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTXXXXXXXXVRQAPGKGLEWXXXXXXXXXXXX --HCDR1- HCDR2- M20-D02 S (60) YADSVKGRFTISRDNSKN^YLQMNSI-RAEDTAVYYCAKGDYLVYSAYYFDSWGQGTLVTVTS M31 BOl (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG LWAFDYWGQGTLVTVTS BOl-3 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG LWAFDYWGQGTLVTVSS BOl - 5 (60) YADSV G FTISHDNS N LYLQMMSLEASDTAVYYCAREG LWAFDYWGQGTL.VTVSS B01-7 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSI-RAEDTAVYYCAREG L AFDKWGQGTLVTVSS BOl-lO (60) ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG LWAFDYWGQGTLVTVSS (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG LWAFDKWGQGTLVTVSS consenso (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLVYSAYYFDSWGQGTLVTVSS D02-6 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLVYSSYYFKSWGQGTLVTVSS D02-7 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLVYKSYYFKSWGQGTLVTVSS D02-11 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLVYSSYYFKSWGQGTLVTVSS D02-13 (60) YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYLVYKSYYFKSWGQGTLVTVSS consensúa (60) XXXXXXXXFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCXXXXXXXXXXXXXXXWGQGTLVTVTS HCDR3 Otra forma de realización preferida de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que las secuencias de CDR se seleccionan tal como se muestra en la tabla 7.

Otra forma de realización preferida de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el que las secuencias VH y VL se seleccionan como se muestra en la tabla 7. El trabajador experto puede usar los datos en las Tablas 3, 4 y 7 para diseñar variantes peptídicas que están dentro del alcance de la presente invención. Se prefiere fabricar las variantes modificando los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR; asimismo, una variante podría tener una o más regiones estructurales alteradas. También se pueden producir alteraciones en las regiones estructurales. Por ejemplo, un dominio FR peptídico podría alterarse cuando exista una desviación en un residuo en comparación con una secuencia de línea germinal.

Con referencia a una comparación de los nuevos anticuerpos con las correspondientes secuencias consenso, que se indican en las Tablas 3 y 4 los residuos candidatos que se pueden modificar incluyen, por ejemplo, el residuo 42 de la región variable de la cadena pesada de M20-D02 S-A en comparación con VHIII del gen DP47. Como alternativa, el experto podría realizar el mismo análisis mediante comparación de las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente memoria descriptiva con las secuencias conocidas de la misma clase de estos antibióticos, usando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik, A., y col. JMB 2000, 296:57-86.

Además, se pueden obtener variantes usando un anticuerpo como punto de partida para optimización mediante diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en el anticuerpo, preferentemente residuos de aminoácidos en una o más CDR, y mediante detección selectiva de la recolección resultante de variantes de anticuerpos para variantes con propiedades mejoradas. Particularmente preferida es la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en la CDR3 de VL y/o VH. La diversificación se puede realizar mediante la síntesis de una colección de moléculas de ADN usando tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) (Virnekás, B, y col., Nucí. Acids Res. 1994, 22: 5600.). Anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen moléculas con modificaciones/variaciones que incluyen, entre otras, modificaciones que conducen a una semivida alterada (p. ej., modificación de la parte Fe o fijación a otras moléculas adicionales tales como PEG) o actividad CCDA o CDC alterada.

Variantes conservadoras de aminoácidos Se pueden fabricar variantes polipeptídicas que conserven la estructura molecular global de una secuencia peptídica del anticuerpo descrita en la presente memoria descriptiva. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, el experto reconocerá algunas sustituciones racionales. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, es decir "sustituciones conservadoras", por ejemplo sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos implicados.

Por ejemplo, (a) aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanlna, triptófano y metionina; (b) aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y (d) aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Normalmente, las sustituciones se pueden realizar dentro de los grupos (a)-(d). Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse una por otra sobre la base de su capacidad para alterar las a-hélices. De igual forma, ciertos aminoácidos, tales como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico, glutamina, histidina y lisina, se encuentran con mayor frecuencia en a-hélice, mientras que valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano y treonina se encuentran con más frecuencia plegados en láminas ß. Glicina, serina, ácido aspártico, asparagina y prolina normalmente se encuentran en giros. Algunas sustituciones preferidas pueden encontrarse entre los grupos siguientes: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L e I. Dado el código genético y las técnicas de AND recombinante y sintético, el científico experto puede fabricar fácilmente AND que codifica las variantes de aminoácidos conservadoras. En un ejemplo concreto, la posición de aminoácido 3 en las SEC ID NoS: 33-36 se puede cambiar de una Q a una E.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "identidad de secuencia" entre dos secuencias polipeptídicas indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. "Homología de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se refiere a moléculas de ADN que codifican un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención. Estas secuencias incluyen, entre otras, las moléculas de ADN expuestas en las SEC ID 37-44, 53, 54, 63, 64, 73, 74, 83, 84, 93, 94, 103, 104, 1 13, 1 14, 123, 124, 133, 134, 143, 144 y 308 - 345.

Las moléculas de ADN de la invención no están limitadas a las secuencias divulgadas en la presente memoria descriptiva, pero también incluyen variantes de las mismas. Variantes de ADN dentro de la invención pueden describirse por referencia a sus propiedades físicas en hibridación. El experto reconocerá que se puede usar ADN para identificar su complementaria y, dado que el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, usando técnicas de hibridación de ácido nucleico. También se reconocerá que la hibridación se puede producir con una complementariedad inferior al 100 %. No obstante, dada una adecuada elección de condiciones, las técnicas de hibridación se pueden usar para diferenciar entre secuencias de ADN basadas en su relación estructural con una sonda concreta. Para una guía sobre dichas condiciones véase Sambrook y col., 1989 ant. y Ausubel y col., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

La similitud estructural entre dos secuencias polinucleotídicas se puede expresar como una función de la "rigurosidad" de las condiciones en las que las dos secuencias hibridarán entre sí. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "rigurosidad" se refiere a la medida en la cual las condiciones no favorecen la hibridación. Las condiciones rigurosas son fuertemente desfavorables para la hibridación y sólo las moléculas más estructuralmente relacionadas hibridarán entre sí en dichas condiciones. Por el contrario, las condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que muestran un menor grado de relación estructural. Por tanto, la rigurosidad de la hibridación se correlaciona directamente con las relaciones estructurales de dos secuencias de ácido nucleico. Las siguientes relaciones son útiles en la correlación de la hibridación y la relación (en las que Tf es la temperatura de fusión de un dúplex de ácido nucleico): a. Tf= 69,3 + 0,41 (G+C)% b. La Tf del ADN dúplex disminuye en 1 °C con cada incremento del 1 % en el número de pares de bases apareados incorrectamente. c. (Tf)u2 - (Tf),! = 18,5 Iog10p2/ µ1 en la que µ1 y µ2 son las fuerzas iónicas de dos soluciones.

La rigurosidad de la hibridación es una función de muchos factores, incluidos la concentración de ADN global, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que rompen los puentes de hidrógeno. Los factores que estimulan la hibridación incluyen concentraciones elevadas de ADN, fuerzas iónicas altas, temperaturas bajas, mayor tamaño de la sonda y la ausencia de agentes que rompen los puentes de hidrógeno. Normalmente, la hibridación se realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".

En primer lugar, en la fase de unión, la sonda se une a la diana en condiciones que favorecen la hibridación. Normalmente, la rigurosidad se controla en esta etapa alterando la temperatura. Para esta elevada rigurosidad, la temperatura normalmente está entre 65 °C y 70 °C, a menos que se usen sondas oligonucleotídicas cortas (< 20 nt). Una solución de hibridación representativa comprende 6X SSC, 0,5 % SDS, 5X solución de Denhardt y 100 pg de ADN transportador inespecífico. Véase Ausubel y col., sección 2.9, suplemento 27 (1994). Por supuesto, se conocen muchas condiciones tampón diferentes, aunque funcionalmente equivalentes. Cuando el grado de relación es menor se puede escoger una temperatura menor. Las temperaturas de unión de baja rigurosidad están entre aproximadamente 25 °C y 40 °C. La rigurosidad media está entre al menos aproximadamente 40 °C a menos de aproximadamente 65 °C. La rigurosidad alta es de, al menos, aproximadamente 65 °C.

En segundo lugar, el exceso de sonda se elimina mediante lavado. Es en esta fase en la que se suelen aplicar las condiciones más rigurosas. Por tanto, es esta etapa "de lavado" la más importante para determinar la relación mediante hibridación. Normalmente, las soluciones de lavado contienen concentraciones menores de sales. Un ejemplo de solución de rigurosidad media contiene 2X SSC and 0,1 % SDS. Una solución de lavado de alta rigurosidad contiene el equivalente (en fuerza iónica) de menos de aproximadamente 0,2X SSC, con una solución rigurosa preferida que contiene aproximadamente 0,1 X SSC. Las temperaturas asociadas con varias rigurosidades son las mismas que las comentadas en lo que antecede para la "unión". Asimismo, la solución de lavado normalmente se sustituye una serie de veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones típicas de lavado de alta rigurosidad comprenden lavar dos veces durante 30 minutos a 55 °C y tres veces durante 15 minutos a 60 °C.

Una forma de realización de la invención es una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica (i) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención, las secuencias de CDR como se representan en la tabla 7 o (ii) las secuencias variables de cadena ligera y pesada como se representan en la tabla 7, o (iii) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención, las secuencias de CDR como se representan en la tabla 7 o las secuencias variables de la cadena ligera y pesada como se representa en la tabla 7.

En un ejemplo concreto de una variante de la invención, la posición 7 del ácido nucleico en las SEC ID N°s: 37-40 o la posición 16 de las SEC ID NoS: 41-44 se puede sustituir de una C a una G, de modo que se cambia el codón de CAC a GAG.

Variantes funcionalmente equivalentes Otra clase más de variantes de ADN dentro del alcance de la invención puede describirse con referencia al producto que codifican. Estos polinucleótidos funcionalmente equivalentes se caracterizan por el hecho de que codifican las mismas secuencias peptídicas que se encuentran en las SEC ID NoS: 5-36, 45-50, 55-60, 65-70, 75-80, 85-90, 95-100, 105-110, 115-120, 125-130, 135-140, debido a la degeneración del código genético.

Se ha reconocido que las variantes de las moléculas de ADN que se proporcionan en la presente memoria descriptiva se pueden fabrican de varias formas diferentes. Por ejemplo, se pueden fabricar como ADN completamente sintéticos. Los procedimientos de sintetizar de forma eficiente oligonucleótidos en el intervalo de 20 a aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel y col., sección 2.11 , suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos solapantes se pueden sintetizar y ensamblar de un modo comunicado por primera vez por Khorana y col., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel y coi, ant, Sección 8.2. Preferentemente, los ADN sintéticos se diseñan con sitios de restricción convenientes sometidos a ingeniería en los extremos 5' y 3' del gen para facilitar la clonación en un vector adecuado.

