MX2012005749A

MX2012005749A - Metodos para mejorar el diseño, la biodisponibilidad de composiciones de polimero de secuencia dirigida, por medio de la deteccion basada en proteinas del suero, de composiciones de polimero de secuencia dirigida.

Info

Publication number: MX2012005749A
Application number: MX2012005749A
Authority: MX
Inventors: Eric Zanelli; Jeff Krieger; Joe Connolly; Kathryn H Collins
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2012-10-03
Also published as: JP2013511725A; BR112012011783A2; AU2010322036A1; US20120276135A1; JP2013511724A; CN102869989A; EP2526419A4; EA201290345A1; WO2011063045A1; WO2011063043A1; CN102869989B; KR20120097520A; US20120282296A1; IL219741A0; CA2778705A1; IL219742A0; MX2012005750A; US8790665B2; EA022399B1; EA201290347A1

Abstract

Existen en la técnica métodos para detectar péptidos simples; sin embargo, los métodos para determinar la concentración efectiva en plasma de polímeros de secuencia dirigida (DSPS), son complicados debido a que los DSPS son mezclas complejas de péptidos, opuestamente a los péptidos individuales con una secuencia de aminoácidos definida; esta solicitud provee métodos mejorados para detectar y evaluar composiciones de DSP, métodos para la detección y cuantificación de composiciones de DSP, medios para determinar y enriquecer un subgrupo de péptidos en una composición de DSP con base en las interacciones del subgrupo con ciertos polipéptidos de captura, y métodos para administrar composiciones de DSP a un sujeto que necesita de las mismas, en donde el régimen y la cantidad de dosificación pueden determinarse o evaluarse con base en los métodos mencionados anteriormente para la detección y cuantificación.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR EL DISEÑO, LA BIODISPONIBILIDAD Y LA EFICACIA DE COMPOSICIONES DE POLÍMERO DE SECUENCIA DIRIGIDA. POR MEDIO DE LA DETECCIÓN BASADA EN PROTEÍNAS DEL SUERO. DE COMPOSICIONES DE POLÍMERO DE SECUENCIA DIRIGIDA REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/281 ,470, presentada en noviembre 17 de 2009, y la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/386,909, presentada en septiembre 27 de 2010.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las mezclas de péptidos complejas son una clase emergente de agentes terapéuticos de péptidos, de los cuales Copaxone (acetato de glatiramer) es un ejemplo sobresaliente. Las mezclas de péptidos complejas incluyen péptidos diversos con una o más características compartidas (tales como similitud de secuencia y/o composición de aminoácidos), e incluyen ligandos de péptidos alterados (APLs), grupos de péptidos, colecciones de péptidos, composiciones de polímeros de secuencia aleatoria (RSP) (por ejemplo, acetato de glatiramer, las composiciones descritas en los documentos WO 03/029276, WO 05/112972 y WO 05/085323), y composiciones de polipéptidos de secuencia dirigida (DSP) (véase, por ejemplo, los documentos WO 2007/120834, WO 2009/051797 y WO 2009/128948). Las composiciones de DSP y RSP son similares, porque ambas comprenden un gran número de péptidos diferentes cuyas secuencias varían aleatoriamente dentro de ciertos parámetros comunes definidos. Las composiciones de RSP son mezclas de polímeros de aminoácidos (típicamente enlazados por medio de enlaces peptídicos) que comprenden dos o más residuos de aminoácido aleatoriamente ordenados a varias relaciones. En las composiciones de RSP, la similitud de secuencia surge del contenido de aminoácidos restringido de los péptidos, debido a que todos los péptidos consisten de los mismos pocos aminoácidos, dispuestos en un orden aleatorio. En las composiciones de DSP, la similitud de secuencia surge de una secuencia compartida de péptidos base, con ciertas posiciones de aminoácido sustituidas aleatoriamente por una pizarra restringida de aminoácidos en frecuencias definidas.

Existen en la técnica métodos para detectar péptidos simples, pero menos métodos son adecuados para detectar y medir mezclas de péptidos complejas. Los métodos para determinar la concentración efectiva en plasma de polímeros de secuencia dirigida (DSPs) son complicados, debido a que los DSPs son mezclas complejas de péptidos, opuestamente a péptidos individuales con una secuencia de aminoácidos definida. Se necesitan métodos mejorados para evaluar la consistencia y composición de los DSPs a través de preparaciones de fabricación múltiples. La determinación de la condición in vivo de una composición de DSP tiene significancia inmunológica debido a que, dependiendo de la vía y/o la frecuencia de administración y las proteínas del suero que se unen a las composiciones de DSPs, una mezcla puede invocar respuestas principalmente inflamatorias (tipo TH1 ) o principalmente reguladoras (tipo TH2), llevando a variaciones en los efectos farmacocinéticos y farmacodinámicos en el sujeto. El diseño más riguroso y la administración consistente de una composición de DSP pueden incrementar la eficacia terapéutica, o reducir el potencial para respuestas inflamatorias adversas.

De esta manera, existe la necesidad de métodos para el análisis cuantitativo de composiciones de DSP, por ejemplo, para facilitar la evaluación in vivo de dichas mezclas, y para determinar la cantidad y los medios de administración adecuados para propósitos terapéuticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud provee métodos mejorados para detectar y evaluar composiciones de DSP. La presente invención provee métodos para la detección y cuantificación de composiciones de DSP. La presente invención provee un medio para determinar y enriquecer un subgrupo de péptidos en una composición de DSP con base en las interacciones del subgrupo con ciertos polipéptidos de captura. La presente invención provee además métodos para administrar composiciones de DSP a un sujeto que necesita de las mismas, en donde el régimen y la cantidad de dosificación pueden determinarse o evaluarse con base en los métodos mencionados anteriormente para la detección y cuantificación.

La presente descripción provee también un método para detectar una composición de DSP, que comprende los pasos de: (a) adherir dicha composición de DSP a un soporte sólido; (b) poner en contacto dicho soporte sólido en (a) con un fluido biológico que contenga proteínas; (c) identificar las proteínas de (b) unidas específicamente al soporte sólido en (a); (d) obtener preparaciones sustancialmente puras de las proteínas unidas en (c); (e) adherir dichas proteínas en (c) a un medio para detectar cuantitativamente dicha composición de DSP; y (f) determinar la unión de dicha composición de DSP a cada una de dichas proteínas individuales en (e).

Esta descripción provee también un método para mejorar el diseño de una composición de DSP, que comprende los pasos de: (a) adherir dicha composición de DSP a un soporte sólido; (b) poner en contacto dicho soporte sólido en (a) con un fluido biológico que contenga proteínas; (c) identificar las proteínas de (b) unidas específicamente al soporte sólido en (a); . (d) obtener preparaciones sustancialmente puras de las proteínas unidas en (c); (e) adherir dichas proteínas en (c) a un medio para detectar cuantitativamente dicha composición de DSP; (f) determinar la unión de dicha composición de DSP a cada una de dichas proteínas individuales en (e); (g) ajustar el diseño de dicha composición de DSP para aumentar o reducir la unión a una o más proteínas en (e); (h) repetir el paso (f); e (i) repetir opcionalmente los pasos (f a h), en donde los ajustes al diseño de dicha composición de DSP resulten en cualquiera de uno o más del grupo que comprende: biodisponibilidad incrementada, reducción en toxicidad e incremento en eficacia.

Además, esta solicitud provee un método para detectar especies dentro de una composición de DSP, que comprende los pasos de: (a) adherir dicha composición de DSP a un soporte sólido; (b) poner en contacto dicho soporte sólido en (a) con un fluido biológico que contenga proteínas; (c) identificar las proteínas de (b) unidas específicamente al soporte sólido en (a); (d) obtener preparaciones sustancialmente puras de las proteínas unidas en (c); (e) adherir dichas proteínas en (c) a un soporte sólido; (f) poner en contacto dicho soporte sólido en (e) con dicha composición de DSP; y (g) determinar la unión de las especies individuales de dicha composición de DSP a dicho soporte sólido en (f).

Además, esta solicitud provee un método para mejorar el diseño de las especies dentro de una composición de DSP, que comprende los pasos de: (a) adherir dicha composición de DSP a un soporte sólido; (b) poner en contacto dicho soporte sólido en (a) con un fluido biológico que contenga proteínas; (c) identificar las proteínas de (b) unidas específicamente al soporte sólido en (a); (d) obtener preparaciones sustancialmente puras de las proteínas unidas en (c); (e) adherir dichas proteínas en (c) a un soporte sólido; (f) poner en contacto dicho soporte sólido en (e) con dicha composición de DSP; (g) determinar la unión de las especies individuales de dicha composición de DSP a dicho soporte sólido en (f); (h) ajusfar el diseño de dicha composición de DSP para aumentar o reducir la unión a una o más proteínas en (f); (i) repetir el paso (g); y (j) repetir opcionalmente los pasos (g a i), en donde los ajustes al diseño de una especie de dicha composición de DSP resulten en cualquiera de uno o más del grupo que comprende: biodisponibilidad incrementada, reducción en toxicidad e incremento en eficacia.

Mediante el uso de los métodos de la presente solicitud, los investigadores no sólo pueden detectar más confiablemente menores cantidades de los componentes de la composición de DSP, sino también pueden detectar específicamente especies dentro de las composiciones de DSP que son responsables de, o contribuyen a, una actividad biológica de interés, por ejemplo, toxicidad o eficacia.

Un hallazgo que sustenta la presente invención, es la unión específica de un péptido individual o una multiplicidad de péptidos dentro de una composición de péptidos de YEAK o YFAK por ciertos materiales proteináceos. Los materiales proteináceos, denominados en la presente como "polipéptidos de captura", se unen también de preferencia a las composiciones de DSP. A la inversa, una vez que se identifican los "polipéptidos de captura", uno o más de los polipéptidos de captura pueden usarse para analizar cuantitativamente péptidos de una composición de DSP, aislar subgrupos funcionalmente superiores de los péptidos dentro de la composición de DSP, o clasificar componentes de la composición de DSP con base en la especificidad de unión. Para poner en práctica la presente invención, un polipéptido de captura que se une a los péptidos se identifica y se prepara en una forma útil para poner en práctica la presente invención, es decir, aislado y purificado a un grado suficiente de modo que su unión a los péptidos no sea comprometida por la presencia de otros componentes.

Un aspecto de la presente invención provee un método para evaluar o determinar variaciones en los productos de distintas preparaciones de fabricación, diferentes métodos de fabricación, o diferentes métodos de procesamiento post-fabricación, de una composición de DSP. Un método particular de la invención es comparar la unión de diferentes preparaciones de una composición de DSP con un polipéptido de captura, para determinar las similitudes y/o diferencias entre las preparaciones.

Otro aspecto de la invención provee un método para analizar cuantitativamente los péptidos que se encuentran en una composición de DSP o una muestra que comprende una composición de DSP. Algunas modalidades de la invención son métodos para determinar una cantidad o concentración in vivo biológicamente disponible (por ejemplo, una concentración en plasma) de una composición de DSP administrada.

Un método de la presente invención es detectar la presencia de composiciones de DSP en el tejido de un sujeto, dicho sujeto habiendo estado previamente en contacto con o tratado con la composición de DSP, en donde el método se lleva a cabo una o más veces inmediatamente después de dicho contacto, o después de por lo menos aproximadamente 10, 20, 30 ó 45 minutos, o 1 , 2, 4, 6, 12, 24, 36 o 48 horas, o 3, 4, 5, 6, 7 o 10 días, o 2, 3, 4, 6, 8, o 12 semanas, después de dicho contacto. Un método particular de la presente invención es detectar la presencia de constituyentes de una composición de DSP en el suero o plasma de un mamífero, dicho mamífero habiendo sido tratado previamente con dicha composición de DSP antes de que se lleve a cabo dicho método dentro de un período descrito anteriormente. En ciertas modalidades, dicho mamífero es un humano.

En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia de, y opcionalmente la cantidad de, composiciones de DSP, uniendo los DSPs a uno o más polipéptidos de captura predeterminados seguido de un método de detección, tal como un método de detección inmunológico. De esta manera, un aspecto de la invención comprende seleccionar o identificar una proteína del suero que se une de preferencia a una composición de DSP. En ciertas modalidades, un método para identificar una o más proteínas del suero comprende poner en contacto una composición de DSP con una muestra biológica que comprenda suero, detectar la unión, si la hay, de péptidos en la composición de DSP a uno o más componentes del suero, aislar los componentes unidos, e identificar uno o más de los componentes unidos. En algunas modalidades, los componentes unidos pueden aislarse poniendo en contacto la muestra con una columna de afinidad diseñada para unir los péptidos de la composición de DSP, y eluyendo posteriormente la fracción unida, seguido de la identificación de los componentes unidos.

Cualquier proteína de unión del suero que se una a las composiciones de DSP, puede usarse en los métodos anteriores. Métodos de detección adecuados incluyen prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) competitiva directa, Western blot, detección citométrica immunoflow, radioinmunoensayo (RIA), o cualquier otro método de detección inmunológico que permita la detección cuantitativa de antígenos específicos.

