MX2012000734A

MX2012000734A - Inmunogenos destoxificados de escherichia coli.

Info

Publication number: MX2012000734A
Application number: MX2012000734A
Authority: MX
Inventors: Laura Serino; Maria Rita Fontana; Danilo Gomes Moriel
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2012-01-27
Also published as: PT2464658E; US10058600B2; CA2768343A1; US20150110830A1; EP2837386B1; EP2464658B1; EP2464658A1; US20120207777A1; SG178035A1; ES2670799T3; WO2011007257A1; CN102770443A; ES2526996T3; EP2837386A1; JP2012532626A; HRP20141270T1; DK2464658T3; SI2464658T1; US8871214B2; IL217539A0

Abstract

Variantes destoxificadas del precursor AcfD (orf3526) de E. coli se han identificado que formulan una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) nativa. Las variantes destoxificadas se pueden modificar adicionalmente para que tengan solubilidad incrementada en comparación a la proteína AcfD (orf3526) nativa.

Description

INMUNOGENOS DESTOXIFICADOS DE ESCHERICHIA COLI Campo de la Invención Esta invención se refiere a inmunización contra cepas patógenas de Escherichia coli.

Antecedentes de la Invención Tradicionalmente las cepas de E. coli se han clasificado como ya sea patógenas u organismos comensales, y las cepas patógenas entonces se subclasifican como cepas intestinales o extraintestinales . Los E. coli patógenos se analizan en más detalle en la referencia 1, y caen en varios fenotipos diferentes, es decir, un grupo de cepas de E. coli que provoca una enfermedad común usando un conjunto común de factores de virulencia. La patotipificación de las cepas es una técnica de rutina que se puede realizar de forma genotípica o fenotípicamente . Un método reciente [2] de patotipificación basado en el genotipo usa un microarreglo de ADN.

Entre las cepas intestinales, se conocen al menos seis patotipos bien descritos: enteropatógeno (EPEC, por sus siglas en inglés) , enterohemorrágico (EHEC) , enteroagregativo (EAEC, por sus siglas en inglés) , enteroinvasivo (EIEC, por sus siglas en inglés) , enterotoxigénico (ETEC, por sus siglas en inglés) y difusamente adherente (DAEC, por sus siglas en inglés) .

REF: 226996 Las cepas patógenas extraintestinales (o cepas "ExPEC" [3, 4]) de E. coli incluyen cepas uropatogenas (UPEC, por sus siglas en inglés) , cepas de meningitis neonatal ( MEC, por sus siglas en inglés) , y cepas asociadas a septicemia (SEPEC, por sus siglas en inglés) . Las ExPEC son la causa más común de infecciones del tracto urinario y una de las causas principales de miningitis neonatal y sepsis neonatal en humanos, que puede conducir a serias complicaciones y a muerte. Otros tipos de infecciones extraintestinales incluyen osteomielitis, infecciones pulmonares, intra-abdominales , de tejido blando y asociadas a dispositivos intravasculares . Otro fenotipo de ExPEC fuera de los humanos es patógeno aviar (APEC, por sus siglas en inglés) , que provoca infecciones extraintestinales en aves de corral.

La mayoría de las vacunas anteriores de ExPEC se han basado en lisados celulares o en estructuras celulares. SOLCOUROVACMR incluye diez diferentes bacterias aniquiladas térmicamente que incluyen seis cepas ExPEC. URO-VAXOMMR es una vacuna de tableta oral que contiene lisados bacterianos liofilizados de 18 cepas de E. coli seleccionadas. Baxter Vaccines desarrolló una vacuna de UTI en base a pilis de 6 a 10 diferentes cepas. Medlmmune desarrolló un producto llamado MEDI 516 en base a complejo de adhesina FimH. En contraste, las referencias 5 y 6 describen inmunógenos específicos de las cepas ExPEC que se pueden usar como la base de vacunas definidas tanto contra cepas de NMEC como de UPEC.

Es un objeto de la invención proporcionar antígenos adicionales y mejores para el uso en la inmunización contra cepas patógenas de E. coli, y de manera más particular contra patotipos intestinales (por ejemplo cepas EAEC, EIEC, EPEC y ETEC) asi como patotipos ExPEC y en particular antígeno que sea destoxificado para permitir su uso como componentes para inmunización o que se ha cortado sin reducir la respuesta inmunitaria formulada para mejorar la expresión y purificación.

Breve Descripción de la Invención Uno de los muchos antígenos descritos en la referencia 5 se anota como el precursor (orf3526) del factor D de colonización no esencial ("AcfD") (SEQ ID Nos: 7051 y 7052 en la presente SEQ ID NO:l en la presente). La referencia 5 describe la secuencia de la cepa NMEC IHE3034, y la presente invención se basa en variantes del "precursor de AcfD" ExPEC (orf3526) que se ha identificado en patotipos adicionales, incluyendo las cepas APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC. Diferente de la descripción de la referencia 5, estas variantes pueden ser particularmente útiles para tratar patotipos intestinales. De esta manera, la invención proporciona estas variantes, junto con su uso en la inmunización de pacientes contra infecciones de E. coli.

Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli donde el fragmento tiene solubilidad incrementada en comparación a la longitud completa en tanto que formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como aquella formulada por la proteína de longitud completa. Adicionalmente , esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli donde el fragmento tiene toxicidad disminuida en comparación a la proteína de longitud completa en tanto que formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como aquella formulada por la proteína de longitud completa. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli donde el fragmento formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como aquella formulada por la proteína de longitud completa en tanto que tienen características mejoradas con respecto a la purificación cuando se expresa en E. coli.

Polipéptidos Usados con la Invención La invención proporciona un polipéptido inmunogénico que comprende el polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli que comprende una mutación con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de y en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La proteína AcfD (orf3526) de E. coli puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1-19.

Las mutaciones de ejemplo que disminuyen la toxicidad incluyen una supresión de todo o una porción del dominio de zincin-metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de zincin-metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa. En ciertas modalidades, la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico. Una mutación puntual preferida es la sustitución del número de aminoácido 1305 en base a la alineación con SEQ ID NO:l.

Las supresiones de ejemplo incluyen remoción de al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al ménos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 700 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La invención proporciona un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli en donde el polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 20 a 76; (b) al menos a % de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID Nos: 20 a 76; o (c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones (supresiones, inserciones, sustituciones) de aminoácido, individuales, que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las secuencias de (a) o (b) ; y/o; (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID Nos: 20 a 76 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal (tal como para una alineación que se extiende a p aminoácidos, donde p>x, hay p-x+1 de estas ventanas) tiene al menos x«y aminoácidos alineados, idénticos, en donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99; y si x*y no es un número entero cuando se redondea hasta el número entero más cercano. en donde el polipéptido inmunogénico comprende una mutación con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

El algoritmo preferido de alineación en pares es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [7] , que usa parámetros por omisión (por ejemplo, con Penalidad de abertura de separación = 10.0, y con Penalidad de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62) . Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta neecile en el paquete EMBOSS [8] .

Estos polipéptidos incluyen otras variantes destoxificadas de SEQ ID Nos: 20 a 76, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas , homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

El valor de a se puede seleccionar de 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87.5 %, 90 %, 91 , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 , 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más.

Los polipéptidos inmunogénicos anteriores pueden contener además una supresión con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que incrementa la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli en tanto que el polipéptido inmunogénico aún formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

Las supresiones de ejemplo que incrementan la solubilidad incluyen remoción de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta la región gly-ser, la remoción de toda o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambas. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 8, en donde la supresión es la remoción de al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación a la prcteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 38 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La invención también proporciona un fragmento de polipéptido inmunogénico de un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 77 a 95; (b) al menos a % de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID Nos: 77 a 95; o (c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones (supresiones, inserciones, sustituciones) de aminoácido, individuales, que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las secuencias de (a) o (b) ; y/o; (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID Nos: 77 a 95 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal (tal que para una alineación que se extiende a p aminoácidos, donde p>x, hay p-x+1 de estas ventanas) tiene al menos x«y aminoácidos alineados, idénticos, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99; y si x«y no es un número entero entonces se redondea hasta el número entero más cercano, en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico tiene menor toxicidad que la proteína AcfD (orf3526) de E. coli y en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

El algoritmo preferido de alineación en pares es el algoritmo de alineación global de Needleman- unsch [7] , usando parámetros por omisión (por ejemplo, con Penalidad de abertura de separación = 10.0, y con Penalidad de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62) . Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [8] .

Estos polipéptidos incluyen otras variantes destoxificadas de SEQ ID Nos: 77 a 95, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas , homólogos, ortólogos, parálogos, imitantes, etc.

El valor de a se puede seleccionar de 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87.5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 , 99.5 % o más.

El fragmento de polipéptido inmunogénico en ciertas modalidades no comprenderá al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 25 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli .

El fragmento de polipéptido inmunogénico en ciertas modalidades (que se puede combinar con las modalidades precedentes) no comprenderá al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La invención proporciona además un fragmento de polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli en donde el polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 20 a 76; (b) al menos a % de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID Nos: 20 a 76; o (c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones (supresiones, inserciones, sustituciones) de aminoácido, que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las secuencias de (a) o (b) ; y/o; (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID Nos: 20 a 76 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal (tal que para una alineación que se extiende a p aminoácidos, donde p>x, hay p-x+1 de estas ventanas) tiene al menos x«y aminoácidos alineados, idénticos, en donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99; y si x»y no es un número entero entonces se redondea hasta el número entero más cercano, en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

El algoritmo preferido de alineación en pares es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [7] , que usa parámetros por omisión (por ejemplo, con Penalidad de abertura de separación = 10.0, y con Penalidad de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62) . Este algoritmo se implanta convenientemente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [8] .

Estos polipéptidos incluyen otras variantes de SEQ ID Nos: 20 a 76, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

El valor de a se puede seleccionar de 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87.5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más.

Los fragmentos de ejemplo no comprenderán al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los¾ primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 700 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

Los polipéptidos inmunogénicos anteriores pueden contener además una supresión con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli lo que incrementa la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli en tanto que el polipéptido inmunogénico aún formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

Las supresiones de ejemplo que incrementan la solubilidad incluyen remoción de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta la región gly-ser, la remoción de toda o una parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambos. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 8, en donde la supresión es la remoción de al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 38 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E.~ coli, al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La invención también proporciona un fragmento de polipéptido inmunogénico de un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 77 a 95; (b) al menos a % de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID Nos: 77 a 95; o (c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones (supresiones, inserciones, sustituciones) de aminoácido, individuales, que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las secuencias de (a) o (b) y/o; (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID Nos: 77 a 95 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal (tal como para una alineación que se extiende a p aminoácidos, donde p>x, hay p-x+1 de estas ventanas) tiene al menos x«y aminoácidos alineados, idénticos, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99; y si x*y no es un número entero entonces se redondea hasta el número entero más cercano, en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

El algoritmo preferido de alineación en pares es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [7] , usando los parámetros por omisión (por ejemplo, con Penalidad de abertura de separación = 10.0, y con Penalidad de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62) . Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta aguja en el paquete EMBOSS [8] .

Estos polipéptidos incluyen otras variantes de SEQ ID Nos: 77 a 95, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

El valor de a se puede seleccionar de 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87 .5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 , 99.5 % o más .

El fragmento de polipéptido inmunogénico en ciertas modalidades no comprenderá al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 25 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La invención proporciona adicionalmente una composición inmunogénica que comprende un fragmento de polipéptido inmunogénico de un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos a % de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID Nos: 77 a 95, en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, y en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli .

El algoritmo preferido de alineación en pares es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [7] , usando parámetros por omisión (por ejemplo, con Penalidad de abertura de separación = 10.0, y con Penalidad de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSU 62) . Este algoritmo se implementa de manera conveniente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [8] .

Estos polipéptidos incluyen otras variantes de SEQ ID Nos: 77 a 95, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas , homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

El fragmento de polipéptido inmunogénico de la composición inmunogénica en ciertas modalidades no comprenderá al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 25 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

La composición inmunogénica puede comprender además un adyuvante que en ciertas modalidades puede comprender 1-12 % en volumen de un aceite metabolizable, y 0.2 % a 2.5 % en peso de un agente emulsionante, en donde el aceite metabolizable y el agente emulsionante están presentes en la forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite sustancialmente todas las cuales son de menos de 1 micrón de diámetro; 4-5 % en volumen de escualeno, y (b) aproximadamente 1 % de un agente emulsionante que comprende monooleato de polioxietilensorbitán y trioleato de sorbitán, en donde el escualeno y el agente emulsionantes están presentes en la forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite sustancialmente todas las cuales son de menos de 1 micrón de diámetro; o MF59MR.

Los polipéptidos inmunogénicos destoxificados y fragmentos de polipéptidos inmunogénicos, anteriores, retienen de manera preferente al menos un epítopo o fragmento inmunogénico de SEQ ID Nos: 1 a 19. Un epítopo dentro de un fragmento puede ser un epítopo de célula B y/o un epítopo de célula T. Estos epítopos se pueden identificar de manera empírica (por ejemplo, PEPSCAN [9, 10] o métodos similares), o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico Jameson-Wolf [11] , planteamientos basados en matriz [12], MAPITOPE [13], TEPITOPE [14, 15], redes neurales [16], OpiMer & EpiMer [17, 18], ADEPT [19], Tsites [20], hidrofilicidad [21] , índice antigénico [22] o los métodos descritos en las referencias 23-27, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconoce por y se unen a los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos o receptores de células T, y también se pueden referir como "determinantes antigénicos" .

Los polipéptidos inmunogénicos destoxificados y fragmentos de polipéptido inmunogénico, anteriores, incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o analizados en la sección "composiciones inmunogénicas y medicamentos" posterior) , o un portador adecuado acoplado al polipéptido, induce una respuesta inmunitaria mediada por células T o anticuerpos que reconoce el polipéptido de longitud completa SED ID Nos 1 a 19, respectivamente, de los cuales se deriva el polipéptido inmunogénico .

