MX2011000117A - Composicion farmaceutica para tratamiento y prevencion de cancer. - Google Patents

Abstract

Se describe un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con un polipéptido que comprende al menos siete residuos de aminoácido contiguos contenidos en la proteína CD179b que se identifica como una proteína antígena de cáncer capaz de expresarse específicamente en la superficie de una célula cancerígena o un fragmento del anticuerpo. El anticuerpo o su fragmento pueden utilizarse en una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer.

Description

MPOSICION FRMACEUTICA PARA TRATAMIENTO Y PREVENC CANCER Campo de la Invención La presente invención se refiere a un n céutico de un anticuerpo contra CD179b o uno entos, con un agente para terapia y/o profi r .

Antecedentes de la Invención Los cánceres son la causa más común de muer S causas de muerte, y las terapias actualmente li por consiguiente son principalmente el tra rgico en combinación con radioterapia y quimiote r del desarrollos de nuevos métodos quirúrgic brimiento de nuevos agentes anticancerígenos, recientes, los resultados del tratamiento de En un método terapéutico para cáncer para s secundarios, se desea que el péptido, polip ína reconocida como el antígeno existan fuerte as normales y existan específicamente en rígenas. En 1991, Boon et al., en el Instituto L ca aisló un antígeno de melanoma humano ocido por las células T CD8-positivas , a travé o de clonación de expresión de ADNc utilizando u ar cancerígena autóloga y células T reactivas co ratura No de Patente 2) . A continuación, se re o SEREX (identificaciones serológicas de ant s de clonación de la expresión recombinante) , antígenos de tumor reconocidos por los ant cidos en un cuerpo viviente de un paciente con c esta al cáncer del paciente mismo se identif s de la aplicación de un método de clona las que utilizan vacunas que contienen los antí r han sido llevados a cabo.

Por el otro lado, en años recientes, cos de anticuerpo de terapia de cáncer se h icuos en el mundo, cuyos fármacos activan las p antígeno en las células cancerígenas. Ya que es de los efectos farmacológicos pueden obten fármacos de anticuerpo como los agentes tera íficos del cáncer, están llamando la atención, parte de las proteínas de antígeno a ser activ que se expresan en células normales, de tal f resultado de la administración del anticue ente las células cancerígenas, sino también las ales que expresan el antígeno se dañan, da itado la aparición de efectos secundarios, que lemáticos. De esta forma, se espera que la identi enciación de las células B y no se expresa en c as. Sin embargo, CD179b se sabe que se expr as de leucemia (leucemia de células pre-B) pr a cancerización de pre-B (Literaturas No de Pate Además, CD179b se sabe que se expresa también en infoma (linfoma de célula pre-B) producidas rización de las células pre-B, y capaces de ut un marcador de diagnóstico para el linfoma d (Literatura No de Patente 12) . Sin emba sión específica no ha sido reportada para cé mia diferentes de las células de leucemia de cél infomas diferentes del linfoma de la célula as de cáncer de pecho y similar. Además, no h n reporte que sugiera que los anticuerpos CD s para terapia y/o profilaxis de cáncer.

Literaturas de la Técnica Anterior Literatura No de Patente 4: Int. J. Cáncer, 997) Literatura No de Patente 5: Cáncer Res., (1998) Literatura No de Patente 6: Int. J. Cáncer, (1998) Literatura Ño de Patente 7: Int. J. Oncol . , (1999) Literatura No de Patente 8: Cáncer Res., (1996) Literatura No de Patente 9: Hum. Mol. Genet ) Literatura No de Patente 10: Adv. Immunol . , ) Literatura No de Patente 11: Blood, 92:4 ) Medios para Resolver los Problemas Los presentes inventores estudiaron inte obtener, a través del método SEREX utilizando aciente perro del cual se preparó una colección ada de tejido de cáncer de pecho de canino, el ica una proteína que se une a los anticuer en en el suero derivado del cuerpo viviente que r, y, con base en un gen humano homólogo ido, CD179b humano que tiene la secuencia de am ada en SEC ID NO: 3 se preparó. Además, los p itores descubrieron que CD179b se expresa fuerte os normales, pero se expresa específicamente e pecho, leucemia y células de linfoma. Adem ntes inventores descubrieron que los anticuerpo 9b dañan las células cancerígenas que expresan lo tanto finalizando la presente invención. ácido, o a un fragmento que comprende no men ácidos continuos.

En este modo, el cáncer anterior es un cá sa el gen CD179b.

En otro modo, el cáncer anterior es ca , leucemia o linfoma.

En otro modo, el anticuerpo es un an lonal o un anticuerpo policlonal.

En otro modo, el anticuerpo es un anticu uerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un an estructura de cadena individual o un an ecífico .

En otro modo, el anticuerpo anterior uerpo que comprende una región variable de caden tiene las secuencias de aminoácido mostradas e 103, 104 y 102 y una región variable de caden La presente invención además proporci entes anticuerpos. (i) Un anticuerpo que comprende una ble de cadena pesada que tiene las secuen ácido mostradas en SEC ID NOs : 103, 104 y 10 n variable de cadena ligera que tiene las secue ácido mostradas en SEC ID NOs : 106, 107 y uerpo tiene inmunoreactividad para una proteína (ii) Un anticuerpo que compren una región adena pesada que tiene la secuencia de am ada en SEC ID NO: 105, y una región variable d a que tiene la secuencia de aminoácido SEC ID ticuerpo tiene inmunoreactividad a la proteína C (iii) Los anticuerpos dé (i) y (ii) anterio n actividad citotóxica. (iv) Los anticuerpos de (i) y (ii) anterior cuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 1 ue codifica el polipéptido. (vii) Un ADN que tiene la secuencia base C ID NO: 110. (viii) Un ADN que tiene la secuencia base C ID NO: 111. (ix) Un polipéptido de la región determi ementariedad de cadena pesada (CDR) selecció que consiste de las secuencias de aminoácido m EC ID NOs: 103, 104 y 102 , o un ADN que cod éptido. (x) Un polipéptido de la región determi lementariedad de cadena ligera (CDR) selecció que consiste de las secuencias de aminoácido m EC ID NOs: 106, 107 y 108, o un ADN que cod éptido . encia 1 representa el patrón de expresión ica la proteína CD179b; y el número de re senta el patrón de expresión del gen GAPDH.

La Figura 2 es un diagrama que muestra u tumoral de un anticuerpo contra CD179b (an lonal anti-CD179b #8) en un ratón desnudo al celular cancerígena Namalwa que expresa CD lanto. El número de referencia 3 representa e tumor en miceto con el cual el anticuerpo mo -CD179b #8 se administró; y el número de re senta el tamaño del tumor en el ratón al istró PBS (-) .

Mejor Modo Para Llevar a Cabo la Invención La secuencia de aminoácido mostrada en SEC 1 Listado de Secuencias descrito en la presente i a secuencia de aminoácido de CD179b aislada, a tr uerpos monocloríales , anticuerpos polic uerpos sintéticos , anticuerpos multiespe uerpos humanos, anticuerpos humanizados, ant ricos, anticuerpos de cadena individual (s entos de anticuerpo tales como Fab y F(ab') uerpos y sus fragmentos pueden prepararse a t os conocidos por el experto en la técnica, nte invención, el anticuerpo puede preferi e específicamente a una proteína CD179b, y, en el sujeto es un humano, el anticuerpo preferi anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado co itar o suprimir la reacción de rechazo.

