MX2011013231A - Sintesis de hmo. - Google Patents

Abstract

Célula que puede ser cultivada de manera estable en un medio, que ha sido modificada para producir oligosacáridos, donde la célula ha sido transformada de manera tal que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una enzima que participa en la síntesis de los oligosacáridos. Además, la célula ha sido transformada para que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de la familia de los transportadores que participan en la exportación de los azúcares, o un homólogo funcional o un derivado de ésta. Método para producir oligosacáridos donde se emplea la célula mencionada.

Description

SÍNTESIS DE HMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una célula que puede ser cultivada de manera estable en un medio, que ha sido modificada para producir oligosacáridos, donde la célula ha sido transformada de manera tal que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una enzima que participa en la síntesis de los oligosacáridos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Estas células se conocen, por ejemplo, a partir de Dumon et al., 2001.

Desde hace- tiempo, se sabe que la leche materna humana, además de lactosa, comprende una mezcla compleja de oligosacáridos que se conocen como oligosacáridos de la leche humana (HMO). La fracción de los oligosacáridos de la leche materna humana tiene una composición y una cantidad particular de componentes. En contraste con otros mamíferos, la leche materna humana comprende una concentración de oligosacáridos que varía entre 7 y 12 g/|, que es entre 10 y 100 veces mayor que la que puede observarse en la mayoría de los otros mamíferos (Boehm y Stahl, 2007, Kunz et al., 2000, Newburg y Neubauer, 1995).

En la actualidad, se han caracterizado más de 80 compuestos que pertenecen a la clase de los HMO. En general, a diferencia de los otros oligosacáridos que se encuentran en el cuerpo humano, los HMO se caracterizan porque presentan una unidad de lactosa en el extremo reductor y una unidad de fucosa y/o de ácido siálico en el extremo no reductor.

Pueden distinguirse dos tipos básicos: los oligosacá-ridos con estructuras del tipo I comprenden una fucosa unida a través de un enlace <x1 ,4 a un residuo de GIcNAc, mientras que los oligosacáridos con estructuras del tipo II comprenden una fucosilación cc1 ,3 en los residuos de GIcNAc o de glucosa. Cualquiera de ellos puede comprender una fucosa unida a través de un enlace a1 ,2 a una galactosa. Los oligosacáridos más prominentes son la 2'-fucosil-lactosa y la 3-fucosil-lactosa.

Estas estructuras están relacionadas estrechamente con los epitopes de los glucoconjugados que se encuentran en la superficie de las células epiteliales, los antígenos del grupo histo-sanguíneo de Lewis, tales como Lewis x (Lex) (Gal(( i-4)[fuc-(a1 -3)]GlcNAc((pi )) (Newburg, 2001 ). La homología estructural entre los HMO y los epitopes epiteliales es el fundamento de las propiedades de protección contra los patógenos bacterianos.

Por ejemplo, la virulencia de las variantes patogénicas de Escherichia coli (Cravioto et al., 1991 ), de Vibrio cholerae (Coppa et al., 2006), de Streptococcus pneumoniae (Andersson et al., 1986) o de Campilobacter jejuni (Ruiz-Palacios et al., 2003) puede reducirse drásticamente uniendo los patógenos a los HMO en lugar de a los glucanos de la superficie de la mucosa humana, o bien a toxinas, tales como la enterotoxina estable ante el calor de E. coli (Crane et al., 1994).

Además de los efectos locales en el tracto intestinal que se mencionaron con anterioridad, los HMO también pueden provocar efectos sistémicos en los lactantes al ingresar en la circulación sistémica (Gnoth et al., 2001 ). Los efectos que presentan los HMO sobre las interacciones entre las proteínas y los hidratos de carbono, por ejemplo, sobre la unión entre las selectinas y los leucocitos, abarcan la modulación de las respuestas inmunes y la reducción de las respuestas inflamatorias (Bode, 2006, Kunz y Rudloff, 2006).

Con el propósito de reducir la frecuencia de las infecciones contraídas por los neonatos, y como consecuencia, la mortalidad infantil, es evidente que resultará generalmente deseable proveerles a los lactantes una nutrición que incluya HMO. Este objetivo puede cumplirse sin inconvenientes en aquellas sociedades en las que el amamantamiento es una práctica común. Sin embargo, este no siempre es el caso.

Hay numerosas razones médicas, tales como la transmisión posible de enfermedades infecciosas desde las madres hasta los niños, que bajo determinadas circunstancias pueden tornar inconveniente el amamantamiento. Por ejemplo, en muchos países africanos, el amamantamiento puede ser una razón importante para que ocurran infecciones del VIH durante la infancia.

Puede haber circunstancias culturales que tomen inconveniente el amamantamiento, lo cual puede observarse, por ejemplo, en los países industriales importantes, tales como los EEUU.

Debido al hecho de que los HMO pueden hallarse solamente en concentraciones bajas en las fuentes naturales, tales como la leche de otros mamíferos, la extracción de los oligosacáridos de las fuentes naturales no es apropiada para satisfacer la demanda de HMO.

La síntesis química de los oligosacáridos es laboriosa, y para efectuarla es necesario poner en práctica pasos de protección y de desprotección (Kretzschmar y Stahl, 1998), por lo que generalmente resulta costosa y presenta rendimientos reducidos.

Por lo tanto, la producción de oligosacáridos por fermentación, mediante el uso de organismos modificados por medios biotecnológicos, constituye una alternativa prometedora para la síntesis de HMO a gran escala.

Durante la última década, se han publicado informes sobre diversos intentos exitosos de sintetizar HMO usando una fermentación con E. coli recombinante o una conversión con enzimas in vitro. En estos casos, los esfuerzos se han concentrado en la síntesis de compuestos fucosilados pertenecientes a la clase de los HMO o muy similares a ellos.

Por ejemplo, en diversas publicaciones se describe la síntesis de estructuras de Lewis como la lacto-N-neofucopentosa, la lacto-N-neodifucohexosa y la lacto-N-neodifucooctosa, así como la 2'-fucosil-lactosa y la 3-fucosil-lactosa (Albermann et al., 2001 , Dumon et al., 2006, Dumon et al., 2001 , Dumon et al., 2004, Koizumi et al., 2000). En estos casos, la fucosilación con enzimas de eductos como la lactosa se lleva a cabo con fucosiltransferasas (FucT).