Como se ha indicado, un procedimiento de generar variantes es comenzar con uno de los ADN divulgados en la presente memoria descriptiva y, después, realizar mutagénesis dirigida por sitio. Véase Ausubel y col., ant., sección 8, suplemento 37 (1997). En un procedimiento típico, un ADN diana se clona en un vehículo bacteriófago de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se aisla e híbrida con un oligonucleótido que contiene la(s) alteraciones nucleotídicas deseadas. Se sintetiza la hebra complementaria y el fago de doble cadena se introduce en un huésped. Alguna de la progenie resultante contendrá el mutante deseado, que se puede confirmar usando secuenciación de ADN. Además, están disponibles varios procedimientos que incrementan la probabilidad de que el fago progenia sea el mutante deseado. Estos procedimientos son bien conocidos para los expertos en el campo y hay comercialmente disponibles kits para generar dichos mutantes.

Constructos y expresión de ADN recombinante La presente invención además proporciona constructos de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias nucleotídicas de la presente invención. Los constructos recombinantes de la presente invención se usan en relación con un vector, tal como un plásmido, fagemido, fago o vector vírico, en el que se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención.

Un anticuerpo, porción de unión a antígeno, o derivado del mismo que se proporciona en la presente memoria descriptiva se puede preparar mediante expresión recombinante de secuencias de ácido nucleico que codifican cadenas ligeras y pesadas o porciones de las mismas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo, porción de unión a antígeno o derivado del mismo de forma recombinante, una célula huésped se puede transfeccionar con uno o más vectores de expresión recombinante portadores de fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y/o pesadas o porciones de las mismas de modo que las cadenas ligeras y pesadas se expresen en la célula huésped. Las metodologías de ADN recombinante estándar se usan para preparar y/u obtener ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras, para incorporar estos ácidos nucleicos en vectores de expresión recombinantes y para introducir los vectores en células huésped, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. y col. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la patente de EE.UU. n° 4.816.397 de Boss y col.

Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican regiones variables de las cadenas pesadas y/o ligeras se pueden convertir en, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican cadenas de anticuerpo de longitud completa, fragmentos Fab o en scFv. El fragmento de ADN que codifica VL o VH se puede unir de forma operativa (de modo tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN estén en el marco) a otro fragmento de ADN que codifica, por ejemplo, una región constante de anticuerpo o un ligador flexible. Las secuencias de las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera humanas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publicación n° 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR estándar.

Para crear una secuencia de polinucleótidos que codifica un scFv, los ácidos nucleicos que codifican VH y VL se pueden unir de forma operativa a otro fragmento que codifica un ligador flexible de modo que las secuencias VH y VL se puedan expresar en forma de una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el ligador flexible (véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; Huston y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos se pueden usar porciones de unión a antígeno o derivados de los mismos se pueden usar procedimientos estándar de expresión de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Por ejemplo, se puede insertar ADN que codifica el polipéptido deseado en un vector de expresión que después se transfecciona en una célula huésped adecuada. Las células huésped adecuadas son células eucariotas y procariotas. Ejemplos de células huésped procariotas son, por ejemplo, bacterias, ejemplos de células huésped eucariotas son células de levadura, de insecto o de mamífero. En algunas formas de realización, los ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras se insertan en vectores distintos. En otras formas de realización, los ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras se insertan en el mismo vector. Se entiende que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, está afectado por factores tales como la elección de la célula huésped, el nivel de expresión de la proteína deseada y si la expresión es constitutiva o inducible.

Expresión bacteriana Se construyen vectores de expresión útiles para uso bacteriano mediante la inserción de una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionares y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y, si de desea, para proporcionar la amplificación dentro del huésped. Entre los huéspedes procariotas adecuados se incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus.

Los vectores bacterianos pueden ser por ejemplo, vectores basados en bacteriófagos, plásmidos o fagemidos. Estos vectores pueden contener un marcador seleccionare y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles que normalmente contienen elementos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tras la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se desreprime/induce mediante medios adecuados (p. ej., cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Normalmente las células se recogen mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el;extracto bruto resultante se conserva para su posterior purificación.

En los sistemas bacterianos, de forma ventajosa se pueden seleccionar numerosos vectores de expresión en función del uso previsto para la proteína que se. exprese. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de anticuerpos o para la detección selectiva en bibliotecas peptídicas, pueden ser deseables, por ejemplo, vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de productos proteicos de fusión que se purifiquen fácilmente. Anticuerpos de la presente invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen productos naturales, productos de procedimientos químicos sintéticos y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota, incluidas, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, preferentemente de células de E. coli.

Expresión y purificación en mamíferos Secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), el virus 40 de simio (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (p. ej., el promotor tardío principal del adenovirus (AdMPLP) y polioma. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales, y de sus secuencias, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.168.062 de Stinski, la patente de EE.UU. N°. 4.510.245 de Bell y col. y la patente de EE.UU. N° 4.968.615 de Schaffner y col. Los vectores de expresión recombinante también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores seleccionares (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, de Axel y col.) Marcadores seleccionabas adecuados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia a metotrexato y el gen neo confiere resistencia a G418.

La transfección del vector de expresión en una célula huésped se puede llevar a cabo usando técnicas estándar, tales como electroporación, precipitación en fosfato cálcico, lipofección y DEAE-dextrano, lipofección o transfección mediada por policationes.

Células huésped de mamífero adecuadas para expresar los anticuerpos, porciones de unión a antígeno o derivados de los mismos que se proporcionan en la presente memoria incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionare de DHFR, por ejemplo como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En algunas formas de realización, el vector de expresión está diseñado de forma que la proteína expresada se secreta en el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. La transfección//expresión transitoria de anticuerpos puede conseguirse, por ejemplo, siguiendo los protocolos de Durocher y col (2002) Nucl.Acids Res. Vol 30 e9. La transfección//expresión estable de anticuerpos puede conseguirse, por ejemplo, siguiendo los protocolos del sistema UCOE (T. Benton y col.). (2002) Cytotechnology 38: 43-46).

Los anticuerpos, porciones de unión a antígeno o derivados de los mismos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purificación proteica estándar.

Los anticuerpos de la invención o un fragmento de unión a antígeno de los mismos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, incluidos, entre otros, precipitación en sulfato amónico o etanol, extracción acida, cromatografía en proteína A, cromatografía en proteína G, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía en lectina. La cromatografía de líquidos de alto rendimiento ("HPLC") también se puede emplear para purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo los Capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno incorporado en la presente memoria descriptiva en su totalidad por referencia.

Anticuerpos de la presente invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen productos naturales, productos de procedimientos químicos sintéticos y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota, incluidas, por ejemplo, células de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero, preferentemente de células de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede estar glicosilado o no glicosilado, prefiriéndose que esté glicosilado. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook, ant., Secciones 17.37-17.42; Ausubel, ant., Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.

Procedimientos terapéuticos Los procedimientos terapéuticos implican administrar a un sujeto que necesite tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo contemplado por la invención. En el presente documento, una cantidad "terapéuticamente eficaz" se define como la cantidad de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que es suficiente cantidad para eliminar las células positivas a C4.4a en un área tratada de un sujeto, bien en forma de monodosis o de acuerdo con un régimen de múltiples dosis, solo o en combinación con otros agentes, lo que produce el alivio de una afección adversa, y que, además, dicha cantidad es toxicologicamente tolerable. El sujeto puede ser un animal humano o no humano (p. ej., conejo, rata, ratón, perro, mono u otro primate de orden menor).

Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, podría administrarse de forma conjunta con medicamentos conocidos y, en algunos casos, el anticuerpo podría estar modificado. Por ejemplo, un anticuerpo podría estar conjugado con un agente citotóxico o radioisótopo para potencialmente aumentar adicionalmente la eficacia.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar como único agente farmacéutico o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales en los que la combinación no produce efectos adversos inaceptables. Esta terapia de combinación incluye la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales, así como la administración de un anticuerpo de la invención y cada agente terapéutico en su propia formulación de dosificación farmacéutica aparte. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención y un agente terapéutico se pueden administrar al paciente conjuntamente en una composición de dosificación oral individual tal como un comprimido o cápsula, o cada agente se puede administrar en formulaciones de dosificación separada.

Cuando se usan formulaciones de dosificación distintas, un anticuerpo de la invención y uno o más agentes terapéuticos pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo (p. ej., de forma concurrente) o a tiempos separados escalonados (p. ej., secuencialmente).