En la presente, el término "específicament a proteína CD179b" significa que el an íficamente se une a una proteína CD179b y no ncialmente a otras proteínas. s de inmunocitos o complemento, como se iormente .

Además, el sujeto de la presente invenció ido a terapia y/o profilaxis de cáncer es un como un humano, una mascota, un animal domésti l deportivo, y el sujeto es preferiblemente huma Los términos "cáncer" y "tumor" utilizado nte especificación significan un neoplasma malig zan de manera intercambiable.

Preparación de antígenos, preparaci uerpos y composiciones farmacéuticas, relacion esente invención.

Ahora se describirán preparación de antíge eparación de anticuerpos Las especies animales de las. cuales se ut ína o uno de sus fragmentos como un ag zarse .

Las secuencias base y las secuencias de am 179b humano y sus homólogos pueden obtenerse or ejemplo, accediendo GenBank (NCBI, USA y ut lgoritmo tal como BLAST o FASTA (Karlin and A Nati. Acad. Sci. U. S. A., 90:5873-5877, 1993; l., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997). én se denomina ?5 , IGLL1, Vpreb2 , LOC608248 o "CD179b" se utiliza como un representante ificación presente. Por ejemplo, el CD179b h tra bajo el número tal como NM_152855 y NM 2 se registra bajo los números tales como N _0 8248 se registra bajo los números tales como XM_ En la presente invención, en los casos en ncía base o la secuencia de aminoácido de CD179 iliza como un estándar, un ácido nucleico o una adas entre sí de tal forma que se logra la s a entre ellas con o sin la introducción de un hu La longitud del fragmento de la proteína C enor de la longitud de los aminoácidos del rminanté antigénica) , que es la unidad má ocida pór el anticuerpo, y menor de la longitud roteína.'La longitud del epítopo está normalment ntervalo de 7 a 12 aminoácidos continuos.

La' proteína CD179b humana antes descrit éptido que contienen sus péptidos parciale tizarse; a través de un método de síntesis quí el método Fmoc (método fluorenil-metiloxicarboni o tBoc (método t-butoxicarbonilo) . Además, tizarse a través de métodos convencionales ut s tipo,s de sintetizadores de péptido comerc nibles .! Además, el polipéptido de interé zando un sintetizador de ácido nucleico corriere nible. Por ejemplo, el ADN que tiene la secuen ada en SEC ID NO: 1 puede preparase llevando a zando ADN cromosómico humano o una colección a como una plantilla, y par de iniciadores desig forma que la secuencia base mostrada en-, SEC I amplificarse ahí mismo. Las condiciones de la PCR pueden establecerse apropiadamente, los incluyen, pero no se limita a, rep dimientb de reacción de 94 °C durante 30 aturalización) , 55 °C durante 30 segundos a lado) y 72 °C durante 2 minutos (extensión) dura lo, 30 ciclos, seguido por la reacción a 72 °C d os. Además, el ADN deseado puede aislarse prepar a(s) o iniciador (s) apropiado con base en la inf I las secuencias base y las secuencias de a como la preparación de la sonda (s) o iniciado rucción , de la colección de ADNc, la clasificaci ción de ADNc y la clonación del gen de int idos por el experto en la técnica y, pueden li de acuérdo con los métodos descritos en, por ook et 'al., Molecular Cloning, Segunda Edición, cols in Molecular Biology (1989) . A partir del I forma obtenido, un ADN que codifica una proteín a o uno de sus péptidos parciales pueden obtener Las células hospederas antes descritas pu uier célula mientras expresen el polipéptido ant ejemplos de células procarióticas incluyen, pe an a, ! E. coli y ejemplos de células euca yen, pero no se limitan a, células cultiv ero tales como células de riñon de mono COS 1, vario de hámster Chino CHO, la línea celular ementario de nutriente y/o similar. Los eje r de expresión para E. coli incluyen el sist scriptll, el sistema de expresión pET y el si sion pGEX. Al incorporar un ADN que codi éptido anterior en tal vector de expresión y tra células .hospederas procarióticas con el vector, el cultivo de los transformantes resultan éptido .codificado por el ADN puede expresarse as hospederas procarióticas. En este procedimi éptido también puede expresarse como una pro n con otra proteína (por ejemplo, la rescente verde (GFP) o glutationa S-transíerasa ( En los casos en donde se utilizan rióticas como células hospederas, un vector de e las eiicarióticas que tienen un promotor, un ime, un* sitio de poli (A) adición y/o similar se ióticas. En los casos en donde se utiliza pIND -CMV-2, pEGFP-Nl, pEGFP-Cl o similar como el v sión, el polipéptido anterior puede expresarse ína de fusión a la cual una etiqueta tal eta His (por ejemplo, (His)6 a (His)i0), una , etiqueta myc, etiqueta Ha o GFP se adiciona.

Paira la introducción del vector de expresio as hospederas, pueden utilizarse métodos bien c como electroporación, el método de fosfato cál o de liposoma, el método de dextrina inyección .

El aislamiento y la purificación del polipé rés de las células hospederas pueden llevarse és de una combinación de operaciones separa los de ' operaciones separadas conocidas incluyen, imitan ¡a, tratamiento con un desnaturalizante opolimérica que tiene por lo menos dos cadenas p cadenas ligeras. Excepto por Ig , es una glico otetramérica de aproximadamente 150 kDa constit cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas icas (H) . Típicamente, cada cadena ligera está cadena pesada a través un enlace covalente de d idual, pero el número de enlaces de disulfuro e as pesadas varía entre varios isoti oglobulina. Cada una de las cadenas pesadas as ligeras también tienen enlaces de disulfur as. Cada cadena pesada tiene un dominio variable en uno de sus extremos, y el dominio variable es varias regiones constantes. Cada cadena ligera io variable (región VL) y tiene una región cons de sus extremos opuestos . La región constante a ligera se alinea con la primera región cons as y de las cadenas ligeras para cuatro FR enl s de tres CDR. En cada cadena pesada, las tres inan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en el orden del térm ada cadena ligera, se denominan CDRL1 , CDRL2 y forma similar. Para la especificidad de unió uerpo contra un antígeno, CDRH3 es la más imp s, las CDR en cada estructura de cadena se m s a través de la región FR de tal forma que una cerca de la otra, por lo tanto contribuye ción de un sitio de unión de antígeno junto co tra estructura de cadena. Aunque la región cons ibuye directamente a la unión del anticu eno, muestra varias funciones efectoras tales cipación en la citotoxicidad mediada por la diente del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis a trav del receptor Fcy, el grado de vida media/depu cual el anticuerpo y un antígeno CD179b se un la función para dañar (o causar la muerte, sup sión de) tumores se ejerce a través de tal u , el tipo del anticuerpo utilizado en la ción no está restringido mientras el anticuer e a una proteína CD179b para tumores dañados ta mia y linfoma.

Los ejemplos de anticuerpo incluyen ant lónales, anticuerpos policlonales , ant ticos, anticuerpos multiespecíficos , ant os, anticuerpos humanizados, anticuerpos qui uerpos de cadena individual, y fragmentos de an ejemplo, Fab y (Aab')2) - Además, el anticuerpo p a clase arbitraria de una molécula de inmunoglobu IgG, IgE, IgM, IgA, IgD o IgY, o una subclase ar como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl o IgA2. as se separan y se fusionan con células de mi , y, de las células fusionadas obtenidas (hibr lon que produce un anticuerpo que tiene una sora del crecimiento de la célula cancerí ciona. A través del aislamiento del hibridoma p nticuerpo monoclonal que tiene una acción supre miento de la célula cancerígena, y el cult doma seguido por la purificación del anticuerpo sobrenadante de cultivo mediante un mét icación de afinidad utilizado comúnmente, s rar el anticuerpo.

