MX2010011170A - Polipeptidos del factor vii que se modifican y usos de los mismos. - Google Patents
Polipeptidos del factor vii que se modifican y usos de los mismos.Info
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Abstract
Se proporcionan polipéptidos del factor VII modificados y usos de los mismos. Tales polipéptidos FVII incluyen el Factor Vila y otras formas de Factor VII. Entre los polipéptidos FVII modificados proporcionados están aquellos que tienen actividades alteradas típicamente actividad procoagulante alterada, incluyendo actividades procoagulantes incrementadas. Por lo tanto, tales polipéptidos son terapéuticos.
Description
POLIPÉPTIDOS DEL FACTOR VII QUE SE MODIFICAN Y USOS DE LOS
MISMOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Se proporcionan proteínas terapéuticas modificadas. En particular se proporcionan polipéptidos modificados del Factor VII, el cual incluye el Factor Vlla y otras formas del Factor VII, y-usos de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La hemostasis es el . proceso fisiológico complejo que conduce a la suspensión .del sangrado. Las plaquetas, proteínas del plasma y los vasos sanguíneos y células endoteliales son los tres componentes de este proceso, en que cada uno juega un papel importante en los eventos que siguen inmediatamente a la lesión de tejidos y el cual, bajo circunstancias normales, resulta en la formación rápida de un coágulo. La cascada de coagulación es medular para esto, una serie de eventos proteolíticos en los cuales determinadas proteínas de plasma (o factores de coagulación) se activan secuencialmente en una . "cascada" por otro factor de coagulación previamente activado, conduciendo a una generación rápida de la trombina. Las grandes cantidades de trombina producidas en esta cascada luego funcionan para
escindir el fibrinógeno en péptidos de fibrina que se requieren para la formación de coágulos.
Los factores de coagulación circulan como zimógenos inactivos de cadena sencilla, I se activan por escisión en una o más posiciones para generar una forma activada de dos cadenas de la proteina. El factor VII (FVII), una proteina del plasma dependiente de la vitamina K, circula inicialmente en la sangre como un zimógeno. El zimógeno FVII se activa por la escisión proteolitica en un sitio sencillo, Arg152-Ile153, lo que resulta en una proteasa de dos cadenas ligada por un enlace sencillo bisulfuro (FVIIa). El FVIIa se enlaza a su cofactor, factor de tejido (TF) , . para formar un complejo en el cual FVIIa puede activar efectivamente el factor X (FX) al FXa, con lo que se inicia la serie de eventos que resultan en la formación de fibrina y la hemostasis. Aunque la hemostasis normal se alcanza en la mayoría de los casos, los defectos en el proceso pueden conducir a trastornos de sangrado en los cuales se prolonga el tiempo que se toma para la formación del coágulo. Tales trastornos pueden ser congénitos o adquiridos. Por ejemplo, las hemofilias A y B son enfermedades heredadas caracterizadas por deficiencias en el factor VIII (FVIII) y el factor IX (FIX) , respectivamente. La terapia de reemplazo es el tratamiento tradicional para las hemofilias A y B, e involucra la administración intravenosa
de FVIII o FIX, ya sea preparados a partir de plasma humano o como proteínas recombinantes . En muchos casos, sin embargo, los pacientes desarrollan anticuerpos (también conocidos como inhibidores) contra las proteínas de infusión, lo cual reduce o niega la eficiencia del tratamiento. El FVIIa recombinante (Novoseven® (Factor de Coagulación Vlla (Recombinante))) ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A o B que tienen inhibidores para FVIII o FIX, y se puede usar también para detener episodios de sangrado o evitar el sangrado asociado con el trauma y/o cirugía. El FVIIa recombinante también ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con deficiencia congénita FVII, y se utiliza crecientemente en usos fuera de aprobación, tales como el tratamiento del sangrado asociado con otros trastornos de sangrado congénitos o adquiridos, trauma, y cirugía en pacientes no hemofílicos. El uso del FVIIa recombinante para promover la formación de coágulos soporta su importancia creciente como un agente terapéutico. La terapia con FVIIa deja una necesidad médica importante no atendida. Por ejemplo, con base en los datos de ensayos clínicos, un promedio de 3 dosis de FVIIa durante un periodo de tiempo de 6 o más horas se requiere para manejar episodios agudos de sangrado en pacientes con hemofilia. Se necesitan variantes más eficaces de FVIIa para reducir estos requerimientos. Por
lo tanto, entre los objetivos en la presente, es un objetivo proporcionar polipéptidos FVII modificados que se diseñen para tener propiedades terapéuticas mejoradas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se proporcionan en la presente polipéptidos modificados del Factor VII (FVII). En particular, se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que muestran actividades procoagulantes. Los polipéptidos FVII se modifican en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, eliminaciones . y reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados incluyen polipéptidos FVII que muestran aquellos que tienen resistencia incrementada a inhibidores tales como antitrombina III (AT-III) e inhibidor de la trayectoria del factor de tejido (TFPI), aquellos que tienen resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, aquellos que tienen actividad catalítica incrementada en la presencia y/o ausencia de TF, aquellos que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como vida media creciente, aquellos que tienen enlace y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y aquellos que tienen enlace y/o afinidad para la integrina de plaquetas a?^ß3· Los polipéptidos FVII modificados pueden
contener cualquier combinación de modificaciones aquí proporcionados, por lo que una o más actividades o propiedades del polipéptido se alteran en comparación con un polipéptido FVII. no modificado. Típicamente el polipéptido FVII modificado retiene proactividad coagulante. También se proporcionan en la. presente moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células que codifican/expresan polipéptidos FVII modificados. Composiciones farmacéuticas, artículos de manufactura, kits y métodos de tratamiento también son aquí proporcionados. Los polipéptidos FVII incluyen variantes de especies y alélicas y polipéptidos y otras variantes que tienen modificaciones que afectan otras actividades y/o propiedades. También se incluyen fragmentos activos de los polipéptidos FVII que incluyen una modificación aquí proporcionada. Ejemplos de los polipéptidos FVII son aquellos que incluyen la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3, asi como variantes de la misma que tienen 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con ella.
Se proporcionan en la presente polipéptidos modificados por el factor VII (FVII) que contienen una modificación en un polipéptido FVII en la posición Q286 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en los residuos correspondientes en un polipéptido
FVII. La modificación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción ( es ) o eliminación (es ) de aminoácidos, o combinación de los mismos. En casos en donde la modificación es un reemplazo de aminoácidos, el reemplazo se puede hacer por un aminoácido básico (por ejemplo Arg (R) , Lys (K) y His (H) ) o un aminoácido seleccionado de entre Arg (R) , Lys (K) His (H) , Tyr (Y), Gly (G) , Phe ( F) , Met (M) , He (I), Leu (L) , Val (V) , Pro (P), Glu (E) , Trp (W) , Asp (D), y Cys (C) . Ejemplos de tales reemplazos de . aminoácidos incluyen Q286R, Q286K, Q286H, Q286Y, Q286G, Q286F, Q286M, Q286I, Q286L, Q286V, Q286P, Q286E, Q286W, Q286D, y Q286C. Tales modificaciones se pueden hacer en un polipéptido FVII no modificado que contiene una secuencia establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3, o una variante alélica o de especie de la misma, o una variante que tiene al menos 60% de identidad de secuencias con el FVII de cualesquiera de SEQ ID' NOS: 1-3, o un fragmento activo de un polipéptido FVII que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 1-3, o una variante alélica o de especie de la misma, o una variante que tiene al menos 60% de identidad de secuencias with el FVII de cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede ser un fragmento activo que contiene reemplazo en una posición que corresponde a la posición Q286 en un polipéptido FVII.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en la presente contienen un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 286 en un polipéptido FVII que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en un residuo correspondiente en un polipéptido FVII, en donde la modificación es reemplazo en la posición 286 por un aminoácido básico que resulta en un polipéptido FVII modificado que muestra actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido FVII que no tiene la modificación en la posición 286. El aminoácido básico puede ser seleccionado de entre Arg (R) , Lys (K) y His (H) . Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado aquí proporcionado puede contener un reemplazo de Gln (Q) con Arg (R) en la posición 286.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados tienen solamente la modificación sencilla en la posición 286. En otros ejemplos, los polipéptidos FVII modificados también contienen una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido FVII. La modificación adicional puede ser un reemplazo, inserción o eliminación de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación adicional puede ser un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, £132, V158, ??61, A175,
D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, Q286, L287, R290 A292, A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395 y R396, Ejemplos de tales modificaciones incluyen D196K, D196R, D196A, D196Y,
D196F, D196 , D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D,
K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D,
K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E,
R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R,
K341Q, K341N, K341M, K341.D, G237T238insA, G237T238insS,
G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK,
D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA,
D196K197insM, Kl97H98insE, K197I198insY, K197I198insA,
K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H,
T239I, L287T, M298Q, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D,
Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M,
H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S,
K161A, K161V, H216S, H216A, H216 , H216R, S222A, S222K,
S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Intercambio
FIX, {Gla Intercambio FIX/E40L}, {Gla Intercambio FIX/K43I}, {Gla Intercambio FIX/Q44S}, {Gla Intercambio FIX/MI 9K}, {Gla Intercambio FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S } , Gla Intercambio FX, Gla Intercambio Prot C, Gla Intercambio Prot S, Gla Intercambio Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S,
S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S11 ldelinsQRLMEDICLPR GCL EDDF,
Hl 15S126delinsQRLMEDICLPR GCL EDDF,
T128 P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPR GCLWE, S103SllldelinsDICLPR GCLWED, H115S126delinsDICLPR GCL ED, T128P134delinsDICLPR GCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCL ED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED,
S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV,
T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC,
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, E296V, M298 y M298Q.
Ejemplos de los polipéptidos FVII modificados que se proporcionan en la presente son aquellos que contienen modificaciones Q286R/M298Q, Q286R/Gla Intercambio FIX, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Gla Intercambio FIX, Q286R/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/S222A/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/M298Q/K341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Intercambio FIX,
Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A294S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V,
S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/H373A, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D,
Q286R/Q366N, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N,
Q286R/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Intercambio
FIX/E40L} /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio
FIX/K43I } /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/Q44S} /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio
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FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R,
T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F,
V158D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Gla Intercambio
FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q,
T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q,
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Intercambio
FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla
Intercambio FIX/S52A/S60A/Q286R/ 298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/H373F/ ,
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R, Gla Intercambio FIX/S222A/T239V/Q286R, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio
FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/H373F,
T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R, Gla Intercambio FIX/S222A/T239I/Q286R, T239I/Q286R/M298Q,
S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio
FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/H373F, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla Intercambio
FIX/S222A/Q286R/H373F, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/H257S/Q286R/ , S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257 S/Q286R/M298Q/H373F,
S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q,
T128N/P129A/A175S/Q286R,
A122N/G124S/A175S/Q286R, Gla Intercambio
FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R, Gla Intercambio
FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R,
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q,
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q,
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F,
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, {Gla Intercambio FIX /K43I} /T128N/P129A/Q286R/M298Q,
T128N/P129A/Q286R/ 298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX/K43I } /Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q,
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q,
T128N/P129A/S222A/T239V/H257 /Q286R/M298Q,
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F,
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q ¦ o
T128N/P129A/T239I/Q286R/ 298Q/H373F.
Se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que contienen dos o más modificaciones en un polipéptido FVII, variante alélica o de especie de la misma o fragmentos activos del mismo. Al menos una de las modificaciones en tales polipéptidos está en una posición que corresponde a la posición Q286 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII, con la condición de que la modificación en la posición Q286, sola o en combinación con alguna otra modificación, no resulta en la introducción de un nuevo sitio de glicosilación comparado con el polipéptido FVII no modificado. Tales modificaciones puede ser un reemplazo, inserción o eliminación de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación en la posición Q286 puede ser un reemplazo por un aminoácido seleccionado de entre Arg (R) , Lys (K) His (H) , Tyr (Y) , Gly (G), Phe (F), Met (M) , ' lie (I), Leu (L) , Val (V), Pro (P), Glu (E) , Trp (W) , Asp (D) , y Cys (C) . En algunos ejemplos, la modificación es Q286R. La una o más de otras modificaciones se puede seleccionar de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D,
K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, 199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, Kl 97 I 198 insE , K197I198insY, Kl 97 I 198 insA, Kl97I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Intercambio FDC , {Gla Intercambio FDC/E40L } , {Gla Intercambio FIX/K43I}, {Gla Intercambio FIX/Q44S}, {Gla Intercambio FIX/M19K} , {Gla Intercambio FDC/M19K/E40L/K43I/Q44S} , Gla Intercambio FX, Gla Intercambio Prot C, Gla Intercambio Prot S, Gla Intercambio . Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S,
S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF,
H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
T128P134delinsQRLMEDICLPR GCL EDDF,
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, · H115S126delinsIEDICLPR GCLWE,
T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S11 ldelinsDICLPRWGCLWED,
H115S126delinsDICLPRWGCL ED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED,
P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW,
P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED,
S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV,
T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC,
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC , V158T, V158D, L287T, E296V, M298K y M298Q.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados contienen una modificación en una posición correspondiente P54, Q66, L121, A122, P129 o E132 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII. Modificaciones ejemplares incluyen P54S, Q66N, L121S, A122N, P129A y E132S. En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación en una posición correspondiente P54, Q66, L121, A122, P129 o E132 también contienen una o más modificaciones adicionales, incluyendo reemplazos, inserciones o eliminaciones de aminoácidos en otra posición en el polipéptido FVII. Tales modificaciones incluyen P54S, S52N, Y58S, S119N, G124S, T12.8N, T130N, V158D, A175S, S222A, G241S, E296V, M298Q, E394N, P395A, R396S, G318N y Q366V. Así, ejemplos de las modificaciones de combinación en un polipéptido FVII que se proporcionan en la presente son
S119N/L121S, T128N/P129A, A122N/G124S, A122N/G124S/A175S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S,
A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N,
A122N/G124S/E394N/P395A/R396S,
S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S, S119N/L121S/A175S, T128N/P129A/A175S, T130N/E132S, Q66N/Y68S, T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q, T128N/P129A/S222A,
T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V,
T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G12 S/A175S/S222A, T128N/P129A/M298Q' y T128N/P129A/M298Q/H373F.
También se proporcionan en la, presente polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación que corresponde a T239S, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366N, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161V, H216S, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E o H257S en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII. Además, tales polipéptidos FVII modificados también pueden contener una o más modificaciones adicionales en otra posición, tal como la posición de aminoácidos A51, S52, P54, S60, Q56, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, A175, D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, Q286, L287,. R290
A292, A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395 y R396. Modificaciones ejemplares en estas posiciones incluyen Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196 , D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197 , K199A, K199D, K199E, G237 , G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, 341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV,
G237T238insAS, G237T238insSA, DI 96K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K1971198insE, Kl971198insY, K1971198insA, K1971198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, . P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Intercambio FIX, Gla Intercambio FX, Gla Intercambio Prot C, Gla Intercambio Prot S, Gla Intercambio Trombina, Gla Intercambio FIX , {Gla Intercambio FIX/E40L}, (Gla Intercambio FIX/K431}, {Gla Intercambio FIX/Q44S}, {Gla Intercambio FIX/M19K}, {Gla Intercambio
FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} , S52A, S60A, E394N, P395A, R396S,
R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, SI 19N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
T128 P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPR GCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128 P134delinsDICLPRWGCLWED,
P406insIEDICLPRWGCLW, P4 O 6insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPR GCL ED,
S103SllldelinsSFGRGDIRNV, Hll5S126delinsSFGRGDIRNV,
T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC,
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, M298K y M298Q. Las modificaciones de combinación resultantes pueden incluir Q366D/H373E, Q366V/H373V, Q366V/H373L, Q366V/H373I,
S222K/H257A, H216A/S222A, S222S/Gla Intercambio FIX, S222A/H257A/Gla Intercambio FIX, S222A/ 298Q,
S222A/H257A/M298Q, S222A/A292N/A294S/Q366V, A175S/S222A/Q366V, S222A/Q366V, H257S/Q366V, S222A/H373A, M298Q/H373F, S52A/S60A/S222A, S222A/T239V,
V158D/T239V/E296V/M298Q, S222A/T239I, V158D/E296V/ 298Q/H373F, Gla Intercambio FIX/Q366V,
M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F y T239I/M298Q/H373F.
Se proporcionan en la presente polipéptidos FVII
modificados que contienen dos o más modificaciones en un polipéptido FVII, variante de especies y alélicas del mismo o fragmentos activos del mismo, en donde las dos o más modificaciones de aminoácidos son seleccionadas de entre modificaciones de aminoácidos que corresponden a H216A, H257A, E394N, P395A, R396S, K109N, A292N, A175S, H257A y Gla Intercambio FIX. Por ejemplo, polipéptidos FVII modificados aqui proporcionados incluyen aquellas con modificaciones seleccionadas de entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S y K109N/A175S. Además, también se puede incluir una modificación que corresponde a M298Q o A294S. Asi, también se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que contienen modificaciones seleccionadas de entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S y K109N/A175S. En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados también contienen una modificación que corresponde a 298Q o A294S. Esto puede resultar en, por ejemplo, un polipéptido FVII modificado que contiene las modificaciones H257A/M298Q o K109N/A292N/A294S . También se proporcionan polipéptidos FVII modificados que contienen modificaciones que corresponden a
S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q o V158D/T239I/E296V/M298.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados aquí suministrados contienen una secuencia de enlace a la albúmina de suero, tal como una secuencia de aminoácidos
establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 103-109, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a albúmina de suero. Tales polipéptidos FVII modificados pueden mostrar afinidad incrementada para o enlace a albúmina de suero en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace a la albúmina de suero pueden mostrar al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad incrementada para o enlace a enlace para albúmina de suero. La secuencia de enlace a la albúmina de suero puede reemplazar una secuencia contigua de residuos de aminoácidos del polipéptido FVII no modificado. Polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace a la albúmina de suero pueden contener una modificación seleccionada de entre S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hl 15S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPR GCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCL E, S103SllldelinsDICLPRWGCL ED, H115S126delinsDICLPR GCL ED, T128P134delinsDICLPRWGCL ED, P406insIEDICLPRWGCLW, P 06insGGGSIEDICLPRWGCL ,
P406insDICLPRWGCL ED y P406insGGGSDICLPRWGCLWED
Se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace a integrina de plaquetas ???¾ß3. Tales polipéptidos FVII modificados pueden mostrar afinidad incrementada para o enlace a la integrina de plaquetas a?¾ß3 en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace de integrina de plaquetas 0ínbP3 pueden mostrar al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%,. 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, .99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad incrementada para o enlace a la integrina de plaquetas a?¾ß3 en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Ejemplos de secuencia de enlace a la albúmina de suero incluyen aquellas secuencias de aminoácidos establecidas en cualesquiera de SEQ ID NOS: 110-112, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a la integrina de plaquetas ???)ß3, lo cual puede reemplazar una secuencia contigua de residuos de aminoácidos del polipéptido FVII no modificado. Polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación seleccionados de entre S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV,
T127P134delinsSFGRGDIRNV, .. P 06insCSFGRGDIRNVC y
P406.insGGGSCSFGRGDIRNVC.
Los polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace a albúmina de suero o integrina de plaquetas 0????3ß3 también pueden contener una o más modificaciones adicionales en otra . posición en el polipéptido FVII, tal como reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición G237V. Asi también se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación seleccionados de entre
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE/G237V,
S103SllldelinsDICLPRWGCL ED/G237V,
H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V,
H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V,
H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V,
T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF/G237V,
T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V,
S103SllldelinsQRLMEDICLPR GCLWEDDF/G237V y
T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados contienen 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más modificaciones. En ejemplos adicionales, los polipéptidos FVII modificados aquí suministrados contienen un dominio heterólogo Gla, o una porción suficiente de los mismos para efectuar el enlace a^ fosfolípidos . Tales polipéptidos pueden mostrar afinidad incrementada para o enlace a fosfolipidos en
comparación con el polipéptido FVII no modificado, tal como al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%., 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad o enlace creciente para fosfolipidos . El dominio heterólogo Gla puede ser seleccionado de entre un dominio Gla en Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteina C, proteina S, osteocalcina, proteina de matriz Gla, proteina 6 especifica de suspensión del crecimiento (Gas6) y proteina Z y, en algunos ejemplos,, puede tener una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 83-91, 93 y 94, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a fosfolipidos . Todo o una porción contigua del dominio nativo FVII de Gla, que puede incluir aminoácidos 1-45 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3, o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII, se puede remover y reemplazar con el dominio heterólogo Gla, o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace a fosfolipidos .
Polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados pueden mostrar resistencia incrementada a antitrombina III en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Tal polipéptido FVII modificado puede mostrar al menos o alrededor de 1%,. 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistancia a antitrombina III en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados también pueden mostrar actividad coagulante o catalítica creciente en comparación con el polipéptido FVII no modificado, tal como un incremento de al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más en comparación con un polipéptido FVII no modificado. Además, los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados pueden mostrar resistencia incrementada a TFPI en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Tales polipéptidos FVII modificados puede ser al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistentes a TFPI en comparación a un polipéptido FVII no modificado. Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados también pueden mostrar resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede ser al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%,
9%, 10%, 201, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistente a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con polipéptido FVII no modificado.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVIÍ modificados aquí proporcionados contienen una o más modificaciones que introducen y/o eliminan uno o más sitios de glicosilación en comparación con el polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, .5, 6, o más sitios de glicosilación pueden ser introducidos o eliminados. Los sitios de glicosilación que · pueden ser introducidos o eliminados incluyen sitios de N-glicosilación y sitios de 0-glicosilación . Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados pueden contener ' una o más modificaciones adicionales de aminoácidos que incrementen la resistencia a antitrombina-III, incrementen el enlace y/o afinidad a fosfolipidos , incrementen la afinidad para el factor de tejido, incrementen la actividad intrínseca, incrementen la actividad dependiente . de TF, incrementen la actividad coagulante, alteren la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, incrementen la actividad coagulante o catalítica al cambiar el equilibrio entre conformaciones altamente activas y menos activas de FVIIa a favor de las conformaciones altamente activas, ' incremente la resistencia a
las proteasas, disminuyan la glicosilación, incrementen la glicosilación, reduzcan la inmunogenicidad, incrementen la estabilidad, y/o faciliten la ligadura de grupos químicos. En algunos ejemplos, la zimogenicidad alterada confiere una forma más del tipo zimógeno o una forma menos del ' tipo zimógeno.
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados contienen una o más modificaciones adicionales de aminoácidos seleccionadas de entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, , S282C/V299C, inserción de una tirosina en la posición. , F4S, F4T , P10Q, P10E, P10D, PION, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, 41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D,
N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T,
N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W,
N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W,
K157P, 157G, K157S., K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E,
K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F,
V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N,
V158E, V158R, V158K, . V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T,
G179N, 1186S5 1186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T,
D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N,
E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D,
A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C,
A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N,
F278S, F278A. F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C,
L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S,
R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N,
G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L,
E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T,
E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, 298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G,
M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H,
M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M,
R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I,
L305F, L305A, L305M, -L305W, L305P, L305G, L305S, L305T,
L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q,
M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E,
S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314 , S314P, S314G,
S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R,
S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T,
R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C,
V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M,
N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H,
N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A,
Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I,
D334M, D334F, D334 , D334P, D3.34L, D334T, D334C, D334Y,
D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E,
S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L,
S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D,
S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P,
K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R,
K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A,
K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A,
F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T,
F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D,
F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D,
M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D,
S393C, S393K, S393E, E394 , P395K, E394C, P395D, P395C,
P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C,
P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K,
V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, 38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T,
E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T,
I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T,
A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T,
R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T,
L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T,
A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T,
R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T,
Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T,
V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T,
S339N/ 341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T,
R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T,
K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T,
E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T,
R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T,
G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T,
L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T,
R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T,
P404N/P406S y P404N/P406T. En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados también contienen una sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312, o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, o sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
Ejemplos de polipéptidos FVII modificados que se proporcionan en la presente son aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 113-273. En algunos ejemplos, las modificaciones se hacen en un polipéptido FVII no modificado que es una variante alélica o de especies del polipéptido establecido en SEQ ID NO: 3. La variante alélica o de especies u otra variante puede tener 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencias con el polipéptido establecido en SEQ ID NO: 3, excluyendo las modificaciones de aminoácidos. El polipéptido FVII modificado aquí proporcionado puede ser un polipéptido humano, un polipéptido no humano y/o un polipéptido maduro. En algunos ejemplos, solamente se modifica la secuencia primaria. En otros ejemplos, una modificación, química o una modificación post-traduccional también se incluye. Por ejemplo, el
polipéptido FVII modificado puede ser glicosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado, o conjugado con una porción de polietilenglicol (PEG).
Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados pueden ser polipéptidos de cadena sencilla, polipéptidos de dos cadenas y/o activos o .activados. La activación puede ser efectuada oir la escisión proteolítica por autoactivación, escisión por Factor IX (FlXa), escisión por Factor X (FXa), escisión por Factor XII (FXIIa), o escisión por trombina.
Los polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados can retener una o más actividades del polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos FVII modificados pueden contener modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos con tal de que el polipéptido retenga al menos una actividad FVII del polipéptido FVII no modificado. Tales polipéptidos FVII modificados pueden retener al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de una actividad del polipéptido FVII no modificado. En algunos ejemplos, una o más actividades son seleccionadas de entre enlace al factor de tejido (TF) , activación por factor X (FX), activación por Factor IX (FIX), enlace a fosfolipidos , y actividad de coagulación. Además, las actividades que se
retienen se pueden aumentar o disminuir en comparación con el polipéptido FVII no modificado. En algunos ejemplos, la actividad de coagulación se incrementa en comparación con el polipéptido FVII no modificado, tal como al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado. Las actividades se pueden medir in vitro, ex vivo o in vivo.
Se proporcionan en la presente moléculas de ácidos nucleicos que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos FVII modificados aquí proporcionados. También se proporcionan vectores que contienen tales moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo vectores procarióticos, vectores virales, o vectores eucarióticos , tales como un vector de mamíferos. Los vectores virales pueden ser seleccionados de entre un adenovirus, un virus asociado con adeno, un rétrovirus, un virus de herpes, un lentivirus, un virus de viruela, y un citomegalovirus . Se proporcionan en la presente células que contienen estos vectores, incluyendo células eucarióticas , tales como células de mamíferos. Ejemplos de las células de mamíferos con las células de riñon de hámster recién nacido (BHK-21) o células 293 cells o células CHO. En algünos ejemplos, las células
expresa el polipéptido FVII modificado. Asi, también se proporcionan en la presente polipéptidos FVII modificados que se producen por estas células.
Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que contienen una concentración o cantidad terapéuticamente efectiva de cualquier polipéptido FVII modificado, molécula de ácido nucleico, vector o célula aquí proporcionados en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se formula para administración local, s'istémica, o tópica, tal como administración oral, nasal, pulmonar bucal, transdérmica , subcutánea, intraduodenal , enteral, parenteral, intravenosa, o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas también se pueden formular para administración por dosificación sencilla y/o liberación controlada.
Se proporcionan en la presente métodos de tratamiento de un sujeto por la administración de una composición farmacéutica aquí, proporcionada, en donde el sujeto tiene una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante, tal como por al administración de FVII activo (FVIIa). En algunos ejemplos, el tratamiento con la composición farmacéutica aminora o alivia los síntomas asociados con la enfermedad ?· afección. En ejemplos adicionales, los métodos aquí proporcionados también incluyen
el monitoreo del sujeto para cambios en los síntomas asociados con la enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. La enfermedad o afección a tratarse al usar los métodos aquí proporcionados puede ser seleccionada de entre trastornos de coagulación sanguínea, trastornos hematológicos , trastornos de sangrado, hemofilia (tal como es la hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C, hemofilia congénita o adquirida) , deficiencia del factor VII y trastornos de sangrado, incluyendo complicación por sangrado debida a cirugía (tal como cirugía del corazón, angioplastia , cirugía de pulmón, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental, o cirugía para transplante de órganos) o trauma. En algunos ejemplos, el sangrado se manifiesta como hemartrosis agudas, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales, o hemorragia cerebral. En ejemplos adicionales, el sangrado se debe a extracción dental. La cirugía de transplante puede ser seleccionada de entre transplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas, e hígado.
En algunos ejemplos, el método aquí proporcionado puede ser usado para tratar un sujeto que tiene autoanticuerpos para el factor. VIII o factor IX. Los métodos aquí
proporcionados también pueden incluir administrar uno o más factores de coagulación adicionales, tal como factores de coagulación recombinantes o purificados de plasma, procoagulantes, tal como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteina C, plasma, plaquetas, células de glóbulos rojos y corticosteroides , o tratamientos..
Se proporcionan en la presente artículos de manufactura que contienen material de empaque y una composición farmacéutica aquí proporcionada contenida dentro del material de empaque. En algunos ejemplos, el polipéptido FVII modificado en la composición farmacéutica es efectivo para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por FVII, y el material de empaque incluye una etiqueta que indica que el polipéptido FVII modificado es usado para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por FVII. También se proporcionan en la presente kits, que comprenden una composición farmacéutica aquí descrita, un dispositivo para la administración de la composición y, opcionalmente , instrucciones para la administración.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 detalla la cascada de coagulación. La figura muestra la trayectoria intrínseca y la trayectoria
extrínseca de la coagulación para la producción independiente de FXa, y la convergencia de las trayectorias a una trayectoria común para generar trombina y fibrina para la formación de un coágulo. Estas trayectorias están interconectadas . La figura detalla el orden de las moléculas involucradas en la cascada de activación en la cual un zimógeno se convierte a una proteasa activada por escisión de uno o más enlaces péptidos. La proteasa activada luego sirve como la proteasa de activación para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, lo que resulta finalmente en la formación de coágulo.
La Figura 2 detalla el modelo de coagulación basado en la célula (ver por ejemplo Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965). La figura detalla los eventos de coagulación cuando se separan en tres fases, donde el inicio de la coagulación se efectúa por la activación de FX a FXa por el complejo TF/FVIIa sobre la célula que lleva TF, lo que resulta en la generación de una cantidad pequeña de trombina después de la activación por FXa/FVa. La amplificación tiene lugar cuando la trombina se enlaza a y active las plaquetas, e inicia la activación de cantidades suficientes de los factores de coagulación apropiados para formar los complejos de FVIIIa/FIXa y FVa/FXa. La propagación de la coagulación sucede sobre la superficie de
grandes números de plaquetas activadas en el sitio de la lesión, lo que resulta en un estallido de generación de trombina que es suficientemente grande para generar ;suficiente fibrina a partir del fibrinógeno para establecer un coágulo en el sitio de la lesión.
La Figura 3 detalla los mecanismos por los cuales FVIIa puede iniciar la formación de trombina. La figura ilustra la trayectoria dependiente de la generación de trombina de FVIIa FVIIa, la cual actúa en la superficie de la célula que transporta TF e involucra la formación de complejos de FVIIa con TF previo a la activación de FX a FXa . La figura también detalla la trayectoria independiente de TF de la generación de trombina de FVIIa, durante la cual FVIIa se enlaza, a fosfolipidos sobre la . plaqueta activada y activa FX a FXa, lo cual a su vez forma complejos con FVa para escindir la protrombina en trombina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Introducción
A. Definiciones
B. Descripción General de la Hemostasis
1. Adhesión y agregación de plaquetas
2. Cascada de coagulación
a. Inicio
b. Amplificación
c. Propagación
3. Regulación de la Coagulación
C. Factor VII (FVII)
1. Estructura y organización de FVII
2. Modificaciones post-traduccionales
3. Procesamiento de FVII
4. Activación de FVII
5. Función de FVII
a. Actividad de FVIIa dependiente del factor de tejido
b. Actividad de FVIIa independiente del factor de tej ido
6. FVII como biofarmacéutico
D. Polipéptidos FVII modificados
1. Actividad catalítica aumentada
a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica
i. Sustituciones básicas de aminoácidos en la posición 286.
ii. Otras mutaciones en la posición 286
2. Resistencia incrementada a AT-III
Modificaciones ejemplares para efectuar resistencia incrementada a AT-III
3. Resistencia incrementada a inhibición por Zn2+
Modificaciones ejemplares para incrementar la resistencia a la inhibición por Zn2+
4. Glicosilacion alterada
Modificaciones ejemplares para alterar la glicosilacion
5. Enlace aumentado para albúmina de suero y/o integrina de plaquetas anb 3
a. Polipéptidos FVII ejemplares con secuencias de enlace a la albúmina de suero
b. Polipéptidos FVII ejemplares con secuencias de enlace a integrina de plaquetas 0ínb|¾3
6. Modificación por la introducción de un dominio heterólogo Gla
7. Combinaciones y Modificaciones Adicionales
a. Modificaciones que incrementan la resistencia a
TFPI
b. Modificaciones que incrementan la actividad intrínseca
c. Modificaciones que incrementan la resistencia a proteasas
d. Modificaciones que incrementan la afinidad para fosfolípidos
e. Modificaciones que alteran la glicosilacion f. Modificaciones para facilitar la ligadura de
grupos químicos
g. Mutaciones ejemplares de combinación
E. Producción de los polipéptidos FVII
1. Vectores y células
2. Sistemas de expresión
a. Expresión procariótica
b. Levaduras
c. Insectos y células de insectos
d. Células mamíferas
e. Plantas
2. Purificación
3. Proteínas de fusión
4. Modificaciones de polipéptidos
5. Secuencias de nucleótidos
F. Evaluación de las actividades del polipéptido FVII modificado
1. Ensayos in vitro
a. Modificación post-traduccional
b. Actividad proteolítica
c. Actividad de coagulación
d. Enlace a y/o inhibición por otras proteínas e. Enlace a fosfolípidos
2. Modelos animales no humanos
3. Ensayos clínicos
G. Formulación y administración
1. Formulaciones
a. Dosificaciones
b. Formas de dosificación
2. Administración de polipéptidos FVII modificados
3. Administración de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos FVII modificados (terapia génica)
H. Usos Terapéuticos
1. Trastornos de sangrado congénitos
a. Hemofilia
b. Deficiencia por FVII
c. Otros
2. Trastornos de sangrado adquiridos
a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia b. Otras coagulopatias
c. Sangrado adquirido por transplantes
d. Sangrado inducido por terapias anticoagulantes e. Hemofilia adquirida
3. Trauma y sangrado quirúrgico
I. Terapias de Combinación
J. Artículos de manufactura y kits
K. Ejemplos
A. Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente¦ por alguien experto en la técnica a quien pertenece la invención (es ) . Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias del Genbank, bases de datos, sitios web y otros materials publicados referidos a lo largo de la descripción complete en la presente, a menos que se señale de otra manera, se incorporan como referencia en su totalidad. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos en la presente, prevalecerán aquellos en esta sección. Donde se haga referencia a un URL u otro de tal identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y que puede ir y venir la información en la internet, pero se puede encontrar información equivalente al buscar en internet. La referencia a ello hace evidente la disponibilidad y diseminación pública de tal información.
Como se usa en este documento, trayectoria de coagulación o cascada de coagulación se refiere a la serie de eventos de activación que conduce a la formación de un coágulo de fibrina insoluble. En la trayectoria o cascada de coagulación, una proteína inactiva de una serina proteasa (también llamada', un zimógeno) se convierte a una proteasa
activa por escisión de uno o más enlaces de péptidos, lo cual luego sirve como la proteasa activante para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada. En la etapa final proteolitica de la cascada, el fibrinógeno se escinde proteoliticamente por la trombina a la fibrina, el cual luego se retícula en el sitio de la lesión para formar un coágulo.
Como se usa en este documento, "hemostasis" se refiere a la supresión del sangrado o flujo sanguíneo en un órgano o parte del cuerpo. El término hemostasis puede abarcar el proceso completo de coagulación sanguínea para evitar la pérdida de sangre que sigue a la lesión de los vasos sanguíneos hasta la disolución posterior del coágulo sanguíneo que sigue a la reparación del tejido.
Como se usa en este documento, "formación de coágulos" o "coagulación" se refiere a la formación de un coágulo insoluble de fibrina, o al proceso por el cual los factores de coagulación de la sangre interactúan en la cascada de coagulación, lo que resulta finalmente en la formación de un coágulo insoluble de fibrina.
Como se usa en este documento, una "proteasa" es una enzima que . cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes. Estas designaciones incluyen formas de zimógeno y formas activadas de cadena sencilla, de dos, o múltiples de las mismas. Por cuestión de claridad, la referencia a las
proteasas se refiere a todas las formas. Proteasas incluyen, por ejemplo, serina . proteasas , cisteina proteasas, aspartico proteasas, treonina y metalo-proteasas dependiendo de la actividad catalítica de su sitio activo y mecanismo de escisión de los enlaces péptidos de un sustrato objetivo.
Como se usan en la presente, serina proteasas o serina endopeptidasas se refiere a una clase de peptidasas, las cuales se caracterizan por la presencia de un residuo de serina en el sitio activo de la enzima. Las serina proteasas participant en un amplio rango de funciones en el cuerpo, incluyendo la coagulación sanguínea y la inflamación, así como el funcionamiento como enzimas digestivas en procariotas y eucariotas. El mecanismo de escisión por serina proteasas se basa en el ataque nucleofílico de un enlace peptídico atacado por una serina. Cisteina, treonina o moléculas de agua asociadas con aspartato o metales también pueden jugar este rol. Las cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato forman una triada catalítica común a la mayoría de las serina proteasas. El sitio activo de serina proteasas se forma- como una hendidura donde se enlaza el sustrato del polipéptido.
Como se usan en la presente, Factor VII (FVII, F7 ; también referido como como Factor 7, factor VII de coagulación, factor VII de suero, acelerador de la conversión
de protrombina en suero, SPCA, proconvertina y eptacog alfa) se refiere a una serina proteasa que es parte de la cascada de coagulación. FVII incluye un dominio Gla, dos dominios EGF (EGF-1 y EGF-2) , y un dominio de serina proteasa (o dominio de peptidasa SI) que está altamente conservado entre todos los miembros de la familia de la peptidasa SI de serina proteasas, tal como por ejemplo con quimiotripsina . La secuencia de un precursor ejemplar FVII que tiene un péptido de señal y propéptido está establecida en SEQ ID NO: 1. Un polipéptido maduro FVII ejemplar está establecido en SEQ ID NO: 3. FVII se presenta como un zimógeno de cadena sencilla, un polipéptido de dos cadenas tipo zimógeno y una forma completamente activada de dos cadenas. La activación complete, que se presenta con el cambio conformacional de una forma tipo zimógeno, sucede con el enlace a su factor de tejido de co-factor. También, se pueden introducir mutaciones que resulten en el cambio de conformación en la ausencia del factor de tejidos. Asi, la referencia a FVII incluye formas de cadena sencilla y de dos cadenas del mismo, incluyendo formas de tipo zimógeno' y de dos cadenas completamente activadas.
La referencia al polipéptido FVII también incluye polipéptidos precursores y polipéptidos maduros FVII en formas de cadena sencilla o dos cadenas, formas truncadas de
los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especies, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencias al polipéptido precursor establecido en SEQ ID NO: 1 o la forma madura del mismo. Se incluyen polipéptidos FVII modificados, tal como aquellos de SEQ ID NOS: 113 y 273 y variantes de los mismos. También se incluyen aquellos que conservan al menos una actividad de un FVII, tal como enlace a TF, enlace a factor X, enlace . a fosfolipidos , y/o actividad coaqulante de un FVII. Al retener la actividad, la actividad puede ser alterada, tal como reducida o incrementada, como en comparación con un FVII de tipo silvestre con tal de que el nivel de actividad retenido sea suficiente para producir un efecto detectable. Los polipéptidos FVII incluyen, pero no se limitan a, isoformas especificas de tejidos y variantes alélicas de los mismos, moléculas sintéticas preparadas por la traducción de ácidos nucleicos, proteínas generadas por síntesis química, tales como síntesis que incluyen ligamiento de polipéptidos más cortos, a través de métodos recombinantes, proteínas aisladas de tejido y células humanas y no humanas, polipéptidos quiméricos FVII y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos FVII también
incluyen fragmentos o porciones de FVII que tienen una longitud suficiente o que incluyen regiones apropiadas para retener al menos una actividad (con activación si es necesario) de un polipéptido maduro de longitud completa. Los polipéptidos FVII también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o post-traduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o post-traduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.
Los polipéptidos FVII ejemplares son aquellos de origen mamífero, incluyendo humanos. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de.FVII de origen humano están establecidas en SEQ ID NOS: 1, 2, y 3. Las variantes ejemplares de tal FVII polipéptido humano, que incluye cualquiera de los polipéptidos precursores establecidos en SEQ ID NOS: 18-74. Los polipéptidos FVII también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, equino, piscino, ranino, y otros polipéptidos de factor VII del primate. Los polipéptidos FVII ejemplares de origen no humano incluyen, por ejemplo, vaca (Sos taurus, SEQ ID NO: 4), ratón (Mus musculus, SEQ ID NO:5), chimpancé pigmeo (Pan paniscus,
SEQ ID N0:6), chimpancé {Pan troglodytes, SEQ ID N0:7), conejo {Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO: 8), rat (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), mono rhesus {Macaca mulatto, SEQ ID NO: 10), cerdo (Sus scrofa, SEQ ID NO: 11), dog (Canis familiaris, SEQ ID NO: 12), pez cebra (Brachydanio rerío, SEQ ID NO: 13), pez globo japonés (Fugu rubripes, SEQ ID NO: 14), pollo (Gallus gallus, SEQ ID NO: 15), orangután {Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) y gorila {Gorilla gorilla, SEQ ID NO: 17) .
Alguien experto en la técnica reconoce que las posiciones referidas del polipéptido maduro del factor VII (SEQ ID NO: 3) difiere por 60 residuos de aminoácidos cuando en comparación con la isoforma un polipéptido precursor FVII establecido en SEQ ID NO: 1, que es la isoforma de un polipéptido del factor VII que contiene las secuencias del péptido de señal y propéptidos. Asi, el primer residuo de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 "corresponde a" el sexagésimo primer (61o.) residuo de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Alguien experto en la técnica también reconoce que las posiciones referidas del polipéptido maduro del factor VII (SEQ ID NO: 3) difiere por 38 residuos de aminoácidos cuando en comparación con el polipéptido precursor FVII establecido en SEQ ID NO: 2, que es el polipéptido de factor VII de la isoforma b que contiene las secuencias del péptido de señal y
de propéptidos. Asi, el primer residuo de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 "corresponde a" el trigésimo noveno (39o.) residuo de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Como se usa en este documento, residuos correspondientes se refieren a residuos que se presentan en los lugares alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean por cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica. Tales métodos típicamente maximizan las coincidencias, e incluyen métodos tales como el uso de alineaciones manuales y el uso de diversos programas de alineación disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica. Al alinear las secuencias de polipéptidos, alguien experto en la técnica puede identificar los residuos correspondientes, al usar residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por ejemplo, al alinear las secuencias de los polipéptidos del factor VII, alguien experto en la técnica puede identificar residuos correspondientes, usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por ejemplo, la alanina en la posición de aminoácido 1 (Al) de SEQ ID NO: 3 (factor VII maduro) corresponde a la alanina en la posición de aminoácido 61 (A61) de SEQ ID NO:l, y la alanina en la posición de aminoácido 39 (A39) de SEQ ID NO: 2. En otros casos, pueden identificarse las regiones que corresponden.
Por ejemplo, el dominio Gla corresponde a posiciones de aminoácidos Al a la F45 de SEQ ID NO: 3, a posiciones de aminoácidos A61 a la S105 de SEQ ID NO:l y a posiciones de aminoácidos A39 a S83 de SEQ ID N0:2. Alguien experto en la técnica también puede emplear residuos de aminoácidos conservados como guia para encontrar residuos correspondientes de aminoácidos entre las secuencias dos o más humanas y no humanas. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos S43 y E163 de SEQ ID NO: 3 (humana) corresponden a S83 y E203 de : SEQ ID NO: 4 (bovino) . Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineaciones estructurales, por ejemplo al usar . alineaciones simuladas por computadora de la estructura de proteínas. En otros casos, se pueden identificar las regiones correspondientes.
Como se usa en este documento, una "proregión, "
"propéptido, " o "pro secuencia, " se refiere a una región o un segmento que se escinde para producir una proteína madura. Esto puede incluir segmentos que funcionan para suprimir la actividad proteolítica al ocultar la maquinaria catalítica y evitar así la formación del intermediario catalítico (es decir, al obstruir esféricamente el sitio de enlace al sustrato). Una proregión es una secuencia de . aminoácidos posicionada en la terminación amino de un polipéptido maduro biológicamente activo u puede ser tan pequeña como unos
cuantos aminoácidos o puede ser una estructura de multidominios .
Como se usa en este documento, "factor VII maduro" se refiere a un polipéptido FVII que carece de una secuencia de señal y una secuencia de propéptido. Típicamente, una secuencia de señal ataca una proteína por secreción por medio de la trayectoria retículo endoplásmico (ER)-golgi y se escinde después de la inserción dentro de ER durante la traducción. Una secuencia de propéptido típicamente funciona en modificación post-traduccional de la proteína y se escinde previo a la secreción de la proteína desde la célula. Así, un polipéptido maduro FVII es típicamente una proteína secretada. En un ejemplo, un polipéptido FVII maduro humano es establecido en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 difiere de aquella de los polipéptidos precursores establecidos en SEQ ID NOS : 1 y 2 en que SEQ ID NO: 3 carece de la secuencia de señal/ la. cual corresponde a residuos de aminoácidos 1-20 de SEQ ID NOS : 1 y 2; y también carece de la secuencia de propéptido, la cual corresponde a los residuos de aminoácidos 21-60 de SEQ ID NO:l y los residuos de aminoácidos 21-38 de SEQ ID NO: 2. La referencia a un polipéptido maduro FVII abarca la forma de zimógeno de cadena sencilla y la forma de dos cadenas.
Como se usa en este documento, "tipo silvestre " o
"nativo" con referencia a FVII se refiere a un polipéptido FVII codificado por un gen FVII nativo o que se presenta naturalmente, incluyendo variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo un humano y otros animales, en la naturaleza. La referencia al factor VII de tipo silvestre sin referencia a una especie se pretende que abarque cualquier especie de un factor VII de tipo silvestre. Se incluyen entre los polipéptidos FVII de tipo Silvestre el polipéptido precursor codificado, fragmentos del mismo, y formas procesadas del mismo, tal como una forma madura que carece del péptido de señal asi como algunas formas pre- o post-traduccionalmente procesadas o modificadas del mismo. También se incluyen entre los polipéptidos FVII nativos aquellos que se modifican post-traduccionalmente, incluyendo, ¦ pero no limitado a, modificación por glicosilación, carboxilación y hidroxilación . Los polipéptidos FVII nativos , también incluyen formas de cadena sencilla y de dos cadenas. Por ejemplo, los humanos expresan el FVII nativo. La secuencia de aminoácidos de FVII humano ejemplar de tipo silvestre está establecida en SEQ ID NOS: 1, 2, 3 y variantes alélicas establecidas en SEQ ID NOS: 4-100 y las formas maduras de las mismas. Otros animales producen FVII nativo, incluyendo, pero no limitado a, vaca (Sos Taurus, SEQ ID N0:4), ratón {Mus musculus, SEQ ID NO: 5), chimpancé pigmeo
(Pan paniscus, SEQ ID NO: 6), chimpancé (Pan troglodytes, SEQ ID NO: ), conejo (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID N0:8), rat (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), mono rhesus {Macaca mulatta, SEQ ID NO: 10), cerdo (Sus scrofa, SEQ ID NO:ll), dog (Canis familiaris, SEQ ID NO: 12), pez cebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO: 13) pez globo japonés (Fugu rubripes, SEQ ID NO: 14), pollo (Gallus gallus, SEQ ID NO: 15), orangután (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) y gorilla (Gorilla gorilla, SEQ ID NO: 17) .
Como se usa en este documento, las variantes de especie se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamíferos, tal como ratón y humano.
Como se usa en este documento, variantes alélicas se refiere a variaciones en las proteínas entre miembros de la misma especie. Como se usa en este documento, una variante de empalme se refiere a una variante producida por procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que resulta en más de un tipo de mRNA.
Como se usa en este documento, un zimógeno se refiere a una proteasa que se activa por escisión proteolítica, incluyendo escisión por maduración, tal como escisión por activación, y/o formación de complejos con otra(s) proteína (s) y/o cofactor (es ) . Un zimógeno es un precursor
inactivo de una enzima proteolítica . Tales precursores son generalmente más grandes, aunque no necesariamente más grandes, que la forma activa. Con referencia a las serina proteasas, los zimógenos se convierten en enzimas activas por escisión especifica, incluyendo escisión catalítica o autocatalítica , o por enlace de un co-factor de activación, el cual genera una enzima activa. Por ejemplo, generalmente los zimógenos están presentes en una forma de cadena sencilla. Los zimógenos generalmente están inactivos y pueden ser convertidos a polipéptidos activos maduros por escisión catalítica o autocatalítica en uno o más sitios proteolíticos, para generar una cadena múltiple tal como un polipéptido de dos cadenas. Un zimógeno así, es una proteína enzimáticamente inactiva que se convierte a una enzima proteolítica por la acción de un activador. La escisión puede ser efectuada por autoactivación . Diversas proteínas de coagulación son zimógenos; son inactivas, pero se escinden y se activan con el inicio del sistema de coagulación que sigue al daño vascular. Con referencia a FVII, los polipéptidos FVII existen en el plasma sanguíneo como zimógenos hasta la escisión por aproteasas, tal como por ejemplo, factor IX activado (FlXa), factor X activado (FXa), factor XII activado (FXIIa), trombina, o por autoactivación para producir una forma de dos cadenas tipo zimógeno, la cual luego requiere de
cambio de conformación adicional para plena actividad.
Como se usa en este documento, una proteina o polipéptido "tipo zimógeno" se refiere a una proteina que ha sido activada por la escisión proteolitica, pero que todavía muestra propiedades 'que se asocian con un zimógeno, tal como, por ejemplo, poca o ninguna actividad, o una conformación que se asemeje a la conformación de la forma de zimógeno de la proteína. Por ejemplo, cuando no se enlaza a un factor de tejido, la forma activada de dos cadenas de FVII es una proteína tipo zimógeno; retiene una conformación similar a un zimógeno no escindido FVII, y así, muestra muy baja actividad. Al enlazarse a un factor de tejido, la forma activada de dos cadenas de FVII se somete a un cambio conformaiconal y adquiere su actividad plena como un factor de coagulación.
Como se usa en este documento, una secuencia de activación se refiere a una secuencia de aminoácidos en un zimógeno que es el sitio requerido para escisión por activación o escisión por maduración para formar una proteasa activa. La escisión de una secuencia de activación se puede catalizar autocatalíticamente o por compañeros de activación.
Como se usa en este documento, escisión por activación es un tipo de escisión por maduración, el cual induce a un cambio por conformación que se requiere para el desarrollo de
la actividad enzimática completa. Esto es una trayectoria clásica de activación, por ejemplo, para serina proteasas en la cual una escisión genera un nuevo término en N que interactúa con las regiones conservadas de la proteasa, tal como Asp 194 en la quimiotripsina, para inducir cambios conformacionales requeridos para actividad. La activación puede resultar en la producción de formas de cadena múltiple de las proteasas. En algunos casos, las formas de cadena sencilla de la proteasa pueden mostrar actividad proteolitica.
