MX2010011819A - Liberacion de adenosina basada en polimero de seda: potencial terapeutico para la epilepsia. - Google Patents
Liberacion de adenosina basada en polimero de seda: potencial terapeutico para la epilepsia.Info
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Abstract
Esta invención se relaciona a formulaciones de liberación sostenida que comprenden biopolímero de fibronía de seda y adenosina, que proporcionan una liberación focal, sostenida de adenosina en niveles terapéuticos para el tratamiento de la epilepsia y/o la prevención de la epileptogénesis. Una modalidad proporciona un implante de liberación de adenosina, basado en seda que alivia las convulsiones o previene la epileptogénesis. Otra modalidad proporciona un método para tratar la epilepsia o prevenir la epileptogénesis que comprende administrar focalmente adenosina en un sistema de suministro de adenosina basado en seda, de liberación sostenida.
Description
LIBERACIÓN DE ADENOSINA BASADA EN POLÍMERO DE SEDA: POTENCIAL
TERAPÉUTICO PARA LA EPILEPSIA CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona a formulaciones de liberación sostenida. Más específicamente, la presente invención se relaciona a formulaciones que comprenden un biopolímero de fibroína de seda y adenosina, que proporciona una liberación focal, sostenida de adenosina en niveles terapéuticos para el tratamiento de la epilepsia y/o la prevención de la epileptogénesis .
ANTECEDENTES
La epilepsia se define como la ocurrencia repetida de convulsiones o ataques no provocados. Uno de los desórdenes neurológicos más comunes, es la epilepsia que afecta aproximadamente 2.5 millones de americanos de todas las edades y procedencias, y más de 60 millones de personas en todo el mundo. Con base en estimaciones modestas, por lo menos un tercio de individuos diagnosticados con epilepsia sufren de fármacoresistencia y efectos secundarios intolerables. Adicionalmente, los fármacos antiepilépticos actuales hacen poco para prevenir el desarrollo de la epilepsia (es decir, epileptogénesis) o para modificar la progresión de la epilepsia. Por lo tanto, son necesarias urgentemente alternativas terapéuticas.
En contraste al suministro de fármaco sistémico, el
suministro de fármaco focal al cerebro por lo general carece de efectos secundarios sistémicos y 'es una promesa para la terapia de la epilepsia, la cual es frecuentemente de origen focal. La reciente identificación de la deficiencia de adenosina focal como una causa principal para la generación de convulsiones proporciona una exposición razonada neuroquímica para las terapias de aumento de adenosina focales (AATs) . Las AATs focales se pueden lograr al implantar dispositivos o células de liberación de adenosina dentro de la vecindad de un foco epileptogénico . Las AATs carecen de efectos secundarios sistémicos y sedantes, y el aumento de la respuesta de la adenosina puede suprimir las convulsiones experimentales de otra manera refractarias a los fármacos antiepilépticos estándares. De esta manera, las AATs son una promesa para la terapia de las epilepsias focales refractarias. Sin embargo, las AATs experimentales no son adecuadas para el desarrollo clínico debido al uso de células animales o la duración a corto plazo del efecto terapéutico en algunos de los procedimientos. El desarrollo clínico adicional de las AATs establece la liberación lenta y sostenida de la adenosina de los implantes cerebrales seguros y biocompatibles .
BREVE DESCRIPCIÓN
Las presentes modalidades proporcionan implantes de biopolímero de seda que suministran adenosina de liberación
sostenida, administrando la terapia focal para el tratamiento de la epilepsia. Las formulaciones de suministro de adenosina basadas en fibroina de seda de las presentes modalidades ejercen efectos anti-ictogénicos potentes y por lo menos efectos anti-epileptogénicos parciales.
Las terapias de aumento de adenosina (AAT) hacen uso racional del sistema de control de convulsiones basado en adenosina del cerebro y son una promesa para la terapia de la epilepsia refractaria. Proporcionando una AAT compatible con la aplicación clínica, las presentes modalidades emplean un sistema de liberación basado en proteína de seda novedoso para la adenosina. En algunos aspectos, los implantes cerebrales de liberación de adenosina con dosis de liberación objetivo de 0 ng, 40 ng, 200 ng, y 1,000 ng de adenosina al día se prepararon al incrustar microesferas que contienen adenosina dentro de estructuras de fibroina de seda recubiertas con nanopelícula . In vitro, los polímeros respectivos liberaron 0 ng, 33.4 ng, 170.5 ng, y 819.0 ng de adenosina al día durante catorce días. En una modalidad particular, el implante de fibroina de seda se diseñó para liberar aproximadamente 1000 ng adenosina al día durante un período de tiempo de diez días. Este implante demostró una terapia segura y eficiente para suprimir las convulsiones o ataques .
El potencial terapéutico de los implantes también
se validó en un estudio de .dosis-respuesta en un modelo de rata de epileptogénesis de activación. Por ejemplo, de cuatro a ocho días antes del inicio de la activación, los polímeros liberadores de t adenosina se implantaron dentro de la hendidura del infrahipocampo, y se supervisó la adquisición progresiva de convulsiones activadas durante treinta estimulaciones. Las presentes formulaciones proporcionaron una retardación dependiente de dosis de la adquis'ición de convulsiones. En recipientes de polímeros que liberan aproximadamente 819 ng de adenosina al día, la epileptogénesis de activación se retardó por más de una semana. Los análisis histológicos de las muestras cerebrales confirmaron la ubicación correcta de los implantes. Adicionalmente, el bloqueo de los receptores Ai de adenosina no exacerbaron las convulsiones en los animales protegidos.
Otra modalidad de la presente invención proporciona la prevención o tratamiento de la epilepsia en un sujeto, incluyendo un sujeto humano, al implantar una composición de liberación de adenosina basada en fibroína de seda directamente dentro del cerebro del sujetó. La dosis de adenosina del implante puede ser de aproximadamente 50 ng/día a aproximadamente 50 mg/día, inclusive, dependiendo del tamaño del hipocampo del sujeto, el tamaño del foco epiléptico y en el sito de implantación. Por ejemplo, se puede requerir una dosis más baja si el implante se coloca
directamente dentro del foco epiléptico; se puede requerir una dosis más alta si el implante se coloca dentro del sistema ventricular en la vecindad del foco epiléptico.
La duración de tiempo durante el cual la adenosina se suministra puede ser de aproximadamente un mes a más de un año, inclusive. Por ejemplo, el suministro a corto plazo, por ejemplo, un mes después de un efecto desencadenador de la epileptogénesis , tal como una lesión cerebral traumática, puede prevenir la epileptogénesis. Debido a' que la epilepsia es típicamente una enfermedad permanente, se puede usar un sistema de implante terapéutico para proporcionar un control de convulsiones durante la vida de un sujeto. De esta manera, una modalidad de la presente invención proporciona un sistema de implante en el cual el implante de adenosina de fibroína de seda suministra adenosina durante aproximadamente un año, después del cual cualquier estructura expirada se remueve y se reemplaza con un implante reciente, el sistema que se puede lograr por la vía de catéteres permanentemente implantados .
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 presenta un representación esquemática de la fabricación de implante que muestra los componentes de suministro de fármacos basados en seda individuales: (1) Se preparan microesferas encapsuladoras de adenosina; (2) Se mezclan las microesferas con solución de seda,' luego se
fabrican estructuras porosas incrustadas con microesferas ;
(3) La estructura se empapa en solución de seda+adenosina , llenando los poros y recubriendo el implante con una película cargada con fármaco de macroescala; y (4) Se carga adenosina adicional con una deposición de nanopelícula alternante.
La FIG. 2 muestra la liberación de adenosina in vitro de los polímeros basados en seda (0 ng, 40 ng, 200 ng y 1,000 ng de implantes objetivos) en dos escalas diferentes
(A, B) . Las desviaciones 'estándares se omiten en las gráficas, ya que se presentarían únicamente como fondo (ver el texto y la Tabla 2 para los datos de desviación estándar) .
La FIG. 3 presenta datos que reflejan la liberación diaria de la adenosina de los polímeros basado en seda. Panel
(A) La liberación de adenosina se determinó para cada día mostrado, con base en los valores promediados de N = 3 polímeros. Observar la velocidad de liberación estable de aproximadamente 1000 ng de adenosina/día desde el día 4 al día 10, que corresponde a la velocidad de liberación objetivo pre-diseñada . Los errores se dan como . ± SD. Panel (B) La estimación de la antiepileptogénesis en el modelo activado de rata de acuerdo por Silver y colaboradores, 29 Ann. Neurol. 356-63 (1991) . La activación se inicia durante el suministro del fármaco seguido por un período de lavado del fármaco; subsecuentemente, la activación se resume en ausencia del fármaco. Observar que el criterio para la supresión completa
de la epileptogénesis es un cambio de la curva' de activación a la derecha; el número de estimulaciones de activación sin fármaco necesario para desencadenar una etapa de convulsión específica debe ser el mismo como en los animales de control. Negro: sin supresión de convulsiones, sin antiepileptogénesis ; gris oscuro: animal de control no tratado; gris: supresión de convulsiones más antiepileptogénesis parcial; gris claro: antiepileptogénesis completa; gris más claro: -supresión de convulsiones, sin antiepileptogénesis.
La FIG. 4 muestra la retardación de la activación después de la implantación en el infrahipocampo de polímeros de liberación de adenosina. Cuatro días después de la implantación en el infrahipocampo de los polímeros basados en seda con velocidades de liberación objetivo diarias para la adenosina de 0 ng (N=5, línea superior,, círculos, barra extrema izquierda en cada conjunto) , 40 ng (N=5, 2da línea de la parte superior, cuadrados oscuros, barra de la 2da línea de la derecha en cada conjunto), 200 ng (N=6, triángulos, 2da barra de la izquierda en cada conjunto) , o 1000 ng (N=6, línea más baja, diamantes, barra extrema izquierda en cada conjunto) las estimulaciones activadas se suministraron a una velocidad de 6 estimulaciones al día (= sesión) , con la sesión 1 a la 8 que corresponde a los días 4, 6, 8, 11, 13, 15, 18 y 20 después del implante. Panel (A) Etapas de
convulsiones promediadas a través de los animales de cada grupo de cada estimulación individual. Las curvas activadas se cambiaron a la derecha con el incremento de la dosis de adenosina. Observar que los recipientes de una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina al dia se protegieron completamente de cualquiera de las convulsiones durante las primeras 23 estimulaciones. Panel (B) Respuesta por sesión de convulsiones promediadas (N-6 estimulaciones) de los mismos animales representados en el panel (A) . Observar- la relación de respuesta de dosis en la sesión 8. Los errores se dan como ± SD. Los datos se analizaron por el ANOVA, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0,001, grupos de tratamiento comparados con el control (0 ng) .
La FIG. 5 muestra el número de estimulaciones activadas necesarias para inducir convulsiones de la etapa 1 o la etapa 2 parciales. Los datos se promediaron a partir de las tablas de registro de convulsiones de los animales de la FIG. 4. Los errores se dan como ± SD.
La FIG. 6 presenta la supresión de convulsiones totalmente activadas por la adenosina derivada del implante. Ratas totalmente activadas (criterio: por lo menos tres convulsiones de etapa 5 consecutivas) recibieron implantes de infrahipocampo de los polímeros basados en seda con una velocidad de liberación objetivo diaria para la adenosina de 0 ng (N = 4, cuadros), o 1000 ng (N = 5, diamantes). Las
estimulaciones de prueba individuales se suministraron en los días 4, 6, 10, 14, 18, y 21. Las etapas de convulsiones promediadas a través de los animales de cada grupo se muestran para cada estimuló. Observar que los recipientes de una dosis objetivo 1000 ng de adenosina al día se protegen completamente de cualquiera de las convulsiones durante los 10 días después de la implantación que corresponde a la liberación sostenida de adenosina durante -el periodo de tiempo. Los errores se dan como ± SD. Los datos se analizaron por el ANOVA de dos vías seguido por una prueba Bonferroni; la importancia de la interacción entre los grupos se determinó como F=2.390; P<0.05; los niveles de importancia de las pruebas individuales se indican: * P<0.05, ** P<0.01.
La FIG. 7 representa la duración promedio después de la descarga en los registros EEG durante la adquisición activada. El Panel (A) muestra la duración después de la descarga (ADD) como se determina después de cada estimulación activada al analizar los registros EEG respectivos. Las ADDs se promediaron para cada sesión (n = 6 estimulaciones) y tipo de tratamiento: implantes que liberan dosis objetivo de 0 ng (barra extrema derecha en cada conjunto, N=5) , 40 ng (barra derecha penúltima en cada conjunto, N=5), 200 ng (barra izquierda penúltima, N=6) , o 1000 ng (barra extrema izquierda en cada conjunto, N=6) de adenosina al dia. Los errores se dan como ± SD. Los datos se analizaron por el ANOVA: *
P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, los implantes de polímero de liberación de adenosina contra el control (0 ng de adenosina) . El Panel (B) es un registro EEG representativo en la sesión 5 de un animal con un implante de control. El Panel (C) muestra un registro EEG representativo en la sesión 5 de un animal con una dosis de liberación objetivo de 1,000 ng de adenosina/día .