Los polipéptidos inmunogénicos destoxificados y fragmentos de polipéptido inmunogénico, anteriores, incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o analizados en la sección "composiciones inmunogénicas y medicamentos" posterior) , o un portador adecuado acoplado al polipéptido, induce una respuesta inmunitaria mediada por células T o anticuerpos que reconoce el polipéptido de longitud completa, aislado SED ID Nos 1 a 19, respectivamente, de los cuales se deriva el fragmento inmunogénico .

Los polipéptidos inmunogénicos destoxificados y fragmentos de polipéptido inmunogénico, anteriores, incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o analizados en la sección "composiciones inmunogénicas y medicamentos" posterior) , o un portador adecuado acoplado al polipéptido, induce una respuesta inmunitaria mediada por células T o anticuerpos que reconocen el polipéptido de longitud completa, aislado SED ID Nos 1 a 19, respectivamente, del cuales se deriva el fragmento inmunogénico.

Un polipéptido destoxificado de la invención puede en comparación a cualquiera de las SEQ ID Nos 1 a 19, incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 etc.), sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones conservadoras (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada) . Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina (3) no polares, es decir, alanina, valina, leuciná, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican algunas veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto mayor en la actividad biológica.

Un polipéptido destoxificado puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 etc.), supresiones individuales de aminoácido con relación a cualquiera de SEQ ID Nos 1 a 19. De manera similar, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 etc.), inserciones (por ejemplo cada uno de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) con relación a cualquiera de SEQ ID Nos 1 a 19.

En general, cuando un polipéptido destoxificado o fragmento de polipéptido inmunogénico de la invención comprende una secuencia que no es idéntica a una completa de SEQ ID Nos 1 a 19 (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencias con <100 % de identidad de secuencia a esto, o cuando comprende un fragmento del mismo) se prefiere que el polipéptido pueda producir un anticuerpo que reconoce un polipéptido que consiste de la secuencia SEQ ID completa, es decir, el anticuerpo se une a uno o más de las SEQ ID Nos 1 a 19. Este anticuerpo puede unirse de manera específica a. SEQ ID Nos 1 a 19, respectivamente en tanto que no se une a proteínas no-AcfD (orf3526) con afinidad significativamente mayor que la afinidad no específica del anticuerpo a albúmina de suero humano como una norma de referencia de unión no específica.

Los polipéptidos usados con la invención pueden tomar varias formas (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosilada, no glicosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomérica, multimérica, en partículas, desnaturalizada, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede tener una cisteína N-terminal lipidada (por ejemplo Cys-24 de SEQ ID Nos: 1 a 19) .

Los polipéptidos usados con la invención se pueden preparar por varios medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química, etc.). Se prefieren proteínas recombinantemente expresadas .

Los polipéptidos usados con las invención se proporcionan de manera preferente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos que se presentan de forma natural) , particularmente de otros polipéptidos de E. coli o células hospedadoras , en general son al menos aproximadamente 50 % puros (en peso) , y usualmente al menos aproximadamente 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente 50 ¾, y de manera más preferente menos de aproximadamente 10 % (por ejemplo, 5 %) de una composición está constituido de otros polipéptidos expresados. De esta manera, los antígenos en las composiciones se separan del organismo entero con el cual se expresa la molécula.

Los polipéptidos usados con la invención son preferentemente polipéptidos de E. coli. Estos polipéptidos se pueden seleccionar adicionalmente de polipéptidos de E. coli NMEC, APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas .

La invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia -P-Q- o -Q-P-, en donde: -P- es una secuencia de aminoácidos como se define anteriormente y -Q-no es una secuencia como se define anteriormente, es decir, la invención proporciona proteínas de fusión. Donde el codón N-terminal de -P- no es ATG, pero este codón no está presente en el N-terminal de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido normal para ese codón en lugar de aquel como un Met. Donde este codón esté en el N-terminal de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de porciones -Q- incluyen, pero no se limitan a, marcas de histidina (es decir, Hisn donde n= 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) , una proteína de unión a maltosa, o glutationa-S-transferasa (GST) .

La invención también proporciona una proteína oligomérica que comprende un polipéptido de la invención. El oligómero puede ser un dímero, un trímero, un tetrámero, etc. El oligómero puede ser un homo-oligómero o un hetero-ligómero. Los polipéptidos en el oligómero pueden estar asociados de forma covalente o de manera no covalente .

La comparación de la respuesta inmunitaria formulada en un sujeto por el polipéptido con la respuesta inmunitaria formulada por la proteína de longitud completa se puede llevar a cabo por el uso de cualquier medio disponible para al experto en la técnica. Un método simple como se usa en los ejemplos posteriores comprende la inmunización de un sujeto modelo tal como ratón y luego estimulación con una dosis letal de E. coli. Para comparación apropiada, un experto en la técnica, seleccionará de manera natural el mismo adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund. En esta prueba, los fragmentos de polipéptido inmunogénico de la presente invención formularan una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto (por ejemplo, proporcionará sustancialmente la misma protección contra la estimulación letal) si, por ejemplo, el polipéptido proporciona al menos 70 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 80 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 85 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 90 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 95 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 97 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos 98 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, o al menos 99 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa.

La proteína AcfD (orf3526) de longitud completa contra la cual se comparará el fragmento de polipéptido inmunogénico (para solubilidad, toxicidad y respuesta inmunitaria formulada) puede ser cualquier proteína AcfD (orf3526) de E. coli representativa sin limitación SEQ ID Nos 1-19. En modalidades preferidas, la proteína AcfD (orf3526) será la proteína correspondiente de longitud completa de la cual se obtiene el fragmento de polipéptido inmunogénico .

La invención también proporciona un proceso para producir un polipéptido de la invención, que comprende el paso de cultivar una célula hospedadora transformada con ácido nucleico de la invención bajo condiciones que induzcan la expresión del polipéptido. El polipéptido entonces se puede purificar, por ejemplo, de sobrenadantes de cultivo.

La invención proporciona una célula de E. coli, que contiene un plásmido que codifica para un polipéptido de la invención. El cromosoma de la célula de E. coli puede incluir un análogo de AcfD (orf3526) , o este análogo puede estar ausente, pero en ambos casos el polipéptido de la invención se puede expresar del plásmido. El plásmido puede incluir un gen que codifica para un marcador, etc. Estos y otros detalles de plásmidos adecuados se dan posteriormente.

Aunque la expresión de los polipéptidos de la invención puede tomar lugar en una cepa de E. coli, la invención usará usualmente un hospedador heterólogo para la expresión. El hospedador heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. Los hospedadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinérea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis) , levaduras, etcétera.

La invención proporciona un proceso para producir un polipéptido de la invención, que comprende el paso de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos .

Cualquiera y todas las proteínas anteriores, polipéptidos , polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos pueden estar en cualquiera de varias formas que incluyen, sin limitación, recombinante , aislada o sustancialmente purificada (de materiales coexistentes con estas proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos en su estado natural) . Ácidos nucleicos La invención también proporciona ácido nucleico que codifica para polipéptidos y polipéptidos híbridos de la invención. También proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para uno o más polipéptidos o polipéptidos híbridos de la invención.

La invención también proporciona ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia a estas secuencias de nucleótidos. La identidad entre secuencias se determina de manera preferente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se describe anteriormente. Estos ácidos nucleicos incluyen aquellos que usan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido.

La invención también proporciona ácido nucleico que puede hibridar a estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente "severidad" . Las condiciones que incrementan la severidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica (por ejemplo, página 7.52 de referencia 211) . Los ejemplos de condiciones pertinentes incluyen (en orden de severidad creciente) : temperaturas de incubación de 25°C, 37°C, 50°C, 55°C y 68°C; concentraciones de amortiguador de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (donde SSC es amortiguador de NaCl 0.15 M y citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas amortiguadores; concentraciones de formamida de 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas, 1, 2, o más pasos de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2, o 15 minutos; y condiciones de lavado 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización es bien conocida en la técnica (ver por ejemplo, referencias 25, 26, 211, 213, etc.].

En algunas modalidades, el ácido nucleico de la invención híbrida a un objetivo o diana bajo condiciones de baja severidad, en otras modalidades, híbrida bajo condiciones de severidad intermedia; en modalidades preferidas, híbrida bajo condiciones de alta severidad. Un conjunto de ejemplo de condiciones de hibridación de baja severidad es 50°C y 10 x SSC. Un conjunto de ejemplo de condiciones de hibridación de severidad intermedia es 55 °C y 1 x SSC. Un conjunto de ejemplo de condiciones de hibridación de alta severidad es 68 °C y 0.1 x SSC.

La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para el uso como cebadores) .

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar en reacciones de hibridación (por ejemplo transferencias Northen o Southern, o en microarreglos de ácido nucleico o "chips génicos") y reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etcétera) y otras técnicas de ácido nucleico.

El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede tomar varias formas (por ejemplo, de hebra individual, de doble hebra, vectores, cebadores, sondas, marcada, etcétera) . Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero en general serán lineales. A menos que se especifique o requiera de otro modo, cualquier modalidad de la invención que utilice un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma de doble hebra como cada una de las dos formas de hebra individual complementarias que constituyen la forma de doble hebra. Los cebadores y sondas en general son de hebra individual, como son los ácidos nucleicos antisentido.

Los ácidos nucleicos de la invención se proporcionan de manera preferente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos que se presentan de forma natural) , particularmente de otros ácidos nucleicos de E. coli o célula hospedadora, en general, que son al menos aproximadamente 50 % puros (en peso), y usualmente al menos aproximadamente 90 % puros. Los ácidos nucleicos de la invención son de manera preferente ácidos nucleicos de E. coli.

Los ácidos nucleicos de la invención se puede preparar de muchas maneras, por ejemplo por síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita de ADN) en totalidad o en parte, al digerir ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción) , al unir ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas) , de bibliotecas genómicas o de ADNc, etcétera.

El ácido nucleico de la invención se puede unir a. un soporte sólido (por ejemplo, una cuenta, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de microarreglo, resina, etcétera) . El ácido nucleico de la invención se puede marcar por ejemplo, con una marca radiactiva o fluorescente, o una marca de biotina. Esto es particularmente útil donde el ácido nucleico se va a usar en técnicas de detección, por ejemplo donde el ácido nucleico es un cebador o como una sonda.

El término "ácido nucleico" incluye, en general, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/AR . También incluye análogos de ADN o ARN, tal como aquellos que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes , ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etcétera. Donde el ácido nucleico de la invención toma la forma de ARN, pueden tener o no un remate 5' .

Los ácidos nucleicos de la invención puede ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación", que se diseñan para aislamiento, propagación y repetición de nucleótidos insertados, "vectores de expresión" , que se diseñan para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora, "vectores virales", que se diseñan para dar por resultado la producción de un virus recombinante o partículas tipo virus, o "vectores de transposición" , que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos, como se menciona anteriormente. Una "célula hospedadora" , incluye una célula individual o un cultivo celular que pueden ser o ha sido un receptor de ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen progenie de una célula hospedadora individual, y la progenie no necesariamente puede ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula progenitora original, debido a cambio y/o mutación natural, accidental o deliberada. Las células hospedadoras incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con ácido nucleico de la invención.

Donde un ácido nucleico es ADN, se apreciará que "U" en una secuencia de ARN se reemplazará "T" en el ADN. De manera similar, donde un ácido nucleico es ARN, se apreciará que "T" en una secuencia de ADN se reemplazará por "U" en el ARN.

El término "complemento" o "complementariedad" cuando se usa con relación a ácidos nucleicos se refiere a apareamiento de bases de Watson-Crick . De esta manera, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) , y el complemento de T (o U) es A. También es posible usar bases tal como I (la purina inosina) , por ejemplo a pirimidinas (C o T) de complemento.

Los ácidos nucleicos de la invención se puede usar, por ejemplo: para producir polipéptidos, como sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como sondas o cebadores de ADN de hebra individual; o como oligonucleótidos que forman triple hebra.

La invención proporciona un proceso para producir ácido nucleico de la invención, en donde el ácido nucleico se sintetiza en parte en totalidad usando medios químicos.

La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y las células hospedadoras transformadas con estos vectores.

La amplificación de ácido nucleico de a acuerdo a la invención puede ser cuantitativa y/o en tiempo real.

Para ciertas modalidades de la invención, los ácidos nucleicos son de manera preferente de al menos 7 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más largos) .

Para ciertas modalidades de la invención, los ácidos nucleicos son de manera preferente de a lo mucho 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos) .

Los cebadores y sondas de la invención, y otros ácidos nucleicos usados para hibridación, son manera preferente de entre 10 y 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos).

Composiciones y Medicamentos Inmunogénicos Los polipéptidos de la invención son útiles como ingredientes activos (inmunógenos) en composiciones inmunogénicas , y estas composiciones pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo a la invención, pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para impedir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección) , pero típicamente serán profilácticas.

Las composiciones inmunogénicas serán farmacéuticamente aceptables. Usualmente, incluirán componentes además de los antígenos por ejemplo, incluirán típicamente uno o más portadores, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Un análisis completo de los portadores y excipientes está disponible en la referencia 208. Los análisis completos de adyuvantes de vacunas están disponibles en las referencias 30 y 31.

Las composiciones se administrarán en general a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se elaboran en forma acuosa, entonces se rellenan y distribuyen y administran también en una forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la elaboración y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento del. De esta manera, una composición de la invención se puede secar, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservadores tal como tiomersal o 2-fenoxietanol . Sin embargo, se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre (es decir, menos de 5µ?/p?1) material mercurial por ejemplo, libre de tiomersal. Son más preferidas las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren de forma particular vacunas libres de conservador.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector a la temperatura .

Para la controlar la tonicidad, se prefiere una sal fisiológica, tal como una sal sódica. Se prefiere cloruro de sodio (NaCl) , que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl . Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etcétera.