Como se usa en este documento, "Factor VII activado" o "FVIIa" se refiere a cualquier forma de dos cadenas de un polipéptido FVII. Una forma de dos cadenas típicamente resulta de la escisión proteolitica, pero puede ser producida sintéticamente. El Factor- VII activado, incluye así la forma de dos cadenas tipo zimógeno con baja actividad coagulante, una forma completamente activada (alrededor de 1000 veces más actividad) que se presenta con el enlace a factor de tejidos, y formas mutadas que existen en una forma de dos cadenas completamente activadas o que se someten a un cambio por conformación a una forma completamente activada. Por ejemplo, una forma de cadena sencilla del polipéptido FVII (ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 3) se escinde proteolíticamente entre los residuos de aminoácidos R152 e 1153 del polipéptido maduro
FVII. Los productos de escisión, cadena pesada de FVII y cadena ligera de FVII, que se mantienen juntos por un- enlace disulfuro (entre los residuos de aminoácidos C135 y C262 en el FVII de SEQ ID NO: 3), forman la enzima activadas de dos cadenas FVII. La escisión proteolitica puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por el factor IX activado (FlXa), factor X activado (FXa), factor XII activado (FXIIa), trombina, o por autoactivación .
Como se usa en este documento, una "propiedad" de un polipéptido FVII se refiere a una propiedad física o estructural property, tal como estructura tridimensional, pi, vida media, conformación y otras de tales características físicas .
Como se usa en este documento, una "actividad" de un polipéptido FVII se refiere a cualquier actividad mostrada por un polipéptido de factor VII. Tales actividades se pueden probar in vitro y/o in vivo e incluyen, pero no se limitan a, coagulación o actividad coagulante, actividad pro-coagulante, actividad catalítica o proteolitica tal como efectuar la activación de factor X (FX) o la activación del Factor IX (FIX) ; antigenicidad (capacidad para enlazar a o competir con un polipéptido para enlace a un anticuerpo anti-FVII); capacidad de enlazar al factor de tejido, factor X o factor IX; y/o capacidad para enlazar a fosfolípidos . La actividad
puede ser evaluada in vitro o in vivo usando ensayos reconocidos, por ejemplo, al medir la coagulación in vitro o in vivo. Los resultados de tales ensayos indican que un polipéptido muestra una actividad que puede ser correlacionada con la actividad del polipéptido in- vivo, en la cual la actividad in vivo puede ser referida como actividad biológica. Los ensayos para determinar la funcionalidad o actividad de formas modificadas de FVII se conocen por aquellos expertos en la técnica. Los ensayos ejemplares para evaluar la actividad de un polipéptido FVII incluyen ensayo de tiempo de protromboplastina (PT) ó el ensayo de tiempo de protromboplastina parcial activado (aPTT) para evaluar la actividad coagulante, o ensayos cromogénicos al usar sustratos sintéticos, tales como los descritos en los Ejemplos a continuación, para evaluar la actividad catalítica o proteolítica .
Como se usa en este documento, "muestra al menos una actividad" o "retiene al menos una actividad" se refiere a la actividad mostrada por un polipéptido FVII modificado cuando en comparación con un polipéptido FVII no modificado de la misma forma y bajo las mismas condiciones. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado en una forma de dos cadenas se compara con un polipéptido FVII no modificado en una forma de dos cadenas, bajo las mismas condiciones experimentales, en
donde la única diferencia entre los dos polipéptidos es la modificación bajo estudio. En otro ejemplo, un polipéptido FVII modificado en una forma de cadena sencilla es en comparación con un polipéptido FVII no modificado en una forma de cadena sencilla, bajo las mismas condiciones experimentales, donde la única diferencia entre los dos polipéptidos es la modificación bajo estudio. Típicamente, un polipéptido FVII modificado que retiene o muestra al menos una actividad de un polipéptido FVII no modificado de la misma forma retiene una cantidad suficiente de la actividad tal que, cuando se administra in vivo, el polipéptido FVII modificado es terapéuticamente efectivo como un terapéutico procoagulante. Generalmente, para que un polipéptido FVII modificado retenga eficacia terapéutica como un procoagulante, la cantidad de actividad que se retiene está o es alrededor de 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%,. 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad de un polipéptido FVII no modificado de la misma forma que despliega eficacia terapéutica como un procoagulante. La cantidad de actividad que se require para mantener eficacia terapéutica como un procoagulante puede ser determinada empíricamente, si es necesario. Típicamente, la retención de 0.5% a 20%, 0.5% a 10%, 0.5% a 5% de una
actividad es suficiente para retener la eficacia terapéutica como un procoagulante in vivo.
Se entiende que la actividad que se muestra o conserva por un polipéptido FVII modificado puede ser cualquier actividad, incluyendo, pero no limitado a, coagulación o actividad coagulante, actividad pro-coagulante; actividad proteolitica o catalítica tal como para efectuar la activación del factor X o la activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para enlazar a o competir con un polipéptido para enlace a un anticuerpo anti-FVII); capacidad de enlace a un factor de tejido, factor X o factor IX; y/o capacidad para enlazar a fosfolípidos . En algunas instancias, un polipéptido FVII modificado puede retener una actividad que se incrementa en comparación con un polipéptido FVII no modificado. En algunos casos, un polipéptido FVII modificado puede conservar una. actividad que se disminuye en comparación con un polipéptido FVII no modificado. La actividad de un polipéptido FVII modificado puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado, en donde ambos polipéptidos están en la misma forma, incluyendo pero no limitado a, 1% de la actividad, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más actividad en comparación con. . el polipéptido que no contiene la
modificación en cuestión. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede mostrar actividad aumentada o disminuida en comparación con el polipéptido FVII no modificado de la misma manera. Por ejemplo, puede retener al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% de la actividad del polipéptido FVII no modificado. En otras modalidades, el cambio en actividad es al menos alrededor de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, o más veces mayor que el FVII no modificado. El nivel particular a retenerse es una función del uso pretendido del polipéptido y puede determinarse empíricamente. La actividad puede medirse, por ejemplo, al usar ensayos in vitro o in vivo tal como aquellos descritos en la presente o en los Ejemplos a continuación.
Como se usa en este documento, "actividad de coagulación" o "actividad coagulante" o "actividad procoagulante" se refiere a la capacidad de un polipéptido para efectuar la coagulación. Los ensayos para evaluar la actividad coagulante se conocen por aquellos expertos en la técnica, e incluyen el ensayo de tiempo de protromboplastina
(PT) o el ensayo de tiempo parcial activado de tromboplastina (aPTT) .
Como se usa en este documento, "actividad catalítica" o "actividad proteolítica" con referencia a FVII se refiere a la capacidad de una proteína FVII para catalizar la escisión proteolítica de un sustrato, y se usan de forma intercambiable. Los ensayos para evaluar tales actividades se conocen en la técnica. Por ejemplo, la actividad proteolítica de FVII se puede, medir al usar sustratos cromogénicos tales como Spectrozyme FVIIa (CHsSCk-D-CHA-But-Arg- pNA) , en donde la escisión del sustrato se monitorea por la absorbancia y la velocidad de hidrólisis del sustrato determinada por regresión lineal.
Como se usa en este documento, "actividad intrínseca" con referencia a FVII se refiere a la actividad catalítica, proteolítica, y/o coagulante de una proteína FVII en la ausencia del factor de tejido.
Como se usa en este documento, dominio (típicamente una secuencia de tres o . más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos) se refiere a una porción de una molécula, tal como proteínas o los ácidos nucleicos gue codifican, que son estructuralmente y/o funcionalmente distintos de otras porciones de la molécula y es identificable . Por ejemplo, los dominios incluyen aquellas porciones de una cadena de
polipéptido que puede ' formar una estructura plegada independientemente dentro de una proteina constituida de una o más porciones estructurales y/o que se reconoce en virtud de una actividad funcional, tal como actividad proteolitica . Una proteina puede tener uno, o más de un dominio diferente. Por ejemplo, un dominio se puede identificar, definir o distinguir por homología de la secuencia en ello a miembros relacionados de la familia, tales como homología a porciones que definen un dominio de proteasa o un dominio gla. En otro ejemplo, un dominio se puede distinguir, por su función, tal como por la actividad proteolitica, o una capacidad de interactuar con una biomolécula, tal como enlace al ADN, enlace a ligandos, y dimerización . Un dominio puede mostrar independientemente una función o actividad biológica tal que el dominio independientemente o fusionado a otra molécula pueda efectuar una actividad, tal. como, por ejemplo actividad proteolitica o enlace a ligandos. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Tales dominios se conocen, y se pueden identificar por aquellos expertos en la técnica. Para ej emplificación en la presente, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está bien dentro de la experiencia de la técnica reconocer dominios particulares por nombre. Si es necesario,
un software apropiado puede ser empleado para identificar dominios .
Como se usa en este documento, un dominio de proteasa es la porción catalíticamente activa de una proteasa. La referencia a un dominio de proteasa de una proteasa incluye las formas sencilla, de dos y de cadena múltiple de cualquiera de estas proteínas. Un dominio de proteasa de una proteína contiene todas las propiedades requeridas de esa proteína requeridas para su actividad proteolítica, tal- como por ejemplo, el centro catalítico. Con referencia a FVII, el dominio de proteasa comparte homología y aspectos estructurales con los dominios de proteasa de la familia de la quimiotripsina/tripsina, incluyendo la triada catalítica. Por ejemplo, en el polipéptido maduro FVII establecido en SEQ ID NO: 3, el dominio de la proteasa corresponde a posiciones de aminoácidos 153 a 392.
Como se usa en este documento, un dominio de gamma-carboxiglutamato (Gla) se refiere a la porción de una proteína, por ejemplo una proteína dependiente de la vitamina K, que · contiene modificaciones post-traduccionales de residuos de glutamato, generalmente la mayoría, pero no todos de los residuos de glutamato, por carboxilación dependiente de la vitamina K para, formar Gla. El dominio Gla es responsable del enlace de alta afinidad de los iones de
calcio y el enlace a los fosfolipídos cargados negativamente. Típicamente, el dominio Gla inicia en la extremidad N-terminal de la forma madura de las proteínas dependientes de la vitamina K y termina con un residuo aromático conservado. En un polipéptido maduro FVII el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos 1 a 45 del polipéptido ejemplar establecido en SEQ ID NO: 3. Los dominios Gla son bien conocidos y sus lugares se pueden identificar en polipéptidos particulares. Los dominios Gla de las diversas proteínas dependientes de la vitamina K, comparten homología de secuencias, estructural y funcional, incluyendo el agrupamiento de residuos hidrofóbicos en el N-terminal dentro de un parche hidrofóbico que medie la interacción con fosfolipídos cargados negativamente sobre la membrana de la superficie de la célula. Ejemplos de otros polipéptidos que contienen Gla incluyen, pero no se limitan a, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina , proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de la suspensión del crecimiento (Gas6) , y proteína Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares están establecidos en cualesquiera de SEQ ID NOS : 83-94.
Como se usa en este documento, "nativo" o "endógeno" con referencia a un dominio Gla se refiere al dominio Gla que se presenta naturalmente asociado con todo o una parte de un
polipéptido que tiene un dominio Gla. Para los propósitos én la presente, un dominio nativo Gla es con referencia a un polipéptido FVII. Por ejemplo, el dominio nativo Gla de FVII, establecido en SEQ ID NO: 92, corresponde a aminoácidos 1-45 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3.
Como se usa en este documento, un dominio heterologo Gla se refiere al dominio Gla de un polipéptido, desde la especie igual o diferente, que no es un dominio FVII Gla. Ejemplos de dominios heterólogos Gla son los dominios Gla a partir de polipéptidos que contienen Gla incluyendo, pero no limitado a, FIX, FX, protrombina, proteina C, proteina S, osteocalcina , proteina Gla de matriz, proteina 6 especifica de la suspensión del crecimiento (Gas6) , y proteina Z. Los dominios Gla de estas y otras proteínas ejemplares están establecidos en cualesquiera de SEQ ID NOS: 83-91, 93 y 94.
Como se usa en este documento, una porción contigua de un dominio Gla se ' refiere a al menos dos o más aminoácidos adyacentes, típicamente- 2 , 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 o más hasta todos los aminoácidos que constituyen un dominio Gla.
Como se usa en este documento, "una porción suficiente de un dominio Gla para efectuar el enlace a fosfolípidos" incluye al menos un aminoácido, típicamente, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 o más aminoácidos del dominio, pero menos que todos
los aminoácidos que constituyen el dominio, con tal de que el polipéptido que contiene tal porción muestre enlace a fosfolipidos .
Como se usa en este documento, "reemplazar" con respect a un dominio Gla o "intercambio de dominio Gla" se refiere al proceso por el cual se reemplaza el dominio endógeno Gla de una proteina, al usar métodos recombinantes , sintéticos u otros métodos, con el dominio Gla de otra proteina. En el contexto de un "intercambio de dominio Gla", un "dominio Gla" es cualquier selección de aminoácidos de un dominio Gla y regiones adyacentes, que es suficiente para retener la actividad de enlace a fosfolipidos . Típicamente, un intercambio de dominio Gla involucrará el reemplazo de entre 40 y 50 aminoácidos de la proteína endógena con entre 40 y 50 aminoácidos de otra proteína, pero puede involucrar menos o más aminoácidos.
Como se usa en este documento, un dominio del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGF-I o EGF-2) se refiere a la porción de una proteína que comparte homología de secuencias con una porción específica de 30 a 40 aminoácidos de la secuencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) . El dominio EGF incluye seis residuos de cisteína que se ha demostrado (en EGF) que están involucrados en los enlaces bisulfuro. La estructura principal de un dominio EGF es una
lámina beta de dos hebras con un rizo en una lámina de dos hebras cortas en C-termirial. FVII contiene two EGF domains: EGF-I y EGF-2. Estos dominios corresponden a las posiciones de aminoácidos 46-82, y 87-128, respectivamente, del polipéptido maduro FVII establecido en SEQ ID NO: 3.
' Como se usa en este documento, "polipéptido no modificado" o "FVII no modificado" y variaciones gramaticales de ello, se refieren a un polipéptido de partida que se selecciona para modificación como es aquí proporcionado. El polipéptido de partida puede ser una forma de tipo silvestre o que se presenta naturalmente de un polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede ser alterado o mutado, tal que difiera de una isoforma de tipo silvestre nativa pero no obstante se refiera en la presente como un polipéptido de partida no modificado relativo a los polipéptidos posteriormente modificados producidos en la presente. Asi, las proteínas existentes conocidas en la técnica que han sido modificadas para tener un incremento o disminución deseados en una actividad o propiedad en particular en comparación con una proteína de referencia no modificada se puede seleccionar y usar como el polipéptido de partida no modificado. Por ejemplo, una proteína que ha sido modificada de su forma natural por uno . o más cambios sencillos de aminoácidos y posee ya sea un ' incremento o disminución en una propiedad
deseada, tal como un cambio en un residuo' o residuos de aminoácidos para alterar la glicosilación, puede ser una proteina objetivo, referida en la presente como no modificada, para una modificación adicional de ya sea la misma o diferente propiedad. Los polipéptidos FVII modificados ejemplares conocidos en la técnica incluyen cualquier polipéptido FVII descrito en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 y 6806063, publicaciones de patentes de E.U.A. Nos. 20030100506 y 20040220106 y publicaciones de patente internacionales Nos. WO1988010295, WO200183725, WO2003093465, WO200338162, WO2004083361, WO2004108763, WO2004029090, WO200 029091 , O2004111242 y O2005123916.
Como se usa en este documento, "polipéptidos modificados del factor VII" y "factor VII modificado" se refiere a un polipéptido FVII que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido no modificado del factor VII. La una o más diferencias de aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos tales como uno o más reemplazos de aminoácidos (sustituciones) , inserciones o eliminaciones, o pueden ser inserciones o eliminaciones de dominios completos, y algunas combinaciones de los mismos. Típicamente, un polipéptido FVII modificado tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un
polipéptido FVII no modificado. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado aquí proporcionado puede tener 1, 2, 3, .4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido FVII no modificado. Está contemplada cualquier modificación con tal de que el polipéptido resultantes muestre al menos una actividad FVII con un polipéptido FVII nativo, tal como, por ejemplo, actividad catalítica, actividad proteolítica, la capacidad de enlazar a TF o la capacidad de enlazar plaquetas activadas.
Como se usa en este documento, "inhibidores de coagulación" se refieren a proteínas o moléculas que actúan para inhibir o evitar la coagulación o formación de coágulos. La inhibición o prevención de la coagulación se puede observar in vivo o in vitro, y se puede ensayar al usar cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, ensayo de tiempo de . protromboplastina (PT) o el ensayo activado parcial de tiempo de protromboplastina (aPTT) .
Como se usa en este documento, inhibidor de la trayectoria del factor de tejido (TFPI, también referido como TFPI-1) es un inhibidor del tipo Kunitz que está involucrado en la formación de un complejo inhibidor cuaternario TF/FVIIa/TFPI/FXa en el cual se inhibe la actividad de FVIIa.
TFPI se expresa como dos diferentes formas precursoras que siguen al empalme alternativo, precursores TFPI (SEQ ID NO:75) y ?G?? (SEQ ID NO : 77 ) , los cuales se escinden durante la secreción para generar una proteína madura de 276 aminoácidos (SEQ ID NO: 76). y una de 223 aminoácidos (SEQ ID NO:78), respectivamente. TFPI contiene 3 dominios Kunitz, de los cuales el dominio Kunitz-1 es responsable del enlace e inhibición de FVIIa.
Como se usa en este documento, TFPI-2 (también conocida como proteína 5 de placenta (PP5) e inhibidor de serina proteasa asociado con matriz (MSPI)) se refiere a un homólogo de TFPI. La proteína madura TFPI-2 de 213 aminoácidos (SEQ ID NO: 79) contiene tres dominios del tipo Kunitz que muestran un 43%, 35% y 53% de identidad de secuencias primaria con los dominios 1, 2 y 3 del tipo Kunitz del TFPI-I, respectivamente. TFPI-2 juega un papel en la regulación de la digestión y remodelado de la matriz extracelular , y no se cree que sea un factor importante en la trayectoria de coagulación.
Como se usa en este documento, antitrombina III (AT-III) es un inhibidor de serina proteasa (serpina) . AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 95) que se escinden durante la secreción para liberar una antitrombina madura de
432 aminoácidos (SEQ ID NO: 96).
Como se usan en la presente, cofactores se refieren a proteínas o moléculas que se enlazan a otras proteínas o moléculas específicas para formar un complejo activo. En algunos ejemplos, se requiere el enlace a un cofactor para actividad proteolítica óptima. Por ejemplo, el factor de tejido (TF) es un cofactor de FVIIa. El enlace de FVIIa a TF induce cambios conformacionales que resultan en actividad proteolítica incrementada de FVIIa para sus substratos, FX y FIX.
Como se usa en este documento, factor de tejido (TF) se refiere a una glicoproteína de transmembrana de 263 aminoácidos (SEQ ID NO: 97) que funciona como un cofactor para FVIIa. Se expresa constitutivamente por las células del músculo liso y los fibroblastos, y ayuda a iniciar la coagulación al enlazar FVII y FVIIa cuando estas células entran en contacto con el torrente sanguíneo después de una lesión de tejidos.
Como se usa en este documento, plaqueta activada se refiere a una plaqueta que se ha disparado por el enlace de moléculas tales como colágeno,' tromboxano A2, ADP y trombina para sufrir diversos cambios en la morfología, fenotipo y función que finalmente promueven la coagulación. Por ejemplo, una plaqueta activada cambia en forma a una más amorfa con
extremos que se proyectan. Las plaquetas activadas también padecen una "aleta" de la membrana celular tal que la fosfatidilserina y otros fosfolipidos cargados negativamente que están normalmente presentes en la cubierta interior de la membrana celular, se transubican hacia la superficie exterior orientada al plasma. Estas membranas de las plaquetas activadas proporcionan la superficie sobre la cual se efectúan muchas de las reacciones de la cascada de coagulación. Las plaquetas activadas también segregan vesciculas que contienen tales factores pro-coagulantes como vWF, FV, trombina, ADP y tromboxano A2 , y se adhieren una con la otra para formar un tapón de plaquetas el cual se estabiliza por fibrina para convertirse en un coágulo.
Como se usa en este documento, enlace y/o afinidad incrementada para plaquetas activadas, y cualesquiera variaciones gramaticales de lo mismo, se- refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteina, por ejemplo un polipéptido FVII, para enlazar a la superficie de una plaqueta activada, en comparación con un polipéptido o proteina de referencia. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido FVII modificado para enlazar a plaquetas activadas puede ser mayor que la capacidad del polipéptido FVII no modificado para enlazar a plaquetas activadas. El enlace y/o afinidad · de un polipéptido para plaquetas
activadas puede incrementarse por al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%·, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con el enlace y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Los ensayos para determinar el enlace y/o afinidad de un polipéptido para plaquetas activadas se conocen en la técnica. El enlace de un polipéptido FVII a plaquetas activadas está mediado a través de la interacción de aminoácidos en el dominio Gla del polipéptido FVII y fosfolipidos cargados negativamente, tales como fosfatidilserina, sobre la plaqueta activada. Como tal, los métodos para ensayar el enlace de polipéptidos , tales como los polipéptidos FVII, a plaquetas activadas usa membranas y vesículas que contienen fosfolipidos, tales como fosfatidilserina . Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para enlazarse a una plaqueta activada se refleja por la capacidad del polipéptido para enlazar a vesículas de fosfolipidos, lo cual puede medirse por técnicas de dispersión de luz.
Como se usa en este documento, enlace y/o afinidad incrementada para fosfolipidos, y cualesquiera variaciones gramaticales de lo mismo, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteína para enlazar a fosfolipidos en comparación con un polipéptido o proteína de
referencia. Los fosfolípidos pueden incluir cualesquiera fosfolipidos, pero incluyen particularmente fosfatidilserina . El enlace y/o afinidad de un polipéptido para fosfolípidos puede incrementarse por al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con el enlace y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Los ensayos para determinar, la afinidad y/o enlace de un polipéptido a fosfolípidos se conocen en la técnica. Por ejemplo, el enlace del polipéptido FVII a vesículas de fosfolípidos puede ser determinado por dispersión relativa de luz a 90° a la luz incidente. La intensidad de la dispersión de luz con. las vesículas de fosfolípidos solas y con vesículas de fosfolípidos con FVII se mide para determiner la constante de disociación. La resonancia de plasma en superficie, tal como en un instrument biosensor BIAcore, también puede ser usada para medir la afinidad de los polipéptidos FVII para membranas de fosfolípidos.
Como se usa en este documento, resistencia incrementada a inhibidores o "resistencia incrementada a AT-III" o "resistencia incrementada a TFPI" se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad disminuida de un polipéptido a los efectos inhibidores de un inhibidor, tal como AT-III o TFPI, en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un
polipéptido FVII no modificado. La resistencia incrementada a un inhibidor, tal como AT-III, puede ser ensayada al evaluar el enlace de un polipéptido FVII modificado a un inhibidor. La resistencia incrementada a un inhibidor, tal como AT-III, también puede ser ensayada al medir la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido FVII en la presencia de AT-III. Los ensayos para determinar el enlace de un polipéptido a un inhibidor se conocen en la técnica. Para inhibidores covalentes, tal como, por ejemplo, AT-III, una constante de velocidad de segundo orden para inhibición puede ser medida. Para inhibidores no covalentes, tal como, por ejemplo, TFPI, una k± puede ser medida. Además, la resonancia de superficie en plasma, tal como sobre un instrumento biosensor BIAcore, también puede ser usada para medir el enlace de los polipéptidos FVII a AT-III u otros inhibidores. Sin embargo, para los inhibidores covalentes tales como AT-III, solamente una velocidad activa puede ser medida usando BIAcore. Los ensayos para determinar el efecto inhibidor de, por ejemplo, AT-III sobre la actividad coagulante o actividad intrínseca de FVII también se conocen en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido FVII modificado para escindir su sustrato FX en la presencia o ausencia de AT-III puede ser medida, y el grado al cual AT-III inhibe la reacción determinada. Esto puede ser en comparación con la
capacidad de un polipéptido FVII no modificado para escindir su sustrato FX en la presencia o ausencia de AT-III. Un polipéptido modificado que muestra resistencia incrementada a un inhibidor muestra, por ejemplo, un incremento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más resistencia a los efectos de un inhibidor en comparación con un polipéptido no modificado.
Como se usa en este documento, "resistencia incrementada a inhibición por Zn2+, " "resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+" o "resistencia incrementada a Zn2+" se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad disminuida de un polipéptido para los efectos inhibidores de Zn + en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido FVII no modificado. La resistencia incrementada a Zn2+ se puede ensayar mediante, por ejemplo, medir la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido FVII en la. presencia de Zn, tal como se describe en el Ejemplo 11. La resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+ puede ser el resultado de un enlace disminuido a Zn2+. El enlace disminuido a Zn2+ puede ser ensayado al medir la cantidad de Zn2+ enlazado por molécula de FVIIa o al medir la afinidad del enlace de Zn2+ a FVIIa o al
medir un IC50 para inhibición de una actividad FVIIa por zinc. Un polipéptido modificado que muestra resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+ muestra, por ejemplo, un incremento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o mas resistencia a los efectos de Zn en comparación con un polipéptido no modificado.
Como se usa en este documento, una secuencia de enlace a la albúmina de suero se refiere a' una secuencia de residuos de aminoácidos que pueden efectuar enlace a albúmina de suero. Asi, cuando se inserta dentro de un polipéptido FVII, la secuencia de enlace a la albúmina de suero puede potenciar la afinidad para o el enlace a albúmina de suero del polipéptido FVII. La capacidad del polipéptido FVII modificado que contienen la secuencia de enlace a la albúmina de suero puede por lo ta.nto mostrar un enlace y/o afinidad incrementado para albúmina de suero. Un polipéptido modificado que muestra enlace y/o afinidad incrementado para albúmina de suero muestra, por ejemplo, un incremento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o- más en comparación cbn el enlace y/o afinidad de un polipéptido no modificado.
Típicamente, las secuencias de enlace a la albúmina de suero contienen al menos 10 o más aminoácidos, típicamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 o más aminoácidos. Ejemplos de las secuencias de enlace a la albúmina de suero son aquellas establecidas en SEQ ID NOS: 103-109.
Como se usa en este documento, una secuencia de enlace a integrina de plaquetas a?^ß3 se refiere a una secuencia de residuos de aminoácidos que puede efectuar el enlace a la integrina de plaquetas a?¾ 3· Así, cuando se inserta dentro de un polipéptido FVII,' la secuencia de enlace a la integrina de plaquetas oínbP3 puede potenciar la capacidad del polipéptido FVII para enlazar a la integrina de plaquetas a?¾ß3 y, por lo tanto, plaquetas, incluyendo plaquetas activadas. La capacidad del polipéptido FVII modificado que contiene la secuencia de enlace de integrina de plaquetas ap^ puede por lo tanto mostrar enlace y/o afinidad incrementado para integrina de plaquetas ani^3 y/o plaquetas. Un polipéptido modificado que muestra enlace y/o afinidad incrementado para integrina de plaquetas anb 3 muestra, por ejemplo, un incremento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con el enlace y/o afinidad de un polipéptido no modificado. Típicamente, las secuencias de
enlace a integrina de plaquetas anb (33 contienen al menos 5 o más aminoácidos, típicamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 o más aminoácidos. Ejemplos de las secuencias de enlace de la integrina de plaquetas anb 3 son aquellos establecidos en SEQ ID NOS: 110-112.
Como se usa en este documento, un sitio de glicosilación se refiere a una posición amino- en un polipéptido al cual puede unirse una porción de carbohidratos. Típicamente, una proteína glicosilada contiene uno o más residuos de aminoácidos, tal como asparagina o serina, para la unión a las porciones de carbohidratos.
Como se usa .en este documento, un sitio de glicosilación nativo se refiere a una posición amino a la cual una porción de carbohidratos se une en un polipéptido de tipo silvestre. Existen cuatro sitios de glicosilación nativos en FVII; dos sitios de N-glicosilación en N145 y N322, y dos sitios de 0-glicosilación en S52 y S60, que corresponden a posiciones de aminoácidos en el polipéptido maduro FVII establecido en SEQ ID NO:3.
Como se usa en este documento, un sitio de glicosilación no nativo se refiere a una posición amino a la cual una porción de carbohidrato.s se une en un polipéptido modificado que no está presente en un polipéptido de tipo silvestre. Los sitios de glicosilación no nativos pueden ser introducidos
dentro de un polipéptido FVII por reemplazo de aminoácidos. Los sitios de O-glicosilación pueden ser creados, por ejemplo, por reemplazo de aminoácidos de un residuo nativo con una serina o. treonina. Los sitios de N-glicosilación puede ser creados, por ejemplo, 'al establecer la porción Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys , donde Xaa no es prolina. La creación de esta secuencia de consenso por la modificación de aminoácidos puede involucrar, por . ejemplo, un reemplazo de aminoácidos sencillo de un residuo de aminoácidos nativo con una asparagina, un reemplazo de aminoácidos sencillo de un residuo de aminoácidos nativo con una serina, treonina o cisteina, o un reemplazo de aminoácidos doble que involucra un primer reemplazo de aminoácidos de un residuo nativo con una asparagina y un segundo reemplazo de aminoácidos de residuo nativo con una serina, treonina o cisteina.
Como se usa en este documento, "actividad biológica" se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o respuestas fisiológicas que resultan con la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. Actividad biológica, asi, abarca efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Las actividades biológicas pueden observarse en sistemas in vitro diseñados para probar o usar tales actividades. Asi, para los propósitos en la presente una actividad biológica de
un polipéptido FVII abarca la actividad coagulante.
Como se usa en este documento el término "evaluar" y variaciones gramaticales del mismo, se pretende para incluir determinación¦ cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto por la actividad de un polipéptido, y también de obtener un indicé, relación, porcentaje, valor visual u otro valor indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la detección de escisión de un sustrato por un polipéptido puede ser por medición directa del producto, o puede ser medido indirectamente al determinar la actividad resultante del sustrato escindido.
Como se usa en este documento, "numeración de quimiotripsina" se refiere a la numeración de aminoácidos de un polipéptido maduro de quimiotripsina de SEQ ID NO: 80. La alineación de un. dominio de proteasa de otra proteasa, tal como por ejemplo el dominio de proteasa del factor VII, puede ser hecha con quimiotripsina. En tal caso, los aminoácidos de factor VII que corresponden a los aminoácidos de quimiotripsina se les da la numeración de los aminoácidos de quimiotripsina. Las posiciones correspondientes pueden ser determinadas por tal alineación por alguien experto en la técnica al usar alineaciones manuales o al usar los diversos programas de alineación disponibles (por ejemplo, BLASTP) .
Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineaciones estructurales, por ejemplo al usar alineaciones simuladas por computadora de estructura de proteínas. La mención de que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a los aminoácidos en una secuencia descrita se refieren a aminoácidos identificados con la alineación del polipéptido con la secuencia descrita para maximizar la identidad u homología (donde se alinean los aminoácidos conservados) al usar un algoritmo de alineación estándar, tal como el algoritmo GAP. Los números correspondientes de quimiotripsina de posiciones de aminoácidos 1 a 406 del polipéptido FVII establecido en SEQ ID NO: 3 se suministran en la Tabla 1. Las posiciones de aminoácidos relativas a la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3 están en fuente normal, los residuos de aminoácidos en esas posiciones están en negritas, y los números correspondientes de quimiotripsina están en cursivas. Por ejemplo, con la alineación del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) con la quimiotripsina madura (SEQ ID NO:80), la isoleucina (I) en la posición de aminoácidos 153 en el factor VII se da la numeración de quimiotripsina de 116. Los aminoácidos posteriores se enumeran consecuentemente. En un ejemplo, un ácido glutámico (E) en la posición de aminoácidos 210 del factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) corresponde a la posición E70 de aminoácidos con base
en la numeración de quimiotripsina . Donde existe un residuo en una proteasa, pero no está presente en la quimiotripsina, al residuo de aminoácidos se le da una notación de letra. Por ejemplo, los residuos en la quimiotripsina que son parte de un rizo con el aminoácido 60 con base en la numeración de quimiotripsina, pero se insertan en la secuencia del factor VII en comparación con la quimiotripsina, se refieren como por ejemplo K60a, I60b, K60c o N60d. Estos residuos corresponden a K197, 1198, K199 y N200, respectivamente, por numeración relativa a la secuencia madura del factor VII (SEQ I D NO : 3 ) .
Tabla 1. Numeración de quimiotripsina del factor VII
153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167
1 V G G K V C P K G E C P W Q
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182
V U L L V N G A Q L C G G T L
3) 32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
183 184 185 j 186 187 188 189 190 191 192 193 94 195 196 197
I N T I W V V S A A H C F D K
47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 60A
198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212
1 K N w R N L 1 A V L G E H D
608 60C 60D 6Í 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227
L S E H D G D E Q S R R V A Q
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242
V 1 I P S T Y V P G T T N H 0
88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 707 702
243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
1 A L L R L H Q P V V L T D H
103 104 705 106 107 108 709 770 777 772 773 774 775 116 117
258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272
V V P L C L P E R T F S E R T
118 119 120 121 722 J23 724 725 726 727 728 729 729? 129B 729C
273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287
L A F V R F S L V S G W G Q L
129D 129E 129F 129G 134 135 736 737 738 739 740 141 142 743 144
288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302
L D R G A T A L E L M V L N V
145 146 147 149 750 151 752 753 754 755 756 757 158 759 760
303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317
P R L T Q D C L Q Q S R K V
161 162 163 164 765 766 767 768 769 70 170 A 7 08 170C 770O 170E
I
318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332
! G D S P N I T E Y M F C A G Y
170F Í 0G 170H 1701 Í 5 7 6 777 7 8 7 9 780 787 782 183 184 A 184
333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347
S D G S K D S C K G D S G G P
185 186 187 188 A 188 789 790 797 792 793 794 795 196 797 798
348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362
H A T H Y R G T W Y L T G 1 V
199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 270 277 212 273
363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377
S W G Q G C A T V G H F G V Y
214 215 216 217 219 220 221A 221 222 223 224 225 226 227 228
378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392
T R V S Q Y I E W L Q K L M R
229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243
393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406
S E P R P G V L L R A P F P
244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
Como se usa en este documento, ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos de péptidos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios . Cuando se refiere a sonda o cebadores, que están opcionalmente etiquetados, tales como con una etiqueta detectable, tal como una fluorescente o radioetiqueta , se contemplan moléculas monocatenarias . Tales moléculas son típicamente de una longitud tal que su objetivo es estadísticamente único o de un número de baja copia (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para la formación de sondas o de cebadores en una colección. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de complementariedad de secuencia para, o idénticos para un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden, ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos
nucleicos de largo.
Como se usa en este documento, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene desde 2 hasta 40 aminoácidos de largo .
Como se usa en este documento, los aminoácidos que se presentan en las diversas secuencias de aminoácidos aquí proporcionadas se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres letras o de una letra (Tabla 2) . Los nucleótidos que se presentan en los diversos fragmentos de ácidos nucleicos se designan con las designaciones estándar de una letra usadas de rutina en la técnica.
Como se usa en este documento, un "aminoácido", es un compuesto orgánico que contiene un grupo aminoácido y un grupo ácido carboxilico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para los propósitos en la presente, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos que se presentan naturalmente, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en donde el carbono a tiene una cadena lateral).
De acuerdo con la nomenclatura estándar de polipéptidos descrita en J. Biol. Chem. , 243: 3552-3559 (1969), y adoptada por 37 C.F.R, §§ 1.821-1.822, las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 2:
Tabla 2 - Tabla de Correspondenc
Se debe observar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos representadas en este documento por las fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del amino-terminal a carboxilo-terminal . Además, la frase "residuo de aminoácidos" se define ampliamente para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 2) y aminoácidos modificados e
inusuales, tales como aquellos referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en este documento a manera de referencia. Adicionalmente, se debe observar que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace de péptido a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos, a un grupo amino-terminal tal como NH2 o a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH .
Como se usa en este documento, un "aminoácido hidrofóbico" incluye cualquiera de los aminoácidos determinados que sean hidrofóbicos usando la escala consenso de hidrofobicidad de Eisenberg. Son ejemplares los aminoácidos hidrofóbicos de origen natural, tales como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptófano, metionina, alanina, glicina, cisteina y tirosina (Eisenberg y colaboradores, (1982) Faraday. Symp. Chem. Soc. 17:109- 120). También se incluyen aminoácidos hidrofóbicos no de origen natural .
Como se usa en este documento, un "aminoácido ácido" incluye entre los aminoácidos de origen natural residuos de ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen aminoácidos ácidos no de origen natural.
Como se usa en este documento, "aminoácidos de origen natural" se refiere a los 20 L-aminoácidos que ocurren en los
polipéptidos .
Como se usa en este documento, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxilico que no es uno de los aminoácidos de origen natural listados en la Tabla 2. Los aminoácidos no de origen natural incluyen de esta manera, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos no de origen natural e incluyen, pero no se limitan a, los D-isostereómeros de aminoácidos. Los aminoácidos no naturales ejemplares son conocidos por aquellas personas expertas en el campo y se pueden incluir en un polipéptido de factor VII modificado.
Como se usa en este documento, un constructo de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, de hebra individual o doble hebra que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos de ADN existen como un resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.
Como se usa en este documento, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de plásmido,
el cual, cuando se lee de la dirección 5' a 3' , codifica las secuencias de aminoácidos del polipéptido especificado.
Como se usa en este documento, el término polinucleótido propone un polímero de hebra individual o doble hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídos del extremo 5' al 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizadas in vitro, o preparadas a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucleótido se proporciona en este documento en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares base (abreviados "bp") . El término nucleótidos se usa para moléculas de hebra individual y doble hebra donde el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra se usa para indicar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término pares base. Se reconocerá por aquellas personas expertas en el campo que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas se pueden escalonar; de esta manera todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra no se puede parear. Estos extremos no pareados, en general,, no excederán 20 nucleótidos en longitud.
Como se usa en este documento, "secuencia primaria" se
refiere a la secuencia de residuos de aminoácido en un polipéptido.
Como se usa en este documento, "similitud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud se puede basar en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de residuos y los residuos contenidos en las mismas. Los métodos para estimar el grado de similitud entre las proteínas o ácidos nucleicos son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Por ejemplo, en un método para estimar la similitud dé secuencia, dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se alinean de una manera que produzca un niel máximo de identidad entre las secuencias. "identidad" se refiere al grado al cual las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. La alineación de la secuencia de aminoácidos, y algún grado de secuencias de nucleótidos, también pueden tomar en cuenta diferencias conservadoras y/o sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos) . Las diferencias conservadoras son aquellas que conservan las propiedades fisicoquímicas de los residuos implicados. Las alineaciones pueden ser globales (alineación de las secuencias comparadas sobre la longitud total de las secuencias e incluyen todos los residuos) o locales (la
alineación de una porción de secuencia que incluye únicamente la región o regiones más similares).
Como se usa en éste documento, los términos "homología" e "identidad" se usan intercambiablemente, pero la homología de las proteínas puede incluir cambios de aminoácidos conservadores. En general para identificar las posiciones correspondientes las secuencias de aminoácidos sé alinean para que el igualamiento de primer orden se obtenga (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed . , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data. Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo y colaboradores (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) .
Como se usa en este documento, "identidad de secuencia" se refiere al número de aminoácidos idénticos (o bases de nucleótidos) en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y de referencia. Polipéptidos homólogos se refiere a una variedad predeterminada de residuos de aminoácidos idénticos u homólogos. La homología
incluye sustituciones de aminoácidos conservadores como también residuos idénticos. La identidad de secuencia se puede determinar mediante programas de algoritmo de alineación estándar usados con penalizaciones de espacio por omisión establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico homologas se refieren a una variedad predeterminada de nucleótidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones que no cambian el aminoácido codificado (es decir, "sustituciones silenciosas") así como también residuos idénticos. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homologas se hibridan típicamente en rigor moderado o en alto rigor todas a lo largo de la longitud del ácido nucleico o a lo largo de por lo menos aproximadamente 70%, 80% o 90% de la molécula de ácido nucleico de longitud completa de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contiene codones degenerados en lugar de codones en la hibridación de la molécula de ácido nucleico. (Para la determinación de la homología de las proteínas, se pueden alinear aminoácidos conservadores así como también aminoácidos idénticos; en este caso, el porcentaje de identidad y el porcentaje de homología varían). Si cualquiera de dos moléculas de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos (o cualquiera de los dos polipéptidos tienen secuencias de aminoácidos) que son por lo menos 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticos" se puede determinar usando algoritmos de computadora conocidos tal como el programa "FAST A", que usa por ejemplo, los parámetros por omisión como en Pearson y colaboradores Proc . Nati. ñcad. Sci. EUS 85: 2444 (1988) (otros programas incluyen el paquete de programas GCG . (Devereux, J., y colaboradores, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., y colaboradores,' J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed . , Academic Press, San Diego (1994), y Carillo y colaboradores SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos Información del Centro Nacional para Biotecnología se puede usar para determinar la identidad. Otros programas comercialmente o públicamente disponibles incluyen el programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) y el programa "Gap" del Grupo de Computadora de Genética de la Universidad de Wisconsin (U G) (Madison WI)). El porcentaje de homología o identidad de las proteínas y/o las moléculas de ácido nucleico se puede determinar, por ejemplo, al comparar la formación de secuencia que usa un programa de computadora GAP (por ejemplo, Needleman y colaboradores J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), como se revisó por Smith y Waterman {Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Brevemente, un programa GAP define la similitud como el número de símbolos
alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, divididos por el número total de símbolos en lo más corto de las dos secuencias. Los parámetros por omisión para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación pesadas de Gribskov y colaboradores Nucí. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds . , Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979); (2) una penalización de 3.0 para cada espacio y una penalización de 0.10 adicional para cada símbolo en cada espacio; y (3) sin penalización para los espacios de extremo.
Por lo tanto, como se usa en este documento, el término "identidad" representa una comparación entre una prueba y un polipéptido o polinucleotido de referencia. En un ejemplo no limitante, "por lo menos 90% idéntico a" se refiere al porcentaje de identidades de 90 a 100% relativos con los polipéptidos de referencia. La identidad en un niel de 90% o más es indicativo del hecho de que, asumiendo para propósitos de ej emplificación se compara una longitud de polinucleotido de prueba de referencia de 100 aminoácidos, no más de 10% (es decir, 10 de 100) de aminoácidos en el polipéptido de prueba difiere de aquel de los polipéptidos de referencia. Se pueden
hacer comparaciones similares entre unos polinucleótidos de prueba y de referencia. Estas diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de una secuencia de aminoácidos o se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variante hasta el máximo permisible, por ejemplo, 10/100 diferencias de aminoácidos (aproximadamente 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones y supresiones, de ácidos nucleicos o aminoácidos. En el nivel de las homologías o identidades anteriores aproximadamente 85-90%, el resultado debe ser independiente del programa y los ajustes de los parámetros de espacio; estos niveles de identidad se pueden estimar fácilmente, sin depender frecuentemente de un software.
Como se usa en este documento, también se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" varían con el contexto como es entendido por aquellas personas expertas en el campo relevante, pero que aquellas personas de experiencia pueden estimar.
Como se usa en este documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean dos o más secuencias que se relacionan por 50% o más de identidad. Un
conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y pueden incluir secuencias de alineación derivadas de ARNs, tales como ESTs y otros ADNAcs, alineados con la secuencia de ADN genómico.
Como se usa en este documento, "hibridiza específicamente" se refiere a la combinación de pares de bases, mediante apareamiento de bases complementario, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo un oligonucleótido ) a una molécula de ácido nucleico objetivo. Aquellas personas expertas en el campo están familiarizados con los parámetros in vitro e in vivo que afectan la hibridación especifica, tal como longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros pertinentes particularmente con la hibridación in vitro incluyen además temperaturas de combinación de pares de bases y de lavado, composición amortiguadora y concentración de sal. Las condiciones de lavado ejemplares para remover moléculas de ácido nucleico no específicamente enlazadas en alto rigor son 0.1 x SSPE, 0.1% de SDS, 65°C, y en rigor medios son 0.2 x SSPE, 0.1% de SDS, 50°C. Son conocidas en el campo las condiciones rigurosas equivalentes. La persona experta puede ajusfar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico a una molécula de ácido nucleico objetivo apropiada para una
aplicación particular.
Como se usa en este documento, polipéptido o proteína aislada o purificada o porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula del tejido de la cual la proteína se deriva, o sustancialmente libre de- los precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Las preparaciones se pueden determinar para estar sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables como se determina por los métodos estándares de análisis, tal como cromatografía de capa delgada (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , usadas por aquellas personas expertas en el campo para estimar esta pureza, o sustancialmente pura tal que la purificación adicional no alteraría detectablemente las propiedades físicas y químicas, tales como actividades proteolíticas y biológicas, de la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos de manera sustancial químicamente puros son conocidos por aquellas personas de experiencia en el- campo. Un compuesto de manera sustancial químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros . En estos casos, la purificación adicional podría incrementar la actividad específica del compuesto.
El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se aisla o produce recombinantemente . En una modalidad, el término sustancialmente' libre de material celular incluye preparaciones de proteínas de proteasa que tienen menor que aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no de proteasa (también referidas en este documento como una proteína contaminante) , generalmente aproximadamente 20% no de proteasa o 10% no de proteasa o menor que aproximadamente 5% de proteínas no de proteasa. Cuando la proteína de proteasa o porción activa de la misma se produce recombinantemente, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menor que, aproximadamente, o igual a 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína de proteasa.
Como se usa en este documento, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos incluye preparaciones de proteínas de proteasa en las cuales la proteína se separa de los precursores químicos u otros químicos que se implican en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas de proteasa que tienen menor que aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menor de precursores químicos o
químicos o componentes no de proteasa.
Como se usa en este documento, la producción mediante métodos recombinantes al usar métodos de ADN recombinante se refiere al uso de los métodos . bien conocidos de la biología molecular para expresar proteínas codificadas por el ADN clonado.
Como se usa en este documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ácido nucleico heterólogo en las células para ya sea la expresión o replicación de la misma. Los vectores permanecen típicamente episomales, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o porción del mismo dentro de un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de estos vehículos son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo.
Como se usa en este documento, expresión se refiere al proceso por el cual el ácido nucleico se transcribe dentro del ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos , o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si una célula hospedera eucariótica apropiada u organismo se selecciona,' incluyen procesamiento, tal como
empalme del ARNm.
Como se usa en este documento, un vector de expresión' incluye vectores capaces de expresar ADN que se enlaza operativamente con las secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de estos fragmentos de ADN. Estos fragmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras , y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de aplicación, uno o más marcadores selecciónateles , un potenciador, una señal de poliadenilación y los similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN plásmido o viral, o puede contener elementos de ambos. De esta manera, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN o ARN recombinante , tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, en la introducción en una célula hospedera apropiada, da por resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo e incluyen a aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o o células procarióticas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran dentro del genoma de la célula hospedera.
Como se usa en este documento, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores
virales son virus diseñados que se enlazan operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos dentro de las células.
Como se usa en este documento, un adenovirus se refiere a cualquiera de un . grupo de virus que contienen ADN ' que causan conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en humanos.
Como se usa en este documento, ADN desnudo se refiere a ADN sin histonas que se pueden usar para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se hace pasar de célula a célula durante una transferencia de genes procesada llamada transformación o transfección . En la transformación o transfección, el ADN purificado o desnudo que es captado por la · célula recipiente proporcionará a la célula recipiente una nueva característica o fenotipo.
Como se usa en este documento, operable u operativamente enlazado cuando se refiere a segmentos de ADN propone que los segmentos sean arreglados para que funcionen conjuntamente con sus propósitos intencionados, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento de codificación al terminador.
Como se usa en este documento, un agente que modula la actividad de una proteína o expresión de un gen o ácido nucleico ya sea disminuye o incrementa o de otra manera
altera la actividad de la proteína o, de alguna manera regula por incremento o decremento o altera de otra manera la expresión del ácido nucleico en una célula.
Como se usa en este documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido enlazado operativamente a un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión proporcionada en este documento puede incluir uno o más polipéptidos FVII, o una porción de los mismos, y uno o más de otros polipéptidos para cualquiera o más de unas señales de control transcripcionales/traduccionales , secuencias de señal,, una etiqueta para localización, una etiqueta para purificación, parte de un dominio de una inmunoglobulina G, y/o un agente objetivo. Un polipéptido FVII quimérico también incluye aquellos que tienen sus dominios o regiones endógenas del polipéptido intercambiado con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen aquellas producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, aquellas producidas por medios químicos, tal como mediante acoplamiento químico, a través, por ejemplo, del acoplamiento de grupos de sulfhidrilo, y aquellos producidos por cualquier otro método mediante el cual por lo menos un polipéptido (es decir FVII), o una porción del mismo, se enlaza, directa o indirectamente por la vía de enlazador (es ) a otro
polipéptido .
Como se usa en este documento, enlazado operativamente cuando se refiere a una proteína de fusión se refiere a un polipéptido proteasa y un . polipéptido no de proteasa que se fusionan dentro del marco entre sí. El polipéptido no de proteasa se puede fusionar a la N-término o C-término del polipéptido proteasa.
Como se usa en este documento, un agente objetivo, es cualquier porción, tal como una proteína o porción efectiva de la misma, que proporciona enlace específico a una molécula de la superficie celular, tal como un receptor de superficie celular, el cual en . algunos casos puede interiorizar un conjugado enlazado o porción del mismo. Un agente objetivo también puede ser uno que promueve o facilita, por ejemplo, el aislamiento o purificación de afinidad del conjugado; unión del conjugado a una superficie; o detección del conjugado o complejos que contienen el conjugado.
Como se usa en este documento, derivado o análogo de una molécula se refiere a una porción derivada de o una versión modificada de la molécula.
Como se usa en este documento, "enfermedad o trastorno" se refiere a una condición patológica en un organismo que resulta de la causa o condición que incluye, pero no se limita a, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones
genéticas, y se caracteriza por síntomas identificables .. Las enfermedades y trastornos de interés en este documento son aquellos que implican coagulación, que incluyen aquellas mediadas por proteínas de coagulación y aquellas en las cuales las proteínas de coagulación desempeñan una función en la etiología' o patología. Enfermedades y trastornos también incluyen aquellos que son causados por la ausencia de una proteína tal como en la hemofilia, y de interés particular en este documento son aquellos trastornos donde la coagulación no ocurre debido a una deficiencia de defecto en una proteína de coagulación.'
Como se usa en este documento, "procoagulante" se refiere a cualquiera sustancia que promueve la coagulación de la sangre.
Como se usa en este documento, "anticoagulante" se refiere a cualquier sustancia que inhibe la coagulación de la sangre .
Como se usa en este documento, "hemofilia" se refiere a un trastorno de sangrado causado por una deficiencia en unos factores de coagulación, de la sangre. La hemofilia puede ser el resultado, por ejemplo, de ausencia, expresión reducida o función reducida dé un factor de coagulación. El tipo más común de hemofilia es hemofilia ?, la cual resulta de una deficiencia en el factor VIII. El segundo tipo más común de
hemofilia es la hemofilia B, la cual resulta de una deficiencia en el factor IX. La hemofilia C, también llamada deficiencia en FXI, es una forma más leve y menos común de hemofilia.