En particular, un anticuerpo de la presente invención se puede usar en combinación fija o separada con otros agentes antitumorales tales como agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes antitumorales derivados de plantas, agentes hormonales de terapia, inhibidores de topoisomerasa, derivados de camptotecina, inhibidores de quinasa, fármacos objetivo, anticuerpos, interferones y/o modificadores de la respuesta biológica, compuestos antiangiogénicos y otros fármacos antitumorales. A este respecto, la siguiente es una relación no limitante de ejemplos de agentes secundarios que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la presente invención: Los agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, altretamina, apaziquona, brostalicina, bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, mafosfamida, bendamustina y mitolactol; los compuestos alquilantes coordinados de platino incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, carboplatino, eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, oxaliplatino y satraplatino; Los anti-metabolitos incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ribosido de 6-mercaptopurina, mercaptopurina, 5-fluorouracilo sólo o en combinación con leucovorina, tegafur, doxifluridina, carmofur, citarabina, octofosfato de citarabina, enocitabina, gemcitabina, fludarabina, 5-azacitidina, capecitabina, cladribina, clofarabina, decitabina, eflornitina, etinilcitidina, arabinosido de citosina, hidroxiurea, melfalán, nelarabina, nolatrexed, ocfosfito, premetrexed disódico, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, triapina, trimetrexato, vidarabina, vincristina y vinorelbina; Agentes de terapia hormonal incluyen, pero no se limitan a, exemestano, Lupron, anastrozol, doxercalciferol, fadrozol, formestano, inhibidores de la 11-beta hidroxiesteroide deshidrogenasa 1 , inhibidores de la 17-alfa hidroxilasa/17,20 Nasa tales como acetato de abiiraterona, inhibidores de la 5-alfa reductasa tales como finasterida y epristerida, anti-estrógenos tales como tamoxifeno citrato y fulvestrant, Trelstar, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol, anti-andrógenos tales como bicalutamida, flutamida, mifepristona, nilutamida, Casodex, y agentes anti-progesterona y combinaciones de los mismos; Las sustancias antitumorales derivadas de plantas incluyen, por ejemplo, las seleccionadas de inhibidores mitóticos, por ejemplo epotilonas tales como sagopilona, ixabepilona y epotilona B, vinblastina, vinflunina, docetaxel y paclitaxel; Los agentes que inhiben la topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a, aclarrubicina, doxorrubicina, amonafida, belotecán, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, diflomotecán, irinotecán, topotecán, edotecarina, epimbicina, etopósido, exatecán, gimatecán, lurtotecán, mitoxantrona, pirambicina, pixantrona, rubitecán, sobuzoxano, taflupósido y combinaciones de los mismos; Las sustancias inmunológicas incluyen interferones tales como interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a e interferón gamma-n1 , y otros agentes potenciadores de la inmunidad tales como L19-IL2 y otros derivados de IL2, filgrastim, lentinán, sizofilán, TheraCys, ubenimex, aldesleucina, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazina, daclizumab, denileucina, gemtuzumab, ozogamicina, ibritumomab, ¡miquimod, lenograstim, lentinán, vacuna de melanoma (Corixa), molgramostim, sargramostim, tasonermin, tecleucina, timalfasina, tositu-momab, Vimlizin, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab, y Provenge; Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa de organismos vivos o las respuestas biológicas tales como la supervivencia, el crecimiento o la diferenciación de células de tejidos para dirigirlas para que tengan actividad antitumoral; tales agentes incluyen, por ejemplo, krestin, lentinán, sizofirán, picibanilo, ProMune y ubenimex; Los compuestos antiangiogénicos incluyen, pero no se limitan a, acitretina, aflibercept, angiostatina, aplidina, asentar, axitinib, bevacizumab, brivanib alaninat, cilengtida, combretastatina, endostatina, fenretinida, halofuginona, pazopanib, ranibizumab, rebimastat, recentína, regorafenib, removab, revlimid, sorafenib, esqualamina, sunitinib, telatinib, talidomida, ucraína, vatalanib y vitaxin; Los anticuerpos incluyen, pero no se, limitan a, trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, rituximab, ticilimumab, ipilimumab, lumiliximab, catumaxomab, atacicept, oregovomab y alemtuzumab; Los inhibidores de VEGF, tales como, por ejemplo, sorafenib, regorafenib, bevacizumab, sunitinib, recentín, axitinib, aflibercept, telatinib, brivanib alaninato, vatalanib, pazopanib y ranibizumab; Inhibidores de EGFR (HER1) tales como, por ejemplo, cetuximab, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib y Zactima; Inhibidores de HER2 tales como, por ejemplo, lapatinib, tratuzumab y pertuzumab; Inhibidores de mTOR tales como, por ejemplo, temsirolimus, sirolimus/rapamicina y everolimus; Inhibidores de c-Met; Inhibidores de PI3K y AKT; Inhibidores de CDK tales como roscovitina y flavopiridol; Inhibidores de los puntos de comprobación del ensamblaje del uso y agentes anti-mitóticos dirigidos tales como inhibidores de PLK, inhibidores de Aurora (p.ej., Hesperadina), inhibidores de la cinasa del punto de comprobación e inhibidores de KSP; Inhibidores de HDAC tales como, por ejemplo, panobinostat, vorinostat, MS275, belinostat y LBH589; Inhibidores de HSP90 y HSP70; Inhibidores de proteasoma tales como bortezomib y carfilzomib; Inhibidores de la serina/treonina cinasa, incluidos inhibidores de MECK e inhibidores de Raf tales como sorafenib; Inhibidores de farnesiltransferasa tales como, por ejemplo, tipifarnib; Ihibidores de la tirosina cinasa, incluidos, por ejemplo, dasatinib, nilotibib, regorafenib, bosutinib, sorafenib, bevacizumab, sunitinib, cediranib, axitinib, aflibercept, telatinib, mesilato de imatinib, alaninato de brivanib, pazopanib, ranibizumab, vatalanib, cetuximab, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib, lapatinib, tratuzumab, pertuzumab, e inhibidores de c-Kit; Agonistas del receptor de vitamina D; Inhibidores de proteína Bcl-2 tales como obatoclax, oblimersen sodio y gossypol; Grupo de 20 antagonistas de receptores de diferenciación tales como, por ejemplo, rituximab; Inhibidores de reductasa de ribonucleótidos tales como, por ejemplo, gemcitabina; Agonistas de receptor 1 de ligando que inducen apoptosis y necrosis de tumores tales como, por ejemplo, mapatumumab; Antagonistas de receptor de 5-hidroxitriptamina tales como, por ejemplo, rEV598, xaliproden, clorhidrato de palonosetrón, granisetrón, Zindol y AB-1001; Inhibidores de integrinas que incluyen inhibidores de integrina alfa5-beta1 tales como, por ejemplo, E7820, JSM 6425, volociximab y endostatina; Antagonistas de receptor de andrógenos que incluyen, por ejemplo, decanoato de nandrolona, fluoximesterona, Android, Prost-aid, andromustina, bicalutamida, flutamida, apo-ciproterona, apo-flutamida, acetato de clormadiona, Androcur, Tabi, acetato de ciproterona y nilutamida; Inhibidores de aromatasa tales como, por ejemplo, anastrozol, letrozol, testolactona, exemestano, aminoglutetimida y formestano; Inhibidores de metaloproteinasa de matriz; Otros agentes anticancerosos que incluyen, por ejemplo, alitretinoína, ampligen, atrasentán bexaroteno, bortezomib, bosentán, calcitriol, exisulind, fotemustina, ácido ibandrónico, miltefosina, mitoxantrona, l-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pegaspargasa, pentostatina, tazaroteno, velcade, nitrato de galio, canfosfamida, darinaparsina y tretinoína.

En una forma de realización preferida, los compuestos de la presente invención se pueden usar en combinación con quimioterapia (es decir agentes citotóxicos), anti-hormonas y/o terapias marcadas tales como otros inhibidores de cinasa (por ejemplo, inhibidores del EGFR), inhibidores de mTOR e inhibidores de la angiogénesis.

Los compuestos de la presente invención se pueden emplear también en el tratamiento del cáncer en conjunción con radioterapia y/o intervención quirúrgica.

Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, podría, en algunos casos, estar modificado. Por ejemplo, un anticuerpo podría estar conjugado con cualquiera, pero no limitado, a los compuestos mencionados en lo que antecede o cualquier radioisótopo para aumentar potencialmente de forma adicional la eficacia. Además, los compuestos de la invención pueden utilizarse, como tales o en composiciones, en investigaciones y diagnósticos, o como estándares de referencia analítica, y similares, que se conocen bien en la técnica.

Los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se pueden usar como herramienta terapéutica o diagnóstica en diversas situaciones en las que de forma indeseada se expresa o se encuentra C4.4a, por ejemplo trastornos de la proliferación celular como el cáncer. Trastornos y afecciones particularmente adecuados para tratamiento con un anticuerpo de la invención son tumores sólidos, tales como cáncer de mama, del tracto respiratorio, cerebral, de órganos reproductores, del tracto digestivo, del tracto urinario, ocular, de hígado, de piel, de cabeza y cuello, de tiroides, de paratiroides, y sus metástasis distantes. Dichos trastornos también incluyen linfomas, sarcomas y leucemias.

Ejemplos de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ y carcinoma lobular in situ.

Los ejemplos de cánceres del tracto respiratorio incluyen, pero no están limitados a, carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón no de células pequeñas, así como a adenoma bronquial y a blastoma pleuropulmonar.

Ejemplos de cánceres de cerebro incluyen, pero no se limitan a glioma del bulbo raquídeo y glioma hipotalámico, astrocitoma cerebelar y cerebral, glioblastoma, meduloblastoma, ependimoma, así como a tumor neuroectodérmico y a tumor pineal.

Los tumores de los órganos reproductores masculinos incluyen, pero no se limitan a cáncer de próstata y cáncer testicular. Los tumores de los órganos reproductores femeninos incluyen, pero no se limitan a cáncer endometrial, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer vaginal y cáncer vulvar, así como sarcoma del útero.

Los tumores del tracto digestivo incluyen, pero no se limitan a cánceres anal, de colon, colorrectal, esofágico, de vesícula biliar, gástrico, pancreático, renal, del intestino delgado y de las glándulas salivares.

Los tumores del tracto urinario incluyen, pero no se limitan a cánceres de vejiga, de pene, de riñon, de pelvis renal, de uréter, uretral y cánceres renales papilares esporádicos.

Los cánceres del ojo incluyen, pero no se limitan a melanoma intraocular y retinoblastoma.

Ejemplos de cánceres de hígado incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular (carcinomas de hepatocitos con y sin variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma del conducto biliar intrahepático) y colangiocarcinoma hepatocelular mixto.

Los cánceres de piel incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de piel de células de Merkel, y cáncer de piel no melanoma.

Los cánceres de cabeza y cuello incluyen, pero no se limitan a, cáncer laríngeo, cáncer hipolaríngeo, cáncer nasofaríngeo, cáncer orofaríngeo, cáncer de labios y cáncer de la cavidad oral y cáncer escamoso.

Los linfomas incluyen, pero no se limitan a, linfoma relacionado con SIDA, linfoma no-Hodgkin, linfoma de las células T cutáneo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central.

Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, sarcoma del tejido blando, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma y rabdomiosarcoma.

Las leucemias incluyen, pero no se limitan a leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena crónica y leucemia de células vellosas.

Los trastornos mencionados anteriormente están bien caracterizados en seres humanos, pero también existen con una etilogía similar en otros animales, incluyendo mamíferos, y se pueden tratar administrando las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Para tratar cualquiera de los trastornos anteriores, las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención se pueden formular de un modo convencional usando uno o más soportes o excipientes fisiológicamente aceptables. Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede administrar por cualquier medio adecuado, que puede variar en función del tipo de trastorno que se esté tratando. Las posibles vías de administración incluyen las vías parenteral (p. ej., intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención podría administrarse mediante infusión en pulsos con, por ejemplo, dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosis se administra mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La cantidad que se va a administrar dependerá de diversos factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo, si se administran otros fármacos o no. El experto en la técnica reconocerá que la vía de administración variará dependiendo del trastorno o afección que se vaya a tratar.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz del nuevo polipéptido, de acuerdo con esta invención, dependerá en gran medida de las características concretas del paciente, la vía de administración y la naturaleza del trastorno que se esté tratando. Guías generales se pueden encontrar en, por ejemplo, las publicaciones de la Conferencia Internacional sobre Armonización y en Remington's pharmaceutical sciences, capítulos 27 y 28, pág. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como toxicidad y eficacia del medicamento. La toxicidad se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica y encontrados en las referencias anteriores. La eficacia se puede determinar utilizando las mismas guías junto con los procedimientos descritos más adelante en los ejemplos.

Procedimientos diagnósticos Los anticuerpos frente a C4.4a, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se pueden usar para detectar la presencia de tumores que expresan C4.4a. La presencia de células que contienen C4.4a o que desprenden C4.4a dentro de varias muestras biológicas, incluidas suero, y muestras de biopsia tisular, puede detectarse con anticuerpos frente a C4.4a. Además, los anticuerpos frente a C4.4a se pueden usar en varias metodologías de imagen, tales como inmunoescintigrafía con un anticuerpo conjugado con sup.99mTc (u otro isótopo). Por ejemplo, un protocolo de imagen similar al recientemente descrito usando anticuerpos anti-PSMA conjugados con 111ln se puede usar para detectar carcinomas pancreáticos u ováricos (Sodee y col., Clin. Nuc. Med. 21 : 759-766, 1997). Otro procedimiento de detección que se puede usar es la tomografía de emisión de positrones conjugando los anticuerpos de la invención con un isótopo adecuado (véase Herzog y col., J. Nucí. Med. 34:2222-2226, 1993).

Composiciones y administración farmacéuticas Una forma de realización de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos frente a C4.4a, o fragmentos de unión a antigeno de los mismos, solos o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier transportador farmacéutico estéril blocompatible, incluidos, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Otra forma de realización son composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a C4.4a o fragmento de unión a antígeno del mismo, y otro compuesto farmacéuticamente activo que es adecuado para tratar enfermedades relacionadas con el C4.4a tales como el cáncer. Cualquiera de estas moléculas se puede administrar a un paciénte en monoterapia o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas en las que se mezcla con excipiente(s) o transportadores farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización de la presente invención, el transportador farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte.

