MX2010011717A

MX2010011717A - Anticuerpos anti-hepcidina y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2010011717A
Application number: MX2010011717A
Authority: MX
Inventors: Ian Foltz; Keegan Cooke; Michael Gallo
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2008-05-01
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2010-11-30
Also published as: EP2294087A1; ES2487846T3; EP2294087B1; AU2009246946B2; CA2722600C; US9315577B2; AU2009246946A1; EP2816059A1; EP2620448A1; CA2722600A1; US20110150888A1; JP2011519279A; WO2009139822A1

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se enlazan a la hepcidina y métodos para elaborar y usar estos anticuerpos. También se proporcionan métodos para tratar trastornos relacionados con la hepcidina.

Description

ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA Y METODOS DE USO Campo de la Invención La invención se refiere a la hepcidina, antagonistas de hepcidina (que incluyen anticuerpos que se enlazan a la hepcidina) y su capacidad para modular la actividad de la hepcidina.

Antecedentes de" la Invención El hierro es un oligoelemento esencial requerido para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. El contenido de hierro en mamíferos se regula al controlar la absorción de hierro, el reciclaje de hierro, y la liberación de hierro de las células en las cuales se almacena. El hierro se absorbe predominantemente en el duodeno y el yeyuno superior por los enterocitos. Existe un mecanismo de retroalimentación que mejora la absorción de hierro en individuos quienes tienen deficiencia de hierro, y que reduce la absorción de hierro en individuos con sobrecarga de hierro (Andrews, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet., 1:75 (2000); Philpott, Hepatology, 35:993 (2002); Beutler y colaboradores, Drug-Metab. Dispos . , 29:495 (2001)). El hierro se recicla de glóbulos rojos degradados por los macrófagos reticuloendoteliales en la médula ósea, las células de Kupffer hepáticas y el vaso. La liberación del hierro se controla por la ferroportina, una proteína de REF: 214780 exportación de hierro principal localizada sobre la superficie celular de los enterocitos, macrófagos y hepatocitos, las células principales capaces de liberar el hierro dentro del plasma. La hepcidina se enlaza a la ferroportina y disminuye su actividad funcional al hacer que se internalice desde la superficie celular y se degrade. (Nemeth y colaboradores, Science, 306:2090-3, 2004; De Domenico y colaboradores, Mol. Biol. Cell., 18:2569-2578, 2007) .

La hepcidina es un regulador importante de la homeostasis de hierro (Philpott, Hepatology, 35:993 (2002); Nicolás y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 99:4396 (2002)). Altos niveles de hepcidina humana dan por resultado niveles de hierro reducidos y viceversa. Las mutaciones en el gen de hepcidina las cuales dan por resultado la falta de actividad de la hepcidina son asociadas con la hemocromatosis juvenil, una enfermedad grave de sobrecarga de hierro (Roetto y colaboradores, Nat. Genet. , 33:21-22, 2003). Estudios en ratones han demostrado una función en la hepcidina en el control de la homeostasis normal de hierro (Nicolás y colaboradores, Nat. Genet., 34:97-101, 2003; Nicolás y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sel. EUA, 99:4596-4601, 2002; Nicolás y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 98 : 8780-8785, 2001) .

Además, se acumulan datos que implica a la hepcidina en el secuestro de hierro, durante la inflamación (Véase, por ejemplo, Weinstein y colaboradores, Blood, 100:3776-36781, 2002; Kemna y colaboradores, Blood, 106:1864-1866, 2005; Nicolás y colaboradores, J. Clin. Invest . , 110: 1037-1044, 2002; Nemeth y colaboradores, J. Clin. Invest., 113: 1271-1276, 2004; Nemeth y colaboradores, Blood, 101:2461-2463, 2003 y Rivera y colaboradores, Blood, 105:1797-1802, 2005). La expresión del gen de hepcidina se ha observado que se sobreregula firmemente después de los estímulos inflamatorios, tales como infecciones, las cuales inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas inmunitarios innatos de los vertebrados. En los ratones, la expresión del gen de hepcidina mostró que se regula por incremento por el lipopolisacárido (LPS) , turpentina, adyuvante completo de Freund, e infecciones adenovíricas . La expresión de la hepcidina se induce por la citoquina interleucina- 6 (IL-6) inflamatoria. Una fuerte correlación entre la expresión de la hepcidina y la anemia de inflamación también se descubrió en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo infecciones bacterianas, fúngicas y víricas.

La hepcidina humana, un péptido de 25 aminoácidos con actividad anti-microbiana y reguladora de hierro, se descubrió independientemente por dos grupos que investigan péptidos antimicrobianos novedosos. (Krause y colaboradores, FEBS Lett., 480:147 (2000); Park y colaboradores, J. Biol. Chem. , 276:7806 (2001)). También se ha referido como LEAP-1 (péptido antimicrobiano expresado en el hígado) . Un ADNc de hepcidina que codifica un pre-propéptido de 83 aminoácidos en ratones y un pre-propéptido de 84 aminoácidos en ratas y humanos se identificó subsecuentemente en una investigación para los genes específicos de hígado que se regularon' por el hierro (Pigeon y colaboradores, J. Biol. Chem., 276:781 1 (2001) ) . El péptido de señal de N-terminal de 24 residuos primero se parte para producir pro-hepcidina, la cual luego se procesa adicionalmente para producir hepcidina madura, encontrada tanto en la sangre como en la orina. En la orina humana, la forma predominante contiene 25 aminoácidos, aunque también están presentes péptidos de 22 y 20 aminoácidos más cortos.

El péptido maduro se caracteriza por contener ocho residuos de cisteína enlazados como cuatro puentes de disulfuro. La estructura de la hepcidina se estudió por Hunter y colaboradores, J. Biol. Chem., 277:37597-37603 (2002) , mediante RMN usando hepcidina químicamente sintetizada con un tiempo de retención de HPLC idéntico a aquel de la hepcidina nativa purificada de la orina. Hunter y colaboradores reportaron su determinación de que la hepcidina se plegó dentro de una estructura de bucle de horquilla que contiene un enlace de disulfuro vecinal (C1-C8, C2-C7, C3-C6, C4-C5) . Véase también Lauth y colaboradores, J. Biol. Chem. , 280:9272-9282 (2005). Sin embargo, como se descubre y se da a conocer en la Solicitud de Patente de EUA copendiente No. 12/022,515, incorporada a manera de referencia en este documento en su totalidad, se determinó que la estructura de la hepcidina tiene una conectividad de enlace de disulfuro diferente a aquella observada anteriormente.

Las Publicaciones de Solicitud de Patente de EUA Nos. 2003/0187228, 2004/0096987, 2004/0096990, 2005/0148025, 2006/0019339, 2005/0037971 y 2007/0224186; Patentes de EUA Nos. 7,232,892 y 7,294,690 y Publicación Internacional No. O 02/98444 plantean anticuerpos de hepcidina.

Breve Descripción de la Invención Varias modalidades de la invención proporcionan anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a la hepcidina humana, métodos para producir estos anticuerpos, métodos para usar estos anticuerpos para detectar la hepcidina, formulaciones farmacéuticas que incluyen estos anticuerpos, métodos para preparar las formulaciones farmacéuticas, y métodos para tratar pacientes con. las formulaciones farmacéuticas, que incluyen terapia de combinación con estimuladores de eritropoyesis como se describe posteriormente. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores y células hospederas recombinantes que comprenden estos ácidos nucleicos, y métodos para producir estos anticuerpos .

En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo aislado que se enlaza a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD de menor que aproximadamente 10" 8M que exhibe por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (a) por lo menos aproximadamente una KD 50 veces más alta en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6 comparada con su KD para la hepcidina en un pH de aproximadamente 7.4; (b) por lo menos aproximadamente una eliminación 5 veces más rápida de la hepcidina comparada con el anticuerpo 1S1; y (c) una constante de disociación de aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6. Alternativamente, o además de una o más de las propiedades anteriores, el anticuerpo exhibe por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (a) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre-formada en complejo de 3.7 g de hepcidina humana con una dosis de 1 mg del anticuerpo; (b) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 pg de hepcidina .humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; (c) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en la acumulación, total de hepcidina en suero total en los ratones tratados con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1; y (d) da por resultado por lo menos aproximadamente una acumulación intracelular 2 veces más alta de hepcidina en células HEK293 transfectadas con FcRn incubadas con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1.

En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo aislado que se enlaza a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD de menor que aproximadamente 10"8M, en donde el anticuerpo incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que sobreexpresa la hepcidina humana durante por lo menos 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3 , por lo menos 4 , por lo menos , por lo menos 6 , por lo menos .7 , por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis de anticuerpo .

En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo aislado que se enlaza a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9, con una afinidad KD de por lo menos 10"8M¿ en donde el anticuerpo se obtiene al: (a) reemplazar un aminoácido en la cadena pesada o ligera del anticuerpo con una histidina (b) detectar el anticuerpo obtenido en (a) para el enlace de pH diferencial; (c) reemplazar otro aminoácido en la cadena pesada o_ ligera del anticuerpo con una histidina; y (d) detectar el anticuerpo, para tener por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (i) por lo menos aproximadamente una KD 50-1000 veces más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6 comparada con su KD para la hepcidina en aproximadamente pH 7.4; y (ii) una constante de disociación de aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento disminuye el hierro en las células que expresan ferroportina estimuladas con 50 ng/mL de hepcidina en una EC50 de aproximadamente 20 nM o menor; y/o incrementa el nivel en un sujeto de una de por lo menos hemoglobina o hematocrito, o ambos; y/o incrementa en un sujeto uno de por lo menos el conteo de glóbulos rojos, el contenido de hemoglobina de los glóbulos rojos, o el volumen medio de células de glóbulos rojos del conteo de glóbulos rojos, o cualquiera de las combinaciones de los mismos; e/o incrementa en un sujeto uno de por lo menos el conteo de reticulocitos, el contenido de hemoglobina de los reticulocitos o el volumen medio de células de los reticulocitos del conteo de reticulocitos, o cualquiera de las combinaciones de los mismos; e/o inhibe la actividad reguladora del hierro de la hepcidina.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 170 o a SEQ ID NO: 168, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID NOs : 171-176, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos u '-; cambio- de aminoácidos a cualquiera, de SEQ ID NOs : 171-176. En un aspecto, el anticuerpo comprende SEQ ID NOs: 171-173. En otro aspecto, el anticuerpo comprende SEQ ID NOs: 174-176.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 333 o a SEQ ID NO: 331, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 334-349, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 334-349. En ün aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 334-346. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs-: 347-349.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 343 o a SEQ ID NO: 341, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 344-349, y cualquiera de . las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 344-349. En un aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 344-346. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 347-349.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 353 o a SEQ ID NO: 351, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 354-359, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 354-359. En un aspecto, un anticuerpo ' descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 354-356. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 357-359.

. En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 363 o a SEQ ID NO: 361, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 364-369, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos . un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 364-369. En un aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 364-366. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 367-369.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 373 o a SEQ ID NO: 37, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 374-379, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 374-379. En un aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 374-3-76. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 377-379.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 383 o a SEQ ID NO: 381, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 384-389, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 384-389. En un aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 384-386. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 387-389.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos, por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 393 o a SEQ ID NO: 391, él polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 394-399, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 394-399. En un aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs : 394-396. En otro aspecto, un anticuerpo descrito en este documento comprende SEQ ID NOs: 397-399.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170 en donde por lo menos uno, dos, tres o los cuatro aminoácidos en las posiciones 52, 57, 99 y 107 de la secuencia de aminoácidos se reemplazan con una histidin'a. Este anticuerpo puede comprender además SEQ ID NO: 168. En otras modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 en donde por lo menos uno o ambos de los aminoácidos en las posiciones 27 y 89 de la secuencia de aminoácidos se reemplazan con una histidina. Este anticuerpo puede comprender además SEQ ID NO: 170.

Opcionalmente, cualquiera de la SEQ ID NO: 170 modificada anterior y cualquiera de la SEQ ID NO: 168 modificada anterior se pueden combinar en un anticuerpo. En una modalidad, los aminoácidos en las posiciones 57 y 107 de SEQ ID NO: 170 ambos se reemplazan con una histidina. En otra modalidad, el aminoácido en la posición 107 de SEQ ID NO: 170 y el aminoácido en la posición 27 de SEQ ID NO: 168 ambos se reemplazan con una histidina. En otra modalidad, el aminoácido en la posición 107 de SEQ ID NO: 170 y el aminoácido en la posición 89 de SEQ ID NO: 168 ambos se reemplazan con una histidina. En todavía otra modalidad, los aminoácidos en las posiciones 99 y 107 de SEQ ID NO: 170 ambos se reemplazan con una histidina.

Cualquiera de " los anticuerpos anteriores puede ser un anticuerpo monoclonal, o un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunas modalidades, el anticuerpo es un isotipo igG, tal como un isotipo igGl, lgG2, igG3 o igG4.

En otro aspecto, las modalidades de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los anticuerpos anteriores, un vector de expresión que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas, enlazadas operablemente a una secuencia de control reguladora, células hospederas que comprenden estas moléculas de ácido nucleico aisladas o vectores, y métodos para usar estas células hospederas para producir un anticuerpo. Estos métodos de producción comprenden cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas de tal manera que el ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, y recuperar opcionalmente el anticuerpo de la célula hospedera o medio de cultivo. En una modalidad relacionada, se proporciona un anticuerpo o agente aislado producido mediante el método mencionado anteriormente. ' Las modalidades descritas en este documento incluyen una composición que contiene cualquiera de los anticuerpos anteriores, por ejemplo en una cantidad terapéuticamente efectiva, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, las -modalidades de la invención incluyen un método para tratar un trastorno de homeostasis de hierro en un sujeto en necesidad del mismo al administrar cualquiera de los anticuerpos o composiciones anteriores, por ejemplo, en una cantidad terapéuticamente efectiva. Los trastornos ejemplares de la homeostasis de hierro incluyen anemia, sepsis, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, trastorno renal de etapa final, enfermedad crónica de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V) , anemia por deficiencia de hierro, un trastorno de homeostasis de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis , diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriesclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías , y trastornos de glóbulos rojos. En aspectos relacionados, las modalidades de la invención proporcionan métodos para tratar a un humano con un nivel elevado de hepcidina, o métodos para tratar a un humano con anemia, al administrar cualquiera de los anticuerpos o composiciones anteriores, por ejemplo en una cantidad terapéuticamente efectiva. También se proporcionan usos de cualquiera de los anticuerpos anteriores en la preparación de un medicamento para tratar cualquiera de los sujetos o afecciones anteriores.

Se entiende que los métodos de co-administración que implican la administración de anticuerpos con un segundo agente terapéutico, como se describe en este documento, abarca no únicamente el uso del anticuerpo en preparación de un medicamento para la¦ co-administración con el segundo agente terapéutico, sino también el uso del segundo agente terapéutico en preparación de un medicamento para la co-administración con el anticuerpo.

En algunas modalidades, el mamífero es un humano que padece de una afección seleccionada del grupo que consiste de sobrecarga de hierro africana, alfa-talasemia, enfermedad de Alzheimer, anemia, anemia de cáncer, anemia enfermedad crónica, anemia de inflamación, arteriesclerosis o aterosclerosis (que incluye enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cerebrovascular o enfermedad arterial oclusiva periférica), ataxias, ataxias relacionadas con el hierro, atransferrinemia, cáncer, deficiencia de ceruloplasmina, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal crónica/de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V) , que incluye enfermedad renal de etapa final o deficiencia renal crónica/de los ríñones, cirrosis de hígado, hemocromatosis clásica, artritis inducida por colágeno (CIA) , condiciones con exceso de hepcidina (hepcidina elevada) , anemia diseritropoyética congénita, insuficiencia cardíaca conge'stiva, enfermedad de Crohn, diabetes, trastornos de biodistribución de hierro, trastornos de homeostasis de hierro, trastornos de metabolismo de hierro, .enfermedad de ferroportina, hemocromatosis de mutación de ferroportina, deficiencia de folato, ataxia de Friedrich, mielosis funicular, síndrome de grácil, infección con H. pyelori u otras infecciones bacterianas, enfermedad de Hallervordan Spatz, hemocromatosis, hemocromatosis que resulta de las mutaciones en el receptor 2 ¦ de transferina, hemoglobinopatías , hepatitis, hepatitis (Brock) , hepatitis C, carcinoma hepatocelular, hemocromatosis hereditaria, VIH u otras enfermedades víricas, enfermedad de Huntingdon, hiperferritinemia, anemia microcítica hipocrómica, hipoferremia, resistencia a la insulina, anemia por deficiencia de hierro, trastornos por deficiencia de hierro, trastornos de sobrecarga de hierro, condiciones por deficiencia de hierro con exceso de hepcidina, hemocromatosis juvenil (HFE2) , esclerosis múltiple, mutación en el receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina u otros genes del metabolismo de hierro, hemocromatosis neonatal, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el hierro, osteopenia, osteoporosis pancreatitis, neurodegeneración asociada por Pantotenato cinasa, enfermedad de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutánea tarda, pseudoencefalitis , hemosiderosis pulmonar, trastornos de glóbulos rojos, artritis reumatoide, . sepsis, anemia sideroblástica, lupus . eritematosos sistémico, talasemia, talasemia intermedia, sobrecarga de hierro transfusional , tumores, vasculitis, deficiencia de vitamina. B6, deficiencia de vitamina B12 y/o enfermedad de ilson.

En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar anemia, en los cuales a un humano se le administra cualquiera de los . anticuerpos o composiciones anteriores y un estimulador de eritropoyesis . Los estimuladores de eritropoyesis ejemplares incluyen eritropoyetina, variantes y péptidos o anticuerpos de eritropoyetina que en lazan y activan el receptor de eritropoyetina. Otros estimuladores de eritropoyesis ejemplares incluyen eritropoyetina humana de SEQ ID NO: 72 o alfa darbepoyetina de SEQ ID NO: 73. Las formas ejemplares de anemia que se pueden tratar de acuerdo con estos métodos incluyen anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia por deficiencia de hierro, un trastorno de homeostasis de hierro, enfermedad de ferroportina, o anemia que resulta de la enfermedad de los ríñones. También se proporcionan métodos para tratar un mamífero con' anemia que es hipo-sensible, o aun resistente a la terapia con un estimulador de eritropoyesis , que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza específicamente a la hepcidina humana. Cualquiera de los métodos anteriores también puede incluir administrar hierro al sujeto.

La breve descripción anterior no se propone para definir cada aspecto de la invención, y se describen aspectos adicionales en otras secciones, tal como la descripción detallada. El documento completo se propone para ser relacionado como una divulgación unificada, y se debe entender que todas las combinaciones de las características descritas en este documento se pueden contemplar, aún si la combinación de las características no se encuentran juntas en la misma oración, o párrafo o sección de este documento.

Además de lo anterior, la invención puede incluir, como un aspecto adicional, todas las modalidades de la invención limitadas en alcance en cualquier forma que las variaciones definidas por los párrafos específicos en este documento. Por ejemplo, ciertos aspectos de la invención que se describen como un género, y se deben entender que cada miembro de un género es individualmente, un aspecto de la invención. También, los aspectos descritos como un género o selección de un miembro de un género, se debe entender que incluyen combinaciones de dos o más miembros del género.

Se debe entender que mientras varias modalidades en especificación se presentan usando el lenguaje- "que comprende", bajo varias circunstancias, una modalidad relacionada también se puede describir usando el lenguaje "que consiste de" o "que consiste esencialmente de. Se va a observar que el término "un" o "una" , se refiere a uno o más, por ejemplo, "una molécula de inmunoglobulina", se entiende que representa una o más moléculas de inmunoglobulina. Como tal, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "por lo menos uno" se pueden usar intercambiablemente en este documento.

Se debe entender que cuando se describe un intervalo de valores, la característica que se describe podría ser un valor individual encontrado dentro del intervalo. Por ejemplo, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6", podría ser, pero no se limita a, pH , 4.2, 4.6, 5.1 5.5 etcétera y cualquier valor entre estos valores. Adicionalmente, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6", no se debe considerar que propone que el pH de una formulación en cuestión varía 2 unidades de pH en el intervalo de pH 4 a pH 6 durante el almacenamiento, sino más bien un valor se puede seleccionar en ese intervalo para el pH de la solución, y el pH permanece amortiguado en aproximadamente ese pH. En algunas modalidades, cuando se usa el término "aproximadamente" , propone el número citado más o menos 5%, 10%, 15% o más de ese número citado. La variación actual propuesta es determinable a partir del contexto. Aunque los solicitantes irivéntaron el alcance completo de la invención descrito en este documento, los solicitantes no proponen reclamar el contenido descrito en el trabajo de la técnica anterior de otras. Por lo tanto, en el caso en que la técnica anterior dentro del alcance de una reivindicación se trae .la tensión de los solicitantes por una oficina de patentes u otra entidad "o individuo, los solicitantes reservan el derecho de ejercer los derechos de enmienda bajo las leyes de patente aplicables para redefinir el tema de esta reivindicación para excluir específicamente esta técnica anterior legal o variaciones obvias de la técnica anterior legal del alcance de esta reivindicación. Las variaciones de la invención definidas por estas reivindicaciones enmendadas también se proponen como aspectos de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1F muestran las constantes de disociación para los anticuerpos 1S1, 1S3 , 2.7, 18B11, 23F11 y 26F11.

La Figura 2 muestra la capacidad funcional del anticuerpo 2.7 anti-hepcidina de murino para reducir las concentraciones de hierro intracelulares en un ensayo de respuesta de hierro de beta-lactamasa .

La Figura 3 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-hepcidina humanos 18B11, 23F11 y 24E4 para reducir las concentraciones de hierro intracelulares que en un ensayo de respuesta de hierro de beta-lactamasa.

Las Figuras 4A a 4B muestran que un anticuerpo anti-hepcidina neutroiza la hepcidina humana inyectada en ratones .

Las Figuras 5A a 5E demuestran que la neutralización del anticuerpo de la hepcidina humana expresada viralmente por los ratones restaura las características de los glóbulos blancos tempranas normales.

Las Figuras 6A y 6B demuestran que el tratamiento con el anticuerpo 18B11 restauró las características de los glóbulos blancos tempranas normales .

Las Figuras 7A y 7B demuestran que el tratamiento con el anticuerpo 18B11 conduce a una reducción significativa en los niveles totales de hepcidina.

La Figura 8 muestra una titulación de una expresión de hepcidina mediada por el virus asociado con el adenovirus (AAV) y concentraciones de hierro en suero resultantes.

La Figura 9 muestra que la sobreexpresión viral de la hepcidina causa hiposensibilidad a la eritropoyetina.

Las Figuras 10A a 10E demuestran que un anticuerpo anti-hepcidina restaura la sensibilidad a la eritropoyetina en ratones que sobreexpresan viralmente la hepcidina.

Las Figuras 11A a 11C muestran que la neutroización de la hepcidina por el tratamiento con anticuerpos anti-hepcidina restaura la sensibilidad a la eritropoyetina en ratones genéticamente eficientes con hepcidina humana con anemia de inflamación.

La Figura 12 demuestra que los niveles de hepcidina.. son elevados en pacientes con anemia de cáncer (AoC) y no en pacientes normales.

La Figura 13 demuestra que los niveles de hepcidina se correlacionan con la diagnosis de la anemia inflamatoria y no con la anemia por deficiencia de hierro.

La Figura 14A muestra un árbol de decisiones de índices de hierro y estados de enfermedad para la estimación de un paciente, en ausencia de la medición de hepcidina.

La Figura 14B muestra un árbol de decisiones teórico para la estimación de un paciente que usa una medición de niveles de hepcidina.

Las Figuras 15A-15B muestran la concentración de prohepcidina medida por un inmunoensayo de emparedado, que demuestra que la prohepcidina no es detectable en suero.

La Figura 16 muestra los resultados de un experimento Biacore que demuestra que dos anticuerpos monoclonales pueden enlazarse a la hepcidina a la vez.

La Figura 17 demuestra que un ELISA de emparedado se puede construir con anticuerpos monoclonales contra la hepcidina madura.

La Figura 18 muestra la concentración de la hepcidina presente en la solución amortiguadora, suero de conejo y suero humano agrupado como se determina por un ensayo de enlace competitivo.

La Figura 19 muestra la medición de la hepcidina en los sueros humanos .

La Figura 20 muestra la concentración de hepcidina presente en sueros humanos normales que usan un ensayo de enlace competitivo.

La Figura 21 muestra la concentración de anticuerpos en suero de anticuerpos 1S1 y 18B11 después de la administración de complejos de anticuerpo-hepcidina en varios puntos de tiempo.

La Figura 22 muestra la concentración de hepcidina en suero después de la administración de los complejos de anticuerpo-antígeno en varios puntos de tiempo.

La Figura 23 muestra la- concentración de hepcidina de orina total en ratones pre-dosificados con el anticuerpo 1S1 o 18B11 en varios puntos de tiempo.

La Figura 24 muestra la concentración de hepcidina en suero después de la administración de los anticuerpos 18B11 y 1S1 en varios puntos de tiempo.

La Figura 25 muestra la concentración de hepcidina en suero en ratones pre-dosificados con el anticuerpo 1S1 y 18B11 en varios puntos de tiempo.

La Figura 26 demuestra que el anticuerpo 18B11 causa una acumulación de hepcidina intracelular .

Descripción Detallada de la Invención Se describen en este documento anticuerpos que exhiben una o más propiedades que se asocian con la • eliminación del antígeno objetivo mejorado de la circulación. Normalmente, los anticuerpos se internalizan dentro de las células y luego se reciclan de nuevo en la circulación por la vía de una ruta que implica el receptor FcRn (SEQ ID NO: 400) . Véase, por ejemplo, Prabhat y colaboradores, Proc . Nat'l Acad. Sci., 104 (14 ) : 5889-5894 (2007). Los anticuerpos (ya sea solos o formados en complejo con el antígeno) se internalizan dentro de los endosomas acidificados de las células. Algunos de estos anticuerpos en los endosomas acidificados luego se enlazan a FcRn, el cual luego recicla los anticuerpos y cualquier antígeno asociado de nuevo fuera de la célula. Los anticuerpos y/o antígeno los cuales no se enlazaron a FcRn son transportados a los lisosomas donde se degradan.

Se proporcionan anticuerpos en este documento que exhiben enlace de pH diferencial a un antígeno en un pH abajo de aproximadamente 7.4, así como también métodos mejorados de tratamiento que usan estos anticuerpos. Por ejemplo, en algunas modalidades, estos anticuerpos se enlazan al antígeno con una afinidad de enlace reducida de por lo menos aproximadamente de 50 veces a 1000 veces o más en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6 comparado con un pH de aproximadamente 7.4 (como es medido por una KD relativa de 50 veces a 1000 veces o más alta en pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6 comparado con un pH de aproximadamente 7.4). En algunas modalidades, los anticuerpos exhiben una rápida constante de disociación para al antígeno de aproximadamente 6 x 10"2 s"1 o más alta, o .aproximadamente 1 x 10"1 s"1 o más alta. Estos anticuerpos se espera que se enlacen al antígeno en la circulación pero tienden a liberar el antígeno en los endosomas acidificados en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6. La mayor liberación del antígeno en los lisosomas acidificados se asocia con la mayor degradación del antígeno objetivo y la eliminación mejorada del antígeno. Otra propiedad puede ser un mayor reciclaje de anticuerpos libres (no enlazados al antígeno) dentro de la circulación para enlazarse al antígeno adicional. En contraste, los anticuerpos que no liberan su antígeno se reciclan más frecuentemente dentro de la circulación como un complejo de anticuerpo-antígeno, dando por resultado la incapacidad del anticuerpo de enlazarse a y eliminar finalmente el antígeno adicional de la circulación.

También se proporcionan anticuerpos que producen una acumulación intracelular incrementada, por ejemplo, por lo menos -1.5 veces o 2 veces de antígeno objetivo y/o eliminación mejorada del antígeno de la circulación y/o acumulación reducida del antígeno circulante, así como también métodos mejorados de tratamiento que usan estos anticuerpos. Otras propiedades de estos anticuerpos pueden incluir la - -prevención de acumulación de complejos de anticuerpo-antígeno en la circulación, haciendo el anticuerpo libre más reciclaje disponible para enlazar el antígeno que los anticuerpos convencionales, mejor potencia y dosis reducida y/o o frecuencia de administración para lograr una efectividad terapéutica.

Los antígenos objetivo pueden incluir algunos antígenos que tienen un nivel relativamente alto de producción y/o una vida media corta en la circulación de aproximadamente 24 horas o menos, o aproximadamente 18, 12, 8, 4, 3, 2, o 1 hora o menos, o aproximadamente 45, 30, o 15 minutos o menos. Los anticuerpos se enlazarán generalmente al antígeno objetivo con una KD en el intervalo de 1 x 10"6M o menos, o que desciende a 10"16M o más bajo, (por ejemplo, aproximadamente 10"6, aproximadamente 10"7, aproximadamente 10" 8, aproximadamente 10"9, aproximadamente 10~10, aproximadamente 10"11, aproximadamente 10"12, aproximadamente 10~13, aproximadamente 10~14, aproximadamente 10~15, aproximadamente 10"16 o menos) , donde la KD mas baja indica mejor afinidad.

También se proporcionan métodos para detectar anticuerpos con propiedades deseadas que comprenden identificar un anticuerpo que exhibe enlace de pH diferencial ,a un antígeno en un pH abajo de aproximadamente 7.4, y que demuestra opcionalmente que el anticuerpo exhibe eliminación de antígeno objetivo mejorada relativo con un anticuerpo de afinidad de enlace similar o mejor que no exhibe enlace de pH diferencial, y/o que demuestra opcionalmente que el anticuerpo exhibe acumulación intracelular incrementada del antígeno objetivo y/o acumulación reducida - del antígeno circulante con relación a un anticuerpo de afinidad de enlace similar o mejor que no exhibe enlace de pH diferencial.

En otro aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento que implican administrar cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos con las propiedades descritas anteriormente, opcionalmente que implican también detectar el nivel de sangre circulante de un antígeno objetivo antes o concurrente con la administración, y detectar el nivel de sangre circulante del antígeno objetivo después de la administración, por ejemplo aproximadamente 24 horas, 2 días, 3, 4, 5, 6, 7 días, o 2 semanas después de la administración.

La hepcidina es un buen antígeno objetivo para los anticuerpos que exhiben las propiedades descritas en este documento. La hepcidina tiene una vida media relativamente corta (Rivera y colaboradores, Blood, 106:2196- 2199, 2005). El gen de- hepcidina humana codifica un pre-propéptido de 84 residuos (SEQ ID NO:' 8). El ADNc correspondiente y las secuencias genómicas se establecen en SEQ ID NOs: 7 y 100, respectivamente! El péptido señal N-terminal de 24 residuos (residuos 1-24 de SEQ ID NO: 8.) primero se' parte para producir la pro-hepcidina, la cual luego se procesa adicionalmente mediante la escisión del pro-dominio (residuos 25-59 de SEQ ID NO: 8) para producir la hepcidina madura de 25 residuos' (residuos 60-84 de SEQ ID NO: 8, establecida en SEQ ID NO: 9) . Además de la forma de 25 aminoácidos primaria, las formas N-terminalmente truncadas adicionales que son 20 o 22 aminoácidos en longitud se pueden identificar en la orina (20 aminoácidos, SEQ ID NO: 96; y 22 aminoácidos, SEQ ID NO: 98) . La hepcidina humana madura contiene ocho residuos de cisteína, los cuales son referidos ' en este documento secuencialmente como Cl a C8 (numerados desde la N-terminal hasta la C-terminal) .

En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en este documento se enlazan a la hepcidina humana bioactiva madura, correctamente plegada en la cual los enlaces de disulfuro se forman entre C1-C8, C2-C4, C3-C6 y C5-C7, con la afinidad deseada. En algunas modalidades, los anticuerpos inhiben la actividad reguladora de hierro de la hepcidina. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal disminuye la concentración "de hierro intracelular y/o incrementa la concentración de hierro circulante en una EC50 de aproximadamente 1018M o menor, o aproximadamente 20 nM o menor. En algunas modalidades, el anticuerpo exhibe la propiedad de los mamíferos de incrementar el conteo de glóbulos rojos (número) o niveles de hemoglobina o hematocritos , y/o normalizar el conteo de reticulocitos, volumen medio de células de reticulocitos y/o conteo de hemoglobina de reticulocitos, incrementa el nivel de. hierro circulante o Tsat en un ratón que sobreexpresa la hepcidina humana durante por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 días o más prolongado después de una sola dosis del anticuerpo.

ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA Y AGENTES DE ENLACE ESPECIFICOS El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos totalmente ensamblados, anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (que incluyen anticuerpo biespecífieos) , fragmento de anticuerpo que se pueden enlazar a un antígeno (que incluyen, Fab' , F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena individual, diacuerpos) , y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Se contemplan multímeros agregados de moléculas y/o fragmentos intactos que incluyen anticuerpos químicamente derivatizados . Se contemplan anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo, que incluyen IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2 , o cualquier alotipo. Diferente isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los "isotipos IgGl e IgG3 tienen -actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en este documento exhiben enlace de pH diferencial a un antígeno. El término "enlace de pH diferencial" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo que se enlaza a su antígeno con alta afinidad (KD más baja) a un pH de aproximadamente 7.4 pero se enlaza al antígeno con una afinidad más baja ( D más alta) en un pH más bajo. Un anticuerpo que exhibe una KD que es por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 100, por lo menos 150, por lo menos 200, por lo menos 250, por lo menos 300, por lo menos 350, por lo menos 400, por lo menos 450, por lo menos 500, por lo menos 550, por lo menos 600, por lo menos 650, por lo menos 700, por lo menos 750, por lo menos 800, por lo menos 850, por lo menos 900, por lo menos 950, por lo menos 1000 veces o más alta para su antígeno en un pH -más ácido que un pH de aproximadamente 7.4 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.5, aproximadamente 6.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 5.0 o .aproximadamente 4.5) se contempla específicamente.

El término "afinidad de enlace o "afinidad" como se usa en este documento se refiere a la constante de disociación de equilibrio (KD) asociada con cada interacción de antígeno-anticuerpo . En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en este documento exhiben propiedades deseables tal como afinidad de enlace como es medida por la KD para la hepcidina en el intervalo de 1 x 10"6M o menor, o que desciende a 10"16M o menor, (por ejemplo, aproximadamente 10"6, 10"12, 10"13, 10"14, 10"15, 10" 16M o menor) en aproximadamente pH 7.4, donde" la KD más baja indica mejor afinidad. Opcionalmente el anticuerpo exhibe además una KD para la hepcidina por lo menos 50-1000 veces más alta (afinidad de enlace menor) a aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6 comparado con un pH de aproximadamente 7.4. La constan de disociación de equilibrio se puede determinar en un ensayo de equilibrio en solución usando BIAcore y/o KinExA, tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4.

La afinidad de enlace se relaciona directamente con la relación de la constante de disociación cinética (reportada generalmente en unidades de tiempo inverso, por ejemplo segundos"1) dividida por la constante de asociación cinética (reportada generalmente en unidades de concentración por tiempo unitario, por ejemplo M/s). El análisis de constante de disociación puede estimar la estimar la interacción que ocurre en vivo, puesto que una constante de disociación lenta pre-elegiría un grado mayor de interacción durante un período de tiempo, prolongado. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en este documento exhiben una constante de disociación de aproximadamente 6x10" ^s"1 o más alta, o aproximadamente 1 x 10"1 s"1 o más alta (constante de disociación más rápida) en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6. Opcionalmente , el anticuerpo también exhibe una constante de disociación de 1 x lO^s"1 o menor (constante de disociación más lenta) en aproximadamente pH 7.4. En otras modalidades, los anticuerpos descritos en' este documento exhiben una constante de disociación (media en s"1) que es por lo menos aproximadamente 10 veces, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6 comparada con la constante de disociación en aproximadamente pH 7.4.