La FIG. 8 muestra la influencia sobre la epileptogénesis por los polímeros de liberación de adenosina. FIG. 8A: Cuatro días después de la implantación en el infrahipocampo de los polímeros basados en seda con velocidades de liberación objetivo diarias para la adenosina de 0 ng (N = 5, diamante), o 1000 ng (N = 8, cuadrado) las estimulaciones activadas se suministraron a una velocidad de 6 estimulaciones/día en los días 4, 6, 8, y 11 después de la-implantación. Se suministraron un total de veinticuatro estimulaciones activadas. En el día doce, DPCPX (1 mg/kg, i.p.) se inyectó 30 minutos antes de la estimulación. Cada animal se sometió a prueba nuevamente en el día trece (sin DPCPX) . Las etapas de convulsiones se promediaron a través de los animales de cada grupo para cada estímulo individual. Observar que los recipientes de un objetivo de 1000 ng de adenosina/día mostraron una protección significativa del desarrollo de activación, y el DPCPX no incrementó el registro de convulsiones. Los errores se dan como ± SD. Los
datos se analizaron por el ANOVA de dos vías seguido por una prueba Bonferroni; la importancia de la interacción entre los grupos se determinó como determinó como F=6.704, P<0.0001; los niveles de importancia de las pruebas individuales se indican: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
La FIG. 8B muestra que los cuatro días después de la implantación en el infrahipocampo de los polímeros basados en seda con velocidades de liberación objetivo diarias para la adenosina de 0 ng (N = 7, diamante), o 1000 ng (N = 5, cuadrado) las estimulaciones de activación se suministraron a una proporción de 6 estimulaciones/dia en los días 4, 5, 6, 7, y 8 después de la implantación. Se suministraron un total de 30 estimulaciones de activación. Observar la frecuencia de activación incrementada comparada con la FIG. 8 A. Después de la 30ava estimulación de activación, la activación se discontinuó durante nueve días. Las estimulaciones se resumieron en el dia 18. Las etapas de convulsiones se promediaron a través de los animales de cada grupo para cada estimulo individual. Observar que los recipientes de una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina al dia resumió la activación en el dia 18 en un nivel en el cual la activación se discontinuó en el octavo dia. Después de 7 convulsiones de etapa 5 consecutivas, la activación se descontinuó en los animales de control debido a las consideraciones del bienestar del animal. Los errores se dan como ± SD. Los datos
se analizaron por el ANOVA de dos vías seguido por una prueba Bonferroni; la importancia de la interacción entre los grupos se determinó como F=19.36, P<0.0001; los niveles de importancia de las pruebas individuales se indican: ** P<0.01, *** P<0.001.
La FIG. 9 presenta descargas posteriores durante la adquisición de activación. Los registros EEG representativos se muestran de los recipientes de polímero de control (0 ng) y los recipientes de implante de adenosina (1000 ng) en el 1 y 5 de la activación (que corresponde al día 4 y al día 8 después de la implantación del polímero) . La barra de escala representa el intervalo de estimulación de 10 segundos. Observar la presencia de las' descargas posteriores electrográficas en los recipientes de implante de adenosina. La duración de la descarga posterior (ADD) en el día 1 y 5 de la activación se determinó después de cada estimulación de activación al analizar los registros EEG respectivos. Las ADDs se promediaron durante cada día (n = 6 estimulaciones) y tipo de tratamiento: implantes que liberan dosis objetivo de 0 ng de adenosina (N=7) o 1000 ng (N=5) de adenosina al día. Los errores se dan como ± SD. Los datos se analizaron por el ANOVA; las ADDs no fueron estadísticamente diferentes, P > 0.05.
La FIG. 10 es una micrografía que muestra una sección cerebral coronal teñida con Nissl representativa
veinte dias después del trasplante. Observar que la ubicación de infrahipocampo del polímero de seda y el canal de implantación del electrodo estimulador están localizados en el mismo plano anterior-posterior.
La FIG. 11 es una micrografía que muestra la caracterización de los implantes antes y después de la implantación. Los Paneles (A) y (B) muestran ejemplos del análisis de degradación de Image J (muestra de pre-implante #1, Tabla 1) : se mide el área superficial total de los pixeles (Panel A), luego se mide la suma de las áreas superficiales de todos los poros (Panel B) . El porcentaje de porosidad se calcula al tomar la relación del área superficial del poro sobre el área de implante total. Barras de escala en las imágenes A y B = 300 µ?a. El Panel (C) tinción de violeta de cresilo de . una sección cerebral sagital de una rata representativa en cuatro semanas de posimplantación. El implante de polímero es azul oscuro y se indica con una flecha. Barra de escala = 3 mm. Panel (D) Tinción con hematoxilina y eosina que muestra la morfología del implante de fibroína de seda cargado con adenosina derivada acuosa del infrahipocampo representativo después de 4 semanas. Barra de escala = 300 µ??. Flecha sólida estructura restante.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se debe entender que esta invención no se limita a
la metodología, protocolos, y reactivos particulares, etc., descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología usada en la presente es para el propósito de describir únicamente modalidades particulares y no se propone para limitar el alcance de la presente invención.
Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo indique claramente ^ de otra manera. Diferente a los ejemplos de operación, o donde de otra manera se indica, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en la presente se deben entender como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" .
Todas las patentes y otras publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente a manera de referencia para el propósito de describir, y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían usar en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido se debe interpretar como una admisión de que los inventores no tienen derecho de anteceder tal descripción en virtud de la invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto
a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos se basa en la información disponible de los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la corrección de las fechas o contenidos de estos documentos.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como aquellos comúnmente entendidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos, dispositivos, y materiales conocidos se pueden usar en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales en este aspecto se describen en la presente.
La epilepsia fármacoresistente continúa permaneciendo como un problema de salud mayor. A pesar de la disponibilidad de un arsenal de fármacos antiepilépticos, aproximadamente 30% de todas las epilepsias no se pueden tratar con la fármacoterapia sistémica por una variedad de razones incluyendo fármacoresistencia y efectos secundarios intolerables (Vajda, 14(9) J. Clin. Neurosci. 813-23 (2007)). Por otra parte, los fármacos antiepilépticos actuales hacen poco para prevenir el desarrollo de la epilepsia (es decir, epileptogénesis ) o para modificar la progresión de la enfermedad (Loscher y colaboradores, 23 Trends Pharmacol. Sci. 113-18 (2002)).
En contraste al suministro sistémico, el suministro
de fármacos focal al cerebro carece generalmente de efectos secundarios sistémicos y es una gran promesa para la terapia de la epilepsia, la cual frecuentemente es de origen focal (Nilsen & Cock, 44(2-3) Brain Res. Rev. 141-53 (2004); Pitkanen y colaboradores, 48 (S2) Epilepsia 13-20 (2007); Kohling, 37(4) Klinische Neurophysiologie 216-24 (2006); Duncan y colaboradores, 367(9516) Lancet 1087-100 (2006)) . De esta manera, varias terapias de células y genes están actualmente en desarrollo para el tratamiento de la epilepsia intratable (Lósher y colaboradores, 31(2) Trends Neurosci 62-73 (2008) ; Shetty & Hattiangady, 25(10) Stem Cells, 2396-407 (2007); Raedt y colaboradores, 16(7) Seizure-Eur. J. Epilepsy 565-78 (2007) ; Noe y colaboradores, 28(2) Peptides, 377-83
(2007) ; Boison, 5(2) Current Neuropharmacol. 115-25 (2007)) .
La reciente identificación de la deficiencia de adenosina focal como una causa principal de generación de convulsiones (Li y colaboradores, 118(2) J. Clin. Inv. 571-82
(2008) ; Boison, 84 Prog . Neurobiol. 249-62 (2008) ), proporciona una exposición razonada neuroquimica para las terapias de aumento de adenosina focal (AATs ) . Las AATs focales se pueden lograr al implantar dispositivos o células de liberación de adenosina dentro de la vecindad de un foco epileptogénico (Boison, 4(1) Neurodegener . Dis. 28-33 (2007a) ) . La prueba 'de principio para la eficacia terapéutica de las AATs se ha establecido en modelos animales de
convulsiones inducidas o espontáneas (Li y colaboradores, 2008; Li y colaboradores, 130(5) Brain 1276-88 (2007b); Huber y colaboradores, 98(13) P.N.A.S. EUA 7611-16 (2001); Boison y colaboradores, 160(1) Exp . Neurol . 164-74 (1999). Estos estudios demuestran que las AATs focales pueden suprimir las convulsiones (Huber y colaboradores, 2001; Boison, y colaboradores, 1999) , pero también podrían ser capaces de retardar o prevenir la progresión de la epileptogénesis (Li y colaboradores, 2008; Li y colaboradores, 2007). Además, las AATs focales carecen de efectos secundarios sistémicos y sedantes (Guttinger y colaboradores, 193 Exp. Neurol. 53-64 (2005) ) , y el aumento de la respuesta de adenosina es efectiva en suprimir las convulsiones experimentales que fueron refractarias a los fármacos antiepilépticos estándares (Gouder y colaboradores, 44(7) Epilepsia 877-85 (2003)).
Las propiedades anti-convulsionantes de la adenosina son grandemente mediadas por la activación de los receptores Ai de adenosina (AiRs) que median la mayoría de las funciones protectoras de la adenosina (Fredholrn y colaboradores, 63 Int. Rev. Neurobiol 191-270 (2005a); Fredholrn y colaboradores, 45 Ann . Rev. Phramacol. Toxicol. 385-412 (2005b) ) . Más importantemente, los AiRs previenen la propagación y generalización de las convulsiones, y limitan la muerte celular inducida por convulsión o lesión (Fedele y colaboradores 200 Exp. Neurol. 184-90 (2006); Kochanek y
colaboradores, 26 J. Cereb. Blood Flow Metab. 565-75 (2006)). De esta manera, los AiRs constituyen un objetivo importante para la terapia antiepiléptica; de hecho la activación de AiR previno a convulsiones en un modelo animal que fue resistente a los fármacos antiepilépticos convencionales (Gouder y colaboradores, 2003) .
Adicionalmente , la disfunción de los mecanismos basados en adenosina en la epilepsia, en particular deficiencia de adenosina focal debido a la sobrerregulación de la enzima adenosina cinasa (ADK) removedora de la adenosina basada en astrocitos, se han identificado 'como desencadenadores para la ictogénesis (Boison, 84 Prog. Neurobiol. 249-62 (2008b); Li y colaboradores, 3 Neuton Glia Bio. 353-66 (2007a); Li y colaboradores, 2008). De esta manera, la enzima ADK especifica de astrocitos se ha identificado como un enlace molecular entre la astrogliosis -una marca distintiva patológica del cerebro epiléptico - y disfunción neuronal en la epilepsia (Boison, 3 Future Neurobio. 221-24 (2008a)). Por lo tanto, las AATs constituyen un procedimiento terapéutico racional para prevenir convulsiones al restaurar el equilibrio adenosinérgico . Los estudios _ de trasplante de células sugiere que las AATs podrían combinar propiedades anti-ictogénicas con anti-epileptogénicas (Li y colaboradores, 2007b; Li y colaboradores, 2008), sin embargo con los procedimientos de
tratamiento basados en células no fue posible diseccionar parcialmente los efectos anti-epileptogénicos de los anti-ictogénicos traslapantes de la adenosina, debido a que la anti-ictogénesis de la adenosina basada en células podría enmascarado la anti-epileptogénesis .
A pesar de las AATs potenciales, los problemas permanecen en llevar este procedimiento a la población de pacientes. Por ejemplo, la activación sistémica de los AiRs es de interés terapéutico limitado, debido a los efectos cardiovasculares graves y secundarios sedantes (Dunwiddie & Masino, 24 Ann . Rev. Neurosci . 184-90 (2001)). Y aunque las AATs son de gran promesa para la terapia de las epilepsias focales refractarias, las AATs experimentales usadas previamente no son adecuadas para el desarrollo clínico debido al uso de células animales (Boison y, colaboradores, 2007a) o la duración a muy corto plazo del efecto terapéutico en algunos de los procedimientos (Guttinger y colaboradores, 2005; Guttinger y colaboradores, 46(8) Epilepsia, 1-8 (2005) ) . El desarrollo clínico adicional de las AATs requiere la liberación lenta y sostenida de la adenosina de los implantes cerebrales seguros y biocompatibles . Aunque las terapias de células y genes para la epilepsia se podrían considerar en el futuro, la vía más directa y más segura para el desarrollo de AATs puede implicar implantes cerebrales usados en polímero biocompatible para el suministro sostenido
de adenosina.
Las modalidades presentadas en la presente hacen uso de un sistema de suministro limitado de tiempo basado en la seda novedoso para la adenosina (Wilz y colaboradores, 29 Biomats. 3609-16 (2008)), para estudiar los efectos anti-ictogénicos y anti-epileptogénicos de la ??? focal sin ninguna confusiones que podrían ser causadas por los implantes cerebrales basados en células. La fibroína de seda es un polímero de proteína biológicamente derivado novedoso particularmente bien adecuado para el suministro de fármacos de molécula pequeña debido a su biocompatibilidad (Altman y colaboradores, 24(3) Biomats. 401-16 (2003)), y biodegradación controlable, relativamente lenta (Horan y colaboradores, 26(17) Biomats. 3385-93 (2005); ang y colaboradores, 29 Biomats. 3415-28 (2008)). La seda también se puede procesar bajo condiciones acuosas y ambientales (Jin & Kaplan, 424 Nature 1057-61 (2003); Li y colaboradores 27(16) Biomats. 3115-24 (2006)), dentro de un intervalo diverso de formatos de material (Hofmann y colaboradores, J. Control Reléase, 219-27 (2006) ; Sofia y colaboradores, J. Biomed. Mater. Res. 139-48 (2001); Wang y colaboradores, 21 Langmuir 1 1335-41 (2005); Wang y colaboradores, 28 Biomats. 4161-69 (2007a)). Como se usa en la presente, el. término "fibroína de seda" incluye fibroína de gusano de seda y proteína de seda de insectos o arañas (Lucas y colaboradores,
13 Adv. Protein Chem 107-242 (1958)). La fibroina se puede obtener de una solución que contiene .una seda de gusano de seda o seda de araña disuelta. La proteina de seda de gusano de seda se obtiene, por ejemplo, de Bombyx morí, y la seda, de araña se obtiene de Nephila clavipes . Alternativamente, las proteínas de seda adecuadas puede ser seda genéticamente diseñada, tal como se expresa en las bacterias, levadura, células de mamífero, animales transgénicos o plantas transgénicas . Ver, por ejemplo, WO/2008/118133; WO 97/08315: patente norteamericana No. 5,245,012.