Un hibridoma que produce un anticuerpo mo ién puede preparase, por ejemplo, como sigue.

Primero, de acuerdo con un método conoc l se inmuniza con un agente de sensibiliza ral el método se lleva a cabo a través de i dor apropiado cuando la inmunización con el a bilización se lleva a cabo.

Después de la inmunización de un mamífe rmación del aumento en el nivel de suero del an do, se recolectan los inmunocitos del mamífe en a fusión celular. Los ejemplos de inm ridos especialmente incluyen células de bazo.

Como las otras células progenitoras nadas con los inmunocitos, se utilizan cél rna de mamífero. Los ejemplos de células de riblemente utilizadas incluyen varias líneas cidas como P3U1 (P3-X63Ag8Ul) , P3 (P3x63Ag8.65 1. (1979)123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current T biology and Immunology ( 1978) 81 , 1-7), NS-1 (Ko Milstein, C. Eur. J. Immunol . (1976)6, 511-51 argulies. D.H. et al., Cell (1976)8, 405-415) Más particularmente, la fusión celular se por ejemplo, en la presencia de un agente pro sión celular, en un medio nutriente normal. Los gente promotor de la fusión incluyen polietil y el virus Sendai (HVJ) , y, con el fin de me encia de la fusión, un agente auxiliar t xido de dimetilo también pueden agregarse s .

La proporción entre los inmunocitos y las mieloma a ser utilizada puede esta rariamente. Por ejemplo, se prefiere utilizar d más inmunocitos que células de mieloma. Los medio que pueden utilizarse para la fusión yen el medio RPNI1640 que se prefiere miento de la línea celular de mieloma; el medi medios normalmente utilizados para esta c zclado de la mezcla resultante para formar el h nterés. Posteriormente, al repetir la operació on sucesiva de un medio apropiado y la remo nadante a través de centrifugación, los agente n celular y similares que no preferidos miento del hibridoma se remueven.

El hibridoma de esta forma obtenido se sele s de ser cultivado en un medio de selección ño el medio HAT (un medio que contiene hipo pterina y timidina) . El cultivo en el medio HAT ntinúa durante una elaboración de tiempo suficie las células diferentes del hibridoma de interés usionadas) mueran (normalmente durante varios s semanas) . A continuación, se lleva a cabo un m ión de limitación normal para clasificar y e idoma individual que produce el anticuerpo de int gistro TIB196) , para obtener un hibridoma que pr uerpo humano que tiene una actividad deseada (a upresión del crecimiento celular, por ejemp doma de esta forma preparado que produce un an lonal puede subcultivarse en medio normal, enarse en nitrógeno líquido durante un largo per Es decir, el hibridoma puede prepararse a t rocedimiento en donde las células que expr eno deseado se utilizan como un age ibilización para llevar a cabo la inmunización de un método de inmunización convencional, por lo nen los inmunocitos, que después se fusionan con nitoras conocidas a través de un método de lar convencional, seguido por la clasificación ías productoras de anticuerpo monoclonales {hibr s de un método de clasificación convencional. ce el anticuerpo humano, y el suero se obti ño animal. Un anticuerpo policlonal se icando el suero a través de, por ejemplo, preci ulfato de amonio, columnas de proteína y pro tografía de intercambio de ion DEAE, o una co dad acoplada con una proteína CD179b o un tico .

En la presente, los ejemplos conocidos de r ce anticuerpo humano incluyen el ratón KM a/Medarex) y el Xenoratón (Amgen) . Cuando tal iza con una proteína CD179b o uno de sus fragme obtener un anticuerpo policlonal de humano com angre. Además, al eliminar las células de bazo d izado y someter las células al método de fu as de mieloma, se puede preparar el an lonal de tipo humano. nbinante de gen, cuyo anticuerpo se preparó a t clonación del gen del anticuerpo del hibr porándolo en un vector apropiado, el cual de fectó a un hospedero, seguido por permitir dero produzca el anticuerpo a través de la té binación genética (por ejemplo, ver Cari, baeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MO ODIES, publicada en el Reino Unido por M ISHERS LTD, 1990) .

Más particularmente, el ADNc de la región ión V) del anticuerpo de sintetiza de ARNm del h izando transcriptasa inversa. Después de obtene codifica la región V del anticuerpo de interés, e za al ADN que codifica la región constante del an ión C) de interés, y el resultante se incorpo or de expresión. Alternativamente, el ADN que cod referiblemente un anticuerpos monoclonal . Sin én puede ser un anticuerpo policlonal, un an icamente modificado (tal como un anticuerpo qui uerpo humanizado) , o similar.

Los ejemplos de anticuerpo monoclonal uerpos monoclonales humanos y anticuerpos mono les no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclo , anticuerpos monoclonales de rata y ant clonales de pollo) . El anticuerpo monoclona ararse cultivando un hibridoma obtenidos a trav ón de las células de bazo de un mamífero no hum lo, un ratón productor del anticuerpo de ratón izado con la proteína CD179b, con células de mié ejemplos siguientes, un anticuerpo monoclonal de reparó, con el cual se confirmo un efecto anti- nticuerpo #8 tiene una región variable de caden avés de las combinaciones de secuencias deriv entes animales. Sus ejemplos incluyen un anticu regiones variables de la cadena pesada y la a de un cuerpo de ratón y las regiones constant a pesada y la cadena ligera de un anticuerpo hu ración del anticuerpo quimérico puede llevarse zando un método conocido. Por ejemplo, se puede do un ADN que codifica la región V del anticue que codifica la región C el anticuerpo humano, la incorporación del resultante a un vector de e ansfectando el vector a un hospedero, por l tiendo la producción de un anticuerpo quimérico.

Los ejemplos de anticuerpo policlonal uerpos obtenidos a través de la inmunizació l productor del anticuerpo humano (ratón, por n proteína CD179b. regiones de estructura (FR) de un anticuerpo h tizan a través del método PCR de varios oligonuc rados de tal forma que los oligonucleótidos nes traslapadas en sus extremos. El ADN obt a a un ADN que codifica la región consta uerpo humano y el resultante se incorpora en u xpresión, seguido por la introducción del vect dero, para obtener un anticuerpo humaniza icación de Solicitud de Patente Europea No. EP icación de Solicitud de Patente Internació /02576) . Las FR del anticuerpo humano enlazadas a leccionan de tal forma que las regiones determin lementariedad forman un buen sitio de unión a a se requiere, los aminoácidos en las regi ctura en las regiones variables del anticuerp ituirse de tal forma que las regiones determin antes pueden sustituirse con otros aminoácidos.

El número de aminoácidos a ser sustituidos lo, menor de 15, menos 18, no más de 8, no más e 6 , no más de 5 , no más de 4, no más de 3 o n referiblemente de 1 a 5 , preferiblemente de 1 ó uerpo sustituido debe ser funcionalmente equiva uerpo sin sustituir. Las sustitucione riblemente sustituciones de aminoácido conse son sustituciones entre los aminoácidos que iedades de cargas similares, cadenas la idades, aromaticidades y/o similares. Los ami tienen propiedades similares pueden clasifica lo, en aminoácidos básicos (arginina, l idina) , aminoácidos ácidos (por ejemplo, ácido a ido glutámico) , aminoácidos polares sin cargar ragina, glutamina, serina, treonina, cist no está restringida. Tal anticuerpo modificad erse a través de modificación química del an ido. Estos métodos están bien establecidos ca.