En otras modalidades, los anticuerpos descritos en este documento exhiben especificidad para o se enlazan específicamente a la hepcidina humana. Como se usa en este documento, un anticuerpo es "específico para" o "se enlaza específicamente" a la hepcidina humana cuando tiene una afinidad de enlace significativamente más alta para, y consecuentemente es capaz de distinguir, la hepcidina humana comparada con otras proteínas no relacionadas en diferentes familias. En algunas modalidades, estos anticuerpos también pueden tener una reacción cruzada con hepcidina u otras especies, tal como hepcidina de murino, rata, o primate mientras que en otras modalidades, los anticuerpos se enlazan únicamente ' a la hepcidina humana de primate y no significativamente a la hepcidina de roedor. En algunas modalidades, los anticuerpos se enlazan a la hepcidina humana y de mono cynomolgus pero no significativamente la hepcidina de roedor. En algunas modalidades, los anticuerpos específicos para la hepcidina tienen una reacción cruzada con otras proteínas en la misma familia, mientras que en otras modalidades, los anticuerpos distinguen la hepcidina de otros miembros de familia relacionados, que incluyen defensinas o hepc2 de ratón.

En algunas modalidades, los anticuerpos exhiben "eliminación de antígeno objetivo mejorada", significa que producen una reducción más rápida o mayor en los niveles de sangre circulante del antígeno objetivo total. Por ejemplo, la eliminación del antígeno mejorada comparada con un anticuerpo que no exhibe enlace de pH diferencial se puede medir al comparar los niveles de sangre del antígeno objetivo en un cierto punto de tiempo, por ejemplo aproximadamente 12, 24, 36, 48, o 72 horas, después de la administración del anticuerpo. La eliminación del antígeno mejorada dará por resultado una reducción mayor en el nivel de sangre en el mismo punto de tiempo. Alternativamente, por ejemplo, la eliminación mejorada del antígeno se puede, medir al comparar el período de tiempo requerido para reducir el antígeno objetivo a, por ejemplo, 25%, 50%, 75% o 90% de su nivel de sangre antes de la administración del anticuerpo. La eliminación mejorada del antígeno dará por resultado un período de tiempo más corto para lograr esta reducción. Como todavía otra alternativa, la eliminación mejorada del antígeno se indica por la mayor internalización del antígeno objetivo dentro de las células que expresan FcRn, como es medido por la acumulación intracelular del antígeno objetivo.

En todavía otras modalidades, los anticuerpos monoclonales inhiben (o neutroizan) la actividad reguladora de hierro de la hepcidina, in vitro y/o in vivo. Estos anticuerpos neutroizantes de la hepcidina son terapéuticamente útiles para trastornos relacionados con hepcidina o trastornos de la homeostasis de hierro. La actividad neutroizante de la hepcidina se puede medir a través de una variedad de marcadores, por ejemplo, niveles de ferritina/hierro, conteo de glóbulos rojos, características de glóbulos rojos (contenido de hemoglobina y/o volumen de células) , características de glóbulos rojos precoces (números de reticulocitos , contenido de hemoglobina o volumen de células) (Clinical Hematology, tercera edición, Lippincott, Williams and Wilkins; editor Mary L. Turgeon, 1999) internalización de la ferroportina, o transporte de hierro. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal disminuye la concentración de hierro intracelular en una EC50 de aproximadamente 10"8M o menor y/o incrementa la concentración de hierro circulante.

En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal como se describe en este documento antagoniza el efecto de la hepcidina humana o "inhibe la actividad reguladora de hierro de la hepcidina. En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal como se describe . en este documento ejerce un efecto en ,una EC50 de aproximadamente lxlO"8M o menor, o aproximadamente lxlO"7M o menor. Por ejemplo, un anticuerpo puede disminuir el nivel de hierro intracelular en una célula en una EC50 de aproximadamente lxlO"8 M o menor, o puede reducir la expresión de ferritina de una EC50 de aproximadamente lxlO"8 M o menor, como se determina por un ensayo de ferritina. En otras modalidades, un anticuerpo monoclonal como se describe en este documento puede reducir los niveles de hepcidina en suero libre por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 90%. En otras modalidades, un anticuerpo monoclonal como se describe en este documento puede incrementar el conteo dé glóbulos rojos (número) , volumen medio de- células de los glóbulos rojos o contenido de hemoglobina de los glóbulos rojos, incrementar la hemoglobina, incrementar los hematocritos , incrementar el Tsat, incrementar los niveles de hierro circulantes (o en suero) y/o incrementar o normalizar el conteo de reticulocitos , volumen medio de células de los reticulocitos , contenido de "hemoglobina de los. reticulocitos o números ' de reticulocitos.

En algunas modalidades, la invención contempla: 1) un anticuerpo monoclonal que retiene cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, ¿- cinco o seis de CDRH1 , GDRH2, CDRH3 , CDRL1, CDRL2 o CDRL3 de cualquiera de anticuerpo Ab43, 2.7, 2.41, R9, 1C9, 1S1, 1S2, 1S3, 1S4, 1S5, 3B3; 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11, que incluye opcionalmente una o dos mutaciones en estas CDR(s), en donde el anticuerpo exhibe enlace de pH diferencial, y/o constante de disociación rápida (por ejemplo, 6xl0"2 s"1 o más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6, y/o eliminación mejorada de hepcidina; .2) un anticuerpo monoclonal que retiene todo de CDRHl, CDRH2, CDRH3 , o la región variable de cadena pesada de cualquiera del anticuerpo Ab43, 2.7, 2.41, R9, 1C9, 1S1, 1S2, 1S3, 1S4, 1S5, 3B3 ; 4E1, 7A3 , 9D12 , 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11,' 24E4 y 26F11, que incluye opcionalmente una o dos mutaciones en estas CDR(s) , en donde el anticuerpo exhibe el enlace de pH diferencial, y/o constante de disociación rápida (por ejemplo, 6xl0"2 s"1 o más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente . .6, y/o eliminación mejorada de hepcidina; 3) un anticuerpo monoclonal que retiene todo., 'de CDRL1, CDRL2, CDRL3 , o la región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos Ab43, 2.7, 2.41, R9, 1C9, lSl", 1S2, 1S3 , 1S4 , 1S5, 3B3; 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 18BU, 18D8 , 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11, que incluye opcionalmente una o dos mutaciones en estos CDR(s) , en,..', donde el anticuerpo exhibe enlace de pH diferencial, y/o constante de disociación rápida (por ejemplo, 6xl0"2 s"1 o más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6, y/o eliminación mejorada de hepcidina; 4) un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítopo de la hepcidina humana madura como el anticuerpo Ab43, 2.7, 2.41 , R9( 1C9, 1S1, 1S2, 1S3, 1S4 , 1S5, 3B3 ; 4E1, 7A3, 9D12, 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11, por ejemplo como se determina a través de la cristalografía de rayos X o un epítopo conformacional que comprende un aminoácido dentro de los aminoácidos 1-5 de SEQ . ID NO: 9 y/o un aminoácido dentro de un bucle formado por los aminoácidos 10-13 de SEQ ID NO: 9 y/o un aminoácido dentro de un bucle formado por los aminoácidos 14-22 de SEQ ID NO: 9, en donde el anticuerpo exhibe enlace de pH diferencial, y/o constante de disociación rápida (por ejemplo, ..6xl0-2 s'"1 o más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6, y/o eliminación mejorada de hepcidina * 5) un anticuerpo .monoclonal que compite con el anticuerpo Ab43, 2.7, 2.41, R9, 1C9, 1S1, 1S2, 1S3, 1S4, 1S5, 3B3; 4E1, 7A3 , 9D12 , 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11 para enlazarse a la hepcidina humana madura por más de aproximadamente 75%, más de aproximadamente 80%, o más de aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95% (por ejemplo, estimado por el ELISA o Biacore o por otros métodos conocidos en el campo) en donde el anticuerpo exhibe enlace de pH diferencial, y/o constante de disociación rápida (por ejemplo, 6xl0"2 s"1 o más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6, y/o eliminación mejorada de hepcidina; 6) un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD (constante de disociación de equilibro) para la hepcidina en el intervalo de 1 x 10"8M o menor, o que desciende a 10"16 M o menor, (por ejemplo, aproximadamente 10"8, 10~9, 10~10, 10"11, 10~12, 10"13, 10"14, 10"15, 10"1ß M o menor) como es medido por el BIAcore o KinExA y que exhibe por lo menos una, dos, tres o más de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: i) enlace de pH diferencial como se mue'stra por una afinidad por lo menos aproximadamente 50-1000 veces más baja (o KD más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6 comparado con aproximadamente pH 7.4; ii) una eliminación por lo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces más rápida de la hepcidina comparada con el anticuerpo 1S1; iii) una velocidad de constante de disociación como es medido por, por ejemplo, una constante de disociación de aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6 , o una constante - de disociación de aproximadamente 1 x 10"1 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6, o una constante de disociación de por lo menos aproximadamente 10 veces, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces a aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente 6 comparada con la constante de disociación en aproximadamente pH 7.4; iv) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero por lo menos aproximadamente 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre-formadas en complejo de 3.7 de hepcidina humana con una dosis de 1 mg del anticuerpo; v) . reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 ig de hepcidina humana, " en donde la hepcidina se administra tres días después de que al ratón se le pre-dosifica con el anticuerpo; vi) produce por lo menos aproximadamente una acumulación intracelular de 1.5 veces o 2 veces más alta de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1; vii) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en la acumulación total de hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1, por ejemplo, en aproximadamente 24 horas; y/o viii) incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos -6 , por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis del anticuerpo.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento exhibe enlace de pH diferencial como se muestra por una afinidad por lo menos aproximadamente 50-1000 veces más baja (KD más alta) en un pH de aproximadamente 5.5 o aproximadamente 6 comparado en aproximadamente pH 7.4 y también exhibe (1) una eliminación por lo menos' aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces más rápida de la hepcidina comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (2) una velocidad de constante de disociación de, por ejemplo, aproximadamente 6 x 10~12 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6; y/o (3) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero por lo menos aproximadamente 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre- formada en complejo de 3.7 g de hepcidina humana con una dosis de 1 ¦ mg del anticuerpo; y/o (4) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente- 24 horas después que al ratón se le administra . una sola dosis de 3.7 pg de hepcidina humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; y/o (5) reduce además la acumulación intracelular por lo menos aproximadamente 1.5 veces o 2 veces más alta de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (6) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en la acumulación total de la hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1; y/o (7) incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis del anticuerpo.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento exhibe una eliminación de por lo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces más rápida de la hepcidina comparada con el anticuerpo 1S1 y~ también (1) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero por lo menos aproximadamente 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre-formada en complejo de 3.7 µ? de hepcidina humana con una 'dosis de 1 mg del anticuerpo; y/o (2) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 pg de hepcidina humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; y/o (3) produce una acumulación intracelular por lo menos aproximadamente 1.5 veces o 2 veces más alta de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (4) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en la acumulación total de la hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparada con el anticuerpo 1S1 y/o (5) incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7 , por lo menos 8, por -lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis del anticuerpo.

En algunas modalidades, el anticuerpo exhibe una velocidad de constante de disociación, por ejemplo, aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5 o aproximadamente pH 6 y también (1) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero por lo menos aproximadamente 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis preformada en complejo de 3.7 µq de hepcidina humana con una dosis de 1 mg del anticuerpo; y/o (2) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 yg de hepcidina humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; y/o (3) produce una acumulación intracelular de por lo menos aproximadamente 1.5 veces o dos veces más ala de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (4) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en la acumulación total de hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (5) incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3 , por lo menos 4 , por lo menos 5 , por lo menos 6 , por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis del anticuerpo .

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento reduce el nivel de hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 g de hepcidina humana," en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo, y también (1) produce una acumulación intracelular de por lo menos aproximadamente 1.5 veces o 2 veces más alta de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (2) da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en- la acumulación total de la hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparada con el anticuerpo 1S1; y/o (3) incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durante por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11· días o más después de una sola dosis del anticuerpo.

En algunas modalidades, un anticuerpo descrito en este documento produce una acumulación intracelular de por lo menos aproximadamente 1.5 veces o 2 veces más alta de hepcidina humana en células HEK293 transfectadas con FcRn comparada con el anticuerpo 1S1 y también da por resultado una reducción mayor que aproximadamente 50% en acumulación total de hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparada con el anticuerpo ISl; y/o incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que expresa hepcidina durable por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos 2, por lo menos 3 , . or lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 días o más después de una sola dosis del anticuerpo.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para modificar anticuerpos que carecen de propiedades tal como enlace de pH diferencial y/o eliminación mejorada de antígeno objetivo) para producir anticuerpos que exhiben estas propiedades. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-hepcidina producido mediante estos métodos. En algunas modalidades, los residuos en las CDRs y/o residuos que de acuerdo con el modelo tridimensional se predicen para ser más afectados por la introducción de un aminoácido con una pKa en el intervalo de pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.4 son mutados por la introducción de este -aminoácido, por ejemplo histidina. La histidina es un aminoácido que es sensible a los cambios de pH de 7.4 a 6.0, ya que la cadena lateral de imidazol de la histidina tiene una pKa justo arriba de 6 , la cual puede variar ligeramente más alta o más baja dependiendo del medio ambiente del aminoácido. En un. cambio en el pH de aproximadamente 7.4 a-"un pH más bajo de aproximadamente 6.0 o 5.5, por ejemplo, el anticuerpo mutado puede someterse a un cambio conformacionaí alostérico que interrumpiría la interacción del antígeno-anticuerpo .

Los residuos candidato para la mutación incluyen residuos que son sitios de contacto dirigidos con antígeno o sitios que contribuyen a la formación de interacciones de carga-carga a lo largo de la interfaz de enlace de anticuerpo-antígeno . Otros residuos candidato incluyen residuos dentro de regiones conservadas del anticuerpo. Todavía otros residuos candidato incluyen residuos de estructura que son por lo menos 10% de superficie expuesta y dentro de 4.5 Á un resido de CDR. Los residuos candidato adicionales incluyen aquellos seleccionados por la inspección visual de . un : modelo estructural tridimensional para aminoácidos en a proximidad a las CD s . o residuos de estructura seleccionado. La histidina u otros aminoácidos deseados se pueden mutar en las posiciones 'individuales o múltiples dentro de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las mutaciones que producen algún efecto de enlace de pH diferencial como mutaciones individuales se pueden combinar como mutaciones dobles, triples o más mutaciones múltiples. Los anticuerpos que se han mutado de tal manera luego se clasifican para el enlace de pH diferencial y luego se pueden clasificar adicionalmente para otras propiedades.

En un aspecto, por lo menos uno, dos, tres, cuatro, seis o más residuos en la región variable de cadena pesada del anticuerpo se suprimen y se reemplazan con un residuo de histidina. En otro aspecto, por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más residuos en la región variable de cadena ligera del anticuerpo se suprimen y se reemplazan con un residuo de histidina. En algunos aspectos, por lo menos un residuo de la región variable de cadena ligera del anticuerpo y por lo menos un residuo de la región variable de cadena pesada del anticuerpo se reemplaza con un residuo de histidina. En una modalidad, por lo menos un residuo en la región variable de cadena pesada en una posición seleccionada del grupo que consiste de 52, 57, 99 and 107 de SEQ ID NO: 170 se reemplaza con un residuo de histidina. En otra modalidad, por lo menos un residuo en la región variable' de cadena ligera en una posición seleccionada del grupo que consiste de 27 y 89 de SEQ ID NO: 168 se reemplaza con un residuo de histidina. En otra modalidad, los aminoácidos en las posiciones 57 y 107 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 170 se reemplazan con un residuo de histidina. En otra modalidad, los aminoácidos en la posición 107 de la región variable de cadena pesada de, SEQ ID NO: 170 y la posición 27 de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 168 se reemplazan con una histidina. En otra modalidad, el aminoácido en la posición 107 de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 170 y el aminoácido en la posición 89 de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 168 se reemplaza con una histidina. En otra modalidad, el aminoácido en las posiciones 99 y 107 de . la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 170 se reemplazan con una histidina.

En una modalidad, el anticuerpo comprende .por ' lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 16-21 (Ab 43). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 28-33 (2.7 CDRs) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 40-45 (2.41 CDRs). En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 52-57 (CDRs R9) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 111-116 (CDRs 1C9) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 121-126 (CDRs 3B3). En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : Q 131-136 (CDRs 4Él) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 141-146 (CDRs 7A3) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 151-156 (CDRs 9D12). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 161-166 (CDRs 12B9) . En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 171-176 (CDRs 15E1) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 334-339 (CDRs 18B11) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro;, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 314-319 (CDRs 18D8). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 344-349 (CDRs 19B8) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 324-329 (CDRs 19C1) . En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 294-299 (CDRs 19D12) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 304-309 (CDRs 19H6). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 354-359 (CDRs 20E12) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias , de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 364-369 (CDRs 22F12) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, "tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 374-379 (CDRs 22H10). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 384-389 (CDRs 23A11) . En todavía otra modalidad,' el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 181-186 (CDRs 23F11) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 394-399 (CDRs 24E4). En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 191-196 (CDRs 26F11) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 203-205 and 131-133 (CDRs 1S1) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 214-216 and 144-146 (CDRs 1S2) . En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 225-227 y 164-166 (CDRs 1S3) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de.- aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 236-238 and 174-176 (CDRs 1S4) . En otra modalidad, el anticuerpo comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 247-249 y 184-186 (CDRs 1S5).

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena ligera, las tres CDRs de cadena pesada, o las seis CDRs. En algunas modalidades, los CDRs de cadena ligera de un anticuerpo se pueden combinar con un tercer CDR de cadena ligera de un anticuerpo diferente. Alternativamente, una CDRL1 de un anticuerpo se puede combinar con una CDRL2 de un anticuerpo diferente y una CDRL3 de todavía otro anticuerpo, particularmente donde las CDRs son altamente homologas. Similarmente, dos CDRs de cadena pesada de un anticuerpo se pueden combinar con un tercer CDR de cadena pesada de un diferente anticuerpo; o un CDRH1 de un anticuerpo se puede combinar con una CDRH2 de un anticuerpo diferente y un . CDRH3 de todavía otro anticuerpo, particularmente donde los CDRs son altamente homólogos.

También se pueden, usar CDRs de consenso. En una modalidad, el anticuerpo comprende una o más de las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 74 (XASNLES) , SEQ ID NO: 75 (XQSNEE) y SEQ- ID NO: 76 (QQXNEX) , SEQ ID NO: 28 (RASESVDSYGNSFMH) , SEQ ID :Ñ0 : 77 (WTNTXSGVPTY ADDFXG) , SEQ ID NO: 78 (XXYYGX*A*Y) , SEQ ID NO: 19 (TYGMS) , SEQ ID NO: 284 (VIXYXXSNKYYADSVKG) , SEQ ID NO: 285 (WIXAXNGXXXXAXXXQX) , SEQ ID NO: 286 (AQEGXAPDAFDI) , SEQ ID NO: 287 (QA WYSSTNVX) , SEQ ID NO: 288 (QAWDSSTAXX) , SEQ ID NO: 289 (QSDYSSXXX** ) , en donde X es cualquier aminoácido y * puede estar ausente o cualquier aminoácido.

En todavía otra modalidad, el anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo, por ejemplo, SEQ ID NO: 15 (región variable de cadena pesada Ab43) , y/o SEQ ID NO: 13 (región variable de cadena ligera Ab43) ; SEQ ID NO: 27 (región variable de cadena pesada 2.7), y/o SEQ ID NO: 25 (región variable de cadena ligera 2.7); SEQ ID NO: 39 (región variable de cadena pesada 2.41), y/o SEQ ID NO: 37 (región variable de cadena ligera 2.41); o SEQ ID NO: 51 (región variable de cadena pesada R9) , y/o SEQ ID NO: 49 (región variable de cadena ligera R.9), SEQ ID NO: 110 (región variable de cadena pesada 1C9) y/o SEQ ID NO: 108 (región variable de cadena ligera 1C9) ; o SEQ ID NO: 120 (región variable de cadena pesada 3B3) y/o SEQ ID NO: 118 (región variable de cadena ligera 3B3) ; SEQ ID NO: 130 (región variable de cadena 4E1 pesada) y/o SEQ ID NO: 128 (región variable de cadena libera 4E1) ; o SEQ ID NO: 140 (7A3 región variable de cadena pesada) y/o SEQ ID NO: 138 (7A3 región variable de cadena ligera) ; o SEQ ID NO: 150 (región variable de cadena pesada 9D12) y/o SEQ ID NO: 148 (región variable de cadena ligera 9D12) ; SEQ ID NO: 160 (región variable de cadena 12B9) , y/o SEQ ID NO: 158 (región variable de cadena ligera 12B9) ; SEQ ID NO: 170 (región variable de cadena pesada 15E1) y/o SEQ ID NO: 168 (región variable de cadena ligera 15E1) ; SEQ ID NO: 333 (región variable de cadena pesada 18B11) y/o SEQ ID NO : 331 (región variable de cadena ligera 18B11) ; SEQ ID NO: 313 (región variable de cadena pesada 18D8) y/o SEQ ID NO: 311 (región variable de cadena ligera 18D8) ; SEQ ID NO: 343 (región variable de cadena pesada 19B8) y/o SEQ ID NO: 341 (región variable de cadena ligera 19B8) ; SEQ ID NO: 323 (región variable de cadena pesada 19C1) y/o SEQ ID NO: 321 (región variable de cadena ligera 19C2) ; SEQ ID NO: 293 (región variable de cadena pesada 19D12) y/O SEQ ID NO : 291 (región variable de cadena ligera 19D12 ) ; SEQ ID NO : 303 (región variable de cadena pesada 19H6) y/o SEQ ID NO: 301 (región variable de cadena ligera 19H6) ; SEQ ID NO: 353 (región variable de cadena pesada 20E12) y/o SEQ ID NO: 351 (región variable de cadena ligera 20E12) ; SEQ ID NO: 363 (región variable de cadena pesada 22F12) y/o SEQ ID NO: 361 (región variable de cadena "-ligera 22F12) ; SEQ ID NO: 373 (región variable de cadena pesada 22H10) y/o SEQ ID NO: 371 (región variable de cadena ligera 22H10) ; SEQ ID NO: 383 (región variable de cadena pesada 23A11) y/o SEQ ID NO: 381 (región variable de cadena ligera 23A11) ; SEQ ID NO: 180 (región variable de cadena pesada 23F11) y/o SEQ ID NO: 178 (región variable de cadena ligera 23F11) ; 393 (región variable de cadena pesada 24E4) y/o SEQ ID NO: 391 (región variable de cadena ligera 24E4) ; SEQ ID NO: 190 (región variable de cadena pesada 26F11) y/o SEQ ID NO: 188 (región variable de cadena ligera 26F11) ; o SEQ ID NO: 202 (región variable de cadena pesada 1S1) y/o SEQ ID NO: 128 (región variable de cadena ligera 1S1) ; SEQ ID NO: 213 (región variable de cadena ligera 1S2) y/o SEQ ID NO: 140 (región variable de cadena pesada 1S2) ; SEQ ID NO: 224 (región variable de cadena ligera 1S3) y/o SEQ ID NO: 160 (región variable de cadena pesada 1S3) ; SEQ ID NO: 235 (región variable de cadena ligera 1S4) y/o SEQ ID NO: 170 (región variable de cadena pesada 1S4 ; o SEQ ID NO: 246 (región variable de cadena ligera 1S5) y/o SEQ ID NO: 190 (región variable de cadena pesada 1S5) .

En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo · que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% O más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 15 (región variable de cadena pesada Ab43), 27 (región variable, de cadena pesada 2.7), 39 (región variable de cadena pesada 2.41), 51 (región variable de cadena pesada R9) , 110 (región variable de cadena pesada 1C9) , 120 (región variable de cadena pesada 3B3) , 130 (región variable de cadena pesada 4E1) , 140 (región variable de cadena pesada 7A3) , 150 (región variable de cadena pesada 9D12) , 160 (región variable de cadena pesada 12B9) , 170 (región variable de cadena pesada 15E1) , 333 (región variable de cadena pesada 18B11) , 313 (región variable de cadena pesada 18D8) , 343 (región variable de cadena, pesada 19B8) , 323 (región variable de cadena pesada 19C1) , 293 (región variable de cadena pesada 19D12) , 303 (región variable de cadena pesada 19H6) , 353 (región variable de cadena pesada 20E12) , 363 (región variable de cadena pesada 22F12) , 373 (región variable de cadena pesada 22H10) , 383 (región variable de cadena pesada 23A11) , 180 (región variable de cadena pesada 23F11) , 393 (región variable de cadena pesada 24E4) , 190 (región variable de cadena pesada 26F11) , 202 (región variable de cadena pesada 1S1) , 13 (región variable de cadena ligera Ab43) , 25 (región variable de cadena ligera 2.7), 37 (región variable de cadena ligera 2.41), 49 (R9 región variable de cadena ligera) , 108 (región variable de cadena ligera 1C9) , 118 (región variable de cadena ligera 3B3), 128 (región variable de cadena ligera 4E1) , 138 (región variable de cadena ligera 7A3), 148 (región variable de cadena ligera 9D12) , 158 (región variable de cadena ligera 12B9) , 168 (región variable de cadena ligera 15E1) , 331 (región variable de cadena ligera 18B11) , 311 (región variable de cadena ligera 18D8) , 341 (región variable de cadena ligera 19B8) , 321 (región variable de cadena ligera 19C2) , 291 (región variable de cadena ligera 19D12) , 301 (región variable de cadena ligera 19H6) , .351 (región variable de cadena ligera 20E12) , 361 (región variable de cadena ligera 22F12) , 371 (región variable de cadena ligera 22H10) , 381 (región variable de cadena ligera 23A21) , 178 (región variable de' cadena ligera 23F11) , 391 (región variable de cadena ligera 24E4) , 188 (región variable de cadena ligera 26F11) , 213 (región variable de cadena ligera 1S2) , 224 (región variable de cadena ligera 1S3) , 235 (región variable de cadena ligera 1S4) , 246 (región variable de cadena ligera 1S5) , el polipéptido que comprende además por lo menos una o más de las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NOs: 16-21 (Ab43 CDRs) , 28-33 (2.7CDRs), 40-45 (2.41 CDRs) , 52-57 (R9 CDRs), 111-116 (1C9 CDRs) , 121-126 (3B3 CDRs), 131- 136 (4E1 CDRs) , 141-146 (7A3 CDRs) , 151-156 (9D12 CDRs) , 161-166 (12B9 CDRs), 171-176 (15E1 CDRs), 334-339 (18B11 CDRs), 314-319 (18D8 CDRs) , 344-349 (19B8 CDRs) , 324-329 (19C1 CDRs) , 294-299 (19D12 CDRs) , 304-309 (19H6 CDRs) , 354-359 (20E12 CDRs) , 364-369 (22F12 CDRs) , 374-379 (22H10 CDRs), 384-389 (23A11 CDRs) , 181-186 · (23F11 CDRs), 394-399 (24E4 CDRs ) , 191-196 (26F11 CDRs), 203-205. (CDRs de cadena ligera 1S1) y 131-133 (CDRs de cadena pesada 1S1) , 214-216 (CDRs de cadena pesada 1S2 CDRs) y 144-146 ( CDRs de cadena ligera 1S2) , 2 25-227 (CDRs de cadena pesada 1S3) y 164-166 (CDRs de cadena ligera 1S3) , 236-238 (CDRs de cadena pesada 1S4) y 174-176 (CDRs de cadena ligera 1S4), 247-249 (CDRs de cadena pesada 1S5) y 184-186 (CDRs de cadena ligera 1S5) . En cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido incluye una secuencia que comprende una o dos modificaciones para cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NOs: 16-21 (Ab43 CDRs), 28-33 (2.7 CDRs), 40-45 (2.41 CDRs), 52-57 (R9 CDRs), 111-116 (1C9 CDRs), 121-126 (3B3 CDRs) , 131-136 (4E1 CDRs) , 141-146 (7A3 CDRs) , 151-156 (9D12 CDRs), 161-166 (12B9 CDRs), 171-176 (15E1 CDRs), 334-339 (18B11 CDRs), 314-319 (18D8 CDRs), 343-349 (19B8 CDRs), 324-329 (19C1 CDRs), 294-299 (19D12 CDRs), 304-309 (19H6 CDRs), 354-359 (20E12 CDRs), 364-369 (22F12 CDRs), 374-379 (22H10 CDRs), 384-389 (23A11 CDRs), 181-186 (23F11 CDRs), 394-399 (24E4 CDRs), 191-196 (26F11 CDRs) , 203-205 (CDRs de cadena ligera 1S1) y 131-133 (CDRs de cadena pesada 1S1) , 214-216 (CDRs de cadena pesada 1S2) y 144-146 (CDRs de cadena ligera 1S2) , 225-227 (CDRs de cadena pesada 1S3) y 164-166 (CDRs de cadena ligera 1S3) , 236-238 (CDRs de cadena pesada 1S4) y 174-176 (CDRs de cadena ligera 1S4) , 247-249 (CDRs de cadena pesada 1S5) y 184-186 (CDRs de cadena ligera 1S5) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos Ab43,- 2.7, 2.41 -, R9, 1C9, 1S1, 1S2, 1S3 , 1S4, 1S5, '3B3; 4E1, 7A3 , .9D12, 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11 y comprende opcionalmente una región " constante seleccionada del grupo que consiste de una región constante de. cadena pesada IgGl humana (SEQ ID NOs : 401-402) y una región constante de cadena pesada IgG2 (SEQ ID NOs : 403-404). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos Ab43, 2.7, 2.41, R9 , 1C9 , 1S1, 1S2, 1S3, 1S4, 1S5, 3B3; 4E1, 7A3, 9D12, 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12 , 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 , y 26F11 y comprende opcionalmente una región constante de cadena ligera kappa humana (SEQ ID NOs : 405-406). En otra modalidad, el anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos Ab43, 2.7, 2.41, R9, 1C9, 1S1, 1S2, 1S3, 1S4, 1S5, 3B3 ; 4E1, 7A3 , 9D12 , 12B9, 15E1, 18B11, 18D8, 19B8, 19C1, 19D12, 19H6, 20E12, 22F12, 22H10, 23A11, 23F11, 24E4 y 26F11 y comprende opcionalmente una región constaten seleccionada del grupo que consiste de una región constante de cadena ligera lambda humana de tipo Cl (SEQ ID NOs : 407-408), una región constante de cadena ligera lambda humana de tipo C2 (SEQ ID NOs : 409-410), una región constante de cadena ligera lambda humana de tipo C3 (SEQ ID NOs : 411-412), una región constante de cadena ligera lambda humana de tipo C6 (SEQ ID NOs: 413-414) y una región constante de cadena ligera lambda humana de tipo C7 (SEQ ID NO: 415-416).

Las secuencias de ADNc y de aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de cada uno de los anticuerpos 1C9, 3B3, 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 23F11 y 26F11 también se proporcionan. Las secuencias de ADNc que codifican la cadena . ligera de longitud completa de los anticuerpos 1C9, 3B3 , 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 123F11, 26F11, 1S2, 1S3, 1S4 y 1S5, que incluyen la región constante, se establecen en SEQ ID NOs: 197, 208, 219, 230, 241, 252, 256, 260, 264, 217, 228, 239 y 250, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos 1C9, 3B3, 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 23F11, 26F11 , 1S2 , 1S3 , 1S4 y 1S5, que incluyen la región constante, se establecen en SEQ ID NOs: 198 (de los cuales los residuos 1-20 corresponden al péptido señal y el resto es el péptido maduro) , 209 (de lo cual los residuos 1- 19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 220 (del cual los residuos 1-20 corresponden al péptido señal y .el resto es el polipéptido maduro) , 231 (del cual los residuos 1-20 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 242 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 253 (del cual los residuos 1-20 corresponden al -péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 257 (del cual los residuos "1-20 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 261 (del cual los residuos 1 - 19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 265 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 218 (del cual los residuos 1-22 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 229 (del cual los residuos 1-22 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 240 (del cual los residuos 1 -22 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) and 251 (del cual los residuos 1-22 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro), respectivamente.

Las secuencias de ADNc que codifican la cadena pesada de longitud completa de los anticuerpos 1C9, 3B3, 4E1, 7A3, 9D12, 12B9, 15E1, 23F11, 26F11 y 1S1, que incluyen la región constante, se establecen en SEQ ID NOs : 199, 210, 221, 232, 243, 254, 258, 262, 266 y 206, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa de los anticuerpos 1C9 , 3B3, 4E1, 7A3 , 9D12, 12B9, 15E1, 23F11, 26F11 y 1S1, que "incluyen la región constante, se establecen en SEQ ID NOs : 200 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 211 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 222 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 233 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 244 (péptido no de señal) , 255 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 259 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro), 263 (del cual los residuos 1-20 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) , 267 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro) y 207 (del cual los residuos 1-19 corresponden al péptido señal y el resto es el polipéptido maduro), respectivamente.

En algunas modalidades de la invención los anticuerpos comprenden 20-467 aminoácidos de SEQ ID NO: 207 (cadena pesada 1S1) y 21-234 aminoácidos de SEQ ID NO: 220 (cadena ligera 1S1) ; o 20-466 aminoácidos de SEQ ID NO: 233 (cadena pesada 1S2) y 23-234 aminoácidos de SEQ ID NO: 218 (cadena ligera 1S2); o 20-466 aminoácidos de SEQ ID NO: 255 (cadena pesada 1S3) y 23-234 aminoácidos de SEQ ID NO: 229 (cadena ligera 1S3) ; o 20-466 aminoácidos de SEQ ID NO: 259 (cadena pesada 1S4) y en donde 23-234 aminoácidos de SEQ ID NO: 240 (cadena ligera 1S4) o 20-466 aminoácidos de SEQ ID NO: 267 (cadena pesada lS5)_._y 23-234 aminoácidos de SEQ ID NO: 251 (cadena ligera 1S5) El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo, como ese término se define en este documento, obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones de origen natural posibles o modificaciones postraduccional alternativas que pueden estar presentes en cantidades menores, ya sea producidos de hibridomas o técnicas de ADN recombinante . Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos de murino, conejo, rata, pollo, quiméricos, humanizados o humanos, anticuerpos totalmente ensamblados, anticuerpos multiespecíficos (que incluyen anticuerpos biespecífieos) , fragmentos de anticuerpo que se pueden enlazar a un antígeno (que incluyen, Fab' , F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena individual, diacuerpos) , maxicuerpos, nanocúerpos y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada, o variantes o derivados de los mismos. La secuencia, de anticuerpos la humanización o modificación de la secuencia de anticuerpos que es más similar a humana se describe por, por ejemplo, Jones y colaboradores, Nature 321:522 525 (1986); Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., E.U.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison y .01, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer y colaboradores, Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol, 31(3): 169 217 (1994); y Kettleborough, CA. y colaboradores, Protein Engineering. , 4(7):773 83 (1991)..; Co, M . S., y colaboradores. (1994), J. Immunol 152, 2968-2976); Srudnicka y colaboradores, Protein Engineering 7:805-814 (1994) ; cada una de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Un método para aislar anticuerpos monoclonales humanos es el uso de la tecnología de expresión en fago. La expresión en fago se describe por, por ejemplo, Dower y colaboradores, WO 91/17271, McCafferty y colaboradores, WO 92/01047, y Catón y Koprowski, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87:6450-6454 (1990), cada una de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Otro método para aislar anticuerpos monoclonales humanos usa animales transgenicos que no tienen producción de inmunoglobulina endógena y son diseñados para contener sitios de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Jakobovits y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUS, 90:2551 (1993); Jakobovits y colaboradores, iVature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y colaboradores, Year in Inmuno., 7:33 (1993); WO 91/10741, WO 96/34096, WO 98/24893, o Publicaciones de Solicitud de . Patente Nos . 2003/0194404, 2003/0031667 "o 2002/0199213; cada una incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Un anticuerpo "aislado" se refiere a un anticuerpo, como ese término se define en este, documento, que se ha identificado y separado de un componente de su medio ambiente natural. Los. componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o · terapéuticos para el- anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. . En ciertas modalidades, el anticuerpo se purificará (1) a mayor que 95% en peso del anticuerpo, o más que 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna o (3) a una homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no de reducción que usan la tinción con azul de Coomassie o plata. El anticuerpo de origen natural aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una "inmunoglobulina" o "anticuerpo nativo" es una glicoproteína tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos , cada- par que tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) . y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino- terminal de cada cadena incluye una región "variable" ("V") de aproximadamente 100 a 1 10 o más aminoácidos responsables principalmente para el reconocimiento del antígeno. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente para la función efectora. Las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante- de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ) , delta (?) ,. gamma (?) , alfa (a) , y épsilon (e), y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Varios de éstos se pueden dividir adicionalmente en subclases o isotipos, por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgGl e IgG3 tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Las cadenas ligeras humanas se clasifican como kappa (K) y lambda (?) . Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que incluye también una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Véase generalmente, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

Los alotipos son variaciones en la secuenciá de anticuerpos, frecuentemente en la región constante, que pueden ser inmunogénicos y se codifican por alelos específicos en los humanos. Los- alotipos se han identificado para cinco de los agentes IGHC humanos, los genes IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2 e IGHE , y se distinguen como alotipos Glm, G2m, G3m, A2m, y Em, respectivamente. Por lo menos son conocidos 18 alotipos Gm: nGlm(l), nGlm(2), Glm (1, 2, 3, 17) o Glm (a, x, f, z) , G2m (23) o G2m (n) , G3m (5, 6, 10, 11/ 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (bl, c3 , b5 , bO , b3 b4 , s, t, gl, c5, u, v, g5) . Existen dos alotipos A2m A2m(l) y A2m(2) .

Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos, véase Roth, D. B., y Craig, N. L. , Cell, 94:41 1-414 (1998), incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad. Brevemente, el proceso para generar ADN que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera ocurre principalmente en el desarrollo de las células B. antes del reordenamiento y unión de varios segmentos de genes de inmunoglobulina, los segmentos de genes V, D, J y constante (C) se encuentran generalmente en proximidad relativamente cercana sobre un solo cromosoma. Durante la diferenciación de células B, uno de cada uno de los miembros de la familia apropiada de los segmentos de genes V, D, J (o únicamente V y J en los casos de los genes de cadena ligera) se combinan para formar regiones variables funcionalmente reordenadas de los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera. Este proceso de reordenamiento de segmentos de genes parece que es secuencial. Primero, se hacen uniones de D a J de cadena pesada, seguido por las uniones de V a J de cadena pesada y las uniones de V a J de cadena ligera. Además del reordenamiento de los segmentos C, D y J, se genera una diversidad adicional en el repertorio primario de las cadenas pesadas y . ligera de inmunoglobulina por medio de la recombinación variable en las ubicaciones donde los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y donde los segmentos D y J de la cadena pesada se unen. Esta variación en la cadena ligera ocurre típicamente dentro del último codón del segmento del gen V y el primer codón del segmento J. La imprecisión similar en la unión ocurre en el cromosoma de cadena pesada entre los segmentos D y JH y pueden extenderse sobre tanto como 10 nucleótidos. Adicionalmente, los diversos nucleótidos se pueden insertar entre los segmentos de los genes D y JH y entre el VH y D los cuales no se codifican por el ADN genómico. La adición de estos nucleótidos es conocida como diversidad de . -región. El efecto neto de estos reordenamientos en los segmentos del gen de región variable y la recombinación variable que puede ocurrir durante esta unión es la producción de un repertorio de anticuerpos primarios .

El'l término región "hipervariable" se refiere a residuos de aminoácidos de una región determinante complementaria o CDR (es decir, residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 , (H3) en el dominio variable de cadena pesada como se describe por . Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) . Aún una CDR individual puede reconocer y enlazarse a un antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de enlace de antígeno completa que contiene todas las CDRs.

Una definición alternativa de los residuos de un "bucle" hipervariable se describe por Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987) como residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada.

Los residuos "de estructura" o FR son aquellos residuos de región variable diferentes a los residuos de región hipervariable .

"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de una inmunoglobulina intacta, por ejemplo, un enlace de antígeno o región variable del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos multiespecíficos (biespecíficos , triespecíficos, etcétera) formados de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de inmunoglobulinas se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos .

Ejemplos non limitantes de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, Fv (región variable), anticuerpos de dominio (dAb, que contienen un dominio VH) (Ward y colaboradores, Nature, 341:544-546, 1989)., fragmentos de región determinante complementaria (CDR) , anticuerpos de cadena individual (scFv, que contienen dominios VH y VL sobre una cadena de polipéptidos individual) (Bird y colaboradores, Science, 242:423-426, 1988, y Huston y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 85:5879-5883, 1988, incluye opcionalmente un enlazador de polipéptido ; y opcionalmente multiespecífico, Gruber y colaboradores, J. Immunol . , 152: 5368 (1994)), fragmentos de anticuerpo de cadena individual, diacuerpos (dominios VH y VL sobre una cadena de polipéptido individual que se parean con los dominios VL y VH complementarios de otra cadena) (EP 404,097.;. WO 93/11,161; y Holliger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 90:6444-6448 (1993)), triacuerpos, tetracuerpos , minicuerpos (scFv fusionado a CH3 por la vía de un enlazador de péptido (sin bisagra) o por la vía de una bisagra IgG) (Olafsen, y colaboradores, Protein Eng Des Sel. Abril de 2004; 17(4) :315-23) , anticuerpos lineales (fragmentos Fd en tándem (VH-CHl-VH -CH1) (Zapata y colaboradores, Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos recombinantes quelantes (crAb, los cuales se pueden enlazar a dos epítopos adyacentes sobre el mimos antígeno) (Neri y colaboradores, J Mol Biol., 246:367-73, 1995), anticuerpos (Fab-scFv biespecíficos) o tricuerpos (Fab- (scFv) (2) triespecífico) (Schoonjans y colaboradores, J Immunol . 165:7050-57, 2000; Willems y colaboradores, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol . Biomed. Life Sci, 786: 161-76, 2003), intracuerpos (Biocca, y colaboradores, EMBO J. , 9: 101-108, 1990; Colby y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 101 : 17616-21, 2004) los - cuales también pueden comprender secuencias de señales de células las cuales retienen o dirigen el anticuerpo intracelularmente (Mhashilkar y colaboradores, EMBO J. , 14:1542-51, 1995; Wheeler y colaboradores, FASEB J. , 17:1733-5, 2003), transcuerpos (anticuerpos permeables a las células que contienen un dominio de transducción de proteínas (PTD) fusionado a scFv (Heng y colaboradores, Med Hypotheses., 64: 1105-8, 2005), nanocuerpos (un dominio variable de aproximadamente 15kDa de la cadena pesada) (Cortez-Retamozo y colaboradores, Cáncer Research 64:2853-57, 2004), inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIPs) (Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0133939 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0118592) , una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace de antígeno, un. anticuerpo camelizado (en cuyo VH se recombina con una región constante que contiene los dominios de bisagra, CH1, CH2 y CH3) (Desmyter y colaboradores, J. Biol , Che . , 276:26285-90, 2001; Ewert y colaboradores, Biochemistry, 41:3628-36, 2002; Publicaciones de solicitud de patente de E.U.A. Nos. 2005/0136049 y 2005/0037421), un anticuerpo que contiene VHH, anticuerpos de cadena pesada (HCAbs, homodímeros de dos cadenas pesadas que tienen la estructura H2L2) , o variantes o derivados de los mismos, y polipéptidos que contienen por lo menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace de antígeno específico al polipéptido, tal como una secuencia CDR, siempre y cuando el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada.

El término "variante" se refiere a una secuencia de polipéptidos de un anticuerpo que contiene por lo menos una sustitución, supresión, o inserción de aminoácidos en la región variable o la porción equivalente a la región variable, con la condición de que la variante retenga la afinidad de enlace deseada o la actividad biológica. Además, los anticuerpos como se describen en este documento pueden tener modificaciones de aminoácidos en la región constante para modificar la función efectora del anticuerpo, que incluye vida media o eliminación, actividad ADCC y/o CDC. Estas modificaciones pueden mejorar la farmacocinética o mejorar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Véase Shields y colaboradores, J. Biol. Chem. , 276 (9) : 6591-6604 (2001), incorporada a manera de referencia en este documento en su totalidad., En el caso, del IgGl, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra o CH2, pueden incrementar o disminuir la función efectora, que incluyen la actividad ADCC y/o CDC. En otras modalidades, una región constante IgG2 se modifica para disminuir la formación de agregado de anticuerpo-antígeno . En el caso del IgG4, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra, pueden reducir la formación de semi-anticuerpos .

El término "modificación" incluye pero no se limita a, uno o más cambios de aminoácidos (que incluyen sustituciones, inserciones o supresiones)'; modificaciones químicas que no interfieren con la actividad de enlace de hepcidina; modificación covalente por la conjugación a los agentes terapéuticos o de diagnóstico; etiquetado (por ejemplo, con radionúclidos o varias enzimas) ; unión covalente de polímero tal como pegilación (derivatización con polietilenglicol) e inserción o sustitución mediante síntesis química de aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, los polipéptidos modificados (que incluyen anticuerpos) retendrán las propiedades de enlace de moléculas no modificadas.

El término "derivado" se refiere a anticuerpos o polipéptidos que se modifican covalentemente mediante la conjugación a los agentes terapéuticos o de diagnóstico, etiquetado (por ejemplo, con radionúclidos o varias enzimas) , unión de polímero covalente tal como pegilación (derivatización con polietilenglicol) e inserción o sustitución mediante síntesis química de aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, los derivados retendrán las propiedades de enlace de las moléculas no derivatizadas .

Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos y otros multiespecífieos son conocidos en el campo e incluyen reticulación química, uso de cremalleras de leucina (Kostelny y colaboradores, J. Immunol 148: 1547-1553, 1992); tecnología de diacuerpo (Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL USA, 90:6444-48, 1993); dímeros scFv (Gruber y colaboradores, J". Immunol., 152: 5368, 1994), anticuerpos lineales (Zapata y colaboradores, Protein Eng. , 8:1057-62, 1995) ; y anticuerpos recombinantes quelantes (Neri y colaboradores, J. Mol. Biol, 246:367-73, 1995).

De esta manera, una variedad de composiciones que comprende una, dos, -y/6 tres CDRs de una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo se pueden generar mediante técnicas bien conocidas en el campo.

PRODUCCION RECOMBINANTE DE ANTICUERPOS .

Los ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos monoclonales descritos en este documento también se proporcionan, opcionalmente enlazados operablemente para controlar las secuencias reconocidas por . una célula hospedera, vectores y células hospederas que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, los cuales pueden comprender cultivar la célula hospedera para que el ácido nucleico- se exprese y, opcionalmente, recupere el anticuerpo del cultivo de células hospederas o medio de cultivo.

La secuencia de aminoácidos relevante de una inmunoglobulina de interés se puede determinar mediante la secuenciación de proteínas directa, y la secuencia de nucleótidos de codificación adecuadas se puede diseñar de acuerdo con una tabla de codones universal. Alternativamente, el ADNc genómico que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar de las células que producen estos anticuerpos usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) .

La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándares (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia) . Por ejemplo, una biblioteca de ADNc se puede construir mediante la transcripción inversa de poliA+ ARNm, por ejemplo, ARNm asociado con membrana, y la biblioteca se puede clasificar usando sondas específicas para las secuencias de genes de polipéptido de inmunoglobulina humana. En una modalidad, sin embargo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se usa para amplificar los ADNc (o porciones de ADNc de longitud completa) que codifican un segmento del gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de cadena ligera o pesada. Las secuencias amplificadas se pueden clonar fácilmente dentro de cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de minigenes, o vectores de expresión en fago. Se apreciará que el método particular de clonación usado no es crítico, siempre y cuando sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

Una fuente para el anticuerpo-ácidos nucleicos es un hibridoma producido al obtener una célula B de un animal inmunizado con el antígeno de interés y fusionarla a una célula inmortal. Alternativamente, el ácido nucleico se puede aislar de las células B (o de vaso entero) del animal inmunizado. Todavía otra .fuente de ácidos .-nucleicos que codifican anticuerpos es una biblioteca de estos ácidos nucleicos generados, por ejemplo, a través de . la tecnología de expresión en fago. Los polinucleótidos que codifican péptidos,. de interés, por ejemplo, péptidos de región variable con características de enlace deseados se puede identificar mediante técnicas estándares tal como inmunoplaqueteo .

La secuencia que codifica una región variable completa del polipéptido de inmunoglobulina se puede determinar; sin embargo, algunas veces será adecuada para secuencias únicamente una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica CDR. La secuenciación se lleva a cabo usando técnicas estándares (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. y colaboradores, (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 74: 5463-5467, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia) . Al comparar la secuencia del ácido nucleico clonado con las secuencias publicadas de genes de inmunoglobulina humana y ADNcs, una persona de experiencia será capaz fácilmente de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de la línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina de hibridoma (que incluye el isotipo de la cadena pesada (ii) la secuencia de las regiones variables de cadena pesada y ligera, que incluyen las secuencias que resultan de la adición de la N-región y el proceso de mutación somática. Una fuente de información de la secuencia de genes de inmunoglobulina es the National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

Como se- usa en este documento, . una molécula dé ácido nucleico "aislada" o secuencia de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es ya sea (1) identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con lo cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico o (2) clonada, amplificada, etiquetadas, o de otra manera distinguida de los ácidos nucleicos de fondo tal que la secuencia del ácido nucleico de interés se puede determinar. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o configuración en la cual se encuentra en la naturaleza. Sin. embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan ordinariamente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las células naturales; Una vez aislado, el ADN se puede enlazar operativamente a las secuencias de control de expresión o se coloca dentro de los vectores de expresión, las cuales luego se transfectan dentro de las células hospederas que no producen de otra manera la proteína de inmunoglobulina, para dirigir la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en el campo.

Las secuencias de control de expresión se refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, inerven un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Las células eucarióticas sé saben que usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores .

El ácido nucleico se enlaza operablemente cuando se coloca dentro de una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para un líder de pre-secuencia o secretos se enlaza operablemente al ADN para un polipéptido si se expresa como una proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transfección de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, enlazado operablemente significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, son contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores- de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Muchos vectores son conocidos en el campo. Los componentes de vector pueden incluir uno o más de lo siguiente: una secuencia de señal (que puede, por ejemplo, dirigir la secreción del anticuerpo, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos (que pueden, por ejemplo, conferir resistencia a antibióticos u otros fármacos, deficiencias auxotróficas de complemento, o nutrientes críticos de suministro no disponibles en los medios) , un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción, todos de los cuales son bien conocidos en el campo.

La célula, línea de células, y cultivo de células se usan frecuentemente de manera intercambiable y todas de estas designaciones en este documento incluyen la progenie. Los transformantes y células transformadas incluyen la célula objetivo primaria y los cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no puede ser. precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas p inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como es clasificada para la célula originalmente transformada.

Las células hospederas ejemplares incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores (es decir, un organismo multicelular) . Las células hospederas procarióticas incluyen eubacterias, tal como organismos Gram-negativos o Gram-positivos , por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmunolla, por ejemplo, Salmunolla typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como también Bacilli tal como B. subtilis y B. lichenifor is, Pseudomonas, y Streptomyces . Los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o de levadura son hospederos de clonación o de expresión adecuados para los polipéptidos o anticuerpos recombinantes . Saccharomyces cerevisiae, o la levadura para pan común, se usa más comúnmente entre los microorganismos hospederos eucarióticos inferiores. Sin embargo, una variedad de otros géneros, especies y cepas son comúnmente disponibles y útiles en este documento, tales como Pichia, por ejemplo P. pastoris, Schizosaccharo yces po be,- Kluyveromyces, Yarrowia,- Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como as, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus hosts tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospederas para la expresión del polipéptido o anticuerpo glicosilado se pueden derivar de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrado incluyen células de planas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y células hospederas de insectos permisivas correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (ciempiés) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una variedad de. cepas virales para la transfección de estas células son públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-l de la NPC Autographa californica y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV.

Las células hospederas de vertebrados también son hospederos adecuados, y la producción recombinante del polipéptido o anticuerpo de estas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles son células de ovario de hámster Chino que incluyen células. CHOK1 (ATCC CCL61) , DXB-11, DG-44, y células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL EUA, 77: 4216 (1980) ) ; línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS- 7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico dé humano (293 o 293 células subclonadas para el desarrollo en un cultivo de suspensión, [Graham y colaboradores, J". Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10); células . Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. , 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; Células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2) ; células de riñon caninas (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de. rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL1442) ; células de pulmón humano (W 138, ATCC CCL 75); células de hepatoma humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather y colaboradores, Annals N. Y Acad. Sci, 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 o células FS4 ; o células de mieloma de mamífero.

Las células hospederas se transforman o se transfectan con los ácidos nucleicos descritos anteriormente o vectores para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados como se apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, los vectores novedosos y las líneas de células transfectadas con múltiples copias de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos.

Las células hospederas usadas para producir un anticuerpo descrito en este documento se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Minimal Essential Médium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y Medio Eagle Modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos por Ham y colaboradores, Meth. Enz. , 58: 44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal. Biochem. , 102: 255 (1980), Patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; O Re. Patente de E.U.A. No. 30,985 se pueden usar como medios de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios se puede suplementar como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones amortiguadoras (tal como HEPES) , nucleótidos (tal como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como fármaco GentamycinR) , elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de otros suplementos necesarios también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por aquellas personas expertas en el campo. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH, y los similares, son aquellos previamente usados con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el artífice ordinariamente experto .

. Al cultivar las células hospederas, el - anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio preriplásmico, o se puede secretar directamente dentro del medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los restos particulados, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, se remueven, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.

El anticuerpo se puede purificar usando, por ejemplo, .cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, o cromatografía de afinidad, usando el antígeno de interés o proteína o proteína G como un ligando de afinidad. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas ??, ?2 , o ?4 humanas (Lindmark y colaboradores, J". Immunol . Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para el ?3 (Guss y colaboradores, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une es más frecuentemente agarosa pero otras matices son disponibles . Las matrices mecánicamente estables -tal como un vidrio poroso controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempo de procesamiento más cortos que se pueden lograr con la agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio 3 CH, la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la " purificación de proteínas tal como precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también son posibles dependiendo del anticuerpo que se recupera .

Anticuerpos quiméricos y humanizados Debido a que los anticuerpos quiméricos u humanizados son menos . inmunogénicos en humanos que los anticuerpos monoclonales de roedor parenterales , se pueden usar para el tratamiento de humanos con mucho menos riesgo de anafilaxis. De esta manera, estos anticuerpos se contemplan en aplicaciones terapéuticas que implican la administración in vivo a un humano.

Por ejemplo, un anticuerpo de murino en la administración in vivo repetida en hombres ya sea solos o como un conjugado llevarán a cabo una respuesta inmunitaria en el recipiente, algunas veces llamada una respuesta HAMA (Anticuerpo Anti-Ratón de Humano) . La respuesta del RAMA puede limitar la efectividad del producto farmacéutico si se requiere una dosificación repetida. La inmunogenicidad del anticuerpo se puede reducir por modificación química del anticuerpo con un polímero hidrofílico tal como polietilenglicol o al usar los métodos de ingeniería genética para hacer la estructura de enlace de anticuerpo más similar a la humana.

La frase "anticuerpo quimérico" como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que contiene anticuerpos derivada de dos anticuerpos diferentes que se originan típicamente de especies diferentes. Más típicamente, los anticuerpos quiméricos comprenden dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de roedor fusionado a dominios Ig constantes humanos. Estos anticuerpos se pueden generar usando procedimientos estándares conocidos en el campo (véase Morrison, S. L . , y colaboradores. (1984) "Chimeric Human Anticuerpo Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Región Domains", Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA, 81, 6841-6855; y, Boulianne, G. L., y colaboradores, iVature 312, 643-646. (1984)). Aunque algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han probado ser menos inmunogénicos en humanos, los dominios Ig variables de roedor aún pueden conducir a una respuesta anti-roedor humana significativa.

La frase "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de roedor. Alternativamente, un anticuerpo humanizado se puede derivar de un anticuerpo quimérico .

Los anticuerpos humanizados se pueden lograr mediante una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo: (1) injertar las regiones determinantes complementarias no humanas (CDRs) sobre una estruct,ura humana y una región constante (un proceso referido en el campo como humanización a través de "injerto de CDR" ) , o, alternativamente, (2) trasplantar los dominios variables no humanos completos, sino "encubriéndolos" con una superficie similar a humana por el reemplazo de los residuos superficiales (un proceso referido en el campo como "inactivación") . Estos métodos se dan a conocer por, por ejemplo, Junos y colaboradores, Nafcure 321:522 525 (1986); Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 81:6851 6855 (1984); Morrison y 01, Adv. Immunol , 44:65 92 (1988); Verhoeyer y colaboradores, Science 239: 1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498. (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169 217 (1994); y Kettleborough, CA. y colaboradores, Protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cada uno de los cuales se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.

El injerto de CDR implica introducir una o más de las seis CDRs de los dominios Ig variables de cadena pesada y ligera de ratón dentro de las · regiones de estructura apropiadas de un dominio Ig variable humano. Esta técnica (Riechmann, L., y colaboradores, Nature 332, 323 (1988)), usa las regiones de estructura conservadas (FR1-FR4) como un supercóntigo para soportar los bucles de CDR los cuales son los contactos primarios con un antígeno. Una desventaja significativa del injerto de CDR, sin embargo, es que puede dar por resultado un anticuerpo humanizado que tiene una afinidad de enlace sustancialmente más baja que el anticuerpo de ratón original, debido a que los aminoácidos de las regiones de estructura pueden contribuir al enlace de antígeno, y debido a que los aminoácidos de los bucles de CDR pueden afectar la asociación de los dos dominios Ig variables. Para mantener la · afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, la técnica de injerto de CDR se puede mejorar al seleccionar las regiones de estructura . humanas que se asemejan más estrechamente a las regiones de estructura de anticuerpo de ratón original, y por la mutagénesis dirigida de sitio de aminoácidos individuales dentro de la estructura o CDRs ayudados por la modelación por computadora del sitio de enlace de antígeno (por ejemplo, Co, M. S., y colaboradores (1994), J. Im unol 152, 2968-2976).

Un método para humanizar anticuerpos comprende alinear las secuencias de cadena pesada y ligera no humanas a las secuencias de cadena pesadas y ligeras humanas, seleccionar y reemplazar la estructura no · humana con una estructura humana' con base en esta alineación, modelación molecular para predecir la conformación de la secuencia humanizada y comparación a la conformación del anticuerpo precursor. El proceso es seguido por la retromutación repetida de los residuos en la región CDR los. cuales interrumpen la estructura de la CDRs hasta que la información predicha de modelo de secuencia humanizado se aproxime estrechamente a la conformación de las CDRs no humanas del anticuerpo no humano precursor. Estos anticuerpos humanizados se pueden derivar además para facilitar la captación y eliminación, por ejemplo, por la vía de los receptores de Ashwell (Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5, 530, 101 y 5, 585, 089) .

Se ha reportado una variedad de humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón por el diseño racional (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2002/0091240 publicada el 11 de Julio del 2002, el documento O 92/11018 y la Patente de E.U.A. No., 5,693,762, patente de E.U.A. No. 5,766,866).

Anticuerpos Human EngineeredMR La frase "anticuerpo Human EngineeredMR" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de roedor o posiblemente un anticuerpo quimérico. El Human EngineeringMR de los dominios variables del anticuerpo se han descrito por Studnicka [Véase, por ejemplo, Studnicka y colaboradores, Patente de E.U.A. No. 5,766,886; Studnicka y colaboradores Protein Engineering, 7: 805-814 (1994)] como un método para reducir la inmunogenicidad mientras que se mantiene la actividad de enlace de las moléculas de anticuerpo. De acuerdo con el método, cada aminoácido de región variable se ha asignado un riesgo de sustitución-. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por una de las tres categorías de riesgo: (1) cambios de riesgo bajos son aquellos que tienen el potencial más grande para reducir la inmunogenicidad con la última oportunidad de interrumpir el enlace de antígeno; (2) moderar los cambios de riesgo son aquellos que reducirían además la inmunogenicidad, pero tienen una probabilidad mayor de afectar el enlace de antígeno o" el plegamiento de la proteína; (3) residuos de alto riesgo son aquellos que son importantes para enlazar o mantener la estructura del anticuerpo y llevar el riesgo más alto de que se afectará el enlace de antígeno o el plegamiento de la proteína. Debido a una función estructural tridimensional de las prolinas, las modificaciones . en las prolinas se consideran generalmente que son por lo menos cambios de riesgo moderado, aún si la posición es típicamente una posición de bajo riesgo.

Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo de roedor pueden ser Human Engineered al sustituir los aminoácidos humanos en las posiciones determinadas que son poco probable que afecten adversamente ya sea el enlace de antígeno o el plegamiento de la proteína, pero es probable que reduzcan la inmunogenicidad en un medio ambiente humano. Aunque cualquier región variable humana se puede usar, incluyendo una secuencia VH o VL individual o una secuencia VH o VL de consenso humana o una secuencia de línea germinal humana individual o consenso, generalmente una secuencia humana con identidad u homología más alta a la secuencia de roedor se usa para minimizar el número de sustituciones. Los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo o en todas las posiciones de riesgo bajo, se pueden cambiar. Por ejemplo, en cada posición de riesgo bajo donde los residuos de aminoácidos de murino y humanos alineados difieren, se introduce una modificación de aminoácidos que reemplaza el residuo de roedor con el residuo humano. Además, los residuos de aminoácidos en cualquier número o todas las posiciones de riesgo moderado se pueden cambiar. En algunas modalidades, todas las posiciones de riesgo bajo y moderado se cambian de la secuencia de roedor a humana.

Los genes sintéticos que contienen regiones variables de cadena pesada y/o ligera modificadas se construyen y se enlazan a las regiones constantes de cadena pesada ? y/o cadena ligera kappa humana. Cualquier cadena pesada humana y las regiones constantes de cadena ligera de cualquier clase o subclase se pueden usar en combinación con las regiones variables del anticuerpo Human EngineeredMR.

Anticuerpos de Animales Transgénicos Diseñados para Contener Sitios de Inmunoglobulina Humana Los anticuerpos a la hepcidina también se pueden producir usando animales transgénicos que no tienen producción de inmunoglobulina endógena y se diseñan para mantener sitios de inmunoglobulina humana. Por;, ejemplo, el documento WO 98/24893 da a conocer animales transgénicos que tienen un sitio Ig humano en donde los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de los sitios de cadena pesada y ligera endógena. Los hospederos mamíferos no primate transgénicos capaces de montar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de primate, y en donde los sitios de codificación de inmunoglobulina endógena se sustituyen o se inactivan también se han planteado. El documento WO 96/30498 da a conocer el uso del sistema Cre/Lox para modificar el sitio de inmunoglobulina en un mamífero, tal como para reemplazar todo o una porción de la región constante o variable para formar una molécula de anticuerpo modificada. El documento WO 94/02602 da a conocer hospederos mamíferos no humanos que tienen sitios Ig endógenos inactivados y sitios Ig humanos funcionales. La Patente de E.U.A. No. 5,939,598 da a conocer métodos para desarrollar ratones transgénicos en los cuales los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan un sitio de inmunoglobulina exógeno que comprende una o más regiones constantes xenogénicas .

Usando un animal transgénico descrito anteriormente, se puede producir una respuesta inmunitaria a una molécula antigénica seleccionada, y las células productos de anticuerpos se puede remover del animal y usar para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales derivados de humano. Los protocolos de inmunización, adyuvantes y los similares son conocidos en el campo, y se usan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en el documento WO 96/33735. Los anticuerpos monoclonales se pueden someter a prueba para la capacidad de inhibir o neutroizar la actividad biológica o efecto fisiológico de la proteína correspondiente.

Véase también Jakobovits y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits y colaboradores, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y colaboradores, Year in Inmuno., 7:33 (1993); y Patente de E.U.A. No. 5,591,669, Patente de E.U.A. No. 5,589,369, Patente de E.U.A. No. 5,545,807; y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2002/0199213. La Solicitud de publicación de Patente de E.U.A. No. 2003/0092125 describe métodos para afectar la respuesta inmunitaria de un animal al epítopo deseado. También se pueden generar anticuerpos humanos por las células B activadas in vitro (véase Patentes de E.U.A. Nos. 5, 567, 610 y- 5, 229, 275) .

Producción de anticuerpos mediante técnicas de expresión en fago El desarrollo para las tecnologías para elaborar repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes , y la expresión de los fragmentos de anticuerpos codificados sobre la superficie del bacteriófago filamentoso, ha proporcionado otros medios para generar anticuerpos derivados de humanos. La expresión en fago se describe por ejemplo, Dower y colaboradores, WO 91/17271, McCafferty y colaboradores, WO 92/01047, y Catón y Koprowski, Proc. Nati. Acad. ScL EUA, 87:6450-6454 (1990), cada una de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Los anticuerpos producidos por la tecnología en fago se producen usualmente como fragmentos de enlace de antlgeno, por ejemplo fragmentos Fv o Fab, en bacterias y de esta manera carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras se pueden introducir por una de las dos estrategias: los fragmentos se pueden diseñar ya sea dentro de anticuerpos completos para la expresión en las células de mamífero, o dentro de fragmentos de anticuerpo biespecífieos con un segundo sitio de enlace capaz de desencadenar una función efectora.

Típicamente, el fragmento Fd (VH-CH1) y la cadena ligera (VL-CL) de los anticuerpos se clonan separadamente mediante PCR y se recombinan aleatoriamente en colecciones de expresión en fago de combinación, las cuales luego se pueden seleccionar para enlazarse a un antígeno particular. Los fragmentos de .anticuerpos se expresan sobre la superficie en fago, y la selección del Fv o Fab (y por lo tanto el fago que contiene el ADN que codifica el fragmento de anticuerpos por el enlace de antígenos se logra a través de varias rondas de enlace de antígeno y reamplificación, un procedimiento llamado inmunoplaqueteo . Los fragmentos de anticuerpo específicos para el antígeno se enriquecen y se aislan finalmente. Las técnicas de expresión en fago también se pueden usar en un procedimiento para la humanización de anticuerpos monoclonales de roedor, llamada "selección guiada" (véase (véase Jespers, L. S., y colaboradores, Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón se puede expresar en combinación con una biblioteca de cadena ligera humana, y la biblioteca Fab híbrida resultante luego se puede seleccionar con el antígeno. El fragmento Fd de ratón proporciona en consecuencia una plantilla para guiar la selección. Subsecuentemente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una biblioteca de fragmento Fd humano. La selección de la biblioteca resultante produce Fab completamente humano.

Una variedad de procedimientos se ha descrito para derivar anticuerpos humanos de colecciones de expresión en - - fago (Véase, por ejemplo, Hoogenboom y colaboradores, J. Mol.

Biol, 227:381 (1991); Marks y colaboradores, J". Mol. Biol . , 222:581-597 (1991); Patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905; Clackson, T. , and Wells, J. A., TIBTECH, 12, 173- 184 (1994)) . En particular, la selección y evolución in vitro de los anticuerpos derivados de las colecciones de expresión en fago se han vuelto una herramienta poderosa (Véase Burton, D. R., y Barbas III, C. F. , Adv. Iwmunol, 57, 191-280 (1994); y, Winter, G. , y colaboradores, Annu. Rev. Iwmunol, 12, 433- 455 (1994) ; Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2002/0004215 y el documento WO92/01047; Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0190317 publicada el 9 de Octubre del 2003 y la Patente de E.U.A. No. 6,054,287; Patente de E.U.A. No. 5,877,293.

Watkins, "Screening of Phage-Expréssed Antibody Librarles by Capture Lift" , Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols, 178: 187-193, y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0044772 publicada el 6 de Marzo de 2003 describen métodos para clasificar bibliotecas de anticuerpos expresados en fago u otras moléculas de enlace por la elevación de captura, y un método que implica la inmovilización de las moléculas de enlace candidato sobre un soporte sólido.

Fragmentos de Anticuerpos Como se observa anteriormente, los fragmentos de anticuerpos comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa intacta, o un enlace de antígeno o región variable del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. · Ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, Fd, anticuerpo de dominio (dAb) , fragmentos de la región determinante complementaria (CDR) , anticuerpos de cadena individual (scFv) , fragmentos de anticuerpo de cadena individual, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos recombinantes quelantes, tricuerpos o bicuerpos, intracuerpos , nanocuerpos, inmunofarmacéuticos moduladores pequeños (SMIPs) , una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace de antígeno, un anticuerpo camelizado, un anticuerpo que contiene VHH, o muteínas . o derivados de las mismas, y polipép idos que contienen por lo menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir enlace de antígeno específico al polipéptido, tal como una secuencia CDR, siempre y cuando el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada. Estos fragmentos de antígeno se pueden producir mediante la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de nuevo usando tecnologías de ADN recombinante o síntesis de péptido.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, los fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH VL¡) .'. Al usar un enlazador que es muy corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios se llevan en pares con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097;. WO 93/11161; u Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL EUA, 90:6444-6448 (1993) .

Los fragmentos dé anticuerpos "Fv de cadena individual" o "scFv" comprenden los. dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido individual, y comprenden opcionalmente un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que habilita la Fv para formar la estructura deseada para el enlace de antígeno. (Bird y colaboradores, Science 242:423-426, 1988, y Huston y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL EUA 85:5879-5883, 1988). Un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1.

Los fragmentos adicionales incluyen un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward y colaboradores, Nature 341:544-546, 1989) el cual consiste de un dominio VH.

"Anticuerpos lineales" comprende un par de segmentos Fd en tándem (VH -CH1 - VH - CHD los cuales formar un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecífieos (Zapata y colaboradores, Protein Eng. , 8:1057-62 (1995)).

Un "minicuerpo" que consiste de scFv fusionado a CH3 por la vía de un enlazador de péptido (sin bisagra) o por la vía de una bisagra IgG se ha descrito por Olafsen, y colaboradores, Protein Eng. Des. Sel., 2004 Apr; 17(4) :315-23.

El término "maxicuerpo" se refiere a scFvs bivalentes unidos covalentemente a la región Fe de una .inmunoglobulina, véase, por ejemplo, Fredericks y colaboradores, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) y Powers y colaboradores, Journal of I munological Methods, 251:123-135 (2001).

Los anticuerpos de cadena pesada funcionales que carecen de cadenas ligeras son de origen natural en ciertas especies de animales, tal como tiburones nodriza, tiburones wobbegong y Camelidae, tales como camellos, dromedarios, alpacas y llamas. El sitio de enlace de antígeno se reduce a un solo dominio, el dominio VHH, en estos animales. Estos anticuerpos forman regiones de enlace de antígeno que usan únicamente una región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas que tienen únicamente la estructura H2L2 (referidos como "anticuerpos de cadena pesada" o "HCAbs" ) . El VHH camelizado se recombina supuestamente con las regiones constantes IgG2 e IgG3 que contienen los dominios bisagra, CH2 , y CH3 y carecen de un domino CHl . Los fragmentos únicamente VH clásicos son difíciles de producir en forma soluble, pero se pueden obtener mejoras en la solubilidad y enlace específico cuando los residuos de estructura se alteran para ser más similares a VHH. (Véase, por ejemplo, Reichman, y colaboradores, J. Inmunol. Methods, 1999, 231:25-38) . Los dominios VHH camelizados se han descubierto que se enlazan al antígeno con alta afinidad (Desmyter y colaboradores, J". Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) y posee alta estabilidad en solución (Ewert y colaboradores, Biochemistry 41:3628-36, 2002). Los métodos para generar anticuerpos que tienen cadenas pesadas camelizadas se describen en, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A Nos. 2005/0136049 y 2005/0037421. Se pueden hacer supercóntigos alternativos a partir de dominios similares variables al humano que igualan más estrechamente el supercóntigo V-NAR de tiburón y pueden proporcionar una estructura para una estructura de bucle de penetración larga.

Debido a que el dominio variable de los anticuerpos de cadena pesada en el fragmento de enlace de ant'ígeno totalmente funcional más pequeño con una masa molecular de únicamente 15 kDa, esta entidad es referida como un nanocuerpo (Cortez-Retamozo y colaboradores, Cáncer Research 64:2853-57, 2004). Una biblioteca de nanocuerpos- se puede generar a partir de un dromedario inmunizado como se describe por Conrath y colaboradores, {Antimicrob Agents Chemother, 45: 2807-12, 2001) .

