MX2012006199A - Agentes para tratamiento de enfermedad. - Google Patents
Agentes para tratamiento de enfermedad.Info
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Abstract
Se proporcionan métodos de criba para identificar moléculas capaces de ligar a CD4 y capaces de activar células T regulatorias CD4+CD25+. Además se proporcionan anticuerpos y fragmentos de anticuerpo capaces de activar células T regulatorias CD4+CD25+ y métodos y usos que involucran los anticuerpos y sus fragmentos.
Description
AGENTES PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a agentes para el tratamiento de enfermedad, y específicamente a tratamiento mediante la activación de células T regulatoria de CD4+CD25+, a través del receptor de superficie de célula T CD . La invención involucra métodos de criba para identificar estos agentes, agentes capaces de activación de las células T regulatorias CD4+CD25+ y su uso en el tratamiento de enfermedad, en particular enfermedades autoinmunes, así como en métodos realizados in vitro.
Técnica Previa
Las células T pertenecen a los linfocitos y son responsables por una cantidad de funciones clave en el sistema inmune. En mamíferos, las células T (timocitos) se diferencian en la glándula timo de las células progenitoras hematopoyéticas formadas en la médula ósea. Parte del proceso de diferenciación es la expresión de receptores de superficie característicos, primordialmente las glicoproteínas CD4 y CD8. Las células T que expresan CD4, así denominadas células T CD4+, ligan a complejos MHC clase II (Reinerz and Schlossman, Cell 19, 821-827 (1980); Reinerz et al., PNAS USA 77, 1588-1592 (1980)), mientras que las células T CD8+ ligan a complejos MHC clase I (Fitch, Microbiol. Rev. 50, 50-69 (1986)). Las células T son liberadas a la sangre y linfa.
Células CD4 positivas pueden diferenciarse en sub-poblaciones auxiliares T (Thl y Th2), pero también en células T regulatorias . Las células T regulatorias además pueden dividirse en sub-clases, las derivadas de timo (nTreg) inducibles (iTregs) son las más evaluadas.
Aunque hay otras sub-poblaciones Treg, tales como por ejemplo Trl o Th3, la presente invención se refiere a las Tregs derivadas de timo CD4 positivas (nTregs) y Tregs inducibles, ambas que expresan el factor de transcripción Foxp3. Como una diferencia principal Foxp3 se expresa en forma estable y permanente en nTregs confirmando el fenotipo Treg irreversible, mientras que Tregs inducibles exhiben expresión Foxp3 inducible y transitoria, que es reversible.
Tregs secretan citocinas inmunomoduladoras tales como IL-10, TGF beta o IL-35 y ejercen actividad supresora en células T efectoras mediante varios mecanismos, por ejemplo mediante supresión de la producción de citocinas proinflamatorias , contacto célula-célula directo y modulan el estado de activación o función en células que presentan antigeno (APC) (Shevach et al., Immunity (2009) 30; 636-645) . Una característica principal de células Treg CD25 CD4 positivas es su fenotipo anérgico, lo que significa que no proliferan ante estímulo TCR, que puede restaurarse por la adición de IL-2 exógena.
Un papel prominente para Tregs comprende mantener homeostasis referente a inmuno respuestas y auto tolerancia. La disfunción Treg está correlacionada con enfermedades autoinmunes.
Comúnmente, células T regulatorias pueden ser aisladas mediante las glicoproteinas receptoras de superficie CD4, CD25, y caracterizado por tinción intracelular de F0XP3. Una proteina de superficie adicional representa CD127 (IL-7 R) , que se regula a la baja en células Treg, y puede emplearse para adicional purificación de Tregs. Además, la expresión de CD39 (endonucleotidasa) (Borselino et al., Blood (2007) 110, 1225-1232) o GARP (repeticiones de glicoproteina A predominantes (GARP, o LRRC32) (Wang et al., PNAS (2009) 106, 32. 13439-13444) .
CD4 humano se codifica en cromosoma 12 y pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig). Su función natural como un receptor de superficie de célula T se relaciona a la activación de célula T al ligar complejos HC clase II. Además, CD4 puede ligar la proteina HIV-1 gpl20, la proteina P4HB/CDI, y las proteínas cápside de virus de herpes humano HHV-7. Interacciones con las proteínas HIV-1 gpl20 y Vpu también se han reportado. CD4 tiene 458 aminoácidos. La secuencia péptido se muestra en la Figura 1.
La entrada UniProt P01730 proporciona la estructura de dominio de CD4 como se muestra a continuación en la Tabla 1, y en la Figura 6. Los primeros 25 aminoácidos son un péptido de señal, que se disocia en la forma biológicamente activa. Las posiciones 26 a 396 constituyen el dominio extracelular , que es seguido por la región de transmembrana, posiciones 397 a 418. Asn296 y Asn325 son sitios de glicosilación conocidos (Kónig et al., J. Biol. Chem. 263, 9502-9507 (1988); Carr et al., J. Biol. Chem. 264, 21286-21295 (1989)).
La última parte, posiciones 419 a 458, es el dominio citoplásmico . Aquí, el sitio de enlace para la Tirosina proteína cinasa LCK (p56lck) (Rudd et al., PNAS USA 85, 5190-5194 (1988); Veillette et al., Cell 55, 301 (1988)), es parte de la ruta de señalización activada por ligandos que enlazan con CD4.
Tabla 1 Tabla que muestra la estructura de dominio de CD4 (de acuerdo con UniProt P01730)
La parte extracelular comprende 4 dominios tipo inmunoglobulina . El primero, el dominio N-terminal, que comprende las posiciones 26 a 125 es un dominio de tipo V como Ig. Con base en la homología a anticuerpos, tiene tres homólogos de regiones de determinación de complementariedad de antígeno, CDR1, CDR2 y CDR3 (Ashkenazi et al., PNAS USA 87, 7150-7154 (1990)) (ver Figura 6). Las extensiones CDR1 y CDR2 están involucradas en el enlace de moléculas MHC clase II (Moebius et al., PNAS USA 89, 12008-120012 (1992)), la proteína envolvente gpl20 HIV-1 (Moebius et al., J. Exp. Med. 176, 507-517 (1992)) y anticuerpos anti-CD4 (Lanza et al., PNAS USA 90, 11683-11687 (1993)). Phe68 de CDR2 juega un papel clave para reconocer y ligar moléculas MHC clase II y la proteína envolvente gpl20 HIV-1
(Sharma et al., Biochemistry 44, 16192-16202 (2005)). Todos los ligandos conocidos de CD4 enlazan al dominio tipo V como Ig N-terminal.
El mecanismo de cómo funcionan las células T regulatorias no es totalmente claro. Tregs CD4+CD25+ inhiben activación de células T policlonales y específicas de antígeno. La supresión puede ser mediada por ejemplo por un mecanismo dependiente de contacto celular que requiere activación de Tregs CD4+CD25+ mediante TCR pero Tregs no muestran una respuesta proliferativa ante activación TCR o estímulo con anticuerpos mitogénicos
(anérgico) (Shevach, Nature Rev. Immunol 2: 389 (2002). Una vez estimulados, son competentes para suprimir en una forma independiente de antígeno, la respuesta de células T CD4+ y células T CD8+ al igual que inhiben la activación de célula B y expansión clonal.
La capacidad de células T regulatorias CD4+CD25+ para tener una influencia de control en actividad del sistema inmune ha significado que se ha reconocido como un objetivo o diana potencial para tratar enfermedades, tales como enfermedades autoinmunes, en donde es conveniente ejercer un control en el sistema inmune.
La autoinmunidad es la falla de un organismo en reconocer sus propias partes constituyentes (hasta niveles sub-moleculares) como "propias", que resulta en una respuesta inmune contra sus propias células y tejidos. Cualquier enfermedad que resulta de esta inmuno respuesta aberrante se denomina una enfermedad autoinmune. Enfermedades autoinmunes incluyen esclerosis múltiple (MS = Múltiple Sclerosis), artritis reumatoide (RA = Rheumatoid Arthritis) , psoriasis, artritis psoriásica, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, Diabetes Mellitus Tipo I (TID) , miasfenia gravis (MG) , síndrome autoinmune poliglandular tipo II (APS-II), tiroiditis de Hashimoto (HT = Hashimoto 's thyroiditis ) , lupus sistémico eritematoso (SLE = Systemic Lupus Erythematosus ) , Síndrome de Sjórgen y síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALS = Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome) .
Enfermedad autoinmune ocurre cuando células T reconocen y reaccionan con moléculas "propias", esto es moléculas producidas por las células del hospedero. La activación de células T "autoreactivas" por presentación de autoantígenos procesados por células que presentan antígeno (APC = Antigen Presenting Cells) lleva a su expansión clonal y migración a los tejidos específicos en donde inducen inflamación y destrucción de tejido.
La supresión de estas células efectoras T funciona al utilizar fármacos inmunosupresores, es una estrategia terapéutica principal que se ha empleado exitosamente para tratar enfermedades autoinmunes. Sin embargo, estos fármacos inducen en general inmuno supresión debido a su deficiente selectividad, resultando en inhibición no solo de las funciones nocivas del sistema inmune, sino también de las útiles. Como consecuencia, varios riesgos como infección, cáncer y toxicidad de fármacos pueden ocurrir.
En general se conviene que las células T CD4+ juegan una parte principal, para iniciar y mantener autoinmunidad . De acuerdo con esto, se ha propuesto el utilizar mAbs contra moléculas de superficie de células T CD4+, y en particular anti-CD4 mAbs, como agentes inmunosupresores. Aunque numerosos estudios clínicos confirman el interés potencial de este enfoque, también dieron lugar a varios aspectos para atender a fin de hacer anti-CD4 mAbs más adecuados para uso en la práctica clínica rutinaria .
Varios mecanismos diferentes de acción para CD4 mAbs se han propuesto, incluyendo: (1) antagonismo de interacciones CD4-MHC II que resulta en inhibición de activación de célula T, (2) modulación de receptor CD4 como se determina por una disminución en expresión de superficie celular de CD4, (3) señalización parcial a través del receptor CD4 en la ausencia de entrelazamiento de receptor de células T que puede suprimir subsecuente activación de célula T y activar la muerte apoptósica de célula T CD4, (4) citotoxicidad dependiente de complemento mediada por Fe (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que lleva a agotamiento de células T CD4 , y (5) estimulo de células T reguladoras.
Varios anticuerpos anti-CD4 que hacen blanco en células T, han estado en desarrollo clínico ( Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Masón et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al'., Rheumatology 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)) primordialmente dirigidos al agotamiento de células CD4+ con solo unos cuantos anticuerpos CD4 que han sido atribuidos a los otros mecanismos como TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A.
El enfoque de usar agentes dirigidos a la activación de células T regulatorias para la terapia de enfermedades autoinmunes ha demostrado ser extremadamente difícil. La activación de Tregs mediante TCR utilizando el anticuerpo anti-CD3 agonista OKT-3 (Abramowicz et al, N Engl. J ed. 1992 Sep 3; 327 (10) : 736) o mediante la molécula CD28 co-estimulatoria utilizando el anticuerpo anti-CD28 superagonista TGN 1412 lleva a completo agotamiento de la población de células T regulatorias así como otras células T convencionales y la inducción sistémica y liberación de cantidades excesivas de citocinas pro-inflamatorias incluyendo IFN-?, TNF-a, IL-1 y IL-2, resultando en síndrome de liberación de citocinas (CRS = Cytokine Reléase Syndrome) clínicamente aparente en humanos (Suntharalingam et al, N Engl. J Med. 2006 Sep 7 ; 355 ( 10 ): 1018-28 ) .
Sin embargo, anticuerpos anti-CD4 recientemente humanizados se han descrito en WO2004/083247, que son capaces de activar células T regulatorias CD4+CD25+. Los anticuerpos descritos en WO2004/083247 son versiones humanizadas del anticuerpo de ratón, mB-F5, un CD4 antihumano IgGl murino descrito por Racadot et al. (Clin. Exp. Rheum. , 10, 365-374 (1992)). El epítopo de mB-F5 se reportó por Racadot et al., que se extiende por los dominios C2 tipo 1 y tipo 2 como Ig de CD4 humano del aminoácido 162 al aminoácido 232 como se muestra en la Figura 6.