En la presente, el término "funcio alente" significa, por ejemplo, que el antic ión tiene una actividad biológica o bioquímica particularmente, una función para dañar tumore ialmente causa la reacción de rechazo cuando s umano. Los ejemplos de tal actividad pueden inc idad supresora del crecimiento celular y una a ión .

Como un método bien conocido por el exper ea para la preparación de un polipéptido funcio alente a un cierto polipéptido, la introducció ión(s) a un polipéptido es conocida. Por ejem rar un anticuerpo funcionalmente equivalente uerpo .

El anticuerpo que reconoce al epítopo ína CD179b a ser reconocido por el anticuer b antes descrito puede obtenerse a través de u ido por el experto en la técnica. Los eje os a través de los cuales pueden obtenerse inc o en donde el epítopo de la proteína CD179b re el anti-CD179b se determina a través de un métod ejemplo, mapeo de epítopo) y un anticuerpo se zando como un inmunógeno un polipéptido que t ncia de aminoácido incluida en el epítopo; y u onde el epítopo del anticuerpo se determina a t étodo normal, seguido por la selección de un an tiene el mismo epítopo que el anticuerpo anti-CD resente, el término "epítopo" significa un frag El anticuerpo de la presente invenció garse con un agente antitumoral. La unión e uerpo y el agente antitumoral puede llevarse s de un separador que tiene un grupo (por eje succinimidilo, grupo formilo, grupo 2-piridilti midilo, grupo alcoxicarbonilo o grupo hidroxi) un grupo amino, grupo, carboxilo, grupo hidrox y/o similar.

Los ejemplos del agente antitumoral incl ientes agentes antitumorales conocidos en la lite lares, que son, paclitaxel, doxorubicina, dauno fosfamida, metotrexato, 5 -fluorouracilo , lfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, car redopa, uredopa, altretamina, trietilen tilenfosforamida, trietilentiofO etilolmelamina, bulatacina, bulatacinona, campt rina, bleomicina, cactinomicma, car nomicina, carzinofilina , cromomicina, dactin bicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRI bicina, esorubicina, idarubicina, márcel aicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivo micina, potfiromicina , puromicina, quel ubicina, estreptonigrina, estreptozocina , tube imex, zinostatina, zorubicina, denopterina, ptero trexato, fludarabina, 6 -mercaptopurina , tia anina, azactidina, 6-azauridina, carmofur, cit soxiuridina , doxifluridina, enocitabina y flo genos tales como calusterona, propion stanolona, epitostanol, mepitiostano, test gluteimida , mitotano, trilostano, ácido f latona, glicósido de aldofosfamida, olevulínico, eniluracilo, amsacrina, best osina, doxetaxel, clorambucilo, gemcitabi anina, mercaptopurina, cisplatina, oxali platina, viriblastina, etoposida, ifo antrona, vincristina, vinorelbina, nov * osida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, ronato, irinotecan, inhibidores de topois orometilornitina (DMFO) , . cido retinoico y capee sales farmacéuticamente aceptables y derivados.

Alternativamente, el anticuerpo de la ción puede unirse a un radioisótopo conocido des literatura o similar, tal como At211, I131, I125, Y , Sm153, Bi212, P32 o Lu. El radioisótopo preferible ivo para terapia y/o diagnóstico de un tumor.

. El anticuerpo de la presente invención uerpo que tiene una reactividad inmunológica co anticuerpo que específicamente reconoce CD1 anticuerpos es un anticuerpo recombinante e región variable en la cadena pesada y en l a está constituida por las regiones determin ementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) derivado de u umano y las regiones de estructura derivada uerpo humano; o cada región variable en la caden la cadena pesada se deriva de un animal no huma uerpo recombinante tiene regiones constantes d anticuerpo humano en la cadena pesada y en l a . Los primeros dos anticuerpos son preferidos.

Estos anticuerpos recombinantes pueden pr sigue. Un ADN que codifica un anticuerpo monoclo lo, anticuerpo monoclonal humano, anticuerpo mo ratón, anticuerpo monoclonal de rata, o an lonal de pollos) contra CD179b humano se c ías productoras de anticuerpo tales como hibrid h, Bethesda, Md. (1991)). Además, los ADN que c egiones variables respectivas o los ADN que codi respectivas se preparan utilizando la téc binación genética (Sambrook et al., Molecular da Edición, Current Protocols in Molecular ) ) o un sintetizador de ADN. En la prese doma productor del anticuerpo monoclonal huma ito puede prepararse inmunizando un animal produ uerpo humano (por ejemplo, ratón) con CD179b do por la fusión de las células de bazo extir l inmunizado con células de mieloma. Además, c era, los ADN que codifican la región variabl n constante en la cadena ligera o en la caden ados de un anticuerpo humano se preparan utilÍ ea de recombinación genética o un sintetizador d En el caso de un anticuerpo humanizado, el uerpo humano .

En el caso de un anticuerpo quimérico, un ica el anticuerpo quimérico puede prepararse a t rocedimiento en donde un ADN que codifica la ble en la cadena ligera o en la cadena pesada animal no humano (por ejemplo, ratón rata o p a un ADN que codifica la región constante de l a o la cadena pesada, respectivamente, derivad uerpo humano.

En el caso de un anticuerpo de cadena ind s un anticuerpo que tiene una región variable d a y una región variable de cadena ligera lin s entre sí a través de un enlazador, un ADN que ticuerpo de cadena individual puede prepararse procedimiento en donde un ADN que codifica l ble de cadena pesada, un ADN que codifica el enl eering Design and Selection 2007, 20 ( 9 ) : 425-432 ) En el caso de un anticuerpo bis uerpo) , que es un anticuerpo capaz de íficamente a dos diferentes epítopos, un ica el anticuerpos biespecífico puede prepar lo, a través de un procedimiento en donde un ica una región A variable de cadena pesada, un ica una región B variable de cadena ligera, un fica una región B variable de cadena pesada y un fica una región A variable de cadena ligera s en este orden (sin embargo, el ADN que codi n B variable de cadena ligera y el ADN que cod n B variable de cadena pesada se enlazan ent s de un ADN que codifica un enlazador como se riormente) . En la presente, cada una de la ble de cadena pesada y la región variable d as de insecto) , seguido por permitiendo la co-e ADN recombinante (P.J. Delves . , A TIBODY PR TIAL TECHNIQUES . , 1997 WILEY, P. Shepherd and C lonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PR g., Monoclonal Antibodies: principies and pr ACADEMIC PRESS) .

El anticuerpo de la presente invención pre s del método anterior es un anticuerpo que co ejemplo, una región variable de cadena pesada q secuencias de aminoácido mostradas en SEC ID N y 102 y una región variable de cadena ligera q secuencias de aminoácido mostradas SEC ID Nos: lO En la presente, las secuencias de aminoácido m ID Nos: 103, 104 y 102 son las de CDR1 , CDR2 ctivamente , de una región variable de cadena pe cuerpo de ratón, y las secuencias de aminoácido m ncías de aminoácido de las regiones de est adas de un anticuerpo humano; y una región var a ligera que tiene las secuencias de am adas en SEC ID Nos: 106, 107 y 108 y las secue ácido de la regiones de estructuras derivada uerpo humano. (i i) Un anticuerpo que comprende: una ble de cadena pesada que tiene las secuen ácido mostradas en SEC ID Nos: 103, 104 y 102 encias de aminoácido de las regiones de es adas del anticuerpo humano; una región constant da que tiene una secuencia de aminoácido deriva cuerpo humano; una región variable de cadena li e las secuencias de aminoácido mostradas en SEC 107 y 108 y las secuencias de aminoácido de las structuras derivadas de un anticuerpo humano ácido mostrada en SEC ID NO: 105; una región qu adena pesada que tiene una secuencia de am ada de un anticuerpo humano; una región varí a ligera que tiene la secuencia de aminoácido EC ID NO: 109; y una región constante de caden tiene una secuencia de aminoácido derivada uerpo humano.