En la mayoría de las publicaciones donde se describe la producción de compuestos fucosilados también se describe el uso de FucT provenientes de Helicobacter pilori. En general, las FucT humanas son apropiadas para este propósito. Sin embargo, cuando se las sobreexpresa en células bacterianas, las FucT de fuentes bacterianas generalmente son menos problemáticas en áreas como la producción de pliegues erróneos y la insolubilidad.

Además, la mayoría de los sistemas publicados para sintetizar oligosacáridos fucosilados se basan en la reserva de GDP-fucosa endógena de E. coli, que normalmente se emplea para sintetizar un exopolisacárido que contiene fucosa que se conoce como ácido colónico (Grant et al., 1970). En estos casos, la disponibilidad de GDP-fucosa evidentemente es un factor limitativo que restringe la eficiencia del proceso.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Recientemente, los autores de la presente invención describieron un nuevo proceso de producción donde se emplean células completas y la enzima Fkp (Parkot et al., 2008). Los contenidos completos de la solicitud de patente correspondiente se incorporan en la presente a modo de referencia.

La Fkp (Coyne et al., 2005), que se origina en Bacteroides fagilis, es una enzima bifuncional, que presenta actividad de fucoquinasa y de L-fucosa-1-P-guanililtransfe-rasa. De esta manera, la fucosa que se introduce desde el exterior primero es fosforilada y luego es activada con nucleótidos, con lo que se forma una molécula precursora importante, la GDP-fucosa. La vía de captura de L-fucosa basada en Fkp ha sido usada con éxito para sintetizar oligosacáridos fucosilados (Parkot et al., 2008).

Aunque se han desarrollado estrategias importantes sobre la base de una síntesis bioquímica como la que se mencionó con anterioridad, los métodos conocidos para sintetizar oligosacáridos in vivo presentan determinadas desventajas, que en el peor de los casos dan como resultado la inhibición de la producción en masa de oligosacáridos. Las dificultades más importantes en el contexto de la producción de oligosacáridos con rendimientos elevados a partir de células son el incremento descontrolado en la cantidad de los oligosacáridos producidos y los subproductos con nucleótidos en el interior de las células y la extracción de los oligosacáridos producidos.

Debido a que se acumulan en grandes cantidades en el interior de las células, los productos de la reacción de síntesis pueden inhibir gradualmente las enzimas que participan en la síntesis. Por lo tanto, en un punto determinado, la síntesis se torna ineficientemente lenta. Además, los productos pueden acumularse hasta alcanzar concentraciones citotóxicas, que pueden provocar la lisis de las células, o al menos una interrupción en su metabolismo. En cualquier caso, no es posible producir oligosacáridos continuamente en el interior de las células.

Adicionalmente, puede esperarse que la acumulación de cantidades excesivas de oligosacáridos eventualmente dé como resultado la lisis y la muerte de las células. Si se recurre a la lisis temprana o tardía de las células para extraer los oligosacáridos sintetizados, se obtiene una mezcla compleja de los oligosacáridos deseados y diversos componentes de las células (metabolitos, restos). La purificación de los oligosacáridos deseados a partir de esta mezcla compleja es costosa, por lo que la mayoría de los oligosacáridos no son económicos.

Bajo estas circunstancias, la producción biotécnica de oligosacáridos es muy ineficiente y resulta difícil de controlar, especialmente si se tiene en cuenta que suele ponérsela en práctica usando cultivos en lotes, los cuales no producen resultados satisfactorios desde el punto de vista económico.

Teniendo en cuenta lo anterior, un objetivo de la invención es mejorar los métodos de producción biotécnica de oligosacáridos para obtener procesos más sencillos y controlables y para incrementar el rendimiento de los oligosacáridos en general.

De acuerdo con la invención, estos y otros objetivos se cumplen cuando se provee una célula como la que se mencionó con anterioridad, que además ha sido transformada para que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de la familia de los transportadores que participan en la exportación de los azúcares, o un homólogo funcional o un derivado de ésta.

De esta manera, se cumple completamente el objetivo de la invención.

De acuerdo con la invención, los oligosacáridos hacen referencia a los polímeros cortos de monosacáridos que comprenden al menos 2 subunidades de azúcares. Los oligosacáridos pueden estar ramificados o pueden formar una cadena lineal de subunidades. Más aun, las subunidades de azúcares de los oligosacáridos pueden presentar numerosas modificaciones químicas. Por ende, los oligosacáridos de acuerdo con la presente invención pueden comprender una o más unidades que no son azúcares.

De acuerdo con la invención, una secuencia de ácido nucleico hace referencia a un código genético que está representado por un polímero de ácidos nucleicos, tal como un polímero de ácidos desoxirribonucleicos o un polímero de ácidos ribonucleicos. El código genético puede incluir secuencias codificantes que comprenden información para formar una proteína, así como regiones no codificantes, tales como regiones promotoras, regiones para fijar compuestos reguladores o auxiliares, separadores o secuencias estructurales que influyen en la estructura secundaria o terciaria del propio polímero de ácidos nucleicos y/o que participan en su procesamiento.

De acuerdo con la invención, la transformación hace referencia a cualquier método con el que puede insertarse al .menos una secuencia de ácido nucleico adicional en una célula, de manera tal que la secuencia de ácido nucleico permanezca en el interior de la célula en forma de un plásmido o se integre en los uno o más cromosomas de la célula. Los métodos de transformación conocidos abarcan, por ejemplo, la transformación química y la electroporación. La trangénesis estable, incluso en ausencia de agentes de selección, generalmente puede efectuarse integrando al menos una secuencia de ácido nucleico adicional en los cromosomas. Con este propósito, la célula puede infectarse con un virus o con un fago. Como alternativa, puede recurrirse a otros medios de recombinación homóloga o no homóloga, que por ejemplo, pueden comprender sistemas basados en virus o en transposones.

En el contexto de las aplicaciones biotecnológicas, la exportación de los oligosacáridos más grandes desde las células es un problema complejo. Esto se debe primariamente a que se han identificado unos pocos mecanismos celulares que participan en el transporte. La razón de la frecuencia reducida de la exportación de los oligosacáridos desde las células es que su síntesis implica el consumo de una gran cantidad de recursos ¡ntracelulares, por lo que la pérdida de estos compuestos generalmente resulta desfavorable para las células.