La presente invención también se refiere a la administración de composiciones farmacéuticas. Dicha administración se consigue por vía oral o parenteral. Entre los procedimientos de administración parenteral se incluye la administración tópica, intraarterial (directamente en el tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o ¡ntranasal. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Otros detalles sobre las técnicas de formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

Composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular usando soportes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica con posologías adecuadas para la administración oral. Dichos soportes permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante combinación de compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir las sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o grageas. Excipientes adecuados son cargas de hidratos de carbono o de proteínas, tales como azúcares, incluidos lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; y gomas, incluidas arábiga y de tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentrado, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para la identificación de productos o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener ingredientes activos mezclados con una carga o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuestos activos. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina tamponada fisiológicamente. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Adicionalmente se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas para inyección adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

Para la administración tópica o nasal, en la formulación se usan penetrantes adecuados para atravesar la barrera concreta. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

KitS La invención además se refiere a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas en lo que antecede. Asociados con dicho(s) contenedor(es) se puede recomendar en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, lo que refleja la aprobación de la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para administración en seres humanos.

En otra forma de realización, los kits pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferentemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proporcionan en un plásmido adecuado para la transfección y expresión en una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (a menudo un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido puede también contener sitios de restricción adecuados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido para producir diversos anticuerpos. Los plásmidos pueden también contener otros numerosos elementos para facilitar la clonación y la expresión de las proteínas codificadas. Dichos elementos son bien conocidos para el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores seleccionabas, codones de iniciación, codones de terminación y similares.

Fabricación y almacenamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de un modo conocido en la técnica, por ejemplo por medio de procedimientos convencionales mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, trituración, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de una sal y se puede formar con ácidos, incluidos, entre otros, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, mélico, succínico etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que son las correspondientes formas de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, sacarosa 0,1 %-2 %, manitol 2 %-7 % a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 que se combina con tampón antes de usar.

Después de que se han preparado las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención en un transportador pueden introducirse en un contenedor adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una afección para la que están indicadas. Para la administración de anticuerpos frente a C4.4a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, dicho etiquetado incluiría cantidad, frecuencia y procedimiento de administración.

Dosis terapéuticamente eficaz Composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito previsto, es decir el tratamiento de un estado de enfermedad concreto que se caracteriza por la expresión de C4.4a. La determinación de una dosis eficaz entra bien en la capacidad de los expertos en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente bien en ensayos de cultivo celular, por ejemplo células neoplásicas, o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros, cerdos o monos. El modelo animal también se usa para alcanzar un intervalo de concentración deseado y vía de administración. Tal información se puede usar después para determinar dosis útiles y vías de administración en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que mejora los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DE50/OL50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se usan en la formulación de in intervalo de dosificación para uso humano. Las dosis de tales compuestos están preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

Cada médico escoge la dosificación exacta según el paciente que va a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Entre los factores adicionales que se pueden tener en cuenta se incluyen la gravedad de la enfermedad, por ejemplo el tamaño y la localización del tumor; la edad, el peso y el sexo del paciente, la dieta, la hora y la frecuencia de administración, la(s) combinaciones de fármacos, las sensibilidades de la reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada podrían administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la semívida y el índice de aclaramiento de la formulación concreta.

Las cantidades de dosificación normales varían de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, en función de la vía de administración. En la bibliografía se proporcionan guías en cuanto a dosificaciones y procedimientos de liberación. Véase la patente de EE.UU. n° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para polinucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De forma similar, la liberación de polinucleótidos o polipéptidos será específica de células, afecciones, localización etc. concretas. Actividades específicas preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar de 0,1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva¡y col., Clin. Cáncer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner y col., 2008 Radiology 246(3):895-902) La presente invención se describe adicionalmente mediante los ejemplos siguientes. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención por referencia a formas de realización específicas. Estos ejemplos, aunque ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no retratan las limitaciones ni circunscriben el alcance de de la invención divulgada.

Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto donde se describa lo contrario en detalle. Las técnicas de biología molecular habituales de los ejemplos siguientes se pueden llevar a cabo tal como se describe en los manuales estándar de laboratorio, tales como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Una forma de realización preferida de la invención es: A. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica a C4.4a, preferentemente al dominio S1 de C4.4a.

B. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la forma de realización A, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, presenta reacción cruzada con un C4.4a de roedores, preferentemente con un C4.4a murino.

C. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con las formas de realización A o B, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se internaliza tras la unión a las células que expresan C4.4a.

D. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización A a C, en las que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, compite por la unión a C4.4a con el anticuerpo M31-B01 o M20-D02 S-A.

E. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la forma de realización D, en la que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR representada en la tabla 7, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % ó 95 % idéntica a al menos una secuencia de VH o VL representada en la tabla 7.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización D a E, en las que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es, al menos, 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR de M31-B01 o M20-D02 S-A, o al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % ó 95 % idéntica a la secuencia de VH o VL de M31-B01 o M20-D02 S-A.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización D a F, en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una de las secuencias de CDR de cadena pesada de conformidad con las secuencias consenso SEC ID N°: 297 o SEC ID N0:: 302 (CDR H1), SEC ID N°: 298 o SEC ID N°: 303 (CDR H2) o SEC ID N°: 299 o SEC ID N°: 304 (CDR H3), y/o al menos una de las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las secuencias consenso de SEC ID N°: 300 o SEC ID N°: 305 (CDR L1), SEC ID N°: 22 o SEC ID N°: 306 (CDR L2) o SEC ID N°: 301 o SEC ID N°: 307 (CDR L3).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización D a G, a) en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de la cadena pesada de conformidad con la SEC ID N°: 297 (CDR H1), SEC ID N°: 298 (CDR H2) y SEC ID N°: 299 (CDR H3), y las secuencias de CDR de la cadena ligera de conformidad con la SEC ID N°: 300 (CDR L1), SEC ID N°: 22 (CDR L2) y la SEC ID N°: 301 (CDR L3), o b) en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de la cadena pesada de conformidad con la SEC ID N°: 302 (CDR H1), SEC ID N°: 303 (CDR H2) y SEC ID N°: 304 (CDR H3) y las secuencias de CDR de la cadena ligera de conformidad con la SEC ID N°: 305 (CDR L1), SEC ID N°: 306 (CDR L2) y la SEC ID N°: 307 (CDR L3).

El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización D a H, que comprende las secuencias de CDR variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo M31-B01 o modificaciones de las mismas, en las que i. en la CDR-H1 modificada, el aminoácido en la posición 3 se selecciona del grupo constituido por N y S, y en la posición 4 se selecciona del grupo constituido por A e Y; ii. en la CDR-H2 modificada, el aminoácido en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por T y S, y en la posición 11 se selecciona del grupo constituido por I y T; iii. en la CDR-H3 modificada, el aminoácido en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por Y, K, G, W y N; iv. en la CDR-L1 modificada, el aminoácido en la posición 1 se selecciona del grupo constituido por T y S; v. en la CDR-L2 modificada, el aminoácido en la posición 4 se selecciona del grupo constituido por Q y K; vi. en la CDR-L3 modificada, el aminoácido en la posición 4 se selecciona del grupo constituido por W, E, F e Y, en la posición 7 se selecciona del grupo constituido por R, S y M, en la posición 9 se selecciona del grupo constituido por N, K y S, en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por G y R, y en la posición 11 se selecciona del grupo constituido por P y A.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la forma de realización G a H, que comprende la secuencia estructural de las secuencias CDR variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo M31-B01 o modificaciones de las mismas, en el que en la cadena ligera variable modificada, el aminoácido en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por A y V y en la posición 13 se selecciona del grupo constituido por A y T.

El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización D a H, que comprende las secuencias de CDR variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo M20-D02 S-A o modificaciones de las mismas, en las que i. en la CDR-H1 modificada, el aminoácido en la posición 3 se selecciona del grupo constituido por D y S; ii. en la CDR-H2 modificada, el aminoácido en la posición 4 se selecciona del grupo constituido por V e I, y en la posición 9 se selecciona del grupo constituido por A y G, y en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por R y S; iii en la CDR-H3 modificada, el aminoácido en la posición 9 se selecciona del grupo constituido por S, K y R, en la posición 10 se selecciona del grupo constituido por A, S y R, en la posición 14 se selecciona del grupo constituido por D, K, E y R, y en la posición 15 se selecciona del grupo constituido por S e Y; iv. en la CDR-L1 modificada, el aminoácido en la posición 7 se selecciona del grupo constituido por V e I; v. en la CDR-L3 modificada, el aminoácido en la posición 3 se selecciona del grupo constituido por A, Q, y R, en la posición 5 se selecciona del grupo constituido por D y G, en la posición 7 se selecciona del grupo constituido por R y S, en la posición 9 se selecciona del grupo constituido por N, W y S, y en la posición 12 se selecciona del grupo constituido por V, A y G.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización D a K, en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una secuencia de CDR o al menos una secuencia variable de cadena pesada o de cadena ligera tal como se representa en la tabla 7.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, en las que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de la cadena pesada y ligera o las secuencias variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de tabla 7.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 75-77 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 78-80, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 5, 9 y 13 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 17, 21 y 25, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 6,10 y 14, y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 18, 22 y 26, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 7,11 y 15, y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 19, 23 y 27, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 8,12 y 16, y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 20, 24 y 28, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 45-47 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 48-50 o: las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 55-57 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 58-60 o: las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante las SEC ID N°: 65-67 las secuencias de CDR de cadena ligera presentadas mediante la SEC ID N°: 68-70 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 85-87 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 88-90 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 95-97 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 98-100 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 105-107 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 108-110 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 115-117 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 118-120 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 125-127 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 128-130 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 135-137 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 138-140.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que comprende una secuencia variable de cadena pesada como se presenta mediante la SEC ID N°: 81 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 82, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 33 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 29 o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 34 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 30, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 35 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 31 , o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 36 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 32, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 51 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 52, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 61 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 62, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 71 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 72, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 91 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 92, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 101 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 102, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 111 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 112, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID NP: 121 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID °: 122, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 131 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 132, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 141 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 142.

El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que es un anticuerpo IgG.

El fragmento de unión a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que es un fragmento scFv, Fab, Fab' o un fragmento F(ab')2.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización precedentes, que es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno.

Un conjugado anticuerpo-fármaco, que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las formas de realización A a S. En otra forma de realización, el CAF comprende un agente citotóxico, o un radioisótopo, en una forma de realización preferida adicional, el agente citotóxico o radioisótopo está unido de forma covalente al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización A a S. Una forma de realización adicional es un ácido nucleico tal como se representa en la tabla 7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la forma de realización U.

Una célula que expresa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización A a S y/o que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la forma de realización U o un vector de acuerdo con la forma de realización V.

Una célula de acuerdo con la forma de realización W, en la que dicha célula es una célula procariota o eucariota.

