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MX2010012990A - Analogos de peptido de la hormona de estimulacion de alfa-melanocito. - Google Patents

Analogos de peptido de la hormona de estimulacion de alfa-melanocito.

Info

Publication number
MX2010012990A
MX2010012990A MX2010012990A MX2010012990A MX2010012990A MX 2010012990 A MX2010012990 A MX 2010012990A MX 2010012990 A MX2010012990 A MX 2010012990A MX 2010012990 A MX2010012990 A MX 2010012990A MX 2010012990 A MX2010012990 A MX 2010012990A
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MX
Mexico
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msh
ser
ala
trp
phe
Prior art date
Application number
MX2010012990A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael A Perricone
John Lyle Dzuris
Timothy E Weeden
James E Stefano
Clark Q Pan
Andrea E Edling
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of MX2010012990A publication Critical patent/MX2010012990A/es

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Abstract

Se proporcionan en la presente análogos de péptido estables de la hormona de estimulación de alfa-melanocito (a-MSH) nativa que tienen selectividad para el receptor de melanocortina 1 (MC1R). También se proporcionan en la presente preparaciones farmacéuticas de los análogos de péptido de a-MSH, así como métodos para utilizar estos análogos en el tratamiento de condiciones médicas y veterinarias que involucran MC1R.

Description

ANÁLOGOS DE PÉPTIDO DE LA HORMONA DE ESTIMULACIÓN DE ALFA- MELANOCITO Campo Técnico La invención se relaciona a análogos de péptido. En particular, la invención se relaciona a análogos de péptido de la hormona de estimulación de alfa-melanocito nativa (o¡-MSH) que tienen selectividad para el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , preparaciones farmacéuticas de los mismos, asi como el uso de estos análogos en el tratamiento de condiciones médicas y veterinarias.
Técnica Antecedente Los neuropéptidos son péptidos biológicamente activos pequeños que se distribuyen ampliamente por todo el cuerpo y tienen funciones desde neurotransmisor a factor de crecimiento. Mucha evidencia ha indicado que los neuropéptidos tienen capacidades antiinflamatorias. Entre los muchos neuropéptidos están los péptidos melanocórticos (melanocortinas ) , que enlazan a y estimulan los receptores de melanocortina (MC) . Un ejemplo de una melanocortina incluye la hormona de estimulación de a-melanocito (a-MSH) , principalmente conocida por su habilidad para regular la pigmentación periférica, pero también se conoce que tiene capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras . El neuropéptido a-MSH se ha detectado en varios órganos y se produce por las neuronas, pituitaria, intestino, piel y células inmunes.
Las capacidades inmunomoduladoras de la a-MSH se han demostrado en modelos de hipersensibilidad de contacto donde la tolerancia especifica de hapteno se indujo mediante la inyección con a- SH y en la supresión de la inflamación mediada por endotoxina bacteriana. También, cx- SH se ha mostrado que tiene actividad terapéutica en muchos modelos de enfermedad de animales tal como la enfermedad de intestino inflamatorio, artritis y trasplante de corazón experimental. Otros modelos de animales de inflamación del cerebro, lesión renal e inflamación del hígado han demostrado efectos antiinflamatorios con este neuropéptido . -MSH suprime la producción de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-a, IL-6 e IL-1 e inhibe las quimioquinas que reducen la migración de macrófagos y neutrófilos a los sitios inflamatorios. El óxido nítrico (NO) es un mediador común para varias formas de inflamación. La síntesis de NO mediante macrófagos y neutrófilos estimulados con endotoxina también ha mostrado que es inhibida por la . a-MSH. Además de sus efectos sobre la producción de citoquina, a-MSH regula hacia abajo la expresión de MHC clase I, CD86 y CD40 sobre monocitos y células dendríticas que efectúa la presentación de antígeno y la co-estimulación . a-MSH también se conoce que incrementa la formación de interleucina 10 (IL-10) en monocitos, que se cree que es un componente importante en los efectos inmunosupre.sores .
Aunque los mecanismos moleculares de los efectos inmunomoduladores de la a-MSH no son completamente entendidos, un mecanismo de acción potencial de la a-MSH es su habilidad para inhibir la activación del factor nuclear-?? en células. La inhibición de NF-?? da por resultado la supresión de la producción de citoquina pro-inflamatoria y la síntesis de óxido nítrico por los macrófagos. La a-MSH funciona al enlazar los receptores específicos que pertenecen a un grupo de receptores acoplados a la proteína G con siete dominios de transmembrana. Estos receptores incluyen los receptores de melanocortina 1 y de melanocortina 3 (MCR-1 y MCR-3) sobre macrófagos mediante el cual el enlace de a-MSH inhibe NF-??. Muchos de los efectos inmunomoduladores de la a-MSH también son mediados a través de la acumulación de cAMP. El enlace de a-MSH a los receptores de melanocortina incrementan los niveles de cAMP que puede suprimir la degradación de ??? y por lo tanto inhibe la translocación de NF-?? y la producción de ácido nítrico.
Los receptores de MCI, a los cuales a-MSH se enlaza y estimula se ha implicado en varias respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladoras . Cinco tipos de receptores de melanocortina se han identificado, MC1-MC5. Los receptores de MCI se han encontrado sobre melanocitos, células de melanoma, macrófagos, neutrófilos, células de glioma, astrocitos, monocitos, células endoteliales, en ciertas áreas del cerebro, testículos y ovario. Aun permanece interés continuo en compuestos y métodos para estimular los receptores de MCI y para producir respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladoras efectivas.
Breve Descripción de la Invención Se proporciona en la presente un compuesto sustancialmente puro que selectivamente enlaza el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , el compuesto que comprende un tetrapéptido de núcleo que tiene la secuencia His Xaai Arg Trp (SEQ ID NO:l) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEQ ID NO:2); en donde Xaai es D-Cha, D-Phe o Cha, y Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas modalidades, la secuencia C-terminal es D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:3).
Además se proporciona en la presente un compuesto sustancialmente puro que selectivamente enlaza el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , el compuesto que comprende un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaaio Xaann Xaai2 Xaai3, en donde Xaai es D-Val, D-Ala o D-Lys; Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys; Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys; Xaa4 es Gly, o D-Ala; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi- Trp, D-Phe, o D-Ala; Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala; Xaaio es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala; Xaan es D-Ser, D-Ile o D-Ala; Xaai2 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala; Xaai3 es D-Ser o D-Ala; en donde no más de un Xaai-i3 es D-Ala excepto cuando Xaai-3 son todos D-Ala, y no más de un Xaai-13 es un L-aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En todavía otro aspecto, se proporciona en la presente un compuesto sustancialmente puro que comprende un polipéptido que tiene la secuencia: D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 4); D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 5); Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO: 6) ; o D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEQ ID NO:7); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas modalidades, los polipéptidos proporcionado en la presente son PEGilados.
En algunas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente pueden ser conjugados a una porción biológicamente activa.
En algunas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente selectivamente enlazan MC1R. En algunas modalidades, los compuestos exhiben por lo menos una de las siguientes propiedades: habilidad para activar selectivamente MC1R, estabilidad en plasma in vitro y resistencia a la degradación de proteasa.
En un aspecto, se proporciona en la presente una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos sustancialmente puros proporcionados en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar una enfermedad o condición autoinmune en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto proporcionado en la presente. En algunas modalidades, la enfermedad o condición autoinmune se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple, diabetes tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Grave, enfermedad ciliaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveitis autoinmune y miastenia grave.
En todavía otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar inflamación en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto proporcionado en la presente. En algunas modalidades, la inflamación está asociada con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de intestino inflamatorio, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis, psoriasis, gastritis y enfermedad de corazón isquémica .
En un aspecto, se proporciona en la presente un método para reducir o inhibir el rechazo de trasplante de un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto proporcionado en la presente.
En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para tratar melanoma en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una sustancia farmacéutica que comprende excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de .un compuesto proporcionado en la presente.
En todavía otro aspecto, se proporciona un método para tratar melanoma en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una sustancia farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado que comprende un compuesto proporcionado en la presente que está conjugado a una carga útil antitumoral. La carga útil antitumoral puede ser un radionúclido, un radiosensibilizador , un fotosensibilizador , un agente quimioterapéutico, o una toxina.
En un aspecto adicional, se proporciona en la presente un equipo que comprende la composición farmacéutica de un compuesto proporcionado en la presente y opcionalmente instrucciones para el uso.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la reducción de uveitis mediante a-MSH. La Fig . 1A muestra datos de ratones B10.RIII que se trataron con - SH · nativa (100 g/ratón) IV diariamente cuando los registros clínicos fueron 2-3. La uveitis se redujo significativamente comparada con el control no tratado (p<0.01) . La Fig. IB muestra datos de ratones B10.RIII que se trataron con - SH nativa (100 µg/ratón) IP o dexametasona IP (0.2 mg/kg o 2.0 mg/kg) diariamente cuando los registros clínicos fueron 1-2 (n=5) . La inflamación retinal se redujo después de iniciación del tratamiento (p<0.05). El asterisco denota diferencias significantes del control.
La Figura 2 muestra la aminoración de la uveitis en la enfermedad de etapa tardía por RI a-MSH y a-MSH nativa. EAU se indujo en ratones B10.RIII y 100 g/ratón de a-MSH nativa, RI a-MSH o PBS se administró diariamente, i.v., en el Día 12 cuando los ratones alcanzaron la enfermedad de etapa. tardía (registros de 3). La Fig. 2A muestra los datos de los ratones tratados con a-MSH nativa o retro-RI a-MSH que mostraron reducción en los registros del ojo de enfermedad de uveitis comparado con los ratones de control de PBS. La Fig. 2B muestra los registros del ojo máximo individual de ratones en cada grupo en el día 16 de la post-inducción de EAU (n=8) . El asterisco denota las diferencias significantes entre los grupos (p<0.05 ) .
La Figura 3 muestra las imágenes de retina y registros de ojo individuales de animales tratados con a-MSH o RI a-MSH. EAU se indujo en ratones B10. RUI, y diariamente el tratamiento i.v. con 100 µg/ratón de a-MSH nativa, RI a-MSH o PBS comenzando en el día 13 cuando los ratones alcanzaron la enfermedad de etapa tardía. Las imágenes fundoscópicas de las retinas que representan registros de ojo medios de cada grupo después de 13 días de tratamiento son mostradas (n=ll) . El ratón tratado con PBS con un registro de ojo de 3 muestra lesiones inflamatorias en varios cuadrantes del ojo y vasculitis próxima al nervio óptico (Fig. 3A) . Los ratones tratados con a-MSH y RI a- SH con registros de ojo de 1 muestra resolución de uveitis con inflamación solamente alrededor del nervio óptico (Figs. 3B y 3C, respectivamente). Las retinas representan el registro de ojo medio de cada grupo. Los registros de ojo individuales de ratones en cada grupo en el día 13 de post-tratamiento se muestran en la gráfica. El asterisco denota la diferencia significante entre los grupos (p<0.01).
La Figura 4 ilustra la histopatologia de ratones tratados con RI a-MSH y a-MSH nativa en EAU. Ratones B10.RIII hembras se inyectaron con IRBP + CFA para inducir EAU. Los ratones se trataron diariamente, i.v., con 100 g/ratón de retro-inverso a-MSH, a-MSH nativa, o PBS cuando los ratones alcanzaron registros de ojo de 3. El grupo tratado con RI a-MSH o a-MSH de ratones aminoró la respuesta inflamatoria ocular (p<0.05). Las fotografías muestran un manchado de hematoxilina y eosina de los ojos 10 días después del inicio del tratamiento que representan registros de ojo medios de PBS (Fig. 4A) , a-MSH (Fig. 4B) y RI a-MSH (Fig. 4C) de los grupos tratados de ratones. El aumento es 100X.
La Figura 5 muestra el efecto de la dosificación diaria intraperitoneal de retro-inverso a-MSH en la uveitis comparada con un control de péptido mezclado. Los ratones B10.RIII se trataron diariamente mediante inyecciones intraperitoneales con 100 de RI a-MSH o un control de péptido de D aminoácido mezclado en di día 11 después de la inducción de la enfermedad. Los datos muestran los registros de ojo medios clínicos de los grupos de ratones tratados con RI a-MSH (n=4) y con péptido de control mezclado (n=5). Los ratones se trataron un total de 13 días. Los datos son representativos de dos experimentos. El asterisco denota diferencias significantes entre los grupos (p<0.04).
La Figura 6 ilustra la eficacia de RI a-MSH en el tratamiento de la inflamación retinal. Los ratones B10RIII se trataron con RI a—MSH (3, 10, o 100 ug/raton) diariamente por inyecciones IP cuando los registros clínicos fueron 4. El control de péptido mezclado se inyectó en 100 µg/ratón diariamente. La gráfica representa los registros clínicos a través del tiempo. La inflamación retinal reducida se observó después de iniciación del tratamiento con 100 o 10 µg/ratón. Las respuestas clínicas benéficas limitadas se observaron en ratones tratados con una dosis inferior de RI a-MSH (3 pg/ratón) o con PBS o el péptido mezclado de control (n=4). El asterisco denota las diferencias significantes entre los grupos (p<0.05 ) .
La Figura 7 muestra el efecto de RI a-MSH sobre la producción de cAMP en células de melanoma de murino. cAMP se midió en células de melanoma B16-F1 después del tratamiento de las células con a-MSH nativa, retro-inverso a-MSH o el péptido de control mezclado en concentraciones de 0.01 ng/ml - 1000 ng/ml. La Fig. 7A muestra que tanto a- SH nativa y RI -MSH significativamente incrementó el cAMP. Los controles utilizados para medir cAMP incluyeron forskolina en una concentración de 100 µ?. La Fig. 7B muestra los datos de exploración de alanina. Los péptidos sustituidos con alanina de RI OÍ-MSH en 1 g/ml se probaron para incrementos en niveles de cAMP en la linea de células de melanoma B16-F1 de murino. Los datos son representativos de dos experimentos. La lista de secuencias se puede encontrar en la Tabla 1. El asterisco denota diferencias significantes entre los grupos (p<0.01) .
La Figura 8 ilustra el curso de enfermedad de la EAE inducida por OG. EAE se indujo en ratones C57BL/6 mediante la inyección de un péptido MOG35-55 (200 g/ratón) y la emulsión de CFA. La toxina pertusis se inyectó en el dia 0 y el dia 2. El tratamiento i.v. diariamente con 100 ug/ratón de OÍ-MSH, RI a-MSH o PBS inició en el dia 10. La Fig. 8A muestra los registros de enfermedad clínico registrados diariamente. La Fig. 8B muestra los registros de enfermedades individuales en cada grupo en el día 20 > después de la inducción de la enfermedad.
La Figura 9 muestra la reducción de los registros de enfermedad EAE medios mediante RI OÍ-MSH . EAE se indujo en ratones C57BL/6 mediante inyecciones con una emulsión de péptido MOG35-55 (200 g/ratón) y CFA. La toxina pertusi se inyectó en el Día 0 y el día 2. El tratamiento i.p. diariamente con 100 ug o 30 yg/ratón de a-MSH o RI OÍ-MSH, 2 mg/kg de dexametasona, o PBS inició en el día 10. Los registros de enfermedad clínicos se registraron diariamente.
La Figura 10 ilustra la histología de la médula espinal de ratones tratados con RI a-MSH. EAE se indujo en ratones C57BL/6 mediante la inyección de un péptido MOG35-55 (200 µg/ratón) y emulsión de CFA. La toxina pertusis se inyectó en el día 0 y el día 2. El tratamiento i.p. diariamente con 100 µg/ratón de RI a-MSH comenzó en el día 10. La médula espinal se recolectó en el día 24 después de la inducción de la enfermedad. Dos ratones representativos de cada grupo son mostrados: tratados con PBS (Figs. 10a y 10c) y tratados con RI a-MSH (Figs. 10b' y lOd) . Las flechas muestran los sitios de la infiltración de célula inflamatoria .
La Figura 11 muestra la cantidad de TNFa e IL-10 mRNA en el bazo de ratones cebados con péptido MOG durante la fase de enfermedad de EAE. Los ratones se cebaron con 200 iq de péptido MOG en el día 0 y se trataron con PBS, a-MSH (100 pg) o RI a-MSH (100 g) diariamente en los días 10-15. Los bazos se recolectaron en los Días 1 (Figs. lia y 11b), 4 (Figs, lie y lid) y 7 (Figs, lie y llf) después del inicio del tratamiento y se analizaron para la expresión de TNFa e IL-10 mRNA mediante la PCR cuantitativa. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de RNA se normalizan a ß-actina.
