MX2011006549A - Suplemento alimenticio para el cultivo de celula de mamifero y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Se provee un suplemento alimenticio mejorado para cultivo de las células de mamífero utilizado para producir proteínas; el suplemento mejorado carece de componentes derivados de animal e hidrolizados de proteína; la invención también provee métodos para el uso del suplemento en la producción de una proteína terapéutica, tal como un anticuerpo; en algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo anti-lL23p19 de humano.

Description

SUPLEMENTO ALIMENTICIO PARA EL CULTIVO DE CELULA DE MAMIFERO Y METODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a los suplementos de los medios para uso en el cultivo de células para la producción de proteínas recombinantes, tales como los anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cultivo de célula de ovario de hámster chino (CHO) frecuentemente se utiliza para producir proteínas para uso como agentes terapéuticos, tales como anticuerpos terapéuticos. El medio de crecimiento para dichos cultivos celulares históricamente ha incluido los suplementos de origen animal, pero dichos suplementos recientemente se han vinculados con la aparición de las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs), tales como las encefalopatías espongiformes bovinas (BSE, mal de las vacas locas), que está vinculado a la variante de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD) en humanos. Véase, por ejemplo, Cleland et al. (2007) J. Microbiol. Meth. 69: 345. A la luz de la preocupación resultante sobre dicha contaminación, es preferible utilizar los medios de producción que no incluyen componentes de origen animal para la fabricación de agentes farmacéuticos.

Los hidrolizados de proteina, tales como el hidrolizado de soya, también han sido utilizados como suplementos en el medio de cultivo celular para mejorar la productividad. Sin embargo, la calidad de dichos hidrolizados puede variar de lote a lote, afectando tanto la cantidad como la calidad del producto fabricado.

Por consiguiente, existe la necesidad de mejorar los métodos para la producción de proteínas terapéuticas en células CHO en cultivo que no implica la adición de componentes de origen animal que podrían introducir contaminantes problemáticos. Preferiblemente, dichos métodos también podrían apoyar la expresión de alto nivel de polipéptidos terapéuticos de las células CHO en cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface estas necesidades y más al proporcionar un suplemento alimenticio concentrado basado en un DMEM 20X/F12 modificado, denominado "alimento SP" en la presente invención, que carece de componentes animales y lisados de proteína, y los métodos de uso de este suplemento para el cultivo de células CHO que producen polipéptidos terapéuticos. En una modalidad, el polipéptido terapéutico es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En una modalidad, el polipéptido terapéutico es un anticuerpo IgG, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas modalidades el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo quimérico, humanizado o completamente humano que se une específicamente a la IL-23p19 de humano.

En una modalidad, la producción del suplemento alimenticio de la presente invención comprende la vitamina E y/o selenita de sodio (Na2Se04). En otra modalidad, la vitamina E está presente en el suplemento concentrado a aproximadamente 30.2 mg/L En otra modalidad, la selenita de sodio está presente en el suplemento concentrado a aproximadamente 0.3 mg/L. En otra modalidad, la producción de suplemento alimenticio concentrado comprende los componentes listados en el Cuadro 3.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar el suplemento de la presente invención para producir proteínas terapéuticas. En una modalidad, el método incluye una lógica de alimentación hacia adelante en la que la cantidad de nutrientes que proporcionan a los cultivos celulares se basa en la tasa de crecimiento de las células y en el consumo de nutrientes. En varias modalidades del suplemento alimenticio de la presente invención se agrega a un cultivo celular en más de una ocasión durante la producción, por ejemplo, como en la serie de dos o más alimentaciones en forma de bolo, por ejemplo a los días 3, 5 y 10. En otra modalidad, el suplemento de la presente invención, se añade durante la fase exponencial temprana, fase exponencial tardía, y la fase estacionaria. En varias modalidades los cultivos se suplementan una, dos, tres, cuatro, cinco o más veces. En incluso otras modalidades, el suplemento puede ser por día, o de manera continua o semi-permanente, para asegurar una concentración constante de los componentes en el tiempo. En varias modalidades la invención incluye recuperación de la proteina de cultivo después de un periodo de crecimiento adecuado, dicha recuperación puede ser a partir del medio de cultivo (sobrenadante), las células (por ejemplo, mediante lisis), o ambos.

En una modalidad, uno o más componentes del suplemento alimenticio para producción de la presente invención se añaden al cultivo por separado, por ejemplo, uno, dos, tres o más componentes se pueden agregar por separado a partir de una mezcla de los componentes restantes. En una modalidad, la tirosina y/o la cisteína se añaden por separado a partir de la mezcla de otros componentes de la alimentación.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para suplementar las células de mamífero en cultivo para la producción de una proteína que comprende la adición de vitamina E y/o selenita de sodio al medio de cultivo por lo menos una vez durante un proceso de producción. En varias modalidades, los cultivos se suplementan con la vitamina E hasta una concentración final de aproximadamente 2 mg/L, 4 mg/L o 6 mg/L. En varias otras modalidades, los cultivos se suplementan con selenita de sodio a una concentración final de aproximadamente 0.02 mg/L, 0.04 mg/L o 0.06 mg/L.

En algunas modalidades, los métodos y el suplemento alimenticio de la producción de la presente invención apoyan la producción de proteínas terapéuticas a los niveles (títulos) por lo menos tan altos como los alcanzados con medios de crecimiento suplementados con hidrolizado de la planta, tales como hidrolizado de soya. En varias modalidades, la alimentación y los métodos de la presente invención apoyan la producción de un anticuerpo monoclonal terapéutico a un titulo de aproximadamente 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 o 2.0 veces o más el titulo en comparación con la alimentación basal (glucosa y glutamina solamente).

En algunas modalidades, los métodos y medio de la presente invención apoyan la producción de proteínas terapéuticas que son al menos tan puras como se consiguen usando hidrolizado de soya que contiene medio de alimentación. En algunas modalidades la pureza se evalúa después de la purificación de un anticuerpo mediante cromatografía con la proteína A. La pureza se puede determinar, por ejemplo, por HPLC en fase inversa o la cromatografía de exclusión por tamaño (HP-SEC).

En una modalidad, la temperatura del cultivo se desplaza durante la producción de 37°C a 34°C, por ejemplo, al día 3, 4 ó 5 de la producción.

