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MX2012003006A - Modulacion de expresion de huntingtina. - Google Patents

Modulacion de expresion de huntingtina.

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Publication number
MX2012003006A
MX2012003006A MX2012003006A MX2012003006A MX2012003006A MX 2012003006 A MX2012003006 A MX 2012003006A MX 2012003006 A MX2012003006 A MX 2012003006A MX 2012003006 A MX2012003006 A MX 2012003006A MX 2012003006 A MX2012003006 A MX 2012003006A
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MX
Mexico
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compound
isis
huntingtin
seq
linked nucleosides
Prior art date
Application number
MX2012003006A
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English (en)
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MX340397B (es
Inventor
Susan M Freier
C Frank Bennett
Gene Hung
Seng H Cheng
Holly Kordasiewicz
Lisa Stanek
Don W Cleveland
Lamya Shihabuddin
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of MX2012003006A publication Critical patent/MX2012003006A/es
Publication of MX340397B publication Critical patent/MX340397B/es

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Abstract

La presente proporciona métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARNm y proteína de huntingtina en un animal. Dichos métodos, compuestos, y composiciones son útiles para tratar, prevenir, retrasar, o mejorar la enfermedad de Huntington, o un síntoma de la misma.

Description

MODULACION DE EXPRESIÓN DE HUNTINGTINA Listado de Secuencias La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado BIOL0113WOSEC.txt creado el 8 de septiembre del 2010, el cual tiene un tamaño de 456 Kb. La información en el formato electrónico del listado de secuencias está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.
Campo de la Invención En la presente invención se proporcionan métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión del mARN de huntingtina y proteína en un animal. Dichos métodos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, evitar o aliviar la enfermedad de Huntington.
Antecedentes de la Invención La enfermedad de Huntington (HD), es una enfermedad neurodegenerativa, dominante, autosomal, devastadora, originada por una expansión en la repetición de trinucleótido que codifica un tracto de poliglutamina (PolyQ) anormalmente largo en la proteína de huntingtina. El gen de la enfermedad de Huntington fue mapeado primero en el año de 1993 (Grupo de Colaboración de la Enfermedad de Huntington Cell. 1993, 72:971-83), que consiste en un gen, IT15, el cual contenía una repetición de polimórfico que es expandida e inestable en cromosomas HD. Aunque las repeticiones de CAG en el rango de tamaño normal normalmente son heredadas como los alelos de Mendelian, las repeticiones HD expandidas son inestables a través de la transmisión meiótica y se encuentran como expandidas más allá del rango de tamaño normal (6 a 34 unidades de repetición) en pacientes HD.
La proteína de huntingtina tanto normal como variante, está localizada principalmente en el citoplasma de las neuronas (DiFiglia y asociados, Neuron 1995, 14:1075-81 ). Como resultado de la longitud de poliglutamina excesiva, la proteína de huntingtina forma agregados en el citoplasma y el núcleo de las neuronas CNS (Davies y asociados, Cell 1997, 90:537-548). Las líneas celulares tanto de animales transgénicos como genéticamente modificadas han sido utilizadas para investigar los efectos de las repeticiones polyQ expandidas en la localización y procesamiento de huntingtina. Sin embargo, aún no está claro si la formación de agregados per se, es el paso citotóxico esencial o una consecuencia de disfunción celular.
HD está caracterizada por corea progresiva, cambios psiquiátricos y disminución intelectual. Este trastorno dominante afecta por igual a hombres y mujeres, y ocurre en todas las razas (Gusella y MacDonald, Curr. Opin. Neurobiol. 1995 5:656-62). Los síntomas de HD son debido a la muerte de las neuronas en muchas regiones del cerebro, aunque es más aparente en el estrato, particularmente en el núcleo caudato, el cual padece de un gradiente de pérdida celular progresivo que finalmente diezma toda la estructura. Aunque el gen que codifica huntingtina es expresado en forma ubicuota (Strong, T.V. y asociados, Nat. Genet. 1995, 5:259-263), se observa la pérdida de células selectiva y astrocitosis fibrilar en el cerebro, particularmente en el caudato y putamen del estrato y en la corteza cerebral de pacientes HD (Vonsattel, J-P. y asociados, Neuropathol. Exp. Neurol. 1985, 44:559-577), y, en un menor grado, en el hipocampo (Spargo, E. y asociados, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1993, 56:487-491) y el subtálamo (Byers, R.K. y asociados, Neurology 1973, 23:561-569).
Huntingtina es crucial para el desarrollo normal y puede considerarse como un gen de supervivencia celular (Nasir y asociados, Human Molecular Genetics, Vol 5, 1431-1435). La función normal de huntingtina permanece caracterizada en forma no completa, pero con base en las interacciones proteína-proteína, parece no estar asociada con el citoesqueleto y requerido para neurogenésis (Walling y asociados, J. Neurosci Res. 1998, 54:301-8). Huntingtina se disocia en forma específica durante la apoptosis a través de una proteína de cisteína clave, apopaína, conocida por desempeñar un papel centra en la técnica. El rango de disociación es aumentado por los tractos de poliglutamina más largos, lo que sugiere que la apoptosis no adecuada subyace HD.
La tecnología antisentido está surgiendo como un medio efectivo para reducir la expresión de productos de gen específico, y por consiguiente, puede probar ser útil únicamente en un número de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico e investigación para la modulación de expresión de huntingtina (Ver las Publicaciones de Patente Norteamericana Nos. 2008/0039418 y 2007/0299027) Los compuestos antisentido para modular la expresión de huntingtina se describen en las solicitudes de patente publicadas, antes mencionadas. Sin embargo, permanece la necesidad de compuestos adicionales.
Breve Descripción de la Invención En la presente invención se proporcionan métodos, compuestos y composiciones para modular la expresión de huntingtina y tratar, prevenir, retardar o disminuir la enfermedad de Huntington y/o un síntoma de la misma.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : La relación PK/PD de la expresión mARN de huntingtina en el tejido intrastriatal con la concentración ISIS 387898 en ratón de cerebro. Ratones C57/BL6 fueron administrados con un bolo simple de 50 ig de ISIS 387898 y se midieron la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. También se calculó el EC50 de ISIS 387898.
Figura 2: Comparación de la expresión mARN de huntingtina en tejido intrastriatal y concentración ISIS 387898 en diversos puntos de tiempo. Ratones C57/BL6 fueron administrados con un bolo simple de 50 jg de ISIS 387898 y se midieron la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración de oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó como más larga la duración de acción (tal como se mide mediante expresión htt mARN) de ISIS 387898 (línea punteada), incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea sólida) en el tejido.
Figura 3: La relación PK/PD de la expresión de mARN de huntingtina en el tejido de corteza anterior con la concentración de ISIS 387898 en cerebro de ratón. Ratones BACHD fueron administrados con una infusión intracerebroventricular de 75 pg de ISIS 387898 durante 2 semanas, y se midieron la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración de oligonucleótido antisentido en el tejido. También se calculó el EC50 de ISIS 387898.
Figura 4: Comparación de la expresión de mARN de huntingtina en el tejido de la corteza anterior y concentraciones ISIS 387898 en diversos puntos de tiempo. Ratones BACHD fueron administradas con una infusión intracerebroventricular de 75 pg de ISIS 387898 durante 2 semanas, y se midieron la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración de oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó como más larga la duración de acción (tal como se mide mediante expresión htt mARN) de ISIS 387898 (línea punteada), incluso después de la concentración de oligonucleótido (línea sólida) en el tejido.
Figura 5: Comparación de expresión de mARN de huntingtina en el tejido de la corteza posterior y concentraciones ISIS 388241 en diversos puntos de tiempo. Ratones BACHD fueron administrados con una infusión intracerebroventricular de 50 g de ISIS 388241 durante 2 semanas, y se midieron la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración del oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó como más larga la duración de acción (tal como se mide mediante la expresión htt mARN) de ISIS 388241 (línea punteada), incluso después de la concentración de oligonucleótido (línea sólida) en el tejido.
Figura 6: Comparación de expresión de mARN de huntingtina en tejido de la corteza posterior y concentraciones y ISIS 443139 en diversos puntos de tiempo. Ratones BACHD fueron administrados con una infusión intracerebroventricular de 50 g de ISIS 443139 durante 2 semanas, y se midió la expresión de mARN de huntingtina, así como la concentración de oligonucleótido antisentido en el tejido. Se observó más larga ¡la duración de acción (tal como se mide mediante expresión htt mARN) de ISIS 443139 (línea punteada), incluso después de la concentración del oligonucleótido (línea sólida) en el tejido.
Figura 7.
Efecto del tratamiento de oligonucleótido antisentido en el desempeño motor de ratones BACHD utilizando el ensayo Rotarod. Los ratones BACHD fueron tratados con 50 pg/día ICV de ISIS 388241 o PBS durante dos semanas. Los grupos de control de crías no transgénicas, fueron tratados en forma similar con ISIS 388241 o PBS. Posteriormente se llevó a capo el ensayo Rotarod de aceleración. Los animales se colocaron en el Rotarod a una velocidad de 2 RPM; el Rotarod aceleró a 40 RPM en 5 minutos. Se registró la duración de la caída. Se tomaron los valores de la línea de base a los 6 meses de edad, antes del tratamiento y los puntos de tiempo determinados son la edad de los ratones en la cual se llevó a cabo el ensayo. Las barras representan la duración de la caída en segundos, a través de ratones BACHD tratados con ISIS 388241 (negro);! a través de ratones BACHD tratados con PBS (rayados); y; a través de crías no transgénicas tratadas con PBS (blanco). Los ratones tratados con ISIS 388241 mostraron una duración incrementada de la caída, y por consiguiente, un desempeño motor mejorado en el grupo Rotarod, en comparación con ¡el control PBS.
Figura 8.
Efecto de oligonucleótido antisentido en el peso del cerebro de ratones R6/2. Se trataron ratones R6/2 de seis meses de edad con 50 pg/día ICV de ISIS 388817 u oligonucleótido de control ISIS 141923 o PBS durante 4 semanas. Los grupos de control de crías no transgénicas fueron tratados en forma similar con ISIS 388817 o PBS. Se incluyó en el estudio un grupo de control de ratones R6/2 pre-sintomáticos de ocho semanas de edad, y no se les proporcionó tratamiento. Las barras representan los pesos del cerebro de ratones R6/2 no tratados de ocho semanas de edad; ratones R6/2 tratados con ISIS 141923; ratones R6/2 tratados con PBS; ratones R.6/2 tratados con ISIS 388817; crías no transgénicas tratadas con PBS; y crías no transgénicas tratadas con ISIS 388817. Hubo un incremento en el peso del cerebro de los ratones R6/2 tratados con ISIS 388817 en comparación con el control PBS.
Figura 9 Caracterización de comportamiento de ratones YAC128 tratados con oligonucleótido antisentido, utilizando el ensayo de Campo Abierto. Se trataron ratones YAC128 de cinco meses de edad con 50 pg/día ICV de ISIS 388241 u oligonucleótido control ISIS 141923 o PBS durante 14 días. Se incluyeron en el estudio un grupo de control de crías FVB/NJ no transgénicas, y no se les proporcionó tratamiento. Los ratones se colocaron en una arena de campo abierto que utiliza divisiones de fotorayps para medir el movimiento horizontal y vertical durante una sesión de prueba de 30 minutos. Los datos fueron analizados utilizando el software Activity Monitor para revisar el movimiento ambulatorio total dentro de la arena, y el movimiento dentro del centro de la arena, como una medida de ansiedad. Las barras representan el tiempo en segundo transcurrido en el centro del campo por ratones FVB/NJ, YAC128 tratados con PBS, y ratones YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241, pasaron ! más tiempo en el centro, y por consiguiente se consideraron menos propensos a la ansiedad que el control PBS.
Figura 10 i Caracterización de comportamiento de ratones YAC128 tratados con oligonucleótido antisentido, utilizando el ensayo de Elevated Plus Maze. Se trataron ratones YAC128 de cinco meses de edad con 50 pg/día ICV de ISIS 388241 u oligonucleótido de control ISIS 141923 o con PBS durante 14 días. Se incluyó un grupo de control de crías FVB/NJ no transgénicas como un control no tratado. Los ratones se colocaron en un centro de un aparato, el cual consistió de d'ós brazos abiertos y dos brazos cerrados, midiendo cada uno 65 x I 6.25 cm y elevados 50 cm arriba del suelo. La localización fie los ratones en el aparato y la cantidad de tiempo transcurrido en los brazos abiertos, fue registrado durante una sesión de prueba de 5 minutos, como una medida de ansiedad. Las barras representan el porcentaje de tiempo transcurrido en los brazos abiertos por los ratones de control FVB/NJ, YAC128 tratados con PBS, y ratones YAC128 tratados con ISIS 388241. Los ratones YAC128 tratados con ISIS 388241, transcurrieron más tiempo en los brazos abiertos, y por consiguiente se consideraron menos propensos a la ansiedad que el control PBS.
Descripción Detallada de la Invención Quedará entendido que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada que se encuentra a continuación, son únicamente de ejemplo y de explicación, y no son restrictivos de la presente invención, según se reivindica.
Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que e manifieste específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en la presente invención, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "qüe incluye" así como otras formas, tales como "que incluye" "incluido" no son limitantes. Asimismo los términos tales como I, "elemento" o "componente" comprenden tanto elementos como i componentes que comprenden una unidad, y elementos j y i componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. j Los encabezados de las secciones aquí utilizados, son únicamente con propósitos de organización, y no serán construidos como una limitante de asunto o materia descrito. Todos los documentos, o porciones de documentos, mencionados en la presente solicitud, incluyendo pero sin limitarse a, patentes, solicitudes de patente, artículos, libros! y tratados, están incorporados expresamente como referencia para las partes del documento aquí descritas, así como en su totalidad.
Definiciones A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos; y i técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica aquí descritas, son las conocidas y comúnmente utilizadas en el arte. Se pueden utilizar técnicas estándar para síntesis química, y análisis químico. Cuando se ha permitido, todas las patentejs, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, Números de Acceso GENBANK e información de secuencia asociada obtenible a través de las bases de datos tales como la Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) y otros datos referidos a lo largo de la presente descripción, están incorporados como referencia para las partes del documento aquí descritas, así como en su totalidad.
A menos que se indique de otra manera, los siguientes términos, tienen los siguientes significados: ! "2'-0-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-0(CH2)2-OCH3) se refiere a la modificación O-metoxi-etilo de la posición 2' del anillo de furosilo. Una azúcar modificado por 2'-0-metoxietilo es un azúcar modificado. "2'-0-metoxietil nucleótido" significa un nucleótido que comprende una porción de azúcar modificada 2'-0-metoxietilo. "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo adherido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio farmacéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo., en ciertas modalidades, un oligonucleótido antisentido dirigido a huntingtina es un agente farmacéutico activo.
La "región objetivo activa" o "región objetivo" significa una región a la cual se dirigen uno o más compuestos antisentido activos. "Compuesto antisentido activo", significa compuestos antisentidos que reducen los niveles de ácido nucleico y niveles de proteína objetivo.
"Administrado en forma concomitante" se refiere a la administración conjunta de dos agentes en cualquier forma en la cual se manifiesten los efectos farmacológicos en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes sean administrados en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o a través de la misma ruta de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos necesitan únicamente traslaparse durante un período de tiempo y no necesitan ser co-extensivos.
El término "administración" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye pero no se limita a, administración a través de un profesional médico y autoadministración.
"Disminución" significa una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad trastorno ¡ o condición asociada. La severidad de indicadores puede determinarse a través de medidas objetivas u objetivos, las cuales son conocidas para los expertos en la técnica.
"Animal", se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo pero sin limitarse a ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo pero son limitarse a monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible, atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido para su ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico objetivo o proteína codificada por dicho ácido nucleico objetivo. ' "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que tiene la capacidad de pasar por hibridación para un ácido nucleico objetivo a través de enlace de hidrógeno. I "Inhibición de antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo en la presencia de un compuesto antisentido complementario para un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo, en la ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de hebra simple que tiene una secuencia de nucleobase que permite la hibridación para una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo. I "Azúcar bicíclica" significa un anillo de furosilo modificado por el puenteo de dos átomos de anillo no germinales. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Acido nucleico bicíclico" o "BNA", se refiere a n nucleósido o nucleótido, en donde la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido, incluye un puente que conecta dós átomos de carbono del anillo de furanosa, para formar de esta manera un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de tapa" o "porción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, las cuales han incorporadas en cualquier término de un compuesto antisentido. ! "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es en cierta forma químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos de 2'-0-metoxietilo, es químicamente distinta a una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-0-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
"Co-administración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una composición i farmacéutica simple, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos pueden administrarse a través de las mismas o diferentes rutas de administración. La co-administración comprende administración paralela o en secuencias.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, iel diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionada en una administración simple, o en un período de tiempo específico. En ciertas modalidades, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas modalidades en donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente a través de una sola inyección, por consiguiente, se pueden utilizar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas modalidades, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado, en forma continua. Las dosis pueden ser manifestadas como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana, o mes.
"Cantidad efectiva" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita de un agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos, dependiendo de la salud y condición física del individuo que será tratado, el grupo taxonómico de individuos que serán tratados, la formulación de la composición, evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Acido nucleico de Huntingtina" significa cualquier ácido nucleico que codifique huntingtina. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un ácido nucleico de huntingtina incluye una secuencia de ADN que codifica huntingtina, una secuencia de ARN transcrita del ADN que codifica huntingtina (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), y la secuencia de mARN que codifica huntingtina. "mARN de huntingtina" significa un mARN que codifica una proteína huntingtina.
"Totalmente Complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobase de una secuencia de nucleobase de un primer ácido nucleico que tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobase de un segundo ácido nucleico. En ciertas modalidades, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el cual, se coloca una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soportan la disociación RNase H, entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos al nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede ser referida como un "segmento de gap" y las regiones externas pueden ser referidas como "segmentos de ala".
"Ensanchado-gap" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de gap de 12 o más 2'-desoxiribonucleósidos contiguos, colocados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Hibridación" significa el endurecimiento de las moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.
"Inmediatamente adyacente" significa que no existen elementos de intervención entre elementos inmediatamente adyacentes.
"Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento en terapia.
"Ligadura de internucleósido" se refiere al enlace químipo entre nucleósidos.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes los cuales se unen juntos. ; "Desacoplamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en donde una nucleobase de un primer ácido nucleico no tiene la capacidad de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico objetivo.
"Ligadura de internucleósido modificada" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace de internucleósido que ocurre naturalmente (por ejemplo, enlace de internucleósido de fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase además de adenina, citosina, guanina, timidina, o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina de adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina de timina (T), citosina (C), y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una porción de azúcar modificada, ligadura de internucleósido modificada o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una porción de azúcar modificada o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado.
"Porción de azúcar" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Ligadura de internucleósido que ocurre naturalmente" significa una ligadura de fosfodiéster de 3' a 5'.
"Porción de azúcar natural" significa una azúcar encontrado en ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). "Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuesta de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxiribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de hebra simple, ácidos nucleicos de hebra doble, ácidos ribonucleicos de interferencia pequeños (siARN), y microARNs (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una molécula simple. ¡ "Nucleobase" significa una porción heterocíclica con la capacidad de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, ligadura o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada a un azúcar.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo de fosfato enlazado en forma covalente a una porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas, que tiene |a capacidad de hibridar para al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidós enlazados, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independiente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracranial, por ejemplo administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede se continua, o crónica o corta o intermitente.
"Péptido" significa una molécula formada enlazando al menos dos aminoácidos mediante enlaces de amida. El péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestós antisentido, por ejemplo, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleotido de origen y no imparten efectos toxicológicos indeseados al mismo.
"Ligadura de fosforotioato" significa una ligadura entre nucleósidos en donde el enlace de fosfodiéster es modificado, reemplazando uno de los átomos de oxígeno de no puenteo con un átomo de azufre. Una ligadura de fosforotioato es una ligadura de internucleósido modificada. j "Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (por ejemplo, enlazada) de un ácido nucleico. En ciertas modalidades, una porción se define como un número definido de nucleobases contiguo de un ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, una porción se define como un núme'ro de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere al retraso o anticipación del desencadenamiento o desarrollo de una enfermedad, trastorno: o condición durante un periodo de tiempo de minutos hasta en forma indefinida. Prevenir, también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o condición.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que es preparado en una forma inactiva que se convierte a una forr a activa dentro del cuerpo o células del mismo, mediante ,|a acción de enzimas endógenas u otros químicos o condiciones.1 "Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento diferentes a los efectos deseados-En ciertas modalidades, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección anormalidades en pruebas j de función de hígado a normalidades de función renal, toxicidad de hígado, toxicidad renal, anormalidades del sistema nervioso central, miopatías y malestares generales. Por ejemplo, los niveles de aminotransferasa incrementados en suero, pueden indicar toxicidad del hígado o anormalidad de la función del hígado. Por ejemplo, la bilirrubina incrementada puede indicar toxicidad del hígado o anormalidad de la función del hígado.
"Oligonucleótido de hebra simple" significa un oligonucleótido que no híbrida para una hebra complementaria;.
"Específicamente hibridizable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto secundario, exhibiendo al mismo tiempo mínimos efectos, o no efectos en los ácidos nucleicos no objetivo, bajo condiciones en las cuales se desea el enlace específico, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Dirección" o "dirigido" significa el proceso para diseño y selección de un compuesto antisentido, que hibridará en forma I específica para un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado. i "Acido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcripción de ARN objetivo", todos se refieren a un ácido nucleico con la capacidad de ser dirigido mediante compuestos antisentido.
El término "segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótido de un ácido nucleico objetivo, al cual se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5"' se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3"' se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejoría de una i enfermedad, trastorno o condición.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótildo compuesto de nucleobases que ocurren naturalmente, porciones de azúcar y ligaduras de internucleósido. En ciertas modalidades, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (por ejemplo, ß-D-ribonucleósidos) o nucleótido de ADN (por ejemplo, ß-D-desoxiribonucleósido).
Ciertas Modalidades Ciertas modalidades proporcionan métodos, compuestos, y composiciones para inhibir la expresión de huntingtina.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos antisentido dirigidos para un ácido nucleico de huntingtina. En ciertas modalidades, el ácido nucleico de huntingtina es cualesquiera de las secuencias establecidas en el Acceso GENBANK No.
NM_002111.6 (incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 1), Acceso GENBANK No. NT006081.17 truncado de l!ós nucleótidos 462000 a 634000 (incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 2), Acceso GENBANK No. NM_010414.1 (incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 3), el complemento del Acceso GENBANK No. NM_0011097 6.1 truncado en los nucleótidos 698000 a 866000 (incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 4) y Acceso GENBANK No. NM_024357.2 (incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 5).