Los intracuerpos son anticuerpos de cadena individual que demuestran una expresión intracelular y pueden manipular la función de la proteína intracelular (Biocca, y colaboradores, EMBO J. 9: 101-108, 1990; Colby y colaboradores, Proc Nati Acad Sci E U A. 101 : 17616-21, 2004) . Los intracuerpos, los cuales comprenden secuencias de señal de células las cuales retienen el constructo de anticuerpo en las regiones intracelulares , se pueden producir como se describe por Mhashilkar y colaboradores (EMBO J 14:1542-51, 1995) y Wheeler y colaboradores. (FASEB J. 17: 1733-5. 2003). Los transcuerpos son anticuerpos permeables en las células en las cuales unos dominios de transducción de proteínas (PTD) se fusionan con los anticuerpos de fragmento variable de cadena individual (scFv) Heng y colaboradores, (Med Hypotheses., 64:1105-8, 2005).

Se contemplan además anticuerpos que son SMIPs o proteínas de fusión inmunoglobulina de domino de enlace específicas para la proteína objetivo. Estos constructos son polipéptidos de cadena individual que comprenden dominios de enlace de antígeno fusionados a los dominios de inmunoglobulina necesarios para llevar a cabo las funciones efectoras del anticuerpo. Véase por ejemplo, el documento O 03/041600, Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0133939 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0118592.

Anticuerpos Multivalentes En algunas modalidades, puede ser deseable generar anticuerpos multivalentes o aún un anticuerpo monoclonal multiespecífico (por ejemplo, biespecífico, triespecífico, etcétera) . Este anticuerpo puede temer especificidades de enlace para por lo menos dos epítopos diferentes del antígeno objetivo, o alternativamente se pueden enlazar a dos moléculas diferentes, por ejemplo al antígeno objetivo y a una proteína de la superficie celular o receptor. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede incluir un .brazo que se enlaza al objetivo y otro brazo que se enlaza a una molécula activadora sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3) , o receptores Fe para IgG (FcyR) , tal como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII- (CD16) para que se enfoquen los mecanismos de defensas celulares a la célula de expresión objetivo. Como otro ejemplo, los anticuerpos biespecífieos se pueden usar para localizar agentes citotóxicos a las células las cuales expresan en antígeno objetivo. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace objetivo y un brazo el cual se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-60, alcaloide de la vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno de isótopos radioactivos) . Se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento también se pueden construir para plegarse en formas multivalentes, las cuales pueden mejorar la afinidad de enlace, especificidad y/o vida media incrementada en la sangre. Las formas multivalentes de anticuerpos anti-hepcidina se pueden preparar mediante técnicas conocidas en el campo.

Los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" .. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a la avidina, el otro a la biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar usando cualquiera de los métodos de reticulación convenientes. Los agentes reticuladores adecuados son bien conocidos en el campo, y se dan a conocer en la Patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con una variedad de técnicas de reticulación. Otro método se designa para elaborar tetrámeros al agregar una secuencia de codificación de estreptavidina en la C-terminal del scFv. La estreptavidina está compuesta de cuatro subunidades, de módo que cuando la scFv-estreptavidina se pliega, cuatro subunidades se asocian para formar un tetrámero. (Kipriyanov y colaboradores, Hum Anticuerpos Hybridomas 6(3): 93-101 (1995), la descripción de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

De acuerdo con otro procedimiento para elaborar anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales se recuperan del cultivo celular recombinante . Una interface comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interface de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral grandes se crean sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos grandes con las más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros . Véase el documento WO 96/27011 publicado el 6 de Septiembre de 1996.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos se pueden preparar usando un enlace químico. Brennan y colaboradores, Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde- los anticuerpos intactos se parten proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de la arsenita de sodio del agente de complejo de ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados luego se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB luego se convierte al Fab'-tiol por la reducción con la mercapto-etil-amina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Better y colaboradores, Science 240: 1041-1043 (1988) dan a conocer la secreción de fragmentos de anticuerpo funcionales de bacterias (véase, por ejemplo, Better y colaboradores, Skerra y colaboradores Science 240: 1038-1041 (1988)). Por ejemplo, los fragmentos Fab' -SH se pueden recuperar directamente del E. coli y se acoplan químicamente para formar anticuerpos biespecífieos (Cárter y colaboradores, Bio/ echnology 10: 163-167 (1992); Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)).

Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab' )2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmentos Fab' se secretó separadamente del E. coli se sometió al acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de enlazarse a las células que sobreexpresan el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como también la activación de la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumor de mama humano.

También se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos o multiespecíficos directamente del cultivo celular recombinante . Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina, por ejemplo GCN . (Véase generalmente Kostelny y colaboradores, J. Imunol 148 (5) : 1547-1553 (1992)). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante la fusión de genes. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego reoxidarlos para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este método también . se puede usar para la producción de homodímeros de anticuerpo.

Los diacuerpos, descritos anteriormente, son un ejemplo de un anticuerpo biespecífico. Véase, por ejemplo, Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993). Los diacuerpos bivalentes se pueden estabilizar por el enlace de disulfuro.

Los tetrámeros Fv monoespecíficos o biespecíficos estables también se pueden generar mediante la asociación no covalente en la- configuración (scFv2) 2 o como bis-tetracuerpos . Alternativamente, dos scFvs diferentes se pueden unir en tándem para formar un bis-scFv.

Otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv (sFv) de cadena individual también se han reportado. Véase Gruber y colaboradores, J. Imunol 152: 5368 (1994). Un procedimiento ha sido enlazar dos anticuerpos scFv con enlazadores o enlaces de disulfuro (Mallendery Voss, J". Biol. Chem. , 269:199-2061994, el documento WO 94/13806, y la Patente de E.U.Á. No. 5,989,830, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como se describe por Zapata y colaboradores Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1 -VH -CH1) los cuales forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos .

Los anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . (Tutt y colaboradores, J. Immunol 147:60 (1991) ) .

Un "anticuerpo recombinante quelante" es un anticuerpo biespecífico que reconoce epítopos adyacentes y no de traslapamiento del antígeno objetivo, y es suficientemente flexible para enlazarse a ambos epítopos simultáneamente (Neri y colaboradores, J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

La producción del Fab-scFv biespecífico ("bicuerpo") y Fab- (scFv) (2) triespecífico ( "tricuerpo" ) se describen por Schoonjans y colaboradores (J" Immunol . 165:7050-57, 2000) y Willems y colaboradores (J" Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci . 786: 161-76, 2003). Para los bicuerpos o tricuerpos, una molécula scFv se fusiona a una o ambas de las cadenas VL-CL (L) y VH-CHx (Fd) , por ejemplo, para producir un tricuerpo de dos scFvs que se fusiona la C-terminal del Fab mientras que en un bicuerpo un scFv se fusiona a la C-terminal del Fab.

En todavía otro método, los dímeros, trímeros y tetrámeros se producen después de que una cisteína libre sé introduce en la proteína parental . Un reticulador basado en péptido con números variables (dos a cuatro) de grupos maleimida se usó para reticular la proteína de interés a las cisteínas libres (Cochran y colaboradores, Immunity 12(3): 241-50 (2000), la descripción de la cual se incorpora en este documento en su totalidad) .

AGENTES DE ENLACE ESPECIFICOS Se pueden preparar otros agentes de enlace específicos de hepcidina, por ejemplo, con base en las CDRs de un anticuerpo o al clasificar bibliotecas de diversos péptidos o compuestos químicos orgánicos para los péptidos o compuestos que exhiben las propiedades de enlace deseadas para la hepcidina humana. El agente de enlace específico de hepcidina incluye · péptidos que contienen secuencias de aminoácidos que son por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,' 99% o más idénticas a una o más CDRs de anticuerpo de murino Ab43 (SEQ ID NOs : 16-21); anticuerpo de murino 2.7 (SEQ ID NOs : 28-33); anticuerpo de murino 2.41 (SEQ ID NOs : 40-45), anticuerpo R9 de rata (SEQ ID NOs : 52-57) o anticuerpo 1C9 humano (SEQ ID NOs: 111-116), anticuerpo 3B3 humano (SEQ ID NOs : 121-126), anticuerpo 4E1 humano (SEQ ID NOs: 131-136), anticuerpo 7A3 humano (SEQ ID NOs: 141-46), anticuerpo 9D12 humano (SEQ ID NOs : 151-156), anticuerpo 12B9 humano (SEQ ID NOs : 161-166), anticuerpo 15E1 humano (SEQ ID NOs: 171-176), anticuerpo 18B11 humano (SEQ ID NOs : 334-339), anticuerpo 18D8 humano (SEQ ID NOs : 314-319), anticuerpo 19B8 humano (SEQ ID NOs : 343-349), anticuerpo 19C1 humano (SEQ ID NOs: 324-329), anticuerpo 19D12 humano (SEQ ID NOs : 294-299), anticuerpo 19H6 humano (SEQ ID NOs : 304-309), anticuerpo 20E12 humano (SEQ ID NOs : 353-359), anticuerpo 22F12 humano (SEQ ID NOs: 363-369), anticuerpo 22H10 humano (SEQ ID NOs : 373-379) , anticuerpo -23A11 humano (SEQ ID NOs : 383-389), anticuerpo 23F11 humano (SEQ ID NOs: 181-186), anticuerpo 24E4 humano (SEQ ID NOs : 393-399), anticuerpo 26F11 humano (SEQ ID NOs : 191-196), o anticuerpo 1S1 humano (SEQ ID NOs : 203-205 y 131-133) o anticuerpo 1S2 humano (SEQ ID NOs : 214-216 and 144-146) o anticuerpo 1S3 humano (SEQ ID NOs : 225-227 y 164-166) o anticuerpo 1S4 humano (SEQ ID NOs : 236-238 y 174-176) O anticuerpo 1S5 (SEQ ID NO: 247-249 y 184-186.

Los agentes de enlace específicos de hepcidina también incluyen pepticuerpos . El término "pepticuerpo" se refiere a una molécula que comprende un dominio Fe de anticuerpo unido a por lo menos un péptido. La producción de péptidos se describe generalmente en la publicación PCT O 00/24782, publicada el 4 de Mayo del 2000. Cualquiera de estos péptidos se puede enlazar en tándem (es decir, secuencialmente) , con o sin enlazadores . Los péptidos que contienen un residuo de cisteinilo se pueden reticular con otro péptido que contiene Cys, cualquiera o ambos de los cuales se pueden enlazar a un vehículo. Cualquier péptido que tenga más de un residuo Cys puede formar un enlace de disulfuro de intrapéptido también. Cualquiera de estos péptidos se puede derivatizar, por ejemplo, el carboxilo terminal se puede terminar con un grupo amino, las cisteínas se pueden terminar, o los residuos de aminoácidos se pueden sustituir por porciones diferentes a los residuos de aminoácidos (véase, por ejemplo, Bhatnagar y colaboradores, J. Med. Chem. , 39: 3814-9 (1996), y Cuthbertson y colaboradores, J. Med. Chem., 40: 2876-82 (1997), las cuales se incorporan á manera de referencia en este documento en su totalidad) . Las secuencias de péptido se pueden optimizar, análogos a la maduración de afinidad para los anticuerpos, u de otra manera alterar por la mutagénesis de escaneo o aleatoria o dirigida de alanina seguido por la clasificación para identificar los mejores enlazadores. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26: 401-24 (1997). Se pueden insertar varias moléculas dentro de la estructura del agente de enlaces específico, por ejemplo, dentro de la porción de péptido misma o entre las porciones de péptido o vehículo de los agentes de enlace específicos, mientras que retienen la actividad deseada de enlace específico. Se pueden insertar fácilmente, por ejemplo, moléculas tal como un dominio Fe o fragmento del mismo, polietilenglicol u otras moléculas relacionadas tal como dextrano, un ácido graso, un lípido, un colesterol, un carbohidrato pequeño, un péptido, una porción detectable como se describe en este documento (que incluye agentes fluorescentes, radioetiquetas tales como radioisótopos) , un oligosacárido, oligonucleótido, un polinucleótido, ARN de interferencia (o otro), enzimas, hormonas, o los similares. Otras moléculas adecuadas para la inserción en esta forma se apreciarán por aquellas personas expertas en el campo y se abarcan dentro del alcance de la invención. Esto incluye la inserción de, por ejemplo, en una molécula deseada entre dos aminoácidos consecutivos, unidos opcionalmente por un enlazador adecuado.

El desarrollo de pepticuerpos de hepcidina.. La interacción de un ligando de proteína con su receptor toma lugar frecuentemente en una interfase relativamente grande. Sin embargo, como se muestra para la hormona de crecimiento humana y su receptor, únicamente pocos residuos claves en la interfase contribuyen a la mayoría de la energía de enlace. Clackson y colaboradores, Science 267: 383-6 (1995). El volumen del ligando de proteína expresa meramente los epítopos de enlace en la topología correcta o sirve a las funciones no relacionadas con el enlace. De esta manera, las moléculas de únicamente la longitud de "péptido" (generalmente 2 a 40 aminoácidos) se puede enlazar a la proteína receptora de un ligando dé proteína grande proporcionado. Estos péptidos pueden limitar la bioactividad del ligando de proteína grande ("agonistas de péptido") o, a través del enlace competitivo, inhiben la bioactividad del ligando de proteína grande ("antagonistas de péptido") .

La tecnología de expresión en fago ha emergido como un método poderoso en identificar estos agonistas y antagonistas de péptido. Véase, por ejemplo, Scott y colaboradores Science, 249: 386 (1990); Devlin y colaboradores, Science 249: 404 (1990); Patente de E.U.A. No. 5,223,409, expedida el 29 de Junio de 1993; Patente de E.U.A. No. 5,733,731, expedida el 31 de Marzo de 1998; Patente de E.U.A. No. 5,498,530, expedida el 12 de Marzo de 1996; Patente de E.U.A. No. 5,432,018, expedida el 11 de Julio de 1995; Patente de E.U.A. No. 5,338,665, expedida el 16 de Agosto de 1994; Patente de E.U.A. No. 5,922,545, expedida el 13 de Julio de 1999; el documento WO 96/40987, publicado el 19 de Diciembre de 1996; y el documento WO 98/15833, publicado el 16 de Abril de 1998 (cada uno de los cuales se incorpora a manera de referencia en su totalidad. En las colecciones de expresión en fago de péptido, las secuencias de péptido aleatorias se pueden expresar por la fusión con las proteínas de capa de fago filamentoso. Los péptidos expresados se pueden eluír por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado con anticuerpos de un receptor, si se desea. El fago retenido se puede enriquecer por rondas sucesivas de purificación por afinidad y repropagación. Los mejores péptidos de en lace se pueden secuenciar para identificar los residuos claves dentro de una o más familias estructuralmente relacionadas de péptidos. Véase, por ejemplo, Cwirla y colaboradores, Science 276: 1696-9 (1997), en lo cual se identificaron dos familias distintas. Las secuencias de péptidos también pueden sugerir que residuos se pueden reemplazar con seguridad por el escaneo de alanina o por la mutagénesis en el nivel de ADN. Las bibliotecas de mutagénesis se pueden crear y clasificar para optimizar opcionalmente la secuencia de los mejores enlazadores . Lowman, Ann. Rev. Biophys . Biomol . Struct. , 26: 401-24 (1997) .

El análisis estructural de la interacción de proteína-proteína también se puede usar para sugerir los péptidos que imitan la actividad de enlace de los ligandos de proteína grandes. En este análisis, la estructura de los cristales puede sugerir la identidad y la orientación relativa de · los residuos críticos de ligando de proteína grande, a partir del cual se puede diseñar un péptido. Véase, por ejemplo, Takasaki y colaboradores, Nature Biotech 15: 1266-70 (1997) . Estos métodos analíticos también se pueden usar para investigar la interacción entre una proteína receptora y péptidos seleccionados por la expresión en fago, la cual puede sugerir una modificación adicional de los péptidos para incrementar la afinidad de enlace.

Otros métodos compiten con la expresión en fago en la búsqueda del péptido. Una biblioteca de péptidos se puede fusionar al carboxilo terminal del represor lac y se puede expresar en el E. coli. Otro método basado en E. coli permite expresarse sobre la membrana exterior de la célula mediante la fusión con una lipoproteína asociada con péptidoglicano (PAL) . A partir de ahora, estos y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "expresión de E. , coli" . En otro método, la traducción del ARN aleatorio se detiene antes de la liberación del ribosoma, dando por resultado una biblioteca, de polipéptidos con su ARN asociado a un unido. A partir de ahora, este y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "expresión de ribosoma" . Otros métodos emplean el enlace químico de los péptidos a ARN. Véase, por ejemplo, Roberts y Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 94: 12297-303 (1997) . A partir de ahora, este y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "clasificación de péptidos del ARN" . Se han desarrollado bibliotecas de péptidos químicamente derivadas en las cuales los péptidos se inmovilizan sobre materiales no biológicos, estables, tal como barras de polietileno o resinas permeables al solvente. Otra biblioteca de péptidos químicamente derivada usa politografía para escanear los péptidos inmovilizados sobre portaobjetos de vidrio. A partir de ahora, estos y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "clasificación química del péptido" . La clasificación química del péptido puede ser ventajosa en que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así- como también elementos no de péptido. Ambos métodos biológicos y químicos son revisados en Wells y Lowman, Curr. Opin. Biotechnol, 3: 355-62 (1992) .

Conceptualmente, se puede descubrir imitaciones de péptido de cualquier proteína que usa la expresión en fago y los otros métodos mencionados anteriormente. Estos métodos se han usado para el mapeo de epítopo, para la identificación de aminoácidos críticos en las interacciones de proteína-proteína, y como conduce al descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos. Véase, por ejemplo, Córtese y colaboradores, Curr. Opin. Biotech. , 7: 616-21 (1996). Las bibliotecas de péptidos ahora están siendo usadas más frecuentemente en estudios inmunológicos, tal como el mapeo del epítopo. Véase Kreeger, The Scientist, 10(13): 19-20(1996).

Las fuentes para los compuestos que se pueden clasificar para su capacidad de enlazarse a o modular (es decir, incrementar o disminuir) la actividad de los polipéptidos de hepcidina descritos en este documento incluyen (1) bibliotecas químicas inorgánicas y orgánicas, (2) bibliotecas de producto natural, y (3) bibliotecas de combinación comprendidas de péptidos ya sea aleatorios o miméticos, oligonucleótidos o moléculas orgánicas.

Las bibliotecas químicas se pueden sintetizar fácilmente o comprar de una variedad de fuentes comerciales, y pueden incluir análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que se identifican como "golpes" o "guías" por la vía de la clasificación del producto natural.

Las fuentes de las bibliotecas del producto natural son microorganismos (que incluyen bacterias y hongos) , animales, plantas u otra vegetación, y organismos marinos, y bibliotecas de mezclas para la clasificación se pueden crear mediante: (1) fermentación y extracción de caldos del suelo, plantas o microorganismos marinos o (2) extracción de los organismos mismos . Las bibliotecas de producto natural incluyen polipéptidos , péptidos no ribosomales, y variantes (de origen no natural) de los mismos. Para una revisión, véase Science 282:63-68 (1998).

Las bibliotecas de combinación se componente de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o compuestos orgánicos y se pueden preparar fácilmente mediante métodos de síntesis automatizada tradicionales, PCR, métodos sintéticos de clonación o propietarios. De particular interés son las bibliotecas de combinación de péptidos y oligonucleótidos. Aún otras bibliotecas de interés incluyen bibliotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticos , recolección sintética multiparalela, de recombinación y de polipéptidos. Para una revisión de la química y bibliotecas de combinación creadas de los mismos, véase Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707 (1997). Para las revisiones y ejemplos de las bibliotecas peptidomiméticas , véase Al-Obeidi y colaboradores, Mol. Biotechnol, 9(3):205-23 (1998); Hruby y colaboradores, Curr. Opin. Chem. Biol . , 1(1): 114-19 (1997); Dorner y colaboradores, Bioorg. Med. Che ., 4(5):709-15 (1996) (dipéptidos alquilados) .

Los agentes de enlace específicos de hepcidina también incluyen proteínas de andamiaje, como se describe por Hays y colaboradores Trends In Biotechnology, 23 (10) : 514-522 (2005) , incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad, y una tecnología de proteína Avimer, como se describe en las Publicaciones de E.U.A. Nos. 2006-0286603 y 2006-0223114, ambas incorporadas en este documento a manera de referencia en sus totalidades .

METODOS DE CLASIFICACION PARA ANTICUERPOS 0· AGENTES DE ENLACE ESPECIFICOS También se proporcionan métodos para identificar anticuerpos o agentes de enlace específicos los cuales se enlazan a la hepcidina y/o los cuales bloquean en forma cruzada anticuerpos ejemplares descritos en este documento, y/o los cuales inhiben la actividad de la hepcidina.

Los anticuerpos o agentes de enlace específicos se pueden clasificar mediante la afinidad de enlace por métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, los ensayos de cambio en gel, técnica de Western blots, ensayo de competición radioetiquetas , co-fraccionamiento mediante cromatografía, co-precipitación, reticulación, ELISA, y los similares se pueden usar, los cuales se describen en, por ejemplo, Current Protocole in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Para clasificar inicialmente los anticuerpos o agentes de enlace específico los cuales se enlazan al epítopo deseado sobre el antígeno objetivo, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) , se puede realizar. Los ensayos de enlace competitivos de rutina también se pueden usar, en los cuales el anticuerpo desconocido se caracteriza por su capacidad de inhibir el enlace del objetivo a un anticuerpo específico objetivo descrito en este documento. El antígeno intacto, fragmentos del mismo tal como el dominio extracelular, o epítopos lineales se pueden usar. El mapeo del epítopo se describen en Champe y colaboradores, J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995) . También se pueden usar ensayos de enlace competitivos para determinar la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno . Por ejemplo, un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I), o fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades da incremento de un antígeno no etiquetado, y la detección del anticuerpo en lazado al antígeno etiquetado. Las constantes de disociación de enlacé se .pueden determinar a partir de los datos por el análisis gráfico de scatchard.

En una variación de un ensayo de enlace in vitro, se proporciona el método que comprende (a) poner en contacto una hepcidina inmovilizada con un anticuerpo candidato o agente de enlace específico y (b) detectar el enlace del anticuerpo candidato o el agente de enlace específico a la "hepcidina. En una modalidad alternativa, el anticuerpo candidato o agente de enlace específico se inmoviliza y el enlace de la hepcidina se detecta. La inmovilización se logra usando cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo, que incluyen enlace covalente a un soporte, una perla o una resina cromatográfica, así como también una interacción de alta afinidad, no covalente tal como el enlace de anticuerpo, o uso de enlace de estreptavidina/biotina en donde el compuesto inmovilizado incluye una porción de biotina. La detección del enlace se puede lograr (i) usando una etiqueta radioactiva sobre el compuesto que no se inmoviliza, (ii) usando una etiqueta fluorescente sobre el compuesto no inmovilizado, (iii) usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) usando una etiqueta sobre el compuesto' no inmovilizado que excita un soporte fluorescente al cual el . compuesto inmovilizado se une, así como también otras técnicas bien conocidas y. practicadas rutinariamente en el campo.

En algunas modalidades, los anticuerpos o agentes de enlace específicos que inhiben o neutroizan la actividad de la hepcidina humana se puede identificar al poner en contacto la hepcidina con el anticuerpo (o agente de enlace específico) , comparando la actividad de la hepcidina en presencia y ausencia del anticuerpo del anticuerpo de prueba (o agente de enlace específico) , y determinando si la presencia del anticuerpo (o agente de enlace específico) disminuye la actividad de la hepcidina. La actividad biológica de un anticuerpo particular, o agente de enlace específico, o combinación de anticuerpos o agentes de enlace específicos, se puede evaluar in vivo usando un modelo animal adecuado, que incluye cualquiera de aquellos descritos en este documento .

En algunas modalidades, los ensayos de selección de alto rendimiento (HTS) para identificar los anticuerpos que interactúan con o inhiben la actividad biológica (es decir, inhiben la fosforilación, dimerización, activación del receptor inducido por ligando, o señalización intracelular etcétera) del antígeno objetivo también se contemplan. Los ensayos HTS permiten la selección de grandes números de compuestos de una manera eficiente. Los sistemas HTS basados en células se contemplan para investigar la interacción entre el antígeno objetivo y sus socios de enlace. Los ensayos HTS se diseñan para identificar los compuestos "de golpes" "guías" que tiene la propiedad deseada, de la cual las modificaciones se pueden diseñar para mejorar la propiedad deseada..

En otra modalidad, se emplea la selección de alto rendimiento para los fragmentos de anticuerpos o CDRs con 1, 2, 3 o más modificaciones a aminoácidos dentro de las CDRs que tienen afinidad de enlace adecuada a un polipéptido de antígeno objetivo.

PRODUCCION DE VARIANTES Y DERIVADOS DE ANTICUERPOS Los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento se pueden modificar fácilmente mediante técnicas bien conocidas por una persona de experiencia ordinaria en el campo. Las mutaciones potenciales incluyen inserción, supresión o sustitución de uno o más residuos. En alguna modalidad, las inserciones o supresiones están en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, en el intervalo de aproximadamente 1 a 3 aminoácidos, o en el intervalo de aproximadamente 1 o 2 aminoácidos.

Las variantes de supresión son polipéptidos en donde por lo menos se remueve un residuo de aminoácido de cualquier secuencia de aminoácidos. Las supresiones se pueden efectuar en una o ambas terminales de la proteína, o con la remoción de uno o más residuos dentro (es decir, interno a) el polipéptido. Los métodos para la preparación de variantes de supresión son de rutina en el campo. Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, la descripción de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones de amino y/o carboxilo terminal que varían en longitud desde un residuo hasta los polipéptidos que contienen cientos o más residuos, así como también inserciones de secuencia interna de uno o más aminoácidos. Como con cualquiera de los diferentes tipos de variantes descritos en este documento, se pueden diseñar variantes de .inserción tal que el polipéptido resultante retiene las mismas propiedades biológicas o exhibe una nueva propiedad física, química y/o biológica no asociada con el polipéptido precursor del cual se derivó. Los métodos para la preparación de las variantes de inserción también son de rutina y bien conocidos en el campo (Sambrook y colaboradores, supra) .

Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido que comprende un anticuerpo antihepcidina descrito en este documento y un polipéptido heterólogo son un tipo específico de variante de inserción contemplado en este documento. Ejemplos no limitantes de polipéptidos heterologos los cuales se pueden fusionar a los polipéptidos de interés incluyen proteínas con vida media circulante prolongada, tal como, pero no se limita a, regiones constantes de inmunoglobulina (por ejemplo, región Fe) ; secuencias marcadoras que permite la identificación del polipéptido de interés; secuencias que facilitan la purificación de polipéptido de interés; y secuencias que promueve la formación de proteínas multiméricas .

Los métodos para elaborar proteínas de fusión de anticuerpo son bien conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,306,393, la descripción de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, se producen proteínas de fusión las cuales pueden incluir un enlazador flexible, el cual conecta el anticuerpo scFv quimérico a la porción de proteína heteróloga. Las secuencias enlazadoras apropiadas son aquellas que no afectan la capacidad de la proteína de fusión resultante que es reconocida y se enlaza al epítopo específicamente enlazado por el dominio V de la proteína (véase, por ejemplo, el documento WO 98/25965, la descripción del cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

Las variantes de sustitución son aquellas en las cuales por lo menos un residuo en la secuencia de aminoácidos del polipéptido se remueve y se inserta un residuo diferente en su lugar. Las modificaciones en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar sustituciones que " difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, una conformación de lámina o helicoidal (b) la carga de la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. En ciertas modalidades, se diseñan las variantes de sustitución, es decir, uno o más residuos de aminoácidos específicos (como es opuesto a la aleatoria) se sustituyen con un residuo de aminoácido específico. Los cambios típicos de estos tipos incluyen sustituciones conservadoras y/o sustitución de un residuo por otro con base en las propiedades similares de los residuos nativos y de sustitución.

Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1. La sustitución más conservadora se encuentra bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Si estas sustituciones no dan por resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir. más cambios sustanciales y los productos se clasifican.

Tabla 1 Original Ejemplar Sustituciones de Residuos Preferidas Ala (A) val ; leu; ile val Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his ; as , lys ; gln arg Asp (D) glu; asn glu.

Cys (C) ser; ala ser Gln (Q). asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala His (H) asn; gln; lys ; arg lie (I) leu; val ; met ; ala Leu phe : norleucina Leu (L) noleucina • ile; val; ile met ; ala; phe lie Lys (K) arg; gln; asn Arg Met (M) leu; phe; ile Leu Phe (F) leu; val ; ile; ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thr Thr (T) ser Ser Trp(W) tyr; phe Tyr Tyt (Y) trp; phe; thr; ser Phe Val (V) ile; leu; me ; phe; Leu ala; norleucina Los residuos de aminoácidos los cuales comparten propiedades de cadena lateral comunes se agrupan frecuentemente como sigue. (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acido: asp, glu; (4) básico: asn, gin, his, lys, arg (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromático: trp, tyr, phe.

Variantes de Anticuerpos En ciertos casos, las variantes de anticuerpos se preparan con el intento de . modificar aquellos residuos de aminoácidos los cuales se implican directamente en el enlace del epítopo. En otras modalidades, la modificación de los residuos los cuales no se implican directamente en el enlace del epítopo o residuos no implicados en el enlace del epítopo de ninguna manera, es deseable, para los propósitos planteados en este documento. Se contempla la mutagénesis dentro de cualquiera de las regiones CDR y/o regiones de estructura .

A fin de determinar cuáles residuos de aminoácidos de anticuerpo son importantes para el reconocimiento y enlace del epítopo, se puede realizar la mutagénesis de clasificación de alanina para producir · variantes de sustitución. Véase, por ejemplo, Cunningham y colaboradores, Science, 244:1081-1085 (1989), la descripción de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. En este método, los residuos de aminoácidos individuales se reemplazan uno a la vez con un residuo de alanina y el anticuerpo anti-hepcidina resultante se clasifica por su capacidad de enlazarse a su epítopo específico relativo con el anticuerpo no modificado. Los anticuerpos modificados con la capacidad de enlace reducida se clasifican para determinar cual residuo se cambió, indicando su importancia en las propiedades de enlace o biológicas.

Las variantes de sustitución de los anticuerpos se pueden preparar mediante la maduración de afinidad en donde los cambios de aminoácidos aleatorios se introducen en la secuencia de anticuerpos precursora. Véase, por ejemplo, Ouwehand y colaboradores, Vox Sang 74 (Suppl 2) : 223-232, 1998; Rader y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 95:8910-8915, 1998; Dall'Acqua y colaboradores, Curr. Opin. Struct. Biol, 8:443-450, 1998, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en sus totalidades. La maduración de afinidad implica preparar y clasificar los anticuerpos anti-hepcidina, o variantes de los mismos y seleccionar a partir de las variantes resultantes a aquellas que tienen propiedades biológicas modificadas, tal como afinidad de enlace incrementada relativa con el anticuerpo anti-hepcidina precursor. Una forma conveniente para generar variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando la expresión en fago. Brevemente, se mutan varios sitios de región hipervariable para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes generadas de esta manera se expresan en una forma monovalente sobre la superficie de las partículas en fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado con cada partícula. Las variantes expresadas en fago luego se clasifican para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace). Véase por ejemplo, los documentos WO 92/01047, WO 93/1 12366, WO 95/15388 y WO 93/19172.

Los métodos de maduración de afinidad de anticuerpo actuales que pertenecen a las dos categorías de mutagénesis: estocástico y no estocástico. La PCR propensa a errores, cepas bacterianas mutadoras (Low y colaboradores, J. Mo. Biol. 260, 359-68, 1996), y mutagénesis de saturación (Nishimiya y colaboradores, J". Biol. Chem. 275: 12813-20, 2000; Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) son ejemplos típicos de métodos de mutagénesis estocástica (Rajpal y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA. 102:8466-71, 2005) . Las técnicas no estocásticas usan frecuentemente mutagénesis de clasificación de alanina o dirigida al sitio para generar recolecciones limitadas de muteínas especificas. algunos métodos se describen con detalle adicional posteriormente . .:..-¦ Maduración de afinidad por la vía de métodos de inmunoplaqueteo - La maduración de afinidad de los anticuerpos recombinantes se realiza comúnmente a través de varias corridas de inmunoplaqueteo de anticuerpos candidato en la presencia de cantidades decrecientes de antígeno. La disminución de la cantidad de antígeno por ronda selecciona los anticuerpos con afinidad más alta al antígeno produciendo en consecuencia anticuerpos de alta afinidad de una grande acumulación de material de partida. La maduración de afinidad por la vía del inmunoplaqueteo es bien conocida en el campo y se describe, por ejemplo, por Huís y colaboradores {Cáncer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001). Los métodos de maduración de afinidad que usan las terminologías de expresión en fago se describen en cualquier lugar en este documento y son conocidos en el campo (véase por ejemplo, Daugherty y colaboradores, Proc Nati Acad Sci E UA. 97:2029-34, 2000) .

Mutagénesis de exa inación detenida - La mutagénesis de examinación detenida (LTM) (Rajpal y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA 102:8466-71, 2005) proporciona un método para mapear rápidamente el sitio de enlace del anticuerpo. Para la LTM, nueve aminoácidos, representativos de las químicas de cadena lateral principales proporcionadas por los 20 aminoácidos naturales, se seleccionan para diseccionar las contribuciones de cadena lateral funcionales para enlazarse en cada posición en todas las seis CDRs de un anticuerpo. La LTM genera una serie posicional de mutaciones individuales dentro de una CDR donde cada residuo "de tipo natural" se sustituye sistemáticamente por uno de los nueve aminoácidos seleccionados. Las CDRs mutadas se combinan para generar las bibliotecas de fragmento variable de cadena individual de combinación (scFv) de complejidad y tamaño crecientes sin llegar a ser prohibitivos para la expresión cuantitativa de todas las muteínas. Después de la selección positiva, los clones con enlace mejorado se secuencian, y se mapean las mutaciones benéficas.

PCR propensa a errores — La PCR propensa a errores implica la aleatorización de los ácidos nucleicos entre las diferentes rondas de selección. La aleatorización ocurre a una baja protección por la proporción de error intrínseca de la polimerasa usada pero se puede mejorar por la PCR propensa a errores (Zaceólo y colaboradores, J". Mol. Biol. 285:775-783, 1999) usando una polimerasa que tiene una alta proporción de error intrínseca durante la transcripción (Hawkins y colaboradores, J Mol Biol . 226:889-96, 1992) . Después de los sitios de mutación, los clones con afinidad mejorada para el antígeno se seleccionan usando métodos de rutina en el campo.

Las técnicas que usan una transposición genética y evolución dirigida también se pueden usar para preparar y clasificar los anticuerpos anti-hepcidina, o variantes de os mismos, para la actividad deseada. Por ejemplo, Jermutus y colaboradores, Proc Nati Acad Sci E U A. , 98(l):75-80 (2001) mostraron que las estrategias de selección in vitro adaptadas con base en la expresión de ribosomas se combinaron con la diversificación in vitro por la transposición de ADN para implicar ya sea la constante de disociación o estabilidad termodinámica de los scFvs; Fermer y colaboradores, Tumour Biol. Enero-Abril del 2004; 25(1-2) :7-13 reportó que el uso de la expresión en fago en combinación con la transposición de ADN elevó la afinidad por casi tres órdenes de magnitud. Dougherty y colaboradores, Proc Nati Acad Sci E U A. 2000 Feb. 29; 97 (5) : 2029-2034 reportó que (i) los clones funcionales ocurren en una frecuencia inesperadamente alta en bibliotecas hipermutadas , (ii) los mutantes de ganancia de función se representan bien en estas bibliotecas, y (iii) la mayoría de las mutaciones scFv que conducen a una afinidad más alta corresponden a residuo distantes de sitio de enlace.

Alternativamente, o además, puede ser benéfico analizar una estructura de cristales del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno, o para usar un software de computadora para modelar estos puntos de contacto. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en este documento. Una vez que se generan estas variantes, se someten a la clasificación como se describen en este documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para un desarrollo adicional.