En una modalidad, el suplemento de la presente invención se ha elaborado como un concentrado 20X y se añade a la concentración final de 1.33X, 2.66X y/o 4X en ciclos de producción. En otras modalidades, el suplemento se prepara y se utiliza como concentrado 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 11X, 12X, 12X, 13X, 14X, 15X, 16X, 17X, 18X, 19X o más. En incluso otras modalidades, el suplemento se prepara y se utiliza como un concentrado 21X, 22X, 23X, 24X, 25X, 26X, 27X, 28X, 29X, 30X o más.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A muestra el título de mejora relativa para las tres líneas celulares de producción de anticuerpos crecidas utilizando los medios base comerciales como una función de cómo (y si) los cultivos fueron alimentados durante la producción. Los anticuerpos producidos por las líneas celulares se refieren en la presente invención como anticuerpos A (barra blanca), B (barra sombreada) y C (barra negra). Todas las células fueron cultivadas en medio base comercial con suplementos como se indica. Los medios base utilizados fueron medio C5467 EX-CELL® ACF CHO de Sigma, libre de componente animal, con HEPES, sin L-glutamina, líquido, esterilizado por filtración, evaluado para cultivo celular, ya sea con ácido aurin tricarboxilico (ATA) (para las células productoras de anticuerpos A y C) o sin ATA (para las células productoras de anticuerpos B, y los anticuerpos D, E y F, que se discuten a continuación). Todos los cultivos en las figuras 1A y 1 B fueron cultivadas a 37°C. Los cultivos se suplementaron con cualquiera de hidrolizado de soya, un medio concentrado para alimentación comercialmente disponible o alimento SP. El medio de alimentación comercialmente disponible fue Suplemento para alimentación de bio-reactor C1615 CHO de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Los títulos de anticuerpos fueron determinados por HPLC de fase reversa.

La figura 1 B muestra datos similares a los que se muestran en la figura 1A, salvo que los datos se presentan para las células suplementadas con hidrolizado de soya y con alimento SP.

Las figuras 2A-2D muestran la mejora relativa del titulo para los diversos anticuerpos. Las figuras 2A y 2B muestran la mejora relativa de títulos para el anticuerpo D como una función de si los cultivos se suplementaron con hidrolizado de soya o con alimento SP, tanto en biorreactores Braun de 2L (Figura 2A) como en matraces de agitación (Figura 2B). La figura 2C muestra la mejora relativa del título en matraces de agitación para dos clonas que expresan anticuerpos E como una función de si los cultivos se cultivaron usando alimentación básica, suplementada con hidrolizado de soya, o suplementada con la alimento SP. La figura 2D muestra el título de mejora relativa en matraces de agitación para 10 clones diferentes seleccionados que expresan anticuerpos F como una función de si los cultivos se cultivaron usando la alimentación básica, se suplementaron con hidrolizado de soya, o se suplementaron con la alimento SP. Como es evidente, los títulos relativos se normalizaron a los títulos de los cultivos suplementado con hidrolizado de soya.

La figura 3 muestra el título relativo para una línea celular de producción de anticuerpos cultivada a 37°C (barra sombreada) o 34°C (barra blanca), como una función de si los cultivos fueron suplementados con hidrolizado de soya, alimento SP, o ambos. La línea celular utilizada en este experimento produjo anticuerpos A. Los cultivos crecidos a 37°C presentaron menores títulos bajo todas las condiciones. Los datos se normalizaron con respecto al cultivo suplementado con hidrolizado de soya y crecido a 37°C.

La figura 4 muestra análisis de citometría de flujo con Anexina V y yoduro de propidio (Pl) de la apoptosis en una línea celular para la producción de anticuerpo monoclonal. La línea celular utilizada en este experimento produjo anticuerpos D. Los cultivos fueron suplementados ya sea con hidrolizado de soya o con alimento SP. Las muestras fueron tomadas a los días 0, 6, 13 y 19, y se tiñeron con Anexina V (eje x) y yoduro de propidio (eje Y) y se analizaron mediante citometría de flujo.

La figura 5 muestra el análisis por citometría de flujo de una línea celular para producción de anticuerpo monoclonal (producción de anticuerpo D) suplementada con hidrolizado de soya o alimento SP. En los días 0, 6, 13 o 19, las células se fijaron con paraformaldehído, se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpos anti-Fc de humano marcado con isotiocianato de fluoresceina (FITC). Lecoeur et.al. (1997) J. Immunoi. Methods 209: 1 1 1. Las puertas viables se establecieron basándose en el tamaño celular y los perfiles la granularidad de dispersión frontal/dispersión lateral (FSC/SSC). El histograma gráfica el número de células que expresan la intensidad de FITC indicada en un intervalo de intensidades de FITC, y por lo tanto refleja el número de células que contienen anticuerpos. El eje X es una escala logarítmica de 0 a 104 células, y el eje y es una escala lineal de 0 a 200 cuentas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan como referencias en la misma medida como si cada publicación individual, la entrada de la base de datos (por ejemplo, las secuencias de GenBank o entradas GeneID), solicitud de patente, o la patente, fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia. Los números de acceso GenBank para el ácido nucleico y las secuencias de proteínas mencionadas en la presente invención se refieren al contenido de la base de datos a partir de la fecha de presentación de esta solicitud. Aunque dichas entradas de base de datos se pueden modificar subsecuentemente, GenBank mantiene un registro público de todas las versiones anteriores de las secuencias como una función de la fecha, haciendo a dichas entradas de base de datos una referencia inequívoca a una secuencia específica.

Además, la incorporación como referencia de cualquier patente o solicitud de patente publicada tiene por objeto incorporar las secuencias en la lista de secuencias para esa patente o solicitud de patente publicada. Por ejemplo, la incorporación como referencia de las patentes o solicitudes de patente publicadas describe anticuerpos que se unen específicamente a la IL-23p19 tiene la intención de incorporar todas las secuencias de las mismas, incluyendo todas las CDRs, las variantes del CDR, los dominios variables, y las cadenas ligeras y pesadas, tanto en forma de proteína como de ácido nucleico.

Se pretende que esta declaración de incorporación como referencia por parte de los solicitantes, de conformidad con 37 C.F.R. § 1.57 (b) (1 ), se relacione con cada publicación individual, entrada de la base de datos (por ejemplo, las secuencias GenBank o entradas GeneID), solicitud de patente, o patente, cada una de las cuales se indicada claramente con el cumplimiento de 37 C.F.R. § 1.57 (b) (2), incluso si dicha citación no es inmediatamente adyacente a una declaración dedicada de la incorporación por referencia. La inclusión de las declaraciones de incorporación dedicadas como referencia, si la hay, dentro de la especificación no debilita, de ninguna manera, este estado general de la incorporación como referencia. La citación de las referencias en la presente invención no pretende ser una admisión de que la referencia es la técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto a los contenidos o la fecha de estas publicaciones o documentos.