Un procedimiento de producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las formas de realización A a S que comprende cultivar una célula de acuerdo con la forma de realización X y la purificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de acuerdo con las formas de realización A a S o un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la forma de realización T como medicamento.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización A a S como agente diagnóstico.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización A a S o un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la forma de realización T como medicamento para el tratamiento del cáncer.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización A a S o un conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la forma de realización T.

Una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con las formas de realización A a S o una composición farmacéutica de acuerdo con la forma de realización CC y uno o más compuestos terapéuticamente activos. EE. Un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado con la presencia indeseada de C4.4a, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo con la forma de realización CC o una combinación de acuerdo con la forma de realización DD. En otra forma de realización preferida, la enfermedad es cáncer.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas n-CoDeR El aislamiento de anticuerpos humanos contra C4.4a se realizó mediante tecnología de expresión en fagos empleando la biblioteca de anticuerpos no expresados antes n-CoDeR de Biolnvent International AB (Lund, Suecia; descrita en Sóderling y col., Nature Biotech. 2000, 18:853-856) en un enfoque de selección celular. La n-CoDeR es una biblioteca de Fab en la que se han diversificado las seis CDR. Inicialmente, las secuencias de las CDR se obtuvieron de donantes humanos sanos.

Brevemente, en un alícuota de la biblioteca de anticuerpos Fab se eliminaron los aglutinantes de superficie no deseados mediante preincubación con 107 células CHO-S parentales que no expresan C4.4a en PBS / 3 % de FCS / 0,01 % de NaN3 (tampón A) a 4°C mediante rotación de extremo a extremo durante 15 minutos. Después de la eliminación de células mediante centrifugación el sobrenadante se usó durante 2 ciclos adicionales de preincubación con células CHO-S. La inmunofijación subsecuencial en las células diana (107 de células CHO-S:hC4.4a) se efectuó mediante incubación con la preparación de fagos durante 45 minutos a 4 °C en el tampón A, seguido por 10 lavados con tampón A (4°C). Los fagos unidos se eluyeron tratando las células durante 5 minutos mediante rotación de extremo a extremo con ácido cítrico 76 mM (4°C). La preparación que contenía los fagos eluidos se neutralizó mediante la adición de Tris/HCI 1 M, a pH 7,5 y se realizaron 2 ciclos adicionales de fijación celular. En cada ciclo, los fagos eluidos se propagaron y los títulos de fagos se determinaron como se ha descrito previamente (Cicortas Gunnarsson y col., PEDS 2004, 17(3) 213-221 ). Brevemente, los alícuotas de la solución eluida se guardaron para experimentos de titulación y el resto se usó para transformar exponencialmente las células E. coli HB101 en crecimiento para la preparación de nuevos almacenes de fagos. Para cada ciclo de selección se titularon los fagos de entrada y de salida en E. coli HB101 ' en crecimiento exponencial y los clones se escogieron de los ciclos 2 y 3 para en análisis en ELISA de fagos.

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA): ELISA de fagos: Los fagos seleccionados de diferentes ciclos de selección se analizaron para determinar la especificidad usando ELISA para fagos. Brevemente se realizó la expresión en fagos mediante la adición de 10 µ? de cultivo durante la noche (en medio LB suplementado con 100 pg/ml de ampicilina y 15 pg/ml de tetraciclina) hasta 100 µ? de medio fresco (medio LB suplementado con 100 pg/ml de ampicilina y 15 pg/ml de tetraciclina y 0,1 % de glucosa) y agitando a 250 rpm y 37°C en MTP de 96 pocilios hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5. Posteriormente se añadió el fago colaborador M13K07 (Invitrogen) y las muestras se incubaron durante otros 15 minutos a 37 °C sin agitación. Tras la adición de IPTG (c.f. de 0,25 mM), las células se incubaron durante 16 horas a 30°C agitando a 200 rpm.

Las placas MTP de 96 pocilios (Nunc-maxisorb) se revistieron durante 16 horas a 4°C con 50 µ? de C4.4a recombinante (5 µg/ml de proteína humana o de ratón). Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con PBS/0,05 % de Tween 20 (tampón B), se trataron con reactivo de bloqueo (3 % de polvo de leche en tampón B), y se lavaron 3 veces con tampón B. Después, alícuotas de 50 µ? de las expresiones en fagos se transfeccionaron por pocilio y se incubaron durante 1 hora a 20 °C. Después de lavar 3 veces con tampón B, se añadió anticuerpo anti M13 acoplado a HRP (GE Healthcare, 27-9421-01; 1 :2500 diluido en tampón B) y se incubó durante 1 hora a 20 °C. La reacción de color se desarrolló mediante la adición de 50 µ? de TMB (Invitrogen) y se detuvo tras 5-15 min a 20°C mediante la adición de 50 µ? de solución de terminación (Invitrogen). La reacción colorimétrica se registró a 450 nM en un lector Tecan.

Detección selectiva de sFabs mediante ELISA: Para la generación de Fab solubles (sFabs) se aisló ADN de fagemido de los ciclos de selección 2 y 3 y se digirió con las enzimas de restricción EagI y EcoRI de acuerdo con las instrucciones del suministrador con el fin de eliminar el producto del gen III. El fragmento resultante se volvió a unir y los constructos se transformaron en células E. coli Top10 competentes usando procedimientos estándar. Se escogió un total de ~1500 clones, se transfirieron a placas de 96 pocilios que contenían medio LB (100 pg/ml, 0,1 % de glucosa) y se agitaron a 250 rpm y 37°C hasta alcanzar una DO600 de 0,5. Después, se indujo la producción de sFab mediante la adición de IPTG (concentración final de 0,5 mM) y la incubación continuó durante 16 horas a 30 °C agitando a 200 rpm. A la mañana siguiente, a cada pocilio se añadió tampón BEL (24,7 g/l de ácido bórico; 18,7 g/l de NaCI; 1 ,49 g/l de EDTA a pH 8,0; 2,5 mg/ml de lisozima (Roche)) y 50 µ? de los cultivos tratados se analizaron para determinar la unión de sFab a la diana en un ELISA esencialmente como se ha descrito para fagos, a excepción de que la detección se realizó con anti-hlgG (específico de Fab) acoplado a HRP (Sigma; N° de producto A 0293) FACS: La unión celular de sFab a las células diana se analizó en un FACSarray de BD. Brevemente, 50 µ? de la suspensión celular (2x106 células/ml) se mezclaron con 50 µ? de sobrenadante de E. coli durante 1 hora a 4°C y 300 rpm. Posteriormente se añadieron 100 µ? de tampón A, las células se centrifugaron y se trataron otras 2 veces con tampón A. Para la detección del conjugado de Fabs R-fi coeritrina se añadió fragmento F(ab')2anti-humano de cabra AffiniPure F(ab')2 especifico; Jackson Immuno Research; N° de producto 109-116-097, diluido a 1 :100 en tampón A a las células y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Después de 3 lavados con tampón A, el sedimento final se resuspendió en 150 µ? de tampón A y 5000 sucesos de FACS se registraron por muestra. El análisis de datos se realizó usando el software de sistema BD FACSArray.

EJEMPLO 2: Agrupación de epítopos Se realizaron experimentos de agrupación de epítopos usando análisis de resonancia en plasmón superficial en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) mediante monitorización de la unión simultánea de pares de anticuerpos anti-C4.4a frente a C4.4a. Todas las demás etapas de realizaron a 20°C. Aproximadamente 2000 UR (una UR (unidad de resonancia) representa la unión de 1 pg de proteína por mm cuadrado) del primer anticuerpo se inmovilizó covalentemente en el chip sensor CM5 a través de acoplamiento con amina primaria. El chip se activó con una proporción 1 :1 de N-etil-N-(3-dietilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,4 M y n-hidroxisuccinamida (NHC) 0,4 M a un caudal de 10pl/m¡n durante 5-15 min. A continuación, los sitios de unión sobre la superficie no ocupados se bloquearon con un exceso de etanolamida 1M a Ph 8,5. El C4.4a soluble (concentración de 400 nM en tampón HEPES-EP ((GE Healthcare Biacore, Inc.) a un caudal de 10 µ?/min durante 3 minutos) se capturó sobre la superficie a través del anticuerpo inmovilizado. Por tanto, el epítopo del anticuerpo de captura queda bloqueado para todas las moléculas de C4.4a unidas. Posteriormente, un segundo anticuerpo (a una concentración de 200 nM en tampón HEPES-EP a un caudal de 10 µ?/min durante 3 minutos) se pasó inmediatamente sobre la superficie para ligar el C4.4a capturado. Dos anticuerpos que reconocen el mismo epítopo, o epítopos solapantes, no se pueden unir a C4.4a, mientras que los anticuerpos con distintos epítopos sí se pueden unir. La superficie del anticuerpo se regeneró con MgCI2 3M (a un caudal de 10 µ?/min durante 30 segundos), para eliminar todas las proteínas unidas y, después, se repitió el proceso con otros anticuerpos.

Se sometieron a ensayo los anticuerpos M31-B01 y M20-D02 S-A en formato de IgGl Ninguno de los anticuerpos pudo unirse de forma simultánea a C4.4a y, por tanto, competir por la unión (véase la Fig.1).

EJEMPLO 3: Reactividad cruzada con C4.4a murino En la Tabla 1 se muestran los resultados de estudios con Biacore que muestran la reactividad cruzada y las constantes de disociación (KD) de los anticuerpos de la invención con C4.4a murino.

Las afinidades de unión de los anticuerpos anti C4.4 se determinaron mediante análisis de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.). Los anticuerpos se inmovilizaron sobre un chip sensor CM5 a través de un reactivo de captura indirecta, Fe IgG anti-humano. Los reactivos del "Human Antibody Capture Kit" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) se usaron tal como lo describe en fabricante. Aproximadamente 5000 UR del anticuerpo monodonal IgG (Fe) anti-humano de ratón se inmovilizaron por célula. Los anticuerpos anti C4.4 se inyectaron a una concentración de 5 g/ml a 10 µ?/min durante 10 segundos para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 600 UR. Varias concentraciones (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6,25 nM, y 3,12 nM) en tampón HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) de C4.4a humano o murino se inyectaron sobre anticuerpos anti C4.4a inmovilizados a un caudal de 60 µ?/min durante 3 minutos y se permitió la disociación durante 10 minutos. Se generaron sensogramas tras corrección de células de referencia en línea, seguida por la resta de la muestra tampón. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó sobre la base de la proporción de las constantes de asociación (kor) y disociación (koff), obtenida ajustando los sensogramas con un modelo de unión 1 :1 de primer orden usando Biacore Evaluation Software (versión 4.0).