Ciertas modalidades proporcionan compuestos comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 30 nucleósidos ligados, en donde los nucleósidos ligadas comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, o al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En ciertas modalidades, las secuencias de nucleobase son las mencionadas en las SEC ID NOs: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, o al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 15 a 25 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11 , 12, 13, 18, 22, 32. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22, 32. En ciertas modalidades, las secuencias de nucleobase son las mencionadas en las SEC ID NOs: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21 , 22, 32, 13. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 21 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11 , 12, 13, 18, 22, y 32. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleobases I contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32. En ciertas modalidades, las secuencias de nucleobase son las mencionadas en las SEC ID NOs: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32, 13. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33. ¡¡ Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-497,7, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 11506!$- 115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 481j3-4832, 4862-4881, 5809-5828, 4928-4947 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades la región se selecciona de 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, y 5809-5828 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades la región se selecciona de 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado tiene al menos una porción de 9, una de al menos 10, una de al menos 11, o una de al menos 12 nucleobases contiguas, que es complementaria dentro de una región aquí descrita.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 15 a 25 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, y 5809-5829 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, :'el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, una de al menos 10, una de al menos 11, una de al menos 12, una de al menos 13, o una de al menos 15 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de una región aquí descrita.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 15 a 25 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas, que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, una de al menos 10, una de al menos 11, una de al menos 12, una de al menos 13, o una de al menos 15 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de una región aquí descrita.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado de 18 a 21 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881 , 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, ; y 5809-5829 de las SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, una de al menos 10, una de al menos 11, una de al menos 12, una de al menos 13, una de al menos 14, una de al menos 15, una de al menos 16, una de al menos 17, o una de al menos 18 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de una región aquí descrita.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 18 a 21 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas que es complementaria dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado tiene una porción de al menos 9, una de al menos 10, una de al menos 11, una de al menos 12, una de al menos 13, una de al menos 14, una de al menos 15, una de al menos 16, una de al menos 17, o una de al menos 18 nucleobases contiguas que es. complementaria dentro de una región aquí descrita.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste en un oligonucleótido modificado de hebra simple.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
En ciertas modalidades, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos el 90% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobase de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos el 95% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobase de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado es al menos el 99% complementaria en toda su longitud de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado el 100% complementaria en toda su longitud a una secuencia de nucleobase de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5.
En ciertas modalidades, el compuesto tiene al menos uría ligadura de ¡nternucleósido modificada. En ciertas modalidades, la ligadura de ¡nternucleósido es una ligadura de ¡nternucleósido de fosforotioato.
En ciertas modalidades, el compuesto tiene al menos un nucleósido que comprende un azúcar modificado. En ciertas modalidades, el al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas modalidades, el al menos una azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-0-2'. En ciertas modalidades, el al menos un azúcar modificado comprende un 2'-0-metoxietilo.
En ciertas modalidades, el compuesto comprende al menos un nucleósido modificado por un tetrahidropirano, en donde ,e\ anillo de tetrahidropirano reemplaza el anillo de furanosa. En ciertas modalidades el al menos un nucleósido modificado píor un tetrahidropirano tiene la estructura: donde Bx es una porción base heterocíclica opcionalmente protegida.
En ciertas modalidades, el compuesto tiene al menos Un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. ciertas modalidades, la nucleobase modificada es una 5-metil citosina.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de gap que consiste en desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de gap que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap está colocado inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende una azúcar 2'-0-metoxietilo; y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura de fosforotioato.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de gap que consiste en ocho desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste en seis nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste en seis nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap está colocado inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende una azúcar 2'-0-metoxietilo; y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura i de fosforotioato.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de gap que consiste en ocho desoxinucleósidos enlazados; (ii) un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (iii) un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap está colocado inmediatamente adyacente a, y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende una azúcar 2'-0-metoxietilo) y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura de fosforotioato.
Ciertas modalidades proporcionan una composición que comprende un compuesto tal como aquí se describe, o una sal del mismo, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32 o una sal del mismo y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas modalidades proporcionan una composición que comprende un compuesto tal como aquí se describe, o una sal del mismo, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: 1 I2, 22, 28, 30, 32, y 33 o una sal de las mismas, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas modalidades proporcionan métodos para tratar, prevenir, o aliviar la enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan métodos que comprende administrar a un animal, un compuesto tal como se describe. En ciertas modalidades, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contig de una secuencia de nucleobase seleccionada de entre las secuencias de nucleobase mencionadas en las SEC ID NOs: i6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 y 32.
Ciertas modalidades proporcionan métodos que comprende administrar a un animal, un compuesto tal como aquí se describe. En ciertas modalidades, el método comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase I seleccionada de entre las secuencias de nucleobase I mencionadas en las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33. ! En ciertas modalidades, el animal es un humano. i En ciertas modalidades, la administración previene, trata, alivia o disminuye el progreso de la enfermedad de Huntington, tal como aquí se describe.
En ciertas modalidades, el compuesto se administra en conjunto con un segundo agente.
En ciertas modalidades, el compuesto y el segundo agente se administran en forma concomitante.
En ciertas modalidades, la administración es parenteral.
En ciertas modalidades, la administración parenteral es administración intracraneal. En ciertas modalidades, la administración intracraneal es administración intratecal o intracerebro entricular.
Ciertas modalidades proporcionan en forma adicional un método para reducir la expresión de proteína o mARN de huntingtina en un animal, en donde el método comprende administrar al animal un compuesto o composición tal como aquí se describe, para reducir la expresión de proteína o mARN de huntingtina en el animal. En ciertas modalidades, el animal es un humano. En ciertas modalidades, la reducción de la expresión de proteína o mARN de huntingtina, previene, alivia, o disminuye el progreso de la enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan un método para tratar a un humano que tiene enfermedad de Huntington, en donde el método comprende identificar al humano con la enfermedad, y administrar al humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o composición tal como aquí se describe. En ciertas modalidades, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en nerviosismo, carencia de coordinación, movimientos iniciados en forma no intencional, movimientos no complicados en forma intencional, modo de caminar no constante, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anormal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, mareos, perturbaciones del sueño, planeación dañada, flexibilidad dañada, pensamiento abstracto dañado, adquisición de reglas dañada, inicio dañado de acciones adecuadas, inhibición dañada de acciones no adecuadas, memoria a corto plazo dañada, memoria a largo plazo dañada, paranoia, desorientación, confusión, alucinación, demencia, ansiedad, depresión, afecto entorpecido, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad, ideas suicidas, masa cerebral reducida, atrofia muscular, falla cardiaca, tolerancia dañada a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular.
Se proporciona además un método para reducir o prevenir la enfermedad de Huntington, en donde el método que comprende administrar a un humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o composición tal como aquí se describe, para reducir o prevenir de esta forma la enfermedad de Huntington.
Se proporciona además un método para disminuir 'un síntoma de la enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un compuesto que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado hibrida en forma específica a la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5, disminuyendo de esta manera un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
Se proporciona además un método para reducir un rango de progreso de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado hibrida en forma específica a la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5, para reducir de esta forma el rango de progreso de un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
Se proporciona además un método para revertir la generación indicada por un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, administrar a un humano que necesita del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado hibrida específicamente a SEC ID NO: 1, 2, 3, 4 ó 5, revertiendo de esta forma la degeneración indicada por un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma físico, cognitivo, psiquiátrico, o periférico. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste en nerviosismo, carencia de coordinación, movimientos iniciados en forma no intencional, movimientos no complicados en forma intencional, modo de caminar no constante, corea, rigidez, movimientos de contoneo, postura anormal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, mareos, y perturbaciones de sueño. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en planeación dañada, flexibilidad dañada, pensamiento abstracto dañado, adquisición de reglas dañada, inicio dañado de acciones adecuadas, inhibición dañada de acciones no adecuadas, memoria a corto plazo dañada, memoria a largo plazo dañada, paranoia, desorientación, confusión, alucinación, y demencia. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, afecto entorpecido, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideas suicidas. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste en masa cerebral reducida, atrofia muscular, falla cardiaca, tolerancia dañada a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testicular.
También se proporcionan métodos y compuestos para 'la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o disminución de la enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan el uso de un compuesto tal como aquí se describe, en la fabricación de un medicamento para tratar, aliviar, o prevenir la enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan un compuesto tal como aquí se describe, para utilizarse en el tratamiento, prevención o alivio de la enfermedad de Huntington tal como aquí se describe en la presente invención, mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional tal como aquí se describe. Los agentes o terapias pueden administrarse en conjunto o administrarse en forma concomitante.
Ciertas modalidades proporcionan el uso de un compuesto tal como aquí se describe, en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir, disminuir la enfermedad de Huntington, tal como aquí se describe, mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional tal como aquí se describe. Los agentes o terapias pueden administrarse en conjunto o administrarse en forma concomitante.
Ciertas modalidades proporcionan el uso de un compuesto tal como aquí se describe en la fabricación de un medicamento, para tratar, prevenir o aliviar enfermedad de Huntington, tal como aquí se describe en un paciente a quien se le administra en forma subsecuente un agente o terapia adicional tal como aquí se describe.
Ciertas modalidades proporcionan un equipo para tratar, prevenir, o aliviar enfermedad de Huntington tal como aquí se describe, en donde el equipo comprende: (i) un compuesto tal como aquí se describe; y como alternativa, (ii) un agente adicional o terapia tal como aquí se describe.
Un equipo tal como aquí se describe puede incluir en forma adicional instrucciones adicionales de equipo para tratar, prevenir o aliviar enfermedad de Huntington tal como aquí se describe, mediante terapia de combinación tal como aquí se describe.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o hasta al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SÉC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, ó 36, para utilizarse en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición es un trastorno neurológico. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición es Enfermedad de Huntington. En ciertas modalidades, jel animal es un humano. 1 Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12¡ a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en las SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, ó 36, para utilizarse jen un animal que tiene una enfermedad o condición asociada cj n huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto pa a prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de la enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en l;as SEC ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, ó 33, para utilizarse en jún animal que tiene una enfermedad o condición asociada don huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición es un trastorno neurológico. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición es Enfermedad de Huntington. En ciertas modalidades, el animal es un humano.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, ó 33, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto para prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de enfermedad de Huntington.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados tienen al menos una porción de 8, al menos una de 9, al menos una de 10, al menos una de 11, al menos una de 12, al menos una de 13, al menos una de 14, al menos una de 15, al menos una de 16, al menos una de 17, al menos una de 18, al menos una de 19, o al menos una de 20 nucleobases contiguas complementaria con la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608- 4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-494;7, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 486¿-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de la SEC ID NO: 1, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina.
Ciertas modalidades proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden una porción de al menos 8, al menos una de 9, al menos una de 10, al menos una de 11, al menos una de 12, al menos una de 13, al menos una de 14, al menos una de 15, al menos una de 16, al menos una de 17, al menos una de 18, al menos una de 19, o al menos una de 20 nucleobases contiguas complementaria con la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608- 4627, 4609-462Í8, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-483;3, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-494|7, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de la SEC ID NO: 1, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del, compuesto para prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de enfermedad de Huntington.
Compuestos Antisentido Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótido, miméticos de oligonucleótido, compuestos antisentido, oligonucleótido antisentido, y siARNs. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que tiene la capacidad de pasar por hibridación para un ácido nucleico objetivo a través de un enlace de hidrógeno.
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando está escrita en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al cual se dirige. En ciertas de dichas modalidades, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que cuando está escrita en una dirección 5' a 3', que comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al cual se dirige.
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico huntingtina tiene de 12 a 30 nucleótidos de longitud. En otras palabras, los compuestos antisentido son de 12 a 30 nucleobases enlazadas. En otras modalidades, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, ó 20 nucleobases enlazadas. En ciertas de dichas modalidades, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleobases enlazadas de longitud, o un rango definido por cualesquiera de los dos valores anteriores.
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado acortado o truncado. El oligonucleótido modificado acortado o truncado puede tener un nucleósido simple eliminado del extremo 5' (truncado 5'), o como alternativa del extremo 3' (truncado 3'). Un oligonucleótido acortado o truncado puede tener dos 5' eliminados', o como alternativa, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3'. Como alternativa, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse a través del oligonucleótido modificado, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando está presente un nucleósido adicional simple en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede localizarse en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos adicionales pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos agregados al extremo 5' (adición 5'), o como alternativa al extremo 3' (adición 3'), del oligonucleótido. Como alternativa, el nucleósido agregado puede dispersarse a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene un nucleósido agregado al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo.
Es posible incrementar o disminuir la longitud del compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de desacoplamiento sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en la Publicación de Woolf y asociados, (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13 a 25 nucleobases en longitud, con respecto a su capacidad de inducir la disociación de un ARN objetivo de un modelo de inyección de ooscito. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 ó 11 bases desacopladas cerca de los extremos de los oligonucleotidos antisentido, tuvieron la capacidad de dirigir la disociación específica del mARN objetivo, aunque en un menor grado que los oligonucleotidos antisentido que no contenían desacoplamientos. En forma similar, se logró la disociación específica objetivo utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobase, incluyendo los que tienen 1 ó 3 desacoplamientos.
Gautschi y asociados (J. Nati. Cáncer Inst. 93:463-471, Marzo 2001) demostró la capacidad que tiene el oligonucleótido del 100% de complementariedad con el bc1-2 mARN, y que tiene 3 desacoplamientos para el mARN bd-xL para reducir la expresión tanto de bd-2 como de bc1-xL ¡n vitro e ¡n vivo. Además, este oligonucleótido demostró in vivo potente actividad anti-tumor.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) probó una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases comprendidas de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido tándem, respectivamente, con respecto a su capacidad de detener la traducción de una DHFR humana en un ensayo de reticulocito de conejo. Cada uno de los oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases sólo, tuvo la capacidad de inhibir la traducción, aunque en un nivel más moderado que los oligonucleótidos antisentido de 28 ó 42 nucleobases.
Motivos de Compuesto Antisentido En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina, tienen subunidadés químicamente modificadas arregladas en patrones o motivos, para conferir las propiedades de los compuestos antisentido, tal como actividad de inhibición mejorada, afinidad de enlace incrementada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación mediante nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos, normalmente contiene al menos una región modificada de modo que se confiere resistencia incrementada a la degradación de nucleasa, captación celular incrementada, afinidad de enlace incrementada para el del ácido nucleico objetivo, y/o actividad de inhibición incrementada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico, puede servir opcionalmente como un substrato para la endonucleasas celular RNasa H, la cual disocia la hebra de ARN de un dúplex ARN.ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo de gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la disociación de RNaseH, se coloca dentro de las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleosidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo de gapmer, el segmento de gap generalmente sirve como el substrato para la disociación de endonucleasa, aunque los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas modalidades, las regiones de un gapmer son diferenciadas por los tipos de porciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de porciones de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gapmer en algunas modalidades pueden incluir ß-D-ribonucleósidos, ß-D-desoxiribonucleósidos, nucleósidos modificados-2' (tal como nucleósidos modificados-2' que pueden incluir 2'-MOE, y 2'-0-CH3, entre otros), y nucleósidos í modificados por azúcar bicíclicos (dichos nucleósidos modificados con azúcar bicíclicos pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2)n-0-2', en donde n= 1 o n = 2). Preferentemente, cada región distinta comprende porciones de azúcar uniformes. El motivo ala-gap-ala es descrito frecuentemente como "X-Y-Z", en donde "X" representa la longitud de la región de ala 5', "Y" representa la longitud de la región gap, y "Z" representa la longitud de la región de ala 3'. Tal como se utiliza en la presente invención, un gaprner descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de gap está colocado en forma inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos de ala 5' y el segmento de ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos de intervención entre el segmento de ala 5' y el segmento gap, o el segmento gap y el segmento de ala 3'. Cualesquiera de los compuestos antisentido aquí descritos, pueden tener un motivo de gapmer. En algunas modalidades, X y Z son las mismas, en otras modalidades son diferentes. En una modalidad preferida, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden tener cualesquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmers incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-60 5-8-5.
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido con un motivo de "alamer" que tiene una configuración ala-gap o gap-ala, es decir una configuración, X-Y o Y-Z tal como se describe para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de alamer incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, o 5-13.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo de gapmer 5-10-5.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo de gapmer 6-8-6.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina poseen un motivo de gapmer 5-8-5. ¡ En ciertas modalidades, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un motivo ensanchado mediante gap.
En ciertas modalidades, un oligonucleótido antisentido ensanchado mediante gap dirigido a un ácido nucleico de huntingtina, tiene un segmento de gap de diez 2 -desoxiribonucleótidos colocados en forma inmediatamente adyacente a, y entre los segmentos de ala de cinco nucleósidós químicamente modificados. En ciertas modalidades, la modificación química comprende una modificación de azúcar-2'. En otra modalidad, la modificación química comprende una I modificación de azúcar 2'-MOE.
En ciertas modalidades, un oligonucleótido antisenticjo ensanchado mediante gap dirigido a un ácido nucleico de huntingtina tiene un segmento de gap de ocho 2'-desoxiribonucleótidos colocados en forma inmediatamente adyacente a y entre los segmentos de ala de cinco nucleósidós químicamente modificados. En ciertas modalidades, ¡la modificación química comprende una modificación de azúcar-2'. En otra modalidad, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE. i En ciertas modalidades, un oligonucleótido antisentido ensanchado por gap dirigido a un ácido nucleico de huntingtina, tiene un segmento de gap de ocho 2'-desoxiribonucleótidós colocados en forma inmediatamente adyacente a, y entre los segmentos de ala de seis nucleósidos químicamente modificados. En ciertas modalidades, la modificación química comprende una modificación de azúcar-2'. En otra modalidad, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE. Ácidos Nucleico Objetivo, Regiones Objetivo y Secuencias de Nucleótido Las secuencias de nucleótido que codifican huntingtina, incluyen sin limitación, las siguientes: Acceso GENBANK No. NM_00211 1.6, depositado primero con GENBANK® el 31 de Mayo del 2006, incorporada en la presente invención como SEC ID NO: 1; Acceso GENBANK No. NT_006081.17 truncada de los nucleótidos 462000 a 634000, depositada primero cón GENBANK® el 19 de Agosto del 2004, e incorporada como la SEC ID NO: 2 a la presente invención; Acceso GENBANK No. NM_010414.1 , depositada primero con GENBANK® el 23 de Marzo del 2004, incorporada a la presente invención como SEC ID NO: 3; el complemento de Acceso GENBANK No. NW_001 109716.1 truncada en los nucleótidos 698000 a 866000, depositada primero con GENBANK® el 14 de Junio del 2006, incorporada a la presente invención como SEC ID NO: 4, y Acceso GENBANK No. NM_024357.2, depositada primero con GENBANK® el 5 de Junio del 2008, incorporada a la presente invención como SEC ID NO: 5.
Quedará entendido que la secuencia establecida en cada SEC ID NO en los Ejemplos aquí contenidos, es independiente de cualquier modificación a una porción de azúcar, una ligadura de internucleósido, o una nucleobase. Por lo tanto, los compuestos antisentido definidos por una SEC ID NO, pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una porción de azúcar, una ligadura, o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por los Números Isis (Isis No) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
En ciertas modalidades, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede comprender una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una unión de exón/intrón, una región de codificación, una región de inicio de traducción, una región de terminación de traducción, u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones definidas estructuralmente para huntingtina, pueden ser obtenidas mediante el número de acceso de las bases de datos de secuencia tal como NCBI y dicha información está incorporada a la presente invención como referencia. En ciertas modalidades, una región objetivo puede comprender la secuencia de un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo para un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la región objetivo.
La dirección incluye la determinación de al menos un segmento objetivo al cual híbrida un compuesto antisentido, de modo que ocurre un efecto deseado. En ciertas modalidades, iel efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo de mARN. En ciertas modalidades, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificados por el ácido nucleico objetivo o un cambio de fenotipo asociado con el ácido nucleico objetivo.
Una región objetivo puede comprender uno o más segmentos objetivo. Los múltiples segmentos objetivo dentro de una región pueden estar traslapados. Como alternativa pueden no estar traslapados. En ciertas modalidades, los segmentos objetivos dentro de una región objetivo están separados por rio más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas modalidades, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo, están separados por un número de nucleótidos que son, aproximadamente, no más de, no más de aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, o o nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un rango definido por cualesquiera de los dos valores precedentes. En ciertas modalidades, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo.
En ciertas modalidades, los segmentos objetivos están contiguos, se contemplan regiones definidas por un rango que tiene un ácido nucleico de partida que es cualesquiera de Ibs sitios objetivo 5' o sitios objetivo 3' aquí descritos.
Los segmentos objetivo adecuados se pueden dentro de una 5' UTR, una región de codificación, una 3' UTR, un intrón, un exón, o una unión de exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de detención también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir en forma específica una cierta región estructuralmente definida, tal como el codón de inicio o el codón de detención. La determinación de lós segmentos objetivo adecuado puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo a otras secuencias a i través del genoma. Por ejemplo, se puede utilizar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre los ácid s nucleicos diferentes. Esta comparación puede prevenir :la selección de secuencias de compuesto antisentido que pueden hibridar en una forma no específica para secuencias diferentes a un ácido nucleico objetivo seleccionado, (es decir, secuencias no objetivo o fuera de objetivo).
Puede haber una variación en la actividad (por ejemplo, tal como se define mediante reducción de porcentaje de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas modalidades, las reducciones en los niveles de mARN jde huntingtina son indicativos de la inhibición de la expresión de huntingtina. La reducción en los niveles de proteína c_e huntingtina también son indicativos de la expresión de mARN objetivo. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de huntingtina.
Por ejemplo, el incremento en el tamaño del cerebro a lo normal, la mejoría en coordinación motora, disminución en espasmos musculares continuos (distonia) disminución en irritabilidad y/o ansiedad, mejoría de la memoria o un incremento en energía, entre otros cambios fenotípicos pueden ser ensayados. También se pueden ensayar, tal como se describe más adelante, otras indicaciones fenotípicas, por ejemplo, los síntomas asociados con la enfermedad de Huntington.
Hibridación En algunas modalidades, la hibridación ocurre entre un compuesto antisentido aquí descrito y un ácido nucleico de huntingtina. El mecanismo de hibridación más común, implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido) entre nucleobases de complementariedad de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede ocurrir bajo diversas condiciones. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia y son determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que serán hibridadas.
Los métodos para determinar si una secuencia es hibridizable en forma específica para un ácido nucleico objetivo, son bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido aquí proporcionados son específicamente hibridizables con un ácido nucleico de huntingtina.