La Figura 12 ilustra la respuesta recordatoria al péptido MOG 35-55. Los ratones se cebaron con 200 ? de péptido MOG35-55 en el día 0. En los días 2-8 los ratones se inyectaron i.p. con PBS, 100 de a-MSH o 100 µq de RI OÍ-MSH (n=5) . En el día 9 el bazo (Fig. 12a) y las células del ganglio linfático (Fig. 12b) se recolectaron y se estimularon con 25 g/ml de péptido MOG35-55 o péptido OVA in vitro. Las células se pulsaron con [3H] timidina en el dia 3 en cultivo. Los datos muestran la media ± SD. El sobrenadante se recolectó de los cultivos de células del bazo estimulados con péptido MOG después de 24 horas y los niveles de citoquina de TNF-a e IFN ? (Fig. 12c) y MCP-1 (Fig. 12d) se analizaron mediante citometria de flujo. Los datos muestran la media ±SD. Los ratones nal"ve no se cebaron con el péptido MOG.
La Figura 13 ilustra los perfiles de citoquina en el suero y el bazo después del tratamiento con RI a-MSH en ratones cebados con MOG. Los ratones se cebaron con 200 yg de péptido MOG35-55 en el dia 0. En el dia 2-8 los ratones se inyectaron i.p. con PBS, 100 g de a-MSH o 100 \ig de RI a-MSH (n=5) . En el día 9 se recolectó el bazo y el suero. Las Figs. 13a y 13b muestran los niveles de TNF-a e IL-10 mRNA en el bazo, respectivamente, cuantificado por la PCR en tiempo real. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de RNA se normalizan a ß-actina. El suero también se analizó para los niveles de citoquina mediante la citometria de flujo. La Fig. 13c muestra los niveles en el suero de TNF-a, MCP-1, IL-6, y la Fig. 13d muestra los niveles en el suero de IL-10 e IL-12 . Los ratones nal've no se cebaron con el péptido MOG. Los datos muestran la media ±SD.
La Figura 14 muestra el efecto de a-MSH y RI a- SH sobre marcadores de macrófago. Los ratones se cebaron con el péptido MOG ín vivo y se trataron diariamente con a-MSH o RI a-MSH (100 pg/ratón) en los dias 1-7. Los macrofagos esplénicos se analizaron mediante la citometria de flujo para los niveles de expresión de CD14, CD40 y CD86. Las células se encerraron en ya sea el CDllb+ (Fig. 14a) o F4/80+ (Fig. 14b) población de células de macrófago. Los datos muestran tanto el por ciento positivo medio de la población de macrofagos encerrados (n=5) .
La Figura 15 ilustra un incremento inducido por LPS de niveles de mRNA de mMCIR en tanto los macrofagos perifonéales (Fig. 15a) como el bazo (Fig. 15b) . Los ratones C57BL/6 (n=4) se inyectaron i.p. con LPS (1 pg/ratón) . Los macrofagos perifonéales y el bazo se recolectaron en 0.5 hr, 1 hr y 24 hr. Los niveles de mRNA de mMCIR se cuantificaron mediante la PCR en tiempo real. Los niveles de RNA se normalizaron a 18s.
La Figura 16 muestra el efecto de MSH en un modelo de inflamación de LPS in vivo. Los ratones C57BL/6 se inyectaron con 1 pg de LPS, i.p., Después de 30 min, los ratones se trataron con Dexametasona (2 mg/kg) y a-MSH (Figs. 16a-16c) o RI a-MSH análogo 891 (Figs. 16d-16f ) , i.p. el suero se recolectó 2 horas después de la estimulación de LPS. Los niveles de TNF-a (Figs. 16a y 16d) , MCP-1 (Figs. 16b y 16e) e IL-10 (Figs. 16c y 16f) se analizaron mediante el ensayo de cuentas citométricas mediante la citometria de flujo. Los datos muestran las mediciones de citoquinas individuales y la media de cada grupo (n=6) .
La Figura 17 ilustra la estabilidad de RI-a-MSH y a-MSH en el plasma y el suero. La Fig. 17A muestra la estabilidad de RI-a-MSH y el péptido a-MSH en el plasma y PBS a 37 °C. La Fig. 17B muestra la vida media en el suero del RI-a-MSH y el péptido a-MSH después de una sola inyección intravenosa.
La Figura 18 muestra los resultados de los estudios de enlace de MCH (Fig. 18A) y RI-MSH (Fig. 18B) a los receptores de melanocortina 1, 3, 4 y 5.
La Figura 19 muestra la inversión del HfR de tetrapéptido de núcleo y el retroinverso MSH.
La Figura 20 ilustra la sustitución de los residuos de aminoácido no naturales en porciones variantes de RI-MSH.
La Figura 21 ilustra un ensayo de enlace competitivo representativo de RI-MSH y variaciones del mismo en MC1R.
La Figura 22 ilustra el efecto de los análogos de RI o¡-MSH sobre los niveles de cAMP en células de melanoma de murino B16F1. Fig. 22A: Análogos 890, 891 y 892; Fig. 22B: Análogos 893, 894 y 895; Fig. 22C: Análogos 880, 886 y 878; y Fig. 22D: Análogos 872, 878 y 869.
Descripción Detallada de la Invención Definiciones Las proteínas a-MSH y MC1R y ácidos nucleicos de los presentes métodos no están limitados a una fuente o especie particular. Así, las proteínas y ácidos nucleicos pueden ser aislados o recombinantes .
La hormona de estimulación de a-Melanocito ( -MSH) es un polipéptido que comprende la secuencia Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO: 8) (SYSMEHFRWGKPV) . a-MSH se ha examinado recientemente para las capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras . -MSH se origina de la segmentación proteolítica intracelular de la hormona de proopiomelanocortina (POMC) . El neuropéptido a-MSH se ha detectado en varios órganos y se produce por las neuronas, pituitaria, intestino, piel y células inmunes, a-MSH se ha reportado que suprime la función de la célula T efectora, induce las células T reguladoras y tiene efectos benéficos en los modelos autoinmunes y de transplante.
"Conjugado" o "conjugado" incluye dos o más miembros que son enlazados como unidos, acoplados, formados en complejo o de otra manera asociados entre si. Los miembros se pueden unir entre si a través de enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlace electrostático, enlace hidrógeno, interacciones de van der aals o medios físicos.
Las porciones biológicamente activas" incluyen una molécula o compuesto que induce o modula una respuesta fisiológica. En un aspecto, un compuesto biológicamente activo estimula los receptores de melanocortina, de preferencia los receptores de MCI.
Por "modular" y "modulación" se propone . que la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteína es regulada hacia arriba o regulada hacia abajo, tal que, la expresión, nivel o actividad es mayor que o menor que la observada en la esencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir" o "estimular".
"Secuencia C-terminal" incluye la referencia al extremo de la cadena de aminoácidos terminada típicamente, pero no necesariamente, por un grupo carboxilo. La convención para escribir secuencias de péptido es colocar el extremo C-terminal a la derecha y escribir la secuencia de N- a C-terminal. La secuencia C-terminal puede comprender 1 a 100 aminoácidos, de preferencia 2 a 15 aminoácidos, y aun más de preferencia 3 a 10 aminoácidos. La secuencia C-terminal puede terminar con un grupo carboxilo o el terminal puede ser modificado por métodos bien conocidos en la técnica para i comprender un miembro funcional (por ejemplo, grupo de dirección, señal de retención, lipido y fijador) .
La presente invención proporciona un "compuesto sustancialmente puro". El término "compuesto sustancialmente puro" se utiliza en la presente para describir una molécula, tal como un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que enlaza MC1R, o un fragmento del mismo) que está sustancialmente libre de otras proteínas, . lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los cuales está naturalmente asociado. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como . un polipéptido, puede ser por lo menos 60%, en peso seco, la molécula de interés. La pureza de los polipéptidos se puede determinar utilizando métodos estándares que incluyen, por ejemplo, la electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE) , cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) ) , y el análisis de secuencia de aminoácidos amino-terminal .
En una modalidad, la frase "selectivamente enlaza" significa que un compuesto polipéptido hecho utilizado en la presente invención de preferencia enlaza a un tipo de receptor sobre otro tipo de receptor cuando está en la presencia de una mezcla de dos o más receptores (por ejemplo, receptores de melanocortina, receptores de MCI, MC2, MC3, MC A , MC5 ) .
"Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" incluye un oligopéptido, péptido, polipéptido o secuencia de proteina, o a un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de estos, y a moléculas que ocurren naturalmente o sintéticas. Los términos "polipéptido" y "proteina" incluyen aminoácidos unidos entre si por enlaces de péptido o enlaces de péptido modificados (es decir, isósteres de péptido, y pueden contener aminoácidos modificados diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El término "polipéptido" también incluye péptidos y fragmentos de polipéptido, porciones y los similares. Las abreviaciones en mayúsculas, de una sola letra de los aminoácidos se refieren al L-isómero natural. Las abreviaciones en minúsculas, de una sola letra de los aminoácidos denotan el D-isómero.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteina" se utilizan intercambiablemente, para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los péptidos y polipéptidos pueden ser ya sea completamente compuestos de análogos no naturales, sintéticos de aminoácidos, o es una molécula quimérica de aminoácidos de péptido parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. En un aspecto, un polipéptido se utiliza en una composición, sistema de célula o proceso de la invención (por ejemplo, una célula hospedera que tiene un plásmido que expresa por lo menos una enzima de la invención) . Además, el polipéptido puede referirse a compuestos comprendidos de polímeros de aminoácidos covalentemente unidos a otro grupo funcional (por ejemplo, grupo solubilizante, un grupo de dirección, PEG, grupo no de aminoácido u otro agente terapéutico) .
Los aminoácidos pueden ser abreviados utilizando la siguiente designación entre paréntesis: Prolina (Pro), Valina (Val), Lisina (Lys) , Ornit.ina (Orn) , Norleucina (Nle) , Glicina (Gly) , Triptofano (Trp) , Alanina (Ala) , Fenilalanina (Phe), Arginina (Arg) , Histidina (His), ácido Glutámico (Glu) , ácido Aspártico (Asp) , Serina (Ser) , Metionina (Met) , Isoleucina (He) , Tirosina (Tyr) , Ciclohexilalanina (Cha) , 4-fluoro-D-fenilglicina ( 4-fluoro-D-Phg) , 2-tienil-D-alanina (D-Thi) .
"Tratamiento", "tratando", "tratar" o "terapia" como se utiliza en la presente se refiere a la administración, a un mamífero, de agentes que son capaces de inducir un efecto profiláctico, curativo u otro efecto benéfico con el individuo. El tratamiento adicionalmente puede dar por resultado la atenuación o aminoramiento de una enfermedad o síntoma de una enfermedad en un sujeto.
Como se utiliza en la presente, la forma singular "un", "uno" y "el" incluye referencias plurales a menos que se indique de otra manera. Por ejemplo, "una" célula objetivo incluye una o más células objetivo.
Las composiciones de polipéptido de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. Los residuos de péptido individuales se pueden unir mediante enlaces de péptido, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tal como, por ejemplo, glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida , maleimidas bifuncionales, N, N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N, N' -diisopropilcarbodiimida (DIC) . Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces del enlace de amida tradicional ("enlace de péptido") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=0)-CH2~ para -C(=0)-NH-) , aminometileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH2-O) , tioéter (CH2-S) , tetrazol, tiazol, retroamida, tioamida o éster (ver, por ejemplo, Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry de Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp . 267-357, "Péptido Backbone Modifications, " Marcel Dekker, NY, incorporado en la presente por referencia) .
Los polipéptidos utilizados para practicar el método de la invención se puede modificar por ya sea procesos naturales, tal como el procesamiento post-traduccional (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc.), o por técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte en el polipéptido, incluyendo la cadena principal de péptido, las cadenas laterales de aminoácido o el amino carboxilo terminal. Será apreciado que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos o variantes grados en varios sitios en un polipéptido dado. También un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lipido, unión covalente de un fosfatidilinositol, ciclización de reticulación, formación de enlace de disulfuro, demetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de fijador de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, PEGilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, selenoilación, sulfatación, y adición mediada por RNA de transferencia de aminoácidos a la proteína tal como arginilación . Ver, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins -Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983), incorporado en la presente por referencia .
Modalidades adicionales de compuestos En algunas modalidades, la invención proporcionada en la presente es un compuesto sustancialmente puro que selectivamente enlaza el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , el compuesto que comprende un polipéptido que tiene la secuencia : Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa Xaas Xaa6 Xaa7 Xa s Xaa9 Xaa^o Xaan Xa i2 aai3, en donde Xaax es D-Val, D-Ala o D-Lys; Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys; Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle , D-Ala o D-Lys; Xaa4 es Gly, o D-Ala; Xaas es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala; Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D- -fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala; Xaas es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala; Xaaio es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala; Xaan es D-Ser, D-Ile o D-Ala; Xaai2 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala; Xaai3 es D-Ser o D-Ala; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas modalidades, los análogos de péptido proporcionados en la presente selectivamente enlazan MC1R y comprenden un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaag Xaa9 Xaaio Xaan Xaai2 Xaai3, en donde Xaax es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, o D-Phe; Xaa6 es D-Arg o D-His; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, o D-4-nitro-Phe; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser; Xaaio es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaan es D-Ser o D-Ile; Xaai2 es D-Tyr o D-Ser; Xaai3 es D-Ser; en donde no más de un Xaai-i3 es un L-aminoácido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otras modalidades, los análogos de péptido proporcionados en la presente comprenden un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa¾ Xaa6 Xaa7 Xaaa' Xaa9 Xaaio aan Xaai2 Xaai3, en donde Xaai es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp o Trp; Xaa5 es D-Arg; Xaa es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi; Xaa8 es D-His o His; Xaa9 es D-Glu o D-Ser; Xaaio es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaa es D-Ser o D-Ile; Xaai2 es D-Tyr o D-Ser; Xaai3 es D-Ser; en donde no más de Xaai-13 es un L-aminoácido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos proporcionados en la presente comprenden análogos de péptido de la hormona de simulación de a-Melanocortina (a-MSH) .
En una ¦ modalidad alternativa, los análogos de péptido consisten de D-aminoácidos . En otras modalidades, los péptidos comprenden D-aminoácidos, L-aminoácidos o una mezcla de D y L aminoácidos. En otras modalidades, los péptidos están comprendidos de por lo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de aminoácidos. Los compuestos de la invención también pueden incorporar los siguientes ejemplos no limitativos de aminoácido no estándares: D-ornitina, D-norleucina, 3-benzotienil-D-alanina, 5-hidroxi-D-Trp, 5-metoxi-D-Trp, 4 -fluoro-D-fenilglicina ( 4-fluoro-D-Phg) , 3-piridil-D-alanina, 2-tienil-D-alanina (D-Thi), D-ciclohexilalanina (D-Cha) , 4-nitro-D-Phe , D-citrulina, a-metil-D- et, y D-butionina.
En algunas modalidades, el tetrapéptido de núcleo está comprendido de la secuencia de aminoácidos His Phe Arg Trp o Trp Arg Phe His, de preferencia en la configuración de D-aminoácido . En otra modalidad, el tetrapéptido de núcleo está comprendido de la secuencia de aminoácidos His D-Cha Arg Trp o Trp Arg D-Cha His, de preferencia en la configuración de D-aminoácido . En algunas modalidades, el tetrapéptido de núcleo está comprendido de 4 D-aminoácidos . En otras modalidades, el tetrapéptido de núcleo tiene por lo menos un aminoácido no estándar.
Los compuestos proporcionados en la presente pueden ser sintéticos o recombinantes . Los compuestos de la invención se pueden manufacturar mediante técnicas químicas convencionales conocidas en el arte. Los métodos de síntesis en fase sólida se explican en la literatura publicada tal como Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (E. Atherton, y colaboradores, 1989) . Los compuestos de la invención también se pueden manufacturar mediante técnicas de biología molecular convencionales conocidas en el arte. Dentro de esta solicitud, a menos que se establezca de otra manera, las definiciones de los términos e ilustración de las técnicas de esta solicitud se pueden encontrar de cualquiera de las referencias bien conocidas tales como: Sambrook, J. , y colaboradores, , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel, D., ed. , Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); "Guide a Protein Purification" in Deutshcer, M.P., ed., Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1989); Innis, y colaboradores, PCR Protocols: A Guide a Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual Basic Technique, 2nd Ed. , Alan Liss, Inc. New York, NY (1987); Murray, EJ. , ed. , Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, The Humana Press Inc., Clifton, NJ y Lewin, B., Genes VI, Oxford University Press, New York (1997) . Todas las referencias citadas son incorporadas completamente en la presente por referencia.