Un intervalo diverso de formatos de material se puede generar a partir de la fibroína de seda, que presenta varias opciones para suministrar moléculas pequeñas usando sistemas de matriz de proteína de seda. El control adicional de la liberación del fármaco de los biomateriales de seda se puede lograr por la vía de la regulación del contenido de ß-lámina (Hofmann y colaboradores 2006) y la integración de múltiples formatos portadores dentro de un implante (Wilz y colaboradores, 2008). La seda se ha explorado como un vehículo para el suministro de fármaco en la forma de películas atrapadoras de fármacos (Hofmann y colaboradores, 111(1-2) J. Control Reléase 219-27 (2006)), como microesferas encapsuladoras de fármaco, y por la vía deposición o recubrimientos de nanopelícula de sea' y fármacos (Wang y colaboradores, 2007a; Wang y colaboradores, 21(24) Langmuir
11335-41 (2005) ) . Los péptidos y proteínas también se han acoplado previamente de manera química a la fibroína de seda usando la química de carbodiimida (Sofia y colaboradores, 54(1) J. Biomed. Mater Res. 139-48 (2001); Karageorgiou y colaboradores, 71(3) J. Biomed. Mater. Res. A 528-37 (2004)). Además, el uso frecuente de suturas de seda en el cerebro y el tejido nervioso confirma la viabilidad del implante de los biomateriales de seda en el cerebro. Por ejemplo, se ha demostrado la seguridad y eficacia relativa de las suturas de seda para la malformación arteriovenosa (AVM) y la embolización endovascular pre-operativa (Dehdashti y colaboradores, 11(5) Neurosurg Focus e6 (2001); Schmutz y colaboradores, 18(7) AJNR Am. J. Neuroradiol. 1233-37 (1997). La combinación de diferentes puntos de tiempo del implante del polímero ' con los paradigmas de activación diferentes permitió la investigación de los efectos anti-ictogénicos y anti-epileptogénicos por la vía del suministro de adenosina basada en seda.
Como se observa anteriormente, la versatilidad en la manipulación de la estructura de la proteína de seda y la morfología sugiere opciones de suministro novedosas potencialmente aplicable al suministro de adenosina. Debido a que cada forma de seda tiene su propio perfil de liberación que se puede modular por la vía de las condiciones de procesamiento, el nivel de control de la liberación de¦
fármacos de molécula pequeña se puede aumentar por la integración de múltiples formatos portadores dentro de un dispositivo o sistema, tal como combinaciones de recubrimientos ultradelgados, microesferas, y películas de seda de macroescala. El sistema a la mano proporciona varias estrategias para un procedimiento de suministro de material de proteína jerárquicamente estructurada, a escala para orquestar el control del suministro de adenosina. El potencial terapéutico de estos dispositivos de A7AT novedosos fue validado en el modelo de activación de rata, en el cual el desarrollo de convulsiones progresivas se estudio y se cuantificó como una función de diferentes proporciones de liberación de adenosina.
Al buscar alternativas terapéuticas para pacientes que sufren de epilepsia farmacoresistente, se han desarrollado y se han sometido a prueba varios procedimientos novedosos. Estos incluyen estimulación eléctrica y magnética (Wyckhuys y colaboradores, 48(8) Epilepsia 1543-50 (2007); Sun y colaboradores, 5(1). Neurotherapeutics, 68-74 (2008); ilby y colaboradores, 5 ( 1 ) Neurotherapeutics 75-85 (2008); Liebetanz y colaboradores, 47(7) Epilepsia 1216-24(2006)); enfriamiento focal (Yang y colaboradores, 23(3) Neurobiol Dis. 637-43 (2006)); terapia celular (Loscher y colaboradores, 2008; Shetty & Hattiangady, 2007; Thompson, 133(4) Neurosci. 1029-37 (2005); Carpentino y colaboradores,
86(3) J. Neurosci. Res. 512-24 (2008)); terapia de genes (Vezzani A. 7(12) Expert Rev. Neurother. 1685-92 (2007); Foti y colaboradores, 14(21) Gene Ther. 1534-36 (2007) ; McCown, 14(1) . Mol Ther. 63-68 (2006); Raol y colaboradores, 26(44) J. Neurosci. 11342-46 (2006)); y dieta cetogénica (Masino & Geiger, Trends Neurosci. 2008 in press; Stainman y colaboradores, 16(7) Seizure, 615-19 (2007)) . Por consiguiente, las modalidades de la presente invención incluyen métodos para tratar la epilepsia, que incluye de otra manera epilepsia fármacoresistente .
Se ha discutido una disposición razonada neuroquímica para las AATs focales, y algunos de los procedimientos terapéuticos alternativos se basan en el aumento de adenosina: la adenosina se libera como una consecuencia de la estimulación del cerebro profundo (Bekar y colaboradores 14(1) Nature Med. 75-80 (2008) ), y se puede implicar en los efectos terapéuticos de la dieta cetogénica (Masino & Geiger, 2008) . De esta manera, las AATs focales son de gran promesa para el tratamiento de la epilepsia parcial fármacoresistente . La exposición - razonadas terapéutica indica'da anteriormente impulsó el desarrollo de una AAT novedosa, compatible con la aplicación clínica futura. El procedimiento presentado en la presente combina dos materiales aprobados por la FDA - seda y adenosina - para desarrollar un implante cerebral biocompatible para el
suministro focal de adenosina.
Los resultados in vitro presentados en la presente sugieren que los dispositivos de proteína de seda jerárquicamente diseñados, combinados se pueden generar para lograr generar para lograr velocidades de suministro controlables de adenosina. Todos los implantes 'Continuaron liberando adenosina durante por lo menos catorce días, con velocidades de liberación promedio cercanas a las velocidades de liberación objetivo. Las velocidades de liberación promedio fueron ligeramente más bajas que sus velocidades objetivo, probablemente el resultado de los implantes que liberan menos que la carga de fármaco completa dentro de catorce días. Todos los implantes tuvieron velocidades de liberación inicial altas, pero estas velocidades disminuyeron durante catorce días. Esto puede ser el resultado de la liberación "repentina" inicial que es característico de muchos sistemas de suministro, pero existen varias estrategias potenciales para retardar la liberación repentina y prolongar la liberación y lograr una cinética de orden cercana a cero.
En los estudios, los recubrimientos de las microesferas de seda (Wang y colaboradores, 2007a) ; y el acoplamiento químico a la seda (Trayer y colaboradores, 139(3) Biochem. J. 609-23 (1974)), se exploran como estrategias para ganar el control adicional del proceso.
Experimentos de liberación sugieren que incrementar el número de capas de cobertura de seda, la cristalinidad de la seda, y el incremento del espesor de la nanopelicula puede disminuir la velocidad de la liberación del fármaco. La investigación que se correlaciona con las relaciones fundamentales entre las características de material (por ejemplo, condiciones de procesamiento, cristalinidad, espesor . de la capa) a la cinética de liberación, mejora los modelos predecibles y mayor control de las velocidades de liberación del fármaco.
Los resultados in vivo presentados en la presente demuestran que la liberación de adenosina focal de los polímeros basados en seda es efectiva en retardar la epileptogénesis de activación de una manera dependiente de dosis. Este procedimiento único combinó polímeros diseñados para liberar dosis objetivo especificadas (0 ng, 40 ng, 200 ng, y 1,000 ng de adenosina al día) durante un período de catorce días limitado con un paradigma de epileptogénesis de activación prolongado a veinte días después del implante del polímero para documentar la progresión de activación después de la expiración de los polímeros activos. En particular, la relación recíproca de la declinación progresiva en la liberación de adenosina con el incremento progresivo en el desarrollo de activación permitió la delineación de las relaciones de dosis-respuesta.
Este único procedimiento de suministro de adenosina
permitió las siguientes conclusiones, las cuales van más allá de los resultados obtenidos de las AATs previas:
(i) Estimación de dosis efectiva: Los primeros signos de desarrollo de activación (por ejemplo, registros de convulsiones de comportamiento) se presentan típicamente con un retardo de una sesión comprendida de seis estimulaciones. De estas manera, los recipientes de implantes de control muestran los primeros, signos de activación durante la sesión 2 (FIG. 4); esto implica que la epileptogénesis de activación se inicia en la sesión (es decir, en la dosis relevante de la adenosina liberada en ese tiempo) precediendo los primeros signos de activación. Consecuentemente, los primeros signos de activación se presentaron con un retardo dependiente de dosis de aproximadamente una sesión en el grupo de control (estimulación " #6) , dos sesiones en el grupo 40 ng (estimulación #10), tres sesiones en el grupo de 200 ng (estimulación #16) , y cuatro sesiones en el grupo de 1000 ng (estimulación #24) (FIG. 4A) .
La dependencia de dosis cercana también se refleja en el número promedio de estimulaciones necesarias para inducir la primera convulsión de etapa 1 o etapa 2 (FIG. 4) y sugiere una relación de dosis-respuesta lineal. Debido a que los experimentos se diseñaron para prolongar la activación después del cese de la liberación de adenosina de los polímeros, los datos de liberación de adenosina in vitro
paralelos (Tabla 3) permitió la determinación de la dosis efectiva mínima necesaria para retardar el inicio de la activación. Esto se vuelve más evidente en los recipientes de una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina al día. Estos animales continuaron siendo protegidos de cualquier actividad de convulsión durante las primeras 23 estimulaciones (es decir, durante la sesión 1 a 4) (FIG. 4) . Las primeras •convulsiones ocurrieron durante la sesión 5; tomando en consideración el retardo de una sesión para detectar las convulsiones de comportamiento, mostraron que la epileptogénesis de activación se inició durante la sesión 4, que corresponde al onceavo día después del implante del polímero. En ese tiempo los polímeros liberaron aproximadamente 200 ng de adenosina al día (Tabla 3) .
Los cálculos similares realizados en los recipientes de las dosis objetivo de 40 ng y 200 ng de adenosina al día indicaron que la epileptogénesis de activación se inició tan pronto como las velocidades de liberación diarias de adenosina descendieron abajo de 50 ng a 100 ng de adenosina (FIG. 4, Tabla 3) . Estos cálculos permitieron la estimación de la dosis efectiva mínima que está en el intervalo de 50 ng a 200 ng de adenosina al día. Estos datos están de acuerdo con los experimentos de trasplante de células previos, en los cuales las velocidades de liberación de adenosina de aproximadamente 20 ng a 40 ng
de adenosina liberada de 105 células fue suficiente para suprimir las convulsiones activadas (Huber y colaboradores 2001 ; Güttinger y colaboradores, 2005) . Observar que las altas dosis de adenosina (>2000 ng de adenosina al día) parecieron que son bien toleradas, sin ningunos cambios de comportamiento serios de los animales.
(ii) Efecto anti-epileptogénico posible: La adquisición de activación ocurre con un retardo dependiente de dosis pero en la misma velocidad de activación (es decir, progresión en la. gravedad de la convulsión) . Esta observación sugiere qué la adenosina derivada de implante podría prevenir la epileptogénesis . El diseño experimental único presentado en la presente, se limita la liberación de adenosina a catorce días (que corresponde a la sesión 1 a 5) , pero que prolonga la activación a veinte días (que corresponde a la sesión 8) permitió resumir la activación después de la expiración de los polímeros. Las etapas de convulsiones reducidas (FIG. 4) combinadas con la presencia pero de duración reducida de las ADDs (FIG. 7) en los recipientes de implante de liberación de adenosina durante las etapas tempranas de la activación podrían tener dos explicaciones alternativas: supresión de convulsiones, sin embargo la supresión de la convulsión puede enmascarar · la epileptogénesis en curso; o prevención de la epileptogénesis. En el primer caso, si las convulsiones se suprimieron
simplemente por la adenosina derivada de injerto y la epileptogénesis se enmascaró por la supresión de convulsiones, el cese de la liberación de adenosina de los polímeros implicaría una elevación rápida, repentina en la gravedad de la convulsión. Esto claramente no es el caso, sin embargo, como se muestra en ¦ la FIG. 4. En cambio, la velocidad de adquisición de activación no se cambió en los recipientes de los polímeros de liberación de adenosina. De esta manera, el desarrollo de la activación en los recipientes de una dosis objetiva de 1,000 ng al día procedió' en la misma velocidad' como el desarrollo de activación en los animales de control (FIG. 4), pero con un retardo en el inicio de la activación. Estos datos sugieren que el suministro basado en polímero focal de la adenosina podría prevenir la epileptogénesis. Es importante notar que las descargas posteriores que son consideradas como el estímulo "epileptogénico" no se suprimen por la adenosina derivada de implante. La interpretación de estos datos es consistente con la atribución de los efectos anti-epileptogénicos a la adenosina cerebral incrementada.
Las presentes modalidades se diseñaron para estimar cuidadosamente las propiedades anti-ictogénicas y anti-epileptogénicas de la aumentación de adenosina focal en el cerebro de rata activado después del implante de los polímeros basados en seda que liberan una dosis definida,
constante de adenosina durante un tiempo limitado. Con base en el estudio de dosis-respuesta descrito en la presente (ver también ilz y colaboradores, 2008) los polímeros que liberan una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina al día se seleccionaron para análisis adicionales. Las terapias de aumento de adenosina focal (AATs) se basan en la exposición razonada neuroquímica de que la disfunción del sistema de adenosina es una marca distintiva neuropatológica de la epilepsia y un factor de contribución para la generación de convulsiones (Boison, 3 Future Neurol . 221-24 (2008a); Boison, 84 Prog. Neurobiol. 249-62 (2008b); Dulla y colaboradores, 48 Neuron, 1011-23 (2005); Li y colaboradores, 118 J. Clin. Invest. 571-82 (2008); Rebola y colaboradores, 18 Eur. J. Neurosci. 820-28 (2003)).
Notablemente, la AAT fue efectiva en suprimir las convulsiones en ratones que fueron refractarios a los fármacos antiepilépticos estándares tal como la carbamazepina, valproato, y fenitoína (Gouder y colaboradores, 44 Epilepsia 877-85 (2003) ) . La adenosina ejerce sus efectos antiepilépticos en gran medida por la activación de los receptores Ai de adenosina pre- y pos-sinápticos que se acoplan a las proteínas g inhibidoras, disminuyen la liberación de glutamato pre-sináptico, estabilizan el potencial de la membrana pos-sináptica, e inhiben la adenilil ciclasa (Fredholm y colaboradores, 63
Int'l Rev, Neurobiol . 191-270 (2005a); Fredholm y colaboradores, . 45 Ann. Rev. Pharma. Toxicol, 385-412 (2005b) ) . La activación de receptor Ai no solo suprime eficientemente las convulsiones (Jacobson & Gao, 5 Nat. Rev. Drug Discov. 247-64 (2006) ) , sino también mantiene esencialmente un foco epileptogénico localizado (Fedele y colaboradores, 200 Exp. Neurol. 184-90 (2006)). Con base en estas observaciones la activación del receptor Ai podría combinar los efectos anti-ictogénico con los anti-epileptogénicos . Debido a los efectos secundarios periféricos de la activación del receptor Ai sistémico (Guttinger y colaboradores, 193 Exp. Neurol. 53-64 (2005)), las AATs focales se vuelven una necesidad.