Como se usa en este documento, "hemofilia congénita" se refiere a tipos de hemofilia que son heredados. La hemofilia congénita resulta de la mutación, supresión, inserción u otra modificación de un gen de factor de coagulación en el cual la producción del factor de coagulación está ausente, reducida, o no funcional. Por ejemplo, las mutaciones hereditarias en los genes del factor de coagulación, tal como factor VIII y factor IX dan por resultado las hemofilias congénitas, Hemofilia A y Hemofilia B, respectivamente.
Como se usa en este documento, "hemofilia adquirida" se refiere a un tipo de hemofilia que se desarrolla en la edad adulta de la producción de anticuerpos que inactivan el FVIII.
Como se usa en este documento, "trastorno hemorrágico" se refiere a una condición en el cual el sujeto tiene una capacidad disminuida de controlar el sangrado. Los trastornos de sangrado se pueden heredar o adquirir, y pueden resultar de, por ejemplo, defectos o deficiencias en la vía de coagulación, defectos o deficiencias en actividad de plaquetas o defectos vasculares.
Como se usa en este documento, "trastorno hemorrágico adquirido" se refiere a trastornos de sangrado que resultan de deficiencias de coagulación causadas por condiciones tal como enfermedad del hígado, deficiencia de vitamina K, o terapia con coumadina (warfarina) u otro anti-coagulante .
Como se usa en este documento, "tratar" un sujeto que tiene una enfermedad o condición propone que un polipéptido, composición u otro producto proporcionado en este documento se administre al sujeto.
Como se usa en este documento, un agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o quimioterapéutico propone fármacos convencionales y terapias con fármacos que incluyen vacunas, los cuales son conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Los agentes radioterapéuticos son bien conocidos en el campo.
Como se usa en este documento, tratamiento propone cualquier manera en la cual los síntomas de una condición, trastorno o enfermedad se mejoran o de otra manera se alteran benéficamente. Por consiguiente el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de las composiciones en este documento. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de un FVII modificado y composiciones proporcionadas en este documento.
Como se usa en este documento, mejoramiento de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por un tratamiento, tal como mediante la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquiera que disminuya, ya sea permanente o temporal, de larga duración o transiente, de los síntomas que se pueden atribuir a o asociar con la administración de la composición o agente terapéutico.
Como se usa en este documento, la prevención o profilaxis se refiere a métodos en los cuales el riesgo de desarrollar enfermedad o condición se reduce. La profilaxis incluye reducción en el riesgo de desarrollar una enfermedad o condición y/o una prevención de empeoramiento de los síntomas o progresión de una enfermedad o reducción en el riesgo de empeoramiento de los síntomas o progresión de una enfermedad.
Como se usa en este documento una cantidad efectiva de un compuesto o composición para tratar una enfermedad particular es una cantidad que es suficiente para mejorar, o de alguna manera reducir los síntomas asociados con la enfermedad. Esta cantidad se puede administrar como una sola dosis o se puede administrar de acuerdo con un régimen, mediante el cual es efectivo. La cantidad puede curar la enfermedad, pero típicamente, se administra a fin de mejorar
los síntomas de la enfermedad. Típicamente, la administración repetida es requerida para lograr un mejoramiento deseado de los síntomas.
Como se usa en este documento, "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es por lo menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Una cantidad efectiva es la cantidad de un agente terapéutico necesario para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se usa en este documento, "paciente" o "sujeto" que se trata incluye humanos y o animales no humanos, que incluyen mamíferos. Los mamíferos incluyen primates, tales como humanos, chimpancés, gorilas y monos; animales domesticados, tales como perros, caballos, gatos, cerdos, cabras, vacas; y roedores tales como ratones, ratas, hámster y jerbos.
Como se usa en este documento, una combinación se refiere a cualquiera asociación entre dos o entre más artículos. La asociación puede ser espacial o referirse al uso de dos o más artículos para un propósito común.
Como se usa en este documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o
compuestos (por ejemplo, agentes, moduladores, reguladores, etcétera) . Puede ser una solución, una suspensión, liquido, polvo, o una pasta, formulaciones acuosas o no acuosas o cualquier combinación de las mismas.
Como se usa en este documento, un "articulo de manufactura" es un producto que se hace y se vende. Como se usa por toda esta solicitud, el término se propone para abarcar polipéptidos de proteasa modificados y ácidos nucleicos contenidos en artículos de empaque.
Como se usa en este documento, fluido se refiere a cualquier composición que puede fluir. Los fluidos abarcan de esta manera composiciones que están en la forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras de estas composiciones.
Como se usa en este documento, un "kit" se refiere a una combinación empaquetada, que- incluye opcionalmente reactivos y otros productos y/o componentes- para practicar los métodos usando los elementos de la combinación. Por ejemplo, se proporcionan kits que contienen un polipéptido modificado o molécula de ácido nucleico proporcionados en este documento y otro artículo para un propósito que incluye, pero no se limita a, administración, diagnóstico, y estimación de una actividad o propiedad biológica. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para el uso.
Como se usa en este documento, el anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, los cuales se componen de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada.
Como se usa en este documento, un receptor se refiere a una molécula que tiene una afinidad para un ligando particular. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores también ¦ se pueden referir en el campo como anti-ligandos .
Como se usa en este documento, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no se limita a; primates que incluyen humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como gallinas; rumiantes, tales como cabras, vacas, venados, ovejas; ovinos, tales como cerdos y otros animales. Animales no humanos excluyen humanos como el animal contemplado. Las proteasas proporcionadas en este documento provienen de cualquier fuente, animal, vegetal, procariotica y fúngica.
Como se usa en este documento, la terapia génica implica la transferencia de ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, dentro de ciertas células, células objetivo, de un mamífero, particularmente un humano, con un trastorno o condición para la cual se busca esta terapia. El ácido nucleico, tal como ADN, se introduce en las células objetivo seleccionadas, tal
como directamente o en un vector u otro vehículo de suministro, de una manera tal que el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, se expresa y un producto terapéutico codificado en consecuencia se produce. Alterativamente, el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, puede de alguna manera mediar la expresión del ADN que codifica el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia genética también se usa para suministrar ácido nucleico que codifica un producto génico que reemplaza un gen defectuoso o suplementar un producto génico producido por el mamífero o la célula en la cual se introduce. El ácido nucléico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como una proteasa o proteasa modificada, que no se produce normalmente en el hospedero mamífero o que no se produce en cantidades terapéuticamente efectivas o en un tiempo terapéuticamente útil. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN que codifica el producto terapéutico se puede modificar antes de la introducción en las células del hospedero afectado a fin de mejorar o de otra manera alterar el producto o expresión del mismo. La terapia genética también puede implicar el suministro de un inhibidor o represor u otro modulador de la expresión génica.
Como se usa en este documento, ácido nucleico heterologo es ácido nucleico que no se produce normalmente in vivo por las célula en la cual se expresa o que se produce por la célula pero está en un sitio diferente o se expresa diferentemente o que media o codifica los mediadores que alteran la expresión del ácido nucleico endógeno, tal como ADN, al afectar la transcripción, traducción, u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterologo no es generalmente endógeno a la célula en la cual se introduce, sino se ha obtenido de otra célula o se ha preparado sintéticamente. El ácido nucleico heterologo puede ser endógeno, pero es ácido nucleico que se expresa de un sitio diferente o se altera en su expresión. Generalmente, aunque no necesariamente, este ácido codifica el ARN y las proteínas que no se producen normalmente por la célula o de la misma forma en la célula en la cual se expresa. El ácido nucleico heterologo, tal como ADN, también se puede referir como ácido nucleico extraño, tal como ADN. De esta manera, el ácido nucleico heterologo o ácido nucleico extraño incluye una molécula de ácido nucleico no presente en la orientación o posición exacta como la contraparte de la molécula de ácido nucleico tal como ADN, se encuentra en un genoma. También puede referirse a una molécula de ácido nucleico de otro organismo o especie (es decir, exógena) .
Cualquier ácido nucleico, tal como ADN, y que una persona experta en el campo reconocería o consideraría heterologo o extraño a la célula en la cual el ácido nucleico se expresa se abarca en este documento por ácido nucleico heterologo; el ácido nucleico heterologo incluye ácido nucleico exógenamente agregado que también se expresa endógenamente. Ejemplos de ácido nucleico heterologo incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreables, tal como una proteína que confiere resistencia a fármacos, ácido nucleico que codifica sustancias terapéuticamente efectivas, tales como agentes anticáncer, enzimas y hormonas y ácido nucleico tal como ADN, que codifica otros ¦ tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos que se codifican por el ácido nucleico heterologo se pueden secretar o expresar sobre la superficie de la célula en la cual se ha introducido el ácido nucleico heterologo.
Como se usa en este documento, un producto terapéuticamente efectivo para la terapia génica es un producto que se codifica por el ácido nucleico heterologo, típicamente ADN, que, en la introducción del ácido nucleico en un hospedero, se expresa un producto que mejora o elimina los síntomas, manifestaciones de una enfermedad heredada o adquirida que cura la enfermedad. También se incluyen
moléculas de ácido nucleico biológicamente activas, tal como ARNi de antisentido.
Como se usa en este documento, la citación de que un polipéptido "consiste esencialmente" de una secuencia citada de aminoácidos propone que únicamente la porción citada, o un fragmento de la misma, del polipéptido de longitud completa este presente. El polipéptido puede opcionalmente y podrá generalmente, incluir aminoácidos adicionales de otra fuente o se puede insertar en otro polipéptido.
Como es usa en este documento, las formas singulares
"un", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a compuesto, que comprende "un dominio extracelular" incluye compuestos con una o una pluralidad de dominios extracelulares.
Como se usa en este documento, intervalos y cantidades es pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 bases" propone "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases."
Como se usa en este documento, . "opcional" u "opcionalmente" propone que el evento o circunstancia subsecuentemente descritos ocurra o no y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia ocurre en casos
donde no. por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido propone que el grupo sea insustituido o sea sustituido.
Como se usa en este documento, las abreviaturas para cualquiera de los grupos protectores, aminoácidos y otros compuestos, están, a menos que se indique de otra manera, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Nomenclatura de la Comisión en la Bioquímica IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11: 1726). ¦
B. Descripción General de la Hemostasis
Se proporcionan en este documento polipéptidos de Factor
VII (FVII) modificados. Estos polipéptidos FVII se diseñan para tener actividad coagulante incrementada. Por consiguiente, estos polipéptidos tienen una variedad de usos y aplicaciones, por ejemplo, como agentes terapéuticos para modular la hemostasis, y otros procesos biológicos relacionados. Para apreciar las modificaciones proporcionadas en este documento y el uso de estas moléculas FVII modificadas, es ventajoso un entendimiento del sistema hemostático y la cascada de coagulación de la sangre. El siguiente planteamiento proporciona este antecedente, preliminar a un planteamiento del factor VII, y modificaciones de los mismos.
La hemostasis es el mecanismo fisiológico que surge a raíz del sangrado que resulta de una lesión a la vasculatura.
La hemostasis normal depende de componentes celulares y proteínas plasmáticas solubles, e implica una serie de eventos de señalización que conduce finalmente a la formación de un coágulo sanguíneo. La coagulación se inicia rápidamente después de que ocurre una lesión al vaso sanguíneo y se dañan las células endoteliales . En la primera fase de la coagulación, las plaquetas se activan para formar un tapón hemostático en el sitio de la lesión. La hemostasis secundaria sigue implicando los factores de coagulación plasmáticos, los cuales actúan en una cascada proteolítica que da por resultado la formación de hebras de fibrina las cuales fortalecen el tapón de plaquetas.
En la lesión del vaso, el flujo sanguíneo al área lesionada inmediata se restringe por la constricción vascular permitiendo que las plaquetas se adhieran al colágeno fibrilar recientemente expuesto sobre el tejido conjuntivo sub-endotelial . Esta lesión es dependiente del factor von Willebrand (vWF) , el cual se enlaza al endotelio dentro de tres segundos de la lesión, facilitando en consecuencia la adhesión y la agregación de las plaquetas. La activación de las plaquetas agregadas da por resultado la secreción de una variedad de factores, que incluyen ADP, ATP, tromboxano y serotonina. Las moléculas de adhesión, fibrinógeno, vWF, trombospondina y fibronectina también se liberan. Esta
secreción promueve la adhesión y agregación adicional de las plaquetas, la activación de las plaquetas incrementada y la constricción del vaso sanguíneo, y la exposición de fosfolípidos aniónicos sobre la superficie de la plaqueta que sirve como plataformas para un ensamble de los complejos de enzimas de coagulación de la sangre. Las plaquetas cambian de forma conduciendo a la formación pseudópoda, la cual facilita además la agregación a otras plaquetas que dan por resultado un tapón de plaquetas suelto.
Una cascada de coagulación de peptidasas (la cascada de coagulación) se. inicia simultáneamente. La cascada de coagulación implica una serie de eventos de activación que implican la escisión proteolítica . En esta cascada una proteína inactiva de una serina proteasa (también llamada un zimógeno) se convierte a una proteasa activa mediante la escisión de uno o más enlaces de péptido, los cuales luego sirven como la proteasa de activación para la siguiente molécula zimógeno en la cascada, dando por resultado finalmente la formación del coágulo por la reticulación de la fibrina. Por ejemplo, la cascada genera moléculas activadas tal como trombina (de la escisión de la protrombina ) , la cual activa además las plaquetas, y también genera la fibrina de la escisión del fibrinógeno. La fibrina luego forma un polímero reticulado alrededor del tapón de plaquetas para
estabilizar el coágulo. En la reparación de la lesión, la fibrina se digiere por el sistema fibrinolitico, los componentes principales de los cuales son el plasminógeno y el activador de plasminógeno de tipo de tejido (tPA) . Ambas de estas proteínas se incorporan en la polimerización de la fibrina, donde interactúan para generar la plasmina, la cual, a su vez, actúa sobre la fibrina para disolver el coágulo preformado. Durante la formación del coágulo, los inhibidores del factor de coagulación también circulan a través de la sangre para evitar la formación de coágulo más allá del sitio de la lesión.
La interacción del sistema, desde la lesión hasta la formación del coágulo y la fibrinólisis subsecuente, se describe a continuación.
1. Adhesión y Agregación de Plaquetas
La coagulación de la sangre se evita activamente bajo condiciones normales. El endotelio vascular soporta la vasodilatación, inhibe la adhesión y activación de las plaquetas, suprime la coagulación, mejora la escisión de la fibrina y es antiinflamatorio en naturaleza. Las células endoteliales vasculares secretan moléculas tales como óxido nitroso (NO) y prostacilina, las cuales inhiben la agregación de plaquetas y dilatan los vasos sanguíneos. La liberación de estas moléculas activa las guanilato-ciclasas solubles (sGC)
y proteína cinasa I (cGKI) dependiente de cGMP e incrementa los niveles del monofosfato de guanosina cíclica (cGMP) , los cuales causan la relajación del músculo liso en la pared del vaso. Adicionalmente, las células endoteliales expresan ADPasas de la superficie celular, tal como CD39, las cuales controlan la activación y agregación de las plaquetas al convertir la ADP liberada de las plaquetas en inhibidores de plaqueta de nucleótidos de adenina. El endotelio también desempeña una función importante en la regulación de las enzimas en la cascada fibrinolítica . Las células endoteliales promueven directamente la generación de plasmina a través de la expresión de los receptores del plasminógeno (anexina II) y urocinasa, así como también la secreción de los activadores de plasminógeno de tipó de tejido y urocinasa, todos de los cuales promueven la eliminación de coágulos. En una capa final de la regulación protrombótica, las células endoteliales desempeñan una función activa en inhibir la cascada de coagulación al producir sulfato de heparano, el cual incrementa la cinética de la inhibición de la antitrombina III de la trombina y otros factores de coagulación .
Bajo trauma vascular agudo, sin embargo, los mecanismos ¦vasoconstrictores predominan y el endotelio es protrombótico, procoagulante y pro-inflamatorio en naturaleza. Esto se logra
por una reducción de agentes de. dilatación endoteliales: adenosina, NO y prostaciclina ; y la acción directa del ADP, serotonina y tromboxano sobre las células del músculo liso vascular para inducir su contracción (Becker, Heindl y colaboradores 2000). El desencadenador principal para el cambio en la función endotelial que conduce a la formación de trombo hemostático es la pérdida de la barrera celular endotelial entre los componentes de matriz sanguínea y extracelular (ECM) (Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234). Las plaquetas circulantes se identifican y discriminan áreas de lesiones endoteliales y se adhieren al sub endotelio expuesto. Su interacción con los diversos substratos trombogénicos y los agonistas generados o liberados localmente da por resultado la activación de las plaquetas. Este proceso se describe por poseer dos etapas, 1) adhesión: el anclaje inicial a- una superficie, y 2) agregación: cohesión plaqueta-plaqueta (Savage y colaboradores (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276).
La adhesión de las plaquetas se inicia cuando las plaquetas circulantes se enlazan al colágeno expuesto a través de la interacción con las proteínas de enlace de colágeno sobre la superficie celular, y a través de la interacción con vWF, también presente sobre el endotelio, la proteína vWF es una estructura multimérica de tamaño
variable, secretada en dos direcciones por el endotelio basolateralmente y dentro de · la corriente sanguínea. El vWF también se enlaza al factor VIII, el cual es importante en la estabilización del factor VIII y su supervivencia en la circulación .
La adhesión y activación subsecuente de las plaquetas se logra cuando el vWF se enlaza por la vía de su dominio Al a GPIb (parte del complejo receptor de glicoproteína de plaquetas GPIb-IX-V) . La interacción entre vWF y GPIb se regula por una fuerza cortante tal que un incremento en la tensión de esfuerzo cortante da por resultado un incremento correspondiente en la afinidad de vWF para GPIb. La integrina a1ß2, también conocida sobre los leucocitos como VLA-2, es el receptor de colágeno principal sobre las plaquetas, y el acoplamiento a través de este receptor genera las señales intracelulares que contribuyen a la activación de las plaquetas. El enlace a través del a1ß2 facilita el acoplamiento del receptor de colágeno de afinidad más baja, GP VI. Esto es parte de la superfamilia de inmunoglobulinas y es el receptor de genera las señales intracelulares más potentes para la activación de las plaquetas. La activación de las plaquetas da por resultado la liberación de difosfato de adenosina' (ADP) , el cual se convierte a tromboxano A2.
La activación de las plaquetas también da por resultado
la expresión superficial de los receptores de glicoproteina Ilb-IIIa (GP Ilb-IIIa) de plaquetas, también conocidos como ????ß3 integrina. ¦ Los receptores ¦ GP Ilb-IIIa permiten la adherencia de las plaquetas entre si (es decir agregación) en virtud de las moléculas de fibrinógeno que se enlazan a las plaquetas a través de estos receptores. Esto da por resultado la formación de un tapón de plaquetas en el sitio de la lesión para ayudar a prevenir la pérdida de sangre adicional, mientras que el tejido vascular dañado libera factores que inician la cascada de coagulación y la formación de una malla de fibrina estabilizante alrededor del tapón de plaquetas. 2. Cascada de coagulación
La trayectoria de coagulación es una trayectoria proteolitica donde cada enzima está presente en el plasma como un zimógeno, o forma inactiva. La escisión del zimógeno se regula para liberar la forma activa de la- molécula precursora. Los cofactores de las proteasas activadas, tales como las glicoproteinas FVIII y FV, también es activan en la reacción de cascada y desempeñan una función en la formación del coágulo. La trayectoria funciona como una serie de bucles de. retroalimentación positiva y negativa los cuales controlan el proceso de activación, donde la meta final es producir trombina, la cual luego puede convertir el . fibrinógeno soluble en fibrina para formar un coágulo. Los factores en la
coagulación se proporcionan típicamente como un número numérico romano, con una minúscula "a" anexada para indicar una forma activada. La Tabla 3 a continuación expone una lista ejemplar de los factores, que incluyen su nombre común, y su función en la cascada de coagulación. Generalmente estas proteínas participan en la coagulación de la sangre a través de una o más de las vías intrínsecas, e extrínsecas o comunes de coagulación (véase la Figure 1) . Como se plantea posteriormente, estas vías se interconectan, y la coagulación de la sangre que cree que ocurren a través de un modelo basado en células de la activación en el Factor VII (FVII) que es el iniciador primario de la coagulación.
Tabla 3
Factores de Coagulación
Factor Nombre Común Via Característica
I Fibrinógeno Ambas - II Protrombina Ambas Contiene el dominio Gla N- terminal
III Factor de tejido Extrínseca - IV Calcio Ambas - V Proacelerina, factor Ambas Cofactor de lábil, globulina proteina
Aceleradora
VI Acelerina (Redundante al (Va) factor V)
VII Proconvertina, Extrínseca Endopeptidasa acelerador de con dominio Gla conversión de
protrombina de suero
(SPCA)
cotromboplastina
VIII Factor A Intrínseca Cofactor de antihemofiliaco, proteína globulina
antihemofiliaca
(AHG)
IX Factor navidad, Intrínseca Endopeptidasa factor B, con el dominio antihemofiliaco, Gla
componente de
tromboplastina en
plasma (PTC)
X Factor de potencia Ambas Endopeptidasa
Stuart con domino Gla
XI Antecedente de Intrínseca Endopeptidasa tromboplastina en
plasma (PTA)
XII Factor de Hageman Intrínseca Endopeptidasa
XIII Protransglutamidasa , Ambas Transpeptidasa factor estabilizador
de fibrina (FSF) ,
fibrinoligasa
* Tabla adaptada de M.W. King (2006) en
med . unibs . it/~marchesi/blood . html
La generación de la trombina se ha dividido históricamente en tres trayectorias, la trayectoria
intrínseca (se sugiere que todos los componentes de la trayectoria son intrínsecos al plasma) y extrínseca (que
sugiere que uno o más componentes de la trayectoria sean
extrínsecos al plasma) que proporcionan rutas alternativas
para la generación del factor X activado (FXa), y la
trayectoria común final la cual da por resultado la formación de trombina (Figura 1). Estas trayectorias participan conjuntamente en un proceso interconectado e interdependiente para afectar la coagulación. Se desarrolló un modelo de coagulación basado en células que describe estas vías (Figura 2) (Hoffman y colaboradores (2001) Thromb Haemost 85:958-965). En este modelo, las trayectorias "extrínsecas" e "intrínsecas" se efectúan sobre diferentes superficies celulares, la célula que lleva el factor de tejido (TF) y la plaqueta, respectivamente. El proceso de coagulación se separa en fases distintas,. iniciación, amplificación y propagación, durante lo cual las- trayectorias extrínsecas e intrínsecas funcionan en varias etapas para producir la gran explosión de trombina requerida para convertir cantidades suficientes de fibrinógeno a fibrina para la formación del coágulo .
a. Inicio
El FVII se considera que es el factor de coagulación responsable para la iniciación de la cascada de coagulación, lo cual la iniciación es dependiente de su interacción con el TF. El TF es una glicoproteína de transmembrana expresada por una variedad de células tales como células del músculo liso, fibroblastos, monocitos, linfocitos, granulocitos , plaquetas y células endoteliales . Las células mieloides y las células
endoteliales expresan únicamente TF cuando se estimulan, tal como mediante citocinas pro-inflamatorias. Las células del músculo liso y fibroblastos, sin embargo, expresan TF constitutivamente. Por consiguiente, una vez que estas células entran en contacto con la corriente sanguínea después de la lesión del tejido, la cascada de coagulación se inicia rápidamente por el enlace del TF con el factor VII o FVIIa en el plasma.
Como se plantea posteriormente, la mayoría de FVII en la sangre está en la forma de zimógeno con una pequeña cantidad, aproximadamente 1%, presente como FVIIa. En la ausencia del enlace de TF, sin embargo, aún FVIIa tiene características similares a zimógeno y no muestra actividad significativa hasta que se forma en complejo con TF. De esta manera, el FVII plasmático requiere activación por la escisión proteolítica, y el cambio conformacional adicional a través de la interacción con TF, para la actividad completa. Una gama de proteasas, que incluyen factores IXa, Xa, Xlla, y trombina, se han mostrado que son capaces de la escisión de FVII in vitro, un proceso el cual se acelera en presencia del TF. El FVIIa por sí mismo, también puede activar FVII en presencia de TF, un proceso llamado autoactivación . Las pequeñas cantidades de FVIIa en la sangre son probablemente debido a la activación por FXa y/o FlXa ( ildgoose y
colaboradores (1992) Blood- 80:25-28, y Butenas y colaboradores (1996) Biochemistry 35:1904-1910). Los complejos TF/FVIIa se pueden formar de esta manera por el enlace directo de FVIIa a TF, o por el enlace de FVII a TF y luego la activación subsecuente de a FVII a FVIIa por una proteasa plasmática, tal como FXa, FlXa, FXIIa, o FVIIa misma. El complejo TF/FVIIa permanece anclado a la célula que lleva TF donde activa pequeñas cantidades de FX en FXa en lo que es conocido como la "trayectoria extrínseca" de la coagulación.
El complejo TF/FVIIa ' también escinde pequeñas cantidades de FIX en FlXa. El FXa se asocia con su cofactor FVa también para formar un complejo sobre la célula que lleva TF que luego puede convertir la protrombina a trombina. La pequeña cantidad de trombina producida es, sin embargo, inadecuada para soportar la formación de fibrina requerida para completar la coagulación. Adicionalmente, cualquier FXa e FlXa activo se inhiben en la circulación por la antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, las cuales se plantean con más detalle posteriormente. Esto evitaría normalmente la formación de coágulos en la circulación. En presencia de una lesión, sin embargo, el daño a la vasculatura da por resultado la agregación y activación de plaquetas en este sitio de formación de trombina, permitiendo en consecuencia
la amplificación de la señal de coagulación.
b. Amplificación
La amplificación tiene lugar cuando la trombina se enlaza a y activa las plaquetas. Las plaquetas activadas liberan FV de sus gránulos alfa, los cuales se activan por la trombina a FVa. La trombina también libera y activa FVIII del complejo FVIII/vWF sobre la. membrana de las plaquetas, y escinde, FXI en FXIa. Estas reacciones generan plaquetas activadas que tienen FVa, FVIIIa y FlXa sobre su superficie, lo cual ajusta la etapa para una gran explosión de generación de trombina durante la etapa de propagación.
c . Propagación
La propagación de · la coagulación ocurre sobre la superficie de grandes números de plaquetas en el sitio de la lesión. Como se describe anteriormente, las plaquetas activadas tienen FXIa, FVIIIa y FVa sobre su superficie. En este punto es que la vía extrínseca se efectúa. El FXIa activa FIX a FlXa, el cual luego se puede enlazar con FVIIIa. Este proceso, además de las pequeñas cantidades de FlXa que se genera por la escisión de FIX por el complejo TF/FVIIa sobre la célula que lleva TF, genera grandes números de complejos FXIa/FVIIIa los cuales a su vez pueden activar cantidades significativas' de FX a FXa . Las moléculas de FXa se enlazan a FVa para generar los complejos de protrombinasa
que activan la protrombina a trombina. La trombina actúa en un circuito de retroalimentación positiva para activar incluso más las plaquetas y nuevamente inicia los procesos descritos para la fase de amplificación.
Dentro de poco tiempo, existen suficientes números de plaquetas activadas con los complejos apropiados para generar la explosión de trombina que es suficientemente grande para generar suficientes cantidades de trombina de fibrinógeno para formar un coágulo de fibrina hemostática. El fibrinógeno es un dimero soluble en plasma el cual, cuando se escinde por la trombina libera fibrinopéptido ' A y fibrinopéptido B. el fibrinopéptido B luego se escinde por la trombina, y los monómeros de fibrina formados por esta segunda escisión proteolitica forma espontáneamente un gel insoluble. La fibrina polimerizada se. mantiene junta por fuerzas no covalentes y electrostáticas y se estabiliza por el factor XlIIa (FXIIIa), de factor de enzima de transamidación, producido por la escisión de FXIII por la trombina. La trombina también activa TAFI, el cual inhibe la fibrinólisis al reducir la generación de plasmina en la superficie del coágulo. Adicionalmente , la trombina misma se incorpora dentro de la estructura del coágulo para estabilización adicional. Estos agregados (coágulos) de fibrina insoluble, conjuntamente con las plaquetas (trombos) agregados, bloquean
el vaso sanguíneo dañado y evitan el sangrado adicional.
3. Regulación de la Coagulación
Durante la coagulación, la cascada se regula por procesos constitutivos y estimulados para inhibir la formulación adicional de coágulos. Existen varias razones para tales mecanismos reguladores. Primero, la regulación es requerida para limitar la isquemia de los tejidos por la formación de coágulos de fibrina. Segundo, la regulación evita la trombosis extendida al localizar la formación de coágulos únicamente en el sitio de · la lesión del tejido.
La regulación se logra por los cationes de varias moléculas inhibidoras. Por ejemplo, la antitrombina III (AT-III) y el inhibidor de la vía del factor de tejido (TFPI) trabajan constitutivamente para inhibir los factores en la cascada de coagulación. El AT-III inhibe la trombina, FlXa, y FXa, mientras que el TFPI inhibe FXa y el complejo FVIIa/TF. Un factor adicional, Proteína C, la cual se estimula por la vía de la activación de plaquetas, regula la coagulación por la escisión proteolítica y la inactivación de FVa y FVIIIa. La Proteína S mejora la actividad' de la Proteína C. Además, otro factor que contribuye a la inhibición de la coagulación es la trombomodulina proteínica de membrana integral, la cual se produce por células endoteliales vasculares y sirve como un receptor para la trombina. El enlace de trombina a la
trombomodulina inhibe las actividades procoagulantes de la trombina y también contribuye a la activación de la proteina C.
La fibrinólisis, · la ruptura del coágulo de fibrina, también proporciona un mecanismo para regular la coagulación. Los multimeros de fibrina reticulados en un coágulo se rompen a polipéptidos solubles por la plasmina, una serina proteasa. La plasmina se puede generar de su plasminógeno precursor inactivo y r.eclutarse al sitio de un coágulo de fibrina en dos formas: mediante la interacción con el activador de plasminógeno de tejido (tPA) en la superficie de un coágulo de fibrina, y mediante la interacción con el activador de plasminógeno de urocinasa (uPA) en una superficie celular. El primer mecanismo parece que es el principal responsable para la disolución de los coágulos dentro de los vasos sanguíneos. El segundo, aunque capaz de mediar la disolución del coágulo, puede desempeñar una función principal en la remodelación del tejido, migración de células y la inflamación.
La disolución del coágulo también se regula en dos formas. Primera, la activación eficiente de la plasmina y la fibrinólisis ocurren únicamente en complejos formados en la superficie del coágulo o sobre una. membrana celular, mientras que las proteínas libre en las sangre son catalizadores ineficientes y se inactivan rápidamente. Segunda, los
activadores de plasminógeno y la plasmina se inactivan por las moléculas tal como inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PAI-1) y PAI-2 los cuales actúan sobre los activadores de plasminógeno, y a2-antiplasmina y a2-macroglobulina que inactivan la plasmina. Bajo circunstancias normales, el balance oportuno entre la coagulación y la fibrinólisis da por resultado la formación eficiente y eliminación de coágulos después de la lesión vascular, mientras que previene simultáneamente episodios trombóticos co-hemorrágicos no deseados.
Una breve descripción de los factores de coagulación ejemplares, cofactores y proteínas reguladoras, y sus actividades, se exponen en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Zimógenos del Factor de Coagulación y Cofactores
Nombre del Factor Actividad
Zimógenos de Serina Proteasa
Factor XII Enlaces de colágeno expuestos en el sitio de la lesión de la pared del vaso, activados por quininógeno con alta MW y calicreina
Factor XI Activada por el factor Xlla
Factor IX Activada por el factor Xla + Ca2+
Factor VII Activada por la trombina, factor X, factor IXa o factor Xlla + Ca2+, o autoacti ación
Factor X Activada sobre la superficie de las
plaquetas por el complejo de tenasa
(FIXa/FVIIIa) ;
También activada por el factor Vlla + factor de tejido + Ca2+, o factor Vlla + Ca2+
Factor II Activada sobre la superficie de la plaquetas por el complejo de protrombinasa (FXa/FVa)
Cofactores
Factor VIII Activada por la protrombina ; el factor Villa actúa como el cofactor para el factor IXa en la activación del factor X
Factor V Activada por la trombina; el factor
Va actúa como el cofactor para el factor Xa en la activación de la protrombina
Factor III (Factor de tejido) Actúa como el cofactor para el factor Vlla
Fibrinógeno
Factor I (Fibrinógeno) Escindido por la trombina para formar fibrina
Transglutaminasa
Factor XIII Activada por la trombina + Ca2+;
promueve la reticulación covalente de fibrina
Regulador y otras proteínas
Factor von Willebrand (v F) Actúa como puente entre el complejo
GPIb-V-IX y colágeno
Proteína C Activada por la trombina enlazada a la trombomodulina; Ca degrada los factores VIIIA y Va
Proteína S Actúa como factor de proteína C
Trombomodulina Proteína de la superficie celular endotelial; enlaza la trombina, la cual activa la proteína C
Antitrombina III Inhibidor de coagulación,
principalmente de trombina y factor
Xa, pero también los factores IXa, Xla, y Xlla, y el factor vlla formados en complejo con TF
Inhibidor de la Via del Factor de Enlaza FXa y luego forma una tejido (TFPI) estructura cuaternaria con TF/FVIIa para inhibir la actividad TF/FVIIa
*Tabla adaptada de M.W.King (2006)
med . unibs . it/-marchesi/blood . html
C. Factor VII (FVII)
El factor VII -es una glicoproteína de la serina proteasa dependiente de vitamina K que se sintetiza en animales, que
incluyen mamíferos, como un zimógeno de cadena individual en
el hígado y secretada dentro de la corriente sanguínea.' Como
se describe anteriormente, el FVII es la proteasa de
coagulación responsable para iniciar la cascada de eventos proteolíticos que conducen a la generación de trombina y a la deposición de fibrina. Es parte de la vía extrínseca, aunque los efectos corriente abajo de su actividad también impartan
grandemente sobre la vía intrínseca. Esta función integral en la formación de coágulos ha atraído el interés significativo
en el FVII como un objetivo para las terapias anticoagulantes y hemostáticas clínicas. Por ejemplo, el FVII activado
recombinante (rFVIIa) se ha desarrollado como un agente
hemostático para el uso en sujetos hemofílicos, y sujetos con
otras condiciones hemorrágicas . Se proporcionan en este
documento polipéptidos FVII modificados que se diseñan para
tener actividad de coagulación incrementada en la activación, y que pueden servir como agentes terapéuticos mejorados para tratar enfermedades y condiciones susceptibles a la terapia con factor VII.
1. Estructura y organización del FVII
El gen FVII humano (F7) se localiza sobre el cromosoma 13 en 13q34 y es 12.8 kb de largo con 9 exones. El gen FVII comparte similitud de organización significativa con los genes que codifican otras proteínas dependientes de vitamina K, tal como protrombina, factor IX, factor X y proteína C. El ARNm para FVII se somete al empalme alternativo para producir dos transcriptos: variante 1 (No. de Acceso de Genbank NM_000131, expuesto en SEQ ID NO: 81) y variante 2 (No. de Acceso de Genbank NM 019616, expuesto en SEQ ID NO: 82) . La variante de transcripción 2, la cual es la forma más abundante en el hígado, no incluye el exón Ib y de esta manera codifica un polipéptido precursor más corto de 444 aminoácidos (precursor b de isoforma FVII; SEQ ID NO:2), comparado con el polipéptido precursor de 466 aminoácido codificado por la. variante de transcripción 1 (precursor a de isoforma FVII; SEQ ID N0:1). Los aminoácidos que no están presentes en el polipéptido. precursor b de isoforma FVII corresponde a las posiciones de aminoácidos 22 a 43 del precursor a de isoforma FVII. Estos aminoácidos son parte de
la secuencia de propéptidos, que dan por resultado el propéptido b de isoforma FVII truncado. Los polipéptidos precursores están constituidos de los siguientes segmentos y dominios: un péptido de señal hidrofóbico (aa 1-20 de SEQ ID NO:l y 2), un propéptido (aa 21-60 de SEQ ID NO:l, y aa 21-38 de SEQ ID N0:2), un dominio Gla (aa 39-83 de SEQ ID NO:2, y aa 61-105 de SEQ ID NO: 1 ) , un dominio de factor de crecimiento epidérmico de tipo B (1 similar a EGF, aa 84-120 de SEQ ID NO: 2, y aa 106-142 de SEQ ID NO: 1), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo A (2 similar a EGF, aa 125-166 de SEQ ID NO: 2; y aa 147-188 de SEQ ID NO: 1), y un dominio de adicciones serina proteasa (aa 191-430 de SEQ ID NO: 2, y aa 213-452 de SEQ ID NO: 1) .
La forma madura de 406 aminoácidos del polipéptido FVII (SEQ ID NO: 3) carece de las secuencias de péptido y propéptido de señal, y es idéntica en la longitud y secuencia sin considerar el precursor de isoforma del cual se origina. En la forma madura del polipéptido FVII las posiciones de aminoácidos correspondientes para los dominios mencionados anteriormente son como sigue: dominio Gla (aa 1-45 de SEQ ID NO: 3), 1 similar a EGF' (aa 46-82 de SEQ ID NO: 3), 2 similar a EGF (aa 87-128 de SEQ ID NO: 3), y dominio serina proteasa (aa 153-392 de SEQ ID NO: 3) .
El dominio Gla de FVII es un motivo de enlace de
membrana el cual, en la presencia de iones de calcio, interactúa con las membranas de fosfolipido que incluye fosfatidilserina . El dominio Gla también desempeña una función en el enlace- al cofactor FVIIa, el factor de tejido (TF) . Formado en complejo con TF, .el dominio Gla de FVIIa se carga con siete iones Ca2+, protege tres cadenas laterales hidrofóbicas en la dirección de la membrana celular para la interacción con los fosfolipidos sobre la superficie celular, y tiene contacto significativo con el domino C-terminal de TF. El domino Gla se conserva entre las proteínas dependientes de vitamina K, tal como protrombina, factores VII, IX y X de coagulación, proteínas C, S, y Z. Las proteínas requieren ¦ vitamina K para la síntesis postraduccional del ácido ?-carboxiglutámico, un aminoácido agrupado en el dominio Gla de N-terminal de estas proteínas. Todos los residuos glutámicos presentes en el dominio son sitios de carboxilación potenciales y muchos de ellos se modifican por lo tanto mediante la carboxilación.
Además del dominio Gla, la proteína FVII madura también contiene dos dominios similares a EGF. El primer dominio similar a EGF (1 similar a EGF 1 o EGF1) es un dominio EGF de enlace de calcio, en el cual seis cisteínas de núcleo conservadas forman tres fuentes de disulfuro. El dominio EGF1 de FVII enlaza solo un ión Ca2+, pero con afinidad
significativa más alta que aquella observada con el dominio Gla (Banner y colaboradores (1996) Nature 380:41-46). Este ión Ca2+ enlazado promueve la fuerte interacción entre el dominio EGF1 de FVII y TF (Osterlund y colaboradores (2000) Eur J Biochem 267:6204-6211). El segundo dominio similar a EGF (2 similar a EGF 2 o EGF2) no es un dominio de enlace de calcio, sino también forma 3 puentes de disulfuro. Similar a los otros dominios en FVII, el dominio EGF2 interactúa con TF. También se enlaza con disulfuro junto con el dominio de proteasa, con el cual comparte una gran interface de contacto.
Finalmente, el dominio de serina proteasa de FVII es el dominio responsable para la actividad proteolitica de FVIIa. La secuencia de aminoácidos de FVII en su dominio catalítico exhibe alta identidad de secuencia y similitud de estructura terciaria con otras serina proteasas tal como tripsina y quimotripsina (Jin y colaboradores (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). Por ejemplo, estas serina proteasas comparten una triada catalítica común H57, D102, S195, con base en la numeración de la quimotripsina. Diferente a otras serina proteasas, sin embargo, la escisión de FVIIa no es suficiente para completar la conversión del zimógeno a una enzima totalmente activa. En lugar, como se plantea posteriormente, FVIIa se activa . alostéricamente en su fusión catalítica al
enlazarse al receptor de superficie celular TF, la cual induces un cambio conformacional en el dominio FVIIa proteasa que cambia de un estado inactivo similar a zimógeno a una enzima catalíticamente activa. Una región de bucle de hélice entre el sitio de enlace del co-factor de sitio activo (posiciones de residuos de aminoácidos 305-321, que corresponden a los residuos 163-170Í en la numeración de la quimotripsina) de FVIIa es importante para la alosteria y zimogenicidad de FVIIa (Persson y colaboradores (2004) Biochem J. , 379: 497-503). Esta región se compone de una hélice a corta (posiciones de residuos de aminoácidos 307 a 312) seguido por un bucle. La porción N-terminal de la hélice forma parte de la interfaz entre el dominio de proteasa y TF, y contiene una variedad de residuos que son importantes para la función proteolítica y el enlace óptimo a TF. Una comparación de la estructura de cristal de FVIIa solo y FVIIa formado en complejo con TF indica que la hélice se somete a un cambio conformacional significativo cuando FVIIa se enlaza a TF. La hélice a de FVIIa solo parece que se distorsiona, se acorta y se orienta de manera diferente. Esto afecta las estructuras de bucle adyacentes, que se mueven lejos del sitio activo. En contraste, la hélice de FVIIa cuando se forma en complejo con TF se estabiliza, y los bucles vecinos se posicionan más cerca al sitio activo. Esta estabilización
se efectúa a través de los mecanismos que indican por lo menos la metionina en la posición de aminoácidos 306 (residuo de aminoácido Met164 por la numeración de la quimotripsina) de FVII (Pike y colaboradores (1999) PNAS 8925-8930) .
2. Modificaciones Postraduccionales
El polipéptido precursor FVII (cualquier isoforma del gen del VII) se fija como objetivo a la via secretora celular por el péptido de señal hidrofóbico, el cual se inserta en el retículo endoplásmico (ER) para iniciar la translocación a través de la membrana. Mientras que la proteína se translocaliza a través de la membrana ER, el péptido de señal de 20 aminoácido se escinde por una peptidasa de señal dentro del lumen ER, después de lo cual el polipéptido se somete a modificaciones pos-traduccionales adicionales, que incluyen N- y O-glicosilación, carboxilación dependiente de vitamina K de ácidos glutámicos N-terminal a ácidos ?-carboxiglutámico, e hidroxilación de ácido aspártico a ácido ß-hidroxiaspártico .
El propéptido proporciona un sitio de enlace para una carboxilasa dependiente de vitamina K que reconoce una hélice a anfipática de 10 residuos en el propéptido FVII. Después del enlace, los ?-carboxilatos de carboxilasa de 10 residuos de ácido glutámico dentro del dominio Gla del polipéptido FVII, que produce residuos de ?-carboxiglutamilo en las
posiciones E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 y E95 relativas con la secuencia de aminoácidos precursora. FVII expuesta en SEQ ID NO: 2. Estas posiciones corresponden a las posiciones E6, E7, E 14, ? 19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. Para la actividad óptima, la molécula de FVII requiere calcio, el cual enlaza el polipéptido y facilita los cambios conformacionales necesarios para el enlace de FVIIa con TF y lipidos. El dominio Gla ?-carboxilado enlaza siete iones Ca2+ con afinidad variable, lo cual induce al cambio conformacional que permite que el dominio Gla interactúe con el dominio C-terminal de TF, y también las fosfatidilserinas u otros fosfolípidos negativamente cargados sobre la membrana de las plaquetas.
La glicosilación ligada en N se lleva a cabo por la transferencia de . Glc3 an9 (GlcNAc) a dos residuos de asparagina en el polipéptido FVII, en posiciones que corresponden a los residuos de aminoácidos 145 y 322 de la proteína madura (SEQ ID NO: 3). La glicosilación enlazada con 0 ocurre en los residuos de aminoácido 52 y 60 y en el polipéptido maduro, y la hidroxilación a un ácido ß-hidroxiaspártico ocurre en el residuo de ácido aspártico en la posición 63. Estos residuos de serina O-glicosilados y el residuo de ácido aspártico ß-hidroxilado están en el dominio
EGF-1 de FVII. Estas modificaciones se efectúan en el complejo ER y Golgi antes del procesamiento final del polipéptido a su forma madura.
3. Procesamiento del FVII
El polipéptido pro-FVII modificado se transporta a través del lumen de Golgi al compartimiento trans-Golgi donde el propéptido se escinde por una propeptidasa justo antes de la secreción de la proteina de la célula. La PACE/furina (donde PACE es un acrónimo para Enzima de Escisión de Aminoácidos Básicos Pareados) . es una endopeptidasa localizada en la membrana de Golgi que escinde muchas proteínas sobre el lado carboxi terminal del motivo de secuencia Arg- [cualquier residuo] - (Lys o Arg) -Arg. Esta propeptidasa escinde las glicoproteínas dependientes de vitamina K tal como los polipéptidos de pro-factor IX y pro-v F (Himmelspach y colaboradores (2000) Thromb Research 97; 51-67), liberando el propéptido de la proteína madura. La inclusión de un sitio de reconocimiento PACE/furina apropiado dentro de los precursores de Factor VII recombinantes facilita el procesamiento y secreción correcta del polipéptido recombinante (Margaritas y colaboradores (2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031). La PACE/furina, u otra enzima propeptidasa similar a subtilisina, es probablemente responsable por el procesamiento proteolítico de pro-FVII a
FVII. Puede reconocer y enlazarse al motivo consenso -Arg-Arg-Arg-Arg- en las posiciones de aminoácidos 35-38 de las secuencias expuestas en SEQ ID N0:1, y las posiciones 57-60 de la secuencia expuesta en SEQ · ID NO: 2, escindiendo el polipéptido y liberando la proteína madura para la secreción.
4. Activación del FVII
La vasta mayoría de FVII en la sangre está en la forma de un zimógeno de cadena individual no activado, aunque una pequeña cantidad está presente en una forma activada de dos cadenas. La activación de FVII ocurre en la escisión proteolítica en el enlace Arg152-I.le153 (posiciones relativas con el polipéptido FVII maduro, expuesto en SEQ ID NO: 3), dando origen a un polipéptido de dos cadenas que contiene una cadena ligera de 152 aminoácido (aproximadamente 20. kDa) enlazada por un puente de disulfuro a una cadena pesada de 254 aminoácido (aproximadamente 30 kDa) . La cadena ligera de FVIIa contiene el dominio Gla y los dominios similares a EGF, mientras que la cadena pesada contiene la porción catalítica o de serina-proteasa de la molécula. La conversión del FVII de cadena individual en el FVIIa de dos cadenas es mediada por la escisión por FlXa, FXa, FXIIa, trombina, o en una manera autocatalítica por el FVIIa endógeno (Butenas y colaboradores (1996) ' Biochem 35:1904-1910; Nakagaki y colaboradores (1991) Biochem 30:10819-10824). La- cantidad
traza de FVIIa que ocurre en la circulación surge probablemente de la acción de FXa y FlXa.
Como se plantea anteriormente, la escisión de FVII de su forma de zimógeno a FVIIa no es suficiente para la actividad total. FVIIa requiere la asociación con TF para la actividad total (Higashi y colaboradores (1996) J Biol Chem 271 : 26569-26574) . Debido a este requerimiento, FVIIa solo se han escrito características similares a zimógeno, que muestra el plegamiento y forma del zimógeno, y exhibe actividad relativamente baja. Esta característica similar a zimógeno de FVIIa en ausencia de su asociación con TF lo hace relativamente resistente a la antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, las cuales actúan generalmente, principalmente sobre las formas activas de la serina proteasa antes que la forma de zimógeno. Además, TFPI, el inhibidor principal de la actividad de TF/FVIIa, tampoco se enlaza eficientemente a la forma no formada en complejo "inactiva" de FVIIa.
En la formación de complejos con TF, el FVIIa se somete a un cambio conformacional que permite actividad total de la molécula. Todos los .dominios FVII se implican en la interacción con TF, pero los cambios conformacionales que ocurren se localizan en el dominio de proteasa de FVIIa. Por ejemplo, los cambios conformacionales que ocurren en la
interacción alostérica de FVIIa y TF incluyen la creación de un exositio de enlace de substrato macromolecular extendido. Este sito de enlace extendido mejora grandemente la activación proteolitica mediada por FVII del factor X.
La actividad de FVIIa se incrementa adicionalmente (es decir miles de veces) cuando la interacción de FVIIa es con el TF de superficie celular expresada. Esto es debido a que las membranas de fosfolipido que contiene fosfolipidos negativamente cargados, tal como fosfatidilserina , son un sitio de interacción de otros factores de coagulación dependientes de vitamina K tal como FIX y FX, los cuales se enlazan por la via de sus dominios Gla. De esta manera, la concentración local de estas proteínas dependientes de vitamina K es más alta en la superficie celular, promoviendo su interacción con el complejo TF/FVIIa.
5. Función del FVII
Aunque el FVIIa exhibe actividad incrementada después de la activación alostérica por el TF, hay evidencia de que los mecanismos existen en los cuales el FVIIa solo puede iniciar la coagulación. Por consiguiente, el FVII puede funcionar de una manera dependiente de TF e independiente de TF. Esta última vía puede desempeñar una función mucho más pequeña en la hemostasis normal, aunque su importancia podría incrementarse cuando se considera en el contexto de los
trastornos de sangrado, y el tratamiento de los mismos.
a. Actividad del FVIIa dependiente del factor de tejido
El FVII circulante enlaza el TF de superficie celular y se activa por FlXa, FXa, trombina, o de una manera autocatalitica por el FVIIa endógeno como se describe anteriormente. Alternativamente, la cantidad muy pequeña de FVIIa circulante puede enlazar directamente TF. El complejo TF/FVIIa luego enlaza una fracción pequeña del FX plasmático y el dominio catalítico de FVIIa escinde a FX para producir FXa. La trombina se forma de esta manera por la vía de la ruta extrínseca sobre la superficie de la célula que lleva TF, cuando FXa se forma en complejo con FVa y activa la protrombina a trombina (Figura 3). El FIX también se activa por el complejo TF/FVIIa, proporcionando un enlace a la vía intrínseca que opera sobre la superficie de la plaqueta activada. Los sistemas de retroalimentación positiva de la cascada de coagulación descrita anteriormente proporcionan los medios por los cuales se producen grandes cantidades de trombina, la cual escinde el fibrinógeno en fibrina para formar un coágulo.
b. Actividad del FVIIa independiente del factor de tejido
Además del mecanismo dependiente de TF para la activación de FX a FXa, existe evidencia que FVIIa también
puede activar FX en ausencia de TF. Las plaquetas activadas translocalizan las fosfatidilserinas y otros fosfolipidos negativamente otros fosfolipidos negativamente cargados- a la superficie de plasma orientada, exterior. (Hemker y colaboradores (1983) Blood Cells 9:303-317). Estas proporcionan "receptores" alternativos a través de los cuales FVIIa puede enlazarse, aunque con una afinidad relativamente baja que es 1000 veces menor que la afinidad de enlace de FVIIa a TF (Monroe y colaboradores (1997) Br J Haematol 99:542-7). Esta interacción es mediadas a través de residuos en el dominio Gla (Harvey y colaboradores (2003) 278:8363-8369) . El FVIIa puede convertir FX a FXa y FIX a FlXa sobre la superficie de plaquetas activadas (Hoffman y colaboradores (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9:S61-S65). El FXa permanece asociado con la superficie de plaquetas, donde se puede enlazar a FVa y generar suficiente trombina de la protrombina mientras que los ensambles de FlXa recientemente formados con FVIIIa para catalizar la activación de más de FX a FXa (Figura 3) . La hemostasis en ausencia de TF luego se puede lograr por los mecanismos de retróalimentación y propagación positiva descrita anteriormente. Es notable, sin embargo, que mientras que FVIIIa puede contribuir al proceso de coagulación sobre la plaqueta activada, su presencia no es requerida para la generación de. trombina en un mecanismo
independiente de TF (Figura 3). De esta manera, en ausencia de FVIII, tal como en pacientes con hemofilia, existe evidencia de que el FVIIa puede iniciar y/o amplificar la generación de trombina a través de este mecanismo secundario y efectuar la formación de coágulos.