I. Definiciones Como se utiliza en la presente invención, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una" y "el/la", incluyen sus correspondientes referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se utiliza en la presente invención, "DMEM/F12" se refiere a una mezcla 1 : 1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y medio base F12 de Ham. Dicho medio, se encuentra comercialmente disponible, por ejemplo, como Medio EX-CELL® ACF CHO de Sigma (No. de catálogo C5467). El suplemento alimenticio de la presente invención (alimento SP) se basa en una forma modificada de DMEM/F12 20X con la reducción de las sales inorgánicas (para reducir la osmolaridad acumulada durante la producción), y sin HEPES o rojo fenol. Esta forma modificada de DMEM/F12 20X abarca los componentes 1-46 del Cuadro 3. A menos que se indique lo contrario, el número "componentes" a que se refiere la presente invención son los componentes que figuran en el Cuadro 3. La alimento SP comprende los 49 componentes del Cuadro 3, es decir, DMEM/F12 20X modificado con glutamina agregada a 15 g/L, y además suplementado con selenita de sodio (0.3 mg/L) y vitamina E (30.2 mg/L), como se indica.

A menos que se indique lo contrario, los componentes mencionados por su número en el Cuadro 3 se utilizan en las concentraciones que figuran en el Cuadro 3.

Por razones prácticas, la glutamina (componente 47) suele ser añadido a la mezcla de alimento SP poco antes de la alimentación para evitar la desaminación del glutamato. Además, la tirosina (componente 27) y la cisterna (componente 13) no se mezclan con los otros componentes antes de tiempo, sino que se agregan por separado al cultivo en el momento de la alimentación. Sin pretender limitarse por la teoría, la solubilidad de la tirosina y la cisteina impide su adición al concentrado de alimento SP antes de la alimentación, ya que tienden a caer fuera de la solución durante el tiempo. Por ejemplo, para la producción de procesos en que participan tres alimentaciones en forma de bolo, una solución premezclada de componentes alimenticio SP 1 a 47, se añade al cultivo en el día de un alimento mediante la adición de 6.7% del volumen de cultivo (1/3 del total de 20% de los alimentos agregado sobre el proceso de producción). Una cantidad adecuada de selenito de sodio se añade al cultivo, y una cantidad adecuada de vitamina E se añade a cultivo, de tal manera que las concentraciones finales de los 49 componentes del cultivo sean sustancialmente las mismas que habría sido si los 49 componentes se hubieran añadido como una solución pre-mezclada (concentrado), incluyendo las cantidades previstas en el Cuadro 3. Dichos cálculos se encuentran dentro de la capacidad de la técnica para las personas que elaboran proteínas terapéuticas. Aunque el componente 48, componente 49, y la mezcla de los componentes 1-47 se añaden al cultivo por separado, se pueden añadir en cualquier orden. La formulación proporcionada en el Cuadro 3, por lo tanto, se puede ver como una formulación "virtual" en el sentido de que los componentes del concentrado de alimento se pueden agregar al cultivo para lograr el mismo resultado final como si hubiera sido una única solución preparada, independientemente de si un número limitado de componentes se agregan por separado por razones prácticas o de conveniencia.

El suplemento de la presente invención, en varias modalidades, comprende composiciones definidas por la relación de los componentes presentes en el Cuadro 3, independientemente de la concentración a la que se formulan. Por consiguiente, la invención no se limita a ninguna concentración específica. La invención que comprende la forma del concentrado 20X se proporciona en la Cuadro 3, pero también puede comprender cualquier otra concentración, como por ejemplo menos de 1 X, 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 11X, 12X, 12X, 13X, 14X, 15X, 16X, 17X, 18X, 19X, 20X, 21X, 22X, 23X, 24X, 25X, 26X, 27X, 28X, 29X, 30X o más de 30X, y también las operaciones de concentración no integral. Se pretende que el suplemento se añada para dar una concentración final de aproximadamente, pero no exactamente necesariamente, 4X.

Las concentraciones "X" concentraciones reportadas en la presente invención son arbitrarias, y se basan únicamente en el hecho de que el suplemento alimenticio de la presente invención se deriva de un medio D E /F 2 "20X". Por consiguiente, las concentraciones "X" no reflejan ninguna concentración de procesamiento deseada específica o concentración final. Una concentración final de 4X en medio de cultivo, por ejemplo, puede ser perfectamente adecuada. Este uso no puede ser como el uso típico, en los que a menudo está implícito que "1X" representa cierta concentración "final" deseada en una mezcla de reacción o medio de cultivo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo" se puede referir a cualquier forma de anticuerpos que presenta la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se utiliza en el sentido más amplio y se refiere específicamente a los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud total), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, etc, mientras que exhiban la actividad biológica deseada.

Como se utiliza en la presente invención, cuando se refiere a los anticuerpos, los "fragmentos de unión de los mismos" o "fragmentos de unión al antígeno de los mismos" abarca un fragmento o un derivado de un anticuerpo que aún mantiene sustancialmente la capacidad de unirse a su blanco. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2 , y los fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple, por ejemplo, sc-FV, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Típicamente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos el 10% de su afinidad para su blanco, por ejemplo, no más que un cambio de 10 veces en la constante de unión en equilibrio de disociación (Ka). Preferiblemente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos el 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (o más) de su afinidad de unión, aunque cualquier fragmento de unión con afinidad suficiente para ejercer el efecto biológico deseado será útil. También se pretende que, cuando sea especifico, un fragmento de unión puede incluir las variantes de secuencia con sustituciones conservativas de aminoácidos que no alteran sustancialmente su actividad biológica.

Un "antagonista IL-23" es una molécula que inhibe la actividad de la IL-23 de alguna manera. En algunas modalidades, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención es un antagonista de la IL-23 que inhibe la señalización de la IL-23 a través del receptor de IL-23, por ejemplo mediante la unión a una subunidad de IL-23 o su receptor. En otras modalidades un antagonista de la IL-23 es una molécula pequeña o un polinucleótido, tal como un ácido nucleico o antisentido del siRNA.