Pruebas clínicas subsecuentes reportadas en WO2009/112502, O2009/121690, WO2009/124815 y en WO2010/034590 , utilizando uno de estos anticuerpos, designado BT061 (un IgGl monoclonal humanizado) ha resultado en el tratamiento exitoso de pacientes que sufren de psoriasis y artritis reumatoide, proporcionando prueba de que estos anticuerpos son capaces de tratar enfermedades autoinmunes en forma segura y con buena eficacia.
Los resultados clínicos promisorios logrados han incrementado el interés en proporcionar adicionales agentes terapéuticos que tienen propiedades similares. Por lo tanto el objetivo de la presente invención es proporcionar métodos de criba para identificar estos agentes, y proporcionar adicionales agentes terapéuticos.
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un método para cribar una molécula capaz de ligar a CD4, que comprende:
(a) proporcionar una o más moléculas candidato;
(b) determinar si la una o más moléculas candidato son capaces de ligar a una o más de las siguientes regiones de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192; y
(c) seleccionar una molécula determinada de la etapa (b) capaz de ligar a CD4.
Los presentes inventores han encontrado en forma inesperada que el anticuerpo humanizado BT061 liga a un dominio de CD4 que previamente no se reconocía como un sitio de enlace de ligando. Este hallazgo es sorprendente en forma particular dado que lo que se conocía en la técnica como el epítopo para el anticuerpo murino, mB-F5, del BT061 se derivó. Los presentes inventores también han establecido los residuos de BT061 que están involucrados en enlace de la molécula CD4 y han encontrado de manera sorprendente que no todas las CDRs de BT061 están involucrados en enlace CD4.
La identificación de la región de enlace, y detalles del mecanismo de enlace, han permitido el desarrollo de adicionales métodos de criba, y de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos capaces de activar células T regulatorios CD4+CD25+.
De acuerdo con esto, la presente invención también proporciona un método para cribar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de ligar con CD4 que comprende :
(a) proporcionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende CDRl y CDR2 de la cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de la cadena pesada de BT061 opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de CDRs siempre que :
(i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57;
(iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o
TyrllO,
(b) determinar si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de ligar a CD4, y
(c) seleccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo determinado en la etapa (b) para ser capaz de ligar a CD4, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
Aún más, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprenden CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones de aminoácidos en las secuencias de CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57; (iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o
Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO,
y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
La invención se ilustrará a manera de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes Figuras, en donde :
La Figura 1 muestra la secuencia péptido (SEQ ID No: 1) y fuentes disulfuro de CD4 humano (UniProt ID P01730) .
La Figura 2? muestra la secuencia péptido (SEQ ID No: 2) de la cadena ligera del anticuerpo humanizado BT-061. Los residuos de CDRs se muestran con cuadros (CDR1: SEQ ID No: 4, CDR2 : SEQ ID No: 5 y CDR3: SEQ ID No: 6). Los residuos circundados por cuadros punteados no se representan por la estructura de cristal.
La Figura 2B muestra la secuencia péptidos (SEQ ID No: 3) de la cadena pesada del anticuerpo humanizado BT-061. Los residuos de las CDRs se muestran con cuadros (CDR 1: SEQ ID No: 7, CDR2 : SEQ ID No: 8 y CDR 3: SEQ ID No: 9). Residuos circundados por los cuadros punteados no se representan por la estructura de cristal.
La Figura 3 proporciona una representación de la unidad asimétrica de la estructura de cristal CD4-BT061.
La Figura 4 proporciona una representación de la estructura de cristal CD4-BT061 superpuesta con una estructura de cristal de un complejo CD4 con una molécula MHC clase II (PDB código 1JL4).
La Figura 5 proporciona una representación de la estructura de cristal CD4-BT061 superpuesta con una estructura de cristal de un complejo de CD4 con la proteina gpl20 HIV-1 (PDB código 2NY1) . Esto último, además, se liga al anticuerpo 17b.
La Figura 6 muestra la secuencia péptido (SEQ ID No: 1) y la estructura de dominio CD4 humano (Uniprot ID P01730) .
La Figura 7 proporciona una representación del sitio de enlace BT061 en la superficie CD4. Todos los aminoácidos mostrados son parte del dominio C2-tipo 1 como Ig, que sigue el dominio tipo V como Ig N-terminal.
La Figura 8 proporciona la secuencia de cadena ligera de aminoácidos BT061 (SEQ ID No: 2). Los aminoácidos involucrados en enlace de CD4 están marcados por cuadros redondeados.
La Figura 9 proporciona la secuencia de cadena pesada de aminoácidos BT061 (SEQ ID No: 3) . Los aminoácidos involucrados en enlace a CD4 se marcan por cuadros redondeados.
La Figura 10 proporciona una representación del sitio de enlace BT061 en la superficie de CD4. Los aminoácidos que forman la cavidad de unión o enlace para yrios de la cadena pesada BT061 están con circulo.
La Figura 11 proporciona una representación del sitio de enlace BT061 en la superficie de CD4. Aminoácidos que forman la cavidad de enlace para Argi0 a Aspi06 de la cadena pesada BT061 están en circulo.
La Figura 12 proporciona una representación del sitio de enlace BT061 en la superficie de CD . Aminoácidos que forman la cavidad de enlace para Tyr34 de la cadena ligera BT061 están en circulo.
Descripción Detallada de la Invención
Métodos de Criba
La presente invención proporciona métodos para cribar una o más moléculas capaces de enlazar a CD4, y de preferencia CD4 humano. Como se indicó anteriormente, la información que se proporciona aquí describe la interacción entre CD4 y el anticuerpo BT061, que es capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+. En particular, BT-061 liga tanto a células auxiliares T como T regulatorias y activa selectivamente células T regulatorias sin activación de las células auxiliares T. El conocimiento de las estructuras de BT061 y como éstas interactúan con la región extracelular de CD4, proporciona un medio para diseñar y producir agentes con propiedades similares a BT061 en términos de enlace CD4 y activación selectiva de células T regulatorias .
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para cribar una molécula capaz de ligar a CD4, que comprende: (a) proporcionar una o más moléculas candidato; y (b) determinar si la una o más moléculas candidato son capaces de ligar a una o más de las siguientes regiones o aminoácidos de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185, 187, 189, 190 y 192; (c) seleccionar una molécula determinada en la etapa (b) que es capaz de ligar a CD4. Más particularmente, las regiones de CD4 humano son aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192.
En una modalidad, las etapas (a) a (c) pueden completarse en un sistema de computadora y la interacción entre CD4 y una o más moléculas candidato modelarse, con base en la información que se proporciona aquí respecto a la interacción entre BT061 y CD4 humano, es decir la criba se realiza mediante diseño de moléculas asistido por computadora. En particular, un modelo estructural tridimensional de CD4, y en particular, su región extracelular, se genera en el sistema de computadora por interacción de la secuencia de aminoácidos para al menos parte de CD4 y soporte lógico o programa que se conoce por la persona con destreza en la especialidad, por ejemplo Discovery Studio (Accelrys®) o Benchware 3D Explorer (Tripos). Estos programas además permiten la alimentación de, o generación de novo, de información de secuencia y/o estructural en una o más moléculas candidato. La capacidad de una molécula candidato para ligar a las regiones de CD4 identificadas como importantes para enlace BT061 (que se discute más a continuación) puede entonces examinarse.
En particular, el método para criba de una molécula capaz de ligar a CD4 puede comprender como etapas (a) y (b) : (i) alimentar en . un sistema de computadora o programa, una secuencia 'de . aminoácidos de CD4 que comprende cuando menos los aminoácidos 148 a 154, 164 a 168 y los ácidos 185, 187, 189, 190 y 192; (ii) generar un modelo tri-dimensional del polipéptido o péptido codificado por la secuencia de aminoácidos; (iii) generar o alimentar la estructura tridimensional de una o más moléculas candidato; y (iv) simular la interacción entre las secuencias de aminoácidos de CD4 y una molécula candidato para determinar si la molécula candidato es capaz de ligar a CD4 mediante los aminoácidos 148 a 154, 164 a 168 y los ácidos 185, 187, 189, 190 y 192.
La selección de moléculas candidato además puede restringirse al considerar las características de la interacción CD4-BT061 descritas a continuación en el Ejemplo 1. En particular, moléculas candidato pueden restringirse a aquellas que ligan a las regiones de CD4 sin puentes de sal y/o aquellas que incluyen uno o más componentes acomodados en una o más de las cavidades de enlace en la superficie CD4 que involucra:
(i) residuos aminoácidos S152, V153, Q154, Q164, G165, T185, V186, L187 y K192 de CD4 (como se muestra en la Figura 10 ) ;
(ii) residuos aminoácidos S150, S152, G165 y G166 de CD4 (como se muestra en la Figura 11); y/o
(iii) residuos aminoácidos S150, P151, S152 y K167 (como se muestra en la Figura 12) . ·
El método de esta modalidad implementada por computadora además puede comprender una etapa (d) en la que la molécula seleccionada en la etapa (c) se produce. Por ejemplo, cuando la molécula selecta es un péptido, la secuencia de aminoácidos del péptido se toma de la computadora y el péptido se fabrica in vitro. Posteriormente, la actividad de la molécula selecta puede estimarse in vitro, al poner en contacto la molécula selecta con un péptido o polipéptido que comprende las regiones/aminoácidos relevantes de CD4, o al poner en contacto la molécula selecta con una célula que expresa CD4. Estas etapas in vitro se describen más a continuación con relación a la modalidad del primer aspecto en la que las etapas (a) a (c) se realizan in vitro.
En particular, como una alternativa a la modalidad asistida por computadora descrita anteriormente, las etapas (a) a (c) del método de criba pueden realizarse in vitro, y la etapa (b) puede comprender poner en contacto una o más moléculas candidato con las regiones/aminoácidos relevantes de CD4 y determinar si la molécula candidato es capaz de ligar a una o más de estas regiones. Un ejemplo de esta modalidad comprende un método para cribar una o más moléculas capaces de ligar a CD4, que comprende: (a) poner en contacto la una o más moléculas con un péptido que comprende una o más de las siguientes regiones de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168, y aminoácidos 185 a 192; y (b) detectar si la una o más moléculas ligan a la una o más regiones del péptido, en donde la molécula no comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de BT061.
El método de la presente invención de preferencia comprende cribar una biblioteca de moléculas. En particular, la biblioteca puede ser una biblioteca de expresión en fago preparada de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. La biblioteca puede ser una biblioteca péptido que refleja combinación sistemática de diferentes aminoácidos/péptidos en gran número. Usualmente, una biblioteca péptido se sintetiza en fase sólida, primordialmente en resina, que puede hacerse como superficies planas o perlas (síntesis de péptido en fase sólida) . Esta biblioteca puede emplearse para interacciones de proteína-proteína, descubrimiento de fármaco, purificación de proteínas y variación en la secuencia de reconocimiento de anticuerpo para generar variantes de anticuerpo con diferentes afinidades.
Adicionales bibliotecas además de la expresión en fago incluyen expresión de levadura, expresión bacteriana, expresión mRNA, expresión ribosomal y polisomal. La expresión de ribosoma. comprende un proceso que resulta en proteínas producidas que se asocian con su progenitor mRNA que se emplea, como un complejo, para enlazar a un ligando inmovilizado en una etapa de selección. La expresión de mRNA resulta en péptidos o proteínas producidos que se asocian con su progenitor mRNA mediante un enlace puromicina.
La expresión bacteriana representa una tecnología de biblioteca de polipéptidos expresada en la superficie de bacterias que puede cribarse utilizando citometría de flujo o procedimientos de selección iterativa (bioselección por ciclos de absorción-desorción) .
En la técnica de expresión de levadura (Abbott), una proteina de interés se expresa como una fusión a la proteina Aga2p en la superficie de levadura. La proteina Aga2p se emplea naturalmente por levadura para mediar contactos célula-célula durante apareamiento de células de levadura. Como tal, la expresión de una proteina mediante Aga2p proyecta la proteina lejos de la superficie celular, produciendo al mínimo interacciones potenciales con otras moléculas en la pared de célula de levadura. El uso de separación magnética y citometría de flujo en conjunto con una biblioteca de expresión de levadura, es un método altamente efectivo para aislar ligandos de proteínas de alta afinidad contra casi cualquier receptor a través de evolución dirigida. .