Complementariedad Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí, cuando una cantidad suficiente de hidrógeno del compuesto antisentido pueden enlazar hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de modo que ocurrirá un efecto deseado (por ejemplo, la inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, tal como ácido nucleico de huntingtina).
Un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o mas segmentos de un ácido nucleico de huntingtina de modo que los segmentos de intervención o adyacentes no están implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, estructura del lazo, estructura del desacoplamiento u horquilla).
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido aquí proporcionados, o una parte específica de los mismos, son, o son al menos el 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% complementarios con un ácido nucleico de huntingtina, una región objetivo, un segmento objetivo, o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo, puede ser determinado utilizando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el cual 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios con una región objetivo, y por lo tanto pueden hibridar en forma especifica, puede representar el 90% de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases de no complementariedad restantes pueden ser agrupadas o dispersas internamente con las nucleobases complementarias, y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Por lo tanto, un compuesto antisentido el cual tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo puede tener el 77.8% de complementariedad general con el ácido nucleico objetivo, y por lo tanto puede estar dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo, puede ser determinado en forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y asociados, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o de complementariedad, se pueden determinar, por ejemplo, a través del programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 por Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando configuraciones por default, que utilizan el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. ath., 1981, 2, 482 489).
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido aquí proporcionados, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (por ejemplo, el 100% de complementariedad) con un ácido nucleico objetivo, o parte específica del mismo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de huntingtina, o una región objetivo, o un segmento objetivo o una secuencia objetivo del mismo. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "completamente complementario", significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido tiene la capacidad de emparejamiento base preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobase es completamente complementario a una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de largo, siempre que exista una porción de 20 nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo que es completamente complementario al compuesto antisentido. El término completamente complementario, también se puede utilizar con referencia a una parte específica del primero y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobase puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de largo. La porción de 20 nucleobase del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria con la secuencia objetivo, si la secuencia objetivo tiene una porción de 20 nucleobase correspondiente, en donde cada nucleobase es complementario con la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede o no ser completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las restantes 10 nucleobases del compuesto antisentido, también son complementarios para la secuencia objetivo.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Como alternativa, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementario, pueden ser contiguas (por ejemplo, enlazadas) o no contiguas. En una modalidad, una nucleobase no complementaria se localiza en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido de gapmer. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 nucleobases de longitud, comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementario relativa al ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o una parte específica del mismo.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 11, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria relativa al ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico de huntingtina, o un parte específica del mismo.
Los compuestos antisentido aquí proporcionados también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (por ejemplo, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también se puede referir a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido, son complementarios para al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido son complementarios para una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido son complementarios para al menos una de 15 nucleobase porción de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios para al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleobase porción de un segmento objetivo, o un rango definido por cualesquiera de dos de estos valores. Identidad Los compuestos antisentido aquí proporcionados también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótido particular, SEC ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Tal como se utiliza en la presente invención, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en la presente invención, si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en el lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita, puede considerarse idéntico a la secuencia de ADN, ya que tanto uracilo como tímida emparejan con adenina. Las versiones acortadas o alargadas de los compuestos antisentido, aquí descritos, así como los compuestos que tienen bases no idénticas relativas a los compuestos antisentido aquí proporcionados, también están contempladas. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas a |o largo del compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen emparejamiento de bases idéntico, relativo a la secuencia con la cual se compara.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a uno o más de los compuestos antisentido o SEC ID NOs, o una porción de los mismos, tal como aquí se describe.
Modificaciones Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido, normalmente es una porción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucíeósidos que incluyen además un grupo de fosfato enlazado en forma covalente a una porción de azúcar del nucleósido. Para los nucíeósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, que el grupo de fosfato puede enlazarse a la porción de hidroxilo de 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de los nucíeósidos adyacentes uno a otro, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótido, los grupos de fosfato son comúnmente referidos formando las ligaduras de internucleósido de oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido comprenden sustituciones o cambios a ligaduras de internucleósido, porciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados con frecuencia son preferidos con respecto a las formas nativas, debido a las i, propiedades deseables tales, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para ácido nucleico objetivo, estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas, ; o actividad de inhibición incrementada.
Los nucleósidos químicamente modificados, también pueden ser empleados para incrementa la afinidad de enlace de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico. En consecuencia, los resultados comparables con frecuencia pueden ser obtenidos con compuestas j antisentido más cortos, que tienen dichos nucleósid^os químicamente modificados.
Ligadura de Internucleósido Modificada La ligadura de internucleósido que ocurre naturalmente be ARN y ADN es una ligadura de fosfodiéster 3' a 5'. LÓs compuestos antisentido que tienen una o más ligaduras de internucleósidos modificadas, es decir que no ocurren naturalmente, con frecuencia son seleccionados con respecto a los compuestos antisentido que tienen ligaduras de internucleósido que ocurren naturalmente, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada, para ácidos nucleicos objetivo, y estabilidad incrementada en la presencia de nucleases.
Los oligonucleótidos que tiene ligaduras de internucleósido modificadas incluyen ligadura ele internucleósido que retienen un átomo de fósforo, así como ligaduras de internucleósido que no tiene un átomo de fósforo. Las ligaduras de internucleósido que contienen fósforo representativas, incluyen, pero no se limitan a fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos, y fosf orotioatos. Los métodos de preparación de ligaduras que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido i dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden una o más ligaduras de internucleósido modificadas. En ciertas modalidades, las ligaduras de internucleósido modificadas son ligaduras de fosforotioato. En ciertas modalidades, cada ligadura de internucleósido de un compuesto antisentido es una ligadura de internucleósido de fosforotioato.
Porciones de Azúcar Modificadas Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos, en donde el grupo de azúcar ha sido modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nuclease mejorada, afinidad de enlace incrementada o alguna otra propiedad biológica benéfica a los compuestos antisentido. En ciertas modalidades, los nucleósidos comprenden porciones de anillo de ribofuranosa quicamente modificadas. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2'), el puenteo de átomo de anillos no germinales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno de anillo de ribosilo S, N(R), o C(R1)(R)2 (con un alquilo R = H, C1-C12 o un grupo de protección) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen un nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (Ver Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 Publicada el 8/21/08 para otros nucleósidós sustituidos con 5',2'-bis descritos) o el reemplazo del átomo de oxígeno de anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente Norteamericana Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio del 2005) o como alternativa la sustitución-5' de BNA (ver la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 Publicada el 11/22/07, en donde LNA se sustituye por ejemplo con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidós que tiene porciones de azúcar modificadas incluyen sin limitación nucleósidós que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 y 2'-0(CH2)20CH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar de alilo, amino, azidó, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, 0(CH2)2SCH3, 0(CH2)2-0-N(Rm)(Rn), y 0-CH2-C( = 0)-N(Rm)(Rn), en donde cada Rm y Rn, es independientemente H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNAs) incluyen sin limitación nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos de anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido aquí proporcionados incluyen uno o más nucleósidos BNA en donde el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-0-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)-0-2' (LNA); 4 '-(C H2 )2-0-2 ' (ENA); 4'-C(CH3)2-0-2' (ver PCT/US2008/068922); 4'-CH(CH3)-0-2' y 4'-C-H(CH20CH3)-0-2' (ver Patente Norteamericana 7,399,845, presentada el 15 de julio del 2008); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (ver PCT/US2008/064591); 4'-CH2-0-N(CH3)-2' (ver Solicitud de Patente Norteamericana US2004-0171570, publicada el 2 de Septiembre del 2004); 4'-CH2-N(R)-0-2' (ver Patente Norteamericana 7,427,672, presentada el 23 de Septiembre del 2008); 4·-??2-0(??3)-2' y 4'-CH2-C-( = CH2)-2' (ver PCT/US2008/ 066154); y en donde R es independientemente, H , C1-C12 alquilo, o un grupo de protección. Cada uno de los BNAs anteriores, incluyen configuraciones de azúcar estereoquímicas incluyendo por ejemplo a-L-ribofuranosa y ß-D-ribofuranosa (ver Solicitud Internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de Marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas modalidades, los nucleósidos son modificados mediante el reemplazo del anillo de ribosilo con un sustituto de azúcar. Dichas modificaciones incluyen sin limitación, el reemplazo del anillo de ribosilo con un sistema de anillo sustituto (algunas veces referidos como análogos de ADN) tal como un anillo morfolino, un anillo ciclohexenilo, un anillo ciclohexilo o un anillo tetrahidropiranilo tal como uno que tiene la fórmula: Muchos otros sistemas de anillo de sustituto de azúcar bicíclico y tricíclico, también son conocidos en la técnica ya que se pueden utilizar para modificar nucleósidos para incorporación de los compuestos antisentido (ver por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillo pueden pasar por diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados, son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificadas, las porciones de nucleobase (natural, modificada o una combinación de las mismas) se mantienen para hibridación con un objetivo de ácido nucleico adecuado.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina, comprenden uno o más nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificadas.
En ciertas modalidades, la porción de azúcar modificada es 2'- OE. En ciertas modalidades, los nucleótidos modificados 2'-MOE son ajustados en un motivo de gapmer.
Nucleobases Modificadas Las modificaciones de nucleobase (o base) o sustituciones son estructuralmente distinguibles de, aún funcionalmente intercambiables con, nucleobases no modificadas sintéticas o que ocurren naturalmente. Las nucleobases tanto naturales como modificadas tienen la capacidad de participar en el enlace de hidrógeno. Dichas modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de enlace o algún otra propiedad biológica benéfica a los compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobase sintéticas y naturales, tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado incrementar la estabilidad dúplex del ácido nucleico mediante 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Investigación y Aplicaciones Antisentido, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278).
Las nucleobases no modificadas adicionales incluyen citosina de 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina; y ? guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilO; y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, uracilo de 6-azo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas-8, 5-halo, particularmente y 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidas-5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadeni a y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Las porciones base heterocíclicas también pueden incluir aquellas en las cuales se reemplaza la base de purina o pirimidina con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adeninja, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas sustituida-5, 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y purinas sustituidas-O-6, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina comprenden unajo más nucleobases modificadas. En ciertas modalidades, los i oligonucleótidos antisentido ensanchados mediante gáp dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina, comprenden una: o más nucleobases modificadas. En ciertas modalidades, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas modalidades, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y Métodos para Formular las Composiciones Farmacéuticas Los oligonucleótidos antisentido pueden ser mezclados en adiciones con una sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas, dependen de una cantidad de criterios, incluyendo pero sin limitarse, a la ruta de administración, grado de enfermedad o dosis que será administrada.
El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina, puede ser utilizado en composiciones farmacéuticas, combinando el compuesto antisentido con un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable, incluye una solución salina amortiguada por fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para utilizarse en composiciones que serán administradas en forma parenteral. Por consiguiente, en una modalidad, empleada en los métodos aquí descritos, se encuentran una composición farmacéutica que comprende ün compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas modalidades, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido, comprenden cualquiera de las sales, ésteres farmacéuticamente aceptable o sales de dichos ésteres, o cualquier otro oligonucleótido, el cual al momento de la administración a un animal, incluyendo un humano, tiene la capacidad de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, se proporciona la descripción para las sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de sodio o potasio.
Un profármaco puede incluir incorporación de nucleósidos adicionales de uno o ambos segmentos del extremo del compuesto antisentido, los cuales son disociados mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos Antisentido Conjugados Los compuestos antisentido pueden ser enlazados én forma covalentes a una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los compuestos antisentido resultantes. Los grupos de conjugado típicos incluyen porciones de colesterol y porciones de lípidos. Los grupos de conjugado adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas, y tintas.
Los compuestos antisentido también pueden ser modificados para tener uno o más grupos de estabilización que generalmente se adhieren a uno o más términos del compuesto antisentido para mejorar las propiedades tales como, por ejemplo, estabilidad de nucleasa. Incluidas en los grupos de estabilización se encuentran las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene un ácido nucleico terminal contra la degradación de exonucleasa, y pueden ayuda en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el término-5' (tapa-5') o en el término-3' (tapa-3'), o pueden estar presentes en ambos términos. Las estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tapas abásicas desoxi invertidas. Los grupos de estabilización 3' y 5' que se pueden utilizar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa, incluyen los descritos en la Publicación Internacional WO 03/004602 publicada el 16 de Enero del 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido Los compuestos de los efectos antisentido en el nivel, actividad o expresión de ácidos nucleicos de huntingtina pueden probarse in vitro en una variedad de tipos celulares. Los tipos celulares utilizados para dichos análisis, están disponibles con proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor, utilizando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos celulares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a células HepG2, células Hep3B, hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células y LLC-MK2.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido En la presente invención se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar en forma adecuada para tratamiento con otrós compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido, cuando las células alcanzan una confluencia de aproximadamente 60 a 80% en el cultivo.
Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas, incluyen el reactivo de transfección de lípido catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada del oligonucleótido antisentido y una concentración final de LIPOFECTIN® que normalmente fluctúa de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas, incluyen LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en un medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y ui a concentración de LIPOFECTAMINE® que normalmente fluctúa de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas, incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en un medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), para lograr la concentración de oligonucleótido antisentido deseada y una concentración de Cytofectin®, que normalmente fluctúa de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica utilizada para introducir los oligonucleótidps antisentido en las células cultivadas incluye electroporacion.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido a través de métodos rutinarios. Las células normalmente se recolectan de 16 a 24 horas después del tratamiento de oligonucleótido antisentido, tiempo en el cual se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo, a través de métodos conocidos en la técnica y tal como aquí se describen. En general, cuando se llevan a cabo tratamientos en múltiples réplicas, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos de réplica.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada, varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración de oligonucleótido antisentido óptima para una línea de celular en particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos normalmente se utilizan en concentraciones que fluctúan de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTA INE2000®, Lipofectin o Citofectin. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en mayores concentraciones, que fluctúan de 625 a 20,000 nM, cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN El análisis de ARN se puede llevar a cabo en el ARN o poli(A)+ mARN celular total. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el Reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles o expresión objetivo La inhibición de niveles o expresión de un ácido nucleico de huntingtina se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden ser cuantificados, por ejemplo, mediante análisis de manchado Northern, reacción de cadena de polimerasa competitiva (PCR), o PCR de tiempo real cuantitativa. Los análisis ARN se pueden llevar a cabo en ARN o poli(A)+ mARN celular total. Los métodos para aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. Los análisis ele manchado Northern también son de rutina en la técnica. El PCR de tiempo real cuantitativo puede lograrse en forma conveniente utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7600, 7700, ó 7900, comercialmente disponible, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y ser utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de Tiempo Real PCR Cuantitativo de Niveles de ARN Objetivo La cuantificación de los niveles de ARN objetivo, se puede lograr PCR de tiempo real cuantitativo utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7600, 7700, o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR de tiempo real cuantitativo, son bien conocidos en la técnica.
Antes del PCR de tiempo real, el ARN aislado se somete a reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (cADN), que posteriormente se utiliza como el substrato para la amplificación PCR de tiempo real. Las reacciones PCR RT y de tiempo real, se llevan a cabo en secuencias también en la misma muestra. Los reactivos PCR RT y de tiempo real, se obtienen en Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones PCR RT de tiempo real, se llevan a cabo a través de métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Las cantidades objetivos de gen (o ARN) obtenidas mediante PCR de tiempo real, se normalizan utilizando ya sea el nivel de expresión de un gen, cuya expresión es constante, tal como ciclofilina A, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR de tiempo real, corriéndose en forma simultánea en el objetivo, multiplexándose, o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN mediante RIBOGREEN®, son enseñados en la Publicación de Jones, L.J., y asociados, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia RIBOGREEN®.
Las sondas y cebadores están diseñados para hibridar un ácido nucleico de huntingtina. Los métodos para diseñar sondas y cebadores PCR de tiempo real con bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de un software tal como el software PRIMER EXPRESS® Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de Niveles de Proteínas La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de huntingtina se puede ensayar midiendo los niveles de proteína de huntingtina. Los niveles de proteína de huntingtina pueden evaluar o cuantificar en una variedad de formas conocidas en la técnica, tal como inmunoprecipitación, análisis de manchado Western (inmunomanchado), ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA), ensayos de proteína cuantitativa, ensayos de actividad de proteína (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, ¡nmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo se pueden identificar y obtener de una variedad de fuentes, tal como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar mediante métodos de generación de anticuerpo monoclonal o policlonal convencionales, bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de huntingtina de humano y rata están comercialmente disponibles.
Prueba in vivo de compuesto antisentido Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se probaron en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de huntingtina y producir cambios fenotípicos. Las pruebas se pueden llevar a cabo en animales normales, o en modelos de enfermedad experimental. Para administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente, tal como solución salina amortiguada por fosfato. La administración incluye rutas de administración parenteral. Después de un período de tratamiento con oligonucleótido antisentido, se aisló el ARN del tejido y se midieron los cambios en la expresión de ácido nucleico de huntingtina. También se midieron los cambios en los niveles de proteína de huntingtina.
Ciertos Compuestos Aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido diseñados recientemente de diversas longitudes, motivos y composición de esqueleto, fueron probados con respecto en mARN de huntingtina humano in vitro en diversos tipos celulares. Los nuevos compuestos se compararon con aproximadamente doscientos cincuenta compuestos diseñados previamente incluyendo ISIS 387916, el cual ha sido determinado previamente como uno de los compuestos antisentido más potente (ver las publicaciones de patente Norteamericana Nos. 2008/0039418 y 2007/0299027). De los aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido recientemente diseñados, se seleccionaron aproximadamente sesenta compuestos para estudios adicionales con base en la comparación de potencia ¡n vitro con ISIS 387916. Los compuestos seleccionados fueron probados para tolerabilidad sistémica (ver Ejemplo 3) y la actividad y tolerabilidad en el cerebro de ratones BACHD (ver Ejemplo 4) en comparación con ISIS 388241 y ISIS 387916 previamente diseñados. De estos estudios, los compuestos que tienen una secuencia de nucleobase de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 o 32 fueron seleccionados como teniendo alta tolerabilidad y alta potencia in vivo. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios para las regiones 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101 105, 115066-1 15085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 o 4928-4947 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, los compuestos que dirigen las regiones descritas, tal como se describe en forma adicional en la presente invención, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobase de la secuencia mencionada en la SEC ID NOs, tal como aquí se describe. En ciertas modalidades, lós compuestos que dirigen las regiones descritas o que tienen una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs descritas, pueden tener diversas longitudes, tal como se describe en forma adicional más adelante, y pueden tener uno de diversos motivos, tal como se describe en forma adicional más adelante. En ciertas modalidades, un compuesto que dirige una región o que tiene una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs descritas, tiene la longitud y motivo específicos tal como se indica a través de ISIS NOs: ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 451541, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, o ISIS 444663.
Los compuestos descritos anteriormente como teniendo alta potencia y tolerabilidad in vivo, posteriormente se probaron mediante inyección de bolo CNS en ratas, para evaluar en forma adicional la neurotoxicidad (ver Ejemplo 5) junto con diversos compuestos adicionales que tienen una secuencia de nucleobase de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 7, 8, 11, 16, 17. De estas, diez compuestos que tienen una secuencia de nucleobase de una secuencia mencionada en |a SEC ID NO: 24, 25, 26, 6, 12, 28, 21, 22, 32 ó 13, fueron seleccionados como teniendo alta tolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios para las regiones 4384-4403, 4609-4628, 4610-4629, 4860-4877, 4862-4881, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4955-4974, o 5809-5829 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, los compuestos que dirigen las regiones descritas, tal como se describe en forma adicional en la presente invención, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene una porción de nucleobase de la secuencia mencionada en las SEC ID NOs, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. En ciertas modalidades, los compuestos que dirigen las regiones descritas o que tienen una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs descritas, pueden tener diversas longitudes, tal como se describe en forma adicional en la presente invención, y pueden tener uno de diversos motivos, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. En ciertas modalidades, un compuesto que dirige una región o que tiene una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs descritas, tiene la longitud y motivo específicos tal como se indica en ISIS NOs: ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, y ISIS 444661. Los compuestos seleccionados fueron comparados con el compuesto previamente diseñado ISIS 388241 mediante administración ICV en ratones BACHD.
Posteriormente se llevaron a cabo estudios adicionales en los compuestos descritos anteriormente, como teniendo alta potencia y tolerabilidad in vivo. Los estudios adicionales fueron diseñados para evaluar en forma adicional la neurotoxicidad. Los estudios incluyeron la administración ICV en ratones tipo silvestre (ver Ejemplo 16) y administración de bolo en ratas (ver Ejemplo 17). Se seleccionaron las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33 como teniendo alta neurotolerabilidad. En virtud de su secuencia complementaria, los compuestos son complementarios para las regiones 4862-4881, 4609-4628, 5809-5828, 5809-5826, 5801-5820, y 4955-4974 de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, los compuestos que dirigen las regiones descritas, tal como se describe en forma adicional en la presente invención, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene ciertas porciones de nucleobase de la secuencia mencionada en las te SEC ID NOs, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. En ciertas modalidades, los compuestos que dirigen las regiones descritas, o que tienen una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs pueden tener diversas longitudes, tal como se describe en forma adicional en la presente invención, y pueden tener uno de diversos motivos, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. En ciertas modalidades, un compuesto que dirige una región o que tiene una porción de nucleobase de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs descritas, tiene la longitud y motivo específicos tal como se indica mediante ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 444591, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444652, y ISIS 436689.
Por consiguiente, en la presente invención se proporcionan compuestos antisentido con características mejoradas. En ciertas modalidades, en la presente invención se proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado tal como se describe en forma adicional en la presente invención dirigido a, o hibridizable en forma específica con la región de nucleótidos de la SEC ID NO: 1. En ciertas modalidades, los compuestos tal como aquí se describen, son eficaces en virtud de tener al menos uno de un IC50 in vitro menor a 7 uM, menor a 6 uM, menor a 5, uM, menor a 4 uM, menor a 3 uM, menor a 2 uM, menor a 1 uM, cuando se suministran a una línea de célula de fibroblasto humana, tal como se describe en la presente invención, o un ED50 menor a 10 pg, menor a 9 pg, menor a 8 pg, menor a 7.5 pg, menor a 7.4 pg, menor a 7.0 pg, menor a 6 pg, menor a 5 pg, menor a 4 pg menor a 3 pg, o menor a 2 pg o mediante inyección de bolo. Tal como aquí se describe, la infusión ICV puede dar como resultado valores ED50 de 3 a 4 veces superiores para los compuestos aquí descritos. En ciertas modalidades, los compuestos tal como aquí se describen son altamente tolerables tal como lo demuestran por tener al menos uno de un incremento en un valor ALT o AST no mayor a 4 veces, 3 veces, o 2 veces con respecto a los animales tratados con solución salina. Un incremento en el peso del hígado, bazo o riñon no mayor a 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%; o un incremento en los niveles de AIF1 en no más de 350%, 300%, 275%, 250% 200%, 150% o 100% con respecto al control.