"La interleucina-23 (o "IL-23") es una proteína compuesta por dos subunidades polipeptídicas, p19 y p40. La secuencia de la subunidad p19 (también conocida como IL-23p19, IL23A) se proporciona en cualquiera de las Bases de Datos NCBI de Secuencias de Proteínas de Números de Acceso NP_057668, AAH6751 1 , AAH66267, AAH66268, AAH66269, AAH667512, AAH67513 o variantes de estas secuencias que se presentan de manera natural. La secuencia de la subunidad p40 (también conocida como IL-12p40, IL12B) como se describe en cualquiera de las Bases de Datos NCBI de Secuencias de Proteínas de Acceso de Números NP_002 78, P29460, AAG32620, AAH74723, AAH67502, AAH67499, AAH67498, AAH67501 o variantes de estas secuencias que se presentan de manera natural. Todas estas secuencias se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad. "lnterleucina-23R" o "IL-23R", significa una cadena polipeptídica sencilla que consiste de la secuencia de la forma madura de la IL-23R de humano como se describe en la Base de Datos NCBI de Secuencias de Proteínas de Acceso de número NP_653302 (IL23R, Gene ID: 149233) o variantes de las mismas que se producen de manera natural. Las variantes adicionales de la secuencia de IL-23R se describen en WO 01/23556 y WO 02/29060. Todas estas secuencias y los documentos se incorporan aquí como referencia en su totalidad. "lnterleucina-12R 1 " o "IL-12R i " significa una cadena polipeptídica sencilla que consiste de la secuencia de la forma madura de la ?1_-12?ß1 como se describe en la Base de Datos NCBI de Secuencias de Proteínas de Acceso Números NP_714912, NP_005526 (IL12RB1 , Gene ID: 35p4) o variantes de las mismas de origen natural. Todas estas secuencias y documentos se incorporan como referencia en su totalidad.

El término "anticuerpos monoclonales", como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un epitope antigénico único. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonal) típicamente incluyen una gran cantidad de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) epítopes diferentes. El modificador "monoclonales" indica el carácter del anticuerpo como se obtienen de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considera como una exigencia de la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan de conformidad con la presente invención se pueden elaborar mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o se pueden elaborar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales", también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con o es homologa con respecto a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homologa con respecto a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de estos anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada. Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA: 6851-6855.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina ¡nmunológicamente funcional que contiene sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH están covalentemente unidas a un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente se pueden dirigir a los mismos antígenos o a antigenos diferentes.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión al antlgeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades del antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a los fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que permiten que el scFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun (1994) The Pharmacology of monoclonal antibodies, vol. 1 13, y Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp 269-315.

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención también incluyen anticuerpos de dominio único camelizado. Véase, por ejemplo, Muyldermans et al. (2001 ) Trends Biochem. Sci. 26: 230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 23 : 25; WO 94/04678, WO 94/25591 , Patente de E.U.A. No. 6,005,079). En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios VH con modificaciones de tal manera que se forman anticuerpos de dominio único.

Como se utiliza en la presente invención, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión al antigeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el enlace entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de la otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, EP 404.097, WO 93/11 161 , y Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448. Para una revisión de las variantes de anticuerpos diseñados en general, véase Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1 136.

Como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpos que contienen secuencias a partir de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murino), así como los anticuerpos de humano. Dichos anticuerpos contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancíalmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todos o casi todos las asas hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todos o casi todos los de las regiones FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. El prefijo "hum", "hu" o "h" se añade a las designaciones de la clona del anticuerpo cuando sea necesario para distinguir los anticuerpos humanizados de los anticuerpos parentales de roedor (aunque esas mismas designaciones, dependiendo del contexto, también pueden indicar la forma humana de una proteína en particular). Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor en general, comprenderán las mismas secuencias CDR de los anticuerpos parentales de roedor, aunque algunas sustituciones de aminoácidos que se pueden incluir para aumentar la afinidad, aumentan la estabilidad del anticuerpo humanizado, o por otras razones.

Los anticuerpos también incluyen los anticuerpos con las regiones Fe modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,624,821 , WO 2003/086310, WO 2005/120571 , WO 2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58: 640-656. Dicha modificación se puede utilizar para mejorar o suprimir las diversas reacciones del sistema inmunológico, con posibles efectos benéficos en el diagnóstico y el tratamiento. Las alteraciones de la región Fe incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, eliminaciones e inserciones), glicosilación o deglicosilación, y la adición de múltiples Fe. Los cambios en la Fe también pueden alterar la vida media de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos. Una vida media más prolongada puede dar lugar a dosis menos frecuentes, con el concomitante aumento de la comodidad y un menor consumo de material. Véase Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 1 16: 731 a 734-35.

Los anticuerpos también incluyen los anticuerpos con las regiones Fe intactas que proveen funciones efectoras completas, por ejemplo, anticuerpos de isotipo lgG1 de humano, que inducen citotoxicidad dependiente del suplemento (CDC) o anticuerpos dependientes de la citotoxicidad celular (ADCC) en una célula dirigida. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son administrados a células selectivamente depletadas que expresan el antígeno cognado a partir de una población de células.

El término "anticuerpo totalmente humano" se refiere a un anticuerpo humano que comprende solamente las secuencias de proteínas de inmunoglobulina. Un anticuerpo totalmente humano puede contener cadenas de hidratos de carbono de murino si se producen en un ratón, en una célula del ratón, o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. Del mismo modo, "anticuerpo de ratón" o "anticuerpo de rata" se refieren a un anticuerpo que comprende sólo las secuencias de inmunoglobulina de ratón o de rata, respectivamente. Un anticuerpo totalmente humano se puede generar en un ser humano, en un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano, mediante exhibición de fagos y otros métodos de biología molecular.

"Compuesto de unión" se refiere a una molécula, molécula pequeña, macromolécula, polipéptido, anticuerpo o un fragmento o análogo del mismo, o receptores solubles, capaces de unirse a un blanco. El "Compuesto de unión" también puede referirse a un complejo de moléculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molécula ionizada, y a una molécula covalentemente o no covalentemente modificada, por ejemplo, modificada mediante fosforilación, acilación, entrecruzamiento, delación o escisión limitada, que es capaz de unirse a un blanco. Cuando se utiliza con referencia a los anticuerpos, el término "compuesto de unión" se refiere a los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos. "Unión" se refiere a una asociación del compuesto de unión con un blanco en donde la asociación resulta en la reducción del movimiento browniano normal del compuesto de unión, en los casos en donde el compuesto de unión se puede disolver o suspender en la solución. La "composición de unión" se refiere a una molécula, por ejemplo, un compuesto de unión, en combinación con un estabilizador, excipiente, sal, regulador de pH, solvente o aditivo, capaces de unirse a un blanco.

El anticuerpo, o la composición de unión se deriva del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, de la unión del método contemplado a su antigeno con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor, preferiblemente por lo menos diez veces mayor, más preferiblemente al menos 20 veces mayor, y preferiblemente por lo menos 100 veces mayor que la afinidad con antigenos no relacionados. En una modalidad preferida, el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor que aproximadamente 109 litros/mol, como se determinó, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107: 220-239.