Un aspecto de la presente invención es un método para detectar la presencia de una composición de DSP en una muestra biológica, que comprende: poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura; y detectar la presencia o ausencia de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP, en donde la presencia de unión indica la presencia de componentes de péptidos de la composición de DSP en la muestra biológica. Además, dicho método puede extenderse para medir la cantidad o la concentración de una composición de DSP en una muestra.

Otro aspecto de la presente invención es un método para medir la biodisponibilidad de una composición de DSP en un mamífero, que comprende: administrar a un mamífero una dosis de una composición de DSP; remover una muestra biológica del sujeto; y poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura; determinando de esta manera la biodisponibilidad, o el grado de biodisponibilidad, de la composición de DSP en la muestra biológica.

Otro aspecto de la presente invención provee métodos para administrar composiciones de DSP a un sujeto mamífero, dicha cantidad determinada con base en la porción biodisponible de la cantidad dosificada según se determina mediante el método descrito anteriormente, u otros métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, el método comprende además incluir una muestra control, realizar una prueba farmacodinámica para determinar cambios de marcadores fisiológicos, tales como hormonas, enzimas, proteínas del suero, citocinas, inmunomoduladores, o un efector o regulador de cualquiera de estas proteínas funcionales, entre la muestra control y muestras de prueba comparando los dos resultados, y determinando la dosificación efectiva para inducir los cambios deseados en el parámetro farmacodinámico. En ciertas modalidades, se observan cambios de comportamiento, cambios subjetivos reportados por un sujeto, tales como alivio del dolor o un síntoma de una enfermedad, u otra evidencia de efectos indirectos. En ciertas modalidades, dicho sujeto mamífero es un roedor, tal como un ratón o rata. En otras modalidades, dicho sujeto es humano.

Ciertas modalidades de este aspecto de la invención proveen un método para determinar una dosis adecuada de una composición de DSP para administrarla a un sujeto que necesita de la misma, que comprende: (a) administrar al sujeto una dosis de la composición de DSP; (b) remover una muestra biológica del sujeto; (c) poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura; (d) determinar un nivel de componentes de la composición de DSP en la muestra biológica; (e) repetir opcionalmente los pasos (a) a (d) usando una dosis diferente; y (g) comparar los niveles con un nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica; en donde la dosis adecuada es una dosis que resulta en el nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica.

Algunas modalidades de la invención proveen métodos para predecir una porción de la fracción biodisponible de una composición de DSP. Dichos métodos comprenden poner en contacto una muestra que comprende una composición de DSP con un polipéptido de captura predeterminado que se encuentra in situ en un sitio en donde se contempla la administración y el suministro de dicha composición de DSP, y determinar la unión de la composición de DSP al polipéptido de captura. La unión por una gran fracción de la composición de DSP puede ser indicativa de una proporción más grande de péptidos que son terapéuticamente y/o fisiológicamente relevantes, y la unión más estrecha (por determinación de la constante de disociación) puede ser indicativa de un efecto protector que extiende la vida media de esos péptidos in vivo.

Otro aspecto de la presente invención provee métodos para predecir una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de DSP que se va a administrar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), con base en datos obtenidos de sujetos experimentales. En ciertas modalidades, el método comprende administrar una composición de DSP a un sujeto mamífero experimental no humano, determinar la porción biodisponible de la cantidad dosificada (por ejemplo, usando un método de detección cuantitativa descrito en la presente), determinar lecturas de salida funcionales, y predecir una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de DSP que se va a suministrar al sujeto terapéutico con base en los datos obtenidos para el sujeto mamífero experimental, y una relación de correlación entre los sujetos terapéutico y experimental. Para los propósitos de la presente invención, una "lectura de salida funcional" puede ser un fenotipo o función del sujeto, un fenotipo o función de material celular derivado del sujeto, o la composición de uno o más fluidos derivados del sujeto. Una lectura de salida funcional puede incluir adicionalmente o en forma alternativa una medición de uno o más componentes biosintéticos o metabólicos, tales como hormonas, enzimas, proteínas del suero, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, inmunomoduladores, y un efector o regulador de dichas lecturas de salida funcionales. En ciertas modalidades, el paso de detección puede repetirse en varios intervalos de tiempo, regulares o irregulares, para determinar el curso de tiempo de la biodisponibilidad, el metabolismo y/o la depuración, después de la administración. En ciertas modalidades, una vida media en plasma de la composición de DSP como un grupo puede determinarse de esta manera. En otra modalidad, una vida media de una especie dentro de la composición de DSP puede determinarse de esta manera. En modalidades particulares, el sujeto experimental es un roedor, tal como un ratón o rata.

Otro aspecto de la presente invención provee un método eficiente y efectivo para tratar a un paciente administrando una composición de DSP, que comprende: preparar una composición de DSP sintetizando péptidos (por ejemplo, simultáneamente usando grupos de monómeros de aminoácidos en cada ciclo de elongación) preparando una formulación farmacéuticamente aceptable de dicha composición de DSP, administrar dicha composición de DSP a un sujeto, obtener una muestra de tejido de dicho sujeto, determinar las cantidades y/o concentraciones de la composición de DSP en dicha muestra de tejido, determinar una lectura de salida funcional, correlacionar las cantidades de la composición de DSP con la lectura de salida funcional, y ajustar la dosificación de la composición de DSP al sujeto para mejorar la lectura de salida funcional.

Otro aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir una respuesta inmune no deseada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una dosis adecuada de una composición de DSP, en donde dicha dosis adecuada se determina: (i) administrando al sujeto una dosis de la composición de DSP; (ii) removiendo una muestra biológica del sujeto experimental; (iii) poniendo en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura; (iv) determinando un nivel del polipéptido de captura en la muestra biológica; (v) repitiendo opcionalmente los pasos (i) a (iv) usando una dosis diferente; y (vi) comparando los niveles contra un nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica; en donde una dosis adecuada es la dosis que resulta en el nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en dicha muestra biológica.

En algunos de los aspectos y modalidades anteriores, el polipéptido de captura es marcado. En algunas modalidades, los polipéptidos de captura son adheridos a un soporte sólido. En algunas modalidades, el complejo que comprende un polipéptido de captura y uno o más componentes de péptidos de una composición de DSP, es detectado y/o aislado. En modalidades particulares, el complejo es detectado y/o aislado por anticuerpos específicos para el complejo, pero no para el polipéptido de captura o para el componente de péptido de la composición de DSP.

Otro aspecto de la presente invención provee un método para aislar un subgrupo seleccionado de los péptidos que constituyen la composición de DSP. En casos particulares, el subgrupo puede consistir de péptidos que tengan una o más secuencias de aminoácidos diferentes. En otros casos, pueden usarse polipéptidos de captura para clasificar los componentes de la composición de DSP con base en la especificidad de unión.

En ciertas modalidades, un método para aislar péptidos de una muestra que comprende una composición de DSP, comprende: (a) poner en contacto la muestra con por lo menos un polipéptido de captura; y (b) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla. En algunas de dichas modalidades, los polipéptidos de captura son adheridos a un soporte sólido. En algunas modalidades, los polipéptidos de captura son marcados o marcados con epítopes. En algunas modalidades, el método comprende además separar los péptidos unidos de los polipéptidos de captura para aislar los péptidos. En modalidades particulares, el método comprende además determinar las características de los péptidos aislados, tales como las composiciones de aminoácidos del grupo de péptidos aislados y/o las secuencias de aminoácidos de los péptidos aislados.

En ciertas modalidades, un método para identificar péptidos biodisponibles en una composición de DSP en un sujeto, comprende: (a) administrar la composición de DSP al sujeto; (b) remover una muestra de tejido del sujeto después de llevar a cabo el paso (a); y (c) identificar los péptidos en la muestra que se unen a por lo menos un péptido de captura.

En ciertas modalidades, un método para identificar un subgrupo de péptidos que se unen a un polipéptido de captura, comprende preparar una composición de DSP de acuerdo con un protocolo, poner en contacto dicha composición de DSP con un polipéptido de captura predeterminado (por ejemplo, eso es deseable como objetivo o vehículo in vivó), determinar la unión de los péptidos dentro de la composición de DSP, identificando las características que diferencian a los péptidos que se unen de los péptidos que no se unen, y preparar una composición de DSP mejorada que refleje una o más de las características de diferenciación.

Otro aspecto de la invención es un método para mejorar el procedimiento de fabricación de una composición que comprende una composición de DSP. En algunas modalidades, se diseña una composición de DSP con base en el método anterior para identificar un subgrupo de péptidos que se unen a un polipéptido de captura. En algunas modalidades, la composición de DSP se diseña de modo que la composición de aminoácidos y/o la secuencia de aminoácidos, se aproxime a la del subgrupo de péptidos que se unen al polipéptido de captura. En algunas modalidades, la composición de DSP tiene potencia aumentada en comparación con una composición de DSP de referencia, en donde la composición de DSP de referencia es la misma o es sustancialmente la misma que la composición de DSP original que se puso en contacto con el polipéptido de captura. En otras modalidades, la composición de DSP tiene menor toxicidad en comparación con la composición de DSP de referencia.

En modalidades alternativas, un método comprende preparar una composición de DSP de acuerdo con un protocolo, formular una composición que comprenda los DSPs, determinar la cantidad biodisponible de los DSPs en dicha composición detectando el nivel o el grado de lectura de salida funcional, comparar dicha lectura de salida contra un estándar, y ajusfar el protocolo o formulación de la composición para obtener una biodisponibilidad deseada.

Otro aspecto de la invención es dirigir los agentes terapéuticos hacia tejidos específicos asociando una composición de DSP (por ejemplo, una composición de DSP de referencia o una composición de DSP mejorada generada mediante los métodos descritos en la presente), o un componente de una composición de DSP con un agente terapéutico de interés, en donde dicha composición de DSP o componente de la misma se une a un polipéptido de captura que tiene propiedades de direccionamiento específicas de tejido.

Dichos agentes asociados pueden administrarse a un paciente para dirigir el agente hacia un tejido asociado con el polipéptido de captura correspondiente.

Algunas modalidades de este aspecto de la invención proveen un método para suministrar un agente terapéutico hacia un tejido específico en un sujeto, dicho método comprendiendo: (a) aislar un marcador de péptidos poniendo en contacto una composición de DSP con un péptido específico de tejido y separar los péptidos que se unen al péptido específico de tejido de la mezcla; (b) acoplar el marcador del péptido a un agente terapéutico; y (c) administrar el conjugado a un sujeto. Otras modalidades de la invención incluyen un método para preparar dicho agente terapéutico dirigido mediante los pasos (a) y (b) del método descrito anteriormente, y un agente terapéutico dirigido preparado de esta manera.

Otro aspecto de la presente invención es una composición útil y usada en cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Una modalidad de este aspecto de la invención es una composición para detectar una composición de DSP en una muestra biológica, que comprende por lo menos un polipéptido de captura. En ciertas modalidades, el polipéptido de captura se selecciona de un componente de suero normal de humano, suero normal de primate no humano, suero normal de conejo, suero normal de ratón, suero normal de rata, suero normal de hurón, suero normal de cerdo, suero normal de perro, suero normal de caballo, suero normal de oveja, suero normal de vaca, un componente de proteoma de HDL derivado de mamífero, un componente de proteoma de LDL derivado de mamífero, componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (IDs de búsqueda BLAST como una cadena pesada de IgM), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-III, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C de ¡nmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig.

En modalidades particulares, el polipéptido de captura puede ser una proteína de unión del suero. En modalidades más particulares, el polipéptido de captura se selecciona de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina, o de los polipéptidos de captura enumerados en el párrafo que precede inmediatamente a este párrafo, o de polipéptidos del suero descritos en la presente.

Además, en cualquiera de las modalidades anteriores, la unión de los péptidos en una composición de DSP a un polipéptido de captura, tal como una proteína del suero, puede llevarse a cabo en presencia de componentes fisiológicamente relevantes adicionales. En modalidades particulares, el componente adicional es un lípido, tal como colesterol o triglicéridos. En modalidades particulares, el componente adicional es un complejo de HDL o LDL sustancialmente libre de cualquier componente proteináceo diferente del polipéptido de captura.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación esquemática de una prueba usada para determinar la unión de una composición de DSP a proteínas de unión del suero unidas a soporte. Después de que las proteínas del suero han sido identificadas, son unidas al soporte sólido. Una composición de DSP, ya sea sola o contenida dentro del suero, se añade al soporte. Se añade un anticuerpo primario contra la composición de DSP (o contra el conjugado entre la composición de DSP y la proteína del suero), y se detecta la unión del anticuerpo primario a sus objetivos mediante un anticuerpo secundario y reactivo de detección.

La figura 2 muestra la absorbencia colorimétrica A450 de los anticuerpos anti-YFAK y anti-YEAK conjugados con HRP, después de que los anticuerpos se han unido a sus objetivos. Los objetivos comprenden mezclas de péptidos complejos que comprenden péptidos de YEAK o YFAK unidos a proteínas del suero contenidas en (o inutilizadas en) el suero normal de humano. A mayores concentraciones de las mezclas de péptidos complejos, la detección de los conjugados por anticuerpos anti-YEAK o anti-YFAK es mayor que las menores concentraciones de las mezclas de péptidos complejos. 12.5 ng/mL corresponden a una dosis de aproximadamente 2 mg en un paciente humano.