Ciertas Indicaciones En ciertas modalidades, en la presente invención se proporcionan métodos para tratar a un individuo, en donde los métodos comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas tal como aquí se describe. En ciertas modalidades, el individuo tiene enfermedad de Huntington.
Tal como se muestra en los ejemplos que se encuentran a continuación, los compuestos dirigidos a huntingtina tal como aquí se describen, han mostrado reducir la severidad de síntomas fisiológicos de la enfermedad de Huntington. En ciertos de los experimentos, los compuestos reducen el rango de degeneración, por ejemplo, los animales continúan experimentando síntomas, pero los síntomas fueron severos en comparación con los animales no tratados. En otros de los experimentos, sin embargo, los compuestos parecen dar corno resultado la regeneración de la función con el tiempo; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo, experimentaron síntomas menos severos, a los síntomas de los que se les administraron los compuestos durante un período de tiempo más corto. Tal como se describe anteriormente, la enfermedad de Huntington es una enfermedad degenerativa con un progreso tipificado por severidad incrementada de los síntomas con el tiempo. La capacidad de los compuestos ejemplificados más adelante para restaurar la función, demuestra por consiguiente que los síntomas de la enfermedad pueden ser revertidos mediante el tratamiento con un compuesto tal como aquí se describe.
Por consiguiente, en la presente invención se proporcionan métodos para disminuir un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, en un sujeto que necesita del mismo. En ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir el rango de generación de un síntoma asociado con enfermedad de Huntington. En ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir la severidad de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. En ciertas modalidades, se proporciona un método para regenerar la función neurológica, tal como se muestra a través de la mejoría de un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. En dichas modalidades, los métodos comprenden administrar a un individuo que necesita del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto dirigido a un ácido nucleico de huntingtina.
La enfermedad de Huntington está caracterizada por numerosos síntomas físicos, neurológicos, psiquiátricos, y/o periféricos. Cualquier síntoma conocido para un experto en la técnica, asociado con la enfermedad de Huntington, puede ser disminuido o de otra manera modulado tal como se establece anteriormente en los métodos descritos. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma físico seleccionado del grupo que consiste en nerviosismo, carencia de coordinación, movimientos iniciados en forma no intencional, movimientos no completados en forma no intencional, modo de caminar no constante, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura normal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad al masticar, dificultad al tragar dificultad al tragar, convulsiones y perturbaciones del sueño. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma cognitivo seleccionado del grupo que consiste en planeación dañada, flexibilidad dañada, pensamiento abstracto dañado, adquisición de regla dañada, inicio dañado de acciones adecuadas, inhibición dañada de acciones no adecuadas, memoria a corto plazo dañada, memoria a largo plazo dañada, paranoia, desorientación, confusión, alucinación, y demencia. En ciertas modalidades, los síntomas es un síntoma psiquiátrico seleccionado del grupo que consiste en ansiedad, depresión, afecto entorpecido, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideas suicidas. En ciertas modalidades, el síntoma es un síntoma periférico seleccionado del grupo que consiste en masa cerebral reducida, atrofia muscular, falla cardiaca, tolerancia a glucosa dañada, pérdida de peso, osteoporosis, y atrofia testicular.
En ciertas modalidades, el síntoma es nerviosismo. En ciertas modalidades, el síntoma es carencia de coordinación. En ciertas modalidades, el síntoma es movimientos iniciales en forma no intencional. En ciertas modalidades, el síntoma es movimientos no completados en forma no intencional. En ciertas modalidades, el síntoma es modo de caminar no constante. En ciertas modalidades, el síntoma es corea. En ciertas modalidades, el síntoma es rigidez. En ciertas modalidades, el síntoma es movimientos de contorsión. En ciertas modalidades, el síntoma es postura anormal. En ciertas modalidades, el síntoma es inestabilidad. En ciertas modalidades, el síntoma es expresiones faciales anormales. En ciertas modalidades, el síntoma es dificultad para masticar. En ciertas modalidades, el síntoma es dificultad para tragar. En ciertas modalidades, el síntoma es dificultad para hablar. En ciertas modalidades, el síntoma es convulsiones. En ciertas modalidades, el síntoma es perturbaciones del sueño.
En ciertas modalidades, el síntoma es planeación dañada. En ciertas modalidades, el síntoma es flexibilidad dañada. En ciertas modalidades, el síntoma es pensamiento abstracto dañado. En ciertas modalidades, el síntoma es adquisición de reglas dañada. En ciertas modalidades, el síntoma es inicio dañado de acciones adecuadas. En ciertas modalidades, el síntoma es inhibición dañada de acciones no adecuadas. En ciertas modalidades, el síntoma es memoria a corto plazo dañada. En ciertas modalidades memoria a largo plazo dañada. En ciertas modalidades, el síntoma es paranoia. En ciertas modalidades, el síntoma es desorientación. En ciertas modalidades, el síntoma es confusión. En ciertas modalidades, el síntoma es alucinación. En ciertas modalidades, el síntoma es demencia. En ciertas modalidades, el síntoma ansiedad. En ciertas modalidades, el síntoma es depresión. En ciertas modalidades, el síntoma es afecto entorpecido. En ciertas modalidades, el síntoma es egocentrismo. En ciertas modalidades, el síntoma es agresión. En ciertas modalidades, el síntoma es comportamiento compulsivo. En ciertas modalidades, el síntoma es irritabilidad. En ciertas modalidades, el síntoma es ideas suicidas. En ciertas modalidades, el síntoma es masa cerebral reducida. En ciertas modalidades, el síntoma es atrofia muscular. En ciertas modalidades, el síntoma es falla cardiaca. En ciertas modalidades, el síntoma es tolerancia a glucosa dañada. En ciertas modalidades, el síntoma es pérdida de peso. En ciertas modalidades, el síntoma es osteoporosis. En ciertas modalidades, el síntoma es atrofia testicular.
En ciertas modalidades, los síntomas de la enfermedad de Huntington pueden ser cuantificables. Por ejemplo, la osteoporosis se puede medir y cuantificar, por ejemplo, mediante exploraciones de densidad ósea. Para dichos síntomas, en ciertas modalidades, el síntoma puede ser reducido en aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 99%, o un rango definido por cualesquiera de dos de estos valores.
En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo, en donde los individuos comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas tal como aquí se describen. En ciertas modalidades, el individuo tiene enfermedad de Huntington.
En ciertas modalidades, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de huntingtina, da como resultado la reducción de la expresión de huntingtina de al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 99%, o un rango definido por cualesquiera de estos dos valores.
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a huntingtina, son utilizadas para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece de, o es susceptible a enfermedad de Huntington.
En ciertas modalidades, los métodos aquí descritos incluyen administrar un compuesto que comprende, un oligonucleótido modificado, que tiene una porción de nucleobases contigua, tal como aquí se describe de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 10, 11, 12, 13, 18, 22 ó 32. En ciertas modalidades, los métodos aquí descritos incluyen, administrar un compuesto que comprenden un oligonucleótido modificado, que tiene una porción de nucleobase contigua tal como aquí se describe de una secuencia mencionada en las SEC ID NOs: 12, 22, 28, 30, 32, y 33.
Administración En ciertas modalidades, los compuestos y composiciones aquí descritos se administran en forma parenteral.
En ciertas modalidades, la administración parenteral es mediante infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En ciertas modalidades, se suministran con una bomba agentes farmacéuticos infusionados. En ciertas modalidades, administración parenteral es mediante inyección.
En ciertas modalidades, los compuestos y composiciones se suministran al CNS. En ciertas modalidades, los compuestos y composiciones se suministran al fluido cerebroespinal. En ciertas modalidades, compuestos y composiciones se administran a la parénquima cerebral. En ciertas modalidades, compuestos y composiciones se suministran a un animal mediante administración intratecal, o administración intracerebroventricular. Se puede lograr una amplia distribución de los compuestos y composiciones, aquí descritos, dentro del sistema nervioso central, con administración intraparenquimál, administración intratecal o administración intracerebroventricular.
En ciertas modalidades, la administración parenteral es mediante inyección. La inyección puede suministrarse con una jeringa o una bomba. En ciertas modalidades, la inyección es inyección de bolo. En ciertas modalidades, la inyección se administra directamente a un tejido, tal como el estrato, caudato, corteza, hipocampo y cerebelo.
La concentración efectiva promedio (EC50) de los compuestos antisentido para inhibir la expresión de mARN de huntingtina, fue calculada ya sea después de infusión ICV o inyección de bolo (ver Ejemplos 9 y 10). La EC50 para el compuesto después de inyección intrastriatal, fue determinada como de 0.45. La EC50 después de administración ICV, fue determinada como de 26.4 pg/g.
Por consiguiente, en ciertas modalidades, el suministro de un compuesto o composición aquí descrito, puede afectar el perfil farmacológico cinético del compuesto o composición. En ciertas modalidades, la inyección de un compuesto o composición aquí descrito, a un tejido objetivo, mejora el perfil farmacocinético del compuesto o composición, en comparación con la infusión del compuesto o composición. En ciertas modalidades, la inyección de un compuesto o composición mejora la potencia en comparación con la amplia difusión, que requiere menos del compuesto o composición para lograr una farmacología similar. En ciertas modalidades, la farmacología similar se refiere a la cantidad de tiempo en que es desactivado el mARN objetivo y/o proteína objetivo (por ejemplo, duración de acción). En ciertas modalidades, los métodos para localizar en forma específica el agente farmacéutico, tal como mediante inyección de bolo, disminuye la concentración efectiva (EC50) mediante un factor de aproximadamente 50 (por ejemplo, se requiere 50 veces menos concentración en el tejido para lograr el mismo o un similar efecto farmacodinámico). En ciertas modalidades, los métodos para localizar en forma específica un agente farmacéutico, tal como mediante inyección por bolo, disminuyen la concentración efectiva promedio (EC50) en un factor de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50. En ciertas modalidades el agente farmacéutico es un compuesto antisentido tal como aquí se describe en forma adicional en la presente invención. En ciertas modalidades, el tejido dirigido es tejido cerebral. En ciertas modalidades el tejido dirigido es tejido estriatal. En ciertas modalidades, es deseable la disminución de la EC50, debido a que se reduce la dosis requerida para lograr el resultado farmacológico de un paciente que necesita del mismo.
La vida media de los oligonucleótido de gapmer MOE en el tejido cerebral es de aproximadamente 20 días (ver Ejemplos 9-11). La duración de acción tal como se mide mediante inhibición del mARN de huntingtina se prolonga en el cerebro (ver Ejemplos 9 y 10). La infusión intracerebroventricular oligonucleótidos antisentido durante 2 semanas, dio corno resultado la inhibición del mARN de huntingtina en al menos el 50% en tejido estriatal de ratones BACHD, durante al menos 91 días después del término de la dosificación. La administración mediante inyección de bolo, dio como resultado una duración de acción similar.
En ciertas modalidades, el suministro de un compuesto o composición, tal como aquí se describe, al CNS, da como resultado una desactivación del 47% de un mARN objetivo y/o proteína objetivo, durante al menos 91 días. En ciertas modalidades, el suministro de un compuesto o composición da como resultado al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, o al menos el 75% de desactivación de un mARN objetivo y/o proteína objetivo durante al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días, al menos 100 días, al menos 110 días, al menos 120 días. En ciertas modalidades, el suministro al CNS es mediante administración intraparenquimal , administración intratecal, o administración intracerebroventricular.
En ciertas modalidades, se suministra un oligonucleótido antisentido mediante inyección o infusión una vez al mes, cada dos meses, cada 90 días, cada 3 meses, cada 6 meses, dos veces al año o una vez al año.
Ciertas Terapias de Combinación En ciertas modalidades, se administran en conjunto una o más composiciones farmacéuticas con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En ciertas modalidades, dichos uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o condición que la una o más composiciones farmacéuticas aquí descritas. En ciertas modalidades, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos, están diseñados para tratar una diferente enfermedad, trastorno o condición que las una o más composiciones farmacéuticas aquí descritas. En ciertas modalidades, dichos uno o más de otros agentes farmacéuticos, están diseñados para tratar un efecto secundario indeseado de una o más de las composiciones farmacéuticas tal como aquí se describen. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas se administran junto con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado del otro agente farmacéutico. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas se administran con otro agente farmacéutico para producir un efecto de combinación. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas se administran con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran en diferentes momentos. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas, y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una sola formulación. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas, y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan por separado.
En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden administrar en conjunto con una composición farmacéutica incluyen agentes anti-psicóticos, tales como, por ejemplo haloperidol, clorpromazina, clozapina, quetapina, y olanzapina; agentes antidepresivos tales como por ejemplo fluoxetina, clorhidrato de sertralina, venlafaxina y nortriptilina ; agentes tranquilizantes tales como, por ejemplo, benzodiazepinas, clonazepam, paroxetina, venlafaxin, y beta-bloqueadores; agentes de estabilización de humor, tales como, por ejemplo, litio, valproato, lamotrigina, y carbamazepina; agentes paralíticos tales como, por ejemplo, tocina de Botulineo; y/o otros agentes experimentales, incluyendo pero sin limitarse a, tetrabenazina (Xenazina), creatina, coenzima Q10, trehalosa, ácidos docosahexanoico, ACR16, etil-EPA, atomoxetina, citalopram, dimebon, memantina, fenilbutirato de sodio, ramelteon, ursodiol, ziprexa, xenasina, tiaprida, riluzól, amantadina, [123I]MN I-420, atomoxetina, tetrabenaziná, digoxin, detrometorfan, warfarina, alprozam, ketoconazol, omeprazol, y minociclina.
EJEMPLOS Descripción no Limitante e Incorporación como Referencia Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos aquí descritos, han sido descritos con especificidad de acuerdo con ciertas modalidades, los ejemplos que se encuentran a continuación, sirven únicamente para ilustrar los compuestos aquí descritos, y no pretenden limitar los mismos. Cada una de las referencias mencionadas en la presente solicitud, está incorporada en su totalidad a la presente invención corrió referencia.
Ejemplo 1: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a secuencias de gen de huntingtina humanas Se probaron aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido recientemente diseñados, de diversas longitudes, motivos y composición de esqueleto que dirigen el gen de huntingtina, con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humano in vitro en diversos tipos celulares. En estos gapmers fueron diseñados en forma adicional con ligaduras de inter nucleósido que son ya sea únicamente ligaduras de fosforotioato (descritas en la tabla 1) o que son ligaduras de fosforotioato y fosfodiéster (descritos en la tabla 5). Una cantidad de los oligos recientemente diseñados y dos oligonucleótidos de estándar de comparación (previamente diseñados y descritos) tal como se proporciona en las tablas 1 y 5.
Gapmers con ligaduras de internucleósido completamente de fosforotioato Ciertos de los compuestos presentados en la tabla 1, tienen un motivo de 5-10-5 OE, 6-8-6 MOE, o 5-8-5 MOE. Los gapmers 5-10-5, tienen veinte nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap central tiene diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada una. El gapmer 6-8-6 tiene veinte nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap central tiene ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen seis nucleósidos cada una. Los gámperos 5-8-5 gapmers tienen dieciocho nucleósidos enlazados, en donde el segmento de gap central tiene ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que tienen cinco nucleósidos cada uno. Para todos los gapmers descritos en la tabla 1, cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3', tiene una modificación 2'- OE. Las ligaduras de internucleósido a través de cada gapmer, son ligaduras de internucleósido de fosforotioato (P = S). Todas las citocinas a lo largo de cada gapmer, son 5-metilcitosinas. Cada gapmer en la tabla 1, está dirigido a la SEC ID NO: 1 (Acceso GENBANK No. NM_002111.6) o SEC |D NO: 2 (Acceso GENBANK No. NT_006081.17 truncada de los nucleótidos 462000 a 634000). El término "sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "sitio de detección" indica el nucleótido más 3' para el cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana.
Tabla 1 Oligonucleótidos antisentido quiméricos con ligaduras de internucleósido de fosforotioato que dirigen las secuencias de gen de huntingtina humanas (SEC ID NOs: 1 y 2) La complementariedad de los gapmers en tabla 1 con secuencias de gen de huntingtina de ratón, mono rhesus y rata, se describe en forma adicional en las tablas 2, 3, y 4.
Los gapmers de la tabla 2 son complementarios con el mARN de huntingtina de ratón (Acceso GENBANK No. NM_010414.1 , designado en la presente invención como SEC ID NO: 3). El término "sitio de inicio de dirección de ratón" indica el nucleotido más 5' al cual se dirige el gapmer en el mARN de ratón. El término "sitio de detención objetivo de ratón" indica el nucleotido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN de ratón. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano" indica el nucleotido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humano. El término "Sitio de Detención Objetivo Humano" indica el nucleotido más 3' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "número de desacoplamiento" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleótido humano y la secuencia mARN de ratón.
Tabla 2 Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tiene ligaduras de f osf o Los gapmers de la tabla 3 son complementarios con la secuencia genómica de huntingtina de mono rhesus (el complemento de Acceso GENBANK No. NW_001109716.1 truncada en los nucleotidos 698000 a 866000, designada en la presente invención como SEC ID NO: 4). El término "sitio de inicio de dirección de mono rhesus" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen de mono rhesus. El término "sitio de detención objetivo de mono rhesus" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen de mono rhesus. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "Sitio de Detención Objetivo Humano" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "número de desacoplamiento'" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de gen de mono rhesus.
Tabla 3 Complementariedad de oligonucleotidos antisentido que tienen ligaduras de f osforotioato con la secuencia de mono rhesus (SEC ID NO: 4) Los gapmers de la tabla 4, son complementarios con un mARN de huntingtina de rata (Acceso GENBANK No. NM_024357.2, designada en la presente invención como SEC ¡D NO: 5). El término "sitio de inicio de objetivo de rata" indica ¡el nucleótido más 5', al cual se dirige el gapmer en el mARN de rata. El término "sitio de detención objetivo de rata" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN de rata. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano'" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "Sitio de Detención Objetivo Humano" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen humana. El término "número de desacoplamiento" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleótido humano y la secuencia mARN de rata.
Tabla 4 Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen ligaduras de fosforotioato de mARN de rata (SEC ID NO: 5) Gapmers con ligaduras de internucleósido de fosforotioato y fosfodiéster mezcladas Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la tabla |5, fueron designados como gapmers 5-10-5 MOE. Los gapmers 5-10-5 tienen veinte nucleósidos enlazados, en donde ;el segmento de gap central tiene diez 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alás que tienen cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3', tiene una modificación 2'-MOE. Las ligaduras de internucleósido dentro del segmento gap central segmento, las ligaduras que conectan el segmento gap con el segmento de ala 5' o 3', y las I ligaduras de los nucleósidos más 5' y más 3' de cada segmento de ala, todas son ligaduras de fosforotioato (P = S); las ligaduras de internucleósido que conectan el resto de los nucleósidos de los segmentos de ala tanto 5' como 3', son ligaduras de fosfodiéster; por ejemplo, es decir, el gapmer tiene un esqueleto mezclado. Todas las citocinas a través de cada gapmer, son 5-metilcitosinas. Cada gapmer en la tabla 5 está dirigido a la secuencia de mARN humana (Acceso GENBANK i; No. NM_002111.6, designado en la presente invención como i SEC ID NO: 1). El término "sitio de inicio", indica, el nucleótido i más 5' al cual se dirige en el gapmer en el mARN humano. ;EI i i I término 'sitio de detención" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN. humano i Tabla 5 Oligonucleótidos antisentido quiméricos con ligaduras de internucleósido de fosforotioato y fosfato que dirigen el mARN de huntingtina humano (SEC ID NO: 1) complementariedad de los gapmers en la tabla 5 con secuencias de gen de huntingtina de ratón, mono rhesus y rata, se describen en forma adicional en las tablas 6, 7, y 8.
Los gapmers de la tabla 6 son complementarios con mARN de huntingtina de ratón (Acceso GENBANK No. N M_010414.1 ; SEC ID NO: 3). El término "sitio de inicio objetivo de ratón" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en mARN de ratón. El término "sitio de detención objetivo de ratón" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN de ratón. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM 002111.6). El término "Sitio de Detención Objetivo Humano", indica el nucleótido más 3 al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM 002111.6). El término "número de desacoplamientos" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleótido humano y la secuencia mARN de ratón.
Tabla 6 Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen ligaduras de f osf orotioato y fosfato mezcladas con mARN de múrido (SEC ID NO: 3) Los gapmers de la tabla 7, son complementarios con la secuencia genómica de huntingtina de mono rhesus (el complemento de Acceso GENBANK No. NW_001109716.1 , truncada en los nucleótidos 698000 a 866000; SEC ID NO: 4). El término "sitio de inicio objetivo de mono rhesus" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen de mono rhesus. El término "sitio de detención objetivo de mono rhesus" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en la secuencia de gen de mono rhesus. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM_002111.6). El término "Sitio de Detención Objetivo Humano" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM_002111.6). El término "número de desacoplamiento" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleotido humano y la secuencia de gen de mono rhesus.
Tabla 7 Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen ligaduras de fosforotioato y fosfato mezcladas con secuencia de gen de mono rhesus (SEC ID NO: 4) Los gapmers de la tabla 8 son complementarios con el mARN de huntingtina de rata (Acceso GENBANK No. NM_024357.2; SEC ID NO: 5). El término "sitio de inicio objetivo de rata" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en el mARN de rata. El término "sitio de detención objetivo de rata" indica el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN de rata. El término "Sitio de Inicio Objetivo Humano" indica el nucleótido más 5' al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM_002111.6). Él término "Sitio de Detención Objetivo Humano" indica :el nucleótido más 3' al cual se dirige el gapmer en el mARN humano (Acceso GENBANK No. NM 002111.6). El término "número de desacoplamiento" indica el número de desacoplamientos entre el oligonucleótido humano y la secuencia de mARN de rata.
Tabla 8 Complementariedad de oligonucleótidos antisentido que tienen ligaduras de fosforotioato y fosfatos mezcladas con mARN de rata (SEC ID NO: 5) Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de mARN de huntingtina humana in vitro Se probaron aproximadamente mil setecientos compuestos antisentido recientemente diseñados de diversas longitudes, motivos y composición de esqueleto, con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humano in vitro en diversos tipos j_le células. Estos compuestos se compararon con aproximadamente doscientos cincuenta compuestos diseñados previamente incluyendo el compuesto ISIS 387916, el cual fue determinado previamente como un compuesto con potencia in vivo considerable. Tal como se muestra en este ejemplo, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591, ISIS 444661, ISIS 437527, ISIS 444584, y ISIS 444652 y el ISIS 388241 previamente diseñado, se encontró como que tienen una potencia asimilar o mejor que el compuesto de estándar de comparación in vitro ISIS 387916.