Anticuerpo con carbohidratos modificados Las variantes, de anticuerpo también se pueden producir ya que tienen un patrón de glicosilacion modificado relativo con el anticuerpo precursor, por ejemplo, adicionando o suprimiendo una o más de las porciones de carbohidratos enlazadas al agente de enlace específico o anticuerpo y/o agregando o suprimiendo uno o más sitios de glicosilacion en el agente de enlace específico o anticuerpo.

La glicosilacion de los polipéptidos, que incluyen anticuerpos es típicamente ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazado se refiere a la unión de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de las secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. De esta manera, los sitios de glicosilación N-enlazados se pueden agregar a un agente de enlace específico o enlace de anticuerpo al alterar la secuencia de aminoácidos tal que contiene una o más de estas secuencias de tripéptidos. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Los sitios de glicosilación O-enlazados se pueden agregar a un agente de enlace específico o anticuerpo al insertar o sustituir uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de agente de enlace específico original o anticuerpo.

Función Efectora Alterada El (los) residuo (s) de cisteína se puede (n) remover o introducir en la región Fe de un anticuerpo o polipéptido que contiene Fe, eliminando e incrementando en consecuencia la formación de enlace de disulfuro de intercadena en eta región. Un agente de enlace específico homodimérico o anticuerpo generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o exterminio de célula mediado por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . Véase Carón y colaboradores, J. Exp. Med. , 176:1 191-1195 (1992) and Shopes, B., J. Immunol 148: 2918-2922 (1992) . Los agentes de enlace específicos homodiméricos o anticuerpos también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales como se describe por Wolff y colaboradores, Cáncer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un agente de enlace específico o anticuerpo el cual tiene regiones Fe dobles y pueden tener en consecuencia una lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. Véase Stevenson y colaboradores, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) .

Se ha mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden causar que un anticuerpo se enlace a MHC Clase II y activador de una respuesta de células T colaboradoras no deseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el agente de enlace específico o anticuerpo retengan la actividad de enlace y aún reduzca su capacidad de activar una ¦ respuesta de células T no deseada. También se contempla que uno o más de los 20 aminoácidos N-terminales de la cadena pesada o ligera se remuevan: En algunas modalidades, la producción de moléculas de anticuerpo se contempla con una estructura de carbohidratos alterada que da por resultado una actividad efectora alterada, que incluyen moléculas de anticuerpo con fucosilación ausente o reducida que exhiben actividad ADCC y mejorada. Una variedad de formas son conocidas en el campo para lograr esto. Por ejemplo, una actividad efectora ADCC es mediada por el enlace de la molécula de anticuerpo receptor FcyRIII, el cual se ha mostrado que es dependiente sobre la estructura de carbohidratos de la glicosilación N-enlazada en el Asn-297 del dominio CH2. Los anticuerpos no fucosilados enlazan este receptor con afinidad incrementada y activan las funciones efectoras mediadas por FcyRIII más eficientemente que los anticuerpos fucosilados, nativos. Por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpo no fucosilado en las células CHO en las cuales la enzima alfa-1, 6-fucosil-transferasa que ha sido genéticamente deficiente da por resultado un anticuerpo con actividad ADCC 100 veces incrementada (Yamane-Ohnuki y colaboradores, Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5 ; 87 (5) : 614-22) . Se pueden lograr efectos similares a través de disminuir la actividad de esta u otras enzimas en la ruta de fucosilación, por ejemplo, a través del tratamiento con ARNsi o ARN antisentido, diseña las líneas de células para hacer genéticamente deficiente la(s) enzima(s), o cultivar, con inhibidores de glicosilación selectivos (Rothman y colaboradores, Mol Immunol . 1989 Dec 26 (12) : 11 13-23) . Algunas cepas de células hospederas, por ejemplo Led 3 o línea de células YB2/0 de hibridoma de rata producen naturalmente anticuerpos con niveles de fucosilación más bajos. Shields y colaboradores, J Biol Chem. 2002 Jul 26;277 (30) :26733-40; Shinkawa y colaboradores, J Biol Chem. 2003 Jan 31; 278 (5) : 3466-73. Un incremento en el nivel de carbohidratos divididos en dos, por ejemplo a través de producir recombinantemente anticuerpos en las células que sobreexpresan la enzima GnTIII, se ha determinado que incrementa la actividad ADCC. Umana y colaboradores, Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17 (2): 176-80. Se ha predicho que la ausencia de únicamente uno de los dos residuos de fucosa pueden ser suficientes para incrementar la actividad ADCC. (Ferrara y colaboradores, J Biol Chem. 5 de Diciembre de 2005) .

Otras Modificaciones Covalentes Las modificaciones covalentes de un polipéptido, o anticuerpo también se incluyen dentro del alcance de esta invención. Se pueden elaborar mediante la síntesis química o mediante la escisión enzimática o química del polipéptido o anticuerpo si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes se pueden introducir al hacer reaccionar residuos de aminoácidos objetivo con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos de¦ N-terminal o C-terminal .

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con -haloacetatos (y aminas correspondientes) , tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para proporcionar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . Los residuos de cisteinilo también es derivan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido .alfa. -bromo-ß- (5-imidozoil) propiónico, cloroacetil-fosfato, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2 -cloromercuri-4-nitrofenol , o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol .

Los residuos de histidilo se derivan por la reacción con el dietilpirocarbonato en pH 5.5-7.0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. En algunas modalidades, también es útil el bromuro de para-bromofenacilo; y la reacción se realiza en cacodilato de sodio 0.1 M a H 6.0.

Los residuos de lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otro ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar residuos que contienen .alfa. -amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencensulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y and reacción catalizada con transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican por ' la reacción por uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2 , 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la pKa alta del grupo funcional guanidina. Adicionalmente , estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como también el grupo épsilon-amino de arginina .

Se puede hacer la modificación específica de los residuos de tirosilo, con interés particular al introducir etiquetas espectrales dentro de los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, el N-acetilimidizol y tetranitrometano se usan para formar especies de 0-acetil-tirosilo y derivados de 3 -nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas etiquetadas para el uso en un radioinmunoensayo .

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por la reacción por carbodiimidas (R-N.dbd.C.dbd.N-R' ) , donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tal como l-ciclohexil-3 - (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4 , 4-dimetilpentil) carbodiimida . Adicionalmente, los residuos de aspartilo y glutamilo . se convierten a residuo de asparaginilo y glutaminilo por la reacción por los iones de amonio.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desaraidan frecuentemente a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de la. prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de sérilo o treonilo, metilación de los grupos .alfa.-amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar química o enzimáticamente los glicósidos al agente de enlace específico o anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren la producción del polipéptido o anticuerpo en una célula hospedera que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación enlazada a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO87/05330 publicado el 11 Septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. , páginas 259-306 (1981) .

La remoción de cualquiera de las porciones de carbohidratos presentes en el polipéptido o anticuerpo se puede lograr química o enzimáticamente . La desglicosilación química- requiere la exposición del agente de enlace específico o anticuerpo al ácido trifiuorometansulfónico compuesto o un compuesto equivalente. Este tratamiento da por resultado la escisión de la mayor parte o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras que deja el agente de enlace específico o anticuerpo intactos. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin, y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge y colaboradores, Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La enzimática de las porciones de carbohidratos sobre un agente de enlace específico o anticuerpo se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura y colaboradores, Meth. Enzymol, 138: 350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento comprende enlazar el polipéptido, agente de enlace específico o anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteínico, por ejemplo, polietilenglicol , sorbitol polioxietilado, . glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos , o polímeros de polisacárido tal como dextrano . Estos métodos son conocidos en el campo, véase, por ejemplo Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 o el documento EP 315 456.

METODOS DE DIAGNOSTICO PARA TRASTORNOS RELACIONADOS CON LA HEPCIDINA Y SUPERVISION DE LA TERAPIA CON ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA En otro aspecto, se proporciona un método para detectar hepcidina humana en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra de un humano con cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente bajo condiciones que permitan el enlace del anticuerpo a hepcidina humana, y detectar el anticuerpo enlazado. En una modalidad, un primer anticuerpo a la hepcidina se inmoviliza sobre un soporte sólido, como un reactivo de captura, y un segundo anticuerpo para la hepcidina se inmoviliza sobre un soporte sólido, como un reactivo de captura y un segundo anticuerpo para la hepcidina se usa como un reactivo de detección. En un aspecto relacionado la cantidad de hepcidina en la muestra se cuantifica al medir la cantidad del anticuerpo enlazado. Los métodos de detección se pueden usar en una variedad de métodos de diagnóstico, pronóstico y supervisión, que incluyen métodos para diagnosticar un trastorno relacionado con hepcidina, métodos para diferenciar una enfermedad inflamatoria de una enfermedad no inflamatoria y métodos para supervisar la terapia con un anticuerpo anti-hepcidina . En éstos métodos, un nivel de hepcidina arriba de un cierto umbral se correlaciona con la presencia del trastorno relacionado con hepcidina, tal como anemia relacionada con la hepcidina, mientras que un nivel abajo del umbral indica que el paciente es poco probable que tenga un trastorno relacionado con hepcidina. Similarmente, un nivel de hepcidina arriba de un cierto umbral se correlaciona con la presencia de una enfermedad inflamatoria, con un nivel abajo del umbral que indica que el paciente es poco probable que tenga una enfermedad inflamatoria. En algunas modalidades, estos métodos diagnosticarán pacientes que tienen anemia por deficiencia de hierro, anemia de inflamación o anemia mezclada. Para la supervisión de la terapia dirigida a la supresión de los niveles de hepcidina, un nivel de hepcidina abajo de un cierto umbral indica que la dosis del anticuerpo de hepcidina es terapéuticamente efectiva, y un nivel arriba del umbral indica que la dosis del anticuerpo de hepcidina no es terapéuticamente efectiva.

También se proporcionan métodos para diagnosticar trastornos relacionados con hepcidina tal como anemia relacionada con la hepcidina u · otras enfermedades de exceso de hepcidina o deficiencia de hepcidina, y para supervisar la efectividad de la terapia para esta enfermedad, que incluye terapia con un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento. Para determinar la presencia o ausencia de la anemia relacionada con la hepcidina, una muestra biológica de un paciente es pone en contacto con uno o más anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos . Los inmunocomplejos formados entre un anticuerpo anti-hepcidina y hepcidina en la muestra biológica luego se detectan. La cantidad de hepcidina en la muestra se cuantifica al medir la cantidad del inmunocomplejo formado entre el anticuerpo y la hepcidina. Dentro de ciertos métodos, una muestra biológica se aisla de un paciente y se incuba con uno o más de los anticuerpos anti-hepcidina, dados a conocer en este documento, y el nivel del complejo de anticuerpo-hepcidina arriba de un cierto umbral se correlaciona con la presencia de la anemia relacionada con la hepcidina, y un nivel abajo del umbral indica que el paciente es poco probable que tenga anemia relacionada con la hepcidina. Por ejemplo, un nivel dentro del intervalo normal indica que el paciente es poco probable que tenga anemia relacionada con la hepcidina. El intervalo normal de hepcidina en suero es generalmente menor que 10 ng/ml cuando se determina por ciertos ensayos, es decir, técnicas de espectrometría de masas descritas en la Solicitud de Patente de E.U.A. de co-propiedad No. 11/880,313 y Publicación Internacional No. WO 2008/011158, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad, pero variarán dependiendo del ensayo y dependiendo del subconjunto de población sometida a prueba.

También se proporcionan métodos para diferenciar una enfermedad inflamatoria de una enfermedad inflamatoria. Para terminar la presencia o ausencia de una enfermedad inflamatoria, una muestra biológica de un paciente se pone en contacto con uno ó más de los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplej os . Se pueden usar varios inmunoensayos conocidos en el campo, que incluyen pero no se limitan a: sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tal como radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas) , inmunoensayos de "emparedado", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifución, inmunoensayos in situ (usando etiquetas de oro coloidal, enzimas o radioisótopos, por ejemplo) , técnicas de Western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación) , ensayos, de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etcétera. En una modalidad, el . enlace de anticuerpo se detecta al detectar un anticuerpo una etiqueta sobre el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta al detectar el enlace de un anticuerpo reactivo secundario al anticuerpo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario se etiqueta. Muchos medios son conocidos en el campo para detectar el enlace en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Anticuerpos: A Laboratory Manual (1988) por Harlow & Lañe o ediciones más recientes; inmunoensayos : A Practical Approach, Oxford University Press, Gosling, J. P. (ed.) (2001) o ediciones más recientes; y/o Protocolos Actuales en la Biología moléculas (Ausubel y colaboradores) , los cuales se actualizan regularmente. Ejemplos de estos ensayos implican usualmente. en anticuerpo unido a una superficie o matriz, suero del paciente agregado y tiempo permitido para formar un complejo; procedimientos de lavado adecuados para remover el complejo no enlazado, seguido por ya sea la adición de un segundo anticuerpo para permitir la detección del complejo (un ELISA de emparedado) o una versión detectable de hepcidina para detectar los sitios de enlace de hepcidina libres sobre las superficies del anticuerpo (un ELISA de competición). El nivel de hepcidina, como es detectado por los métodos anteriores, arriba de un cierto umbral se correlaciona con la presencia de una enfermedad inflamatoria, y un nivel abajo del umbral indica que el paciente es poco probable que tenga una enfermedad inflamatoria. Un paciente es poco probable que tenga una enfermedad inflamatoria cuando el nivel de histidina está dentro del intervalo normal. Un paciente es probable que tenga una enfermedad inflamatoria cuando el nivel de hepcidina exceda el intervalo normal por ejemplo 20 ng/ml, en particular, cuando el nivel está entre 20 y 1000 ng/ml. Las enfermedades inflamatorias relacionadas con la hepcidina ejemplares incluyen anemia de cáncer, anemia de enfermedad crónica, anemia de inflamación, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad crónica de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V), y la enfermedad renal de etapa final, insuficiencia renal crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, cáncer, artritis reumatoide, lupus eritematosos sistémico, enfermedad de Crohn, infección por H. pyelori u otras infecciones bacterianas, hepatitis C, VIH, y otras enfermedades víricas, arteriosclerosis , aterosclerosis , cirrosis del hígado, pancreatitis, sepsis, vasculitis, deficiencia de hierro, anemia microcítica hipocrómica y condiciones con el exceso de hepcidina.

Dentro de otros métodos, una muestra biológica obtenida de un paciente se somete a prueba para el nivel de hepcidina. La muestra biológica que incuba' con uno o más anticuerpos de los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formar inmunocomplejds . Los inmunocomplejos formados entre la hepcidina y los anticuerpos en la muestra biológica que se enlaza específicamente a la hepcidina luego se detectan. Una muestra biológica para el uso dentro de estos métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que se espera que contenga hepcidina. Las muestra biológicas adecuadas incluyen sangre, sueros, plasma, orina y médula ósea. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos de células humanas, de roedor, de conejo, de cabra, de camello o cualquier otra especie.

La muestra biológica se incuba con los anticuerpos en una mezcla de reacción bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formar inmunocomplejos entre la hepcidina y anticuerpos que son inmunoespecíficos para la hepcidina. Por ejemplo, una muestra biológica y uno o más anticuerpos anti-hepcidina se pueden incubar a 4°C durante 24-48 horas.

Después de la incubación, la mezcla de reacción se somete a prueba para la presencia de inmunocomplejos. La detección de inmunocomplejos formados entre un anticuerpo anti-hepcidina y la hepcidina presente en la muestra biológica se puede lograr por una variedad de técnicas conocidas, tal como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes enlazados con enzimas (ELISA) . Los ensayos adecuados son bien conocidos en el campo y se describen ampliamente en la literatura científica y de patente (Harlow y Lañe, 1988) . Los ensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, la técnica de inmunoensayo de emparedado del anticuerpo monoclonal doble (Patente de E.U.A. No. 4,376,110); ensayo de · emparedado de anticuerpo monoclonal- policlonal (Wide L. , "Solid Phase Antigen-Anticuerpo Systems," Radioimm noassay Methods: European Workshop 15-17 e Septiembre de 1970 Edinburgh, Kirkham y Húnter, eds . , (Churchill Livingston, Edenburgh, (1971)) páginas 405-412; el método "western blot" (Patente de E.U.A. No. 4,452,901); inmunoprecipitación del ligando etiquetado (Brown y colaboradores, J. Biol. Chem. 4980-4983m 1980); ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas; técnicas inmunocitoquímicas , que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks y colaboradores, Clin. Exp. Immunol . , 39: 477, 1980); · y neutroización de la actividad (Bo en-Pope y colaboradores, Science, 226:701-703,1984). Otros inmunoensayos incluyen pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876.

Para propósitos de detección, un anticuerpo anti- hepcidina puede ser ya sea etiquetado o no etiquetado. Los anticuerpos no etiquetados se pueden usar en los ensayos de aglutinación o en combinación con los reactivos de detección etiquetados que se enlazan a los inmunocomplejos (por ejemplo, anti-inmunoglobulina, proteína G, Proteína A o una lectina y anticuerpos secundarios, o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos, capaces de enlazarse a los anticuerpos que se enlazan específicamente a la hepcidina) . Si el anticuerpo anti-hepcidina se etiqueta, el grupo reportero puede ser cualquier grupo reportero adecuado conocido en el campo, que incluyen radioisótopos, grupos fluorescentes (por ejemplo fluoresceína o rodamina) , grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas de tinción. Las etiquetas que son por sí mismas detectables directamente incluyen tintes fluorescentes o luminiscentes, metales o quelatos de metal, etiquetas electroquímicas, radionúclidos (por ejemplo, 32P, 14C, 1251, 3H, o 1311) , etiquetas o perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS) , etiquetas paramagnéticas , o etiquetas colorimétricas (por ejemplo, oro perlas de oro coloidal, vidrio de color o plástico. Estas etiquetas detectables se pueden conjugar directamente al anticuerpo anti-hepcidina o reactivo de detección o se pueden asociar con una perla o partícula que se une al anticuerpo anti-hepcidina o reactivo de detección. Las etiquetas que son detectables a través del enlace de un socio · de enlace específico etiquetado incluyen biotina, digoxigenina, maltosa, oligohistidina, 2 , 4-dinitrobenceno, fenil-arsenato, ADNss o 'ADNds) . Las etiquetas indirectas que se pueden detectar indirectamente por su producción de un producto de reacción detectable incluyen varias enzimas bien conocidas en el campo, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, xantina-oxidasa, glucosa-oxidasa u otras sacárido-oxidasas , o luciferasas, las cuales par.ten el substrato apropiado para formar un producto de reacción coloreado o fluorescente.

Dentro de ciertos ensayos, un anticuerpo anti-hepcidina etiquetado se inmoviliza sobre un soporte sólido para el uso como un "agente de captura" (o reactivo) que captura la hepcidina dentro de una muestra biológica. El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo al cual el anticuerpo se puede unir. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocilio de prueba en una placa de microtítulo o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser un tubo, perla, partícula o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un material de plástico tal como polietileno, polipropileno, poliestireno o cloruro de polivinilo o una matriz porosa. Otros materiales incluyen agarosa, dextrano, poliacrilamida, nailon, Sephadex, celulosa o polisacáridos .

El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,359,681. El anticuerpo anti-hepcidina inmovilizado puede ser un anticuerpo policlonal, o uno o más anticuerpos monoclonales tales como aquellos descritos en este documento, o una combinación de anticuerpos policlonales y uno o más monoclonales. El anticuerpo se puede inmovilizar sobre el soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo, las cuales se describen ampliamente en la literatura de patente y científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a la asociación no covalente, tal como adsorción, como unión covalente (la cual puede ser un enlace directo entre el antígenó y los grupos funcionales sobre el soporte o puede ser un enlace por medio de un agente de reticulación) . Se contempla la inmovilización por adsorción a un pocilio por una placa de microtítulo o a una membrana. En estos casos, la adsorción se puede lograr al poner en contacto el anticuerpo anti-hepcidina, en una solución amortiguadora adecuada, con un soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero es típicamente entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, el contacto de un pocilio de una placa de microtítulo de plástico (que incluye poliestireno o cloruro de polivinilo) con una cantidad de péptido varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 iq, aproximadamente - 100 ng a aproximadamente 1 µ?, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de péptido.

Después de la inmunización, los sitios de enlace de la proteína restantes sobre el soporte se bloquean típicamente. Se puede usar cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, que incluyen albúmina de suero bocino, Tween 20MR (Sigma Chemical Co . , St. Louis, Mo . ) , suero de cabra normal inactivado por calor (NGS) , o BLOTTO (solución amortiguada de leche en polvo descremada la cual también contiene un conservador, sales y un agente antiespuma) . El soporte luego se incuba con una muestra biológica sospechosa de contener hepcidina. La muestra se puede aplicar pura, o, más frecuentemente, se puede diluir, usualmente en una solución amortiguada la cual contiene una pequeña cantidad (0.1%-5.0% en peso) de proteína, tal como BSA, NGS, o BLOTTO. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un período de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno que es inmunoespecífico par ala hepcidina dentro de una muestra que con tiene hepcidina. En algunas modalidades, el tiempo de contacto es suficiente para lograr un nivel de enlace que es por lo menos aproximadamente 95% de aquel logrado en el equilibrio entre en anticuerpo enlazado y no enlazado o fragmento de anticuerpo. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo reconocerán que el tiempo necesario para lograr el equilibrio se puede determinar fácilmente al someter a ensayo el nivel de enlace que ocurre durante un período de tiempo. A temperatura ambiente,, un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es generalmente suficiente.

La muestra no enlazada se remueve al lavar el soporte sólido con una solución amortiguadora apropiada, tal como PBS que contiene Tween 20MR al 0.1%. Un reactivo de retención que se enlaza a la hepcidina en los inmunocomplej os (formados por el enlace de captura y la hepcidina de la muestra) luego se pueden agregar. Este reactivo de detección puede ser un anticuerpo policlonal, o uno o más anticuerpos monoclonales tales como aquellos descritos en este documento, o una combinación de anticuerpos policlonales y uno o más monoclonales tales como aquéllos descritos en este documento o una fracción Fab de cualquier anticuerpo. El reactivo de detección se puede etiquetar directamente, es decir, comprende por lo menos una primera etiqueta detectable o molécula "reportera" . Alternativamente, el reactivo de detección puede ser un anticuerpo anti-hepcidina no etiquetado. Este anticuerpo anti-hepcidina no etiquetado (primario) luego se detecta por el enlace de un anticuerpo o reactivo secundario etiquetado al anticuerpo primario. Por ejemplo, si el anticuerpo primario es una inmunoglobulina de murino, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo de inmunoglobulina anti-murino etiquetado. Similarmente, si el anticuerpo primario es una inmunoglobulina de conejo, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo de inmunoglobulina anti-conejo etiquetado.

El reactivo de detección se incuba con el inmunocomplejo durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo enlazado o fragmento de enlace de antígeno del mismo. Una cantidad apropiada de tiempo se puede determinar generalmente al someter a ensayo el nivel de enlace que ocurre durante un período de tiempo. El reactivo de etiqueta o detección no enlazado luego se remueve y el reactivo.de etiqueta o detección enlazado se detecta usando un ensayo adecuado o instrumento analítico. El método empleado para detectar el grupo reportero depende de la naturaleza del grupo reportero. Para etiquetas radiactivas, los métodos de conteo de centelleo o autoradiográficos son generalmente apropiados. ... Se pueden usar métodos espectroscópicos para detectar tintes, porciones luminiscentes o quimioluminiscentes y varios cromógenos, etiquetas fluorescentes y similares. La biotina se puede detectar usando avidina, acoplada a un grupo reportero diferente (comúnmente un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima) . Los grupos reporteros de enzimas (que incluyen peroxidasa de. rábano picante, ß-galactosidasa, fosfatasa alcalina y glucosa-oxidasa) se pueden detectar generalmente por la adición del substrato (generalmente durante un período de tiempo específico) , seguido por un análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de reacción. Sin considerar el método específico empleado, un nivel de reactivo de detección enlazado que es por lo menos dos veces mayor que el de fondo) es decir, el nivel observado para una muestra biológica obtenida de un individuo con un nivel normal de hepcidina, indica la presencia de un trastorno asociado con expresión de la hepcidina.

En modalidades alternativas, la muestra y el reactivo de detección se pueden poner en contacto simultáneamente con el agente" de captura, antes de que se agreguen secuencialmente . En todavía otra alternativa, la muestra y el reactivo de detección se pueden pre-incubar conjuntamente, cuando se agregan al agente de captura. Otras variaciones son fácilmente evidentes para una persona de experiencia ordinaria en el campo.

En otra modalidad, la cantidad de hepcidina presente en una muestra se determina por un ensayo de enlace competitivo. Los ensayos de enlace competitivos dependen de la capacidad de un estándar etiquetado (por ejemplo, un polipéptido de hepcidina, o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de la muestra de prueba (un polipéptido de hepcidina) para enlazarse con una cantidad limitada de un anticuerpo anti-hepcidina. Después de la separación de la hepcidina libre y enlazada, la hepcidina se cuantifica al asociar la relación de la hepcidina enlazada/no enlazada a estándares conocidos. La cantidad de un polipéptido de hepcidina en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que enlaza se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se enlaza, los anticuerpos se inmovilizan típicamente sobre un soporte sólido de modo que el estándar y el analito que se enlazan a los anticuerpos se puedan separar convenientemente del estándar y el analito los cuales permanecen no unidos. De esta manera, en estas modalidades, también se contempla poner en contacto una muestra biológica con la hepcidina madura etiquetada (o un fragmento etiquetado de la misma que retiene la antigenicidad de la hepcidina) y un anticuerpo que se enlaza a la hepcidina madura, y que . detecta la cantidad de complejo de hepcidina etiquetado con anticuerpo formado.

La preparación de conjugados a soportes sólidos o etiquetas detectables comprende frecuentemente el uso de reticuladores químicos . Los reactivos reticuladores contienen por lo menos dos grupos reactivos, y se dividen generalmente en reticuladores homofuncionales (que contienen grupos reactivos idénticos) y reticuladores heterofuncionales (que contiene grupos reactivos no idénticos) . Los reticuladores homobifuncionales que se acoplan a través de las aminas, sulfhidrilos o reaccionan no específicamente son disponibles de muchas fuentes comerciales. Las maleimidas, haluros de alquilo y arilo, alfa-haloacilos y disulfuros de piridilo son grupos reactivos de tiol. Las maleimidas, haluros de alquilo y arilo, y alfa-haloacilos reaccionan con sulfhidrilos para formar enlaces de tiol-éter, mientras que los disulfuros de piridilo reaccionan con los sulfhidrilos para producir disulfuros mezclados. El producto de disulfuro piridilo es escisable. Los imidoésteres también son muy útiles para las reticulaciones de proteína-proteína.

Los reticuladores heterobifuncionales poseen dos o más grupos reactivos diferentes que permiten conjugaciones secuenciales con grupos específicos de proteína, minimizando la polimerización o autoconjugacion indeseable. Los reactivos heterobifuncionales también se usan cuando es problemática la modificación de las aminas. Las aminas algunas veces se pueden encontrar en los sitios activos de las macromoléculas , y la modificación de estas puede conducir a la pérdida de actividad. Otras porciones tales como sulfhidrilos, carboxilos, fenoles y carbohidratos pueden ser objetivos más apropiados. · Una estrategia de dos etapas permite el acoplamiento de una proteína que puede tolerar la modificación de sus aminas a una proteína con otros grupos accesibles. Una variedad de reticuladores heterobifuncionales , cada uno combina diferentes atributos para la conjugación exitosa, son comercialmente disponibles. Los reticuladores que son reactivos a aminas en un extremo y reactivos a sulfhidrilo en otro extremo son muy comunes . Si se usan reactivos heterobifuncionales, el grupo más lábil se hace reaccionar típicamente primero para asegurar la reticulación efectiva y evitar la polimerización indeseada.

Como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. copendiente No. 12/022,515, la descripción de la cual se incorpora a manera de referencia en este documento en su totalidad, es el nivel de hepcidina madura (aminoácidos 60-84 de SEQ ID NO: 8) antes que el niel de prohepcidina (aminoácidos 25-84 de SEQ ID NO: 8) el cual es un diagnóstico para ciertos estados de enfermedad tal como anemia de inflamación y anemia de cáncer. De esta manera, en una modalidad preferida, los anticuerpos que se enlazan a la hepcidina madura, apropiadamente plegada (SEQ ID NO: 9) se usa como tanto un agente de captura como un reactivo de detección. Los anticuerpos que se enlazan a las versiones de N-terminal truncadas de origen natural (por ejemplo, carece hasta dos o hasta cinco de los aminoácidos de N-terminal de la hepcidina madura) también se pueden usar. Se contemplan varias combinaciones de agente de captura y reactivo de detección. Por ejemplo, el agente de captura puede ser un anticuerpo monoclonal que se enlaza al primer epítopo de la hepcidina madura y el reactivo de detección puede ser un anticuerpo monoclonal diferente que se enlaza a un segundo epítopo de la hepcidina madura. En algunas modalidades, se usan anticuerpos específicos para diferentes epítopos de hepcidina a fin de minimizar la competición o interferencia entre el agente de captura y el reactivo de detección. Alternativamente, el agente de captura puede ser un anticuerpo policlonal que se enlaza a la hepcidina madura y el reactivo de detección puede ser un anticuerpo monoclonal. Como todavía otra alternativa, el agente de captura puede ser un anticuerpo monoclonal que se enlaza a la hepcidina madura y el reactivo de detección puede ser un anticuerpo monoclonal. En cualquiera de las modalidades anteriores, ya sea el agente de captura o el reactivo de detección pueden ser una combinación de un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal.

En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal específico de hepcidina madura se usa como ya sea el agente de captura o reactivo de detección o ambos. Un anticuerpo específico de hepcidina madura no se enlaza a la prohepcidina en lo absoluto, o se enlaza a la prohepcidina con tal baja afinidad que el anticuerpo puede diferenciar hepcidina madura de la prohepcidina. Por ejemplo, este anticuerpo monoclonal se puede enlazar a la N- terminal de la hepcidina madura, o puede enlazar un epítopo de la hepcidina madura . que no es detectable en la prohepcidina (por ejemplo debido al enmascaramiento por el pro-dominio) .

En modalidades que usan un anticuerpo monoclonal que se enlaza a un epítopo presente en tanto la hepcidina madura como la prohepcidina, se contempla un refinamiento adicionalmente opcional. La cantidad de hepcidina madura sola se determina al restar la cantidad de prohepcidina presente en la muestra de la cantidad de la hepcidina total (prohepcidina más hepcidina madura) presentes en la misma muestra. La cantidad de prohepcidina se puede determinar al usar anticuerpos policlonales y/o monoclonales específicos de prohepcidina en las técnicas similares a aquellas descritas anteriormente. Un anticuerpo específico de prohepcidina no se enlaza a la hepcidina madura en absoluto, o se enlaza a la hepcidina madura con tal baja afinidad que el anticuerpo puede diferenciar la prohepcidina de la hepcidina madura. Por ejemplo, estos anticuerpos se pueden enlazar a un epítopo lineal o conformacional presente únicamente en el pro-dominio de la hepcidina (aminoácidos. 25-59 de SEQ ID NO: 8) . En estas modalidades, la cantidad de hepcidina y prohepcidina total se puede determinar secuencial o simultáneamente. Debido a que la prohepcidina se degradas rápidamente en suero a la hepcidina, en algunas modalidades se agregan inhibidores de furina a la muestra biológica a fin de prevenir o reducir la degradación de la prohepcidina.

En algunas modalidades el uso de un anticuerpo monoclonal que se enlaza a la hepcidina madura de 25 aminoácidos ,- el anticuerpo monoclonal no enlaza los productos de degradación (es decir, hepcidina-22 y hepcidina-20) .

En una modalidad de un ensayo simultáneo para detectar la hepcidina y prohepcidina total, el agente de captura es un anticuerpo que se enlaza a un epítopo presente en tanto la hepcidina como la prohepcidina madura, y los reactivos de detección se amplían simultáneamente.. El. primer reactivo de detección es un anticuerpo etiquetado que se enlaza a un epítopo presente en tanto la hepcidina como la prohepcidina madura y el segundo reactivo de detección es un anticuerpo específico de prohepcidina diferentemente etiquetada. Por ejemplo, el primer reactivo de detección se etiqueta con un tinte fluorescente detectable en una primera longitud de onda mientras que el segundo reactivo de detección se etiqueta con un tinte fluorescente detectable en una segunda longitud de onda. De esta manera, en este ejemplo, el agente de captura se enlazará a la hepcidina total (hepcidina madura más la prohepcidina) en la muestra, el primer reactivo de detección detectará la cantidad de hepcidina total, y el segundo reactivo de detección detectará la cantidad de prohepcidina. El resto de la cantidad de la prohepcidina de la cantidad de la hepcidina total producirá la cantidad de hepcidina- madura. En otras . modalidades alternativas, se pueden usar dos agentes de captura diferentes: un primer agente de captura que se enlaza a un epltopo presente en tanto la hepcidina madura como la prohepcidina, y un segundo .agente de captura que es un anticuerpo específico de prohepcidina, opcionalmente con un reactivo de detección que se enlaza a un epítopo presente en tanto la hepcidina madura como la prohepcidina.

Otras modalidades para llevar a cabo los ensayos simultáneos son bien conocidas en el campo, que incluyen el sistema de multiplexación descrito, por ejemplo, por Khan y colaboradores, Clin. Vaccine Immunol. , 13(1) 45-52 (Enero de 2006) que implica conjuntos diferentemente codificados de microperlas fluorescentes. Otras modalidades para realizar múltiples ensayos simultáneos sobre una superficie individual incluyen superficies que incluyen una pluralidad de ubicaciones discretas, dirigibles para la detección de una pluralidad de diferentes analitos. Estos formatos incluyen microconfiguraciones de proteínas, o "chips de proteínas" (véase, por ejemplo, Ng y Hag, J. Cell Mol. Med. 6: 329-340 (2002) ) y dispositivos capilares (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,019,944). En estas modalidades, cada ubicación superficial discreta tiene un anticuerpo diferente que inmoviliza un analito diferente para la detección en cada ubicación. Las superficies pueden tener alternativamente una o más partículas discretas (por ejemplo, micropartículas o nanopartículas) inmovilizadas en ubicaciones discretas de una superficie, de la cual el conjunto de partículas contiene un agente de captura diferente para un analito diferente.

Los pares de anticuerpos complementarios (anticuerpos que se enlazan a diferentes epítopos sobre la hepcidina tal que los pares son adecuados para el uso en los ensayos de emparedado) fueron difíciles de identificar. El uso de pares complementarios que minimizan la competición o interferencia pueden incrementar la sensibilidad del ensayo por 20 veces a 50 veces. En algunas modalidades, los inmunoensayos descritos en este documento son capaces de medir los niveles de hepcidina que varían de 0.01 ng/mL a 10 pg/mL.

Los pares de anticuerpos adecuados para el uso en los inmunoensayos de emparedado incluyen lo siguiente: (1) cuando un anticuerpo del par es un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo es 1S1, o compite con el anticuerpo 1S1 para enlazarse a la hepcidina humana madura de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, un segundo anticuerpo adecuado puede ser: (a) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 23F11, o compite con el anticuerpo 23F11 para enlazarse a la hepcidina humana madura, de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (b) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 15E1, o compite con el anticuerpo 15E1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (c) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 12B9, o compite con el anticuerpo 12B9 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; (2) cuando un anticuerpo del -par es un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 12B9 o compite con el anticuerpo 12B9 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, un segundo anticuerpo adecuado puede ser: (a) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 18D8, o compite con el anticuerpo 18D8 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, o (b) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19C1, o compite con el anticuerpo 19C1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%,. 85%, 90% o más, o (c) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19D12, o compite con el anticuerpo 19D12 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, o (d) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19H6, o compite con el anticuerpo 19H6 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (e) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 1S1 o compite con el anticuerpo 1S1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (3) cuando un anticuerpo o el par es un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 23F11, o compite con el anticuerpo 23F11 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, un segundo anticuerpo adecuado puede ser: (a) . un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 18D8, o compite con el anticuerpo 18D8 para enlazares a la hepcidina humana madura de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o- más, o (b) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19C1, o compite con el anticuerpo 19C1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, o (c) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19D12, o compite con el anticuerpo 19D12 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, o (d) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 19H6, o compite con el anticuerpo 19H6 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (e) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como anticuerpo 1S1 o compite con el anticuerpo 4E1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; o (f) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 3B3 o compite con el anticuerpo 3B3 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más; (4) cuando un anticuerpo del par es un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 15E1, o compite con el anticuerpo 15E1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más, un segundo anticuerpo adecuado puede ser: (a) un anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo como el anticuerpo 1S1, o compite con el anticuerpo 1S1 para enlazarse a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90% o más.