En algunas modalidades, los análogos de péptido proporcionados en la presente selectivamente ' enlazan o activan el receptor de melanocortina 1 (MC1R) . Cualquier ensayo adecuado se puede emplear para medir el enlace o activación de MC1R. Por ejemplo, la inducción de cAMP in vitro se puede utilizar para estimar la activación de MC1R. La estimación in vitro puede indicar la activación in vivo. Modalidades adicionales de esta invención comprenden cualquier polipéptido selectivo para los receptores de MCI. La identificación de un compuesto receptor de MCI selectivo puede ser determinado mediante un ensayo de clasificación apropiado. Un ejemplo no limitativo de un ensayo de enlace de receptor de MCI se divulga en el Ejemplo 4. En algunas modalidades, los receptores de MCI preferibles comprenden un receptor de melanocortina 1 de homo sapiens (GenBank Acceso No: NP_002377) .
Modalidades adicionales de la invención se dirigen al compuesto que modulan los niveles de cAMP, óxido nítrico (NO), TNF-OÍ, TNF-OÍ mRNA, IL-10 mRNA, IL-10, IFNy, IL-ß, IL-12 y/o MCP-1. En algunas modalidades, los compuestos incrementan los niveles de cAMP. En otras modalidades, los compuestos se dirigen a la disminución o inhibición de los niveles de óxido nítrico (NO) , TNF-OÍ, TNF- mRNA, IL-10 mRNA, IL-10, IFNy, IL-6, IL-12 y/o MCP-1. La identidad de los compuestos que modulan los niveles mencionados en lo anterior se pueden determinar a través de ensayos de clasificación. Los ensayos aceptados conocidos en la técnica se pueden utilizar para medir los niveles mencionados en lo anterior. Ejemplos no limitativos de ensayos para identificar compuestos que exhiben modulación deseable de estos niveles se divulga en los ejemplos.
En algunas modalidades, los compuestos de esta invención pueden modular la respuesta inmune y la inflamación por un mecanismo de acción alternativo y no está limitado a los mecanismos divulgados en la presente.
En algunas modalidades, los péptidos proporcionados en la presente tienen estabilidad en el plasma mejorado y resistencia a la degradación de proteasa. La estabilidad en el plasma y la resistencia a la degradación de proteasas se puede estimar mediante cualquier método adecuado. Un ejemplo no limitativo se ha divulgado en el Ejemplo 19. La estimación in vitro puede indicar el desempeño, resistencia mejorada y una vida media más larga in vivo.
Los métodos proporcionados en la presente se pueden practicar in vivo, ex vivo o in vitro.
Péptidos PEGilados En algunas modalidades, los péptidos se modifican para aumentar la vida media del péptido. En algunas modalidades, el péptido es PEGilado. En algunas modalidades, los péptidos PEGilados se dirigen a péptidos covalentemente unidos o conjugados a una o más cadenas poliméricas de polietilenglicol (PEG) . Las cadenas poliméricas de PEG pueden incluir cadenas de PEG modificadas, funcionalizadas o de otra manera derivadas. En otra modalidad, la cadena polimérica de PEG puede tener por lo menos uno o más puntos de ramificación. En algunas modalidades preferidas, las cadenas poliméricas de PEG y el péptido PEGilado correspondiente son solubles en agua, son altamente movibles en solución, carecen de toxicidad e inmunogenicidad, tienen fácil evacuación del cuerpo y pueden tener distribución alterada en el cuerpo. En algunas modalidades preferidas, la naturaleza farmacocinética del péptido PEGilado es modulado por el tipo de la cadena de PEG. Las estrategias y métodos para la preparación de péptidos PEGilados se llevan a cabo por métodos conocidos en la técnica (G. Pasuta y F.M. Veronese (2007) "Polimer-drug conjugátion, recent achievements and general strategies" Progress in Polimer Science 32 ( 8-9) : 933-961 , incorporado en la presente por referencia) . La PEGilación de primera y segunda generación de procesos de proteina se puede encontrar en la técnica.
Un ejemplo no limitativo de PEGilación comprende la primera^ etapa de la funcionalización adecuada del polímero PEG en una o ambas terminales (para PEGs lineales) . Los PEGs que son activados en cada terminal con la misma porción reactiva es conocido como "homobifuncional" , donde como si los grupos funcionales presentes son diferentes, entonces el derivado de PEG es referido como "heterobifuncional" o "heterofuncional" . Los derivados químicamente activos o activados del polímero de PEG se preparan para unir el PEG a la molécula deseada. La dirección del grupo funcional adecuado para el derivado de PEG se basa en el grupo de tipo reactivo disponible sobre la molécula que será acoplada al PEG. Ejemplos no limitativos de aminoácidos reactivos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, trionina y tirosina. El grupo amino N-terminal y el ácido carboxílico C-terminal también puede ser utilizado.
Otros PEGs heterobifuncionales para la conjugación: Estos PEGs heterobifuncionales son mucho muy útiles en enlazar dos entidades, donde se necesita un espaciador hidrofílico, flexible y biocompatible . Los grupos de extremo preferidos para PEGs heterobifuncionales son maleimida, vinil sulfonas, piridil disulfuro, amina, ácidos carboxílicos y ésteres N-hidroxisuccinimida (NHS) .
En algunas modalidades de la invención, el péptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0.2 kDa-100 kDa . En algunas modalidades preferidas de la invención, el péptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0.2 kDa-40 kDa. En algunas modalidades preferidas de la invención, el péptido PEGilado puede tener un interval.o de peso molecular entre 0.2 kDa-15 kDa. En otras modalidades, el peso molecular promedio preferido (en Da; como es determinado mediante la cromatografía de exclusión de tamaño) para PEGs, comercialmente disponibles, se puede seleccionar de <lk, 2k, 3.5k, 5k, 10k, 20k, 30k, 40k, y mayor pero puede ser cualquier MW dependiendo de la farmacocinética deseada. Por ejemplo, los PEGs heterobifuncionales de menor peso molecular que pueden ser utilizados como enlazadores y PEGs de peso molecular menor se pueden utilizar para mejorar la solubilidad del péptido. El PEG también puede ser de multibrazos, bifurcado o ramificado.
En algunas modalidades, el péptido se conjuga a moléculas de dirección o funciona como una molécula de dirección, en donde la molécula de dirección preferencialmente se asocia con un receptor deseado. En algunas modalidades deseadas de la invención el péptido se conjuga con un agente citotóxico. El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, función de células y/o causa de extrusión de las células. El término se propone para incluir agentes quimioterapéuticos de isótopos radioactivos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Ejemplos no limitativos del agente citotóxico incluyen maintansina, dolastatina y sus análogos incluyendo tasidotina y auristatina. En otras modalidades de la invención, ejemplos no limitativos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a maitansinoides, itio, bismuto, ricina, cadena A de ricina, saporina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, subunidad A de toxina de difteria, . exotoxina de Pseudomona truncada (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, · fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis, y glucocortocoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211, I 1131 , 1112.5 , vY90 , , Se™m153 , DBi· 212 , DP32 _e i·sótopos radioactivos de LU. Los anticuerpos también se pueden conjugar con una enzima de activación de profármaco anticáncer capaz de convertir el profármaco a' su forma activa.
El péptido puede ser enlazado ya sea directamente o indirectamente al agente citotóxico o de dirección mediante cualquier método actualmente conocido en la técnica. En algunas modalidades preferidas de la invención, el péptido se traba al agente citotóxico o agente de dirección mediante uno o más enlazadores para formar un conjugado, mientras que 'la inclusión del enlazador no impida sustancialmente la función-, enlace, toxicidad o inclusión del péptido o agente conjugado.
Ejemplos no limitativos de enlazadores incluyen enlaces iónicos y covalentes y cualquier otra asociación suficientemente estable, mediante lo cual el agente dirigido será internalizado por una célula a la cual se dirige el conjugado. La porción enlazadora se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas. Las consideraciones de la selección del enlazador pueden incluir el alivio o disminución del impedimento estérico causado por la proximidad de los elementos conjugados, la alteración de otras propiedades del conjugado, -tal como la' especificidad, toxicidad, solubilidad, estabilidad en el suero y/o disponibilidad intracelular del conjugado y/o para incrementar la flexibilidad del enlace. El enlazador puede ser cualquier tipo de enlace y el ejemplo se describe en las patentes norteamericanas Nos. 7,166,702 y 5,194,425, ambas de las cuales son incorporadas completamente por referencia.
Los enlazadores y enlaces que son adecuados para conjugados químicamente enlazados incluyen, pero no están limitados a, enlaces de disulfuro, enlaces de tioéter, enlaces de disulfuro articulado y enlaces covalentes entre* grupos reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estos enlaces se producen utilizando reactivos heterobifuncionales para grupos de tiol reactivos sobre uno o ambos de los polipéptidos y luego al hacer reaccionar a los grupos tiol sobre un polipéptido con grupos tiol reactivo o grupos amina al cual los grupos maleimido reactivos o grupos tiol se pueden unir sobre el otro. Otros enlazadores incluyen, enlazadores segmentables con ácido, tal como bismaleimidoetoxi propano, conjugados de transferrina inestables con ácido y dihidrazida de ácido adipico, que serán segmentados en compartimientos intracelulares más acidicos; reticuladores que son segmentados en la exposición a la luz UV o luz visible y enlazadores, tales como los diversos dominios, tales como CH1, CH2 y CH3, de la región constante de IgGl humana (ver Batra y colaboradores, (1993) Mol. Immunol. 30:379-386, incorporada en la presente por referencia) .
Los enlazadores químicos y enlazadores de péptido se pueden insertar al acoplar covalentemente en enlazador al-péptido y el agente de dirección o citotóxico. ' Los agentes heterobifuncionales, descritos enseguida, se pueden utilizar para efectuar tal acoplamiento covalente.
Reactivos de Reticulación Heterobifuncionales Numerosos reactivos de reticulación heterobifuncionales que se utilizan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en proteínas, con conocidos para aquellos expertos en esta técnica (ver, por ejemplo, the PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook, 1992-1993, que describe la preparación de y uso de tales reactivos y proporciona una fuente comercial para tales reactivos; ver también Cumber y colaboradores, (1992) Bioconjugate Chem. 3' .397-401; Thorpe y colaboradores, (1987) Cáncer Res. 47:5924-5931; Gordon y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci USA 84:308-312; Walden y colaboradores, (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson y colaboradores, (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Manan y colaboradores, (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; awryznaczak y colaboradores, (1992) Br. J. Cáncer 66:361-366; Fattom y colaboradores, (1992) Infection & Immun. 60:584-589). Todas las referencias citadas son incorporadas completamente en la presente por referencia. Estos reactivos se pueden utilizar para formar enlaces covalentes entre el agente de dirección, la quimioquina y el agente dirigido. Estos reactivos incluyen, pero no están limitados a: N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP; enlazador de disulfuro); 6-[3-(2- piridilditio ) propionamido] exanoato de sulfosuccinimidilo ( sulfo-LC-SPDP) ; succinimidiloxicarbonil-a-metil bencil tiosulfato (SMBT, enlazador de disulfato impedido); 6- [3- (2-piridilditio) propionamido] hexanoato de succinimidilo (LC-SPDP) ; 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) ; 3- (2- piridilditio) butirato de succinimidilo (SPDB; enlazador de enlace de disulfuro impedido) ; 2- (7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamida) etil-1, 3-ditiopropionato de sulfosuccinimidilo (SAED) ; 7-azido-4-metilcoumarin-3-acetato de sulfosuccinimidilo (SAMCA) ; 6-[alfa-metil-alfa- (2-piridilditio) toluamido] hexanoato de sulfosuccinimidilo ( sulfo-LC-SMPT ) ; 1, -di- [3' - (2' -piridilditio) propionamido] butano (DPDPB); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- (2-piridiltio) tolueno (SMPT, enlazador disulfato impedido); 6 [a-metil-a- ( 2-piridilditio) toluamido] hexanoato de sulfosuccinimidilo ( sulfo-LC-SMPT ) ; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) ; éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS) ; N-succinimidil ( 4-yodoacetil) aminobenzoato (SIAB; enlazador de tioéter) ; benzoato de sulfosuccinimidil (4-yodoacetil) amino (sulfo-SIAB); succinimidil-4- (p-maleimidofenil ) butirato (SMPB) ; sulfosuccinimidil-4- (p-maleimidofenil ) butirato (sulfo-SMPB) ; hidrazida de azidobenzoilo (ABH) .
Otros enlazadores segmentables heterobifuncionales incluyen (4-yodoacetil) -aminobenzoato de N-succinimidilo; (4-yodoacetil) -aminobenzoato de succinimidilo; 4-succinimidil-oxicarbonil-a- (2-piridilditio) -tolueno; sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a- (piridilditiol ) -toluamido] hexanoato; N-succinimidil-3- ( -2-piridilditio) -proprionato; 6 [3 (- (-2-piridilditio) -proprionamido] hexanoato de succinimidilo ; 6[3(-( -2-piridilditio) -propionamido] hexanoato de succinimidilo; hidrazida de 3- (2-piridilditio) -propionilo, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazinico, S- ( 2-tiopiridil ) -L-cisteina . Compuestos de reticulación bifuncionales ejemplares adicionales se divulgan en las patentes norteamericanas Nos. 5, 349,066, 5, 618, 528, 4, 569, 789, 4, 952, 394 y 5, 137,877, todas las cuales son incorporadas completamente en la presente por referencia.
Enlazadores Segmentables con Ácido, Fotosegmentables y Sensibles al Calor También se pueden utilizar enlazadores segmentables con ácido, fotosegmentables y enlazadores sensibles al calor, particularmente donde fuese necesario segmentar el agente dirigido para permitirle que sea más fácilmente accesible a la reacción. Los enlazadores segmentables con ácido incluye, pero no están limitados a, bismaleimidoetoxi propano; y enlazadores de dihidrazida de ácido adipico (ver, por ejemplo, Fattom y colaboradores, (1992) Infection & Immun. 60:584-589, incorporado en la presente por referencia) y conjugados de transferrina inestables en ácido que contiene una porción suficiente de transferrina para permitir la entrada en la ruta de ciclado de transferrina intracelular (ver, por ejemplo, Welhóner y colaboradores, (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314, incorporado en la presente por referencia) .
Los enlazadores fotosegmentables son enlazadores que se segmentan en la exposición, a la luz (ver, por ejemplo, Goldmacher y colaboradores, (1992) Bioconj . Chem. 3:104-107, los enlazadores que se incorporan en la presente por referencia) para de esta manera liberar el agente dirigido en la exposición a la luz. Los enlazadores fotosegmentables que segmentan la exposición a la luz son conocidos (ver, por ejemplo, Hazum y colaboradores, (1981) in Pept. , Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed) , pp. 105-110, que describe el uso de un grupo nitrobencilo como un grupo protector fotosegmentable para cisterna; Yen y colaboradores, (1989) Makromol. Chem. 190:69-82, que describe copolimeros fotosegmentables solubles en agua, incluyendo copolimeros de hidroxipropilmetacrilamida, copolimero de glicina, copolimero de fluoresceina y copolimero de metilrodamina; Goldmacher y colaboradores, (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107, que describe un reticulador y un reactivo que se somete a la degradación fotolitica en la exposición a la luz de UV cercana (350 nm) ; y Senter y colaboradores, (1985) Photochem . Photobiol . 42:231-237, que describe reactivos de reticulación de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen enlaces fotosegmentables ) para de esta manera liberar el agente dirigido en la exposición a la luz. Todas las referencias citadas se incorporan completamente en la presente por referencia. Tales enlazadores tendrían uso particular en tratar condiciones dermatológicas u oftálmicas que se pueden exponer a la luz utilizando fibra óptica. Después de la administración del conjugado, el ojo o la piel u otra parte del cuerpo se puede exponer a la luz, dando por resultado la liberación de la porción dirigida a partir del conjugado. Tales enlazadores fotosegmentables son útiles en relación con protocolos de diagnóstico en los cuales es deseable remover el agente de dirección para permitir la evacuación rápida desde el cuerpo del animal.