En general, las composiciones tendrán una osmolaridad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, de manera preferente entre 240-360 mOsm/kg, y caerán de manera más preferente dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más amortiguadores. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato, un amortiguador Tris, un amortiguador de borato, un amortiguador de. succinato, un amortiguador de histidina (particularmente, con un adyuvante de hidróxido de aluminio), o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20mM.

El pH de una composición estará en general entre 5.0 y 8.1, y de manera más típica entre 6.0 y 8.0, por ej emplo 6.5 y 7.5 o entre 7.0 y 7.8.

La composición es de manera preferente estéril. La composición es manera preferente no pirogénica por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida normal) por dosis, y de manera preferente <0.1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización individual, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un equipo de "múltiples dosis"). La inclusión de un conservador se prefiere en arreglos de múltiples dosis. Como una alternativa (o además) de incluir un conservador en las composiciones de múltiples dosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para remoción del material .

Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosis de aproximadamente 0.5 mi, aunque se pueden administrar medias dosis (es decir, aproximadamente 0.25 mi) a niños.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunoreguladores . De manera preferente, uno o más de los agentes inmunoreguladores incluyen uno o más adyuvantes . Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2 , analizados adicionalmente más adelante. Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: A. Composiciones que Contienen Mineral Las composiciones que contienen mineral adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tal como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de estas) . Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" descritas en la referencia 32) . Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etcétera, con las sales que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etcétera) . Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen mineral también se pueden formular como una partícula de sal de metálica [33] .

Se pueden usar adyuvantes conocidos tal como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan sólo por conveniencia, puesto que no es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (ver por ejemplo, capítulo 9 de la referencia 30) . La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o "fosfato" que son de uso en general como coadyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que usualmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que también contienen frecuentemente una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio) . Se pueden obtener por precipitación, y las condiciones de reacción y concentraciones durante la precipitación tienen influencia en el grado de sustitución de fosfato para hidroxilo en la sal .

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se ve en micrografías electrónicas de transmisión) es típica para adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pl de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente de aproximadamente 11, es decir, el adyuvante mismo tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han reportado capacidades absorbentes de entre 1.8-2.6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7.4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar de P04/A1 entre 0.3 y 1.2, de manera preferente entre 0.8 y 1.2 y de manera más preferente 0.95±0.1. El fosfato de aluminio en general, será amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato . Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de P04/A1 entre 0.84 y 0.92, incluido a 0.6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio está en general en partículas (por ejemplo, morfología tipo placa como se ve en micrografías electrónicas de transmisión) . Los diámetros típicos , de las partículas están en el intervalo de 0.5-20µp? (por ejemplo, aproximadamente de 5-10µ??) después de cualquier adsorción de antígeno. Las capacidades adsorbentes de entre 0.7-1.5 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7.4 se han reportado para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC, por sus siglas en inglés) de fosfato de aluminio está relacionado de forma inversa al grado de sustitución de fosfato por hidroxilo y esté grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y de la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones libres de fosfato en solución (más fosfato = más PZC ácido) o al adicionar un amortiguador tal como un amortiguador de histidina (que hace al PZC más básico) . Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo a la invención tendrá en general un PZC de entre 4.0 y 7.0, de manera más preferente entre 5.0 y 6.5, por ejemplo aproximadamente de 5.7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la invención puede contener un amortiguador (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un amortiguador Tris) , pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones preferentemente estéril y libre de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato, acuosos, libres, por ejemplo presentes a una concentración de entre 1.0 y 20 mM, de manera preferente entre 5 y 15 mM, y de manera más preferente aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

La invención puede usar una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo una relación en peso de al menos: 2:1 por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8 : 1 , >9:1, etcétera.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es de manera preferente menos de 10 mg/ml por ejemplo <5mg/ml, <4mg/ml, 3mg/ml, 2mg/ml, 1 mg/ml, etcétera. Un intervalo preferido está entre 0.3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0.85mg/dosis .

B. Emulsiones de Aceite Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 [Capítulo 10 de referencia 27, ver también referencia 31] (5 % de escualeno, 0.5 % de Tween 80 y 0.5 % de Span 85, formulado en partículas de submicrones usando un microfluidizador) . El adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés), también se pueden usar.

Se conocen varios adyuvantes de emulsión de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un agente tensioactivo, con los aceites y agentes tensioactivos que son biodegradables (metabolizables) y biocompatibles . Las gotas de aceite en la emulsión en general son de menos de 5µ?t? de diámetro, y de manera ideal tiene un diámetro de sub-micrones, con estos tamaños pequeños que se logran con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Las gotas con un tamaño menor de 220 nm se prefirieren, puesto que se pueden someter a esterilización en filtro.

La emulsión puede comprender aceites, tal como aquellos de una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. Aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites nuez. Se puede usar aceite de jojoba por ejemplo, obtenido de frijol de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de ajonjolí, y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos cereales tal como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1, 2-propanodiol, en tanto que no se presentan de manera natural en los aceites de semilla, se pueden preparar por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados iniciando de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto se pueden usar en la práctica de la invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de pescados contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de esperma de ballena tal como el esperma ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en la presente. Se sintetizan bioquímicamente varios aceites de cadena ramificada en unidades de isopreno de 5 carbonos y en general se refieren como terpenoides . El aceite de hígado de tiburón contiene terpenoides ramificados, insaturados conocidos como escualeno, 2,6,10,15,19, 23-hexametil-2 , 6 , 10, 14 , 18 , 22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en la presente. El escualeno, el análogo saturado de escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualáno, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferóles (ver posteriormente) . Se pueden usar mezclas de aceites .

Los agentes tensioactivos se pueden clasificar por su "HLB" (equilibrio hidrófilo/lipófilo) . Los agentes tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, de manera preferente al menos 15, y de manera más preferente al menos 16. La invención se puede usar con agentes tensioactivos, que incluyen pero no se limitan a: los agentes tensioactivos de ésteres de polioxietilen-sorbitan (referidos comúnmente como los Tweens) , especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) , y/o óxido de butileno (BO) , vendidos bajo el nombre comercial DowfaxMR, tal como copolímeros de bloque lineales de EO/PO; octoxinoles, que puede variar en el número de grupos repetitivos etoxi (oxi-1, 2-etanodiilo) , con octoxinol-9 (Tritón X-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol) que es de interés particular; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; fosfolípidos tal como fosfatidilcolina (lecitina) , etoxilatos de nonilfenol, tal como la serie TergitolMR NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, esteárico y oleílico (conocidos como agentes tensioactivos Brij ) , tal como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30) y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los SPAN), tal como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Se prefieren agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos preferidos para incluir en emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitan) , Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Tritón X-100.

Se pueden usar mezclas de agentes tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitan tal como monooleato de polioxietilen-sorbitan (Tween 80) y también es adecuado un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X- 100) . Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilen-sorbitan y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de agentes tensioactivos (% en peso) son: éster de polioxietilen-sorbitan (tal como Tween 80) 0.01 a 1 %, en particular aproximadamente 0.1 %; octil- o nonilfenoxi-polioxietanoles (tal como Tritón X-100, u otros detergentes en la serie Tritón) 0.001 a 0.1 %, en particular 0.005 a 0.02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0.1 a 20 %, de manera preferente 0.1 a 10 % y en particular 0.1 a 1 % o aproximadamente 0.5 %.

Los adyuvantes de emulsión preferidos tienen un tamaño promedio de gota de <1 µt? por ejemplo <750nm, <500nm, <400nm, <300nm, <250nm, <220nm, <200nm, o más pequeño. Estos tamaños de gota se pueden lograr de manera conveniente por técnicas tal como microfluidisación.

Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a: - Una emulsión de submicrones de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0.5 % polisorbato 80 y aproximadamente 0.5 % de Span 85. En términos de peso, estas relaciones llegan a ser 4.3 % de escualeno, 0.5 % de polisorbato 80 y 0.48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como ' F59' [35-37] , como se describe en más detalle en el capítulo 10 de la referencia 38 y capítulo 12 de la referencia 39. La emulsión MF59 incluye de manera ventajosa iones citrato, por ejemplo amortiguador de citrato de sodio 10 mM.

- Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salida amortiguada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo a 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0.3 a 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno : tocoferol es de manera preferente <1 puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes a una relación en volumen de aproximadamente 5:2. Esta emulsión se puede producir al disolver Tween 80 en PBS para dar una solución al 2 %, luego mezclar 90 mi de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 mi de escualeno) , luego microfluidizar la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite de submicrones, por ejemplo con un diámetro promedio de entre 100 y 250nm, de manera preferente aproximadamente 180nm.

- Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y un detergente Tritón (por ejemplo Tritón X-100) . La emulsión también puede incluir u 3d-MPL (ver posteriormente) . La emulsión puede contener un amortiguador de fosfato.

- Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo polisorbato 80) , un detergente Tritón (por ejemplo Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo un succinato de a- tocoferol) . La emulsión puede incluir estos tres componentes a una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo 750 g/ml de polisorbato 80, 110 ug/ml de Tritón X-100 y 100 g/ml de succinato de a-tocoferol) , y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver posteriormente) . La fase acuosa puede contener un amortiguador de fosfato.

Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PluronicMR L121"). La emulsión se puede formula en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4. Esta emulsión es un vehículo de distribución útil para muramil-dipéptidos , y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [40] (0.05-1% de Thr-MDP, 5% de escualeno, 2.5% de Pluronic L 121 y 0.2% de polisorbato 80) . También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" : [41] (5% de escualeno, 1.25% de Pluronic L 121 y 0.2% polisorbato 80) . Se prefiere la microfluidización.

- Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un agente tensioactivo no iónico hidrófilo de polioxietileno-alquil-éter (por ejemplo éter cetoestarílico de polioxietileno (12) y un agente tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo éster de sorbitan o éster de manida, tal como monoleato de sorbitan o "Span 80") . La emulsión es preferentemente termoreversible y/o tiene al menos 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm [42] . La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo un azúcar tal como dodecilmaltosida y/o sacaros) ; y/o un alquilpoliglicósido . Estas emulsiones se pueden liofilizar.

- Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [43] . La concentración final (en peso) de estos componentes en vacunas con adyuvante son 5 % de escualeno, 4 % de poloxámero 105 (poliol plurónico) y 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico) .

- Una emulsión que tiene de 0.5-50 % de un aceite, 0.1-10 % de un fosfolípido, y 0.05-5 % de un agente tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 44, los componentes preferidos de fosfolípidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol , fosfatidilglicerol , ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina . Los tamaños submicrónicos de gota son ventajosos.

- Una emulsión de aceite en agua de submicrones de un aceite no metablizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un agente tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80) . Se pueden incluir aditivos, tal como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipofilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 45, producido por la adición de amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo de ácido glucurónico) , bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) ropanodiamina .

- Una emulsión en la cual están asociados una saponina (por ejemplo QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo un colesterol) como micelas helicoidales [46] .

- Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol grado etoxilado lipófilo no iónico, y un agente tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilen-polioxipropileno) [47] .

- Una emulsión que comprende un aceite mineral, µ? alcohol graso etoxilado, hidrófilo, no iónico, y un agente tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno [47] .

En algunas modalidades, se puede mezclar una emulsión con antígeno de forma extemporánea, en el momento de la distribución, y de esta manera, el adyuvante y el antígeno se puede mantener de forma separada en una vacuna envasada o distribuida, lista para formulación final en el momento del uso. En otras modalidades, una emulsión se mezcla con antígeno durante la elaboración, y de esta manera la composición se envasa en una forma líquida con adyuvante. El antígeno estará en general en una forma acuosa, tal que la vacuna se prepare finalmente al mezclar los líquidos. La relación en volumen de los dos líquidos para mezclado puede variar (por ejemplo entre 5:1 y 1:5) pero en general es aproximadamente 1:1. Donde se dan concentraciones de componentes en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición no diluida, y la concentración después del mezclado con una solución de antígeno disminuirá de esta manera .

Donde una composición incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los OÍ, ß, ?, d, e o ? tocoferóles, pero se prefieren a-tocoferóles . El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tal como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se pueden usar tanto D-a-tocoferol como DL- -tocoferol . Los tocoferóles incluyen de manera ventajosa en vacunas para uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo con edad de 60 años o más grande) debido a que se ha reportado que la vitamina E tiene un efecto positivo en la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes [44] . También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [45] . Una a-tocoferol preferida es DL-OÍ-tocoferol , y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. La sal de succinato se ha contrato que coopera con ligandos relacionados a TF ?? vivo.

C. Formulaciones de Saponina [capítulo 22 de referencia 30] También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de esterol-glicósidos y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces y aún flores de una amplia variedad de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol de Molina Quillaia saponaria se ha estudiado ampliamente como adyuvante . La saponina también se puede obtener de forma comercial de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) , y Saponaria officianalis (raíz de jabón) . Las formulaciones con adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como formulaciones de lípidos, tal como ISCOM. El QS21 se comercializa como StimulonR.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. De manera preferente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 46. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [51] .

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM, por sus siglas en inglés) [capítulo 23 de referencia 30] . Los ISCOM incluyen también típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Se puede usar cualquier saponina conocida en los ISCOM. De manera preferente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 51-53. Opcionalmente, los ISCOMS pueden estar desprovistos de detergente adicional [54] .

En la referencia 55 y 56 se puede encontrar una revisión de desarrollo de adyuvantes basados en saponina.

D. Virosomas y Partículas Tipo Virus - También se pueden usar virosomas y partículas tipo virus (VLP, por sus siglas en inglés) como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. En general no son patógenos, no son replicantes y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser producidas de forma recombinante o se aislan de los virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en los virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas de virus de influenza (tal como HA o NA) , virus de Hepatitis B (tal como proteína núcleo o capsida) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de Enfermedad de Pies y Boca, Retrovirus, virus de Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, ARN- fagos, ?ß-fago (tal como proteínas de cubierta) , GA-fago, fr-fago. Fago AP205, y Ty (tal como proteína pl de Ty de retrotransposon) . Las VLP se analizan adicionalmente en las referencias 57-62. Los virosomas se analizan adicionalmente por ejemplo en la referencia 63.

