MX2011008764A - Uso del modulador de actividad de vgii3 para la modulacion de adipogenesis. - Google Patents

Abstract

La presente ¡nvención se refiere a VgII3 un nuevo objetivo que participan en la modulación de adipogénesis. Además, la presente invención se refiere a métodos para incrementar la actividad de Vgll3 en adipocitos y preadipocitos. Además, la composición farmacéutica que comprende la actividad de Vgll3 para mejorar moléculas con el fin de mejorar la actividad de VgII3 en un tejido objetivo también se proporciona. Estos métodos, composiciones y moléculas pueden ser útiles para modular la adipogénesis y así tratar la obesidad y trastornos relacionados.

Description

USO DE MODULADOR DE ACTIVIDAD VGLL3 PARA LA MODULACION DE LA ADIPOGENESIS Campo de la Invención La presente invención se refiere a Vg 113 , un nuevo objetivo implicado en la modulación de la adipogénesis.

Antecedentes de la Invención Además, la presente invención se refiere a métodos para aumentar la actividad de V g 113 en adipocitos y preadipocitos. Además, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula para intensificar la actividad de Vgll3 en un tejido objetivo. Estos métodos, composiciones y moléculas pueden ser útiles para modular la adipogénesis y tratar así la obesidad y trastornos relacionados.

La obesidad es un factor importante de riesgo para una serie de trastornos que incluyen la hipertensión arterial, enfermedad arterial coronaria, dislipemia, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. Debido a la importancia de la obesidad epidémica, gran número de investigaciones se han centrado en la biología del adipocito, dentro de la cual se incluye la vía de desarrollo a través de la cual se crean nuevos adipocitos. La adipogénesis es el proceso por el cual las células precursoras mesenquimatosas no diferenciadas llegan a ser adipocitos maduros. A lo largo de la última década se ha realizado un considerable progreso en la elucidación de los mecanismos moleculares de la diferenciación de los adipocitos, que implica la activación secuencial de factores de transcripción de varias familias tales como proteínas de unión al potenciador CCAAT (C/???a, a, y ?) y el receptor de hormonas nucleares receptor activado por proliferador de peroxisoma ? (PPARy) (Rosen, E. D. y colaboradores , 2002) PPARy ha sido descrito como un "regulador patrón" de la adipogénesis puesto que se ha demostrado que es suficiente y necesario para la adipogénesis tanto in vitro como in vivo. Recientemente, se ha descrito que participan en la adipogénesis nuevos factores de transcripción, tales como la familia KLF (KLF2, 5 y KLF15) (Banerjee, S. S. y colaboradores, 2003; Gray, S. M. y colaboradores, 2002), la familia Ebf (Jiménez, M. A. y colaboradores, 2007) y Krox 20 (Chen, Z. y colaboradores , 2005), que sugieren que la cascada transcripcional que tiene lugar durante la adipogénesis es mucho más compleja de lo que se pensaba previamente. Además, también se ha descrito que las moléculas de señalización y/o los receptores tales como la familia Wnt de proteínas secretadas (Kang S. y colaboradores, 2007), la proteina sonic hedgehog, el receptor Notch, están implicados en procesos moleculares que conducen a la formación de adipocitos. Es interesante observar que los procesos extracelulares e intracelulares se acoplan de algún modo para regular la adipogénesis. Todas estas vías de señalización convergen en una cascada transcripcional estrechamente regulada que requiere ser entendida más completamente para controlar potencialmente el desarrollo de los adipocitos y prevenir la obesidad.

El almacenamiento de grasa en tejido adiposo tiene un límite, y exceder de esta capacidad conduce a la acumulación de lípidos en otros tejidos, en particular en el músculo, hígado y páncreas endocrino, y a la secreción de diversas adipocinas por los adipocitos. El tejido adiposo consiste en diversos depósitos situados en diferentes sitios anatómicos que pueden originarse a partir de distintos precursores y que presentan diferentes funciones fisiológicas y desempeñan diferentes papeles patofisíológicos. En comparación con los depósitos adiposos subcutáneos, los viscerales pueden contribuir más a los defectos asociados al síndrome metabólico.

Se han identificado receptores tipo 1 de cannabinoides en todos los órganos que desempeñan un papel clave en el metabolismo de la glucosa y la diabetes de tipo 2, es decir el tejido adiposo, el tubo digestivo, hígado, músculo esquelético y páncreas. Se ha demostrado que Rimonabant, el primer antagonista selectivo de receptores tipo 1 de cannabinoides (CB1R) en uso clínico, reduce la ingesta de alimento y el peso corporal, mejorando así la regulación del metabolismo de la glucosa.

Sin embargo, aún existe la necesidad de nuevos objetivos terapéuticos para el tratamiento de la obesidad.

El factor tipo vestigial 3 (Vg 113 ) pertenece a la familia vestigial, que comprende 3 miembros. Fue descrito por primera vez en Drosophila melanogaster como un co-factor de transcripción que podría estar implicado en el desarrollo del ala (Paumard-Rigal, S. y colaboradores, 1998). Vg 113 está situado dentro del núcleo, y podría interaccionar con la cascada transcrípcional adípogénica. Recientemente se ha relacionado al segundo miembro, Vg 112 , con el desarrollo del músculo en mamíferos (Chen, H. H., T., y colaboradores, 2004). Esta familia de proteínas está expresada en células precursoras que presumiblemente están destinadas a ser, o bien adipocitos, o bien células musculares.