A. Fibroblastos GM04281 Los fibroblastos GM04281 cultivados en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transfectados utilizando electroporación con 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM,¡ o 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2 17 (secuencia directa CTCCGTCCGGTAGACATGCT, designada en la presente invención como SEC ID NO: 37; secuencia inversa GGAAATCAGAACCCTCAAAATGG, designada en la presente invención como SEC ID NO: 38; secuencia de sonda TGAGCACTGTTCAACTGTGGATATCGGGAX, designada en la presente invención como SEC ID NO: 39), para medir los niveles de mARN. Los niveles de mARN de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 9 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a células de control no tratadas y demuestran la reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina.
Se calculó la concentración de inhibición máxima promedio (IC50) de cada oligonucleótido, también presentada en la tabla 9, trazando las concentraciones de oligonucleótidos utilizados, versus el porcentaje de inhibición de la expresión de mARN de huntingtina, lograda en cada concentración, y se observa que se logró . la concentración de oligonucleótido en donde la expresión de mARN de huntingtina llego al 50% de inhibición, en comparación con el control. La IC50 se expresa en µ?.
Tabla 9 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 El ISIS 387916, ISIS 388241, y ISIS 437507 se probaron en forma adicional con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana ¡n vitro. Se probaron los fibroblastos i GM04281 cultivados en un procedimiento similar, tal como se describe anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 10 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, ! y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC5o de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 10 expresada en µ?.
Tabla 10 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, y ISIS 437507 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Se probaron los fibroblastos GM04281 cultivados en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 11 como i el porcentaje de inhibición del mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran la reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. El IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 11 expresada en µ?.
Tabla 11 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, y ISIS 436754 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humano ¡n vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados fueron probados en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 12 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido en los niveles de mARN de huntingtina. La IC5o de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 12 expresada en µ?.
Tabla 12 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, y ISIS 437507 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transfectados utilizando electroporación con 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM o 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles mARN. Se ajustaron los niveles mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 13, como el porcentaje de inhibición mARN ¡de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 13, expresada en µ?.
Tabla 13 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 443139, ISIS 444584, ISIS 444615, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, y ISIS 44461 con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos G 04281 cultivados en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transfectados utilizando electroporación con 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1250 nM, o 2500 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles mARN. Se ajustaron los niveles mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide i mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en lia tabla 14 como el porcentaje de inhibición de mARN ¿le huntingtina, en forma relativa a las células de control ijio tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 14 expresada én µ?.
Tabla 14 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 436671, ISIS 444661, ISIS 419641, y ISIS 436665 con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos G04281 cultivados en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transfectados utilizando electroporación con 13.6719 nM, 27.3438 nM, 54.6875 nM, 109.375 nM, 218.75 nM, 437.5 nM, 875 nM, 1750 nM, 3500 nM, 7000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó un conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 15 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control o tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 15 expresada en µ?.
Tabla 15 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437168, y ISIS 437175 con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos G04281 cultivados en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transí ectados utilizando electroporacion con 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM y 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó un conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 15 con o el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 15.1 expresada en µ?.
Tabla 15.1 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437441, y ISIS 437442 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados se i probaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 15.2 como el porcentaje ? \ de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleotido antisentido de los niveles mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleotido antisentido también se presenta en la tabla 15¡.2 expresada en µ?.
Tabla 15.2 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 Se probaron ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 437175, ¡ y ISIS 437527 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Los fibroblastos GM04281 cultivados $e probaron en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 15.3 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 15:3 expresada en µ?.
Tabla 15.3 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en fibroblastos GM04281 B. Células A549 Alguno de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1, se probaron con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humana in vitro. Las células A549 cultivadas en una densidad de 4,000 células por depósito, fueron transfectadas utilizando el reactivo de transfección de lipofectina con 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células, y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles de mARN. Los niveles de mARN de huntingtina se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla i 16 como un porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, ¡ y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido se presenta en la tabla 16 expresada en nM.
Tabla 16 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células A549 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 38824;1 , y ISIS 437507 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Las células A549 cultivadas en una densidad de 20,000 células por depósito, se transfectaron utilizando electroporación con 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM o 8000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de ün período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para los niveles mARN. Se ajustaron los niveles de mARN ele huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 17 expresados como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de contrpl no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de ¡la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido I Tabla 17 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células A549 C. Células LLC-MK2 Alguno de los oligonucleótidos antisentido descritos en !el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humana, se probaron con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas en una densidad de 25,000 células por depósito, fueron transfectadas utilizando electroporación con 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5000 nM, 10,000 nM o 20,000 nM del oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células, y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó un conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 (secuencia directa GTCTGAGCCTCTCTCGGTCAA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 40; secuencia inversa AAGGGATGCTGGGCTCTGT, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 41 ; secuencia de soncia AGC AAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTX, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 42) para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 18 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control, y demuestran :|a reducción dependiente de la dosis transmitida pór oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN ¿Je huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido, también se presenta en la tabla 18 expresada en µ?.
Tabla 18 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células LLC-MK2 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, y ISIS 444607 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas fueron probadas en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 19 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 19 expresada en µ?.
Tabla 19 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina n.d. = La IC50 no puede ser medida para dicho compuesto.
Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISllS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, y ISIS 444661 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas fueron probadas en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Líos i resultados se presentan en la tabla 20 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las i | células de control no tratadas, y demuestran la reduccipn I dependiente de la dosis transmitida por oligonucleóticlo antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en ¡la tabla 20 expresada en µ?.
Tabla 20 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, y ISIS 419642 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas en una densidad de 3,000 células por depósito, fueron transfectadas utilizando reactivo de transfeccion de lipofectina con 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisjló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 21 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 21 expresada en nM.
Tabla 21 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células LLC-MK2 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 419641, y ISIS 436689 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas en una densidad de 3,000 células por depósito, fueron transfectadás utilizando el reactivo de transfección LipofectAMINE2000 con 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 22 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 22 expresada en nM.
Tabla 22 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células LLC-MK2 Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 436665, ISIS 436671, y ISIS 436689 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de monos resus in vitro. Las células LLC-MK2 cultivadas en una densidad de 3,000 células por depósito, fueron transfectadas utilizando el reactivo de transfección de lipofectina con 4.6875 nM, 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 75 nM o 150 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2686 para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 23 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC5o de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 22 expresada en nM.
Tabla 23 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en células LLC-MK2 D. Hepatocitos de ratón transgénico BACHD Algunos de los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 1 y dirigidos a un ácido nucleico de huntingtina humano, se probaron con respecto a su efecto en el mARN de huntingtina humana in vitro.
Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados en una densidad de 10,000 células por depósito utilizando el reactivo de transfección de citofectina con 7.4074 nM, 22.222 nM, 66.667 nM, o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 24 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 24 expresada en nM.
Tabla 24 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en hepatocitos de múrido transgénicos BACHD Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, y ISIS 419641 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitro. Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados en una densidad de 10,000 células por depósito utilizando el reactivo de transfección de citofectina con 12.5 nM, 25 n M , 50 nM, 100 nM o 200 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 para medir los niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 25 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La IC5o de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 25 expresada en nM.
Tabla 25 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en hepatocitos de múrido transgénicos BACHD Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419641, ISIS 436665, ISIS 436671, y ISIS 436689 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina humana in vitrp. Los hepatocítos de ratón BACHD cultivados, se probaron en una forma idéntica a la descrita anteriormente. Los resultados se presentan en la tabla 26 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de :|a dosis transmitida por oligonucleotido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. La IC50 de cada oligonucleotido antisentido también se presenta en la tabla 26 expresada en I nM. i Tabla 26 Reducción dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en hepatocitos de múrido transqénicos BACHD Se probaron en forma adicional ISIS 387916, ISIS 419640, ISIS 419641, y ISIS 419642 con respecto a su efecto en mARN de huntingtina de ratón in vitro. Se transfectaron hepatocitos de ratón BACHD cultivados en una densidad de 20,000 células por depósito utilizando el reactivo de transfección de citofectiha con 6.667 nM, 20 nM, 60 nM o 180 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se i midieron los niveles de mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo. Se utilizó el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633 (secuencia directa CAG AGCTGGTCAACCGTATCC, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 43; secuencia inversa GGCTTAAACAGGGAGCC AAAA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 44; secuencia de sonda ACTTCATG ATGAGCTCGGAGTTCAACX, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 45). Se ajustaron los niveles de mARN de huntingtina de acuerdo con el contenido cíe ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 27 como el porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina, en forma relativa a las células de control no tratadas, y demuestran una reducción dependiente de la dosis transmitida por oligonucleótido antisentido de los niveles de mARN de huntingtina. Los datos presentados son el promedio de dos experimentos. La IC50 de cada oligonucleótido antisentido también se presenta en la tabla 27 expresada en nM.
Tabla 27 Reducción dependiente de la dosis de m ARN de huntingtina en hepatocitos de múrido transgénicos BACHD Ejemplo 3: Administración sistémica de oligonucleótidos antisentido contra mARN de huntingtina en ratones BACHD De los aproximadamente 1,700 compuestos antisentido recientemente diseñados, sesenta y seis compuestos fuerón seleccionados con base en su potencia in vitro en comparación con ISIS 387916, para probarlos en clasificaciones de tolerabilidad sistémica.
Los ratones BACHD se trataron con oligonucleótidos ISIS y se evaluaron con respecto a los cambios en los niveles de marcadores metabólicos diversos, así como la inhibición del mARN de huntingtina en el hígado. Los oligonucleótidds antisentido que originaron cambios adversos en el peso corporal, peso de los órganos o en los niveles de marcadores metabólicos se consideraron como no adecuados para utilizarse en estudios adicionales. i Estudio 1 Tratamiento j Se inyectaron diecinueve grupos de cuatro ratones BACHD cada uno en forma intraperitoneal con 12.5 mg/kg de ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419629, ISIS 419637, ISIS 436684, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o I S S 444663 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de control de cuatro ratones, con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se exanguinaron para recolección de plasma, después de lo cual se llevó a cabo la dislocación cervical y se recolectaron los órganos.
Análisis de ARN Se extractó el ARN del tejido de hígado para análisis PCR de tiempo real de los niveles de ARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina muíante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles de huntingtina normales de ratón, utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS263 . Los resultados se presentan en las tablas 28 y 29 y se calcularon como el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina de humano y múrido, respectivamente, en forma relativa al control PBS. Todos los oligonucleótidós antisentido efectuaron una inhibición significativa de los niveles de mARN de huntingtina humana. ISIS 388241 tiene más de tres desacoplamientos con la mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no muestra inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 28 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina humana en ratones BACHD Tabla 29 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de múrido en ratones BACHD Medidas de peso de órganos Se midieron los pesos del hígado, bazo y riñon al final del estudio, y se presentan en la tabla 30 como un porcentaje del control salino normalizado al peso corporal.
Tabla 30 Porcentaje de cambio en el peso de órganos de ratones BACHD después de tratamiento con oligonucleótido antisentido Evaluación de función de hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las medidas de transaminasa de alanina (ALT) y transaminasa de aspartato (AST), se expresan en IU/Land, y los resultados se presentan en la tabla 31.
Tabla 31 Efecto del tratamiento de oligonucleótido antisentido en marcadores de función de hígado Estudio 2 Tratamiento Se inyectaron en forma intraperitoneal catorce grupos de cuatro ratones BACHD cada uno, con 12.5 mg/kg o 50 mg kg de ISIS 419581, ISIS 419602, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419640, ISIS 419641 o ISIS 419642 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de cuatro ratones BACHD, con 12.5 mg/kg de ISIS 387916 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de control de cuatro ratones, con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se exanguinaron para la recolección de plasma, después de jlo cual se llevó a cabo la dislocación cervical y se recolectaron los órganos.
Análisis ARN Se extractó el ARN del tejido de hígado para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles de mARN de huntingtina mutante humana, utilizando ¡el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles de huntingtina normal de ratón, utilizando Jel conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Lbs resultados se presentan en las tablas 32 y 33, y se calcularon como el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina de humano y de múrido, respectivamente, en forma relativa al control PBS.
Tabla 32 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina humana ratones BACHD Tabla 33 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de múrido en ratones BACHD Medidas de peso de los órganos Se midieron los pesos de hígado, bazo y riñon al final del estudio, y se presentan en la tabla 34 como un porcentaje del control salino normalizado al peso corporal.
Tabla 34 Porcentaje de cambio en el peso de órganos de ratones BACHD después del tratamiento de oligonucleotido antisentido Evaluación de función de hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, las concentraciones de plasma de transaminasas fueron medidas utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, N Y). Las medidas de ALT y AST se expresan en lU/Land, y los resultados se presentan en la tabla Tabla 35 Efecto de tratamiento de oligonucleotido antisentido en marcadores de función de hígado Estudio 3 Tratamiento Se inyectaron en forma intraperitoneal dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD cada uno con 12.5 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, ISIS 419641, ISIS 436645, ISIS 436649, ISIS 436668 o ISIS 436689 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de cuatro ratones BACHD, con 12.5 mg/kg de ISIS 388241 dos veces a la semana durante dos semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de control de cuatro ratones con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se exanguinaron para la recolección de plasma, después de lo cual se llevó a cabo la dislocación cervical y se recolectaron los órganos.
Análisis ARN Se extractó el ARN del tejido de hígado para análisis PCR de tiempo real de los niveles de mARN de huntingtina. Los niveles mARN de huntingtina muíante humana, se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles de huntingtina normal de ratón, utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las tablas 36 y 37, y se calcularon como el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina de humano y múrido, respectivamente, en forma relativa al control PBS. Los cuatro oligonucleótidos antisentido, efectuaron una inhibición significativa de los niveles de mARN de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 388250, ISIS 388251, ISIS 388263, ISIS 388264, y ISIS 436645 tenían más de tres desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no mostraron inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 436649, y ISIS 436689 tienen tres desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 36 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina humana en ratones BACHD Tabla 37 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de murido en ratones BACHD Medidas de peso de órganos Se midieron los pesos del hígado, bazo y riñon al final del estudio, y se presentan en la tabla 38 como un porcentaje del control salino normalizado al peso corporal. Los ratones tratados con ISIS 388263, y ISIS 436645, sufrieron de incrementos en el peso del hígado en una dosis 50 mg kg compara con el control PBS.
Tabla 38 Porcentaje de cambio en el peso de los órganos de ratones BACHD después de tratamiento de oligonucleotido antisentido Evaluación de función de hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleotidos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasas, utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las medidas de transaminasa de alanina (ALT) y transaminasa de aspartato (AST), se expresan en IU/L y los resultados se presentan en la tabla 39.
Tabla 39 Efecto del tratamiento de oligonucleótido antisentido en marcadores de función de hígado Estudio 4 Tratamiento Se inyectaron en forma intraperitoneal dieciocho grupos de cuatro ratones BACHD cada uno, con 12.5 mg kg o 50 mg/kg de ISIS 388241 , ISIS 437123, ISIS 437132, ISIS 437140, ISIS 437442, ISIS 437446, ISIS 437477, ISIS 437478, O ISIS 437490 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de cuatro ratones BACHD con 12.5 mg/kg de ISIS 387916 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de control de cuatro ratones con PBS dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se exanguinaron para recolección de plasma, después de lo cual se llevó a cabo la dislocación cervical y se recolectaron los órganos.
Análisis de ARN Se extractó el ARN del tejido de hígado para análisis POR de tiempo real de niveles de mARN de huntingtina. Se midieron los niveles de mARN de huntingtina mutante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles de huntingtina normales de ratón utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las tablas 40 y 41, y se calcularon como el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión de huntingtina de humano y múrido, respectivamente, en forma relativa al control PBS. ISIS 388241, y ISIS 437490 tienen más de tres desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 437132 tiene tres desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEO ID NO: 3), y por consiguiente no mostró inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 437123, y ISIS 437140 tienen dos desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y no muestran inhibición significativa de los mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 40 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina humana en ratones BACHD Tabla 41 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtína de múrido en ratones BACHD Medidas de peso de órganos Se midieron los pesos del hígado, bazo y riñon al final del estudio, y se presentan en la tabla 42 como un porcentaje del control salino normalizado al peso corporal.
Tabla 42 Porcentaje de cambio en el peso de órganos de ratones BACHD después de tratamiento con oligonucleotido antisentido Evaluación de función de hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en ja función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasás utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las medidas de transaminasa de alanina (ALT) y transaminasa de aspartato (AST), se expresan en IU/L y los resultados se presentan en la tabla 43.
Tabla 43 Efecto de tratamiento de oligonucleotido antisentido en marcadores de función de hígado Estudio 5 Tratamiento ',' Se inyectaron en forma intraperitoneal once grupos de i cuatro ratones BACHD cada uno, con 12.5 mg/kg de ISIS 388241 , ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436689, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 444591 o ISIS 444661 dos veces a la semana durante 2 semanas. Se inyectó en forma intraperitoneal un grupo de control de cuatro ratones con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) dos veces a la semana durante 2 semanas. Dos días después de la última dosis, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se exsanguinaron paira recolección de plasma, después de lo cual se llevó a cabo la dislocación cervical y se recolectaron los órganos.
Análisis ARN Se extractó el ARN de tejido de hígado de análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina muíante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador de humano RTS2617. Se midieron los niveles de huntingtina normal de ratón, utilizando el conjunto de sonda de cebador de ratón RTS2633. Los resultados se presentan en las tablas 44 y 45, y se calcularon como el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión e huntingtina de humano y múrido, respectivamente, en forma relativa al control PBS. Los oligonucleótidos antisentid¡o, efectuaron una inhibición significativa de los niveles de mARN de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507, y ISIS 443139 tuvieron más de tres desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3) y por consiguiente no mostraron inhibición significativa de los niveles mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 436689 tiene ¡ 3 desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEO ID NO: 3), y no muestra inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 44 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina humana en ratones BACHD Tabla 45 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de múrido en ratones BACHD Medidas de peso corporal y peso de órganos Se midieron los pesos corporales de los ratones al momento del estudio, y en forma subsecuente dos veces a la semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la tabla 46, y se expresan como un porcentaje de cambio en los pesos tomados al inicio del estudio. Los resultados indican que el tratamiento con estos oligonucleótidos no originó algún cambio adverso en el peso corporal de los ratones a lo largo del estudio.
Tabla 46 Porcentaje de cambio en el peso corporal de ratones BACHD después de tratamiento de oligonucleotido antisentido Se midieron los pesos del hígado, bazo y riñon al final del estudio, y se presentan en la tabla 47, como un porcentaje del control salino normalizado al peso corporal.
Tabla 47 Porcentaje de cambio en el peso de los órganos de ratones BACHD después del tratamiento de oligonucleótido antisentido Evaluación de función de hígado Para evaluar el Impacto de los ollgonucleótldos ISIS en la función hepática de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automática (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Y) . Las medidas de ALT y AST se expresan en IU/L. Los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina también se midieron utilizando el mismo analizador de química clínica y se expresan en g/dL. Los resultados se presentan en la tabla 48.
Tabla 48 Efecto del tratamiento de oligonucleotido antisentido en marcadores de función hepática Medida de función de riñon Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS en la función de riñon de los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea en sangre (BUN) y creatinina, utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla 49 y se expresan en mg/dL.
Tabla 49 Efecto del tratamiento de oligonucleotido antisentido en marcadores de función de riñon Medida de otros parámetros metabólicos Para evaluar el impacto de los oligonucleotidos ISIS en otras funciones metabólicas en los ratones descritos anteriormente, se midieron las concentraciones en plasma de glucosa, colesterol y triglicéridos utilizando un analizador de química clínica automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla 50 y se expresan en mg dL, y demuestran que el tratamiento con estos oligonucleotidos, no originó cambios adversos algunos en los niveles de estos marcadores metabólicos entre los grupos de control y de tratamiento.
Tabla 50 Efecto del tratamiento de oligonucleótido antisentido en marcadores metabólicos Ejemplo 4: Administración mediante bolo de oligonucleotidos antisentido contra mARN de huntingtina al estrato de ratones BACHD Se trataron ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS mediante administración con bolo a un área de cerebro definida de ratón, el estrato, con el propósito de clasificar la actividad de los oligonucleótidos en el tejido cerebral contra la expresión de expresión de mARN de huntingtina de humano y ratón.
Tratamiento y cirugía ; A grupos de cuatro ratones BACHD cada uno, se les administró ISIS 388241, ISIS 419628, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 437168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661 o ISIS 444663, suministrados como una inyección de bolo simple en concentraciones de 3 pg, 10 pg o 25 pg en el estrato.
Un grupo de control de 4 ratones BACHD, fueron tratados en forma similar con PBS. Se administró ISIS 388241 en siete grupos de 4 ratones cada uno, y los resultados presentados son el promedio de los datos derivados de 28 ratones. Se administró ISIS 419628 en 2 grupos de 4 ratones BACHD cada uno, y los resultados presentados son el promedio de los datos derivados de 8 ratones. Siete días después de la administración con bolo, los ratones fueron eutanizados utilizando isoflurano, y los órganos fueron eliminados. Los animales fueron decapitados y el cerebro fue eliminado para disección del tejido estriatal.
Análisis de ARN Se extractó el ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de niveles de mARN de huntingtina. Se midieron los niveles de mARN de huntingtina muíante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles de mARN de huntingtina normales de ratón, utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633. Los resultados de los niveles de mARN de huntingtina humana se presentan en la tabla 51, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el grupo de control PBS. Todos los oligonucleótidos antisentido efectuaron una inhibición dependiente de la dosis de los niveles de mARN de huntingtina humana. Los resultados de los niveles de mARN de huntingtina humana se presentan en la tabla 52, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el grupo de control PBS.
Las dosis efectivas (ED50) de cada oligonucleótido para mARN de huntingtina humana y mARN de huntingtina de ratón, fueron calculadas trazando las concentraciones de oligonucleótidos utilizadas versus el porcentaje de inhibición de los niveles de expresión mARN de huntingtina de cada especie, y observando las concentraciones en las cuales se logró el 50% de inhibición de la expresión de mARN de huntingtina para cada especie, en comparación con los controles correspondientes. La ED50 para cada oligonucleótido antisentido, también se presenta en las tablas 51 y 52 para mARN de huntingtina de humano y múrido, respectivamente.