EJEMPLO 4: Unión a C4.4a recombinante humano y murino La figura 2 representa curvas de unión del anticuerpo anti-C4.4 M31-B01 y M20 D02 S-A sobre C4.4a recombinante humano (A) y -C4.4.a murino (B), respectivamente. Brevemente, placas MTP de 96 pocilios se revistieron durante 16 horas a 4°C con C4.4a recombinante humano o de ratón (placas de 100 ng/pocillo se lavaron 3 veces con PBS/0,05 % de Tween 20 (=tampón B) tratadas con reactivo de bloqueo (PBS + 2 % de BSA) y se lavaron de nuevo 3 veces con tampón B. Después, se añadieron los anticuerpos anti C4.4a de la invención en concentraciones de 0,39 ng a 400 ng /por pocilio y se incubaron durante una hora a 20°C. Después de lavar 3 veces con tampón B, a cada pocilio se añadieron 20 ng de proteina A en 100 µ? de tampón B. La reacción de color se desarrolló mediante la adición de 50 µ? de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma). Los datos para la determinación de la CE50 se registraron tras 18 minutos midiendo la extinción 360 nm en lector de placas Tecan infinite. Los valores de CE50 para M31-B01 fueron 0,24 y 0,29 nM en C4.4a humano y murino respectivamente. Y para M20-D02 S-A, los valores de CE50 fueron 0,3 y 0,38 nM en C4.4a humano y murino respectivamente. Esto indica una elevada afinidad de unión de los anticuerpos anti C4.4a de la invención por C4.4a recombinante soluble humano y murino.

EJEMPLO 5: Unión a diferentes células tumorales La Figura 3 representa curvas de unión y valores de CE50 de los anticuerpos M31-B01 y M20-D02 S-A a diferentes células tumorales. Los análisis se realizaron mediante FACS usando la línea celular transfeccionada A549:hC4.4a y las líneas de células tumorales que expresan C4.4a NCI H292, NCI H332, H1975/BCRP y BxPC3. La Figura 3 f) muestra que ambos anticuerpos de la invención se unen específicamente y con afinidades elevadas a este amplio abanico de células tumorales. Los valores de CE50 de otros anticuerpos de la invención en células mC4.4a : CHO de la invención y células NCI H292 se representan en la Tabla 8 .

La titulación FACS se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocilios, en la que diluciones seriadas del anticuerpo principal en un volumen de 50 µ? de tampón de FACS (3 % de FCS, en PBS) se mezclaron con 50 µ? de una suspensión celular compuesta por 2 x 105 células/ml que se habían desprendido con solución de disociación celular (1x) no enzimática (Sigma) y se resuspendieron en tampón FACS. La incubación se realizó a 4 °C durante 1 hora con agitación. Las células se precipitaron, se lavaron con tampón FACS y se resuspendieron en 100 µ?/pocillo de solución conjugada con ficoeritrina anti-humana de cabra (Dianova) en tampón FACS. La incubación y el lavado se realizaron como antes. El análisis de los anticuerpos unidos a las células se efectuó a la longitud de onda de detección respectiva usando el dispositivo FACS Array. Los valores de CE50 se determinaron a partir de las medianas de fluorescencia de duplicados usando el software Swift 8.0.

EJEMPLO 6: Internalización La internalización relativa de los anticuerpos antiC4.4a en las células C4.4a:A549 transfeccionadas se muestra en la Figura 4 y la Tabla 9. Los ensayos de internalización se realizaron con anticuerpos anti-C4.4a marcados con fluorescencia.

Como marcador fluorescente se escogió el pigmento fluorescente sensible a pH CypHer 5E (GE Healthcare, PA15401) porque sólo se puede detectar una señal de fluorescencia a pH ácido, presente en los endosomas, mientras que con valores de pH neutros o básicos no se mide fluorescencia. Para el acoplamiento, los anticuerpos anti- C4.4a se incubaron durante 1 hora a 20 °C con un exceso 2 molar del pigmento en PBS/Carbonato Na a pH 8,3 (9:1). De media se alcanzó una carga de pigmento acoplado a Lys de 1 ,6. Los efectos del acoplamiento sobre la afinidad se analizaron en ensayos FACS y los cambios en los valores de CE50 se consideraron insignificantes. 1x104 células A549:hC4.4a se usaron para investigar la internalización específica de C4.4a tras la unión del anticuerpo. Las células se trataron con varias concentraciones (34n - 6,6nM) de anticuerpos marcados a 37°C/ 5 % de C02. La internalización se midió cinéticamente durante hasta 24 horas usando el analizador IN Cell Analyzer 1000. El análisis de la internalización se realizó microscópicamente a un aumento de 40 x y mediante determinación de la granularidad (recuento de gránulos/célula; excitación a 620 nm, y emisión a 700 nm para CypHer5E). Los núcleos se visualizaron con tinción de ADN usando tinción permeable celular Hoechst 33342 (0,5pg/ml, incubación durante 30 min, emisión a 353-365 nm detección a 480 nm).

Las correspondientes células vector que no expresan C4.4a se usaron como controles, así como las células A549 salvajes (A549 wt). Una lgG1 humana se seleccionó con isotipo control y se marcó en paralelo. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes; los puntos de datos representan las determinaciones por triplicado. Los anticuerpos M31-B01 y M20-D02 S-A se internalizaron de forma eficiente. El tiempo de seminternalización máxima fue de 31 minutos para 31-B01 y de 49 min para M20-D02 S-A, respectivamente.

EJEMPLO 7: Conversión de Fab a formato IgG Para transferir regiones VH y VL de Fab a formato IgG y/o cambiar el sistema de expresión de E. coli a un sistema de células de mamífero, las regiones VH y VL se amplificaron usando cebadores de PCR. En ambos extremos 5' y 3' de VH y VL, respectivamente, se introdujeron sitios adyacentes de escisión para enzimas de restricción. Estos sitios de restricción se usaron para clonar VH y VL en un vector de expresión que contiene una estructura IgG.

A 100 µ? de agua en un tubo de ensayo se añadieron células de E. coli y se incubaron a 95 °C durante 10 minutos y, después, se mantuvieron en hielo durante 5 minutos. Después de agitar en vórtex, los residuos bacterianos se sedimentaron mediante centrifugación. El sobrenadante se usó para amplificar el ADN. Las reacciones de PCR se prepararon por separado para VH y VL usando pares de dejadores específicos con sitios de restricción BamHI y Hpal para VL y sitios Blp1 y Mfe1 para VH, respectivamente. Las reacciones de PCR se realizaron con la polimerasa AccuPrime Pfx (Invitrogen n° 12344-024) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se comprobó la calidad de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1 %. Los vectores de expresión y los productos de PCR se digirieron durante 2 horas a 37 °C con las respectivas endonucleasas de restricción para crear extremos compatibles, de acuerdo con las instrucciones de los suministradores. La reacción de digestión se detuvo mediante incubación a 70 °C durante 15 minutos. Los fragmentos resultantes se ligaron en un vector de expresión y los constructos se transformaron en E. coli o células de mamífero usando procedimientos estándar.

EJEMPLO 8: Modelo de cáncer de xenoinjerto subcutáneo: Los efectos antitumorales de los anticuerpos ant¡-C4.4a se evaluarán usando modelos de xenoinjerto subcutáneo en ratones inmunodeficientes. Las células A431 se mantienen como cultivos adherentes en medio DMEM suplementado con 10 % de FBS. En ratones SCID de 6-7 semanas de edad se inocularán por vía subcutánea en el flanco derecho 1x 10e7 células en 0,1 mi de medio. Se administrarán anticuerpos monoclonales i.p. 3x cada 3 días a una dosis de 5-60 mg/kg. Los ratones control se tratarán con PBS o con un anticuerpo monoclonal ¡rrelevante. El tamaño del tumor se medirá cada 2 días con un compás deslizante. La eficacia antitumoral se evaluará comparando el tamaño del tumor en el tratamiento con anticuerpos anti-C4.4a frente al tratamiento control.

EJEMPLO 9: Modelo de cáncer de xenoinjerto subcutáneo con conjugados de anticuerpo-fármaco: Los anticuerpos anti-C4.4a se pueden conjugar con pequeñas moléculas citotóxicas usando protocolos conocidos en la técnica (p.ej., Liu y col., Proc Nati. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623). Las células A431 se mantienen como cultivos adherentes en medio DMEM suplementado con 10 % de FBS. En ratones SCID de 6-7 semanas de edad se inocularán por vía subcutánea en el flanco derecho 1x 10e7 células en 0,1 mi de medio. Cuando el tumor alcanza un tamaño de 50 mm3 se administrarán los conjugados anticuerpo-fármaco i.p. 3x cada 3 días a una dosis de 1-60 mg/kg. Los ratones control se tratarán con PBS, un anticuerpo monoclonal irrelevante o un fármaco libre sin conjugar. El tamaño del tumor se medirá cada 2 días con un compás deslizante. La eficacia antitumoral se evaluará comparando el tamaño del tumor en el tratamiento con conjugados de anticuerpos anti-C4.4a-fármaco frente al tratamiento control.

EJEMPLO 10: Clonación, expresión y cuantificación de los niveles de expresión del fragmento de anticuerpo Fab para la maduración de la afinidad.

Las cadenas pesada y ligera de los Fab salvajes de M31-B01 y M20-D02 S-A portadores de una marca 3xHA y una marca de hexa-histidina en el extremo C de la cadena pesada se subclonaron en el vector de expresión bacteriano pET28a (Novagen/Merck Chemicals Ltd., Nottingham, Reino Unido) y se transformaron en células Top10F' (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania). Como alternativa se pueden usar otros vectores de expresión bacterianos (p.ej., el sistema del vector pQE, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y cepas (p.ej., DH5a, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania). Se generaron variantes mediante mutagénesis estándar dirigida a sitio con oligonucleótidos y se confirmaron; mediante secuenciación del ADN. En particular se modificaron los residuos de aminoácidos dentro de o alrededor de las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas pesada y/o ligera.

Para la expresión, las variantes se transformaron en la cepa BL21starDE3 de Escherichia coli (Invitrogen, C6010-03), se inocularon en un cultivo durante la noche en medio LB con kanamicina (30 pg/ml) y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. Los cultivos de expresión se generaron inoculando el cultivo a 1 :20 en medio LB fresco con kanamicina (30 g/ml). Después de 6 horas a 37°C, se añadió IPTG 1 mM para inducir expresión de anticuerpos y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a 30 °C.

Para cuantificar los niveles de expresión se usó un abordaje con ELISA. Brevemente, placas MTP (Nunc maxisorp black, 460518) se incubaron con un AcMo marcado con epitopo de HA (Covance, MMS-101 P) diluido en tampón de revestimiento (Candor Bioscience GmbH, 121125) a 4CC durante 16 horas, se lavaron con PBST (solución salina tamponada con fosfato que contiene: NaCI 137mM, KCI 2,7mM, Na2HP04 10mM, KH2P04 2mM, a pH 7,4, 0,05 % de Tween 20), se bloquearon con 100 % de Smart Block (Candor Bioscience GmbH, 113500) durante 1 hora a 20°C y se lavaron de nuevo. Los cultivos se diluyeron en 10 % de Smart Block en PBST y se fijaron a las placas MTP durante 1 hora a 20°C. Después de lavar con PBST, los anticuerpos capturados se incubaron con un anticuerpo anti-lambda acoplado a H P (Sigma, A5175) y se detectaron mediante incubación de la placa con sustrato rojo amplex 10µ? (Invitrogen, A12222) durante 30 minutos a 20°C en oscuridad, seguido por medición de la fluorescencia. Se comprobó que las señales de cuantificación determinadas estuvieran dentro del intervalo dinámico de una serie de calibración preparada con sobrenadante del cultivo de expresión de Fab parental concentrada (M31-B01 o M20-D02-S-A) permitiendo una cuantificación relativa de cada muestra individual de expresión de Fab.