II. Suplemento alimenticio con producción libre de producto de origen animal/libre de hidrolizado La presente invención se basa en un deseo de eliminar la dependencia de los componentes animales e hidrolizados de proteína mal definida para la producción de anticuerpos monoclonales y elementos protéicos biológicos en cultivo de células de mamífero (por ejemplo, CHO). El resultado es un suplemento alimenticio para producción químicamente definido, con un rendimiento de producción que es 25% mayor que el título de cultivos suplementados con hidrolizado de soya en biorreactores a pequeña escala, y para duplicar el título de los cultivos sin ningún tipo de suplemento en los estudios en un matraz para agitación. Véanse las Figuras 2A-2D. La proteína generada utilizando este concentrado de DMEM/F12 modificado es de una pureza comparable a la producida utilizando un suplemento que contiene hidrolizado.

En una modalidad, la presente invención proporciona un suplemento alimenticio para un alto rendimiento de anticuerpo monoclonal (mAb) que carece de componentes animales y de hidrolizados de proteína. Dichos suplementos producen mAbs con títulos mejorados y con un perfil de calidad del producto que es comparable a los procesos convencionales que utilizan hidrolizados.

En algunas modalidades, el suplemento se puede utilizar para crecer las células para producir anticuerpos terapéuticos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la IL-23, por ejemplo, a través de la subunidad P19. Los anticuerpos ejemplares que se unen a la IL-23p19 se describen en la Solicitud de Patente Internacional Publicada comúnmente asignada No. WO 2008/103432. En otras modalidades el medio se puede utilizar para producir otras proteínas, incluyendo anticuerpos que se unen específicamente a proteínas diferentes a la IL-23p19, incluyendo fragmentos de anticuerpos o sus derivados, citoquinas, receptores de citoquinas, factores de crecimiento, polipéptidos para uso como vacunas, e incluso proteínas no terapéuticas.

El suplemento para medio de crecimiento de la presente invención (denominado "alimento SP") se basa en una formulación concentrada modificada, del medio base DMEM/F12 suplementado con vitamina E y selenio de sodio (Na2Se03). Otro protocolo de alimentación para la producción de anticuerpos incluye la suplementacion con DMEM/F12 y selenito de sodio como se ha informado. Zhou et al. (1997) Cytotechnology 24: 99.

La estrategia de alimentación se basa en una lógica de alimentación hacia adelante, en la que la cantidad de nutrientes introducidos en el cultivo de células se basa en el consumo de nutrientes y la tasa de crecimiento de las células. Véase, por ejemplo, Zhou et al. (1997) Cytotechnology 24: 99. El medio y los métodos de la presente invención se probaron en matraces para agitación y en biorreactores de tanque agitado a pequeña escala (STR). La caracterización del proceso de producción y evaluación de los productos fueron evaluados de forma simultánea. Los matraces para agitación se emplearon para evaluar los parámetros, tales como las características generales del crecimiento celular, el crecimiento como una función de la temperatura, los efectos del medio base y medio para alimentación, y la evaluación preliminar de estabilidad de la línea celular. Al mismo tiempo, STR se utilizaron para investigar la viabilidad de la producción novedosa de medio para alimentación en un ambiente más controlado. Los cambios fisiológicos que se produjeron con la alimentación de nutrientes y cambios en los parámetros del proceso fueron analizados y controlados para reducir la desviación de los productos.

En un aspecto, la invención se refiere a los métodos de cultivo de células de mamífero, tales como las células CHO, para la producción de polípéptidos terapéuticos, tales como los anticuerpos. Los solicitantes estudiaron varias líneas de células productoras de anticuerpos en cultivo para determinar cuando fueron las mayores tasas de crecimiento celular y de consumo de nutrientes, con suplementación diaria con la alimento SP. Los solicitantes encontraron que 1g de glutamina fue consumida por cada 4 g de glucosa, lo que lleva a una proporción 1 :4 de glutamina en glucosa en la alimentación de SP. Los solicitantes también encontraron que para al menos algunas líneas celulares, es posible alcanzar altos niveles de anticuerpos y de producción utilizando un número finito de alimentaciones en forma de bolo durante un ciclo de producción, en lugar de alimentar diariamente. La alimentación se puede realizar, por ejemplo, ya como tres alimentaciones en forma de bolo, por ejemplo a los días 3, 5 y 10 después de la inoculación. La reducción en el número de tomas simplifica enormemente el proceso de producción, que es de especial importancia para la producción a gran escala, por ejemplo, para la preparación de material clínico. Por consiguiente, en una modalidad, el método consiste en una o más alimentaciones en forma de bolo durante un ciclo de producción, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro tomas, cinco o más alimentaciones en forma de bolo. Estas alimentaciones se realizan preferiblemente antes de agotamiento de los nutrientes en el cultivo, de tal manera que se optimizan la viabilidad celular y la producción. En algunos casos, dichas alimentaciones pueden tener lugar a los días 3, 5 y 10 después de la inoculación.

Como se muestra en la figura 1A, la alimento SP aumenta el título final de anticuerpos en aproximadamente 20% a 80% en relación con el título obtenido cuando las células se suplementan con hidrolizado de soya, un aditivo común para la producción de proteínas. El suplemento alimenticio de la presente invención también se puede utilizar en combinación con otros suplementos, como el hidrolizado de soya, para mejorar aún más la producción en algunas líneas celulares. La figura 1 B demuestra que, si bien el hidrolizado de soya aumenta la producción en un 20%, y la alimento SP aumenta la producción >70%, la combinación aumenta la producción a partir de la línea de células que producen el anticuerpo B en un 90%.

Como se ilustra en las figuras 2A-2D, la suplementacion con alimento SP mejora el título en un ~20%-60% con respecto a la suplementacion con hidrolizado de soya para un número de anticuerpos diferentes. Los títulos fueron mayores con alimento SP en los dos biorreactores y matraces agitados (Figuras 2A y 2B), con títulos 20-33% mayores en el biorreactor con ambos suplementos en comparación con los matraces para agitación (datos no mostrados).

Los anticuerpos utilizados en los experimentos, cuyos resultados se presentan en las figuras 1A, 1 B y 2A-2D se describen generalmente en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Anticuerpos utilizados para evaluar la mejora del título utilizando alimento SP Como se muestra en la figura 3, los cultivos crecidos a 34°C presentaron mayores títulos que los cultivos crecidos a 37°C, independientemente del suplemento al medio de crecimiento. La suplementación con el alimento SP mejoró título de anticuerpos en comparación con la suplementación con hidrolizado de soya, y la combinación de ambos suplementos mejoró los títulos un poco más.