6. FVII como un biofarmacéutico
El FVII funciona para iniciar la coagulación de la sangre. El FVIIa recombinante (NovoSevenMR; rFVIIa) se aprueba para el tratamiento de episodios hemorrágicos o prevención de hemorragia en procedimientos quirúrgicos o invasivos en pacientes que tienen hemofilia A o B con inhibidores para el Factor VIII o Factor IX, y en pacientes con deficiencia del Factor VII congénita. El NovoSevenMR es una preparación genéticamente diseñada del factor Vlla que se produce en un sistema de expresión de mamífero usando células de riñón de hámster bebes (BH ) . El agente es casi idéntico al factor Vlla derivado de plasma en su estructura y función (Ratko y colaboradores (2004), P & T, 29: 712-720).
La administración de. FVIIa recombinante (rFVIIa) se ha mostrado que promueve la coagulación de la sangre en pacientes que sufren de hemofilia, y el tratamiento con dosis de FVIIa se ha descubierto que es segura y bien tolerada en sujetos humanos. Típicamente, el uso de rFVIIa ha sido en pacientes quienes han desarrollado inhibidores (es decir
aloanticuerpos ) al Factor VIII o Factor IX. El uso de rFVIIa como un coagulante se ha extendido al tratamiento de otros trastornos de sangrado, por ejemplo trombastenia de Glanzmann; otros eventos asociados con hemorragia extensiva, tal como un resultado de trauma o cirugía que incluye, pero no se limita a, trasplantes de hígado, cirugía de la próstata y trauma hemorrágico; coagulopatías neonatales, enfermedad hepática grave; trasplante de médula ósea, trombocitopenias y trastornos de la función de plaquetas; reversión urgente del anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X, y XI; y enfermedad de von illebrand con inhibidores al factor von Willebrand.
Una dosis alta de rFVII es requerida para lograr un efecto terapéutico. La dosis y régimen de dosificación requerido para la administración de rFVII varía dependiendo de la indicación clínica. Por ejemplo, la dosificación típica de rFVII para los episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o hemofilia B que tienen aloanticuerpos es 90 pg/kg administrado por inyección intravenosa (IV). Puesto que rFVII tiene una vida media de 2 horas, se requiere dosificación repetida. La dosificación adicional se puede proporcionar cada dos horas hasta que se logra la hemostasis. El intervalo de dosificación se puede alterar dependiendo de la gravedad de la condición. Por ejemplo, las dosis que
varían de 35 - 120 pg/kg han sido eficaces. También, la dosis y régimen de dosificación puede variar con otras indicaciones. Por ejemplo, los pacientes con hemofilia A o hemofilia B que se someten a la cirugía se pueden administrar con una dosis inicial de 90 g/kg inmediatamente antes de la cirugía, con una dosificación de repetición administrada cada dos horas durante y después de la cirugía. Dependiendo de la gravedad de la cirugía y el episodio del episodio hemorrágico, la infusión de IV de bolo puede continuar cada dos a seis horas hasta que se logra la sanación. En los pacientes deficientes de FVII congénito, el rFVII se administra típicamente para evitar la hemorragia en la cirugía u otros procedimientos invasivos en 15 - 30 pg/kg cada 4-6 horas hasta que se logra la hemostasis.
El mecanismo de acción de rFVIIa para iniciar la hemostasis explica el requerimiento de dosis alta. Los pacientes con hemofilia tienen una fase de iniciación normal de coagulación, donde el complejo TF/FVIIa activa FX a FXa y conduce a la producción de trombina en el sitio de la célula que lleva TF. Después, sin embargo, el proceso de coagulación se rompe conforme los pacientes con hemofilia carece de FVIII (hemofilia A) o FIX (hemofilia B) , y por lo tanto son incapaces de formar los complejos FVIIIa/FIXa sobre la superficie de la plaqueta activada, la cual sirve normalmente
para activar grandes cantidades de FX a FXa en las fases de amplificación y propagación descritas previamente, debido a la presencia de los inhibidores, tales como TFPI y AT-III, el FXa que se produce sobre la célula que lleva TF después de la escisión por TF/FVIIa es incapaz de difundirse fácilmente entre las superficies celulares. Como resultado, la generación de trombina a gran escala sobre la superficie de la plaqueta activada no ocurre, y no se forma un coagulo.
Existe evidencia de que el efecto hemostático de altas dosis de rFVIIa se puede . lograr usando la generación dependiente de TF y/o independiente de TF de FXa por rFVIIa sobre las plaquetas activadas (Figura 3). La generación de trombina dependiente de TF se puede maximizar muy rápidamente con la saturación de moléculas TF con FVIIa endógeno y rFVIIa. En algunos casos, las altas dosis de rFVIIa pueden enlazar las plaquetas activadas y convertir FX a FXa. El FXa asociado con la ¦ superficie activa el FVa para generar suficiente trombina para la hemostasis. Puesto que rFVII se enlaza a la superficie de la plaqueta con baja afinidad, una dosis más alta de rFVII se puede requerir para la generación de trombina. La activación de FXa sobre las plaquetas activadas asegura que la hemostasis mediada por rFVIIa se localiza al sitio de la lesión.
Un medio para lograr una dosificación reducida de rFVII
puede mejorar su utilidad y eficiencia como un fármaco. Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII. Entre éstos son los polipéptidos FVII modificados que exhiben resistencia incrementada a AT-III y actividad catalítica incrementada en presencia y/o ausencia de TF. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento también pueden exhibir resistencia incrementada a TFP1, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media de suero incrementada, enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas, enlace incrementado y/o afinidad para la albúmina de suero, y/o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas anbP . Estos polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada. Los polipéptidos FVII proporcionados en este documento se pueden usar en tratamientos para iniciar la hemostasis en un mecanismo dependiente de TF y/o independiente de TF tal que FXa se produce y la trombina se genera.
D. Polipéptidos FVII modificados
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados. Los polipéptidos FVII exhiben alteraciones en una o más actividades o propiedades comparadas con el polipéptido FVII que¦ no se modifica de esta manera. Las actividades o propiedades que se pueden alterar como
resultado de la modificación incluyen, pero no se limitan a, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolitíca o catalítica tal como para efectuar la activación del factor X (FX) o la activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad de enlazarse a o competir con un polipéptido para enlazarse a un anticuerpo anti-FVII); capacidad para enlazar el factor de tejido, factor X o factor IX; capacidad para enlazarse a los fosfolípidos ; vida media; estructura tridimensional; pi; y/o conformación. Típicamente, los polipéptidos FVII , modificados exhiben actividad procoagulante. Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que exhiben actividad coagulante incrementada en la activación de su forma de zimógeno de cadena individual. Estos polipéptidos FVII modificados se pueden usar en el tratamiento de trastornos o eventos hemorrágicos, tales como hemofilias o lesiones, donde los polipéptidos FVII pueden funcionar para promover la coagulación de la sangre. Incluidos entre estos polipéptidos FVII modificados son aquellos que tienen resistencia incrementada a los inhibidores tal como la antitrombina III (AT-III) y el inhibidor de vía de factor de tejido (TFPI), aquellos que tienen resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, aquellos que tienen actividad catalítica incrementada en presencia y/o ausencia de TF, aquellos que
tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media incrementada, aquellos que tienen enlace y/o afinidad incrementada para la superficie de la plaqueta, aquellas que tienen enlace y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y aquellos que tienen enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de la plaqueta
En particular, estos polipéptidos FVII modificados se pueden usar en enfermedades o condiciones para proporcionar actividad coagulante mientras que al mismos tiempo desvian los requerimientos para FVIIIa y FlXa. En un ejemplo, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar en pacientes hemofilicos que tienen autoanticuerpos FVIIIa y FlXa. Por consiguiente, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento ofrecen ventajas que ocurre una disminución en la cantidad de FVII administrado que es requerido para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para la hemostasis. Esto puede conducir a, por ejemplo, dosis más bajas y/o frecuencia de dosificación necesaria para . lograr efectos biológicos comparables, comodidad superior y aceptación por los sujetos, y atenuación de los efectos secundarios.
Las modificaciones en un polipéptido FVII se pueden hacer para cualquier forma de un polipéptido FVII, que incluye variantes alélicas y especies, variantes de empalme,
variantes conocidas en el campo o moléculas FVII híbridas o quiméricas. Por ejemplo, las modificaciones proporcionadas en este documento se pueden hacer en un polipéptido FVII precursor expuesto en SEQ ID NOS: 1 o 2, un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquiera de las especies, variantes alélicas o modificadas y fragmentos activos de las mismas, que tiene 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de los polipéptidos FVII expuestos en SEQ ID NOS: 1-3. Las variantes alélicas de FVII incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de aquellos polipéptidos precursores que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 18-74. Variantes de especies ejemplares para la modificación en este documento incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos humanos y no humanos que incluyen polipéptidos FVII de vaca, ratón, chimpancé enano, chimpancé, conejo, rata, mono rhesus, cerdo, perro, pez cebra, pez globo, pollo, orangután y polipéptidos FVII de gorila, aquellas secuencias se exponen en SEQ ID NOS: 4-17 respectivamente. Las modificaciones en un polipéptido FVII se pueden hacer para un polipéptido FVII que también contiene otras modificaciones, tales como aquellas descritas en el campo, que incluyen modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones no en la secuencia primaria del polipéptido.
La modificación de los polipéptidos FVII también incluye la modificación de los polipéptidos que son híbridos de polipéptidos FVII diferentes y también polipéptidos FVII sintéticos preparados recombinantemente o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en el camp con base en la secuencia de los polipéptidos conocidos. Por ejemplo, con base en la alineación de FVII con otros miembros de la familia del factor de coagulación, tal como el factor IX (FIX) o factor X (FX), dominios homólogos entre los miembros de la familia se identifican fácilmente. Las variantes quiméricas de los polipéptidos FVII se pueden construir donde uno o más aminoácidos o dominios enteros se reemplazan en la secuencia de aminoácidos FVII usando la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia correspondiente. Adicionalmente , los polipéptidos FVII quiméricos incluyen aquellos donde uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos FVII humana usando la secuencia de aminoácidos de una especie diferente véase, por ejemplo, Williamson y colaboradores (2005) J Thromb Haemost 3: 1250-6). Estas proteínas quiméricas se pueden usar como el polipéptido FVII no modificado, de partida en este documento.
Las modificaciones proporcionadas en este documento de un polipéptido de referencia no modificado, de partida
incluyen reemplazos de aminoácidos o sustitución, adiciones o supresiones de aminoácidos, o cualquiera combinación de los mismos. Por ejemplo,. los polipéptidos FVII modificados incluyen aquellos con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más de posiciones modificadas. También se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados con dos o más modificaciones comparadas con un polipéptido FVII de referencia de partida. Los polipéptidos FVII modificados incluyen aquellos con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más de posiciones modificadas. Cualquier modificación proporcionada en este documento se puede combinar con cualquier otra modificación conocida por aquellas personas expertas en el campo siempre y cuando el polipéptido FVII modificado resultante exhiba actividad de coagulación incrementada cuando está en su forma de dos cadenas. Típicamente, los polipéptidos FVII modificados exhiben actividad coagulante incrementada. Las actividades o propiedades que se pueden alterar como resultado de la modificación incluyen, pero no se limita a, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como efectuar la activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad de en lazarse a o competir
con un polipéptido para enlazarse a un anticuerpo anti-FVII); capacidad para enlazarse al factor de tejido, factor inhibidor del factor de tejido (TFPI), antitrombina III, factor X o factor IX; capacidad para enlazarse a fosfolipidos, albúmina de suero o integrina de plaquetas a??5ß3 vida media del suero; estructura tridimensional; pi; y/o conformación. Incluidos entre los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento son aquellos que tienen resistencia incrementada a la antitrombina III (AT-III), actividad catalítica incrementada en presencia y/o ausencia de TF, resistencia incrementada al inhibidor de la vía del factor de tejido (TFPI), resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media de suero incrementada, actividad intrínseca incrementada, glicosilación alterada, afinidad y/o enlace incrementado para la albúmina de suero, afinidad y/o enlace incrementados para la integrina de plaqueta y/o afinidad y/o enlace incrementados para las plaquetas activadas.
En algunos ejemplos, una modificación puede afectar dos o más propiedades o actividades de un polipéptido FVII. Por ejemplo, una modificación puede dar por resultado una resistencia incrementada AT-III y actividad catalítica incrementada del polipéptido FVII modificado comparado con un
polipéptido FVII no modificado.. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden someter a ensayo para cada propiedad y actividad para identificar el intervalo de efectos de una modificación. Estos ensayos son conocidos en el campo y se describen posteriormente. Los . polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento también incluyen polipéptidos FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria celular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glicosilados , ?-carboxilados y ß-hidroxilados .
Las modificaciones proporcionadas en este documento, para un polipéptido FVII se hacen para incrementar la resistencia a AT-III, incrementar la resistencia TFPI, incrementar la resistencia a los efectos inhibidores de Zn2+, mejorar las propiedades farmacocinéticas , tal como incrementar la vida media del suero, incrementar la actividad catalítica en presencia y/o ausencia de TF, incrementar el enlace a las plaquetas activadas, alterar la glicosilacion, incrementar la afinidad y/o enlace a la integrina de plaquetas o(nb^>3r incrementar la afinidad y/o enlace a la albúmina de suero, y/o incrementar la afinidad y/o enlace para las plaquetas activadas. Por ejemplo, un polipéptido FVII puede incluir una (s) modificación (es ) que incrementa (n) una o ambas de actividad catalítica y enlace a las plaquetas. En otros
ejemplos, cualquier modificación proporcionada en este documento se puede combinar con cualquier otra modificación conocida por aquellas personas expertas en el campo siempre y cuando el polipéptido FVII modificado resultante exhiba actividad de coagulación incrementada cuando está en su forma de dos cadenas. Típicamente, esta actividad de coagulación incrementada es debido a la resistencia incrementada a AT-III, actividad catalítica incrementada, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media del suero incrementada, resistencia incrementada a TFPI, glicosilación alterada, enlace y/o afinidad incrementada para los fosfolípidos , enlace, y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y/o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas aiIt> 3. En algunos ejemplos, las modificaciones que se introducen en. un polipéptido FVII para alterar una actividad específica o propiedad, también, o en lugar, pueden afectar otra actividad o propiedad. De esta manera, las modificaciones proporcionadas en este documento pueden afectar la propiedad o actividad que se diseñaron para afectar y una o más de otras propiedades o actividades. Por ejemplo, las modificaciones hechas a un polipéptido FVII para incrementar la actividad catalítica también pueden incrementar la resistencia a AT-III. En algunos ejemplos, una
modificación individual, tal como una sustitución de aminoácido individual, altera 2, 3, 4 o más propiedades o actividades de un polipéptido FVII. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en la presentes se pueden someter a ensayo para cada propiedad y actividad para identificar el intervalo de efectos de una modificación. Estos ensayos son conocidos en el campo y se describen posteriormente. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados es este documento también incluyen polipéptidos FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria celular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glicosilados , ?-carboxilados y ß-hidroxilados.
Las modificaciones proporcionadas en la presente se pueden hacer mediante técnicas de ADN recombinante estándares tales como son rutina para una persona experta en el campo. Cualquier método conocido en el campo efectúa la mutación de cualquiera o más de aminoácidos en una proteína objetivo que se puede emplear. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida de sitio estándar (usando por ejemplo, un kit, tal como el kit tal como QuikChange disponible de Stratagene) de la codificación de moléculas de ácidos nucleicos, o mediante, los métodos de síntesis de polipéptido de fase sólida. Además, las proteínas quiméricas modificadas proporcionadas en este documento (es decir intercambio de domino Gla) se puede
generar mediante técnicas de ADN recombinante de rutina. Por ejemplo, los polipéptidos quiméricos se pueden generar usando enzimas de restricción y metodologías de coagulación para la clonación de rutina de los componentes de polipéptido quimérico deseados.
Otras modificaciones que están o no están en la secuencia primaria del polipéptido también se pueden incluir en un polipéptido FVII modificado, o conjugado del mismo, que incluye, pero no se limita a, la adición de una porción de carbohidrato, la adición de una porción de polietilenglicol (PEG), la adición de un dominio Fe, etcétera. Por ejemplo, estas modificaciones adicionales se pueden hacer para incrementar la estabilidad o vida media de la proteína.
Los polipéptidos FVII modificados resultantes incluyen aquellos que son polipéptidos de zimógeno de cadena individual o aquellos que son polipéptidos similares a zimógeno de dos cadenas. Por ejemplo, cualquier polipéptido modificado proporcionado en este documento que sea un polipéptido de cadena individual se puede autoactivar o activar por otros factores de coagulación para generar un FVII modificado que es una forma de dos cadenas (es decir FVIIa) . Las actividades dé un polipéptido FVII modificado se exhiben típicamente en su forma de dos cadenas.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este
documento pueden exhibir resistencia a AT-III incrementada, actividad catalítica incrementada en presencia y/o ausencia de TF, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia a TFPI incrementada, por propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media del suero incrementada, glicosilación alterada, enlace y/o afinidad incrementada para los fosfolípidos , enlace y/o actividad incrementada para la albúmina de suero, y/o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas 0ínb,33. Típicamente, estas propiedades y/o actividades de los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se hacen mientras que retienen otras actividades o propiedades de FVII tal como, pero no se limitan a, enlace a TF y/o enlace y activación de FX. Por consiguiente, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento retienen el enlace TF y/o el enlace FX en la activación como es comparado con una forma de tipo silvestre o de partida del polipéptido FVII. Típicamente, esta actividad no. es cambia sustancialmente (menor que 1%, 5% o 10% cambiada) comparada con una proteína de tipo silvestre o de partida. En otros ejemplos, la actividad de un polipéptido FVII modificado se incrementa o se disminuye como es comparado con un polipéptido FVII de tipo silvestre o de partida. La actividad se .puede estimar in vitro o in vivo y
se puede comparar con el polipéptido FVII no modificado, tal como por ejemplo, el polipéptido FVII nativo de tipo silvestre maduro (SEQ ID NO: 3), el polipéptido FVII precursor de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 o 2), o cualquier otro polipéptido FVII conocido por una persona experta en el campo que se usa como el material de partida.
Por consiguiente, en virtud de las modificaciones proporcionadas en este documento, los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada, duración incrementada de la actividad coagulante, y/o un índice terapéutico mejorado. Esto se puede observar de una manera dependiente de TF y/o independiente de TF. Típicamente, la actividad coagulante incrementada, durante incrementada de la actividad coagulante, y/o un índice terapéutico mejorado de los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden observa in vivo o ex vivo en ensayos apropiados, o in vivo, tal como en la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano o no humano. La actividad incrementadas de los polipéptidos FVII modificados se puede incrementar por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 1 10%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad del polipéptido d FVIIa de
partida o no modificado.
1. Actividad catalítica incrementada
El FVII contiene un residuo de serina (posición 195 en la numeración de quimotripsin (ógeno) estándar) en su centro activo que actúa como un nucleófilo durante, la reacción de escisión. La triada catalítica de la serina proteasas también incluye dos residuos adicionales: H57 y D 102 (numeración de la quimotripsina) . La triada catalítica del FVIIa humano corresponde a H193, D242 y S344 del polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. Estos tres aminoácidos clave desempeñan cada uno una función ¦ esencial en la actividad catalítica de las proteasas. Las serina proteasas hidrolizan los enlaces de péptido por la vía de la transformación de los estados de transición tetraédricos y los intermediarios de acilo-enzima . La vía de reacción que comienza con el enlace no covalente del substrato dentro de una ranura sobre la superficie de la proteasa (es decir, la hendidura del sitio activo) que contiene H57 y S195 para formar un "complejo de Michael is- enton" . El progreso productivo a lo largo de la vía de reacción requiere el ataque nucleofílico subsecuente del residuo de carbonilo Pl del substrato por la O-gamma de la serina del sitio activo (es decir, serina 195) de la enzima para formar un estado de transición tetraédrico que se convierte rápidamente en un intermediario de acilo-enzima.
Una estructura dentro de la hendidura del sitio activo que incluye los residuos de glicina 193 y serina 195 (que corresponden a G342 y S344 del polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y se conoce como el orificio de oxianión que promueve la catálisis eficiente al estabilizar el estado de transición. Específicamente, los hidrógenos de amida de cadena principal de estos dos residuos forman los enlaces de hidrógeno de estabilización con el oxianión (es decir, el oxígeno de carbonilo del residuo Pl) que es secretado en el estado de transición tetraédrico. Además de esta estabilización, el enlace del substrato dentro del orificio de oxianión posiciona el enlace escindible apropiadamente para las reacciones de acilación y desacilación productoras que dan por resultado la escisión de enlace. La importancia del orificio de oxianión y en la actividad FVII se resalta por la observación de que las mutaciones en la posición de aminoácidos 342 (que corresponde a 193 por la numeración de quimotripsina ) puede dar por resultado una deficiencia de FVII (véase por ejemplo Bernardi y colaboradores, (1994) Br. J. Haematol . 86:610-618 y Bernardi y colaboradores, (1996) Human Mut . 8:108-1 15).
a. Modificaciones ejemplares para incrementar la actividad catalítica
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII
modificados que exhiben actividad coagulante e incrementada. Estos polipéptidos FVII se pueden generar mediante la sustitución de aminoácidos de uno o más residuos que pueden afectar la conformación el orificio del oxianión. La introducción de diferentes residuos de aminoácidos en posiciones particulares (por ejemplo, la posición 143 por la numeración de la quimotripsina in 286 por la numeración de FVII maduro) puede alterar la conformación del polipéptido FVII. modificado tal que el orificio de oxianión es más efectivo durante la catálisis. Esto puede dar por resultado un polipéptido FVII modificado con actividad catalítica incrementada comparada con un polipéptido FVII no modificado. Los cambios en la actividad catalítica debido a las mutaciones que afectan el orificio de oxianión pueden manifestarse como actividad coagulante incrementada. Los incrementos en la actividad catalítica y coagulante de los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden observar en presencia y/o ausencia del factor de tejido (es decir pueden ser dependiente de TF y/o independientes de TF) . De esta manera, cuando se evalúa en un ensayo in vitro, in vivo, o ex vivo apropiado tal como después de la administración a un sujeto como un agente terapéutico procoagulante, los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada comparada
con aquellas de los polipéptidos FVII no modificados.
La conformación del orificio de oxianión se puede alterar para inducir una conformación más efectiva mediante la modificación de uno o más residuos de aminoácidos que se implican en la formación de, o están en proximidad a, el orificio de oxianión. Como se proporciona en este documento, ejemplar de estos residuos de aminoácidos es Q286 (la numeración que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO; 3), el cual corresponde a Q143 por la numeración de quimotripsina . El Q286 se puede modificar mediante, por ejemplo, la sustitución, supresión o inserción de aminoácidos. Cuando la modificación se efectúa mediante la sustitución de aminoácidos, el residuo de glutamina en la posición 286 se puede reemplazar con cualquier otro residuo de aminoácidos.
El Q286 se localiza adyacente a y en contacto con. los residuos que forman las regiones de sitio activo y la hendidura de sitio activo del polipéptido FVII. Como tal, se ha establecido que la modificación en esta posición debe dar por resultado la actividad catalítica reducida (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6806063) . Esto se ha demostrado en estudios previos (véase, por ejemplo, Publicación de Patente Internacional No. WO2007031559) , donde el residuo de glutamina se reemplazó con una alanina (Q286A) .
El polipéptido FVIIa modificado resultado exhibe una capacidad reducida para activar el Factor X comparado con el polipéptido de tipo silvestre. En ostros estudios, la misma mutación no tuvo esencialmente efecto sobre la actividad catalítica del mutante FVIIa para el Factor X (Dickinson y colaboradores, (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA. 93:14379-14384) o un substrato sintético (Publicación de Patente Internacional No. WO2007031559) .
Como se muestra en este documento véase el Ejemplo 4 y posteriormente) , sin embargo, la modificación del polipéptido FVII en la posición 286 (numeración que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; que corresponde a la posición 143 por la numeración de la quimotripsina ) , particularmente con un residuo básico, tal como arginina (Arg, R) , da por resultado un polipéptido FVII modificado con actividad catalítica y coagulante incrementada .
De esta manera, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación, tal como un reemplazo de aminoácidos con un aminoácido básico, y en la posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 286 del. polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (posición de aminoácidos 143 por la numeración de la quimotripsina) . Las modificaciones
proporcionadas en este documento en la posición de aminoácidos 286 se pueden hacer en cualquier polipéptido FVII, que incluye un polipéptido FVII precursor expuesto en SEQ ID NOS: 1 o 2 , un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquier especie, variantes alélicas o modificadas y fragmentos activos de las mismas, que tiene 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de los polipéptidos FVII expuesto en SEQ ID NOS: 1-3.
La modificación de un polipéptido FVII en la posición de aminoácidos 286 por la numeración de FVII maduro (que corresponde al aminoácido 143 por la numeración de quimotripsina ) puede alterar la conformación del orificio de oxianión a una conformación, que- facilita la catálisis más efectiva de un substrato. La actividad catalítica incrementada de estos polipéptidos FVII modificados se puede exhibir en presencia y/o ausencia del factor de tejido, y se puede estimar usando ensayos in vitro tales como aquellos descritos en los Ejemplos 4 y 7, posteriormente. Además de exhibir actividad catalítica incrementada, los polipéptidos FVII que se han modificado en la posición de aminoácidos 286 por la numeración de FVII maduro también pueden exhibir resistencia incrementada a AT-III. Esto puede ser debido a, por ejemplo, el enlace reducido del polipéptido FVII
modificado a AT-III bajo condiciones especificadas (por ejemplo, después de la inyección en un paciente) o una velocidad reducida de inactivación por ATI II (es decir, una segunda constante de velocidad de orden reducida para la inhibición) , la cual puede manifestarse como actividad coagulante incrementada en presencia de AT-III comparado con un polipéptido FVII no modificado. La resistencia incrementada a AT-III se puede estimar usando ensayos in vitro tales como aquellos descritos en el Ejemplo 5.
El residuo de aminoácido Q286 por la numeración de FVII maduro (que corresponde a Q143 por la numeración de quimotripsina) se puede modificar mediante la supresión de aminoácidos, o reemplazo o sustitución con cualquier otro aminoácido. Alternativamente, un aminoácido se puede insertar inmediatamente antes o después de alterar la conformación en la vecindad del residuo de aminoácido Q286. Además, un polipéptido FVII que contiene una modificación de Q286 también puede contener una o más de otras modificaciones, que incluyen inserciones de aminoácidos, supresiones, sustituciones o reemplazos, y modificaciones no en la secuencia primaria del polipéptido, tal como la adición de una porción de carbohidratos, la adición de una porción de polietilenglicol (PEG), la adición de un dominio Fe, etcétera, o cualquiera combinación de los mismos. De esta
manera, un polipéptido FVII que contiene una modificación en la posición de aminoácidos 286 por la numeración de FVII maduro puede contener 2, 3, 4, .5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más de posiciones modificadas. Estos polipéptidos retienen por lo menos una actividad de un polipéptido FVII no modificado. Típicamente, el polipéptido. FVII modificado exhibe actividad coagulante incrementada .
Estos cambios en las actividades pueden manifestarse como actividad coagulante incrementada, duración incrementada de la actividad coagulante, inicio incrementado del beneficio terapéutico, incremento del inicio de la actividad coagulante y/o un índice terapéutico mejorado. De esta manera, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación en la posición de aminoácidos 286 por la numeración de FVII maduro que exhibe actividad de coagulación incrementada comparado con un polipéptido FVII no modificado. Estos polipéptidos FVII modificados se pueden usar en el tratamiento de trastornos o eventos hemorrágicos , tales como hemofilias, cirugía, trauma y lesión, donde los polipéptidos FVII pueden funcionar para promover la coagulación de la sangre. Debido a una actividad coagulante incrementada, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento que contienen una
modificación en la posición de aminoácidos 286 por la numeración de FVII maduro ofrece ventajas sobre el tratamiento con un polipéptido FVII de tipo silvestre, tal como Factor VII NovoSevenMR, que incluye una disminución en la cantidad del FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para la hemostasis. Esto puede conducir a, por ejemplo, disminuir las dosis y/o frecuencia de dosificación necesaria para lograr efectos biológicos comparables, inicio más rápido del beneficio terapéutico, duración más prolongada de acción, comodidad superior y aceptación por los sujetos, y/o atenuación de los efectos secundarios indeseados.
i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición
286
Se proporcionan polipéptidos FVII modificados en los cuales la glutamina en la posición 286 (numeración que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; que corresponde a la posición 143 por la numeración de quimotripsina ) se reemplaza con un residuo de aminoácido básico, tal como cualquiera de arginina (Arg, R) , histidina (His, H) o lisina (Lys, K) . En particular, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados en los cuales la glutamina en la posición 286 se reemplaza con una arginina (es decir Q286R, que corresponde a Q143R por la numeración de
quimotripsina) . Los estudios de modelación indican que la sustitución de la glutamina con una arginina da por resultado la pérdida de dos interacciones claves que estabilizan una conformación inactiva del orificio de oxianión FVIIa en el FVII de tipo silvestre o no modificado. Las interacciones de desestabilizantes en el polipéptido FVII de tipo silvestre o no modificado incluyen la interacción entre la cadena lateral de Q286 (que corresponde a Q143 por la numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de G342 (que corresponde a G193 por la numeración de quimotripsina) , y la interacción entre el carbonilo de cadena principal de K341 (que corresponde a Kl por la numeración de quimotripsina) y la amida de cadena principal de S195 (que corresponde a S344 por la numeración de quimotripsina) . Al sustituir la glutamina de tipo silvestre con una arginina a una posición de 286, sin embargo, no únicamente estas interacciones se pierden, sino se crean dos nuevas interacciones importantes. Estas incluyen la creación de un puente de sal entre la cadena lateral básica del aminoácido modificado R286 (R143 por la numeración de quimotripsina) y la cadena lateral ácido de D289 nativo (D 146 por la numeración de quimotripsina), y una interacción de la amida . de cadena principal del aminoácido modificado R286 y el carbonilo de cadena principal de 341 que estabilizan una conformación activa del
polipéptido FVIIa modificado. Adicionalmente, la nueva fuente de sal entre el aminoácido modificado R286 y D289 se espera que altere la conformación y/o flexibilidad del "bucle de autolisis," el cual forma parte de la hendidura de sitio activo. El bucle de autolisis se implica en determinar el substrato macromolecular y la especificidad inhibidoras de las proteasas de coagulación. De esta manera, una conformación alterada y/o flexibilidad de este bucle, por ejemplo, puede dar por resultado una actividad catalítica incrementada para el substrato (por ejemplo, factor X y/o factor IX) y resistencia incrementada a inhibidores (por ejemplo TFPI y/o AT-III). De esta manera, la modificación de la glutamina en la posición 286 con un aminoácido básico, tal como arginina (Arg, R) , histidina (His, H) o lisina (Lys, K) , puede dar por resultado la actividad catalítica y coagulante incrementada comparada con el polipéptido FVII de tipo silvestre. Por consiguiente, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII que contienen una mutación Q286R, Q286K o Q286H por la numeración de FVII maduro (que corresponde a Q143R, Q143K o Q143H, respectivamente, por la numeración de quimotripsina) . Ejemplares de estos polipéptidos son aquellos con una secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOS: 118, 119 y 129, respectivamente.
El reemplazo del aminoácido de la glutamina (Gln, Q) con
un residuo de aminoácido básico, en particular una arginina (Arg, R) , en la posición de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 286 de un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 se puede hacer en cualquier 'polipéptido FVII, que incluye un polipéptido FVII precursor con una secuencia expuesta en SEQ ID NOS: 1 o 2, un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, o cualquiera de las especies, variante alélica y · modificada, tales como aquellas descritas en el campo, y fragmentos activos de las mismas, que tienen 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia de cualquiera de los polipéptidos FVII expuestos en SEQ ID NOS: 1-3.' Por ejemplo, la mutación Q286R se puede incorporar dentro de cualquier polipéptido FVII modificado descrito en el campo que incluye cualquiera de aquellos descritos en algún lugar en este documento. Estos polipéptidos FVII modificados incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido FVII modificado que contiene la(s) mutación (es) M298Q (SEQ ID NO: 158) véase por ejemplo Persson y colaboradores, (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 98:13583- 13588), E296V/M298Q (SEQ ID NO:343), V158E (SEQ ID NO:344), E296R/M298K (SEQ ID NO:345), K337A (SEQ ID NO:346), V158D/E296V/M298Q (SEQ ID NO: 98; NN1731; véase por ejemplo, Persson y colaboradores, .(2007) Art. Thromb. Vase. Biol . 27(3): 683-689),
V158D/E296V/M298Q/K337A (SEQ ID NO:347; véase por ejemplo Lisman y colaboradores, (2003) J. Thromb. Haem. 1:2175-2178), V253N (SEQ ID NO: 348; véase por ejemplo US7427592), T106N (SEQ ID NO:349; véase, por ejemplo US7427592), T106N/V253N (SEQ ID NO:350; véase por ejemplo US7427592), K143N/N145T (SEQ ID NO:351; US7442524), R315N/V317T (SEQ ID NO:352; US7442524) o Kl 43N/N145T/R315N/V317T (SEQ ID NO:353; US7442524). La mutación Q286R también se puede incorporar en los polipéptidos FVII quiméricos o polipéptidos de fusión FVII o polipéptidos FVII que se modifican de otra manera, tal como' mediante 1 glicoPEGilación (véase por ejemplo el documento O2007022512 , Ghosh y colaboradores, (2007) transcripción de la presentación en la Am. Society. Hematol . Meeting, 01 de Diciembre 10 de 2007). En un ejemplo, el reemplazo de aminoácido de la glutamina con una arginina en la posición de aminoácido position que corresponde a posición de aminoácido 286 de un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 da por resultado un polipéptido FVII con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 118.
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen la sustitución de aminoácido Q286R por la numeración de FVII maduro (que corresponde a Q143R por la numeración de quimotripsina ) , en donde los polipéptidos FVII exhiben actividad coagulante incrementada. Estos
polipéptidos FVII modificados pueden contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más de posiciones modificadas, en donde una de las composiciones modificadas es la posición de aminoácidos 286. De esta manera, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificado que contienen dos o más modificaciones, en donde una modificación es la sustitución de aminoácido Q286R (por la numeración de FVII maduro) y el polipéptido FVII modificado exhibe actividad coagulante modificada comparada con un polipéptido FVII no modificado. La mutación Q286R se puede combinar con cualquier otra mutación descrita en este documento o conocida en el campo. Típicamente, el polipéptido modificado resultante muestra actividad coagulante incrementada. Una persona experta en el campo puede determinar la actividad coagulante de un polipéptidos FVII que contiene la modificación Q286R que usa ensayos in vitro e in vivo bien conocidos en el campo y descritos en este documento. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento incluyen aquellos que contiene la mutación Q286R y también contiene una o más mutaciones que, por ejemplo, incrementa la resistencia a la antitrombina-III , incrementan la activación de FX, incrementan la activación de FIX, incrementan el enlace y/o afinidad a los fosfolípidos, incrementan la
afinidad para el factor de tejido, incrementan la actividad intrínseca, incrementan la . actividad dependiente de TF, altera la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, incrementa la actividad catalítica o coagulante, tal como al cambiar el equilibrio entre las conformaciones FVIIa altamente activas y menos activas en favor de las conformaciones altamente activas, incrementa la resistencia a las proteasas, - disminuyen la glicosilación, incrementan la glicosilación, reducen la inmunogenicidad, incrementan la estabilidad, y/o facilitan el enlace del grupo químico .
La actividad coagulante incrementada de los polipéptidos FVII modificados que contienen la sustitución de aminoácidos Q286R puede ser un resultado de un incremento en la actividad catalítica. La actividad catalítica incrementada se puede observar en presencia y/o ausencia del factor de tejido (TF) . De esta manera, la actividad catalítica incrementada puede ser dependiente de TF y/o independiente de TF. La actividad catalítica de un polipéptido FVII modificado que contiene la mutación Q286R se puede estimar usando ensayos ín vitro, tales como los ensayos descritos en los Ejemplos 4 y 7. Estos ensayos pueden determinar la actividad catalítica de un polipéptido FVII modificado para un substrato, tal como factor X, en presencia o ausencia del factor de tejido. Los
polipéptidos FVII modificados que contienen las mutaciones Q286R pueden exhibir actividad catalítica incrementada de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en presencia y/o ausencia del factor de tejido comparado con la actividad catalítica de el polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 4, un polipéptido FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por la numeración de quimotripsina ) como la única modificación puede exhibir actividad catalítica para FX en presencia o ausencia de TF que es aproximadamente dos a cuatro veces mayor que la actividad catalítica exhibida por el FVII de tipo silvestre. En otros ejemplos, un polipéptido FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q pueden exhibir actividad catalítica para FX en presencia de TF que es aproximadamente tres a cuatro veces mayor que la actividad catalítica exhibida por el FVII de tipo silvestre, y puede exhibir actividad catalítica para FX en una ausencia de TF que es aproximadamente siete a veintiséis veces mayor que la actividad catalítica exhibida por el FVII de tipo silvestre.
Ejemplos no limitantes de polipéptidos FVII modificados que contienen dos o . más modificaciones, en donde una modificación es la sustitución de aminoácido Q286R (pro la
numeración de FVII maduro) y el polipéptido FVII modificado exhibe actividad catalítica incrementada hacia FX en presencia y/o ausencia del factor de tejido comparado con un polipéptido FVII no modificado, expuesto en la Tabla 5 y en el Ejemplo 4, posteriormente. El identificador de secuencia (SEQ ID NO) se identifica en el cual las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII se exponen. Como se plantea con mayor detalle en la sección D.6, posteriormente, la modificación "Gla Intercambio FIX" implica la supresión del dominio FVII Gla endógeno al suprimir los residuos de aminoácido Al a Y44 (residuo que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 45 residuos de aminoácido que corresponden a los residuos de aminoácido Yl a Y45 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83.. En algunos ejemplos, el dominio heterólogo en FIX Gla en . el polipéptido FVII modificado con "Gla Intercambio FIX" contiene una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido que corresponde a MI 9, E40, K43 y/o Q44 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83. Estas sustituciones se indican por llaves (por ejemplo {Gla Intercambio FIX/Q44S}). En casos donde una posición de aminoácido modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácido 153 a 406 que corresponde al
polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se expone en la Tabla 1, anterior) , la posición se indica en corchetes que usan la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, T158N no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como T[158]N cuando se refiere a la numeración de quimotripsina. Tabla 5.
Modificación - numeración Modificación - numeración SEQ ID NO. de FVII maduro de quimotripsina
Gla Intercambio FIX/Q286R Gla Intercambio FIX/Q143R 131
Q286R/H257A H117A/Q143R 132
S222A/Q286R S82A/Q143R 133
Q286R/S222A/H257A S82A/H117A/Q143R 134
Gla Intercambio S82A/Gla intercambio 135
FIX/S222A/Q286R FIX/Q143R
Gla Intercambio H117A/Gla · intercambio 136
FIX/H257A/Q286R FIX/Q143R
Gla Intercambio FIX Q143R/S82A/H117A/Gla 137
/S222A/H257A/Q286R Intercambio FIX
Q286R/M298Q Q143R/M156Q 138
Q286R/M298Q1K341Q Q143R/M156Q/K192Q 139
Q286R/M298Q/ 199E Q143R/M156Q/K60CE 140
S222A/11257A/Q286R/M298Q S82A/H117A/Q143R/M156Q 150
A175S/Q286R/Q366V A39S/Q143R/Q217V 144
S222A/Q286R/Q366V S82A/Q143R/Q217V 145
H257S/Q286R H117S/Q143R 146
H257S/Q286R/Q366V H117S/Q143R/Q217V 147
S222A/H257A/Q286R/Q366V S82A/H117A/Q1 3R/Q217V 148
Q286R/H373A Q143R/H224A 149
Q286R/K341D Q143R/K192D 151
Q286R/Q366D QI43R/Q217D 152
Q286R/Q366N Q143R/Q217N 153
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 155
Q286R/H373F Q143R/H224F 156
Q286R/M298Q/H373F Q143R/M156Q/H224F 157
Modificación - numeración Modificación - numeración SEQ ID NO. de FVII maduro de quimotripsina
Q286R/ 298Q Q143R/M156Q 138
T128N/P129A/Q286R T[128]N/P[129]A/Q143R 279
Gla Intercambio FIX/ Gla Intercambio FIX/ 285 T128N/P129A/S222A/Q286R T[128]N/P[129]A/S82A/Q1 3R
Gla Intercambio FIX/ Gla Intercambio FIX/ 292 S52A/S60A/S222A/Q286R S[521A1S [60] A/S82A/Q143R
Gla Intercambio Gla Intercambio 141 FIX/Q286R/M298Q FIX/Q143R/M156Q
T128N/P129A/Q286R/M298Q T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 280
Gla Intercambio FIX/T128N/P Gla Intercambio FIX/ 286 129A/Q286R/M298Q T[128]N/P[129] /Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIX/E40L}/ {Gla Intercambio 274 Q286R/ 298Q FIX/E[40]L}/ Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIX/K43I}/ {Gla Intercambio 275 Q286R/M298Q FIX/K[43]I}/ Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIXIQ44S}/ {Gla Intercambio 276 Q286R/M298Q FIX/Q[44]S}/ Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIX/M19K}/ {Gla Intercambio 277 Q286R/ 298Q FIX/M[19]K}/ Q143R/M156Q
S52A/S60A/Q286R/M298Q S [52] A/S [60] A/Q143R/M 293
156Q
T128N/P129A/S222A/H257A/Q28 T [128]N/P[129] A/S82A/H117A/ 287 6R/M298Q Q143R/M156Q
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R S [52] /S [60] A/S82A/H1 298 /M298Q I7A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/Q286R/H373F T [128]N/P[129] A/Q143R/H224F 281
S52A/S60A/Q286R/H373F S [52] R/H[60] A/Q143R/H224F 296
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H37. T [128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 288 3F /H224F
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F S [52] A/S [60] A/Q143R/ 156Q/H 297
22 4F
V21D/Q143R/E154V/M156Q V21D/Q143R/E154V/M156Q 282
Gla Intercambio FIX Gla Intercambio FIX 301 /S222A/T239V/Q286R /S82A/T99V/Q143R
T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q 302
Modificación - numeración Modificación - numeración SEQ ID NO. de FVII maduro de quimotripsina
Gla Intercambio FIX/ Gla Intercambio FIX/ 304 T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q
S222A/T239V/H257A/Q286R/M29 S82A/T99V/H117A/Q143R/M156Q 303 8Q
T239V/Q286R/H373F T99V/Q143R/H224F 305
T239V/Q286R/M298Q/H373F T99V/Q143R/M156Q/H22 F 306
T239L/Q286R T991/Q143R 308
Gla intercambio Gla Intercambio FIX 310 FIX/S222A/T2391/Q286R /S82A/T991/Q143R
T239L/Q286R/M298Q T991/Q143R/M156Q 311
Gla Intercambio FIX Gla ¦ Intercambio FIX 313 /T2391/Q286R/ 298Q /T991/Q143R/M156Q
S222A/T2391/H257A/Q286R/ 29 S82A/T991/H17143R/M156Q 312 8Q
T2391/Q286R/H373F T991/Q143R/H224F 314
T239V/Q286R T99V/Q143R 299
T2391/Q286R/M298Q/H373F T991/Q143R/M156Q/H22 F 315
H257S/Q286R/M298Q H117S/Q143R/M156Q 322
Gla Intercambio FIX Gla Intercambio FIX 321 /Q286R/S222A/H257S /Q143R/S82A/H117S
S222A/H257S/Q286R/M298Q S82A/H117S/Q1 3R/M156Q 324
H257S/Q286R/M298Q/H373F H117S/Q143R/ 156Q/H224F 325
S222A/Q286R/M298Q/H373F S82A/Q143R/M156Q/H224F 326
Gla Intercambio Gla Intercambio FIX 318 FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F S82A/Q143R/M156Q/H22 F
S222A/Q286R/M298Q S82A/Q143R/M156Q 328
Gla Intercambio Gla Intercambio FIX 317 FIX/S222A/Q286R/M298Q S82A/Q143R/M156Q
Gla Intercambio FIX/ Gla Intercambio FIX/ 316 S222A/Q286R/H373F S82A/Q143R/H224F
H257A/Q286R/M298Q H117A/Q143R/M156Q 321
T128N/P129A/A175S/Q286R/M29 T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/ 337 8Q M156
A122N/G124S/A175S/Q286R/M29 A[122]N/G [124] S/A39S/Q143R/ 338 8Q M156Q
Modificación - numeración Modificación - numeración SEQ ID NO. de FVII maduro de quimotripsina
T128N/P129A/A175S/S222A/H25 T[128]N/P[129] A/A39S/S82A/H 339 7A/Q286R/M298Q 117A/Q143R/M156Q
A122N/G124S/A175S/S222A/H25 A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H 340 7A/Q286R/M298Q 117A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/A175S/Q286R/M29 T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/ 341 8Q/H373F M156Q/H224F
A122N/G124S/A175S/Q286R/M29 A[1221N/G[124] S/A39S/Q143R/ 342 8Q/H373F M156Q/H224F
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H37 V21D/Q1 3R/E15 V/M156Q/H22 320 3F F
{Gla Intercambio {Gla Intercambio FIX 355 FIX/K431 } /T128N/P129A/Q286R / [43] I}/T[128]N/P[129]A/Q1
/M298Q 43R/M156Q
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 T [128] /P[129] /Q143R/M156Q 356 6N /Q217N
{Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio 357 /K431 } /Q286R/M298Q/Q366N FIX/K[43] IJ/Q143R/M156QQ217
N
(Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio FIX 358 /K431}/T128N/P129A/Q286R/M2 /K[43] 1}/T[128]N/P[129]A/Q1
98Q/Q366N 43R/M156QQ217N
V158D/Q286R/E296V/M298Q V21D/Q1 3R/E15 V/ 156Q 360
T128N/P129A/Q286R/ 298Q/Q36 T [128]N/P[129] A/Q143R/M156Q 364 6N1H373F /Q217N/H224F
T239V/Q286R/M298Q/Q366N T99V/Q1 3R/M156Q/Q217N 365
T2391/Q286R/M298Q/Q366N T9911Q143R/M156Q/Q217N 366
T128N/P129A/T239V/Q286R/M29 T [128] N/P[129] A/T99V/Q143R/ 367 8Q M156Q
T128N/P129A/S222A/T239V/H25 T [128]N/P[129] /S82A/T99V/H 368 7A/Q286R/M298Q 117A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/T239V/Q286R/M29 T [128] /P [129JA/T99V/Q 369 8Q/H373F 143R/M156Q1H224F
T128N/P129A/T2391/Q286R/M29 T[128]N/P[129]A/T99L/Q 370 8Q 143R/M156Q
T128N/P129A/T239L/Q286R/M29. T [128] N/P[129] /T991/Q143R/ 371
Modificación - numeración Modificación - numeración SEQ ID NO. de FVII maduro de quimotripsina
8Q/H373F M156Q/H224F
polipéptido FVII que contiene la mutación Q286R por la numeración de FVII maduro también puede exhibir
resistencia incrementada a AT-III. La resistencia incrementada a AT-III puede ser un resultado de una
velocidad disminuida de inhibición por AT-III o enlace disminuido a AT-III bajo condiciones · especificadas, tal
como después de la inyección en un animal o paciente. La resistencia a AT-III se puede demostrar al medir la segunda
constante de velocidad de orden, para la inhibición de los polipéptidos FVIIa de tipo silvestre y variantes. Otros
métodos in vitro, tales como los ensayo BIAcoreMR, también
se pueden usar. Los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir resistencia incrementada a los efectos inhibidores de AT-III comparados con un polipéptido FVII no modificado, el cual se puede estimar en los ensayos in vitro tales como aquellos descritos en el Ejemplo 5. Los polipéptidos FVII
modificados que contienen las mutaciones Q286R pueden
exhibir resistencia incrementada a AT-III de
aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%,· 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, .70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%,
400%, 500%, o más comparados con la resistencia a AT-III del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya
sea in vivo o in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 5 posteriormente, un polipéptido FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por la numeración de quimotripsina ) puede exhibir actividad catalítica para FX en presencia de AT-III y la ausencia de TF que es dos a cuatro veces o más grande que la actividad catalítica exhibida por el FVII de tipo silvestre. De esta manera, el polipéptido Q286R FVII modificado puede exhibir un incremento en la resistencia a AT-III de aproximadamente 200% a 400% de aquella a un polipéptido FVII no modificado.
La actividad catalítica incrementada y la resistencia incrementada a AT-III pueden manifestarse como actividad coagulante incrementada en presencia y/o ausencia de TF. Estas actividades se pueden estimar in vitro, ex vivo o in vivo, tal como mediante la administración a un sujeto humano o animal. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados que contiene la mutación Q286R se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. Por ejemplo, el Ejemplo 6.B.2 muestra que un polipéptido FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por
la numeración de quimotripsina ) exhibe actividad de coagulación en un modelo hemorrágico de ratón que es mayor (aproximadamente 2 veces) que la actividad de coagulación exhibida por un polipéptido FVII de tipo silvestre (por ejemplo FVII NovoSevenMR) . El polipéptido FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M2.98Q (Q143R y M156Q, respectivamente, por la numeración de ' quimotripsina) exhiben actividad de coagulación aún mayor.
ii . Otras mutaciones en la posición 286
La glutamina en la posición de aminoácido que corresponde a la posición 286 del polipéptido FVII expuesto en SEQ ID NO: 3 se puede reemplazar con un aminoácido diferente a un aminoácido básico (es decir diferente a arginina, histidina o lisina) . Estas sustituciones pueden alterar la conformación del orificio de oxianión, por ejemplo, dando por resultado una conformación . que incrementa la actividad catalítica del polipéptido FVII modificado comparado con un polipéptido FVII de tipo silvestre. Los polipéptidos FVII modificado que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado puede exhibir actividad catalítica incrementada de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%,. 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad catalítica del polipéptido FVII
no modificado de tipo silvestre cuando se mide usando ya sea ensayos in vivo, ex vivo, o in vitro.
La Tabla 6 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en Q286 diferente al reemplazo con arginina, que corresponde a las posiciones de aminoácido de un polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Como se observa, estos polipéptidos FVII se diseñan para cambiar la conservación del orificio de oxianión a una conformación más efectiva, y por lo tanto tiene actividad coagulante incrementada. Con referencia a estas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia de polipéptido FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esta posición. Las posiciones de aminoácidos para la mutación también son referidas por el esquema de numeración de quimotripsina . En la Tabla 6 a continuación, se identifica el identi ficador de secuencia (SEQ ID NO) en el cual la secuencia de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se expone.