Los inventores han encontrado ahora que g 113 desempeña un papel crítico en la diferenciación de adipocitos. Por tanto, se considera a V g 113 como un nuevo objetivo relevante para la modulación de la adipogénesis y, por ello, para el tratamiento de la obesidad y los trastornos relacionados. La sobre-expresión de Vg 113 puede ser utilizada también para la reducción de adipogénesis con el fin de disminuir la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.

Descripción detallada de la invención La presente invención está dirigida a métodos para la regulación de la adipogénesis y de la función metabólica en adipocitos y preadipocitos.

La presente invención consiste en moléculas intensifícadoras de la actividad de V g 113 que son capaces de aumentar la actividad de Vg 113 en preadipocitos o adipocitos. Tales moléculas son útiles para conseguir la disminución de la grasa visceral y/o subcutánea. Por tanto, se pueden utilizar para preparar un medicamento destinado a disminuir la ad ipogénesis , en particular para el tratamiento de obesidad y trastornos relacionados.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "moléculas intensificadoras de la actividad de V g 113 " comprende compuestos capaces de aumentar la actividad de Vg 113 y vectores que expresan una proteína recombinante Vg 113. Estos dos tipos de moléculas se describen con detalle más adelante.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "trastornos relacionados" en "obesidad y trastornos relacionados" comprende hipertensión arterial, enfermedad arterial coronaria, dislipemia, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2.

Mediante un enfoque transcriptómico, los inventores de la presente invención han identificado genes cuya expresión está correlacionada con la ganancia de peso corporal en cohortes de ratones C57BI/6 alimentados con una dieta rica en grasa. Después, han llevado a cabo un segundo análisis para evaluar los cambios en la expresión de los genes inducidos por el tratamiento con Rimonabant de los ratones alimentados con una dieta rica en grasa. Se conservaron genes que no se habían descrito nunca antes en la biología de los adipocitos pero que podían estar implicados en importantes procesos biológicos tales como la señalización, la modificación de proteínas de la matriz extracelular y la transcripción génica. Estos genes podían ser importantes para la adipogénesis, en especial puesto que podían estar implicados en el mecanismo por el cual el Rimonabant reduce la masa de grasa en los ratones. En este contexto, se ha identificado que Vg 113 está implicado en el metabolismo de los adipocitos, en especial en una nueva ruta de señalización. Hablando más en general, parece que este gen desempeña un papel en la adipogénesis y en el control del desarrollo del tejido adiposo en la obesidad.

La intensificación de la actividad de Vg 113 en adipocitos y preadipocitos puede ser útil en terapia para modular la adipogénesis, en especial para disminuir la adipogénesis, en particular en el tratamiento y prevención de trastornos relacionados con la obesidad, que son la diabetes de tipo 2, dislipemia, hipertensión arterial, resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares y, más generalmente, síndromes metabólícos.

La intensificación de la actividad de Vg 113 en adipocitos y preadipocitos también puede ser útil para aplicaciones cosméticas con el fin de disminuir una acumulación de grasa desfavorecedora .

En una modalidad, se puede aumentar la actividad de Vg 113 en adipocitos y preadipocitos utilizando moléculas pequeñas que intensifican la transcripción de Vg 113. Tales compuestos capaces de aumentar la actividad de g 113 pueden ser identificados por medio de métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Un método puede consistir en un sistema informador compuesto por el promotor de Vg 113 enlazado en el mismo marco con un gen informador y expresado en una línea celular adecuada; se puede medir cuantitativamente la actividad del producto del gen informador. Así, un compuesto que intensifique la expresión del gen informador puede ser considerado como un candidato potencial.

Son numerosos los genes informadores que se pueden usar en tales sistemas informadores y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales genes informadores pueden ser genes que permitan la expresión de la Proteina Fluorescente Verde (GFP, por sus siglas en inglés), luciferasa, 3-galactosidasa.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método para la detección y detección sistemática de intensíficadores de la actividad de Vg 113 , que comprende las etapas de: a) transfecta una línea celular con una construcción informadora que comprenda un promotor de g 113 unido a un gen informador b) cultivar tal línea celular en condiciones que permitan la expresión del gen informador. c) añadir compuestos candidatos al cultivo celular. d) identificar los compuestos intensíficadores como los compuestos que presentan la capacidad de aumentar la expresión del gen informador.

El promotor de Vg 113 humano pronosticado que se puede usar en el ensayo de detección sistemática descrito anteriormente para moduladores de la transcripción de Plac8 corresponde a la SEC ID No 17.

En otra modalidad, la intensificación de la actividad de g 113 en un paciente que lo necesite se puede obtener mediante la administración de un vector recombinante que porte una secuencia para la expresión de Vg 113.

Con este propósito, la presente invención proporciona vectores que comprenden polinucleótidos para expresión de una proteina recombinante V g 113. Estos vectores pueden ser ADN desnudo, o un vector viral tal como un vector adenoviral, un vector AAV o un vector retroviral, por ejemplo un vector lentiviral. Estos vectores pueden ser administrados por diferentes vías adecuadas, entre ellas la vía intravenosa o la inyección local, que comprende la vía intramuscular, la inyección directa en el tejido subcutáneo, u otro tejido objetivo, seleccionado de acuerdo a la práctica usual.

En una modalidad, el vector de expresión es un plásmido. Por motivos de seguridad, tal plásmido puede ser un plásmido de replicación condicional que sea incapaz de replicarse en los pacientes. Estos plásmidos pueden estar basados en el plásmido pCOR tal como se ha descrito en la publicación de patente WO 97/10343. El vector puede comprender un promotor capaz de dirigir la expresión del polipéptido V g 113 en el tejido al cual se administra, por ejemplo el promotor temprano inmediato de citomegalovirus. El vector puede comprender además una señal de poliadenilación de SV40. El vector puede ser administrado de diversas maneras, entre ellas por inyección intramuscular. El vector puede ser administrado mediante inyecciones múltiples directamente en los músculos isquémicos que han de ser tratados .