Otros Enlazadores para Conjugación Química Otros enlazadores, incluyendo enlazadores de tritilo, particularmente, grupos de tritilo derivados para generar un género de conjugados que proporcionan liberación de agentes terapéuticos en varios grados de acidez o alcalinidad. La flexibilidad así dada por la habilidad para preseleccionar el intervalo de pH en el cual el agente terapéutico será liberado permite la selección de un enlazador basado en- las diferencias fisiológicas conocidas entre los tejidos en necesidad del suministro de un agente terapéutico (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,612,474, incorporada en la presente por referencia) . Por ejemplo, la acidez de los tejidos de tumor aparece que es menor que aquella de los tejidos normales.
Enlazadores de Péptido Las porciones enlazadoras pueden ser péptidos. Los enlazadores de péptido se pueden emplear en el conjugado. El enlazador de péptido típicamente tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 60 residuos de aminoácido, por ejemplo de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 residuos de aminoácido. La longitud seleccionada dependerá de los factores, tal como el uso para el cual se incluye en enlazador.
La porción de enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos espaciadora flexible, tales como aquellos conocidos en la investigación de anticuerpo de una sola cadena. Ejemplos de tales porciones enlazadoras conocidas incluyen, pero no están limitadas a GGGGS, (GGGGS)n, GKSSGSGSESKS, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKSSGSGSESKEF, SRSSG, SGSSC. Enlazador sensible a tripsina de toxina de Difteria A que tiene la secuencia AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM también es útil.
Se describen porciones de enlace adicionales, por ejemplo, en Huston y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:5879-5883, 1988; Whitlow, M. , y colaboradores, Protein Engin. 6:989-995, 1993; Newton y colaboradores, Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumber y colaboradores, Bioconj . Chem. 3:397-401, 1992; Ladurner y colaboradores, J. Mol. Biol 273:330-337, 1997; y la patente norteamericana No. 4,894,443, todas las publicaciones que son incorporadas en la presente por referencia.
Otros enlazadores incluyen, pero no están limitados a: sustratos de enzima, tal como el sustrato de catepsina B, sustrato de catepsina D, sustrato de tripsina, sustrto de trombina, sustrato de subtilisina, sustrato de Factor Xa y sustrato de enteroquinasa; enlazadores que incrementan la solubilidad, flexibilidad y/o segmentabilidad intracelular incluyen enlazadores tal como (glymser)n y (sermgly)n, (ver, por ejemplo, PCT Pub. No. WO 96/06641, incorporado en la presente por referencia, que proporciona enlazadores ejemplares para el uso en conjugados) . En algunas modalidades, varios enlazadores se pueden incluir con el fin de tomar ventaja de las propiedades deseadas de cada enlazador.
Preparación de Conjugados Los conjugados con agentes dirigidos enlazados se pueden preparar ya sea mediante la conjugación química, tecnología de DNA 5ecombinante, o combinaciones de expresión recombinante y conjugación química. El péptido de la invención y el agente citotóxico de dirección se puede enlazar en cualquier dirección y más de un agente de dirección y/o agente dirigido puede estar presente en un conjugado.
. En algunas modalidades preferidas de la invención, el agente citotóxico es atado al péptido por medio de un polímero espaciador hidrofílico y biocompatible, que incluye una cadena de alquilo corta, ácido polisiálico o hialurónico, un polipéptido o un PEG. En algunas modalidades preferidas de la invención, el agente citotóxico se conjuga a través de un enlazador segmentable, por ejemplo, un enlace de disulfuro o péptido que contiene una secuencia segmentable por proteasas lisosomales tales como catepsinas. En algunas modalidades preferidas de la invención, el espaciador se une ya sea al N-o C-terminal del péptido.
Formulaciones Métodos para preparar' estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de llevar en asociación un compuesto de la presente invención con el portador y, opcionalmente , uno o más ingredientes adicionales. En general, las formulaciones se preparar al llevar uniformemente e íntimamente en asociación un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto.
Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la manufactura de sustancias farmacéuticas. Tales formulaciones pueden contener agentes endulzantes, agentes saborizantes , agentes colorantes y agentes conservantes. Una formulación se puede mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para manufactura. Tales "excipientes" generalmente se refieren a un material sustancialmente inerte que no es tóxico y no interactúa con otros componentes de la composición de una manera perjudicial. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, líquidos tales como agua, solución salina regulada, polietilenglicol, hialurónico, glicerol y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser incluidas en las mismas, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como trifluoroacetato, clorhidratos, bromohidratos , fosfatos, sulfatos y los similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y los similares .
El agente terapéutico se puede administrar en un medicamento con farmacéutica adecuada para el suministro. Las formulaciones pueden comprender uno o más diluyentes, emulsionantes, conservadores, soluciones reguladoras, excipientes, etc., y se pueden proporcionar en tales formas como polvos liofilizados, rocíos, cremas, lociones, geles, sobreparches , en implantes, etc. Las formulaciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular utilizando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones apropiadas y adecuadas. Tales portadores permiten a las sustancias farmacéuticas que sean formuladas en formas de dosificación unitarias como tabletas, pildoras, polvo, grageas, cápsulas, líquidos, pastillas, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones, etc. adecuadas para la ingestión por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral se pueden formular como un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de adicionar compuestos adicionales adecuados, si es deseado, para obtener tabletas o núcleos de gragea. Los excipientes sólidos adecuados son carbohidrato o rellenadores de proteína que incluyen, por ejemplo, azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa u otras plantas; celulosa tal como metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o~ carboxi-metilcelulosa de sodio; y gomas incluyendo goma arábiga y de tragacanto; y proteínas, por ejemplo, gelatina y colágeno. Se pueden adicionar agentes de desintegración o solubilizantes, tal como la. polivinil pirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Las suspensiones acuosas pueden contener un agente activo (por ejemplo, un polipéptido quimérico o peptidomimético de la invención) en mezcla con excipientes adecuados para la manufactura de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia, y agentes dispersantes humectantes tal como una fosfatida que ocurre naturalmente (por ejemplo, lecitina) , un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno) , un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecatilen oxicetanol) , un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol) , o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán) . La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservadores tales como p-hidroxibenzoato de etilo o de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes de endulzamiento, tal como sacarosa, aspartame o sacarina. Las formulaciones se pueden ajusfar para la osmolaridad .
Las sustancias farmacéuticas basadas en aceite son útiles para la administración de agentes activos hidrofóbicos de la invención. Las suspensiones basadas en aceite se pueden formular al suspender un agente activo (por ejemplo, una composición quimérica de la invención) en un aceite vegetal, tal como aceite de arachis, aceite de olivo, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida; o una mezcla de estos. Ver por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,716,928, incorporada en la presente por referencia, que describe la utilización de aceites · esenciales o componentes de aceite esencial para incrementar la biodisponibilidad y reducir la variabilidad Ínter- y intra-individual de compuestos farmacéuticos hidrofóbicos oralmente administrados (ver también la patente norteamericana No. 5,858,401, incorporada en la presente por referencia) . Las suspensiones de aceite pueden contener un agente de espesamiento, tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Los agentes de endulzamiento se pueden adicionar para proporcionar una preparación oral agradable, tal como glicerol, sorbitol o sacarosa. Estas formulaciones se pueden preservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. Como un ejemplo de un vehículo de aceite inyectable, ver Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, incorporada en la presente por referencia. Las formulaciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral, descrito en lo anterior, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas que ocurren naturalmente, tal como goma de acacia y goma de tragacanto, fosfatidas que ocurren naturalmente, tal como lecitina de soya, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tal como monoleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tal como monoleato de polioxietilen sorbitán.' La emulsión también puede contener agentes de endulzamiento y agentes saborizantes , como en la formulación de jarabes y elíxires. Tales formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservador o un agente colorante.
También se contempla que una composición o medicamento que comprende el agente terapéutico puede contener un portador farmacéuticamente aceptable que sirve como un estabilizador, particularmente para péptido, proteína, polinucleótido u otros agentes similares. Ejemplos de portadores adecuados que también actúan como estabilizadores para péptidos incluyen, sin limitación, grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano y los similares. Otros portadores adecuados incluyen, nuevamente sin limitación, almidón, celulosa, fosfatos de sodio o de calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de alto peso molecular (PEGs) y combinación de los mismos. También puede ser útil emplear un lípido cargado y/o detergente. Los lípidos cargados adecuados incluyen, sin limitación, fosfatidilcolinas (lecitina) y los similares. Los detergentes típicamente serán un surfactante no iónico, aniónico, catiónico o anfotérico. Ejemplos de surfactantes adecuados incluyen, por ejemplo, surfactantes Tergitol® y Tritón® (Union Carbide Chemicals y Plastics, Danbury, CT) , polioxietilenosorbitans , por ejemplo, surfactantes TWEEN® (Atlas Chemical Industries, ilmington, DE), éteres de polioxietileno, por ejemplo, Brij , ésteres de ácido graso farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sulfato de laurilo y sales del mismo (SDS) y materiales similares. Una discusión completa de excipientes, portadores y estabilizadores y otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991), incorporada en la presente por referencia.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para la administración , parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones o suspensiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, soluciones reguladoras, bacteriostatos, solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto, o agentes de suspensión o de espesamiento.
Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y los similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. La fluidez ¦apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de surfactantes .
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismo a los compuestos de la presente invención se puede asegurar mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales , por ejemplo, parabeno, clorubutanol , fenol, ácido sórbico y los similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, solución salina regulada con fosfato, y los similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como rtionoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable detener la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede realizar mediante el uso de una suspensión liquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en el agua. La velocidad de absorción del' fármaco entonces depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco parenteralmente administrada se realiza al disolver o suspender el fármaco en un vehículo aceitoso.
En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos también se pueden suministrar como microesferas para la liberación en el cuerpo. Por ejemplo, las microesferas se pueden administrar por la vía de inyección intradérmica del fármaco con liberación lenta subcutáneamente; ver Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645; como formulaciones de gel biodegradable e inyectable, ver, por ejemplo, Gao (1995) Pharm. Res. 12:857-863 (1995); o como microesferas para la administración oral, ver, por ejemplo, Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674. Todas las referencias citadas son incorporadas completamente en la presente por referencia.
Las formas de depósito inyectables se hacen al formar matrices de microcápsula de los compuestos de la presente invención en polímeros biodegradables tales como polilacturo-poliglicoluro . Dependiendo de la relación del fármaco al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres ) y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
El polipéptido se puede administrar por su propia cuenta o en combinación con otro compuesto terapéutico. En particular, el polipéptido se puede administrar en conjunción con un compuesto terapéutico utilizado para tratar melanoma, inflamación o una enfermedad autoinmune del mamífero. El polipéptido y compuesto terapéutico adicional se pueden formular en las mismas o diferentes composiciones. El polipéptido se puede administrar simultáneamente, secuencialmente o separadamente del compuesto terapéutico adicional .
Dosificación Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad, del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin ser tóxico al paciente. Cuando los compuestos de la presente invención se administran como sustancias farmacéuticas, a humanos y animales, ellas se pueden dar per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.1 a 99% del ingrediente activo, más de preferencia, 10 a 30%, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción o metabolismo del compuesto particular que es empleado, la velocidad y grado de absorción, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado, y factores similares bien conocido en las artes médicas.
Un médico o veterinario que tiene habilidad ordinaria en la técnica puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica en niveles menores que aquellos requeridos con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta que se logre el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva generalmente dependerá de los factores descritos en lo anterior. Generalmente, las dosis orales, intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas del compuesto de la presente invención para un paciente, cuando se utilizan para los efectos indicados, tendrá un intervalo limitativo de aproximadamente 1 mcg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso del cuerpo por hora. En otras modalidades, las dosis de un intervalo no limitativo de aproximadamente 5 mcg a aproximadamente 2.5 mg por kilogramo de peso del cuerpo por hora. En modalidades adicionales, la dosis tendrá un intervalo no limitativo de aproximadamente 5 mcg a aproximadamente 1 mg por kilogramo de peso del cuerpo per hora.
Si es deseado, la dosis diaria efectiva del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas separadamente en intervalos apropiados por todo el dia, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. En una modalidad, el compuesto se administra como una dosis por dia. En modalidades adicionales, el compuesto se administra continuamente, como a través de rutas intravenosas u otras rutas. En otras modalidades, el compuesto se administra menos frecuentemente que diariamente, tal como semanalmente o menos .
Mientras que es posible para un compuesto de la presente invención que sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación (composición) farmacéutica .
El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier animal en necesidad, incluyendo primates, en particular humanos, y otros mamíferos como conejos, equinos, ganado vacuno tal. como bovino, cerdos, cabras y ovejas, y aves de corral y mascotas en general.
El compuesto de la invención se puede administrar como tal o en mezclas con portadores farmacéuticamente aceptables y también se pueden administrar en conjunción con agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas , aminoglucósidos y glucopéptidos . La terapia conjuntiva así incluye la administración secuencial, simultánea y separada del compuesto activo de una manera que los efectos terapéuticos del primero administrado no solamente desaparecen cuando se administra el subsecuente.
Posibles Rutas de Administración para los Compuestos Divulgados Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para la terapia mediante cualquier ruta de administración adecuada. Como se utiliza en la presente, el término "ruta" de administración se propone para incluir, pero no está limitada a la inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intraocular, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, administración intratraqueal, administración intraadiposal, administración intraarticular, administración intratecal, administración epidural, inhalación, administración intranasal, administración oral, administración sublingual, administración bucal, administración rectal, administración vaginal, administración intracisternal, administración transdérmica y administración tópica, o la administración por la vía del suministro local (por ejemplo mediante catéter o stent) . Los compuestos también se pueden administrar o coadministrar en formas de dosificación de liberación lenta.
En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos también se pueden administrar mediante una ruta intranasal, intraocular, periocular e intravaginal incluyendo supositorios, insuflación, polvos y formulaciones de aerosol (para ejemplos de inhalantes esferoides, ver Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann . Alergia Asthma Immunol. 75:107-111, incorporado en la presente por referencia) . Las formulaciones de supositorios se pueden preparar al mezclar en el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero liquido a las temperaturas corporales y por lo tanto se fundirá en el cuerpo para liberar el fármaco. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles .
En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos se pueden suministrar transdérmicamente, mediante una ruta tópica, formulada como adherentes aplicadores, soluciones, suspensiones, emulsiones, agentes, cremas, ungüentos, pastas, gelificaciones , polvos y aerosoles.
En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos se pueden administrar parenteralmente, tal como mediante la administración intravenosa (IV) ola administración en una cavidad del cuerpo (por ejemplo, el espacio sinovial) o lumen de un órgano. Estas formulaciones pueden comprender una solución de agente activo disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y solventes aceptables que se pueden empelar son agua y solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico. Además, los aceites fijados estériles se pueden emplear como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijado blando se puede emplear incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos.
Como es descrito en la presente, los métodos de la presente invención se pueden utilizar solos o en combinación con otros procedimientos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o las otras condiciones descritas en la presente .
La combinación particular de terapias (terapéuticos o procedimientos) para emplear un régimen de combinación tomará en cuenta la compatibilidad de los terapéuticos deseados y/o procedimientos y el afecto terapéutico deseado que es logrado. También será apreciado que las terapias involucradas pueden lograr un efecto deseado para el mismo desorden (por ejemplo, como un compuesto inventivo se puede administrar concurrentemente con otro agente utilizado para tratar el mismo desorden) o pueden lograr diferentes efectos (por ejemplo, control de cualquiera de los efectos adversos) . Como se utiliza en la presente, los agentes terapéuticos adicionales que son normalmente administrados para tratar o prevenir una enfermedad o condición particular, son conocidos como "apropiado para la enfermedad o condición que es tratada" .
Un tratamiento de combinación de la presente invención como se define en la presente se puede lograr por medio de la administración simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento.
Aplicaciones Terapéuticas La administración del polinucleótido o un compuesto modulador (después en la presente "agente terapéutico") como se discute en la presente puede ser ya sea para propósito preventivo o terapéutico. Cuando se proporcionan preventivamente, el agente terapéutico se proporciona por adelantado de cualquiera de los síntomas. La administración preventiva del agente terapéutico sirve para prevenir o atenuar cualquiera de los síntomas. Cuando se proporcionan terapéuticamente, el agente terapéutico se proporciona en (o poco tiempo después) el inicio de un síntoma de la enfermedad o desorden. La administración terapéutica del agente terapéutico sirve para atenuar cualquier exacerbación real de los síntomas.