Las secuencias de las regiones constante nes variables de las cadenas pesadas y cadenas anticuerpo humano pueden obtenerse de, por ejemp ; GenBank, UniGene y similar) . Los ejemplos de se ueden referirse para incluir el número de acces la región constante de cadena pesada IgGl hu o de acceso J00230 para la región constante d a IgG2 humana, el número de acceso X03604 par ante de cadena pesada IgG3 humano, el número d bles de la cadena pesada y la cadena ligera y l nticuerpos anteriores se presentan para el prop ración solamente/ y es evidente que no ingidas a secuencias específicas. Un hibridoma q cir otro anticuerpo humano u otro anticuerpo d umano (por ejemplo, anticuerpo de ratón) contr o se preparó, y el anticuerpo monoclonal produ ibridoma se recuperó, seguido por la decisión de n anticuerpo de interés utilizando como índ idad inmunológica y su citotoxicidad a CD179b h s de esto, un hibridoma producto del an lonal de interés se identificó, y los ADN que c regiones variables de la cadena pesada y la caden nticuerpo de interés se prepararon del hibridoma ibe anteriormente, seguido por la determinació ncias de ADN y después utilizando los ADN Ífica de 2 a 5, preferiblemente de 2 a 3.

La presente invención además proporciona un fica el anticuerpo anterior de la presente inven que codifica la cadena pesada o la cadena li uerpo anterior o un ADN que codifica la región a cadena pesada o la cadena ligera del an rior. Los ejemplos de tal ADN incluyen: ADN que regiones variables de cadena pesada que ti encias base que codifican las secuencias de am radas en SEC ID Nos: 103, 104 y 102 que codif ones variables de cadena ligera que tienen las se S que codifican las secuencias de aminoácido most ID Nos: 106, 107 y 108; y similar.

Ya que las regiones determinant lementariedad (CDR) codificadas por los ADN tien encias son regiones que determinan la especific cadena pesada y la cadena ligera preferiblement ncías bases que codifican las secuencias de am spondiente derivadas de un anticuerpo humano.

Otros ejemplos de ADN que codifican el an presente invención incluyen ADN que codifican 1 ble de cadena pesada que tiene una secuencia ica la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ADN en donde la región que codifica la región cadena ligera tiene una secuencia que codi ncía de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 109 nte, los ejemplos de secuencia base que cod ncia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 105 ecuencia base mostrada en SEC ID NO: 110. Ade los de la secuencia base que codifica la secu ácido mostrada en SEC ID NO: 109 incluyen la s mostrada en SEC ID NO: 111. Entre estos zando un kit de extracción de ARN comerc nible, y ADNc se sintetiza a través de trans sa utilizando iniciadores aleatorios o si riormente, a través del método PCR ut nucleótidos de iniciadores que tienen se rvadas en la región variable de cada uno de los a pesada del anticuerpo de ratón conocidos y e adena ligera, los ADNc que codifican el antic fican. La secuencia que codifica cada región c obtenerse amplificando una secuencia conocida n método PCR. Las secuencias bases del ADN minarse a través de un método convencional a tr ejemplo, la incorporación de las secuencias en p os para determinación de secuencia.

El efecto anti-tumoral del anti-CD179b util presente invención contra células canceríge llevarse a cabo, como se muestra particularment íos siguientes, midiendo la actividad ADC ito o la actividad CDC contra células canceríg san CD17 b in vi tro.

Ya que el anticuerpo anti-CD179b utilizad nte invención se une a una proteína CD179b en rígenas y exhibe una acción anti-tumoral debi idades anteriores, el anticuerpo se conside do efectivo para terapia y/o profilaxis de cá r, la presente invención proporciona una com acéutica para terapia y/o profilaxis de cán rende como componente efectivo un anticuerpo anti os casos en donde se utiliza el anticuerpo ant el propósito de administrar a un cuerpo humano nticuerpo) , el anticuerpo es preferiblemente p un anticuerpo humano a un anticuerpo humanizad rapia y/o profilaxis de cáncer. En términos de unión superior, la constante Ka de vado/ desactivado) es preferiblemente al menos 107 108 M_1, al menos 5x10s M_1 , al menos 109 M_1, M"1, al menos 1010 al menos 5xl010 M_1 , al m al menos BxlO11 M"1, al menos 1012 M"1, al menos se mencionó previamente.

Composición Farmacéutica El objetivo de la composición farmacéutic nte invención para terapia y/o profilaxis de c restringida mientras sea un cáncer (célula) que gen CD179b, y preferiblemente un cáncer ccionada del grupo que consiste de leucemia, l er de pecho, incluyendo también cáncer de la ria, cáncer de la glándula mamaria combinada, turn no de la glándula mamaria, adenocarcinoma papila cnica. Por ejemplo, puede utilizarse parenteral rma de una solución inyectable que contiene una il o una suspensión preparada con otro céuticamente aceptable. Por, ejemplo, la com utilizarse en combinación con un por céuticamente aceptable y/o medio/medio, tal c il, salina fisiológica, aceite vegetal, emuls e de suspensión, agente tensioactivo, estábi e saborizantes , excipiente, vehículo, antisép inante, el cual se mezcla en la forma de u ria requerida para llevar a cabo la formula aímente se acepta. La cantidad del componente formulación se determina de tal forma que se ob en apropiado dentro del intervalo prescrito.

La composición estéril para inyecció ribirse utilizando un vehículo tal como agua d orbato 80 (TM) ; y/o HCO-60.

Los ejemplos "de líquidos oleosos incluyen jonjolí y aceites de frijol de soya, que zarse en combinación con benzoato de bencilo o lico, como, un solubilizante . Además, un agente r H tal como el regulador de pH de fosfato, o regu acetato de sodio; agente calmante tal como clo rocaína; y/o estabilizante tal como alcohol be o antioxidante también pueden mezclarse. La so ción preparada usualmente se rellena en una iada .

La administración se lleva a cabo teralmente , preferiblemente parenteralmente, los particulares incluyen el tipo de table, tipo ele administración nasal, t istración pulmonar y tipo de administración per seleccionarse dentro del intervalo de, por 1 mg a 1000 mg por 1 kg del peso corporal por un nativamente , la dosis puede seleccionarse de valo de 0.001 a 100000 mg/cuerpo por paciente, no se restringe a estos valores. La dosis y e ministración varían dependiendo del peso corpora rna y similar del paciente, y los expertos en la n apropiadamente seleccionarlas.

Polipéptido de ADN La presente invención además proporci entes polipéptidos y ADN relacionados con el an ior . (i) Un polipéptido que tiene la secue ácido mostrada en SEC ID NO: ^105, y un ADN que lipéptido, (ii) Un polipéptido que tiene la secue odifica el polipéptido. (vi) Un polipéptido CDR de cadena cionado del grupo que consiste de secuen ácido mostradas en SEC ID Nos: 106, 107 y 108, odifica el polipéptido.