E. Derivados Bacterianos o Microbianos Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tal como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , Derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificados de estos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil-lípido A (MPL) y MPL 3 -O-deacilado (3dMPL) . El 3dMPL es una mezcla de monofosforil-lípido A 3 -des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de "partícula pequeña" del monofosforil-lípido A 3 -Des-O-acilado se describe en la referencia 64. Estas "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas estériles a través de una membrana de 0.22 [64] . Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil-lípido A, tal como derivados de aminioalquil-glucosaminida-fosfato , por ejemplo RC-529 [65, 66].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 67 y 68.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso, adyuvantes de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citocina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también se han mostrado que son inmunoestimuladores.

El CpG puede incluir modificaciones de nucleótidos/análogos tal como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de hebra individual . Las referencias 69, 70 y 71 describen posibles sustituciones análogas por ejemplo reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina . El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se analiza adicionalmente en las referencias 72-77.

La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [78] . La secuencia de CpG puede se específica para inducir una respuesta inmunitaria Thl, tal como un CpG-AODN, o puede ser más específico para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B ODN se analizan en las referencias 79-81. De manera preferente, el CpG es un CpG-A ODN.

De manera preferente, el oligonucleótido está construido de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos de CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, referencias 78 y 82-84.

Un adyuvante útil de CpG es CpG7909, también conocido como ProMuneMR (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como una alternativa, o además, a usar secuencia de CpG, se pueden usar secuencias de TpG [85] , y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos de CpG no metilados. El oligonucleótidos inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de timidina (por ejemplo TTTT, como se describe en la referencia 85) , y/o puede tener una composición de nucleótidos con ->25 de timidina (por ejemplo >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de citosina (por ejemplo CCCC, como se describe en la referencia 85) , y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25 % de citosina (por ejemplo >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Típicamente los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimuladores se conoce como IC-31MR [86] . De esta manera, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y de manera preferente múltiple) motivos Cpl (es decir, una citosina enlazadas a una inosina para formar un dinucleótido) , y (ii) un polímero catiónico tal como un oligopéptido (por ejemplo entre 5-20 aminoácidos) que incluyen al menos una (y de manera preferente múltiples) secuencias tripeptídicas de Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia 26-mer 5'-(IC) i3-3' (SEQ ID NO: 110). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 11-mer KLKLLLLL LK (SEQ ID NO: 111) .

Se pueden usar toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y derivados desoxificados de las mismas, adyuvantes en la invención. De manera preferente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina "LT" térmicamente lábil de E. coli) , cólera ("CT"), o pertussis ("PT"). El uso de toxinas ADP-ribosilantes destoxificadas, adyuvantes mucosos se describe en la referencia 87 y como adyuvantes parenterales en la referencia 88. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende tanto subunidades A como B. De manera preferente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante ; de manera preferente, la subunidad B no está mutada. De manera preferente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72, y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en la referencia 89-96. Un mutante CT útil es CT-E29H [97] . La referencia numérica para las sustituciones de aminoácido se basa preferentemente en las alineaciones de la subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la referencia 98, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad sólo para el propósito de la alineación y numeración de aminoácidos de la presente.

F. Inmunomoduladores Humanos Los inmunoestimuladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citosinas, tal como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [99], etc.) [100], interferones (por ejemplo interferon-?) , factor estimulador de colonia de macrófagos, y factor de necrosis tumoral . Un inmunomodulador preferido es IL-12.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos, adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [101] o mucoadhesivos tal como derivados reticulados de poli (ácido acrílico) , alcohol polivinílico, polivinil-pirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa .

También se pueden usar quitosan y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [102] .

H. Microparticulas También se pueden usar microparticulas como adyuvantes en la invención. Las microparticulas (es decir, una partícula con un diámetro de -lOOnm a ~150µp?, de manera más preferente de un diámetro de ~200nm a ~30pm, y de manera más preferente un diámetro de ~500nm a -??µ??) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli ( -hidroxi-ácidb) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli ( lactido-co-glicolido) son preferidos, opcionalmente tratados para tener una superficie de carga negativa (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de referencia 30) Los ejemplos de formulaciones de liposoma adecuadas para el uso como adyuvantes se describen en las referencias 103-105.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [106] . Estas formulaciones incluyen además agentes tensioactivos de éster de polioxietileno-sorbitan en combinación con un octoxinol [107] así como agentes tensioactivos de éster o éter de polioxietileno-alquilo en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [108] . Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-lauril (laureth 9) , éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxitileno-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo, y éter de polioxietilen-23 - laurilo .

K. Fosfazenos Se puede usar un fosfazeno, tal como poli [di (carboxilatofenoxi) fosfazeno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en las referencias 109-110.

L. Péptidos de Muramilo Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (l' -2'-dipalmitoil-sn-glicero-3 -hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) . M. Compuestos de Imidazoquinolona Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen Imiquimod ("R-837") [111, 112], Resiquimod ("R-848") [113] , y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato) . Los detalles adicionales a cerca de las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras se pueden encontrar en referencias 114 a 118.

N. Ureas Sustituidas Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de la fórmula I, II o III, o sales de los mismos : 1 II III .x'-n'-v' / A HO-P=0 0=P-0H Z'^ -í=° 0=1—0"f" *° Hi¾ ¿ íh r K r- .

Como se define en la referencia 119, tal como ' ER 803058', N ER 803732', ' ER 804053', ER 804058', ' ER 804059', ' ER 804442', ' ER 804680', ' ER 804764', ER 803022 o 'ER 804057' por ejemplo: o -p—o O N» UN v_ T T o ER-803022: O O. Adyuvantes Adicionales Los adyuvantes adicionales que se pueden usar con la invención incluyen: Un derivado de fosfato de aminoalquil-glucosaminida, tal como RC-529 [120, 121] .

Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como aquellos descritos en la referencia 122. Los métodos para formular, elaborar y examinar compuestos activos también se describen en la referencia 122. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica -humana para la producción de citocinas, tal como TNF - OÍ .

- Un compuesto de triptantrina, tal como aquellos descritos en la referencia 123. Los métodos para formular, elaborar y examinar compuestos activos también se describen en la referencia 123. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-a.

Un análogo de nucleósido, tal como: (a) asatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina) : y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA- 025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos descritos en las referencias 124 a 126, Loxoribina ( 7 -alil- 8 -oxoguanosina) [127] .

- Compuestos descritos en la referencia 128, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indol-diona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ) , compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol-quinolinona (ABIQ) [129, 130] , compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de Pirrol [131] , compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina , y compuestos de benzazol [132] .

- Compuestos que contienen lípidos enlazados a una estructura acíclica que contiene fosfato, tal como el agonista de TLR4 E5564 [133, 134] : Polímero de polioxidonio [135, 136] u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado. - 5 ' -monofosfato de metil- inosina ("MI P") [137] .

- Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilado [138] , tal como uno que tiene la fórmula: CH2OH donde R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo, (por ejemplo cicloalquilo) , alquenilo, alquinilo y arilo, rectos o ramificados, insustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3 -epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3 , 7 -diepi/ -casuarina, etc.

- Un ligando CDld, tal como a-glicosilceramida [139-146] (por ejemplo -galactosilceramida) , -glicosilceramidas que contienen fitosfingosina OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-l-0- ( -D-galactopiranosil) -2- (N-hexacosanoilamino) -1, 3 , 4 -octadecanotriol] , CRONY-101, 3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

- Una gamma-inulina [147] o derivado de la misma, tal como algammulina.

¦PhJsCTlj Combinaciones de Adyuvantes La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes composiciones de adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [148] (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [117] ; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [150] ; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [151]; (6) SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0.4 % de Tween 80MR, 5 % de polímero de bloque plurónico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicrones o sometido vórtice para generar una emulsión con tamaño más grande de partícula. (7) sistema adyuvante RibiMR (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2 % de escualeno, 0.2 % de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , trehalosa-dimicolato (TDM) , y estructura de pared celular (CWS) , de manera preferente MPL + CWS (DetoxMR) : y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) .

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores se describen en el capitulo 7 de la referencia 30. " El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio se prefiere de forma particular, y los antigenos se adsorben en general en estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones preferidas de adyuvantes incluyen combinaciones de adyuvantes de Thl y Th2 tal como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Las composiciones de la invención se pueden producir tanto una respuesta inmunitaria mediada por células así como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferentemente anticuerpos de duración prolongada (por ejemplo neutralizadores) y una inmunidad mediadas por célula que pueda responder rápidamente en la exposición a pneumococos .

En general, se piensa que son necesarios dos tipos de células T, células CD4 y CD8, para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral . Las células T CD8 pueden expresar un co-receptor de CD8 y se refieren comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL) . Las células T CD8 son capaces de ser reconocidas o interactuar con antígenos exhibidos en las moléculas de MHC Clase I .

Las células T CD4 pueden expresar un co-receptor de CD4 y se refieren comúnmente como células auxiliares T. las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas MHC clase II. En la interacción con una molécula de MHC clase II, las células CD4 pueden segregar factores tal como citocinas. Estas citocinas segregadas pueden activar células B, células T citotóxicas, macrófagos, y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Las células T auxiliares o células CD4+ positiva se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH y fenotipo TH2 que difieren en su función efectora y de citocina.

Las células THl activadas mejoran la inmunidad celular (incluyendo un incremento en la producción de CTL específicas del antígeno) y por lo tanto son de valor particular en la respuesta a infecciones intracelulares . Las células THl activadas pueden segregar uno o más de IL-2, IFN-?, y TNF-ß. Una respuesta inmunitaria de THl puede dar por resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (aniquiladoras naturales) , y células T citotóxicas CD8 (CTL) . Una respuesta inmunitaria de THl también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de células B y T con IL-12. Las células B estimuladas con THl pueden segregar IgG2a.

Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y por lo tanto son de valor a responder a infecciones extracelulares . Las células TH2 activadas pueden segregar una o más de IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10. Una respuesta inmunitaria de TH2 puede dar por resultado la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria para protección futura.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria de THl mejorada y una respuesta inmunitaria de TH2.

Una respuesta inmunitaria de THl puede incluir uno o más de un incremento en la CTL, un incremento en una o más de la citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria con THl (tal como IL-2, IFN-?, e TNF-ß), un incremento en macrófagos activados, un incremento en actividad de N , o un incremento en la producción de IgG2a. De manera preferente, la respuesta inmunitaria de THl mejorada incluirá un incremento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmunitaria de THl se puede producir usando un adyuvante de THl. Un adyuvante de THl producirá en general niveles incrementados de producción de IgG2a con relación a la inmunización del antígeno sin el adyuvante. Los adyuvantes de THl adecuados para el uso en la invención pueden incluir por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas tipo virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , oligonucleótidos inmunoestimuladores . Los oligonucleótidos inmunoestimuladores , tal como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes THl preferidos para el uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) , o un incremento en la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria. De manera preferente, la respuesta inmunitaria de TH2 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgGl.

Una respuesta inmunitaria de TH2 se puede producir usando un adyuvante de TH2. En general un adyuvante de TH2 producirá niveles incrementados de producción de IgGl con relación a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para el uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, y toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales tal como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para el uso en la invención.

De manera preferente, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de THl y un adyuvante de TH2. De manera preferente, esta composición produce una respuesta de THl mejorada y de TH2 mejorada, es decir, un incremento en la producción tanto de IgGl como de IgG2a con relación a la inmunización sin un adyuvante. De manera preferente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de THl y de TH2 produce una respuesta inmunitaria de THl incrementada y/o de TH2 incrementada con relación a la inmunización con un adyuvante individual (es decir, con relación a la inmunización con un adyuvante de THl solo o inmunización con un adyuvante de TH2 solo) .

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de THl y una respuesta de TH2. De manera preferente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta de THl mejorada y una respuesta de TH2 mejorada.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y mucosa. De manera preferente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y mucosa mejorada. De manera preferente la respuesta inmunitaria mucosa es una respuesta inmunitaria de TH2. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un incremento en la producción de IgA.

E. coli puede . provocar enfermedad en varias ubicaciones anatómicas [4] y de este modo las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por liofilización) . La composición se puede preparar para administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula, como una aspersión o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición se puede preparar para administración pulmonar por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o una aspersión. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en la forma de equipo, diseñado tal que se reconstituya una composición combinada justo antes de la administración a un paciente. Estos equipos pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida o una o más antígenos liofilizados .

Donde se va a prepara extemporáneamente una composición antes del uso, (por ejemplo, donde esté presente un componente en la forma liofilizadas) y esté presente como un equipo, el equipo puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa ya rellena y un frasco, con los contenidos de la jeringa que se usan para reactivar los contenidos del frasco antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de antígenos, así como cualquiera de otros componentes, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se quiere decir que la administración de esa cantidad o un individuo, ya sea en una dosis individual o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado deseado de protección, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica por parte del doctor que trata, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina.

Métodos de Tratamiento, y Administración de la Vacuna invención también proporciona un método para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y comprende de manera preferente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El método puede formular una respuesta de refuerzo.

La invención también proporciona un polipéptido de la invención para el uso como un medicamento, por ejemplo, para el uso en la formulación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido de la invención en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero .

La invención también proporciona un dispositivo de distribución pre-relleno con una composición inmunitaria de la invención.