La figura 3 muestra a YEAK en el suero de ratones dosificados IV con 4 mg/kg de YEAK o SC con 21 mg/kg usando la absorbancia colorimétrica A450 de anticuerpos anti-YEAK conjugados con HRP después de que YEAK se ha unido a su objetivo que comprende péptidos de YEAK unidos a las proteínas del suero contenidas en el suero normal de humano. La figura muestra que los fragmentos de GA (acetato de glatiramer) alcanzan la concentración máxima en suero de 1800 ng/mL alrededor de 15 minutos postdosificación. La biodisponibilidad estimada de Copaxone® administrado SC fue de 12%, en comparación con Copaxone® administrado IV. La fracción de GA se detectó aún en el suero a 2 horas post-dosificación.

La figura 4 muestra un ejemplo de la liberación aguda de los factores solubles en el suero o el plasma en respuesta a la administración de YEAK en ratones, en este caso CCL22, conocido también como MDC. Como se observa en la figura, existe una correlación lineal entre la dosis de YEAK administrado SC a los ratones, y la concentración máxima de CCL22 en plasma observada.

La figura 5 muestra los patrones de péptidos observados mediante LC-MS de proteínas del suero eluidas de fragmentos de YEAK inmovilizados sobre una columna de CNBr-Seph. Se identificaron las secuencias de péptidos usando la máquina de búsqueda Mascot. En resumen, los fragmentos de YEAK generados mediante digestión con enzimas trípticas fueron acoplados a bromuro de cianógeno Sepharose (CNBr-Seph) 4b, e incubados por dos horas a temperatura ambiente con suero de humano o de ratón. Las proteínas del suero unidas a los fragmentos de YEAK fueron eluidas usando una solución de clorhidrato de glicina 0.1 M, pH 2.8, y digeridas con tripsina en metanol a 50%/bicarbonato de amonio 50 mM, desecadas, separadas usando cromatografía de líquidos (LC), desolvatadas, ionizadas, rociadas en un espectrómetro de masa (MS), visualizadas, e identificadas usando la máquina de búsqueda Mascot.

La figura 6 muestra una prueba de ELISA usando los métodos de la presente invención descritos en la figura 1 , en donde YEAK fue inutilizado en el suero normal de humanos de sexo masculino y femenino, y el suero normal de humanos de sexo masculino y femenino agrupado. La prueba demuestra una escala lineal que detecta a YEAK en el suero de entre 1 y 100 ng/ml. Esta prueba no puede replicarse usando el suero de ratones, ni cuando se usan controles irrelevantes tales como el polisuero anti-hemocianina de la lapa Fissurella (KLH).

La figura 7 muestra un perfil de SE-CLAR de lotes de Copaxone® (YEAK) P53218 y 1 19142, con los pesos moleculares que se demuestra tienen perfiles similares.

La figura 8 muestra los dos lotes de Copaxone® vistos en la figura 7 usados en los métodos de la presente invención descritos en la figura 1 .

La figura 9 muestra los dos lotes de Copaxone® usados en las figuras 7 y 8 en un bioensayo, en donde la línea de monocitos RAW264.7 expuesta a YEAK liberó a CCL22 en una manera dependiente de la concentración.

La figura 10 muestra usando MALDI-TOF, la estricta relación lineal entre los pesos moleculares medios real y teórico de copolímeros de YEAK de diferentes longitudes definidas. Los valores teóricos se calculan multiplicando la longitud del copolímero en aminoácidos, es decir, 20, 40, 60 y 80, por el peso molecular promedio de un aminoácido teórico más una molécula de agua. El peso de un aminoácido teórico se calcula usando la masa respectiva de Y, E, A y K menos una molécula de agua perdida durante el acoplamiento del aminoácido y la relación de aminoácidos de 1.0, 1.5, 4.5 y 3.6.

La figura 1 1 muestra las relaciones de producción normalizadas a 100 aminoácidos de copolímeros de YEAK de diferentes longitudes fabricados mediante síntesis en fase sólida determinada mediante el análisis de aminoácidos, así como el mismo análisis realizado en los dos lotes de Copaxone® observados en las figuras 7, 8 y 9.

Se generan curvas estándar, usando los copolímeros de YEAK de 20, 40, 60 y 80 aminoácidos. Como comparación, se generó también una curva estándar usando Copaxone®. La figura 11 ilustra la relación entre el tamaño de los copolímeros de YEAK y la detección mediante las pruebas farmacocinéticas competitivas basadas en ELISA. El copolímero de YEAK de 20 partes tiene poco efecto inhibidor, pero la curva estándar generada con el copolímero de YEAK de 80 partes cubre la curva obtenida con Copaxone®.

La figura 12 muestra una prueba de ELISA en donde la fracción de Ig del polisuero de conejo interactúa fuertemente con Copaxone®, y demuestra un reconocimiento creciente conforme la longitud de los copolímeros de YEAK sintetizados en fase sólida se incrementa.

La figura 13 muestra una prueba de ELISA usando un método farmacocinético previo (como se describe en la publicación del PCT WO2009/075854, incorporada de esta manera en su totalidad en la presente como referencia) con copolímeros de YEAK sintetizados en fase sólida, demostrando una relación entre el tamaño de los copolímeros de YEAK y la detección mediante los métodos del sistema de prueba previo.

La figura 14 muestra que la línea de monocitos RAW264.7 cultivada con los copolímeros sintetizados en fase sólida de diferentes tamaños observados en las figuras 1 1 , 12 y 13, produce una cantidad creciente de CCL22 conforme la longitud del copolímero se incrementa.

La figura 15 muestra la capacidad de los dos lotes de Copaxone® usados en las figuras 7, 8, 9 y 1 1 y los copolímeros de YEAK sintetizados en fase sólida de diferentes longitudes usados en las figuras 1 1 , 12, 13 y 14, para inducir la proliferación ex vivo de esplenocitos de ratones inmunizados semanalmente por 3 semanas con 2.5 mg/kg de Copaxone®. Una semana después de la última administración SC, se colectaron los bazos, se hicieron suspensiones de células, y las células se cultivaron por 4 días con varias concentraciones de los diferentes copolímeros. Se determinó la proliferación de esplenocitos midiendo la incorporación de timidina tritiada usando métodos bien conocidos en la técnica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composiciones de polímero de secuencia dirigida (DSP) Un DSP es un péptido que tiene una secuencia derivada de una secuencia de péptidos conocida base que puede ser, pero no está limitada a, un epítope nativo asociado con una respuesta inmune, como un punto de partida. Un DSP tiene uno o más residuos de aminoácido que difieren de los de la secuencia de péptidos base, cuya sustitución es determinada por una regla definida. Debido a la diversidad semi-aleatoria de una composición de DSP, un gran número de secuencias de péptidos está presente en la composición. La diversidad de las secuencias de péptidos puede conferir eficacia incrementada sobre las composiciones menos diversas, en particular conforme ocurre el cambio y la dispersión de epítopes. En algunas modalidades, una composición de DSP que comprende DSPs múltiples es útil en la modulación de respuestas inmunes no deseadas, o la inducción de respuestas inmunes cuando el péptido base es débilmente o indetectablemente inmunógeno.

Los DSPs están diseñados para incluir una variación de aminoácidos definida a una velocidad de ocurrencia definida de introducción de dichos residuos de aminoácido en cualquier posición dada de la secuencia a la secuencia de péptidos base. A diferencia de los RSPs, tales como Cop-1 , los péptidos resultantes, aunque pueden ser sustituidos a grados variables, mantienen su similitud con la secuencia natural de residuos de aminoácido de una secuencia de péptidos predeterminada definida de una longitud especificada. Cada posición de aminoácido está sujeta a cambio con base en una serie definida de reglas, y dicha sustitución de aminoácidos se selecciona de aminoácidos químicamente relacionados, aminoácidos con similitudes esféricas, variaciones filogenéticas encontradas en proteínas análogas xenogénicas del péptido base, variantes alélicas conocidas que no resultan en disfunción del péptido base, o pequeños residuos de aminoácido introducidos para perturbar la estructura secundaria de los péptidos. En ciertas modalidades, el aminoácido es sustituido de acuerdo con los métodos vistos en Kosiol et al., J. Theoretical Biol., 2004, 228: 97-106). En forma alternativa, los aminoácidos pueden ser cambiados de acuerdo con los ejemplos de sustituciones descritos en el documento PCT/US2004/032598, págs. 10-11.

Pueden prepararse DSPs mediante síntesis de péptidos en fase sólida, y por cada ciclo de la síntesis, una mezcla de aminoácidos adecuadamente protegidos a una relación definida, seleccionada por las razones descritas anteriormente, más que un aminoácido individual, presentada por incorporación en los polipéptidos sintetizados. Cuál de los aminoácidos seleccionados es introducido, varía de acuerdo con la relación de la mezcla. De esta manera, una composición de DSP, al igual que una composición de RSP, no es sintetizada como un péptido individual, sino siempre es sintetizada como parte de una composición que comprende DSPs relacionados múltiples con base en una secuencia molde común, cuya mezcla general es reproducible y consistente con las reglas de síntesis que se aplicaron. El resultado es una mezcla de proteínas terapéuticamente útiles relacionadas, la cual se describe en la presente como una composición que comprende "polímeros de secuencia dirigida" o "DSPs". Para un procedimiento de síntesis en fase sólida, la mezcla de aminoácidos para una posición dada en el péptido es definida por una relación de uno por otro. Antes de que se inicie la síntesis, dicha relación de aminoácidos en la mezcla disponible para una posición variante se determina para cada posición a lo largo del péptido. La mezcla de péptidos de orden dirigido resultante comprende una multiplicidad de secuencias de péptidos relacionadas. Algunos DSPs que pueden usarse en la invención, incluyen los descritos en las solicitudes internacionales WO 2007/120834, WO 2009/051797, WO 2009/128948, y la solicitud de E.U.A. publicación US 2009/0036653. Estas referencias describen métodos para sintetizar DSPs, composiciones que comprenden DSPs, formulaciones terapéuticas de DSPs, métodos para administrar composiciones de DSP a un sujeto, enfermedades que pueden tratarse con DSPs, y agentes terapéuticamente efectivos adicionales que pueden co-administrarse a un sujeto con los DSPs. Las enseñanzas de todas estas patentes, solicitudes y publicaciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, con atención particular a aquellas porciones que discuten la estructura, preparación y función de los DSPs.

Los DSPs se diseñan y se preparan seleccionando una proteína, ya sea que no tenga función conocida, que tenga un interés de investigación conocido o anticipado, que tenga un interés de diagnóstico conocido o anticipado, o que tenga una asociación conocida o anticipada con alguna enfermedad, y seleccionando una porción dentro de la proteína, cuya porción puede ser un epítope dentro de una escala de inmunogenicidad, de inmunogenicidad no conocida a que sea débilmente ¡nmunógeno a que sea fuertemente inmunogeno, o en donde se sepa que es relevante para la patología de una enfermedad. Las secuencias de péptidos base para preparar composiciones de DSP pueden seleccionarse de varias fuentes. En ciertos casos, las secuencias de péptidos con algún significado para un estado de enfermedad o una reacción adversa, pueden identificarse a través de la investigación experimental de un epítope relevante. Estas secuencias pueden incluir secuencias de péptidos de ocurrencia no natural que se ha demostrado son útiles para tratar una enfermedad o una condición, y un ejemplo se encuentra en la solicitud de patente internacional publicación WO 2006/031727, la patente de E.U.A. No. 6,930,168, y la publicación científica relacionada de Stern er a/., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, 102: 1620-25.

Además, las secuencias de péptidos base que pueden ser epítopes se determinan empíricamente identificando secuencias candidatas mediante la exploración posicional de colecciones combinatorias de péptidos sintéticos (véase, por ejemplo, D. Wilson et al., citado anteriormente; R. Houghten et al., citado anteriormente; Hernández et al., Eur. J. Immunol., 2004, 34: 2331-41), u obteniendo secuencias de péptidos traslapantes de la proteína entera de interés, y poniendo a prueba estos péptidos para reactividad inmune usando, por ejemplo, cualquier prueba de lectura de salida útil para dichos propósitos, tales como la prueba de Hl, un modelo de desafío viral, o uno descrito en Current Protocols in Immunology, editado por John E Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strober NIH, John Wiley & Sons, en un sistema de prueba in vitro o in vivo adecuado para la enfermedad y la especie de epítope para lo que se busca. Las moléculas candidatas pueden incluir péptidos que son modificados durante la síntesis o post-síntesis, por ejemplo, mediante la adición de azúcar y azúcar modificado tal como en glucosilación y glucogenación, el cual puede ser N- o S-enlazado, modificación de ácidos grasos tales como miristoilación, o la creación de enlaces disulfuro.

Después de que se identifica un epítope candidato, puede generarse una serie probable de epítopes relacionados adicionales usando variantes de sub-cepa, variantes de grupo, variantes de deriva o variantes de cambio de un patógeno, por medio de la elaboración de modelos y algoritmos de predicción descritos en referencias fácilmente disponibles, por ejemplo, el documento WO 2000/042559, alineando y analizando las mutaciones, epítopes accesibles de anticuerpos probables, o la unión predicha de estos epítopes probables usando modelos de predicción disponibles descritos, por ejemplo, en los documentos WO 2005/103679, WO 2002/073193 y WO 99/45954.