Más aun, la mayoría de los mecanismos conocidos con los que se exportan los oligosacáridos abarcan la modificación química de los oligosacáridos, por ejemplo, su unión a unidades lipídicas (Alaimo et al., 2006). En consecuencia, los oligosacáridos no solamente quedan anclados a la membrana, lo que impide su liberación en el medio, sino que también permanecen unidos a través de enlaces químicos a las unidades lipídicas, lo que reduce su solubilidad en los medios acuosos. Por lo tanto, estos mecanismos no son apropiados para emplearlos en la producción de oligosacáridos a gran escala.

La familia de los transportadores que participan en la exportación de los azúcares (SET), que fue descripta por primera vez por Liu y sus colegas (Liu et al., 1999a) en E. coli, comprende las proteínas SetA, SetB y SetC. Pueden hallarse homólogos de las proteínas transportadoras (con identidades superiores a 50% a nivel de los aminoácidos) primariamente en las Enterobacteriáceae (Liu et al., 1999a).

Además de presentar especificidad por la glucosa y por la lactosa, las proteínas exportadoras de la familia SET presentan especificidad por determinados monosacándós y determinados disacáridos, tales como la molécula inductora isopropil-p-D-tiogalactósido (IPTG) y el análogo de azúcar tóxico O-nitrofenil-p-D-tiogalactósido (ONPG) (Liu et al., 1999b). Sin embargo, por medio de estudios bioquímicos se ha demostrado, por ejemplo, que SetA presenta una actividad de transporte reducida o nula con moléculas más grandes o voluminosas, tales como las heptosas o los trisacáridos.

Por las razones que se mencionaron con anterioridad, no puede esperarse qué las proteínas exportadoras de la familia SET sean apropiadas para transportar los oligosacáridos.

Sin embargo, los inventores descubrieron que, mediante la sobreexpresión de las proteínas exportadoras de la familia SET, sorprendentemente se obtiene una exportación muy eficiente de oligosacáridos.

Más aun, se ha demostrado que las proteínas de la familia SET exportan lactosa, que es uno de los eductos en la reacción de síntesis. Entonces, podía esperarse que la síntesis de los oligosacáridos en las células modificadas procediera con una eficiencia y una velocidad muy bajas, debido a la eliminación constante de los eductos de las células.

Sin embargo, los inventores demostraron por primera vez que, a pesar de la sobreexpresión de las proteínas exportadoras de la familia SET, la síntesis de oligosacáridos resulta altamente productiva en las células modificadas.

En general, resulta preferible que la célula se seleccione del grupo que consiste en las células bacterianas, las células fúngicas, las células animales y las células vegetales. En el contexto de la presente invención, resulta particularmente preferible que la célula sea una célula de Escherichia coli.

La ventaja de la presente invención es que las células de E. coli presentan una actividad metabólica y una frecuencia reproductiva elevadas. Además, E. coli es uno de los organismos que mejor han sido caracterizados a nivel molecular para propósitos biológicos y biotécnicos. Diversos procedimientos para transformar y cultivar bacterias que son conocidos en la técnica han sido adaptados especialmente para E. coli. Además, en el ámbito comercial hay disponibles cepas de E coli que presentan diversos antecedentes genéticos.

Adicionalmente, resulta preferible que la enzima se seleccione del grupo que consiste en la glicosiltransferasa, la glicosiltransferasa del tipo de Leloir, la glicosíltransferasa de un tipo diferente al de Leloir, la sialiltransferasa, la galactosiltransferasa, la fucosiltransferasa, la manosiltransferasa, la N-acetilglucosaminiltransferasa y la N-acetilgalactosaminiltransferasa.

De acuerdo con una forma de realización, la enzima es una fucosiltransferasa.

Más aun, resulta preferible que el transportador que participa en la exportación dé los azúcares sea SetA o un derivado de éste. En este caso, la ventaja es que, entre los miembros de la familia de proteínas de transporte SET que han sido caracterizados a nivel bioquímico, SetA presenta la especificidad más amplia por los sustratos. De esta manera, con SetA puede ser posible exportar y producir una variedad más amplia de oligosacáridos.

También resulta preferible que la célula haya sido transformada para que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína que facilite o promueva la importación de los eductos que son necesarios para sintetizar los oligosacáridos.

En este caso, resulta ventajoso incrementar la concentración de los eductos en las células. Bajo circunstancias normales, la importación de eductos como la fucosa o la lactosa está limitada por la disponibilidad de las proteínas importadoras correspondientes. Sin embargo, en el caso de una célula que ha sido modificada para sintetizar oligosacáridos a gran escala, la importación de los eductos basada en los niveles endógenos de las proteínas importadoras puede ser insuficiente para proveer un suministro constante para la reacción de síntesis. Este problema puede solucionarse sobreexpresando las proteínas importadoras en cuestión.

Las proteínas importadoras relevantes para la presente invención son primariamente los importadores de monosacáridos o de disacáridos, tales como los importadores de lactosa, por ejemplo, la ß-galactósido permeasa de £ coli (LacY), o los importadores de fucosa, por ejemplo, la fucosa permeasa de E. coli (FucP), así como los importadores de nucleótidos y de otros eductos.

Resulta especialmente preferible que la célula haya sido transformada para que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una protelna seleccionada del grupo que consiste en un transportador de lactosa, un transportador de fucosa, un transportador de ácido siálico, un transportador de galactosa, un transportador de mañosa, un transportador de N-acetilglucosamina, un transportador de N-acetilgalactosamina', un transportador ABC, un transportador de un azúcar activado con un nucleótido y un transportador de una nucleobase, de un nucleósido o de un nucleótido.

En este contexto, un azúcar activado con un nucleótido puede ser, sin limitaciones, la GDP-fucosa, el CMP-ácido siálico, la UDP-galactosa, la UDP-glucosa, la GDP-manosa, la UDP-glucosamina o la UDP-galactosamina.

Además, el término nucleobase abarca la guanina, la citosina, la adenina, la timina y el uracilo. Los nucleósidos abarcan la guanosina, la citidina, la adenosina, la timidina y la uridina, mientras que los nucleótidos pueden ser monofosfatos, difosfatos o trifosfatos de guanosin , de citidina, de adenosina, de timidina o de uridina.