Al formular una respuesta inmunitaria en el mamífero por estos usos y métodos, el mamífero se puede proteger contra infección de E. coli, incluyendo cepas ExPEC y no de ExPEC. La invención es particularmente útil para proporcionar protección amplia contra E. coli, patógeno, incluyendo patotipos intestinales tal como patotipos de EPEC, EAEC, EIEC, ETEC y DAEC . De esta manera, el mamífero se puede proteger contra enfermedades que incluyen, pero no se limitan a peritonitis, pielonefritis, cistitis, endocarditis, prostatitis, infecciones del tracto urinario (UTI, por sus siglas en inglés) , meningitis (particularmente meningitis neonatal) , sepsis (o SIRS, por sus siglas en inglés) , deshidratación, pneumonía, diarrea (infantil, de viajero, aguda, persistente, etc.), disentería bacilar, síndrome urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés), pericarditis, bacteriuria, etc.

SEQ ID NO: 21, 30, 35, 40, 49, 54, 59, 68 y 73 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EAEC, y de esta manera para prevenir diarrea (tanto aguda como crónica) .

SEQ ID NO: 22, 28, 36, 41, 47, 55, 56, 60, 66, 74 y 75 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo UPEC, y de esta manera prevenir UTI, incluyendo, sin limitación, pielonefritis , cistitis (tanto aguda como recurrente), peritonitis, UTI asociada a catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática) .

SEQ ID NO: 23, 42 y 61 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EIEC, y de esta manera para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños) .

SEQ ID NO: 24, 27, 29, 43, 46, 48, 62, 65, y 67 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo ETEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea del viajero y de infante) .

SEQ ID NO: 25, 26, 33, 34, 45, 53, 63, 64, y 72 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EAEC, y de esta manera para prevenir diarrea (tanto aguda como crónica) .

SEQ ID NO: 79, 85, 93 y 94 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo UPEC, y de esta manera para prevenir UTI incluyendo pero no limitado a, pielonefritis , cistitis (tanto aguda como recurrente) , peritonitis, UTI asociadas a catéter, prostatitis, y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática) .

SEQ ID NO: 80 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EIEC, y de esta manera para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños) .

SEQ ID NO: 81, 84, y 86 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo ETEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea del viajero y de infante) .

SEQ ID NO: 82, 83, y 91 y sus otras variantes destoxificadas son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EPEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea infantil) .

SEQ ID NO: 21, 30, 35, 40, 49, 54, 59, 68, y 73 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EAEC, y de esta manera para prevenir diarrea (tanto aguda como crónica) .

SEQ ID NO: 22, 28, 36, 41, 47, 55, 56, 60, 66, 74, y 75 sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo UPEC, y de esta manera para prevenir UTI, y incluyendo pero no limitado a, pielonefritis , cistitis (tanto aguda como recurrente) , peritonitis, UTI asociada a catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática) .

SEQ ID NO: 24, 27, 29, 43, 46, 48, 62, 65, y 67 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo ETEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea del viajero y de infante) .

SEQ ID NO: 25, 26, 33, 34, 45, 53, 63, 64, y 72 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EAEC, y de esta manera para prevenir diarrea (tanto aguda como crónica) .

SEQ ID NO: 79, 85, 93 y 94 y sus otras son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo UPEC, y de esta manera para prevenir UTI incluyendo pero no limitado a, pielonefritis, cistitis (tanto aguda como recurrente) , peritonitis, UTI asociadas a catéter, prostatitis, y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática) .

SEQ ID NO: 80 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EIEC, y de esta manera para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños) .

SEQ ID NO: 81, 84, y 86 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo ETEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea del viajero y de infante) .

SEQ ID NO: 82, 83, y 91 y sus otras variantes son particularmente útiles para inmunizar contra el patotipo EPEC, y de esta manera para prevenir diarrea (incluyendo diarrea de infante) .

El mamífero es preferentemente un humano pero puede ser por ejemplo una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, puesto que la enfermedad de E. coli también es problemática en estas especies [4] . Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo un niño que empieza a andar o un infante) o un adolecente; en donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolecente o un adulto. Una vacuna propuesta para niños también se puede administrar a adultos por ejemplo para valorar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.

Una manera para verificar la eficiencia del tratamiento terapéutico comprende monitorizar la infección de E. coli después de la administración de las composiciones de la invención. Una manera para verificar la eficiencia del i tratamiento profiláctico comprende monitorizar las respuestas inmunitarias, de manera sistemática (tal como monitorizando el nivel de producción de IgGl e IgG2a) y/o de forma mucosa (tal como monitorizando el nivel de producción de IgA) , contra los antígenos en las composiciones de la invención después de la administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpo en suero específicas de antígeno se determinan post- inmunización pero pre-estimulación en tanto que las respuestas de antígeno mucosal específicas de antígeno se terminal post-inmunización y post-estimulación.

Otra manera para valorar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas de forma recombinante para examinar sueros de pacientes o secreción en mucosas por inmunotransferencia y/o microarreglos . Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este método también se puede usar para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de antígenos .

La eficiencia de las composiciones de vacuna también se puede determinar in vivo al estimular modelos de animal de infección de E. coli, por ejemplo, cobayos o ratones, con las composiciones de vacuna. Un modelo murino de ExPEC y sepsis letal se describe en la referencia 152. En la referencia 153 se describe un modelo de rata de algodón.

Las composiciones de la invención se administrarán en general de forma directa a un paciente. La administración directa se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, de forma subcutánea, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente , o al espacio intersticial de un tejido), o de forma mucosa, tal como por administración rectal, oral (por ejemplo tableta, aspersión), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal . Las nuevas formas de administración directa también pueden incluir expresión transgénica de los polipéptidos descritos en la presente en alimentos por ejemplo, expresión transgénica en una patata.

La invención se puede usar para producir inmunidad sistémica y/o mucosa, de manera preferente para producir una inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada.

De manera preferente la inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada se refleja en una respuesta inmunitaria de TH1 y/o TH2 mejorada. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un incremento en la producción de IgGl y/o IgG2a y/o IgA.

La dosis puede ser por un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, se pueden dar las varias dosis por la misma o diferentes rutas. Por ejemplo, un refuerzo mucoso y cebadura parenteral, un refuerzo parenteral y cebadura mucosa, etc. Las múltiples dosis se administrarán típicamente con al menos 1 semana de separación (por ejemplo aproximadamente 2 semanas , aproximadamente 3 semanas , aproximadamente 4 semanas , aproximadamente 6 semanas , aproximadamente 8 semanas , aproximadamente 10 semanas , aproximadamente 12 semanas , aproximadamente 16 semanas, etc. ) .

Las vacunas de la invención se pueden usar para tratar tanto niños como adultos. De esta manera, un paciente humano puede ser de menos de 1 año de edad, de 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o de al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los pacientes de edad avanzada (por ejemplo >50 años de edad, >60 años de edad, y de manera preferente >65 años) , los pacientes jóvenes (por ejemplo <5 años de edad) , los pacientes hospitalizados, los trabajadores de cuidado de la salud, personal militar y de servicio armado, mujeres embarazadas, los pacientes inmunodeficientes o crónicamente enfermos . Las vacunas no son adecuadas solo para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar de manera más general en una población.

Las vacunas de la invención son particularmente útiles para pacientes quienes están esperando una operación quirúrgica, u otros pacientes en hospital. También son útiles en pacientes a quienes se les podrá catéter. También son útiles en hembras adolecentes (por ejemplo de una edad de lile) y en pacientes con infecciones crónicas del tracto urinario .

Las vacunas de la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente en el mismo momento como (por ejemplo durante la misma consulta médica o visita a un profesional de cuidado de la salud o centro de vacunación) otras vacunas por ejemplo sustancialmente al mismo tiempo como una vacuna de sarampión, una vacuna de paperas, una vacuna de rubéola, una vacuna de MMR, una vacuna de varicela, una vacuna de MMRV, una vacuna de difteria, una vacuna de tétanos, una vacuna de pertussis, una vacuna de DTP, una vacuna de H. influenzae E tipo b conjugada, una vacuna de poliovirus inactivado, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna de conjugado raeningocóccico (tal como la vacuna tetravalente A-C-W135-Y) , una vacuna de virus sincitial respiratorio, etc.

Inmunización de Ácido Nucleico Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente incluyen antígenos de polipéptido. En todos los casos, sin embargo, los antígenos de polipéptido se pueden reemplazar por ácidos nucleicos (típicamente ADN) que codifican para estos polipéptidos , para dar composiciones, métodos y usos en base a la inmunización de ácido nucleico. La inmunización de ácido nucleico ahora es un campo desarrollado (por ejemplo ver referencias 154 a 161 etc.) .

El ácido nucleico que codifica para inmunógeno se expresa in vivo después de la administración a un paciente y el inmunógeno expresado entonces estimula el sistema inmunitario. El ingrediente activo tomará típicamente la forma de un vector de ácido nucleico que comprende: (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica para el inmunógeno, operablemente enlazada al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador seleccionable . Los vectores preferidos pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de transcripción corriente abajo de y operablemente enlazado a (ii) . En general, (i) y (v) será eucariótico y (iii) y (iv) será procariótico .

Los promotores preferidos son promotores virales, por ejemplo, de citomegalovirus (CMV) . El vector también puede incluir secuencias reguladoras transcripcionales (por ejemplo intensificadores) además del promotor y que interactúan de forma funcional con el promotor. Los vectores preferidos incluyen el intensificador/promotor de CMV inmediatamente temprano, y los vectores más preferidos también incluyen el intrón A de CMV. El promotor está enlazado operablemente a una secuencia en la dirección 3' que codifica para un inmunógeno, tal que la expresión de la secuencia que codifica para el inmunógeno está bajo el control del promotor.

Donde se usa un marcador, funciona de manera preferente en un hospedador microbiano (por ejemplo en una procariota, en una bacteria, en una levadura) . El marcador es de manera preferente un marcador seleccionable procariótico (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariótico) . Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos.

El vector de la invención es de manera preferente un vector extracromosómico o episómico autónomamente replicante, tal como un plásmido.

El vector de la invención comprende de manera preferente un origen de replicación. Se prefiere que el origen de replicación esté activo en procariotas pero no en eucariotas .

Los vectores preferidos incluyen de esta manera un marcador procariótico, para selección del vector, un origen procariótico de replicación, pero un promotor eucariótico para activar la transcripción de la secuencia que codifica para el inmunógeno. Los vectores por lo tanto se (a) amplificarán y seleccionarán en hospedadoras procarióticos sin expresión de polipéptido, pero (b) se expresarán en hospedadores eucarióticos sin que se amplifiquen. Este arreglo es ideal para vectores de inmunización de ácido nucleico .

El vector de la invención puede comprender una secuencia terminadora transcripcional eucariótica corriente abajo de la secuencia codificadora. Esto puede mejorar los niveles de transcripción. Donde la secuencia codificadora no tiene en sí misma, el vector de la invención comprende de manera preferente una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferida es de hormona de crecimiento bovino.

El vector de la invención puede comprender un sitio de clonación múltiple.

Además de las secuencias que codifican para el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia codificadora eucariótica. El vector también puede comprender un IRES en la dirección 5' de la segunda secuencia a fin de permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariótico del mismo transcripto como el inmunógeno. De manera alternativa, la secuencia que codifica para el inmunógeno puede estar en la dirección 3' de un IRES.

El vector de la invención puede comprender motivos de CpG no metilados, por ejemplo secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citocina que precede una guanosina, flanqueada por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3' . En su forma no metilada, estos motivos de ADN se ha demostrado que son potentes estimuladores de varios tipos de célula inmunitaria.

Se pueden administrar vectores de una manera dirigida. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptor se describen, por ejemplo, en la referencia 162 a 167. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de aproximadamente lOOng a aproximadamente 200mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. Los intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 µg a aproximadamente 500 µ?, y de aproximadamente 20 µg a aproximadamente 100 µg de ADN también se pueden usar durante un protocolo de terapia génica. Los factores tal como el método de acción (por ejemplo para mejorar o inhibir los niveles del producto génico codificado) y la eficiencia de transformación y expresión son consideraciones que afectarán la dosis requerida para eficiencia final. Donde se desea mayor expresión sobre una mayor área de tejido, mayores cantidades del vector o las mismas cantidades se re-administran en un protocolo sucesivo de administraciones o se . pueden requerir varias administraciones a diferentes porciones de tejido adyacentes o cercanas para efectuar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación de rutina en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para el efecto terapéutico óptimo.

Se pueden administrar vectores usando vehículos de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser de origen viral o no viral (ver en general referencias 168 a 171) .

Los vectores de base viral para la administración de un ácido nucleico deseado y para la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos de base viral de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (por ejemplo, referencias 172 a 182) , vectores basados en alfavirus (por ejemplo vectores de virus Sindbis, virus de bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de encefalitis equina Venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); híbridos y quimeras de estos virus también se pueden usar) , vectores de virus de viruela (por ejemplo vaccinia, viruela de aves de corral, viruela de canario, vaccinia Ankara modificado, etc.), vectores de adenovirus, y vectores de virus adeno-asociados (AAV) (ver por ejemplo referencias 183 a 188) . También se puede ' emplear la administración de ADN enlazadas a virus aniquilados [189] .

Los vehículos de administración no virales y métodos también se pueden emplear, incluyendo, pero no limitado a, ADN condensado policatiónico enlazado o no enlazado a adenovirus aniquilado solo [por ejemplo 189] , ADN enlazado a ligando [190] , vehículos de administración de células eucarióticas [por ejemplo referencias 191 a 195] y neutralización de carga nucleica o fusión con otras membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Los métodos de introducción de ADN desnudo de ejemplo se describen en las referencias 196 y 197. Los liposomas (por ejemplo inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de administración génica se describen en la referencia 198 a 202. Los planteamientos adicionales se describen en la referencia 203 y 204.

La administración no viral adicional adecuada para el uso incluye sistemas de administración mecánica tal como el planteamiento descrito en la referencia 204. Además, la secuencia codificadora y el producto de expresión de esta se pueden administrar a través del depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizados o el uso de radiación ionizante [por ejemplo referencia 205 y 206] . Otros métodos convencionales para administración génica que se pueden usar para la administración y distribución de la secuencia codificadora incluyen, por ejemplo, el uso de pistola de partículas portátil de transferencia génica [207] o el uso de radiación ionizante para activar los genes transferidos [205 y 206] .