Cada uno de ISIS 388241 , ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, ISIS 443139, y ISIS 444584, están desacoplados por 8 pares base o más con mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 437168, y ISIS 437441 tienen 2 desacoplamientos cada uno con el mARN de huntingtina ele múrido (SEQ ID NO: 3), y no muestran inhibición de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS 436689 tiene 3 desacoplamientos con la mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3) y no muestra inhibición significativa de lós niveles de mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 51 Porcentaje de inhibición de los niveles de mARN de huntingtina humana in vivo, y ED50 de los oligonucleótidos antisentido Tabla 52 Porcentaje de inhibición de los niveles de mARN de huntingtina de múrido in vivo, y ED50 de los oligonucleótidos antisentido Los diez compuestos marcados con un asterisco, tuvieron una ED50 mejorada con respecto a ISIS 388241.
Ejemplo 5: Ensayo para efectos neurotóxicos de administración con bolo de oiigonucleotidos antisentido en el tejido estriatal de ratas Se seleccionaron aproximadamente 30 compuestos, como teniendo alta tolerabilidad y alta potencia. Posteriormente los compuestos fueron probados mediante inyección de bolo CNS en ratas, para evaluar en forma adicional la neurotoxicidad.
Se trataron ratas Sprague-Dawley cada una con oiigonucleotidos ISIS mediante administración con bolo a un área definida del cerebro, el estrato, con el propósito 'de clasificar la inducción del marcador microglial AIFI como una medida de toxicidad CNS.
Tratamiento y cirugía A grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se les administró ISIS 387916, ISIS 388241, ISIS 419627, ISIS 419628, ISIS 419629, ISIS 419630, ISIS 419636, ISIS 419637, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 4196671, ISIS 436684, ISIS 436689, ISIS 436754, ISIS 443168, ISIS 437175, ISIS 437441, ISIS 437442, ISIS i 437507, ISIS 437527, ISIS 443139, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444591, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444615, ISIS 444618, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444658, ISIS 444659, ISIS 444660, ISIS 444661, o ISIS 444663 como una inyección de bolo simple en una concentración de 50 pg en el estrato.
Un grupo de cuatro ratas fue tratado en forma similar con PBS. Un grupo de 4 ratas fue tratado en forma similar con ISIS 104838, un oligonucleótido antisentido contra TNF-a, como un grupo de control negativo. Se administró ISIS 387916 en 4 grupos de 4 ratas cada uno, y los resultados presentados son un promedio de los datos derivados de 16 ratas. Se administró ISIS 419628 en dos grupos de 4 ratas cada uno y los resultados presentados son el promedio de los datos de 8 ratas. ISIS 419629, ISIS 444584, y ISIS 444618, los cuales tuvieron indicadores de toxicidad en el estudio de administración sistémica (Ejemplo 3) también fueron probados en este estudio. Siete días después de la administración con bolo, las ratas fueron eutanizadas utilizando isoflurano y se eliminaron los órganos. Los animales fueron decapitados y el cerebro fue eliminado para disección del tejido estriatal.
Análisis ARN de niveles de expresión AIF1 Se extractó el ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de los niveles de mARN AIF1. Se midieron los niveles AIF1 de rata utilizando el conjunto de sonda de cebador de rata rAifl_LTS00219 (secuencia directa AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 46; secuencia inversa CAATTAGGGCAACTCAG AAATAGCT, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 47; secuencia de sonda CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGAX, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 48). Los resultados fueron calculados como el porcentaje de expresión AIF1 con respecto al del control PBS, y se presentan en la tabla 53. ISIS 419629, ISIS 444584, y ISIS 444618, tuvieron indicadores tóxicos en el estudio de administración sistémica (en el Ejemplo 3), también tuvieron indicadores tóxicos en este estudio (más del 300% con respecto al control salino). Los estudios posteriores mostraron que ISIS 444584 es neurotolerable y exhibe indicadores tóxicos insignificantes (ver Ejemplo 16 y 17).
Tabla 53 Porcentaje de expresión de niveles de mARN AIF1 in como una medida de neurotoxicidad Análisis ARN para niveles de expresión de huntingtina Se extractó ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina de rata utilizando el conjunto de sonda de cebador de rata rHtt_LTS00343 (secuencia directa CAG AGCTGGTG AACCGTATCC, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 49; secuencia inversa GGCTTAAGCAGGG AGCCAAAA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 50; secuencia de sonda ACTTCATG ATGAGCTCGGAGTTCAACX, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 51). Los resultados se calcularon como el porcentaje de reducción de la expresión de huntingtina con respecto al del control PBS, y se presentan en la tabla 54. Cada uno de ISIS 388241, ISIS 436684, ISIS 436754, ISIS 437175, ISIS 437507, y ISIS 443139 estuvieron desacoplados por 6 pares base o más con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5), y por consiguiente no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de rata en comparación con el control. ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 436665, ISIS 436668, ISIS 437442, ISIS 444615, y ISIS 444627 tienen un desacoplamiento cada uno, con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5), y no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de rata en comparación con el control. ISIS 437168, y ISIS 437441 tienen 2 desacoplamientos cada uno con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5), y no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de rata en comparación con el control. IS|S 436689, y ISIS 444584 tienen 3 desacoplamientos cada uno con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5), y no muestran inhibición significativa de los niveles de mARN de rata en comparación con el control.
Tabla 54 Porcentaje de reducción de los niveles de mARN de huntingtina de rata en ratas Ejemplo 6: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra mARN de huntingtina -estudio de tolerabilidad en ratas BACHD Se compararon compuestos seleccionados con el compuesto previamente designado ISIS 388241 mediante administración ICV en ratones BACHD.
Los compuestos seleccionados más el 388241 de estándar de comparación, se seleccionaron con base en la potencia in vitro y sistémica y en la tolerabilidad sistémica, así como la potencia y tolerabilidad CNS.
Los ratones BACHD fueron tratados con oligonucleótidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) a un área del cerebro definida de ratón, el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la tolerabilidad de la dosificación ICV en ratones.
Tratamiento y cirugía Grupos de cinco ratones BACHD cada uno, fueron administrados con ISIS 388241, ISIS 437507, ISIS 443139, ISIS 419640, ISIS 419641, ISIS 419642, ISIS 444591, ISIS 436665, ISIS 436671, ISIS 444661 o ISIS 436689 en 150 pg/día suministrado ICV con bombas Alzet 2002 en un rango de 12 µ?/día durante 2 semanas. Un grupo de control de 4 ratones BACHD, fueron tratados en forma similar con PBS. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas en la siguiente forma: Los ratones fueron anestesiados individualmente con 3% de isoflurano para la implantación de la bomba. Después de dos semanas, los ratones fueron anestesiados nuevamente, y la bomba se eliminó quirúrgicamente. Posteriormente a los animales se les dejó recuperar durante dos semanas más antes de ser eutanizadosi Se tomaron semanalmente durante los períodos de tratamiento y recuperación, los pesos corporales de los ratones. Después de cuatro semanas, los ratones fueron eutanizados utilizando isoflurano y se decapitaron. Se eliminó el cerebro para la adquisición de tejido de las secciones anteriores y posteriores.
Análisis ARN Se extractó el ARN del hemisferio derecho de la corteza anterior y la sección cerebelar posterior del sitio de canulacion para análisis PCR de tiempo real de los niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina muíante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los niveles mARN de huntingtina normal de ratón fueron medidos utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633. Los resultados se calcularon como el porcentaje de inhibición de la expresión de mARN de huntingtina humana y de múrido, en comparación con el control, y se presentan en las tablas 56 y 57, respectivamente. Todos los oligonucleótidos antisentido efectuaron una inhibición significativa de los niveles mARN de huntingtina humana. ISIS 388241, ISIS 437507 y ISIS 443139 cada uno fueron desacoplados mediante 8 pares base o más con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente no mostraron inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido comparados con el control. ISIS 444591 tiene 1 desacoplamiento con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y no muestran inhibición significativa de los de mARN de múrido en comparación con el control. ISIS tiene 3 desacoplamientos con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y no muestra inhibición significativa de los niveles de mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 56 Porcentaje de reducción de los niveles mARN de huntingtiha humana en ratones BACHD mediante administración ICV de oligonucleótidos antisentido Tabla 57 Porcentaje de reducción de los niveles mARN de huntingtina de múrido en ratones BACHD, mediante administración ICV de oligonucleótidos antisentido Medida de peso corporal Se midieron los pesos corporales de los ratones en la generación del estudio y posteriormente una vez a la semana. Los pesos corporales de los ratones se presenten en la tabla 58, y se expresan como un porcentaje de cambio con respecto a los pesos tomados al inicio del estudio. Los pesos corporales fueron considerados una medida de la tolerabilidad de los ratones a la administración ICV del oligonucleótido antisentido. "n.d." significa que no hubieron datos disponibles para dicho período de tiempo.
Tabla 58 Porcentaje de cambio en peso corporal de ratones BACHD durante el tratamiento de oligonucleótido antisentido Supervivencia de los ratones La supervivencia de los ratones fue evaluada a lo largo de todo el período de estudio. La tabla 59 que se encuentra1 a continuación, muestra el patrón de supervivencia en los grupos de ratones tratados con oligonucleótidos ISIS, así como el control.
Tabla 59 Número de supervivencias durante el tratamiento de oligonucleótido antisentido Ejemplo 7: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra huntingtina en ratones C57/BL6 Se trataron ratones C57/BL6 tipo silvestre con oligonucleótidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) a un área del cerebro definida del ratón, el ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la potencia de los oligonucleótidos contra huntingtina de ratón en estos ratones.
Tratamiento y cirugía Grupos de diez ratones C57/BL6 cada uno, fueron administrados con ISIS 408737 (5' TCCTAGTGTTACATTACCGC 3' (SEQ ID NO: 52), sitio de inicio 5263 de SEQ ID NO: 3) 50 pg/día suministrado ICV con bombas Alzet 2002 en un rango de 0.5 pL/día durante 7 días o 14 días. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6, fue tratado similarmente con PBS. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas e la siguiente manera: En síntesis, se ensamblaron bombas osmóticas Alzet (Modelo 2002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bombas se rellenaron con una solución que contiene el oligonucleotido antisentido y se incubaron durante la noche a una temperatura de 37°C, 24 horas antes del implante. Los animales fueron anestesiados con 3% de isofluorano y se colocaron en una estructura estereotáctica. Después de la esterilización del sitio quirúrgico, se realizó una incisión de línea media en el cráneo, y se creó una cavidad subcutánea sobre la parte trasera, en donde se implantó una bomba osmótica llena previamente. Se elaboró un pequeño agujero pronunciado a través del cráneo arriba del ventrículo lateral derecho. Posteriormente se colocó una cánula, conectada a la bomba osmótica mediante un catéter de plástico, en el ventrículo y se pegó en el lugar utilizando adhesivo Loctite. La incisión se cerró con suturas. El oligonucleotido antisentido o PBS se infusionó durante 7 ó 14 días, después de lo cual los animales fueron eutanizados de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Institutional Animal Care and Use Committee). Se recolectaron los tejidos de cerebro y médula espinal y se congelaron en nitrógeno líquido. Antes de la congelación, el tejido del cerebro se cortó en forma transversal en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 tuvieron aproximadamente 2 mm de separación entre sí, siendo S1 el más rostral y S5 el más caudal.
Análisis de ARN y proteína Se extractó el ARN total del cerebro y médula ósea del ratón con un equipo RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para análisis PCR de tiempo real de los niveles mARN de huntingtina, utilizando un equipo de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Se llevaron a cabo reacciones Q-PCR y se analizaron en un Detector de Secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Se midieron los niveles mARN de huntingtina de ratón utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido ABI # Mm01213820_m1 (Applied Biosystems) y se normalizaron a los niveles de mARN de isomerasa A de peptidilprolilo. Los Usados fueron preparados de barras de cerebro de ratón tal como se describió anteriormente (Li S.H. y Li X.J., Métodos en Biología Molecular (2008), 217:1940-6029). Los Usados se corrieron en gel de tris- acetato 3 a 8% y se transfirieron utilizando el sistema de manchado en seco iBIot (Invitrogen). Se probaron los manchados con tubulina anti-beta (Chemicon) y anticuerpo MAB2166 monoclonal (Millipore) , que reaccionan específicamente con proteína de proteína de huntingtina de múrido. Los inmunomanchados fueron cuantif icados utilizando el software Odyssey V3.0. Los resultados se presentan en la tabla 60 como el porcentaje de reducción en comparación con el control PBS, y demuestran inhibición significativa de los niveles de mARN y proteína de huntingtina a través del oligonucleotido antisentido, tanto el día 7 como el día 14.
Tabla 60 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de múrido en ratones C57/BL6 Ejemplo 8: Administración intracerebroventricular de oligonucleotidos antisentido, contra mARN de huntingtina en monos cinomolgos Se trataron monos cinomolgo con oligonucleotidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) a un área definida del cerebro, los ventrículos laterales, con el propósito de clasificar la actividad de los oligonucleotidos en el tejido de cerebro contra expresión mARN de huntingtina.
Tratamiento y cirugía Dos grupos de 3 monos cinomolgos cada uno, fueron administrados ya sea con 0.635 mg/ml (1.5 mg/día) o 1.67 mg/ml (4 mg/día) de ISIS 436689, suministrado ICV con bombas ambulatorias individuales (Pegasus Vario), en un rango de 0.05 ml/hr durante 4 semanas. Un grupo de control de 2 monos cinomolgos, fue administrado con PBS en una forma similar. Los grupos fueron administrados ISIS 436689 en forma bilateral. A un animal se le administró ISIS 436689 en una dosis de 4 mg/día en forma unilateral al ventrículo derecho.
Los animales se dejaron en recuperación de la cirugía 10 días antes de que se llevara a cabo la infusión. Durante el período de recuperación posterior a la cirugía, los animales se mantuvieron en infusión PBS ICV en un rango de flujo de 0.05 mL/h, utilizando una bomba de infusión ambulatoria por ventrículo. Al final del período de recuperación, se conectó cada cánula a una bomba ambulatoria individual (Pegasus Vario) colocada dentro de una chaqueta de primate (Lomir, PJ-02NB). Las bombas permanecieron conectadas hasta el término del período de infusión. Después de 4 semanas de administración, los animales fueron eutanizados, y se recolectó el cerebro, hígado y riñon.
Análisis ARN de htt mARN i Se extractó el ARN del caudato anterior, caudato posterior, corteza temporal, corteza parietal, hipotálamo, cerebro medio, hipocampo y médulas espinales, así como hígado y riñon para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Los niveles mARN de huntingtina se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617 y se normalizaron a los niveles de ciclofilina A de mono. Los resultados se calcularon como porcentaje de inhibición de la expresión mARN de huntingtina en comparación con el control PBS, y se presentan en la tabla 61. ISIS 436689 efectuó una inhibición significativa de los niveles mARN de huntingtina humana en el CNS.
Tabla 61 Porcentaje de reducción de los niveles mARN de huntingtina en monos cinomolgo mediante administración ICV de oligonucleótidos antisentido n.d. sin datos Ejemplo 9: Medida de vida media de ISIS 387898 en estrato de ratones C57/BL6 mediante administración de bolo simple Ratones C57/BL6 fueron administrados con ISIS 387898 como un bolo simple al estrato con el propósito de medir la vida media y duración de acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de mARN de huntingtina en dicho tejido.
Tratamiento Se trataron cuarenta ratones C57/BL6 con ISIS 387898 (5' CTCGACTAAAGCAGGATTTC 3' (SEQ ID NO: 53); posición de inicio 4042 de SEQ ID NO: 1 y posición de inicio 4001 de SEQ ID NO: 3) suministrado como un bolo simple de 50 Mg en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5. Se trataron ocho ratones C57/BL6 de control con PBS en un procedimiento similar. Se eutanizaron grupos de 4 ratones cada uno en diversos puntos de tiempo y se extractó el tejido estriatal en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5.
Análisis ARN Se extractó el ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Los niveles mARN de huntingtina normales de ratón, se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633. Los resultados se presentan en la tabla 62, y se expresan como un porcentaje de inhibición en comparación con el grupo de control PBS el día 7. Se observó el efecto inhibidor de ISIS 387898 como prolongado durante al menos 91 días.
Tabla 62 Efecto de ISIS 387898 como una administración de bolo simple en expresión mARN de huntingtina de múrido en diversos puntos de tiempo en estrato C57/BL6 Análisis de concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: Se picaron, pesaron, homogeneizaron y extractaron tejidos de cerebro, utilizando un método de extracción de líquido-líquido de fenol/cloroformo. Esto estuvo seguido de extracción de fase sólida del sobrenadante en una columna enlazada con fenilo antes de la inyección electrocinética de electroforesis de gel capilar. Se utilizó un instrumento de electroforesis capilar P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) para análisis eletroforético capilar llenado con gel. Se detectaron picos de oligonucleótido mediante absorbancia UV en 260 nm.
Se trazó la concentración de ISIS 387898 en el cerebro (pg/g) contra la expresión de huntingtina humana como un porcentaje del control PBS (tabla 63 y figura 1). La concentración de ISIS 387898 que logra el 50% de inhibición de la expresión de mARN de huntingtina (EC50), fue calculada. Se determinó la EC50 como 0.45 pg/g. También se trazó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en el tejido de cerebro y el porcentaje correspondiente de la expresión mARN de huntingtina (tabla 64 y figura 2) y se calculó como de 21 días la vida media del oligonucleótido.
Tabla 63 Concentración de ISIS 387898 en tejido de cerebro y su efecto en expresión htt mARN como un porcentaje del control Tabla 64 Concentración dependiente del tiempo en ISIS 387898 de tejido de cerebro, y su efecto en la expresión htt mARN como un porcentaje del control Ejemplo 10: Medida de vida media de ISIS 387898 en los ventrículos laterales de ratones BACHD mediante administración ICV A ratones BACHD se les administró ISIS 387898 mediante ICV en los ventrículos laterales del cerebro, con el propósito de medir la vida media y duración de acción del oligonucíeotido antisentido contra la expresión de mARN de huntingtina en dicho tejido.
Tratamiento Se trataron veintiocho ratones BACHD con ISIS 387898 suministrado mediante administración ICV en 75 pg/día durante dos semanas, en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trataron veintiocho ratones BACHD de control con PBS, en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se eutanizaron grupos de 4 ratones cada uno, tanto de los grupos de tratamiento como de control en puntos de tiempo bisemanales, y se extractó el tejido cortical anterior en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9.
Análisis ARN Se extractó el ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación para análisis PCR de tiempo real de los niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina mutante humana, utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Se midieron los niveles mARN de huntingtina normal de ratón utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633. En la tabla 65 se presentan los niveles de expresión de mARN de huntingtina mutante humana y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el promedio del que se midió en los grupos de control PBS. En la tabla 66 se presentan niveles de expresión de mARN de huntingtina normal de múrido y se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con el promedio de los medidos en los grupos de control PBS. Se observó el efecto inhibidor de ISIS 387898 como prolongado durante 91 días.
Tabla 65 Efecto de ISIS 387898 administrado ICV en expresión mARN de huntingtina humana en diversos puntos de tiempo Tabla 66 Efecto de ISIS 387898 administrado ICV en expresión mARN de huntingtina de múrido en diversos puntos de tiempo Análisis de concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: Se procesó el tejido de cerebro en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trazó la concentración de ISIS 387898 en la corteza anterior del cerebro ^g/g), contra la inhibición de huntingtina humana como un porcentaje del control PBS (tabla 67 y figura 3), y se calculó la EC50 como 26.4 pg/g. También se trazó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en tejido de cerebro (tabla 68 y figura 4) y se calculó como de 21 días la vida media del oligonucleótido.
Tabla 67 Concentración de ISIS 387898 en tejido de cerebro y su efecto en expresión htt mARN como un porcentaje del control Tabla 68 Concentración dependiente del tiempo de ISIS 387898 en tejido de cerebro y su efecto en la expresión htt mARN como un porcentaje de control Ejemplo 11: Medida de vida media de ISIS 388241 y ISIS 443139 en los ventrículos laterales de ratones BACHD mediante administración ICV Los ratones BACHD fueron administrados con ISIS 388241 o ISIS 443139 mediante ICV en los ventrículos laterales del cerebro, con el propósito de medir la vida media y duración de acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de mARN de huntingtina en dicho tejido.
Tratamiento Se trataron veinte ratones BACHD con ISIS 38241 suministrado mediante administración ICV en 50 pg/día durante 2 semanas, en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trataron veinte ratones BACHD con ISIS 443139 suministrado mediante administración ICV en 50 pg/día durante 2 semanas, en un procedimiento similar al descrito en ; el Ejemplo 9. Se trataron veinte ratones BACHD de control con PBS en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se eutanizaron en puntos de tiempo bisemanales grupos de 4 ratones cada uno tanto de los grupos de tratamiento como de los grupos de control, y se extractó el tejido en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9.
Análisis ARN Se extractó el ARN del hemisferio derecho, tanto anterior como posterior al sitio de canulación para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina mutante humana utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2617. Los resultados i' se presentan en la tabla 69 y se expresan como un porcentaje de inhibición en comparación con el promedio del medido en los grupos de control PBS. Los efectos inhibidores tanto de ISIS 388241 como ISIS 443139 fueron observados como prolongados durante al menos 16 semanas.
Tanto ISIS 388241 como su equivalente de esqueleto mezclado, ISIS 443139, tuvieron más de 3 desacoplamientos con mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 5), y por consiguiente no mostraron inhibición significativa de los niveles mARN de múrido en comparación con el control.
Tabla 69 Efecto de ISIS 388241 y ISIS 443139 administrados ICV en expresión mARN de huntingtina humana en diversos puntos de tiempo Análisis de concentración de oligonucleótido antisentido en el cerebro: Se procesó tejido de cerebro en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 9. Se trazó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 388241 en el tejido de cerebro posterior (tabla 70 y figura 5) y se calculó la vida media del oligonucleótido como 20 días. Se trazó la concentración dependiente del tiempo de ISIS 443139 en el tejido de cerebro posterior (tabla 71 y figure 6) y se calculó la vida media del oligonucleótido como 20 días.
Tabla 70 Concentración de ISIS 384241 en tejido de cerebro y su efecto en expresión htt mARN como un porcentaje del control Tabla 71 Concentración de ISIS 443139 en tejido de cerebro y su efecto en la expresión htt mARN como un porcentaje del control Ejemplo 12: Efecto de inhibición antisentido de huntingtina humana mutante en el desempeño motor de ratones BACHD Se trataron ratones BACHD con oligonucleótidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de oligonucleótidos contra expresión de mARN de huntingtina en su desempeño motor a través de ensayo de varilla rotatoria.