Los procedimientos focales para la terapia de epilepsia en general son bien tolerados y carecen de efectos secundarios indebidos (Nilsen & Cock, 44 Brain Res. Rev. 141-53 (2004)), e incluyen terapias de células (Boison, 5 Curr. Neuropharmacol . 115-25 (2007b); Loscher y colaboradores, 31 Trends. Neurosci. 62-73 (2008); Raedt y colaboradores, Seizure-Eur. J. Epilepsy 565-78 (2007); Shetty & Hattiangady, 25 Stem Cells 2396-407 (2007)), y terapias de genes (Foti y colaboradores, 14 Gene Ther. 1534-36 (2007); McCown, 4 Expert Op. Biologic. Ther. 1 171-76 (2004); Raol y colaboradores, 26 J. Neurosci. 11342-46 (2006); Vezzani, 7 Expert Rev. Neurother. 1685-92 (2007)). Las presentes modalidades
proporcionan el uso terapéutico de los polímeros basados en seda diseñados para liberar adenosina, como una alternativa terapéutica clínicamente viable para lograr la AAT focal con objetivos combinados de anti-ictogénesis y anti-epileptogénesis .
Las presentes modalidades proporcionan el potencial anti-ictogénico de la adenosina liberada por la vía del biopolímero de seda. Las propiedades anti-ictogénicas de la adenosina son bien establecidas (Boison, 2007a) . De esta manera, la inyección focal directa de la adenosina previno convulsiones en ratas (Anschel y colaboradores, 190 Exp. Neurol. 544-47 (2004)), y los implantes intraventriculares de células liberadoras de adenosina encapsulada, proporcionan una supresión consistente de convulsiones en ratas activadas (Boison, 2007a) . Los procedimientos de terapia de células basados en células de roedor no son aceptables para procedimientos terapéuticos futuros debido a que implican el xenoinjerto. Además, los procedimientos basados en células pueden impedir los estudios de respuesta de dosis detallados. Como una primera etapa para desarrollar una AAT novedosa que sea compatible con aplicaciones clínicas futuras dos compuestos aprobados por la. FDA, seda y adenosina, se combinaron dentro de un sistema de suministro focal biodegradable, biocompatible para la adenosina. Usando este tipo novedoso de polímeros se realizó un estudio de dosis-
respuesta que demostró la retardación dependiente de dosis (velocidades de liberación objetivo de 0, 40, 200, y 1000 ng de adenosina al dia) del desarrollo de activación en ratas (Wilz y colaboradores 2008) .
Un ejemplo particular de la presente invención proporciona una formulación en la cual los implantes de liberación de adenosina pueden suprimir las convulsiones totalmente activadas y el efecto anti-ictogénico y diferencial el efecto anti-epileptogénico : polímeros basados en seda que liberaron una dosis constante de aproximadamente 1000 ng de adenosina al día desde el día hasta el día diez, antes de declinar gradualmente a niveles no detectables de adenosina (FIG. 3). Los polímeros se diseñaron para liberar adenosina durante un tiempo limitado para estimar específicamente las respuestas de convulsiones después de la expiración de la liberación de adenosina. Los ejemplos posteriores demuestran la supresión completa de las convulsiones totalmente activadas durante los primeros diez días del implante o del polímero (FIG. 6) en línea con el perfil de liberación específico de los polímeros (FIG. 3). Importantemente, las convulsiones comienzan a recurrir durante la expiración de la liberación de adenosina de los polímeros (desde el día catorce hasta el día veintiuno) . Este descubrimiento es de importancia por dos razones: (i) la recurrencia de las convulsiones después de la expiración de
la liberación de adenosina de los polímeros indica que la supresión de convulsiones depende de la adenosina derivada de implante; (ii) la igualación precisa de la efectividad terapéutica con las propiedades de liberación del polímero es un pre-requisito para los estudios de anti-epileptogénesis presentados en la presente.
Varios estudios recientes sugirieron una función anti-epileptogénica novedosa de las AATs focales: (i) ambos, derivados de células madre (Li y colaboradores, 2007b) , así como también basados en polímero de seda (Wilz y colaboradores, 2008) (descritos en la presente), implantes del infrahipocampo diseñados para aumentar la adenosina del hipocampo retardaron la progresión de la epileptogénesis de activación en ratas, (ii) en un modelo de ratón de la epileptogénesis selectiva de CA3 que incluye astrogliosis y sobrerregulación de ADK como marcas distintivas patológicas de la epileptogénesis, los implantes de liberación de adenosina derivados de células madre del infrahipocampo redujeron la astrogliosis, previnieron la sobrerregulación de ADK, y la ocurrencia de convulsiones espontáneas; en particular, el efecto anti-astrogliótico de estos implantes basados en células se puede interpretar como un efecto anti-epileptogénico .
De esta manera, se diseñó' una modalidad específica para someter a prueba los posibles efectos anti-
epileptogénicos de la adenosina derivada de implante. Para lograr este objetivo se diseñaron polímeros basados en seda diseñados para liberar una cantidad estable de adenosina durante un marco de tiempo limitado (1000 ng de adenosina al día por hasta diez días) . Se diseñaron dos procedimientos dependientes para demostrar la anti-epileptogénesis por estos implantes; en ambos procedimientos los polímeros se implantaron antes del inicio de la activación. En un ejemplo, los recipientes de implante se activaron cada dos días desde el día cuatro hasta el día once (que corresponde un total de veinticuatro estimulaciones) . Comparados con los recipientes de implante de control, los recipientes de implante de liberación de adenosina sé caracterizaron por la retardación marcada en la expresión de las convulsiones activadas (FIG. A) . En este punto de tiempo, el DPCPX no logró incrementar los registros de convulsiones en los recipientes de implante de liberación de adenosina indicando que la falta de registros de convulsiones más altos no fue debido a la supresión de la convulsión basada en adenosina. Estos descubrimientos demostraron un efecto anti-epileptogénico de los implantes cerebrales de liberación de adenosina. Se diseñó otro procedimiento para iniciar la activación durante la fase de liberación alta constante de adenosina (1000 ng al día de los días cuatro a ocho) (FIG. 3) , y para resumir la activación después de un período de retardo de nueve días, un
marco de tiempo durante el cual la liberación de adenosina de los polímeros había expirado. Este paradigma experimental es adecuado para cuantificar el grado de antiepileptogénesis (Silver y colaboradores 1991) .
Los fármacos que no tienen cualquiera de los efectos anticonvulsivos (por ejemplo, carbamazepina , Silver y colaboradores, 1991) dan por resultado la igualación de curvas de activación entre los grupos de control y tratamiento, tanto durante como después de la fase de fármaco. De esta manera, la carbamazepina no afectó el desarrollo de la activación durante la fase de fármaco. Los fármacos que tienen efectos anti-epileptogénicos parciales (por ejemplo, fenobarbital , Silver y colaboradores, 1991) exhiben supresión del desarrollo de la activación durante la fase de fármaco y resumen el desarrollo de activación en la misma etapa en la cual la activación se descontinúa. En el caso del fenbarbital, sin embargo, se redujo el número de descargas posteriores en fármacos necesarias para inducir etapas de convulsiones que corresponden al grupo de control, indicando antiepileptogénesis parcial. Los fármacos que ejercen efectos anti-epileptogénicos completos (por ejemplo, valproato, Silver y colaboradores, 1991) exhiben supresión del desarrollo de activación durante la fase de fármaco, resumen la activación después de la discontinuación del fármaco en la misma etapa como antes de la discontinuación
del fármaco, pero los números de descargas posteriores · en fármaco para inducir convulsiones correspondientes en los animales tratados con fármaco y de control es la misma.
De acuerdo con estas consideraciones, los datos (FIG. 8B) demuestran la supresión casi completa del desarrollo de la activación durante las primeras 24 estimulaciones de activación en recipientes de implantes liberadores de adenosina. Después de la 30ava estimulación suministrada en el octavo día, los recipientes de los implantes liberadores de adenosina aun se protegieron fuertemente con registros de convulsiones de aproximadamente uno. Al mismo tiempo, los recipientes de los implantes de control se activaron completamente. Cuando la activación se resumió en el octavo día, los recipientes de implante liberadores de adenosina aun se protegieron, y en la ausencia de la adenosina derivada . de implante desarrollaron gradualmente convulsiones activadas. La progresión del desarrollo de convulsiones en estos animales estuvo en paralelo con el desarrollo de la activación en los animales de control, sin embargo, se redujo el número de descargas posteriores en fármacos necesarios para inducir las etapas de convulsiones que corresponden a aquellos en los animales de control. De acuerdo con las consideraciones de McNamara las investigaciones de los investigadores demuestran que la liberación transiente de la adenosina durante las primeras
sesiones de activación (día cuatro al día ocho proporcionaron la prevención parcial de la epileptogénesis . Si la falta de convulsiones durante ese tiempo fue debido a la supresión de convulsiones basada en adenosina (enmascaramiento de la epileptogénesis) , entonces los animales debían haber reaccionado con convulsiones de etapa 5 de acuerdo con los animales de control en el octavo día. Observar que a pesar de la falta -de convulsiones de comportamiento, se indujo siempre una descarga posterior electrográfica aún en recipientes de implantes de liberación de adenosina (FIG. 9), que indica que los animales se activaron con estimulaciones supra-umbral que se esperan que suministren un desencadenamiento relevante de la epileptogénesis.
Los mecanismos benéficos como el aumento crónico de la adenosina cerebral, como se logra por los implantes descritos en la presente, podrían contribuir por lo menos parcialmente a la prevención de la epileptogénesis necesaria para ser distinguida de los mecanismos de aumentos agudos en la adenosina a niveles micromolares (Fredholm y colaboradores, 2005a) como una respuesta a la lesión que se cree que desencadena la astrogliosis (Boison, 2008b) . Las diferencias mecanísticas para oponerse a los efectos corriente abajo de los incrementos basados en implante crónicos en adenosina, contra los incrementos de alto nivel agudos en la adenosina durante la lesión cerebral, están
siendo inducidas.
Se pueden implicar varios mecanismos: (a) El incremento moderado en los niveles de adenosina logrados por los implantes cerebrales podría ser insuficiente para desencadenar cambios de expresión receptores sobre los astrocitos y podrían activar preferentemente los receptores Ai astrocíticos , y de esta manera promueven los efectos anti-epileptogénicos por la vía de la modulación de astrocitos; (b) En contraste, los altos niveles agudos de adenosina inhiben la adenosina cinasa (Mimouni y colaboradores, 269 J. Biol. Chem. 17820-25 (1994)), de esta manera los altos niveles de adenosina después de la lesión aguda podrían desencadenar la sobrerregulacion de la adenosina cinasa como un mecanismo compensatorio enlazado a la epileptogénesis (Li y colaboradores, 2008); y (c) Un aumento agudo en la adenosina a niveles micromolares (es decir, como ocurres después de la lesión o durante el estado epiléptico prolongado) podría conducir a cambios en los receptores de adenosina astrocíticos, más notablemente regulación hacia abajo de los receptores Ai implicados en la regulación de la proliferación de astrocitos; cambios en los receptores de adenosina astrocíticos luego podrían desencadenar la astrogliosis como parte de la cascada epileptogénica .
El potencial terapéutico de los polímeros liberadores de adenosina biodegradables se demuestra en la
presente. La degradación de las estructuras demostradas en la presente (FIG. .11; Tabla 4) sugiere la presencia de proteasas degradadoras de seda en el cerebro de ratas. Por ejemplo, la quimotripsina se ha mostrada que degrada la seda (Li y colaboradores, 2003) y se han identificado una variedad de proteasas similares a la quimotripsina en el cerebro de 'ratas. Caldecrin (una proteasa similar a la quimotripsina) se demostró que se expresa dentro del hipocampo del cerebro de rata adulto (Tomomura y colaboradores, 317 Neurosci. Lett. 17-20 (2002)). Las proteasas especificas implicadas en el proceso y modos para regular la vida de degradación de este tipo de implante se puede caracterizar adicionalmente . La biodegradabilidad de los implantes poliméricos basados en seda demostraron en la presente que constituye una ventaja principal para el uso preventivo de este tipo de implante cerebral. Los efectos anti-epileptogénicos parciales de las estructuras de seda liberadoras de adenosina como está previsto en la presente permiten el uso preventivo de tales implantes en los pacientes de alto riesgo en desarrollar epilepsia, por ejemplo, después de la lesión cerebral traumática. De esta manera, las estructuras de liberación de la adenosina basadas en seda se podrían implantar dentro de un área cerebral traumatizada poco después de la lesión, haciendo uso sinérgico de las propiedades neuroprotectoras (Cunha, 1 Purinergic Signaling 1 11-34 (2005)), anti-
ictogénicas, y anti-epileptogénicas posibles de la adenosina. El suministro sostenido de la adenosina podría mejorar el resultado terapéutico en estos pacientes y eventualmente el polímero se degradaría completamente y se reabsorbería sin dejar ningunos residuos.
Varias de las presentes modalidades proporcionan liberación de adenosina durante una ventana de tiempo restringida. Este diseño específico del implante permitió la evaluación de efectos anti-epileptogénicos posibles de la adenosina y demostración de la supresión de convulsiones en ratas completamente activadas. Los presentes datos, pero también aguellos derivados de otros estudios (Li y colaboradores 2007a; Li y colaboradores, 2007b; Li y colaboradores, 2008; ilz y colaboradores, 2008), sugieren efectos anti-epileptogénicos por lo menos parciales de las AATs focales. Estudios adicionales, que incluyen estudios de dosis-respuesta y el uso de diferentes modelos de epileptogénesis , tratan adicionalmente los efectos anti-epileptogénicos de la adenosina.