Tabla 6.
Los polipéptidos FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado pueden exhibir actividad catalítica incrementada de aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,. 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad catalítica del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre cuando es mide usando ya sea ensayos in vivo, ex vivo, o in vitro. En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados que tienen una conformación
de orificio de oxianión alterado también pueden exhibir resistencia incrementada a inhibidores de proteasa endógenos (es decir, velocidad disminuida de inhibición por o afinidad disminuida para inhibidores) tal como TFPI o AT-III por aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 6.0%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la velocidad de inhibición por o afinidad para los inhibidores endógeno exhibidos por el polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo, ex vivo, o in vitro. La actividad y/o resistencia catalítica incrementada a los inhibidores endógenos tal como resistencia a AT-III de estos polipéptidos FVII modificados también se puede manifestar como actividad de coagulación incrementada, duración de la actividad de coagulación, iniciación más rápida de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico mejorado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo, ex vivo, o in vitro.
2. Resistencia incrementada a AT-III
La antitrombina III (también conocida como antitrombina
o AT-III) es una serpina anticoagulante importante (inhibidor de serina proteasa) . La AT-III se sintetiza como una proteina precursora que contiene 464 residuos de aminoácido (SEQ ID NO: 122) . En el curso de la secreción de un péptido de señal de 32 residuos se escinde para generar una antitrombina humana madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO: 123) . La glicoproteina 58 kDa AT-III circula en la sangre y funciona como un inhibidor de serina proteasa (serpina) para inhibir una gran variedad de serina proteasas del sistema de coagulación. Los objetivos principales de AT-III son la trombina y el factor Xa, aunque AT-III también se ha mostrado que inhibe las actividades de FlXa, FXIa, FXIIa y, a un grado menor, FVIIa. La acción de AT-III se mejora grandemente por los glicosaminoglicanos, tal como el sulfato de heparano de origen natural o las diversas heparinas derivadas de tejidos que se usan ampliamente como anticoagulantes en la práctica clínica. La AT-III se enlaza de una manera altamente específica a una secuencia de pentasacáridos única en la heparina que induce un cambio conformacional en el bucle central reactivo. En esta conformación, el bucle central reactivo de AT-III puede interactuar más eficientemente con el sitio reactivo de la serina proteasa y efectuar la inhibición.
La AT-III no es normalmente inhibidora para el FVIIa
plasmático libre, aún en presencia de la heparina, probablemente debido a la conformación similar al zimógeno de FVIIa que evita la interacción eficiente con AT-III. Los efectos inhibidores en AT-III se incrementan, sin embargo, una vez que el FVIIa se forma en complejo con TF. El enlace de AT-III al complejo TF/FVIIa puede liberar FVIIa de TF y lo mantiene en un complejo inactivo con AT-III. La afinidad incrementada de AT-III para el FVIIa enlazado con TF comparado con FVIIa solo refleja presumiblemente la maduración del sitio activo de FVIIa cuando se forma en complejo con TF, haciéndolo por lo tanto susceptible al enlace de AT-III (Rao y colaboradores (1993) Blood 81:2600-2607). De esta manera, el impacto de AT-III sobre FVIIa es proporcionar a la actividad intrínseca de la molécula FVIIa misma, a menos que las mutaciones se hayan agregado al polipéptido FVIIa que median la resistencia a AT-III. Mientras que FVIIa retiene su conformación similar a zimógeno, la AT-III tiene poco efecto. Sin embargo, si FVIIa cambia la conformación a una forma más activa, tal como al enlazar TF, o mediante modificaciones in vitro específicas, la inhibición de AT-III triple se incrementa significativamente. Los polipéptidos FVIIa que se modifican para tener actividad intrínseca incrementada exhiben frecuentemente incremento simultáneo en la susceptibilidad a
la inhibición de AT-III. Por ejemplo, la modificación de uno o más aminoácidos en la bolsa de activación de FVIIa, tal como mediante reemplazos de aminoácido que corresponden a K337A, L305V, M298Q,¦ V158D y sustituciones de E296V (relativos con la secuencia FVII maduro expuesta en SEQ ID NO: 3), da por resultado la sensibilidad incrementada del polipéptido FVIIa a AT-III, inhibiendo en consecuencia la actividad de FVIIa por hasta 90% (Persson y colaboradores (2001) PNAS 98:13583-13588). En otro ejemplo, la inducción de una conformación más similar a zimógeno por la modificación de los aminoácidos implicados en la a-hélice de FVIIa, mientras que incrementa la actividad de la proteina FVIIa modificada, también incrementa susceptibilidad a AT-III (Persson y colaboradores (2004) Biochem J 379:497-503).
Modificaciones ejemplares para efectuar la resistencia incrementada a AT-III
Se pueden hacer modificaciones para un polipéptido FVII que incremente su resistencia a AT-III. Generalmente, tales polipéptidos FVII modificados retienen por lo menos una actividad de un polipéptido FVII. Típicamente, estas modificaciones incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en cualquier posición del polipéptido FVII que se implican en interacción de FVIIa con AT-III. Estas modificaciones pueden, · por ejemplo, dar por resultado el
enlace reducido del FVII modificado a AT-III. Los polipéptidos FVII modificados son por lo tanto resistentes a los efectos naturalmente inhibidores de AT-III con respecto a la iniciación de la coagulación. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un agente terapéutico procoagulante, los polipéptidos FVII resistentes a AT-III modificados exhiben actividad coagulante incrementada como son comparados con los polipéptidos FVII no modificados.
Como se describe en este documento posteriormente, una persona experta en el campo puede diseñar empírica o racionalmente polipéptidos FVII modificados que exhiban resistencia incrementada a AT-III. Estos polipéptidos FVII modificados se pueden someter a prueba en ensayos conocidos por una persona experta en el campo para determinar si estos polipéptidos FVII ¦ modificados exhiben resistencia incrementada a AT-III. Por ejemplo, estos polipéptidos AT-III modificados también se pueden someter a prueba para enlazarse a AT-III. Generalmente, un polipéptido FVII modificado que tiene resistencia incrementada a AT-III exhibirá enlace disminuido y/o afinidad disminuida para AT-III. Típicamente, estos ensayos se realizan sobre una forma de dos cadenas de FVII, tal como la forma actividad de FVII (FVIIa) . Además, los ensayos para determinar los efectos de AT-III se realizan
generalmente en presencia de heparina y la presencia del factor de tejido, aunque estos ensayos también se pueden realizar en ausencia de uno o ambos cofactores.
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que exhiben resistencia incrementada a AT-III. La resistencia a la inhibición por ATIII es relevante tanto en presencia y ausencia de TF. Las variantes del polipéptido FVII proporcionadas en este documento se han modificado en una o más de las posiciones de aminoácido 239, 931, 366 y 373 (que corresponde a las posiciones de aminoácido 99, 170i, 217 y 224, respectivamente, por la numeración de quimotripsina) . Estos residuos de aminoácido se pueden modificar tal como mediante el reemplazo, en supresión o sustitución de aminoácidos. Los residuos identificados se pueden reemplazar o sustituir con cualquier otro aminoácido. Alternativamente, las inserciones de aminoácido se pueden usar para alterar la conformación de un residuo de aminoácido objetivo o la estructura de proteina en la vecindad de un residuo de aminoácido objetivo.
Cualquier residuo de aminoácido se puede sustituir para el residuo de aminoácido endógeno en las posiciones identificadas. Típicamente, se selecciona el aminoácido de reemplaza tal que interfiere con la interacción entre FVII y AT-III. En algunos ejemplos, el residuo de treonina en la
posición 239 (que corresponde a la posición 99 por la numeración de quimotripsina) se reemplaza con una serina (Ser, S) , asparagina (Asn, N) , glutamina (Gln, Q) , valina (Val, V), leucin (Leu, L) , histidina (His, H) , o isoleucina (He, I) . En otros ejemplos, la prolina en la posición 321 (que corresponde a la posición 170i por la numeración de quimotripsina) se reemplaza con una lisina (Lys, K) , ácido glutámico (Glu, E) , serina (Ser, S) , o tirosina (Tyr, Y) . En ejemplos adicionales, la glutamina en la posición 366 (que corresponde a la posición 217 por la numeración de quimotripsina) se reemplaza con una asparagina (Asn, N) , ácido aspártico (Asp, D) , ácido glutámico (Glu, E) , serina (Ser, S) , treonina (Thr, T) , lisina (Lys, K) , o valina (Val, V) . En otros ejemplos, la histidina en la posición 373 (que corresponde a la posición 224 por la numeración de quimotripsina) se reemplaza con un ácido aspártico (Asp, D) , ácido glutámico (Glu, E) , serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) o alanina (Ala, A) . En una modalidad adicional, se pueden generar mutantes de combinación. Incluidos entre estos mutantes de combinación son aquellos que tienen dos o más mutaciones de los residuos T239, P321, Q366 y H373 (que corresponden a T99, P 170i, Q217 y H224, respectivamente, por la numeración de quimotripsina) . Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en
2, 3, 4 o 5 de las posiciones incrementadas. Por consiguiente, un polipéptido modificado puede exhibir 1, 2,
3, 4 o 5 mutaciones que pueden dar por resultado resistencia 'incrementada del polipéptido FVII modificado a los efectos inhibidores de AT-III. Por ejemplo, un polipéptido FVII se puede modificar en¦ la posición de aminoácido 366 y la posición de aminoácido 373. En algún ejemplo, las posiciones se modifican por el reemplazo de aminoácidos tal como, por ejemplo, el reemplazo de la glutamina en la posición 366 con un ácido aspártico, y el reemplazo de la histidina en la posición 373 con un ácido glutámico.
La Tabla 7 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los residuos identificados, que corresponden a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Se incluyen entre estos mutaciones de combinación ejemplares. Como se observa, estos polipéptidos FVII se diseñan para incrementar la resistencia a AT-III y por lo tanto tienen actividad coagulante incrementada. En referencia con estas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia de polipéptido FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra)
corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de
aminoácidos para la mutación también son referidas mediante
el esquema de numeración de quimotripsina . En la Tabla 7 a continuación, se identifica el identificador de secuencia
(SEQ ID NO) en el cual las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se exponen.
Tabla 7.
Modificación Modificación - SEQ ID NO.
numeración de numeración de
FVII maduro quimotripsina
T239S T99S 159
T239N T99N 160
T239Q T99Q ¦ 161
T239V T99V 162
T239L T99L 163
T239H T99H 164
T2391 T991 165
P321K P170ÍK 166
P321E P170ÍE 167
P321Y P170ÍY 168
P321S P170ÍS 169
Q366D Q217D 170
Q366E Q217E 171
Q366N Q217N 172
Q366T Q217T 173
Q366S Q217S 174
Q366V Q217V 175
Q3661 Q2171 176
Q366L Q217L 177
Q366M Q217M 178
H373D H224D 179
H373E H224E 180
H373S H224S 181
H373F H224F 182
H373A H224A- 183
Q366D/H373E Q217D/H224E 184
Q366V/H373V Q217V/H224V 185
Q366V/H373L Q217V/H224L 186
Q366V/H3731 Q217V/H2241 187
Los polipéptidos FVII modificados que tienen resistencia incrementada para AT-III pueden exhibir una reducción para el
grado de inhibición bajo condiciones especificadas o en la
segunda constante de velocidad de orden para la inhibición
por AT-III mediante por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,' 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con el grado de inhibición o la segunda constante de velocidad de
orden para la inhibición del polipéptido FVII no modificado o
de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. De esta manera,
los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir resistencia incrementada a AT-III que es por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de la
resistencia exhibida por un polipéptido FVII no modificado.
La resistencia incrementada a AT-III por estos polipéptidos FVII modificados . también se pueden manifestar por como actividad de coagulación incrementada, duración de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico mejorado en presencia de AT-III. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificado con AT-III se puede incrementar mediante por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
3. Resistencia incrementada para la inhibición por Zn2+ La actividad amidolítica de FVIIa se regula por las alteraciones alostéricas inducidas por el enlace de iones de calcio y el factor de tejido (TF) . El FVII libre existe típicamente en una conformación inactiva. El enlace a Ca2+ y TF induce un cambio en la conformación y la actividad amidolítica incrementada (Pederson y -colaboradores, (1990) J Biol. Chem. 265:16785-16793). En contraste, el enlace de iones de zinc ' a FVIIa se ha mostrado que tiene un efecto inhibidor sobre la actividad. El enlace de Zn2+ a FVIIa da por resultado actividad amidolítica disminuida y afinidad reducida para TF. Los estudios indican que Ca2+ y Zn2+ compiten para enlazarse a FVIIa, tal que en presencia de Ca2+,
el efecto inhibidor de Zn2+ se reduce. Adicionalmente, FVIIa enlazado a TF es menos susceptible a la inhibición del zinc.
Además de los sitios de enlace Zn2+ en el dominio Gla, en enlace del cual no afecta la actividad amidolitica del FVIIa, se han cartografiado dos enlaces de Zn2+ al dominio de proteasa de FVII (Petersen y colaboradores, (2000) Protein Sci. 9:859-866, Bajaj y colaboradores, (2006) J. Biol . Chem. 281:24873-24888). La cartografía de estos sitios de enlace en el dominio de proteasa indica que el primer sitio de enlace Zn2+ implica las cadenas laterales de los residuos de aminoácido H216, E220 y S222 (H76, E80 y S82 por la numeración de quimotripsina) , y el segundo sitio de enlace Zn2+ implica las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos H257, D219 y K161 (H117, D79 y K24 por la numeración de quimotripsina) . El Zn2+ podía, por lo tanto, tener una función fisiológica en regular la homeostasis como un inhibidor de FVII. Se ha postulado que estos efectos inhibidores ocurren como un resultado de un incremento en la concentración de Zn+ en el sitio del coágulo después de la activación de las plaquetas (Bajaj y colaboradores, (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888). Las plaquetas almacenan grandes cantidades de Zn2+ en citoplasma y a-gránulos, los cuales se liberan en la activación de las plaquetas. Esto podría incrementar la concentración local de Zn2+ lo cual a su vez
podría inhibir la actividad de FVIIa y el enlace de FVIIa a TF.
Modificaciones ejemplares para incrementar la resistencia a la inhibición por Zn2+
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que exhiben resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la mutación de uno o más residuos en FVII implicados en interacción y enlace con Zn2+ para reducir o prevenir este enlace, haciendo en consecuencia los polipéptidos FVII modificados resistentes a los efectos inhibidores de Zn2+ con respecto a la actividad catalítica y al enlace de TF. Cuando se evalúa en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un agente terapéutico procoagulante, los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada como son comparados con los polipéptidos FVII no modificados.
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que tienen una o más mutaciones en los residuos que se pueden implicar en el enlace de Zn2+ en el dominio de proteasa. Estos residuos incluyen, pero no se limitan a, K161, H216, D219, E220, S222 y H257, con la numeración relativa con las posiciones de aminoácidos de un polipéptido
FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (que corresponde a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, respectivamente, por la numeración de quimotripsina ) . En alqunos ejemplos, uno o más de los residuos de aminoácido H216, S222 y H257 (que corresponden a H76, S82 y H117, respectivamente, por la numeración de quimotripsina) se modifican, tal como mediante el reemplazo o supresión de aminoácidos. Cualquier residuo de aminoácido se puede usar para reemplazar el residuo endógeno en las posiciones identificadas. Por ejemplo, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados en los cuales la histidina en la posición de aminoácidos 216 se reemplaza con un residuo de serina, alanina, lisina o arginina. En otro ejemplo en la posición de aminoácidos 222 se reemplaza con un residuo de alanina o lisina, o la histidina en la posición 257 se reemplaza con un residuo de alanina o serina. En una modalidad adicional, la lisina en la posición 161 se reemplaza con un residuo de serina, alanina o valina. Las modificaciones también incluyen inserciones de aminoácidos en o cerca de las posiciones de aminoácidos identificadas por ser implicadas en el enlace de Zn2+. Estas inserciones pueden •interrumpir el sito de enlace de Zn2+, dando por resultado un polipéptido FVII modificado con enlace disminuido a Zn2+.
Los mutantes de combinación en los cuales los reemplazos de aminoácidos se hacen en más de uno de los residuos
identificados anteriormente en un polipéptido FVII también se pueden generar. Incluidos entre estos mutantes de combinación •son aquellos que tienen dos o más mutaciones de los residuos K161, H216, D219, E220, S222 y H257 (que corresponde a K24, H76, D79, E80, S82 y H117, respectivamente, por la numeración de quimotripsina) . Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4, 5 o 6 de las posiciones identificadas. Por consiguiente, un polipéptido modificado puede exhibir 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones que pueden dar por resultado una capacidad disminuida del polipéptido FVII modificado de enlazarse a Zn2+. Por ejemplo, un polipéptido FVII se puede modificar por el reemplazo de aminoácido de la serina en la posición 222 con una lisina, y la histidina en la posición 257 con un residuo de alanina.
Los polipéptidos FVII modificados que tienen resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+ pueden exhibir un incremento por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, .9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la resistencia del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. Una reducción en el enlace de Zn2+ y, por . lo tanto, la resistencia incrementada con los efectos inhibidores de Zn2+, por estos polipéptidos
FVII modificados también se puede manifestar como una actividad de coagulación incrementada en presencia de Zn2+. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados se puede incrementar por los menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
La Tabla 8 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los residuos identificados, que corresponden a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Incluido entre éstos son las mutaciones de combinaciones ejemplares. Como se observa, estos polipéptidos FVII se diseñan para exhibir una capacidad reducida de enlazarse a Zn2+ y, por lo tanto, resistencia incrementada contra los efectos inhibidores de Zn2+. De esta manera, el polipéptido FVII modificado puede tener actividad coagulante incrementada. En referencia con estas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura . de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido
seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones' de aminoácidos para la mutación
también se refieren mediante el esquema de numeración de
quimotripsina. En la Tabla 8 a continuación, se identifica el
identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el cual las
secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se exponen.
Tabla 8.
Modificación Modificación SEQ ID NO.
numeración de FVII numeración de
maduro quimotripsina
K161S K24S 188
K161A K24A' 189
K161V K24V 190
H216S H76S 191
H216A H76A 192
H216K H76K 193
H216R H76R 194
S222A S82A 195
S222K S82K 196
S222V S82V . 197
S222N S82N 198
S222E S82E 199
S222D S82D 200
H257A H117A 201
H257S H117S 202
S222K/H257A S82K/H117A 203
H216A/H257A H76A/H117A 204
4. Glicosilación alterada
Las propiedades y actividades de una proteina se pueden alterar al modular el grado, nivel y/o tipo de glicosilación. Por ejemplo, la glicosilación puede incrementar la vida media del suero de los polipéptidos al incrementar la estabilidad, solubilidad, y al reducir la inmunogenicidad de una proteina. La glicosilación puede incrementar la estabilidad de las proteínas al reducir al proteólisis de la proteína y puede proteger la proteína de la degradación térmica, exposición a los agentes desnaturalizantes, daño por los radicales libres de oxígeno, y cambios en el pH. La glicosilación también puede permitir que la pro-teína, objetivo evada los mecanismos de eliminación que pueden implicar el enlace a otras proteínas, incluyendo los receptores de la superficie celular. Las porciones de carbohidratos que contienen ácido siálico pueden afectar la solubilidad de una proteína. Las porciones de ácido siálico son altamente hidrofilicas y pueden proteger a los residuos hidrofóbicos de la proteína objetivo. Esto disminuye la agregación y precipitación de la proteína objetivo. La agregación disminuida también ayuda en la prevención de la respuesta inmune contra la proteína objetivo. Los carbohidratos pueden proteger adicionalmente
las secuencias inmunogénicas del sistema inmunitario. El volumen de espacio ocupado por las porciones de carbohidratos puede disminuir el área superficial disponible que se examina por el sistema inmunitario. Estas propiedades conducen a la reducción en la inmunogenicidad de la proteina objetivo.
Los sitios de glicosilación proporcionan un sitio para la unión de monosacáridos y oligosacáridos a un péptido por la via de un enlace glicosidico tal que cuando el polipéptido se produce en una célula eucariótica capaz de la glicosilación, se glicosila. Los dos tipos principales de glicosilación son la glicosilación enlazada con N donde las unidades de azúcar se unen por la via del nitrógeno de amida de un residuo de asparagina, y la glicosilación enlazada con O, donde las unidades de azúcar se unen por la via del grupo hidroxilo de los residuos de serina, treonina, hidroxilisina o hidroxiprolina . Otras formas más menores de enlaces glicosidicos incluyen el enlace S a cisteina y el enlace C a triptófano. La glicosilación enlazada con N ocurre en las asparaginas en la secuencia de consenso -Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys donde Xaa no es prolina. No se conoce motivo para la 0-glicosilación, aunque la O-glicosilación es más probable en las secuencias con una alta producción de residuos de serina, treonina y prolina. La presencia de un sitio de glicosilación potencial sin embargo, no asegura que el sitio se glicosilará
durante el procesamiento postraduccional en el ER. Adicionalmente , el nivel de glicosilacion puede variar en un sitio proporcionado, y un sitio puede tener muchas estructuras de glicano diferentes. Existen cuatro sitios de glicosilacion de origen natural en FVII; dos sitios de N-glicosilación en N145 y N322, y dos sitios de O-glicosilación en S52 y S60, que corresponde a las posiciones de aminoácido en polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
Modificaciones ejemplares para alterar la glicosilacion Se proporcionan en este documento polipéptido FVII que se han modificado al alterar el nivel y/o tipo de .glicosilacion como es comparado con un polipéptido FVII no modificado. La glicosilacion se puede incrementar o disminuir comparada con el FVII no . modificado . En algunos casos, el nivel de glicosilacion se incrementa, dando por resultado un polipéptido FVII hiperglicosilado . Estos se puede lograr por ejemplo, mediante la incorporación de por lo menos un sitio de glicosilacion no nativo no encontrado en polipéptido FVII no modificado al cual se enlaza una porción de carbohidrato. Los polipéptido FVII hiperglicosilados también se pueden generar por el enlace de una porción de carbohidrato a por lo menos un sitio de glicosilacion nativo encontrado pero no glicosilado en el polipéptido FVII no modificado. En otros ejemplos, el nivel del glicosilacion en un polipéptido FVII
modificado se disminuye comparado con un polipéptido FVII no modificado. Esto se puede lograr al eliminar uno o más sitios de glicosilación nativos, tal como mediante el reemplazo o supresión de aminoácidos. Uno o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 52, 60, 145 y 322 que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 se pueden suprimir o se pueden reemplazar con un residuo de aminoácidos que no se puede enlazar a las porciones de carbohidrato. Por ejemplo, los residuos de serina en las posiciones 52 y/o 60 se pueden reemplazar con un residuo de alanina, eliminando en consecuencia uno o ambos de los sitios de O-glicosilación nativos. De esta manera, los sitios de glicosilación en un polipéptido FVII se pueden introducir, alterar, eliminar o rearreglar.
Un polipéptido FVII se puede modificar en una o más posiciones para alterar la glicosilación del polipéptido. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento que han al alterado la glicosilación comparados con un polipéptido FVII no modificado pueden tener ninguna glicosilación, glicosilación enlazada con O, glicosilación enlazada con N, y/o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, un polipéptido FVII modificado incluye 1, 2, 3, 4, 5 o más porciones de carbohidrato, cada una enlazada con diferentes sitios de glicosilación. Los sitios de
glicosilación pueden ser un sitio de glicosilación nativo y/o un sitio de glicosilación no nativo. En algunos ejemplos, el polipéptido FVII modificado se glicosila en más de un sitio de glicosilación no nativo. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado se puede modificar para introducir 1, 2, 3, 4, 5 o más de sitios de glicosilación no nativo.
Los sitios de glicosilación no nativos se pueden introducir mediante el reemplazo de aminoácidos. Se pueden crear sitios de O-glicosilación, por ejemplo, mediante el reemplazo de aminoácidos de un residuo nativo con una serina o treonina. Los sitios de N-glicosilación se pueden crear al establecer el motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys , donde Xaa no es prolina. La creación de esta secuencia consenso por la modificación de aminoácidos podría implicar el reemplazo de un residuo de aminoácido nativo con una asparagina, el ¦reemplazo de un residuo de aminoácido nativo con una serina, treonina o cisteína, o el reemplazo de un resido de aminoácido nativo con un reemplazo de asparagina y aminoácido del residuo nativo con una serina, treonina o cisteína. Por ejemplo, la lisina en la posición 109 (basada en la numeración de FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) se puede reemplazar con una asparagina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en el dominio EGF1 y un nuevo sitio de N-glicosilación en la posición de aminoácidos 109. En otro
ejemplo, la alanina en la posición 292 se reemplaza con una asparagina y la posición de alanina 294 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser y un nuevo sitio de N- glicosilación en la posición de aminoácidos 292. En un ejemplo adicional, la alanina en la posición 175 se reemplaza con una serina para crear un nuevo motivo Asn-Xaa-Ser en las posiciones de aminoácidos 173-175 con base en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y un nuevo sitio de N-glicosilación en la posición de aminoácidos 173. Los sitios de glicosilación no nativos se pueden crear en cualquier región en el polipéptido FVII. Por ejemplo, uno o más sitios de glicosilación se pueden introducir en el dominio EGF1, el cual corresponde a las posiciones de aminoácido 46-82 del polipéptido FVII maduro en SEQ ID NO: 3. En otros ejemplos, los sitios de glicosilación no nativos se introducen en la región de dominio de proteasa del polipéptido FVII, o en las posiciones que pueden asociase con la región de dominio de la proteasa en el plegamiento de la proteina.
Los sitios de glicosilación nativos se pueden modificar para prevenir la glicosilación o mejorar o disminuir la glicosilación, mientras que otras posiciones en el polipéptido FVII se pueden modificar para introducir sitios de glicosilación . no nativos. En algunos ejemplos, el
contenido de carbohidratos del polipéptido FVII se puede modificar. Por ejemplo, la posición de número, resistencia de enlace, estructura y composición de los enlaces de carbohidratos (es decir, estructura de los carbohidratos con base en la naturaleza de los enlaces glicosidicos o ramificaciones de carbohidrato) de las porciones de carbohidratos agregadas al polipéptido FVII se pueden alterar.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento que han alterado la glicosilación retienen por lo menos una actividad de FVII. Típicamente, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento que han alterado la glicosilación exhiben actividad coagulante incrementada comparada con un FVII no modificado. En algunos ejemplos, el nivel de glicosilación de un polipéptido FVII se incrementa. El nivel de glicosilación se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con el nivel de glicosilación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre. En otros ejemplos, el nivel de glicosilación se disminuye. El nivel de glicosilación se puede disminuir por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%,
300%, 400%, 500%, o más comparado con el nivel de glicosilación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre. Los niveles de glicosilación alterados o cambios en el tipo de glicosilación presentes en el polipéptido FVII modificado comparado con un polipéptido FVII no modificado se pueden manifestar como actividad de coagulación incrementada. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados con glicosilación alterada se pueden incrementar por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, .60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
La Tabla 9 proporciona ejemplos no limitantes de los reemplazos de aminoácidos ejemplares, que corresponden a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3, que se incluyen en un polipéptido FVII modificado para alterar los niveles de glicosilación al agregar o al eliminar sitios de glicosilación. Los reemplazas de aminoácidos ejemplares pueden crear sitios de glicosilación no nativos o eliminar sitios de glicosilación nativos. En algunos casos, se requieren dos reemplazos de aminoácidos para crear un nuevo sitio de glicosilación. También se incluyen en la Tabla 9 mutaciones de combinación
ejemplares que crean más de un nuevo sitio de glicosilación nativo en el polipeptido FVII. Como se observa anteriormente, los cambios en los niveles de glicosilación pueden, por ejemplo, incrementar la vida media. De esta manera, los polipéptidos FVII modificados pueden tener actividad coagulante incrementada. En referencia a estas mutaciones, un primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia de polipéptido FVII maduro con referencia a SEQ ID NO: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para la mutación también son referidas por el esquema de numeración de quimotripsina donde es apropiado. En los casos dónde una posición de aminoácidos modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir, no está dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se expone en la Tabla 1, anterior) , la posición se indica en corchetes usando la numeración de FVII. Por ejemplo, ?51? no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como A[51]N cuando se refiere a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 9 a continuación, se identifica el
identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el cual las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se exponen. También se identifica en la Tabla 9 cualquiera de los nuevos sitio (s) de glicosilación nativo (s) generados por la modificación (es) .
Tabla 9.
Modificación Modificación Sitio de Sitio de. SEQ ID (es) (es) glicosilaglicosilaNO.
numeración de numeración de ción no ción no
FVII maduro quimotripsina nativo nativo
( numeración (numeración
de FVII de
maduro) quimotrip- sina )
S52A S[52]A ninguno ninguno 206
S60A S [60] A ninguno ninguno 207
E394N/P395A1R39 E245N/P246A1R2 N394 N245 208 6S 47S '
R202S R62S N200 N60d 209
A292N/A294S A150N/A152S N292 N150 210
G318N G170fN N318 N170f 211
A175S A39S N173 N37 212
K109N K[109JN N109 N[109j 213
A122N/.G124S A[122]N/G[124] N122 N[122] 214
S
A51N A[51]N N51 N[51] 215
T130NIE132S T[130jN/E[132] N130 N[130] 216
S
A122N/G124S/ A[122JN/G[124] N122 y N394 N[122] y 217
E394N/P395A/R39 S/E245N/P246A/ N245
6S R247S
A122N/G124S/E39 ' A[122]N/G[124] N122, N394 y N[122], N245 218
4N/P395A/R396S/ S/E245N/P246A1 N318 y N318
G318N R247S/G170fN
S52A/S60A S [52] A/S [601A ninguno ninguno 219
S52N/P54S S[52]N/P[54]S N52 N[52] 220
S119N/L121S S[119]N/L[121] N119 N[119] 221
S
T128N/P129A T[128]N/P[129] N128 N[128] 222
A
Q56N/Y68S Q[66]N/Y[68]S N66 N[66] 223
S52N7P54S/A122N S[52]N/P[54]S/ N52, N122 y N[52] , 224 /G124S/E394N/P3 A[122]N/G[124] N397 N[122] y
95A/R396S S/E245N/P246A/ N245
R247S
KI09N/A292N/A29 K[109]N/A150N/ N109 y N292 N[109] y 225 4S A152S N150
K109N/A175S [109]N/A39S N109 y N173 N[109] y N37 226
S119N/.L121S/A17 S [119]N/L[121] N119 y N173 N[119] y N37 271 5S S/A39S
T128N/P129A1A17 T[128]N/P[129] N128 y N173 N[1281 y N37 272 5S A/A39A
A122N/G124S/A17 A[122]N/G[124] N122 y N173 N[122] y N37 273 5S S/A39S
5. Enlace incrementado a la albúmina de suero y/o a la integrina de plaquetas aIIbp3
El FVII no modificado recombinante tiene una vida media de suero de únicamente 1.5-3 horas en humanos. El incremento de la vida media del suero de ' un polipéptido FVII puede reducir en cantidad y frecuencia a las dosificaciones requeridas para el efecto terapéutico. Se pueden emplear varias estrategias para incrementar la vida media del suero que incluyen, pero no se limitan a, incrementar la glicosilación, incrementar la resistencia a la proteasa,
PEGilación y conjugación o fusión a proteínas más grandes, tal como albúmina de suero y la porción Fe de IgG. Estas modificaciones pueden dar por , resultado, por ejemplo, degradación reducida del polipéptido FVII por las proteasas en suero, eliminación renal reducida, eliminación hepática reducida, y neutralización o eliminación reducida por el sistema inmunitario. Otra estrategia que se puede emplear para incrementar la vida media del suero de un polipéptido FVII implica el injerto de las secuencias de enlace dentro de un polipéptido FVII no modificado para establecer interacciones nuevas o mejoradas de proteína-proteína que no se observan en un polipéptido FVII no modificado.
Las secuencias de enlace que se insertan dentro del polipéptido FVII no modificado pueden contener aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o más de residuos de aminoácidos que facilitan la interacción con otra proteína. Las secuencias de enlace pueden corresponder a una secuencia de enlace presente naturalmente en una proteína nativa, o pueden ser una secuencia de. enlace sintética con poco o nada de correlación de secuencia a las secuencias de enlace presentes naturalmente en una proteína nativa. Las secuencias de enlace usadas para modificar los polipéptidos FVII en este documento interactúan específicamente con un' sito de enlace u otra
proteína, estableciendo una interacción de proteína-proteína no covalente. En algunos ejemplos, la proteína por la cual la secuencia de enlace es específica es una proteína de suero, tal como, por ejemplo, albúmina de suero. Estas secuencias son bien conocidas en el campo (véase por ejemplo US20030069395, US20040009534 y US20070202045) . En otros ejemplos, la proteína reconocida por la secuencia de enlace es un receptor de superficie celular o ligando tal como, por ejemplo, integrina de plaquetas anb 3 (Smith y colaboradores (1995) J. Biol. Chem. 270:30486-30490). La afinidad con la cual el polipéptido FVII modificado se enlaza a la proteína de suero o al receptor de superficie celular se caracteriza típicamente por una constante de disociación, Kd, de 1 µ?, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 p , 10 pM, 1 pM o menor. El enlace del polipéptido FVII modificado a la proteína de suero o al receptor de superficie celular por la vía de la secuencia de enlace puede reducir, por ejemplo, la eliminación renal o la eliminación hepática del polipéptido FVII modificado comparado con un polipéptido FVII no modificado. En algunos ejemplos, el enlace del polipéptido FVII modificado a un receptor de superficie celular también puede fijar como objetivo el polipéptido FVII modificado a una célula deseada o tipo de tejido o región en el cuerpo, "concentrando" en consecuencia ese polipéptido FVII en un sito particular, tal
como, por ejemplo, un coágulo sanguíneo. De esta manera, los polipéptidos FVII modificados que contienen las secuencias de enlace injertadas pueden exhibir vida media incrementada comparada con un polipéptido FVII no modificado.
a. Polipéptidos FVII ejemplares con secuencias de enlace de albúmina de suero
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contiene secuencias de enlace de albúmina de suero, los polipéptidos FVII modificados pueden enlazarse a la albúmina de suero . in vitro o in vivo, dando por resultado una vida media incrementada. De esta manera, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados con vida media incrementada comparado con un polipéptido FVII no modificado. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un agente terapéutico procoagulante, los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada como son comparados con los polipéptidos FVII no modificados.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden contener secuencias de enlace de albúmina de suero. Las secuencias de enlace de albúmina de suero se pueden insertar dentro del polipéptido FVII no modificado o se pueden enlazar a la C- o N-terminal del polipéptido FVII.
Por ejemplo, la secuencia de enlace de albúmina de suero se puede extender desde el residuo de prolina en la posición de aminoácidos 406 en la C-término del polipéptido FVII (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Si las secuencias de enlace se insertan en el polipéptido FVII, la inserción está en una posición tal que el polipéptido FVII modificado resultante retiene por lo menos una actividad de un polipéptido FVII no modificado. La secuencia de enlace se puede insertar en el polipéptido FVII sin remover ninguno de los residuos de aminoácidos en el polipéptido FVII, o pueden reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de enlace de albúmina de suero reemplaza los residuos de aminoácidos S103 a Slll (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) para generar un polipéptido FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de enlace de albúmina de suero reemplaza los residuos de aminoácidos H115 a S126, o T128 a P134 (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) . Las secuencias de enlace de albúmina de suero ejemplares se exponen en SEQ ID NOS: 206-212.
La Tabla 10 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que se pueden hacer a un polipéptido FVII insertando una secuencia de enlace de
albúmina de suero. Como se observa anteriormente, la inclusión de una secuencia de enlace de albúmina de suero puede incrementar la vida media de un polipéptido FVII. De esta manera, los polipéptidos FVII modificados pueden tener actividad coagulante incrementada. En referencia y con las modificaciones listadas en la Tabla 10, los residuos de aminoácidos en los cuales la secuencia de enlace de albúmina de suero se inserta en el polipéptido FVII, y la secuencia de enlace, ambas se representan en la tabla. Por ejemplo, el 'S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los residuos de aminoácidos S103 a Slll de una numeración de. longitud completa del polipéptido ' FVII no modificado residuos que corresponden a las secuencias del polipéptido FVII maduro expuesta en SEQ ID NO: 3) se han suprimido y reemplazado con una secuencia de enlace de albúmina de suero con la secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO:206). La citación de precisamente un residuo de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de enlace de albúmina de suero se inserta después de que el P406 y ninguno de los residuos de aminoácidos se han suprimido del polipéptido FVII. Las posiciones de aminoácidos para la mutación también son referidas por el esquema de numeración de quimotripsina donde sea apropiado. En casos donde una posición de aminoácidos modificada no tiene un número de quimotripsina
correspondiente (es decir, no está dentro de las posiciones
de aminoácidos 153 a 406 que corresponde a un polipéptido
FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se expone en la
Tabla 1, anterior) , la posición se indica en corchetes usando
la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene un
número de quimotripsina correspondiente y se expone como S[103] cuando se refiere a la numeración de quimotripsina. En
la Tabla 10 a continuación, se identifica el identificador de
secuencia (SEQ ID NO) en el cual las secuencias de
aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se
exponen .
Tabla 10.
Modificación Modificación SEQ numeración de FVII - numeración de quimotripsina ID maduro NO
S103SllldelinsQRLMEDICLPR S [103] S [III jdelinsQRLMEDICLPRW 227 WGCLWEDDF GCLWEDDF
Hll5S126delinsQRLMEDICLPR H [115] S [126] delinsQRLMEDICLPRW 228 WGCLWEDDF GCLWEDDF
T128P134delinsQRLMEDICLPR T[128] P[134]delinsQRL EDICLPRW 229 WGCLWEDDF GCLWEDDF
S103SllldeIinsIEDICLPRWGC S [103] S [111] delinsIEDICLPRWGCL 230 LWE W E
H115S126delinsIEDICLPRWGC H [115] S [126] delinsIEDICLPRWGCL 231 LWE WE
T128P134delinsIEDICLPRWGC T [ 128] P[ 134] delinsIEDICLPRWGCL 232 LWE W E
S103SllldelinsDICLPRWGCLW S [103] S[lll]delinsDICLPRWGCLWE 233 ED D
H115S126delinsDICLPR GCLW H [115] S [126] delinsDICLPRWGCLWE 234 ED D
T128P13 delinsDICLPRWGCLW T[128] P[134]delinsDICLPRWGCLWE 235 ED D
P406insIEDICLPRWGCL P257insIEDICLPRWGCLW 236
P406insGGGSIEDICLPRWGCLW P257insGGGSIEDICLPRWGCLW 237
P406insDICLPRWGCLWED P257insDICLPRWGCLWED 238
P406insGGGSDICLPRWGCLWED P257msGGGSDICLPRWGCLWED 239
Los polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace de albúmina de suero pueden exhibir enlace incrementado a la albúmina de suero que es por lo
menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%,
300%, 400%, 500%, o más comparados . con el polipéptido FVII no
modificado de tipo silvestre a la albúmina de suero ya sea in vivo o in vitro. Los - polipéptidos FVII modificados que se pueden enlazar a la albúmina de suero pueden exhibir vida media de suero implementada de por lo menos aproximadamente
1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la vida media del suero del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. La vida media de enlace de la albúmina de suero incrementada y/o
de suero incrementada de los polipéptidos FVII modificados
también se pueden manifestar como actividad de coagulación
incrementada, durante de la actividad coagulante y/o índice
terapéutico mejorado. La. actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
b. Polipéptidos FVII ejemplares con secuencias de enlace de integrina de plaquetas oiiibPa
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen secuencias de enlace de integrina de plaquetas anb 3. La . integrina de plaquetas (también llamada glicoproteina (GP) Ilb/IIIa) es el receptor de adhesión de plaquetas más abundante. Es un heterodimero dependiente de calcio que sirve como un receptor para las proteínas que incluyen, pero no se limitan a, fibrinógeno, fibronectina , vitronectina , factor von Willebrand, y trombospondina . El enlace a los ligandos de la proteína "cognado" puede activar el a?:^ß3 e inducir a una transducción de señal en el citoplasma por la vía del dominio intracelular de la proteína. Los polipéptidos FVII modificados que contienen secuencias de enlace de integrina de plaquetas por lo tanto, pueden enlazarse a las plaquetas. Los polipéptidos FVII modificados se pueden enlazar a la
integrina de plaquetas OubP3 (la forma actividad y/o desactivadas) in vitro o in vivo, dando por resultado una vida media incrementada. Aquellas variantes de FVIIa que se enlazan selectivamente a anb 3 pueden, por lo tanto, ser fijadas como objetivo a plaquetas activadas y concentradas de esta manera en el sitio de un coágulo sanguíneo en desarrollo. El objetivo selectivo de FVIIa para coágulos sanguíneos en evolución sería esperado que mejoren la actividad terapéutica de la variante al mejorar tanto la eficacia como el índice terapéutico. De esta manera, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados con vida media incrementada comparados con un polipéptido FVII no modificado y variantes que, además, se enlazan selectivamente a las plaquetas activadas. Cuando se evalúa en un ensayo in vitro apropiado, o in vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un agente terapéutico procoagulante, los polipéptidos FVII modificados pueden exhibir actividad coagulante incrementada como es comparado con los polipéptidos FVII no modificados.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento contienen secuencias de enlace de integrina de plaquetas IIb 3. Las secuencias de enlace de integrina de plaquetas 0fnbP3 se pueden insertar con el polipéptido FVII no modificado o se . pueden enlazar a la C- o N-terminal del
polipéptido FVII. Por ejemplo, las secuencias de enlace o¡ b 3 se pueden extender desde el residuo de prolina en la posición de aminoácidos 406 en la C-terminal del polipéptido FVII (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Si las secuencias' de enlace se insertan dentro del polipéptido FVII, la inserción está en una posición tal que el polipéptido FVII modificado resultante retiene por lo menos una actividad de un polipéptido FVII no modificado. La secuencia de enlace se puede insertar dentro del polipéptido FVII sin remover ninguno de los residuos de aminoácidos en el polipéptido FVII, o puede reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido FVII. En algunos ejemplos, una secuencia de enlace de integrina de plaquetas anb 3 reemplaza los residuos de aminoácidos S103 a Slll (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) para generar un polipéptido FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de enlace anbP3 reemplaza los residuos de aminoácidos H115 a S126, o TI 28 a P134 (que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3). Las secuencias de enlace de integrina de plaquetas a?^ß3 ejemplar se exponen en SEQ ID NOS: 213-215.
La Tabla 11 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que se pueden hacer a un polipéptido FVII para insertar una secuencia de enlace de
integrina de plaquetas aIIbp3. Como se observa anteriormente, la inclusión de una secuencia de enlace de integrina de plaquetas aIIbp3 puede incrementar la vida media del suero de un polipéptido FVII y/o fijar como objetivo la proteina a un coagulo sanguíneo en evolución. De esta manera, los polipéptidos FVII modificados pueden tener actividad coagulante incrementada. En referencia con las modificaciones listadas en la Tabla 11, los 'residuos de aminoácidos en los cuales la secuencia, de enlace de integrina de plaquetas anbp3 se inserta en el polipéptido FVII, y la secuencia de la secuencia de enlace, ambas se representan en la tabla. Por ejemplo, H115S126delinsSFGRGDIRNV indica que los residuos de aminoácidos H115 a S126. de una numeración de longitud completa del polipéptido FVII no modificado (residuos que corresponden a la secuencia de polipéptido FVII maduro expuesta en SEQ ID NO: 3) se han suprimido y reemplazado con una secuencia de enlace. aIIbp3 con la secuencia de aminoácidos SFGRGDIRNV (SEQ ID NO:213). La citación de tan solo un residuo de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de enlace 0í bp3 se inserta después de que P406 y ninguno de los residuos de aminoácido se han suprimido del polipéptido FVII. Las posiciones de aminoácidos para la mutación también son referidas por el esquema de numeración
de quimotripsina donde es apropiado. En casos donde una posición de aminoácidos modificada no tiene un número de quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácido positions 153 a 406 que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3, y no se expone en la Tabla 1, anterior), la posición se indica en corchetes que usan una numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como S[103] cuando se refiere a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 11 a continuación, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el cual las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se exponen.
Tabla 11.
Los polipéptidos FVII modificados que contienen una secuencia de enlace de integrina de plaquetas a^ß3 puede exhibir enlace incrementado a la integrina de plaquetas a?¾ß3 que es por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con el enlace del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre a la integrina de plaquetas ?????3ß3 in vivo. Los polipéptidos FVII modificados que se pueden enlazar a las plaquetas por la vía de integrina de plaquetas a?¾ß3 puede exhibir vida media incrementada de por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la vida media del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vítro, in vivo o ex vivo. La vida media incrementada de estos polipéptidos FVII modificados también se puede manifestar como actividad de coagulación incrementada, duración de la actividad coagulante y/o índice terapéutico mejorado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
6. Modificación mediante la introducción de un dominio Gla heterólogo
La interacción de los residuos en el dominio Gla ?-carboxilado de proteínas de plasma dependientes de vitamina
K, tal como FVII, FIX, FX, protrombina, proteina C y proteína S, y fosfolipidos negativamente cargados sobre la superficie de la membrana es importante para la hemostasis. Los dominio Gla de las proteínas de plasma dependientes de vitamina K contienen típicamente de manera aproximada 45 aminoácidos, de los cuales 9 a 12 residuos de ácido glutámico se modifican postraduccionalmente por la carboxilación dependiente de vitamina K para formar ?-carboxiglutamato (Gla) . Los aminoácidos que forman el dominio Gla se posiciona inmediatamente después de aquellos que forman el péptido de señal y el propéptido de las proteínas, y se sitúan por lo tanto en la N-término después del procesamiento y la escisión de los polipéptidos precursores a las proteínas maduras. Por ejemplo, los aminoácidos que forman el dominio Gla en FVII están en las posiciones 39-83 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID N0:1, las posiciones 61-105 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 2, y las posiciones 1 a 45 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. De éstos, los 10 residuos de ácido glutámico en las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 el Polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 se modifican mediante la carboxilación para generar residuos de ?-carboxiglutamato (Gla) .
Debido a su afinidad de enlace relativamente baja para
las plaquetas activadas, el dominio Gla de FVII es un objetivo para la modificación, con la meta de mejorar la interacción entre el FVII modificado y la membrana de fosfolipido, incrementado en consecuencia la actividad de coagulación. La modificación se puede efectuar mediante la sustitución de aminoácidos específicos que se implican en este interacción {véase, por ejemplo, Shah y colaboradores PNAS 95: 4429-4234, Harvey y colaboradores (2003) J Biol Chem 278:8363-8369). Alternativamente, la modificación se puede efectuar mediante la sustitución del dominio Gla completo con el dominio Gla de otra proteína dependiente de vitamina K es decir el intercambio del dominio Gla. Este tipo de modificación da por resultado una proteína quimérica, tal como aquella la cual resultó · cuando el dominio Gla de la proteína C se reemplazó con el dominio Gla de FVII (Geng y colaboradores (1997) Thromb Haemost 77:926-933).
Típicamente, tal modificación incluye la introducción, tal como mediante la adición o sustitución, de un dominio Gla heterólogo o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace de fosfolípidos dentro de una región del _ polipéptido FVII para generar un polipéptido FVII modificado quimérico. Generalmente, este polipéptido FVII quimérico retiene por lo menos una actividad de FVII. El enlace y/o afinidad de los polipéptidos FVII modificados con Gla para
las plaquetas activadas se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con el enlace y/o afinidad del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro. El enlace y/o afinidad para las plaquetas activadas por los polipéptidos FVII modificados también se puede manifestar como actividad de coagulación incrementada. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados con Gla se puede incrementar por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo o in vitro.
Un dominio Gla o. porción suficiente del mismo para efectuar el enlace de fosfolipido, tal como 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del dominio Gla heterólogo, contenido dentro de cualquier polipéptido se puede usar como una fuente de dominio Gla heterólogo para la introducción o reemplazo de una región de un polipéptido FVII. Típicamente, este dominio Gla heterólogo exhibe afinidad de enlace para los fosfolípidos, por ejemplo, fosfolípidos presentes sobre la
superficie de una plaqueta activada. Generalmente, la selección de un dominio Gla heterólogo es uno que exhibe afinidad más alta para los fosfolipidos como es comparada con la afinidad del dominio Gla de FVII. El dominio Gla exacto, o porción suficiente del mismo, usado como un dominio heterólogo para la modificación de un polipéptido FVII se puede determinar racional o empíricamente. Ejemplares de los polipéptidos que contienen Gla incluyen, pero no se limitan a FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina , proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de retraso de crecimiento (Gas6) , y proteína Z. Los dominios Gla de esas proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEQ ID NOS: 83-91. Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o más aminoácidos contiguos, o el. dominio Gla completo del domino Gla heterólogo se puede introducir dentro de un polipéptido FVII. Además, la introducción del dominio Gla dentro de un polipéptido FVII también puede incluir aminoácidos adicionales no parte del dominio Gla del polipéptido heterólogo siempre y cuando los aminoácidos adicionales no debiliten significativamente la capacidad de enlace del fosfolípido del dominio Gla introducido.
En algunos ejemplos, la introducción es mediante la adición del dominio Gla al polipéptido FVII tal que el dominio Gla heterólogo se inserta dentro del dominio Gla
endógeno o dentro de otra región o dominio del polipéptido FVII siempre y cuando el polipéptido FVII modificado retenga por lo menos una actividad de FVII. En estos ejemplos, el dominio Gla nativo del polipéptido FVII se retiene el en el polipéptido, aunque en algunos casos la secuencia de aminoácidos que constituye el dominio Gla nativo se interrumpe. En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo, o una porción suficiente del mismo, se inserta adyacente a, ya sea sobre la N- o C-término, del domino Gla nativo, tal que el domino Gla nativo no se interrumpe. En un ejemplo adicional, el dominio Gla heterólogo, o una porción suficiente del mismo, se inserta dentro de otro dominio del polipéptido FVII.
También se proporcionan en este documento polipéptidos FVII de dominio Gla modificados donde todo o una porción contigua del dominio Gla endógeno de FVII se remueve y se reemplaza con un dominio Gla heterólogo, o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace de fosfolipido, siempre y cuando el polipéptido FVII modificado retenga por lo menos una actividad de FVII. Esta modificación también es referida como un intercambio de dominio Gla. Ejemplares de las modificaciones de intercambio Gla son aquellas en las cuales el dominio Gla endógeno se reemplaza con todo o una porción del dominio Gla de cualquiera de FIX (SEQ ID NO: 83),
FX (SEQ ID NO:84), trombina (SEQ ID NO:85), Proteina C (SEQ ID NO:86) o Proteina S (SEQ ID NO: 87). Estas modificaciones son llamadas "Gla Intercambio FIX, " "Gla Intercambio FX," "Gla Intercambio Trombina", "Gla Intercambio Prot C" y "Gla Intercambio Prot S," respectivamente. Estos polipéptidos FVII modificados pueden exhibir enlace incrementado a las plaquetas activadas, dando por resultado una actividad coagulante incrementada. La modificación "Gla Intercambio FIX" implica la supresión del dominio FVII Gla endógeno a suprimir los residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y a la inserción de 45 residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos Yl a Y45 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83. La modificación Gla Intercambio FX implica la supresión de residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 44 residuos de aminoácidos que corresponden a Al a Y44 del dominio FX Gla expuesto en SEQ ID NO: 84. La modificación Gla Intercambio Trombina implica la supresión de residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 44 residuos de aminoácidos que corresponde a los residuos de aminoácidos Yl a Y44 del dominio Trombina Gla
expuesto en SEQ ID NO: 85. La modificación Gla Intercambio Proteína C implica la supresión de los residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII. maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 44 residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos Al a H44 del dominio Proteína C Gla expuesto en SEQ ID NO: 86. La modificación Gla Intercambio Proteína S implica la supresión de los residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 44 residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos Yl a Y44 del dominio Proteína S Gla expuesto en SEQ ID NO: 87.