Adicionalmente, resulta preferible que la célula también haya sido transformada para que comprenda al menos una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína seleccionada del grupo que consiste en la nucleotidiltransferasa, la guaniliitransferasa, la uridililtransferasa, Fkp, la L-fucosa quinasa, la fucosa-1 -fosfato guaniliitransferasa, la CMP-ácido siálico sintetasa, la galactosa quinasa, la galactosa-1 -fosfato uridililtransferasa, la glucosa quinasa, la glucosa-1 -fosfato uridililtransferasa, la mañosa quinasa, la manosa-1 -fosfato guaniliitransferasa, la GDP- -céto-6-desoxi-D-manosa reductasa, la glucosamina quinasa, la glucosaminafosfato acetiltransferasa, la N-acetil-glucosamina-fosfato uridililtransferasa, la UDP-N-acetilglucosamina 4-epimerasa y la UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa.

En este contexto, el término nucleotidil transferasa generalmente hace referencia a una enzima que puede transferir nucleótidos a fosfoazúcares, que pueden ser azúcares naturales o no naturales.

En este caso, tal como se describe en Parkot et al., 2008, que se incorpora en la presente a modo de referencia, la ventaja es que pueden incrementarse las reservas intracelularés de azúcares activados con nucleótidos, tales como la GDP-fucosa, con lo que puede incrementarse la eficiencia de la síntesis de los oligosacáridos. Más aun, generalmente resulta preferible inactivar al menos parcialmente la vfa catabólica de los monosacáridos, los disacáridos o los oligosacáridos que son necesarios para la reacción de síntesis en cuestión.

De esta manera, la ventaja se basa en el hecho de que puede incrementarse la eficiencia general de la síntesis. Esto se debe a que se consume una menor cantidad de los eductos que están destinados a la síntesis de los oligosacáridos a través del metabolismo endógeno de la célula.

En la forma de realización que se describirá más adelante, por ejemplo, se emplean células que presentan deficiencias a nivel de la degradación de la lactosa. Esto puede efectuarse inactivando la enzima ß-galactosidasa, que está codificada por el gen lacZ. Con esta modificación genética, se impide la escisión intracelular de la lactosa en monosacáridos que pueden ser metabolizados rápidamente, tales como la glucosa y la galactosa. De esta manera, la lactosa está presente en una mayor concentración, como una molécula aceptara que puede participar en las reacciones de glucosilación/fucosilación.

En una forma de realización alternativa, las células que se emplean para sintetizar los oligosacáridos presentan deficiencias a nivel de la degradación de la L-fucosa, que pueden estar combinadas o no con la deficiencia a nivel de lacZ que se describió con anterioridad. Esto puede efectuarse inactivando el gen fucA, que codifica una enzima catabólica fundamental en la vía de la degradación de la fucosa, la fuculosa-1 -fosfato aldolasa (FucA).

Evidentemente, es posible emplear otros procedimientos para inactivar al menos parcialmente las vías catabólicas, que abarcan los inhibidores enzimáticos y la transfección estable con construcciones de ARNi.

Dentro del alcance de la presente invención, generalmente resulta preferible que los oligosacáridos comprendan al menos tres subunidades y/o que presenten un peso molecular de al menos aproximadamente 480 g/mol.

Los HMO más importantes tienen un peso molecular superior a este umbral.

La presente invención también se relaciona con un método para producir oligosacáridos que comprende los siguientes pasos: a) proveer una célula de acuerdo con la invención, b) cultivar la célula en un medio, bajo condiciones apropiadas para producir los oligosacáridos, y c) extraer los oligosacáridos del medio de cultivo.

Dentro del alcance de la presente invención, las condiciones apropiadas son condiciones que están relacionadas con parámetros físicos o químicos, que incluyen, sin limitaciones, la temperatura, el pH, la presión, la presión osmótica y la concentración de productos o de educios.

En una forma de realización particular, las condiciones apropiadas pueden incluir una temperatura en el rango de 30 ± 20°C y un pH en el rango de 7 ± 3.

La ventaja del método que se describió con anterioridad es que los oligosacáridos pueden extraerse directamente del medio de cultivo, mientras que en los métodos conocidos precedentes es necesario lisar las células y luego extraer los oligosacáridos del lisado resultante.

En este contexto, resulta preferible que el paso b) se lleve a cabo usando un biorreactor de flujo continuo.

Cuando se emplea un biorreactor de flujo continuo, se obtiene la ventaja de que puede incrementarse fácilmente la cantidad de oligosacáridos producidos. Esto se debe a que la síntesis ocurre en un nivel continuamente elevado.

También resulta preferible que el medio en el paso b) comprenda una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en los suplementos básicos para soportar el crecimiento y la propagación de las células, los agentes de selección, los efectores de la actividad de los genes y los educios necesarios para sintetizar los oligosacáridos.

Los suplementos típicos para soportar el crecimiento y la propagación de las células son bien conocidos a partir de los antecedentes técnicos y se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russel, 2001. Estos suplementos básicos sirven para satisfacer la demanda general de nutrientes de las células, y por ejemplo, abarcan las proteínas, los hidratos de carbono, los lípidos y los minerales.

A partir de los antecedentes técnicos, tales como Sambrook y Russel, 2001 , también se conocen los agentes de selección, que pueden ser antibióticos. Estos agentes pueden usarse para proteger los cultivos de células modificadas genéticamente de la contaminación persistente con organismos competidores, que pueden ser hongos o bacterias. Adicionalmente, por ejemplo, en las poblaciones de bacterias, los agentes de selección pueden emplearse para estabilizar la información genética que está presente en los plásmidos.

Los efectores de la actividad de los genes pueden usarse para inducir o reprimir selectivamente la actividad de determinados genes o conjuntos de genes en una célula. Éstos efectores pueden ser compuestos químicos simples, tales como el isopropil-1 -tio-^ -D-galactopiranósido (IPTG), o compuestos más complejos, tales como las hormonas. Los efectores de la actividad de los genes también son conocidos a partir de los antecedentes técnicos, por ejemplo, Sambrook y Russel, 2001.

Aun más, resulta preferible que los eductos se seleccionen del grupo que consiste en la arabinosa, la treosa, la eritrosa, la ribosa, la ribulosa, la xilosa, la glucosa, la D-2-desox¡-2-amino-glucosa, la N-acetilglucosamina, la glucosamina, la fructosa, la mañosa, la galactosa, la N-acetílgalactosamina, la galactosamina, la sorbosa, la fucosa, el ácido N-acetilneuramínicó, los glucósidos, los azúcares no naturales, las nucleobases, los nucleósidos, los nucleótidos y cualquier dlmero o polímero posible de éstos.