Las actuales modalidades soportan el diseño de implantes de supresión de convulsiones a largo plazo. Para la supresión de convulsiones a largo plazo, el diseño de los implantes se puede modificar para permitir el suministro a largo plazo sostenido de la adenosina. Las matrices porosas 3D se pueden procesar para funcionar in vivo desde semanas a
un año o más dependiendo del modo de procesamiento (Wang y colaboradores, 117 J, Control Reléase, 360-70 (2007b) ) . Por ejemplo, debido a su capacidad de atrapamiento excelente, las microesferas basadas en MeOH proporcionan un suministro de fármacos a largo plazo- (WO/2008/118133). Adicionalmente, la liberación de la adenosina se puede controlar al atrapar la adenosina no únicamente en la matriz 3D, sino en las capas de seda que circundan la matriz, por la vía de inducir la transición a la ß-lámina (por ejemplo, flujo de metanol, de esfuerzo cortante, sales, eléctrico, gas deshidratado) y adicionar capas sobre esta, con cada capa que atrapa la siguiente dosis de adenosina. El procedimiento de capa por capa produce unas estructuras similares a cebolla con carga selectiva en cada capa. Además, la longitud de la inducción de la ß-lámina en cada capa se puede manipular para efectuar la liberación de explosión y la liberación sostenida. Adicionalmente, una o más capas que no contienen adenosina adicionada (capa de barrera) se pueden depositar sobre las capas que contienen la adenosina para controlar la liberación y/o limitar la explosión inicial. El espesor de cada capa depositada se puede afectar al controlar la concentración de fibroina en la solución de fibroina de seda, o el pH de la solución de fibrina usada para formar la capa. Se pueden producir capas que pueden ser de .1 nm a varios m de grueso. De esta manera, el número de capas, el espesor de las capas,
y la inducción de la estructura de ß-lámina en las capas, y la .concentración de la adenosina en cada capa se puede diseñar para producir un perfil de liberación deseado (WO 2005/123114; WO 2007/016524).
Otra modalidad de la presente invención proporciona la prevención o tratamiento de la epilepsia en un sujeto, que incluye un sujeto humano, al implantar una composición de liberación de adenosina basada en fibroina de seda directamente dentro del cerebro del sujeto. La dosificación y régimen terapéutico más apropiado para el tratamiento del sujeto variará por supuesto con la enfermedad o condición que se trata, y de acuerdo con el tamaño del hipocampo del sujeto y otros parámetros. La dosis de adenosina del implante puede ser de aproximadamente 50 ng de adenosina al día a aproximadamente 50 mg de adenosina al día, inclusive, tal como 25 ng de adenosina al día o 250 ng de adenosina al día, dependiendo del tamaño del hipocampo del sujeto, el tamaño del foco epiléptico y en el sitio de implantación. Por ejemplo, se puede requerir una dosis más baja si el implante se coloca directamente dentro del foco epiléptico; se puede requerir una dosis más alta si el implante se coloca dentro del sistema ventricular en la vecindad del foco epiléptico.
La duración de tiempo sobre el cual la adenosina se suministra puede ser de aproximadamente un mes a arriba de un año, inclusive. Por ejemplo, el suministro a corto plazo, por
ejemplo, un mes después de un evento de desencadenamiento de la epileptogénesis , tal como una lesión cerebral traumática, puede prevenir la' epileptogénesis. Debido a que la epilepsia es típicamente una enfermedad permanente, se puede usar un sistema de implante terapéutico para proporcionar un control de convulsiones durante la vida de un sujeto. De esta manera, una modalidad de la presente invención proporciona un sistema de implante en el cual el implante de adenosina de fibroína de seda suministra adenosina durante aproximadamente un año, después de lo cual cualquier estructura expirada se remueve y se reemplaza con un implante reciente, el sistema que se puede lograr por la vía de catéteres permanentemente implantados .
De esta manera, por ejemplo, en el caso de la lesión cerebral traumática (TBI) en un hombre adulto, como un resultado directo de la TBI existirá una cavidad p núcleo de tejido muerto que se puede diagnosticar por la tecnología de formación de imágenes actuales. Este núcleo y su vecindad cicatrizarán eventualmente (dentro de aproximadamente dos semanas) y se desarrollará dentro de un foco de actividad de convulsiones. Este núcleo de la lesión, antes que el sistema ventricular, es el sito lógico para el implante. El implante puede ser aproximadamente esférico, con un diámetro de aproximadamente 0.5 cm, liberando entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 10 mg de adenosina al día durante un
período de tiempo de aproximadamente un mes.
Para la ATT a largo plazo, un procedimiento quirúrgico sería colocar un implante dentro del ventrículo que hace contacto con el hipocampo afectado. En esta modalidad, un implante dimensionado a aproximadamente 1 x 3 x 5 mm se ajustaría dentro del espacio; si su forma podría ser ligeramente cóncava, tal que forma una "capa" de implante de liberación de adenosina que toca el hipocampo, suministrado aproximadamente 200 ng a aproximadamente 5 mg de adenosina al día. Por consiguiente, las formulaciones de liberación sostenida de adenosina se implantan en sujetos para reducir o mejorar los síntomas asociados con la epilepsia. Los puntos finales terapéuticos para el tratamiento de la epilepsia incluyen una reducción de los parámetros de enfermedad tal como frecuencia de convulsiones, gravedad de las convulsiones y anormalidades EEG.
En otra modalidad de la invención, las estructuras basadas en seda, adenosina se pueden combinar con células madre mesenquimales humanas (hMSCs) diseñadas para liberar adenosina (patente norteamericana No. 6,110,902; WO 2007/016524) . Por ejemplo, se ha demostrado un método lentiviral basado en RNAi para diseñar hMSCs para la liberación de adenosina terapéutica (Ren y colaboradores 208 Exp. Neurol. 26-37 (2007)). Los implantes del infrahipocampo de estas células redujeron el ácido caínico agudo inducido
por lesión cerebral y convulsiones (id). Adicionalmente, las hMSCs tomadas de un paciente y diseñadas para liberar adenosina se pueden usar como implantes cerebrales autólogos en combinación con las estructuras basadas en seda biodegradables de la presente invención. Tales estructuras cargadas con MSC proporcionan una actividad terapéutica de adenosina permanente.
En. conclusión, las modalidades descritas en la presente proporcionan un sistema de suministro basado en seda novedoso para la adenosina que cumple los requerimientos cruciales para la aplicación clínica futura, tal como: (i) biocompatibilidad, (ii) suministro de dosis predeterminadas de adenosina, (iii) seguridad, (iv) función sostenida por la vía de la degradación lenta in vivo, y (v) eficacia terapéutica en un modelo preclínico ampliamente usado (modelo de activación de rata) que tiene un valor predictivo alto en el desarrollo del fármaco. Adicionalmente, la presente invención define por primera vez una dosis mínimamente efectiva en el intervalo de 50 ng a 200 ng de adenosina al día, y sugiere que el suministro focal de la adenosina podría no tener únicamente valor terapéutico para la supresión de convulsiones establecidas, sino también para la prevención de la epileptogénesis .
La invención ahora se describirá adicionalmente por ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño del Implante
Los implantes diseñados para suministrar las dosis objetivo (0 ng, 40 ng, 200 ng, y 1 , 000 ng al día) se diseñaron con base en experimentos preliminares para determinar la carga de fármaco. Los implantes también se diseñaron para dividir la carga de fármaco objetivo aproximadamente de manera uniforme entre los tres sistemas seleccionados para la integración en el estudio, microesferas , de macroescala y nanopeliculas . Las tres variables usadas para impactar la dosis de adenosina final fueron: (1) la concentración de microesferas en la solución de seda que se formó dentro de las estructuras porosas, basadas en agua, (2) la concentración de adenosina en la solución de adenosina más seda que las estructuras porosas se recubrieron con la misma para formar las películas de seda de macroescala, y (3) el número de capas de las nanopeliculas depositadas sobre el sistema. La composición de los implantes y las cantidades teóricas de la adenosina cargada por la vía de cada técnica se listan en la Tabla 1.
Tabla 1. Composiciones de implante y carga con adenosina. El número de nanopeliculas incluye tanto una película de seda como la nanopelícula de adenosina subsecuente . Ado = adenosina
Nanopeliculas Microesferas Película de Ado
macroescala total
Número de Ado Conc . de Ado Conc. de Ado cargado nanopeliculas total microesferas total microesferas total para el cargado en la cargado en la cargado implante solución de solución de completo seda seda
40ng/dia 3 250ng lOmg/mL 160ng 0.06mg/raL 150ng 560ng
200ng/dia 12 1, OOOng 50mg/mL 800ng 0.4mg/mL 1, OOOng 2, 800ng
1, OOOng/dia 36 3, OOOng 250mg/mL 4, OOOng 2.8mg/mL 7, OOOng 14, OOOng
Ejemplo 2, Fabricación del Implante
El proceso de fabricación del implante se representa en la FIG. 1. La seda para el estudio se preparó de capullos Bombyx mori como se describe previamente (Sofia y colaboradores, 2001) . Las microesferas que contienen adenosina se prepararon de acuerdo con el protocolo basado en MeOH descrito previamente (Wang y colaboradores, 2007) . Brevemente, 200 iL de 10 mg/mL de solución madre de adenosina se mezclaron con 1 mL de solución acuosa de seda al 8% (p/v) , la cual luego se adicionó a 200 mg de fosfolipido de 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DOPC) que había sido disuelto en 1 mL de cloroformo, luego se secó bajo N2 a una película sobre el interior de un tubo de prueba de vidrio. La solución se diluye, luego se congeló-descongeló repetidamente, luego se liofilizó. Más tarde, las microesferas se trataron con metanol (MeOH) para remover los
lípidos e inducir reticulaciones físicas de la seda de ß-lámina para estabilizar las estructuras de microesferas . Se puede usar etanol o cloruro de sodio en lugar de metanol en las fabricaciones descritas en la presente, y estos agentes también inducen la estructura de ß-lámina. Ver WO 2008/118133. Adicionalmente, la inducción y recocido de la estructura de ß-lámina de las microesferas de fibroína de seda (o películas, a continuación) se pueden lograr mediante la exposición al vapor de agua.
Ver WO 2008/127402.
Las estructuras porosas basadas en agua se prepararon como se describe previamente (Kim y colaboradores, 26(15) Biomats. 2775-85 (2005), usando la mezcla de las microesferas y la solución de seda para incrustar las microesferas en la estructura porosa final. Brevemente, 4 g de 500 µ??-600 ym de NaCl granular se adicionaron a 2 mL de solución de seda al 6% (p/v) mezclada con las microesferas en un contenedor de plástico y es incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas. Las estructuras luego se lavaron durante 24 horas para lixiviar el cloruro de sodio. Para obtener la geometría de seda del implante (0.6 mm-0.7 rara de diámetro, 3 mm de longitud) , las estructuras se perforaron con punzón de biopsia Miltex de 1 mm y luego se recortaron con una rasuradora en cada lado. Las estructuras porosas después se recubrieron con películas de seda cargadas con
fármaco de macroescala comparables con las películas descritas previamente (Hofmann y colaboradores, 111 J.
Control Reléase 219-227 (2006) ) . Los implantes se empaparon en una solución de seda y fármaco mezclada durante dos minutos, luego se incubaron a 60°C durante 15 minutos-20 minutos, luego se lavaron en una solución de MeOH a 90%.
Finalmente, los recubrimientos de nanopelículas se aplicaron usando un protocolo previamente descrito (Wang y colaboradores. 21(24) Langmuir, 11335-41 (2005)), pero se modificaron para adaptarse al recubrimiento de una estructura porosa tridimensional (3D). Las estructuras primero se sumergieron en 2 mg/mL de una solución de fibroína de seda i
durante 2 minutos, y luego se lavaron en solución de MeOH/agua 90:10 (v/v) durante 1 minuto. Después del lavado con metanol, las estructuras se secaron a 60°C durante 15 minutos. Las estructuras secas luego se sumergieron en 1 mg/mL de solución de adenosina durante 2 minutos y luego se secaron a 60°C durante otros 15 minutos. Estas etapas se repitieron hasta que el número deseado de capas se logró, terminando con una capa de seda. Después de la carga de fármacos, todos los implantes se recubrieron con las tres capas de cobertura (tres inmersiones de seda subsecuente) para retardar la liberación repentina.
Medios y métodos adicionales para diseñar y manufacturar los implantes de suministro de adenosina de seda
se pueden hacer con referencia a esta especificación y, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20080085272; WO 2007/016524;
WO/2008/118133.
Ejemplo 3. Estudios de liberación in vitro
Para cada dosis objetivo (40 ng, 200 ng, y 1,000 ng) se caracterizaron tres implantes para la cinética de liberación in vitro (N=3). Para evaluar los perfiles de liberación, los implantes se sumergieron en 1 mL de solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco, pH 7.2 (PBS) a 37°C. En los puntos de tiempo pre-ajustados (1, 2, 3, 4, 6, 10 y 14 dias) la PBS se removió y se reemplazó.
El contenido de adenosina en las muestras de PBS removidas del sistema se midió usando un ensayo de fluorescencia modificado como se describe previamente ( ojcik & Neff 39 J. Neurochem. 280-82 (1982)). La muestra de PBS recolectada se transfirió a tubo Eppendorf de 1.5 mL y el cloroacetaldehido se adicionó a una concentración final de cloroacetaldehido 220 µ?. Estos tubos se taparon y se hirvieron durante 20 minutos. La ebullición de la adenosina y el cloroacetaldehido mezclados produjo la l,N-6-etenoadenosina derivada fluorescente. La fluorescencia de la muestra se midió con un lector de placas (excitación = 310 nm, emisión = 410 nm (Rosenfeld & Taylor, 259(19) J. Biol . Chem. 11920-29 (1984). Para cada dispositivo en cada punto de
tiempo, es tomaron y se promediaron tres lecturas de fluorescencia .
Ejemplo 4. Animales y cirugía
Todos los procedimientos de animales se condujeron en una instalación acreditada por la asociación para la estimación y acreditación del cuidado animal del laboratorio de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de cuidado y uso de animales institucionales y los principios indicados en la Guía N1H para el Cuidad y Uso de Animales de Laboratorio. Ratas Sprague-Dawley macho adultas se usaron en un peso corporal de 280 g a 300. g. Todas las ratas se aclimataron durante una semana antes de ser usadas en los experimentos. Las ratas se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas desde la 8:00 A.M) con alimento y agua proporcionados ad libitum.