En algunos ejemplos, las modificaciones, que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones o reemplazos, inserciones y/o supresiones de aminoácidos, se hacen al dominio Gla heterólogo que está siendo ' introducido en el polipéptido FVII. Estas modificaciones pueden efectuar, por ejemplo, el enlace incrementado a las plaquetas activadas, debido al enlace de fosfolípido incrementado, como es comparado con el enlace observado con la forma de tipo silvestre del dominio Gla heterólogo. Por ejemplo, si el dominio Factor IX Gla, o una porción de enlace de fosfolípido del mismo, se introduce en un polipéptido FVII para generar un polipéptido FVII
modificado, el dominio Factor IX Gla puede contener mutaciones de aminoácidos que confieren un enlace de fosfolipido incrementado comparado con el dominio Factor IX Gla de tipo silvestre. El dominio Gla heterologo contenido en los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones, tal como las sustituciones o reemplazos, inserciones y/o supresiones de aminoácidos.
En algunos ejemplos, la(s) modificación (es) en el domino Gla heterologo incrementa (n) el enlace de fosfolipido. En otros ejemplos el dominio Gla heterologo puede contener una o más mutaciones comparadas con la forma de tipo silvestre del dominio Gla heterologo que confiere funciones similares a FVII al dominio Gla heterologo. Por ejemplo, como se observa anteriormente, R36 del dominio FVII Gla expuesto en SEQ ID NO: 119 se puede implicar en las interacciones con FX. Por consiguiente, el dominio Gla heterologo puede contener modificaciones adicionales, tales como cualquiera requerida para mantener una arginina en la posición 36 del polipéptido FVII maduro, como se expone en SEQ ID NO: 3, o cualquier otras modificaciones requeridas para mantener las propiedades de activación FX del polipéptido FVIIa modificado (Ruf y colaboradores (1999) Biochem 38:1957-1966). De esta manera, el algunos ejemplos, una mutación correspondiente a R36 se
puede hacer en el dominio Gla heterologo. La posición correspondiente se puede determinar por una persona experta en el campo, tal como mediante la alineación de secuencias de aminoácidos .
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen una modificación Gla Intercambio en donde el dominio Gla heterologo o la porción de enlace de fosfolipido del mismo, contiene una o más mutaciones comparadas con el dominio Gla heterologo de tipo silvestre, y se introduce en el polipéptido FVII mediante el reemplazo de algo o todo el dominio FVII Gla endógeno. En un ejemplo, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en . este documento contienen una modificación "Gla Intercambio FIX", la cual, como se describe anteriormente, implica la supresión de el dominio FVII Gla endógeno al suprimir los residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII. maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 45 residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos Yl a Y45 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83. El dominio FIX Gla usado en la modificación Gla Intercambio puede contener una o más mutaciones comparadas con la forma de tipo silvestre del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o más mutaciones, tal como sustituciones, supresiones o
inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, el dominio FIX Gla heterologo en el polipéptido FVII modificado "Gla Intercambio FIX" puede contener una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos que corresponde a M19, E40, K43 y/o Q44 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83.
En un ejemplo, el dominio FIX Gla contiene una sustitución de aminoácidos M19K. Esta modificación se indica por . {Gla Intercambio FIX/MI 9K} es decir la metionina en la posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 19 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. En. un ejemplo adicional, el dominio FIX Gla heterologo modificado en el polipéptido FVII modificado contiene una sustitución de aminoácidos E40L indicada por y {FIX Gla Intercambio/E40L } , mediante lo. cual el ácido glutámico en la posición de aminoácidos que corresponde la posición de aminoácidos 40 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una leucina. También se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contiene una sustitución 431 (indicada por {Gla Intercambio FIX/K43I}) en donde la lisina en la posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 43 del dominio FIX Gla expuesta en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una isoleucina. En otro ejemplo, el dominio FIX Gla heterologo modificado en el polipéptido FVII modificado
contiene una sustitución de aminoácidos Q44S, indicada por {FIX Gla Intercambio/Q44S } , mediante lo cual la glutamina en la posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 44 del dominio FIX Gla expuesta en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una serina. En un ejemplo, el dominio FIX Gla heterólogo contiene las sustituciones de aminoácidos M19K/E40L/K43I/Q44S .
Los polipéptidos FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo, tal como dominio Gla heterólogo modificado, pueden exhibir actividad coagulante incrementada en dosificaciones, más bajas como es comparado con una molécula FVII de tipo silvestre, tal como NovoSevenMR debido al enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas. La actividad de coagulación de los polipéptidos FVII modificados con Gis se pueden incrementar por lo menos o aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparada con la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado o de tipo silvestre ya sea in vivo, ex vivo o in vi tro.
7. Combinaciones y Modificaciones Adicionales
Cualquiera o más de las modificaciones descritas anteriormente se pueden combinar con cualquier otra(s) modificación (es) descrita (s) .anteriormente o descrita (s) en
cualquier lugar en. el campo. De esta manera, además de la modificación de los polipéptidos FVII para tener resistencia incrementada a AT-III, la actividad catalítica incrementada, resistencia incrementada a la inhibición por Zn2+ glicosilación alterada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media incrementada, enlace y/o afinidad incrementada a la albúmina de suero, enlace y/o afinidad incrementada a fosfolípidos, o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas a???ß3, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento también incluyen aquellos que exhiben más de una de las propiedades mencionadas anteriormente. Típicamente, estas modificaciones adicionales son aquellas que por sí mismas dan por resultado una actividad coagulante incrementada del polipéptido modificado y/o estabilidad incrementada del polipéptido. Por consiguiente, los polipéptidos FVII modificados resultantes exhiben una actividad coagulante incrementada. Las modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, cualquier sustitución, supresión o inserción de aminoácidos conocidos en el campo, típicamente cualquiera que incremente la actividad y/o estabilidad coagulante del polipéptido FVII. Cualquiera polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más
de modificaciones de aminoácidos adicionales, siempre y cuando el polipéptido FVII modificado resultante retenga una actividad FVII del polipéptido no modificado de tipo silvestre.
En un ejemplo, la modificación adicional se puede hacer a la secuencia de polipéptido FVII tal que su interacción con otros factores, moléculas y proteínas se altere. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que se implican en la interacción con el inhibidor de vía de factor de tejido (TFPI) se puede reemplazar tal que la afinidad y/o enlace del polipéptido FVII modificado a TF se disminuye. Otras modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificación de aminoácidos que se implican en interacciones con el factor X, factor IX, factor de tejido (TF) y fosfolípidos . En algunos ejemplos, la modificación hecha a la secuencia de polipéptido FVII incluye la inserción de aminoácidos que constituye una secuencia de enlace, tal como, por ejemplo, una secuencia de enlace de albúmina de suero o una secuencia de enlace Ilb-IIIa de glicoproteína .
También se pueden hacer modificaciones adicionales a un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento que altere la conformación o plegamiento del polipéptido. Estos incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más aminoácidos con una cisteína tal que se forma un nuevo enlace
de disulfuro, o modificaciones que estabilizan una conformación de a-hélice, impartiendo en consecuencia actividad incrementada al polipéptido FVII modificado.
También se pueden hacer modificaciones adicionales al polipéptido FVII para efectuar las modificaciones pos-traduccionales . Por ejemplo, el polipéptido se puede modificar para incluir sitios de glicosilación adicionales tal que el polipéptido FVII modificado resultante tiene glicosilación incrementada comparado con un polipéptido FVII no modificado. Las modificaciones también se pueden hacer para introducir residuos de aminoácidos que se pueden enlazar subsecuentemente a una porción química, tal como uno que actúa para incrementar la estabilidad del polipéptido FVII modificado. La estabilidad de un polipéptido FVII también se puede alterar al modificar los sitios proteolíticos potenciales, incrementando en consecuencia la resistencia del polipéptido FVII modificado a las proteasas.
Adicionalmente , las sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos se pueden hacer en el dominio Gla endógeno tal que el polipéptido FVII modificado exhibe enlace y/o afinidad incrementada para las membranas de fosfolípidos . Estas modificaciones pueden incluir una sola sustitución de aminoácidos, supresiones y/o inserciones, o pueden incluir una sustitución, supresión o inserción de aminoácidos de
múltiples aminoácidos. Por ejemplo, todo o parte del dominio Gla endógeno se puede reemplazar con todo o parte de un dominio Gla heterólogo. En otros ejemplos, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden exhibir supresiones en el dominio Gla endógeno o sustituciones en las posiciones que están normalmente gamma-carboxilados (US200700377 6) .
Las siguientes secciones describen ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en el campo para efectuar una estabilidad incrementada y/o actividad coagulante de un polipéptido FVII. Como se plantea anteriormente, estas modificaciones también se pueden incluir adicionalmente en cualquier polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento. Las posiciones de aminoácidos referenciadas posteriormente corresponden al polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ ID NO: 3. Las mutaciones correspondientes se pueden hacer en otros polipéptidos FVII tal como variantes alélicas, especies o de empalme del polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3.
a. Modificaciones que incrementan la resistencia a
TFPI
En un ejemplo, se pueden hacer modificaciones adicionales a un polipéptido FVII modificado que contiene una modificación en la posición de aminoácidos 286 por la
numeración de FVII maduro que da por resultado resistencia incrementadas a TFPI. Esta resistencia a TFPI se puede lograr, por ejemplo, mediante la mutación de uno o más residuos en FVII implicado en la interacción y enlace con TFPI para reducir o prevenir este enlace, haciendo en consecuencia los polipéptidos FVII modificados resistentes a los efectos naturalmente inhibidores de TFPI con respecto a la iniciación de coagulación. Por. ejemplo, las modificaciones se pueden hacer en los residuos de aminoácidos que son residuos de contacto FVII/TFPI o residuos en proximidad cercana con la superficie de interacción.
Ejemplos de modificaciones adicionales que se pueden incluir en los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento para incrementar la resistencia a TFPI incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en la publicación de patente internacional No. WO200 /083361 , Neuenschwander y colaboradores, (1995) Biochemistry 34:8701-8707, Chang y colaboradores, (1999) Biochemistry 38:10940-10948, y Iakhiaev etal., (2001) Thromb. Haemost. 85:458-463, y la solicitud relacionada de E.U.A. No. serie 12/082,662. Ejemplos no limitantes de modificaciones de aminoácidos ejemplares descritos en el campo que pueden dar por resultado resistencia incrementada a TFPI del polipéptido FVII modificado incluyen cualquiera o más de Q176, D196K, D196R,
D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A,
K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, 197W,
K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A,
R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V,
K341E, K341R, K341Q, K341N, 341M, K341D, G237T238insA,
G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197 insR, D196K197insY, D196K197ins , D196K197insA, D196K197insM, Kl 97 I 198 insE, K197I198insY, K197I198insA y K197I198insS (donde, por ejemplo, G237T238insAS indica una modificación en la cual una alanina (A) y una serina (S) se han insertado entre la glicina en la posición 237 (G237) y la treonina en la posición 238).
b. Modificaciones que incrementan la actividad intrínseca
En un ejemplo, se pueden hacer modificaciones adicionales a un polipéptido de factor VII modificado proporcionado en este documento que da por resultado una actividad catalítica incrementada hacia el factor X. Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones a los aminoácidos que se implican en la interacción con su co-factor, TF, tal que el polipéptido FVII modificado resultante tiene afinidad incrementada para TF, y exhibe en consecuencia actividad incrementada hacia FX. También se pueden hacer modificaciones a la bolsa de activación del polipéptido FVII, tal que la
actividad intrínseca del polipéptido FVII modificado hacia FX se incrementa comparado con la actividad del polipéptido FVII no modificado. Otra estrategia de modificación que da por resultado la actividad incrementada implica la modificación del polipéptido FVII tal que el plegamientp y la conformación de la proteína se alteran a una forma más activa. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos tal que la región de bucle de a-hélice (que corresponde a las posiciones 305 a 32.1 de la secuencia madura como se expone en SEQ ID NO: 3) del dominio de proteasa se estabiliza y se pliega más estrechamente al cuerpo del dominio de proteasa para conferir una forma más similar a zimógeno sobre el polipéptido FVII modificado. Un polipéptido más activo también se puede lograr mediante la modificación de los aminoácidos implicados en las ß-hebras del polipéptido FVII. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos que introduzcan nuevos pares de cisterna que puedan formar nuevos enlaces de disulfuro los cuales pueden funcional para "bloquear" el polipéptido FVII modificado en una forma más activa.
Ejemplos de modificaciones adicionales que se pueden incluir en los' polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento para incrementar la actividad intrínseca del polipéptido FVII modificado incluyen, pero no se limitan
a, aquellos descritos por Persson y colaboradores (2004) Biochem J. 379:497-503, Maun y colaboradores (2005) Prot Sci 14:1171-1180, Persson y colaboradores (2001) PNAS 98:13583-13588, Persson y colaboradores (2002) Eur J Biochem 269:5950-5955, Soejima y colaboradores (2001) J Biol Chem 276:17229-17235, Soejima y colaboradores (2002) J Biol Chem 277:49027-49035, WO200183725, O2002022776, W02002038162 , WO2003027147 , WO200338162, O2004029090, WO2004029091, WO2004108763 y WO2004111242. Ejemplos no limitantes de modificaciones de aminoácidos ejemplares descritas en el campo que pueden dar por resultado una. actividad intrínseca incrementada del polipéptido FVII modificado incluyen cualquiera o más de S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S,
P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116D, K157V,
K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S,
K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D,
K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G,
V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K,
V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D,
A274V, A274I, A274F, A274 , A274P, A274G, A274T, A274C,
A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V,
E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S,
E296T, E296C, E296Y, E296N, ¦ E296K, E296R, E296H, E296D,
E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298 , M298P,
M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R,
M298H, 298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305 V,
L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G,
L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H,
L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V,
S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T,
S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D,
S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F,
D334 , D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334 ,
D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V,
S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C,
S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L,
K337V, K337I, K337M, K337F, K337 , K337P, K337G, K337S,
K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D,
K337Q, F374P, F374A, F3 4V, F374I, F374L, F374 , F374 ,
F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K,
F374R, F374H, F374D, F374Q, y sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312, o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, y sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
c. Modificaciones que incrementan la resistencia a las proteasas
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento también pueden contener modificaciones adicionales que dan por resultado una resistencia incrementada del polipéptido a las proteasas. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos que remuevan uno o más sitios de escisión proteoliticos potenciales. Los polipéptidos FVII modificados de esta manera, se pueden hacer más resistentes a las proteasas, incrementando en consecuencia la estabilidad y vida media- del polipéptido modificado.
Ejemplos de modificaciones adicionales que se pueden incluir en los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento para incrementar la resistencia a las proteasas incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en la patente de E.U.A No. US5580560 o Solicitud Publicada Internacional Nos. WO1988010295 y WO2002038162. Ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en el campo que pueden dar por resultado una resistencia incrementada del polipéptido FVII modificado a inhibidores y/o proteasas incluyen cualquiera o más de K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K,
R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A y K341S.
d. Modificaciones que incrementan la actividad para los fosfolipidos
El polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento también puede contener una o más modificaciones adicionales para incrementar la afinidad para los fosfolipidos. La actividad coagulante de FVII se puede mejorar al incrementar el enlace y/o afinidad del polipéptido para los fosfolipidos, tales como aquellos expresados sobre la superficie de las plaquetas activadas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al modificar al dominio FVII Gla endógeno. La modificación se puede afectar mediante la sustitución de aminoácidos en una o más posiciones en el dominio Gla de un polipéptido FVII que da por resultado un polipéptido FVII modificado con capacidad incrementada de enlazarse a la fosfatidilserina y otros fosfolipidos negativamente cargados. Ejemplos de modificaciones adicionales para incrementar el enlace y/o afinidad de fosfolipidos y que se puede hacer para un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento que contiene un dominio FVII Gla endógeno, incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos por Harvey y colaboradores (2003) J Biol
Chem 278:8363-8369, US20030100506, US20040220106,
US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 y WO2004111242. Ejemplares de estas modificaciones, incluyen cualquiera o más de una inserción de una tirosina en la posición 4, o modificación de cualquiera de P10Q, P10E, P10D, PION, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, ?34?, A34L, A34M, A34V, A34F, A34 , A34Y, R36D, R36E, K38E y K38D.
e. Modificaciones que alteran la glicosilacion
La alteración del grado, nivel y/o tipo de glicosilacion de una proteina se ha descrito en el campo como un medio para reducir la inmunogenicidad, incrementar la estabilidad, reducir la frecuencia de administración y/o reducir los efectos secundarios adversos tal como inflamación. Normalmente, esto se efectúa al incrementar los niveles de glicosilacion. El(los) sitio(s) de glicosilacion proporciona (n) un sitio para la unión de una porción de carbohidrato sobre el polipéptido, tal que cuando el polipéptido se produce en una célula eucariótica capaz de la glicosilacion, se glicosila.
Existen cuatro sitios de glicosilacion nativos en FVII; dos sitios de N- glicosilacion en N145 y N322, y dos sitios de 0- glicosilacion en S52 y S60, que corresponde a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido FVII maduro
expuesto en SEQ ID NO: 3. En una modalidad, se pueden hacer modificaciones adicionales a un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento tal que la glicosilación en los sitios anteriores se interrumpe. Esto puede dar por resultado un polipéptido FVII modificado con actividad coagulante incrementada (véase, por ejemplo, WO2005123916) . Ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en el campo que pueden dar por resultado una glicosilación disminuida y actividad incrementada del polipéptido FVII modificado como es comparado con un polipéptido FVII no modificado incluyen, pero no se limitan a S52A, S60A, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145 , N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K; N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W y N322C.
En otra modalidad, se pueden hacer modificaciones adicionales a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento tal que los sitos de glicosilación adicionales es introducen, incrementando de esta manera el nivel de glicosilación del polipéptido FVII modificado como es comparado con un polipéptido FVII no modificado. El sitio de glicosilación puede ser un sitio de glicosilación N-enlazado u O-enlazado.
Ejemplos de modificaciones que se pueden hacer a un polipéptido FVII que introducen uno o más nuevos sitios de gl icosilación incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se describen en los documentos US6806063 y WO200393465. Ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en el campo que pueden dar por resultado una glicosilación incrementada del polipéptido FVII modificado como es comparado con un polipéptido FVII no modificado incluyen, pero no se limitan a F4S , F4T, PION, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N,. G318N, G331N, D334N, 337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, 32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, . D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, S52N/P54S, Q66N/Y68S, S119N/L121S, A122N/G124S, T128N/P129A, T130N/E132S, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S,
E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/,
I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S,
A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S,
R290N/A292T, A292N/A294S, . D289N/G291S, D289N/G291T,
L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T,
A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T,
R315N/V317S. R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T.
Q313N/R315S, Q313N/R315T, 316N/G318S, K316N/G318T,
V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T,
S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T,
R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T,
K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T,
E394N/R396S, E394N/R396T, E394N/P395A/R396S, P395N/P397S,
P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S,
P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S,
V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S,
L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S,
A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.
f . Modificaciones para facilitar el enlace del grupo químico
Modificaciones adicionales de un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento también se pueden hacer para facilitar el enlace subsecuente de un grupo químico. Se puede hacer, una o más sustituciones o inserciones de aminoácidos tal que un grupo químico se puede enlazar a un
polipéptido FVII modificado por la vía de aminoácido sustituido. Por ejemplo, una cisteina se puede introducir a un polipéptido FVII modificado, al cual una porción de polietilenglicol (PEG) se puede enlazar para conferir estabilidad incrementada y vida media del suero. Otros residuos de unión incluyen residuos de lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas modalidades, los residuos de aminoácidos se reemplazan para reducir el número de posiciones de enlace potenciales. Por ejemplo, el número de Usinas se puede reducir. Ejemplos de modificaciones que se pueden hacer a la secuencia de aminoácidos de un Polipéptido FVII el cual puede facilitar el enlace subsecuente con un grupo químico incluyen pero no se limitan a, aquellos que se describen en los documentos US20030096338 , US20060019336, US6806063, WO200158935 y WO2002077218. Ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares de unos polipéptido FVII que pueden facilitar el enlace subsecuente con un grupo químico incluyen, pero no se limitan a; Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292 , T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393 , E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C,
K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E,. K38E, 41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, 316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, Kl 8R, K32R, K38R, . K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, 148R, K157R, K161R, K197R, K199R, 316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H y K389H.
g. Mutaciones de combinación ejemplares
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que tienen dos o más modificaciones diseñadas para efectuar una o propiedades o actividades de un polipéptido FVII no modificado. En algunos ejemplos, las dos o más modificaciones alteran dos o más propiedades o
actividades del polipéptido FVII. Las modificaciones se pueden hacer a los polipéptido FVII tal que se altera una o más de la actividad catalítica, resistencia a, AT-III, resistencia a TFPI, resistencia a la inhibición Zn2+, actividad intrínseca, actividad amidolítica, enlace y/o afinidad de fosfolípidos , glicosilación, resistencia a proteasas, vida media e interacción con otros factor eso moléculas, tal como FX, FIX, albúmina de suero e integrina de plaquetas oíubP3- Típicamente, dos o más modificaciones se combinan tal que el polipéptido FVII modificado resultante tiene actividad coagulante incrementada, duración incrementada de la actividad de coagulante, y/o un índice terapéutico mejorado comparado con un polipéptido FVII no modificado. Las modificaciones pueden incluir una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos. La actividad coagulante incrementada, duración incrementada de la actividad coagulante, y/o un índice terapéutico mejorado del polipéptido FVII modificado que contiene dos o más modificaciones se puede incrementar por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más comparado con la actividad del polipéptido FVIIa de partida o no modificado.
Se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen dos o más modificaciones que se introducen dentro de un polipéptido FVII no modificado para alterar dos o más actividades o propiedades. Los polipéptidos FVII modificados pueden contener 2, 3, 4, 5, 6 o más modificaciones. Además, cada modificación puede implicar uno o más residuos de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede contener dos modificaciones cada una de las cuales es una sola sustitución de aminoácidos. En otro ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede contener dos modificaciones, una de. la cual es una sola sustitución de aminoácidos y la otra de la cual implica la supresión de. más de un residuo de aminoácido y luego la inserción de más de un residuo de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento puede contener la sustitución de aminoácidos S222A (residuos que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) para interrumpir el enlace de Zn2+ y una modificación Gla Intercambio FDC, la cual implica la supresión del dominio FVII Gla endógeno al suprimir los residuos de aminoácidos Al a Y44 (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 45 residuos de aminoácidos que corresponde a los residuos de aminoácidos Yl a Y45 del dominio FDC Gla expuesto en SEQ ID NO: 83.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden tener dos o más modificaciones seleccionadas únicamente de aquellas expuestas en la Tabla 5 a la Tabla 13. En otros ejemplos, el polipéptido FVII modificado contiene dos o más modificaciones donde una o más modificaciones se seleccionan de aquellas expuestas en la Tabla 5 a la Tabla 13 y una o más modificaciones son modificaciones adicionales que no se exponen en la Tabla 5 a la Tabla 13, tal como, por ejemplo, modificaciones descritas en el campo. En algunos ejemplos, la una o más modificaciones adicionales se pueden seleccionar de aquellas expuestas en la Sección D.6.a-e, anterior. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede contener una modificación en uno o más de los residuos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290 o K341 basado en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3 (que corresponde a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 y K192, respectivamente, con base en la numeración de quimotripsina) , lo cual puede incrementar la resistencia TFPI, y una modificación en uno o más residuos de aminoácidos que afecta la actividad intrínseca, tal como, por ejemplo, V158 y M298, (V21 y M156, respectivamente, con base en la numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado puede contener dos sustituciones de aminoácido que incrementan la resistencia a TFPI, tal como K197E y G237V, y
una sustitución de aminoácido que incrementa la actividad intrínseca, tal como M298Q, dando por resultado un polipéptido FVII con actividad coagulante incrementada.
Ejemplares de las modificaciones de combinación ejemplares proporcionadas en este documento son aquellas que incluyen por lo menos la mutación Q286R (numeración que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; que corresponde a Q143R por la numeración de quimotripsina ) . Los polipéptidos FVII modificados que contienen la modificación Q286R pueden contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más modificaciones adicionales. Estas modificaciones adicionales se pueden incluir para, por ejemplo, alterar la actividad catalítica, resistencia a AT-III, resistencia a TFPI, resistencia a la inhibición por Zn2+, actividad intrínseca, actividad amidolítica, enlace y/o afinidad de' fosfolípidos, glicosilación, resistencia a las proteasas, vida media e interacción con otros factores o moléculas, tal como FX, FIX, albúmina de suero e integrina de plaquetas «??ßß3· Típicamente, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento que contienen dos o más modificaciones, en donde una modificación es la sustitución de aminoácidos Q286R, exhiben actividad coagulante incrementada, comparado con el polipéptido FVII de tipo silvestre .
En algunos ejemplos, los polipéptidos FVII modificados que contienen dos o más modificaciones, en donde una es Q286R, exhiben actividad catalítica y coagulante incrementada comparado con el polipéptido de tipo silvestre así como también comparado con un polipéptido FVII que- contiene cualquiera de las mutaciones solas. Por ejemplo, se proporcionan en este documento polipéptidos FVII modificados que contienen tanto las sustituciones de aminoácidos Q286R y 289Q (Q286R/M298Q con la numeración que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3; que corresponde a Q143R/M156Q por la numeración de quimotripsina) . El mutante FVII de combinación Q286R/M298Q exhibe actividad catalítica incrementada para su sustrato, Factor X, comparado con el FVII de tipo silvestre, el mutante individual Q286R y el mutante individual M298Q (véase por ejemplo el Ejemplo 4, posteriormente). Por ejemplo, en un estudio, el mutante M298Q exhibió una actividad catalítica para FX, en presencia de TF, que fue de aproximadamente 1.8 a 2 veces mayor que aquella de polipéptido de tipo silvestre, la actividad catalítica del mutante Q286R fue de aproximadamente 2.1 veces mayor que aquella del polipéptido FVII de tipo silvestre, y el mutante Q286R/M298Q exhibió una actividad catalítica para FX que fue aproximadamente 3.6-4.4 veces que de la actividad catalítica del polipéptido de tipo
silvestre para FX {véase Tabla 15, posteriormente).
Se proporcionan modificaciones de combinación ejemplares no limitantes en la Tabla 12. Estas modificaciones de combinación ejemplares incluyen dos o más modificaciones que se diseñan para alterar dos p más actividades o propiedades de un polipéptido FVII, que incluyen, pero no se limitan a, resistencia a TFPI, resistencia a AT-III, actividad intrínseca, actividad amidolítica, actividad catalítica, enlace de Zn2+, enlace y/o afinidad de fosfolípidos , glicosilación, resistencia a las proteasas, vida media e interacción con otros factores, o moléculas, tales como FX y FIX. Polipéptidos FVII modificados que contienen estas modificaciones de combinación pueden tener actividad coagulante incrementada, duración incrementada de la actividad coagulante, y/o un índice terapéutico mejorado. Las modificaciones expuestas en la Tabla 12 posteriormente usan la misma nomenclatura y sistemas de numeración como se describe en la Tabla 5 a la Tabla 11, anterior. Por ejemplo, la modificación "Gla Intercambio FIX" implica la supresión del dominio FVII Gla endógeno al suprimir los residuos de aminoácidos Al a Y44 · (residuos que corresponde a un polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3) y la inserción de 45 residuos de aminoácido que corresponden a los residuos aminoácidos Yl a Y45 del dominio FIX Gaa expuesto en
SEQ ID NO: 83, como se describe anteriormente. En algunos ejemplos, la modificación "Gla Intercambio FIX" también contiene una o más sustituciones de aminoácidos en la porción de dominio FIX Gla comparado con el dominio FIX Gla de tipo silvestre, como se plantea anteriormente. Por ejemplo, la modificación Gla Intercambio FIX también puede incluir una sustitución de aminoácidos M19K (numeración que corresponde aminoácido positions del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO:83). Esta modificación se indica por {Gla Intercambio FIX/MI 9K}, es decir, el polipéptido FVII modificado contiene un dominio FIX Gla heterólogo en el cual la metionina en la posición que corresponde a la posición 19 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. De esta manera, las modificaciones hechas a las porciones del dominio FIX Gla heterólogo son referenciadas usando posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos del polipéptido FIX de tipo silvestre maduro, o el dominio FIX Gla de tipo silvestre expuesto en SEQ ID NO:83. Las modificaciones hechas a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido FVII son referenciadas usando posiciones de aminoácidos que corresponde a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido FVII maduro como se expone en SEQ. ID NO: 3 y también, se refiere por el esquema de numeración de quimotripsina . Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado
que contiene la modificación Q286R (numeración que corresponde al Polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3), y una modificación Gla Intercambio FIX, en donde el dominio FIX Gla contiene la sustitución de aminoácidos M19K (numeración que corresponde a ¦ las posiciones de aminoácidos del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83), se indica por {Gla Intercambio FIX/M19K } /Q286R . Similarmente , la modificación {Gla Intercambio FIX/Q44S } /Q286R/M298Q indica que el polipéptido FVII contiene una modificación Gla Intercambio FIX en donde la glutamina en la posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 44 del dominio FIX Gla expuesto en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una serina, y también contiene las sustituciones de aminoácidos Q286R y M298Q, con la numeración que corresponde al polipéptido FVII maduro expuesto en SEQ ID NO: 3. En la Tabla 12 a continuación, se identifica el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en el cual secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido FVII modificado se exponen.
Tabla 12.
Modificación - numeración de Modificación SEQ ID NO FVII maduro numeración de
quimotripsina
Gla Intercambio FIX/Q286R Gla Intercambio 131
FIX/Q143R
Q286R/H257A H117A/Q143R 132
S222A/Q286R S82A/Q143R 133
Q286R/S222A/H257A S82A/H117A/Q143R 134
Gla Intercambio FIX S82A/Gla Intercambio 135 /S222A/Q286R FIX/Q143R
Gla Intercambio FIX/H257A/Q286R H117A/Gla Intercambio 136
FIX/Q143R
Gla Intercambio FIX Q143R/S82A/H117A/Gla 137 /S222A/H257A/Q286R Intercambio FIX
Q286R/M298Q Q143R/M156Q 138
Q286R/M298Q/K341Q Q143R/M156Q/K192Q 139 199E/Q286R/M298Q K60cE/Q143R/M156Q 140
Gla Intercambio FIX/Q286R/M298Q Gla Intercambio 141
FIX/Q143R/M156Q
Q286R/Q366V Q143R/Q217V 142
Q286R/A292N/A29 S/Q366V Q143R/A150N/A152S/Q217V 143
A175S/Q286R/Q366V A39S/Q143R/Q217V 144
S222A/Q286R1Q366V S82A/Q143R/Q217V 145
H257S/Q286R H117S/Q143R 146
H257S/Q286R/Q366V H117S/Q143R/Q217V 147
S222A/H257A/Q286R/Q366V S82A/H117A/Q1 3R/Q217V 148
Q286R/H373A Q143R/H224A 149
S222A/H25 A/Q286R/M298Q S82A/H117A/Q143R/ 156Q 150
Q286R/K341D Q143R/K192D 151
Q286R/Q366D Q143R/Q217D 152
Q286R/Q366N Q143R/Q217N 153
Q286R/M298Q/Q366D Q143R/M156Q/Q217D 154
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 155
Q286R/H373F Q143R/H224F 156
Q286R/M298Q/H373F Q143R/M156Q/H224F 157
Gla Intercambio FIX/S222A Gla Intercambio FIX/S82A 245
Gla Intercambio FIX/H257A Gla Intercambio 246
FIX/H117A
Gla Intercambio FIX/S222A/H257A Gla Intercambio 247
FIX/S82A/H117A
S222A/M298Q S82A/M156Q 248
H257A/M298Q H117A/ 156Q 249
S222A/H257A/M298Q S82A/H117A/M156Q 250
S222A/A292N/A294S/Q366V S82A/A150N/A152S/Q217V 251
A175S/S222A/Q366V A39S/S82A/Q217V 252
S222A/Q366V S82A/Q217V 253
H257S/Q366V H117S/Q217V 254
S222A/H373A S82A/H224A 255
V158T/L287T/M298K V21T/L144T/M156K 256
V158D/L287T/M298K V21D/L144T/M156K 257
S103SllldelinsIEDICLPRWGCLW 5 [103] S [lll]delinsTEDICL 258 E/G237V PRWG CLWE/G97V
S103SllldelinsDICLPRWGCLWED S[103] S [111] delinsDICLPR 259 /G237V WGC LWED/G97V
H115S126delinsQRLMEDICLPRWG H[115]S[126]delinsQRLMED 260 CLWEDDF/G237V ICL PR GCLWEDDF/G97V
H115S126delinsIEDICLPR GCLW H[115]S[126]delinsIEDICL 261 E/G237V PRWG CLWE/G97V
H115S126delinsDICLPR GCLWE ' H[115]S[126]delinsDICLPR 262 D/G237V WGC LWED/G97V
T128 P134delinsQRLMEDICLPRWG T[128] P [ 13 ] delinsQRLMED 263 CLWEDDF/G237V ICLPR GCLWEDDF/G97V
T128P134delinsIEDICLPR GCL T[128] P[134]delinsIEDICL 264 E/G237V PRWG CLWE/G97V
S1035111delinsQRLMEDICLPRWG S [103] S [111] delinsQRLMED 265 CLWEDDF/G237V ICL PRWGCLWEDDF/G97V
T128P134delinsDICLPRWGCLWED T[128] P[134] DICLPR GCLWE 266 /G237V D/G97V
S103SllldelinsSFGRGDIRNV/G237 V S[103] S[lll]delinsSFGRGD 267
IRNV/G97V
H115S126delinsSFGRGDIRNV/G23 7V H [115] S [126] delinsSFGRGD 268
IRN V/G97V
T128P134delinsSFGRGDIRNV/G23 7V T [ 128] P[ 134] delinsSFGRGD 269
IRN V/G97V
M298Q/H373F M156Q/H224F 270
S119N/L121S/A175S S[119]N[L[121]S/A39S 271
T128N/P129A/A175S T[128]N/P[129]A/A39S 272
A122N/G1245/A175S A[122]N/G[124] S/A395 273
(Gla Intercambio FIX (Gla Intercambio FIX 274 IE40L}/Q286R/M298Q /E[40]L}/Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio 275
/K431}/Q286R/M298Q FIX/K[43] I}/Q143R/M156Q
{Gla Intercambio {Gla Intercambio 276 FIX/Q44S} /Q286R/M298Q FIX/Q[44]S}/Q143R/M156Q
{Gla Intercambio {Gla Intercambio FIX 277 FDI/M19K}/Q286R/M298Q /M[19]K}/Q143R/M156Q
{Gla Intercambio FIX {GlaIntercambioFIX/M[19] K 278 /M19K/E40L/K431/Q44S} /Q286R/M /E[40] L/ [43/IQ[44] S} /Q14 298Q 3R/ M156Q
T128N/P129A/Q286R T[128]N/P[129]A/Q143R 279
T128N/P129A/Q286R/M298Q T[128]N/P[129]A/Q143R/M15 280
6Q
T128N/P129A/Q286R/H373F T[128] /P[129]A/Q143R/H22 281
4F
V158D/Q286R/E296V/ 298Q V21D/Q143R/E154V1M156Q 282
T128N/P129A/V158D1E296V1M298 Q T[128]N/P[129] /V21D/E154 283
V/M156Q
T128N/P129A/S222A T[128]N/P[129]A/S82A 284
GlaIntercambioFIX/T128N/P129A/S GlalntercambioFIX/ [128] 285 222A/ Q286R /P [129JA/S82A/Q1 3R
GlaIntercambioFIX/T128N/P129A/Q GlaIntercambioFIX/T { 128 ] 286 286R/ M298Q /P[129]A/Q 143R/M156Q
T128N/P129A1S222A/H257A/Q286R T[128]N/P[129] A/S82A/H117 287 /M298Q A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373 F T[128]N/P[129/A/Q143R/M15 288
6Q/ H224F
S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q S [52] A/S [60] AJV21D/E15 V/ 289
M156Q
S52A/S60A/Q286R S[52]A/S[60]A/Q143R 290
S52A/S60A/S222A S[52]A/S[60/A/S82A 291
GlaIntercambioFIX/S52A/S60A/S22 GlaIntercambioFIX/S [ 52 ] A/ 292 2A/Q2 86R S [60] A/S82A/Q143R
S52A/S60A/Q286R/M298Q S[52]A/S[60]A/Q143R/M 293
156Q
GlaIntercambioFIX/S52A/S60A/Q28 GlalntercambioFIX/S [52] A/ 294 6R/M2 98Q S[60]A/Q143R/M156Q
S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/ S [52] A/S [60] A/S82A/H117Q1. 298
M298Q 43R/M156Q
S52A/S60A/Q286R/H373F S [52] A/S [60] A/Q143R/H22 F 296
S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F S[52]A] S[60]A/Q1 3R/M156Q 297
/H224F
V158D/T239V/E296V/M298Q V21D/T99V/E154V/M156Q 298
T239V/Q286R T99V/Q143R 299
S222A/T239V S82A/T99V 300
Gla Intercambio FIX Gla Intercambio 301 /S222A/T239V/Q286R FIX/S82A/T99V/Q143R
T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q 302
S222A/T239V/F1257A/Q286R/M298Q S82A/T99V/H117A/Q1 3R/M 303
156 Q
GlaIntercambioFIX/T239V/Q286R/M GlaIntercambioFIX/T99V/Ql 304 298Q 43R/M156 Q
T239V/Q286R/H373F T99V/Q143R/H224F 305
T239V/Q286R/M298Q/H373F T99V/Q1 3R/M156Q/H22 F 306
V158D/T239UE296V/M298Q V21D/T991I/E154V/M 156Q 307
T239I/Q286R T99T/Q143R 308
S222A/T2391 S82A/T991 309
GlaIntercambioFIX/S222A/T239I/Q GlaIntercambioFIX/S82A/T9 310 286R 9L/Q143R
T239I/Q286R/M298Q T99I/Q143R/M156Q ' 311
S222A/T2391/H257A/Q286R/M298Q S82A/T991/H117A/Q1 3R/M15 312
6 Q
GlaIntercambioFIXIT239I/Q286R/M GlaIntercambioFIX/T99I/Ql 313 298Q 43R/M156Q
T239I/Q286R/H373F T99I/Q143R/H224F 314
T239I/Q286R/M298Q/H373F T99I/Q143R/M156Q/H224F 315
GlaIntercambioFIX/S222A/Q286R/H GlaIntercambioFIX/S82A/Ql 316 373F 43R/H224F
GlaIntercambioFIX/S222A/Q286R/M GlaIntercambioFIX/S82A/Ql 317 298Q 43R/M 156 Q
GlaIntercambioFIX/S222A/Q286R/M GlaIntercambioFIX/S82A/Ql 318 298Q/ H373F 43R/M 156Q[11224F
V158D/E296V/M298Q/H373F V21D/E154V/M156Q/H224F 319
V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373 F V2ID/Q143R/E154V/M156Q/H2 320
24F
H257A/Q286R/M298Q H117A/Qr43R/M156Q 321
H257S/Q286R/M298Q H117S/Q143R/M156Q 322
GlaIntercambioFIX/S222A/H257S/Q GlaIntercambioFIX/S82A/Hl 323 286R 17S/Q143R
S222A/H257S/Q286R/M298Q S82A/H117S/Q143R/M156Q 324
H257S/Q286R/M298Q/H373F H117S/Q143R/M156Q/H224F 325
S222A/Q286R/M298Q/H373F S82A/Q1 3R/M156Q/H224 326
GlaIntercambioFIX/Q366V GlaIntercambioFIX/Q217V 327
S222A/Q286R/M298Q S82A/Q143R/M156Q 328
T128N/P129A/A175S/Q366V T[128]N/P[129] A/A39S/Q21 329
7V
A122N/G124S/A175S/Q366V A[122]N/G[124] S/A39S/Q217 330
V
T128N/P129A/A175S/S222A T[128]N/P[129] /A39S/S82A 331
A122N/G124S/A175S/S222A A[122]N/G[124] S/A39S/S82A 332
T128N/P129A/A175S/Q286R T[128] N/P[129] A/A39S/Q143 333
R
A122N/G124S/A175S/Q286R A[122]N/G[124] S/A39/Q143R 334
GlaIntercambioFIX/T128N/P129A/A GlalntercambioFIX/T [128] N 335 175S/S 222A/Q286R /P[129]A/A 9S/S82A/Q143R
GlaIntercambioFIX/A122N/G124S/A GlalntercambioFIX/A [ 122 ] 336 175S/ S222A/Q286R /G[124] S/A
39S/S82A/Q143R
T128N/P129A/A175S/Q286R/M29S Q T [128] N/P[129] A/A39S/Q143 337
R/M 156Q
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q A [122] /G[124] S/A39S/Q143 338
R/M156Q
T128N/P129A/A175S/S222A/H257A T [128]N/P[129] A/A39S/S82A 339 /Q286R/M298Q /H117A/Q143R/M156Q
A122N/G124S/A175S/S222A/H257A A[122]N/G[1.24] S/A39S/S82A 340 /Q286R/M298Q /H117A/Q143R!M156Q
T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 T[128]N/P[129] A/A39S/Q143 341 Q/H373F R/M156Q/H224F
A122N/G124S/A175S/Q286R/M298 A[122]N/G[124] S/A39S/Q143 342 Q/H373F R/M156Q/H224F
T128N/P129A1M298Q T[128]N/P[129]A/M156Q 354
{Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio 355
/K431 }/T128N/P129A/Q286R/M298Q FIX/K[43] I}/
T[128]N/P[129] A/Q143R/M15
6Q
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 N T [128] N/P[129] A/Q143R/M15 356
6Q/ Q217N
{Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio FIX 357
/K431J/Q286R/M298Q/Q366N /K[43] I}/Q143R/M156QQ217N
{Gla Intercambio FIX {Gla Intercambio 358
1 43D/T128N/P FIX/K[43] I}/
129A/Q286R/M298Q/Q366 N T [128] /P[129] A/Q143R/M1
56Q. Q217N
T128N/P129A/M298Q/H373F T[128] /P[129]A/M156Q/H22 359
4F
V158D/Q286R/E296V/M298Q V21D/Q143R/E154V/M156Q 360
M298Q/Q366N/H373F M156Q/Q217N/H224F 361
T239V/M298Q/H373F T99V/M156Q/H224F 362
T2391/M298Q/H373F T991/M156Q/H224F 363
128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 T [128]N/P[129] A/Q143R/M15 364
N/H373F 6Q/ Q217N/H224F
T239V/Q286R/M298Q/Q366N T99V/Q143R/M156Q/Q217N 3'65
T239I/Q286R/M298Q/Q366N T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 Q T[128]N/P[129] /T99V/Q143 367
R/M156Q
T128N/P129A/S222A/T239V/H257A T[128]N/P[129] A/S82A/T99V 368
/Q286R/M298Q /H117A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/T239V/Q286R/M298 T [128]N/P[129] A/T99V/Q143 369
Q/H373F R/M156Q/11224F
T128N/P129A/T239L/Q28.6R/M298Q T [128]N/P[129] A/T99I/Q143 370
R/M 156Q
T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q T[128]N/P[129] A/T99I/Q143 371
/H373F R/M 156Q/H224F
E. Producción de polipeptidos FVII
Los polipéptidos FVII, que incluyen polipéptidos FVII modificados, o dominios de los mismos de FVII u otro
polipéptido de vitamina K, se pueden obtener mediante métodos bien conocidos en el campo para la purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes . Cualquier método conocido por aquellas personas expertas en el campo para la identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados se pueden usar. Cualquier método disponible en el campo se puede usar para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarca la región de codificación completa) o clon de ADN genómico que codifica un polipéptido FVII u otro polipéptido de vitamina K, tal como de una célula o fuente de tejido, tal como por ejemplo del hígado. Los polipéptidos FVII modificados se pueden diseñar como se describe en este documento, tal como mediante la mutagénesis dirigida en el sitio .
El FVII se puede clonar o aislar usando cualquiera de los métodos disponibles conocidos en el campo para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Estos métodos incluyen amplificación PCR de ácidos nucleicos y clasificación de bibliotecas, que incluyen clasificación de hibridación de ácidos nucleicos,, clasificación basada en anticuerpos y clasificación basada en actividad.
Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos se pueden usar para aislar moléculas de ácido nucleicos que codifican un polipéptido FVII, que incluye por ejemplo,
métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Un material que contiene ácidos nucleicos se puede usar como un material de partida del cual una molécula de ácido nucleico que codifica FVII se puede aislar. Por ejemplo, preparaciones de ADN y ARNm, extractos de células, extractos de tejidos (por ejemplo, del hígado) , ejemplos de fluidos (por ejemplo, sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos se pueden usar en los métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácidos nucleicos también se pueden usar como una fuente de materia de partida. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar una molécula que codifica FVII. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar con base en las secuencias expresadas de las cuales un FVII se genera. Los cebadores se pueden diseñar con base en la traducción posterior de una secuencia de aminoácidos FVII. Las moléculas de ácidos nucleicos generadas por la amplificación se pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipéptido FVII.
Las secuencias de nucleótidos adicionales se pueden unir a una molécula de ácido nucleico que codifica FVII, que incluye secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para el propósito de clonar el gen sintético dentro de un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteína o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN de codificación de
proteína del núcleo. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales se pueden enlazar operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Ejemplos de estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias de promotor diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares , y las secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Secuencias de nucleótidos adicionales, tales como las secuencias que especifican las regiones de enlace de proteínas también se pueden enlazar a las moléculas de ácido nucleico que codifican FVII. Estas regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias para facilitar la captación de FVII en dentro de las células objetivo' específicas, o de otra manera mejorar la farmacocinética del gen sintético.
Los ácidos nucleicos identificados y aislados luego se pueden insertar dentro de un vector de clonación apropiado. Una gran variedad de sistemas de vector-hospedero conocidos en el campo se puede usar. Vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedera usada. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmido pBR322 o pUC o el vector
Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . La inserción dentro de un vector de clonación puede, por ejemplo, ser lograda al ligar el fragmento de ADN dentro de un vector de clonación el cual tiene términos complementarios cohesivos. La inserción se puede efectuar usando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede, producir al ligar las secuencias de nucleótidos (enlazadores ) sobre las terminales de ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codificación las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de proteína FVII se pueden modificar por la cola homopolimérica . Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células hospederas por la vía, por ejemplo, de la transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se pueden generar muchas copias de la secuencia de genes.
En modalidades específicas, la transformación de las células hospederas con las moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína FVII aislado, ADNc, o secuencia
de ADN sintetizado permite la generación de múltiples copias del gen. De esta manera, el gen se puede obtener en grandes cantidades a desarrollar transformantes, al aislar las moléculas de ADN recombinantes de los transformantes y, cuando sea necesario, al recuperar el gen insertado del ADN recombinante aislado.
1. Vectores y Células
Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas FVII, el ácido nucleico que contiene todo o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FVII se puede insertar dentro de un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de proteínas insertas. Ejemplar de este vector es cualquier vector de expresión de mamífero, tal como, por ejemplo, pCMV. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también se pueden suministrar por el promotor nativo para unos genes FVII, y/o sus regiones de flanqueo.
También se proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica el FVII o FVII modificado. Las células que contienen los vectores también se proporcionan. Las células incluyen células eucarióticas y procarióticas , y los vectores son cualquier adecuado para el uso en este
documento.
Se proporcionan células procarióticas y eucarióticas , que incluyen las células endoteliales , que contienen los vectores. Estas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células de plantas vegetales, células de insectos y células de animal. Las células se usan para producir un polipéptido FVII o polipéptido FVII modificado del mismo para desarrollar las células descritas anteriormente bajo condiciones mediantes las cuales la proteína FVII codificada se expresa por la célula, y recuperando la proteina FVII expresada. Para propósitos en este documento, el FVII se puede secretar en el medio.
En una modalidad, se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad FVII y contiene toso o una porción del polipéptido FVII, o múltiples copias del mismo. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión del polipéptido FVII o polipéptido FVII modificado del mismo en la célula o tal que la proteína FVII se expresa como una proteína secretada. Cuando el FVII se expresa el ácido nucleico se enlaza al ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como la secuencia del factor a-unión Saccharomyces cerevisiae o una porción del mismo, o la secuencia de señal nativa.
Una variedad de sistemas de hospedero-vector se pueden usar para expresar la secuencia de codificación de proteínas. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas de células de mamíferos infectadas con su virus, (por ejemplo virus de vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) ; microorganismos tal como vectores de levadura que contienen levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plásmido, ADN cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus resistencias y especificidades. Dependiendo del sistema hospedero-vector usado, se pueden usar cualquiera de una variedad de elementos de transcripción y traducción adecuados.
Cualquiera de los métodos conocidos por aquellas personas expertas en el campo para la inserción de fragmentos de ADN dentro de un vector se pueden usar para construir vectores de expresión que contiene un gen quimérico que contiene señales de control transcripcionales/traduccionales apropiados y secuencias de codificación de proteínas. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética) . La expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido FVII o un polipéptido FVII modificado, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de
los mismos, se pueden regular por una segunda secuencia de ácidos nucleicos de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresan en. un hospedero transformado con la(s) molécula (s) de ADN recombinante . Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar por cualquier promotor / potenciador conocido en el campo. En una modalidad específica, el promotor no es nativo a los genes para una proteína FVII. Los promotores que se pueden usar incluyen pero no se limitan a el promotor temprano SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición 3' larga terminal del virus de sarcoma Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell. 22:781-791 (1980)), el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner, y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 75:1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)); vectores, de expresión procarióticos tal como el promotor ß-lactamasa (Jay y colaboradores, (1981) Proc. Nati. Acad.. Sci EUA 75:5543) o el promotor tac- (DeBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 50:21-25 (1983)); véase también "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrar-Estrella y colaboradores, Nature 303:209-213 (1984)) o el promotor 35S
RNA del virus de mosaico de la coliflor (Garder y colaboradores, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), y el promotor de ribulosa bifosfato carboxilasa de la enzima fotosintética (Herrera-Estrella y colaboradores , Nature 310:115-120 (1984)); elementos de promotor de la levadura y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa , el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional de animal que exhiben especificidad de tenido y se han usado en animales transgénicos : la región de control del gen elastasa I el cual es activo en las células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, Cell 35:639-646 (1984); Ornitz y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol 50:399-409 (1986); MacDonald, . Hepatology 7:425-515 (1987)); región de gen de insulina el cual está active en las células beta pancreáticas (Hanahan y colaboradores, Nature 315:115-122 (1985)), región de control del gen de inmunoglobulina el cual es activo en las¦ células linfoides (Grosschedl y colaboradores, Cell 35:647-658 (1984); Adams y colaboradores, Nature 318:533-538 (1985); Alexander y colaboradores, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), región de control del virus de tumor mamario de ratón el cual está activo en las células testiculares , de seno, linfoides y mastocitos (Leder y
colaboradores, ' Cell 45:485-495 (1986)), región de control de gen de albúmina el cual está activo en hígado (Pinckert y colaboradores, Genes and Devel. 7:268-276 (1987)), región de control del gen de alfa-fetoproteína el cual está activo en el hígado (Krumlauf y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores, Science 235:53-58 1987)), región de control del gen alfa-1 antitripsina el cual está activo en el hígado (Kelsey y colaboradores, Genes and Devel. 7:161-171 (1987)), región de control del gen de beta globina el cual está activo en las células mieloides (Mogram y colaboradores, Nature 375:338-340 (1985); Kollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), la región de control del gen de proteína básica de mielina el cual está activo en las células de oligodendrocitos del cerebro (Readhead y colaboradores, Cell 45:703-712 (1987)), región de control del gen de cadena ligera-2 de miosina el cual está activo en el músculo esquelético (Shani, Nature 374:283-286 (1985)), y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica el cual está activo en los gonadótrofos del hipotálamo (Masón y colaboradores, Science 234:1312-1318 (1986) ) .