El individuo tratado puede ser cualquier mamífero. En un aspecto, el mamífero es un humano. En otro aspecto, el humano tiene una enfermedad o condición autoinmune. En otros aspectos, la enfermedad o condición autoinmune está asociada con o seleccionada del grupo que consiste de esclerosis múltiple, diabetes tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Grave, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis , uveitis autoinmune, encefalomielitis autoinmune y miastenia grave.
En otros aspectos, el humano tiene una enfermedad o condición de inflamación. En otro aspecto, la enfermedad o condición de inflamación está asociada con o seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de intestino inflamatorio, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis , psoriasis, gastritis y enfermedad de corazón isquémico. En otro aspecto, la inflamación está asociada con la muerte cerebral, de preferencia en donde se reducen los niveles de a-MSH endógeno circulante o a-MSH en el tejido cerebral. En todavía otro aspecto, el agente terapéutico se utiliza para tratar un sujeto con un desorden o enfermedad mediada por -MSH o receptor de MCI.
En otro aspecto, la presente invención se dirige hacia el tratamiento de un sujeto con melanoma. En un aspecto, la presente invención atenúa o aminora el melanoma en los sujetos. En todavía otro aspecto, los compuestos de la presente invención se utilizan en ensayos para la detección o formación de imagen de melanoma.
Equipos que Comprenden los Compuestos Divulgados La invención también proporciona equipos para llevar a cabo los regímenes terapéuticos de la invención. Tales equipos comprenden . cantidades terapéuticamente efectivas de un péptido que tiene actividad específica como moduladores de MC1R, en forma farmacéuticamente aceptable. Solo o en combinación con otros . agentes, en forma farmacéuticamente aceptable. Las formas farmacéuticas preferidas incluyen péptidos en combinación con solución salina estéril, solución de dextrosa, solución regulada, u otro fluido estéril farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, la' composición puede ser liofilizada o desecada. En este caso, el equipo puede además comprender una solución farmacéuticamente aceptable, de preferencia estéril, para formar una solución para propósitos de inyección. En otra modalidad, el equipo además puede comprender una aguja o jeringa, de preferencia empacado en forma estéril, para inyectar la composición. En otras modalidades, el equipo además comprende un medio de instrucción para administrar la composición a un sujeto. El medio de instrucción puede ser un inserto escrito, una grabación de audio, una grabación audiovisual o cualquier otro medio de instrucción de la administración de la composición a un sujeto. En una modalidad, el equipo comprende (i) un primer recipiente que contiene un péptido que tiene actividad moduladora especifica de MC1R; y (ii) medios de instrucción para el uso.
Modalidades Adicionales del Método de Tratamiento En algunas modalidades, la invención proporciona un método para reducir o inhibir el rechazo de trasplante en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de por lo menos uno de los compuestos de péptido proporcionados en la presente. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para reducir o inhibir una respuesta inmune del sujeto inducida por el tejido, células u órgano trasplantado. Ejemplos no limitativos de un tejido trasplantado son un aloinjerto en el trasplante de corazón experimental y células de islote pancreático.
Actividad Inmunosupresora en el Modelo de Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) Análogos de péptido de D-aminoácido novedosos de a- MSH se generaron y se evaluaron para los efectos moduladores inmunes en el modelo de uveitis autoinmune experimental (EAU) y encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) asi como en un modelo de enfermedad inflamatoria sustituta del lipopolisacárido ( L PS ) . El tratamiento con el análogo de RI a-MSH redujo los registros de enfermedad clínicos y de incidencia de la enfermedad en el modelo EAU y en un modelo de ratón EAE inducido por MOG. Además, los niveles de expresión de TNF-a e IL-10 mRNA en el bazo y el ganglio linfático de ratones cebados con . MOG se disminuyó en ratones tratados. En un modelo de inflamación sistémica inducida por L P S , el tratamiento con a-MS H y el análogo disminuyó los niveles de citoquina en el suero. Estos datos indican que estos análogos de OÍ-MS H novedosos tienen el potencial para el uso terapéutico en la inflamación y la enfermedad autoinmune.
Materiales y Métodos Péptidos. a-MSH (SYSMEHFRWGKPV) se adquirió de Bachem (King de Prussia, PA) . Un análogo de RI a-MSH de D-aminoácido (vpkgwrfhemsys) , péptido sustituido con alanina de RI a-MSH, (Stearyl) HfR (820), (Ph(CH2)3CO) HfRW (819) y el análogo 891 de RI a-MSH [vpkGwr.( D-Cha ) hsiiss ] se sintetizaron mediante Genzyme Corporation con una metodología de fase sólida estándar y se purificaron mediante la HPLC de fase inversa. Un péptido de control de D-aminoácido mezclado ( ksrsmgvfpeyh) se sintetizó mediante Genzyme Corporation. Un péptido de control de D-aminoácido irrelevante (plykkiikklles ) se sintetizó mediante Genzyme Corporation.
Animales. Ratones B10.III-H2r hembras de cinco a seis semanas de edad se compraron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) .
Ratones C57BL/6 machos o hembras de seis a ocho semanas de edad se compraron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Todos los protocolos para los estudios de animales cumplieron con la aprobación del Institutional Animal Care y use Committee (IACUC) en Genzyme Corporation.
Inducción de EAU. Ratones B10.III hembras se inyectaron subcutáneamente en dos sitios (entre los -homoplatos y en la región pélvica) con un total de 200 pg de péptido de proteina de enlace de interfotoreceptor (IRBP) 161-180 (New England Péptido; Fitchburg, MA) , respectivamente en 2 mg/ml de adyuvante de Freund completo (CFA; Sigma, St. Louis, MO) con tuberculosis de micobacteria H37Ra (Difco, Detroit, MI) .
Registro del Ojo. Los ojos de los ratones se dilatan utilizando una a dos gotas de Mydriacyl 1% (Alcon; Humacao, Puerto Rico) y se dejaron reposar en un cuarto a oscuras durante 5 min. Los ratones se restringieron manualmente y las retinas de ambos ojos se visualizaron utilizando un oftalmoscopio indirecto con una lente de 78 dioptrías. Los ojos se registran para la inflamación utilizando un sistema de registro progresivo en 0-5. Registro 0: Retina normal. Registro 1: Inflamación vascular próxima al nervio óptico. Registro 2: <5 lesiones inflamatorias confinadas a un cuadrante del ojo. Registro 3: >5 lesiones inflamatorias en más de un cuadrante del ojo. Registro 4: Las lesiones inflamatorias están contiguas. Registro 5: Desprendimiento de la retina. Los ojos completos de los ratones se recolectaron y se colocaron en PBS. Los ojos se incrustaron en medio OCT para la fijación congelada. Se cortaron secciones de 5-µp? a través del plano del nervio óptico capilar y se mancharon con hematoxilina y eosina.
Estudios de Enlace a los Receptores de Melanocortina . Los perfiles de enlace para a-MSH, RI a-MSH, y el péptido mezclado se midieron a los receptores de melanocortina: 1, 3, 4, y 5. El enlace se hizo utilizando un ensayo de enlace competitivo' con (Nle4 , D-Phe7 ) a-MSH (Bachem) . El análisis de enlace se hizo mediante Cerep laboratories (París, Francia) con muestras codificadas.
El enlace de los péptidos también se siguió mediante una competición con 125I-NDP-MSH para enlazar los receptores de melanocortina 1, 3, 4, y 5 utilizando preparaciones de membrana de las lineas celulares HEK293. Los péptidos se mezclaron con 125I- (Nle4 , D-Phe7 ) -a-MSH ( PerkinElmer , Boston MA) en placas de 96 cavidades de fondo V en solución reguladora de enlace (HEPES 25 mM pH7, CaCl2 1.5 mM, MgS04 1 mM, NaCl 100 mM, BSA al 0.2%) y se mezclaron con preparaciones de membrana de lineas celulares transíectadas HEK293 (Perkin Elmer, Boston MA) que contienen 1-10 fmol de receptor durante 1 hr a 25°C: (Nle4, D-Phe7 ) -NDP-MSH (Bachem) en 3 µ? se utilizó como un control positivo. Las mezclas se filtraron a través de filtros GFC de 96 cavidades (Mil.lipore, Billerica, MA) , se lavaron 3 veces con solución reguladora de enlace sin BASA, se secaron y se contaron.
Medición de cAMP. Células B16-F1 (linea celular de melanoma) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) se sembraron en placas de 96 cavidades de fondo plano en 5xl0 /cavidad y se cultivaron durante la noche en DMEM (Cambrex, Walkers ville, MD) suplementado con flutamina 2 mM, antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina) y suero de bovino fetal inactivado con calor al 10% (Invitrogen, Grand Island, NY) . Las células luego se trataron con -MSH nativo (0.01-1000 ng/ml), retro-inverso OÍ-MSH (0.01-1000 ng/ml), o un péptido de control de D aminoácido mezclado (0.01-1000 ng/ml) durante 30 min. Las células se Usaron y los niveles de cAMP intracelular se midieron mediante un equipo de inmunoensayo de enzima (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Forskolin (Sigma, St. Louis, MO) en 100 µ? sirvió como controles positivos.
Inducción y registro de EAE. Ratones C57BL/6 hembras se inmunizaron con una emulsión de péptido MOG35-55 (200 µg/ratón; New England Péptido; Fitc burg, MA) en adyuvante de Freund completo (CFA; Sigma, St . Louis, MO) que contiene 0.6 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difce-Detroit, MI) . La emulsión se suministró en un volumen de · 0.2 mi por ratón mediante la inyección subcutánea a dos sitios. La toxina de Bordetella pertussis (PTX; Sigma) en PBS se utilizó en una dosis de 400 ng/animal por la vía de una ruta de administración i.p. y se administra en el día 0 y el dia 3. Los ratones se monitorearon diariamente para síntomas paralíticos de EAE. Los ratones se registraron para los síntomas clínicos utilizando un sistema de registro progresivo entre 0-5. Registro 0: nada de enfermedad; Registro 1: cola flácida; Registro 2: debilidad de los miembros traseros; Registro 3: parálisis del miembro trasero; Registro 4: debilidad/parálisis parcial del miembro frontal; Registro 5: muerte. La médula espinal en el cerebro se recolectó y se incrustaron en parafina para el manchado de hematoxilina y eosina.
Ensayo de Proliferación. Esplenocitos y células de ganglio linfático de ratón C57BL/6 se cultivaron en placas de 96 cavidades 5xl05 células/cavidad. El péptido MOG35-55 u OVA 257-264 se adicionó a las cavidades en una concentración de 25 µg/ml . El sobrenadante se recolectó en 48 horas después de la estimulación con el péptido MOG. Después de 3 días las células de cultivo se pulsaron con [3H] timidina en 1 uCi/cavidad durante 8 hrs . La incorporación de timidina se midió mediante cpm.
Análisis de RNA de citoquina-RT-QPCR. El RNA total se extrajo de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 1 g de RNA total se transcribió inversamente y se utilizó en la PCR cuantitativa al utilizar la incorporación verde SYBR con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) en una ABI 7900. Un estándar de cDNA se corrió en cada PCR para objetivos de citoquina y las concentraciones de mensaje se normalizaron a la ß-actina de ratón. Los cebadores utilizados para obtener estos datos fueron como sigue: TNFa de ratón delantero ggcaggtctactttggagtcattgc y trasero-acattcgaggctccagtgaattcgg (1). Los inventores utilizaron el IL-10 de ratón delantero: tgctatgctgcctgctctta y trasero: tcatttccgataaggcttgg (2) . Las secuencias para ß-actina de ratón son: delantero gtgggccgctctaggcaccaa y trasero ctctttgatgtcacgcacgatttc (3) .
Análisis de CBA. El análisis citométrico de flujo de los perfiles de citoquina inflamatoria de suero de ratón o sobrenadante de células se midieron utilizando el Equipo de Arreglo de Cuenta Citométrica (CBA) hecho por BD Biosciences (San José, CA) . Las muestras se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis de RNA de mMCIR-RT-QPCR. El RNA total se extrajo de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 1 \iq de RNA total se transcribió inversamente y se utilizó en la PCR cuantitativa al utilizar un equipo Taqman con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) sobre un ABI 7900. Un estándar de cDNA se corrió en cada PCR para mMCIR y las concentraciones de mensaje se normalizaron para el control endógeno 18S Eucariótico (sonda VIC/MGB, Applied Biosystems part # 4319413E) . Los cebadores para mMCIR fueron como sigue: delantero CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA y trasero AACATGTGGGCATACAGAATCG y la sonda CCATGCTGGCACTCA . Estos se diseñaron utilizando Primer Express 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
Modelo de ' LPS. Los ratones C57BL/6 machos se estimularon con LPS (1 ug/ratón) , i.p. Después de 30 min los ratones se trataron con dexametasona (2 mg/kg; Sigma) , análogo 891 de RI-a-MSH, o RI-a-MSH. En 2 hrs después de la estimulación con LPS, los ratones se sangraron para el suero. El análisis de citoquina se midió mediante la ' citometria de flujo con un equipo de arreglo de cuenta citométrica (BD Biosciences ) .
Análisis Estadístico. Los resultados se expresan como la ±SD. El experimento se repitió por lo menos dos veces. Para analizar los resultados se utilizó ANOVA de una via y la prueba de comparación múltiple Tukey.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar pero no para limitar la invención.
Ejemplo 1 Actividad Inmunosupresora en el modelo de Uveitis Autoinmune Experimental (EAU) La uveitis autoinmune es un desorden inflamatorio del ojo que puede conducir a dolor y pérdida de visión. Los esteroides y fármacos inmunosupresores son actualmente los únicos terapéuticos para la uveitis y frecuentemente tienen serias toxicidades oculares sistémicas. Por lo tanto, se desean sustancias terapéuticas alternativas más seguras.
La EAU es un modelo de animal de uveitis humana que afecta 2.3 millones de individuos en Estados Unidos. La inmunización con la proteina de enlace retinoide de interfotorreceptor (IRBP) o sus fragmentos de péptido O S-antigeno retinal (S-Ag) con adyuvante puede inducir la enfermedad en razas de roedores susceptibles. La enfermedad involucra la infiltración de células inflamatorias en la retina del ojo y el daño fotorreceptor con la recuperación natural sin recaída espontánea. La transferencia adoptiva de células T uveitogénicas en recipientes de roedores singeneicos sugiere que la uveitis es una enfermedad autoinmune mediada por la célula T especifica de órgano similar a muchas otras enfermedades autoinmunes similares tal como la esclerosis múltiple, diabetes tipo I y la artritis reumatoide .
El microambiente ocular es un sitio privilegiado inmune en el cual los mecanismos para mantener la inmunosupresión está en el lugar adecuado para prevenir la inflamación local. Varios neuropéptidos que son expresados por neuronas en el tejido ocular ayudan a sostener el privilegio inmune en el ojo. Uno de estos neuropéptido es -MSH que es constitutivamente expresada en el microambiente ocular en una concentración fisiológica de 30 pg/ml.
La administración sistémica de a-MSH nativa durante la inducción de la uveitis inducida por endotoxina en ratas inhibió el número de células infiltrantes e IL-6, TNF-a, MCP-1, MIP-2, y los niveles de óxido nítrico en el humor acuoso de una manera dependiente de la dosis. En una administración del modelo de EAU de ratón de a-MSH en el tiempo pico de la inflamación retinal suprimió la severidad de la enfermedad. OÍ-MSH puede inducir las células reguladoras T a través del receptor de melanocortina 5 (MCR-5) sobre las células T y suprimir la EAU.
Se evaluó la eficacia del tratamiento con a-MSH nativa en el modelo de uveitis posterior de murino. La uveitis se indujo en ratones B10.RIII con una inyección de IRBP 161-180 y CFA. El inicio de la enfermedad ocurrió alrededor del día 10 después del cebado. Cuando los registros del ojo de 2-3 se alcanzaron en el día 13, los ratones se les administró a-MSH nativa en 200 µg/ratón, i. v., por 7 días consecutivos o se dejaron sin tratar. Desde el tratamiento profiláctico muchas actividades objetivo en la fase de cebado de la enfermedad antes que la fase efectora, se inició el tratamiento cuando se observó inflamación retinal activa. •Además, esta estrategia de tratamiento mejor recapitula la aplicación clínica. Los ratones tratados con la a-MSH mostraron una reducción de registros de ojos clínicos medios por todo el curso de tratamiento de 7 días comparado con los ratones sin tratar (Figura la) . Los ratones tratados con a-MSH mostraron un registro de ojo medio máximo de 2.83 ± 0.39 en el día 13 en comparación con el grupo no tratado de ratones que alcanzó un registro de ojo medio máximo de 3.67 ± 0.52 en el día 15.