La anestesia se indujo con isoflurano al 3%, N20 al 67%, 02 al 30% y se mantuvieron con isoflurano al 1.5%, N20 al 68.5%, O2 al 30%, mientras que. las ratas (N=22) se colocaron en una estructura estereotáctica Kopf. Primero, los polímeros con una velocidad de liberación objetivo de 0 ng, 40 ng, 200 ng, y 1000 ng de adenosina al día (N=5-6 por dosis) se implantaron usando un dispositivo de implante estereotáctico (diámetro interno de 0.7 mm, diámetro externo de 1 mm) como se describe (Boison 43(8) Epilepsia, 788-96 (2002). El dispositivo cargado con polímero se inserto
estereotactícamente dentro del cerebro usando un orificio arriba del hemisferio izquierdo 2 mm rostral a la bregma y 1,6 mm lateral a la linea media. Usando este orificio el dispositivo cargado se insertó dentro de cerebro usando un ángulo de 45° de la vertical y un ángulo de 45° de la linea media. De esta manera, se creó un tracto de inyección/que apunta en una coordenada de 5.5 mm de caudal a la bregma, 5.5 mm a la derecha de la linea media y 7.5 mm abajo de la dura. En el alcance del sitio objetivo el polímero de 3 mm de. largo se liberó y se depositó dentro de la hendidura del infrahipocampo al retraer lentamente el tubo exterior del dispositivo. Finalmente, el dispositivo se retrae completamente como se describe previamente (id). De esta manera, los polímeros implantados se depositaron dentro de una cavidad formada de 3 mm de longitud adentro de la derecha de la hendidura del infrahipocampo y adyacente al sito del implante del electrodo.
El procedimiento de implante diagonal seguido en la presente y previamente (Li y colaboradores 2007; Li y colaboradores, 2008), se caracteriza por una variedad de ventajas importantes: (i) Cobertura de 3 mm de la longitud dorso-ventral del hipocampo por la colocación de los implantes dentro de fisura del infrahipocampo; (ii) Minimización del daño al hipocampo ipsilateral; (iii) Compatibilidad con los auriculares que contienen electrodos
de los animales. Después, un electrodo de acero inoxidable, recubierto, bipolar, (0.20 mm en diámetro, Plastics One, Roanoke, VA) se implantó dentro del hipocampo derecho y se fijó con una auricular de acrilato dental. Las coordenadas para los electrodos del hipocampo fueron (barra de dientes a 0) : 5.5 mm de caudal a bregma, 5.5 mm lateral a linea media, y 7.5 mm de ventral a dura.
Ejemplo 5. Activación
Cuatro días después de la cirugía, los animales se estimularon unilateralmente seis veces cada dos o tres días con un estimulador Grass S-88 (1-ms de pulsos de onda cuadrada de 5V a una frecuencia de 50-Hz durante 10 segundos; intervalo de 30 minutos entre las estimulaciones). Las convulsiones de comportamiento se registraron de acuerdo con la escala de Racine (3(2) Neurosurg. 234-52 (1978)). Cada animal recibió un total de 48 estimulaciones, lo cual fue equivalente a ocho días de prueba extendidas entre el día 4 y el día 20 después del implante del polímero. El electroencefalograma (EEG) se registró por períodos de 1 minuto antes y 5 minutos después de la aplicación de cada pulso estimulante usando un sistema de supervisión Nervus EEG.
Ejemplo 6. Histología
Después de la terminación de los experimentos, las ratas se perfusionaron transcardialmente con paraformaldehído
al 4% en solución amortiguadora de fosfato (0.15 M, pH 7.4). Los cerebros luego se pos-fijaron en el mismo fijante durante 6 horas y se crioprotegieron en D SO al 10% en PBS (v/v) antes de ser cortado en un total de setenta y dos secciones coronales (40 pm de espesor) cubriendo el grado completo del hipocampo lateral (3.5 mm a 6.5 mm de caudal a bregma) . Para caracterizar la anatomía completa del cerebro en particular en la región del implante, y para verificar la ubicación precisa de los electrodos de activación, una tinción de violeta de Cresilo se realizó en cada sexta sección.
Ejemplo 7. Estadística
En los estudios in vitro, las desviaciones estándares se calcularon para las tres repeticiones por dosis. Los valores para cada uno de los tres implantes de repetición cargados con la misma ' dosis se obtuvieron al promediar tres lecturas de fluorescencia por implante. Las desviaciones estándares se listan en la Tabla 2.
Tabla 2. Liberación de adenosina promedio (Ado = todos los valores en ng)
Días Objetivo: 40 ng Objetivo: 200 ng Objetivo: 1,000 ng
Liberación Liberación Liberación Liberación Liberación Liberación de Ado acumulativa de Ado acumulativa de Ado acumulativa
1 134.4 134.4 679 (± 679 3137 (± 3137 (± 13.8) 25.0) 86.5)
2 89.0 (± 223.4 513.1 (+ 1192.1 2865.2 6002.2
10.5) 21.1) (+ 55.8)
3 33.9 (+ 257.3 202.3 (± 139 .4 984.6 (± 6986.8
9.9) 22.3) 79.7)
4 66.3 (+ 323.6 330.9 (± 1725.3 2042.7 (± 9029.5
4.4) 18.4) 61.2)
6 42.7 (± 366.3 208.4 (± 1933.7 853.7 (± 9883.2
3.4) 15.4) 44.0)
10 62.4 (± 428.7 281.3 (± 2215.0 914.8 (± 10, 798
4.5) 15.8) 50.6)
14 38.7 (± 467.4 172.3 (± 2387.3 667.3 (± 11, 65.3
10.8) 22.3) 45.4)
Los ciatos de convulsiones in vivo se basan en ratas
N=5 para recipientes de los polímeros de control (0 ng de adenosina) y para los recipientes de los polímeros de 40 ng de adenosina/día, y N=6 para los recipientes de los polímeros de 200 ng y 1,000 ng adenosina/día. Los registros de convulsiones individuales y las duraciones de la descarga posterior se agruparon y se promediaron para cada uno de los ocho días de prueba en cada grupo experimental. Los errores se dan como + SD y los datos se analizaron usando el ANOVA de una vía con la Prueba Student-Newman-Keuls . * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
Ejemplo 8. Cinética de liberación de adenosina in vitro
La liberación promedio de la adenosina de los implantes en cada punto de tiempo y la liberación acumulativa
durante 14 días se resumen en la Tabla 2, anteriormente. Durante catorce días, el implante objetivo de 8 ng liberó n total de 100.9 ng (velocidad de liberación promedio = 7.2 ng/día), el implante objetivo de 40 ng liberó 467.4 ng (velocidad de liberación promedio = 33.4 ng/día), el implante objetivo de 200 ng liberó 2387.3 ng (velocidad de liberación promedio = 170.5 ng/día) y el implante objetivo de 1,000 ng liberó 11.465.3 ng (velocidad de liberación promedio = 819 ng/día) . Las velocidades de liberación para cada punto de tiempo se resumen en la Tabla 3. Las curvas de liberación acumulativas se muestran gráficamente en la FIG. 2.
Tabla 3. Velocidades de liberación de la adenosina de los implantes (ng/día)
Ejemplo 8. Supresión dependiente de dosis de la epileptogénesis de activación por los implantes de liberación
de adenosina en el infrahipocampo
El implante en el infrahipocampo de los polímeros basados en seda con velocidades de liberación objetivo diferentes de adenosina que varían de 40 ng a 1000 ng de adenosina/día deben suprimir la epileptogénesis de activación en una forma dependiente de dosis. Para probar esta hipótesis, cuatro grupos de ratas recibieron implantes en el infrahipocampo con velocidades de liberación objetivo de 0 ng
(control, N=5), 40 ng (N=S)5 200 ng (?=ß) , y 1000ng (N=6) de adenosina al día. Estas dosis objetivo se basaron en las estimaciones de dosis previas que sugieren una dosis efectiva que está en el intervalo de 200 ng de adenosina liberada/día
(Huber y colaboradores, 2001; Boison y colaboradores, 1999). Cuatro días después del implante del polímero se inició la activación del hipocampo con cada rata que recibe un total de ocho sesiones de activación cada segundo o tercer día, con cada sesión comprendida de seis estimulaciones suministradas cada 30 minutos. De esta manera, durante un período de tiempo que varía de cuatro días a veinte días después de la estimulación, cada rata recibió un total de 48 estimulaciones
(FIG. 4A) .
Se determinaron registros de convulsiones después de cada estimulación de acuerdo con la escala de Racine (197.8). Las etapas 1 a 3 corresponden a convulsiones parciales de intensidad progresiva, mientras que la etapa 4 y
etapa 5 representan convulsiones generalizadas con componentes tónicos y clónicos. Comparado con el desarrollo de activación de control (0 ng de adenosina) en recipientes de dosis objetivo de 40 ng, 200 ng, y 1000 ng se retardó inicialmente en una relación dependiente de dosis durante las primeras 24 sesiones o hasta el final de la cuarta sesión que corresponde a once días después del implante del polímero. Más notablemente, durante este tiempo los recipientes de polímeros que liberan una dosis objetivo de 1000 ng/día se protegieron completamente de cualquier actividad de convulsión (FIGS. 4A, 4B) . Este efecto terapéutico, dependiente de dosis también se reflejó por el número de estimulaciones, necesarias para inducir la primera convulsión parcial (etapa 1 o etapa 2) (FIG. 5). Aunque los recipientes de los implantes de control las convulsiones parciales ocurrieron primero durante la sesión 2 (es decir, alrededor de la estimulación 10), la primera emergencia de las convulsiones parciales se exhibió notablemente con el incremento de las dosis de la adenosina liberada con los recipientes de una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina/día necesitando 2.5 veces tantas estimulaciones para alcanzar el mismo estado de activación como el grupo de control (FIG. 5) .
Desde la estimulación 25 en adelante (es decir, sesión 5 en el día trece después del implante) los efectos terapéuticos de los implantes declinaron (FIG. 4), lo cual es
consistente con la velocidad reducida de la liberación de adenosina de los polímeros (Tabla 3) . Los recipientes de los implantes de control alcanzaron sus criterios de activación (convulsiones de etapa 4/5 generalizadas) de la sesión 5 hacia adelante, pero los recipientes de los polímeros de liberación de adenosina mostraron un retardo en la adquisición de las respuestas de convulsión generalizadas (FIG. 4). Interesantemente, las velocidades de activación (es decir, el incremento progresivo en las etapas de convulsiones con el tiempo) fueron similares en los recipientes de dosis objetivo de 0 ng, 200 ng, y 1000 ng de adenosina/día, con un retardo dependiente de dosis en el inicio de la activación, indicando una activación suprimida de la liberación de adenosina basada en polímero. Más importantemente, los recipientes de una dosis objetivo 1000 ng de adenosina/día mostraron un retardo de la adquisición de activación de aproximadamente tres sesiones una a la semana, indicando que las dosis de aproximadamente 400 ng de adenosina/día (Tabla 3) son suficientes para suprimir la activación.
Ejemplo 9 Los. implantes de liberación de adenosina del infrahipocampo reducen la duración de la descarga posterior en los registros EEG
El efecto terapéutico de los implantes del infrahipocampo de liberación de adenosina se cuantificó adicionalmente por la determinación de la duración de las
descargas posteriores electroencefalográficas (ADD) inducidas por cada estimulo de prueba durante la fase de adquisición de activación (FIG. 7).
La ADD se promedió de acuerdo con el número de sesión (N=6 estimulaciones, cada una) y la dosis objetivo de tratamiento (0, 40, 200, y 1000 ng de adenosina/dia ) . Durante las primeras tres sesiones una reducción dependiente de dosis de la ADD se volvió evidente. Desde la sesión cuatro hacia adelante las ADDs de los recipientes de las dosis objetivo de 40 ng y 200 ng de adenosina/dia fueron similares a aquellas de los controles falsos (0 ng adenosina/dia), que es consistente con la declinación en la adenosina liberada de estos polímeros con el tiempo (Tabla 3) . Notablemente, las descargas posteriores permanecieron significativamente reducidas por todo el experimento completo en los recipientes de los polímeros que liberan una dosis objetivo de 1000 ng de adenosina/día . En ese tiempo la ADD de los recipientes de las dosis objetivo de 0 ng, 40 ng, y 200 ng de adenosina/día habían alcanzado, una meseta con valores promedio que exceden 120s, mientras que la ADD de los recipientes de las dosis objetivo de 1000 ng de adenosina al día permaneció reducida con los valores de <100s. De esta manera, la respuesta de convulsiones de comportamiento como se observa en la FIG. 4 fue estrechamente paralela por la duración de las descargas posteriores en las EEGs respectivas. Estos resultados también
indican que una dosis objetivo de 1,000 ng de adenosina al día tiene el potencial de la supresión de convulsión prolongada, aun si las velocidades de la liberación de adenosina declinan con el tiempo. Después de la terminación de la supervisión de las convulsiones todos los animales se sacrificaron en el día 20 después del implante de polímero y se sometieron a análisis histológicos serios. En las secciones cerebrales coronales los investigadores detectaron una cavidad que resulta del polímero depositado dentro de la fisura del infrahipocampo y se encontraron pequeñísimas cantidades de la inserción de electrodo en ubicaciones correctas (FIG. 10). No es obvio puesto que se descubrieron una inflamación o hemorragia.
Ejemplo 10. Diseño y fabricación del implante
Los implantes diseñados para suministrar las dosis objetivo 0 (= control) o 1,000 ng de adenosina al día se diseñaron. y se fabricaron como se describe previamente (Wilz y colaboradores, 2008) . Brevemente, los implantes se diseñaron para separar la carga de fármaco objetivo uniformemente entre las microesferas y las películas de macroescala que se integraron dentro de un solo implante y se cubrieron con películas de seda. Las microesferas que contienen adenosina se prepararon de acuerdo con el protocolo basado en MeOH descrito previamente (Wang y colaboradores, 2007a) . Las estructuras porosas basadas en agua se prepararon
como se describe previamente (Kim y colaboradores, 2005) usando la mezcla de microesferas y solución de seda para incrustar las microesferas en la estructura porosa final. Para obtener la geometría de implante deseada (Ó.6-0.7 mm de diámetro, 3 mm de longitud) , las estructuras se perforaron con un punzón de biopsia Miltex de 1 mm y luego se recortaron con una rasuradora en cada extremo. Las estructuras porosas después se recubrieron con películas de seda cargadas con adenosina de macroescala múltiples comparables con las películas descritas previamente (Hofmann y colaboradores, 2006) . Después de la carga del fármaco, todos los implantes se recubrieron con capas de cobertura basadas en seda múltiple para . retardar la liberación repentina de la adenosina .