III. Caracterización de células productoras de anticuerpos Las cualidades y la pureza del anticuerpo a ser producido pueden verse afectadas por los cambios fisiológicos en las células que producen. Por consiguiente, también se caracterizan los efectos del suplemento alimenticio de la presente invención sobre varios aspectos de la fisiología celular. El contenido de ADN de las células se mide para determinar la distribución de las células dentro del ciclo celular (datos no mostrados), el estado apoptótico se determinó para evaluar la viabilidad de las células (Figura 4), y se determinó el mAb asociado a la célula para evaluar la productividad (Figura 5). Los tres parámetros se determinaron por citometría de flujo, por ejemplo, utilizando un sistema de citómetro de flujo de múltiples propósitos FACSCalibur (BD Biosciences, San José, California, USA).

La distribución de ADN celular se analizó por citometría de flujo con tinción con yoduro de propidio. El análisis del porcentaje de células en las fases G0/G1 , S y G2/M del ciclo celular muestra que los cultivos suplementados con la alimento SP proporcionan una distribución en el ciclo celular similar a los cultivos suplementados con hidrolizado de soya.

El estado apoptótico de las células se analizó mediante la unión a la anexina V (utilizando anexina marcada con FITC) y tinción con yoduro de propidio (Pl). Véase, por ejemplo, Vermes et. al. (1995) J. Immunol. Methods (1995) 184: 39; Moore et al. (1998) Methods Cell Biol. 57: 265; Tait (2008) J. Nucí. Med. 49: 1573. La figura 4 muestra que en los días 13 y 19 de la producción, se encontró un mayor porcentaje de células a partir de cultivos suplementados con alimento SP en la puerta viable (cuadrante izquierdo inferior LL) y se encontró un menor porcentaje en la puerta apoptótica/necrótica posterior (cuadrante superior derecho UR) en comparación con las células en cultivos suplementados con hidrolizado de soya. Dichos resultados indican que el alimento SP ofrece un mejor ambiente para mantener la viabilidad celular. Además, si bien ambas fuentes muestran intensidad de fluorescencia media comparable por célula, la figura 5 y el Cuadro 2 (abajo) muestran que las células en cultivos suplementados con alimento SP presentan mayor porcentaje de células en la puerta viable en comparación con la condición de suplemento con hidrolizado de soya (días 13 y 19). El resultado neto con la mayor población de células viables y rendimiento comparable por célula significa que los cultivos suplementados con la alimento SP producen significativamente más anticuerpos al día 13, y en particular al día 19.

CUADRO 2 Producción de anticuerpos y viabilidad IV. Anticuerpos anti-IL-23 En general, los suplementos y los métodos de la presente invención se pueden utilizar en la producción de cualquier proteína de cualquier línea celular de mamífero, y son particularmente adecuados para su utilización en la producción de proteínas terapéuticas de células de ovario de hámster chino (CHO) en cultivo. En un ejemplo no limitante, la proteína terapéutica es un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti IL-23p19 de humano (o fragmento de unión al antígeno del mismo). En varias modalidades, el anticuerpo anti-IL-23p19 de humano comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las secuencias de CDR, o de los dominios variables de cadena pesada y ligera, de los anticuerpos humanizados descritos comúnmente asignados a la Solicitud de Patente Internacional Publicada No. WO 2008/103432, la descripción de la cual se incorpora como referencia en su totalidad, por ejemplo el anticuerpo hu13B8. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-23p 9 de humano compite con el anticuerpo hu13B8 por la unión a la IL-23 de humano. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-23p19 de humano se une al mismo epítope en la IL-23 tal como hu13B8. En otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-23p19 de humano es capaz de bloquear unión de la IL-23p19 al anticuerpo producido por el hibridoma depositado de conformidad con el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC -Manassas, Virginia, USA) el 17 de agosto de 2006, con el número de acceso PTA-7803 en un ensayo de inter-bloqueo. En incluso otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-23p19 de humano se une al mismo epítope que el anticuerpo producido por el hibridoma depositado con el número de acceso ATCC PTA-7803. En incluso otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-23p 9 de humano comprende las mismas secuencias CDR que el anticuerpo producido por el hibridoma depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-7803.

Los anticuerpos anti-IL-23p19 adicionales adecuados para la producción utilizando los medios y métodos de la presente invención se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional Publicada comúnmente asignada No. WO 2007/027714 y WO 2008/103473, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. Los anticuerpos anti-IL-23 adicionales se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 7,247,71 1 (a Centocor, que describe los anticuerpos específicos a anti-IL-23p40), las Solicitudes de Patente Publicada de E.U.A. No. 2007/0009526 y 2007/0218064 (a Centocor, que describe los anticuerpos anti-IL-23p19), la Solicitud de Patente Internacional Publicada No. WO 2007/024846 (a Eli Lilly, que describe los anticuerpos anti-IL-23p19), y la Solicitud de Patente Internacional Publicada No. WO 2007/147019 (a ZymoGenetics, que describe un anticuerpo bispecífico para IL-23p19 e IL-17), las descripciones de los cuales se incorporan como referencia en su totalidad. Los anticuerpos ejemplares IL-12/IL-23 (anti-p40) ya en ensayos clínicos incluyen el anticuerpo ustekinumab completamente de humanos de Centocor (CNTO 1275) y el anticuerpo ABT-874 totalmente de humano de Abbott.

En varias modalidades los anticuerpos anti-IL-23p19 de la presente invención comprenden fragmentos de unión al antigeno, tales como, pero no limitados a, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.

El amplio alcance de esta invención se entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no tienen por objeto limitar las invenciones a las modalidades específicas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Métodos generales Los métodos estándares en biología molecular se describen. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Clonlng, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY¡ Wu (1993) Recombinant DNA, vol. 217, Academic Press, San Diego, C.A. Los métodos estándares también aparecen en Ausbel et al. (2001 ) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que describe la clonación de células bacterianas y la mutagénesis del ADN (Vol. 1 ), la clonación en células de mamíferos y levaduras (Vol. 2), los glicoconjugados y la expresión de proteínas (Vol. 3), y la bioinformática (Vol. 4).

Se describen los métodos para purificación de proteínas tales como la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación, y cristalización. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1 , John Wiley and Sons, Inc., New York. Se describen el análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión, glicosilación de proteínas. Véase, por ejemplo, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001 ) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp 16.0.5-16.22.17, Sigma-Aldrich, Co. (2001 ) Products for Life Science Research, St. Louis, MO, pp 45-89, Amersham Pharmacia Biotech (2001 ) BioDirectory, Piscataway, NJ, pp 384-391. Se describen la producción, purificación, y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Coligan et al. (2001 ) Current Protocols in Inmunology, Vol. 1 , John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow y Lañe (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Harlow and Lañe, anteriormente mencionado. Están disponibles las técnicas estándar para la caracterización de las interacciones entre el ligando/receptor. Véase, por ejemplo, Coligan et al. (2001 ) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York.