La expresión de polisoma comprende muy grandes bibliotecas de péptidos expresadas en polisomas bacterianos (Mattheakis et al., 1994). La tecnología péptido MULTIPIN® también puede emplearse para generar las bibliotecas (Tribbick et al., J Immunl. ethods (2002) 267: 27-35).
En la etapa de contacto in vitro, la molécula selecta o una molécula candidato puede ponerse en contacto con un péptido o polipéptido que comprende una o más de las siguientes regiones o aminoácidos (las
"regiones/aminoácidos relevantes de CD4") de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185, 187, 189, 190 y 192, en donde los aminoácidos son numerados como se muestra en la Figura 6. De preferencia, las regiones de CD4 humano son: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192. Más preferible, el péptido o polipéptido comprende todas estas regiones. Aún más preferible, el péptido o polipéptido además comprende cuando menos uno de los siguientes aminoácidos de CD4 humano: Lys26, Argl56, Argl59, Lysl61 y Lys'192. Más preferible, el péptido o polipéptido comprende el dominio C2-tipo 1 como Ig de CD4 humano (es decir los aminoácidos 126 a 205) y opcionalmente también el dominio tipo V como Ig. En particular, DI de CD4 se utiliza para estabilizar el epitopo. De acuerdo con esto, cuando el péptido o . polipéptido se va a utilizar en un ensayo de enlace competitivo, se prefiere el uso de DI. Sin embargo, se nota que uno o dos aminoácidos de estas regiones pueden retirarse. Se prefiere que el péptido sea de menos de 50 aminoácidos de longitud y más preferible menos de 20 aminoácidos de longitud.
Los péptidos pueden ser péptidos naturales, por ejemplo aquellos elaborados por disociación enzimática de CD4 o directamente por expresión de células hospederas, o pueden ser péptidos sintéticos. Los péptidos también pueden ser modificados por ejemplo por PEGilación, fosforilación, amidación, acetilación, etiquetado con biotina o colorantes fluorescentes tales como FITC o etiquetado con isótopos. Adicionales modificaciones pueden utilizar técnicas como "Aplicación de péptido antigeno múltiple". Con esta tecnología se pueden producir anticuerpos anti-péptido de alto título y vacunas de péptido sintético. Este sistema utiliza los grupos a- y e-amino de lisina para formar una estructura principal a la cual múltiples cadenas péptido pueden conectarse. Dependiendo del número de tiras lisina, diferentes números de ramas péptido pueden sintetizarse. Esto elimina la necesidad por conjugar el antígeno con un portador de proteína (Briand et al., J Immunol Methods (1992). 156; 2: pp 255-265).
Como se indicó anteriormente, los métodos de la presente. invención de preferencia se realizan con secuencias péptidos de CD4 humano. Sin embargo, pueden igualmente realizarse con regiones homologas de proteínas CD4 de otros mamíferos, u otras moléculas que contienen el dominio C2-tipo 1 como Ig.
La etapa de poner en contacto la una o más moléculas, molécula o molécula candidato selecta con un péptido y la etapa de detectar si la una o más moléculas ligan a una o más regiones del péptido, pueden realizarse de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad. En particular, en una modalidad de la invención, el péptido es un péptido lineal que se aplica por puntos o fija sobre una membrana. Durante la etapa de contacto, las moléculas que son capaces de ligar a la secuencia péptido CD4 quedan atrapadas .
En una modalidad alterna, se crean péptidos que pueden imitar la conformación del epitopo CD4 humano tipo silvestre. Esto puede realizarse por métodos de diseño molecular basados en estructura conocidos en la técnica.
Los siguientes métodos de expresión se mencionan, que pueden emplearse para criba:
Para cribar epitopos lineales, puede emplearse una técnica de cartografía de epitopo. Secuencia de aminoácidos que representa partes del epitopo diana (por ejemplo de 10 - 15 aminoácidos) que se superponen por un aminoácido, son aplicados por puntos sobre una membrana (por ejemplo celulosa). Subsecuentemente, es posible cribar proteínas, o péptidos que reconocen la secuencia de aminoácidos aplicada por puntos. Varias rondas de selección pueden realizarse con diferentes condiciones de severidad para seleccionar enlazadores de alta afinidad.
Se han desarrollado para cribar por técnicas de epitopos discontinuos, tales como expresión en fago. Bibliotecas estándar contemporáneas de péptidos lineales o cíclicos tienen una diversidad de aproximadamente 109 clones independientes, lo que significa que bibliotecas con hasta siete posiciones aleatorias pueden garantizar en forma teórica cobertura completa del repertorio de secuencia potencial. Sistemas de traducción in vitro resultan en bibliotecas péptido con una superior diversidad ya que el acoplamiento del péptido con su ARNm se logra en un sistema libre de células que involucra pequeñas partículas de ARN/péptido/ribosoma o sólo complejos ARNm/péptido . Adicionales bibliotecas incluyen expresión polisomal o ribosomal (Mattheakis et al., PNAS 1994; 91 (19) : 9022-6) o la tecnología PROfusion (Roberts and Szostak, PNAS (1997) 94 (23) : 12297-302) . Esta última tecnología comprende una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica puede generarse por traducción in vitro de ARNms sintético que transporta puromicina, un antibiótico aceptor peptidilo, en su extremo 3 ' .
Expresión minicelular (Patente Número E.U.A. 7,125,679) también es posible, que incluye la preparación de péptidos para criba que se expresan en la superficie exterior que contiene biblioteca oligonucleótido. De manera similar, biblioteca péptido aleatoria Flitrix (Invitrogen Corp.) que utiliza la proteína flageral bacteriana FliC y tioredoxina, también puede utilizarse.
Además, al igual que los métodos de expresión anteriormente mencionados, la espectrometría de masas o Recuperación de Epítopo en Fase Sólida (SPHERE = Solid Phase Epitope Recovery) (Genzyme) también puede utilizarse (Lawendowski et al., J Immunol., (2002) 169: 2414-2421).
En una modalidad, la detección de enlace comprende realizar cristalografía de rayos X o RMN. En particular, pueden seleccionarse moléculas que ligan al péptido sin un puente de sal, utilizando métodos de cristalografía de rayos X que se conocen en la técnica.
En forma alterna, o además, el método del primer aspecto puede comprender poner en contacto la molécula selecta o candidato con una célula que expresa CD4, y en particular una célula T regulatoria CD4+CD25+. Esto puede realizarse en particular para determinar la capacidad de la molécula selecta o molécula candidato para modular la actividad ' de, y en particular activar células T regulatorias CD4+ CD25+ (de preferencia selectivamente activar células Tregs sin activar las células auxiliares T) , o determinar la capacidad de la molécula selecta o molécula candidato para reducir, o modular a la baja, expresión de receptor CD4, en particular en poblaciones de linfocitos específicas en un cultivo in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells) . En estas modalidades se prefiere que la molécula selecta o la molécula candidato sean anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y en particular aquellas del tipo IgGl como se discute más a continuación.
Para el ensayo de modulación, Treg puede en general aislarse utilizando equipos de aislamiento comercialmente disponibles (aislamiento de perlas magnéticas) clasificación por CD25, CD27, CD62L y/o CD127 y tinción intracelular adicional por FoxP3. Tregs son negativos para CD127, positivos para CD25 y Foxp3. CD39, una ectonucleotidasa asociada con superficie celular, también puede emplearse para purificar Treg con funciones supresoras fuertes ( andapathil et al., J Immunol. Methods (2009). 346 (1-2), 55-63). Equipos comercialmente disponibles pueden utilizar una combinación de selección negativa de CD4+ seguido por aislamiento positivo de CD25 positivo resultando en una población de células positivas CD4 CD25. Estas células además pueden procesarse. CD25 y el factor de transcripción Foxp3 son marcadores de expresión asociados con la función supresiva de Tregs. Aunque la tinción intracelular con Foxp3 confirma el fenotipo regulatorio, debido a la tinción intracelular, las células no son viables para adicional uso terapéutico. Foxp3 se emplea comúnmente como un marcador intracelular de Tregs activos funcionalmente/Tregs activados.
Además, debido al hecho de que BT061 y la molécula que se criba, ligan a un epitopo que es distinto del ligado por otros anticuerpos comercialmente disponibles, se pueden purificar Tregs con equipos de aislamiento comercialmente disponibles (aislamiento de perlas magnéticas) y adicionalmente otro anticuerpo CD4 (e.g. SK-3 OKT4), que no compite por el sitio de enlace BT061 en CD4 y subsecuentemente ensayan para activación de Tregs con la molécula candidato o molécula selecta.
La capacidad de la molécula candidato para activar Tregs puede ensayarse al examinar la actividad supresora de Treg después de contacto con la molécula candidato por co-cultivo de Tregs con células T efectoras CD25 negativas CD4 positivas. Tregs activados son capaces de inhibir la proliferación de células T efectoras CD4+ CD25, que pueden etiquetarse con CFSE (evaluación de expansión celular mediante ensayo de dilución CFSE) . En forma alterna, la proliferación de células efectoras puede determinarse por incorporación de [3H] Timidina.
En forma más particular, la capacidad supresora puede ensayarse por ejemplo por una reacción de linfocitos mixtos (MLR = Mixed Lymphocyte Reaction) . División celular de células T efectoras puede inhibirse por la acción supresora de Tregs. Para este CD4+ CD25- autólogas sin tratamiento previo, células respondentes T se estimulan con PBMCs estimuladores alogénicos irradiados. Tregs o células T convencionales se titulan en el cultivo y la proliferación puede estimarse por incorporación de Timidina.
Activación de Treg también puede ensayarse a través de la determinación de producción de AMP cíclico (como se describe en WO 2008/092905) .
Citoquinas afectadas por Tregs activados en un co-cultivo también pueden medirse para determinar la actividad de estas células hacia células efectoras. Por ejemplo, Tregs ejercen su actividad supresora también mediante consumo IL-2 que resulta en inhibición de proliferación de células efectoras T. IL-4 o IFN pueden también determinarse en el ensayo co-cultivo y se reducen en caso de Tregs activados. Además, marcadores de activación de superficie en células efectoras T tales como CD25, se reducen cuando las células Treg se activan y ejercen actividad supresora.
Adicionalmente, la determinación de muerte celular (por factores tales como Bim) en células efectoras (que también pueden ser CD4 positivas) inducido por Tregs activado, en co-cultivo representa un método adicional por examinar si Tregs están activados (Pandiyan et al., Nature Immunol. (2007) 8 1353-1362).
Ya que Tregs representan sólo una pequeña proporción en la sangre (2-10%), varias estrategias de expansión se conocen. Por ejemplo, después de estímulo TCR con un anti-CD3 y coestímulo con anti-CD28 y rapamicina puede emplearse para incrementar el número de células T. La rapamicina promueve la supervivencia selectiva de Tregs, pero no las células T efectoras.
Varios protocolos de expansión policlonales están disponibles, por ejemplo siguiendo la selección positiva para células Treg CD4/CD25 puede expandirse en forma policlonal in vitro al utilizar un anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 (para estímulos) en combinación con IL-2 y/o IL-15 capaz de incrementar los números de Treg mientras que conserva capacidad supresora (Earle et al., Clin. Immunol. (2005) 115: 3-9) .
En relación a modulación de expresión CD4, se nota que al agregar anticuerpos anti-CD4, la expresión de receptores CD4 en superficies celulares puede reducirse. Esta, característica puede emplearse cómo base para un ensayo de potencia para determinar el grado de enlace a CD4. En particular, en este ensayo, la etapa de contacto puede comprender (i) incubar el candidato o molécula selecta con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre de donador humano a 37 °C; (ii) tinción de las células incubadas con anticuerpo etiquetado anti-CD4 que no compite con BT061 por enlace CD4; y (iii) detectar la cantidad de tinción para determinar la ocupación de receptores CD4 , y por lo tanto la cantidad de moléculas CD4 presentes en las superficies celulares.