Estos polipéptidos y los ADN pueden pr zando técnicas de recombinación genética ibe anteriormente.

EJEMPLOS La presente invención ahora se describi etamente a manera de Ejemplos, pero el alcanc nte invención no está restringido a estos culares .

Ejemplo 1: Identificación de un Nuevo Ant r mediante el método SEREX (1) Preparación de la colección de ADNc a glándula mamaria de canino. Para la preparaci ción de fago de ADNc se utilizó el Kit para Sín , y el Kit de Clonación ZAP-ADNc Gigapack i icado por STRATAGENE) de acuerdo con los pr itos en las instrucciones anexas. El tamaño cion de fago de ADNc preparada fue de 2.99 x 105 (2) Clasificación de la Colección de ADNc p Utilizando la colección de fago de ADNc der r de la glándula mamaria de canino preparada ibió anteriormente, se llevó a cabo la ificación. Más particularmente, el E. coli h -Blue MRF1) se infectó con la colección de tal f ncluyeron 2340 clones en una placa de agarosa 15 mm, seguido por cultivo a 42 °C du horas para permitir la formación de placas. La ió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond nte perro diluido 500 veces a temperatura te de 2 a 3 horas .

Como el suero del paciente perro iormente, se utilizó un total de 3 muestras ectaron de cada uno de los perros de los c ió glándula mamaria con cáncer y otro paciente p r en la glándula mamaria. Ester suero se alma y se pre-trató inmediatamente antes de uso. miento del suero se llevó a cabo a través del s o. Es decir, E.coli hospedero (XLl-BLue MRF1) se el fago ? ZAP Express en el cual no se insert eno, y se cultivó en una placa NZT a 37 °C du e. Posteriormente, se agregó 0.2 M de regulador 03 (pH 8.3) conteniendo 0.5 M de NaCl a la pla a se dejó reposar a 4°C por 15 horas, seg peración del sobrenadante como un extracto o 500 veces con TBS complementado con 0.5% le grasa, y la dilución resultante se utilizó ial para la inmuno-clasificación.

La membrana que se tiñó con el suero ínas de fusión tratadas antes descritas se 1 (0.05% de Tween 20/TBS) 4 veces, e IgG anti- (conjugado HRP IgG-h+I de anti Perro de cado por BETHYL Laboratories, Inc.) que se dil con TBS complementado con 0.5% de leche seca s dejó, como un anticuerpo secundario, reacc ratura ambiente por 1 hora. La detección se llev avés de la reacción de coloración enzimática ut lución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche ias cuyas posiciones fueron idénticas a las s positivos de la reacción de coloración se reco palca de agarosa NZY de F90?15 mm, y se disolv dos Para someter los 45 clones positivos ai s del método anterior para el análisis de secue a cabo una operación para convertir el vector vector de plásmido. Más particularmente, 200 µ ión preparadas de tal forma que el E. coli h Blue MRF') estuvo contenido a una absorbencia de se mezclaron juntos 250 µ? de la solución icada y 1 µ? de fago auxiliar ExAssist (fabri AGENE) , y la mezcla resultante se dejó reacciona 15 minutos, seguido por la adición de 3 mi de ismo y el cultivo del resultante a 37°C durante . Esto fue inmediatamente seguido por 20 mi ación en un baño de agua a 70 °C y centrifu g por 15 minutos, después de lo cual el sobrena lectó como una solución de fagémido. Posteriorm ltivaron en medio LB complementado con ampici de concentración final) a 37°C/ segui icación de los ADN de plásmido que tiene ins és utilizando el Kit QIAGEN de plásmido icado por QIAGEN) .

Cada plásmido purificado se sometió a aná ncía de longitud completa del inserto a tr o de desplazamiento de iniciador utilizando el i ostrado en SEC ID NO: 94 y el iniciador T7 mos ID NO: 95. Por medio de este análisis de secue ieron las secuencias genéticas mostradas en ID ID NOs : 4 a 92. Utilizando las secuencias bas ncias de aminoácido (ID pares de SEC ID NOs : 5 s genes, se llevó a cabo la búsqueda de homologí s conocidos utilizando un programa de búsq logía BLAST (htt : //www. nebí .nlm.nih.gov/BLAST/) : 1, y las secuencias de aminoácido del factor o se muestran en SEC ID NOs : 2 y 3. 4) Análisis de Expresión en Cada Tejido Las expresiones de los genes obtenidas a tr o anterior en tejidos normales de perro y s líneas celulares se investigaron a través de R (PCR de Transcripción Inversa) . La reac cripción inversa se llevó a cabo como sigue. E a 100 mg de cada tejido o 5-10xl06 células celular, se extrajo el total de AR utili ivo TRIZOL (fabricado por INVITROGEN) de acuerd colo descrito en las instrucciones anexas. Ut ARN total, el ADNc se sintetizó a través del Si sis de la Primera Estructura de Cadena Supersc R (fabricado por INVITROGEN) de acuerdo colo descrito en las instrucciones anexas. aron de tal forma que se obtuvier ntraciones/cantidades de 0.25 µ? de una rada por la reacción de de transcripción inver da uno de los iniciadores anteriores, 0.2 M de os cUSFTP, y 0.65 U de polimerasa ExTaq (fabri a Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 ión se llevó a cabo repitiendo 30 ciclos de 94° dos, 60 °C por 30 segundos y 72 °C por 30 izando un Ciclador Térmico (fabricado por atories) . Los iniciadores específicos antes d genes que tienen las secuencias base mostradas e 96 y 97 fueron para la amplificación de las po 341 en la secuencia base mostrada en SEC ID amplificación de la región común a todos l 9b de perro en los ID pares de SEC ID NOs : ás, los iniciadores específicos para genes que ti r de pecho en caninos. En términos de expresión ogo de humano, la médula espinal fue el únic l de humano en donde se confirmó su expresión, as de cáncer en humanos su expresión se de s celulares de leucemia y líneas celulares de c , por lo que esa expresión específica de CD179 s celulares de leucemia y líneas celulares de c se confirmó.

En la Fig. 1, el número de referencia ada representa el patrón de expresión tificado como se describe anteriormente, y el ? encia 2 representa el patrón de expresión del g el control para comparación. 5) Análisis de Expresión de la Proteína Ant ias Cancerígenas Posteriormente, cada línea celular cancer de suero fetal de becerro, seguido por d nsión resultante reposar en hielo por una hora. var las células con PBS, las células se suspend de FITC-anticuerpo monoclonal IgG2a anti-ratón d do (fabricado por BD Pharmingen) y 95 µ? ementado con 0.1% de suero fetal de bovino, y ar en hielo por 1 hora. Después de lavar las cél se midió la intensidad fluorescente por FAC icado por Beckton Dickinson. Por el otro lado, se la misma operación antes descrita para prep las como un control, utilizando el anticuerpo de sotipo IgG2a de ratón (fabricado por MBL) en l uerpo CD179b anti -humano de ratón. Como result ias a las cuales se agregó el anticuerpo CD17 o mostraron una intensidad fluorescente no meno r que la del control, y por consiguiente se conf o (nombre del clon: GA 170) . En un ifugadora de 50 mi, se recolectaron 106 cél necen a cada uno de los tres tipos de cél mia humana, Namalwa, BDCM y RPMI 1788 (todos comp , cuya expresión de CD179b se confirmó en el , y se agregaron 100 µ?? de cromo 51 al tubo, seg ación a 37°C por 2 horas. A continuación, las cé on 3 veces con medio RPMI complementado con 10% de becerro, y se colocaron en una placa de fo 6 cavidades en una cantidad de 105 células/ca cavidad, se agregó 1 µg de GA170, y además se a misma 2 x 105 linfocitos separados del bazo de do por cultivo bajo las condiciones de 37°C, 5 horas. A continuación, se midió la cantidad de l sobrenadante de cultivo liberada de las cé dañadas, y se calculó la actividad ADCC p La actividad citotóxica se obtuvo como resu roceso en donde el anticuerpo contra CD179b util presente invención, linfocitos de ratón, as de cada línea celular de leucemia se me do por cultivo de las células por 4 horas, mid idad de cromo 51 liberado en el medio desp vo, y calculando la actividad citotóxica contra ar de leucemia de acuerdo con la siguiente ecu lo*.