Están disponibles los métodos de citometría de flujo, incluyendo los sistemas de detección de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS®). Véase, por ejemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001 ) Flow Cytometry, 2a ed.¡ Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Están disponibles los reactivos fluorescentes adecuados para modificar los ácidos nucleicos, incluyendo los iniciadores y sondas de ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos, para uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico. Molecular Probes (2003) Catálogo, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, Sigma-Aldrich (2003) Catálogo, St. Louis, MO.

Se describen los métodos estándares de histología del sistema inmune. Véase, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiat, et al. (2000) Color Atlas of Hystology, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY.

El análisis estadístico se puede realizar utilizando el software comercialmente disponible, incluyendo pero no limitado a JMP® Statistical Discovery Software, SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte, USA.

Se proveen los medios y métodos para crecimiento de la célula, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional Publicada No. WO 90/03430 y la Patente de E.U.A. No. 5,830,761 , las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad.

EJEMPLO 2 Producción del anticuerpo Los anticuerpos monoclonales se producen utilizando los suplementos de alimentación y métodos de la presente invención de la siguiente manera. Las células de ovario de hámster chino (CHO), que expresan el anticuerpo D, un anticuerpo monoclonal IgG anti-IL-23p 9 de humano humanizado de longitud total, se subcultivaron en serie en matraces para agitación con ventilación en el medio base (BM), que comprende el medio libre de proteina C5467 CHO (que carece de ATA) con 1 mL/L de C2115 quelante del hierro (ambos de Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA), 20 mL/L 200 mM de glutamina (Gibco, Grand Island, New York, USA), y 1 mL/L de cada uno de Cellgro Trace Element A y Cellgro Trace Element B (ambos de Mediatech, Manassas, Virginia, USA). Las células se incubaron a 37°C en un incubador humidificado al 7.5% de CO2 y los matraces se agitaron a 100 rpm en una plataforma del agitador orbital Forma (Thermo Scientific, Waltham, Mass., USA). Las células CHO se subcultivaron a una relación de separación de 1 :3 hasta 1 :5, cuando la densidad de células viables fue de 1-2 x 106 células/mL Los efectos de la suplementación con alimento SP sobre la producción de anticuerpos (IgG) se determinaron de la siguiente manera. Los cultivos de control se suplementaron con hidrolizado de soya mediante la adición de un tratamiento térmico al hidrolizado de soya a una concentración final de 5 g/L utilizando una solución de almacenamiento de 200 g/L) en el momento cero. La glucosa y la glutamina se mantuvieron por encima de 1.5 g/L y 100 mg/L, respectivamente, mediante la adición de las soluciones de almacenamiento de la glucosa (450 g/L) y la glutamina (200 mM).

Otros cultivos se suplementaron con la alimento SP, que es un concentrado 20X, para lo cual se proporciona una receta en el Cuadro 3. La alimento SP se basa en un medio DMEM/F12 20X modificado suplementado con selenita de sodio y vitamina E (a-tocoferol), como se describe en el Cuadro 3 y se discute en otro lugar en la presente invención. La glucosa (componente 46) se proporciona a 60 g/L y la concentración de glutamina (componente 47) se ajusta a 15 g/L de conformidad con la relación predeterminada de consumo entre la glucosa y la glutamina de 1 :4.

CUADRO 3 Formulación de alimento SP Componente No. Compuesto Concentración (g/L) 1 CuS04-5H20 0.000026 2 Nitrato férrico-9H20 0.001 3 Sulfato ferroso 7H20 0.00834 4 Sulfato de zinc 7H20 0.00863 5 MgCI2 0.5722 6 MgS04 0.9768 7 Fosfato monobásico de 1 .25 sodio H20 8 Fosfato dibásico de sodio 1.4204 9 L-alanina 0.0891 10 L-Arginina HCI 2.9502 1 1 L-asparagina H20 0.15002 12 Ácido L-aspártico 0.133 13 L-cisteína-HCI H20 0.35122 14 L-Cistina 2HCI 0.62584 15 Ácido L-glutámico 0.14702 16 Glicina 0.37502 17 L-Histidina HCI-H20 0.62964 18 L-lsoleucina 1 .08948 19 L-leucina 1 .18108 20 L-lisina HCI 1.82512 21 L-Metionina 0.34482 22 L-fenilalanina 0.70964 23 L-prolina 0.34502 24 L-serina 0.52504 25 L-Treonina 1 .06908 26 L-triptófano 0.18042 27 L-tirosina 2Na-2H20 1.1 1588 28 L-Valina 1 .057 29 D-biotina 0.000074 30 D-Ca pantotenato 0.0448 31 Cloruro de colina 0.1796 32 Ácido fólico 0.053 33 Mio-lnositol 0.252 34 Niacinamida 0.04037 35 HCI piridoxal 0.04 36 Piridoxina HCI 0.00062 37 Riboflavina 0.00438 38 Tiamina HCI 0.0434 39 Vitamina B-12 0.0136 40 Hipoxantina 2NA 0.054 41 Ácido linoléico 0.00084 42 Ácido lipoico 0.0021 43 Putrescina 2HCI 0.00162 44 Piruvato de sodio 1.1 45 Timidina 0.0073 46 Glucosa 60 47 Glutamina 15 48 Selenita de sodio 0.0003 49 Vitamina E 0.0302 Las células se cultivaron en biorreactores Braun con un volumen de trabajo de 2L (B. Braun Medical Inc., Bethlehem, Pa., USA). El inoculo se escaló en bolsas de onda (Wave Biotech LLC, GE Healthcare, Somerset, NJ, USA) a 37°C y al 7.5% de superposición con C02. Los biorreactores se operaron a pH 6.8, oxígeno disuelto (OD) de 60%, y a una velocidad de agitación de 200 rpm. La temperatura se ajustó inicialmente a 37°C y se disminuyó a 34°C al día 3, 4 ó 5. El oxígeno disuelto se controló mediante burbujeo de oxígeno y el pH se controló mediante la adición de NaOH 1 M o gas de CO2.