Más específicamente, este ensayo involucra aislar PBMC (es decir linfocitos y monocitos) de sangre de donador humano, que después se incuban con diversas concentraciones del candidato o molécula selecta (de preferencia un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) a 37 °C. Después de incubación por 3 horas, las células se tiñen al agregar anticuerpos etiquetados con fluorócromo, tales como ficoeritrina anti-CD4, que ligan a un epitopo diferente en CD4 que el ligado por BT061. Estos anticuerpos de tinción etiquetan receptores CD4 en poblaciones de linfocitos especificas. Ya que el epitopo BT061 y el anticuerpo CD4 marcado con fluorócromo utilizados reconocen diferentes epitopos en la molécula CD4 y no compiten, esta técnica permite que la cantidad de receptores CD4 en la superficie celular se determine, independientemente de enlace a CD4 por la molécula candidato o selecta. Se realiza la medición en un citómetro de flujo en donde las células etiquetadas con anticuerpo pasan a través de un haz láser y se estimulan. Cuando se estimulan por el haz láser, las células teñidas fluorescen en proporción al anticuerpo ligado, y la luz emitida se captura por el citómetro de flujo y después se evalúa utilizando el soporte lógico conocido en la especialidad, por ejemplo el soporte lógico FlowJo (Tree Star, Inc) . Utilizando el soporte lógico (tal como el soporte lógico Parallel Line Assay, Stegmann Systems) es entonces posible calcular una actividad relativa (potencia) para la muestra en relación a la corrida estándar en paralelo.
En una modalidad adicional de este aspecto de la invención, la etapa de contacto puede comprender el contacto del péptido o polipéptido CD4 (de preferencia que comprende DI y D2 de CD4) o célula que expresa CD4, y la molécula candidato/selecta con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo competidor que tiene los dominios variables de cadena pesada y ligera de BT061, para determinar si la molécula candidato/selecta es capaz de bloquear el enlace del anticuerpo competidor o fragmento de anticuerpo a CD4.
La una o más moléculas candidato en el primer aspecto pueden ser un péptido o un no péptido. En particular, 1a una o más moléculas pueden ser un mimótopo, un peptidomimético, una molécula pequeña, una proteina de reconocimiento con base en lipocalina natural o de ingeniería, un oligonucleótido, un siRNA, un DARPin, una fibronectina, un affibody, un inhibidor de tipo Kunitz, un aptámero péptido, una ribosima, una toxina, un camélido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una molécula derivada de anticuerpo.
Los mimótopos son péptidos que imitan proteínas, carbohidratos o epítopos de lípido y pueden generarse por tecnología de expresión en fago. Cuando se seleccionan por anticuerpos, representa epítopos de células B exclusivamente y están carentes de epitopos de célula T específicos de antígeno/alérgeno . Acoplados a portadores o presentados en un péptido antigénico múltiple forman mimótopos que logran inmunogenicidad e inducen respuestas de anticuerpo específicas de epítopo al vacunar.
Un péptido mimético es una cadena de tipo de proteína pequeña diseñada para imitar un péptido. Típicamente surgen de modificación de un péptido existente a fin de alterar las propiedades de la molécula. Por ejemplo, pueden surgir de modificaciones para cambiar la estabilidad de la molécula o actividad biológica. Estas modificaciones involucran cambios al péptido que no ocurren naturalmente (tales como estructuras principales alteradas y la incorporación de aminoácidos no naturales) .
Un ejemplo de péptido miméticos fueron aquellos diseñados y sintetizados con el propósito de enlace a proteínas diana a fin de inducir las células de cáncer en una forma de muerte celular programada denominada apoptosis. Esencialmente estos trabajan imitando interacciones clave que activan la ruta apoptósica en la célula. Un plegámero es una molécula u oligómero de cadena discreta, que adopta una estructura secundaria estabilizada por interacciones no covalentes (Geliman, Acc. Chem. Res (1998) 31 (4): 173-180; Hill et al., Chem. Rev. (2001) 101 (12) : 3893-4012) . Son moléculas artificiales que imitan la capacidad de proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos para plegar en conformaciones bien definidas tales como hélices y hojas ß. Los plegámeros se ha demostrado que exhiben una cantidad de propiedades supramoleculares interesantes, incluyendo autoensamblado molecular, reconocimiento molecular y química hospedero-anfitrión. Se estudian como modelos de moléculas biológicas y se ha mostrado que exhiben actividad antimicrobiana. También tienen gran aplicación potencial para el desarrollo de nuevos materiales funcionales.
Una pequeña molécula es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que, por definición no es un polímero. El límite de peso molecular superior para una molécula pequeña es de aproximadamente 800 Daltons lo que permite la posibilidad de difundirse rápidamente a través de las membranas celulares de manera tal que puedan alcanzar sitios de acción intracelular . Una pequeña molécula ejerce alta afinidad a un biopolímero tal como una proteína, ácido nucleico, o polisacárido y además altera la actividad o función del biopolímero.
Proteínas de Repetición Anquirina Diseñadas (DARPins = Designed Ankyrin Repeat Proteins) son proteínas artificiales que también son capaces de reconocer un antigeno o estructura antigénica. Se derivan estructuralmente de Proteínas Anquirina, son de aproximadamente 14 kDa (166 aminoácidos) y consisten de tres motivos de repetición. Exhiben una afinidad comparable con antigenos como anticuerpos. (Stumpp et al., Drug Discov. Today (2008) 13, Nr. 15-16, S. 695-701) .
Las moléculas Affibodies® son moléculas de proteínas de alta afinidad pequeñas y robustas que pueden someterse a ingeniería o diseñarse para ligar específicamente a una gran cantidad de proteínas diana.
El término "camélido" se refiere a anticuerpos que se producen por camélidos y comprenden un homodímero de cadena pesada y derivados de estas moléculas (Muyldermans et al., Veterinary Inmunology and Inmunopathology, 128; 1-3; pp.178-183 (2009) ) .
Se prefiere que la molécula candidato sea un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. La frase "un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una molécula derivada de anticuerpo" cubre anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multi-específieos y fracamentos de anticuerpos. La expresión "fragmento de anticuerpo" incluye, en particular, fragmentos que comprenden fragmentos Fab, Fab', F(ab) '2, Fv y scFv y fragmento bivalente (diabody) o fragmento bivalente (tribody) . De preferencia, estos se basan en anticuerpos humanos o humanizados. Más preferiblemente el anticuerpo comprende una región/dominio constante, es decir una porción Fe. Cuando el anticuerpo comprende una región constante humana, esta región constante puede seleccionarse entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 y IgG . Regiones constantes preferidas se eligen entre dominios constantes de IgG, en particular IgGl.
Las porciones Fe de diferentes subclases Ig se ligan por FcR celular que son especificas para subclases individuales. Tres diferentes clases FcR se conoce que ligan isotipos IgG con afinidades discretas, CD16, CD32 y CD64. Patrones diversos de FcyR se expresan por diversas células inmunes diferentes tales como monocitos, células B, células destructoras naturales (NK) y otras. Los presentes inventores han encontrado in vitro que la capacidad de la región constante del anticuerpo BT061 para ligar receptores Fe (FcR), es critica para la capacidad del anticuerpo para provocar modulación a la baja CD4 en células T. En particular, estudios in vitro indican que de los receptores Fcy, el receptor Fcyl, que primordialmente se expresa en monocitos, está primordialmente involucrado; la presencia de monocitos en un cultivo de PBMC es necesaria y suficiente para conferir modulación a la baja COA en células T tratadas con BT061.
De acuerdo con esto, en una modalidad de la invención, la molécula candidato es capaz de ligar a un receptor Fe, de preferencia FcyRI (es decir CD64) y más preferiblemente comprende la porción Fe de un anticuerpo IgGl. Además, o en forma alterna, la molécula candidato es capaz de ligar a monocitos mediante un receptor Fe.
En este aspecto de la presente invención, la molécula que se criba no es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera BT061. Estas secuencias CDR se muestran en las Figuras 2A y 2B. En una modalidad preferida, la molécula que se criba no es la molécula B-F5 murina descrita por Racadot et al. (Clin. Exp. Rheum., 10, 365-374 (1992)).
En una modalidad preferida del primer aspecto de la invención, cuando la una o más moléculas candidatos son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo comprenden CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y
Ile57;
(iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO.
En forma alterna, la molécula candidato es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende dominios V que tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% identidad de secuencia con los dominios V de BT061 (es decir SEQ ID No: 2 y SEQ ID No: 3) y que comprende el motivo de secuencia SGYSY (SEQ ID No: 10) en CDR1 del dominio V de cadena ligera, el motivo de secuencia LASILE (SEQ ID No: 11) en CDR2 del dominio V de cadena ligera y el motivo de secuencia SYY/F/HRYD (SEQ ID No: 13) en CDR3 del dominio V de cadena pesada.
En este método, la una o más moléculas cribadas son un conjunto de moléculas candidato definido por su similaridad al anticuerpo BT061 y aquellos residuos dentro de EST061 que los presentes inventores han identificado como importantes en la interacción entre el anticuerpo BT061 y CD4. En particular, este método de preferencia es aquel que identifica moléculas que tienen afinidad/especificidad de enlace aproximadamente equivalente o mejor y actividad de activación Treg en comparación con BT061.
Las secuencias péptido de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo humanizado BT061 se muestran en las Figuras 2A y 2B respectivamente. Las CDRs de la cadena ligera y pesada están marcadas en estas Figuras. Aquí, los residuos aminoácido dentro de estas CDRs se identifican por tipo y número de residuo, en donde el número representa la posición del aminoácido dentro de la región variable del anticuerpo BT061 de cadena ligera o pesada como se representa en las Figuras 2A y 2B. El uso de tipo y número de residuo se ha realizado con el propósito de identificar claramente el residuo aminoácido de BT061 CDR que es referido. Sin embargo, se apreciará que el número del residuo no se pretende que limite el residuo a estar en esa posición en el anticuerpo o fragmento candidato que se criba en el método. Por ejemplo, en un anticuerpo de esta modalidad Ser32 puede estar en la posición 31 dentro una CDRl de cadena ligera si un residuo aminoácido no esencial se ha eliminado de las secciones 1 a 30 de la cadena ligera.
En una modalidad preferida, las substituciones de aminoácido en la secuencia de CDRl y CDR2 de la cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de la cadena pesada BT061 se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5 a continuación. Más preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Tyr53 o Phe53 y una cadena pesada que comprende Ser28 (como se muestra en la Tabla 7 en el Ejemplo 1) . En forma alterna o además, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que contiene Asp64, y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene al menos una de Asp31 y Glu56 (como se muestra en la Tabla 8, en el Ejemplo 1). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo además puede comprender la CDR3 de la cadena ligera BT061 y/o la CDR2 de la cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de estas CDRs en donde las substituciones se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
Anticuerpo o fragmentos de anticuerpo candidatos para utilizar en los métodos de criba pueden generarse al mutar la secuencia conocida de BT061. En particular, cuando estas mutaciones están dentro de las CDRs pueden ser mutaciones dirigidas para asegurar que los aminoácidos descritos anteriormente se retengan o se realicen las substituciones deseadas.
Cuando la etapa (a) del método de criba se realiza in vitro, mutagénesis dirigida puede emplearse para provocar intercambio de aminoácidos en las posiciones definidas dentro de las CDRs. Aunque al saber la secuencia de ADN correspondiente de los aminoácidos, se puede crear una biblioteca de mutantes específicos que contienen un intervalo de substituciones de aminoácido deseadas. En donde las etapas (a) a (c) del método de criba se van a realizar en un sistema de computadora, la estructura tridimensional de los anticuerpos candidato o fragmentos de anticuerpo puede generarse al alimentar la secuencia de aminoácidos en una forma similar a la indicada anteriormente en relación a CD4.
Tabla 4 Tabla que muestra variaciones de secuencia de las CDRs de cadena ligera BT061
Tabla 4 continúa
Tabla 5 Tabla que muestra variaciones secuencia de las CDRs de cadena pesada BT061.
Tabla 5 continúa
Variaciones isostéricas son aquellas que no provocan efectos estéricos, es decir no cambian la conformación del anticuerpo en forma alguna.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para cribar una molécula candidato, que es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que es capaz de ligar con CD4, que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende CDR1 y CDR2 de la cadena ligera BT061 y CDR1 y CDR3 de la cadena pesada BT061, opcionalmente con substituciones de aminoácido en las secuencias de las CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera CDR1 comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57;
(iii) la cadena pesada CDR1 comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO,
(b) determinar si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de ligar a CD4, y (c) seleccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo determinado en la etapa (b) que es capaz de ligar a CD4, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
En una modalidad, las etapas (a) a (c) del método de criba de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, pueden realizarse en un sistema de computadora en una forma similar a la descrita anteriormente en relación al primer aspecto de la invención. En particular, una cantidad de variantes BT061 pueden generase in silico con base en información que aquí se proporciona de los residuos importantes para la interacción de BT061 con su epitopo CD4, y la interacción de estas variantes con CD4 simulado .