Por tanto, se puede proporcionar una proteína recombinante Vg 113 administrando tal vector plásmido a una célula in vivo, in vitro o ex vivo, y permitiendo que se produzca la transcripción desde el vector. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención está enlazado operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificadora por parte de la célula hospedante, es decir, el vector es un vector de expresión.

La expresión "enlazado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en donde los componentes así descritos están configurados de manera tal que realizan su función habitual. Así, una secuencia reguladora dada, por ejemplo un promotor, enlazada operativamente a una secuencia de ácido nucleicos, es capaz de producir la expresión de tal secuencia cuando están presentes las enzimas apropiadas. No es necesario que el promotor sea contiguo a la secuencia, en tanto que funcione para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, la intervención sin traducir con todo las secuencias transcritas puede estar presente entre la secuencia del promotor y la secuencia del ácido nucleico y la secuencia del promotor se puede todavía considerar el "enlazada operativamente" a la secuencia de codificación.

Un "promotor" es una secuencia nucleótido que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (en donde la expresión de una secuencia polinucleótido enlazada operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores represibles (en donde la expresión de una secuencia polinucleótido enlazada operativamente al promotor es reprimida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones de longitud completa del promotor y segmentos funcionales (por ejemplo de control de la transcripción o traducción) de estas regiones.

Los promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionados de manera que sean compatibles con la célula hospedante para la cual se ha diseñado la expresión. En particular, cuando el método de la invención requiere la administración directa a un músculo, los promotores y otros sistemas reguladores de la expresión deben poder funcionar en tejidos musculares. Se pueden utilizar, por ejemplo, promotores de mamífero, tales como promotores de ß-actina.

Los ejemplos de promotores útiles en la práctica de la presente invención incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, promotores virales tales como promotores del Virus de Simios 40 (Simian Virus 40, abreviado (SV40) (por ejemplo el promotor de antígeno T grande de SV40 o promotor temprano de SV40), de Virus de Tumor Mamario de Ratón (en inglés Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) (por ejemplo promotor LTR de MMTV), de Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (por ejemplo el Promotor de Repetición Terminal Larga (en inglés Long Terminal Repeat, LTR) de Promotor VIH, de Virus de Moloney (por ejemplo Promotor LTR de Leucemia Murina de Moloney), de ALV, de Citomegalovirus (CMV) (tal como el Promotor Temprano Inmediato de CMV), de Virus de Epstein Barr (EBV), de Virus de Sarcoma de Rous (RSV) (por ejemplo el promotor LTR de RSV), de adenovirus, (por ejemplo el promotor tardío principal de adenovirus Ad MLP), de HSV (tal como los promotores IE de HSV), o promotores de HPV (por ejemplo la Región Reguladora Aguas Arriba (Upstream Regulatory Región, URR) de HPV). También se pueden derivar promotores adecuados de genes humanos tales como alpha- o beta-actina humanas, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humana, y metalotioneína humana o cualquier promotor específico de tejido, adecuado. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar la presente invención incluyen, aunque sin quedar limitados a estos, señales de poliadenilación de SV40, señales de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina o humana, y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se puede utilizar la señal de poliadenilación de SV40 que está situada en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego Calif.), denominada también señales de poliadenilación de SV40.

El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Se pueden utilizar vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN, o bien se pueden utilizar para transfectar o transformar una célula hospedante, por ejemplo una célula hospedante de mamífero. También se pueden adaptar los vectores para ser utilizados in vivo, por ejemplo para permitir la expresión in vivo del polipéptido.

En una modalidad, el plásmido codificador de Vg 113 contiene un origen condicional de replicación en bacterias tal como el plásmido pCOR tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 97/10343 y en el artículo de Soubrier y colaboradores (Gene Ther. 1999; 6:1482-1488). En el documento WO 2004/033664 también se describen plásmidos basados en el esqueleto pCOR. El esqueleto pCOR es pequeño (1 Kpb) en comparación con los esqueletos convencionales (de 2 a 2.5 Kpb), reduciendo así a la mitad la cantidad de ADN bacteriano indeseado inyectado al paciente.

Por lo tanto, en una modalidad, el plásmido pCOR puede hospedar un cásete de expresión que codifique una proteína recombinante de Vg ! 13 tal como se ha descrito anteriormente.

El vector puede ser un vector viral recombinante. Los vectores virales recombinantes adecuados incluyen, pero sin quedar limitados a éstos, vectores de adenovirus, vectores virales adeno-asociados (AAV), vectores de herpes-virus, un vector retroviral, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores de virus de viruela o vectores de parvovirus.

El vector puede ser un vector con objetivo asignado, es decir, un vector cuya capacidad de infectar o transfectar o transducir una célula, o ser expresado en una célula hospedante y/u objetivo está restringida a ciertos tipos de célula dentro del sujeto hospedante, usualmente células que tienen un fenotipo común o similar.