El ADN de administración usando micropartículas de PLG {poli (láctido-co-glicólido) } es un método particularmente preferido por ejemplo por adsorción a las micropartículas, que se tratan opcionalmente para tener una superficie negativamente cargada, (por ejemplo tratada con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo tratada con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

Aspectos Generales La práctica de la práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, referencias 208-215, etc.

El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

El término "aproximadamente" con relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x+10 %.

La numeración "GI" se usa en la presente. Un número GI, o "Identificador Genlnfo" , es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por NCBI cuando las secuencias se adicionan a sus bases de datos. El número GI no tiene semejanza al número de acceso del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo para corrección o para adicionar más anotación o información), entonces recibe un nuevo número GI. De esta manera, la secuencia asociada con un número GI dado nunca se cambia.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 216. Se determina una alineación preferida por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de separación de afinidad con una penalidad de abertura de separación de 12 y una penalidad de extensión de separación de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith- aterman se describe en la referencia 217.

Un experto en la técnica entenderá que "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o removido de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo, no está "aislado" cuando está en este organismo vivo, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado" , como el término se usa en esta descripción. Adicionalmente , un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro método de recombinación se entenderá que está "aislado" aún si aun está presente en este organismo, organismo que puede estar vivo o no vivo, excepto en donde esta transformación, manipulación genética u otro método recombinante produce un organismo que de otro modo es indistinguible del organismo que se presenta de forma natural .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una alineación CLUSTALW de SEQ ID Nos: 2 a 16. Las regiones N-terminales que se pueden remover para incrementar la solubilidad en tanto que mantienen sustancialmente la misma inmunogenicidad se muestran en el fondo de la alienación. La región N-terminal hasta el ligador gly-ser o la región gly-ser se denota con "G" y la región rica en prolina se denota con "P".

La Figura 2 muestra la entidad de aminoácidos entre pares de de secuencias .

La Figura 3 muestra el análisis en el de proteína purificada, con bandas de alto MW visibles en la ausencia de DTT.

Las Figuras 4A-4B muestran la Western Blot de cepas patógenas y no patógenas de E. coli usando un suero anti-AcfD (orf3526) . La Fig. 4A es una Western Blot del lisado celular total. La Fig. 4B es una Western Blot del sobrenadante del cultivo. Las sendas en cada uno de la figs. 4A y 4B de izquierda a derecha son como sigue: Senda M - proteínas marcadoras con peso molecular en kDa de cada proteína marcadora mostrado en el lado izquierdo de la fig. 4A; 1 -IHE3034; 2 - CFT073; 3 - 536; 4 -BL21; 5 - MG 1655; 6 -W3110; 7 - NISSLE1917; 8 - IHE3034AAcfD. Como se observa del análisis, las cepas patógenas (IHE3034, senda 1; 536, senda 3) expresan y segregan AcfD (orf3526) en tanto que las cepas no patógenas (MG1 655, senda 5; W3110, senda 6; Nissle 1917, senda 7) expresan la proteína pero su secreción es defectuosa. Las cepas CFT073 (senda 2) y IHE3034AAcfD (senda 8) se usan como control negativo, puesto que no tienen el gen AcfD (orf3526) . La cepa BL21 (senda 4) es una cepa de laboratorio usada como control positivo, puesto que expresa y segrega AcfD (orf3526) .

Las Figuras 5A-5B muestran una comparación de la seguridad de la proteína AcfD (orf3526) y varios fragmentos de la proteína en la figura 4A es un gel gradiente de SDS-PAGE (amortiguador MOPS al 4-12%) de muestras a 37°C que compara el sedimento (senda izquierda para cada proteína o fragmento al sobrenadante (senda derecha para cada proteína o fragmento. Las sendas de izquierda a derecha son: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 kDa, 97 kDa y 64 kDa) , bacterias de control transformadas con el vector de expresión pET sin inserción, expresión bacteriana de 3526 (marca his, péptido guía removido) , expresión bacteriana de L3526 (marca his, longitud completa), expresión bacteriana de L3526-2stop (longitud completa con un codón finalizador antes de marca His) , expresión bacteriana de AG3526 (marca his, remoción del N-terminal AcfD (?tß526) al ligador flexible de glicina-serina) , y la expresión bacteriana de ??3526 (marca his + remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica de prolina) . La fig. 5B es un gel gradiente de SDS-PAGE (amortiguador MOPS al 4-12%) de muestras a 25°C siguiendo el mismo orden para las sendas como en la Fig. 5A.

Las Figuras 6A-6C muestran una comparación de la expresión y purificación de la proteína AcfD (orf3526) y varios fragmentos de la proteína. LA FIG. 6A es un gel de SDS-PAGE (amortiguador MOPS al 12%) de muestras de bacterias que expresan 3526 (marca his, péptido gula removido) , cultivados a 25° C que compara fracciones de varias etapas de la purificación. Las sendas de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 kDa, 97 kDa y 64 kDa) , TOT: lisado bacteriano total, INS: fracción insoluble de lisado bacteriano, SM: . fracción soluble de lisado bacteriano, FT: flujo a través de columna de Níquel; El, E2 , y E3 tres eluciones con amortiguador de imidazol 500 mM. La fig. 6B muestra un gel de SDS-PAGE (amortiguador MOPS al 12%) de muestras de bacterias que expresan AG3526 (marca his, remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) al ligador flexible de glicina-serina) cultivadas a 25°C que comparan fracciones de varias etapas de la purificación. Las sendas de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 kDa, 97 kDa- y 64 kDa) , TOT: lisado bacteriano total, INS: fracción insoluble de lisado bacteriano, SM: fracción soluble del lisado bacteriano, FT: flujo a través de columna de Níquel; El, E2, y E3 tres eluciones de amortiguador de imidazol 500 mM. La Fig. 6C es un gel de SDS-PAGE (amortiguador MOPS al 12%) de muestras de bacterias que expresan ??3526 (marca his, remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica en. prolina) , cultivadas a 25°C que compara fracciones de varias etapas de la purificación. Las sendas de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 kDa, 97 kDa y 64 kDa) , TOT: lisado bacteriano total, INS : fracción insoluble del lisado bacteriano, SM: fracción soluble del lisado bacteriano, FT: flujo a través de columna de Níquel; El, E2, y E3 tres eluciones con amortiguador de imidazol 500 mM.

La Figura 7 muestra la entidad de aminoácidos entre pares adicionales de secuencias. Se encontró que dieciséis E. coli Enterohemorrágicos (EHEC) no tienen el gen AcfD (orf3526) (no mostrado) . Las secuencias (donde se representan) de izquierda a derecha o de arriba hacia abajo son como sigue: 10 cepas no patógenas o comensales (1: una cepa comensal de E. coli, '2: cepas DH10B, 3: cepa MG1655, 4: cepa W3110 (SEQ ID NO: 14); 5: cepa HS (SEQ ID NO: 13); 9: otra cepa comensal de E. coli; y 10: aún otra cepa comensal de E. coli); tres cepas NMEC (1: cepa NMEC RS218; 2: cepa NMEC IHE3034 (SEQ ID NO:2); y 3: cepa NMEC S88 (SEQ ID N0:141)); una cepa APEC (1: cepa APEC01) ; seis cepas UPEC (2: cepa UPEC 536 (SEQ ID NO:4); 3: UTI89; 4: cepa UPEC FU (SEQ ID NO: 10); 5: cepa UPEC IAI39 (SEQ ID NO:133); y 6: cepa UPEC UMN026 (SEQ ID N0.137)); tres cepas EAEC (1: cepa EAEC 101-1 (SEQ ID NO:3); 2: cepa EAEC 042 (SEQ ID NO:12; y 3: cepa EAEC 55989 (SEQ ID NO: 129)); una cepa EIEC (1: cepa EIEC 53638 (SEQ ID N0:5)); cuatro cepas EPEC (2: cepa EPEC E22 (SEQ ID NO: 8)); 3: cepa EPEC E2348/69 (SEQ ID NO: 16); y 4: cepa EPEC El 10019 (SEQ ID NO:7)); tres cepas ETEC (1: cepa ETEC B7A (SEQ ID NO:6); 2: cepa ETEC E24377A (SEQ ID NO:9); y 3: cepa ETEC H10407 (SEQ ID NO:ll)); y una cepa resistente a antibióticos (1: cepa resistente a antibióticos SECEC (SEQ ID NO: 15) ) .

La Figura 8 muestra los motivos de secuencia identificados en AcfD (orf3526) que incluyen de izquierda a derecha: un motivo de lipidación; una región rica en prolina, un motivo xxxE, un motivo de unión a zinc, y un dominio de RGD.

La Figura 9 muestra las relaciones de familia de varias zinc metaloproteasas . Las zincinas se resaltan con un cuadro gris puesto que el motivo zincina es el motivo encontrado en AcfD (orf3526) (Ver Figura 8) .

La Figura 10 muestra un SDS-PAGE (gradiente al 4-12%, Bis-Tris) de la expresión de orf3526C. las sendas se marcan a través de la parte superior como sigue: (1) Lisado celular total - sin IPTG, 6 horas a 25°C; (2) Lisado celular total - IPTG 1 mM, 3 horas a 25°C; (3) Lisado celular total -IPTG 1 mM, 6 horas a 25°C; (M) Marcadores (se indican los tamaños en kDa a lo largo del lado izquierdo del gel) ; (4) fracción soluble después de tratamiento con ultrasonido, y IPTG 1 mM, 3 horas a 25°C; y (5) fracción soluble después del tratamiento con ultrasonido, IPTG 1 mM, 6 horas a 25°C. Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID Descripción SEQ ID NOs: 1-19 = secuencias de aminoácidos de longitud completa 1 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC IHE3034 2 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) 3 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 536 (GI: 110643204) 4 Secuencia de aminoácidos de cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) 5 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC B7A (GI: 75227618) 6 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) 7 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E22 (GI: 75259912) 8 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC E24377A (GI: 1571 56747) 9 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC Fll (GI: 75241179) 10 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC H 10407 11 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 042 12 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal HS (GI: 157162442) SEQ ID Descripción 13 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal W3 110 (GI: 89109748) 14 Secuencia de aminoácidos de cepa resistente a antibióticos SECEC 15 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E2348/69 16 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 55989 17 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 1A139 18 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC UMN026 - 19 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC S88 SEQ ID NOs: 20-38 = secuencias de aminoácidos de supresión C-terminal 20 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC 1HE3034 con supresión C-terminal 21 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con supresión C-terminal 22 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 536 (GI: 110643204) con supresión C-terminal 23 Secuencia de aminoácidos de cepa EJEC 53638 (GI: 75515237) con supresión C-terminal 24 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con supresión C-terminal 25 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con supresión C-terminal 26 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con supresión C-terminal SEQ ID Descripción 27 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con supresión C—terminal 28 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC Fll (GI: 75241179) con supresión C-terminal 29 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC H 10407 con supresión C-terminal 30 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 042 con supresión C-terminal 31 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal HS (GI: 157162442) con supresión C-terminal 32 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal W3110 (GI: 89109748) con supresión C-terminal 33 Secuencia de aminoácidos de cepa resistente a antibióticos SECEC con supresión C-terminal 34 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E2348/69 con supresión C-terminal 35 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 55989 con supresión C-terminal 36 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 1A139 con supresión C-terminal 37 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC UMN026 con supresión C-terminal 38 Secuencia de aminoácidos de cepa MEC S88 con supresión C-terminal SEQ ID Descripción SEQ JD NOs : 39-57 = secuencias de aminoácidos de supresión N-terminal 39 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC 1HE3034 con supresión N-terminal 40 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 101-1 (Gl: 83587587) con supresión N-terminal 41 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 536 (GI: 110643204) con supresión N-terminal 42 Secuencia de aminoácidos de cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) con supresión N-terminal 43 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con supresión N-terminal 44 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC El 10019 (GI: 75239450) con supresión N-terminal 45 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con supresión N-terminal 46 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) supresión N-terminal 47 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC F 11 (GI: 75241179) con supresión N-terminal 48 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC H 10407 con supresión N-terminal 49 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 042 con supresión N-terminal SEQ ID Descripción 50 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal HS (GI: 157162442) supresión N-terminal 51 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal W3 110 (GI: 89109748) supresión N-terminal 52 Secuencia de aminoácidos de cepa resistente a antibiótico SECEC con supresión N-terminal 53 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E2348/69 con supresión N-terminal 54 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 55989 con supresión N-terminal 55 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 1A139 con supresión N-terminal 56 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC UMN026 con supresión N-terminal 57 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC S88 con supresión N-terminal SEQ ID NOs : 58-76 = secuencias de aminoácidos de mutación puntual E1305A 58 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC 1HE3034 con una mutación puntual E1305A 59 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con una mutación puntual E1305A 60 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 536 (GI: 110643204) con una mutación puntual E1305A SEQ ID Descripción 61 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC 53638 (GI: 75515237) con una mutación puntual E1305A 62 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con una mutación puntual E1305A 63 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con una mutación puntual E1305A 64 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con una mutación puntual E1305A 65 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con una mutación puntual E1305A 66 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC Fl 1 (GI: 75241179) con una mutación puntual E1305A 67 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC H10407 con una mutación puntual E1305A 68 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 042 con una mutación puntual E1305A 69 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal HS (GI: 157162442) con una mutación puntual E1305A 70 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal W3 110 (GI: 89109748) con una mutación puntual E1305A 71 Secuencia de aminoácidos de cepa resistente a antibióticos SECEC con una mutación puntual E1305A 72 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E2348/69 con una mutación puntual E1305A SEQ ID Descripción 73 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 55989 con una mutación puntual E1305A 74 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 1A139 con una mutación puntual E1305A 75 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC UMN026 con una mutación puntual E1305A 76 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC S88 con una mutación puntual E1305A SEQ ID NOs: 77-95 = secuencias de aminoácidos de fragmento orf3526C 77 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC 1HE3034 con región ?T N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido 78 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 79 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 536 (GI: 110643204) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 80 Secuencia de aminoácidos de cepa EJEC 53638 (GI: 75515237) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 81 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido SEQ ID Descripción 82 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC El 10019 (GI: 75239450 con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 83 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 84 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 85 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC Fll (GI: 75241179) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 86 Secuencia de aminoácidos de cepa ETEC H 10407 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 87 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 042 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 88 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal HS (GI: 157162442) con región AG N-terminal y la porción C- terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 89 Secuencia de aminoácidos de cepa comensal W3 lio (GI: 89109748) con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido SEQ ID Descripción 90 Secuencia de aminoácidos de cepa resistente a antibiótico SECEC con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 91 Secuencia de aminoácidos de cepa EPEC E2348/69 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 92 Secuencia de aminoácidos de cepa EAEC 55989 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 93 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC 1A139 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 94 Secuencia de aminoácidos de cepa UPEC UMN026 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 95 Secuencia de aminoácidos de cepa NMEC S88 con región AG N-terminal y la porción C-terminal que incluye el motivo de zinc suprimido 96/97 Motivos de unión a zinc 98-109 Cebadores 110- Secuencias 1C31 111 Descripción Detallada de la Invención Uno de los antígenos descritos en la referencia 5 se anota como precursor (orf3526) del factor D de colonización no esencial (AcfD) (SEQ ID NO: 2 de aminoácidos de la presente) para la cepa NMEC IHE3034. Esta proteína se ha expresado y purificado, y confiere protección contra cepas ExPEC en un modelo de sepsis de animal-.