En general, resulta preferible que los oligosacáridos comprendan al menos tres subunidades y/o presenten un peso molecular de al menos aproximadamente 480 g/mol.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, el oligosacárido que se produce con el método que se describió con anterioridad es la fucosil-lactosa. En este caso, la ventaja es que la fucosil-lactosa es uno de los HMO más prominentes. Pueden deducirse otras ventajas a partir de la descripción de las formas de realización y los dibujos adjuntos.

Ha de resultar evidente que las características que se describieron con anterioridad y las características que se describirán más adelante pueden combinarse de cualquier manera posible, sin apartarse del alcance de la presente invención.

En la descripción detallada más adelante y en las figuras, que se describen a continuación, se detallan diversas formas de realización de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación esquemática de la síntesis y el transporte de los oligosacáridos en el interior de una célula bacteriana gram negativa modificada de acuerdo con la invención.

En la figura 2 se ilustran los resultados de las mediciones de la 3-fucosil-lactosa en masas húmedas y sobrenadantes celulares provenientes de cultivos de bacterias, con una comparación entre diversos genotipos.

En la figura 3 se ilustra una comparación de la cantidad de 3-fucosil-lactosa sintetizada en cultivos de bacterias con diversos genotipos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1. Síntesis y transporte de oligosacáridos en forma de aceite en el interior de una célula bacteriana gram negativa En la figura 1 se representa una sección de una célula bacteriana gram negativa 10. La célula bacteriana gram negativa 10 de acuerdo con la invención comprende una membrana externa 11 , una membrana plasmática 12, un espacio periplásmico 13, que está localizado entre la membrana externa 11 y la membrana plasmática 12, y un citosol 14, que es el espacio rodeado por la membrana plasmática 12. La membrana externa comprende porinas, a través de las cuales pueden pasar los compuestos solubles en agua desde el medio 16 hasta el espacio periplásmico 13, y viceversa.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la membrana plasmática comprende FucP, que sirve como transportador para el primer educto 17, LacY, que sirve como transportador para el segundo educto 18, y SetA, que sirve para exportar el producto.

En el citosol 14 también están presentes los siguientes componentes: Fkp, que sirve como nucleotidiltransferasa 20, y FutAco, que sirve como glicosiltransferasa 21.

De acuerdo con esta forma de realización, cuando se introduce fucosa como primer educto 22 y lactosa como segundo educto 23 en el medio 16, éstas ingresan en el espacio periplásmico 13 a través de la porina 15. Después, el primer educto 22 es transportado hacia el citosol 14 por el transportador del primer educto 17. En el citosol, el primer educto 22 es modificado por la nucleotidiltransferasa 20 para obtener un primer educto modificado con un nucleótido 24, la GDP-fucosa.

El segundo educto 23 es importado en el citosol 14 por el importador del segundo educto 15.

Posteriormente, la glicosiltransferasa 21 cataliza una reacción entre el primer educto modificado con un nucleótido, la GDP-fucosa, y el segundo educto, la lactosa, con lo que se obtiene el oligosacárido 25, la 3-fucosil-lactosa, y GDP (que no se ilustra).

Después, el oligosacárido 25 es exportado por el exportador del producto 19 (SetA) desde el citosol 14 hasta el espacio periplásmico 13, a partir del cual puede llegar al espacio periplásmico 13 e ingresar en el medio 16 a través de las porinas 15.

Ejemplo 2. Materiales v métodos 2.1. Construcción de los plásmidos de expresión y desarrollo de las cepas de E. coli Se usó E. coli JM109(DE3) (Promega; www.promega.com) como cepa huésped inicial para desarrollar ia cepa de producción de E. coli. Los oligonucleótidos cebadores que se emplearon en los procedimientos de clonación se detallan en la tabla 1. A continuación se describe la construcción de los plásmidos pACIC-/acY y pACIC-/acY-seM. Los genes lacY (que corresponde al acceso GenBank N° ACB02461 ; www.ncbi.nlm.nih.gov) y setA (que corresponde al acceso GenBank N° YP 025293) fueron amplificados a partir de ADN genómico de £. coli TOP10 (Invitrogen; www.invitrogen.com), usando los cebadores directo con lacY Ncol e inverso con lacY EcoRI y directo con setA Ndel e inverso con setA Xhol. Los productos de la PCR fueron sometidos a una digestión con las enzimas de restricción mencionadas y fueron unidos al vector de expresión pACICDuet-1 (Novagen; www.merckbiosciences.co.uk), que había sido digerido de manera apropiada.

Los plásmidos resultantes se verificaron por medio de una digestión con enzimas de restricción, con una electroforesis en gel de a agarosa y con una secuenciación con los cebadores pACICduetUPI , DuetDOWN-1 , DuetUP2 y T7-terminador, para comprobar la inserción correcta de los genes (datos no presentados). Los plásmidos empleados, pCOLA-tkp-fucP y pET-futAco, son plásmidos que han sido construidos con anterioridad (Parkot et al., 2008). Para obtener las cepas JM00, JM01 y JM02, se introdujeron diversas combinaciones de plásmidos en E. coli JM109(pE3) por electroporación (Dower et al., 1988). Los plásmidos y las cepas de bacterias se detallan en la tabla 2. 2.2. Inactivación del catabolismo de la fucosa en E. coli Para prevenir la degradación de la fucosa provista desde el exterior, se suprimió el gen fucA, que codifica la L-fuculosa-1 -fosfato aldolasa, que es una enzima fundamental en el catabolismo de la fucosa, del cromosoma de E. coli J 109(DE3). Los oligonucleótidos cebadores que se emplearon en los procedimientos de mutagénesis se detallan en la tabla 1. Para construir la muíante con la supresión en fucA, se empleó la metodología de Datsenko y Wanner (Datsenko y Wanner, 2000) y los cebadores ftvcA-knock-f y ftvoA-knock-r. La supresión correcta de fucA se confirmó por medio de una PCR donde se usaron los cebadores ftvc/4-control-f y fuc4-control-r, que rodean la localización de la inserción en el cromosoma. El fenotipo negativo para fucosa se verificó sembrando las bacterias en agar mínimo M9 (Sambrook y Russell, 2001 ), con la adición de fucosa como única fuente de carbono (datos no presentados).