Ejemplo 2 Comparación de la a-MSH nativa a la dexametasona en el modelo de uveitis autoinmune experimental en B10.RIII Las formas actuales de terapia para uveitis incluyen corticoesteroides y agentes inmunosupresores . La eficacia de la -MSH nativa se compare con una terapia de corticosteroide conocida, dexametasona. La uveitis indujo en los ratones B10.RIII con inyecciones de IRBP161-180 y CFA. En el momento de inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron un registro de ojo clínico de l,a los ratones se les administró diariamente inyecciones intraperitoneales de a-MSH nativa (100 g/ratón) , 0.2 mg/kg de dexametasona o 2.0 mg/kg de dexametasona. Los ratones se trataron diariamente durante 21 días. Los ratones tratados con a-MSH nativa mostraron una reducción significante de los registros de ojo clínicos medios por todo el curso del tratamiento comparado con los ratones de control de PBS (Fig. IB) . Los datos mostraron que la administración i.p. diariamente de a-MSH nativa suprimió la uveitis a un grado más grande que el tratamiento con dexametasona en ya sea la dosis de 0.2 mg/kg o 2.0 mg/kg.
Ejemplo 3 Un análogo de retro inverso a-MSH novedoso específicamente enlaza MCR-1 Un análogo de péptido D-aminoácido estable, novedoso de a-MSH nativa se sintetizó (RI a-MSH) y se evaluó para las capacidades moduladores inmunes in vitro y en el modelo de uveitis autoinmune experimental (EAU) . Los estudios de enlace indicaron que distinto a la -MSH nativa, RI a-MSH enlaza específicamente al receptor de a-MSH antiinflamatorio (MCR-1) pero ninguno de los otros receptores de a-MSH (MCR-3, 4 o 5) .
Se analizó el enlace del análogo de RI a-MSH a los receptores de melanocortina (MCR) . Se realizó un ensayo de enlace competitivo utilizando un panel de MCR que incluye MCR 1, 3, 4 y 5. El enlace de los péptidos fue seguido por una competición con I-NDP-MSH como es descrito previamente. La a-MSH nativa enlazó a MCR 1, 3, 4 y 5. Sin embargo, distinto a la a-MSH nativa, RI a-MSH se encontró que enlaza solamente a MCR-1 y que regula las respuestas inflamatorias (Tabla 1) . Un péptido de control de D aminoácido mezclad9 no enlazó a cualquiera de los receptores de melanocortina. El desarrollo de un análogo de a-MSH con enlace específico MCR-1, y la exclusión de enlace de MCR-3 y MCR-4, puede disminuir los efectos secundarios potenciales que la a-MSH nativa produce a través del enlace de estos receptores.
Tabla 1 Ki (nM, excepto como es anotado) NIÑO, terminal Secuencia C-terminal MCIR MC3R MC4R MC5R MSH Ac SYSMEHFRWGKPV Amida 0.41 ± 0.14 23 . 41 -1500 RI-MSH vpkGwrfhemsys (720e) Ac (SEQ ID NO:7) Amida 4.6 ± 1.3 >30 µ? >30 µ? ~25 µ? 304 Ac vpkGwrfhemsya Amida nd 805 Ac vpkGwrfhemsas Amida 806 vpkG rfhemays Amida 807 Ac vpkG rfheasys Amida 1400 ± 190 Ac vpkGwrfhamsys Amida 2.5 309 Ac vpkGwrfaemsys Amida 1200 ± 270 810 Ac vpkG rahemsys Amida >30 µ? 811 Ac vpkGwafhemsys Amida 13 ± 7 µ? 812 Ac vpkGarfhemsys Amida 3 µ? 813 Ac vpka rfhemsys Amida 814 Ac vpaG fhemsys Amida 815 Ac vakGwrfhemsys Amida 816 Ac apkGwrfhems s Amida 317 Ac aaaG rfhemsys Amida Ac kkkG rfhemsys Amida <Ph(CH2> 319 3CO) HfRW Amida 0.07 277 27 -3000 320 Estearilo HfRW Amida 1.3 1371 390 860 (CH2)3 847 H2N vpkGwrfh Fenilo) 104 ± 72 347int H2N vpkGwrfh OH 150 857 Ac vp (D-Ornitina) Gwrfhemsys Amida 3.0 858 Ac vp (D-Norleucina) Gwrfhemsys Amida 1 vpkG (3-benzotienil-D- 859 Ac Alanina) rfhemsys Amida 206 vpkG (5-hidxoxi-D- 860 Ac Trp)rfhemsys Amida 96 vpkG (5-metoxi-D-~ 361 Ac Trp)rfhemsys ¦ Amida 75 362-b Ac vpkGfrfhemsys Amida 128 863 Ac vpkGwqfhemsys Amida >100 µ? 864 Ac vpkGwnfhemsys Amida >30 µ? 865 Ac vpkGwhfhemsys Amida 2300 vpkGwr (4-fluoro-D- 866 Ac fenilglicina) hemsys Amida >30 µ? vpkGwr (3-piridil-D- 867 Ac Alanina) hemsys Amida 480 vpkGwr (2-tienil-D- 868 Ac Alanina) hems s Amida 5.4 869 Ac vpkGwr (D-Cha) hemsys Amida 2.2 ± 0.44 30 µ? >10 µ? ~25 µ? 870 Ac vpkGwrwhemsys Amida -2.5 µ? vpkGwr (4-Nitro-D- 871 Ac Phe) hemsys Amida 324 872 Ac vpkGwrfremsys Amida 13.5 873 Ac vpkGwrfwemsys Amida 1900 874 Ac vpkG rffemsys Amida >100 µ? 875 Ac vpkGwrfhdmsys Amida 400 876 Ac vpkGwrfh (D-Citrulina)msys Amida nd vpkGwrfhe (o-metil-D- 377 Ac et)sys Amida 282 378 Ac vpkGwrfhe (D-butionina) sys Amida 2.3 + 0.8 -40 µ? >30 µ? -30 µ? 379 Ac vpkGwrfheksys Amida 832 vpkGwrFhsiiss Ac (SEQ ID NO:4) Amida 1.8 + 0.5 -18 µ -10 µ >30 µ? Ac wrF Cs-Fenilo >10 µ? (1 , 6-diamino- rFh hexano) estearilo 120 Ac wrFh Amida >100 µ? Ac vpkGwrFhemsys Amida 72 >30 µ? -30 µ? >30 µ? Ac vpkGwrfhsiiss Amida 1.0 ± 0.43 -19 µ -10 µ? -20 µ? vpkGwr (D-Cha) he (d- 390 Ac Butionina) sys Amida 1.9 + 0.01 -15 µ? -14 µ? -4.5 µ? vpkGwr (D-Cha) hsiiss 391 Ac (SEQ ID NO:5) Amida 0.43 ± 0.01 -8 µ? -3.2 µ? -2.5 µ? SYSMEH (L-Cha) RWGKPV 892 Ac (SEQ ID ?0:6) Amida 0 . 51 893 Ac vpkG rfhemsys Amida 6.5 -28 µ? >30 µ? -27 µ? 894 Ac vpkGwRfhemsys Amida 380 >30 µ >30 µ? >30 µ? 895 Ac vpkGwrfHems s Amida 19 -37 µ? -11 µ? -37 µ? Las letras minúsculas representan los aminoácidos D-isómero; los caracteres en negritas representan cambios del RI a-MSH.
El enlace de los péptidos fue seguido por una competición con 125I-NDP-MSH para enlazar los receptores de melanocortina 1, 3, 4 y 5 utilizando preparaciones de membrana de las lineas celulares HEK293. Como se muestra en la Figura 18, RI a-MSH mostró una selectividad muy fuerte para MCIR, con valores de Ki por arriba de 30 µ? en tanto MC 3, 4 y 5R, mientras que a-MSH mostró enlace significante a todos los cuatro receptores, con menor que 100 veces de selectividad para MCIR con relación a MC3R.
Ejemplo 4 El tratamiento con el análogo de retroinverso g-MSH aminora la enfermedad en EAU Los efectos inmunomoduladores del análogo de péptido retroinverso a-MSH novedoso se observó en el modelo de ratón de uveitis autoinmune experimental (EAU) y se compararon los resultados con el péptido a-MSH nativo. El suministro sistémico de RI a-MSH en el inicio de la enfermedad o durante la enfermedad en etapa tardia notablemente y reproductiblemente aminoró la uveitis. Además, el tratamiento con el análogo de péptido de RI a-MSH novedoso suprimió la uveitis con una magnitud similar al péptido de a-MSH nativo. Estos datos indican que el análogo de RI a-MSH novedoso muestra actividades antiinflamatorias y tiene uso terapéutico en la uveitis y otras enfermedades autoinmunes y la inflamación.
EAU se indujo en ratones B10.RIII hembras con IRBP 161-180. Se examinó la eficacia del RI a-MSH y a-MSH nativa como un terapéutico antes que un tratamiento profiláctico.
Los ratones se trataron diariamente mediante la inyección intravenosa con 100 yg/ratón de RI a-MSH, 100 yg/ratón de a-MSH nativa, o PBS comenzando cuando los ratones alcanzaron un estado de enfermedad moderado de uveitis (registro de ojo de 2) . Como se observa en la Fig. 2A, los ratones tratados con PBS de control alcanzaron registro de ojo máximos en el día 16 con un registro de ojo medio de 2.75 ± 0.68. Sin embargo, los ratones tratados diariamente con el análogo de RI a-MSH o a-MSH nativa mostraron una reducción significante en. los registros de ojo clínicos, medios por todo el curso del tratamiento comparado con los ratones de control de PBS. En el día 16, cuatro días después del inicio del tratamiento, 5 de los 8 ratones en el grupo tratado con PBS tuvieron un registro de ojo máximo de 3 o más grande mientras que solamente 1 de los 8 ratones tratados con a-MSH nativa y 0 de los 8 ratones tratados con RI a-MSH tuvieron un registro de ojo máximo de 3 o más grande (Fig. 2B) .
Ejemplo 5 Imágenes retínales y examinación histológica de sujetos tratados con RI a-MSH muestran supresión de enfermedad en modelos EAU Las imágenes retínales de los ratones tratados diariamente con RI a-MSH o a-MSH nativa comenzando en la uveitis en etapa tardía muestran la supresión de la enfermedad al compararla con los ratones de control de PBS.
Las imágenes fundoscópicas se adquirieron en el día .13 después del inicio del tratamiento (Figura 3) . La enfermedad en el grupo tratado con PBS se estabilizó o avanzó y tuvo un registro de ojo medio de 3 con vasculitis severa y lesiones inflamatorias a través del ojo (Fig,. 3A) . Sin embargo, la enfermedad rápidamente se resolvió en ambos de los ratones tratados con RI a-MSH y el péptido a-MSH nativo. Las imágenes, de retina mostraron registros de ojo de 1 con inflamación solamente en el nervio óptico (Figs. 3B y 3C) . Los registros de ojo máximos para los ratones individuales en cada grupo se muestran en la Fig. 3D. En el grupo 7 tratado con PBS de los 11 ratones tuvieron- registros de ojo de 3 o más grande. Sin embargo, solamente 2 de los 11 ratones en el a-MSH nativo y RI a-MSH tuvieron registros de ojo de 3 o más grande.
La examinación histológica de ' los ojos 10 días después del inicio del tratamiento diariamente mostró que tanto RI a-MSH como a-MSH nativa redujo la patología en el ojo (Fig. 4). Los ratones tratados con a-MSH nativa y RI a-MSH mostraron arquitectura retinal normal con ligera inflamación en la región del nervio óptico (Fig. 4B y 4C) . En contraste, los ratones tratados con PBS mostraron inflamación ocular y daño en el tejido. La inflamación se observa en la retina y las regiones del nervio óptico con daño fotorreceptor (Fig. 4A) .
Ejemplo 6 Comparación de las administraciones intraperitoneales de retro-inverso a-MSH a un péptido de control mezclado en EAU La uveitis se indujo en ratones B10.RIII con inyecciones de IRBP161-180 y CFA. Los inventores evaluaron iniciando el tratamiento durante la enfermedad de etapa tardía (registros de ojo de 2-3) con RI a-MSH mediante inyecciones intraperitoneales diariamente y compararon la eficacia con un péptido de D-aminoácido mezclado de control. Los ratones se trataron diariamente i.p., durante 13 días con RI a-MSH o el péptido mezclado en 100 g/ratón. Los ratones tratados con RI a-MSH mostraron una reducción significante (p<0.04) en los registros de ojo clínicos medios en los días 15, 21 y 23 del curso de enfermedad comparados con los ratones de control de péptido mezclados (Fig. 5) . Los registros de ojo máximo individuales en el día 23 después de la inducción de la enfermedad mostraron 75% de los ratones con registro =1 en el RI a-MSH comparado con ninguno de los ratones en el grupo de péptido mezclado de control con registro =1. Los pesos individuales de los ratones se registraron en 4 puntos del tiempo por todo el curso de la enfermedad. Todos los ratones en ambos de los grupos tratados con RI a-MSH y tratados con péptido mezclado mantuvieron su peso o mostraron ganancia de peso normal (datos no mostrados) . La dosificación intraperitoneal diariamente con los péptidos no dio por resultado pérdida de peso. Además, la ruta de administración intraperitoneal de - SH nativa o RI OÍ-MSH y 100 yg/ratón tuvo eficacia en la uveitis cuando el tratamiento se administró en el inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron un registro de ojo clínico de 1 (datos no mostrados) . Por lo tanto, la ruta de administración intraperitoneal de RI a-MSH mostró reducciones significantes en los registros de enfermedad comparados con un péptido de control mezclado.
Ejemplo 7 Administración de RI a-MSH en varias dosificaciones al modelo de EAU Los inventores también examinaron la eficacia y dosificación óptima del tratamiento con el retro-inverso a-MSH durante la uveitis severa de etapa tardía. Los ratones B10.RIII se inyectaron con IRBP161-180 y CFA para inducir uveitis. Los ratones se trataron diariamente, i.p. con PBS, péptido mezclado de control (100 yg/ratón) , o RI a-MSH en 100 \ig, 10 g o 3 g/ratón. El tratamiento se inició en el tiempo pico de la enfermedad cuando los ratones alcanzaron registros de ojo de 4 que incluyó lesiones inflamatorias por todo el segmento posterior del ojo y posible hemorragia. La enfermedad en PBS y los grupos de control de péptido mezclado permaneció severa (Fig. 6) . En contraste, el tratamiento con RI a-MSH en 100 yg o 10 yg/ratón rápidamente aminoró la uveitis (p 0.05) . Además, las dosis de 10 y 100 yg/ratón fueron igualmente efectivas. La dosis de 3 g/ratón de RI -MSH no redujo o inhibió la enfermedad.
Ejemplo 8 Efecto del Retro-inverso ot-MSH sobre los niveles de cAMP Los niveles de cAMP en células de melanoma B16-F1 después del tratamiento con a- SH nativa, RI a-MSH o el péptido de control mezclado se examinaron. La linea de células de melanoma B16-F10 expresa un número alto de receptores MCR1 (3000-4000 receptores/célula) comparados con las lineas celulares de macrófagos que expresan solamente 100-200 receptores/célula. Por lo tanto los inventores seleccionaron para examinar el efecto del tratamiento con RI OÍ-MSH la linea de células de melanoma. Las células B16-F1 de melanoma de murino se trataron con -MSH nativa, RI -MSH o el péptido mezclado de control en concentraciones 1 pg/ml-1 µg/ml. Después de 30 min, las células se Usaron y el cAMP intracelular se midió mediante un inmunoensayo de enzima. Forscolina, comúnmente utilizada para elevar los niveles de cAMP, controla (100 µ?) el tratamiento de las células mostró un incremento en el cAMP (3455.39 ± 406.6 SD) . Los niveles de cAMP se elevaron significativamente en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con a-MSH nativa comparada con las células no tratadas (Fig. 7A) . el análogo de RI a-MSH también incrementó significativamente los niveles de cAMP en una manera dependiente de la dosis comparada con el control no tratado o con el control de péptido mezclado. Sin embargo, una concentración más alta de RI a-MSH (100 ng/ml) fue necesaria para incrementar el cAMP comparado con la a-MSH nativa que incrementó el cAMP en una concentración de 10 pg/ml. Esta diferencia en la concentración del péptido necesario para incrementar los niveles de cAMP puede ser el resultado de la afinidad de enlace al receptor MCRl.