En algunas modalidades, las secuencias de péptidos base para el diseño de DSPs son epítopes relacionados con una enfermedad autoinmune seleccionada de esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus tipo I, miastenia grave, artritis reumatoide y pénfigo vulgar.

En otras modalidades, la secuencia de péptidos base en un epítope relevante para la patología de un cáncer seleccionado de leucemia, cánceres de mama, piel, hueso, próstata, hígado, pulmón, cerebro, laringe, vesícula biliar, páncreas, recto, paratiroides, tiroides, glándula suprarrenal, neural, de cabeza y cuello, colon, estómago, bronquios o ríñones, carcinoma de células básales, carcinoma escamocelular, melanoma, carcinoma metastásico de piel, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, carcinoma de células del vetículo, mieloma, tumor de células gigantes, tumor pulmonar de células pequeñas, tumor de las células de los islotes, carcinoma linfocítico, granulocítico, de células pilosas, adenoma, hiperplasia, carcinoma medular, feocromocitoma, tumor de ovario, displasia cervical, carcinoma in situ, neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi y sarcoma osteogénico.

En otras modalidades, la secuencia de péptidos base es un epítope relevante para la patología de una enfermedad infecciosa viral seleccionada de SIDA, complejo relacionado con SIDA, viruela loca (varicela), resfriado común, infección por citomegalovirus, fiebre por ácaros de Colorado, fiebre del dengue, fiebre hemorrágica del Ébola, glosopeda, hepatitis, herpes simple, herpes zoster, HPV, influenza, fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburg, mononucleosis infecciosa, parotiditis, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, rabia, rubéola, SARS, viruela, encefalitis viral, gastroenteritis viral, meningitis viral, neumonía viral, enfermedad del Nilo Occidental y fiebre amarilla.

En otras modalidades, la secuencia de péptidos base es un epítope relevante para la patología de una enfermedad infecciosa bacteriana seleccionada de ántrax, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, enfermedad por arañazo de gato, cólera, difteria, gonorrea, impétigo, legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, infección por MRSA, nocardiosis, pertussis (tosferina), plaga, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, fiebre moteada de las Montañas Rocosas (RMSF), salmonelosis, fiebre escarlata, shigelosis, sífilis, tétanos, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifo (incluyendo tifo epidémico) e infecciones del tracto urinario.

En otras modalidades, dicha secuencia de péptidos base es un epítope relevante para la patología de una enfermedad infecciosa parasitaria seleccionada de amibiasis, ascariasis, babesiosis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, criptosporidiosis, cisticercosis, difilobotriasis, dracunculiasis, equinococosis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, infección amibiana de vida libre, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isospohasis, kala-azar, leishmaniasis, malaria, metagonimiasis, miiasis, oncocerciasis, pediculosis, infección por oxiuros, Plasmodium, sarna, esquistosomiasis, teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquinelosis, triquinosis, tricuriasis, tricomoniasis y tripanosomiasis (incluyendo tripanosomiasis africana).

En algunas modalidades, la secuencia de péptidos base es un epítope relevante para la patología de trastornos por la conformación de proteínas que afectan el sistema nervioso central y/o periférico, seleccionados de: enfermedad de Alzheimer (AD), hemorragia cerebral hereditaria holandesa con amiloidosis (conocida también como amiloidosis cerebrovascular), angiopatía congofílica; enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva; demencia británica familiar; enfermedad de Parkinson (PD), enfermedades relacionadas con el cuerpo de Lewy, atrofia de sistemas múltiples, enfermedad de Hallervorden-Spatz; esclerosis lateral amiotrófica (ALS); enfermedad de Huntington (HD); ataxia espinocerebelar; enfermedad por inclusiones intranucleares neuronales; atrofia dentatorubral-palidoluisiana hereditaria; enfermedades relacionadas con priones tales como scrapie (prurito lumbar), encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, kuru, insomnio familiar fatal y trastornos relacionados; angiopatía amiloide hereditaria por cistatina c; demencia pugilística; y otros trastornos caracterizados por atrofia cerebral y detección de agregados fibrilares intracelulares y/o extracelulares conforme el trastorno progresa.

En una modalidad particular, el trastorno por la conformación de proteínas es enfermedad de Parkinson. En otra modalidad, el trastorno por la conformación de proteínas es enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad, el trastorno por la conformación de proteínas es una enfermedad relacionada con priones. En otra modalidad, el trastorno por la conformación de proteínas es esclerosis lateral amiotrófica. En una modalidad particular, el trastorno por la conformación de proteínas es enfermedad de Huntington.

En otras modalidades, la secuencia de péptidos base usada para el procedimiento para fabricar la composición de DSP, es un epítope relevante para la patología de trastornos por la conformación de proteínas que afectan a órganos múltiples u órganos diferentes del sistema nervioso central, seleccionados de: atrofia muscular espinal y bulbar; amiloidosis cerebral y sistémica hereditaria, amiloidosis familiar tipo finlandés; amiloidosis sistémica senil (conocida también como amiloidosis cardiaca senil), polineuropatía amiloide familiar; diabetes tipo 2, en particular amiloidosis de los islotes pancreáticos; amiloidosis relacionada con la diálisis (DRA); amiloidosis sistémica reactiva asociada con inflamación (conocida también como amiloidosis AA); amiloidosis medial aórtica; carcinoma medular de la tiroides; amiloidosis renal hereditaria; amiloidosis asociada con la cadena ligera, enfermedad por deposición de la cadena ligera, neuropatía tipo la cadena ligera, cardiomiopatía por la cadena ligera; amiloidosis auricular; amiloidosis localizada por inyección; fibrosis quística (CF); anemia de células falciformes, y otros trastornos en donde se observe fibrilogénesis en los órganos o tejidos afectados.

Ejemplos de proteínas y péptidos nativamente no plegados, y aquellos que se sospecha están nativamente no plegados, que sufren fibrilogénesis, y por lo tanto están asociados con trastornos por la conformación de proteínas y pueden usarse como las secuencias de origen de los péptidos base en la preparación de una composición de DSP, incluyen: proteínas de priones y sus fragmentos, proteína beta amiloide y sus fragmentos, proteína abrí, proteína tau, alfa-sinucleína y su fragmento central, polipéptido amiloide de los islotes (conocido también como amilina), exón 1 de huntingtina, protimosina alfa, dominio amino-terminal de la proteína de los receptores de andrógeno, ataxina-1 , proteína DRPLA (conocida también como atrofina-1 ) y calcitonina.

Ejemplos de proteínas globulares que sufren fibrilogénesis, y por lo tanto están asociadas con trastornos por la conformación de proteínas y pueden usarse como las secuencias de origen de los péptidos base en la preparación de una composición de DSP, incluyen: cistatina c, transtiretina, beta 2 microglobulina, proteína amiloide A del suero y sus fragmentos, huntingtina, dominios variables de la cadena ligera de inmunoglobulina, insulina, lisozima (en particular lisozima humana), alfa-lactalbúmina y monelina, dominios de unión al ADN y ligando de la proteína de los receptores de andrógeno, lactadhereina y más específicamente su fragmento (conocida también como residuo 245-294, conocida también como medina), gelsolina, apolipoproteína A1 , fibrinógeno y sus fragmentos, y factor natriurético auricular.

Como ejemplos específicos, en enfermedad de Alzheimer, la patología se correlaciona fuertemente con la presencia de un péptido beta amiloide (?ß) de 4 kDa que forma parte del precursor del péptido ?ß (APP), desdoblado por la enzima presenilina 1 (PS1). La mayoría de los péptidos ?ß son de 40 aminoácidos de longitud, y se designan como ?ß40, ?ß40, ?ß1-40, o tienen extremo amino-terminal variado, ?ß?-40. Además, los estudios han indicado que la forma fibrilar de ?ß1-40 estimula la microglia, cuyo tipo de célula se piensa actualmente desempeña una función importante en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (véase Jekabsone, A. et al., J. Neuroinflammation 3: 24 (2006)). La secuencia de péptidos de ?ß1-40 se muestra como SEQ ID NO: 7 en el cuadro I. Por otra parte, se piensa que ?ß1-42, que es una fracción menor del péptido ?ß que forma placas, contribuye al inicio de la formación de péptidos ?ß fibrilares. Esta "forma larga" del péptido se describe como SEQ ID NO: 8 en el cuadro I. Por lo tanto, la secuencia de péptidos base puede ser el péptido ?ß, ejemplificado por SEQ ID NO: 8. La secuencia de péptidos base puede ser también la del péptido más corto, es decir, ?ß?-40, ?ß1-11 , que se ha reportado en algunos casos tiene significancia clínica, ?ß14-23 o ?ß16-20. Véase Tjernberg, L. O. et al., Biochem. J. 366: 343-351 (2002).

CUADRO I Ejemplos de epítopes Referencias: Náslund, J. et al., Proc. Nal Acad. Sci. USA, 91 : 8378-8382 (1994) 54.

Gandy, S., J. Clin. Invest. 1 15(5): 1121-1 129 (2005) 55. Benner, E. J. et al., PLoS ONE 3(1 ): e1376 (2008) 56.

Campion, D. et al. "The NACP/synuclein gene: chromosomal assignment and screening for alterations in Alzheimer disease" Genomics 26 (2), 254-257 (1995) 57.

Lecerf, J.-M. et al., Proc Nati Acad Sci USA. 98(8): 4764^769 (2001) 58.

Kozhukh, GV et al., JBC, Vol. 277, No. 2, edición de enero 11 , pp. 1310-1315, 2002 59.

Los DSPs pueden usarse también para tratar la enfermedad de Parkinson (PD). La PD es un trastorno neurológico degenerativo actualmente sin cura, que afecta a 1 a 2% de los individuos de más de 50 años de edad. Los distintivos neuropatológicos se caracterizan por pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas que contienen neuromelanina en el par compacto de la sustancia negra (SNpc), con la presencia de inclusiones eosinofílicas, intracitoplásmicas y proteináceas denominadas cuerpos de Lewy (LB). La a-sinucleína es la proteína más abundante en los cuerpos de Lewy, y parece ser un mediador importante, incluso quizá un factor causal, de toxicidad en la PD. De esta manera, se piensa que la reducción de la a-sinucleína tóxica es benéfica para los pacientes con PD. La secuencia de uno de dichos péptidos de a-sinucleína de ratón, derivada de la región C-terminal de la proteína de longitud completa, se muestra como SEQ ID NO: 9 en el cuadro I (véase Benner, E. J. et al., PLoS ONE 3(1 ): e1376 (2008)). Además, la eliminación o el secuestro de la a-sinucleína nitrada y fragmentos de la misma, parece tener efectos favorables sobre los pacientes que sufren de PD. Se dice que los anticuerpos terapéuticamente efectivos son dirigidos en la a-sinucleína nitrada, pero no nativa. Por lo tanto, la secuencia de péptidos base puede ser, por ejemplo, SEQ ID NO: 9. En otras modalidades, la secuencia de péptidos base puede ser un fragmento que comprenda los aminoácidos 121 a 137 de la a-sinucleína humana (DNEAYEMPSEEGYQDYE) (SEQ ID NO: 10). En otras modalidades, la secuencia del fragmento de a-sinucleína (121 -137) es sustituida en las posiciones 121 y 122 en diferentes especies, tri-nitrada en cada posición de Y (tirosina), y/o fosforilada en S115.

Los DSPs pueden derivarse también de la secuencia de péptidos base relevante para enfermedades causadas por priones. SEQ ID NO: 13 (AAH22532) es la secuencia de la proteína de priones de humano. Un péptido relevante se selecciona de secuencias parciales de SEQ ID NO: 13. Las secuencias de priones de varias especies, se describen en Harmeyer, S. et al., J Gen Virol. 79 (parte 4): 937-45 (1998), cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia. Las variaciones de aminoácidos por especie pueden usarse para diseñar los aminoácidos sustituyentes.

Una secuencia de péptidos base puede derivarse también de la superóxido dismutasa I (SOD1). Se sabe que la mutación de SOD1 tiene una relación causal con la patología de algunas formas de ALS familiar. Se ha reportado que los antisueros producidos contra una forma mutante de SOD1 , la proteína recombinante SOD1 G93A de humano, tiene un efecto protector sobre un modelo de ALS de ratón que posee el mutante de SOD1 G37R (línea 29), el cual sobreexpresa la proteína SOD1 de humano 4 veces más que la SOD1 endógena de ratón. Véase Urushitani, M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 104(7): 2495-2500 (2007). Un ejemplo de la secuencia de la proteína SOD1 es SEQ ID NO: 14 (CAG46542). Por lo tanto, una secuencia de péptidos base puede ser una secuencia parcial de SEQ ID NO: 14.

Las proteínas mal plegadas desempeñan también una función en la enfermedad de Huntington, un trastorno genético causado por la expansión patológica de un tracto de poliglutamina (poliQ) en la proteína huntingtina (htt) (SEQ ID NO: 15, huntingtina humana), resultando en neurodegeneración y muerte prematura del individuo afligido. Se ha mostrado que un anticuerpo de cadena sencilla que se une a un epítope formado por los 17 aminoácidos N-terminales de htt (Lecerf, J.-M. et al., Proc Nati Acad Sci USA. 98(8): 4764-4769 (2001) SEQ ID NO: 11), reduce los síntomas en un modelo de enfermedad de Huntington en Drosophila (véase Wolfgang, W. J. eí al., Proc Nati Acad Sci USA. 102(32): 11563-1 1568 (2005)). Por lo tanto, una secuencia de péptidos base puede ser SEQ ID NO: 11.