Los vectores y casetes de expresión de la presente invención pueden ser administrados directamente en forma de una "construcción de ácido nucléicos desnudo". Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "ADN desnudo" hace referencia a un vector tal como un plásmido que comprende un polinucleótido de la presente invención junto con una región corta de promotor a fin de controlar su producción. Se denomina ADN "desnudo" porque los vectores no están soportados en ningún vehículo de administración, por ejemplo están exentos de componentes virales, particularmente cualquier partícula viral que pueda aportar información genética. De manera similar, están exentos de (o "desnudos" con respecto a) cualquier material que favorezca la transfección , por ejemplo formulaciones liposomales, lipidos cargados tales como Lipofectin™, o agentes precipitantes tales como CaP04. Cuando un vector semejante entra en una célula hospedante, por ejemplo en una célula eucariota, las proteínas que codifica son transcritas y traducidas dentro de la célula.

Un vector tal como un plásmido puede ser administrado al animal junto con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. En aplicaciones preferidas, el vehículo líquido es acuoso o parcialmente acuoso, y comprende agua estéril y libre de pirógenos. El pH de la preparación está adecuadamente ajustado y amortiguado. Más adelante se describirán composiciones adecuadas para la administración.

Como alternativa, para administrar los vectores de la invención se pueden utilizar preparaciones liposomales. Las preparaciones liposomales útiles incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), amónicas (cargadas negativamente) y preparaciones neutras, siendo preferidos los liposomas catiónicos. Los liposomas catíónicos pueden intervenir en la administración intracelular de ADN y mARN de plásmido.

En el caso de vectores virales, en la administración del polinucleótido interviene la infección viral de una célula objetivo.

La administración sistémica de un vector que exprese Vgll3 permite transducir tejidos que no están accesibles desde el exterior. Para la administración sistémica, se puede formular la proteína Vg 113 con conjugado de colesterol, liposomas o nanopartículas a base de polímeros. Los liposomas se usan tradicionalmente para proporcionar propiedades farmacocinéticas mejoradas y/o perfiles de toxicidad reducida. Permiten un éxito significativo y repetido en la administración in vivo.

Los métodos para la administración de genes son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de estadounidenses números 5,399,346, 5,580,859 y 5,589,466. Se puede introducir el vector directamente en el sujeto receptor, por ejemplo mediante una inyección intramuscular o intradérmica habitual; la administración transdérmica de partículas; la administración intravenosa, la inhalación; tópicamente, o a través de modos de administración oral, intranasal o mucosal. También se puede introducir el vector in vitro o ex vivo en células que han sido extraídas de un paciente.

De acuerdo con la presente invención, el vector que expresa una proteína recombínante de V g 113 puede portar la secuencia SEC ID NO.15 o sus derivados a causa de la degeneración del código genético, o cualquier derivado de la misma que tengan una identidad de secuencia de al menos 60, 70, 80, 90, 95, 98 ó 99% con esta secuencia .

En una modalidad preferida, el vector expresa una proteína recombinante de Vg 113 que tiene una secuencia correspondiente a SEC ID NO.2 ó SEC ID NO.4 ó derivados o fragmentos u homólogos de estas secuencias que presentan una identidad de secuencia de al menos 60, 70, 80, 90, 95, 98 ó 99% con estas secuencias .

En otra modalidad, estos homólogos, derivados y fragmentos conservan la misma actividad que Vg 113 , o al menos 50, 80 ó 90% de la actividad del mismo.

La invención consiste también en un método para modular la adipogénesis que comprende la administración de una molécula intensificadora de la actividad de V g 113 a un paciente que lo necesite, con el fin de modular la adipogénesis. Se puede usar tal método para tratar la obesidad o las enfermedades relacionadas. También se puede usar tal método para reducir la acumulación de grasa con una finalidad cosmética.

Otro objeto de la invención es una composición que comprende una molécula intensificadora de la actividad de V g 113 de acuerdo con la presente invención. Estas composiciones comprenden una dosis eficaz de al menos una de tales moléculas de acuerdo con la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición es útil para preparar un medicamento destinado a inhibir la adipogénesis. En una modalidad preferida, se puede utilizar para tratar la obesidad y enfermedades relacionadas.

La composición puede ser útil también para disminuir la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.

Dentro del contexto de la presente invención se puede utilizar cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado, y tales vehículos son bien conocidos en la técnica. La elección del vehículo vendrá determinada, en parte, por el sitio particular al cual se ha de administrar la composición y el método particular que se utilizará para administrar la composición. Las formulaciones adecuadas para la inyección incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones inyectables estériles isotónícas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos , y solutos que hagan a la formulación isotónica con la sangre del sujeto al cual está destinada, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensionantes, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de una sola dosis o de múltiples dosis herméticamente cerradas, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden conservarse en un estado desecado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito previamente. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución salina amortiguada. Muy preferiblemente, la composición farmacéutica es isotónica, por ejemplo comprende una solución de cloruro sódico (al 0.9%).

Los expertos en la técnica pueden ajustar la dosis y la concentración para adecuarla a la ruta de administración específica. En una modalidad, se administra una dosis única en una ocasión única. En una modalidad alternativa, se administran varias dosis a un sujeto en la misma ocasión pero, por ejemplo, en lugares diferentes. En otra modalidad, se administran múltiples dosis en múltiples ocasiones. Tales dosis múltiples se pueden administrar en tandas, es decir, con múltiples administraciones en sitios diferentes en la misma ocasión, o bien se pueden administrar individualmente, con una administración en cada una de múltiples ocasiones (opcionalmente en múltiples sitios). Se puede utilizar cualquier combinación de tales regímenes de administración.

Se describe ahora la invención por referencia a los siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos y que no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos Breve Descripción de las figuras.