Tabla 1. Cebadores usados en el estudio Nombre Secuencia (5'-»3')* Sitio de restricción agregado ft/cA-knock-f AATTACTCTTCAATTCGTAAC CCATAGGTTTTGAATTTCTC CAGCACTACGGCAATCTCTT CATCGCTCAGCAGTGTAGG CTGGAGCTGCTTCGAAGTTC ft/C/4-knock-r GGTGGGTAATTAAACGGCTA ATTCAATAGTGTGAAAGGAA CAACATTATTGCCCTGTTTT GAATCAGAGAGAGGGCTGA CATGGGAATTAGCCATGGTC C ftvc>4-control-f CATTCTGTTAGCCATCATCC TTCTCC ftvoA-control-r GAAGAAGATGGTGGGTAATT AAACGGC Directo con setA AAGGGAAAAACATATGATCT Ndel Ndel GGATAATGACGATGGCTCG CCGTATGAACGGTG Inverso con setA AAGGGAAAAACTCGAGCCA Xhol Xhol CGTCATCAAACGTCTTTAAC CTTTGCGG Directo con lacY Ncol AAGGAAATATACCATGGGCT Ncol ACTATTTAAAAAACACAAACT TTTGGATGTTCGG Inverso con lacY AAGGAAAACCGAATTCGATT EcoRI EcoRI GCTTAAGCGACTTCATTCAC CTGACGACGCAGCAGGG pACICduetUPI GGATCTCGACGCTCTCCCT DuetD04VN-1 GATTATGCGGCCGTGTACAA DuetUP2 TTGTACACGGCCGCATAATC T7-terminador TATGCTAGTTATTGCTCAG *Los sitios para las endonucleasas de restricción se representan subrayados.

Tabla 2. Cepas de bacterias y plásmidos empleados en el estudio.

Nombre Características relevantes Referencias Cepas de E. coli TOP10 F- mcrA, A(mrr-hsdRMS-mcrBC), Invitrogen <f>801acZAM15, AlacX74, recAI, araD139, A(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endAI nupG JM109(DE3) endA1, recAI, gyrA96, thi, hsdR17 (r , Promega mk+), relA1, supE44, Á-, A(lac proAB), [F, traD36, proAB, la-cl°ZAM15], 1 DE3 JM109(DE3) fucA Una mutante de JM109(DE3) con una Este supresión en fue A estudio JM00 Una cepa control negativa Este JM109(DE3) con los vectores vacíos estudio pCOLADuet-1 , pETDuet-1 y pACICDuet-1 JM01 JM109(DE3) con pCOLA-f kp-fucP, Este pET-MAco y pACIC-/acV estudio JM02 JM109(DE3) con pCOLA-f kp-fucP, Este pET-futAco y pACIC-/ac Y-setA estudio JM03 JM109(DE3) con pCOLA-fkp-fucP y Este pA-CYC-/acy-seM estudio JMAOO Una cepa control negativa Este JM109(DE3) AfucA con los vectores estudio vacíos pCOLADuet-1 , pETDuet-1 y pACICDuet-1 ???01 JM109(DE3) AfucA con pCOLA-fl p- Este fucP, pET-futAco y pACIC-/acY estudio ???02 JM109(DE3) AfucA con pCOLA-f/f- Este fucP, pET-futAco y pACIC-/acV-seM estudio ???03 JM109(DE3) AfucA con pCOLA-f/cp- Este fucP y pACIC-/acY-seM estudio Plásmidos pCOLADuet-1 Vector de expresión, KmR Novagen pETDuet-1 Vector de expresión, ApR Novagen pACICDuet-1 Vector de expresión, CmR Novagen pCOLA-fkp-fucP Un vector con los genes fkp y fucP, Parkot et KmR al., 2008 pET-MAco Un vector con un gen de Parkot et fucosiltransferasa de H. pilori sometido al., 2008 a una optimización de codones, ApR pAC\C-lacY Un vector con un gen lacY, CmR Este estudio pAC\C-lacY-setA Un vector con los genes lacY y setA, Este CmR estudio ApR, resistencia a la ampicilina; KmR, resistencia a la kanamicina; CmR, resistencia al cloranfenicol. 2.3. Condiciones del cultivo y preparación de los extractos celulares Las cepas de E. coli se inocularon en una dilución de 1 :100, a partir de cultivos que se habían desarrollado durante la noche en 100 mi de un medio mineral (Samain et al., 1999) que contenía 7,0 g/l de NH4H2P04, 7,0 g/l de K2HP04, 1 ,0 g/l de MgS0 7 H20, 0,5 g/l de ácido cítrico, 2,0 g/l de KOH, 0,0045 g/l de tiamina-HCI y 7,5 ml/l de una solución de minerales traza. La solución madre de minerales traza contenía triacetato de nitrilo 70 mM (pH 6,5), 7,5 g/l de citrato férrico, 1 ,3 g/l de MnCI2-4 H20, 0,21 g/l de CoCI2-6 H20, 0,13 g/l de CuCI2-2 H20, 0,25 g/l de H3B03, 1 ,2 g/l de ZnS04-7 H20 y 0, 15 g/l de Na2MoCy2 H20. Al medio se le agregó 0,1% de glucosa y 1 % de glicerol como fuentes de carbono y 100 pg/ml de ampicilina, 50 pg/ml de kanamicina y/o 20 pg/ml de cloranfenicol, antes de realizar una incubación en un agitador rotativo a 37°C, de manera tal de proveer una buena aireación.

Cuando los cultivos alcanzaron una densidad óptica (OD600 nm) de aproximadamente 1 ,0, se agregó el inductor isopropil-1-tio- -D-galactopiranósido (IPTG) en una concentración de 0,5 mM y se incubaron los cultivos durante la noche a 28°C, con agitación constante. Después de aproximadamente 16 horas, se agregó L-fucosa 40 mM y lactosa 20 mM. Luego se incubaron los cultivos de manera continua a 28°C, con agitación constante.