Las composiciones de DSP pueden usarse también para tratar la amiloidosis relacionada con la diálisis (DRA). La DRA puede ser causada por diferentes formas de filtración en la sangre, tales como la hemodiálisis, la heme-filtración o la diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD). La DRA tiene una incidencia de más de 95% de pacientes en diálisis por más de 15 años con amiloidosis por beta-2-microglobulina (B2M, SEQ ID NO: 13), siendo frecuente y aumentando previsiblemente con el tiempo. Se han observado isómeros de conformación de B2M en un ambiente clínico (Uji et al., Nephron Clin Pract 2009; 1 11 : c173-c181 ). La B2M forma parte de la molécula clase I del antígeno de leucocitos humanos (HLA), y tiene una estructura beta-plegada prominente característica de las fibrillas amiloides. Se sabe que B2M circula como un monómero no unido distribuido en el espacio extracelular. B2M sufre fibrilogénesis para formar depósitos amiloides en una variedad de tejidos. Esta deposición causa falla renal, que causa un incremento en la síntesis y la liberación de B2M, exacerbando la condición. De esta manera, en una modalidad de la invención, una proteína cuya secuencia base se usa en la preparación de una composición de DSP, es la beta 2 microglobulina (SEQ ID NO: 16), y fragmentos de la misma. Un ejemplo de fragmento de B2M puede ser el que abarca los residuos de aminoácido 21 a 40, SEQ ID NO: 12 en el cuadro I, útil como un péptido base para la DRA.

En otras modalidades, la secuencia de péptidos base es una secuencia parcial de una proteína seleccionada de: osteopontina, una proteína de HLA, glucoproteína de oligodendritas de mielina, proteína básica de mielina (MBP), proteína de proteolípidos y glucoproteínas asociadas con mielina, S100Beta, proteína alfa de choque térmico, beta cristalina, proteína básica oligodendrocítica asociada con la mielina (MOBP), nucleótido 3'- fosfodiesterasa 2',3' cíclica, hsp60, hsp70, R06O, La, SmD y U1 RNP de 70 kDa, ácido glutámico descarboxilasa (GAD65), antígeno 2 de ¡nsulinoma (IA-2), insulina, subunidad a del receptor de acetilcolina (AChR), y tirosina cinasa de receptores específicos del músculo (MuSK), colágena tipo II, desmogleína 1 (Dsg1), desmogleína 3 (Dsg3), receptores acoplados a proteína G (GPCR), proteínas relacionadas con inflamación, proteínas relacionadas con alergia, interleucinas y sus receptores, quimiocinas y sus receptores, y chaperones y sus receptores. En otras modalidades, la secuencia de péptidos base se deriva de CD20, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD52, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR+), CD33, HER2; proteínas no relacionadas con oncología, por ejemplo, FNT alfa, CD25 o inmunoglobulina E, para inmunosupresión, CD11a, alfa4-beta1 integrina; y receptor de beta-quimiocina relacionada con enfermedad infecciosa CCR5, RSVgpP.

En forma alternativa, puede crearse una secuencia de péptidos base a partir de un epítope discontinuo, es decir, seleccionando los aminoácidos que constituyen el epítope, y combinando los aminoácidos en un péptido lineal para realizar permutaciones dirigidas para crear la composición de DSP.

Otras modalidades de la presente invención comprenden la selección de dos o más proteínas de interés, de las cuales se seleccionan dos o más epítopes con por lo menos un epítope derivándose de cada proteína de interés, y combinando los epítopes en una secuencia lineal para realizar permutaciones dirigidas para crear la composición de DSP.

En otras modalidades, una secuencia base para preparar DSPs se toma del grupo de proteínas que comprenden: una proteína que se sabe contiene sólo un dominio que tiene un atributo estructural primario, secundario, terciario o cuaternario, tal como la hoja beta plegada o las hélices alfa, una proteína que se sabe contiene sólo un dominio que tiene una cierta actividad, tal como unión a serotonina, una proteína que se sabe tiene sólo un origen conocido, una proteína que se sabe pertenece sólo a un compartimiento celular específico tal como el núcleo o el citoplasma, una proteína que se sabe tiene sólo una función celular, tal como un proceso celular que produce una proteína específica de interés, una proteína que se sabe tiene sólo una actividad antioxidante o una actividad metabólica, o una actividad de biosíntesis, o una actividad catabólica, o una actividad de cinasa, o una actividad de transferasa, o una actividad de liasa, o una actividad de ligasa, o una actividad de transducción de señales, o una actividad de unión, o una actividad de movilidad, o una actividad de fusión de membrana, o una actividad de comunicación celular, o una actividad de regulación de procesos biológicos, respuesta a la actividad de estímulos, una actividad relacionada con la muerte celular, una actividad relacionada con la activación de células T, una actividad relacionada con la activación de células B, una actividad relacionada con la activación de APC, una actividad relacionada con la respuesta inmune inflamatoria, una actividad relacionada con la respuesta alérgica, una actividad relacionada con la respuesta a enfermedades infecciosas, una actividad de transportador, una actividad de canales, una actividad de secreción, una actividad patogénica y una actividad de organización del citoesqueleto.

Las composiciones de DSP pueden clasificarse de acuerdo con sus objetivos de unión preferenciales y sus funciones fisiológicas, las cuales se derivan directamente de la composición de aminoácidos y sus relaciones. Cualquier método disponible puede usarse para indagar si una composición de DSP se une a una proteína objetivo candidata o conocida. Por ejemplo, el polipéptido puede ser marcado con una molécula de reportero (tal como un radionúclido o biotina), mezclado con una preparación cruda o pura de una proteina objetivo, y la unión se detecta si la molécula de reportero se adhiere a la proteína objetivo después de la remoción del polipéptido no unido.

En modalidades particulares, las composiciones de DSP útiles para la presente invención se unen a uno o más isotipos de DQ con una Kd promedio de 1 µ? o menos, y más preferiblemente una Ka promedio menor de 100 nM, 10 nM o incluso menos de 1 nM. Otra forma de identificar DSPs preferidos se basa en la medida de una composición de DSP para desplazar a otra en pruebas de unión competitiva, usando pruebas semejantes a las descritas en Sidney et al., 2002, J. Immunol. 169: 5098, la cual se expresa como un valor de IC50. En algunas modalidades, los DSPs de la presente invención tienen valores de IC50 menores de 1 µ?, más preferiblemente menores de 500 nM, y aún más preferiblemente menores de 100 nM.

En los métodos en la presente, los DSPs pueden ser sustituidos con grupos de péptidos, colecciones de péptidos, o grupos de ligandos de péptidos alterados (APLs). Al igual que las composiciones de DSP, las composiciones de APL comprenden una mezcla de polipéptidos relacionados. Los APLs se definen como una serie de péptidos cada uno de los cuales tiene un pequeño número de cambios de aminoácido de una secuencia de partida de interés, tal como la de un ligando de péptido inmunógeno nativo. Péptidos variantes con dichas secuencias de aminoácidos alteradas pueden ser agrupados para preparar una composición que tenga las ventajas de una mezcla de péptidos heterogénea. Véase Fairchild et al., Curr. Topics Peptide & Protein Res. 2004, 6: 237-44. Cada APL tendría una secuencia definida, pero la composición puede ser una mezcla de APLs con más de una secuencia. En algunas modalidades, grupos de péptidos o APLs o colecciones de péptidos que pueden usarse en la presente invención, incluyen los descritos en la patente de E.U.A. No. 7,118,874.

Métodos farmacocinéticos En algunas modalidades, puede determinarse la absorción y distribución de las composiciones de DSP. Puede determinarse también la velocidad a la cual una composición de DSP efectúa un cambio y la persistencia del efecto, así como alteraciones químicas a la composición de la composición de DSP.

Las diferentes composiciones de DSP persistirán por diferentes duraciones de tiempo en el suero y otros fluidos biológicos, que otras mezclas. En algunos casos, los péptidos administrados son secuestrados por, o unidos a, algún componente in vivo in situ, cuyo resultado es una vida media más larga en ese ambiente, con o sin realce en la biodisponibilidad. En ciertas modalidades, el ambiente es el plasma sanguíneo o la linfa. En una modalidad alternativa, el ambiente es el fluido espinal o cerebral. En otras modalidades, el ambiente es cualquier tejido u órgano local al cual los péptidos de la composición de DSP son suministrados.

Identificación de proteínas v polipéptidos fisiológicos que se unen a los polímeros de aminoácidos de las composiciones de DSP Un aspecto de la presente invención es la identificación de un polipéptido de captura que se une a una composición de DSP. El término "polipéptido de captura" se usa en la presente para indicar cualquier polipéptido, proteína, fragmento de proteína, proteolípido, u otra molécula que contenga material proteináceo, encontrado en tejidos y órganos normales. Puede ser un polipéptido individual o una proteína que comprenda polipéptidos y/o subunidades múltiples, o un complejo que comprenda una proteína asociada (covalentemente o no covalentemente) con otros materiales tales como lípidos, los cuales pueden tener además estructuras definidas que son deseables o necesarias para que el polipéptido de captura se una a una composición de DSP. Con frecuencia un polipéptido de captura no es transitorio, es decir, existe una cantidad estable base que se encuentra en todo momento, sin tener en cuenta si existe transitoriamente una presencia inducida o incrementada. De preferencia, un polipéptido de captura es una proteína. Más preferiblemente, un polipéptido de captura es una proteína encontrada en un fluido biológico tal como una proteína del suero.

Algunas modalidades de este aspecto de la invención son métodos para identificar un polipéptido de captura que se une a péptidos que constituyen una composición de DSP, en donde el método comprende: poner en contacto una muestra que contiene una cantidad de la composición de DSP con una muestra de tejido normal; y detectar la unión de los péptidos de la composición de DSP a cualquier componente de la muestra de tejido normal. En ciertas modalidades, los péptidos de la composición de DSP son inmovilizados sobre una resina (a través de enlace covalente haciendo reaccionar los péptidos con resina activada) o sobre un substrato sólido tal como poliestireno. Por ejemplo, una muestra de tejido puede ser puesta en contacto con los péptidos inmovilizados, e incubada, lavada para remover la unión no específica, y los materiales unidos a los péptidos que estaban en la muestra de tejido pueden ser identificados. Los materiales unidos pueden identificarse mediante cualquier método adecuado, tal como sometiendo los materiales a un panel de anticuerpos específicos; microsecuenciación de los materiales si se sospecha que dichos materiales son polipéptidos o nucleótidos; digestión tríptica seguida de cromatografía de líquidos acoplada con espectrometría de masa en tándem (LC-MS/MS), sometiendo dichos materiales a colorantes específicos si se sospecha que dichos materiales son polisacáridos; o cualquier método analítico con sensibilidad suficientemente alta.

Como un ejemplo no limitativo de la identificación descrita anteriormente, puede usarse una composición de DSP en una prueba de ELISA directa para identificar proteínas del suero que se unen a la composición de DSP usando un protocolo tal como el del ejemplo 1. El cuadro II más adelante enlista proteínas del suero que se muestra experimentalmente se unen a RSPs, péptidos de YEAK y/o YFAK, en el suero normal de humano. Se ha observado que los péptidos de YEAK y YFAK tienen diferentes especificidades de unión; a la inversa, puede decirse que las proteínas del suero se unen a los péptidos de YEAK y YFAK con diferentes especificidades. Los cuadros III y IV enlistan proteínas del suero que se asocian con HDL y LDL, respectivamente. Cualquier proteína del suero puede unirse a los DSPs descritos en la presente, haciendo variar las afinidades y selectividades.

Una vez que se identifica un polipéptido de captura que se une a los DSPs, puede determinarse la especificidad de la unión contra péptidos similares o contra péptidos completamente aleatorios. El polipéptido de captura identificado y caracterizado (ya sea las mismas moléculas realmente identificadas o moléculas similares obtenidas de una fuente diferente), puede usarse entonces a su vez para analizar cuantitativamente las composiciones de DSP que se encontró se unen.

Proteínas del suero En algunas modalidades, la unión de las composiciones de DSP a las proteínas del suero constituye un aspecto importante de su actividad biológica. La unión de las composiciones de DSP a las proteínas del suero puede facilitar su distribución en el tejido y la captura por células que presentan antígenos, tales como monocitos y macrófagos. Como se indicó anteriormente, la unión de los péptidos a las proteínas del suero puede protegerlos de la degradación y/o el cambio. En un experimento análogo que implica RSPs, puede detectarse a PI-2301 (plovamer, un polímero de secuencia aleatoria de YFAK) y Cop-1 (acetato de glatiramer, un RSP de YEAK) en el suero de varias especies, incluyendo el hombre, varias horas después de la administración subcutánea, mientras un RSP control desapareció del suero después de un corto tiempo [véase la solicitud de E.U.A. publicación 2009-027496]. El copolímero 1 (Cop-1) es referido también como acetato de glatiramer. Cop-1 ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de esclerosis múltiple (MS), bajo el nombre comercial COPAXONE™ (marca comercial de Teva Pharmaceuticals Ltd., Petah Tikva, Israel). Escalas de peso molecular y procedimientos para producir una forma preferida de Cop-1 , se describen en la patente de E.U.A. No. 5,800,808.