Figura 1 : Selección de genes reguladores de tejido adiposo, críticos. Los diagramas de Venn ilustran la selección de genes basada en los siguientes criterios. 1) Regulación similar por alimentación rica en grasa en subcutánea (SCAT o SQ) y visceral (VAT). Se seleccionaron 151 genes (48 por SCAT y 88 por VAT). 2) Entre esos 151 genes, selección de genes regulada por tratamiento con Rimonabant (14 para SCAT y 54 para VAT). Esto conduce a la selección de 34 genes regulados en ambos tejidos por alimentación rica en grasa y Rimonabant. Entre esos genes, 16 presentan un nivel de expresión correlacionado con el peso corporal de los grupos L, M y H (ligados a la obesidad) y 18 están regulados por HFD (siglas inglesas de "dieta rica en grasa") al mismo nivel en cada subgrupo (no ligados a la obesidad).

Figura 2: Expresión de Vg 113 en diversos tipos de tejidos y de células. Se midieron mediante RT-PCR los niveles de mARN de V g 113 : A) en bazo, músculo (gastrocenemio), corazón, pulmón, riñon, hígado, tejido adiposo marrón (BAT, por sus siglas en inglés), tejido adiposo subcutáneo (SCAT) y tejido adiposo visceral (VAT). Los resultados se expresan como niveles relativos en comparación con la expresión hepática, que se ha tomado como unidad. B) en SCAT y VAT de cepa natural (barra blanca) y ratones Ob/Ob (barra negra) (n = 5), p<0.05, los datos se presentan como media ± desviación típica, y se expresan como factor de incremento con respecto al testigo SCAT, tomado como unidad. C) En SVF (barra negra) y adipocitos aislados (barra blanca) de ratones (n = 5). Los datos se expresan como factor de incremento con respecto a la expresión de SVF en SCAT. D) En SCAT (barra negra) y VAT (barra blanca) de tejido humano completo, adipocitos aislados, preadipocitos aislados y adipocitos diferenciados in vitro, los datos se expresan como niveles relativos respecto a la expresión de SCAT en tejido completo, tomada arbitrariamente como unidad E) En células 3T3-L1 antes del tratamiento con DMI el día 2 y después del tratamiento con DMI hasta el día 7, n = 2 - 3 series de células, los datos se representan como niveles relativos con respecto a la expresión en el día 0.

Figura 3: Sobre-expresión de cADN de Vg 113 cDNA en la línea celular 3T3-L1. A) Células 3T3-L1 transducidas con retrovirus que expresan el cADN humano de V g 113. Imágenes de oil-red-0 de 3T3-L1 diferenciadas en el día 10 B) expresión de mARN de aP2 (marcador de diferenciación) medida por RT-PCR en las mismas células que en A) el día 10. Los resultados están expresados como media ± desviación típica P<0.005 n = 3.

Materiales y Métodos Tratamiento de los animales.

Se alimentaron ratones C57BL/6J, que eran propensos a la obesidad (Collins y colaboradores 2004), durante 6 meses, con una dieta rica en grasa (siglas inglesas HFD ("high fat d i et" ) ) . Después de 6 meses de HFD, los ratones presentaron una dispersión de pesos corporales, con diversos grados de intolerancia a la glucosa (medida por un ensayo de tolerancia a la glucosa. Se separaron los ratones sometidos a HFD en 3 grupos, incluyendo en cada uno animales que presentaban el mismo nivel de intolerancia a la glucosa pero con pesos corporales bajo (B), medio (M) o alto (A) y a estos animales, así como a ratones alimentados con alimento comercial normal (en inglés "normal chow", NC), se les trató durante un mes con vehículo o con Rimonabant (10 mg.kg Vdía"1), para normalizar su peso corporal.

Preparación de ARN, marcado e hibridación en micromatrices de cADN. Se extrajo ARN de 5 ratones diferentes por grupo, de tejidos adiposos viscerales y subcutáneos, usando peqGOLD Trifast™ (peqiab) y extracción con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se precipitó ARN con isopropanol y se purificó por pase por columnas RNeasy (Qiagen). Se comprobó la calidad del ARN antes y después de multiplicación con un Bioanalyzer 2100 (Agilent). Se realizó la transcripción inversa del ARN y se multiplicó el ARN con un estuche MessageAmp™ (Ambion). Se multiplicó de manera similar una Referencia Universal de Ratón (Mouse Universal Reference, Clontech) y se marcó tanto el tejido adiposo como los ARN de referencia mediante una técnica indirecta con Cy5 y Cy3 de acuerdo a protocolos publicados (De Fourmestraux y colaboradores, 2004). Se hibridaron los ARN marcados con micromatrices que contenían 17664 cADN preparados en el DNA Array Facility de la Universidad de Lausanne. El detección, la toma de imágenes, y los análisis de control de calidad se realizaron de acuerdo a publicaciones anteriores (De Fourmestraux y colaboradores, 2004). Los datos se expresaron como log2 de relaciones de intensidad (Cy5/Cy3), normalizados con un método de regresión lineal, localmente ponderada por sector o "print-tip" (también denominada LOWESS por sus siglas inglesas) y se filtraron basándose en la calidad de la mancha y anotación incompleta. Todos los análisis se realizaron con el programa informático R para cálculo estadístico disponible en el Comprehensive R Archive Network (cran.us.r-project.org/).

Extracción de ARN y PCR en tiempo real.