En diversos puntos de tiempo, se tomaron muestras de 20 mi de los cultivos y se cosecharon las células por centrifugación. Los sobrenadantes de los cultivos fueron separados y fueron sometidos de inmediato a un análisis de cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño (HPAEC), o bien fueron almacenados a -20°C. Los precipitados celulares se lavaron con PBS (Sambrook y Russell, 2001 ), se suspendieron nuevamente en el quíntuple del volumen de agua destilada y se lisaron calentándolos a ebullición durante 10 minutos. Para obtener las fracciones intracelulares, se separaron los residuos celulares por centrifugación, y el lisado celular transparente se almacenó a -20°C o se sometió de inmediato a un análisis de HPAEC. 2.4. SDS-PAGE La expresión de las proteínas heterólogas se verificó por SDS-PAGE (Sambrook y Russell, 2001 ; datos no presentados). Se prepararon extractos de proteínas en un amortiguador de carga para SDS en gel 1x y se colorearon los geles de poliacrilamida con azul brillante de Coomassie. 2.5. Detección de los oligosacáridos por medio de una cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño con una detección amperométrica con pulsos (HPAEC-PAD) Las muestras fueron sometidas a un análisis de cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño (HPAEC), con un detector amperométrico con pulsos Decade II (PAD; Antee Leyden; www.antec-leyden.nl) y una columna CarboPac PA20 (Dionex; www.dionex.com) conectada con un sistema de HPLC (Shimadzu; www.shimadzu.eu). La sensibilidad del detector se fijó en 50 pA, con un potencial de pulsación de 0,05 V.

Los monosacáridos, los disacáridos y los oligosacáridos fueron eluidos con hidróxido de sodio 10 mM, con una velocidad de flujo de 0,4 ml/minuto. Después realizar una elución ¡socrática con NaOH 10 mM durante 30 minutos, se lavó la columna con NaOH 200 mM durante 20 minutos, hasta alcanzar tiempos de retención constantes, y luego se realizó una regeneración con NaOH 10 mM durante 20 minutos. En todas las muestras analizadas, se usaron 20 µ? de diluciones 1 :2 en dH20 para llevar a cabo el análisis de HPAEC. Con el análisis de HPAEC-PAD, se obtuvieron tiempos de retención de aproximadamente 3,5 minutos para la referencia de L-fucosa, de aproximadamente 15 minutos para la referencia de lactosa y de aproximadamente 1 1-12 minutos para la referencia de 3-fucosil-lactosa en la columna (datos no presentados). Las sustancias de referencia glicerol y glucosa, que habían sido agregadas al medio de cultivo como fuentes de carbono, presentaron tiempos de retención de aproximadamente 1 ,5 minutos y 7-8 minutos, respectivamente.

Ejemplo 3. Producción de 3-fucosil-lactosa y secreción dependiente de SetA en el medio de cultivo en una E. coli recombinante El objetivo de este experimento fue investigar la exportación mediada por SetA dé la 3-fucosil-lactosa ¡ntracelular. Se usaron las cepas de E. coli JM01 y JM02 (véase la tabla 2) en experimentos de fermentación. Las cepas JM01 y JM02, en las cuales se expresan las enzimas Fkp y FutAco (1 ,3-fucosiltransferasa) y las proteínas transportadoras FucP y LacY, solamente difieren por la expresión del transportador SetA. En JM01 no se produce SetA en exceso, mientras que en JM02 se produce SetA en exceso.

En la figura 2 se ilustran las cantidades de 3-fucosil-lactosa en masas húmedas y sobrenadantes celulares provenientes de cultivos de E. coli JM01 y JM02, donde dichas cantidades se determinaron con análisis de HPAEC-PAD.

Para determinar el efecto de la sobreexpresión de SetA, se llevaron a cabo mediciones 7, 24 y 32 horas después de la inducción de la expresión de fkp, de fucP, de lacY, de futAcó y de setA.

En la figura, se representan las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa que se midieron en E. coli JM01 (donde no se sobreexpresa SetA) en las columnas I, mientras que las fracciones intracelulares se representan en las columnas II. En el caso de E. coli J 02 (donde se sobreexpresa SetA), se representan las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa en las columnas III y las fracciones intracelulares en las columnas IV. Todos los valores representan las medias obtenidas en experimentos por duplicado. Las barras de error representan las desviaciones estándar respectivas.

Sobre la base de estas mediciones, puede establecerse que en la cepa JM01 , donde no se sobreexpresa SetA, se acumula 3-fucosil-lactosa en la fracción del citosol.

En contraste, la concentración intracelular de 3-fucosil-lactosa en la cepa JM002, donde se sobreexpresa SetA, es inferior al nivel de detección.

Adicionalmente, los sobrenadantes de los cultivos de JM01 y de JM02 presentan un contenido determinado de 3-fucosil-lactosa. Sin embargo, el contenido de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante del cultivo de JM02 es mucho mayor que el contenido de 3-fucosil-lactosá en el sobrenadante del cultivo de JM01. Si bien la concentración de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante de JM01 fue de aproximadamente 21 mg/l después de 32 horas, la concentración de 3-fucosil-lactosa en el caso de JM02 fue superior a 51 mg/l.

La comparación de las cantidades totales de 3-fucosil-lactosa en los cultivos de E. coli JM01 y JM02 se ilustra en la figura 3.

En la figura 3, la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en los cultivos de E. coli JM01 se representa en las columnas I, y la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en los cultivos de E. coli JM02 se representa en las columnas II. Una vez más, se proveen los valores medios obtenidos en experimentos por duplicado.

Después de 32 horas de incubación, la cepa JM02 produce un total de 51 ,68 mg/l de 3-fucosil-lactosa, aproximadamente 57% más que la cepa JM01 (32,99 mg/l).

Ejemplo 4. Discusión Sobre la base de los resultados experimentales del análisis de HPAEC-PAD, puede establecerse que hay diferencias a nivel de la síntesis y el transporte de la 3-fucosil-lactosa entre las cepas JM01, donde no se sobreexpresa SetA, y JM02, donde se sobreexpresa SetA.

En primer lugar, no es posible detectar la 3-fucosil-lactosa en la masa celular húmeda del cultivo de J 02, mientras que puede observarse una concentración elevada de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante.

Esto refleja claramente que la sobreexpresión de SetA en E. coli da como resultado una exportación muy eficiente de 3-fucosil-lactosa desde la célula.

De esta manera, los inventores demostraron que SetA, en contraste con lo que podría haberse esperado sobre la base de los antecedentes técnicos, puede exportar oligosacáridos más grandes de manera eficiente. En este caso, los oligosacáridos comprenden tres subunidades y presentan una masa molecular de 488 g/mol.