En algunas modalidades, los métodos para supervisar la efectividad de la terapia con un anticuerpo anti-hepcidina incluyen supervisar cambios en el nivel de la hepcidina en una muestra, o en un animal tal como un paciente humano. Los métodos en los cuales los niveles de hepcidina se supervisan pueden comprender (a) incubar una primera muestra biológica, obtenida de un paciente antes de una terapia con uno o más de los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento, en donde la incubación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir formar inmunocomplejos; (b) detectar inmunocomplejos formados entre la hepcidina en la muestra biológica y los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno que se enlazan específicamente a la hepcidina; y opcionalmente (c) repetir •las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica tomada del paciente en un tiempo posterior, tal como' por ejemplo después de la terapia con uno o más de los anticuerpos anti-hepcidina dados a conocer en este documento; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas .

Otros métodos de supervisión incluyen medir (a) el nivel circulante de sangre (por ejemplo, suero o plasma) de los complejos entre la hepcidina y el agente terapéutico, y opcionalmente (b) la cantidad de la hepcidina libre presente en la circulación. Por ejemplo, los complejos entre la hepcidina y el anticuerpo terapéutico se pueden detectar usando un anticuerpo Fe anti-humano que se enlaza a la parte de anticuerpo terapéutico del complejo, y un fragmento Fab de un anticuerpo anti-hepcidina "de pareo" que se enlaza a la parte de hepcidina del complejo. Alternativamente, un anti-idiotípico se puede usar en lugar del anticuerpo Fe antihumano. Como otra alternativa un anticuerpo anti-hepcidina que contiene un Fe no humano (por ejemplo un Fe humano se reemplaza con un Fe de murino) se puede usar en lugar del fragmento Fab.

Como otro ejemplo, se puede detectar la hepcidina libre después de remover los complejos de anticuerpo terapéutico-hepcidina de la muestra biológica, usando ya sea un anticuerpo Fe anti-humano o un anticuerpo anti-idiotípico que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido. La cantidad de hepcidina libre la cual permanece no enlazada al soporte sólido luego se mide. Este nivel de hepcidina libre puede reflejar la efectividad del anticuerpo terapéutico en la remoción de la hepcidina circulante disponible.

Una muestra biológica para el uso dentro de estos métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que se esperaría que contenga hepcidina. Muestras biológicas ejemplares incluyen sangre, plasma, sueros, orina y médula ósea. Una primera muestra biológica se puede obtener antes de la iniciación de la terapia o hasta cierto punto de un régimen de terapia. La segunda muestra biológica se debe obtener de una manera similar, pero en un tiempo después de la terapia adicional. La segunda muestra biológica se puede obtener en la terminación de, hasta cierto punto, de la terapia, con la condición de que por lo menos una porción de la terapia tome lugar entre el aislamiento de la primera y segunda muestras biológicas.

Los procedimientos de incubación y detección para ambas muestras se pueden realizar generalmente como se describe anteriormente. Una disminución en el número de inmunocomplej os en la segunda muestra relativa con la primera muestra indica una disminución en los niveles de hepcidina y refleja una. terapia exitosa. La hepcidina libre en suero también se puede analizar de una manera similar, y una disminución en la hepcidina libre en suero indica una terapia exitosa.

Los trastornos relacionados con la hepcidina, enfermedades inflamatorias, y enfermedades o trastornos de la homeostasis de hierro para la cual los métodos de diagnóstico o supervisión pueden ser útiles incluyen pero no se limitan a sobrecarga de hierro de áfrica, alfa-talasemia, enfermedad de Alzheimer, anemia, anemia de cáncer, anemia de enfermedad crónica, anemia de inflamación, arteriosclerosis o aterosclerosis (que incluyen enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cerebrovascular o enfermedad arterial oclusiva periférica) , ataxias, ataxias relacionadas con el hierro, atransferrinemia, cáncer, deficiencia de ceruloplasmina, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal/de los ríñones crónica (etapa I, II, III, IV o V) , que incluye la enfermedad renal de etapa final o insuficiencia renal/de los ríñones crónica, cirrosis del hígado, hemocromatosis clásica, artritis inducida por colágeno (CIA) , condiciones con el exceso de hepcidina (hepcidina elevada) , anemia diseritropoyética congénita, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad de Crohn, diabetes, trastornos de biodistribución de hierró, trastornos de homeostasis de hierro, trastornos de metabolismo de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis de mutación de ferroportina, deficiencias de colato, ataxia de Friedrich, mielosis funicular, síndrome de grácil, infección con H. pyelori u otras infecciones bacterianas, enfermedad de Hallervordan Spatz, hemocromatosis, hemocromatosis que resulta de las mutaciones en el receptor de transferrina 2, hemoglobinopatías , hepatitis, hepatitis (Brock) , hepatitis C, carcinoma hepatocelular, deficiencia de hepcidina, hemocromatosis hereditaria, VIH u otras enfermedades víricas, enfermedad de Huntington, hiperferritinemia, anemia microcítica hipocrómica, hipoferremia, resistencia a la insulina,, anemia por deficiencia de hierro, trastornos por deficiencia de hierro, trastornos de sobrecarga de hierro, condiciones de deficiencia de hierro con el exceso de hepcidina, hemocromatosis juvenil (HFE2) , esclerosis múltiple, mutación en la transferencia del receptor 2, HFE, hemojuvelina,- ferroportina u otros genes de metabolismo de hierro, hemocromatosis neonatal, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el hierro, osteopenia, osteoporosis pancreatitis, neurodegeneración asociada con la Pantotenato-cinasa, enfermedad de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutánea tarda, pseudoencefalitis , hemosiderosis pulmonar, trastornos . de glóbulos rojos, artritis reumatoide, sepsis, anemia sideroblástica, lupus eritematosos sistémico, talasemia, talasemia intermedia, carga de hierro transfusional, tumores, vasculitis, deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12, y/o enfermedad de Wilson.

Los métodos para ajustar un umbral apropiado · para la diagnosis de los estados de enfermedad descritos en este documento y para la supervisión de pronóstico como se describe en este documento son bien conocidos en el campo. A manera de ejemplo, los niveles de hepcidina en una muestra de fluido de una variedad representativa suficiente de sujetos normales (por ejemplo poblaciones sanas sin la condición de que se detecta) se analizan relativas con el nivel de hepcidina de un número representativo suficiente de sujetos enfermos (por ejemplo población confirmada que tiene la enfermedad o condición) que usan los mismos protocolos. Se puede determinar un umbral de corte que diferencia la mayoría de la población normal de la mayoría de la población enferma. Alternativamente, los valores de punto final útiles para resultados negativos, inciertos y positivos se puede determinar a partir de los datos. Por ejemplo, un intervalo normal (indicativo de un resultado negativo) se puede determinar, el cual incluye la hepcidina de la mayoría de la población normal pero el cual excluye casi toda la población enferme. Correspondientemente, un intervalo indicativo de un resultado positivo se puede determinar, el cual incluye la hepcidina de la mayoría de la población enferma pero el cual excluye casi toda la población normal. Similarmente, se puede determinar un umbral de niveles de hepcidina de diferenciación en una población que padece de anemia de inflamación de los niveles de hepcidina en una población que padece de anemia por deficiencia de hierro. Los valores de punto final útiles pueden indicar que el paciente está sufriendo de anemia de inflamación, anemia por deficiencia de hierro o anemia mezclada. Los valores de punto final apropiados para el umbral se pueden determinar para optimizar la especificidad o sensibilidad deseada, y también pueden tomar en cuenta los factores médicos y epidemiológicos generales. Los factores que se consideran incluyen el objetivo clínico de la prueba, de laboratorio y si es necesario tener un alto valor predictivo positivo, o un alto valor predictivo negativo, así como también la prevalencia de la enfermedad en la población de prueba.

USOS TERAPEUTICOS PARA LOS ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA También se proporciona el uso de anticuerpos anti-hepcidina descritos en este documento que se enlazan específicamente a la hepcidina humana, para tratar sujetos en necesidad del mismo. En algunas modalidades, el sujeto puede estar en riesgo de o sufrir de un nivel elevado de hepcidina, un trastorno relacionado con la hepcidina, un trastorno de homeostasis de hierro o anemia.

Como se usa en este documento, "tratamiento" o "tratar" se refiere tanto el tratamiento . profiláctico de un sujeto en riesgo de, o que tiene una predisposición hacia, una enfermedad o trastorno, como al tratamiento terapéutico de un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno.

La administración de un agente terapéutico en un método profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas de una enfermedad o trastorno indeseado, tal que la enfermedad o trastorno se previene o, alternativamente, se retrasa en su progresión. De esta manera, cuando se usa en conjunción con los métodos profilácticos, el término "terapéuticamente efectivo" propone que, después del tratamiento, un pequeño número de sujetos (en promedio) desarrollan la enfermedad o trastorno indeseado o progresan en gravedad de los síntomas.

Cuando se usa en conjunción con los métodos terapéuticos que implican la administración de un agente terapéutico después de que el sujeto manifiesta síntomas de una enfermedad o trastorno, el término "terapéuticamente efectivo" propone que, después del tratamiento, uno o más signos o síntomas de la enfermedad del trastorno se mejoran o se eliminan.

"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye humanos, animales domésticos y de granjas, y animales de zoológico, de deportes o mascotas, tal como perros, caballos, gatos, vacas, etcétera. En algunas modalidades, el mamífero es humano.

Como se usa en esté documento, un "trastorno relacionado con hepcidina" se refiere a una condición causada por o asociada con un nivel anormal de hepcidina (por ejemplo, exceso de hepcidina o deficiencia de hepcidina relativa con el grado de anemia o hierro almacenado) el cual interrumpe la homeostasis de hierro. Una interrupción en la homeostasis de hierro puede a su vez dar por resultado enfermedades secundarias tal como anemia. Las condiciones inflamatorias agudas o crónicas p eden dar por resultado la sobrerregulación de la expresión de hepcidina, lo cual puede dar por resultado niveles de hierro circulantes disminuidos, lo cual puede causar anemia o empeorar la anemia existente. Las enfermedades inflamatorias relacionadas con hepcidina ejemplares incluyen anemia de cáncer, anemia de enfermedad crónica, anemia de inflamación, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad crónica de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V) , enfermedad renal de etapa final, insuficiencia renal crónica insuficiencia cardíaca congestiva, cáncer, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, Enfermedad de Crohn, infección por H. pyelori u otras infecciones bacterianas, hepatitis C, VIH, y otras enfermedades víricas, arteriosclerosis , aterosclerosis , cirrosis del hígado, pancreatitis, sepsis, vasculitis, deficiencia de hierro, anemia microcítica hipocrómica y condiciones con el exceso de hepcidina.

Como se usa en este documento, la frase "enfermedad (o trastorno) de la homeostasis de hierro" se refiere a una condición en la cual los niveles de hierro de un sujeto requieren modulación. Incluye trastornos relacionados con hepcidina; condiciones no asociadas con los niveles elevados de hepcidina que no obstante se beneficiarían de la inhibición de la actividad de la hepcidina, tal como una interrupción en la homeostasis de hierro no causada por la hepcidina; enfermedades en donde la absorción de hierro aberrante, reciclaje, metabolismo o secreción causa una interrupción en los niveles de hierro normales en la sangre o distribución del tejido; enfermedades donde la desregulación de hierro es una consecuencia de otra enfermedad o condición, tal como inflamación, cáncer o quimioterapia, enfermedades o trastornos que resultan de niveles de hierro anormales en la sangre o distribución de tejido; y enfermedades o trastornos que se pueden tratar al modular los niveles o distribución de hierro. Ejemplos no limitantes de estas enfermedades o trastornos de la homeostasis de hierro, trastornos relacionados con la hepcidina y condiciones inflamatorias que resultan en el exceso de hepcidina incluyen sobrecarga de hierro africano, alfa-talasemia, enfermedad de Alzheimer, anemia, anemia de cáncer, anemia de enfermedad crónica, anemia de inflamación, arteriosclerosis o aterosclerosis (que incluyen enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cerebrovascular o enfermedad arterial oclusiva periférica) , ataxias, ataxias relacionadas con el hierro, atransferrinemia, cáncer, deficiencia de ceruloplasmina, anemia inducida por quimioterapia, enfermedad renal/de los ríñones crónica (etapa I, II, III, IV o V) , que incluye enfermedad renal de etapa final o deficiencia ' renal/de los ríñones crónica, cirrosis del hígado, hemocromatosis clásica, artritis inducida por colágeno (CIA) , condiciones con el exceso de hépcidina (hepcidina elevada) , anemia diseritropoyética congénita, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad de Crohn, diabetes, trastornos de biodistribución de hierro, trastornos de homeostasis de hierro, trastornos del metabolismo de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis de mutación de ferroportina, deficiencias de folato, ataxia de Friedrich, mielosis funicular, síndrome de grácil, infección con H. pyelori u otras infecciones bacterianas, enfermedad de Hallervordan Spatz, hemocromatosis, hemocromatosis que resulta de las mutaciones en el receptor de 2 de transferrina, hemoglobinopatías , hepatitis, hepatitis (Brock) , hepatitis C, carcinoma hepatocelular, hemocromatosis hereditaria, VIH u otras enfermedades víricas, enfermedad de Huntington, hiperferritinemia, anemia microcítica hipocrómica, hipoferremia, resistencia a la insulina, anemia por deficiencia de hierro, trastornos por deficiencia de hierro, trastornos de sobrecarga de hierro, condiciones por deficiencia de hierro con el exceso de hepcidina, hemocromatosis juvenil (HFE2) , esclerosis múltiple, mutación en el receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina u otros genes de metabolismo de hierro, hemocromatosis neonatal, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el hierro, osteopenia, osteoporosis pancreatitis, neurodegeneración asociada con pantotenato-cinasa, enfermedad de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutánea tarda, pseudoencefalitis , hemosiderosis pulmonar, trastornos de glóbulos¦ rojos, artritis reumatoide, sepsis, anemia sideroblástica, lupus eritematosos sistémico, talasemia, talasemia intermedia, sobrecarga de hierro transfusional , tumores, vasculitis, deficiencia de vitamina B6 , deficiencia de vitamina B12, y/o enfermedad de Wilson.

Las condiciones no inflamatorias las cuales implican en una interrupción de la regulación de hierro incluyen, pero no se limitan a, deficiencia de vitamina B6 deficiencia de vitamina B12, deficiencia de, folato, pelagra, mielosis funicular, pseudoencefalitis , enfermedad de Parkinson (Fasano y colaboradores., J Neurochem. 96:909 (2006) y Kaur y colaboradores, Ageing Res. ¦ Rev. , 3:327 (2004) ) , enfermedad de Alzheimer, enfermedad cardíaca coronaria, osteopenia y osteoporosis (Guggenbuhl y colaboradores, Osteoporos. Int. 16:1809 (2005)), hemoglobinopatías y otros trastornos del metabolismo de los glóbulos rojos (Papanikolaou y colaboradores, Blood 105:4103 (2005) ) , y enfermedad arterial oclusiva periférica.

Varios otros índices de hierro y sus intervalos normales de concentraciones se listan en la Tabla 2.

Tabla 2 índice de hierro Nivel Normal (Intervalo) Hierro en suero 50-170 µg/dL Hemoglobina 11.5-18 g/dL Hematocrito 37-54% Conteo de glóbulos rojos (RBC) 4.6-6.2 x 1012 células/L (hombres) 4.25-5.4 x 1012 células/L (mujeres) Hemoglobina Corpuscular Media 27-32 pg (MCH) Concentración de Hemoglobina 32-36% Corpuscular Media (MCHC) Volumen Corpuscular Medio (MCV) 80-96 fL Ancho de la Distribución de los 11.5-14.5% (método de Glóbulos Rojos . (RDW) impedancia eléctrica) o 10.2- 11.8% (método de luz láser) Conteo de reticulocitos 18-158 X 10" Células/L (0.8-2.5% en hombres; 0.8-4% en mujeres) Capacidad de Enlace del Hierro 250-450 µg/dL Total (TIBC) Porcentaje de Saturación de 15-50% Hierro-Transferrina (Tsat) Ferritina 12-120 µg/dL· Folato 3-16 ng/mL (suero) y 130-628 ng/mL (glóbulos rojos) Vitamina B12 200-900 pg/ml El nivel del índice de hierro de un paciente fuera de los intervalos normales listados en la Tabla 2 indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento. Puesto que la hepcidina desempeña una función clave en la homeostasis de hierro, los niveles y actividad de la hepcidina se correlacionarán con una interrupción de la homeostasis de hierro y/o índices de hierro. Los niveles elevados de hepcidina se correlacionan con los niveles en suero abajo de los intervalos normales indicados en la Tabla 2, baja hemoglobina, y hematocritos , Tsat reducido normal y valores de ferritina altos o normales, y estado inflamatorio elevado como es medido por la elevación de la proteína reactiva C (CRP) y otros marcadores.de inflamación.

Como se usa en este documento, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento se refiere a una cantidad que da por resultado el efecto terapéutico deseado (es decir, que proporciona "eficacia terapéutica"). Los efectos terapéuticos ejemplares incluyen niveles de hierro circulantes incrementados o disponibilidad de hierro incrementada, conteo de glóbulos rojos incrementado, volumen medio de células de glóbulos rojos incrementado, contenido de hemoglobina de los glóbulos rojos incrementado, hemoglobina incrementada (por ejemplo, incrementado por >0.5 g/dL) , hematocritos incrementados, Tsat incrementado, conteo de reticulocitos incrementado, volumen medio de células de reticulocitos incrementado normalizado, contenido de hemoglobina de reticulocitos incrementado, o niveles de hepcidina libres reducidos en suero o en plasma, o normalización de cualquiera de los parámetros descritos anteriormente . El regreso a este parámetro a su estado normal no es requerido para la eficacia terapéutica, por ejemplo, un cambio medible (incremento o reducción) en la dirección de lo normal se puede considerar que es un efecto terapéutico deseado por un médico. Cuando se aplica a un individuo el ingrediente activo, administrado solo, el término se refiere al ingrediente solo. Cuando se aplica una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan por resultado el efecto terapéutico, si se administra en combinación, en serie o simultáneamente. Por ejemplo, en aspectos donde el anticuerpo anti-hepcidina se administra en conjunción con un estimulador de eritropoyesis, una cantidad terapéuticamente efectiva se propone para referirse a la cantidad combinada que incrementa o normaliza cualquiera de los parámetros establecidos anteriormente.

A fin de facilitar la diagnosis de los pacientes, los árboles de decisiones, tales como aquellos de la FIGURA 14B, se pueden usar para interpretar el nivel de hepcidina, y el cual se usa para ayudar al usuario o al intérprete a determinar un curso de tratamiento y la importancia de la lectura de concentración. Los valores de la hepcidina se predicen para ser elevados con pacientes con inflamación de sobrecarga . de hierro y enfermedad de ferroportina y se suprime en pacientes con hemocromatosis , hemoglobinopatías , y otros trastornos de glóbulos rojos. El árbol de decisiones de la FIGURA 14B muestra como la medición de los niveles de hepcidina simplifica la diagnosis y/o estimación de un paciente sospechoso de tener trastornos de metabolismo de hierro. La FIGURA 14A muestra a estimación del árbol de decisiones sin una medición de los niveles de hepcidina.

Las composiciones para y métodos de tratamiento descritos en este documento pueden usar uno o más anticuerpos anti-hepcidina descritos en este documento usados singularmente o en combinación con otros agentes terapéuticos para lograr los efectos deseados.

TERAPIA DE COMBINACION Puede ser además ventajoso mezclar dos o más anticuerpos conjuntamente (los cuales se enlazan a los mismos o diferentes antígenos objetivos) o para co-administrar un anticuerpo descrito en este documento con un segundo agente terapéutico para proporcionar aún eficacia mejorada. La administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, siempre y cuando exista un solapamiento en el período de tiempo durante el cual los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, como es la administración en diferentes días o semanas.

En algunas modalidades, los métodos descritos en este documento incluyen la administración de anticuerpos solos, así como también combinaciones o "cócteles" de diferentes anticuerpos. Estos cócteles de anticuerpo pueden tener ciertas ventajas en la medida que contengan anticuerpos que exploten diferentes mecanismos efectores . Estos anticuerpos en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos.

La terapia de combinación que usa un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento y un estimulador de eritropoyesis se contempla específicamente. En varias modalidades, los anticuerpos anti-hepcidina y los estimuladores de eritropoyesis se pueden usar para mejorar el tratamiento de un paciente con anemia. En particular, los pacientes quienes son hiposensibles a, que incluyen no sensibles o resistentes a, la terapia con estimuladores de eritropoyesis, tal como eritropoyetina o análogos de las mismas (alfa Epoyetina, beta Epoyetina, alfa darbepoyetina) , entre otras se beneficiarán del co-tratamiento de un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento. En una modalidad, la terapia de combinación incluye el tratamiento con por lo menos un anticuerpo que se enlaza a la hepcidina humana y por lo menos un estimulador de eritropoyesis.

La terapia de combinación que usa un anticuerpo anti-hepcidina y un quelante de hierro para redistribuir los almacenamientos, de hierro en el cuerpo también se contemplan. Un quelante de hierro es un agente capaz de enlazarse al hierro y removerlo de un tejido o de la circulación. Ejemplos incluyen deferoxamina (Desferal ) y deferasirox (Exjade ) , y deferiprona (1, 2-dimetil-3-hidroxipiridin-4 -ona) . En algunas modalidades, los anticuerpos anti-hepcidina y los estimuladores de eritropoyesis se pueden usar para mejorar el tratamiento de un paciente de un trastorno de carga de hierro secundario a la sobrecarga de hierro dependiente de transfusión, o tienen un trastorno de distribución errónea de hierro tal como ataxia de Friedreich.

Como se usa en este documento, "estimulador de eritropoyesis" propone un compuesto químico que causa directa o indirectamente la activación del receptor de eritropoyetina, por ejemplo, al enlazarse o al causar la dimeración del receptor o al estimular la expresión de la eritropoyetina endógena. Los estimuladores de eritropoyesis incluyen eritropoyetina y variantes, análogos, o derivados de la misma que se enlazan a y activan el receptor de eritropoyetina; anticuerpos que se enlazan al receptor de eritropoyetina y activan el receptor; o péptidos que se enlazan a y activar el receptor de eritropoyetina; o compuestos químicos orgánicos pequeños, opcionalmente menor que aproximadamente 1000 Daltons en peso molecular, que se enlazan a y activan el receptor de eritropoyetina. Los estimuladores de eritropoyesis incluyen, pero no se limitan a, alfa epoyetina, beta epoyetina, delta epoyetina, omega epoyetina, iota epoyetina, zeta epoyetina y análogos de las mismas, eritropoyetina pegilada, eritropoyetina carbamilada, péptidos miméticos (que incluyen EMPl/hematida) , anticuerpos miméticos e inhibidores de HIF (véase Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2005/0020487, la descripción de la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad) . Los simuladores de eritropoyesis ejemplares incluyen eritropoyetina, darbepoyetina, variantes agonistas de eritropoyetina, y péptidos o anticuerpos que enlazan y activan el receptor de eritropoyetina (e incluyen compuestos reportados en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. 2003/0215444 y 2006/0040858, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad) así como también moléculas de eritropoyetina o variantes o análogos de las mismas, como se dan a conocer en las siguientes patentes o solicitudes de patente, las cuales se incorporan cada una en este documento a manera de referencia en su totalidad: Patentes de E.U.A. Nos. 4,703,008; 5,441 ,868; 5,547,933; 5,618,698; 5,621,080; 5,756,349; 5,767,078; 5,773,569; 5,955,422; 5,830,851; 5,856,298; 5,986,047; 6,310,078; 6,391,633; 6,583,272; 6,586,398; 6,900,292; 6,750,369; 7,030,226; 7,084,245; 7,217,689; publicaciones del PCT nos. WO 91/05867; WO 95/05465; WO 99/66054; WO 00/24893; WO 01/81405; WO 00/61637; WO 01/36489; WO 02/014356; WO 02/19963; WO 02/20034; WO 02/49673; WO 02/085940; WO 03/029291 ; WO 2003/055526; WO ; WO 2004/009627; WO 2004/024.761; WO 2004/033651; WO 2004/035603; WO 2004/043382; WO 2004/101600; WO 2004/101606; WO 2004/101.611; WO 2004/106373; WO 2004/018667; WO 2005/001025; WO 2005/001136; WO 2005/021579; WO 2005/025606; WO 2005/032460; WO 2005/051327; WO 2005/063808; WO 2005/063809; WO 2005/070451; WO 2005/081687; WO 2005/084711; WO 2005/103076; WO 2005/100403; WO 2005/092369; WO 2006/50959; WO 2006/02646; WO 2006/29094; y Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos.: US 2002/0155998; US 2003/0077753; US 2003/0082749; US 2003/0143202; US 2004/0009902; US 2004/0071694 ; US 2004/0091961; US 2004/0143857; US 2004/0157293; US 2004/0175379; US 2004/0175824 ; US 2004/0229318; US 2004/0248815; US 2004/0266690; US 2005/0019914 ; US 2005/0026834; US 2005/0096461, US 2005/0107297; US 2005/0107591; US 2005/0124045, US 2005/0124564; US 2005/0137329; US 2005/0142642, US 2005/0143292; US 2005/0153879; US 2005/0158822, US 2005/0158832; US 2005/0170457; US 2005/0181359, US 2005/0181482; US 2005/0192211; US 2005/0202538 , US 2005/0227289; US 2005/0244409; US 2006/0088906, US 2006/0111279.

La eritropoyetina incluye, pero no se limita a , un polipéptido que comprende la secuencia.de aminoácidos como se establece en SEQ¦ ID NÓ: 72. Los aminoácidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 72 constituyen la proteína madura de cualquiera de las moléculas designadas como una epoyetina, por ejemplo, alfa epoyetina alfa, beta epoyetina, delta epoyetina, omega epoyetina, iota epoyetina, gamma epoyetina, zeta epoyetina y las similares. Adicionalmente, una epoyetina también incluye cualquiera de la epoyetina mencionada anteriormente la cual se modifica anteriormente, por ejemplo, con uno o más polímeros solubles en agua tal como, por ejemplo, polietilenglicol (que incluye PEG-EPO-beta) . También se contemplan análogos de eritropoyetina, con 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad a SEQ ID NO: 72 que aún retienen la actividad eritropoyética .

Las secuencias ejemplares manufactura, purificación y uso de la eritropoyetina humana recombinante se describen en una variedad de publicaciones de patente, que incluyen pero no se limitan a Lin Patente de E.U.A. No. 4,703,008 y Lai y colaboradores Patente de E.U.A. No. 4,667,016, cada una de las cuales se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. La darbepoyetina es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilada que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO los cuales proporcionan dos cadenas de carbohidratos adicionales . Más específicamente, la alfa darbepoyetina contiene dos cadenas de carbohidratos N-enlazados adicionales en los residuos de aminoácidos 30 y 88 de SEQ ID NO: 73. Las secuencias ejemplares, manufactura, purificación y uso de la darbepoyetina y otro análogos de eritropoyetina se describen en una variedad de publicaciones de patente, que incluyen Strickland y colaboradores, WO 91/05867, Elliott y colaboradores, WO 95/05465, Egrie y colaboradores, WO 00/24893, y Egrie y colaboradores WO 01/81405, cada una de las cuales se incorpora en este documento a, manera de referencia en su totalidad. Los derivados de polipéptidos de origen natural o análogos incluyen aquellos los cuales se han modificado químicamente, por ejemplo, para unirse a los polímeros solubles en agua (por ejemplo, pegilados) , radionúclidos , u otras porciones de diagnóstico u objetivo o terapéuticas .

El término "actividad eritropoyética" propone la actividad para estimular la eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón policitémico exipóxico. Véase, por ejemplo, Cotes y Bangha , Nature 191:1065 (1961).

ADMINISTRACION Y PREPARACION DE FORMULACIONES FARMACEUTICAS En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento y un portador, diluyente o excipiente estéril farmacéuticamente aceptable. También se proporciona el uso de estos anticuerpos en preparación de un medicamento para el tratamiento de un humano con un nivel elevado de hepcidina, un trastorno relacionado con la hepcidina, un trastorno de homeostasis de hierro o una anemia. Se entiende que los métodos de co-administración que implican la administración de anticuerpos con un segundo agente terapéutico, como se describe en este documento, abarca no únicamente el uso de un anticuerpo en preparación de un medicamento para la coadministración con el segundo, agente terapéutico, sino también el uso del segundo agente terapéutico en preparación de un medicamento para la coadministración con el anticuerpo.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-hepcidina o agentes de enlace específicos usados en la práctica de un método descrito en este documento se pueden formular en las composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método de suministro deseado. Portadores adecuados .incluyen cualquier material el cual, cuando se combina con un anticuerpo anti-hepcidina o agente de enlace específico, retiene el enlace de alta afinidad de la hepcidina y no es reactivo , con los sistemas inmunitarios del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una variedad de portadores farmacéuticos estándares tal como soluciones salinas amortiguadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y los similares. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3% y los similares y se pueden incluir otras proteínas para la estabilidad mejorada, tal como albúmina, lipoproteína, globulina, etcétera, se someten a modificaciones químicas o leves o las similares.

Las concentraciones de anticuerpos ejemplares en la formulación pueden variar de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 180 mg/ml o de aproximadamente 0.1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, o de aproximadamente 0.5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL, o alternativamente de aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL. Una formulación acuosa del anticuerpo se puede preparar en una solución amortiguada con pH, por ejemplo, un pH que varía de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 6.5, o de aproximadamente 4.8 a aproximadamente 5.5, o alternativamente de manera aproximada 5.0. Ejemplos de soluciones amortiguadoras que son adecuadas para un pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio) , succinato (tal como succinato de sodio) , gluconato, histidina, citrato y otras soluciones amortiguadoras de ácido orgánico. La concentración de la solución amortiguadora puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 raM, o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, dependiendo, por ejemplo, de la solución amortiguadora y la isotonicidad deseada de la formulación.

Un agente de tonicidad, el cual también puede estabilizar el anticuerpo, se puede incluir en la formulación. Agentes de tonicidad ejemplares incluyen polioles tal como manitol sacarosa o trehalosa. En algunas modalidades, la formulación acuosa es isotónica aunque pueden ser adecuadas soluciones hipertónicas o hipotónicas . Las concentraciones ejemplares del poliol en la formulación pueden variar de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% p/v.

También se puede agregar un tensioactivo a la formulación de anticuerpo para reducir la . agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formulación de los particulados en la formulación y/o o reducción adsorción. Tensioactivos ejemplares incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo polisorbato 20, o polisorbato 80) o poloxámeros (por ejemplo poloxámero 188) . Concentraciones ejemplares de tensioactivo pueden variar de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.5%, o de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.2%, o alternativamente de aproximadamente 0.004% a aproximadamente 0.01% p/v.

En una modalidad, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir anticuerpo, solución amortiguadora, poliol y tensioactivo) y están esencialmente libres de uno o más conservadores, tal como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y benzetonio Cl . En otra modalidad, se puede incluir un conservador en la formulación, por ejemplo, en concentraciones que varían de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2%, o alternativamente de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 1%. Uno o más de otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) se pueden incluir en la formulación con la condición de que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen; agentes amortiguadores adicionales; co-solventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tal como EDTA; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteína) ; polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sal tal como sodio.

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo anti-hepcidina se preparan para el almacenamiento al mezclar en anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tal como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico alcohol; parabenos de alquilo tal como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, maltosa o dextrinas : agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tal como T EENMR, PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG) .

En una modalidad, una formulación adecuada contiene una solución amortiguadora isotónica tal como un acetato de fosfato, o solución amortiguadora TRIS en combinación con un agente de tonicidad tal como un poliol, Sorbitol, sacarosa o. cloruro de sodio el cual tonifica y estabiliza un ejemplo de este agente de tonicidad es Sorbitol al 5% o sacarosa. , Además, la formulación podría incluir opcionalmente un tensioactivo tal como para prevenir la agregación y para la estabilización de 0.01 a 0.02% p/vol. El pH de la formulación puede variar de 4.5-6.5 o 4.5-5.5. Otras descripciones ejemplares de las formulaciones farmacéuticas para los anticuerpos se puede encontrar en el documento US 2003/01 13316 y Patente de EUA No. 6,171,586, cada uno incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad.

La formulación en este documento también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trata, aquellos con actividades complementarias que no afecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente inmunosupresor . Estas . moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Esas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .

Las suspensiones y las formas de cristal de los anticuerpos también se contemplan los métodos para elaborar suspensiones y formas de cristal son conocidos por una persona de experiencia en el campo.

Las formulaciones que se usan para la administración in vivo deben ser estériles . En algunas modalidades, las composiciones descritas en este documento se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales. Por ejemplo, la esterilización se logra fácilmente mediante la filtración a través de las membranas de filtración estériles. Las soluciones resultantes se pueden empacar para el uso o filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizar, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de la administración.

El proceso de secado por congelación se emplea frecuentemente para estabilizar los polipéptidos para almacenamiento a largo plazo, particularmente cuando el polipéptido es relativamente inestable en composiciones líquidas. Un ciclo de liofilización se compone usualmente de tres etapas: congelación, secado primario, y secado secundario; Williams y Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volumen 38, Número 2, páginas 48-59 (1984). En la etapa de congelación, la solución se enfría hasta que se congela adecuadamente. El agua en volumen en la solución forma hielo en esta etapa. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, la cual se conduce al reducir la presión de la cámara abajo del vapor de hielo, usando un vacío. Finalmente, el agua sorbida o unida se remueve en la etapa de secado secundario bajo presión reducida de la cámara y una temperatura de anaquel elevada. El proceso produce un material conocido como una torta liofilizada. Después, la torta se puede reconstituir antes del uso.

La práctica de reconstitución estándar para el material liofilizado es adicionar de nuevo un volumen de agua pura (típicamente al volumen removido durante la liofilización) , aunque las soluciones diluidas de los agentes bacterianas algunas veces se usa en la producción de productos farmacéuticos para la administración parenteral; Chen, Drug Development and Industrial Phar acy, Volumen 18, Números 11 y 12, páginas 1311-1354 (1992) .

Se han observado excipientes en algunos casos que actúan como estabilizadores para los productos secados por congelación; Carpenter y colaboradores, Developments in Biological Standardization, Volumen 74, páginas 225-239 (1991) . Por ejemplo, los excipientes conocidos incluyen polioles (que incluyen manitol, sorbitol y glicerol) ; azúcares (que incluyen glucosa y sacarosa) ; y aminoácidos (que incluyen alanina, glicina y ácido glutámico) .

Además, los polioles y los azúcares también se usan frecuentemente para proteger los polipéptidos del daño inducido por congelación y secado y para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento en el estado seco. En general, los azúcares, en particular . disacáridos, son efectivos en tanto el proceso de secado por congelación como durante el almacenamiento. Otras clases de moléculas, que incluyen mono y disacáridos y polímeros tal como PVP, también se han reportado como estabilizadores de productos liofilizados .

Para la inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para la reconstitución con una solución apropiada como se describe anteriormente. Ejemplos de éstos incluyen, pero no se limitan a, polvos secos por congelación, secos por rotación o secos por rocío, polvos amorfos, gránulos, precipitados o particulados. Para la inyección, las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizadores, modificadores de pH, tensioactivos , modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de éstos.