En esta modalidad, el método además puede comprender una etapa en la cual el anticuerpo o fragmento de anticuerpo candidato se pone en contacto con una célula que expresa CD4.
En una modalidad alterna, a la realizada en un sistema de computadora, las etapas (a) a (c) del método de criba de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, pueden realizarse in vitro y la etapa (b) puede comprender poner en contacto el anticuerpo o fragmento de anticuerpo candidato con una célula que expresa CD4. De preferencia, la capacidad de ligar CD4 se determina con base en la capacidad del candidato para activar células T regulatorias CD4+CD25+.
En particular, este aspecto de la presente invención, puede ser un método para cribar por un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprende:
(a) poner en contacto uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con células T regulatorias CD4+CD25+;
(b) estimar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para activar las células T regulatorias CD4+CD25+; y
(c) identificar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que activa las células T regulatorias CD4+CD25+,
en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de las CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y
Ile57;
(iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31,
Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO,
y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
Se nota que la descripción de las modalidades y características preferidas que se proporcionan anteriormente en relación al método de criba de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, también aplican al método de criba de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.
Estos aspectos de la invención ambos pueden además comprender la producción de la molécula selecta y en particular el anticuerpo o fragmento de anticuerpo selectos, para su uso futuro o análisis corriente abajo.
De acuerdo con esto, la invención además proporciona un método para producir una composición teraipéutica y composiciones terapéuticas que se obtienen por el método. En particular, el método comprende:
(a) seleccionar una molécula determinada como capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+, utilizando el método de acuerdo con los métodos de criba descritos anteriormente: y
(b) producir una composición terapéutica que comprende la molécula .
En particular, la composición terapéutica puede ser fabricada al combinar la molécula con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticos aceptables.
Anticuerpos y fragmentos de anticuerpo
El trabajo de los presentes inventores ha permitido la identificación de las características de BT061 que son importantes por su interacción con, y activación de células T regulatorias CD4+ CD25+. Esto ha llevado a la identificación de mutantes/variantes específicos del anticuerpo BT061 que serán capaces de activar células T CD4+CD25+ regulatorias.
De acuerdo con esto, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprenden CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061, opcionalmente con sustituciones aminoácido en las secuencias de las CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57;
(iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO,
y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
En forma alterna, el tercer aspecto proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprenden CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 opcionalmente con sustituciones aminoácido en las secuencias de CDRs siempre que:
(i) la cadena ligera de CDRl comprende: Ser32 o Pro32; Gly33 o Ala33; y Tyr 34;
(ii) la cadena ligera de CDR2 comprende: Leu54, Ile54 o Thr54; y Ile57, Leu57; Val57 o Thr57;
(iii) la cadena pesada de CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y
(iv) la cadena pesada de CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o
TyrllO,
y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
Como se discutió anteriormente, las secuencias péptido de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo humanizado BT061 se muestran en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Las CDRs de la cadena ligera y pesada se marcan en estas figuras. Como se discutió anteriormente, los residuos aminoácido dentro de estas CDRs se identifican por tipo y número de residuo, en donde el número representa la posición del aminoácido dentro de la región variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo BT061, como se representa en las Figuras 2A y 2B. El uso de tipo y número de residuo ha sido realizado con el propósito de identificar claramente el residuo aminoácido de la BT061 CDR que aquí se refiere. Sin embargo, se apreciará que el número del residuo no se pretende que limite el residuo a que esté en esa posición en el anticuerpo o fragmento de la invención. Por ejemplo, en un anticuerpo de la invención, Ser32 puede estar en la posición 31 dentro de una CDR1 de cadena ligera si un residuo aminoácido no esencial se ha eliminado de la sección 1 a 30 de la cadena ligera.
En una modalidad preferida, las sustituciones de aminoácido en la secuencia de CDR1 y CDR2 de la cadena ligera BT061 y CDR1 y CDR3 de la cadena pesada BT061, se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y la Tabla 5 anteriores. Más preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Tyr53 o Phe53 y una cadena pesada que comprende Ser28. En forma alterna o además, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que contiene Asp64, y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene al menos uno de los aminoácidos indicados en la Tabla 8 del Ejemplo 1 como importantes para interacción. En particular, la cadena pesada comprende Asp31 y/o Glu56. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo además puede comprender la CDR3 de la cadena ligera BT061 y/o la CDR2 de la cadena pesada BT061 opcionalmente con sustituciones aminoácido en las secuencias de estas CDRs en donde las sustituciones se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
En particular, reconocimiento y enlace del epitopo CD4 por el anticuerpo BT061 se basa en una constitución y conformación particulares de las tres regiones de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3. Aun cuando sólo CDR1 y CDR2 de la cadena ligera y CDR1 y CDR3 de la cadena pesada están en contacto directo con CD4, todas las. seis CDRs están muy densamente empacadas y soportan mutuamente la conformación entre si. Como consecuencia, muchas posiciones en la CDRs no toleran cualquier sustitución de aminoácidos sin pérdida de afinidad y potencia significantes de BT061. En algunas posiciones, sin embargo, sustituciones no desestabilizan la estructura.
Ejemplos de estas sustituciones conservadoras se dan en las Tablas 4 y 5. En estas tablas, las variaciones de secuencia se han seleccionado de manera tal que se conserva la red de interacción total. La sintaxis de interacciones atractivas asi como repulsivas se mantiene.
Interacciones polares dirigidas pueden ser invertidas, por ejemplo par donador-aceptor de puentes hidrógeno, los socios iónicos de puentes de sal o sitios de los socios de interacciones de dipolo-cuadripolo pueden conmutarse.
En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia (SEQ ID No: 14) :
10 20 30 40 50 60
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCXXXXXXS XSGYSYXYWY QQKPGQPPKL LIYLASILEX
70 80 90 100 110 120
GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSXXXPW XFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
130 140 150 160 170 180
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
190 200 210 218
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
en donde los aminoácidos en las posiciones 24 a 29, 31, 37, 60, 96 a 98 y 101 marcados como "X" se eligen de aquellos mostrados como las posiciones correspondientes en la Tabla 4,
y además comprenden la secuencia (SEQ ID No: 15):
10 20 30 40 50 60
EEQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFSFS XXXXYWLRQA PGKGLEWIGV XXXXXXXXXX
70 80 90 100 110 120
XXXXXXXGRF TISRDDSKNT VYLQMNSLKT EDTAVYYCSA SYXRYDXXXX FXXWGQGTLV
130 140 150 160 170 180
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
190 200 210 220 230 240
LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE
250 260 270 280 290 300 LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
310 320 330 340 350 360
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
370 380 390 400 410 420 SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
430 440 450 454
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
en donde los aminoácidos en las posiciones 31 a 34, 51 a 67, 103, 107 a 110, 111 y 112 marcados como "X" se eligen de aquéllos mostrados en las posiciones correspondientes en la Tabla 5.
En particular, motivos aminoácido específicos dentro de CDRl y CDR2 de la cadena ligera y dentro de CDR3 de la cadena pesada de BT061, son importantes para enlace CD4. De acuerdo con esto, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueden comprender SGYSY (SEQ ID No: 10) de CDRl de la cadena ligera BT061 y la secuencia LASILE (SEQ ID No: 11) de CDR2 de la cadena ligera BT061 y/o la secuencia YYRYD (SEQ ID No: 12) de CDR3 de la cadena pesada BT061.
Además, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ pueden tener dominios V que son al menos 80% idénticos, más preferiblemente al menos 90% idénticos a los dominios V del anticuerpo BT061, los dominios V comprenden:
(i) el motivo de secuencia SGYSY (SEQ ID No: 10) en CDR1 del dominio de cadena ligera V;
(ii) el motivo de secuencia LASILE (SEQ ID No: 11) en CDR2 del dominio V de cadena ligera; y
(iii) el motivo de secuencia SYXRYD en donde X es Y, F o H (SEQ ID No: 13) en CDR3 del dominio V de cadena pesada, con la condición de que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende dominios V que son 100% idénticos a los dominios V del anticuerpo BT061.
En modalidades especificas del tercer aspecto de la presente invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia CDR de la cadena ligera BT061 y las secuencias CDR de la cadena pesada BT061 con una sola sustitución de aminoácido en donde la sustitución es :
(i) A63G en la cadena pesada;
(ii) R33K en la cadena pesada; o
(iii) L98I en la cadena ligera.
o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende las secuencias CDR de la cadena ligera BT061 y las secuencias CDR de la cadena pesada BT061 y una sustitución de aminoácido doble en donde las sustituciones son :
(i) R33K y A63G en la cadena pesada; o
(ii) L98I en la cadena ligera y R33K en la cadena pesada.
En estas modalidades especificas de la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo además puede comprender las secuencias de dominio variable restantes de las cadenas pesadas y ligeras BT061.
Los anticuerpos o sus fragmentos de la presente invención en particular pueden fabricarse por mutagénesis de la secuencia polinucleótido que se conoce codifica los dominios variables del anticuerpo B-F5 murino y el anticuerpo BT061 (como se describe en WO200 /083247 ) .
Se nota que las definiciones y modalidades preferidas para anticuerpo y fragmentos de anticuerpo anteriormente descritas con relación al primer y segundo aspectos de la presente invención, también aplican al tercer aspecto de la invención. En particular, los anticuerpos y fragmentos de preferencias son anticuerpos IgGl y/o de preferencia comprenden una porción Fe tal que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de ligar a un receptor Fe, de preferencia FcyRI (es decir CD64). Más preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la porción Fe de un anticuerpo IgGl. Además, o en forma alterna, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de ligar a monocitos mediante un receptor Fe.
Además, la presente invención proporciona un péptido aislado que comprende menos de 50 aminoácidos de proteina CD4 humana e incluyen una o más de las siguientes regiones de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168, y aminoácidos 185 a 192. De preferencia, el péptido aislado comprende dos de estas regiones, más preferiblemente tres. Además, o en forma alterna, el péptido aislado comprende menos de 30 aminoácidos y más preferible el péptido aislado comprende menos de 20 aminoácidos.
Además, la presente invención proporciona un péptido mimótopo del péptido aislado descrito anteriormente .
La presente invención también incluye ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí descrito. El ácido nucleico puede ser ARN o ADN pero de preferencia ADN y más preferiblemente ADN codifica el dominio V de la cadena H o de la cadena L de los anticuerpos o fragmentos. El polinucleótido puede fusionarse con un polinucleótido que codifica la región constante de una cadena H o L humana con el propósito de expresar las cadenas completas H y L.
La invención también hace uso de casetes de expresión, en donde un polinucleótido como se describe anteriormente, se liga a secuencias de control apropiadas para permitir la regulación de su transcripción y traducción en una célula hospedera selecta. Adicionales modalidades son vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido o cásete de expresión como se describe anteriormente.
El polinucleótido como se describe anteriormente puede ligarse dentro de un vector de expresión a secuencias de control apropiadas que permiten la regulación de su transcripción y traducción en una célula hospedera selecta. Estas construcciones de ADN recombinantes pueden obtenerse e introducirse en células hospederas por las técnicas bien conocidas de ADN recombinante e ingeniería genética.
Células hospederas útiles pueden ser células procarióticas o eücarióticas . Entre células eucarióticas convenientes están células de plantas, células de levadura tales como Saccharomyces, células de insectos tales como Drosophila , o Spodoptera , y células de mamífero tales como HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc. Los anticuerpos o fragmentos aquí descritos pueden obtenerse al cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo bajo condiciones adecuadas para su expresión y recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula hospedera.
De acuerdo con la presente invención, la célula hospedera también puede ser un hibridoma que se obtiene por fusión de una célula que produce un anticuerpo de la presente invención con una célula de mieloma.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene usos médicos y no médicos como se describe más a continuación.
En vista de los usos médicos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí descritos puede formularse en una composición farmacéutica. En particular, una composición farmacéutica de la presente invención comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un portador o diluyente farmacéutico aceptable.