EJEMPLO 11 : Determinación de la actividad y la reactividad cruzada entre especies de las variantes de fragmento de anticuerpo Fab generadas Para determinar la actividad de las variantes Fab mutadas en C4.4a recombinante soluble humano o de ratón se usó un formato de ensayo de ELISA directo. Brevemente, las placas MTP (Nunc maxisorp black, 460518) se recubrieron con 2 [iglm\ de C4.4a humano o de ratón en tampón de revestimiento (Candor Bioscience GmbH, 121 125) y se incubaron durante 15 horas a 4 °C. Después de lavar 3 veces con PBST, las placas se bloquearon con 100 % de Smart Block (Candor Bioscience GmbH, 1 13500) durante 1 hora a 20°C y se repitieron las etapas de lavado. Para la unión de los fragmentos de anticuerpo Fab, 20 µ? de los sobrenadantes de cultivo se añadieron a las placas durante 1 hora a 20 °C, seguido de lavado. En algunos casos se incrementó la rigurosidad del lavado mediante una etapa adicional de incubación con 10 % de Smart BlocK en PBST durante 90 min, seguido por 3 lavados con PBST ("procedimiento B" en la Tabla 10b). Los Fab parentales fijados se detectaron después mediante un conjugado de anticuerpo específico con marca epítopo HA-HRP (Bethyi, A190-108P). A las placas se añadieron 10 µ? de sustrato rojo amplex (Invitrogen, A12222) y la señal de fluorescencia se detectó usando un lector de fluorescencia normal, por ejemplo Tecan Ultra. La cantidad de señales de afinidad normalizadas se calculó en forma de las proporciones de las señales de afinidad y cuantificación de fondo en los respectivos ELISA: (señal de afinidad - afinidad de fondo) / (cantidad de señal-cantidad de fondo). Los valores resultantes se correlacionan principalmente con la afinidad de un modo positivo, mientras que los valores no normalizados se correlacionan adicionalmente con la concentración del Fab de unión en la muestra. Por tanto, la cantidad de señales de afinidad normalizadas sirve como una guía muy buena para la determinación de las variantes con mejor afinidad.

EJEMPLO 12: Sustituciones de un solo aminoácido o de múltiples En las Tablas 10a y 10b se dispone de varios ejemplos de sustituciones de un solo aminoácido generadas en las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. HC D101 K, LC A90Q, LC V97A y LC V97G mostraron la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad normalizada en C4.4a humano, con una señal correspondiente en C4.4a de ratón de al menos 1/8 en comparación con la señal en C4.4a humano (Tabla 10a). Además de las dos sustituciones de CDR3, HC D31S y HC V51 I mostraron la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humano, con una señal correspondiente en C4.4a de ratón del 30 % en el caso de HC V511 (Tabla 10b).

Tabla 10a. Análisis de sustituciones en un solo aminoácido dentro de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. Se relacionan las señales de afinidad normalizada en C4.4a humano y de ratón, la media y las respectivas desviaciones estándar de dos mediciones al menos por cuadruplicado, Tabla 10a: Tabla 10b. Análisis de sustituciones en un solo aminoácido además de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. Se relacionan las señales de afinidad normalizada en C4.4a humano y murino, respectivamente; los números indicados son las medianas de una medición por cuadruplicado. La diferencia entre el procedimiento B y el A es una etapa de incubación adicional en tampón durante 90 minutos en el procedimiento B.

Tabla 10b: En las Tablas 11a y 11b se proporcionan varios ejemplos de sustituciones de un solo aminoácido generadas en las cadenas pesada y ligera de of B01. LC W91 E, LC W91 F, LC W91Y y LC G95bR mostraron la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humano, con una señal correspondiente en C4.4a de ratón de al menos 1/8 en comparación con la señal en C4.4a humano, las últimas tres del 40 % y más (Tabla 11a). Además de las CDR3, la sustitución de HC A32Y mostró la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humano (Tabla 11b).

Tabla 11a. Análisis de sustituciones en un solo aminoácido dentro de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de M31-B01. Se exponen las señales de afinidad normalizada en C4.4a humano y de ratón; la media y la correspondiente desviación estándar de dos mediciones son el resultado de al menos cuadruplicados.

Tabla 11a: Tabla 11b. Análisis de sustituciones en un solo aminoácido además de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de B01. Se exponen las señales de afinidad normalizada en C4.4a humano y de ratón; los números indicados son las medianas de una medición al menos por triplicado.

Tabla 11 b: En las Tablas 12a y 12b se facilitan algunos ejemplos de sustituciones aminoacídicas combinadas dentro de los anticuerpos anti-C4.4a M20-D02 S-A. Algunas sustituciones se analizaron como sustituciones de un solo aminoácido (Tablas 10a y 10b), otras sólo se analizaron como parte de estas sustituciones combinadas. Aunque no se proporcionan todas las combinaciones en las Tablas 12a y 12b, se contempla que el anticuerpo anti-C4.4a puede comprender cualquier combinación de modificaciones proporcionadas en las Tablas 10a y 10b.

Tablas 12a y 12b. Ejemplo de sustituciones de múltiples aminoácidos dentro de M20-D02 S-A.

En las Tablas 13a y 13b se facilitan algunos ejemplos de sustituciones aminoacídicas combinadas dentro de los anticuerpos anti-C4.4a M31-B01. Algunas sustituciones se analizaron como sustituciones de un solo aminoácido (Tablas 11a y 11 b), otras sólo se analizaron como parte de estas sustituciones combinadas. Aunque no se proporcionan todas las combinaciones en las Tablas 13a y 13b, se contempla que el anticuerpo anti-C4.4a puede comprender cualquier combinación de modificaciones proporcionadas en las Tablas 11a y 11 b.

Tablas 13a y 13b. Ejemplo de sustituciones de múltiples aminoácidos dentro de M31-B01.

En las Tablas 14a y 14b se proporcionan extensiones de la secuencia de CDR con potenciales sitios de desamidación, específicamente Asn-Gly ("NG") y Asn-Ala ("NA") en M20-D02 S-A y M31-B01 , así como las respectivas secuencias de algunas variantes correspondientes con múltiples sustituciones de aminoácidos.

En M20 D02-S-A hay dos posibles sitios de desamidación en las CDR, uno en la CDR-L3 y uno en la CDR-H2. En D02-11 , -10, -06, -07 y -13, el sitio en la CDR-L3 se elimina mediante una sustitución N>S.

Tabla 14a: En M31-B01 hay dos posibles sitios de desamidación en las CDR, uno en la CDR-L3 y uno en la CDR-H1. En B01-nn3, -05, -10, -nn4 y -12, el sitio en la CDR-L3 se elimina mediante una sustitución N>S, en B01-nn1 mediante una sustitución N>K y en B01-06 mediante una sustitución G>R. En B01-02, -09, -10, -06, -nn4, -12, -nn5 y -11 , el sitio en la CDR-H1 se elimina mediante una sustitución N>S. B01-10, -06, -nn4 y -12 no muestran ninguno de estos posibles sitios de desamidación.

Tabla 14b: Los procedimientos descritos en los ejemplos 10-12 se usaron para generar anticuerpos con afinidad madurada mediante mutaciones únicas y combinaciones de mutaciones únicas de las mismas. Estos procedimientos son muy adecuados para la generación de anticuerpos que compiten derivados de un anticuerpo parental. Los anticuerpos de los ejemplos mencionados en lo que antecede se representan en la Tabla 7. Estos ejemplos proporcionan más anticuerpos de unión a C4.4a, o fragmentos de unión al fragmento de antígeno, que comprenden secuencias CDR H1 que son al menos un 77 % idénticas a la CDR H1 de M31 B01 , secuencias de CDR H2 que son al menos un 90 % idénticas a la CDR H2 de M31 B01 , secuencias de CDR H3 que son al menos un 90 % idénticas a la CDR H3 de M31 B01 , secuencias de CDR L1 que son al menos un 92 % idénticas a la CDR L1 de M31 B01 , secuencias de CDR L2 que son al menos un 85 % idénticas a la CDR L2 de M31 B01 y secuencias de CDR L3 que son al menos un 58 % idénticas a la CDR L3 de 31 B01 (dichas variantes de anticuerpos compiten por la unión con M31 B01) y los anticuerpos o proteínas de unión-fragmentos de unión a antígeno que comprenden secuencias de CDR H1 que son al menos un 88 % idénticas a la CDR H1 de M20 D02 S-A, secuencias de CDR H2 que son al menos un 85 % idénticas a la CDR H2 de M20 D02 S-A, secuencias de CDR H3 que son al menos un 73 % idénticas a la CDR H3 de M20 D02 S-A, secuencias de CDR L1 que son al menos un 92 % idénticas a la CDR L1 de M20 D02 S-A, secuencias de CDR L2 que son al menos un 100 % idénticas a la CDR L2 de M20 D02 S-A y secuencias de CDR L3 que son al menos un 58 % idénticas a la CDR L3 de M20 D02 S-A (dichas variantes de anticuerpo compiten por la unión con M20 D02 S-A). Tabla 15a: En esta tabla se resumen las variaciones de aminoácidos de las CDR 1-3 de las cadenas pesada y ligera de M20 D02 S-A tal como se describen en el procedimiento 12. A continuación se representan los resultados anteriores en forma de una secuencia consenso de las respectivas secuencias de CDR derivadas de M20 D02 S-A. La secuencia consenso para CDR H1 se representa en la Tabla 15a (i) (SEC ID N°: 297), para CDR H2 se representa en la Tabla 15a (ii) (SEC ID N°: 298), para CDR H3 se representa en la Tabla 15a (iii) (SEC ID N°: 299), para CDR L1 se representa en la Tabla 15a (iv) (SEC ID N°: 300, para CDR L2 es idéntica a la SEC ID N°: 22 (Tabla 15a (v)), para CDR L3 se representa en la Tabla 15a (v) (SEC ID N°: 301), respectivamente.

Tabla 15a: En esta tabla se resumen las variaciones de aminoácidos de las CDR 1-3 de las cadenas pesada y ligera de M20 D02 S-A tal como se describen en el ejemplo 12. (ii) CDR H2 M20 D02 S-A (SEQ ID N°: 10) (vi) CDR L3 20 D02 S-A (SEQ ID N°: 26) A continuación se representan ios resultados anteriores en forma de una secuencia consenso de las respectivas secuencias de CDC derivadas de M31 B01. La secuencia consenso para CDR H1 se representa en la Tabla 15b (i) (SEC ID N°: 302), para CDR H2 se representa en la Tabla 15b (ii) (SEC ID N°: 303), para CDR H3 se representa en la Tabla 15b (iii) (SEC ID N°: 304), para CDR L1 se representa en la Tabla 15b (iv) (SEC ID N°: 305), para CDR L2 se representa en la Tabla 15b (v) (SEC ID N°: 306), para CDR L3 se representa en la Tabla 15b (v) (SEC ID N°: 307), respectivamente.