Ejemplo 11. Estudios de liberación de adenosina in vitro
Tres implantes con una dosis de liberación objetivo de 1,000 ng de adenosina se caracterizaron por la liberación cinética in vitro. Para evaluar los perfiles de liberación, los implantes se sumergieron en 1 mi de solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco, pH 7.2 (PBS) a 37°C. Cada 24 horas (o 48 horas después de dos semanas) la PBS se removió y se reemplazó. El contenido de adenosina en las muestras de PBS removidas del sistema se midió usando un ensayo de fluorescencia .modificado como se describe previamente (Wojcik & Neff, 1982) . La muestra de PBS
recolectada se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 mi y se adicionó cloroacetaldehído a una concentración final de cloroacetaldehído 220 µ?. La ebullición de la adenosina y cloroacetaldehído mezclados durante 20 minutos produjeron la 1 , N6-etenoadenosina derivada fluorescente. La fluorescencia de la muestra se vivió con un lector de placas (excitación = 310 nm, emisión - 410 nm (Rosenfeld & Taylor, 1984) . Para cada dispositivo en cada punto de tiempo, se tomaron y se promediaron tres lecturas de fluorescencia.
Ejemplo 12. Activación
Electrodos de acero inoxidable recubiertos, bipolares (0.20 mm en diámetro, Plastics One, Roanoke, VA) se implantaron dentro del hipocampo derecho y se fijaron con una auricular de acrilato dental. Las coordenadas para los electrodos del hipocampo fueron (barra de dientes a 0) : 5.0 mm de caudal a bregma, 5.0 mm de lateral a línea media, y 7.5 mm de ventral a dura.
Experimento 1: Cuatro días después de la- cirugía, los animales se estimularon unilateralmente seis veces cada segundo o tercer día con un estimulador Grass S-88 (pulsos de onda cuadrada de 1-ms de 5 V en una frecuencia de 50-Hz durante 10 s, intervalo de 30 minutos entre estimulaciones; estas estimulaciones correspondieron a aproximadamente 350 µ?, mientras que los umbrales de descarga posterior antes de la activación estuvieron en el intervalo de 115 µ?) .
Las convulsiones de comportamiento se registraron de acuerdo con escala de Racine (Racine, 1978) . El electroencefalograma (EEG) se registró por periodos de 1 minuto antes y 5 minutos después de la aplicación de cada pulso estimulante usando un sistema de supervisión Nervus EEG. Las estimulaciones en cada día se continuaron en cualquier momento en que se alcanzó en ese día una convulsión de etapa 5. Eventualmente, todos los animales reaccionaron con una convulsión de etapa 5 en la primera (y luego únicamente) la estimulación diaria. Después de tres convulsiones de etapa 5 inducidas por la primera estimulación en los tres días de activación subsecuentes los animales se consideraron que se activaron completamente (es decir reproducibilidad de la actividad de convulsión de etapa 5 después de la estimulación) . Después, la sensibilidad a la adenosina de la activación AIR se sometió a prueba por la inyección de 2-cloro-N ( 6 ) -ciclopentiladenosina (CCPA; agonista selectivo del subtipo del receptor Al de adenosina). La inyección de CCPA (3 mg/kg i.p. en solución salina que contiene D SO al 20%) suministrada en el siguiente día 30 minutos antes de una estimulación de prueba dio por resultado una supresión de convulsiones completa. Veinticuatro (24) horas después, los animales se estimularon nuevamente para demostrar la consistencia y mantenimiento de la actividad de la convulsión de etapa 5 después de la estimulación.
Únicamente los animales que cumplieron estos criterios de activación rigurosa se usaron para los experimentos subsecuentes.
Los polímeros se implantaron dentro de estos animales completamente activados. Los recipientes de implante recibieron una estimulación de prueba cada día 4, 6, 10, 14, 18, y 21 después del implante del polímero y luego se sometieron a el análisis histológico.
Experimento 2: El implante del polímero (ver posteriormente) se combinó con el implante de electrodo (ver anteriormente) en la misma cirugía. Experimento 2a: La activación se inició cuatro días después del implante del polímero con los animales que reciben 6 estimulaciones de activación (pulsos de onda cuadrada de 1-ms de 5 V en una frecuencia de 50-Hz durante 10 segundos, intervalo de 30 minutos entre las estimulaciones) cada día 4, 6, 8, y 11 después del implante; esto ascendió a un total de 24 estimulaciones. Un días después del suministro del estímulo de 24 horas, todos los animales se trataron con 8-ciclopentil-1 , 3-dipropilxantina (DPCPX, antagonista selectivo del subtipo del receptor Al de adenosina) 30 minutos antes de la estimulación (1 mg/kg, i.p. en DMSO) . Veinticuatro (24) horas después de esta prueba de fármaco todos los animales se estimularon nuevamente una vez antes de ser sacrificados para el análisis histológico. Experimento 2b (FIG. 3) : La
activación se inició cuatro días después del implante del polímero con los animales que reciben seis estimulaciones de de activación cada uno en los días 4, 5, 6, 7, y 8, después del implante; esto ascendió a un total de 30 estimulaciones. En estos recipientes de implante de adenosina incompletamente activados las estimulaciones adicionales se suspendieron hasta que la liberación de adenosina de los polímeros había expirado (desde el día dieciocho hacia adelante) . Las estimulaciones de activación se resumieron en los días 18, 19, 20, 21, y 22 después del implante (6 estimulaciones/día; total de 30 estimulaciones adicionales) . Después los animales se sacrificaron para el análisis histológico.
Ejemplo 13. Implante del polímero
Los polímeros con una velocidad de liberación objetivo 1000 ng de adenosina al día o polímeros de control respectivo (0 ng de adenosina) se implantaron usando un dispositivo de implantación estereotáctico (diámetro interno de 0.7 mm, diámetro externo de 1 mm) como se describe (Boison y colaboradores, 2002). Los polímeros se implantaron cada uno después de la terminación de la activación (Experimento 1) o antes del inicio de la activación (Experimento 2) . El dispositivo cargado con polímero se insertó estereotácticalmente dentro del cerebro usando un orificio arriba del hemisferio izquierdo 2 mm rostral a bregma y 1.6 mm lateral a la línea media. Usando este orificio el
dispositivo cargado se insertó dentro del cerebro usando un ángulo de 47° de la vertical y un ángulo de 47° de la linea media. De esta manera, se creó un tracto de inyección diagonal que apunta en una coordenada de 5.0 mm caudal a bregma, 5.0 mm a la derecha de la linea media y 7.5 mm abajo de la dura. Para alcanzar el sitio objetivo el polímero de 3 mm de largo se liberó y se depositó dentro de la fisura del infrahipocampo al retraer lentamente el tubo exterior del dispositivo. Finalmente, el dispositivo se retrajo completamente como se describe previamente (Boison y colaboradores, 2002). De esta manera, los polímeros implantados se depositaron dentro.de una cavidad formada de 3 mm de longitud dentro de la fisura del infrahipocampo de derecho y adyacente al sitio de implante del electrodo. El procedimiento de implante diagonal seguido en la presente y previamente (Li y colaboradores, 2007b; Li y colaboradores, 2008; Wilz y colaboradores, 2008) se caracteriza por una variedad de ventajas importantes: (i) Cobertura de 3 mm del grado dorso-ventral del hipocampo por la colocación de los implantes dentro de la fisura del infrahipocampo; (ii) Minimización del daño al hipocampo ipsilateral; (iii) Compatibilidad con la auricular que contiene electrodo de los animales .
Ejemplo 14. Histología y degradación de la muestra
Las ratas se perfusionaron transcardialmente con
paraformaldehído al 4% en solución amortiguadora de fosfato (0.15 , pH 7.4). Para caracterizar la macroanatomia del cerebro en el sitio de implante y para confirmar la ubicación del implante, se seccionaron cerebros de rata (10 pm a 40 ym) ya sea en el plano coronal o el sagital y se tiñeron con ya sea violeta de Cresilo, o con hematoxilina y eosina. La morfología de la estructura se determinó después del implante por la recuperación de los cerebros con pinzas y seccionaron, o las estructuras se seccionaron mientras que aun estaban incrustadas en el tejido cerebral. Las estructuras antes del implante y las muestras cosechadas después del implante se lavaron en PBS, y es fijaron en formalina amortiguada neutra al 10% antes del análisis histológico. Las muestras se deshidrataron a través de una serie de alcoholes graduados, incrustados en parafina y seccionados en un espesor de 5 µp?. Las secciones se tiñeron con ya sea hematoxilina y eosina (H&E) o violeta de Cresilo '(violeta de metilo 10B) .
Las muestras de los implantes antes y después del implante se compararon para la degradación. Las secciones se examinaron bajo un microscopio de luz Zeiss Axiovert S100 con una "cámara de video de color Sony Exwave HAD ' 3CCD. La relación del área superficial total de los poros (en pixeles) al área superficial total del implante (en pixeles) se evaluó usando el software de procesamiento de imagen Image J. de esta manera, la porosidad de la muestra se determina por el
análisis Image J, que refleja la relación del área superficial total de los poros a el área superficial total de los implantes. Los datos presentados en la Tabla 4 son de seis polímeros cargados con adenosina representativos antes o cuatro semanas después del trasplante dentro del cerebro de la rata. Los datos se analizaron con una prueba t de dos muestras: t = 5.08, df = 10, p < 0.001.
Tabla 4. Porosidad de la muestra antes y después del implante
Ejemplo 15. Estadísticas
En los estudios in vitro ' las desviaciones estándares se calcularon para las tres repeticiones por grupo al promediar tres lecturas de fluorescencia por implante. Los datos de convulsiones in vivo se basan en N = 5 en 8 ratas dependiendo del diseño experimental y el grupo experimental. Los registros de la convulsión individual se agruparon y se
promediaron para cada estimulación en cada grupo experimental. Los errores se dan como ± SD y los datos se analizaron usando el ANOVA de dos vías en las clasificaciones seguidas por una prueba Bonferroni.
Ejemplo 16. Perfiles de liberación de adenosina
La dosis diaria de adenosina liberada de los polímeros cargados con adenosina (polímeros ADO) se determinó por el análisis de fluorescencia de la adenosina después de la derivación a la 1 , N6-etenoadenosina . Después de una liberación repentina inicial en la liberación de adenosina (> 2000 ng / día) durante los primeros tres días de incubación, los polímeros se caracterizaron por una velocidad de liberación estable de aproximadamente 1000 ng/día (1019 ± 197) entre el día cúatro y el día diez (FIG. 3A) . Después de este período de liberación estable, las velocidades diarias de la liberación de adenosina disminuyeron rápidamente a 414 ± 59 ng de adenosina en el día once y 256 ± 45 ng en el día doce. Los polímeros cesaron deliberar adenosina dentro de un marco 'de tiempo de veintiún días de incubación: En contraste, nada de adenosina fue detectable en los sobrenadantes de los polímeros de control cultivados. Este perfil de liberación único de velocidades de liberación inicial altas y estables (1000 ng/día) seguido por la expiración gradual de la liberación de adenosina permitió la confirmación de la dependencia de adenosina de los efectos terapéuticos mediados
por implante.
El experimento 1 estudió los efectos anti-ictogénicos de la liberación de adenosina basada en polímero, después los polímeros se implantaron dentro de ratas completamente activadas. Dado la velocidad de liberación de adenosina inicial alta de los polímeros ADO se esperó la protección completa inicial de las convulsiones seguidas por una recurrencia gradual de la actividad de la convulsión en paralelo con la declinación en la liberación de adenosina terapéutica.
El experimento 2 (esquemáticamente representado en la FIG. 3B) estudió el perfil de liberación único de la adenosina y la estimación de los efectos anti-ictogénicos y anti-epileptogénicos de la liberación de adenosina basado en polímero. Aquí, los polímeros se implantaron cuatro días antes de la iniciación de la activación. La expectación es el desarrollo de la activación reducida en el grupo tratado con polímero ADO de ratas. La supresión del desarrollo de activación puede ser ya sea debido a una supresión real de la epileptogénesis, o "justo" a la supresión de las convulsiones. En el último caso la supresión de convulsión mediada por adenosina "enmascararía" cualquiera de los efectos anti-epileptogénicos. Para distinguir entre estas dos posibilidades se adoptó un paradigma experimental descrito primero por McNamara (Silver y colaboradores, 29 Ann . Neurol.
356-63 (1991): los recipientes de polímero ADO y de polímero de control se activaron únicamente hasta que el grupo ADO mostró los primeros signos de activación (FIG. 3B) ; durante el mismo marco de- tiempo los animales del grupo de control se esperaron que se activen completamente; este período de activación inicial durante un período de liberación de adenosina constante en el grupo ADO (1000 ng de adenosina al día durante los días 4 a 8 después del implante de polímero) se siguió por un espacio de 9 días en la activación. Durante este espacio en la activación, los polímeros cesaron de liberar cantidades significativas de adenosina. La activación luego se resumió en ambos grupos. En caso de que la adenosina en el grupo de polímero ADO haya suprimido meramente las convulsiones pero no la epileptogénesis , se espera un "salto" en la expresión de la convulsión, es . decir, las etapas de convulsiones deben ser similares a aquellas observadas en el grupo de control (FIG. 3B) . En contraste, si la liberación de adenosina basada en polímero ha suprimido la epileptogénesis, se espera que el desarrollo de la activación se resuma, donde se descontinuó previamente, es decir, la curva de etapa de convulsión en la segunda fase de activación del grupo de polímero ADO, debe ser paralelo a la curva de etapa de convulsión en la fase de activación inicial del grupo de control. Usando este paradigma, el número de descargas posteriores sin fármacos para alcanzar una etapa de
activación particular debe ser la misma en el caso de la antiepileptogénesis completa (FIG. 3B) ; si el número de descargas posteriores sin fármacos en el grupo tratado con fármacos es menor que en el grupo de control (FIG. 3B) , alguna epileptogénesis tomó lugar durante la administración del fármaco (Silver y colaboradores, 1991) .