Se obtuvieron secuencias para los ortólogos en varias otras cepas de E. coli. Las secuencias de aminoácidos vista en IHE3034 también se vio en las cepas APECOl y UTI89, pero 14 extra-secuencias se encontraron (SEQ ID NOs : 3 a 16). La Figura 1 muestra una alineación de SEQ ID NOs: 2 a 16. Los 30 aminoácidos N-terminales están 100% conservados, y estos incluyen el péptido de señal (aa 1-23) y la cisteína N-terminal de la lipoproteína nativa.

Algunas cepas tienen una mutación de desplazamiento en el gen AcfD (orf3526) , que no da por resultado la expresión del polipéptido. El gen acfD estuvo totalmente ausente de las cepas CFT073 , EDL933, Sakai y B171. .

La Figura 2 muestra el % de identidad entre las secuencias de aminoácidos. Los marbetes son SEQ ID NOs, excepto para MG1655, RS218, DH10B, APECOl y UTI89 sonde se usa el nombre de la cepa. El nivel más bajo de identidad (en cuadro en la Figura 2) fue 85.9%, entre SEQ ID NOs: 2 y 4 (ambas cepas ExPEC) .

Ejemplo 1.- Inmunogenicidad de la AcfD (orf3526) de longitud completa La secuencia AcfD (orf3526) de la cepa IHE3034 se clonó y expresó de un plásmido como una proteína marcad con His recombinante sin un péptido guía sin un hospedador de E. coli. La proteína se purificó y se analizó. La filtración en gel mostró un peso molecular mucho mayor que lo previsto en base solo a la secuencia de aminoácidos. El análisis en gel en ausencia de DTT, pero no en su presencia, muestra formas de mayor peso molecular de la proteína (Figura 3) . De esta manera, es probable que la proteína forme oligómeros.

Se usaron sueros formulados contra AcfD (orf3526) en transferencias Western contra lisados celulares totales (Figura 4A) o sobrenadantes de cultivo precipitados con 60% TCA (Figura 4B) . Los sueros reconocieron una proteína de ~150kDa en los lisados de cepas tanto patógenas como comensales. No reaccionan con esta banda en lisados de CFT073 o de un mutante suprimido con AcfD (orf3526) de IHE3034. La reactividad con estas proteínas en los sobrenadantes indica que la proteína se puede segregar.

Se inmunizaron subcutáneamente ratones CD1 (5 semanas de dad) usando 20 del antígeno más el adyuvante de Freund (u otro adyuvante como se indica posteriormente) . Los ratones se inocularon a 0, 21, y 35 días. Catorce días después de la tercera inoculación, los ratones se estimularon con una dosis letal (LD80) de una cepa patógena de E. coli. La sangre se recolectó de la cola 24 horas después de la estimulación para evaluar la bacteremia. La mortalidad se monitorizó durante cuatro días después del estímulo. La proporción de protección se puede calcular como (% muertos en grupo de control (sin inmunización - % muertos en grupo experimental (inmunizados) ) / muerto en grupo e control x 100.

Tabla 1 Candidatos Modelo de Sepsis en animal Supervivencia Supervivencia Valor P con vacunación sin vacunación (%) (%) 20pg 3526/alumbre 64/78 (82) 9/80 (11) 0.0001 De esta manera, el precursor AcfD (orf3526) es un candidato efectivo para el uso como una vacuna o componente de vacuna.

Para demostrar adicionalmente la utilidad del precursor AcfD (orf3526) como un candidato para una vacuna o un componente de vacuna, el precursor AcfD (orf3526) se probó para su capacidad para proporcionar protección cruzada contra otras cepas patógenas de E. coli usando el modelo de sepsis en animal como se indica anteriormente. Los resultados de esta prueba se indican en la Tabla 2 posterior (con los resultados de la Tabla 1 incluidos para propósitos de comparación) .

Tabla 2 20 g 3526/alumbre, Modelo de sepsis en animal Cepa de estimulo Supervivencia Supervivencia Valor (porciento de con vacunación sin vacunación P identidad a (%) (%) 1HE3034) 1HE3034 (100) 64/78 (82) 9/80 (11) 0.0001 9855/93 (87) 9/16 (56) 4/15 (26) 0.14 BK658 (98) 4/8 (50) 1/8 (12.5) 0.28 B616 (100C) 6/8 (78) 0/8 (0) 0.007 536 (86) 6/7 (85) 3/8 (37.5) 0.11 De esta manera, el precursor AcfD (orf3526) es un candidato efectivo para el uso como una vacuna o componente de vacuna no solo contra la cepa de la cual se derivó la proteína, sino también contra proteínas relacionadas, incrementando de este modo la utilidad. En base a la similitud entre la respuesta al precursor AcfD (orf3526) y la respuesta a los tres fragmentos inmunógenos probados más adelante (3526A, 3526B, y 3526C) , se esperaría que estos tres fragmentos se proporcionarían también protección cruzada similar.

Ejemplo 2.- Fragmentos de Acf (or3526) con solubilidad incrementada Inesperadamente, la proteína, AcfD (orf3526) presentó baja solubilidad aunque la proteína es una proteína segregada. Como se muestra en la Figura 5B, la remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) a través del ligador gly-ser o región gly-ser incrementó significativamente la solubilidad cuando se expresó a 25°C (ver pKl-AG3526, Figura 5B) . De manera similar la remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica de prolina incrementó significativamente la solubilidad cuando se expresó a 25 °C (Ver ??1-??3526 Figura 5B) .

Para confirmar que ambos fragmentos tienen sustancialmente la misma inmunogenicidad como la AcfD (orf3526) de longitud completa, se purificaron los fragmentos. Los fragmentos purificados se usaron en tres experimentos de inmunización en ratones, con adyuvante completo de Freund. Entonces los ratones se inmunizados se estimularon con una dosis sub- letal de E. coli. La inmunización con AcfD (or0526) con el N-terminal hasta el ligador gly-ser o región gly-ser removido protegió 100% de los ratones de la muerta, en tanto que la muerte se presentó en 90% de los animales en el grupo de control sin inmunizar. La inmunización con AcfD (orf3526) con el N-terminal hasta la región rica en prolina removido protegió 90% de los ratones de la muerte, en tanto que la muerte se presentó en 90% de los animales en el grupo de control sin inmunizar.

Expresión y Purificación Bacterias con una de las tres construcciones que expresan variantes marcadas con his de AcfD (orf3526) se cultivaron en 30 mi de medio y se indujeron a expresar la variante de AcfD (orf3526) a 25°C (AcfD (or0526) sin el péptido guía (3526) , AcfD (orf3526) con el N-terminal removido hasta el ligador gly-ser o región gly-ser (AG3526) , y AcfD (orf3526) con el N-terminal removido hasta la región rica en prolina (??3526) . Las bacterias se recolectaron y lisaron por tratamiento con ultrasonido. Las fracciones solubles se aislaron y cargaron en una columna IMAC. La columna se lavó tres veces con amortiguador de imidazol 20 mM. Las variantes AcfD (orf3526) entonces se eluyeron con tres lavados de amortiguador de imidazol 500 mM. Como se muestra en la Figura 6, la remoción del N-terminal de AcfD (orf3526) hasta el ligador gly-ser o región gly-ser incrementó significativamente la solubilidad y el rendimiento de la proteína purificada. El rendimiento obtenido se estimó por ensayo de Bradford para que sea como sigue: 0.18 mg de 3526 y 2.34 mg AG3526.

Ejemplo 3.- Mutantes de AcfD (orf3526) Con Toxicidad Reducida Se identificó un motivo de unión a zinc en la proteína AcfD (orf3526) (Ver Figura 8) . El motivo de zinc-metaloproteasa de zincina también se encuentra en StcE (proteasa segregada de inhibidor de esterasa Cl de EHEC) que es una proteína segregada por EHEC que está comprendida en la patogénesis de E. coli.

StcE HEVGHNYGLGH (SEQ ID NO: 96) AcfD (orf3526) HEVGHNAAETP (SEQ ID NO: 97) Dado que este motivo está conservado en todas las variantes de AcfD (orf3526) y EHEC fue el único patotipo en el cual no se identificó AcfD (orf3526) se supone que AcfD (orf3526) de manera similar en una zinc-metaloproteasa comprendida en la patogenia de los patotipos de E. coli en los cuales se expresa y se segrega. Por lo tanto, se busca la inactivación de la toxicidad de AcfD (orf3526) . Un experto en la técnica no tendría dificultad en modificar AcfD (orf3526) para inactivar la metaloproteasa . Puesto que el residuo Glu del motivo se conoce que es el más importante a la actividad catalítica en tanto que los dos residuos His coordinan el Zinc, el Glu se mutó a Ala como una mutación de ejemplo que inactiva la actividad de metaloproteasa - SEQ ID NOs : 58-76 (ver, por ejemplo, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Septiembre 1998, p. 597-635, Vol . 62, No. 3). Además, se digirieron dos variantes adicionales destoxificadas : una con el C-terminal suprimido - SEQ ID NOs: 20-38, y una con el N-terminal suprimido - SEQ ID NOs : 39-57. Prueba de toxicidad in vitro de AcfD (orf3526) longitud completa Se probaron dos diferentes líneas celulares para su capacidad para valorar la toxicidad de la proteína AcfD (orf3526) : células endoteliales de médula ósea humana (HBMEC) y células de ovario de hámster chino (células CHO) . Para HBMEC, el efecto de incrementar las dosis de la proteína AcfD (orf3526) (0.1 ug/ml, 1 g/ml, y 10 yg/ml) se comparó a TNF-a (como un control positivo) . Las células tratadas con TNF-a mostraron un promedio de muerte celular de -22.5% (promedio de tres experimentos) en tanto que la más alta dosis de la proteína AcfD (orf3526) mostró solo un promedio de muerte celular de -5% (promedio de tres experimentos) en comparación al control negativo que mostró solo un promedio de muerte celular de -2.5% (promedio de tres experimentos). Para células CHO, el efecto de incrementar las dosis de proteína AcfD (orf3526) (1 pg/ml, 10 g/ml, y 100 g/ml) se comparó a TNF-a (como un control positivo) al medir el cambio en la diferencia potencial con el paso del tiempo debido a la alteración del citoesqueleto de las células CHO. Al nivel más alto de la prueba de proteína AcfD (orf3526) , se detectó una disminución significativa después de 46 horas, pero la disminución en la respuesta a TNF-a fue notablemente mayor.

De esta manera, en tanto que no se ha identificado una prueba preferida para la toxicidad con una señal fuerte, los fragmentos identificados más adelante aún tienen utilidad significativa. Como se analiza anteriormente, estos tres fragmentos deben proporcionar un grado similar de protección cruzada como la versión de longitud completa probada anteriormente. Adicionalmente , E. coli comensal es una cepa preferida para la expresión de la proteína AcfD (orf3526) . Sin embargo, como se indica en la Figura 4, comensal expresa una versión de la proteína AcfD (orf3526) , pero no segrega la proteína. De esta manera, la expresión de un fragmento de una proteína AcfD (orf3526) proporciona la ventaja de permitir la separación del fragmento de la proteína AcfD (orf3526) endógena en base a la diferencia y tamaño sin la necesidad de una marca de purificación por afinidad.

Clonación y expresión 3526A y 3526B Se obtuvieron mutantes usando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio de GeneTailor (Invitrogen) . Los genes se clonaron en los vectores pET-21b (Novagen) y se transformaron en células químicamente competentes DH5a-Tl para propagación (Invitrogen) . Se usaron para la expresión células químicamente competentes BL21 (DE3) subrayado. Todos los candidatos se clonaron y expresaron sin la secuencia de señal y como proteínas de fusión de marca his que se purifica por cromatografía de afinidad.