En contraste, fue posible detectar una cantidad considerable de 3-fucosil-lactosa en la masa celular húmeda del cultivo de JM01 , mientras que en el sobrenadante se observó una cantidad comparativamente muy pequeña.

Esto refleja que, en ausencia de la sobreexpresión de SetA, la 3-fucosil-lactosa se acumula en grandes cantidades en el citosol de las células bacterianas. Sobre la base del conocimiento técnico actual, la detección de la 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante, también bajo estas circunstancias, puede atribuirse a una lisis incrementada de las células bacterianas, que puede ser el resultado de las concentraciones elevadas de 3-fucosil-lactosa en su interior.

Cuando se comparan las cantidades totales de 3-fucosil-lactosa en los cultivos de J 01 y de JM02, resulta evidente que la sobreexpresión de SetA no solamente da como resultado una concentración incrementada de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante, sino que también provoca un incremento en la cantidad de 3-fucosil-lactosa sintetizada (véase la figura 3).

Este incremento en la eficiencia general de la síntesis puede atribuirse a una mayor viabilidad de las células donde se sobreexpresa SetA, que puede deberse a la anulación de la citotoxicidad provocada por el producto. Como alternativa o adicionalmente, el incremento én la eficiencia general de la síntesis puede atribuirse a la anulación de los efectos de inhibición de las enzimas que participan en la síntesis que podrían ser provocados por el producto, merced a la exportación del producto mediada por el transportador SetA sobreexpresado.

Por lo tanto, los inventores demostraron que la sobreexpresión del transportador SetA es un abordaje eficiente para incrementar el rendimiento de la síntesis de los oligosacáridos, que puede ponerse en práctica con métodos biotécnicos donde se emplean células en cultivos. Además, debido a que puede evitarse en gran medida la inhibición de las enzimas que participan en la síntesis que puede ser provocada por el producto y la citotoxicidad que puede ser provocada por los productos de la síntesis, puede facilitarse y controlarse más apropiadamente la producción. LISTA DE REFERENCIAS Alaimo, C, Catrein, L, Morf, L, Marolda, C. L, Callewaert, N., Valvano, M. A., Feldman, M. F., y M. Aebi, (2006) Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO 125(5): 967-976.

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Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una célula que puede ser cultivada de manera estable en un medio, que está modificada para producir oligosacáridos, donde la célula está transformada de manera tal que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que participa en la síntesis de los oligosacáridos, caracterizada porque la célula también está transformada de manera tal que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la familia de los transportadores que participan en la exportación de los azúcares, o un homólogo funcional o un derivado de ésta.

2. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste en las células bacterianas, las células fúngicas, las células animales y las células vegetales.

3. Una célula de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque la célula es una célula de Escherichia coli.

4. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la enzima se selecciona del grupo que consiste en la glicosiltransferasa, la glicosiltransferasa del tipo de Lelcir, la glicosiltransferasa de un tipo diferente al de Leloir, la sialiltransferasa, la galactosiltransferasa, la fucosiltransferasa, la manosiltransferasa, la N-acetilglucosaminiltransferasa y la N-acetilgalactosaminiltransferasa.

5. Una célula de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque la enzima es una fucosiltransferasa.

6. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el transportador que participa en la exportación de los azúcares es SetA o un derivado de éste.

7. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque también ha sido transformada de manera tal que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que facilita o promueve la importación de los eductos que son necesarios para sintetizar los oligosacáridos.

8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque ha sido transformada de manera tal que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una protelna seleccionada del grupo que consiste en el transportador de la lactosa, el transportador de la fucosa, el transportador del ácido siálico, el transportador de la galactosa, el transportador de la mañosa, el transportador de la N-acetilglucosamina, el transportador de la N-acetilgalactosamina, el transportador ABC, un transportador de un azúcar activado con un nucleótido y un transportador de una nucleobase, de un nucleósido o de un nucleótido.

9. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque también ha sido transformada de manera tal que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en la nucleotidiltransferasa, la guanililtransferasa, la uridililtransferasa, Fkp, la L-fucosa quinasa, la fucosa-1 -fosfato guanililtransferasa, la CMP-ácido siálico sintetasa, la galactosa quinasa, la galactosa-1 -fosfato uridililtransferasa, la glucosa quinasa, la glucosa-1 -fosfato uridililtransferasa, la mañosa quinasa, la manosa-1 -fosfato guanililtransferasa, la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-mánosa reductasa, la glucosamina quinasa, la glucosaminafosfato acetiltransferasa, la N-acetil-glucosamina-fosfato uridililtransferasa, la UDP-N-acetilglucosamina 4-epimerasa y la UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa.

10. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende una vía catabólica de un monosacárido, un disacárido o un oligosacárido seleccionado que ha sido inactivada al menos parcialmente, donde el monosacárido, el disacárido o el oligosacárido son necesarios para sintetizar los oligosacáridos mencionados.

11. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque los oligosacáridos comprenden al menos tres subunidades y/o presentan un peso molecular de al menos aproximadamente 480 g/mol.

12. Un método para producir oligosacáridos que comprende los siguientes pasos: a) proveer una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , b) cultivar la célula en un medio, bajo condiciones apropiadas para producir los oligosacáridos, y c) extraer los oligosacáridos del medio de cultivo.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado el paso b) se lleva a cabo usando un biorreactor de flujo continuo.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el medio en el paso b) comprende una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en los suplementos básicos para soportar el crecimiento y la propagación de las células, los agentes de selección, los eductos necesarios para sintetizar los oligosacáridos y los efectores de la actividad de los genes.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque los eductos se seleccionan del grupo que consiste en la arabinosa, la treosa, la eritrosa, la ribosa, la ribulosa, la xilosa, la glucosa, la D-2-desoxi-2-amino-glucosa, la N-acetilglucosamina, la glucosamina, la fructosa, la mañosa, la galactosa, la N-acetilgalactosamina, la galactosamina, la sorbosa, la fucosa, el ácido N-acetilneuramínico, los glucósidos, los azúcares no naturales, las nucleobases, los nucleósidos, los nucleótidos y cualquier dímero o polímero posible de éstos.

16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque los oligosacáridos comprenden al menos tres subunidades y/o presentan un peso molecular de al menos aproximadamente 480 g/mol.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque el oligosacárido es la fucosil-lactosa.