En una modalidad específica, se usa un vector que contiene un promotor operablemente enlazado a ácidos nucleicos que codifican una polipéptido FVII o polipéptido
FVII modificado, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo, del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente , uno o. más marcadores seleccionables (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos) . Los vectores y sistemas para la de expresión de polipéptidos FVII incluyen los vectores Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, CA) , particularmente aquellos diseñados para la secreción de las proteínas codificadas. Los vectores de plásmido ejemplares para la expresión en las células de mamíferos incluyen, por ejemplo, pCMV. Vectores de plásmido ejemplares para transformación de células E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponible de Qiagen, Valencia, CA; véase también la literatura publicada por Qiagen que describe el sistema) . Los vectores pQE tienen un promotor fago T5 (reconocido por la ARN polimerasa de E. coli) y un módulo de represión operador lac doble para proporcionar una expresión de alto nivel, estrechamente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de enlace ribosomal sintético (RBS II) para la traducción eficiente, una secuencia de codificación 6xHis tag, terminadores transcripcionales t0 y TI, origen ColEl de replicación, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de un 6xHis en ya sea la N- o C-terminal de la
proteína recombinante . Estos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31, los cuales proporcionan múltiples sitios de clonación para los tres marcos de lectura y proporcionan la expresión de las proteínas N-terminalmente de 6xHis-tag. Otros vectores del plásmido ejemplares para la transformación de células de E. colí, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, la Patente de EUA 4,952,496; disponible en NOVAGEN, Madison, WI; véase, también la literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Estos plásmidos incluyen pET lia, el cual contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible, y el gen represor lac; pET 12a-c, el cual contiene el promotor T7, el terminador T7, y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET' 15b y pET19b (Novagen, Madison, WI), los cuales contienen una secuencia líder His-TagMR para el uso en la purificación con una columna' His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región del promotor T7-lac y el terminador T7.
2. Sistemas de Expresión
Los polipéptidos FVII (modificados y no modificados) se pueden producir mediante cualquiera de los métodos conocidos en el campo para la producción de proteínas que incluyen métodos in vitro e in vivo, tales como, por ejemplo, ' la
introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican el FVII dentro de una célula hospedera, animal hospedero y expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican FVII in vitro. El FVII y los polipéptidos FVII modificados se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades requeridas y las formas de un polipéptido FVII necesaria para la administración y el tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos, tales como E. coli, levadura, plantas, células de insectos,, células de mamífero, que incluyen líneas de células humanas y animales transgénicos . Los hospederos de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como también los tipos de modificaciones post- traduccionales que están presentes sobre las proteínas expresadas. La selección del hospedero de expresión se puede • hacer con base en estos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costos de producción y la necesidad y métodos para la purificación.
La expresión en hospederos eucarióticos pueden incluir la expresión en las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia Pastoría , células de insectos tales como células de Drosophila y células de lepidopteran , plantas y células de plantas tales como tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucarióticas de expresión también incluyen
lineas de células de mamíferos tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de riñon de hámster bebe (BHK) . Los hospederos de expresión eucarióticos también incluyen la producción en animales transgénicos, por ejemplo, incluyendo la producción en suero, leche y huevos. Los animales transgénicos para la producción de polipéptidos FVII de tipo silvestre son conocidos en el campo (Publicaciones de Patente de EUA Nos. 20020166130 y 20040133930) y se pueden adaptar para la producción de polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento.
Muchos vectores de expresión están disponibles y conocidos por aquellas personas expertas en el campo para la expresión de FVII. La selección del vector de expresión se afecta por la selección del sistema de expresión hospedero. Esta selección está muy dentro del nivel de experiencia del artífice experto. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente , potenciadores , señales traduccionales, y señales de terminación transcripcionales y traduccionales. Los vectores de expresión que se usan para la transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable el cual permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, un origen de replicación se puede usar para ampliar el número de copias de los vectores en las células.
El FVII o los polipéptidos FVII modificados también se pueden usar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, una fusión se puede generar para agregar funcionalidad adicional a un polipéptido. Ejemplos de proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia de señal, una etiqueta tal como para la localización, por ejemplo, una His6 tag o una myc tag, o una etiqueta para la purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la dirección de proteínas y/o asociación de membranas.
En una modalidad, el polipéptido FVII o los polipéptidos FVII modificados se puede expresar en una forma activa, mediante la cual la activación se logra por la autoactivación del polipéptido después de la secreción. En otra modalidad, la proteasa se expresa en una forma de zimógeno inactiva.
Los métodos de producción de los polipéptidos FVII pueden incluir co-expresión de uno o más polipéptidos heterólogos adicionales que pueden ayudar en la generación de los polipéptidos FVII. Por ejemplo, estos polipéptidos puedan contribuir al procesamiento post-traduccional de los polipéptidos FVII. Polipéptidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, peptidasas que ayudan a escindir las secuencias del precursor FVII, tal como la secuencia de propéptidos, y enzimas que participan en la modificación del polipéptido
FVII, tal como mediante la glicosilación, hidroxilación, carboxilación, fosforilación, por ejemplo. Una peptidasa ejemplar que se pueden co-expresar con FVII es PACE / furina (o PACE-SOL) , la cual ayuda en la escisión de la secuencia de propéptido FVII. Una proteina ejemplar que ayuda en la carboxilación del pólipéptido FVII es la 2,3-epóxido reductasa de vitamina K de enzima sensible a la warfarina (VKOR) , la cual produce vitamina K reducida para la utilización como un cofactor por la ?-carboxilasa dependiente de la vitamina K (Wajih y colaboradores, J. Biol Chem 280(36)31603-31607). Una subunidad de esta enzima, VKORC1, se puede co-expresar con el pólipéptido FVII modificado para incrementar la ?-carboxilación . El uno o más polipéptidos adicionales se pueden expresar del mismo vector de expresión como el pólipéptido FVII o de un vector diferente,
a. Expresión procariotica
Las procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de FVII (véase, por ejemplo, Platis y colaboradores (2003) Protein Exp . Purif. 31 (2) : 222-30; y Khalilzadeh y colaboradores (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31.(2) : 63-69) . La transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por aquellas personas expertas en el campo. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles
que son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que exhiben alguna toxicidad a las células hospederas. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores T7 y SP6 RNA y el promotor APL regulado con temperatura.
El FVII se puede expresar en el medio ambiente citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un medio ambiente de reducción y para algunas moléculas, esto puede dar por resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Los agentes de reducción tales como ditiotreitol y ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes (por ejemplo, tal como guanidina-HCl y urea) se pueden usar para resolubilizar las proteínas. Un procedimiento alternativo es la expresión de FVII en el espacio periplásmico de las bacterias lo cual proporciona un medio ambiente oxidante e isomerasas similares a chaperonina y de disulfuro que conducen a la producción de la proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína que se expresa lo cual dirige la proteína al periplasma. El líder luego se remueve por las peptidasas de señal dentro del periplasma. Ejemplos de secuencias líder objetivo periplásmicas incluyen el líder pelB del gen de liasa pectato y el líder derivado del gel de fo.sfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión
periplásmica permite la fuga de la proteína expresada dentro del medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y simple del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden ser obtener del periplasma mediante la lisis osmótica. Similar a la expresión citoplasmática, en algunos casos, las proteínas se pueden llegar a ser insolubles y desnaturalizantes y agentes de reducción se pueden usar para facilitar la solubilización y replegamiento . La temperatura de inducción y crecimiento también puede afectar los niveles de expresión . y la solubilidad. Típicamente, las temperaturas entre 25°C y 37 °C se usan. Las mutaciones también se pueden usar para incrementar la solubilidad de las proteínas expresadas. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas . De esta manera, si las proteínas requieren glicosilacion para la fusión, la glicosilacion se puede agregar in vitro después de la purificación de las células hospederas,
b . Levadura
Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica , Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris son hospederos de expresión útiles para FVII (véase, por ejemplo, Skoko y colaboradores (2003) Biotechnol. Appl . Biochem. 38 ( Pt3 ): 257-65 ) . La levadura se puede transformar con vectores de replicación episomales o
mediante la integración crornosorna1 estable por la recombinación homologa. Típicamente, los promotores inducibles se usan para regular la expresión génica. Ejemplos de estos promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína como CUP1. Los vectores de expresión incluyen frecuentemente un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la selección y mantenimiento del AD.N transformado. Las proteínas expresadas en la levadura son frecuentemente solubles y la co-expresión con chaperoninas , tal como Bip y disulfuro isomerasa proteínica, pueden mejorar los niveles de expresión y solubilidad. Adicionalmente , las proteínas expresadas en la levadura se pueden dirigir para la secreción usando fusiones de péptido señal de secreción tal como la señal de secreción del factor alfa del tipo de acoplamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie celular de levadura tal como el receptor de adhesión de acoplamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans . Un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, la Kex-2 proteasa) se puede diseñar para remover las secuencias fusionadas de los polipéptidos con forme salen de la vía de secreción. La levadura también es capaz de la glicosilación en un motivo Asn-X-Ser/Thr .
c. Insectos y células de insectos
Los insectos y células de insectos, que usan
particularmente un sistema de expresión de baculovirus, son útiles para la expresión de polipéptidos tales como FVII o formas modificadas del mismo (véase, por ejemplo, Muneta y colaboradores (2003) J. Vet. Med. Sci. 65 (2) : 219-23) . Las células de insectos y larvas de insectos, que incluyen la expresión en la hemolinfa, expresan altos niveles de proteina y son capaces de la mayoría de las modificaciones post-traduccionales usadas por los eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un intervalo de hospedero restrictivo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariótica. Típicamente, los vectores de expresión usan un promotor tal como el promotor de polihedrina de baculovirus para la expresión a alto nivel. Los sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen baculovirus tales como virus poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) , y virus poliedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea de células de insectos tales como Sf9 derivadas de Spodoptera frugiperda , Pseudaletia unipuncta (7A7S) y Danaus plexippus (DpNl). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula que se expresa se fusiona inmediatamente corriente abajo del codón de iniciación de polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en las células de insecto y se puede usar para secretar la
proteína expresada dentro del medio de cultivo. Además, las líneas de células Pseudaletia uN/Puncta (A7S) y Danaus plexippus (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de células de mamíferos.
Un sistema de expresión alternativo en las células de insecto es el uso de células establemente transformadas. Las líneas de células tales como las células Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 {Aedes albopictus) se puede usar para la expresión. El promotor de metalotioneína de Drosophila se puede usar para inducir altos niveles de expresión en presencia de la inducción de metal pesado con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente por el uso de marcadores seleccionables , tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
Los sistemas de expresión de mamíferos se pueden' usar para expresar polipéptidos FVII. Los constructos de expresión se pueden transferir a las células de mamífero mediante la infección viral tal como adenovirus o mediante la transferencia de ADN directo tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos, tales como electroporacion y microinyección .
Los vectores de expresión para las células de mamíferos
incluyen típicamente un sitio cap de ARNm, una caja TATA, una secuencia de iniciación traduccional (secuencia consenso ozak) y elementos de poliadenilación . Estos vectores incluyen frecuentemente la promotores-potenciadores transcripcionales para la expresión de alto nivel, por ejemplo el promotor-potenciador SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV),- y la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous (RSV) . Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de células. También se pueden usar regiones de promotores y potenciadores de tipo de tejido de células para la expresión. Las regiones de promotor/potenciador ejemplar incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes tal como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteína, alfa 1-antitripsina, beta-globina , proteína básica de mielina, cadena ligera-2 de miosina, y control de genes de hormona liberadora gonadotrópica . Los marcadores seleccionables se pueden usar para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, aminoglucósidos fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina cinasa. La fusión con las moléculas de señalización de la superficie
celular tal como TCR-? y FCCRI~Y pueden dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo sobre la superficie celular .
Muchas líneas de células están disponibles para la expresión de mamíferos que incluyen células de ratón, rata, humano, mono, y pollo y hámster. Las líneas de células ejemplares incluyen, pero no se limitan a, BHK (es decir, células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, ratón NSO (no secretor) y otras líneas de células de mieloma, líneas de células de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8, y células HKB. Las líneas celulares también están disponibles adaptadas a los medios sin suero lo cual facilita la purificación de las proteínas secretadas del medio de cultivo de células. Un ejemplo es la línea de células EBNA-1 sin suero (Pham y colaboradores , (2003) Bíotechnol Bioeng. 84:332-42). La expresión de los polipéptidos FVII recombinantes que exhiben estructura similar y modificaciones post-traduccionales como FVII derivado de plasma son conocidos en el campo {véase, por ejemplo, Jurlander y colaboradores, (2003) Semin Throm Hemost) . Son conocidos métodos para optimizar la expresión de proteína dependiente de la vitamina K. Por ejemplo, la suplementación de la vitamina K en medio de cultivo o co-expresión de ?-
carboxilasas dependientes de la vitamina K (Wajih y colaboradores, J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) pueden ayudar en la modificación pos-traduccional de proteínas dependientes de la vitamina K, tal como polipéptidos FVII.
e . Plantas
Las células de plantas transgénicas y plantas se pueden usar para la expresión de' FVII-. Los constructos de expresión se transfieren típicamente a las plantas usando la transferencia de DDN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia medida por PEG dentro de los protoplastos , y con transformación mediada por Agrobacterium . Los vectores de expresión pueden incluir secuencias de promotor y de potenciador, elementos de terminación de transcripcionales, y elementos de control traduccionales . Los vectores de expresión y las técnicas de transformación se dividen usualmente entre hospederos dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospederos monocotiledóneos , tal como arroz y maíz. Ejemplos de promotores de plantas usados para la expresión incluyen el promotor del virus de mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de ribosa bifosfato carboxilasa y promotores de ubiquitina y UBQ3. Marcadores, seleccionables tal como higromicina, . fosfomanosa isomerasa y neomicina' fosfotransferasa se usan frecuentemente para facilitar la
selección y mantenimiento de las células transformadas. Las células de plantas transformadas se pueden mantener en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regeneradas en plantas completas. Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las células de mamíferos, esto puede afectar la selección para producir FVII en estos hospederos. Las células de plantas transgénicas también pueden incluir algas diseñadas para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield y colaboradores, (2003) PNAS 100:438-442). Debido a que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación diferentes que las células de mamíferos, esto puede afectar la selección para producir FVII en estos hospederos.
2. Purificación
Los métodos para la purificación de los polipéptidos FVII de las células hospederas dependen de las células hospederas seleccionadas y los sistemas de expresión. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente del medio de cultivo después de la remoción de las células. Para la expresión intracelular , las células se pueden lisar y las proteínas se purifican del extracto. Cuando los organismos transgénicos , tales como las plantas y animales transgénicos se usan para la expresión, se pueden usar tejidos u órganos como material, de partida para hacer un
extracto de células Usadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en la leche o huevos, los cuales se pueden recolectar, y si es necesario además las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente usando métodos estándar en el campo.
El FVII se puede purificar usando técnicas de purificación de proteínas estándar conocidas en el campo, que incluyen pero no se limitan a, SDS-PAGE, cromatografía de fracción de tamaño y exclusión de tamaño, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de quelato y cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo, los polipéptidos FVII se pueden purificar mediante la cromatografía de intercambio aniónico. Ejemplar de un método para purificar polipéptidos FVII es mediante el uso de una columna de intercambio iónico que permite . el enlace de cualquier polipéptido que tenga dominio Gla funcional, seguido por la elución en presencia de calcio (Véase por ejemplo, Ejemplo 2). También se pueden usar técnicas de purificación de afinidad para mejorar la eficiencia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, los anticuerpos, receptores y otras moléculas que se enlazan a FVII se pueden usar en la purificación de afinidad. En otro ejemplo, la purificación también se puede mejorar usando una columna de afinidad de TF soluble (STF) (Maun y colaboradores
(2005) Prot. Sci. 14:1171-1180). Los con constructos de expresión también se pueden diseñar para agregar una etiqueta de afinidad tal como un epitopo myc, fusión GST o His6 y afinidad purificada con el anticuerpo myc, resina de glutationa, y Ni-resina, respectivamente, a una proteina. La pureza se puede estimar mediante cualquier método conocido en el campo, incluyendo electroforesis en gel y tinción y técnicas espectrofotométricas .
La proteasa FVII se puede expresar y purificar para estar en una forma inactiva (forma de zimógeno) o, alternativamente, la proteasa expresada se puede purificar dentro de una forma activa, tal como mediante autocatálisis . Por ejemplo, los polipéptidos FVII que se han activado por la vía de la escisión proteolítica del Arg152-Ile153 se pueden preparar in vitro (es decir, FVIIa, forma de dos cadenas) . Los polipéptidos FVII primero se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos de producción descritos en este documento, que incluyen pero no se limitan a, producción en las células de mamíferos seguidos por la purificación. Escisión de los polipéptidos FVII dentro de la forma de proteasa activa, FVIIa, se puede lograr por diferentes medios. Por ejemplo, la autoactivación durante la incubación con vesículas de¦ fosfo.lípido en presencia de calcio se puede lograr en 45 minutos (Nelsestueri y colaboradores, (2001) J
Biol Chem 276:39825-31). Los polipéptidos FVII también se pueden activar para la terminación mediante la incubación con el factor Xa, factor XII, o TF en presencia de calcio, con o sin fosfolipidos {véase, por ejemplo, Ejemplo 2 Broze y colaboradores, (1980) J Biol ' Chem. 255:1242-1247, Higashi y colaboradores, (1996) J Biol Chem 271:26569-26574, Harvey y colaboradores J Biol Chem. 278:8363-8369).
3. Proteínas de Fusión
Las proteínas de fusión que contienen un polipéptido FVII modificado y uno o más de otros polipéptidos también se proporcionan. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen estas proteínas de fusión formuladas para la administración mediante una vía adecuada. Las proteínas de fusión se forman al enlazar en cualquier orden el polipéptido FVII Modificado y un agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando, y otro de este agente para los propósitos de facilitar la purificación de un polipéptido FVII, alterando las propiedades farmacodinámicas de un polipéptido FVII al dirigir, por ejemplo, al dirigir un polipéptido' a una células o tenido objetivo, y/o al incrementar la expresión o secreción del polipéptido FVII. Típicamente, cualquier proteína de fusión FVII retiene por lo menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% actividad coagulante
comparado con un polipéptido FVII no de fusión, que incluye 96%, 97%, 98%, 99% o mayor actividad coagulante comparado con un polipéptido no de fusión.
El enlace de un polipéptido FVII con otro polipéptido se puede efectuar directa o indirectamente por la vía de un enlazador. En un ejemplo, el enlace puede ser mediante el enlace químico, tal como por la vía de agentes heterobifuncional o enlaces de tiol u otros enlaces. La fusión también se puede efectuar por medios recombinantes . La fusión de un polipéptido FVII a otro polipéptido puede ser a la N- o C-terminal del polipéptido FVII. Ejemplos no limitantes de polipéptidos que se pueden usar en las proteínas de fusión con un polipéptido FVII proporcionado en este documento incluyen, por ejemplo, un polipéptido GST (glutationa S-transferasa ) , dominio Fe de inmunoglobulina G, o una secuencia de señal heteróloga. Las proteínas de fusión puede contener componentes adicionales, tal como la proteína de enlace de maltosa E. coli (MBP) que ayuda en la captación de la proteína por las células (véase, Solicitud de PCT Internacional No. O 01/32711).
Una proteína de fusión se puede producir mediante técnicas recombinantes estándares. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican la secuencia de polipéptido diferentes se pueden ligar conjuntamente dentro del marco de
acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, al emplear términos de extremo resultado o de extremo escalonado para la ligación, la digestión de enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación de PCR de los fragmentos de genes se pueden llevar a cabo usando cebadores de ancla que dan origen a colgaduras complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que se pueden recocer subsecuentemente y reamplificar para generar una secuencia de genes quiméricos (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992) . Por otra parte, muchos vectores de expresión son comercialmente disponibles ya que codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica FVII se puede clonar dentro de este vector de expresión, tal que la porción de fusión se enlaza dentro del marco a la proteina de proteasa.
4. Modificación del Polipéptido
Los polipéptidos FVII modificados se pueden preparar
como cadenas de polipéptido desnudo o¦ como un complejo. Para algunas aplicaciones, puede ser deseable preparar FVII modificado en una forma "desnuda" sin modificaciones post-traduccionales u otras modificaciones químicas. Las cadenas de polipéptido desnudo se pueden preparar en hospederos adecuados que no modifican post-traduccionalmente FVII. Estos polipéptidos también se pueden preparar en sistemas in vitro y usando síntesis química de polipéptido. Para otras aplicaciones, se pueden desear modificaciones particulares, que incluyen pegilación, albuminación, glicosilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, u otras modificaciones conocidas. Las modificaciones se pueden hacer in vitro o, por ejemplo, al producir el FVII modificado en un hospedero adecuado que. produzca estas modificaciones.
5. Secuencias de Nucleótidos
Las moléculas de ácido nucleico que codifican FVII o polipéptidos FVII modificados se proporcionan en este documento. Las moléculas de ácido nucleico incluyen variantes alélicas o variantes de empalme de cualquier polipéptido FVII codificado. Ejemplares de moléculas de ácido nucleico proporcionada en este documento son cualquiera que codifique un polipéptido FVII modificado proporcionado en este documento, tal como cualquiera que codifique un polipéptido expuesto en cualquiera de SEQ ID No.: 113-273. En una
modalidad, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en este documento tienen por lo menos 50, 60, 65, '70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, o.99% identidad de secuencia o se hibridan bajo condiciones de rigor medio o alto a lo largo de por lo menos 70% de la longitud completa de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido FVII- proporcionado en este documento. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico puede incluir aquellas secuencias de codón degenerado que codifican cualquiera de los polipéptidos FVII proporcionados en este documento.
F. Estimación de las actividades del polipéptido FVII modificado
Las actividades y propiedades de los polipéptidos FVII se pueden estimar in vitro y/o in vivo. Ensayos para estas estimaciones son conocidos por aquellas personas expertas en el campo y son conocidos por correlacionar actividades sometidas a prueba y resultados a las actividades terapéuticas e in vivo. En un ejemplo, las variantes FVII se pueden estimar en comparación con el FVII no modificado y/o de tipo silvestre. En otro ejemplo, la actividad de los polipéptidos FVII modificados se puede estimar después de la estimación in vitro o in vivo a AT-III y se comparan con aquellos de los polipéptidos . FVII modificados que no se han expuesto a ¦AT-III. Estos ensayos se pueden realizar en
presencia o ausencia de TF. Los ensayos in vitro incluyen cualquier ensayo de laboratorio conocido para una persona de experiencia en el campo, tal como por ejemplo, ensayos basados en células, que incluyen ensayos de coagulación, ensayos de enlace, ensayos de proteínas, y ensayos de biología molecular. Los ensayos in vivo incluyen ensayos de FVII en modelos animales, así como también la administración a humanos. En algunos casos, la actividad de FVII in vivo se puede determinar al estimar la sangre, suero, u otro fluido corporal para determinantes de ensayo. Las variantes FVII también se pueden someter a prueba in vivo para estimar una actividad o propiedad, tal como un efecto terapéutico.
Típicamente, los ensayos descritos en este documento están con respecto a la forma actividad de las cadenas de FVII, es decir, FVIIa. Estos ensayos también se realizan con la forma de cadena individual, tal como para proporcionar un control negativo puesto que esta forma no contiene típicamente actividad proteolítica o catalítica para la actividad coagulante de FVII. Además, estos ensayos también se pueden realizar en presencia de co-factores, tal como TF, los cuales en algunos casos aumentan la actividad de FVII.
1. Ensayos in vitro
Los ensayos in vitro ejemplares incluyen ensayos para estimar la modificación y actividad del polipéptido. Las
modificaciones se pueden estimar usando ensayos in vitro que estima la ?-carboxilación y otras modificaciones post-traduccionales , ensayos de proteínas y ensayos conformacionales conocidos en el campo. Los ensayos para la actividad incluyen, pero no se limitan a, medición de la interacción de FVII con otros factores de coagulación, tal como TF, factor X y factor IX, ensayos proteolíticos para determinar la actividad proteolítica de los polipéptidos FVII, ensayos para determinar el enlace y/o afinidad de los polipéptido FVII para las fosfatidilserinas y otros fosfolípidos , y ensayos basados en células para determinar el efecto de los polipéptidos FVII en la coagulación .
Las concentraciones de polipéptidos FVII modificados se pueden estimar mediante métodos bien conocidos en el campo, que incluyen pero no se limitan a, ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas (ELISA) , SDS-PAGE; métodos Bradford, Lowry, BCA; absorbencia de UV, y otros métodos de etiquetación de proteínas cuantificables, tal como, pero no se limita a, métodos inmunológicos , radioactivos y fluorescentes y métodos relacionados.
La estimación de los productos de escisión de las reacciones de proteólisis, que incluyen escisión de los polipéptidos FVII o productos producidos por la actividad de
la proteasa FVII, se puede realizar usando métodos que incluyen, pero no se limitan a, escisión de sustrato cromogénico, HPLC, análisis SDS-PAGE, ELISA, técnica de Western Blot, inmunohistoquimica, inmunoprecipitación, secuenciación de NH2-terminal , y etiquetación de proteínas.
Las propiedades estructurales de los polipéptidos FVII modificados también se pueden estimar. Por ejemplo, la cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (NMR) , y microscopía de crioelectrones (crio-EM) de los polipéptidos FVII modificados se puede realizar para estimar la estructura tridimensional de la polipéptidos FVII y/u otras propiedades de los polipéptidos FVII, tal como el enlace de Ca2+ o de cofactor.
Adicionalmente, la presencia y grado de degradación de FVII se puede medir mediante técnicas estándares tal como la electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) , y la técnica de Western Blot de las muestras que contienen FVII electroforisado . Los polipéptidos FVII que se han expuesto a las proteasas también se pueden someter a la secuenciación N-terminal para determinar la ubicación o cambios en los sitios de escisión de los polipéptidos FVII modificados.
a. Modificación postraduccional
Los polipéptidos FVII también se pueden estimar para la
presencia de modificaciones postraduccionales . Estos ensayos son conocidos en el campo e incluyen ensayos para medir la glicosilación, hidroxilación y carboxilación . En un ensayo ejemplar para la glicosilación, se puede realizar el análisis de carbohidratos, por ejemplo, con el análisis SDS-page de los polipéptidos FVII expuestos a la hidrazinolisis o tratamiento con endoglicosidasa . La hidrazinolisis libera glicanos N- y O-enlazados de glicoproteinas mediante la incubación con hidracina anhidra, mientras que la endoglicosidasa libera PNGasa F, la cual libera la mayoría de N-glicanos de glicoproteinas. La hidrazinolisis o el tratamiento con ' endoglicosidasa de los polipéptidos FVII generan un término de reducción que se puede etiquetar con una etiqueta de fluoroforo o cromóforo. Los polipéptidos FVII etiquetados se pueden analizar mediante la electroforesis de carbohidratos asistida con fluoroforo (FACE). La etiqueta fluorescente para los glicanos también se puede usar para el análisis de monosacáridos , perfil o huella de los patrones de glicosilación complejos por HPLC. Los métodos de HPLC ejemplares incluyen la cromatografía de interacción hidrofílica, interacción electrónica, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión de tamaño. Las sondas de glicano ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 3- (acetilamino) -ß-aminoacridina (AA-Ac) y ácido 2-
aminobenzoico (2-AA) . Las porciones de carbohidratos también se pueden detectar del uso de anticuerpos específicos que reconocen el polipéptido FVII glicosilado. Un ensayo ejemplar para medir la ß-hidroxilación comprende el análisis de HPLC de fase inversa de los polipéptidos FVII que se han sometido a la hidrólisis alcalina (Przysiecki y colaboradores (1987) PNAS 84:7856-7860). La carboxilación y ?-carboxi lación de los polipéptidos FVII se puede estimar usando la espectrometría de masas con el análisis de tiempo de vuelo de ionización de desabsorción láser asistida con matriz (MALDI-TOF) , como se describe en el campo (véase, por ejemplo Harvey y colaboradores J Biol Chem 278:8363-8369, Maun y colaboradores Prot Sci 14:1171-01180). La interacción de un polipéptido FVII que contiene el propéptido (pro-FVII) con la carboxilasa responsable por la modificación del ?-carboxilato postraduccional también se puede estimar. La constante de disociación (Kd) después de la incubación de la carboxilasa con los polipéptidos pro-FVII etiquetadas con fluoresceína se pueden medir al determinar la cantidad de carboxilasa en lazada mediante anisotropía (Lin y colaboradores (2004) J Biol Chem 279:6560-6566).
b. Actividad proteolitica
Los polipéptidos FVII modificados se pueden someter a prueba para la actividad proteolitica. La actividad
proteolitica de FVII se puede medir usando substratos cromogénicos tales como Cromozima t-PA (MeS02-D-Phe-Gly-Arg-p A) , S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA) , S-2266 (H-D- Val-Leu-Arg-pNA) , S-2765 ( Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA) , Espectrozima FXa y Espectrozima FVIIa (CH3 S02-D-CHA-But-Arg-pNA) . Los polipéptidos FVII solos o en presencia de TF, se incuban con concentraciones variantes de substrato cromogénico. La escisión del substrato se . puede supervisar mediante la absorbancia de la velocidad de la hidrólisis del substrato determinada por la regresión lineal usando un software fácilmente disponible.
La activación de los substratos del factor de coagulación, tal como FX, por los polipéptidos FVII también se puede estimar. Los polipéptido FVII, con o sin pre-incubación con TF, se pueden incubar con FX purificado (comercialmente disponible) . La cantidad de FXa activo producido como una consecuencia de incubación con los polipéptido FVII se mide como la actividad de FXa para un substrato cromogénico, tal como S-2222 o Espectrafluoró FXa (CH3S02-D-CHA-Gly-ATg-AMC. AcOH) , el cual se supervisa por la vía de cambios de absorbancia (Harvey y colaboradores J Biol Chem 278:8363-8369, véase también el Ejemplo 4 posteriormente) . Una fuente de fosfolipido también se puede incluir en la incubación de FVII y FX (Nelsestuen y
colaboradores (2001) J Biol Chem 276:39825-31).
c . Actividad de coagulación
Los polipéptidos FVII se pueden someter a prueba para la actividad de coagulación al usar ensayos bien conocidos en el campo. Por ejemplo, algunos de los ensayos incluyen, pero no se limitan a, un ensayo de coagulación de dos etapas (Liebman etai, (1985) PNAS 82:3879-3883); el ensayo de tiempo de protrombina (PT, el cual puede medir la actividad dependiente de TF de FVIIa en la vía extrínseca) ; ensayos los cuales son modificaciones de la prueba PT; el tiempo de la tromboplastina parcial activada (aPTT, el cual puede medir la actividad independiente de TF de FVIIa) ; tiempo de coagulación activada (ACT) ; tiempo de coagulación activada recalcificada; el tiempo de coagulación Lee-White; o tromboelastografía (TEG) (Pusateri y colaboradores (2005) Critical Care 9:S15-S24). Por ejemplo, la actividad de coagulación de un polipéptido FVII modificado se puede determinar por un ensayo basado en PT donde FVII se diluye en plasma deficiente de FVII, y se mezcla con un reactivo de tiempo de protrombina (TF recombinante con fosfolípidos y calcio) , tal como aquel disponible como InnovinMR de Dade Behring. La formación de coágulos se detecta ópticamente y el tiempo de la formación de coágulo se determina y se compara contra el plasma deficiente de FVII solo.
d. Enlace a y/o inhibición por otras proteínas y moléculas
Los ensayos de inhibición se pueden usar para medir la resistencia de los polipéptidos FVII modificados a los inhibidores FVII, tal como, por ejemplo, AT-III y TFPI, o moléculas tal como Zn2+. La estimación de la inhibición a otros inhibidores también se puede someter a prueba e incluyen, pero no se limitan a, otros inhibidores de serina-proteasa, y anticuerpos de FVII. La inhibición se puede estimar mediante la incubación de, por ejemplo, AT-III, TFPI o Zn2+ con polipéptidos FVII que se han pre-incubado con y/o sin TF. La actividad de FVII luego se puede medir usando cualquiera de uno o más de los ensayos de actividad o coagulación descritos anteriormente, y la inhibición por AT-III, TFPI, o Zn2+ se puede estimar al comparar la actividad de los polipéptidos FVII incubados con el inhibidor, con la actividad de los polipéptidos FVII que no se incubaron con el inhibidor.
Los polipéptidos FVII se pueden someter a prueba para enlazarse a otros factores de coagulación e inhibidores. Por ejemplo, las interacciones directas e indirectas de FVII con cofactores, tales como TF, sustratos, tal como FX y FIX, e inhibidores, tal como la antitrombina III, TFPI, y heparina
se pueden estimar usando cualquier ensayo de enlace conocido en el campo, que incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación , purificación en columna, SDS-PAGE no de reducción, ensayos BIAcoreMR, resonancia de plasmones superficiales (SPR), transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), polarización de fluorescencia (FP), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), dicroísmo circular (CD) , ensayos de complementación de fragmentos de proteína (PCA), espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (NMR) , dispersión de luz, equilibrio de sedimentación, cromatografía de filtración en gel de zona pequeña, retardación de gel, técnica de Far-western blotting, polarización de fluorescencia, huella de proteína radical de hidroxilo, expresión en fago, y varios sistemas de dos híbridos. En un ejemplo, el enlace de Zn2+ se estima usando el análisis de equilibrio (Petersen y colaboradores, (2000) Protein Science 9:859-866).
e . Afinidad del fosfolipido
El enlace y/o afinidad del polipéptido FVII modificado para la fosfatidilserina (PS) y otros fosfolípidos se puede determinar usando ensayos bien conocidos en el campo. Los fosfolípidos altamente puros (por ejemplo, concentraciones conocidas de PS de bovino y fosfatidilcolina (PC) de huevo, los cuales son comercialmente disponibles, tal como de Sigma,
en solvente orgánico se pueden usar para preparar vesículas de fosfolípidos unilamelares pequeñas. El polipéptido FVII que se enlaza a estas vesículas PS/PC se puede determinar mediante la dispersión de luz relativa a 90° a la luz incidente. La intensidad de la dispersión de luz con PC/PS solo y con PC/PS/FVII se mide para determinar la constante de disociación (Harvey y colaboradores J Biol Chem 278:8363-8369) . La resonancia de plasma superficial, tal como sobre un instrumento biosensor BIAcoreMR, también se puede usar para medir la afinidad de los polipéptidos FVII para las membranas de fosfolípidos (Sun y colaboradores Blood 101:2277-2284).
2. Modelos animales no humanos
Los modelos animales no humanos se pueden usar para estimar la actividad, eficacia y seguridad de los polipéptidos FVII modificados. Por ejemplo, los animales no humanos se pueden usar como modelos para una enfermedad o condición. Los animales no humanos se pueden inyectar con la enfermedad y/o sustancias que inducen el fenotipo antes de la administración de las variantes de FVII, tal como cualquier variante de FVII expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 113-273, para supervisar los efectos en la progresión de la enfermedad. Los modelos genéticos también son útiles. Se pueden generar animales, tal cómo ratones, los cuales imitan una enfermedad o condición mediante la sobreexpresión, bajo
expresión o deficiencia genética de uno o más genes, tales como, por ejemplo, ratones genéticamente deficientes de factor VIII que exhiben hemofilia A (Bi y colaboradores (1995) Nat Gen 10:119-121). Estos animales se pueden generar mediante técnicas de producción de animales transgénicos bien conocida en el- campo o usando cepas mutantes de origen natural o inducidas. Ejemplos de modelos animales no humano útiles de enfermedades asociadas con FVII incluyen, pero no se limitan a, modelos de trastornos de sangrado, en particular hemofilia, o enfermedad trombótica. Los modelos animales no humano para lesión también se pueden usar- para estimar una actividad, tal como la actividad de coagulación, de los polipéptidos FVII. Estos modelos animales no humanos se pueden usar para supervisar la actividad de las variantes de FVII comparadas con un polipéptido FVII de tipo silvestre.
Los modelos animales también se pueden usar para monitorear la estabilidad, vida media y eliminación de los polipéptidos FVII modificados. Estos ensayos son útiles para comparar los polipéptidos FVII modificados y para calcular las dosis y regímenes' de dosis para ensayos adicionales de animales no humanos y humanos. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado, tal como cualquier variante de FVII proporcionado en este documento incluye, por ejemplo, cualquiera expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 113-2.73, se
puede inyectar en la vena de la cola de los ratones. Las muestras de sangre luego se toman en puntos de tiempo después de la inyección (tal como minutos, horas y días posteriormente) y luego el nivel de los polipéptidos FVII modificados en las muestras corporales que incluyen, pero no se limitan a, suero o plasma, se pueden supervisar en puntos de tiempo específicos por ejemplo mediante el ELISA o radioinmunoensayo.. Las muestras de sangre de varios puntos de tiempo después de la inyección de los polipéptidos FVII también se someten a prueba para la actividad de coagulación usando varios métodos, tal como se describe en el Ejemplo 9. Estos tipos de estudios farmacocinéticos pueden proporcionar información con respecto a la vida media, eliminación y estabilidad de los polipéptidos FVII, los cuales pueden ayudar a determinar las dosis adecuadas para la administración como un procoagulante.
Los polipéptidos FVII modificados, tal como cualquiera que se exponga en cualquiera de SEQ ID NOS: 113-273, se puede someter a prueba para la efectividad terapéutica usando modelos animales para la hemofilia, en un ejemplo no limitante, un modelo animal tal como un ratón se puede usar. Los modelos de ratón de la hemofilia están disponibles en el campo y se pueden emplear para someter a prueba los polipéptidos FVII modificados. Por ejemplo, un modelo de
ratón de hemofilia A que se produce mediante la inyección con anticuerpos anti-FVIII se puede usar para estimar la actividad coagulante de los polipéptidos FVII (véase por ejemplo el Ejemplo 6, y Tranholm y colaboradores Blood (2003)102:3615-3620). Un modelo, de ratón de hemofilia B también se puede usar para someter a prueba los polipéptidos FVII (Margaritis y colaboradores (2004) J Clin Invest 113:1025-1031). Los modelos no de ratón de trastornos de sangrado también existente. La actividad del polipéptido FVII se puede estimar en ratas con hemorragia inducida por warfarina o hemorragia inducida por melagatran (Diness y colaboradores (1992) Thromb Res 67:233-241, Elg y colaboradores (2001) Thromb Res 101:145-157), y conejos con hemorragia inducida con heparina (Chan y colaboradores (2003) J Thromb Haemost 1:760-765). .Perros con enfermedad de hemofilia A, hemofilia B y von Willebrand congénita que exhiben hemorragia grave también se pueden usar en estudios de animal no humano con polipéptidos FVII (Brinkhous y colaboradores (1989) PNAS 86:1382-1386). La actividad de los polipéptidos FVII también se puede estimar en un modelo de conejo de hemorragia en el cual la trombocitopenias se induce mediante una combinación de irradiación de rayos gamma y el uso de anticuerpos de plaqueta (Tranholm y colaboradores (2003) Thromb Res 109:217-223).
Además de los animales con . trastornos de sangrado generalizados, modelos de lesión y trauma también se pueden usar para evaluar la actividad de los polipéptidos FVII, y su seguridad y eficacia como un agente terapéutico coagulante. Ejemplos no limitantes de estos modelos incluyen un modelo de estenosis con área de conejo (Fatorutto y colaboradores (2004) Can J Anaesth 51 : 672-679) , un modelo de lesión del hígado grado V en cerdos (Lynn y colaboradores (2002) J Trauma 52:703-707), un modelo de lesión de hígado grado V en cerdos (Martinowitz y colaboradores (2001) J Trauma 50:721-729) y un modelo de aortotomía de cerdo (Sondeen y colaboradores (2004) Shock 22 : 163-168 ) .
3. Ensayos clínicos
Muchos ensayos están disponibles para estimar la actividad de FVII para el uso clínico. Estos ensayos pueden incluir la estimación de la coagulación, estabilidad de proteínas y vida media in vivo, y ensayos fenotípicos. Los ensayos fenotípicos y los ensayos para estimar el efecto terapéutico del tratamiento con FVII incluyen la estimación de los niveles de sangre de FVII (por ejemplo medición del FVII en suero antes de la administración y puntos de tiempo después de las administraciones que incluyen, después de la primera administración,' inmediatamente después de la última administración, y puntos de tiempo intermedios, corrección
para el índice de masa corporal (BMI)), estimación de la coagulación de la sangre in vitro usando los métodos descritos anteriormente después del tratamiento con FVII (por ejemplo, ensayo PT) , y respuesta fenotípica al tratamiento con FVII que incluye mejoramiento de los síntomas a través del tiempo comparados con los sujetos tratados con un FVII no modificado y/o de tipo silvestre o placebo. Los pacientes tratados con polipéptidos FVII se pueden supervisar para la pérdida de sangre, requerimiento de transfusión, y hemoglobina. Los pacientes se pueden supervisar regularmente durante un período de tiempo para administraciones de rutina o repetidas, o después de la administración en respuesta a eventos agudos tales como hemorragia, trauma o procedimientos quirúrgicos .
G. Formulación y Administración
Las composiciones para el uso en el tratamiento de trastornos de sangrado se proporcionan en este documento. Estas composiciones contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de factor VII como se describe en este documento. Las concentraciones efectivas de los polipéptidos FVII o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos se mezclan con un portador o vehículo farmacéutico aceptable para la administración sistémica, tópica o local. Los compuestos se incluyen se incluyen en una cantidad
efectiva para tratar el trastorno seleccionado. La concentración del compuesto activo en la composición dependerá en la absorción, inactivación, velocidades de excreción del compuesto activo, el programa de dosificación, y la cantidad administrada asi como también otros factores conocidos por aquellas personas expertas en el campo.
Los portadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en este documento incluyen cualquiera de estos portadores conocidos por aquellas personas expertas en el campo que sean adecuados para el modo particular de administración. Las composiciones farmacéuticas que incluyen uña' cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FVII descrito en este documento también se puede proporcionar como un polvo liofilizado que se reconstituye, tal como con agua estéril, inmediatamente antes de la administración.
1. Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas que contienen un FVII modificado se pueden formular de cualquier manera convencional al mezclar una cantidad seleccionada del polipéptido con uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. La selección del portador o excipiente está dentro de la experiencia de la profesión de administración y puede depender de una variedad de
parámetros. Estos incluyen, por ejemplo, el modo de administración (es decir sistémico, oral, nasal, pulmonar, local, tópico, o cualquier otro modo) y trastorno tratado. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se pueden formular para una sola administración de dosificación (directa) o para la dilución u otra modificación. Las concentraciones de los compuestos en las formulaciones son efectivas para el suministro de una cantidad, en la administración, que es efectiva para el tratamiento propuesto. Típicamente, las composiciones se formulan para una sola administración de dosificación. Para formular una composición, la fracción en peso de un compuesto o mezcla del mismo se disuelve, se suspende, se dispersa, o de otra manera se mezcla en un vehículo seleccionado a una concentración efectiva tal que la condición tratada se alivia o se mejora.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden formular para administración a un sujeto como una proteína FVIIa de dos cadenas. Los polipéptidos FVII modificados se pueden activar mediante cualquier método conocido en el campo antes de la formulación. Por ejemplo, el FVII se puede someter a la autoactivación durante la purificación mediante la cromatografía de intercambio iónico (Jurlander y colaboradores (2001)¦ Semin Thromb Hemost 27:373-
384). Los polipéptidos FVII modificados también se pueden activar mediante la incubación con FXa inmovilizado sobre perlas ( Kemball-Cook y colaboradores (1998) J Biol Chem 273:8516-8521), o cualquier otro de los métodos conocidos en el campo (véase también el Ejemplo 2 posteriormente) . La inclusión de calcio en estos procesos asegura la activación total y el plegamiento correcto de la proteina FVIIa modificada. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento también se pueden formular para la administración como una sola .proteina de cadena. Los polipéptidos FVII de cadena individual se pueden purificar de tal manera como . para prevenir la escisión (véase, por ejemplo, US6677440) . Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden formular tal que las formas de cadena individual y dos cadenas están contenidas en la composición farmacéutica, en cualquier relación mediante la . selección apropiada del medio para eliminar o controlar la autoactivación .
El compuesto se puede suspender en forma micronizada u otra forma adecuada o se puede derivar para producir un producto activo más soluble. La forma de la mezcla resultante depende de una variedad de factores, que incluyen el modo propuesto de administración y la solubilidad de compuesto en el portador o vehículo seleccionado. Las mezclas resultantes
son soluciones, suspensiones, emulsiones y otras de estas mezclas, y se pueden formular como una mezcla no acuosa o acuosa, cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, rocíos, supositorios, vendajes, o cualquier otra formulación adecuada para la administración sistémica, tópica o local. Para la administración interna local, tal como, administración intramuscular, parenteral o intraarticular , los polipéptidos se pueden formular como una suspensión en solución en un medio basado acuso, tal como solución salina isotónicamente amortiguadas o se combinan con un soporte biocompatible o bioadhesivo propuesto para la administración interna. La concentración efectiva es suficiente para mejorar la condición objetivo y se puede determinar empíricamente. Para formular una composición, la fracción en peso del compuesto se disuelve, se suspende, se dispersa, o de otra manera se mezcla en un vehículo seleccionado en una ¦ concentración efectiva tal que la condición objetiva se alivia o se mejora.
Generalmente, las composiciones farmacéuticamente aceptables se preparan en vista de aprobaciones por una agencia reguladora u otras preparadas de acuerdo con la farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales y en humanos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir
portadores tales como un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra una isoforma. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de .soya, aceite mineral, y aceite de ajonjolí. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se pueden .emplear como portadores líquidos, particularmente para las soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio, o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tal como goma de acacia, gelatina,, glucosa, melazas, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de los mismos, povidona, crospovidonas y otros de estos aglutinantes conocidos para aquellas personas expertas en el campo. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilenglicol , agua y
etanol . Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes de humectación o emulsionadores , o agentes amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sodio de trietanolamina , oleato de trietanolamina, y otros de estos agentes. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, y formulaciones de liberación sostenida. Las cápsulas y cartuchos de por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla de polvo de un compuesto terapéutico y una base de polvo adecuado tal como lactosa o almidón. Una composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes adicionales y portadores tales como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como de grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y otros de estos agentes. Las preparaciones para administración oral también se pueden formular adecuadamente con inhibidores de proteasa, tal como el inhibidor de Bowman-Birk, inhibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina y camostato. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describe en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W.
Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración apropiada a un sujeto o paciente.
La formulación se debe adaptar al modo de administración. Por ejemplo, el FVII modificado se' puede formular para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua) . Las composiciones inyectables pueden tomar estas formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,4-butanodiol. Aceites fijos, estériles se pueden emplear convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo blando se puede emplear, incluyendo, pero no se limita a, mono- diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (que incluyen ácido oleico) , aceites vegetales de origen natural como aceite de ajonjolí, aceite de coco, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, y otros aceites, o vehículos grasos sintéticos como oleato de etilo. Soluciones amortiguadoras, conservadores,
antioxidantes, y los ingredientes adecuados, se pueden incorporar como se requiera, o, alternativamente, pueden comprender la formulación.
Los polipéptidos se pueden formular como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición o se pueden . combinar con otros ingredientes activos. Los polipéptidos se pueden dejar como objetivo para el suministro, tal como mediante la conjugación a un agente objetivo, tal como un anticuerpo. Las suspensiones liposomales, que incluyen liposomas fijadas como objetivo al tejido, también pueden ser adecuadas como portadoras farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar como se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,522,811. El suministro liposomal también puede incluir formulaciones de liberación lenta, que incluyen matrices farmacéuticas tales como geles de colágeno y liposomas modificados con fibronectina (véase, por ejemplo, einer y colaboradores (1985) J Pharm Sci . 74 ( 9) : 922-5) . Las composiciones proporcionadas en este documento pueden contener además uno o más adyuvantes que facilitan el suministro, tal como, pero no se limitan a, portadores inertes, o sistemas de dispersión coloidales. Ejemplos
representativos y no limitantes cié estos portadores inertes se pueden seleccionar de agua, alcohol isopropílico, clorocarburos gaseosos, alcohol etílico, polivinilpirrolidona, propilenglicol , un material productor de gel, alcohol estearílico, ácido esteárico, esperma de ballena, monooleato de sorbitan, metilcelulosa, así como también, combinaciones adecuadas de dos o más de los mismos. El compuesto activo se incluye en el portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables sobre el sujeto tratado. La concentración terapéuticamente efectiva se puede determinar empíricamente al someter a prueba los compuestos en sistemas vitro e in vivo conocidos, tales como los ensayos proporcionados en este documento,
a. Dosificaciones
La cantidad precisa o dosis del agente terapéutico administrado depende del polipéptido FVII particular, la vía de administración, y otras consideraciones, tal como la gravedad en la enfermedad y el peso y el estado general del sujeto. La administración local del agente terapéutico requerirá típicamente una, dosis más pequeña que cualquier modo de administración sistémica, aunque la concentración del agente terapéutico puede, en algunos casos, ser más alto
después de la administración local que se puede lograr con seguridad en la administración sistémica. Si es necesario, una dosificación particular y duración y protocolo del tratamiento se pueden determinar empíricamente o extrapolar. Por ejemplo, las dosis ejemplares de polipéptidos FVII recombinantes y nativos se pueden usar como un punto de partica para determinar dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, un polipéptido FVII recombinante (rFVIIa) que ha activado a rFVIIa, NovoSevenMR, se han administrado a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, quienes están experimentando un episodio hemorrágico, en una dosificación de 90 g/kg mediante la infusión de bolo durante 2 a 5 minutos, logrando un nivel de circulación efectivo de por lo menos 2 pg/ml. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se logra la hemostasis. · Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden ser efectivos en cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas comparados con un FVII recombinante. Por ejemplo, en los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden administrar en una dosificación de 80 pg/kg, 70 pg/kg, 60 pg/kg, 50 pg/kg, 40 pg/kg, 30 pg/kg, 20 pg/kg, 15 pg/kg o menos. En algunas modalidades, las dosificaciones pueden ser más altas, tal como 100 pg/kg, 110 pg/kg, 120 pg/kg, o más altas. La duración del tratamiento y
el intervalo entre las inyecciones variará con la gravedad del sangrado y la respuesta del paciente al tratamiento, y se puede ajustar por consiguiente. Los factores tales como el nivel de actividad y la vida media del FVII modificado en comparación en el FVII no modificado se pueden tomar en cuenta cuando se hacen las determinaciones de dosificación. Se pueden determinar empíricamente las dosificaciones y regímenes particulares.