Tratamiento Se llevó a cabo el ensayo de varilla rotatoria de aceleración en la varilla rotatoria Ugo Basile. Los animales se colocaron en la varilla rotatoria a una velocidad de 2 RPM, la varilla rotatoria aceleró a 40 RPM durante 5 minutos. Se registró la duración para la caída. La duración para la caída se define mediante ya sea que el animal cae de la varilla rotatoria, o detiene su corrida, se cuelga en la varilla rotatoria y rota en la misma. Se entrenaron ratones BACHD de seis meses de edad y sus crías no transgénicas para correr en la varilla rotatoria durante una semana previa al tratamiento. Esto consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una, con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. Posteriormente se trató un grupo de 15 ratones BACHD con ISIS 388241 en 50 pg/día suministrado ICV con bombas Alzet 2002 en un rango de 12 pL/día durante 2 semanas. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Se trató ün grupo de control de 14 ratones BACHD con PBS en una forma similar. Se trató un grupo de control de 9 crías no transgénicas con PBS en una forma similar.
Ensayo de desempeño de varilla rotatoria Al final del período de tratamiento, las bombas se eliminaron y dos semanas después, se llevó a cabo el primer ensayo de varilla rotatoria post-tratamiento. Se analizó el comportamiento de varilla rotatoria mensualmente hasta que los ratones tuvieron 11 meses de edad. Cada mes, los animales fueron colocados en la figura 7 durante tres corridas de prueba un día durante 2 días. Los resultados se presentan en la figura 7, así como en la tabla 72 expresados como la duración para caer en segundos. Se tomaron los valores de línea de base a los 6 meses de edad antes del tratamiento, y los puntos de tiempo proporcionados son la edad de los ratones en la cual óe llevó a cabo el ensayo. Los datos indican que el tratamiento de ratones BACHD con ISIS 388241, incrementó la duración para caer en comparación con la observada en ratones BACHD no tratados.
Tabla 72 Efecto de inhibición antisentido de mARN de huntingtina mutante en la duración para caer (seg) Ejemplo 13: Efecto de inhibición antisentido de huntingtina humana mutante y mARN de huntingtina de múrido tipo silvestre en el desempeño motor de ratones BACHD Se trataron ratones BACHD con oligonucleotidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleotidos contra expresión de mARN de huntingtina en su desempeño motor; a través del ensayo de varilla rotatoria.
Tratamiento Se llevó a cabo el ensayo de varilla rotatoria de aceleración en la varilla rotatoria Ugo Basile. Los animales se colocaron en la varilla rotatoria a una velocidad de 2 RPM, |la varilla rotatoria aceleró a 40 RPM en 5 minutos. Se registró la duración para caer. La duración para caer es definida por el animal ya sea cuando cae de la varilla rotatoria, o detiene su corrida, se cuelga en la varilla rotatoria y rota en ella. Se entrenaron ratones BACHD de dos meses de edad y sus crías no transgénicas para correr en la varilla rotatoria durante uha semana antes del tratamiento. Esto consistió en tres pruebas consecutivas de 5 minutos cada una, con un período de descanso de 20 minutos entre las pruebas. Posteriormente se trataron grupos de 17 a 21 ratones BACHD cada uno con ISIS 388241 en 50 g/día, ISIS 408737 en 75 Mg/día, o ISIS 387898 en 75 pg/día, suministrados ICV con bombas Alzet 2002 en un rango de 0.5 L/hora durante 2 semanas. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 6. Se trató un grupo de control de 20 ratones BACHD con PBS en una forma similar. También se trataron en forma similar grupos de ratones de control no transgénicos con oligonucleótidos ISIS o PBS en una forma similar.
Ensayo de desempeño de varilla rotatoria Al final del período de tratamiento, las bombas fueron eliminadas y dos semanas después, se llevó a cabo el primer ensayo de varilla rotatoria post-tratamiento. Se analizó el comportamiento de varilla rotatoria mensualmente hasta que los ratones tuvieron 10 meses de edad. Cada mes, los ratones fueron colocados en la varilla rotatoria para 3 a 5 corridas de prueba un día durante 3 días consecutivos. Los resultados se presentan en la tabla 73 expresados como la duración para caer en segundos. Los valores de línea de base a los 2 meses de edad, fueron tomados antes del tratamiento y los puntos de tiempo determinados son la edad de los ratones en la cual se llevó a cabo el ensayo. ISIS 387898 (designado en la tabla como ASO humano-ratón) es reactivo en forma cruzada con mARN de huntingtina tanto de ratón como de humano, y por consiguiente puede inhibir tanto el mARN de huntingtina mutante humana como el mARN de huntingtina de múrido tipo silvestre en los ratones. ISIS 388241 (designado en la tabla como ASO humano) dirige en forma específica el mARN de huntingtina humana y está desacoplado por 8 pares base con mARN de huntingtina de múrido. Posteriormente, ISIS 388241 puede inhibir en forma específica únicamente el mARN de huntingtina mutante humana y no el mARN de huntingtina de múrido tipo silvestre en los ratones. ISIS 408737 (designado en la tabla como ASO de ratón) dirige en forma específica el mARN de huntingtina de múrido y está desacoplado por 7 pares base con mARN de huntingtina humana. Posteriormente, ISIS 408737 puede inhibir específicamente únicamente al mARN ¡de huntingtina de múrido tipo silvestre, y no a mARN de huntingtina mutante humana en los ratones. "Tg" indica los ratones BACHD y 'No-Tg' indica los ratones de control no transgénicos.
Los resultados del estudio indican que la inhibición de la mARN de huntingtina mutante humana mediante ISIS 388241 (ASO Tg-Humano) mejoró en forma significativa el desempeño de los ratones en el ensayo de varilla rotatoria en comparación con el control (Tg-PBS). Los resultados también indican que el tratamiento de ratones con ISIS 387898 (ASO de Tg-Humano-ratón), que dirige el mARN de huntingtina tanto de humano como tipo silvestre en los ratones, no origina efectos perjudiciales algunos en el desempeño motor de los ratones, y de hecho, también mejoró en forma significativa el desempeño de varilla rotatoria en comparación con el control (Tg-PBS). Los ratones tratados con ISIS 408737 (ASO Tg-ratón) no mostraron un desempeño de varilla rotatoria mejorado en comparación con el control PBS, tal como se esperaba, ya que el oligonucleótido no dirige el mARN de huntingtina mutante. Los controles ño transgénicos fueron utilizados como controles positivos en este ensayo.
Tabla 73 Efecto de inhibición antisentido de mARN de huntingtina en la duración para caer (segundos) Ejemplo 14: Efecto de inhibición antisentido de mARN de huntingtina en la masa cerebral de ratones R6/2 Se trataron ratones R6/2 con oligonucleótidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV) con el propósito de evaluar el efecto de oligonucleótidos contra expresión de mARN de huntingtina en peso y volumen del cerebro.
Tratamiento Se alojaron ratones R6/2 en grupos de hasta 5 por jaula (genotipos mezclados, un solo sexo). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de caja-zapato con cama de madera estéril que cubre la tierra, la cual fue cambiada en forma tan frecuente como fue necesario para proporcionar a los animales una cama seca. Este ambiente básico fue enriquecido con la adición de túneles para jugar, cuna protegida y huesos de plástico para todos los ratones; es decir, la jaula enriquecida ambientalmente contiene un túnel de ratón (BioServ Product# K3323 color ámbar, certificado, transparente) un Petite Green Gumabone (BioServ Product # K3214) y un nido (Hockley et al., Ahn Neurol. 2002, 51: 235-242). Se administraron ad libitum alimento y agua a los ratones en sus jaulas domésticas.
Un grupo de diez ratones R6/2 de seis meses de edad, fue administrado 50 g/día de ISIS 388817 suministrado ICV con bombas Alzet 1004 en un rango de 0.12 µ?/hr durante 4 semanas. Un grupo de dos crías no transgénicas, fue administrado con 50 pg/día de ISIS 388817 suministrado en una forma similar. Un grupo de control de cinco ratones R6/2, fue administrado con 50 pg/día de ISIS 141923 suministrado en una forma similar. Un grupo de control de nueve ratones R6/2 fue administrado mediante PBS en una forma similar. Un grupo de ocho crías no transgénicas fue administrado mediante PBS en una forma similar. Un grupo de cuatro ratones R6/2 pre-sintomáticos, de ocho semanas de edad, no tratados, también se incluyó en este estudio.
Medida de peso cerebral Los animales fueron anestesiados con isofluorano y posteriormente sometidos a perfusión transcardial con amortiguador de fosfato de Sorenson enfriado con hielo (SPB), y se fijaron con 4% de paraformaldehído en SPB. Los cerebros fueron eliminados, y cortados con cortes coronales inmediatamente rostrales al cerebro frontal (eliminando los bulbos olfativos) e inmediatamente caudal al cerebelo (eliminando la médula espinal). El cerebro restante se pesó en mg. Los resultados se presentan en la figura 8 y la tabla 74, y demuestran el incremento en el peso de cerebro en ratones R6/2 tratados con ISIS 388817, en comparación con el control PBS.
Tabla 74 Efecto de inhibición antisentido de mARN de huntingtina mutante en peso de cerebro (mg) Ejemplo 15: Efecto de inhibición antisentido de mARN de huntingtina en desempeño de ansiedad de ratones YAC128 Ratones YAC128 fueron tratados con oligonucleotidos ISIS mediante administración intracerebroventricular (ICV), con el propósito de evaluar el efecto de los oligonucleotidos contra expresión de mARN de huntingtina en ansiedad en estos ratones, tal como se mide a través de su desempeño en los ensayos de campo abierto y elevado más laberinto.
Tratamiento A un grupo de siete ratones YAC128 de cinco meses de edad se les administró 50 pg día de ISIS 388241 suministrado ICV con bombas Alzet 1004 en un rango de 0.5 pl/hr durante 14 días. Un grupo de control de cuatro ratones YAC128, fue tratado en forma similar con PBS. Un grupo de control de ocho crías FVB/NJ no transgénicas, se incluyó en el estudio y no recibió tratamiento alguno. Los ratones fueron implantados quirúrgicamente con las bombas en la siguiente forma: en síntesis, se ensamblaron bombas osmóticas Alzet (Modelo 2002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bombas se llenaron con una solución que contiene el oligonucleótido antisentido y se incubaron durante la noche a una temperatura de 37°C, 24 horas antes del implante. Los animales fueron anestesiados con isofluorano al 3% y se colocaron en una estructura estereotáctica. Después de estabilizar el sitio quirúrgico, se realizó una incisión en la línea media en el cráneo, y se creó una cavidad subcutánea en la parte trasera, en donde se implantó una bomba osmótica llenada previamente. Se realizó un agujero pequeño pronunciado en el cráneo arriba del ventrículo lateral derecho. Posteriormente se colocó en el ventrículo una cánula, conectada, a la bomba osmótica a través de un catéter de plástico, y se pegó en el lugar utilizando adhesivo de Loctine. Se cerró la incisión con suturas. Se infusionó el oligonucleótido antisentido o PBS durante 14 días, después de lo cual las bombas fueron eliminadas. Los animales se dejaron en recuperación durante 2 semanas, después de lo cual se llevó a cabo un análisis de comportamiento, y los ratones fueron finalmente eutanizados de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Institutional Animal Care and Use Committee). Se recolectó el tejido de cerebro y médula espinal y se congeló en nitrógeno líquido. Antes de congelarse, el tejido del cerebro se cortó en forma transversal en cinco secciones (S1 , S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 tuvieron aproximadamente 2 mm de separación una de la otra, siendo SI la más rostral y S5 la más caudal.
Ensayo de campo abierto Los ratones se colocaron en una arena de campo abierto (Med Associates) que utiliza divisiones de fotorrayo para medir el movimiento horizontal y vertical en una cesión de prueba de 30 minutos. Los datos fueron analizados utilizando el software Activity Monitor para revisar el movimiento ambulatorio total dentro de la arena, y el movimiento en el centro de la arena, como una medida de ansiedad. Se esperó que los ratones de control YAC128 tardaran menos tiempo en el centro de la arena en comparación con sus crías FVB/NJ no transgénicas, menos propensas a la ansiedad. Los resultados se presentan en la figura 9 y tabla 75, e indican que el tratamiento de ratones YAC128 con oligonucleotido antisentido, disminuye la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros del ensayo de campo abierto.
Tabla 75 Efecto de inhibición antisentido de htt mARN mutante en desempeño de campo abierto de ratones YAC128 Ensayo elevado más laberinto El aparato consistió en dos ramificaciones abiertas y dos ramificaciones cerradas, que miden cada una 65 x 6.25 cm y están elevadas 50 cm arriba del piso. Los ratones se colocaron en el centro del aparato, y se registró su ubicación durante una cesión de prueba de cinco minutos. Se esperó que los ratones YAC 128 tardaran menos tiempo en las ramificaciones abiertas del aparato, en comparación con sus crías FVB/NJ no transgénicas, menos propensas a la ansiedad. Los resultados se presentan en la figura 10 y tabla 76 e indican que el tratamiento de los ratones YAC128 con oligonucleótido antisentido, disminuyó la ansiedad en estos ratones, de acuerdo con los parámetros del ensayo elevado más laberinto.
Tabla 76 Efecto de inhibición antisentido de htt mARN mutante en desempeño en elevado más laberinto de ratones YAC128 Análisis de ARN y proteína Se extractó el ARN total del cerebro y médula espinal de ratón con el equipo RNeasy Protect Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) para análisis PCR de tiempo real de los niveles mARN huntingtina utilizado el equipo de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Se llevaron a cabo reacciones Q-PCR y se analizaron en un detector de secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Se midieron los niveles mARN de huntingtina humana utilizando el conjunto de sonda de cebador humano RTS2686, y se normalizaron para niveles de mARN de isomerasa A de peptidilpropilo.
Se prepararon lisados de proteína de barras de cerebro de ratón tal como se describió previamente (Li S.H. y Li X.J., Métodos en Biología Molecular (2008), 217:1940-6029). Los Usados corrieron en un gel de tris-acetato al 3 a 8% y se transfirieron utilizando el sistema de manchado en seco iBIot (Invítrogen) . Los manchados se sondearon con tubulina antibeta (Chemicon) y anticuerpo E 48 monoclonal de ratón, que reacciona específicamente con proteína de huntingtina humana (Millipore). Los inmunomanchados fueron cuantificados utilizando el software Odyssey V3.0.
Los resultados se presentan en la tabla 77 como ¡el porcentaje de reducción en comparación con el control PBS, y demuestran inhibición significativa de los niveles de mAR y proteína de huntingtina mediante oligonucleótido antisentido.
Tabla 77 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina en ratones Ejemplo 16: Administración intracerebroventrícular de oligonucleótidos antisentido contra huntingtina en ratones C57/BL6 Se trataron ratones C57/BL6 con oligonucleótidos ISIS mediante administración intracerebroventrícular (ICV) al ventrículo lateral derecho, con el propósito de evaluar la tolerabilidad de los oligonucleotidos en estos ratones.
Tratamiento y cirugía Grupos de cinco ratones C57/BL6 cada uno fueron administrados con ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444578, ISIS 444584, ISIS 444607, ISIS 444608, ISIS 444627, ISIS 444652, ISIS 444659, ISIS 444660, o ISIS 444661 en 150 pg/día suministrados ICV con bombas Alzet 2002 en un rango de 0.5 pL/día durante 2 semanas. Un grupo de control de seis ratones C57/BL6, fue tratado en forma similar con PBS. El procedimiento para implantar las bombas y la administración de oligonucleótido, se describe en el Ejemplo 6.
Los animales se dejaron en recuperación durante dos semanas antes de ser eutanizados utilizando isoflurano. Se recolectaron los tejidos de cerebro y médula espinal y se congelaron en nitrógeno líquido. Antes de congelarse, el tejido de cerebro se cortó en forma transversal en cinco secciones (S1, S2, S3, S4 y S5) utilizando una matriz de cerebro de ratón. Las secciones 1 a 5 tuvieron aproximadamente 2 mm de separación entre sí, siendo S1 la más rostral y S5 la más caudal.
Análisis ARN Se extractó ARN total de las cortezas anteriores y posteriores del cerebro para análisis PCR de tiempo real de los niveles mARN de huntingtina, utilizando un equipo de preparación RNeasy Mini (Qiagen). Se llevaron a cabo reacciones RT-PCR en un Detector de Secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Se midieron los niveles mARN de huntingtina de ratón utilizando un conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633, y se normalizaron para niveles mARN de ciclofilina. Los resultados se presentan en la tabla 78 como un porcentaje de reducción en comparación con el control PBS. ISIS 387916, ISIS 437527, ISIS 444627 y ISIS 444652, todós tienen un desacoplamiento con el mARN de huntingtina de múrido (SEQ ID NO: 3), y por consiguiente, no muestran inhibición significativa de los niveles mARN de múrido en comparación con el control.
El marcador microglial, AIF1, también se midió mediante análisis RT-PCR utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido mAIF1_LTS00328 (secuencia directa TGGTCCCCCAGCCAAGA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 54; secuencia inversa CCCACCGTGTGACATCCA, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 55; secuencia de sonda AGCTATCTCCGAGCTGCCCTGATTGG, designada en la presente invención como SEQ ID NO: 56). Los resultados se presentan en la tabla 79, e indican que los oligonucleótidos ISIS probados, no indujeron una respuesta inflamatoria.
Tabla 78 Porcentaje de inhibición de mARN de huntingtina de múrido en comparación con el control en ratones C57/BL6 Tabla 79 Porcentaje de incremento en expresión de mARN AIF1, en comparación con el control en ratones C57/BL6 Medidas de peso corporal Se midieron los pesos corporales en intervalos regulares a lo largo del período de estudio, y se presentan en la tabla 80. Estos pesos fueron utilizados como un indicador de tolerabilidad. Los ratones tratados con ISIS 437527, ISIS 444584 y ISIS 444652 tuvieron un peso corporal consistente a lo largo de período de estudio, y se consideraron los más tolerables de todos los oligonucleótidos ISIS incluidos en el estudio, "n/a" indica que no hay datos para dicho grupo de ratones.
Tabla 80 Pesos corporales de ratones C57/BL6 después de tratamiento de oligonucleótido antisentido Ejemplo 17: Ensayo para efectos neurotóxicos de administración con bolo de oligonucleótidos antisentido en el tejido estriatal de ratas Se trataron ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos ISIS mediante administración con bolo al estrato, con el propósito de clasificar la inducción del marcador microglial AIF1 como una medida de toxicidad CNS.
Tratamiento y cirugía Cuatro grupos de ratas Sprague-Dawley fueron administradas con ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671, ISIS 437527, ISIS 444584, ISIS 444591, o ISIS 444652, suministrados como un bolo simple en una concentración de 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg.
Un grupo de cuatro ratas fue tratado en forma similar con ISIS 387916, suministrado como un bolo simple en concentraciones de 10 pg, 25 pg, 50 pg, o 75 pg. Un grupo de control de 4 ratas fue tratado en forma similar con PBS. Siete días después de la administración con bolo, las ratas fueron eutanizadas utilizando isoflurano y los órganos fueron eliminados. Los animales fueron decapitados y el cerebro fue eliminado para disección del tejido estriatal. Se colocaron un par de pinzas finas curvas en forma recta hacia abajo en el cerebro justo en la parte anterior al hipocampo para elaborar una incisión transversal en la corteza y debajo de los tejidos mediante disección despuntada. Se colocaron las puntas de otro par de pinzas finas curvas en forma recta hacia abajo a lo largo de la parte media del seno midsagital entre el hipocampo y el bulbo olfativo para elaborar una incisión longitudinal, cortando el cuerpo calloso mediante disección despuntada. Posteriormente se utilizó el primer par de pinzas para reflejar hacia atrás la esquina resultante de la corteza exponiendo el estrato y la cápsula interna, y posteriormente para diseccionar la cápsula interna fuera del estrato. Se colocó el segundo conjunto de pinzas de modo que los extremos curvos estuvieran en cualquier lado del estrato y se presionaron hacia abajo para aislar el tejido. Se utilizó el primer conjunto de pinzas para eliminar el extremo posterior del estrato, y eliminar el estrato del cerebro.
Análisis ARN de niveles de expresión AIF1 Se extractó el ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN AIF1. Se midieron los niveles AIF1 de rata utilizando el conjunto de sonda de cebador de rata rAif 1 _LTS00219. Los resultados fueron calculados como el porcentaje de expresión AIF1 con respecto al del control PBS, y se presentan en la tabla 81. Los resultados indican que ISIS 388241, ISIS 443139, ISIS 436671 , ISIS 444591 , ISIS 437527, ISIS 444584, y ISIS 444652 todos fueron bien tolerados en cerebro de rata.
Tabla 81 Porcentaje de expresión de niveles mARN AIF1 in vivo como una medida de neurotoxicidad Análisis ARN de niveles de expresión de huntingtina Se extractó ARN del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real para niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina de rata utilizando el conjunto de sonda de cebador de rata rHtt_LTS00343. Los resultados se calcularon como el porcentaje de reducción de la expresión de huntingtina con respecto a la del control PBS, y se presentan en la tabla 82. ISIS 388241 y ISIS 443139 cada uno fue desacoplado por 6 pares base o más, con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5) y por consiguiente no muestran inhibición significativa de los niveles mARN de rata en comparación con el control. ISIS 444584 tiene 3 desacoplamientos con la secuencia de gen de rata (SEQ ID NO: 5), y por consiguiente no muestra inhibición significativa de los niveles de mARN de rata en comparación con el control.
Tabla 82 Porcentaje de reducción de niveles mARN de huntingtina Ejemplo 18: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en hepatocitos de mono cinomolgo Se probaron ISIS 437527, ISIS 444584 y ISIS 444652 en hepatocitos primarios de cinomolgo en diversas dosis. Los oligonucleótidos de estándar de comparación, ISIS 387916 y ISIS 388241 también se incluyeron para comparación. Se revistieron células en una densidad de 35,000 células por depósito y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 39.0625 nM, 78.125 nM, 156.25 nM, 312.5 nM, 625 nM, 1,250 nM, 2,500 nM, 5,000 nM, 10,000 nM y 20,000 nM para cada oligonucleótido antisentido. Después de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de transcripción mARN de huntingtina mediante PCR de tiempo real cuantitativo utilizando el conjunto de sonda de cebador RTS2686. Se normalizaron los niveles de trascripción de mARN de huntingtina para contenido de ARN total, tal como se mide mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en la tabla 83 como el porcentaje de inhibición de huntingtina, en forma relativa a las células de control. El oligonucleótido de control, ISIS 141923, fue incluido en este ensayo y no demuestra inhibición de mARN de huntingtina, tal como se esperaba.
ISIS 437527, ISIS 444584 y ISIS 444652 tuvieron valores IC50 inferiores al oligonucleótido de estándar de comparación, ISIS 388241. ISIS 437527 y ISIS 444652 tienen valores IC50 bajos o más bajos que el oligonucleótido de estándar de comparación, ISIS 387916.