?Ecuación: Actividad citotóxica (%) = la romo 51 liberado de Namalwa, BDCM o RPMI1788 de dición del anticuerpo contra CD179b y linfocitos . cantidad de cromo 51 liberado de las células és de la adición de 1N de ácido clorhídrico x 10 (2) La Actividad CDC La sangre recolectada de conejo se coloc ro. A continuación, las células se suspendieron conteniendo el suero de conejo prepara iormente en una cantidad de 50%, y se colocó de fondo en V de 96 cavidades en una cantida as/cavidad. A cada cavidad, se agregó 1 µg d ido por cultivo bajo las condiciones de 37°C, 5 horas. A continuación, se midió la cantidad de obrenadante de cultivo liberada de las células as, y se calculó la actividad CDC por GAI70 con ia cancerígena. Como resultado, se confirma idades CDC de 30.5%, 21.2% y 30.5% para Namalwa 1788, respectivamente. Por el otro lado, cu izó un control de isotipo (nombre del clon: para la misma operación, la actividad anteri ctó. De esta forma, se reveló que, a travé idad CDC inducida utilizando un anticuerpo ntidad de cromo 51 liberada de células objetivo adición de 1N de ácido clorhídrico x 100.

Ejemplo 3: Preparación de un Anticuerpo Mon (1) Preparación de una Proteína Antígena La proteína CD19b humana se preparó por e ipofección en células de animal. El gen CD179 ID NO: 22) se introdujo a un vector que cod n IgGIFc humana. El vector SRalgGIFc, a travé s de restricción Xhol y amHI . El vector SRalgGl r preparado por la introducción del gen para l e humana en el vector pcDL-SRa296 (fabricado po riormente, se mezclaron 24 µg del plásmido con ectamina 2000 (fabricada por Invitrogen) , y icado por Invitrogen) se agregó a la mezcla re obtener un volumen total de 3 mi, seguido por a reposar a temperatura ambiente por no meno hcare) . La sefarosa HP de Proteína A se e ientemente con 20 mM de regulador de pH de fos 0.15 M de NaCl (regulador de pH de equilibrio/r H de lavado) , y se introdujo en la misma una rada mezclando el sobrenadante de cultivo ador de pH de equilibrio a una proporción riormente, la columna se lavó lo suficiente ador de pH de lavado, y se llevó a cabo la elu M regulador de pH de Glicina (pH 2.5) . La a se neutralizó por la adición de 1M de Tris ( egulador de pH se cambió por ultra-filtración ut M de regulador de pH de fosfato (pH 7.4) /O.15 M preparar la proteína CD1790b humana. (2) Obtención de hibridomas Con una cantidad igual del adyuvante ricado por Sigma) , se mezclaron 100 \ig del on con PBS(-) (fabricado por Nissui Pharmaceuti y centrifugaron a 1500 rpm por 10 minutos para brenadante, por lo tanto obteniendo células de b as del bazo obtenidas y las células de mieloma (compradas de ATCC) se mezclaron a una propo , y una solución de PEG calentada a 37 °C prepa ado de 200 µ? de medio RPMI1640 complementado co fetal de becerro y 800 µ? de PEG1500 (fabri inger) se agregaron a la mezcla resultante, seg la mezcla reposar por 5 minutos, por lo tanto bo la fusión. El sobrenadante se removió a tra os de centrifugación a 1700 rpm, y las cél ndieron en 150 mi de medio RPMI1640 (medio de s complementado con 15% suero fetal de becerro, al ó 2% equivalente a la solución HAT fabricada po ada cavidad de placas de 96 cavidades (fabri ades, se colocaron 100 µ?/ml de la solució ína CD179b humana preparada en (1) anterior ión se dejó reposara 4°C por 18 horas. Cada ca con PBS-T 3 veces, y se agregaron 400 µ? de ión de BSA (Albúmina de Suero de Bovino) (fabri ) a cada cavidad, seguido por dejar reposar la ratura ambiente por 3 horas. La solución se re avidades se lavaron 3 veces con 400 µ?/cavidad d do por la adición de 100 µ?/cavidad del sobrena vo de cada uno de los hibridomas obtenidos en ior y dejando la placa a temperatura ambient .

Después de lavar las cavidades 3 veces co gregaron 100 µ? de un anticuerpo IgG (Hit) an do con FIRP (fabricado por Invitrogen) diluí con PBS a cada cavidad, y la placa se dejó r nticuerpos que muestran la absorbencia más alta.

Los hibridomas seleccionados se colocaron de 96 cavidades de tal forma que cada cavidad de célula, y se cultivaron. Una semana desp varon los hibridomas que forman colonias individ cavidades. Las células en estas cavidades a varon para obtener 60 líneas celulares de hi das .

Posteriormente, se seleccionó una línea ce idoma utilizando como índices las afinidades d a células de leucemia, de los anticuerpos produc 60 líneas de células de hibridoma anteriores, ad de una placa de 96 cavidades, se colocaron 1 ción de 1 mg/ml poli -L- lisina (fabricada por Sig placa se dejó reposar a temperatura ambiente tos . Después de remover la solución de poli-L-Lis os, el sobrenadante se removió, y se agregaron 1 ión al 0.05% glutaraldehído (fabricado por Sigm cavidad, seguido por dejar reposar la ratura ambiente por 10 minutos. Cada cavidad se 3 veces, y se agregaron 300 µ? de solución al cada cavidad, seguido por dejar reposar la pla 8 horas. Después de lavar las cavidades 3 veces e agregaron 100 µ? de los sobrenadantes de cu una de las 60 líneas celulares de hibridoma o anteriormente a la cavidad, y la placa se dejó r ratura ambiente por 2 horas . El sobrenadante se S cavidades se lavaron 3 veces con PBS-T, seguid ón de 100 µ? de un anticuerpo de IgG anti -ratón HRP (H+L) diluido 5000 veces con PBS a cada c do la placa reposar a temperatura ambiente por cavidades se lavaron 3 veces con PBS-T, y se a El isotipo del anticuerpo #8 monoclonal ant cido por la cepa #8 de la célula de cionada como se describe anteriormente se deterr todo ELISA.

El sobrenadante de cultivo de la cepa # a de hibridoma se evaluó con el kit de sub-tipi (COSMO BIO Co., Ltd.) de acuerdo con los pr itos en las instrucciones anexas, y, como resul uerpo monoclonal anti-CD1790b se reveló como Ejemplo 4: Efecto Anti-tumoral del Antic lonal Anti-CD179b (I) Preparación del Anticuerpo #8 Monoclon b La cepa #8 de la célula de hibridoma se cu de Hibridoma (fabricado por Invitrogen) . El fl Efecto Anti-tumoral in vitro (en Células) Actividad ADCC Se estudio sí o no o el anticuerpo #8 mo CD179b puede dañar las células de tumor que b humano.