Aún más, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo adicionalmente puede comprender una etiqueta. Técnicas de etiquetado de anticuerpo son bien conocidas en la especialidad. De acuerdo con esto, a manera de ejemplo solamente, el anticuerpo puede ser etiquetado con una etiqueta fluorescente, tal como GFP o un colorante fluorescente (por ejemplo FITC, dyLight de alto desempeño) , un isótopo radiactivo, biotina, HRP, etc.
Usos de anticuerpos y epitopos
La presente invención además proporciona métodos de tratamiento utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. Ya que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de activar selectivamente células T regulatorias CD4+CD25+ tiene uso particular en terapia. La presente invención proporciona un método para tratar un sujeto que sufre de o para evitar a un sujeto que sufre de una enfermedad autoinmune o rechazo de trasplante que comprende administrar al sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. De manera similar, la presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe aquí para utilizar en medicina y específicamente para utilizar en tratamiento de una enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe aquí para la fabricación de un medicamento para uso en tratamiento de una enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante. Usos médicos convenientes y métodos de tratamiento son aquellos como se describe para BT061 en WO2009/112502 , O2009/121690 , WO2009/124815 y WO2010/034590, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia.
En una modalidad preferida, la enfermedad autoinmune se elige de psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo 1, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, tiroiditis autoinmune, miastenia gravis autoinmune, lupus sistémico eritematoso, colitis ulcerativa, dermatitis atópica, miocarditis y enfermedades relacionadas a trasplante, tales como reacciones de injerto contra hospedero u hospedero contra injerto o aspectos de tolerancia de órganos en general. El tratamiento de psoriasis y artritis reumatoide se prefiere particularmente .
La presente invención además proporciona un método para tratar a un sujeto que sufre de o para evitar que un sujeto sufra de una enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante, que comprende retirar una muestra que comprende células T regulatorias CD4+ CD25+ del sujeto, poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe aquí para activar las células T regulatorias CD4 + CD25+ y administrar las células activadas al sujeto. Este método puede adicionalmente incluir una etapa in vitro de incrementar el número de células Treg. Esto puede realizarse utilizando las estrategias de expansión aquí descritas (Peters et al., 2008) .
Similarmente, la presente invención proporciona células T regulatorias CD4+CD25+ activadas, que se han activado in vitro utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. Estas células regulatorias T activadas pueden ser para utilizar en medicina y en particular para uso en el tratamiento de enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante. De manera similar, la presente invención proporciona el uso de células T regulatorias CD4+CD25+ activadas utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante.
Pacientes con una enfermedad autoinmune tales como artritis reumatoide, exhiben Tregs que tienen menor capacidad supresiva, que puede deberse a citocinas pro-inflamatorias tales como TNF alfa. La presente invención incluye un método para cribar, aislar y/o activar Tregs de pacientes que sufren de una enfermedad autoinmune y pueden exhibir (pero no necesariamente) una población deshabilitada de Tregs. El modo de enlace especifico del anticuerpo y sus fragmentos de la pre.sente invención permite que el anticuerpo no sólo ligue a CD4 sino de manera más importante a Tregs activos. El aislamiento de Tregs puede ocurrir utilizando BT061 o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. En caso de que la etapa de activación siga, la selección CD4 debe ocurrir por un anticuerpo CD4 que no compite con BT061 para ligar a CD4. En forma alterna, una estrategia de expansión puede incluirse antes de la etapa de activación.
En la presente invención Tregs pueden aislarse utilizando BT061 y/o el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención y transferirse de regreso al paciente en "inmunoterapia basada en células Tregs". En forma alterna, Tregs pueden estimularse directamente al administrar a un paciente ya sea en forma intravenosa o subcutánea.
La inmunoterapia basada en Treg es de gran interés público para inducir tolerancia en enfermedades autoinmunes o trasplantes. Varios enfoques existen para generar Tregs inducibles (Tregs) in vitro tal que el uso de ácido retinoico que induce la expresión FoxP3 o co-cultivo con DCs derivados de médula ósea además de estimulo con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Por ejemplo, la solicitud de TCP No. PCT/US2009/054631 se refiere a un método para purificación de FoxP3 Tregs para el tratamiento de enfermedades' autoinmunes ("inmunoterapia basada en Treg") utilizando LAP y CD121b.
Aplicaciones terapéuticas requieren grandes cantidades de Tregs y estas celdas deberán retener su fenotipo regulatorio. En la actualidad solo se logra al seleccionar Tregs naturales. Tregs inducibles generados por métodos in vitro tiene la desventaja de que puedan invertir su fenotipo en células efectoras, provocando un riesgo no pronosticable para los pacientes.
Sin embargo, BT061 se ha demostrado que activa Tregs en una reacción de linfocitos mixtos (WO 2009112502 Al) . Esto se debe al modo de enlace inesperado especifico a CD4 aquí descrito.
Usos In vltro
El anticuerpo y fragmentos de anticuerpo y péptidos aislados de la presente invención también tienen una cantidad de usos in vitro. En particular, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí descrito puede ser empleado para activar células T regulatorias CD4+ CD25+ in vitro, o para identificar células T regulatorias CD4+ CD25+ in vitro.
Más específicamente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención puede emplearse en un método para cribar la presencia de células regulatorias T CD4+ CD25+ en una muestra. Este método puede comprender la etapa poner en. contacto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo etiquetado con la muestra, lavar la muestra para retirar anticuerpo no ligado y detectar la presencia de la etiqueta en la muestra.
En particular, en este método de criba, las células regulatorias T CD4+ CD25+ son células regulatorias T CD4+ CD25+ activadas. La muestra de preferencia es una muestra de sangre que se toma de un sujeto que sufre de la enfermedad autoinmune.
La presente invención también describe un equipo para aislar células T regulatorias CD4+ CD25+ que comprenden perlas magnéticas o revestidas con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aquí descrito. El equipo además puede comprender un segundo anticuerpo anti-CD25 y/o anticuerpo anti-CD4+. Anticuerpos adicionales para llevar a cabo etapas de selección adicionales, por ejemplo selección positiva para CD39, una etapa de selección negativa para CD127, agotamiento de células positivas CD19, también pueden incluirse. Péptido asociado a latencia (LAP = Latency Associated Peptide) , GARP o CD121b (11-1 tipo receptor 2) pueden emplearse para caracterización de fenotipo Treg.
Después de aislamiento Treg, las células aisladas con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención también pueden ser crio conservadas (Peters et al., PLoS One (2008) 3; 9: e 3161).
Aún más, la presente invención proporciona un método in vitro para la activación de células T regulatorias CD4+ CD25+ que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo descritos aquí. Métodos para estimar la capacidad supresora de Tregs activados comprenden (además del MLR anteriormente mencionado) , ensayos MLR que determinan el estado de activación de células T efectoras mediante liberación de citocina o expresión de marcadores de activación en células efectoras T (tales como el ensayo de proliferación y citocina descrito en WO 2009112592 Al, se incorpora aquí por referencia) . Estos métodos adicionalmente pueden comprender una primera etapa de aislar las células T regulatorias CD4+CD25+. Si esta etapa se completa con un anticuerpo, este anticuerpo deberá ser un anticuerpo CD4 no competitivo (por ejemplo 0KT4 o SK3). Esto permite que las células se activen en la etapa principal con el anticuerpo o su fragmento de la presente invención, que liga a un epitopo discreto en CD4. En otro escenario, las células pueden aislarse utilizando otros marcadores de expresión de Tregs, que son distintos de CD4 tales como CD25 o CD39, o por selección negativa mediante CD127.
El anticuerpo de la presente invención se ha descrito previamente como capaz de estimular Tregs, lo que puede confirmarse por co-cultivo con células efectoras T. Tregs son capaces de suprimir la proliferación de células T positivas CD8 por inhibición de la producción de 11-2 y IFN gamma por células T CD8 positivas aloreactivas . Además, se ha demostrado (WO 2009112592) que Tregs CD4+ CD25+ activados previamente hacen que las células CD8+ suprimidas sean incapaces de expresar CD25 ante estimulo de nuevo.
La presente invención ahora se describirá más en relación a las siguientes modalidades especificas.
E emplos
EJEMPLO 1 Estructura de Cristal de CD4 Complejado con BT061
Una estructura de cristal de CD4 humano complejado con el fragmento BT061 Fab se obtuvo por difracción de rayos-X.
Procedimiento de cristalización de BT061
(Fab) :CD4
CD4 humano recombinante se ha producido utilizando métodos convencionales: Construcciones diferentes de CD4 se clonaron por procedimientos estándar en vectores para expresión heteróloga en células de insecto seguido por purificación mediante NiNTA. El fragmento Fab de BT061 se disoció del anticuerpo intacto utilizando la proteasa papaina y purificó por proteina A. Subsecuentemente, el fragmento Fab se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño.
El complejo CD4-Fab se formó al mezclar las proteínas purificadas, con un exceso molar de CD4 y mayor purificación por cromatografía de exclusión de tamaño.
Cristales del complejo CD4:BT061 se prepararon por el método de co-cristalización, lo que significa que el complejo purificado se empleó en pruebas de cristalización que emplean ambas, una criba estándar con aproximadamente 1200 condiciones diferentes, así como condiciones de cristalización identificadas utilizando datos de literatura. Condiciones inicialmente obtenidas se han optimizado utilizando estrategias estándar, variando sistémicamente parámetros que influencian en forma critica la cristalización, tales como temperatura, concentración de proteina, proporción de abatimiento, y otros. Estas condiciones también se refinaron al variar en forma sistémicamente el pH o las concentraciones de precipitante.
Los cristales se congelaron instantáneamente y midieron a una temperatura de 100 K.
Los Datos de Difracción de Rayos X del complejo CD4:BT061 se recolectaron en SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Suiza) utilizando condiciones criogénicas. La estructura se resolvió y refino a una resolución final de 2.9 A.
Los cristales pertenecen a un grupo de espacio P21 con dos complejos en la unidad asimétrica. Los datos se procesaron utilizando los programas XDS y XSCALE. Estadísticas de recolección de datos se resumen en la Tabla 6 siguiente.
1 SWISS LIGHT SOURCE (SLS.; Villigen Suiza)
2 Números en paréntesis cuadrados corresponden a la casilla con Rsym = 44.3%
La información de fase necesaria para determinar y analizar la estructura se obtuvo por reemplazo molecular.
Modelos publicados de CD4 y un fragmento Fab se emplearon como un modelo de búsqueda.
Se realizaron subsecuentes construcciones y refinamiento de modelo de acuerdo con protocolos estándar con los paquetes de soporte lógico CCP4 y COOT . La unidad asimétrica (como se muestra en la Figura 3) consiste de dos de esos complejos con una resolución RMS total de 2.9Á.
En la estructura de cristal, los péptidos de señal están ausentes de la molécula CD4 y las cadenas péptido solo comprenden el dominio tipo V como Ig, el dominio C2-tipo 1 como Ig, y una parte del dominio C2-tipo 2 como Ig. Las cadenas exactas en la estructura de cristal alcanzan desde el residuo aminoácido 26 al residuo 258, como se muestra en la Figura 1 en donde los aminoácidos no representados por la estructura de cristal se marcan dentro de un cuadro punteado. De acuerdo con esto, las moléculas CD4 solo tienen los primeros dos puentes disulfuro, uno entre Cys4i y Cysiog, y otro entre Cysi55 y Cysi84.
Las cadenas ligeras de las dos unidades BT061 y la estructura de cristal alcanzan desde la posición 1 hasta la posición 215 en una unidad, y desde 1 hasta solo 182 en la otra unidad, como se muestra en la Figura 2A. Hay dos puentes disulfuro en las cadenas ligeras BT061, Cys23 -Cys92 y Cysi38 - Cysi98.
Las cadenas pesadas de las dos unidades BT061 en la estructura de cristal alcanzan desde la posición 2 a 219 en una unidad, como se muestra en la Figura 2B, y desde la posición 2 a 220 en la otra unidad. También, en las cadenas pesadas, hay dos puentes disulfuro, uno entre Cys22 y Cys98, y otro entre Cysi5i y Cys2o7.