Por consiguiente, pueden usarse proteínas del suero para capturar y/o identificar uno o más péptidos de una composición de DSP. Como un todo, las composiciones de DSP contienen un gran número, incluso miles de millones de péptidos individuales, de los cuales una o más sub- fracciones pueden ser responsables de las propiedades de unión a las proteínas del suero, mientras otras sub-fracciones no. Esto es especialmente aplicable para mezclas obtenidas mediante la síntesis de péptidos de fase en solución, en donde diferentes lotes de composiciones de DSP pueden contener variaciones en el porcentaje de péptidos capaces de unirse a las proteínas del suero. Por ejemplo, puede ser importante monitorear las composiciones de DSP en el suero para demostrar la bioequivalencia entre los diferentes lotes para demostrar que las fracciones que se unen a las proteínas del suero son cuantitativamente y cualitativamente equivalentes a través de los diferentes lotes de composiciones de DSP.

Pueden usarse proteínas del suero in vitro para seleccionar y/o caracterizar miembros de unión de una composición de DSP. Pueden usarse también proteínas del suero in vivo para seleccionar, medir y de otra manera caracterizar péptidos que se unen a las proteínas del suero, proveyendo de esta manera un medio para distinguir péptidos específicos o subgrupos de péptidos con base en su unión a las proteínas del suero y/o su persistencia in vivo. Características específicas de los péptidos que se unen a las proteínas del suero pueden comprender secuencias específicas de aminoácidos, relaciones de aminoácidos en la mezcla, estructuras, motivos únicos o la configuración de residuos cargados.

CUADRO II Ejemplos de proteínas del suero que experimentalmente se muestran unirse a péptidos de YEAK y YFAK en el suero humano CUADRO II (CONTINUACIÓN) CUADRO III Proteínas del suero asociadas con HDL CUADRO III (CONTINUACIÓN) CUADRO III (CONTINUACIÓN) CUADRO IV Proteínas del suero asociadas con LDL Unión entre las proteínas del suero y las composiciones de DSP Sin que se desee que sea limitado por la teoría, desde el punto de vista mecanicista, la unión de los péptidos dentro de las composiciones de DSP con proteínas del suero tales como las lipoproteínas que se encuentra están asociadas con HDL y LDL, podría facilitar su captura por los monocitos a través de receptores tales como SR-BI o ABCA1. Esta unión puede inducir la activación de los monocitos y su diferenciación en células anti-inflamatorias.

Una proteína del suero puede unirse a una composición de DSP como parte de un complejo de colesterol tal como un complejo de HDL o LDL, y/o en conjunto con otras proteínas y polipéptidos (cualquiera de los cuales puede funcionar también individualmente como un polipéptido de captura) que se encuentran en asociación con la proteína del suero bajo condiciones fisiológicas. De esta manera, los métodos de la invención contemplan que se tengan componentes adicionales encontrados en el suero cuando se une la composición de DSP a una proteína del suero.

Detección de una composición de DSP en una muestra biológica: determinación de la biodisponibilidad Un aspecto de la presente invención es un método para detectar la presencia de una composición de DSP en una muestra biológica, que comprende: poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura; y detectar la presencia o ausencia de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP, en donde la presencia de unión indica la presencia de componentes de péptidos de la composición de DSP en la muestra biológica. Además, dicho método puede extenderse para medir la cantidad o concentración de una composición de DSP en una muestra.

En algunas modalidades, la presencia de una composición de DSP puede detectarse en una muestra biológica, poniendo en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); y detectando la presencia o ausencia de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP. En esta prueba, la presencia de unión indica la presencia de péptidos de DSPs en la muestra biológica. Además, la invención provee métodos para determinar una cantidad de una composición de DSP en una muestra biológica, poniendo en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); y cuantificando un nivel de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP.

. Otras modalidades de la invención proveen métodos para determinar la biodisponibilidad de una composición de DSP en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto una dosis de una composición que comprende la composición de DSP; remover una muestra biológica del sujeto; y poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina). Se contempla que los péptidos de las composiciones de DSP son unidos extensivamente a un polipéptido de captura in vivo. Sin embargo, para más caracterización, pueden usarse anticuerpos específicos contra los complejos que comprenden péptidos de una composición de DSP y un péptido de captura, pero no cada uno de ellos individualmente, para la detección de la composición de DSP biodisponible.

Mejora de la dosificación y métodos de administración Otro aspecto de la presente invención provee métodos para administrar composiciones de DSP a un sujeto mamífero, en una cantidad determinada con base en la porción biodisponible de la cantidad dosificada, según se determina mediante el método descrito anteriormente u otros métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, el método comprende además incluir una muestra control, realizar una prueba farmacodinámica para determinar cambios de marcadores fisiológicos, tales como hormonas, enzimas, proteínas del suero, citocinas, inmunomoduladores o un efector o regulador de cualquiera de estas proteínas funcionales, entre la muestra control y muestras de prueba comparando los dos resultados, y determinando la dosificación efectiva que induce los cambios deseados en un parámetro farmacodinámico. En ciertas modalidades, se observan cambios de comportamiento, cambios subjetivos reportados por un sujeto, tales como alivio del dolor o un síntoma de una enfermedad, u otra evidencia de efectos indirectos. En ciertas modalidades, dicho sujeto mamífero es un roedor, tal como un ratón o rata. En otras modalidades, dicho sujeto es humano.

Más generalmente, un método para tratar o prevenir una respuesta inmune no deseada en un sujeto puede comprender proveer una composición de DSP; administrar la composición de DSP a un sujeto de prueba; remover una muestra biológica del sujeto de prueba; poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo una secuencia de péptidos seleccionada de alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); separar los DSPs que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; determinar características de los DSPs separados; preparar una serie de DSPs con las características de los DSPs separados, y administrar la serie preparada de DSPs a un sujeto.

En estos métodos, las composiciones de DSP pueden administrarse a un sujeto más de una vez. Las composiciones de DSP pueden administrarse al sujeto a intervalos de, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 6, 12, 18, 24, 36, 48 ó 72 horas.

De esta manera, algunas modalidades de la invención son métodos para administrar una dosis adecuada de una composición de DSP a un sujeto que necesita de la misma, en donde la dosis adecuada se determina administrando al sujeto una primera dosis de la composición de DSP; removiendo una muestra biológica del sujeto; poniendo en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); determinando un nivel del polipéptido de captura en la muestra biológica; opcionalmente repitiendo los pasos previos usando una segunda dosis diferente; y comparando los niveles con un nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica. Bajo estas condiciones, una dosis adecuada es la dosis que resulta en el nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica. Un nivel adecuado de una composición de DSP en una muestra biológica, es un nivel al cual se obtiene una lectura de salida funcional deseable, o cambio de marcador sustituto. Una lectura de salida funcional puede ser el fenotipo o función del sujeto, el fenotipo o función de material celular derivado del sujeto, o la composición de fluidos derivada del sujeto. En una modalidad particular, el paso de detección se repite después de ciertos intervalos de tiempo para determinar el curso de tiempo de la biodisponibilidad después de la administración. En ciertas modalidades, se determina una vida media de la composición de DSP como un grupo de dicho curso de tiempo. Ejemplos para lecturas de salida funcionales de aumento o secuestro de la respuesta inmune, son: incremento o detección de FNTa, IL-6, CXCL1 , CXCL2 e IL-12p70 como indicadores de estimulación inmune no deseada, e incremento o detección de 11-1 ra, CXCL 3 y CCL22 como indicadores de cambios positivos deseables. Los cambios en estos marcadores se determinan fácilmente mediante habilidades y materiales conocidos y fácilmente disponibles en la técnica.

Ciertas modalidades de la invención facilitan la comparación de dosis efectivas a través de las especies. La comparación de dosis efectivas en humanos y animales experimentales tales como ratones o ratas, se hace difícil no sólo por la diferencia de tamaño del cuerpo y la diferencia en el metabolismo general, sino también debido a que se ha observado que la biodisponibilidad de un fármaco difiere entre las especies animales. Es un aspecto de la presente invención que la biodisponibilidad de las composiciones de DSP está correlacionada parcialmente por la unión de los péptidos componentes a las proteínas del suero, lo cual puede permitir una vida media más larga y cierta distribución en los tejidos. De esta manera, algunas modalidades de la invención son métodos para determinar una dosificación adecuada de una composición de DSP en un sujeto, dichos métodos comprendiendo determinar una primera dosificación adecuada de la composición de DSP en un modelo animal experimental, en donde la primera dosificación adecuada es dicha dosificación que da una lectura de salida favorable y que corresponde a un nivel de la composición de DSP unida a una proteína del suero in vivo, y determinar una segunda dosificación adecuada de la composición de DSP en el sujeto dosificando el sujeto, de modo que el nivel de la composición de DSP unida a la proteína del suero in vivo en el sujeto, sea similar o idéntica al nivel logrado administrando la primera dosificación adecuada al animal experimental.

En modalidades particulares, la administración de una composición de DSP puede mejorarse usando los métodos de la presente invención. Un método comprende administrar al sujeto una dosis adecuada de una composición de DSP, en donde dicha dosis adecuada se determina administrando al sujeto una dosis de la composición de DSP; remover una muestra biológica del sujeto experimental; poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); determinar un nivel del polipéptido de captura en la muestra biológica; opcionalmente repetir todos los pasos previos, y comparando los niveles contra un nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica. Una dosificación adecuada se determina como se describió anteriormente, con base en lecturas de salida favorables.

Los péptidos pueden marcarse mediante cualquier medio adecuado, tal como adhiriendo porciones fluorescentes, marcas radiactivas, formando conjugados químicos, por medio de biotinilación, añadiendo marcadores de epítopes, o cualquier otra porción que facilite la detección. Proteínas del suero que actúan como polipéptidos detectores como se describió anteriormente, pueden ser adheridas a un soporte sólido. Después de que las proteínas del suero se han unido a uno o más péptidos de la composición de DSP, el complejo unido que comprende el polipéptido de captura unido a la composición de DSP puede ser aislado.

Métodos para aislar complejos unidos pueden incluir inmunoprecipitación, ELISA, inmunodetección, o detección de la marca de los polipéptidos de captura. La detección de la unión del polipéptido de captura a la composición de DSP puede realizarse con anticuerpos para el polipéptido de captura, anticuerpos para la composición de DSP, o anticuerpos que se hayan generado para reconocer el complejo unido.

Las composiciones de DSP pueden administrarse subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, intranasalmente, o a través de cualquier orificio o membrana mucosa.

En algunas modalidades, una composición para detectar una composición de DSP en una muestra biológica, puede comprender por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de alfa-1-antitr¡psina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina.

Selección de péptidos específicos del interior de una composición de DSP Un aspecto de la presente invención es su uso en la identificación y/o el aislamiento de péptidos o un subgrupo de péptidos de una composición de DSP. Aunque un rasgo ventajoso de las composiciones de DSP comparadas con muestras de péptidos específicas de oligómeros o de una especie individual es su heterogeneidad, es concebible que un subgrupo de los péptidos que constituyen la mezcla sea más efectivo que otro subgrupo, o que un subgrupo sea de hecho no deseable. De esta manera, la presente invención provee métodos para identificar y/o aislar péptidos de una muestra que comprende una composición de DSP, con base en la afinidad de los péptidos por ciertos polipéptidos de captura. En casos particulares, el subgrupo puede comprender péptidos que tienen una o más secuencias de aminoácidos diferentes. En otros casos, los polipéptidos de captura pueden usarse para clasificar los componentes de la composición de DSP con base en la especificidad de unión.

En algunas modalidades, un método para identificar un subgrupo de péptidos que se unen a un polipéptido de captura comprende preparar una composición de DSP de acuerdo con un protocolo, poner en contacto dicha composición de DSP con un polipéptido de captura predeterminado (por ejemplo, que sea deseable como objetivo o vehículo in vivo), determinar la unión de los péptidos dentro de la composición de DSP, identificar las características que diferencian los péptidos que se unen de los péptidos que no se unen, y preparar una composición de DSP mejorada que refleje una o más de las características de diferenciación.

En ciertas modalidades, una muestra que contiene una composición de DSP es puesta en contacto con un polipéptido de captura, y los péptidos que constituyen la composición de DSP que se une al polipéptido de captura, son aislados e identificados. En ciertas modalidades, una composición de DSP es puesta en contacto con por lo menos una proteína del suero que actúa como un polipéptido de captura. En modalidades más particulares, dicha proteína del suero se selecciona de un polipéptido de captura de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina.

El polipéptido de captura puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido, y/o puede ser marcado mediante métodos conocidos en la técnica. La inmovilización y la marcación pueden usarse en pasos adicionales para separar los péptidos unidos de los polipéptidos de captura, y/o para determinar las características de los péptidos aislados. Dichas características pueden incluir la secuencia de aminoácidos de un péptido unido, relaciones relativas de aminoácidos en los péptidos unidos, configuración o disposición de los residuos cargados en la secuencia, la estructura del péptido, la carga, o cualquier otra característica adecuada.