Las células Namalwa de leucemia, en las c rmó la expresión de CD179b humano, se recolectar de centrifugadora de 50 mi en una cantidad as, y se agregaron 10 de cromo 51 al tubo, incubación a 37 °C por 2 horas. A continuac as se lavaron 3 veces con medio RPMI complemen suero fetal de becerro, y se colocaron en una p en V de 96 cavidades en una cantidad ias/cavidad. A cada cavidad, se agregaron 2 uerpo #8 monoclonal anti-CD179b, y 2 x 105 li rados del bazo del ratón además se agregaron a l forma, se reveló que el anticuerpo #8 monoclon puede dañar células de tumor que expresan s de su actividad ADCC.

Actividad CDC La sangre recolectada de un conejo se colo Eppendorf , y se dejó reposar a temperatura ambi inutos, seguido por centrifugación a 3000 rp os para preparar el suero para la medició I idad CDC. En un tubo de centrifugadora de 50 ectaron 106 células de Namalwa, que son cél mia humanas, y se agregaron 100 Ci de cromo 51 ido por incubación a 37 °C por 2 horas y lavad ias tres veces con medio RPMI complementado con 1 1 de becerro. A continuación, las células se susp edio RPMI conteniendo el suero de conejo prepar escribe anteriormente en una cantidad de 50 wa. Por el otro lado, cuando se utilizó un co po (nombre del clon: ME07) en una operación sim idad anterior no se detectó. De esta forma, s el anticuerpo #8 monoclonal anti-CD1790b pue as de tumor que expresan CD179b por medi idad CDC. (3) El efecto anti-tumor en el cuerpo vi Se evaluó la actividad anti-tumor del antic lonal anti-CD179b en el cuerpo vivo de un r un tumor. El anticuerpo utilizado se icando el sobrenadante de cultivo de la cepa a de hibridoma a través de una columna en la mis se describe anteriormente.

Utilizando un ratón que lleva un tumor del celular cancerígena derivada de humano que apan SLC, Inc.) y 300 ig del anticuerpo #8 mo CD179b de la vena de la cola. A continua istraron las mismas cantidades de linfocitos de ticuerpo se administró a cada ratón con tumor d de la cola en un total tres veces en 2 días, y e umor se midió cada día, por lo tanto evaluando e tumoral. Por el otro lado, a cada uno de los 10 llevan tumor restantes, se administró PBS(-) anticuerpo anterior, para proporcionar un g ol .

Como resultado de este estudio, en el se administró el anticuerpo anti-CD1796, el vol se redujo a 65% en el Día 8 con respecto al vo al inicio de la administración del anticuerpo, ió como 100%. En el Día 11, Día 17 y Día 20, el nuyó a 52%, 45% y 35%, respectivamente (ver Fig.

Ejemplo 5: Clonación del Gen para la ble del Anticuerpo #8 Monoclonal Anti-CD179b De la línea celular de hibridoma #8, se ex y los genes para la región variable de caden y la región variable de cadena ligera ( uerpo #8 monoclonal antiCD179b se obtuvieron étodo RT-PC utilizando iniciadores específicos ncia líder de ratón y la región constante del an G3. Para la determinación de sus secuencias, est onaron en el vector pCR2.1 (fabricado por Invitr (1) RT-PCR De 106 células de la cepa #8 de la ce doma, el ARNm se separó utilizando el kit icación de ARNm (fabricado por GE Healthcare) , y ido se transcribió de forma inversa para sinteti zando el kit de síntesis de la primera cepa Sup n . VL, se utilizó un iniciador específico ncía líder de ratón (SEC ID NO: 114) y un i ífico para la región constante de cadena K de ra O: 115) . Estos iniciadores se designaron encia a Jones ST and Bending MM Bio/technology ) . Para la PCR, se utilizó Ex Taq (fabricado po INC.). Para 5 µ? del Regulador de pH de 10 x EX aron 4 µ? de Mezcla dNTP (2.5 mM) , 2 µ? de cad niciadores (1.0 µ?) y 0.25 1 de Ex Taq (5 unidad regó una muestra de ADNc, y se agregó agua esté a resultante a un volumen total de 50 µ? . La rea a cabo bajo las condiciones de 2 minutos de tra °C seguido por 30 ciclos de la combinació turalización a 94°C por 1 minuto, templado a 58° dos y la reacción de extensión a 72 °C por 1 minu (2) Clonación ector se cual se enlazó el ADN se utilizó formación de las células competentes DH5a (fa 0Y0B0) de acuerdo con un método convencional. s de cada uno de los transformantes se cultivar (100 ug/ml de ampicilina) a 37°C durante la ADN de plásmido se purificó utilizando el kit rep kit (fabricado por QIAGEN) . (3) Determinación de las Secuencias El análisis de las secuencias genéticas n VH y la región VL se llevó a cabo analizando lásmido en (2) utilizando el iniciador progre ID NO: 116) y el iniciador inverso M13 (SEC ID N avés de un secuenciador fluorescente (secuenciado L fabricado por A131) , utilizando el nciación de Ciclos Ver. 3.1 del Terminador B rdo con el protocolo en las instrucciones anex TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NOs: 94, 96 a 99; iniciadores SEC ID NO: 95: iniciador T7 SEC ID NOs: 100 y 101; iniciadores GAPDH SEC ID NOs : 116 y 117; iniciadores Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para lle ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Una composición farmacéutica para ter laxis de cáncer caracterizada porque comprende nente efectivo un . anticuerpo o unos de sus fra ticuerpo tiene inmuno-reactividad a una proteín iene la secuencia de aminoácido mostrada en SEC a secuencia de aminoácido que tiene una iden ncia no menor del 60% con la secuencia de amino e sus fragmentos que comprende no menos de 7 ami inuos . 2. La composición farmacéutica de conform eivindicación 1, caracterizada porque el cáncer e 5. Un anticuerpo caracterizado porque compr n variable de cadena pesada que tiene las secue ácido mostradas en SEC ID NOs : 103, 104, y 103 n variable de cadena ligera que tiene las secue ácido mostradas en SEC ID NOs : 106, 107, y uerpo tiene inmuno-reactividad a una proteína CD 6. Un anticuerpo caracterizado porque compr n variable de cadena pesada que tiene la secu ácido mostrada en SEC ID NOs: 105 y una región adena ligera que tiene la secuencia de am ada en SEC ID NO: 109, el anticuerpo tiene ividad a una proteína CD179b. 7. El anticuerpo de conformidad ndicación 5 o 6, caracterizado porque es un an izado, anticuerpo quimérico, anticuerpo de idual o anticuerpo biespecífico . ácido que tiene una identidad de secuencia no con la secuencia de aminoácido, o uno de sus fr omprende no menos de 7 aminoácidos continuos. 10. Un polipéptido caracterizado porque t ncia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 105. 11. Un polipéptido tienen la secuen ácido mostrada en SEC ID NO: 109. 12. Un polipéptido CDR de cadena terizado porque es seleccionado del grupo que s secuencias de aminoácido mostradas en SEC ID N y 102. 13. Un polipéptido CDR de cadena terizado porque es seleccionado del grupo que as secuencias de aminoácido mostradas en SEC ID N y 108. 14. Un ADN caracterizado porque codi