Se. pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contiene el anticuerpo, las matrices las cuales están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico) ) , polilácturos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como el Lupron DepotMR (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tal como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de las moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a la humedad a 37°C, dando por resultado una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr al modificar los residuos de sulfhidrilo, liofilizar de las soluciones acidas, controlar el contenido de humedad, usar aditivos apropiados, y desarrollar composiciones de matriz de polímero específico.

En algunas modalidades, las formulaciones descritas en este documento se puede diseñar para ser de corta duración; de rápida liberación, de larga duración o liberación sostenida como es describe en este documento. De esta manera, las formulaciones farmacéuticas también se pueden formular para liberación controlada o para liberación lenta .

Cantidades terapéuticamente efectiva de una composición variarán y dependerán de la gravedad de la enfermedad y el peso y el estado general del sujeto que se trata, pero varían generalmente de aproximadamente 1.0 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 ug/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por aplicación. La administración puede ser diaria, o días alternantes, semanal, dos veces al mes, mensual o más o menos frecuentemente, como sea necesario dependiendo de la respuesta al trastorno o condición y a la tolerancia del sujeto de la terapia. Las dosificaciones de mantenimiento durante un período de tiempo más prolongado, tal como 4, 5, 6, 7, 8, 10 o 12 semanas o más prolongado pueden ser necesarios hasta que una supresión deseada de los síntomas del trastorno ocurra, y las dosificaciones se puedan ajustar como sea necesario. El progreso de esta terapia se supervisa fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Las dosificaciones específicas se pueden ajustar dependiendo de las condiciones de la enfermedad, edad, peso corporal, condiciones de salud generales, sexo, y dieta del sujeto, intervalos de dosis, vías de administración, velocidad de secreción y combinaciones de fármacos. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contienen cantidades efectivas están muy dentro de los límites de la experimentación de rutina y por lo tanto, bien dentro del alcance de la presente invención.

El anticuerpo anti-hepcidina o agente de enlace específico se administra por cualquier medio adecuado, ya sea sistémica o localmente que incluye vía parenteral, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional . Las vías parenterales incluyen administración intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, epidural, e intratecal. Además, el agente de enlace específico o anticuerpo se administra adecuadamente mediante la infusión de pulso, particularmente con dosis declinantes del agente de enlace específico o anticuerpo. En algunas modalidades, la dosificación se administra mediante inyecciones, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte en sí la administración es breve o crónica. Se contemplan otros métodos de administración, que incluyen administración tópica, particularmente transdérmica, transmucosa, rectal, oral o local por ejemplo a través de un catéter colocado cerca del sitio deseado. En algunas modalidades, el agente de enlace específico o anticuerpo descritos en este documento se administran intravenosamente en una solución fisiológica en una dosis que varía entre 0.01 mg/kg a 100 mg/kg en una frecuencia que varía de diario a semanalmente a mensualmente (por ejemplo cada día, cada dos días, cada tercer día, o 2, 3, 4, 5, o 6 veces por semana), o una dosis que varía de 0.1 a 45 mg/kg, de 0.1 a 15 mg/kg o de 0.1 a 10 mg/kg en una frecuencia de 2 o 3 veces por semana, o hasta 45 mg/kg una vez al mes .

KITS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICO En otro aspecto relacionado, los kits para tratar un trastorno asociado con niveles de hepcidina elevados, o un trastorno relacionado con hepcidina, o un trastorno de homeostasis de hierro, o un mamífero con anemia, también se proporcionan. En una modalidad, el kit incluye (a) un anticuerpo anti-hepcidina, y (b) un estimulador de eritropoyesis , y opcionalmente , hierro. En otra modalidad, el kit incluye un anticuerpo anti-hepcidina y una etiqueta unida a o empacada con el contenedor, la etiqueta que describe el uso del anticuerpo anti-hepcidina con un estimulador de eritropoyesis. En todavía otra modalidad, el kit incluye un estimulador de eritropoyesis y una etiqueta unida a o empaquetada con el contenedor, la etiqueta que describe el uso del estimulador de eritropoyesis con un anticuerpo anti-hepcidina. También se proporciona el uso de un anticuerpo anti-hepcidina en la preparación de un médicamente para la administración con un estimulador de eritropoyesis, así como también el uso de un estimulador de eritropoyesis en preparación de un médicamente para la administración con un anticuerpo anti-hepcidina. En cualquiera de estos kits o usos, el ' anticuerpo anti-hepcidina y el estimulador de eritropoyesis puede estar en frasquitos separados o es pueden combinar conjuntamente en una sola composición farmacéutica. En todavía otra modalidad, un anticuerpo anti-hepcidina o estimulador de eritropoyesis, o ambos, se pueden combinar con hierro en una sola composición farmacéutica o pueden estar en frasquitos separados.

Como una cuestión de conveniencia, un anticuerpo dado a conocer en este documento se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Donde el anticuerpo se etiqueta con una enzima, el kit incluirá substratos y co-factores requeridos por la enzima (por ejemplo, un substrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, soluciones amortiguadoras (por ejemplo, una solución amortiguadora de bloqueo o solución amortiguadora de lisis) y los similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos los cuales optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, usualmente liofilizados , que incluyen excipientes los cuales en la dilución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

También se proporcionan reactivos de diagnóstico y kits que comprenden uno o más de estos reactivos para el uso en una variedad de ensayos de diagnóstico, que incluyen, por ejemplo, inmunoensayos tal como ELISA (formato de tipo de emparedado o competitivo). En algunas modalidades, estos kits pueden incluir por lo menos un primer péptido (opcionalmente una hepcidina madura apropiadamente plegada estándar como se describe en este documento) , o un primer anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno descrito en este documento, un fragmento funcional del mismo o un cóctel de ios mismos, y medios para la generación de señal. Los componentes de kit se pueden reunir a un soporte sólido, o se pueden aplicar a la superficie de un soporte sólido cuando el kit se usa. En alguna modalidad, el medio generador de señal puede venir pre-asociado con un anticuerpo descrito en este documento o puede requerir la combinación con uno o -más componentes, por ejemplo, soluciones reguladoras, conjugados de anticuerpo-enzima, substratos de enzima, o los similares, antes del uso. Los kits también pueden incluir reactivos adicionales, por ejemplo, reactivos de bloqueo para reducir el enlace no específico a la superficie de fase sólida, reactivos de lavado, substratos de enzima, y los similares. La superficie de fase sólida puede estar en la forma de un tubo, una perla, una placa de microtítulo, una microesfera, u otros materiales adecuados para inmovilizar proteínas, péptidos o polipéptidos . En algunas modalidades, una enzima que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente o cromogénico o la reducción de un substrato quimioluminiscente o cromogénico es un componente del medio generador de señal. Estas enzimas son bien conocidas en el campo. Los kits pueden comprender cualquiera de los agentes de captura y los reactivos de detección descritos en este documento. Opcionalmente el kit también puede comprender instrucciones para llevar a cabo los métodos descritos en este documento.

También se proporciona un kit que comprende un anticuerpo anti-hepcidina descrito en este documento y un estimulador de eritropoyesis empaquetado en un contenedor, tal como un frasquito o botella, y que comprende además una etiqueta unida a o empaquetada con el contenedor, la etiqueta que describe los contenidos del contenedor y que proporciona indicaciones y/o instrucciones con respecto al uso de los contenidos del contenedor para tratar uno o más estados de enfermedad como se describe en este documento.

En un aspecto, el kit es para tratar un trastorno asociado con los niveles de hepcidina elevados y comprende un anticuerpo anti-hepcidina y un estimulador de eritropoyesis. El kit puede incluir además opcionalmente hierro para la administración oral o parenteral, por ejemplo intravenosa. En otro aspecto, el kit comprende un anticuerpo anti-hepcidina y una etiqueta unida ha o empaquetada con el contenedor que describe el uso del anticuerpo anti-hepcidina con un estimulador de eritropoyesis. En todavía otro aspecto, el kit comprende un estimulador de eritropoyesis y una etiqueta unida ha o empaquetada con el contenedor que describe el uso del estimulador de eritropoyesis con anticuerpo anti-hepcidina. En ciertas un anticuerpo anti-hepcidina y un estimulador de eritropoyesis, y opcionalmente hierro, están en frasquitos separados o se combinan conjuntamente en la misma composición farmacéutica. En todavía otro aspecto, un anticuerpo anti-hepcidina anticuerpo descrito en este documento se combina con hierro en una sola composición farmacéutica. En todavía otra modalidad, el estimulador de eritropoyesis se combina con hierro en una sola composición farmacéutica .

Como se plantea anteriormente en la sección de terapia de combinación, la administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, siempre y cuando exista un solapamiento en el período de tiempo durante el cual los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial como es la administración en diferentes días o semanas.

Los kits terapéuticos o de diagnóstico dados a conocer en este documento también se pueden preparar ya que comprenden por lo menos uno del anticuerpo, péptido, fragmento de enlace de antígeno, o polinucleótido dados a conocer en este documento e instrucciones para usar la composición como un reactivo de diagnóstico o agente terapéutico. Los contenedores para el uso en estos kits pueden comprender típicamente por lo menos un frasquito, tubo de prueba, ÷ matraz, botella', jeringa u otro contenedor adecuado, dentro del cual se pueden colocar uno o más de la(s) composición (es) de diagnóstico y/o terapéutica, y se forman adecuadamente en alícuotas . Donde un segundo agente terapéutico también se proporciona, el kit también puede comprender un segundo contenedor distinto dentro del cual esta segunda composición de diagnóstico y/o terapéutica se puede colocar. Alternativamente, una pluralidad de compuestos se puede preparar en una sola composición farmacéutica, y se puede empaquetar en un solo medio de contenedor, tal como un frasquito, matraz, jeringa, botella, u otro solo contenedor adecuado. Los kit de la presente invención también incluirán típicamente un medio para contener el (los) frasquito (s) en un confinamiento cerrado para la venta comercial, tal como, por ejemplo, contenedores de plástico moldeados por inyección o soplado dentro de los cuales el (los) frasquito (s) deseado (s) son retenidos. Donde una radioetiqueta, etiqueta cromogénica, fluorogénica, u otro . tipo de etiqueta detectable o medio de detección se incluye dentro del kit, el agente de etiquetado se puede proporcionar ya sea en el mismo contenedor como la composición de diagnóstico o terapéutica misma, o se puede colocar alternativamente en un segundo medio contenedor distinto dentro del cual esta segunda composición se puede colocar y formar adecuadamente en alícuotas. Alternativamente, el reactivo de detección y la etiqueta se pueden preparar en un solo medio contenedor, y en la mayoría de casos, el kit también incluirá típicamente para contener el (los) frasquito (s) en un confinamiento cerrado para la venta comercial y/o empaquetamiento y suministro convenientes.

• También se proporciona un dispositivo o aparato para llevar a cabo los métodos de diagnóstico o supervisión descritos en este documento. Este aparato puede incluir una cámara o tubo dentro del cual la muestra se puede ingresar, un sistema de manejo de fluido que incluye opcionalmente válvulas o bombas para dirigir el fluido de la muestra a través del dispositivo, opcionalmente filtros para separar el plasma o suero de la sangre, cámaras de mezclado para la visión de agentes de captura o reactivos de detección, y opcionalmente un dispositivo de detección para detectar la cantidad de etiqueta detectable enlazada al inmunocomplejo de agente de captura. El flujo de la muestra puede ser pasivo (por ejemplo, mediante fuerzas capilares, hidrostáticas u otras fuerzas que no requieren manipulación adicional del dispositivo una vez que la muestra se aplica) o activo (por ejemplo, mediante la aplicación de fuerza generada por la vía de bombas mecánicas, bombas electroosmóticas , fuerza centrífuga, o presión de aire incrementada) , o mediante una combinación de fuerzas activas y pasivas.

En modalidades relacionadas también se proporciona un procesador, una memoria legible en computadora, y una rutina almacenada en la memoria legible en computadora y adaptada para ser ejecutada en el procesador para realizar cualquiera de los métodos descritos en este documento, y/o para generar como salida el nivel detectado de la hepcidina y un umbral o intervalo de niveles de umbral considerados "normales", tal que los niveles fuera del intervalo "normal" se correlacionan con una o más de las condiciones como se describen en este documento. En algunas modalidades, también se proporcionan medios leíbles por computadora que contiene programas o rutinas para realizar funciones similares. Ejemplos de sistemas de computación adecuados, entornos, y/o configuraciones incluyen computadoras personales, servidores, dispositivos portátiles o computadoras portátiles, sistemas de múltiples procesadores, sistemas basados en microprocesador, decodificadores , electrónicos de consumo programables , PCs de red, minicomputadoras , computadoras de estructura principal, entornos de computación distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas anteriores o dispositivos, o cualquier otros sistemas conocidos en el campo .

USOS NO TERAPEUTICOS PARA ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA Los anticuerpos dados a conocer en este documento se pueden usar como agentes de purificación de afinidad para el antígeno objetivo o el ensayo de diagnóstico para el antígeno objetivo, por ejemplo, para detectar su expresión en las células específicas, tejidos o suero. Los anticuerpos también se pueden usar para los ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, para estos propósitos el anticuerpo se etiqueta con un radionúclido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 1251, 3H, 32P o 35S) para que el sitio se pueda localizar usando la inmunocintiografía .

Los anticuerpos dados a conocer en este documento se. pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivos, . ensayos de emparedado directos e indirectos, tal como ELISAs, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Anticuerpos: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Los anticuerpos también se pueden usar · para la inmunohistoquímica, para etiquetar muestras de células que usan los métodos conocidos en el campo.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-HEPCIDINA HUMANA Se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante varios procedimientos como se describe generalmente en la Solicitud de Patente de E.U.A. copendiente No. 12/022,515, incorporada a manera de referencia en este documento en su ' totalidad . Por ejemplo, ratones XenomouseMR IgG2K e IgG4il se inmunizaron con hepcidina humana conjugada con KLH (SEQ ID NO: 9) usando métodos estándares. 23,040 de sobrenadantes IgG2 y 11,520 sobrenadantes IgG4 se clasificaron en una sola concentración contra la hepcidina humana biotinilada anclada a una placa. A partir de esta clasificación 617 de sobrenadantes IgG2 y 1013 sobrenadantes de IgG4 se sometieron a prueba para enlazarse a tanto la hepcidina biotinilada humana como de ratón usando un ELISA de captura de anticuerpo en el cual la cantidad de anticuerpo capturado se limitó para minimizar el efecto de las diferencias de -.concentración entre los sobrenadantes. Muestras de alto nivel (70 IgG2 y 110 IgG4) se caracterizaron adicionalmente en un ELISA de puente el cual mide el enlace de hepcidina-anticuerpo de fase de solución sobre un intervalo de concentraciones de anticuerpo. Este ensayo proporcionó un nivel de afinidad relativo del enlace del anticuerpo .

Los sobrenadantes de cada uno de los paneles IgG2 e IgG4 se designaron como sigue: 1C9 (SEQ ID NOs : 107-116), 3B3 (SEQ ID NOs: 117-126), 4E1 (SEQ ID NOS : 127-136), 7A3 (SEQ ID NOs : 137-146), 9D12 (SEQ' ID NOS : 147-156), 12B9 (SEQ ID NOs : 157-166), 15E1 (SEQ ID NOs : 167-176), 18D8 (SEQ ID NOs : 310-319), 19C1 (SEQ ID NOs : 320-329), 19D12 (SEQ ID NOs : 290-299), 19H6 (SEQ ID NOs : 300-309), 23F11 (SEQ ID NOs : 177-186), 26F11 (SEQ ID NOs:. 187-196), 18B11 (SEQ ID NOs : 331-339), 19B8 (SEQ ID NOs: 341-349), 20E12 (SEQ ID NOs : 351-359), 22F12 (SEQ ID NOS: 361-369), 22H10 (SEQ ID NOs : 371-379), 23A11 (SEQ ID NOs : 381-389) y 24E4 (SEQ ID NOs : 391-399).

Generalmente, las afinidades de enlace de estos anticuerpos a la hepcidina humana se determinaron por el BIAcore, el cual luego se confirmó por KinExA si la KD como se estima por el BIAcore estuvo abajo de 100 pM. La afinidad de enlace del anticuerpo 18B11, sin embargo, se determinó por el KinExA sin el ensayo BIAcore. La KD para los anticuerpos líderes estuvo en el intervalo de entre 1 pM y más de 400 pM.

La reactividad cruzada de especies relativas y el enlace a Hepc20 (SEQ ID NO: 96) se determinó por el ELISA de competición. 18B11 se observó que es de reacción cruzada con la hepcidina de mono cynomolgus y no de reacción cruzada significativamente con la hepcidina de ratón. El anticuerpo 18B11 compite con el anticuerpo 23F11 para enlazarse a la hepcidina humana.

EJEMPLO 2 - GENERACION Y SELECCION DE ANTICUERPOS HUMANOS CON CIERTAS PROPIEDADES FARMACOCINETICAS 2,522 anticuerpos específicos de hepcidina se clasificaron para perfiles de enlace diferencial a la hepcidina humana en pH 7.4 y pH 6.0 por el ELISA. 50 pL '"de Neutravidin (Pierce) en 8 pg/mL en lxPBS se recubrió en una placa de 384 pocilios Nunc Maxisorp, y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Después de bloquear los pocilios con BSA al 0.1%/PBS/Tween 20MR al 0.05% durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0.05%. 25 pL de hepcidina mono-biotinilada a 50 ng/mL en BSA al 0.1%/PBS/Tween 20 al 0.05% se agregaron a la placa de 384 pocilios, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas después se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0.05%. Las concentraciones de anticuerpos de hepcidina de partida se normalizaron a 1 µg/mL para condiciones de pH 5.5 y 6.0 y a 100 ng/mL para condiciones de pH 7.4. Los anticuerpos de hepcidina se diluyeron en serie 3 veces en PBS/NFDM al 1% en pH 7.4 y 4 veces en PBS/NFDM al 1% en pH 6.0 y 5.5. Las diluciones y titulaciones se realizaron en placas de dilución en 96 pocilios de polipropileno, y luego se transfirieron en duplicado a una placa de 384 pocilios recubiertos con Neutravidin. La hepcidina biotinilada y los anticuerpos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa luego se lavó seis veces con PBS/Tween20 al 0.05%. 25 ]iL de peroxidasa de huIgG de rábano picante anti-cabra en una dilución de 1:7000 en BSA al 0.1%/PBS/Tween20 al 0.05% después se agregó a cada pocilio de la placa de ensayo. La placa se lavó finalmente seis veces en PBS/Tween20 al 0.05%. Se agregó un substrato de K-Azul 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -Tetrametilbenzidina (TMB) mejorado (Neogen) y la reacción se detuvo usando H3P04 1 M después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. La absorción se midió a 450 nm sobre un lector de placas. Se analizaron los datos de enlace por -el análisis de regresión no lineal (respuesta de dosis sigmoidea, inclinación variable) para generar valores EC50 usando el software GraphPad PrismMR. De esta clasificación de 243 anticuerpos se demostró una diferencia de > 2 veces en el enlace en pH 7.4 contra pH 6.0. La parte superior de los sobrenadantes de 32 pocilios se volvió a clasificar para una tercera vez sobre un intervalo de diluciones de anticuerpo en pH 7.4 y pH 6.0. Los anticuerpos 18B11, 19B8, 20E12, 22C11, 22F12, 22H10, 23A11, 24E4 y 25H6 se seleccionaron para subclonación.

Las afinidades de enlace de estos anticuerpos a la hepcidina humana se determinaron por el KinExA y las constantes de disociación es determinaron por el BIA. En una dilución de 1:250, todos los anticuerpos sometidos a prueba demostraron una reducción de aproximadamente 10 veces en la afinidad para la hepcidina en pH 6 comparado con pH 7.4.

EJEMPLO 3 - INGENIERIA DEL ANTICUERPO CON EL ENLACE DE PH DIFERENCIAL La introducción de uno o más residuos de histidina en la región variable ligera y/o pesada de un anticuerpo puede proporcionar anticuerpos que exhiben enlaces de pH diferencial a su antígeno. La histidina es el aminoácido- más sensible a los cambios de pH de 7.4 a 6.0, ya que la cadena lateral de imidazol de la histidina tiene una pKa justo arriba de 6, que varía más alta o más baja dependiendo del entorno del aminoácido. Esta técnica se puede aplicar a cualquiera de los anticuerpos anti-hepcidina, que incluyen aquellos descritos en este documento.

Se preparó un modelo de estructura de cristal de la porción Fv del anticuerpo anti-hepcidina 15E1. Usando este modelo de estructura, todos los 62 residuos de CDR del anticuerpo 15E1, que usa la definición Kabat, se seleccionaron para mutación, junto con los residuos de. estructura que fueron por lo menos 10% expuestos y dentro de 4.5 Á de un residuo de CDR, dando por resultado 31 residuos adicionales para la mutación. Se seleccionaron posiciones adicionales para la mutación mediante la inspección visual del modelo de estructura para los aminoácidos en proximidad a las CDRs o residuos de estructuras seleccionados. El ADN de codificación se mutó para proporcionar las mutaciones de histidina en posiciones individuales o múltiples dentro de la secuencia de aminoácidos. Las mutaciones que produjeron algún efecto de enlace diferencial de pH como mutaciones individuales se puede combinar como mutaciones, dobles,. triples o más mutaciones múltiples. Las mutaciones de histidina expresadas colectivamente continuación se diseñaron en cualquiera o más aminoácidos en los cuales la secuencia de "Mutantes" identifica un cambio a una histidina en el siguiente diagrama: . 11111111111 22 15E1 Ligera SYELTQPPSVSVSPGQT^^ 15E1 Mutantes Ligera HHHIHHPPSVSVSPaQ^Tm^ 22222 3333333333 15E1 Ligera SKPJ'SGIPERFSGSSGOT^ 15E1 Mutantes Ligera HHHHHHHHH FHHHHHHHHATLTISG^ 15E1 Ligera GTE LIVLGQP 15E1 Matantes Ligera GTKLTVLQQP 11111 2 15E1 Pesada QVQLVESGQGWQPC.RSLRLSC¾ASGFI^ 15E1 Matantes Pesada 2222222222222222 33 15E1 Pesada IWYAEEM YYADSVKG- FTISPJ^ 15E1 Mutantes Pesada HHHIOTfflHHHHHHHHHHEfflHRH^^ 333333333 15E1 Pesada EGIAPDAEDIWQQGIMVTVSS 15E1 Mutantes Pesada HHHHHHHHHfflGQGIMVTVSS Expres ión de los Constructos Mutantes Se introduj eron mutaciones dentro de los constructos de tipo natural en el vector pTT5 ( cadenas pesadas y ligeras sobre los vectores separados ) usando un kit Quickchange II ( Stratagene #200523 ) y se trans f ectaron transcientemente dentro de las células 293 - 6E (NRCC) .

Mutación de Cadena Ligera S1H Y2H E2H T5H Q6H T21H S23H G24H D25H K26H L27H G28H E29H R30H Y31H A32H C33H V44H Y48H Q49H D50H S51H 52H Mutación de Cadena Ligera R53H P54H S44H G56H 157H P58H E59H S62H G63H S64H N65H S66H G67H N68H T69H Q88H A89H W90H Y91H S92H S93H T94H N95H V96H Mutación de Cadena Ligera L97H V2H F27H T289H S30H S31H Y32H G33H M34H E46H W47H V50H I51H W52H Y53H A54H E55H S56H N57h K58h Y59h Y60h A61h D62h Mutación de Cadena Ligera S63h v64h K65h G66h R67h T69h S71h D73h N74h R87h A99h QlOOh ElOlh G102h I103h A104H P105h D106h A107h F108h D109h IllOh Wlllh , Análisis de Enlace de Equilibrio de Solución KinExA para los Anticuerpos 15E1, Variantes 15E1 y 18B11 para Enlazarse a la Hepcidina Humana.

Se pre-cubrieron perlas de SA-Sepharose con hepcidina humana biotinilada (SEQ ID NO: 9) y se bloquearon con BSA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos y la hepcidina se diluyeron en solución amortiguadora de PBS/BSA al 0.1%/NaN3 al 0.05%. Las concentraciones fijas de los anticuerpos 15E1, 15E1 52H, 15E1 A99H, 15E1 N52H, 15E1 A107H y 18B11 se incubaron con varias concentraciones de hepcidina humana a temperatura ambiente durante 8 horas antes de ser corridos a través de las perlas recubiertas con hepcidina humana. La cantidad del anticuerpo enlazado a la perla se cuantificó por el anticuerpo (Cy5) IgG anti-murino de cabra etiquetado fluorescentemente (H+L) (Jackson Immuno Research, West Grove , PA) . La señal de enlace es proporcional a la concentración del anticuerpo libre en el equilibrio. La constante de equilibrio de disociación (KD) se obtuvo de la regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de enlace homogéneo de un sitio de curva doble (software KinExATM Pro) . Los resultados se establecen a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3 El enlace de pH diferencial de los anticuerpos listados anteriormente en la Tabla 3 luego se determinó por el ELISA. 50 ]iL de Neutravidin (Pierce) en 8 µ?/mL en lxPBS se recubrió en una placa de 384 pocilios Nunc Maxisorp, y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de bloquear los pocilios con BSA al 0.1%/PBS/Tween20 al 0.05% durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween20 al 0.05%. 25 pL de hepcidina mono-biotinilada en 50 ng/mL en BSA al 0.1%/PBS/Tween20 al 0.05% se agregaron a la placa de 384 pocilios, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas luego se lavaron seis veces con ' PBS/Tween20 al 0.05%. Las concentraciones de anticuerpos de hepcidina de partida se normalizaron a 1 yg/mL para condiciones de pH 5.5 y 6.0 y a 100 ng/mL para condiciones de pH 7.4. Los anticuerpos de hepcidina se diluyeron en serie 3 veces en PBS/NFDM al 1% en pH 7.4 y 4 veces en PBS/NFDM al 1% en pH 6.0 y 5.5. Las diluciones y titulaciones se realizaron en placas de dilución de 96 pocilios de polipropileno, y luego se transfirieron en duplicado a una placa de 384 pocilios recubiertos con Neutravidin. La hepcidina biotinilada y los anticuerpos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente . La placa luego es lavó seis veces con PBS/Tween20 0.05%. 25 L de peroxidasa de huIgG-de rábano picante anti-cabra en una dilución de 1:7000 en BSA al 0.1%/PBS/Tween20 al 0.05% luego se agregaron a cada pocilio de la placa de ensayo. La placa se lavó finalmente seis veces en PBS/Tween20 0.05%. Se agregó el substrato de K-Azul 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -Tetrametilbenzidina (TMB) mejorado (Neogen) y la reacción se detuvo usando H3P04 1 M después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. La absorción se midió a 450 nm sobre un lector de placas. Los datos de enlace se analizaron por el análisis de regresión no lineal (respuesta de dosis sigmoidea, inclinación variable) para generar valores EC50 que usan el software GraphPad PrismMR. Las mutaciones individuales del 15E1 de tipo natural que produjo por lo menos un incremento de 1.5 veces en EC50 ya que el pH se disminuyó a 6.0 incluyó L27H (cadena ligera), A89H (cadena ligera) , W52H (cadena pesada) , N57H (cadena pesada) , A99H (cadena pesada) , y A107H (cadena pesada) . Se hicieron combinaciones dobles de estos mutantes. Los mutantes múltiples del 15E1 de tipo natural con por lo menos incremente de 5.5 veces en EC50 conforme el pH se disminuyó a 6.0 incluyó A107H (cadena pesada) /A89H (cadena ligera), A107H (cadena pesada) /L27H (cadena ligera), A107H (cadena pesada) /N57H (cadena pesada), y A107H (cadena pesada) /A99H (cadena pesada) . Los resultados representativos se establecen en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 Los resultados indicaron que el anticuerpo 18B11 demostró una afinidad de enlace evidente más baja 2-log y ese 15E1 N57H A107H demostró una afinidad de enlace evidente más baja de 1-log para la hepcidina en pH 6.0 comparado a pH 7.4. EJEMPLO 4 - ANALISIS DE ENLACE DE CONSTANTE DE DISOCIACION PARA EL ANTICUERPO HUMANO 18B11 También se realizó el análisis de constante de disociación de la disociación en los diferentes pHs. Una constante de disociación lenta se espera que prediga la interacción de enlace incrementada durante un período de tiempo más prolongado, mientras que una constante de disociación más rápida se espera que prediga la interacción de enlace disminuida. Por ejemplo, una constante de disociación más rápida en pH más bajo se espera que prediga la mayor liberación del antígeno en pH más bajo. Se realizó el análisis de enlace de equilibrio de solución usando el BIAcore para estudiar las constantes de disociación de los anticuerpos 1S1, 1S3, 2.7, 18B11, 23F11 y 26F11 con la hepcidina humana recombinante (SEQ ID NO: 9) .

Preparación de las> Superficies del Chip BIAcore La inmovilización de la hepcidina humana recombinante (rhuHepc) a una superficie de chip detector BIAcore se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en una velocidad de flujo de 10 L/min de solución amortiguada corriente (DPBS: Solución Salina Amortiguadora de Fosfato IX de Dulbecco, sin CaCl o MgCl, con tensioactivo Biacore P-20 alO.005%). La matriz carboxilada del chip detector primero se activo con una inyección de 60 de una mezcla que contiene EDC 0.2 M (N-etil-N- (dimetilamina-propil) carbodiimida en agua de BIAcore) y NHS 0.05M (N-hidroxisuccinimida en agua, de Biacore) . 55 ]i de hepcidina humana recombinante (1 g/ml en a-acetato 10 mM pH 4.0) se inyectaron para inmovilizarse sobre el chip detector. Los grupos reactivos en exceso del chip detector se desactivaron con una inyección de 60 µ?, de etanolamina (1.0M, de Biacore). Análisis BIAcore Después el rhuHepc se inmovilizó sobre el chip CM5 con baja densidad, 50 nM de anticuerpos 1S1, 1S3 , 2.7, 18B11, 23F11 y 26F11 se inyectaron sobre y se enlazaron a la superficie rhuHepc en pH 7.4. Las soluciones amortiguadoras de disociación con pH 7.4, pH6 y pH 5.5 se corrieron sobre la superficie enlazada. Se obtuvieron las curvas de disociación. Los resultados indicaron que el anticuerpo 18B11 demostró una diferencia significativa en la constante de disociación en pH 7.4 (>lxl0~2) comparado a pH 5.5. Los otros anticuerpos sometidos a prueba no demostraron una diferencia significativa en la constante de disociación en pH 7.4, 6.0 o 5.5. Véase las Figuras 1A a 1F.

EJEMPLO 5 - ACTIVIDAD DE LA HEPCIDINA IN VITRO EN UN ENSAYO DE- B-LACTAMASA SENSIBLE AL HIERRO SE PUEDE NEUTROIZAR POR LOS ANTICUERPOS ANTI-HEPCIDINA La hepcidina causa que la ferroportina se internalice y se remueva de la superficie celular, inhibiendo de esta manera la liberación del hierro y elevando las concentraciones de hierro intracelular . El efecto de los anticuerpos de anti-hepcidina humana sobre este secuestro de hierro mediado por hepcidina se evaluó in vitro. Se construyó una línea de 293 células que contiene un constructo de expresión de ferroportina inducible por doxiciclina (Fpn) así como también un constructo de expresión de beta-lactamasa (BLA) que contiene una copia del elemento de respuesta de hierro 5' (IRE) de ferritina que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: tcggccccgcctcctgccaccgcagattggccgctagccctccccgagcgccctgcctccg agggccggcgcaccataaaagaagccgccctagccacgtcccctcgcagttcggcggtccc gcgggtctgtctcttgcttcaacagtgtttggacggaacagatccggggactctcttccag cctccgaccgccctccgatttcctctccgcttgcaacctccgggaccatcttctcggccat ctcctgcttctgggacctgccagcaccgtttttgtggttagctccttcttgccaacc (SEQ ID NO: 103) que regula la traducción del ARNm. Estas células 293/Fpn/BLA, tomadas de un cultivo confluente de 70-80%, se colocaron en placas a 2.8xlOE células/mL en D EM (Invitrogen Cat# 11965) FBS al 5% (Invitrogen Cat# 10099-141) PSQ (Invitrogen Cat# 10378-016), 90 pL/pocillo (25,000 células/pocilio) en placas recubiertas con Poli-D-Lisina BioCoat (Becton-Dickinson Cat# 35-6640) y se incubaron a 37°C con C02 al 5%. Al final del mismo día, se hizo una solución de un medio de ensayo (DMEM FBS al 5%PSQ) con 100 ug/mL de doxiciclina, 10 L/pocillo de la misma se agregaron a la placa y la placa se incubó durante toda la noche o durante por lo menos 20 horas. Al siguiente día, el medio se removió de los pocilios y se reemplazó con mezclas prefabricadas de DMEM FBS al 5% PSQ, 2.5 g/mL. de citrato férrico, 50 ng/mL de hepcidina humana sintética y diluciones en serie de los anticuerpos (24E4, 23F11, 18B11, 2.7, 2.41, y Ab43) , todos preparados en una placa de bloque de pocilios profundos de . propileno de 96 pocilios inmediatamente antes de la adición a la placa de ensayo. Las mezclas se agregaron en 100 yL/pocillo y se incubaron durante toda la noche a 37°C, C02 al 5% en una incubadora de cultivo celular. Las placas luego se removieron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de agregar 20 µL/pocillo del reactivo de desarrollo CCF4 A/M GeneBlazer de Invitrogen preparado (Invitrogen Kit# K1085) y al incubar durante 90 minutos en la oscuridad. El reactivo de desarrollo también se agregó, a 16 pocilios de una placa de ensayo de control sin las células que contienen 100 \iL del medio de ensayo (DMEM FBS al 5%PSQ) y se incubaron durante el mismo tiempo. Las señales de fluorescencia Azul y Verde luego se. leyeron sobre un lector de múltiple etiquetas Envision (Perkin-Elmer Inc.) al excitar a 409 nm y al leer las emisiones a 447 nm (azul) y 520 nm (verde) . Los resultados se representan en las Figuras 2 y 3. Se determinó que mAb43, 2.7, 2.41, 18B11, 23F11, 24E4 disminuyó la concentración intracelular del hierro en una EC50 de 1.380 x 10" , 1.700 x 10~8, 1.636 x 10~8, 2.0 x 10~8, 2.3 xlO"9 y 5.0 xlO"9, respectivamente.