Para los lotes alimentados con alimento SP, la alimentación hacia adelante se basa en un indicador - la relación de glucosa/glutamina. El volumen de alimentación fue determinado mediante las siguientes ecuaciones, en las cuales QgiUCosa es la tasa promedio de de consumo de glucosa de 0.019 g/105 células/día, Xn es la densidad de células viables medida en Tn, y CgiUCosa = 60 V reactor C glucosa En la fase de crecimiento: En la fase estacionaria o fase de la muerte: glucosa • X n ' V biorreactor C glucosa La densidad de células viables y la densidad total de células en matraces para agitación y biorreactores se midieron utilizando un analizador automático para cultivo celular Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania). La glucosa, lactato, glutamina y glutamato se determinaron utilizando un analizador YSI 2000 (YSI, Yellow Springs Instruments Co., Ohio, USA). El amoníaco se midió mediante el analizador Nova BioProfile-100 plus (Nova Biomedical Corp., Waltham, Mass., USA). La osmolalidad se midió usando un Micro-Osmómetro Advanced (Advanced Instruments, Norwood, Mass., USA). pH, pC02, p02 se midieron mediante el analizador ABL5 (Radiometer America Inc., Westlake, Ohio, USA). El anticuerpo se cuantificó mediante HPLC en fase inversa o Proteína A-HPLC.

Una vez que un número representativo de los cultivos de una línea celular de producción determinada se ha analizado utilizando las ecuaciones anteriormente mencionadas para determinar cuándo se debe realizar alimentación, y siempre que dichos cultivos muestren una reproducibilidad adecuada, los cultivos futuro de las mismas células, simplemente se pueden alimentar en momentos pre-determinados, en lugar de tener que vigilar activamente el cultivo. Por ejemplo, los cultivos pueden ser alimentados a los días 3, 5 y 10 después de la inoculación. Por otra parte, los cultivos pueden ser alimentados durante la fase exponencial temprana, fase exponencial tardía, y fase estacionaria.

Para algunos de los cultivos estudiados en la presente invención, tres alimentaciones en forma de bolo de 6.67% de volumen cada uno (para un suplemento total de 20% del volumen de trabajo del cultivo a lo largo del proceso de producción) eran suficientes para apoyar la producción de alto nivel de los anticuerpos. Por consiguiente, cada alimento comprende una dilución de la formulación "20X" del Cuadro 3 hasta una concentración final 1.33X en el medio de cultivo. Para los componentes no consumibles, las segunda y tercera alimentaciones en forma de bolo aumentaron su concentración de 2.66X y 4x, respectivamente. Como se estableció anteriormente, las concentraciones "X" reportadas en la presente invención se basan únicamente en el medio DMEM/F12 20X a partir de la cual se deriva el suplemento alimenticio, y no refleja ninguna concentración de trabajo específica deseada (o final) (por ejemplo, "1X").

Las células cultivadas con la adición de alimento SP exhibieron un mejor crecimiento celular, reducción de la apoptosis en los últimos tiempos (por ejemplo, los días 13 y 19 después de la inoculación), y proporcionaron mayores títulos de anticuerpos que los cultivos sin suplementos o cultivos suplementados sólo con hidrolizado de soya. En experimentos con líneas de células CHO que expresan anticuerpos D, los títulos fueron hasta 2 veces mayores en cultivos suplementados con alimento SP, en comparación con los cultivos suplementados sólo con hidrolizado de soya.

Otros experimentos confirman que los anticuerpos producidos a partir de cultivos suplementados con alimento SP tienen características similares a los anticuerpos preparados utilizando un alimento de hidrolizado de soya cuando se mide mediante cromatografía liquida de fase reversa (RP) y cromatografía líquida de alto desempeño para exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) después de la purificación.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un concentrado de suplemento alimenticio celular que comprende los siguientes componentes: CuS04-5H20; Nitrato férrico-9H20; Sulfato ferroso 7H20; Sulfato de zinc 7H2O; MgCI2; MgS04¡ Fosfato monobásico de sodio H20; Fosfato dibásico de sodio; L-alanina; L-Arginina HCI; L-asparagina H20; Ácido L-aspártico; L-cisteína-HCI H20; L-Cistina 2HCI; Ácido L-glutámico; Glicina; L-Histidina HCI-H20; L-lsoleucina; L-leucina; L-lisina HCI; L-Metionina, L-fenilalanina; L-prolina; L-serina; L-Treonina; L-triptófano; L-tirosina 2Na-2H20; L-Valina; D-biotina; D-Ca pantotenato; Cloruro de colina; Ácido fólico; Mio-lnositol; Niacinamida; HCI piridoxal; Piridoxina HCI; Riboflavina; Tiamina HCI; Vitamina B-12; Hipoxantina 2NA; Ácido linoléico; Ácido lipoico; Putrescina 2HCI; Piruvato de sodio; Timidina; Glucosa; Glutamina; y a) selenita de sodio), o b) vitamina E.

2. - El suplemento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende selenita de sodio y vitamina E.

3. - El suplemento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la selenita de sodio está presente a aproximadamente 0.3 mg/L.

4. - El suplemento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la vitamina E está presente a aproximadamente 30.2 mg/L.

5.- Un método para producir una proteina que comprende cultivar células en medio de crecimiento suplementado con el suplemento de la reivindicación 1.

6.- Un método de producir una proteína que comprende: a) crecer las células de mamífero que expresan la proteína en cultivo, b) suplementar el cultivo con el suplemento de la reivindicación 1 , y c) recuperar la proteína a partir del cultivo.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende adicionalmente cambiar la temperatura del cultivo de 37°C a 34°C.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el cambio de la temperatura se lleva a cabo el día 3, el día 4 o el día 5 después de la inoculación.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el paso de suplementacion (b) se repite dos o más veces adicionales.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los pasos de suplementacion se llevan a cabo los días 3, 5 y 10 después de la inoculación.

1 1. - El método de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado además porque las células son células CHO.

12. - El método de conformidad con las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado además porque la proteína es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la misma.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de IgG de humano.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, se une específicamente a la IL-23p19 de humano.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende al menos una CDR de la cadena pesada, y al menos una CDR de la cadena ligera del anticuerpo hu13B8b descrito en la Solicitud de Patente Internacional Publicada No. WO 2008/103432.

16. - Un método para producir una proteína que comprende: a) crecer las células de mamífero que expresan la proteína en cultivo, b) suplementar el cultivo con selenita de sodio o vitamina E, y c) obtener la proteína a partir del cultivo de la célula.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el cultivo está suplementado con selenita de sodio y vitamina E.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la selenita de sodio se añade al cultivo para dar una concentración final de aproximadamente 0.02 mg/L.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la vitamina E se añade al cultivo para dar una concentración final de aproximadamente 2 mg/L.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la selenita de sodio se añade al cultivo para dar una concentración final de aproximadamente 0.02 mg/L y la vitamina E se añade al cultivo para dar la concentración final de aproximadamente 2 mg/L.