Experimento 1: Supresión de convulsiones activadas por la liberación de adenosina basada en polímero. Para establecer el potencial anti-ictogénico de la liberación basada en polímero de seda de la adenosina, cualquiera de los polímeros de liberación de adenosina (FIG. 3A) (n = 5) o los polímeros de control correspondientes (n = 4) que no se cargaron con adenosina se implantaron dentro de la fisura del infrahipocampo de ratas totalmente activadas. Antes del implante de polímero todas las ratas reaccionaron reproduciblemente con convulsiones de etapa 4 o 5 después de la estimulación y de esta manera cumplieron con los criterios de activación rigurosos. Los animales recibieron un estímulo de prueba cada uno en los días 4, 6, 10, 14, 18, y 21 después del implante del polímero. Los recipientes de los polímeros de control mantuvieron la expresión de los ataques convulsivos (etapa de convulsión promedio de 3.9 ± 1.6) durante el curso de los experimentos, pero los recipientes de los implantes que liberaron 1000 ng adenosina/día se protegieron inicialmente casi completamente de ' cualquiera de
las convulsiones (etapa de convulsiones promedio de 0.2 ± 0.5 hasta el día diez después del implante) (FIG. 6) . Durante este tiempo, 4 de 5 ratas no expresaron ni una de las convulsiones (etapa 0) , mientras que la rata restante expresó ataques de etapa 1 no convulsivos. En línea con los niveles reducidos de adenosina liberada de los polímeros desde el día diez hacia adelante (FIG. 3A) , la actividad de las convulsiones en el grupo de adenosina se resumió gradualmente (FIG. 6) indicando que la supresión de convulsiones fue debido a la liberación de adenosina dependiente de implante. Para confirmar además que la supresión de convulsiones es debido a la adenosina derivada de implante una rata tratada con polímero ADO recibió una inyección intraperitoneal del antagonista AIR de adenosina DPCPX (1 mg/kg, i.p.) en el día tres. Cuando se sometió a prueba antes o después de DPCPX en los días 2 y 4, la rata se protegió de convulsiones (etapa 0) . Treinta (30) minutos después de la inyección de DPCPX en el día tres, sin embargo, se indujo una convulsión de etapa 5 indicando la dependencia de adenosina de la supresión de la convulsión. Conjuntamente, estos resultados sugieren una actividad anti-ictogénica poderosa de la liberación de adenosina derivada de implante focal en el intervalo de 1000 ng al día.
Experimento 2: La supresión de la epileptogénesis por la liberación de adenosina basada en polímero. Para
separar, se realizaron experimentos para investigar la posibilidad de los efectos anti-epileptogénicos de la liberación de adenosina basada en polímero. En el experimento 2a se implantaron electrodos y polímeros de activación (velocidad de liberación objetivo de 1000 ng de adenosina/día, n = 8 ; y polímeros de control, n = 6) en ratas SD macho adultas en el día 0. Los animales recibieron 4 x 6 de estimulaciones de activación suministradas en los 4, 6, 8, y 11 después del implante del polímero; de acuerdo con los datos de liberación de adenosina (FIG. 3), la primeras 18 estimulaciones se dieron durante un marco de tiempo de liberación casi constante de 1000 ng de adenosina/día, mientras que la liberación de adenosina en el día once (estimulación 19 a 24) había descendido aproximadamente 400 ng de adenosina al día. En el día doce, cada uno de los recipientes de implante de adenosina recibió una sola inyección del antagonista AIR DPCPX (1 mg/kg, i.p.), seguido después de 30 minutos por una sola estimulación de prueba. En el día trece, cada uno de estos animales se sometió a prueba nuevamente en ausencia de DPCPX. Estos resultados (FIG. 8A) demuestran la supresión completa del desarrollo de activación durante las primeras 13 estimulaciones en el grupo de adenosina, a pesar de la presencia regular de descargas posteriores y sacudidas de perro mojado, inducidas por las estimulaciones de prueba.
Comparados con los recipientes de implante de control, los recipientes de implante de adenosina continuaron exhibiendo una supresión significativa de epileptogénesis de activación durante el curso de este experimento. Únicamente en el día once, que corresponde a una disminución de la liberación de adenosina derivada de implante, el desarrollo de activación comenzó a progresar en el grupo ADO. En la estimulación 24 la respuesta de convulsión promedio de los recipientes de implante de adenosina (etapa 1.25 ± 0.7) fue significativamente más baja (P<0.001) que la respuesta de convulsión observada en el grupo de control' (etapa 3,3 ± 1.2) . Para determinar si la supresión de la convulsión fue debido a la supresión de la ictogénesis (por las AIRs de activadoras de adenosina derivada de implante) o debido a la supresión de la epileptogénesis, la estimulación #25 se dio en presencia del DPCPX. La respuesta de convulsión resultante (etapa 1.8 ± 1.0) fue únicamente de manera ligera diferente de la respuesta de convulsión precedente #24 (etapa 1.25 ± 0.7; P=0.05) y no diferente de la respuesta de convulsión subsecuente #26 inducida en el día posterior (etapa 1.6 ± 1.1; P=0,3). Mientras que el DPCPX, pareado con las estimulaciones de activación, indujo fácilmente las convulsiones de etapa 5 en las ratas totalmente activadas que se protegen de otra manera de los implantes cerebrales de liberación de adenosina (Boison y colaboradores, 43 Epilepsia
788-96 (2002); Güttinger y colaboradores 193 Exp. Neurol . 53-64 (2005); Huber y colaboradores, 98 P.N.A.S. EUA 7611-16 (2001)), en la presente estimulación de prueba de estudio en presencia de DPCPX no logró inducir las convulsiones similares al grupo de control. Estos resultados indican que los registros de convulsión reducidos en los .recipientes de implante de liberación de adenosina podrían ser relacionados con los efectos anti-epileptogénicos de los implantes cerebrales de liberación de adenosina.
Para estudiar adicionalmente los efectos anti-epileptogénicos posibles de la adenosina, el Experimento 2b (FIG. 3B) , parearon las estimulaciones de activación con el perfil de liberación de adenosina específico de los polímeros. Dos grupos de ratas se implantaron con. los polímeros de liberación de adenosina (n = 5) o de control (n = 7) en el día del implante del electrodo. El primer conjunto de 30 estimulaciones de activación se suministró durante una ventana de tiempo durante la cual los polímeros permitieron una velocidad de liberación estable de 1000 ng de adenosina/día (día cuatro a, 6 estimulaciones al día) . En estas ratas pre-activadas la activación se resumió después de un espacio de nueve días, con el objetivo de suministrar estimulaciones adicionales durante la fase de expiración de los polímeros (día dieciocho a veintiuno) hasta que todos los animales se activaron totalmente. En línea con las
investigaciones del Experimento 2a, los recipientes de los implantes de liberación de adenosina mostraron una supresión consistente del desarrollo de activación (FIG. 8B) durante los primeros cinco días de estimulación. Aun después de 30 estimulaciones estos animales continuaron siendo- protegidos de ataques convulsivos y reaccionaron con un registro de convulsión promedio de 1.3 ± 0.5 en el octavo día después del implante del polímero. En contraste, los recipientes de los implantes de control activados de la misma manera reaccionaron reproduciblemente con las convulsiones de etapa 4 o 5 en ese punto de tiempo (registro de convulsión promedio de 4.9 ± 0.4 en la estimulación 30 en el octavo día después del implante del polímero) . Después de esta estimación de convulsión inicial, los animales no se sometieron a ninguna estimulación adicional durante los siguientes nueve días. La activación se resumió en el día dieciocho, cuando todos los animales de control continuaron exhibiendo convulsiones de etapa 4 y 5. En contraste, la activación en los recipientes de polímero de liberación de adenosina se resumió con los registros de la etapa 0 a 1 (registro promedio de 0.5 + 0.6) en un nivel similar a los registros de convulsiones cuando la activación se descontinuó (FIG. 8B) .
Subsecuentemente, estos animales respondieron con los incrementos graduales en la gravedad de la convulsión hasta que alcanzaron los registros de etapa 4 a 5 en el día
veinte y veintiuno después del implante del polímero. Esta curva de activación fue paralela - cambiada albeit a la derecha - a la curva de activación de los recipientes de los implantes de control. El número de descargas posteriores sin fármacos en las ratas tratadas con ADO para inducir las etapas de convulsiones comparables con aquellos de los animales de control fue más baja que en aquellas ratas de control, sin embargo, indicando que alguna epileptogénesis ha ocurrido durante la fase del suministro de adenosina (Silver y colaboradores, 1991) . Conjuntamente, los experimentos 2A y 2B sugieren que el suministro de adenosina focal ejerce efectos anti-epileptogénicos parciales.
Ejemplo 17. La liberación focal de adenosina no afecta la expresión de las descargas posteriores.
Para reglamentar la posibilidad de que el estímulo suministrado a los recipientes de implante de adenosina fue insuficiente para desencadenar la epileptogénesis en presencia de este modulador inhibidor, las descargas posteriores electrográficas en los recipientes de los implantes de liberación de adenosina o de control se. cuant ificaron en el inicio de la activación y durante el 5to día de la activación (es decir, el día ocho después del implante del polímero) , un punto de tiempo en el cual los animales de control se activaron casi totalmente, mientras que los recipientes de implante de adenosina no procedieron
más allá de las convulsiones de etapa 1, los datos (FIG. 9) demuestran que durante el día 1 de la activación (= día cuatro . después del implante del polímero) las duraciones de la descarga posterior en ambos grupos de animales fueron inicialmente casi idénticas (71 ± 16 segundos en los animales de control contra 73 ± 20 segundos en los recipientes de los polímeros ADO; P>0.05). Estos datos indican que la liberación de adenosina de lqs polímeros no afectó la expresión de las descargas posteriores . epileptogénicas . Las duraciones de las descargas posteriores en los recipientes de polímero ADO permanecieron bastante constantes durante los primeros cinco días de activación. Las duraciones de las descargas posteriores promedio durante el quinto día de la activación ascendieron a 73 ± 14 segundos (FIG. 9) en el grupo ADO, mientras que la duración de las descargas posteriores en el grupo de control se había incrementado a 84 ± 17 seg.
Ejemplo 18. Degradación de los implantes cerebrales basados en seda después de cuatro semanas in vivo
La cinética de liberación de adenosina descrita anteriormente y la eficacia terapéutica restringida de tiempo de los implantes usados en el estudio actual sugirieron velocidades de liberación iniciales altas y consistentes de adenosina acopladas a la degradación de los implantes a través del tiempo. Por lo tanto, los polímeros basados en seda de liberación de adenosina se sometieron a un riguroso
análisis para estimar los posibles procesos de degradación. Las secciones (5 µp?) de los polímeros cargados de adenosina antes del trasplante, o recuperadas después de cuatro semanas in vivo (N = 6, cada una) , se sometieron a un análisis Image J para calcular la relación del área superficial total de los poros (en pixeles) al área superficial total del implante (en pixeles) (FIGs. 11A, 11B) . Antes del implante, la porosidad del implante de seda promedio basada en el análisis de área superficial fue de 41.1%, y esto se incrementó a 50.9% después del implante (Tabla 4, Ejemplo 14, anterior) . Los implantes de seda en promedio exhibieron un área superficial más porosa de 9.8% después de cuatro semanas in .vivo, sugiriendo que la degradación de los polímeros estuvo ocurriendo en el cerebro de la rata. Después de la terminación de los experimentos in vivo todos los cerebros de las ratas se sometieron al análisis histológico para verificar la ubicación del electrodo y el polímero. Cuatro semanas después del implante, los polímeros parcialmente degradados todavía estuvieron localizados en proximidad cercana al hipocampo estimulado (FIG. 11C) . La inspección más cercana de los implantes (FIG. 11D) reveló signos de degradación con base en la pérdida de la integridad estructural de las estructuras.
Claims (10)
1. Una composición para la administración focal de adenosina en el cerebro, caracterizada porque comprende un sistema de suministro basado en fibroina de seda y adenosina; en donde la composición alivia las convulsiones o previene la epileptogénesis .
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sistema suministra de aproximadamente 50 . ng de adenosina al día a aproximadamente 10 mg al día.
3. La composición de conformidad con. la reivindicación 2, caracterizada porque el sistema suministra de aproximadamente 200 ng de adenosina al día a aproximadamente 5 mg de adenosina al día, inclusive.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sistema suministra de aproximadamente 1 mg de adenosina al dia a aproximadamente 10 mg de adenosina al dia, inclusive.
5. Un implante biodegradable, biocompatible para la colocación en el cerebro, caracterizado porque comprende fibroina de seda y adenosina, en donde en la implantación el implante libera de aproximadamente 1 mg de adenosina al dia a aproximadamente 10 mg de adenosina al dia, inclusive, durante por lo menos ocho días consecutivos.
6. Un implante biodegradable, biocompatible para la colocación en el cerebro, caracterizado porque comprende fibroina de seda y adenosina, en donde en la implantación el implante libera de aproximadamente 800 ng de adenosina al día a aproximadamente 1100 ng de adenosina al día, inclusive, durante por lo menos ocho días consecutivos.
7. . Un implante biodegradable, biocompatible para ( la colocación en el cerebro, caracterizado porque comprende fibroina de seda y adenosina, en donde en la implantación el implante libera de aproximadamente 200 ng de adenosina al dia a aproximadamente 5 mg de adenosina al dia, inclusive, durante por lo menos ocho días consecutivos.
8. Un método para tratar epilepsia o prevenir la epileptogénesis, caracterizado porque comprende .administrar focalmente adenosina en un sistema de suministro de adenosina basado en seda, de liberación sostenida.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el sistema de suministro libera de aproximadamente 50 ng de adenosina al dia a aproximadamente 50 mg de adenosina al dia, inclusive.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sistema de suministro libera de aproximadamente 200 ng de adenosina al dia a aproximadamente 5 mg de adenosina al dia, inclusive. 11;. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sistema de suministro libera por lo menos aproximadamente 1 mg de adenosina al día a aproximadamente 10 mg de adenosina al día, inclusive. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a formulaciones de liberación sostenida que . comprenden biopolimero de fibroina de seda y adenosina, que proporcionan una liberación focal, sostenida de adenosina en niveles terapéuticos para el tratamiento de la epilepsia y/o la prevención de la epileptogénesis . Una modalidad proporciona un implante de liberación de adenosina, basado en seda que alivia las convulsiones o previene la epileptogénesis. Otra modalidad proporciona un método para tratar la epilepsia o prevenir la epileptogénesis que comprende administrar focalmente adenosina en un sistema de suministro de adenosina basado en seda, de liberación sostenida.
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