Se aisló el ARN total de las células cultivadas usando reactivo peqGOLD TriFast de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Axonlab). Se sintetizó cADN de primera hebra a partir de 0.5 g de ARN total usando cebadores aleatorios y Superscript II (Invitrogen). Se realizó PCR en tiempo real usando Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem). Se usaron los siguientes cebadores para genes de ratón: SEC ID NO.5 (Vgll3-hacia adelante), SEC ID NO.6 (Vgll3-sentido inverso), SEC ID NO.9 (ciclofilina-hacia adelante), SEC ID NO.10 (ciclofilina-sentido inverso), SEC ID NO.13 (aP2-hacia adelante), SEC ID NO.14 (aP2-sentido inverso). Se usaron los siguientes cebadores para genes humanos: SEC ID NO.7 (hVgll3-hacia adelante), SEC ID NO.8 (hVgll3-sentido inverso), SEC ID NO.11 (ciclofilina-hacia adelante), SEC ID NO.12 (ciclofilina-sentido inverso) Aislamiento de adipocitos y fracción estromal vascular (SVF) de tejido adiposo.

Se practicó la eutanasia a ratones C57BL/6J, macho, de ocho semanas, (n = 6 - 8) por inhalación de C02 y se recogió tejido adiposo epididimal (visceral) y subcutáneo y se dispuso en medio DMEM que contenía 10 mg/ml de BSA deficiente en ácidos grasos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI). Se trituró el tejido en trozos pequeños y después se digirió en 0.12 unidades/ml de colagenasa de tipo I (Sigma) a 37°C, en un baño de agua de agitación por sacudidas (80 Hz), durante 1 hora. Después se filtraron las muestras por una malla de nailon de 250 pm, estéril (Scrynel NY250HC, Milian), para retirar los fragmentos no digeridos. Se centrifugó la suspensión resultante a 115 rad/s (1100 RPM), durante 10 minutos, para separar la SVF (siglas inglesas de fracción estromal vascular) de los adipocitos. Se retiraron los adipocitos y se lavaron con amortiguador DMEM. Después se suspendieron en reactivo peqGOLD TriFast (Axonlab) y se aisló ARN de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se incubó la fracción SVF en amortiguador de lisis de eritrocitos (NH4CI 0.154 mM, KHC03 10 mM, EDTA 0.1 mM), durante 2 minutos. Después se centrifugaron las células a 115 rad/s (1100 RPM), durante 10 minutos y se resuspendieron en 500 pl de reactivo peqGOLD TriFast (Axonlab) para aislamiento de ARN.

Cultivo celular Se cultivaron células 3T3-L1 en DMEM (Gibco) con FBS al 10% (Gibco) bajo 5% de C02 Después de infección retroviral (ver a continuación), se permitió que las células crecieran hasta confluencia en placas bien de 100 mm ó de 60 mm en DMEM con FBS al 10%. Una vez alcanzada la confluencia, se expusieron las células a medio de diferenciación con dexametasona (1 µ?), insulina (5 pg/ml) e isobutilmetilxantina (0.5 µ?) (D I). Transcurridos 2 días, se mantuvo a las células en medio que contenía insulina (5 pg/ml) hasta que estuvieron listas para ser cosechadas a los 7 días.

Tinción con oil-red-O Después de 7 a 10 días de diferenciación, se lavaron las células una vez con PBS y se fijaron con formaldehido (Formalde-fresh; Fisher) durante 15 minutos. Se preparó la solución de tinción disolviendo 0.5 g de oil-red-O en 100 mi de isopropanol; se mezclaron 60 mi de esta solución con 40 mi de agua destilada. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se filtró la solución de tinción y se añadió a las placas durante 4 horas. Después se retiró la solución de tinción y se lavaron las células dos veces con agua destilada.

Generación de construcciones retrovirales e infecciones retrovirales.

Se construyeron retrovirus en el RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (pSIREN Clontech) o plásmido de puromicina de pMSCV (pMSCV, Clontech). Se transfectaron construcciones virales usando el método de fosfato cálcico descrito en Jordán, M., y colaboradores (2004) en células empaquetadas 293 HEK junto con construcciones que codificaban gag-pol y la proteína VSV-G. Se recogieron los sobrenadantes después de 48 horas en presencia de 3 pm de tricostatina A (Sigma) y se usaron o inmediatamente o se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80°C para uso posterior. Se añadieron sobrenadantes virales a las células durante 6 horas, en presencia de polibreno (4 pg/ml) y se diluyó dos veces con medio fresco durante las 15 horas siguientes.

Construcciones de sobreexpresión.

Se usó un plásmido retroviral de puromicina pMSCV modificado (de Clontech) que expresaba un marcador de GFP, para sobreexpresa r el cADN de Vg 113 en células. Se insertó el cADN (SEC ID NO. 15) desfosforilado en el sitio de restricción hpal a partir del sitio de multiclonación de pMSCV. Se ensayó en las colonias resultantes la orientación correcta y se seleccionaron por digestión con enzimas. Se seleccionó el clon correcto y se multiplicó y se usó para la infección retroviral de células 3T3-L1.

Resultados Ejemplo 1: Resultados de micromatrices.

Se realizó un análisis bioinformático de los datos de micromatrices para identificar genes que cumpliesen los tres criterios siguientes: (i) estar regulado por alimentación rica en grasa, (ii) estar su expresión regulada análogamente por alimentación rica en grasa, tanto para grasa visceral como para grasa subcutánea, y (iii) presentar una normalización similar de su expresión por tratamiento con Rimonabant (Figura 1). De los aproximadamente 17000 genes objetivos, presentes en la micromatriz de cADN utilizada, 34 genes satisfacían estos criterios, que se enumeran en la Tabla 1. Sorprendentemente, 10 de estos genes - Caví, Fgf1, Fndc3b, Kif5b, Mest, Npr3, Pik3ca, Sparc, Vldlr y Wwtrl - eran conocidos con anterioridad como reguladores importantes del desarrollo y la función del tejido adiposo. Algunos de estos genes presentaron niveles de expresión correlacionados con la ganancia de peso corporal (mostrado en gris en la Tabla 1), lo que sugiere un papel potencial en la hiperplasia y/o hipertrofia de tejidos adiposos durante la obesidad. Estos resultados avalan la propuesta usada para identificar posibles nuevos objetivos para el tratamiento terapéutico de la obesidad.