Análisis de la estructura de cristal muestra que en contraste con otros ligandos conocidos de CD4, el enlace de BT061 involucra el dominio C2-tipo 1 como Ig, solamente. Esto constituye un modo de enlace totalmente nuevo, documentado por la estructura de cristal dada en el Apéndice .
Como se muestra en la Figura 3 BT061 no liga al dominio N-terminal de CD4, hay la posibilidad de enlace concurrente con BT061 y una molécula HC clase II, o una proteina envolvente gpl20 HIV-1 (como se muestra en las Figuras 4 y 5) .
Análisis detallado de la estructura de cristal revela los aminoácidos de interacción de ambos, CD4 y BT061. La selección se basó en un criterio de distancia. Tomando en cuenta la resolución de la estructura de cristal, todos los aminoácidos CD4 que tienen átomos que no son de hidrógeno dentro de una esfera de radio d = 4.5Á alrededor de cualquier átomo que no es de hidrógeno de un aminoácido BT061, se han seleccionado como socios de interacción. El radio d se ha seleccionado como la distancia típica de una interacción no enlazada, 3Á, extendido por la mitad de la resolución de estructura de cristal de 2.9Á (d= 3Á + ½ x 2.9Á = 4.45Á) .
Por lo tanto, la estructura de cristal muestra que el sitio de enlace de la superficie CD4 consiste de un enjambre de 7 aminoácidos consecutivos (Glyi4s a Glni5 ) , un enjambre de 6 aminoácidos consecutivos (Glni64 a hri6s) , más Thriss, Leui87, Asni89, Glnigo, y Lysi92, como se ilustra en la Figura 7.
La Tabla 7 a continuación muestra la matriz de socios de interacción de CD4 y BT061. Hay solo pocas interacciones 1:1 puras; la mayoría de los aminoácidos citados CD4 y BT061 interactúan con más de un socio. Las interacciones primordialmente son enlaces de hidrógeno, complementadas por contactos de van-der-Waals e interacciones polares.
En la hilera superior de la Tabla 7, se muestran los aminoácidos de CD4 que interactúan con aminoácidos de BT061. En el margen izquierdo, se dan los aminoácidos de BT061 que interactúan con CD4. Cada "x" corresponde a cuando menos una interacción. Ya que hay solo pocos apareamientos de interacción 1:1, el patrón extendido en hileras o columnas se encuentra. Seri50 y Proisi de CD4 interactúan con ambos, la cadena ligera y pesada de BT061. Vali86 que es una parte importante de la cavidad de enlace para Tyrios de la cadena pesada BT061 no se cita aquí, debido a que no hay interacciones directas con aminoácidos de BT061. Todas las interacciones se identifican ya sea en enlaces de hidrógeno, interacciones polares, contactos de van-der-Waals, o combinaciones de estos tipos de interacción. La identificación de los aminoácidos de interacción se basa en la estructura de cristal dada en el apéndice. Un criterio de distancia se aplicó, tomando en cuentan que todos los aminoácidos que tienen cuando menos un átomo que no es hidrógeno más cercano a d=4.5Á a un átomo que no es hidrógeno del otro socio molecular. Hablando en general, d corresponde a la distancia típica para una interacción no-covalente de 3Á aumentada a la mitad de la resolución total de la estructura de cristal (2.9Á) .
Tabla 7 Tabla que muestra los aminoácidos de interacción de CD4 y BT061.
La Figura 7 muestra los aminoácidos CD4 del sitio de enlace BT061 como una representación esquemática de su orientación relativa. Además, los aminoácidos que cumplen directamente con el criterio de distancia anteriormente mencionado, una cantidad de aminoácidos están disponibles para interacciones adicionales con BT061 ante cambios de conformación moderados de ambos, BT061 y CD4. Esos aminoácidos, Argi56, Gln188, Asni89, Glni90, y Lysi92 probablemente estarán involucrados en el mecanismo de transducción de señal de CD .
BT061 liga con ambas, la cadena ligera y la cadena pesada de CD . Los aminoácidos respectivos de la cadena ligera se muestran en la Figura 8. Los aminoácidos de la cadena pesada involucrados en enlace a CD4 se ilustran en la Figura 9.
yrXo5 de la cadena pesada BT061 juega un papel muy importante para la interacción con CD4. Su cadena lateral perfectamente ajusta en una cavidad en la superficie de CD4 (Figura 10) .
Aún cuando los puentes de sal son elementos típicos de interacción entre anticuerpos, no existen puentes de sal entre CD4 y BT061 en la estructura de cristal. De manera interesante, BT061 muestra una cantidad de puentes de sal intramoleculares. Uno de ellos, formado entre Argi04 y Aspi06, confiere interacciones polares con una cavidad en la superficie de CD4 (Figura 11) . La formación de puentes de sal intramoleculares puede influenciarse por substancias con actividad amortiguada, que a su vez puede inducir cambios de conformación de BT061 y el complejo con CD4, de esta manera contribuyendo a transducción de señal de CD4.
El otro residuo muy importante para la interacción con CD4 es Tyr34 de la cadena ligera BT061. Muy semejante a Tyr105 de la cadena pesada, Tyr34 se aloja en una cavidad en la superficie de CD4 (Figura 12).
Comparando la estructura de cristal del complejo de CD4 con BT061 con estructuras de cristal de los complejos CD4 con una molécula MHC clase II, y con la proteína envolvente gpl20 HIV-1, puede verse inmediatamente que BT061 se liga con una parte totalmente diferente de la superficie CD4. Respecto a los otros ligandos de CD4, BT061 liga en el lado opuesto de la parte extracelular de CD4 (Figuras 4 y 5) y no interfiere con los sitios de enlace de otros ligandos.
Los aminoácidos CD4 Lys26r Argi56, Lysi6i, y Lysig2 están disponibles para interacciones adicionales con aminoácidos complementarios de carga de BT061 como se indica en la Tabla 8 mostrada a continuación.
Tabla 8. Interacciones adicionales entre CD4 y BT061
En la hilera superior de la Tabla 8, . los aminoácidos de CD4 que pueden formar puentes de sal con aminoácidos de BT061, se ilustran. En el margen izquierdo, los aminoácidos socios de puente de sal posibles de BT061 se dan. Cada "x" corresponde a un puente de sal posible. Los pares indicados no corresponden al criterio de distancia de d=4.5Á anteriormente mencionado. Sin embargo, una serie de cambios de conformación moderados en ambos, CD4 y BT061 pueden resultar en la formación de los puentes de sal indicados. Para BT061, un cambio de la secuencia que se extiende de Ser56 a Gly68 de la cadena ligera, y Ser25 a Cys32, asi como Ser52 a Gly59 de la cadena pesada, permite formar los puentes de sal con Asp3i y GIU56 de CD4.
EJEMPLO 2 Crear y probar mutantes de BT061
Mutantes de dominio variable BT061 se fabricaron por introducción de mutaciones especificas en la secuencia nucleótido que codifica los dominios variables de BT061 y expresión de secuencia de aminoácidos mutada y por lo tanto anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, utilizando técnicas estándar para manipulación de ADN y producción de anticuerpo .
Las siguientes variantes BT061 se realizaron:
(1) seis variantes que tiene una mutación cada una en todas las 6 CDRs : las mutaciones en CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera son G33A, A55G y L98I, respectivamente; las mutaciones en CDR1, CDR2 y. CDR3 de la cadena pesada son R33K, A63G, y S101T, respectivamente;
(2) una variante que tiene dos mutaciones en un dominio variable: R33K y A63G en el dominio variable de cadena pesada; y
(3) tres variantes que tienen mutación paralela tanto de cadena pesada como ligera (por ejemplo combinaciones de variantes de cadena pesada y ligera de la parte (1) : cadena ligera L98I con cadena pesada R33K; cadena ligera A55G con cadena pesada R33K; y cadena ligera G33A con cadena pesada R33K.
La capacidad de las variantes BT061 para activar células T regulatorias CD4+CD25+ se determinó por ensayo in vitro. Un control negativo de un anticuerpo que no liga a CD4 se empleó. La variante BT061 que tiene una mutación en cadena pesada CDR3 (Y105W) también se creó como un control negativo; con base en los resultados obtenidos en el ejemplo 1, se pronosticó que este aminoácido fue critico para enlace BT061. Como controles positivos, se empleó un anticuerpo producido de la secuencia de cadena pesada y ligera maestra, asi como una muestra de BT061 que se produce para pruebas clínicas.
Ensayo in vitro:
La inducción de capacidad supresora de células T regulatorias CD4+CD25+ (Tregs) de donadores sanos por variantes del anticuerpo BT061, se estimó en reacciones de linfocitos mixtos alogenéicos (co-cultivo indirecto) .
Células T regulatorias CD4+ CD25+ se aislaron frescas de un primer donador (donador A) . PBMCs se obtuvieron de sangre-EDTA por centrifugación con gradiente de densidad. Tregs, células T respondedoras (Tresp) y APCs fueron separados en forma inmuno magnética de PBMCs como se describió previamente (Haas et al., J Inmunol. 2007 Jul 15; 179 (2) : 1322-30) . Tregs se pre-incubaron con o sin anticuerpo ligado a placa por 2 días. El número y fenotipo de Tregs se determinan por citometría de flujo de seis colores como se describió previamente (Haas et al., 2007).
Tregs pre-incubados se transfirieron a células T respondientes (segundo donador B) en la presencia de PBMCs irradiadas y agotadas de células T (primer donador A) . Después de estimulo, [3H] se agregó y la proliferación de células T respondientes se midió después de cinco días.
Resultados :
Los resultados del ensayo in vitro se muestran a continuación en la Tabla 9. El por ciento de inhibición de inhibición de célula T respondientes se midió tres veces por cada variante y se tomó un promedio.
Tabla 9. Resultados de ensayo in vitro con Variantes BT061s
Como se pronosticó, el mutante con genes inoperativos de maestro LC HC Y105W no liga a CD4 y fue incapaz de activar células T regulatorias . Además los resultados indican que posiciones sencillas dentro de la cadena pesada pueden mutarse al menos de acuerdo con las substituciones que se establecen en la Tabla 5 (variantes sencillas HC R33K, A63G y variantes dobles HC R33K y A63G retienen actividad) . Además, como se pronosticó por el trabajo de la estructura de cristal, los residuos que circundan Tyr34 en la cadena ligera que constituyen un bucle, también parecen ser cruciales para enlace.
Claims (78)
1. Un método para criba de una molécula capaz de ligar a CD4, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una o más moléculas candidato; (b) determinar si la una o más moléculas candidato es capaz de ligar a una o más de las siguientes regiones de CD4 humano: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192; y (c) seleccionar una molécula determinada en la etapa (b) que es capaz de ligar a CD .
2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) además comprende determinar si la una o más moléculas candidato ligan al menos uno de los siguientes aminoácidos de CD4 humano: 26, 156, 159, y 161.
3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa (b) comprende determinar si la una o más moléculas candidato es capaz de ligar a CD4 sin un puente de sal.
4. Un método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la una o más moléculas candidato es un anticuerpo, una molécula derivada de anticuerpo, un péptido, un oligonucleótido, un siRNA, un mimótopo, un peptidomimético, un plegámero, una molécula pequeña, una proteina de reconocimiento con base en una lipocalina natural o de ingeniería, un DARPin, una fibronectina, un affibody, un inhibidor tipo Kunitz, un aptámero peptídico, una ribozima o una toxina.
5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo camélido.
6. Un método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque una o más moléculas candidato son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que comprenden CDR1 y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDR1 y CDR3 de cadena pesada BT061, opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de CDRs siempre que: (i) la cadena ligera CDR1 comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34; (ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57; (iii) la cadena pesada CDR1 comprende: Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y (iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO.
7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las substituciones de aminoácido en la secuencia de CDR1 y CDR2 de cadena ligera y BT061 CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 se eligen de aquellas establecidas en las Tabla 4 y Tabla 5.
8. Un método de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Tyr 53 o Phe 53 y una cadena pesada que comprende Ser 28.
9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Asp64 y/o una cadena pesada que comprende Glu 56.
10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo además comprende la CDR3 de la cadena ligera BT061 y/o la CDR2 de la cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones de aminoácido en las secuencias de estas CDRs en donde las substituciones se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
11. Un método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las etapas (a) a (c) se realizan en un sistema de computadora.
12. Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende una etapa (d) de producir la molécula seleccionada en la etapa (c) .