La unión entre las composiciones de DSP y las proteínas del suero puede usarse también para identificar péptidos biodisponibles en una composición de DSP, tal como una muestra biológica colectada de un sujeto. Aquí, la composición de DSP puede administrarse al sujeto una primera vez; y entonces, una segunda vez después de la administración, puede removerse una muestra de tejido del paciente. En la muestra de tejido, pueden identificarse péptidos en la muestra que se unen a por lo menos un polipéptido de captura, por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1- antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina.

Preparación mejorada de las composiciones de DSP Otro aspecto de la invención es un método para mejorar el procedimiento de fabricación de una composición que comprende una composición de DSP. En algunas modalidades, se diseña una composición de DSP con base en el método anterior para identificar un subgrupo de péptidos que se unen a un polipéptido de captura. En algunas modalidades, se diseña una composición de DSP de modo que la composición de aminoácidos y/o la secuencia de aminoácidos se aproximen a las del subgrupo de péptidos que se unen al polipéptido de captura.

En ciertas modalidades, un método para producir una composición de DSP que tiene toxicidad reducida, puede comprender poner en contacto la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1-B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; determinar las características de los péptidos separados; y preparar una serie de péptidos con las características de los péptidos separados.

Asimismo, un método para producir una composición de DSP que tiene potencia mejorada, puede comprender poner en contacto la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprenda un péptido (por ejemplo, seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); y separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; determinar las características de los péptidos separados; y preparar una serie de péptidos con las características de los péptidos separados.

En algunas modalidades, un subgrupo deseable de una composición de DSP puede obtenerse usando polipéptidos de captura inmovilizados en una escala preparatoria. Una composición de DSP se prepara como se contempló y se describió anteriormente, y es puesta en contacto con polipéptidos de captura inmovilizados que sean relevantes para una mejora deseada. Los péptidos no unidos son removidos lavando la muestra, y la porción unida de la composición de DSP es eluida usando condiciones de disociación adecuadas, tales como pH variado, concentración de sales o la adición de solventes orgánicos. La porción unida agrupada se trata adecuadamente para concentrar y remover los componentes terapéuticamente no deseables, por ejemplo, solventes orgánicos, mediante evaporación o mediante purificación adicional a través de métodos cromatográficos o de cristalización u otros métodos de purificación adecuados. El subgrupo de la composición de DSP que se prepara de esta manera, se usa como agente terapéutico.

Además, este aspecto de la invención puede combinarse con las mejoras descritas anteriormente en dosificación y administración. Cuando se preparan composiciones de DSP mejor adaptadas, se anticipa que la dosificación y el modo de administración pueden ajustarse en consecuencia. Por lo tanto, en modalidades alternativas, un método comprende preparar una composición de DSP de acuerdo con un protocolo, formular una composición que comprenda la composición de DSP, determinar la cantidad biodisponible de la composición de DSP en dicha composición detectando el nivel o el grado de lectura de salida funcional, comparar dicha lectura de salida contra un estándar, y ajustar el protocolo o la formulación de la composición para obtener una biodisponibilidad deseada.

Direccionamiento de agentes terapéuticos específicos de tejido Otro uso potencial de la relación entre las composiciones de DSP y las proteínas del suero, es el direccionamiento de agentes terapéuticos específicos de tejido. En una modalidad, un método para preparar un agente terapéutico para un tejido objetivo en un sujeto, puede comprender proveer una composición de DSP; y acoplar un agente terapéutico a la composición de DSP para formar un conjugado.

De esta manera, algunas modalidades de la invención son métodos para suministrar un agente terapéutico hacia un tejido específico en un sujeto aislando un marcador de péptidos, poniendo en contacto una composición de DSP con un péptldo especifico de tejidos (por ejemplo, comprendiendo un péptido seleccionado de alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina); y separando los péptidos que se unen al péptido específico de tejidos de la mezcla; acoplando el marcador de péptidos a un agente terapéutico; y (c) administrando el conjugado a un sujeto.

Otras modalidades de la invención incluyen un método para preparar un conjugado que comprende un agente terapéutico acoplado a un marcador de péptidos, y los conjugados resultantes mismos. Dicho péptido puede aislarse de la composición de DSP con base en la afinidad de unión a alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-I, alfa-1 -B-glucoproteína, apolipoproteína A-IV, apolipoproteína D y prealbúmina.

Un agente terapéutico puede ser una pequeña molécula orgánica o una macromolécula biológica, y el tejido específico puede ser tejido de cerebro, pulmón o hígado. El marcador de péptidos puede ser acoplado al agente terapéutico mediante un enlace covalente, complejos de inclusión, enlaces iónicos o enlaces de hidrógeno. Ejemplos de agentes terapéuticos útiles para la práctica de esta invención, son agentes antitumorales que incluyen antimetabolitos, inhibidores de citocinas y factores de crecimiento, inhibidores de cinasa, agentes antíangiogénesis, agentes antiinflamatorios, anticuerpos específicos de enfermedad, vacunas y antibióticos.

Métodos inmunológicos, bioquímicos y de biología molecular estándar pueden usarse en la presente y se conocen en la técnica. Ejemplos de protocolos estándar pueden encontrarse, por ejemplo, en la serie Current Protocols publicada por John Wiley and Sons, y todas las actualizaciones disponibles hasta la fecha, incluyendo Current Protocols en biología molecular, en inmunología, en biología celular, en química de proteínas, en farmacología, y otros. Todas las referencias y patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Detección de PI-2301 y Cop-1 en suero normal de humano Se obtuvieron PI-2301 (un polímero de secuencia aleatoria de YFAK) o Cop-1 (un polímero de secuencia aleatoria de YEAK) a una concentración de 500 ng/mL, y se diluyeron en suero normal de humano a 5% en PBS hasta concentraciones de 100 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL o 12.5 ng/mL, y se añadieron a suero normal de humano. La unión de PI-2301 o Cop-1 a proteínas del suero contenidas en el suero normal de humano, se detectó mediante la adición de anticuerpos anti-YFAK de conejo o anticuerpos anti-YEAK de conejo.

Una placa de ELISA no recubierta fue bloqueada con PBS/Tween 20 a 0.1 % por 2 horas a temperatura ambiente. Muestras de PI-2301 o Cop-1 fueron diluidas en serie en PBS/suero normal de humano a 5% y añadidas a las cavidades bloqueadas y lavadas de la placa de ELISA. La muestra de PI-2301 o Cop-1 en suero normal de humano fue unida a la placa, y la muestra de PI-2301 o Cop-1 no unida fue removida lavando la placa con PBS/Tween 20 a 0.05%. El anticuerpo anti-Cop-1 anti-conejo o el anticuerpo anti-PI-2301 anti-conejo purificado con proteína A, diluido a una concentración adecuada con base en el título, se añadió por 1 hora a temperatura ambiente. Después de otro paso de lavado para remover los anticuerpos anti-Cop-1 de conejo o los anticuerpos anti-PI-2301 de conejo no unidos, se añadió a la cavidad un anticuerpo secundario, un anticuerpo de IgG-HRP anti-conejo de cabra (anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante para IgG de conejo). Después de que se lavó cualquier anticuerpo secundario no unido, se añadió substrato para HRP a las cavidades, y se incubaron por 15 minutos, lo cual dio un color azul que cambió a amarillo cuando se añadió solución de detención, cuya intensidad de color se correlaciona con la cantidad de PI-2301 o Cop-1 total en la cavidad. La densidad óptica se midió a 450 nm con un lector de placa de ELISA, y se generó una curva del título para cada serie de las muestras de suero inutilizadas con PI-2301 y Cop-1 , respectivamente. El límite de detección de PI-2301 en el suero o de Cop-1 en el suero, se define como la concentración que resulta en una absorción A450 nm que está 3 veces arriba del fondo. Las cavidades de la placa de ELISA usadas para determinar el fondo se tratan como se describió anteriormente, salvo que se omitió a PI-2301 o Cop-1.

Los resultados se grafican en la figura 2. En el eje x, se indica la concentración de la mezcla de péptidos complejos. En el eje y, se muestra la absorbancia colorimétrica A450 de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. A mayores concentraciones de las mezclas de péptidos complejos, la detección de los conjugados por los anticuerpos anti-PI-2301 o anti-Cop-1 es mayor que las menores concentraciones de las mezclas de péptidos complejos. 12.5 ng/mL corresponden a una dosis de aproximadamente 2 mg en un paciente humano.

EJEMPLO 2 Captura de los complejos sobre una columna Se preparó PI-2301 o Cop-1 inmovilizado haciendo reaccionar los péptidos con Sepharose® activada con bromuro de cianógeno (CNBr), un medio de cromatografía de poro grande pre-activado usado para inmovilizar ligandos (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos) que contiene aminas primarias, usando el método de bromuro de cianógeno. En resumen, después de que se pesa la cantidad deseada, el medio de CNBr-Sepharose® deshidratado por congelación se lavó 10 X 15 minutos con HCI 1 mM frío (uso de aproximadamente 200 mL de HCI 1 mM/g de Sepharose deshidratado), y entonces 2 X con regulador de pH de acoplamiento. El ligando se disolvió en el regulador de pH de acoplamiento a la concentración deseada, se combinó con el medio de CNBr-Sepharose® a una relación de 1 :2 (uso de 1 volumen de ligando a 2 volúmenes de gel de CNBr-Sepharose® lavado), y se incubó entonces durante la noche a 4°C sobre una plataforma oscilante. Cualquier sitio activo restante sobre el gel fue bloqueado y lavado entonces para remover cualquier exceso de ligando. Para purificar la proteína específica del ligando, el gel acoplado se lavó 2 X en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS), el reactivo deseado (suero, sobrenadante de células) se añadió a una relación de 1 :2 (1 volumen de reactivo a 2 volúmenes de gel de CNBr-Sepharose® lavado), y se incubó entonces durante la noche a 4°C sobre una plataforma oscilante. La suspensión acuosa espesa de reactivo/gel se empacó en una columna desechable, se lavó para remover el reactivo no unido, y entonces la proteína específica del ligando se eluyó con un regulador de pH bajo. Después de la neutralización del pH, se leyó la absorbancia a 280 nm de las fracciones eluidas para identificar las fracciones que contenían a los ligandos. La columna se lavó y se almacenó a 4°C para uso repetido.

EJEMPLO 3 Identificación de proteínas unidas a PI-2301 o Cop-1 Se obtuvieron muestras que contenían proteínas de unión a Pl-2301 o proteínas de unión a Cop-1 , mediante el método del ejemplo 1 o el ejemplo 2. Estas muestras fueron digeridas entonces enzimáticamente y analizadas mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masa en tándem (LC-MS/MS), con el propósito de identificar las proteínas que se unen a PI-230 o Cop-1. En resumen, una alícuota de cada muestra fue digerida con la proteasa específica de secuencias, tripsina. Después de la digestión, la mezcla de péptidos-proteína se analizó mediante LC-MS/MS. Los péptidos se separaron con base en su retención a una columna de fase de liberación, y entonces se rociaron en un espectrómetro de masa. Durante el procedimiento de aspersión, el péptido adquirió una carga de +2 o +3, y el espectrómetro de masa monitorea la relación de sobrecarga de masa. Si un péptido tiene una relación de sobrecarga de masa significativa, es entonces fragmentado por colisión con gases, y se registran los patrones de fragmentación. Estos patrones de fragmentación pueden compararse entonces con los patrones de fragmentación teóricos de todas las proteínas conocidas. Este moldeo de los patrones de fragmentación experimentales con los patrones de fragmentación teóricos, resultó en la identificación de varias lipoproteínas de los complejos de HDL y LDL. Estas lipoproteínas se encontraron en la muestra de PI-2301 y en la muestra de Cop-1. La muestra de Cop-1 tuvo también algunas proteínas únicas que incluyeron proteínas del complemento tales como C3 y C4A.

El cuadro A resume las proteínas del suero en el suero normal de ratón o el suero normal de humano que se identificaron por la unión a PI-2301 o Cop-1. PI-2301 puede ser acetilado o no acetilado. Las proteínas de la muestra se obtuvieron en un método similar al del ejemplo 1 , en donde PI-2301 o Cop-1 se mezclaron y se unieron a los componentes en el suero. Los complejos de unión de PI-2301 o Cop-1 fueron reconocidos por anticuerpos anti-YFAK o anti-YEAK, y detectados con anticuerpos secundarios y reactivos de detección. Las proteínas del suero fueron eluidas del complejo e identificadas. A las proteínas se les asignó una puntuación con base en la absorbancia A450 del reactivo de detección. Una puntuación de 70 corresponde a un valor de significancia de p < 0.001 , en comparación con la absorbancia de fondo, y se considera como estadísticamente significativa.