Es importante señalar que muchos de los genes citados en la tabla 1 nunca habían sido estudiados en el contexto del desarrollo o la biología del tejido adiposo. Estos genes pertenecen a las siguientes clases de función: interacción matriz extracelular/célula , citoesq ueleto , señalización intracelular, enzimas, y factores/cofactores de transcripción. Es probable que estén implicados en la reestructuración de tejidos, y en particular en el desarrollo de los adipocitos. Uno de estos genes, el gen Vg 113 y su papel en la biología de los adipocitos, se presenta en el presente documento y constituye un aspecto de la presente invención .

Las secuencias de ratón y de ser humano de V g 113 , tal como se usan en la presente invención, corresponden a las SEC ID NO.1 y NO.2 y SEC ID NO.3 y NO.4, respectivamente.

Función biológica y Nombre del gen referencias Cadena media de Acetil-Coenzima A deshidrogenasa, (Acadm) Homólogo de proteína 2 asociada con actina ARP2 (Actr2) Proteina (App) precursora de amiloide beta (A4) Anexina A2 (Anxa2) Papel en el ensamblaje de la actina Calmodulina 1 (Calml) Caveolina, proteína 1 de caveola Papel en la homeostasis de (Caví) 1 i pidos Ciclina G1 (Ccgnl) Dominio del choque frío que contiene E1 (Csde) Secuencia AW112037 expresada Función biológica y Nombre del gen referencias Factor 1 de crecimiento de Regulador de la fibroblastos (Fgf1) adipogénesis humana Dominio de fibronectina tipo III Papel en la adipogénesis que contiene 3B (Fndc3b) Miembro de la familia de la Papel en la traslocacion de cinesina 5B (Kif5b) GLUT4 estimulada por la insulina en la membrana plasmática Transcripto específico del Diferenciación y aumento de mesodermo (Mest) tamaño de los adipocitos Proteína 1 de ensamblaje de nucleosomas tipo 1 (Nap1L1) Nidogen 1 (Nid1) Receptor 3 de péptido Posible papel en la natriurético (Npr3) retención de sodio característica de la hipertensión asociada con la obesidad Función biológica y Nombre del gen referencias Homologo de la undecaprenil pirofosfato sintasa nuclear 1 (Nus1) Alfa-polipeptido, catalítico, de Esencial para la adecuada fosfatidilinositol 3-cinasa señalización del factor de (Pik3ca) crecimiento. Papel en la adipogénesis Placenta-específico 8 (Plac8) Familia C que contiene dominio de homología de pleckstrina (Plekhd) Pro teína tiro si na fosfatasa 4a 1 Implicada en crecimiento (Ptp4a1) celular, diferenciación e invasión de tumores Homólogo 2 del oncogén (Rras2) viral RAS relacionado Homólogo de retinitis pigmentosa 9 (Rp9h) Función biológica y Nombre del gen referencias Glicoproteina rica en cisteina Actúa como mediadora en acida secretada (Sparc) interacciones célula - matriz y desempeña un papel en la diferenciación y angiogénesis Tipo 1 asociado a proliferación inducida por la señal 1 (Sipa1L1) Espectrina beta 2 (Spnb2) ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 6 (St3gal6) Tipo vestigial 3 (Vgll3) Receptor de lipoproteínas de Implicado en lipólisis densidad muy baja (Vldlr) Dominio de DHHC que contiene dedo de zinc, 2 (Zdhhc2) Dominio 26 de la repetición de WD (Wdr26) Función biológica y Nombre del gen referencias Dominio WW que contiene Regula la diferenciación de regulador 1 de la transcripción células precursoras (Wwtrl) multipotenciales mesenqui matosas Secuencia AW112037 expresada Gen B930093H17 de cADN de RIKEN (tipo glicosiltransferasa) Tabla 1 : Lista de 34 genes candidatos regulados por HFD y Rimonabant en SCAT y VAT. El nombre y el símbolo del gen se muestran en la primera columna. El papel biológico para genes conocidos y las referencias se indican en la segunda columna. Todos estos genes fueron regulados hacia arriba por HFD y normalizados por tratamiento con Rimonabant, excepto Plac8 y Rp9h, que fueron regulados hacia abajo por HFD. Los genes relacionados con el aumento del peso corporal se muestran en gris.

Ejemplo 2: Tejido y expresión celular de los genes seleccionados Para entender mejor el papel de V g 113 en el desarrollo de los adipocitos, se caracterizó primero su patrón de expresión. Se midieron niveles de mARN mediante RT-PCR en diversos tejidos de ratón, en preadipocitos y adipocitos aislados, en tejido adiposo visceral (VAT) y tejido adiposo subcutáneo (SCAT) del modelo de obesidad de ratón (ratones Ob/Ob) y en tejidos adiposos humanos.

V g 113 se encuentra altamente expresado en el riñon, si se compara con otros órganos. Tiene una expresión similar en VAT, SCAT, músculo y corazón. La expresión más baja se observa en hígado, BAT y bazo. Los niveles de V g 113 están normalizados con ciclofilina A para cada tejido y se expresan como el factor de incremento relativo con relación al nivel en hígado, que se ha establecido arbitrariamente como 1 (Figura 2A).