EJEMPLO 6 - ANTICUERPOS ANTI-HEPC DINA QUE NEUTROIZAN LA HEPCIDINA HUMANA EN RATONES La actividad de los anticuerpos anti-hepcidina humana se evaluó in vivo en ratones que se les administró hepcidina humana en una cantidad suficiente para generar una respuesta hipoferrémica . En el día 0, ratones C57BL/6 hembras se inyectaron subcutáneamente con un anticuerpo monoclonal de murino (Ab2.7) dirigido contra la hepcidina humana. Los ratones de control recibieron IgGl de murino como un control isotípico. En el día 3, los ratones recibieron una sola inyección intraperitoneal de 25 µg de hepcidina humana recombinante derivada de E. coli (rhHepc) . Los niveles de hierro en suero se analizaron dos horas después . Los animales de control tratados con solución salina tuvieron niveles de hierro en suero normales, mientras que los animales tratados con hepcidina y un anticuerpo de control de isotipo mostraron hipoferremia. Los resultados se establecen en la Figura 4B. Tanto 1 mg y 0.5 mg de mAb2.7 proporcionaron estadísticamente una protección significativa de la respuesta hipoferrémica. Aunque un reducción en la hipoferremia se observó en la dosis de 0.25 mg de Ab 2.7, las dosis más bajas (0.25 y 0.1 mg) se definieron como dosis no neutroizantes . Las estadísticas representan A OVA con una prueba pos-hoc de Dunnett que compara todos los grupos contra el control salino., EJEMPLO 7 - LA NEUTROIZACIÓN DEL ANTICUERPO DE LA HEPCIDINA ADMINISTRADA POR AAV RESTAURA LAS CARACTERISTICAS DE' LOS GLOBULOS ROJOS TEMPRANOS NORMALES La expresión de la hepcidina humana mediada por AAV en los ratones produce una anemia hipocrómica, microcítica consiste con la deficiencia de hierro. La actividad de los anticuerpos anti-hepcidina humana se evaluó in vivo en estos ratones que sobreexpresan la hepcidina humana. Ratones C57B1/6 macho se inyectaron con AAV (l.SxlO12 partículas/ratón, I.V.) que contiene casetes de expresión para ya sea la hepcidina humana o beta-galactosidasa (ß-gal) como un control negativo. Los ratones se dejaron por dos semanas para permitir la producción constitutiva de huHepc antes de ser tratados con 1 mg/ratón de Ab 2.7 o control de isotipo (mulgGl) en varias frecuencias de dosificación (IX, 2X y 4X por semana) como se muestra en la Figura 5A. La sangre se extrajo en el quinto día para los niveles de hierro en suero y la determinación de las características de glóbulos rojos tempranos (reticulocitos) (conteo de reticulocitos , contenido de hemoglobina de los reticulocitos (CHr) , y volumen medio de células en los reticulocitos (Retic. MCV) ) Los resultados se establecen en las Figuras 5B-5E. Los niveles de hierro en suero se restauraron a normales en los que reciben la dosificación de 4X Ab2.7 pero no el control de isotipo. Todos los ratones que recibieron Ab2.7 mostraron una producción de reticulocitos incrementada. El contenido de hemoglobina de los reticulocitos (CHr) fue normal en los ratones proporcionando la dosificación de 4x y 2x de -Ab 2.7, pero la hipocromicidad aún se observa en los grupos con dosificación de lx, o el grupo de control de isotipo. El tratamiento con Ab2.7 en las dosis de 4X y 2X restauró el volumen normal a los reticulocitos (Reticulocitos MCV) pero la microcitosis aún estuvo presente en los grupos de control IX e isotipo. Las comparaciones estadísticas a ß-gal inyectados a los animales con el tratamiento de control de isotipo se determinó para observar la restauración de las características de los glóbulos rojos normales (A OVA con la prueba pos-hoc de Dunnett) .

En otro experimento,. la actividad de los anticuerpos anti-hepcidina humana 1S1, 18B11 y 24E4 se evaluó in vivo en los ratones que sobreexpresan la hepcidina humana. Ratones C57B1/6 (4 semanas de edad) se obtuvieron de Charles River Laboratories. En la semana 0, los ratones (n=5 por grupo) es inyectaron por la vía de la vena de la cola con AAV que contiene hepcidina humana (hHepc) o proteína de fluorescencia verde (GFP) como un control de expresión. Los ratones se mantuvieron durante 2 semanas después de la introducción viral para permitir la expresión de la proteína antes del tratamiento con el anticuerpo. Los ratones se trataron con ya sea 1 mg o 0.5 mg de cada anticuerpo 1S1, 18B11 y 24E4 (inyección subcutánea, 0.2 ml/ratón en PBS) e los Días 14 y 16 después de la introducción viral. La sangre se recolectó en el Día 18, y la respuesta a la administración del anticuerpo se midió como un cambio en las características de los reticulocitos (contenido de hemoglobina celular en los reticulocitos) usando un Analizador de Hematología ADVIA 2120 (Bayer Corporation, Tarrytown, NY) . Los niveles de hepcidina en suero totales (libres y enlazados) se midieron por el ELISA para determinar el grado de formación del complejo. Todos los resultados se expresaron como el error medio ± estándar del medio. El ANOVA y una prueba pos-hoc de Dunnett que usa un software Graphpad Prism v4.0MR (San Diego, CA) estimó la importancia estadística de las diferencias (* indica p<0.05, y ** indica p<0.01 comparado con el grupo de control AAV-hHepc + isotipo) .

Después de 18 días, los reticulocitos de los ratones de control tratados con AAV-hHepc + isotipo habían reducido el contenido de hemoglobina (CHr) , volviéndolos hipocrómicos . Los- animales tratados con anticuerpos anti-hepcidina 1S1, 18B11 o 24E4 en ya sea 1 mg o 0.5 mg/ratón tuvieron valores CHr normales como es comparado con los ratones de control a AAV-GFP, indicando que estos anticuerpos son eficaces en este modelo en la restauración de las características de glóbulos rojos tempranos normales. Véase la Figura 6A y la Figura 6B .

Los resultados indicaron que los ratones tratados con la dosis de 1 rag del anticuerpo 18B11 tuvo una reducción de 10 veces en la hepcidina en suero total comparados con los animales tratados con el anticuerpo 1S1 o anticuerpo 24E4 (Figura 7A) . Se obtuvieron resultados similares en la dosis de 0.5 mg/ratón (Figura 7B) . La cantidad notablemente reducida de la hepcidina total observada con el anticuerpo 18B11, es consistente con la eliminación de la hepcidina a través de los endosomas.

EJEMPLO 8 - RESULTADOS DE LA SOBREEXPRESIÓ DE LA HEPCIDINA VIRICA EN LA HIPO-SENSIBILIDAD A LA ERITROPOYETINA Los siguientes ejemplos investigaron la función de la hepcidina y los anticuerpos anti-hepcidina en ratones hipo-sensibles a la eritropoyetina .

La titulación de la expresión de la hepcidina humana mediada por AAV en los ratones causa un incremento en los niveles de la hepcidina en suero y la hipoferremia dependiente de dosis, como se muestra en la Figura 8. Las dosis de AAV-hepcidina humana se seleccionaron para proporcionar un fenotipo resistente a la eritropoyetina y niveles expresados de hepcidina en un intervalo similar para que se detecte en las muestras de pacientes con cáncer en estudios previos (como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. copropietaria copendiente No. 11/880,313 y la Publicación Internacional No. WO 2008/011158, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad) . Ratones C57BL/6 macho se inyectaron con AAV que expresan la hepcidina humana o GFP como un control de expresión (n=4 por grupo) . Los ratones se inyectaron a través de la vena de la cola (hepcidina humana, de 1x10 a 3x10 partículas/ratón; GFP 3xl012 partículas/ratón) . La expresión de la proteína se dejó desarrollar durante dos semanas antes de la cosecha. En las dos semanas el suero se recolectó de los ratones y se determinó los niveles de hierro y hepcidina. Los resultados se reportan en la Figura 8.

A fin- de evaluar el efecto de la hepcidina sobre la resistencia a la eritropoyetina, ratones C57BL/6 macho se inyectaron con AAV (3xl012 partículas/ratón, administración en la vena del portal hepático) que contiene casetes de expresión para ya sea la hepcidina humana o GFP como un control negativo (n=5 por grupo) . Los ratones se dejaron durante tres semanas para permitir la producción constitutiva de la hepcidina humana, y luego se les extrajo sangre para determinar los niveles de hemoglobina en la línea base (Hb) . Los ratones se trataron con alfa-darbepoyetina (100 g/kg/ratón) o solución salina como un control negativo a en cuatro semanas. En la quinta semana, los niveles de hemoglobina se midieron nuevamente . Los resultados se muestran en la Figura 9. Los ratones que sobreexpresan la hepcidina humana son resistentes a altas dosis de alfa-darbepoyetina . La resistencia a la alfa-darbepoyetina demuestra que los niveles de hepcidina elevados son suficientes para causar la hipo-sensibilidad a la eritropoyetina .

EJEMPLO 9 - TERAPIA. DE COMBINACION CON ANTICUERPO DE HEPCIDINA Y UN ESTIMULADOR DE ERITROPOYESIS EN UN MODELO DE SOBRE-EXPRESIÓN DE HEPCIDINA VIRAL El tratamiento de los ratones que poseían un fenotipo resistente a la eritropoyetina con un anticuerpo anti -hepcidina restauró la sensibilidad al tratamiento con la alfa-darbepoyetina . Ratones C57BL/6 macho se inyectaron con AAV (5xl012 partículas/ratón, I.V.) que contiene genes que codifican ya sea la hepcidina humana o GFP como un control de expresión (n=5 por grupo) . Después de dejar dos semanas para estabilizar la expresión de la proteína constitutiva, a los ratones se les extrajo sangre para determinar los niveles de hemoglobina en la línea base (Hb) , luego se trataron con Ab 2.7 (1 mg/ratón) o control de isotipo en varias frecuencias de dosis. En el día después de la primera dosis, se trataron con alfa-darbepoyetina (100 µ?/kg, subcutánea) . Un esquema del programa de dosificación se presenta en la Figura 10A.

La neutralización de la hepcidina restaura la sensibilidad a la alfa-darbepoyetina . La dosificación del Lunes-Miércoles-Viernes del anticuerpo condujo a una respuesta parcial al tratamiento con alfa-darbepoyetina como es medido por un incremento en los niveles Hb; un cohorte con la misma dosificación de anticuerpos sin el tratamiento con alfa-darbepoyetina no mostró elevación en los niveles Hb. (Véase la Figura 10B) una respuesta máxima a la alfa-darbepoyetina se logró en los ratones que reciben una dosificación diaria (Lunes a Viernes) de Ab 2.7. (Véase la Figura 10C) Dos y tres dosis de anticuerpo en combinación con el tratamiento con alfa-darbepoyetina condujo a una respuesta condujo a una respuesta parcial, como es medido por los niveles Hb. (Véase la Figura 10D) . La dosis de anticuerpo y proximidad de la dosis de anticuerpo al tratamiento con la alfa-darbepoyetina afectó la respuesta Hb total al tratamiento con el anticuerpo anti -hepcidina, como se muestra en la Figura 10E (los resultados varían de control donde p < 0.01 por el ANOVA con la prueba pos-hoc de Dunnett se observan con dobles asteriscos) . De esta manera, la neutroización mediada por anticuerpo de la hepcidina se mostró que es un tratamiento efectivo para la anemia causa por los niveles de hepcidina elevados.

EJEMPLO 10 - TERAPIA DE COMBINACION CON UN ANTICUERPO ANTI-HEPCIDINA Y UN ESTIMULADOR DE ERITROPOYESIS EN UN MODELO DE RATON DE ANEMIA INFLAMATORIA La terapia de combinación con un anticuerpo anti-hepcidina y un simulador de eritropoyesis también se evaluó en un modelo de anemia inflamatoria de murino como sigue.

Se generaron ratones tal que la hepcidina 1 de murino se hizo genéticamente deficiente y se reemplazó con la hepcidina humana. Ratones hembra, tanto homocigoto para la expresión de la hepcidina humana, como de control de carnada de tipo natural, se inyectaron con Brucella abortus (2xl08 partículas/ratón, I.P.) en el día 0 y luego se les extrajo sangre en el día 6 para estimar los niveles de hemoglobina. Los ratones luego se trataron con ya sea Anticuerpo 2.7 o un anticuerpo de control de isotipo (1 mg/ratón/día) en los días 6 a 9. Se administró alfa-darbepoyetina (100 pg/kg/ratón) en el día 7, y los niveles Hb se evaluaron en el día 13. Un esquema del protocolo se muestra en la Figura 11A.

Ratones de control de tipo natural los cuales aún poseían el gen de hepcidina 1 de ratón no respondieron a la alfa-darbepoyetina ya se con o sin Ab 2.7. (Véase la Figura 11B) . Ratones genéticamente eficientes de gen humano tratados con el anticuerpo 2.7 exhibieron una sensibilidad restaurada al tratamiento con alfa-darbepoyetina, como se muestra por el mantenimiento de los niveles de hemoglobina estables. (Véase la Figura 11C) .

Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-hepcidina se pueden usar para neutroizar la hepcidina bajo condiciones de exceso de hepcidina y restaurar la sensibilidad a los agentes eritropoyéticos en las anemias mediadas por hepcidina como la anemia de inflamación.

EJEMPLO 11 - MEDICION DEL NIVEL DE HEPCIDINA EN PACIENTES El nivel de la hepcidina en pacientes humanos se midió por técnicas de espectrometría como es describe previamente en la Solicitud de Patente de E.U.A. copropietaria copendiente No. 11/880,313 y la Publicación Internacional No. O 2008/01 1158, las descripciones de cada una de estas solicitudes se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad. El método se reproduce a continuación.

Se recolectaron muestras de pacientes que sufren de anemia de cáncer (obtenidas de ProteoGenex) o voluntarios (control) . 100 pL de cada, muestra, estándares en blanco y de calibración en suero que consisten de siete concentraciones no de cero en duplicados (10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/mL) se extrajeron por SPE usando una placa de 96 pocilios de Elución Oasis HLBm ( aters, Milford, MA) . El solvente de lavado fue metanol/agua al 30% con un pH de aproximadamente 10 ajustado con hidropóxido de amonio. El solvente de elución fue una solución de metanol/agua al 90% con un pH de aproximadamente 5 ajustado con ácido acético. La placa SPE se activó con 500 L de metanol y se acondicionó con 500 L de agua, luego 100 de muestra de suero y 200 de estándar interno se cargaron sobre la placa de elución, se lavaron con 350 µL de agua y 350 de solvente de lavado. La elución se hizo usando 100 µL de solvente de elución y se diluyó con 100 µL de agua. Los 200 µL de material eluído resultante se analizó por LC-MS/MS. 20 µ? de cada muestra extraída se inyectó sobre una columna HPLC de 5 µ?t?, Polaris C18A (2.1 x 50 mm, Varían). La velocidad del flujo de LC se ajustó a 300 µ?/min. La fase móvil A de HPLC fue metanol/agua 5:95, y la fase móvil B fue metanol/agua 95:5, ambos conteniendo ácido fórmico al 0.1%. las condiciones gradientes se ajustaron como sigue: 0-0.1 min, B al 2%/ A al 98% isocráticos ; B al 2% a B al 95% en 0.1-4.5 min; B al 95% a 4.5-4.9 min; B al 95% a B al 2% en 4.9-5.0 min; 5.0-6.0 min, B al 2% isocráticos.

Un espectrómetro de masas cuadrupolo triple Sciex AP 14000 de Applied Biosystems (Foster City, CA) con una fuente Turbo ESI se usó para la detección de la hepcidina en el modo MR con transición iónica de m/z 930.60 a m/z 110.15. La cuantificación se logró al comparar la relación de las áreas pico LC de la hepcidina y el estándar externo a las relaciones obtenidas de una serie de estándares donde se conocieron las cantidades de hepcidina y estándar interno.

Este experimento permitió la determinación de los niveles de suero de la hepcidina en una población de control presumida de contener un gran número de individuos sanos así como también el nivel de suero de la hepcidina de pacientes que sufren anemia de cánceres (AoC) . Los resultados se muestran en la Figura 12.

Cada muestra del paciente luego se analizó para otras concentraciones de índice de hierro para determinar si un paciente tuvo inflamación o anemia por deficiencia de hierro (Figura 13) . Los parámetros se midieron como sigue: hierro en suero, UIBC, ferritina y CRP se midieron sobre un analizador de laboratorio clínico Olympus AU400 usando procedimientos estándares; sTfR se midió usando un método ELISA estándar (R&D systems) .

Como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. copendiente No. 12/022,515, incorporada a manera de referencia en este documento en su totalidad, los niveles de prohepcidina medidos usando el kit de ELISA de prohepcidina DRG, sin embargo, no se correlacionaron los niveles de la hepcidina madura de los pacientes, y los niveles de prohepcidina se correlacionan con el estado inflamatorio de los pacientes. La hepcidina, pero no la prohepcidina, muestra una relación con CRP en pacientes con anemia de cáncer, y por lo tanto se pueden usar como un marcador de la inflamación.

. La distinción de - la anemia de inflamación (AI) de la anemia por deficiencia de hierro (IDA) y la anemia mezclada (componentes de tanto Al e IDA) se complica puesto que la mayoría de los parámetros de laboratorio comúnmente usados se afectan por las . respuestas de fase aguda. Una relación que usa valores del receptor de transferrina soluble (sTfR) y ferritina (Ft) se ha descrito en la literatura como un medio para proporcionar una diagnosis más precisa. Véase Punnunon y colaboradores, Blood, 89:1052-57, 1997. La anemia de inflamación se caracteriza por un cociente bajo sTfR/log Ft (valores menores que uno) , mientras que una alta relación es indicativa de IDA. Por consiguiente, la relación sTfR/log Ft puede servir como un pronosticador preciso de las tres condiciones cuando se combina con un marcador inflamatorio para ayudar a la diagnosis de la anemia mezclada del IDA absoluto.

Los niveles de hepcidina se relacionan fuertemente a los niveles de sTfR/log Ft en pacientes con AoC (r=-0.6407; P<0.0001), ayudando de esta manera a la diagnosis del paciente.

Usando un árbol de decisiones que combina el CRP como un marcador de inflamación y sTfR/logFt, los pacientes con anemia de cáncer se podrían subdividir dentro de aquellos con AI, con anemia mezclada, con IDA y con una anemia de origen desconocido, designado "otros" (Figura 14A) . Los pacientes con niveles de hepcidina elevados se observaron que tienen ya sea AI o una anemia mezclada. (Figuras 15A a 15B) . Los pacientes con niveles de hepcidina bajos o ausentes se observaron que tienen ya- sea IDA o anemia de origen desconocido. Los niveles de hepcidina, como se mide por los métodos de inmunoensayo basados en anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente de E.U.A. copendiente No. 12/022,515, incorporada a manera de referencia en este documento en su totalidad, o el método de cuantificación del método basado en espectrometría de masas descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. copropietaria copendiente No. 11/880,313 y la Publicación Internacional No. WO 2008/011158, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad, y se platean con detalle anteriormente, se pueden usar para diagnosticar anemia inflamatoria.

EJEMPLO 12 - ANTICUERPOS MONOCLONALES EN UN INMUNOENSAYO DE EMPAREDADO PARA LA HEPCIDINA Los siguientes ejemplos describen un inmunoensayo de emparedado para determinar los niveles de hepcidina en una muestra.

Usando el análisis Biacore, una superficie recubierta con el anticuerpo 1S1 se sometió a prueba para el enlace concurrente de la hepcidina y otro anticuerpo (Figura 16) . La inmovilización del anticuerpo anti-Hepc 1S1 a la superficie del chip detector se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un flujo continuo de solución amortiguadora P-20 al 0.005%/PBS. Brevemente, los grupos carboxilo sobre las superficies del chip detector se activaron al inyectar 60 µ?? de una mezcla contiene N- etil- ' - (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0.2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0.05 M. Esto se siguió por la inyección de 1S1 diluido en acetato 10 mM, pH 4.0 en concentraciones y entre 20 yg/mL. Los grupos reactivos de exceso sobre la superficie se desactivaron al inyectar 60 i de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales fueron 5,000-6,000 unidades de resonancia (RU) para la superficie Ab 1S1. Una superficie de referencia acoplada simulada, blanca también se preparó sobre ¦ el chip detector. Se inyectó hepcidina humana derivada de E. coli 20 nM sobre y se enlazó a la superficie de anticuerpo 1S1. Luego el anticuerpo 2.7 50 nM, 23F11, 26F11, y 1S1 se inyectaron sobre la superficie de la hepcidina/lSl . Después de la inyección del anticuerpo, las superficies se regeneraron al inyectar 30 µL de HCl 10 mM pH 2.0.

Hubo una alta selectividad de enlace en la forma de los complejos. El anticuerpo 2.7 de murino, el cual se usó en el ensayo competitivo anteriormente, no fue capaz de formar un par de emparedado con el 1S1, y 26F11 mostró capacidad notablemente más baja para enlazarse a la hepcidina concurrentemente con el 1S1 que lo hizo con el 23F11.

Cuando los 1S1 y 23F11 se ensamblaron en un formato de ELISA de emparedado, la sensibilidad del inmunoensayo para detectar los niveles de hepcidina se mejoró por 50 veces. • Como se muestre en la Figura 17, el ensayo probó ser capaz de medir los niveles de la hepcidina en suero normal después de una etapa de pre-dilución de 50 veces. El eje representa la pre-dilución de los niveles de hepcidina.

EJEMPLO 13 - ENSAYO DE ENLACE COMPETITIVO El siguiente ejemplo describe un ensayo de enlace competitivo para determinar los niveles de hepcidina. En un protocolo, la hepcidina no etiquetada presente en suero compite con la hepcidina biotinilada para enlazarse a un anticuerpo anti-hepcidina (por ejemplo, Anticuerpo 2.7).

Los niveles de hepcidina se determinaron usando estándares de hepcidina de concentraciones variantes (de 1.4-300 ng/ml) sobrecargadas en solución amortiguadora (BSA al 5% : I-bloque) , suero de conejo, o suero humano agrupado. La hepcidina se agregó en volúmenes iguales de 40ng/mL de Ab2.7 y se incubó durante 120 minutos. 25 µ?/pocillo de solución mezclada se agregaron a placas de mitad de área Negra recubierta con 1-2 g/mL de anticuerpo de captura GxM. 25 L/pocillo de hepcidina biotinilada se agregaron a 0.25 nM. La placa se cubrió con un sellador de película de placas y se incubó a temperatura ambiente (25°C) sobre un agitados de placas a aproximadamente <200RPM durante aproximadamente 60 minutos. La placa se lavó y luego se agregaron 50 µ?,/??????? de reactivo de amplificación de' peroxidasa de Poli rábano picante en 1:2000. La placa se dejó asentar durante 30 minutos y luego se lavó con un lavador de placas usando una solución amortiguadora de PBS o KPL 6 veces. La placa se secó con palmadas y se agregó rápidamente un substrato luminiscente (Femto o Pico) . La placa se leyó con un luminómetro ' (ej . : Lmax 340) durante 1 segundo usando un substrato de Femto o Pico. Los resultados indican que la. hepcidina fue medible en un intervalo de concentración de 1 - 100 ng/ml en tanto el suero de conejo como la solución amortiguadora (Figura 18) .

El suero humano agrupado pareció que tiene un nivel de hepcidina existente de mayor que 20 ng/ml. Se determinó que los niveles de hepcidina variaron sustancialmente en los sueros humanos, sobre el intervalo de 1-30 ng/ml para varios sueros aleatoriamente seleccionados (Figura 19) .

Usando los estándares de hepcidina en suero de conejo determinados anteriormente, se sometieron a prueba 24 sueros aleatorios de sujetos humanos normales. Los niveles de hepcidina variaron de no detectables a arriba de 50 ng/ml. Véase la Figura 20. Estos valores estuvieron en una variación con los resultados de los niveles de la hepcidina medidos a través del método de cuantificación basado en espectrometría de masas descrito en la Solicitud de Patente de E.U.A. copropietaria copendiente No. 11/880,313 y la Publicación Internacional No. WO 2008/011158, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad, las cuales proporcionaron generalmente muchos valores baj os .

EJEMPLO 14 - ESTUDIO FARMACOCINETICO DEL ANTICUERPO DESPUES DE UNA SOLA DOSIS DEL COMPLEJO DE ANTICUERPO-HEPCIDINA Ratones C57BL/6 se pre-dosificaron con ya sea el anticuerpo de control o los anticuerpos 1S1 o 18B11 en el Día 0 como una sola inyección intraperitoneal en una dosis de 1 mg/ratón para asegurar que la concentración de anticuerpos estuviera arriba de la KD del anticuerpo. En el Día 1, los . ratones se dosificaron con un complejo de anticuerpo-hepcidina (es decir, ya sea complejo de 1S1-hepcidina o complejo de 18Bll-hepcidina) . Las muestras de orina para la determinación de las concentraciones de hepcidina se recolectaron antes de la administración de la hepcidina y en 1 hora, 24 y 96 horas de la administración del complejo de anticuerpo-hepcidina. Los resultados se establecen en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5 Las muestras de suero para la determinación de las concentraciones de anticuerpo en suero y hepcidina en suero se recolectaron a 5 minutos, 1 hora, 24 horas, 96 horas, 168 horas, 264 horas y 336 horas después de la administración del complejo de anticuerpo-hepcidina. Las concentraciones de anticuerpo y hepcidina en suero se calcularon por el ELISA y los resultados se establecen en la Figura 21 y la Figura 22, respectivamente. Los resultados indicaron que la concentración de la hepcidina en suero en el punto de tiempo de 5 minutos en los ratones que recibieron el complejo de 18Bll-hepcidina fue más baja comparada con el complejo de 1S1 -hepcidina. Interesantemente, la hepcidina no fue detectable después de 24 horas en los ratones que recibieron el complejo de 18Bll-hepcidina, mientras que los ratones tratados con el complejo de lSl-hepcidina aún tuvieron niveles detectables de hepcidina en suero a 168 horas.

EJEMPLO 15 - ESTUDIO FARMACOCINETICO DE ANTICUERPOS DESPUES DE UNA SOLA DOSIS DE HEPCIDINA LIBRE A RATONES Ratones C57 BL/6 se pre-dosificaron con ya sea el anticuerpo de control o anticuerpos 1S1 o 18B11 en el Día 0 como una sola inyección intraperitoneal en una dosis- 1 mg/ratón. En el Día 1, los ratones se pre-dosificaron con los anticuerpos como una sola inyección intravenosa en una dosis de 1 mg/ratón. En el Día 4, la hepcidina humana (3.72 ]iq/ratón) se administró a los ratones mediante inyección intravenosa. Las muestras de orina para la determinación de las concentraciones de hepcidina se recolectaron antes de la administración de la hepcidina y a 1 hora, 6 horas y 24 horas después de la administración de la hepcidina. Los resultados indicaron que la hepcidina no se detectó en los ratones pre-dosificados con ya sea 1S1 o 18B11. Véase la Figura 23.

Las muestras de suero para la determinación de las concentraciones de anticuerpo 1S1 o 18B11 y la hepcidina se recolectaron a 5 minutos, 1 hora, 24 horas, 96 horas, 168 horas, 264 horas y 336 horas después de la administración de la hepcidina. Las concentraciones de anticuerpo y hepcidina en suero se calcularon por el ELISA y los resultados se establecen en las Figuras 24 y 25, respectivamente. Los resultados indicaron que el anticuerpo 18B11 eliminó toda la hepcidina en suero detectable por 24 horas, mientras que los niveles de hepcidina se estabilizaron en los ratones tratados con el anticuerpo 1S1.

EJEMPLO 16 - DETECCION DE LA ACUMULACION INTRACELULAR DE LA HEPCIDINA POR ANTICUERPOS PUESTOS EN CONTACTO CON LAS CELULAS QUE EXPRESAN FCRN El FcRn es el receptor recuperado implicado en el reciclaje de los anticuerpos al rescatarlos de la degradación endosomal. Este Ejemplo examinó el efecto de los anticuerpos en los niveles relativos de la hepcidina intracelular comparada con la hepcidina total, proporcionando una indicación de la internalización y degradación subsecuente de la hepcidina por las células que expresan FcRn. Anticuerpos 1S1 o 18B21 etiquetados con alexa-647 formaron en complejo con el exceso de hepcidina biotinilada mediante la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente. La hepcidina libre se removió usando columnas giratorias. Las células 293T/FcRn se incubaron con los complejos de anticuerpo-hepcidina durante 6 horas a 37°C, C02 al 5% en medio de FBS al 0%. Al final de la incubación las células se cosecharon en una solución amortiguadora FACs fría (PBS, FBS al 2%) . Las células de cada grupo ya sea se fijaron únicamente (detección de la hepcidina extracelular) o se fijaron y se permeabilizaron (detección de la hepcidina total) usando reactivos R&D' s CytoFix y CytoPerm. Todas las muestras se tiñeron con SA-PE y se leen en FACS. Los resultados indicaron que el anticuerpo 18B11 causó mayor acumulación intracelular de hepcidina comparado con el anticuerpo 1S1. Véase la Figura 26. De la hepcidina total detectada en asociación con las células puestas en contacto con el ÍSÍ, toda la hepcidina fue extracelular . De la hepcidina total detectada en asociación con las células puestas en contacto con 18B11, solo aproximadamente un tercio de la hepcidina fue extracelular y el resto fue intracelular.

Para fines de completar la descripción, todos los documentos de patente y artículos de literatura citados en este documento se incorporan expresamente en esta especificación a manera de referencia en sus totalidades.

La descripción y ejemplos anteriores se han establecido simplemente para ilustrar la invención y no se proponen para ser limitantes. Puesto que las modificaciones de las modalidades descritas que incorporan el espíritu y sustancia de la invención pueden ocurrir a personas expertas en el campo, la invención se debe considerar ampliamente para incluir todas las variaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. reivindicaciones.

1. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se enlaza a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD de menor que aproximadamente 10"8M que exhibe por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (a) por lo menos aproximadamente una KD 50 veces más alta en un pH de aproximadamente 5.5 comparada con su KD para la hepcidina en un pH de aproximadamente 7.4; (b) por lo menos aproximadamente una eliminación 5 veces más rápida de la hepcidina comparada con el anticuerpo 1S1; y (c) una constante de disociación de aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH 5.5.

2. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se enlaza a la hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD de menor que aproximadamente 10"8M que exhibe por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (a) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero por lo menos 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre- formada en complejo de 3.7 iq de hepcidina humana con una dosis de 1 mg del anticuerpo, (b) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero, en un ratón por lo menos 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra uría sola dosis de 3.7 yg de hepcidina humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; (c) da por resultado una reducción mayor que 50% en la acumulación total de la hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1; y (d) da por resultado en por lo menos aproximadamente una acumulación intracelular 2 veces más alta de la hepcidina en células HEK293 transfectadas con FcRn incubadas con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque exhibe por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (a) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero por lo menos 90% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas después de la administración al ratón de (i) una dosis de 1 mg del anticuerpo y (ii) una sola dosis pre-formada en complejo de 3.7 iq de hepcidina humana con una dosis de 1 mg del anticuerpo, (b) reduce el nivel de la hepcidina humana total en suero en un ratón por lo menos aproximadamente 90% aproximadamente 24 horas después de que al ratón se le administra una sola dosis de 3.7 \ig de hepcidina humana, en donde la hepcidina se administra tres días después de que el ratón se pre-dosifica con el anticuerpo; (c) da por resultado una reducción mayor que 50% en la acumulación total de la hepcidina en suero total en ratones tratados con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1; y (d) da por resultado en por lo menos aproximadamente una acumulación intracelular 2 veces más alta de la hepcidina en célula HEK293 transfectadas con FcRn incubadas con el anticuerpo comparado con el anticuerpo 1S1.

4. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque se enlaza a una hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una afinidad KD de menor de aproximadamente 10"8M, en donde . el anticuerpo incrementa el nivel de hierro circulante o Tsat en un ratón que sobreexpresa la hepcidina humana durante por lo menos 1 día después de una sola dosis de anticuerpo.

. 5. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el anticuerpo disminuye el hierro en las células que expresan ferroportina estimuladas con 50 ng/mL de hepcidina en una EC50 de aproximadamente 20 nM o menos.

6. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se enlaza a una hepcidina humana de SEQ ID NO: 9, con una afinidad KD de por lo menos 10"8M, en donde el anticuerpo se obtiene al: (a) reemplazar un aminoácido en la cadena pesada o ligera del anticuerpo con una histidina; (b) clasificar el anticuerpo obtenido en (a) para el enlace de pH diferencial; (c) reemplazar otro aminoácido en la cadena pesada o ligera del anticuerpo con una histidina; y (d) clasificar el anticuerpo para tener por lo menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste de: (i) por lo menos aproximadamente una KD 50 veces más alta en aproximadamente pH 5.5 comparada con su KD para la hepcidina en aproximadamente pH 7,4; y (ii) una constante de disociación de aproximadamente 6xl0"2 s"1 o más alta en aproximadamente pH ' 5.5.

7. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo incrementa el nivel en un sujeto de uno de por lo menos hemoglobina o hematocrito, o ambos.

8. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo incrementa en un sujeto uno de por lo menos el conteo de glóbulos rojos, el conteo de hemoglobina de los glóbulos rojos o el volumen medio de células de los glóbulos rojos del conteo de glóbulos rojos o cualquiera de las combinaciones de los mismos.

9. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo incrementa en un sujeto uno de por lo menos el conteo de reticulocitos , el conteo de hemoglobina de los reticulocitos o el volumen medio de células de- los reticulocitos del conteo de reticulocitos, o cualquiera de las combinaciones de los mismos.

10. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la actividad reguladora del hierro de la hepcidina.

11. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 170 o SEQ ID NO: 168, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 171-176, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambió de aminoácidos a cualquiera.de SEQ ID NOs: 171-176.

12. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 171-173.

13. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 12, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 174-176.

14. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos . 90% idéntica a SEQ ID NO: 333 o a SEQ ID NO: 331, el polipéptido comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 334-349 y cualquiera de las secuencias comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 334-349.

15. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 334-346.

16. El anticuerpo . aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 15, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 347-349.

17. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 343 o a SEQ ID NO: 341, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 344-349 y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 344-349.

18. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porqué comprende SEQ ID NOs : 344-346.

19. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 18, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 347-349.

20. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 353 o a SEQ ID NO: 351, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 354-359 y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 354-359.

21. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 354-356.

22. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 21, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 357-359.

23. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 363 o a SEQ ID NO: 361, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 364-369, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 364-369.

24. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 364-366.

25. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 24, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 367-369.

26. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 373 o a SEQ ID NO: 371, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 374-379, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 374-379.

27. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 374-376.

28. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 27, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 377-379.

29. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 383 o a SEQ ID NO: 381, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 384-389, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs: 384-389.

30. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOS : 384-386.

31. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 30, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 387-389.

32.. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 393 o a SEQ ID NO: 391, el polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 394-399, y cualquiera de las secuencias que comprenden por lo menos un cambio de aminoácidos a cualquiera de SEQ ID NOs : 394-399.

33. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs : 394-396.

34. El anticuerpo áislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 33, caracterizado porque comprende SEQ ID NOs: 387-389.

35. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170 en donde por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 52, 57, 99 y 107 de la secuencia de aminoácidos se reemplazan con una histidina.

36. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 20, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 en donde por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 27 y 89 de la secuencia de aminoácidos se reemplazan con una histidina.

37. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 35 o 36, caracterizado porque un aminoácido en la posición 107 de SEQ ID NO: 170 se reemplaza con una histidina.

38. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque los aminoácidos en las posiciones 57 y 107 de SEQ ID NO: 170 ambos se reemplazan con una histidina.

39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el aminoácido en la posición 107 de SEQ ID NO: 170 y el aminoácido en la posición 27 de SEQ ID NO: 168 ambos se reemplazan con una histidina.

40. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el aminoácido en la posición 107 de SEQ ID NO: 170 y el aminoácido en la posición 89 de SEQ ID NO: 168 ambos se reemplazan con una histidina.

41. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque los aminoácidos en las posiciones 99 y 107 de SEQ ID NO: 170 ambos se reemplazan con una histidina.

42. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

43. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

44. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano.

45. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo es de un isotipo IgG.

46. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo es de un isotipo IgGl, lgG2, IgG3 o lgG4.

47. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-46.

48. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 47 enlazada operablemente a una secuencia de control reguladora .

49. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 48 o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 47.

50. Un método para usar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 49, para producir un anticuerpo, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 49 bajo condiciones adecuadas de tal manera que el ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque además comprende recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula hospedera.

52. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-46 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

53. Un método para tratar un trastorno de homeostasis de hierro en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-46.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el trastorno de la homeostasis de hierro se selecciona del grupo que consiste de: anemia, sepsis, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, trastorno renal de etapa final, enfermedad crónica de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V) , anemia por deficiencia de hierro, un trastorno de la homeostasis de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis , diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías, y trastornos de los glóbulos roj os .

55. Un método para tratar un humano con un nivel, elevado de hepcidina, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 52.

56. Un método para tratar un humano con anemia, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 52.

57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el humano que padece de anemia, sepsis, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, trastorno renal de etapa final, enfermedad crónica de los ríñones (etapa I, II, III, IV o V) , anemia por deficiencia de hierro, un trastorno de la homeostasis de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis , diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriosclerosis , tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías , trastornos de los glóbulos rojos.

58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55-56, caracterizado porque además comprende administrar al humano un estimulador de eritropoyesis seleccionado del grupo que consiste de eritropoyetina, variantes de eritropoyetina y anticuerpos que se enlazan al receptor de eritropoyetina.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el estimulador de eritropoyesis es eritropoyetina humana de SEQ ID NO: 72.

60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el estimulador de eritropoyesis es alfa- darbepoyetina de SEQ ID NO: 73.

61. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el método además comprende administrar hierro al paciente.