13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende una etapa (e) de poner en contacto in vitro la molécula producida en la etapa (d) con una célula CD4+ o con un péptido o polipéptido que comprende una o más de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192.
14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la etapa (e) comprende determinar si la molécula producida en la etapa (d) : (i) ligar a un péptido que comprende una o más de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192; (ii) activa células T regulatorias CD4+CD25+; y/o (iii) reduce expresión de receptor CD4 en una célula que expresa CD4.
15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las etapas (a) a (c) se conducen in vitro y la etapa (b) comprende poner en contacto la una o más moléculas candidato con un péptido o polipéptido que comprende una o más de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192.
16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la una o más moléculas candidato son una biblioteca de moléculas.
17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la biblioteca es una biblioteca de expresión en fago.
18. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la etapa de determinar comprende realizar cristalografía de rayos X o RMN y seleccionar una molécula que liga al péptido o polipéptido sin un puente de sal.
19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque además comprende una etapa (d) de cribar una molécula selecta en la etapa (c) por su capacidad por activar células T regulatorias CD4+CD25+, y/o una etapa (e) de cribar una molécula seleccionada en la etapa (c) por su habilidad para reducir expresión de receptor CD4 en una célula que expresa CD4.
20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado porque el péptido o el polipéptido se fija a una membrana o una superficie conveniente equivalente, o se acopla a una perla magnética .
21. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado porque el péptido o polipéptido comprende el dominio 1 tipo C2 como Ig de CD4 humana o comprende el dominio tipo V como Ig y el dominio 1 tipo C2 como Ig de CD4 humana.
22. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, caracterizado porque el péptido o polipéptido imita la conformación del epitopo CD4 tipo silvestre.
23. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, caracterizado porque la etapa de contacto comprende contactar el péptido y la molécula con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo competidores que tienen los dominios variables de cadena pesada y ligera de BT061, para determinar si el candidato o moléculas selectas capaz de bloquear el enlace del anticuerpo o frajmento de anticuerpo competidores a las regiones del péptido o polipéptido.
24. Un método para producir una composición terapéutica, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar una molécula que se determina es capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ utilizando el método de la reivindicación 14 o reivindicación 19; y (b) producir una composición terapéutica que comprende la molécula selecta.
25. Una composición terapéutica que se obtiene por un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la molécula no comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera BT061.
26. Un método para cribar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de ligar CD4, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de las CDRs siempre que: (i) la cadena ligera CDRl comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34; (ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57; (iii) la cadena pesada CDRl comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y (iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO, (b) determinar si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de ligar a CD4, y (c) seleccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo determinado en la etapa (b) que es capaz de ligar a CD4, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada BT061 y CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera BT061.
27. Un método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las substituciones de aminoácido en las secuencias de CDRl y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDRl y CDR3 de cadena pesada BT061 se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
28. Un método de conformidad con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprenden una cadena ligera que 'comprende Tyr53 o Phe53 y una cadena pesada que comprende Ser28. . .
29. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Asp64 y/o una cadena pesada que comprende Glu 56.
30. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo además comprende la CDR3 de la cadena ligera BT061 y/o la CDR2 de la cadena pesada BT061, opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de estas CDRs en donde las substituciones se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
31. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, caracterizado porque las etapas (a) a (c) se realizan en un sistema de computadora.
32. Un método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque además comprende una etapa (d) de producir el anticuerpo o fragmento de anticuerpo seleccionado en la etapa (c) .
33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque además comprende determinar si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido en la etapa (d) : (i) activa células T regulatorias CD4+CD25+; (ii) liga a una o más de las siguientes regiones de CD4 : aminoácidos 148 a 154; aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192; y/o (iii) regula a la baja la expresión de CD4 en células que expresan CD4.
34. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, caracterizado porque las etapas (a) a (c) se realizan in vitro.
35. Un método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la etapa (b) comprende determinar si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo: (i) activa células T regulatorias CD4+CD25+; (ii) liga a uno o más de las siguientes regiones de CD4 : aminoácidos 148 a 154; aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192; y/o (iii) regula a. la baja la expresión de CD4 en células que expresan CD4.
36. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14, 19, 33 y 35, caracterizado porque las células que expresan CD4 son PB C.
37. Método para producir una composición terapéutica, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo identificado de acuerdo con la reivindicación 33 o 35 por ser capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+; y (b) producir una composición terapéutica que comprende la molécula selecta.
38. Una composición terapéutica que se obtiene por un método de conformidad con la reivindicación 37.
39. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprende CDR1 y CDR2 de cadena ligera BT061 y CDR1 y CDR3 de cadena pesada BT061, opcionalmente con substituciones aminoácido en las secuencias de las CDRs siempre que: (i) la cadena ligera CDR1 comprende: Ser32; Gly33; y Tyr 34; (ii) la cadena ligera CDR2 comprende: Leu54; y Ile57; (iii) la cadena pesada CDR1 comprende Asp31, Glu31, Thr31, Cys31, Pro31, Met31 o Tyr31; y (iv) la cadena pesada CDR3 comprende Tyrl03, Phel03 o Hisl03; Argl04; Tyrl05; Aspl06; y TrpllO, PhellO, His 110 o TyrllO, y en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada BT061 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera BT061.
40. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende la secuencia: 10 20 30 40 50 60 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCXXXXXXS XSGYSYXYWY QQKPGQPPKL LIYLASILEX 70 80 90 100 110 120 GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSXXXPW XFGQGTKVEI KRTVAAPSVF 130 140 150 160 170 180 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 190 200 210 218 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC en donde los aminoácidos en las posiciones 24 a 29, 31, 37, 60, 96 a 98 y 101 se eligen de aquellos que se muestran en las posiciones correspondientes en la Tabla 4, y además comprende la secuencia: 10 20 30 40 50 60 EEQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFSFS XXXXYWLRQA PGKGLEWIGV XXXXXXXXXX 70 80 90 100 110 120 XXXXXXXGRF TISRDDSKNT VYLQMNSLKT EDTAVYYCSA SYXRYDXXXX FXXWGQGTLV 130 140 150 160 170 180 TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 190 200 210 220 230 240 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE 250 260 270 280 290 300 LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 310 320 330 340 350 360 EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP 370 380 390 400 410 420 SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 430 440 450 454 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK en donde los aminoácidos en las posiciones 31 a 34, 51 a 67, 103, 107 a 110, 111 y 112 se eligen de aquellos mostrados en las posiciones correspondientes en la Tabla 5.
41. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende la secuencia SGYSY de CDR1 de la cadena ligera BT061 y/o la secuencia LASILE de CDR2 de la cadena ligera BT061 y/o la secuencia YYRYD de CDR3 de la cadena pesada BT061.
42. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque las substituciones de aminoácidos en las secuencias de CDRs son variaciones isostéricas.
43. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprende dominios V que son al menos 80% idénticos a los dominios V del anticuerpo BT061, los dominios V que comprende: (i) el motivo de secuencia SGYSY en CDRl del dominio V de cadena ligera; (ii) el motivo de secuencia LASILE en CDR2 del dominio V de cadena ligera; y (iii) el motivo de secuencia m SYXRYD en CDR3 del dominio V de cadena pesada en donde X es Y, F o H, con la condición de que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no comprende dominios V que son 100% idénticos a los dominios V del anticuerpo BT061.
44. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque las substituciones de aminoácido en la secuencia de CDRl y CDR2 de la cadena ligera BT061 y/o CDRl y CDR3 de la cadena pesada BT061 se eligen de aquellas que están establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
45. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 39 o la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende Tyr53 o Phe 53 y/o una cadena pesada que comprende Ser28.
46. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39, 44 ó 45, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera que contiene Asp64.
47. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39, ó 44 a 46, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende Glu 56.
48. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39, ó 44 a 47, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo además comprende la CDR3 de la cadena ligera BT061a y/o la CDR2 de la cadena pesada BT061 opcionalmente con substituciones de aminoácidos en las secuencias de estas CDRs, en donde las substituciones se eligen de aquellas establecidas en la Tabla 4 y Tabla 5.
49. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 ó 44 a 48, caracterizado porque comprende las secuencias CDR de la cadena ligera BT061a y las secuencias CDR de la cadena pesada BT061 con una sola substitución de aminoácido en donde la substitución es: (i) A63G en la cadena pesada; (ii) R33K en la cadena pesada; o (iii) L98I en la cadena ligera.
50. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 ó 44 a 48, caracterizado porque comprende las secuencias CDR de la cadena ligera BT061a y las secuencias CDR de la cadena pesada BT061 y una substitución doble aminoácido en donde las substituciones son: (iv) R33K y A63G en la cadena pesada; o (v) L98I en la cadena ligera y R33K en la cadena pesada.
51. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 49 y 50, caracterizado porque además comprende las secuencias de dominio variable restantes de BT061.
52. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 51, caracterizado porque además comprende un receptor Fe capaz de ligar a CD64.
53. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 52, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo IgG.
54. Un péptido aislado que comprende menos de 50 aminoácidos de proteina CD4 humana e incluye dos o tres de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168, y aminoácidos 185 a 192.
55. Un péptido aislado que comprende menos de 20 aminoácidos de proteina CD4 humana e incluyen una o más de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192.
56. Un mimótopo de un péptido aislado caracterizado porque comprende menos de 50 aminoácidos de proteina CD4 humana e incluye una o más de las siguientes regiones de CD4 humana: aminoácidos 148 a 154, aminoácidos 164 a 168 y aminoácidos 185 a 192.
57. Un ácido nucléico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53.
58. Un vector que comprende el ácido nucléico de la reivindicación 57.
59. Una célula hospedera o hibridoma que comprende el ácido nucléico de conformidad con la reivindicación 57 o el vector de la reivindicación 58.
60. Método para la producción de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, caracterizado porque comprende una etapa de cultivar la célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 60 en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo y separar el anticuerpo o fragmento del medio de cultivo.
61. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53 y además comprende un portador farmacéutico aceptable.
62. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, caracterizado porque además comprende una etiqueta.
63. Un método in vitro para la activación de células T regulatorias CD4+CD25+, que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53.
64. Un método para tratar un sujeto que sufre de o para evitar que un sujeto sufra de una enfermedad autoinmune o rechazo de trasplante, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53.
65. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53 para utilizar en medicina.
66. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso en medicina de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el uso es el tratamiento de una enfermedad autoinmune o rechazo de trasplante.
67. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 65, para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedad autoinmune o rechazo de trasplante.
68. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, para activar células T regulatorias CD4+CD25+ in vitro.
69. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, para identificar células T regulatorias CD4+CD25+ in vitro.
70. Uso del péptido aislado de conformidad con la reivindicación 54 o reivindicación 55, o el mimótopo de conformidad con la reivindicación 56, para cribar moléculas capaces de ligar a CD4 y/o activar células T regulatorias CD4+CD25+.
71. Un método para cribar la presencia de células regulatorias T CD4+CD25+ en una muestra que comprende una etapa de poner en contacto un anticuerpo o fragmento de anticuerpo etiquetados de conformidad con la reivindicación 62, con la muestra, lavar la muestra para retirar anticuerpo no ligado y detectar la presencia de la etiqueta en la muestra.
72. Un método de criba de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque se activan células regulatorias T CD4+CD25+.
73. Un método de criba de conformidad con la reivindicación 71 o reivindicación 72, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica que se toma de un sujeto que sufre de una enfermedad autoinmune o de rechazo a trasplante.
74. Un método para tratar a un sujeto que sufre de o para evitar que un sujeto sufra de una enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante, que comprende retirar una muestra que comprende células T regulatorias CD4+CD25+ del sujeto, poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, para activar células T regulatorias CD4+CD25+ y administrar las células activadas al sujeto.
75. Una célula T regulatoria CD4+CD25+ activada con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, para utilizar en medicina.
76. Una célula T regulatoria CD4+CD25+ para utilizar de acuerdo con la reivindicación 75, caracterizada porque el uso es en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.
77. Uso de una célula T regulatorias CD4+CD25+ activada con anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o rechazo a trasplante.
78. Un equipo para aislar células T regulatorias CD4+CD25+ que comprende perlas magnéticas revestidas con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 53 y un segundo anticuerpo anti-CD4 o un anticuerpo anti-CD25.
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