El cuadro A muestra una lista de proteínas del suero que se unen a PI-2301 o Copaxone. El origen de las proteínas del suero es suero normal de ratón o suero normal de humano, según se indica. PI-2301 puede ser acetilado o no acetilado. Los complejos de unión de PI-2301 o Copaxone son reconocidos por los anticuerpos anti-YFAK o anti-YEAK, y detectados con anticuerpos secundarios y reactivos de detección. Las proteínas del suero son eluidas del complejo e identificadas. Se asigna a las proteínas una puntuación con base en la absorbancia A450 del reactivo de detección. Una puntuación de 70 corresponde a una p = 0.001 , en comparación con la absorbancia de fondo, y es considerada estadísticamente significativa CUADRO A CUADRO A (CONTINUACIÓN) CUADRO A (CONTINUACIÓN) Mientras que se espera que los péptidos de captura identificados mediante el método anterior se unan a los DSPs, la prueba anterior puede realizarse también con DSPs para identificar empíricamente las proteínas del suero que se unen más fuerte al DSP.

EJEMPLO 4 Comparación de la composición de péptidos a través de varias longitudes y lotes de las composiciones de DSP Después de la síntesis de diferentes composiciones de DSP, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida o mediante síntesis de fase en solución, los lotes individuales o los lotes obtenidos mediante el mismo procedimiento de fabricación, y los lotes individuales de mezclas fabricadas mediante diferentes procedimientos, se ponen a prueba y se comparan para variación usando bioensayos. Dependiendo de la indicación de la composición de DSP, bioensayos adecuados incluyen la liberación de CCL22 por la línea de monocitos RAW264.7, pruebas de proliferación ex vivo, y midiendo la unión de las proteínas del suero a los péptidos en la composición de DSP. Mediante el uso de estos bioensayos, pueden determinarse subgrupos de péptidos o incluso péptidos individuales que están presentes en cualquier procedimiento o lote dado. Los procedimientos y los lotes de las composiciones de DSP se compararán para determinar si los mismos subgrupos de péptidos y/o tipos de péptidos están consistentemente representados a través de los diferentes procedimientos y lotes.

Se preparó una pluralidad de resinas de identificación inmovilizando una selección de proteínas del suero sobre un soporte sólido. En algunas modalidades, la proteína de captura es una proteína del cuadro 1. Cada soporte sólido contendrá por lo menos una proteína del suero, y si más de una proteína del suero es unida al soporte sólido, entonces la relación de las proteínas del suero individuales unidas a un soporte sólido dado será consistente a través de cada resina de identificación. Una alícuota de cada lote de la composición de DSP se aplicará a su propio soporte sólido, bajo condiciones que permitan que un subgrupo de DSPs, se unan a las proteínas del suero. Después del lavado de los péptidos no unidos, los péptidos unidos serán eluidos. Los péptidos de DSP aislados de esta manera serán caracterizados adicionalmente para (1) presencia de péptidos de DSP distintos, (2) relaciones de péptidos con algún otro, (3) proporción de péptidos que se unen a la proteína de unión del suero, respecto a la composición de DSP total, (4) presencia de motivos de unión y secuencias de péptidos, (5) composición de aminoácidos y relaciones de aminoácidos, y/u otras características de los péptidos. Las características de los péptidos de DSP aislados de cada lote, se compararán entre sí.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para detectar una composición de DSP, que comprende: a. proveer una preparación sustancialmente pura de uno o más polipéptidos de captura; b. adherir los uno o más polipéptidos de captura a un medio para detectar cuantitativamente la composición de DSP; y c. determinar la unión de la composición de DSP a los uno o más de dichos polipéptidos de captura.

2 - Un método para mejorar el diseño de una composición de DSP, que comprende: a. proveer una preparación sustancialmente pura de uno o más polipéptidos de captura; b. adherir los uno o más polipéptidos de captura a un medio para detectar cuantitativamente la composición de DSP; c. determinar la unión de la composición de DSP a los uno o más de dichos polipéptidos de captura; d. ajustar el diseño de la composición de DSP para aumentar o reducir la unión a uno o más polipéptidos de captura; e. repetir el paso c; y f. repetir opcionalmente los pasos c a e., en donde el ajuste del diseño de dicha composición de DSP resulta en cualquiera de uno o más de: biodisponibilidad incrementada, reducción en toxicidad e incremento en eficacia.

3.- Un método para detectar especies dentro de una composición de DSP, que comprende: a. proveer una preparación sustancialmente pura de uno o más polipéptidos de captura; b. adherir los uno o más polipéptidos de captura a un soporte sólido; c. poner en contacto el soporte sólido con la composición de DSP; y d. determinar la unión de especies individuales de la composición de DSP al soporte sólido.

4.- Un método para mejorar el diseño de especies dentro de una composición de DSP, que comprende: a. proveer una preparación sustancialmente pura de uno o más polipéptidos de captura; b. adherir los uno o más polipéptidos de captura a un soporte sólido; c. poner en contacto el soporte sólido con la composición de DSP; d. determinar la unión de las especies individuales de la composición de DSP al soporte sólido; e. ajustar el diseño de la composición de DSP para aumentar o reducir la unión a los uno o más polipéptidos de captura; f. repetir el paso d.; y g. repetir opcionalmente los pasos d. a f., en donde el ajuste del diseño de las especies de la composición de DSP resulta en cualquiera de uno o más de: biodisponibilidad incrementada, reducción en toxicidad e incremento en eficacia.

5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque los uno o más polipéptidos de captura de (a) se identifican: i. adhiriendo la composición de DSP a un soporte sólido; ii. poniendo en contacto dicho soporte sólido en i. con un fluido biológico que contenga proteína; ¡ii. identificando las proteínas de ii. unidas específicamente al soporte sólido en i.; en donde una proteína identificada en ii. es un polipéptido de captura.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el polipéptido de captura se selecciona de componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig.

7. - Un método para determinar la presencia de una composición de DSP, que comprende los pasos de: a. adherir una o más proteínas seleccionadas de componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, a!fa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteina no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig, a un medio para detectar cuantitativamente dicha composición de DSP en una muestra; y b. determinar el nivel de dicha composición de DSP en dicha muestra.

8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque un polipéptido de captura se selecciona de componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombína), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histídina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig.

9.- Un método para detectar la presencia de una composición de DSP en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura contenido en suero normal de humano, suero normal de primate no humano, suero normal de conejo, suero normal de ratón, suero normal de rata, suero normal de hurón, suero normal de cerdo, suero normal de perro, suero normal de caballo, suero normal de oveja y suero normal de vaca; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP, en donde la presencia de unión indica la presencia de la composición de DSP en la muestra biológica.

10 - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el polipéptido de captura se selecciona de un polipéptido que comprende por lo menos un componente del proteoma de HDL, proteoma de LDL, o por lo menos una proteína del suero.

1 1.- Un método para detectar la presencia de una composición de DSP, que comprende péptidos de YFAK o YEAK en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-?-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP, en donde la presencia de unión indica la presencia de péptidos de YFAK o YEAK en la muestra biológica.

12.- Un método para medir una cantidad de una composición de DSP que comprende péptidos de YFAK o YEAK en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-l, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-?-glucoproteína, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; y (b) cuantificar un nivel de unión del polipéptido de captura a la composición de DSP; en donde el nivel de unión indica la cantidad de la composición de DSP en la muestra biológica.

13.- Un método para medir la biodisponibilidad de una composición de DSP en un mamífero, que comprende: poner en contacto una muestra biológica de un mamífero que ha sido previamente administrado con una dosis de una composición que comprende la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-?-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteina no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; determinando de esta manera la biodisponibilidad de la composición de DSP en la muestra biológica.

14.- Un método para determinar una dosis adecuada de una composición de DSP para ser administrable a un sujeto que necesita de la misma, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que ha sido previamente administrado con una dosis de la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; (b) determinar un nivel del polipéptido de captura en la muestra biológica; (c) opcionalmente repetir los pasos (a) a (b) usando una dosis diferente; y (d) comparar los niveles con un nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica; en donde la dosis adecuada es la dosis que resulta en el nivel adecuado predeterminado de la composición de DSP en la muestra biológica.

15. - El uso de una dosis adecuada de una composición de DSP en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una respuesta inmune no deseada en un sujeto, en donde dicha dosis adecuada se determina por el método de la reivindicación 14.

16. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 o el uso de la reivindicación 15, en donde el polipéptido de captura es marcado.

17. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 o el uso de la reivindicación 15 en donde el polipéptido de captura es adherido a un soporte sólido.

18. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 o el uso de la reivindicación 15 , que comprende adicionalmente aislar un complejo que comprende el polipéptido de captura unido a la composición de DSP.

19. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 o el uso de la reivindicación 15, que comprende adicionalmente detectar la unión del polipéptido de captura a la composición de DSP con anticuerpos al polipéptido de captura.

20. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el uso de la reivindicación 15, en donde la composición es subcutáneamente administrable.

21. - Una composición para detectar una composición de DSP en una muestra biológica, que comprende por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig.

22.- Un método para aislar péptidos de una muestra que comprende una composición de DSP, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de polipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; y (b) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el polipéptido de captura es inmovilizado sobre un soporte sólido.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el polipéptido de captura es marcado con epítopes.

25 - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende adicionalmente separar los péptidos unidos de los polipéptidos de captura.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende adicionalmente determinar las características de los péptidos aislados.

27 - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la determinación de las características comprende determinar una secuencia de aminoácidos de un péptido unido, o determinar las relaciones relativas de aminoácidos en los péptidos unidos.

28.- Un método para identificar péptidos biodisponibles en una composición de DSP en un sujeto, que comprende: identificar péptidos en una muestra de tejido de un sujeto que ha sido previamente administrado con la composición de DSP que se unen a por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1-antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig.

29.- Un método para producir una composición de DSP que tiene toxicidad reducida, que comprende: (a) poner en contacto la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; y (b) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; (c) determinar las características de los péptidos separados; y (d) preparar una serie de péptidos con las características de los péptidos separados.

30.- Un método para producir una composición de DSP que tiene potencia mejorada, que comprende: (a) poner en contacto la composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de polipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; y (b) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; (c) determinar las características de los péptidos separados; y (d) preparar una serie de péptidos con las características de los péptidos separados.

31.- El uso de una nueva serie de péptidos en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una respuesta inmune no deseada en un sujeto, en donde dicho nueva serie de péptidos se producen por: (a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto de prueba que ha sido previamente administrado con una composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende una secuencia de péptidos seleccionada de: componente C3 del complemento, preproproteína apolipoproteína A-I, preproproteína apolipoproteína A-ll (apolipoproteína D), componente C4A del complemento, inhibidor de tripsina, proteína relacionada con la cadena pesada de la familia de inhibidores de inter-alfa-tripsina (IHRP), alfa-1-B-glucoproteína, alfa-1 -antitripsina, apolipoproteína A-IV, ceruloplasmina, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA34971 del NCBI), apolipoproteína E, factor B del complemento, prealbúmina, apolipoproteína C-lll, glucoproteína alfa2-HS, precursor de apolipoproteína J, cadena C, inmunoglobulina M, cadena ligera lambda de inmunoglobulina, factor de coagulación II (trombina), cadena kappa V-lll de Ig (aglutinina fría KAU), precursor de apolipoproteína J, Bur A1 de Ig, precursor de glucoproteína rica en histidina, glucoproteína alfa-2-HS, precursor de la isoforma a de gelsolina, proteinasa inhibidora tipo Kunitz, producto de proteína no nombrado (locus/No. de acceso CAA28659 del NCBI) y cadena J de Ig; (b) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de la mezcla; (c) determinar las características de los péptidos separados; y (d) preparar una serie de péptidos con las características de los péptidos separados.

32. - El método de la reivindicación 28 ó uso de la reivindicación 31 , en donde los péptidos se administran al sujeto más de una vez.

33. - El método ó uso de la reivindicación 32, en donde los péptidos son administrables al sujeto a intervalos de 1 , 2, 3, 4, 6, 12, 18, 24, 36, 48 ó 72 horas.

34. - Un método para comparar diferentes preparaciones de una composición de DSP, que comprende: (a) poner en contacto una primera composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura contenido en suero normal de humano, suero normal de primate no humano, suero normal de conejo, suero normal de ratón, suero normal de rata, suero normal de hurón, suero normal de cerdo, suero normal de perro, suero normal de caballo, suero normal de oveja o suero normal de vaca; y (b) poner en contacto una segunda composición de DSP con por lo menos un polipéptido de captura que comprende un péptido seleccionado de: suero normal de humano, suero normal de primate no humano, suero normal de conejo, suero normal de ratón, suero normal de rata, suero normal de hurón, suero normal de cerdo, suero normal de perro, suero normal de caballo, suero normal de oveja o suero normal de vaca; y (c) repetir el paso (b) según sea necesario; y (d) separar los péptidos que se unen al polipéptido de captura de las mezclas de los pasos (a) a (c); (e) determinar las características de los péptidos separados del paso (d); y (f) comparar dicha serie separada de péptidos con las características de los péptidos separados del paso (d).

35. - Un método para preparar un agente terapéutico para un tejido objetivo en un sujeto, que comprende: (a) proveer una composición de DSP; y (b) acoplar un agente terapéutico a la composición de DSP para formar un conjugado.

36. - El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el agente terapéutico es una pequeña molécula orgánica o una macromolécula biológica.

37 - El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el tejido es tejido de cerebro, pulmón o hígado.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el- marcador de péptidos es acoplado al agente terapéutico mediante un enlace covalente, complejos de inclusión, enlaces iónicos o enlaces de hidrógeno.