Ejemplo 9 Variación de la secuencia y efectos sobre los niveles de cAMP y el enlace de MC1R MSH enlaza a MC1R, MC3R, MC4R y MC5R, con MC1R que es uno de los objetivos deseados para las enfermedades inmunomediadas . El retro-inverso MSH (RI-MSH) se ha diseñado para tener estabilidad en el plasma aumentada (Fig. 17) y selectividad de MC1R, pero su afinidad para MC1R es 11 veces menor que aquella del péptido MSH nativo (Tabla 1) . Para restaurar la afinidad de MC1R, los inventores injertaron en las modificaciones de RI-MSH conocidas para mejorar la afinidad de MC1R de MSH. Uno de los tres reemplazos de la secuencia SYSME N-terminal - acilo graso, ácido fenil butírico y secuencia SSIIS, que aumenta la afinidad de MC1R de MSH, solamente el último condujo a la mejora significante para RI-MSH. La analogía de exploración de D-alanina de RI-MSH exhibió una relación de actividad de estructura similar como la analogía de exploración de alanina de MSH, pero la exploración de inversión de estereoquímica dé la región de enlace de MC1R del residuo 4 del núcleo sugiere diferencias significantes entre MS H y RI-MS H . Además, la sustitución de ciclohexilalanina en el residuo de fenilalanina clave mejoró RI-MSH, pero no el enlace de MSH a MC1R. La combinación de ciclohexilalanina y las sustituciones de S S I I S condujo a la restauración completa de la afinidad de MSH para MC1R, mientras que retiene la configuración de retroinversión crítica para la estabilidad mejorada y la alta selectividad de MC1R del RI-MSH .
Un conjunto de análogos de exploración de alanina (péptidos 804-816) del . retro-inverso MSH (RI-MSH) se prepararon y se probaron para la inducción de cAMP en células de melanoma humana M624 y B16/F1 de murino. Un subconjunto basado en los resultados de cAMP luego se probó para el enlace de MC1R. Los valores de Ki observados para el enlace de MC1R se muestran en la Tabla 1.
Las células B16-F1 de melanoma de murino se trataron con a-MSH nativa, RI a-MSH y el control de péptido mezclado, KPV, o los péptidos sustituidos con alanina de RI OÍ -MS H en 1 µg/ml (Fig. 7B) . El tratamiento con el control de forscolina (100 µ?) de las células mostró incremento en el cAMP (3294.82 ± 54.53). Los niveles de cAMP se elevaron significativamente en las células tratadas con a-MS H nativa y RI a-MSH comparado con el péptido mezclado, no tratado o las células tratadas con KPV. Los péptidos sustituidos con alanina designados 810, 811 y 812 no mostraron incremento en la actividad de cAMP y exhibieron niveles de cAMP equivalentes al péptido mezclado, no tratado o las células tratadas con KPV. Los péptidos designados 810, 811 y 812 tienen sustituciones ' de alanina en la secuencia de tetrapéptido de núcleo central (región (D-Trp D-Arg D-Phe D-His; AA 5-8) propuesta que está involucrada en el enlace de a-MSH nativa al receptor de melanocortina y su actividad biológica. Las sustituciones de alanina en las regiones N-terminal o C-terminal del péptido RI a-MSH no afectó la acumulación de cAMP en las células de melanoma. Las sustituciones de alanina en los aminoácidos metionina e histidina (807 y 809) también mostró una reducción en la acumulación de cAMP aunque no tan grande como aquella observada en la secuencia de tetrapéptido de núcleo (810, 811 u 812) . Los residuos en el tetrapéptido de núcleo (wrfh) y a un grado menor, la metionina 4 de RI-MSH son críticos para el enlace a MC1R.
Otros medios mostrados para incrementar la afinidad de MSH para MClR se han demostrado utilizando selecciones basados en la exhibición de fago de secuencias variantes de MSH. Una secuencia altamente selectiva de MClR (MS05) se encontró subsecuentemente mediante la recombinación del péptido seleccionado por exhibición de fago en una porción de la secuencia MSH de origen, que produjo una afinidad subnanomolar para MC1R. Inesperadamente, la versión retro-inversa de esta secuencia mostró una afinidad más alta para MC1R (1 nM, Tabla 1 péptido 886) que RI-MSH (4 nM) , aunque MS05 se- reportó que tiene una afinidad ligeramente menor para MC1R que MSH (Ki 0.865 nM contra 0.557 nM para MSH) .
La sustitución de un número de residuos de aminoácido no naturales que incorporan ligeras diferencias en la carga y estructura en cada una de las posiciones de RI-MSH mostró que MC1R tolera solo cambios altamente conservativos. Todos excepto 3 mostraron menor o enlace equivalente. Dos cambios proporcionaron un incremento significante en la afinidad para MC1R: sustitución de la D-fenilalanina por D-ciclohexilalanina (D-Cha, péptido 869; 2.2 nM Ki) y la sustitución de la D-metionina por D-butionina (péptido 878, 2.3 nM Ki) . La sustitución con L-ciclohexilalanina se realizó y se encontró que inhibe ligeramente el enlace a MC1R (péptido 892, Ki de 0.51 nM contra 0.41 nM para MSH) . Inesperadamente, la combinación de las sustituciones de butionina y ciclohexilalanina no logró producir un incremento significante adicional en la afinidad para MC1R (péptido 890, 1.9 nM Ki) . Sin embargo, la combinación del cambio que comprende la sustitución de la secuencia N-terminal retro-inversa de MS05 (siiss) para la secuencia C-terminal (emsys) y D-ciclohexilalanina para D-Phe en RI-MSH produjo un aumento más grande de enlace que cada uno de los cambios solo únicamente, indicando que los efectos son sinergisticos . El péptido resultante (891) mostró una Ki para MC1R indistinguible de SH. Aunque este y los otros cambios también produjeron incrementos en la afinidad para los otros MCR' s, los valores de Ki estuvieron todavía en el intervalo micromolar, indicando que la selectividad de Ri-MSH se preservó grandemente. Los cambios se ilustran en la Figura 20. Un ensayo de enlace competitivo y representativo se muestra en la Figura 21. Ver la Tabla 1 para los valores de Ki observados.
Ejemplo 10 El tratamiento con RI a-MSH reduce los registros de enfermedad clínicos en EAE Se evaluó el efecto de la administración de la a- MSH nativa y el análogo de RI a-MSH en un modelo de ratón de EAE progresiva crónica. Los ratones C57BL/5 hembras .se inmunizaron con 200 yg de péptido MOG 35-55 emulsionado con CFA. La toxina de pertusis se administró en el día 0 y 2. Los ratones se monitorearon diariamente para los signos de síntomas clínicos y pérdida de peso. Los ratones se evaluaron para los síntomas de parálisis iniciando en el día 8 y se registraron en un sistema de clasificación de 0-5. La aparición de síntomas clínicos de parálisis se manifestó alrededor del día 9-11 en la mayoría de los ratones (Fig. 8A) . El tratamiento intraperitoneal (i.p.) diariamente con OÍ -MSH o el péptido RI OÍ-MSH en 100 ug/ratón o control de PBS comenzó en el dia 10. Los ratones tratados con 100 g de RI a-MSH mostraron una reducción significante en el registro de enfermedad clínico medio comparado con el control de PBS (Fig. 8A) . El significado de p= 0.05 se alcanzó en los días 14-22 en el RI OÍ-MS H comparado con el control de vehículo PBS. Sin embargo, el tratamiento con el péptido a-MSH nativo no tuvo un efecto sobre la inducción o progresión de la enfermedad. El por ciento de incidencia máximo de enfermedad en el grupo tratado con RI OÍ-MS H de los ratones (20%) también se redujo comparado con los grupos de ratones tratados con PBS (80%) o tratados con OÍ -MS H nativo (75%) Ejemplo 11 Variación de la dosificación de RI OÍ -MS H en EAE El efecto terapéutico de RI a-MSH fue aparente en la dosis de 100 µg/ratón. El tratamiento con -MSH o el péptido RI a-MSH en 100 yg/ratón y 30 pg/ratón se probó en el modelo de ratón de EAE con MOG. El tratamiento i.p. diariamente comenzó en el Día 10 después de la inmunización con MOG . El tratamiento con dexametasona diariamente (2 mg/kg) se adicionó como una sustancia terapéutica de control. Los ratones que se trataron con 100 ]ig de RI a-MSH repetidamente demostraron una reducción en el registro de enfermedad clínico medio comparado con el control de PBS - , . ·;¦ 89 (Fig. 9) . Sin embargo, las dosis de 30 g/ratón de RI a-MSH no tuvo un efecto significante sobre la reducción de los registros clínicos medios. El tratamiento con dexametasona también mostró una reducción en los registros de enfermedad por todo el curso de la enfermedad. Aunque los ratones tratados con a-MSH nativa tuvieron un registro clínico medio menor que PBS, los ratones tratados con -MSH no mostraron eficacia similar en los ratones tratados con RI a-MSH o dexametasona. El por ciento de incidencia de enfermedad en el grupo tratado con RI a-MSH alcanzó un máximo de 35% y la dexametasona 40% comparado con los ratones tratados con PBS que mostraron un 75% de incidencia máxima de enfermedad (Fig. 9) . Estos datos indican que el tratamiento con el análogo de péptido de RI a-MSH en EAE significativamente disminuye los registros de enfermedad clínicos medios y la incidencia de la enfermedad.
Ejemplo 12 Histología del CNS Las médulas espinales se recolectaron en el día 24 después de la inducción de la enfermedad en ratones tratados con PBS y RI a-MSH. El manchado con hematoxilina y eosina de las secciones de la médula espinal se utilizaron para estimar el grado de inflamación y número de lesiones. La patología de EAE muestra áreas focales de infiltración de células' inflamatorias y desmielinación . La evaluación histopatológica de la médula espinal demostró la eficacia del tratamiento de RI a- SH en el modelo de EAE de MOG. Grupos de ratones representativos del registro clínico medio para cada grupo de tratamiento se muestra en las Figs. 10a-10d. Los datos muestran infiltrados inflamatorios extensivos en el grupo de ratones tratados con PBS comparado con los ratones tratados con RI a-MSH que carecen de área focal de inflamación.
Ejemplo 13 Medición de TNF-g e IL-10 en el bazo durante la progresión de la enfermedad El mecanismo de acción de los efectos del tratamiento de RI a-MSH en EAE se examinó. a-MSH nativa se ha reportado que tiene un efecto sobre los monocitos/macrófagos al disminuir los niveles de TNF-a e incrementar IL-10. Los niveles de TNF-a e. IL-10 mRNA en el bazo de ratones cebados con MOG tratados con RI a-MSH o a-MSH nativa se evaluaron mediante la PCR cuantitativa. Los ratones se inmunizaron con MOG p35-55 y el tratamiento diariamente con RI a-MSH o a-MSH nativa iniciaron el día 10. Las muestras del bazo se recolectaron de los ratones en los días 1, 4 y 7 después del inicio del tratamiento diariamente. Los datos muestran que el tratamiento con RI a-MSH y a-MSH significativamente disminuyó (p= 0.001) TNF-a comparado con el control de PBS después de 7 días de tratamiento diariamente (Fig. lie). Sin embargo no hubo cambio significante en el nivel de TNF-a en puntos de tiempo previos (Día 1 y Día 4; Figs . lia y 11c). Los niveles de IL-10 mRNA también se redujeron en el punto de tiempo en el Día 7 en ambos de los grupos de tratamiento con RI a-MSH y aMSH comparado con el control de PBS (Fig. llf ) . Sin embargo, nada de diferencia de los niveles de IL-10 mRNA se detectaron en los puntos de tiempo tempranos (Figs. 11b y lid). Aunque el tratamiento con -MSH nativa no redujo los registros de enfermedad clínicos medios o el por ciento de incidencia de enfermedad, en este estudio el tratamiento con a- SH redujo ambos de los niveles de TNF-OÍ e IL-10 mRNA en el bazo comparado con el control de PBS por el Día 17 de la progresión de la enfermedad. El análogo de RI a-MSH es capaz de reducir los niveles de TNF-a mRNA en el bazo después del tratamiento diariamente.
Ejemplo 14 Efecto del RI a-MSH en la respuesta de recaída al péptido MOG Los efectos del tratamiento de los ratones con o¡-MSH o RI a-MSH in vivo en las respuestas de recaída al péptido MOG35-55 se evaluaron. Los ratones se cebaron con el péptido MOG35-55 en los Días 2-8 los ratones ya sea que se trataron con PBS, 100 µg de a- SH o 100 pg de RI a-MSH. En el Día 9, el bazo y los ganglios linfáticos de drenado se recolectaron y se analizaron para las respuestas de recaída al péptido MOG35-55 in vitro mediante la incorporación de [3H] timidina. Los datos muestran una disminución significante en las respuestas proliferativas de las células del bazo al péptido OG35-55 en el grupo de ratones de -MSH comparado con el grupo tratado con PBS (Fig. 12a). el grupo tratado con RI a-MSH mostró una reducción ligera en las respuestas de recaída al péptido MOG35-55. Sin embargo, las respuestas de recaída al péptido MOG en la población de células de ganglio linfático no mostró una diferencia significante en la responsividad entre los grupos tratados con PBS, a-MSH, y RI a-MSH (Fig. 12b) .
El sobrenadante de células se recolectó de las células del bazo que se estimularo con el péptido MOG35-55 in vitro de cada uno de los grupos de tratamiento in vivo (na'íve, PBS, a-MSH, RI a-MSH) . Los niveles de citoquina se evaluaron a través de un arreglo de cuenta citométrica mediante la citometría de flujo. Los datos muestran una disminución en los niveles de TNF-a, IFNy, IL-6 y MCP-1 en ambos de los grupos tratados con a-MSH y RI a-MSH comparado con el grupo tratado con PBS (Figs 12c y 12d) . Los niveles de citoquina del sobrenadante de células del bazo en ambos de los grupos tratados con a-MSH y RI a-MSH fueron similares a los niveles de citoquina de las células del bazo de los ratones no cebados.
Por lo tanto, el tratamiento con el péptido RI o¡-MSH tuvo un efecto sobre las respuestas de recaída de citoquina al péptido de MOG pero no tuvo efectos sobre las. respuestas de proliferación de célula T.
Ejemplo 15 Efectos del tratamiento de ratones con a-MSH o RI a-MSH durante la fase de cebado de EAE Los ratones se inmunizaron con el péptido MOG 35-55 y en los días 2-8 se trataron diariamente con el control de vehículo de PBS, a-MSH, o RI a-MSH. Los bazos de los ratones individuales se recolectaron en el Día 9 y la expresión de citoquina de mRNA se cuantificó utilizando la PCR en tiempo real. La Fig. 13 muestra los niveles de expresión de TNF-a y IL-10 mRNA en el bazo de los ratones tratados con PBS, a-MSH o RI a-MSH en la fase de cebado de la enfermedad. Los ratones naive que no se inmunizaron con el péptido MOG se utilizaron para cuantificar los niveles de RNA de línea de base de TNF-a e IL-10. El tratamiento con ya sea a-MSH o RI a-MSH disminuyó los niveles de IL-10 y TNF-a mRNA comparado con el control de vehículo de PBS.
Muestras de suero de sangre también se recolectaron en el día 9 del estudio y se evaluaron para los niveles de citoquina: TNF-a, MCP-1, IL-12, IL-10 e IL-6 (Figs 13c y 13d) . Los datos muestran una disminución en MCP-1 e IL-6 en ambos de los grupos tratados con a-MSH y RI a-MSH comparado con el grupo de control de PBS. PCP-1 se disminuyó significativamente (p<0.01) en el grupo tratado con RI a-MSH comparado con el control de PBS. Adicionalmente, el grupo tratado con RI a-MSH mostró una disminución en TNF-a e IL-12 comparado con el grupo de PBS. No hubo diferencia en los niveles de IL-10 en el suero entre los tres grupos tratados.