Tabla 83 Inhibición antisentido dependiente de la dosis de mARN de huntingtina en hepatocitos primarios de cinomolgo Ejemplo 19: Medida de vida media de oligonucleotidos ISIS en ratones BACHD mediante administración con bolo intrastriatal simple Ratones BACHD fueron administrados con oligonucleotidos ISIS como un bolo simple al estrato, con el propósito de medir la duración de acción de los oligonucleotidos antisentido contra la expresión mARN de huntingtina, o su vida media, en dicho tejido.
Tratamiento y cirugía Grupos de 25 ratones BACD fueron tratados con ISIS 388241, ISIS 436689, ISIS 436671, o ISIS 444591 , suministrado como un bolo simple de 40 en un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 4. Un grupo de control de 25 ratones BACHD, fue tratado con PBS en un procedimiento similar. En varios puntos de tiempo, 5 ratones de cada grupo fueron eutanizados y se extractó el tejido estriatal. Se colocó un par de pinzas finas curvas, en forma recta hacia abajo en el cerebro justo en la parte anterior al hipocampo, para elaborar una incisión transversal en la corteza y tejidos subyacentes mediante disección despuntada. Se colocaron las puntas de otro par de pinzas finas curvas en forma recta hacia abajo, a lo largo de la parte media del seno midsagital entre el hipocampo y el bulbo olfativo, para elaborar una incisión longitudinal, cortando la punta mediante disección. Posteriormente se utilizó el primer par de pinzas para reflejar hacia atrás la esquina resultante de la corteza, exponiendo el estrato y la cápsula interna, y posteriormente para diseccionar la cápsula interna fuera del estrato. Se colocó el segundo conjunto de pinzas, de modo que los extremos curvos estuvieran en cualquier lado del estrato, y se presionaron hacia abajo para aislar el tejido. Se utilizó el primer conjunto de fórceps para eliminar el extremo posterior del estrato y eliminar el estrato del cerebro.
Análisis de ARN Se extractó el ARN de las secciones anteriores y posteriores del tejido estriatal para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina muíante humana utilizando RTS2617. Se midieron los niveles mARN de huntingtina normal de ratón utilizando el conjunto de sonda de cebador de múrido RTS2633.
Los resultados se presentan en las tablas 84 y 85, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el promedio del grupo de control PBS en la semana 1, semana 10 y semana 20. La vida media de los oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro, fue calculada a partir de los datos de inhibición y se presenta en la tabla 86.
Tabla 84 Porcentaje de inhibición de expresión mARN de huntingtina humana en diversos puntos de tiempo Tabla 85 Porcentaje de inhibición de expresión mARN de huntingtina de ratón en diversos puntos de tiempo Tabla 86 Vida media de oligonucleótidos ISIS en la sección anterior del cerebro en ratones BACHD, después de inyección de bolo intrastriatal Medidas de peso corporal Se midieron los pesos corporales en intervalos regulares, y se presentan en la tabla 87 como un porcentaje del peso de los ratones al inicio del estudio. Estos pesos se utilizaron como un indicador de tolerabilidad. No hubieron cambios adversos en el peso corporal en cualesquiera de los ratones tratados con oligonucleótidos ISIS.
Tabla 87 Porcentaje de cambio en peso corporal de ratones BACHD después de tratamiento de oligonucleótido antisentido Ejemplo 20: Efecto de administración intratecal de ISIS 437527 en ratas Sprague Dawley Se dosificaron ratas Sprague Dawley con ISIS 437527 mediante administración intratecal (IT), ya sea como una dosis simple, dosis repetidas o infusión continua.
Tratamiento y cirugía Se anestesiaron ratas con isoflurano y se colocó un catéter de poliuretano de calibre 28 en el espacio lumbar IT de cada rata. El extremo próximo del catéter se adhirió a un pedestal de dosificación que se extendió a través de la piel para los animales en los grupos que recibieron inyecciones de bolo. El catéter para los animales del grupo que recibe infusión continua, fue adherido a una bomba ALZET (Modelo 2ML1) la cual se colocó en una cavidad subcutánea en el aspecto dorsal de cada animal. En forma post-quirúrgica, los animales recibieron una dosis intramuscular simple de sodio de ceftiofur (5 mg kg) y tartrato de butorfanol (0.05 mg/kg). Las ratas que recibieron infusión continua, comenzando a recibir inmediatamente la dosis de oligonucleótido. Los animales que podían recibir inyecciones de bolo, se dejaron en un período de recuperación quirúrgica de al menos 5 días, después de lo cual se evaluó la patencia del catéter.
Un grupo de 5 ratas Sprague Dawley fue administrado con una inyección de bolo simple de 350 g de ISIS 437527 administrado en forma intratecal. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley fue administrado con inyecciones de bolo de 120 pg de ISIS 437527 suministrado en forma intratecal tres veces en el curso de 1 semana. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley fue administrado con inyecciones de bolo de 350 pg de ISIS 437527 suministrado en forma intratecal tres veces en el curso de 1 semana. Otro grupo de 5 ratas Sprague Dawley fue administrado con 50 pg día de ISIS 437527 suministrado mediante infusión continua en una rango de 0.01 mL/hr durante 7 días. Un grupo de control de 5 ratas Sprague Dawley, fue administrado con inyecciones de bolo de PBS suministradas en forma intratecal tres veces durante el curso de 1 semana. A cada grupo se le dio un período de recuperación de 7 días, después de lo cual las ratas fueron eutanizadas. El cerebro y médula espinal de todos los grupos, fueron recolectados y analizados.
Análisis ARN de niveles de expresión de huntingtina Se extractó ARN de la corteza frontal, corteza temporal y médula cervical para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina. Se midieron los niveles mARN de huntingtina de rata utilizando el conjunto de sonda de cebador rHtt_LTS00343 normalizado a niveles de ciclofilina. Los resultados se presentan en la tabla 88, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el promedio de los grupos de control PBS.
Tabla 88 Porcentaje de inhibición de expresión mARN de huntingtiná en ratas Sprague Dawley Análisis ARN de niveles de expresión AIF1 Se extractó el ARN de la corteza frontal, corteza temporal y médula cervical para análisis PCR de tiempo real de los niveles de mARN AIF1. Los niveles AIF1 de ratas se midieron utilizando el conjunto de sonda de cebador de rata rAif 1 _LTS00219. Los resultados se calcularon como el porcentaje de expresión AIF1 con respecto al del control PBS, y se presentan en la tabla 89. Los resultados indican que las administraciones de bolo IT repetidas, conducen a inflamación en los tejidos de la médula cervical. La administración IT continua y la administración de bolo IT simple, fueron bien toleradas en las ratas.
Tabla 89 Porcentaje de expresión de niveles de mARN AIF1 en ratas Sprague Dawley como una medida de neurotoxicidad Ejemplo 21: Medida de vida media de ISIS 436689 en tejidos CNS de monos cinomolgos mediante administración intratecal.
Monos cinomolgos fueron administrados ISIS 436689 en forma intratecal (IT), con el propósito de medir la vida media y duración de acción del oligonucleótido antisentido contra la expresión de mARN de huntingtina en diversos tejidos CNS.
Tratamiento Se llevó a cabo el estudio en Northern Biomedical Research, MI. Antes del inicio del tratamiento, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de 4 semanas, durante lo cual se llevaron a cabo paneles estándar de química en suero y hematología, revisión de muestras fecales para huevos y parásitos y una prueba de tuberculosis, para clasificar los monos anormales o enfermos. A los monos se les implantaron catéteres lumbares intratecales utilizando catéteres de poliuretano, conectados a una puerta de acceso de titanio subcutánea (P.A.S. PORT®, portal Elite Plástic/Titanio con un conector de cierre Ultra). Para infusión continua, utilizando una bomba externa los animales fueron anestesiados para adherir el aparato de dosificación a la puerta. Los animales fueron tratados previamente son sulfato de atropina mediante inyección subcutánea en una dosis de 0.04 mg/kg. Aproximadamente 15 minutos después, se administró para inducir laseración, una dosis intramuscular de 8 mg/kg de HCl de cetamina. Los animales se enmascararon para un plan de anestesia quirúrgica, se intubaron y se mantuvieran aproximadamente en un rango de aproximadamente 1 L/min de oxígeno y 2% de halotano o isoflurano. Los animales recibieron una dosis intramuscular simple de 5 mg/kg de antibiótico de sodio de ceftiofur. Se elaboró una incisión cerca de la puerta para colocar el soporte de aguja modificado. La aguja modificada se colocó en la puerta y se aseguró con suturas. Al momento de la recuperación de la cirugía, se colocó en el animal una chaqueta.
Quince monos cinomolgo machos fueron administrados con 4 mg/día de ISIS 436689 en una concentración de 1.67 mg/mL y en un rango de flujo de 2.4 mL/día durante 21 días. Un grupo de control de 3 monos cinomolgos fue administrado con PBS en una forma similar durante el mismo período de tiempo. Grupos de 3 monos cada uno, se dejaron en períodos de recuperación de 1 día, 2 semanas, 4 semanas u 8 semanas, después de lo cual fueron eutanizados. Durante el período de estudio, los monos fueron observados diariamente con respecto a signos de enfermedad o dificultad.
Todos los animales fueron sedados con una inyección intramuscular de 8.0 mg/kg de cetamina HCI, se mantuvieron en una mezcla de halotano o isof lurano/oxígeno, y se les proporcionó un bolo intravenoso de heparina Na en 200 lU/kg. Los animales fueron perf usionados mediante el ventrículo cardíaco izquierdo con nitrito de sodio al 0.001% en solución salina.
Al momento del sacrificio, el cerebro fue cortado en una matriz de cerebro con un grosor de rebanada coronal de 3 mm. Se muestrearon diversas estructuras de cerebro utilizando Un punzón de biopsia de 4 mm. Se colocó una muestra de diámetro de 4 mm de cada estructura en tubos tapados en forma de rosca de 2 mL que contienen 1.0 mL de solución de estabilización de ARN ARN/afer (Qiagen, CA), se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente se congelaron. Se colocaron muestras adyacentes de 6 mm de diámetro en tubos tapados en forma de rosca 2 mL y se congelaron para análisis farmacocinético.
Se seccionó la médula espinal en secciones cervicales, torácicas y lumbares, y se tomaron secciones con un grosor de aproximadamente 3 mm de cada área de la médula espinal para análisis de ARN y farmacocinético. Estas muestras fueron procesadas en una forma similar a las de las muestras de cerebro.
Se recolectaron muestras del hígado para análisis ARN y farmacocinéticos. Estas muestras fueron procesadas en una forma similar a la del cerebro y médula espinal antes descrita. Análisis ARN Se extractó el ARN de la médula espinal lumbar, médula espinal torácica y médula espinal cervical, corteza frontal, corteza occipital, corteza cerebelar, tejido de caudato hipocampo, cerebro medio, y protuberancias para análisis PCR de tiempo real de niveles mARN de huntingtina con el conjunto de sonda de cebador RTS2617. Los resultados se midieron en las diversas secciones de la médula espinal y se presentan én la tabla 90, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el medido en el grupo de control PBS en 8 semanas. Los resultados medidos en las diversas secciones del cerebro se presentan en la tabla 91, y se expresan como el porcentaje de inhibición en comparación con el medido en el grupo de control PBS en 8 semanas.
Tabla 90 Efecto de ISIS 436689 administrado IT en expresión de mARN de huntingtina en la médula espinal en diversos puntos de tiempo Tabla 91 Efecto de ISIS 436689 administrado IT en expresión de m ARN de huntingtina en diversos tejidos de cerebro en diversos puntos de tiempo Medida de concentración de oligonucleótido mediante ELISA Se picaron tejidos (20 mg), se pesaron, se homogeneizaron antes de la extracción de líquido/líquido utilizando fenol/cloroformo. El sobrenadante se eliminó, se liofilizó y se reconstituyó en plasma EDTA humano (1 mL) antes de analizarse utilizando un procedimiento ELISA de hibridación.
Se detectó ISIS 436689 en tejidos mediante hibridación a una sonda de corte complementaria etiquetada (digoxigenina en el extremo 5' y un espaciador C18 y BioTEG en el extremo 3'). Posteriormente el complejo se capturó en una placa recubierta con neutravidina y se agregó nucleasa S1 para digerir las sondas de corte no hibridadas. Ya que ISIS 436689 protegió la sonda de corte contra la digestión, se utilizó la sonda de corte no digerida como una medida de la concentración de oligonucleótido. Se detectó la sonda de corte no digerida utilizando un anticuerpo de anti-digoxigenina conjugado para fosfatase alcalina, seguido de una lectura de substrato f luorogénico. Se midieron las concentraciones de oligonucleotido en las secciones cervicales, torácicas y lumbares de la médula espinal, y en el hígado los días 7, 20, 34 y 62 del período de recuperación, y se presentan en la tabla 92. Se calculó a partir de estos datos la vida media de ISIS 436689 en estos tejidos, y se presenta en la tabla 93. Los datos indican que el oligonucleotido estuvo concentrado principalmente en el CNS con concentraciones insignificantes en los tejidos sistémicos.
Tabla 92 Concentración (pg/g tejidos) de ISIS 436689 administrado IT en la expresión de mARN de huntingtina en diversos tejidos en diversos puntos de tiempo Tabla 93 Vida media de ISIS 436689 administrado IT en expresión mARN de huntingtina en diversos tejidos

Claims (76)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, én donde los nucleosidos enlazados comprenden al menos ; 8 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, Ó 36.
2. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la SEC ID NO: es cualesquiera del grupo que consiste en 12, 22, 28, 30, 32, ó 33.
3. El compuesto tal como se describe en .la reivindicación 1 , caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste en 15 a 25 nucleosidos enlazados.
4. El compuesto tal como se describe en ila reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste en 18 a 21 nucleosidos enlazados.
5. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde los nucleosidos enlazados comprenden al menos uha porción de 8 nucleobases contiguas complementaria con la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEC ID NO: 1.
6. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de nucleobase comprende al menos 15 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, Ó 36.
7. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque la SEC ID NO: és cualquiera del grupo que consiste en 12, 22, 28, 30, 32, ó 33.
8. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de nucleobase comprende al menos 18 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, ó 36.
9. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la SEC ID NO: es cualquiera del grupo que consiste en 12, 22, 28, 30, 32, ó 33.
10. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el oligonucleotido modificado es un oligonucleotido de hebra simple.
11. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado es al menos el 90% complementaria con la SEC ID NO 1.
12. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado es al menos el 95% complementario con la SEC ID NO 1.
13. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado es el 100% complementario con la SEC ID NO 1.
14. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una ligadura de internucleósido es una ligadura de internucleósido modificada.
15. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque la ligadura de internucleósido es una ligadura de internucleósido de fosforotioato.
16. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un nucleósido del oligonucleotido modificado comprende un azúcar modificado.
17. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.
18. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque cada uno de al menos un azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH2-N(R)-0-2' en donde R es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, o un grupo de protección.
19. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque cada uno de al menos un azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH (CH3)-0-2\
20. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-0-metoxietilo. ,
21. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos un nucleósido modificado de tetrahidropirano, en donde un anillo de tetrahidropirano reemplaza el anillo de furanosa.
22. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque cada uno de al menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura: en donde Bx es una porción de base heterocíclica opcionalmente protegida.
23. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
24. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
25. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de gap que consiste en desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos enlazados; en donde el segmento de gap se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
26. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de gap que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidós enlazados; en donde el segmento de gap se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2'-0-metoxietilo, y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura de fosforotioato.
27. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de gap que consiste en ocho desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidós enlazados; y un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidós enlazados; en donde el segmento de gap se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2'-0-metoxietilo; y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura de fosforotioato.
28. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de gap que consiste en ocho desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 5' que consiste en seis nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 3' que consiste en seis nucleósidos enlazados; en donde el segmento de gap se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-0-metoxietilo; y en donde cada ligadura de internucleósido es una ligadura de fosforotioato.
29. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
30. Una composición que comprende el compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29 o una sal del mismo, y al menos un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
31. Un método que comprende administrar a un animal el compuesto o composición tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29.
32. El método tal como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque el animal es un humano.
33. El método tal como se describe en la reivindicación 31 , caracterizado porque la administración del compuesto previene, trata, disminuye o hace lento el progreso de la enfermedad de Huntington.
34. El método tal como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque comprende la administración en conjunto del compuesto o composición y un segundo agente.
35. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque el compuesto o composición y el segundo agente se administran en forma concomitante.
36. El método tal como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque la administración es al CNS.
37. Un método para reducir la expresión de mARN o proteína de huntingtina en un animal, en donde el método comprende administrar al animal el compuesto o composición tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, para reducir la expresión de mARN o proteína de huntingtina en el animal.
38. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque el animal es un humano.
39. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque la reducción de la expresión de mARN o proteína de huntingtina, previene, trata, alivia o disminuye el progreso de la enfermedad de Huntington.
40. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque comprende administrar en conjunto el compuesto o composición y un segundo agente.
41. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque el compuesto o composición y el segundo agente se administran en forma concomitante.
42. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque la administración es al CNS.
43. Un método para tratar a un humano con la enfermedad de Huntington, en donde el método comprende identificar al humano con la enfermedad, y administrar al humano una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto o composición tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, para tratar de esta forma al humano con la enfermedad de Huntington.
44. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque el tratamiento reduce al menos uno de nerviosismo, carencia de coordinación, movimientos iniciados en forma no intencional, movimientos no complicados en forma intencional, modo de caminar no constante, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura anormal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad para masticar, dificultad para tragar, dificultad para hablar, mareos, perturbaciones del sueño, planeación dañada, flexibilidad dañada, pensamiento abstracto dañado, adquisición de reglas dañada, inicio dañado de acciones adecuadas, inhibición dañada de acciones no adecuadas, memoria a corto plazo dañada, memoria a largo plazo dañada, paranoia, desorientación, confusión, alucinación, demencia, ansiedad, depresión, afecto entorpecido, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad, ideas suicidas, masa cerebral reducida, atrofia muscular, falla cardiaca, tolerancia dañada a la glucosa, pérdida de peso, osteoporosis y atrofia testícular.
45. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque comprende administrar en conjunto el compuesto o composición y un segundo agente.
46. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el compuesto o composición y el segundo agente se administran en forma concomitante.
47. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque la administración es al CNS.
48. Un método para reducir o prevenir enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, para reducir de esta forma o prevenir enfermedad de Huntington.
49. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque comprende administrar en conjunto el compuesto o composición y un segundo agente.
50. El método tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el compuesto o composición y el segundo agente se administran en forma concomitante.
51. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque se administra al CNS.
52. Un método para disminuir un síntoma de enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un compuesto que comprende, un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado híbrida específicamente a SEC ID NO:1 , mediante lo cual se alivia un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
53. Un método para reducir el rango de progreso de un síntoma asociado con la Enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado híbrida en forma específica para SEC ID NO:1, reduciendo de esta forma el rango de progreso de un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
54. Un método para revertir la degeneración indicada con un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado híbrida en forma específica para SEC ID NO:1 , reduciendo de esta forma el rango de progreso de un síntoma de la enfermedad de Huntington en el humano.
55. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque el oligonucleotido modificado es un oligonucleotido de hebra simple.
56. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado tiene al menos el 90% de complementariedad con la SEC ID NO 1.
57. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado tiene al menos el 95% de complementariedad con la SEC ID NO 1.
58. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque la secuencia de nucleobase del oligonucleotido modificado tiene al menos el 100% de complementariedad con la SEC ID NO 1.
59. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
60. El método tal como se describe en la reivindicación 52, 53, ó 54, caracterizado porque el síntoma es al menos uno de un síntoma físico, al menos un síntoma cognitivo, al menos un síntoma psiquiátrico y al menos un síntoma periférico.
61. El método tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque la al menos un síntoma físico se selecciona del grupo que consiste en nerviosismo, carencia de coordinación, movimientos iniciados en forma no intencional, movimientos no completados en forma no intencional, modo de caminar no constante, corea, rigidez, movimientos de contorsión, postura normal, inestabilidad, expresiones faciales anormales, dificultad al masticar, dificultad al tragar dificultad al tragar, convulsiones y perturbaciones del sueño.
62. El método tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque el al menos un síntoma cognitivo se selecciona del grupo que consiste en planeación dañada, flexibilidad dañada, pensamiento abstracto dañado, adquisición de regla dañada, inicio dañado de acciones adecuadas, inhibición dañada de acciones no adecuadas, memoria a corto plazo dañada, memoria a largo plazo dañada, paranoia, desorientación, confusión, alucinación, y demencia.
63. El método tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque el al menos un síntoma psiquiátrico se selecciona del grupo que consiste en ansiedad, depresión, afecto entorpecido, egocentrismo, agresión, comportamiento compulsivo, irritabilidad e ideas suicidas.
64. El método tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque el al menos un síntoma periférico se selecciona del grupo que consiste en masa cerebral reducida, atrofia muscular, falla cardiaca, tolerancia a glucosa dañada, pérdida de peso, osteoporosis, y atrofia testicular.
65. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 52 a la 64, caracterizado porque el compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, consiste en 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde los nucleosidos enlazados comprenden al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, Ó 36.
66. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, caracterizado porque el compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, consiste en al menos 12 a 30 nucleosidos enlazados, en donde los nucleosidos enlazados comprenden al menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, ó 33.
67. Un compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, para utilizarse en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 29, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina. :
68. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad o condición es un trastorno neurológico.
69. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 68, caracterizado porque la enfermedad o condición es Enfermedad de Huntington.
70. El compuesto tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque el animal es un humano.
71. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SÉC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, ó 36, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina.
72. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, ó 36, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, p ra prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de la enfermedad de Huntington.
73. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, ó 33, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina.
74. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia mencionada en la SEC ID NO: 12, 22, 28, 30, 32, o 33, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto para prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de la enfermedad de Huntington.
75. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas complementarias dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605- 4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEC ID NO: 1, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina, mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de modo que se inhiba la expresión de huntingtina.
76. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde los nucleósidos enlazados comprenden al menos una porción de 8 nucleobases contiguas complementarias dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 4384-4403, 4605-4624, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4617-4636, 4622-4639, 4813-4832, 4814-4833, 4823-4842, 4860-4877, 4868-4887, 4925-4944, 4928-4947, 4931-4950, 4931-4948, 4955-4974, 4960-4977, 5801-5820, 5809-5828, 5809-5826, 101088-101105, 115066-115085, 4607-4626, 4608-4627, 4609-4628, 4610-4629, 4813-4832, 4862-4881, 5809-5828 y 4928-4947 de SEC ID NO: 1, para utilizarse en un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con huntingtina mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto para prevenir, tratar, aliviar, o disminuir el progreso de enfermedad de Huntington.
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