Cebadores usados para amplificación de fragmentos (columna final es SEQ ID NO : ) : 3526A 3526F GGAATTCCATATGTGTGATGGTGGTGGTTCA Ndel 98 3526AR CCGCTCGAGGTTGTTCACCACCGATTT Xhol 99 3526BF GGAATTCCATATGGATCCGCAAGGGTATCC Ndel loo 3526B 3526R CCGCTCGAGCTCGGCAGACATCTTATG Xhol 101 Cebadores usados para mutación: Muestra Nombre Secuencia de nucleótidos oligo 3526E1305A 3526GTF1 ACGACTGGCTGATTTGGCACGCAGTCGGTCATA 102 3526GTR1 GTGCCAAATCAGCCAGTCGTTCAGCGGCGT 103 Inmunogenicidad - 3526A y 3526B Para confirmar que ambos fragmentos y la mutación puntual tienen sustancialmente de la misma inmunogenicidad como la AcfD (orf3526) de longitud completa. Se purificaron pos fragmentos. Los fragmentos purificados se usaron en tres experimentos de inmunización en ratones, con adyuvante completo de Freund. Los ratones inmunizados entonces se estimularon con una dosis letal de E. coli. Los resultados del estímulo se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3 Candidatos Modelo de sepsis en animal Supervivencia Supervivencia Valor P con sin vacunación vacunación (%) (%) 3526A (AcfD 13/16 (87.5) 1/8 12.50) 0.01 (Supresión C- terminal 3526B (AcfD 6/8 (75) 1/8 12.50) 0.04 (Supresión C- terminal Clonación y expresión -AAG3526C Como 'una confirmación adicional, se diseñó una construcción que combinó la supresión N-terminal de AG3526 que mejoró la solubilidad con la supresión del C- terminal hasta el motivo de zinc (AG3526C) . Las construcciones de ejemplo se proporcionan como SEQ ID NOs : 77 a 95.

Un vector de expresión no marcado con his para la construcción AG3526C (E. coli capa IHE3034 - SEQ ID NO: 77) se obtuvo por PCR usando los cebadores más indicados más adelante (AG3526A/C_For y AG3526C_NatRev) . El fragmento purificado de PCR se digirió con Ndel y Xhol y se ligó en un vector pET-24b(+) (Novagen) y se transformó en células clínicamente competentes DH5a-Tl para propagación (Invitrogen) . Para la expresión se usaron células químicamente competentes BL21 (DE3) .

Un vector de expresión marcado con his para la construcción AG3526C (E. coli cepa IHE3034 - SEQ ID NO: 77) se obtuvo usando Extensión de Cebador Incompleta de Polimerasa (PIPE) usando los cebadores indicados más adelante (AG3526A/C_For y ñG3526C_Nat para I-PCR y p-petl y pet3 para V-PCR del vector pET-21b (Novagen) ) . El vector de expresión se transformó en células químicamente competentes DH5a-Tl para propagación (Invitrogen) . la expresión se usaron células químicamente competentes BL21 (DE3) .

La versión marcada con his de AG3526C se expresó (Ver por ejemplo, Figura 10) sin la secuencia de señal y se purificó por cromatografía definida en base a la marca de his.

Los cebadores usados para la amplificación del fragmento no marcado con his (SEQID NOs : 104 y 105) AG3526 AG3526A/C_For gaaggagatatacatatgGATACGCCGTCTGTAGAI CTGG C (Ndel) AG3526C_NatRev gtggtggtgctcgagTTACCAAATCAGCCAGTCGTTC-AGC (Xhol) Cebadores usados para la amplificación del fragmento marcado con his (I-PCR) : SEQ ID NOs : 106 y 107 AG3526C AG3526A/C_For gaaggagatatacatatgGATACGCCGTCTGTAGATTCTGG (Ndel) AG3526C_Rev gtggtggtgctcgagCCAAATCAGCCAGTCGTTCAGC (Xhol) Cebadores usados para amplificación del vector de expresión (V-PCR) : SEQ ID NOs : 108 yl09 pET- p-petl catatgatatctccttcttaaagTTAAACAAAATTATTTCTAG 21b p-pet3 CTCGAGCACCACCACCAC Inmunogenicidad -AG3526C Para confirmar que el fragmento adicional tienen sustancialmente la misma inmunogenicidad como la AcfD (orf3526) longitud completa, se purificó el fragmento. El fragmento purificado entonces se probó como sigue. Se inmunizaron los grupos de 8 ratones 8 CD1 (4 semanas de edad) por s.c. con tres dosis del antígeno AG3526C (ya sea 2 iq o 20 µg) , formulado en alumbre en los días 0, 31 y 35. 14 días de la última inmunización, se infectaron ratones (de 11 semanas de edad) i.p. con la cepa patógena de E. coli IHE3034. Se recolectó sangre de la cola después de 24 horas para evaluar la bacteremia. Se monitorizó la mortalidad durante 4 días después de la infección. La protección se calculó como % de supervivencia en el día 4 y se llevó a cabo el análisis estadístico por prueba exacta de Fisher. Los resultados del estímulo se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Candidato : Modelo de sepsis en animal ?35260 Supervivencia con Supervivencia Valor vacunación (%) sin vacunación P (%) 2 g/alumbre 13/16 (81) 0/7 (0) 0.0005 20 15/16 (93) 0/7 (0) 0.0001 g/alumbre Inmunogenicidad cruzada de cepas - AG3526C Para confirmar adicionalmente la utilidad del fragmento adicional en proporcionar proporción contra múltiples cepas, el fragmento purificado se probó adicionalmente como sigue. Se inmunizaron ratones CD1 (4 semanas de edad) s.c. con tres dosis del antígeno AG3526C (ya sea 10 µg o 20 µg) , formulado en alumbre en los días 0, 31 y 35. 14 días de la ultima inmunización, se infectaron ratones (11 semanas de edad) i.p. con la cepa patógena de E. coli como se indica en la Tabla 5. Se recolectó sangre de la cola después de 24 horas para evaluar la bacteremia. Se monitorizó la mortalidad durante 4 días después de la infección. Se calculó la protección como % de supervivencia en el día 4 y se llevó a cabo el análisis estadístico por prueba exacta de Fsher. En la Tabla 5 posterior se muestran los resultados del estímulo .

Tabla 5 Cepa de A3526C Candidato con Alumbre estimulo 20 pg/alumbre lalum 10 g/alumbre (dosis infecciosa) 1HE3034 Supervivencia: 15/16 Supervivencia: 6/8 (1 X 107 CFU) (93%) (75%) PE: 93% PE: 75% 536 Supervivencia: 5/8 Supervivencia: 6/8 (1 X 107 CFU (62.5%) (75%) i.v.) PE: 50% PE: 66% 9855/93 Supervivencia: 23/47 (1 x 107 CFU) (49%) PE: 39% B616 Supervivencia : 6/8 Supervivencia : (2.5 X 107 (75%) 22/24(91%) PE: 87% CFU) ) PE: 66% Cepa de A3526C Candidato con Alumbre estimulo ¦ 20 pg/alumbre lalum 10 g/alumbre (dosis infecciosa) UR4I/S Supervivencia: 4/8 (2.5 x 107 CFU) (50%) PE: 50% UR40/R Supervivencia: 5/8 % (5 x 106 CFU) (62.5%) PE: 62.5% IN22/R Supervivencia: 7/8 (1 x 107 CFU) (87.5%) PE: 80% Se entenderá que la invención se ha descrito a manera solo de ejemplo y se pueden hacer modificaciones en tanto que se permanezca dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf 526) de E. coli que comprende una mutación con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, caracterizado porque disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli y en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

2. El polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína AcfD (orf3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-19.

3. El polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la mutación selecciona de una supresión de todo o una porción del dominio de metaloproteasa de zincina y una mutación puntual en el dominio de metaloproteasa de zincina que reduce la actividad de la proteasa.

4. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico.

5. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el residuo de unión a zinc es el aminoácido número 1305 en base a la alineación con SEQ ID NO: 1.

6. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales De la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales De la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orr3526) de E. coli, al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 700 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

7. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs 20 a 76; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación SEQ ID NOs : 20 a 76; (c) el menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs : 20 a 76; o (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID NOs : 20 a 76 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal tiene al menos x*y aminoácidos alineados idénticos, en donde x es 30 e y es 0.75, en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

8. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el polipéptido inmunogénico contiene además una supresión con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que incrementa la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la supresión es la remoción de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta la región gly-ser, la remoción de toda o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambas.

10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la supresión es la remoción de al menos los primeros 20 Aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 Aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (?tß526) de E. coli, al menos los primeros 38 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (?tß526) de E. coli, al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

11. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico está aislado, purificado o es recom inante .

12. El polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque además comprende un adyuvante .

13. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

14. Una célula de E. coli, caracterizada porque contiene un plásmido que codifica para el polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

15. Un componente de vacuna, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad de la reivindicación 11.

16. Una vacuna, caracterizada porque comprende el componente de vacuna de conformidad con la reivindicación 15.

17. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

18. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque además comprende un componente adicional de vacuna seleccionado: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneu oniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , un antígeno de Pseudo onas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un. antígeno adicional E. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vijbrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi , un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y µ? antígeno de Klebsiella.

19. Un fragmento de polipéptido inmunogénico, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs 77 a 95; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación a SEQ ID NOs : 77 a 95; (c) al menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs : 77 a 95; o (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID NOs : 77 a 95 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal tiene al menos x»y aminoácidos alineados idénticos, donde x es 30 e y es 0.75 , en donde el polipéptido inmunogénico tiene menor toxicidad en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli y en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

20. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 25 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (?Gß526) de E. coli.

21. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

22. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque la proteína AcfD (orf3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-19.

23. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico está aislado, purificado o es recombinante .

24. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, caracterizado porque además comprende un adyuvante.

25. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-22.

26. Una célula de E. coli, caracterizada porque contiene un plásmido que codifica para el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad de las reivindicaciones 19-22.

27. Un componente de vacuna, caracterizado porque comprende el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con las reivindicaciones 19-23.

28. Una vacuna, caracterizada porque comprende el componente de vacuna de conformidad con la reivindicación 27.

29. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un adyuvante .

30. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque además comprende un componente adicional de vacuna seleccionado de: Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de .Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , un antígeno de Pseudo/nonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antigeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno adicional E. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y un antígeno de Klebsiella.

31. Un fragmento de polipéptido inmunogénico, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que comprende : (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs 20 a 57; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación a SEQ ID NOs : 20 a 57; (c) al menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs : 20 a 57; o (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID NOs: 20 a 57, usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal tiene al menos x*y aminoácidos alineados idénticos, donde x es 30 e y es 0.75, en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como una proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

32. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 700 Aminoácidos N-terminales De la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

33. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 31 o 32, caracterizado porque la proteína AcfD (orf3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-19.

34. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33, caracterizado porque el polipéptido inmunogénico contiene además una supresión con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que incrementa la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

35. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la supresión es la remoción de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta la región gly-ser, la remoción de toda o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambos .

36. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la supresión es la remoción de al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 20 Aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 38 aminoácidos en comparación a la proteína AcfD (orf3526) E. coli, al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

37. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-36, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico es aislado, purificado o recombinante .

38. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-37, caracterizado porque además comprende un adyuvante.

39. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-36.

40. Una célula de E. coli, caracterizada porque contiene un plásmido que codifica para el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones las 31-36.

41. Un componente de vacuna, caracterizado porque comprende el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 37.

42. Una vacuna, caracterizada porque comprende el componente de vacuna de la reivindicación 41.

43. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque además comprende un adyuvante .

44. La vacuna de conformidad con la reivindicación 24 o 43, caracterizada porque además comprende un componente adicional de vacuna seleccionado de: Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus a reus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno adicional E. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi , un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y un antígeno de Klebsiella .

45. Un fragmento de polipéptido inmunogénico, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs 77 a 95; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación a SEQ ID NOs: 76 a 9; (c) al menos 85% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 77 a 65; o (d) cuando se alinea con cualquiera de SEQ ID NOs: 77 a 95, usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el N-terminal al C-terminal tiene al menos x*y aminoácidos alineados idénticos, donde x es 30 e y es 0.75, en donde el polipéptido inmunogénico formula una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como una proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

46. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 10 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 20 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 25 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 33 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

47. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con la reivindicación 31 o 46, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la protéína AcfD (o^526) de · E. coli, al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

48. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-47, caracterizado porque la proteína AcfD (orf3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-19.

49. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-48, caracterizado porque el fragmento de polipéptido inmunogénico es aislado, purificado o recombinante .

50. El fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-49, caracterizado porque además comprende un adyuvante.

51. Un polinucleótido caracterizado porque codifica para el fragmento de a polipéptido inmunogénico de con cualquiera de conformidad las reivindicaciones 31-48.

52. Una célula de E. coli, caracterizada porque comprende un plásmido que codifica para el fragmento de polipéptido inmunogénico de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 31-48.

53. Un componente de vacuna, caracterizado porque comprende el fragmento de polipéptido inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-49.

54. Una vacuna, caracterizada porque comprende el componente de vacuna de conformidad con la reivindicación 53.

55. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque además comprende un adyuvante .

56. La vacuna de conformidad con la reivindicación 54 o 55, caracterizada porque además comprende un componente adicional de vacuna seleccionado de: Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de CornyneJac erium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib) , un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno adicional E. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacteriu tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de histeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y un antígeno de Klebsiella.

57. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende un fragmento de polipéptido inmunogénico con una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs : 77 a 95, en donde el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende los 180 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprende los 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

58. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la proteína AcfD (orf3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 1-19.

59. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 57 o 58, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

60. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el adyuvante comprende (a) 1-12% en volumen de un aceite metabolizable, y (b) de 0.2% a 2.5% en peso de un agente emulsionante, en donde el aceite metabolizable del agente emulsionante están presentes en la forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite sustancialmente todas las cuales son de menos de un micrón de diámetro.

61. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el adyuvante comprende (a) 4-5% en volumen de escualeno, y (b) aproximadamente 1% de un agente emulsionante que comprende monooleato de polioxietilensorbitan y trioleato de sorbitan, en donde el escualeno y el agente emulsionante están presentes en la forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite sustancialmente todas las cuales son de menos de 1 micrón de diámetro.

62. El método para inducir una respuesta inmunitaria contra E. coli, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16-18, 28-30, 42-44, y 54-56 o una composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57-61.