Ejemplo 16 RI a-MSH no tiene un efecto sobre los marcadores de macrófago Los macrófagos CDllb+ y F4/80+ explénicos se examinaron para los niveles de expresión de superficie de CD86, CD40 y CD14 mediante la citometria de flujo después de 7 dias de dosificación diariamente con a-MSH o RI a-MSH en ratones inmunizados con MOG 35-55. Los datos no muestran diferencias en los niveles de expresión de CD86, CD40 o CD14 en la población de células de macrófago CDllb+ o F4/80+ esplénicos en ratones tratados con a-MSH o RI a-MSH (Fig. 14). Los resultados mostraron un descubrimiento similar cuando se examinaron los monocitos de la sangre para los niveles de expresión de CD86, CD40, y CD14 (datos no mostrados ) Ejemplo 17 Efectos en el modelo de ratón de inflamación con LPS a-MSH nativa . se reportaron que inhibe la inflamación al regular hacia abajo la producción de TNF-a a través de la estimulación de los receptores de melanocortina (MCR) , en particular el receptor de melanocortina 1. LPS estimula los mediadores inflamatorios tales TNF-a, MCP-1, IL-6 e IFNy y se ha utilizado como un modelo de inflamación aguda. Se examinó si un análogo de a-MSH puede suprimir las citoquinas inflamatorias en un modelo de inflamación de ratón con LPS. Los niveles de expresión de MCIR en el bazo y los macrófagos peritoneales después de la administración de LPS se determinaron. Los ratones C57BL/6 se inyectaron con LPS, i.p., en varios puntos de tiempo después de la inyección de LPS del bazo y los macrófagos peritoneales se recolectaron para el análisis. Los datos no muestran diferencia discernible en los niveles de la expresión de MCIR mRNA entre cualquiera de los puntos de tiempo en los macrófagos peritoneales (Fig. 15a). Sin embargo, la administración de LPS incrementó los niveles de mRNA de MCIR arriba de los ratones nal've que no recibieron una estimulación de LPS. En el bazo los niveles de MCIR mRNA se elevaron 30 minutos de la post-inyección de LPS y luego disminuyeron por una hora de la post-inyección (Fig. 15b). LPS de manera similar incrementó los niveles de mRNA de MCIR en el bazo arriba de los niveles de linea de base en los ratones nal' e.
Los datos que demuestran la expresión de MCIR mRNA en el bazo y los macrófagos peritoneales indicaron que 30 minutos de post-estimulación con LPS podría ser el punto de tiempo óptimo para el tratamiento con -MSH o el análogo de RI OÍ-MSH. Los ratones C57BL/6 se inyectaron con LPS, i.p. y 30 minutos después se administró a-MSH o el análogo 891 de RI OÍ-MSH i.p. en dosis que varían de 5 mg/kg a 0.156 mg/kg. El análogo 891 de RI a-MSH es un análogo de RI -MSH en el cual los D-aminoácidos d-Cha y hsiiss se adicionaron a la secuencia de péptidos de núcleo. El análogo 891 de RI a-MSH ha mostrado que tiene afinidad de enlace incrementada al MC1R de ratón y potencia incrementada para estimular cAMP (datos no mostrados). Los resultados mostraron reducción significante en los niveles de TNF-a e IL-10 en los grupos tratados con a-MSH nativa comparados con el control de vehículo de PBS (Figs. 16a y 16c). MCP-1 no fue afectado por · el tratamiento con a-MSH nativa (Fig. 16b) . El tratamiento de los ratones estimulados con LPS con el análogo 891 de RI a- MSH mostraron resultados similares con una disminución significante en TNF-a e IL-10 sin afectar los niveles de MCP- 1 comparado con el control de vehículo (Figs. 16d- 16f ) . Dosis menores de tanto la a-MSH nativa como el análogo 891 de RI a-MSH mostraron la supresión más grande de citoquinas inflamatorias. El control positivo de dexametasona consistentemente suprimió la supresión de los niveles de TNF- a y MCP-1.
Ejemplo 18 Estabilidad de los péptidos en el plasma La vida media del suero del a-MSH nativa se ha estimado que es aproximadamente 10 minutos. A pesar de esta vida media limitada, el péptido es todavía capaz de inducir potentes actividades antiinflamatorias. Sin embargo, análogos de a-MSH más estables son necesarios para incrementar la potencia de las actividades antiinflamatorias y ser además desarrollado como una sustancia terapéutica. Un análogo de D-aminoácidos de a- SH nativa (referido como retro-inverso a-MSH o RI -MSH) se sintetizó y es más estable para OÍ- SH nativa. La forma de D-aminoácidos de los péptidos es más resistente en la proteólisis y se metaboliza en una velocidad más lenta que la forma L-aminoácido de los péptidos.
La estabilidad de RI-a- SH se determinó mediante la incubación en plasma o PBS in vitro a 37 °C durante 24 horas. Se tomaron alícuotas y - las proteínas se precipitaron con 2 volúmenes de acetonitrilo . a-MSH se utilizó como un control y bradiquininina como un estándar interno. Después de la centrifugación, las muestras se congelaron a -80°C hasta el análisis de LC/MS/MS (MRM) utilizando una separación de columna C18 y el modo de ionización de electrorocío positivo. Como se muestra en la Fig. 17a, MSH mostró una vida media de aproximadamente 3 horas en el plasma, pero fue estable en PBS. Sin embargo, RI a-MSH fue estable tanto en PBS como en el plasma, no mostrando degradación detectable durante 24 horas .
Los perfiles farmacocinéticos (PK) de a-MSH y Rl-a-MSH sugieren que RI-a-MSH tiene una vida media del' suero más larga que la a-MSH nativa (Fig. 17b) . Los ratones tratados con una sola dosis de 100 yg de RI-a-MSH o a-MSH tuvieron niveles de suero medibles de RI-a-MSH después de 24 horas pero no hubo niveles detectables de -MSH 120 minutos de p.ost-tratamiento (n=5) .
Ejemplo 19 Efectos de enlace de retro-inverso péptidos Un tetrapéptido MSH de núcleo que contiene un D-Phe (HfRW) es suficiente para producir enlace significa a MCIR (20-50 nM Ki). Sin embargo, muy poco enlace se observa con la-versión retroinversa del mismo tetrapéptido (wrFh, 883, Ki>30uM, Tabla 1), mostrando que el péptido retro-inverso no logra poner en contacto completamente el receptor de la misma manera como el HfRW. La visión de grupos de asilo graso del N-terminal de HfRW selectivamente mejora su enlace a MCIR, produciendo una afinidad comparable a MSH. Esto se observa para el péptido estearil-HfRW MCIR (1.3 nM, péptido 820). Además de un grupo de diaminohexano estearilo al retro-inverso wrFh (péptido 882) se mejora el enlace a MCIR (120 nM, >250 veces) y a un grado comparable como la adición de ácido esteárico al N-terminal de HfRW (80 veces), pero no logra la afinidad observada para RI-MSH (4.1 nM) , nuevamente indicando que otros residuos en RI-MSH desempeñan una función más grande en el enlace de RI-MSH a MCIR que con MSH.
Ejemplo 20 Efectos de estereoquímica en el enlace de retro-inverso péptidos La estereoquímica de los residuos en el retro-inverso tetrapéptido de núcleo tiene un efecto significativamente diferente del enlace a MC1R que¦ en la forma L de MSH. Como se muestra en la Figura 19, la inversión de los residuos de tetrapéptido de núcleo en RI-MSH a la forma L (péptidos 884, 893-895) todos redujeron la afinidad del péptido para MC1R. Acentuadamente e inesperadamente,! la inversión del D-Phe a L-Phe en la secuencia RI causó una reducción de 20 veces en el enlace, mientras que el cambio correspondiente en HFRW (L-Phe a D-Phe) se ha reportado que mejora el enlace tanto como 400-veces. Para los otros residuos, la inversión esteroquímica se encontró que tiene un efecto menor sobre RI-MSH que sobre el péptido HfRW de núcleo nuevamente indicando la importancia relativa de cada residuo en el tetrapéptido de núcleo que es menor en RI-MSH que en el tetrapéptido HfRW.
Ejemplo 21 Efectos del retro-inverso MSH de terminación de extremo Otra ruta posible para lograr más alta afinidad para MC1R se basa en la observación de que la terminación de extremo del péptido HfRW con ácido fenil butírico selectivamente y fuertemente incrementa la afinidad de HfRW para MC1R (Ki=6 pM) . Sin embargo, no se observó incremento en la afinidad de RI-MSH truncado que lleva una fenilpropilamida C-terminal (péptido 847), con un Ki de 150 nM observado para tanto el péptido truncado en el residuo de histidina (péptido 847 int) y su aducto de aminopropilo-fenilo (péptido 847, Tabla 1), demostrando que con RI-MSH, el enlace se altera de una manera permitiendo la interacción simultánea de la secuencia de tetrapéptido y la interacción aromática postulada del sitio cerca del elemento de enlace de histidina en MC1R.
Ejemplo 22 Síntesis de un conjugado de toxina de retro-inverso MSH Una versión modificada del péptido 891 (Tabla 1) en el cual una cisteína se adjunta al N-terminal se genera mediante la química de Fmoc. Un conjugado de monometil auristatina E (MMAE) que contiene un enlazador de valina-citrulina sensible a proteasa con una porción de maleimido-caproilo para el acoplamiento a tioles se sintetiza de acuerdo con Doronina y colaboradores, (2003) Nature Biotechnol. 21:778-784, incorporado en la presente por referencia. El péptido y el conjugado de MMAE se incuba en una solución de fosfato de' NA 25mM, EDTA 2 mM pH 7 durante 14 h a 25°C y el producto se purifica mediante el HPLC de fase inversa de C18 (RP-HPLC) .
Ejemplo 23 Efecto de los análogos de RI g-MSH sobre el cAMP en líneas celulares de melanoma de murino Tanto a-MSH nativa como RI a-MSH incrementan los niveles de cAMP en células de melanoma de murino. Los análogos de péptido de R I a-MSH se generaron para determinar si las modificaciones a la secuencia de núcleo del péptido R I a-MSH elevaría los niveles de cAMP comparados con el péptido de RI a- SH. Un experimento de dosis respuesta se llevó a cabo para los análogos de RI OÍ-M S H generados en el ensayo de cAMP utilizando las células de melanoma B16-F1 de murino.
Cultivo de células in vitro: Células de melanoma de murino B16-F1 se cultivaron en placas de 96 cavidades 5xl04 células/cavidad durante la noche en el medio con L-glutamina y pen/strep y FBS. El medio se removió y luego el medio con IBMX se adicionó a las células durante 1 hr. Las células luego se trataron con R I a-MSH, o análogos de péptido de R I a- SH (890, 891, 892, 893, 894 u 895) . Las células se lisaron después de 30 min utilizando un equipo de ensayo de cAMP y el sobrenadante se utilizó en el ensayo. La forscolina en 10 µ? sirvió como controles positivos.
Niveles de cAMP : El cAMP intracelular se midió utilizando un Equipo de Ensayo de competición de cAMP (Amersham Biosciences) . Todas las muestras de lisado celular se diluyeron en 1:100 para el análisis.
Péptidos : 869 vpkGwr (d-Cha) hemsys 872 vpkGwrfremsys 880 vpkGwrFhsiiss 78 vpkGwrfhe (d-butionina) sys 86 RI-MS05 vpkgwrfhsiiss 90 vpkGwr (d-Cha) he (d-Butionina ) sys 91 vpkGwr (d-Cha) hsiiss 92 SYSMEH (Cha) RWGKPV 93 vpkGWrfhemsys 94 vpkGwRfhemsys 95 vpkGwrfHemsys Resultados: Células B16-F1 de melanoma de murino se trataron con RI a-MSH o análogo de RI a-MSH (869, 872, 880, '878, 886 y 890-895) en un intervalo de concentración de 10~4- 10-11 M. Los niveles de cAMP de las células tratadas con RI a-MSH o análogos de RI a-MSH. La mayoría de los análogos de RI a-MSH mostraron valores de EC50 mejorados comparados con RI a-MSH con excepción del análogo 894. Los análogos 891, 892 y 886 mostraron la mejora más grande de los valores de EC50 en el ensayo de cAMP comparado con el péptido RI a-MSH. En resumen, los análogos de RI a-MSH mostraron una respuesta de dosis mejorada y el valor de EC50 comparado con el péptido de RI a-MSH, Ver la Fig. 22 para datos gráficos y la Tabla 2 para datos de EC50.
Tabla 2 EC50 ? EC50 µ? EC50 µ? 0C-MSH 0.0004 a-MSH 0.0004 a-MSH 0.0004 RI a-MSH 9.7 RI a-MSH 9.7 RI a-MSH 9.7 Análogo Análogo Análogo ID: ID: ID: 890 3.6 878 0.13 869 0.014 891 0.081 880 0.023 872 2.0 892 0.021 886 0.002 878 0.13 893 0.27 894 212 895 0.3

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto sustancialmente puro que selectivamente enlaza el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , el compuesto caracterizado porque comprende un tetrapéptido de núcleo que tiene la secuencia: His Xaai Arg Trp (SEQ ID NO:l) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEQ ID NO: 2) , en donde Xaai es D-Cha, D-Phe o Cha, y Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto comprende un polipéptido C-terminal que tiene la secuencia: D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 3).
3. Un compuesto sustancialmente puro que selectivamente enlaza el receptor de melanocortina 1 (MC1R) , el compuesto caracterizado porque comprende un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Xaa6 Xaa7 Xaag Xaag Xaaio Xaan Xaai2 Xaai3, en donde Xaai es D-Val, D-Ala o D-Lys; Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys; Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys; Xaa4 es Gly, o D-Ala; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala; Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala; Xaaio es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala; Xaan es D-Ser, D-Ile o D-Ala; Xaai2 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala; y Xaa es D-Ser o D-Ala; en donde no más de un Xaai-13 es D-Ala excepto cuando Xaai_3 son todos D-Ala, y no más de un Xaai-13 es un L-aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto comprende un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 X as Xaa6 Xaa7 Xaag Xaag Xaaio Xa n Xaai2 Xaai3/ en donde Xaai es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala , D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi- Trp, o D-Phe; Xaa6 es D-Arg o D-His; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, o D-4-nitro-Phe; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser; Xaaio es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaan es D-Ser o D-Ile; Xaai2 es D-Tyr o D-Ser; y Xaai3 es D-Ser; en donde no más de un Xaai-13 es un L-aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto comprende un polipéptido que tiene la secuencia: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaag Xaaio Xaan Xaai2 aai3, en donde Xaai es D-Val; Xaa2 es D-Pro; . Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp o Trp; Xaa6 es D-Arg; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi; Xaag es D-His o His; Xaa9 es D-Glu o D-Ser; Xaaio es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaan es D-Ser o D-Ile; Xaai2 es D-Tyr o D-Ser; y Xaai3 es D-Ser; en donde no más de un Xaai-13 es un L-aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Un compuesto sustancialmente puro, caracterizado porque comprende un polipéptido que tiene la secuencia: D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 4); D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO: 5); Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO: 6); o D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEQ ID NO: 7); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6, caracterizado porque el polipéptido es PEGilado.
8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el compuesto selectivamente enlaza MC1R.
9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6, caracterizado porque el compuesto exhibe por lo menos una de las siguientes propiedades : habilidad para activar selectivamente MC1R; estabilidad en plasma in vitro; o resistencia a la degradación de proteasa.
10. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el compuesto de la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6, caracterizado porque el compuesto se conjuga con una porción biológicamente activa.
12. Un método para tratar un enfermedad o condición autoinmune en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la enfermedad o condición autoinmune se selecciona del 'grupo que consiste de esclerosis múltiple, diabetes tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Grave, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveitis autoinmune y miastenia grave.
14. Un método para tratar la inflamación en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la inflamación está asociada con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de intestino inflamatorio, artritis reumatoide, alergia, ateroesclerosis , psoriasis, gastritis y enfermedad de corazón isquémico .
16. Un método para reducir o inhibir el rechazo de trasplante en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6.
17. Un método para tratar melanoma en un sujeto en necesidad del, mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6.
18. Un método para tratar melanoma en un sujeto en no necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, 5 o 6 conjugado con una carga útil antitumoral.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la carga útil antitumoral es un radionúclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador , un agente quimioterapéutico o una toxina.
20. Un equipo, caracterizado porque comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 10 y opcionalmente instrucciones para el uso.
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