Tabla 15b: En esta tabla se resumen las variaciones de aminoácidos de las CDR 1-3 de las cadenas pesada y ligera de M31 B01 tal como se describen en el ejemplo 12. (iv) CDR L1 31 B01 (SEQ ID N°: 17) posició 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1 1 n 2 3 4 aminoáci T G S S S N I G A G Y V V H do variante s consenso T o S C S S S N I G A G Y V V H (v) CDR L2 31 B01 (SEQ ID N°: 21) posició 1 2 3 4 5 6 7 n aminoáci D N N R P S do variante Q consenso D N N K o Q R P S (vi) CDR L3 M31 B01 (SEQ ID N": 25) EJEMPLO 13: Determinación de la unión del anticuerpo a los dominios sencillos de C4.4a mediante Western Blot Para caracterizar el dominio de unión del anticuerpo de M31-B01 y M20-D02 S-A se generaron constructos constituidos por los aminoácidos 1-85 del dominio S1 de C4.4a y los aminoácidos 108-193 del dominio S2 de C4.4 de C4.4a humano SEC ID N°: 1 respectivamente, en forma de fusiones en el extremo C de lgG1 humana Fc-6xHisTag, se clonaron en un vector de expresión en mamífero que contiene un promotor de CMV5 y se expresaron de forma transitoria en células HEK293 6E mediante procedimientos estándar. Las proteínas S1 y S2 expresadas se purificaron después a partir de sobrenadantes celulares mediante cromatografía con quelatos metálicos usando una columna de superflujo de 5 mi de NiNTA (Qiagen) a 20°C. Se ajustó el pH de las muestras a un pH 8,0 con NaOH 1 M y después se aplicaron a la columna equilibrada previamente con NaH2P04 50mM + NaCI 300mM a pH 8,0 a 1 ml /min. La columna se lavó con 15 CV de tampón de equilibrio y las proteínas HisTagged fijadas se eluyeron con NaH2P04 50mM + NaCI 300mM + Imidazol 250mM a pH 8,0. Las proteínas eluidas se purificaron adicionalmente en una Tricorn Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Para el análisis adicional de la longitud completa (C4.4a SEC ID N°: 1), la fusión purificada de S1-Fc-6xHisTag y la marca de Fc-6xHisTag en S2 se aplicaron a diferentes calles de un gel de gradiente prevertido NuPage Bis-Tris 4 - 12 % (Invitrogen, N° NP0322Box) y se separaron mediante electroforesis, usando el tampón de carrera NuPage MES SDS (Invitrogen NP0002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El gel de SDS se transfirió después a una membrana de transferencia en gel iblot (Invitrogen IB3010-02) usando un dispositivo ¡Blot (Invitrogen). La membrana se bloqueó en DPBS a pH 7,4 + 4 % de leche en polvo + 0, 1 % de Tween 20 durante 16 horas a 4°C, seguido por tres etapas de lavado durante 5 minutos a 20°C en DPBS a pH 7,4 + 0,1 % de Tween 20. M31- B01 (5,76 mg/ml) o M20-D02 S-A (3,49mg/ml) se aplicaron en diluciones de 1/5000 y 1/2000 respectivamente y se incubaron durante 1 ,5 horas a 20°C, seguido por 2 lavados en DPBS a pH 7,4 + 0,1 % de Tween 20. El segundo anticuerpo (conjugado de fosfatasa alcalina- IgG anti-humana de cabra, Fab específico; 109-055-097 Jackson ImmunoResearch) se incubó a una dilución de 1/1000 durante 1 ,5 h a 20°C. Seguido por 3 etapas de lavado durante 5 minutos a 20 °C en DPBS a pH 7,4 + 0,1 % de Tween 20. La tinción se realizó con Sigma Fast BCIP/NBT / 1 comprimido en 10 mi de agua a 20 °C hasta que las bandas pasaron a ser visibles. La reacción de tinción se detuvo lavando con agua Ambos anticuerpos M31-B01 y M20-D02 S-A se unen a C4.4a de longitud completa humano y de ratón. Además, se unen al dominio S1 de C4.4a pero no al dominio S2 de C4.4a tal como se representa en la Fig. 6. La unión se puede detectar exclusivamente en muestras reducidas sin DTT, lo que es un fuerte indicador de la presencia de un epítopo dependiente de la conformación que se estabiliza mediante uno o más puentes disulfuro.

EJEMPLO 14: Ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ensayos CCDA) La actividad antitumoral de las IgG anti-C4.4a puede estar mediada por CCDA. Las células A549:hC4.4a que expresan C4.4a y las células parentales que no expresan C4.4a se incuban con 250 ng/ml, 1000 ng/ml o 2000 ng/ml de anticuerpo lgG1 anti-C4.4a humano o control (p. ej., anticuerpo anti-digoxina). A estas células se añaden PBMC humanos en las proporciones efector-diana de 50:1 , 25:1 y 5:1. Se realiza un ensayo de liberación de cromo 51 para determinar el nivel de tisis diana. Si la velocidad de la lisis en presencia de anticuerpo anti-C4.4a y PBMC es mayor que la velocidad de lisis (espontánea) en presencia de anticuerpo ficticio o son anticuerpo y PBMC indica que la CCDA es eficaz.

EJEMPLO 15: Inhibición dependiente de anticuerpos de la proliferación- Proliferación celular medida mediante el sistema xCELLigence El sistema xCELLigence (analizador RTCA n° de cat. 05228972001 , Roche) controla los acontecimientos celulares en tiempo real sin incorporar marcadores. El sistema mide la impedancia eléctrica a través de microelectrodos ¡nterdigitados integrados en el fondo de placas E de cultivo tisular. La medición de la impedancia proporciona información cuantitativa sobre el estado biológico de las células, incluidos el número, la viabilidad y la morfología de las células. Para determinar la velocidad de la proliferación celular, las células A549:hC4.4a se incubaron con un anticuerpo control de isotipo hlgG1 sin unión o B01-3 100 nM de B01-3 (como hlgG1). En primer lugar, a cada pocilio de una placa E 96 se añadió 50µ? de medio de cultivo celular (RPMI (Biochrom FG1640) + 10 % de FCS (Biochrom #S0145) + 1 pg/ml de Puromicina (Sigma 8833)). La placa E 96 se introdujo en la estación RTCA MP (n° de cat. 05331625001 , Roche) y se determinó la impedancia de fondo de cada pocilio. Las soluciones se retiraron de nuevo de la placa E 96 y a los pocilios se añadieron 50µ? de la suspensión celular (5000 células/pocilio de A549:hC4.4a en un medio de cultivo celular). Se volvió a introducir las placas y se midieron durante 4 horas a 37°C + 5 % de C02. La placa E 96 se retiró de nuevo y se añadieron 100µ? de anticuerpos (100nM de B01-3 o de la hlgG1 control sin unión) en medio de cultivo celular. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Después de la reintroducción de la placa E, la medición se realizó durante 92 horas a 37°C + 5 % de C02. Los resultados se analizaron con el paquete de software integrado. Los resultados se representan en la figura 6. El anticuerpo B01-3 claramente disminuye la proliferación celular en comparación con un anticuerpo control sin unión. Esto muestra que los anticuerpos de la invención inhiben eficazmente la proliferación celular de las células que expresan C4.4a.

Tabla 7: Secuencias de anticuer os

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo caracterizado porque une de forma específica al dominio S1 de C4.4a.

2. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, presenta reacción cruzada con un C4.4a de roedores.

3. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se internaliza tras la unión a las células que expresan C4.4a.

4. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, compite por la unión a C4.4a con el anticuerpo M31-B01 o M20-D02 S-A.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR representada en la tabla 7, o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % ó 95 % idéntica a al menos una secuencia de VH o VL representada en la tabla 7.}

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR de M31-B01 o M20-D02 S-A, o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % ó 95 % idéntica a la secuencia de VH o VL de M31 -B01 o M20-D02 S-A.

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una de las secuencias de CDR de cadena pesada de conformidad con las secuencias consenso SEC ID N°: 297 o SEC ID N°: 302 (CDR H1 ), SEC ID N°: 298 o SEC ID N°: 303 (CDR H2) o SEC ID N°: 299 o SEC ID N°: 304 (CDR H3), y/o al menos una de las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las secuencias consenso de SEC ID N°: 300 o SEC ID N°: 305 (CDR L1), SEC ID N°: 22 o SEC ID N°: 306 (CDR L2) o SEC ID N°: 301 o SEC ID N°: 307 (CDR L3).

8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada de conformidad con la SEC ID N°: 297 (CDR H1 ), SEC ID N°: 298 (CDR H2) y SEC ID N°: 299 (CDR H3) y las secuencias de CDR de cadena ligera de conformidad con la SEC ID N°: 300 (CDR L1), SEC ID N°: 22 (CDR L2) y la SEC ID N°: 301 (CDR L3), o b) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada de conformidad con la SEC ID N°: 302 (CDR H1 ), SEC ID N°: 303 (CDR H2) y SEC ID N°: 304 (CDR H3) y las secuencias de CDR de cadena ligera de conformidad con la SEC ID N°: 305 (CDR L1), SEC ID N°: 306 (CDR L2) y la SEC ID N°: 307 (CDR L3).

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una secuencia de CDR o al menos una secuencia variable de cadena pesada o de cadena ligera tal como se representa en la tabla 7.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera o las secuencias variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de tabla 7.

11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 75-77 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 78-80 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 5, 9 y 13, y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 17, 21 y 25, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 6, 10 y 14, y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 18, 22 y 26, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 7, 11 y 15 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 19, 23 y 27, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 8, 12 y 16 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 20, 24 y 28, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 45-47 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 48-50 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 55-57 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 58-60 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 65-67 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 68-70 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 85-87 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 88-90 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 95-97 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 98-100 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 105-107 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 108-110 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 115-117 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 1 8-120 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 125-127 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 128-130 o las secuencias de CDR de cadena pesada variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 135-137 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 138-140.

12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 81 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 82, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 33 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 29, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 34 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 30, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 35 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 31, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 36 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presentan mediante la SEC ID N°: 32, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 51 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 52, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 61 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 62, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 71 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 72, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 91 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 92, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 101 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 102, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 111 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 112, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 121 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 122, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 131 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 132, o una secuencia variable de cadena pesada tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 141 y una secuencia variable de cadena ligera tal como se presenta mediante la SEC ID N°: 142.

13. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un anticuerpo IgG.

14. El fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un fragmento scFv, Fab, Fab' o un fragmento F(ab')2.

15. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno.

16. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno.

17. Un conjugado anticuerpo-fármaco, caracterizado porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno aislado del mismo tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Una secuencia de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 16.

19. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 18.

20. Una célula aislada caracterizada porque expresa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1-16 y/o que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 18 o un vector tal como se define en la reivindicación 19.

21. Una célula aislada de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada porque en la que dicha célula es una célula procariota o una célula eucariota.

22. Un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1-16, el procedimiento estando caracterizado porque comprende el cultivo de una célula tal como se define en la reivindicación 21 y la purificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

23. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1-16 o un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 17 como medicamento.

24. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1-16 como agente diagnóstico.

25. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las 1-16 o un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 17 como medicamento para el tratamiento del cáncer.

26. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en una o más de las reivindicaciones 1-16 o un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 17.

27. Una combinación caracterizada porque comprende una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación 26 y uno o más compuestos terapéuticamente activos.

28. Un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado con la presencia indeseada de C4.4a, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 26 o una combinación de acuerdo con la reivindicación 27.