El tejido adiposo es un tejido complejo que incluye no sólo adipocitos maduros sino también células precursoras tales como preadipocitos así como vasos sanguíneos, macrófagos y células fibroblásticas. Basado en una técnica de digestión con colagenasa I, se separó fracción estromal vascular (siglas inglesas SVF) (que incluye preadipocitos, células endoteliales y macrófagos) de la fracción de adipocitos aislados.

En tejidos adiposos blancos de ratones Ob/Ob, los niveles de Vg 113 están incrementados (Figura 2B). Los mismos patrones de expresión se observaron en estudios de micromatrices.

El tejido adiposo es un tejido complejo que incluye no sólo adipocitos maduros sino también células precursoras tales como preadipocitos así como vasos sanguíneos, macrófagos y células fibroblásticas. Basado en una técnica de digestión de colagenasa I, se separó fracción estromal vascular (SVF) (que incluye preadipocitos, células endoteliales y macrófagos) de la fracción de adipocitos aislados. Vg 113 se encuentra expresado predominantemente en la fracción estromal vascular, que contiene preadipocitos (Figura 2C). Estos resultados indican que Vg 113 podría estar implicado en procesos de diferenciación o proliferación .

La siguiente etapa fue determinar si el gen de Vg 113 está conservado entre especies. Para responder a esta pregunta, se realizó una RT-PCR en muestras de tejido adiposo humano. Se aislaron preadipocitos y adipocitos de SCAT o VAT. Se indujo la diferenciación in vitro de preadipocitos aislados hasta el día 7. Los resultados demostraron que V g 113 está realmente expresado en la grasa humana (Figura 2D).

En conjunto, estos resultados sugieren que V g 113 es un gen candidato relevante para el desarrollo de los adipocitos, posiblemente requerido para la adipogénesis o el incremento del tejido graso en la obesidad, puesto que V g 113 evita estos procesos al ser fuertemente suprimido en el tejido adiposo de ratones HFD y de ratones Ob/Ob.

Ejemplo 3: Expresión de genes seleccionados durante diferenciación 3T3-L1.

A continuación, se evaluó la expresión del gen Vgll3 durante la adipogénesis. Para tal fin, se midieron los niveles de mARN mediante RT-PCR durante el transcurso de tiempo de la diferenciación detallada de 3T3-L1 (una línea celular adipogénica) (Figura 2E). Sorprendentemente, la expresión de V g 113 disminuye en el momento en que se añade el DMI a las células, y permanece a niveles muy bajos durante los 7 días, sugiriendo con ello también que este gen está específicamente regulado hacia abajo para permitir la adipogénesis.

Ejemplo 4: La sobreexpresión de Vg 113 en ia línea celular 3T3-L1 disminuye la adipogénesis.

Para el estudio de ganancia de función, se subclonó el cADN de la secuencia humana de Vg 113 , en el plásmído retroviral pMSCV de Clontech. Tras la infección, se dejó que las células 3T3-I1 alcanzaran la confluencia, y diferenciadas con DMI. El día 10, se tiñeron las células con oil-red-O para resaltar el contenido en lípidos (Figura 3A). La sobreexpresión de Vg 113 disminuye el potencial adipogénico de 3T3-L1. Se confirmó este resultado midiendo los niveles de aP2, un marcador adipogénico, que había disminuido en una proporción de 90% en células 3T3-L1 infectadas con retrovirus que expresan Vg I !3 (Figura 3B).

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una actividad de Vg 113 para mejorar la molécula para su uso como un medicamento.

2. Una actividad de g 113 para mejorar la molécula para la reducción de la adipogénesis.

3. Una actividad de V g 113 para mejorar la molécula para el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados.

4. Una actividad de V g 113 para mejorar la molécula para la reducción de la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.

5. El uso de una molécula de actividad Vg 113 para mejorar la preparación de un medicamento para la reducción de la adipogénesis.

6. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una actividad de Vg 113 para mejorar la molécula es una pequeña molécula.

7. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una actividad de Vg 113 para mejorar la molécula es un vector que expresa una proteína recombinante de Vg 113.

8. Uso de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el vector contiene la SEC ID NO.15 o derivados de la misma.

9. Uso de acuerdo a la reivindicación 7, en donde la secuencia de proteína recombinante de V g 113 corresponde a SEC ID NO.2 ó SEC ID NO. 4 o derivados, o fragmentos u homólogos de las mismas.

10. Composición que comprende una actividad de Vg 113 para mejorar la molécula y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Composición de acuerdo a la reivindicación 10, para la preparación de un medicamento destinado a disminuir la adipogénesis.

12. Composición de acuerdo a la reivindicación 10, para la preparación de un medicamento para tratar la obesidad y enfermedades relacionadas.

13. Composición de acuerdo a la reivindicación 10, para la preparación de un medicamento para reducir la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.

14. Método de modulación de la adipogénesis que consiste en la administración a un paciente con necesidad del mismo, de una actividad de Vg 113 para mejorar la molécula para modular la adipogénesis.

15. Método de detección de los potenciadores de la actividad de g 113 que comprende las etapas de: a) transfecta una línea celular con una construcción informadora que comprenda un promotor de Vg 113 unido a un gen informador. b) cultivar tal línea celular en condiciones que permitan la expresión del gen informador. c) añadir compuestos candidatos al cultivo celular. d) la identificación de compuestos como potenciador de los compuestos que tienen la capacidad de aumentar la expresión del gen informador.