En otro ejemplo, un polipéptido FVII recombinante (rFVIIa) que se. ha activado a rFVIIa, NovoSevenMR, se ha administrado a pacientes con deficiencia FVII congénita quienes están experimentando un episodio hemorrágico, en una dosificación de 15-30 pg/kg mediante la infusión de bolo durante 2 a 5 minutos. La dosis se repite cada 4-6 horas hasta que se logra la hemostasis. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden ser efectivos en cantidades y/o frecuencia de dosificación reducidas comparadas con FVII recombinante. Por ejemplo, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden administrar en una dosificación de 20 pg/kg, 15 pg/kg, 10 pg/kg, 5 yg/kg, 3 pg/kg o menos. En algunos ejemplos, las dosificaciones pueden ser más altas, tal como 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg, o más altas. La duración del tratamiento y el intervalo entre las inyecciones
variará con la gravedad del sangrado y la respuesta del paciente al tratamiento, y se puede ajustar por consiguiente. Los factores tales como el nivel de actividad y vida media del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado se pueden usar en hacer las determinaciones de dosificación. Por ejemplo, un polipéptido FVII modificado que exhibe una vida media más prolongada que un polipéptido FVII no modificado se puede administrar en dosis más bajas y/o menos frecuentemente que un polipéptido FVII no modificado. Similarmente , las dosificaciones requeridas para el efecto terapéutico que usan un polipéptido FVII modificado que exhibe actividad coagulante incrementada comparado con un Ejolipéptido FVII no modificado se pueden reducir en frecuencia y cantidad. Las dosificaciones y regímenes particulares se pueden determinar empíricamente por una persona experta en el campo.
b . Formas de dosificación
Los compuestos terapéuticamente activos farmacéuticos y derivados de los mismos se formulan y se administran típicamente en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. La formulación se puede proporcionar para la administración a humanos y animales en forma de dosificación que incluyen, pero no se limitan a, tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, soluciones o
suspensiones parenterales estériles, soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite-agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Ejemplos de formas de dosis unitaria incluyen ampolletas y jeringas y tabletas y cápsulas individualmente empaquetadas. En algunos ejemplos, la dosis unitaria se proporciona como un polvo liofilizado que es reconstituido antes de la administración. Por ejemplo, un polipéptido FVII se puede proporcionar como polvo liofilizado que se reconstituye con una solución adecuada para generar una solución de dosis individual para la inyección. En algunas modalidades, el polvo liofilizado puede contener el polipéptido FVII y componentes adicionales tales como sales, tal que la reconstitución con el agua destilada estéril da por resultado un polipéptido FVII en una solución amortiguada o salina. La forma de dosificación unitaria se pueden administrar en fracciones o múltiples de las mismas. Una forma de dosificación múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitaria idénticas y empaquetadas en un contenedor individual que se administra en forma de dosis
unitaria agregada. Ejemplos de forma de dosificación múltiples incluyen frasquitos, botellas de tabletas o cápsulas, o botellas de tintas o galones. Por consiguiente, la forma de dosificación múltiple es un múltiple de dosis unitaria que no se segregan en el empaque.
2. Administración de los polipéptidos FVII modificados Los polipéptidos FVII proporcionados en este documento (es decir compuestos activos) se pueden administrar in vitro, ex vivo, o in vivo al poner en contacto una mezcla, tal como un fluido corporal u otras muestras de tejido, con un polipéptido FVII. Por ejemplo, cuando se administra un compuesto ex vivo, un fluido corporal o muestra de tejido de un sujeto se puede poner en contacto con los polipéptidos FVII que se recubren sobre un tubo o filtro, tal como por ejemplo, un tubo o filtro en una máquina de derivación. Cuando se administra in vivo, los compuestos activos se pueden administrar mediante cualquier vía apropiada, por ejemplo, oral, nasal, pulmonar, parenteral, intravenosa, intradérmica , subcutánea, intraarticular , intracisternal , infraocular, intraventricular , intratecal, intramuscular, intraperitoneal , intratraqueal o tópicamente, asi como también mediante cualquier . combinación de cualquiera de dos o más de los mismos, en forma liquida, semiliquida o sólida y se formulan en una manera adecuada para cada vía de
administración. Los polipéptidos FVII modificados se pueden administrar una vez o más de una vez, tal como dos veces, tres veces, cuatro veces, o cualquier variedad de veces que sean requeridas para lograr un efecto terapéutico. Las administraciones múltiples se pueden efectuar por medio de cualquier vía o combinación de vías, y se pueden administrar cada hora, cada dos horas, cada tres horas, cada cuatro horas o más.
La vía más adecuada de administración variará dependiendo de estado de enfermedad que se trata, por ejemplo la ubicación del trastorno hemorrágico. Generalmente, los polipéptidos FVII se administrarán mediante inyección de bolo intravenosa, con un tiempo de administración (infusión) de aproximadamente 2-5 minutos. En otros ejemplos, los niveles de sangre deseables de FVII se pueden mantener mediante una infusión continua del agente activo como es estimado por los niveles de plasma. Se debe observar que el médico que atiende sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir y ajustar la terapia a una dosificación más baja debido a la toxicidad, o disfunciones de la médula ósea, hígado o ríñones. A la inversa, el médico que atiende también sabrá cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más altos si la respuesta clínica es adecuada (previniendo efectos secundarios tóxicos) . En otros ejemplos, la ubicación del trastorno
hemorrágico podría indicar que la formulación FVII se administra por medio de vías alternativas. Por ejemplo, la administración local, que incluye la administración dentro del cerebro (por ejemplo, intraventricularmente) mes podría registrar cuando el paciente está experimentando hemorragia en esta región. Similarmente, para al tratamiento de hemorragia en las articulaciones, la administración local mediante la inyección del agente terapéutico dentro de la articulación (es decir, intra-articularmente, medios intravenosos o subcutáneos) se puede emplear. En otros ejemplos, la administración tópica del agente terapéutico a la piel, por ejemplo formulada como una crema, gel, o ungüento, o administración a los pulmones mediante la inhalación o intra-traquealmente, podrían ser apropiadas cuando la hemorragia se localiza en estas áreas.
Los casos donde los polipéptidos FVII modificados van a ser formulados como una preparación de depósito, las formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante la implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos terapéuticos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión o un aceite aceptable) o resina dé intercambio iónico, o como derivados
escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones, si se desea se pueden presentar en un paquete, en un kit o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, contiene láminas delgadas de metal o plástico, tal como un paquete de ampolla. El paquete o el dispositivo dispensador se pueden acompañar por instrucciones para la administración. Las composiciones que contienen los agentes activos es pueden empaquetar como artículos de manufactura que contienen el material de empaque, · un agente proporcionado en este documento, y una etiqueta que indica el trastorno por el cual el agente se proporciona.
3. Administración de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos FVII modificados (terapia génica)
También se proporcionan composiciones de moléculas de ácido nucleico . que codifican los polipéptidos FVII modificados y los vectores de expresión que los codifican que son adecuados para la terapia génica. Antes del suministro de la proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo, tal como sistémicamente' o mediante otra vía, o ex vivo, tal como mediante la remoción de células, que incluyen linfocitos, introducción del nucleico en el mismo, e
introducción dentro del hospedero y un recipiente compatible.
Se pueden suministrar polipéptidos FVII modificados a las células y tejidos mediante la expresión de moléculas de ácido nucleico. Los polipéptidos FVII modificados se pueden administrar como moléculas de ácido nucleico ácido nucleico que codifican polipéptidos FVII modificados, que incluyen técnicas ex vivo y expresión in vivo directa. Los ácidos nucleicos se pueden suministrar a las células y tejidos mediante cualquier método conocido por aquellas personas expertas en el campo. Las secuencias de ácidos nucleicos aisladas se pueden incorporar en los vectores para manipulación adicional. Como se usa en este documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ADN heterologo dentro de las células para ya sea la expresión o replicación del mismo. La selección y uso de estos vehículos están muy adentro de la experiencia del artífice .
Los métodos para administrar los polipéptidos FVII modificados mediante la expresión de la codificación de las moléculas de ácido nucleico incluyen la administración de vectores recombinantes . El vector se puede diseñar para permanecer episomal, tal como mediante la infusión de un origen de replicación o se pueden diseñar para integrarse dentro de un cromosoma en la célula. Polipéptidos FVII
modificados también se pueden usar en la terapia de expresión génica ex vivo usando vectores no virales. Por ejemplo, las células se pueden diseñar para expresar un polipéptido FVII modificado, tal como al integrar un ácido nucleico que codifica el polipéptido FVII modificado dentro de una ubicación genómlca, ya sea enlazado operativamente a la secuencia reguladoras o tal que se coloca enlazado operativamente a las secuencias reguladoras en una ubicación genómica. Estas células luego se pueden administrar local o sistémicamente a un sujeto, tal como un paciente en necesidad de tratamiento.
Los vectores virales, incluyen, por ejemplo adenovirus, virus asociados con adeno (AAV) , poxvirus, virus del herpes, retrovirus y otros designados para la terapia génica se pueden emplear. Los vectores pueden permanecer episomales o pueden integrarse dentro de los cromosomas del sujeto tratado. Un polipéptido FVII modificado se puede expresar por un virus, el cual se administra a un sujeto en necesidad de tratamiento. Vectores virales adecuados para la terapia génica incluyen adenovirus, virus asociados con adeno (AAV) , retrovirus, lentivirus, virus de vaccinia y otros observados anteriormente. Por ejemplo, la tecnología de expresión del adenovirus es bien conocida en el campo y los métodos de producción y administración del adenovirus también son bien
conocidos. Los serotipos de adenovirus están disponibles, por ejemplo, de the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . Los adenovirus se pueden usar ex vivo, por ejemplo, las células se aislan de un paciente en necesidad de tratamiento, y se transducen con un vector de adenovirus que expresa el polipéptido FVII modificado. Después de un periodo de cultivo adecuado, las células transducidas se administran a un sujeto, local y/o sistémicamente . Alternativamente, las partículas de adenovirus que expresan el polipéptido FVII modificado se aislan y se formulan en un portador farmacéuticamente aceptable para el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o condición de un sujeto. Típicamente, las partículas de adenovirus se suministran en una dosis que varía de 1 partícula 1014 partículas por kilogramo del peso de sujeto, generalmente entre 106 o 108 partículas a 1012 partículas por kilogramo del peso del sujeto. En algunas situaciones es deseable proporcionar una fuente de ácidos nucleicos con un agente que fija como objetivo las células, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o una célula objetivo, o un ligando para un receptor sobre una célula objetivo. El FVII también se puede fijar como objetivo para el suministro dentro de los tipos de células específicas. Por ejemplo, los
vectores adenovirales que codifican los polipéptidos FVII se pueden usar para la expresión estable en las células no de dilución, tal como las células del hígado (Margaritis y colaboradores (2004) J Clin Invest 1 13:1025-1031). En otro ejemplo, los vectores virales o no virales que codifican los polipéptidos FVII se pueden transducir dentro de las células aisladas para el suministro subsecuente. Tipos de célula adicionales para la expresión y suministro de FVII podrían incluir, pero no se limitan a, fibroblastos y células endoteliales .
Las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir dentro de los cromosomas artificiales y otros vectores no virales. Los cromosomas artificiales, tales como ACES (véase, Lindenbaum y colaboradores (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):el72) se pueden diseñar para codificar y expresar la isoforma. Brevemente, los cromosomas artificiales de mamífero (MACs) proporcionan un medio para introducir grandes cargas útiles de información genética dentro de la célula en un formato no integrante, autónomamente de replicación. Únicos entre los MACs, la Expresión del Cromosoma Artificial (ACE) basada en ADN satélite de mamífero se puede generar reproduciblemente de nuevo en líneas de células de diferentes especies y purificar fácilmente de los cromosomas de las células hospederas. Las ACEs de mamífero purificadas luego se
pueden reintroducir en una variedad de lineas de células recipientes donde se . han mantenido establemente durante periodos prolongados en ausencia de la presión selectiva usando un sistema ACE. Usando este procedimiento, la carga especifica de uno o dos objetivos técnicos se ha logrado en las células LMTK(-) y CHO.
Otro método para introducir ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos FVII modificados es una técnica de reemplazo de genes de dos etapas en la levadura, comenzando con un genoma de adenovirus completo (Ad2; Ketner y colaboradores (1994) PNAS 91:6186-6190) clonado en un Cromosoma Artificial de Levadura (YAC) y unas secuencias de adenovirus que contienen plásmido para fijar como objetivo una región especifica en el clon YAC, un cásete de expresión para el gen de interés y un marcador seleccionable positivo y negativo. Los YACs son de interés particular debido a que permiten la incorporación de genes más grandes. Este procedimiento se puede usar para la construcción de vectores basados en adenovirus que llevan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos FVII modificados descritos para la transferencia de genes a células de mamífero o animales enteros.
Los ácidos nucleicos se pueden encapsular en un vehículo, tal como un liposoma, o introducir en unas células,
tal como célula bacteriana, particularmente una bacteria atenuada o introducida en un vector viral. Por ejemplo, cuando los liposomas se emplean, las proteínas que se enlazan a una proteina de la membrana de superficie celular con endocitosis se puede usar para fijar como objetivo y/o para facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cépside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas las cuales se someten a la internalización en la delación, y proteínas que fijan como objetivo la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular.
Para los métodos ex vivo e in vivo, las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido FVII modificado se introducen en las células que son de un donador' adecuado o el sujeto que se trata. Las células dentro de las cuales un ácido nucleico se puede introducir para propósitos de terapia incluyen, por ejemplo, cualquier tipo de célula disponible, deseado apropiado para la enfermedad o condición que se trata, incluyendo pero no se limita a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos , fibroblastos, células musculares, hepatocitos ; células sanguíneas tales como T linfocitos, B linfocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos ; varias células madre o progenitoras. en particular células madre o
progenitoras hematopoyéticas , por ejemplo, tales como células madre obtenidas de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y otras fuentes de las mismas.
Para el tratamiento ex vivo, las células de un donador compatible con el. sujeto que se trata y las células se remueven, el ácido nucleico se introduce dentro de estas células aisladas y las células modificadas se administran al sujeto. El tratamiento incluye la administración directa, tal como, por ejemplo, encapsulada dentro de membranas porosas, las cuales se implantan dentro del paciente (véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,892,538 y 5,283,187 cada una de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) . Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico dentro de las células de mamífero in vivo incluyen el uso de liposomas y lípidos catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, y métodos de precipitación de fosfato de calcio. Los métodos de suministro de DNA se pueden usar para expresar polipéptidos FVII modificados in vivo. Estos métodos incluyen el suministro de liposomas de ácidos nucleicos y suministro de ADN desnudo, que incluye suministro local y sistémico tal como el uso de electroporación, ultrasonido y suministro de
fosfato de calcio. Otras técnicas incluyen microinyección, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas y fusión de esferoplasto .
La expresión in vivo de un polipéptido FVII modificado se puede enlazar a la expresión de moléculas adicionales. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido FVII modificado se puede enlazar con la expresión- de un producto citotóxico tal como en un virus diseñado o expresado en un virus citotóxico. Estos virus se pueden dejar como objetivo a un tipo de célula particular que es un objetivo para un efecto terapéutico. El polipéptido FVII modificado expresado se puede usar para mejorar la citotoxicidad del virus.
La expresión in vivo de un polipéptido FVII modificado puede incluir enlazar operativamente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido FVII modificado a secuencias reguladoras especificas tal como un promotor especifico de células o especifico de tejido. Los polipéptidos FVII modificados también se pueden expresar de vectores que afectan y/o se replican específicamente en tipos de células objetivo y/o tejidos. Los promotores inducibles se pueden usar para regular selectivamente la expresión del polipéptido FVII modificado. .Un sistema de expresión regulable ejemplar es el sistema de expresión de genes
inducibles por doxiciclina, la cual se ha usado para regular la expresión FVII recombinante (Srour yy colaboradores (2003) Thromb Haemost . 90(3): 398-405).
Las moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos desnudos o en vectores, cromosomas artificiales, liposomas y otros vehículos se pueden administrar al sujeto mediante la administración sistémica, tópica, local y otras vías de administración. Cuando es sistémica e in vivo, la molécula de ácido nucleico o vehículo que contiene la molécula de ácido nucleico se puede fijar como objetivo a una célula.
La administración también se puede dirigir, tal como mediante la administración de un vector o células que fijan como objetivo típicamente una célula o tejido. Por ejemplo, las células de tumor y proliferantes se pueden fijar como objetivo las células para la expresión in vivo de los polipéptidos FVII modificados. Las células usadas para la expresión in vivo de un polipéptido FVII modificado también incluyen células autólogas al paciente. Estas células se pueden remover de un paciente, ácidos nucleicos para la expresión de un polipéptido FVII modificado introducido, y luego administrar a un paciente tal como mediante inyección o injerto.
H . Usos terapéuticos
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este
documento se pueden usar para el tratamiento de cualquier condición para la cual se emplea el FVII recombinante . Típicamente, estos tratamientos incluyen aquellos donde la coagulación incrementada, tal como respuestas hemostáticas incrementadas, son deseadas. Los polipéptidos FVII modificados tienen actividad terapéutica sola o en combinación con otros agentes. Los polipéptidos proporcionado en este documento se diseñan para retener la actividad terapéutica pero exhiben propiedades modificadas, particularmente resistencia incrementada a AT-III y actividad catalítica incrementada. Los polipéptidos proporcionado en este documento también pueden exhibir resistencia incrementada a TFPI, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media en suero, enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas, enlace y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y/o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas o¡nbP3- Estas propiedades modificadas, · por ejemplo, pueden mejorar la efectividad terapéutica de los polipéptidos debido a la actividad coagulante implementada de los polipéptidos FVII modificados. Esta sección proporciona usos ejemplares de y métodos de administración. Estas terapias descritas son ejemplares y no limitan las aplicaciones de los polipéptidos
FVII modificados.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar en varios métodos terapéuticos asi como también métodos de diagnóstico en los cuales el FVII se emplea. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos de tratamiento de condiciones fisiológicas y médicas descritas y listadas posteriormente. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento pueden exhibir la mejora de las actividades . in vivo y los efectos terapéuticos comparados con el FVII de tipo silvestre, que incluye dosificación más baja para lograr el mismo efecto, y otras mejoras en la administración y tratamiento tal como pocas y/o menos administraciones frecuentes, efectos secundarios disminuidos y efectos terapéuticos incrementados. Aunque se entiende que los polipéptidos FVII modificados se pueden administrar como un zimógeno de FVII (es decir, forma de cadena individual) , típicamente los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se administran en forma de dos cadenas activadas después, por ejemplo, la autoactivación o activación por otros factores de coagulación, tal como durante la purificación.
En particular, los polipéptidos FVII modificados se proponen para el uso en métodos terapéuticos en los cuales el FVII se ha usado para el tratamiento. Estos métodos incluyen,
pero no se limitan a, métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos, tales como, pero no se limitan a, trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos , trastornos de sangrado, hemofilias, tal como hemofilia A, hemofilia B y deficiencia del factor VII, y trastornos de la sangre adquiridos, tal como deficiencia de factor VII adquirida causada por la enfermedad del hígado. Los polipéptidos FVII modificados también se pueden usar en el tratamiento de enfermedades y trastornos de sangrado adicionales, tal como, pero no se limita a, trombocitopenia (por ejemplo, tal como debido a los regímenes quimioterapéuticos ) , enfermedad de Von illebrand, trastornos de plaquetas hereditarios (por ejemplo, enfermedad de acumulación de almacenamiento tal como síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción ?2 de tromboxano, trombastenia de Glanzmann, y síndrome de Bernard-Soulier ) , síndrome hemolítico-urémico, Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.
En algunas modalidades, las hemorragias que se tratan por los polipéptidos FVII ocurren en órganos tales como el cerebro, región del oído interno, ojos, hígado, pulmones, tejido de tumores, tracto gastrointestinal. En .otras
modalidades, la hemorragia se difunde, tal como gastritis hemorrágica y hemorragia uterina profusa. Los pacientes con trastornos de sangrado, tal como por ejemplo, hemofilia A y B, frecuentemente están en riesgo de complicaciones hemorrágicas durante la cirugía o trauma. Esta hemorragia se puede manifestar como hemartrosis (hemorragias, en las articulaciones), artropatía hemofílica crónica, hematomas, (por ejemplo, musculares, retroperitoneales , sublinguales y retrofaríngicos ) , hematuria (hemorragia del tractor renal), hemorragias del sistema nervioso central, hemorragias gastrointestinal (por ejemplo, sangrados UGI) y hemorragia cerebral, la cual también se puede tratar con polipéptidos FVII modificados. Adicionalment.e, cualquier hemorragia asociada con la cirugía (por ejemplo, hepatectomía) , o extracción dental se pueden tratar con polipéptidos FVII modificados. En una modalidad, los polipéptidos . FVII modificados se pueden usar para tratar episodios de hemorragia debido a un trauma, o cirugía, o disminuir el conteo o actividad de las plaquetas en un sujeto. Los métodos ejemplares para pacientes que se someten a la cirugía incluyen tratamientos para evitar hemorragias y tratamientos antes, y durante, o después de la cirugía tal como, pero no se limita a, cirugía del corazón, angioplastia , cirugía de los pulmones, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía del
cerebro, cirugía vascular, cirugía dental, o cirugía del trasplante de órganos, que incluyen trasplante de médula ósea, corazón, pulmones, páncreas o hígado.
El tratamiento de enfermedades y · condiciones con polipéptidos FVII modificados se puede efectuar mediante cualquier vía adecuada de administración usando formulaciones adecuadas como se describen en este documento que incluyen, pero no se limitan a, inyección, administración pulmonar, oral y transdér ica . El tratamiento se efectúa típicamente mediante la administración de bolo intravenoso.
Si es necesario, una dosificación particular y duración y protocolo de tratamiento se pueden determinar o extrapolar empíricamente. Por ejemplo, las dosis ejemplares de polipéptidos FVII recombinantes y nativos se puede usar como un punto de partica para determinar dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, un polipéptido FVII recombinante (rFVIIa) que ha sido activado a rFVIIa, NovoSevenMR, se ha administrado a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, quienes están experimentado un episodio hemorrágico, en una dosificación de 90 g/kg mediante la infusión de bolo durante 2 a 5 minutos, logrando un nivel de circulación efectivo de por lo menos 2 pg/ml, con una vida media promedio de 2.7 horas. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se logra la hemostasis. Los polipéptidos FVII modificados que son tienen
una actividad coagulante incrementada, debido a, por ejemplo, la resistencia incrementada a AT-III, actividad catalítica incrementada, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia incrementada a TFPI, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como vida media del suero incrementada, enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas, enlace y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y/o enlace y/o actividad incrementada para la integrina de plaquetas x1 Ib 3 , puede ser efectivo en cantidades de dosificación reducidas y/o frecuencias comparadas con este FVII recombinante . Las dosificaciones para el tipo silvestre o polipéptidos FVII no modificados se puede usar como guía para determinar las dosificaciones para los polipéptidos FVII modificados. Los factores tales como el nivel de actividad y la vida media del FVII modificado en comparación con FVII no modificado se pueden usar en hacer estas determinaciones. Las dosificaciones y regímenes particulares se pueden determinar empíricamente.
Los niveles y . regímenes de dosificación se pueden determinar con base en las dosificaciones y regímenes conocidos, y, si es necesario se pueden extrapolar con base en los cambios en las propiedades de los polipéptidos y/o se pueden determinar empíricamente con base en una variedad de
factores. Estos factores incluyen peso corporal del individuo, salud general, edad, la actividad del compuesto especifico empleado, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y la evaluación del médico tratante. El ingrediente activo, el polipéptido, típicamente se combina con un portador farmacéuticamente efectivo. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosificación individual o una forma de múltiples dosificaciones puede variar dependiendo del hospedero tratado y el modo particular de administración.
El efecto de los polipéptidos FVII en el tiempo de coagulación de la sangre se puede supervisar usando cualquiera de las pruebas de coagulación conocidas en el campo que incluyen, pero no se limitan a, tiempo de la protrombina de sangre entera (PT) , tiempo de la tromboplastina parcial activada (aPTT) , el tiempo de la coagulación activada (ACT) , el tiempo de la coagulación activada recalcificada o el tiempo de la Coagulación de Lee-White.
En la mejora de la condición de un paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto o
composiciones, si es necesario; y la dosificación, la forma de dosificación, o frecuencia de administración, o una combinación de los mismos se puede modificar. En algunos casos, un sujeto puede requerir un tratamiento intermitente sobre una base a largo plazo en cualquier recurrencia de los síntomas de enfermedad o. con base en las dosificaciones programadas. En otros casos, se pueden requerir administraciones adicionales en respuesta a eventos agudos tal como hemorragia, trauma o procedimientos quirúrgicos.
Las siguientes son unas condiciones ejemplares para lo cual el FVII (administrado como FVIIa) se ha usado como un agente de tratamiento solo o en combinación con otros agentes .
1. Trastornos de sangrado congénitos
a. Hemofilia
La hemofilia congénita es un trastorno de la sangre recesivo en el cual existen niveles disminuidos de factores de coagulación en el plasma, conduciendo a la interrupción de la cascada de coagulación y el tiempo de coagulación de la sangre incrementado. La hemofilia A, que toma en cuenta aproximadamente 85% de todos los casos de hemofilia, resulta de la(s) mutación (es) en el gen del factor VIII en el cromosoma X, conduciendo a una deficiencia o disfunción de la proteína FVIII. La hemofilia B es causada por una deficiencia
o disfunción del factor de coagulación, FIX, que resulta generalmente de mutaciones o supresiones puntuales en el gen FIX sobre el cromosoma X. La incidencia mundial de la hemofilia A es aproximadamente 1 caso por 5000 individuos hombres, y 1 caso por 25000 mujeres para la hemofilia B. la hemofilia A y B se clasifican, además como leves, moderadas, o graves. Un nivel de plasma con 5%-25% del factor VIII o IX que funcionan normalmente se clasifica como leve, l%-5% es moderado, y menor que 1% es grave. La hemofilia C, frecuentemente referida como deficiencia de FIX, es relativamente una enfermedad leve y rara, que afecta aproximadamente 1 en 100000 personas de una manera recesiva autosomal .
La hemofilia. A y B se manifiesta clínicamente en muchas formas. Cortes menores y abrasiones no darán por resultado sangrado excesivo, pero traumas y cirugías lo harán. El paciente también tendrá numerosos sangrados articulares y musculares y fácil aparición de moretones. La hemartrosis o hemorragia dentro de las articulaciones es una de las complicaciones principales en la hemofilia, y pueden ocurrir espontáneamente . o en respuesta a un trauma. Las articulaciones en bisagra, tales como la rodilla, codo y tobillo, son afectadas más frecuentemente. La cadera y el hombro se afectan mucho menos frecuentemente que la rótula y
la articulación del receptáculo tiene más musculatura que la circunda, protegiéndolas de esta manera más de la lesión. La hemorragia puede causar dolor agudo grave, restringir el movimiento, y conduce a complicaciones secundarias que incluyen hipertrofia sinovial. Adicionalmente, la hemorragia ocurrente en las articulaciones puede causar sinovitis, crónica, la cual puede causar daño de la articulación, destrucción del sinovio, cartílago, y hueso. Las hemorragias que ponen en peligro la vida, tal como hemorragia intracraneal y sangrado en el sistema nervioso central, también afectan a sujetos hemofílicos. El sangrado intracraneal ocurre en aproximadamente 10% de pacientes con hemofilia grave, dando por resultado un 30% de tasa de mortalidad. En contraste,, la hemofilia C es más leve. Los sangrados espontáneos se observan raramente, y el sangrado dentro de las articulaciones, tejidos y músculos blandos tampoco es común. El sangrado se trata generalmente con transfusión de plasma congelado reciente (FFP), terapia de reemplazo de FXI, o, para el tratamiento tópico, tal como tratamiento de heridas externas o extracciones dentales, pegamento de fibrina.
El tratamiento más común para la hemofilia A o B es la terapia de reemplazo, en la cual el paciente se le administra FVIII o FIX. Las formulaciones son comercialmente disponibles
como productos derivados de plasma o recombinantes, con proteínas recombinantes que ahora son el tratamiento de selección en los pacientes previamente no tratados. Mientras que estas terapias pueden ser muy exitosas, surgen complicaciones y el paciente desarrolla inhibidores al factor VIII o factor IX recientemente administrado. Los inhibidores son anticuerpos IgG, la mayoría de la subclase IgG4, que reaccionan con el FVIII o FIX e interfieren con la función pro-coagulante. Los inhibidores afectan aproximadamente 1 en 5 pacientes con hemofilia A grave. La mayoría de sujetos desarrollan estos inhibidores tan pronto después ¦ de la administración de las primeras infusiones del factor VIII, lo cual es frecuentemente temprano en la niñez, aunque los sujetos los desarrollan después en la vida. Los inhibidores también afectan aproximadamente 1 de 15 personas con hemofilia A leve o moderada. Estos inhibidores se desarrollan usualmente durante la edad adulta y no solo destruyen los exógenos FVIII administrados, sino también destruyen el FVIII endógeno. Como resultado, los hemofílicos leves y moderados se vuelven graves. Clínicamente, los pacientes con hemofilia A con inhibidores se clasifican en respondedores altos y bajos de acuerdo con la resistencia de la respuesta anamnésica que experimentan cuando se vuelven a exponer a FVIII. Los inhibidores afectan aproximadamente 1 de 100
pacientes con hemofilia B. En la mayoría de- casos, los inhibidores se desarrollan después de las primeras infusiones del factor IX terapéutico y se pueden acompañar por reacciones alérgicas.
Los polipéptidos FVII modificados presentados en este documento se pueden usar para tratar pacientes con hemofilia, particularmente pacientes con hemofilia con inhibidores. Un producto FVIÍa recombinante (NovoSevenMR, Novo Nordisk) se ha probado y autorizado para el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores a FVIII o FIX y para la prevención de hemorragias en prevenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores a FVIII o FIX. El tratamiento con rFVIIa mejora la generación de la trombina mientras que deriva el requerimiento para FVII la y/o FlXa. La coagulación se inicia eñ el sitio de la lesión mediante la interacción de rFVIIa con TF, dando por resultado la activación de FX inicial, la. generación de trombina y la activación de las plaquetas. La coagulación completa por rFVIIa se puede efectuar por los mecanismos dependientes de TF e independientes de FX donde algunas de las trombinas generadas pueden resultar de .la activación directa de rFVIIa solo, el cual por sí mismo se enlaza a las plaquetas activadas a través de interacciones de baja afinidad con las
membranas del fosfolípido.
Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar en terapias para la hemofilia, que incluyen el tratamiento de episodios hemorrágicos y la prevención de la hemorragia en las intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos. Los polipéptidos FVII modificados en este documento pueden proporcionar resistencia incrementada a AT-III, actividad catalítica incrementada, resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+, resistencia incrementadas a TFPI, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tal como vida media del suero, enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas, enlace y/o afinidad incrementada para la albúmina de suero, y/o enlace y/o afinidad incrementada para la integrina de plaquetas anb 3. Los Polipéptidos FVII pueden exhibir por lo tanto actividad coagulante más alta de una manera dependiente de TF (tal como a través de la resistencia incrementada a TFPI), y/o una manera independiente de TF (tal como a través del enlace y/o afinidad incrementada para las plaquetas activadas. De esta manera, los polipéptidos FVII modificados se pueden ' usar para suministrar terapias más activas para la hemofilia. Ejemplos de mejoras terapéuticas que usan polipéptidos FVII modificados incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, dosificaciones más bajas, pocas y/o
menos administraciones frecuentes, efectos secundarios disminuidos y efectos terapéuticos incrementados.
Los polipéptidos FVII modificados se administran típicamente como polipéptidos FVII activados (FVIIa) . Los polipéptidos FVII modificados se pueden someter a prueba para la efectividad terapéutica, por ejemplo, mediante el uso de modelos animales. Por ejemplo los ratones hemofílicos inducidos con anticuerpos, o cualquier otro modelo de enfermedad para la hemofilia, se pueden tratar con polipéptidos FVII modificados. La progresión de los síntomas de enfermedad y fenotipos se supervisa para estimar los efectos de los polipéptidos FVII modificados. Los polipéptidos FVII modificados también se pueden administrar a sujetos tales como en ensayos clínicos para estimar la efectividad in vivo en comparación con los controles de placebo y/o controles que usan el FVII modificado,
b. Deficiencia de FVII
La deficiencia del factor VII es un trastorno hemorrágico recesivo autosomal que afecta aproximadamente 1 de 500000 personas. La deficiencia de FVII puede ser clínicamente leve, moderada o grave, con deficiencia leve a moderada caracterizada por hemorragia incrementada después de la cirugía y trauma. Los pacientes con deficiencia FVII grave (menor que 1% de actividad de FVII) experimentan síntomas
similares a la hemofilia. Por ejemplo, los sujetos deficientes de FVII están propensos a sangrados articulares, hemorragias nasales espontáneas, hemorragia gastrointestinal, hemorragia del tracto urinario. La hemorragia intracerebral y los sangrados musculares también se han reportado, mientras que las mujeres pueden experimentar menorragia grave (sangrado menstrual pesado) . El tratamiento se puede efectuar mediante la terapia de reemplazo. Un producto FVIIa recombinante (NovoSevenMR, Novo Nordisk) se ha probado y autorizado para el tratamiento de episodios hemorrágicps en pacientes con deficiencia de FVII congénita y para la prevención de hemorragia en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia de FVII congénita. Por consiguiente, los polipéptidos FVII modificados en este documento se pueden usar similarmente . Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar en el tratamiento de episodios hemorrágicos y la prevención de hemorragia e intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en los pacientes deficientes de FVII. Por ejemplo, un paciente neonatal que se presenta con deficiencia FVII grave con hemorragia intracraneal se le puede administrar polipéptidos FVII modificados mediante bolo intravenoso ' para efectuar la coagulación y mantener la hemostasis. Generalmente los
polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
c . Otros
Otros trastornos de sangrado se pueden tratar con los polipéptidos FVII proporcionado en este documento para promover la coagulación. Las deficiencias congénitas de los factores V y X también se presentan con tiempos incrementados de coagulación de la sangre y se pueden tratar potencialmente con la administración de dosis terapéuticas de FVII. Por ejemplo, un paciente con deficiencia de factor X se le puede administrar rFVIIa para controlar la hemorragia asociada con la esplenectomia (Boggio y colaboradores (2001) Br J Haematol 112:1074-1075). Los episodios hemorrágicos espontáneos y asociados con la cirugía, asociados con la enfermedad de von Willebrand (vWD) también se pueden tratar usando los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento. El VWD es un trastorno hemorrágico causado por un efecto de eficiencia de la proteína de coagulación de la sangre, el Factor von Willebrand (vWF) , y se estima que ocurre de 1% a 2% de la población. Los sujetos con vWD se les forman moretones fácilmente, tienen hemorragias nasales recurrentes, sangran después de la extracción de dientes, tonsilectomía y otra cirugía, y pacientes mujeres pueden tener hemorragia menstrual incrementada. Los polipéptidos
FVII modificados se pueden usar para mejorar hemorragia espontánea y asociada con la cirugía en pacientes con vWD (von Depka y colaboradores (2006) Blood Coagul Fibrin 17:311-316) . Otros trastornos de sangrado relacionados con plaquetas, tal como por ejemplo, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Hermansky-Pudlak también se asocian con actividad de coagulación endógena regresiva. La hemorragia espontánea en exceso o asociada con la cirugía en pacientes con trastornos de sangrado relacionados con plaquetas también se pueden controlar por las dosis terapéuticas de los polipéptidos FVII modificados. Por ejemplo, un paciente con trombastenia de Glanzmann que es somete a la cirugía se puede tratar antes, durante y/o después de la cirugía con los polipéptidos FVII modificados para prevenir mayor pérdida de sangre (van Buuren y colaboradores (2002) Dig Dis Sci 47:2134-2136). Generalmente, los polipéptidos FVII modificados es administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
2. Trastornos de sangrado adquiridos
a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia
Los trastornos de sangrado pueden ser adquiridos en vez de congénitos. Por ejemplo, el tratamiento de quimioterapia, tal como para la leucemia y otros cánceres puede dar por resultado trombocitopenia. Esto es probablemente debido a la
pérdida de la producción de plaquetas en la médula ósea de pacientes que reciben la quimioterapia, y ocurre típicamente 6-10 días después de la medicación. El tratamiento de la trombocitopenia adquirida es usualmente por plaquetas, glóbulos rojos o transfusión de plasma, lo cual sirve para prevenir cualquier hemorragia simultánea anormal que puede resultar de la deficiencia de plaquetas. La hemorragia en pacientes con trombocitopenia inducida por quimioterapia, o cualquier otra trombocitopenia adquirida o congénita, también se puede controlar mediante la administración de cantidad terapéutica de los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este- documento. Por ejemplo, un paciente trombocitopénico con hemorragia descontrolada, tal como en el tracto gastrointestinal, se le puede administrar una inyección de bolo intravenosa de una cantidad terapéutica de polipéptido FVII para detener la hemorragia (Gerotziafas y colaboradores (2002) Am J Hematol 69:219-222). Generalmente, los polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa).
b. Otras coagulopatias
. Otras coagulopatias adquiridas se pueden tratar usando los polipéptidos FVII modificados presentados en este documento. La coagulopatía puede resultar de condiciones que incluyen, pero no se limitan a, falla hepática fulminante
(FHF; tal como la causada por fármacos hepatóxicos, toxinas, enfermedades metabólicas, enfermedades infecciosas e isquemia) otra enfermedad del hígado, que incluye cirrosis y enfermedad asociada con enfermedad de ilson, deficiencia de vitamina K (tal como causada por tratamiento con antibióticos o dieta) , síndrome urémico hemolítico, trombocitopenia trombótica (TTC) y coagulopatía intravascular diseminada (DIC) . El tratamiento convencional es generalmente mediante la transfusión con plasma, glóbulos rojos (RBC) , o plaquetas, pero puede ser no exitosa.. En una modalidad, los polipéptidos FVII modificados se pueden administrar a un paciente con FHF que se someten a procedimientos invasivos para evitar la hemorragia. El tratamiento convencional con plasma congelado reciente (FFP) es frecuentemente no exitoso y puede requerir grandes cantidades de plasma, produciendo sobrecarga de volumen y anasarca (una infiltración generalizada de fluido de edema dentro del tejido conjuntivo subcutáneo). El tratamiento con cantidades terapéuticas de polipéptidos FVII modificados mediante bolo intravenoso durante, después y/o después de la cirugía invasiva, tal como por ejemplo, biopsia de hígado o trasplante de hígado, pueden prevenir la hemorragia y establecer la hemostasis en pacientes con FHF. El paciente se puede supervisar mediante PT de la sangre para determinar la eficacia del tratamiento (Shami y colaboradores
(2003) Liver Transpl 9 : 138-143) . En otra modalidad, el FVII se puede administrar a un paciente con hemorragia grave asociada con la coagulopatia , tal como por ejemplo, hemorragia intra-abdominal grave después de la cesárea asociada con la disfunción del hígado y DIC, que no respondió a las infusiones de ' las transfusiones convencionales (Moscardo y colaboradores (2001) Br J Haematol 113:17 -176). Además, los polipéptidos FVII modificados se pueden usar para tratar una coagulopatia en pacientes neonatales y pediátricos. En una modalidad particular, los pacientes neonatales y pediátricos no responden al tratamiento convencional como, tal como RBC e infusión de plaquetas. Por ejemplo, los neonatos con hemorragia pulmonar grave asociada con PTs incrementado quienes no responden a RBC y la transfusión de . plaquetas se les . puede administrar polipéptidos FVII modificados para disminuir el PT y establecer la hemostasis (Olomu y colaboradores (2002) J Perinatol 22:672-674). Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento exhiben actividad de coagulación mejorada comparados con los polipéptidos FVII no modificados, y se pueden administrar por lo tanto, por ejemplo, en dosis más bajas, menos frecuentemente, y pocas reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados
(FVIIa) .
c . Sangrado adquirido por trasplantes
El sangrado grave después del trasplante de médula ósea (BMT) y trasplante de células madre (SCT) es una complicación relativamente común y que pone en peligro la vida asociada con estos procedimientos, debido a la reducción de las plaquetas. Por ejemplo, la hemorragia alveolar difusa (DAH) es una complicación pulmonar de BMT con incidencia estimada de 1-21% en la población de trasplante, y una tasa de mortalidad de 60-100%. El tratamiento convencional de estos episodios hemorrágicos incluye el tratamiento con corticosteroides y transfusión con plasma, plaquetas y/o RBC, aunque estos son grandemente no. exitosos con una tasa de mortalidad total de aproximadamente 50% (Hicks y colaboradores ' (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). La administración de FVII mediante bolo intravenoso, con o sin tratamiento concurrente con corticosteroides y/o infusión de plaquetas, se puede realizar para tratar la DAH y establecer la hemostasis (Hicks y colaboradores (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento exhiben actividad de coagulación mejorada comparados con los polipéptidos FVII no modificados, y se podrían administrar, por lo tanto, por ejemplo en dosis más bajas, menos frecuentemente, durante una
duración de tratamiento más corto, y con pocas reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológica. Generalmente los polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
d. Sangrado inducido por terapia con an icoagula es
Los pacientes que se someten a terapias con anticoagulantes para el tratamiento de condiciones, tal como tromboembolismo, pueden exhibir episodios hemorrágicos en la administración aguda de anticoagulantes, tal como warfarina, heparina y fondaparinox, o desarrollan trastornos de sangrado como un resultado . del uso a largo plazo de estas terapias. Los tratamientos para episodios hemorrágicos incluyen típicamente la administración de procoagulantes, tal como vitamina K, plasma, FIX . exógeno, y protaminas para neutralizar la heparina. La administración del FVII exógeno también se puede realizar para neutralizar el efecto de los anti-coagulantes , incrementar el PT, aPTT, y/u otros marcadores de coagulación y establecer la hemostasis (Deveras y colaboradores (2002) Ann Inten Med 137:884-888). Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar en tratamientos para controlar los episodios hemorrágicos en pacientes con trastornos de sangrado adquiridos debido a tratamientos con anticoagulantes. Generalmente los polipéptidos FVII
modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
e. Hemofilia adquirida
Los inhibidores del factor VIII pueden desarrollarse espontáneamente en individuos de otra manera sanos, dando por resultado una condición conocida, como "hemofilia adquirida". La hemofilia adquirida es una condición rara, con una incidencia de 0.2-1.0 al año por millón de la población. Los anticuerpos son principalmente anticuerpos IgG4, los cuales, cuando se enlazan a FVIII, inhiben la actividad de FVIII al interferir con la escisión de la trombina, la interacción del factor von illebrand y/o el enlace de fosfolípidos. Esto da por resultado hemorragia que pone en peligro la vida en aproximadamente 87% de pacientes afectados. Los sitios comunes de hemorragia son la piel, la mucosa, músculos y retroperitoneo, en contraste con pacientes con hemofilia hereditaria quienes sangran predominantemente en las articulaciones y músculos. La hemofilia adquirida se puede tratar con un concentrado de complejo de protrombina activado o factor VII activado recombinante (NovoSevenMR, Novo Nordisk) para controlar los episodios hemorrágicos . Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento exhiben actividad de coagulación mejorada comparados con los polipéptidos FVII no modificados, y se puede administrar, por
lo tanto, por ejemplo, en dosis más bajas, menos frecuentes, durante una duración de tratamiento más corto, y con pocas reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológica. Generalmente los polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
3. Sangrado por trauma y quirúrgico
Los polipéptidos FVII se pueden usar como terapia para tratar el sangrado asociado con la pérdida de sangre perioperativa y traumática en sujetos con sistemas de coagulación normales. Por ejemplo, los polipéptidos FVII se pueden administrar a un paciente para promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre asociada con la cirugía, además, reducen el requerimiento de trasfusión de sangre. En una modalidad, los polipéptidos FVII se pueden administrar a sujetos que se someten a la prostatectomía retropúbica. La prostatectomía retropúbica se asocia frecuentemente con pérdida de sangre mayor' y una necesidad subsecuente de transfusión. Los sujetos que se someten a esta cirugía o similar se les puede suministrar un bolo intravenoso de una cantidad terapéutica de FVII en la fase operativa temprana para reducir la pérdida de sangre perioperativa al mejorar la coagulación en el sitio de la cirugía. La reducción en la pérdida de sangre da por resultado la eliminación de la necesidad de transfusión de sangre en estos pacientes
(Friederich y colaboradores (2003) Lancet 361:201-205). Los polipéptido FVII se pueden administrar a pacientes con coagulación normal que se someten a otros tipos de cirugía para efectuar la hemostasis rápida y prevenir la pérdida de sangre. Ejemplos no limitantes de procedimientos quirúrgicos en los cuales el FVII, típicamente administrado en la forma activada (es decir FVIIa) , se puede usar una terapia para reducir en la hemorragia perioperativa incluyen, pero no se limitan a, cirugía de válvula cardíaca (Al Douri y colaboradores (2000) Blood Coag Fibrinol 11 : S121-S127 ) , reemplazo de válvula aórtica (Kastrup y colaboradores (2002) Ann Thorac Surg 74:910-912), resección de hemangiopericitoma recurrente (Gerlach y colaboradores (2002) J Neurosurg 96:946-948), cirugía de cáncer (Sajdak y colaboradores (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23:325-326), y cirugía sobre úlceras duodenales (Vlot y colaboradores (2000) Am J Med 108:421-423) . El tratamiento con FVII puede promover la hemostasis en el sito de la cirugía y reducir o prevenir la pérdida de sangre, reduciendo o aboliendo en consecuencia la necesidad de transfusión. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento son diseñados para exhibir actividad de coagulación mejorada comparados con los polipéptidos FVII no modificados, y podrían ser administrados por lo tanto, por ejemplo, en dosis más bajas, menos
frecuentemente, y con pocas reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos FVII modificados se administran polipéptidos FVII activados (FVIIa) .
Los polipéptidos del factor VII también se pueden usar para promover la coagulación y prevenir la pérdida de sangre en sujetos con lesión traumática. El trauma se define como una lesión al tejido viviente por un agente extrínseco, y es la cuarta causa conducente de muerte en los Estados Unidos. El trauma se clasifica como ya sea trauma cerrado (que da por resultado la compresión interna, daño de órganos y hemorragia interna) , o trauma penetrativo (una consecuencia de un agente que penetra el cuerpo y destruye tejidos, vasos y órganos, dando por resultado hemorragia externa.' El trauma puede ser causado por diversos eventos que incluyen, pero no se limitan a, accidentes vehiculares (que causan trauma cerrado y/o penetrativo) , heridas de disparos de armas (que causan trauma penetrativo) , heridas de apuñalamiento (que causan trauma penetrativo) , accidentes con maquinaria (que causan trauma penetrativo y/o cerrado) , y caídas de alturas significativas (que causan trauma penetrativo y/o cerrado) . La hemorragia descontrolada como un resultado de trauma es responsable de la mayoría de la mortalidad asociada. La coagulopatía difusa es una complicación relativamente común asociada con pacientes con trauma, que ocurre, en tanto como 25-36% de
sujetos. La coagulopatía puede desarrollarse temprano después de la lesión, dando por resultado una variedad de factores tal como dilución y consumo de factores de coagulación y plaquetas, fibrinólisis, acidosis, e hipotermia. El manejo convencional implica, la terapia de reemplazo mediante la transfusión con . plaquetas de plasma congelado reciente (FFP) , RBC y/o crioprecipitados , acidosis de corrección, y tratamiento de hipotermia. Estas etapas son frecuentemente insuficientes para detener la hemorragia y prevenir la muerte. El tratamiento mediante la administración de cantidades terapéuticas de FVII puede promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre en pacientes con trauma. Por ejemplo, un paciente con una lesión de disparo de arma que se presenta con sangrado- masivo, además de la intervención quirúrgica, se le administra FVII para controlar la hemorragia coagulopática (Kenet y colaboradores (1999) Lancet 354:1879). La terapia coagulante con FVII puede reducir efectivamente la pérdida de sangre y la hemorragia en pacientes con trauma cerrado y penetrante. (Rizoli y colaboradores (2006) Crit Care 10. 178). Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se diseñan para exhibir actividad de coagulación mejorada comparados con los polipéptidos FVII no modificados, y se podrían administra por lo tanto por ejemplo, en dosis más bajas, menos
frecuentemente, y con pocas reacciones adversas. Generalmente los polipéptidos FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa).
I . Terapias de combinación .
Cualquiera de los polipéptidos FVII modificados descritos en este documentó se pueden administrar en combinación con, antes de, intermitentemente con, o subsecuentemente a, otros agentes o procedimientos terapéuticos que incluyen, pero no se limitan a, otros agentes biológicos, compuestos de moléculas pequeñas y cirugía. Para cualquier enfermedad o condición, que incluyen todas aquellas ejemplificadas anteriormente, por lo cual el FVII. (que incluye FVIIa y rFVIIa) se indica o se ha usado y por lo cual otros agentes y tratamiento están disponibles, el FVII se puede usar en combinación con los mismos. Por consiguiente, los polipéptidos FVII modificados proporcionados en este documento se pueden usar similarmente . Dependiendo dé la enfermedad o condición que se trata, las combinaciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una combinación con otros factores de coagulación purificados o recombinantes en plasma, procoagulantes, tal como Vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides .
J. Artículos de manufactura y kits
Los compuestos farmacéuticos de polipéptidos FVII modificados o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos FVII modificados, o un derivado o una porción biológicamente activa del mismo se pueden empaquetar como artículos de manufactura que contienen material de empaque, una composición farmacéutica que es efectiva para tratar una enfermedad o trastorno hemostático, y una etiqueta que indica el polipéptido FVII modificado, o molécula de ácido nucleico se va a usar para tratar la enfermedad o trastorno hemostático.
Los artículos de manufactura proporcionados en este documento contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para el uso en los productos farmacéuticos de empaque son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,323,907, 5,052,558 y 5,033,352, cada una de las cuales se incorpora en este documento en su totalidad. Ejemplos de materiales de empaque farmacéuticos incluyen, pero no se limitan a, paquetes de ampollas, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, frasquitos, contenedores, jeringas, botellas, y cualquier material de empaque adecuado para una formulación seleccionada y modo propuesto de administración y tratamiento. Se contempla un amplio arreglo de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionadas en este
documento como son una variedad de tratamientos para cualquier enfermedad o trastorno hemostático.
Los polipéptidos FVII modificados y las moléculas de ácido nucleico también se proporcionan como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en este documento y un articulo para la administración. Por ejemplo un FVII modificado se puede suministrar con un dispositivo para la administración, tal como una jeringa, un inhalador, una copa de dosificación, un gotero, o un aplicador. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para la aplicación que incluyen dosificaciones, regímenes de dosificación e instrucciones para los modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en este documento y un artículo de paradiagnóstico . Por ejemplo, estos kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad del FVII o un sistema regulado por FVII de un sujeto .
Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos únicamente y no se proponen para limitar el alcance de la invención.
K. Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación y expresión de FVII
A. Clonación de FVII
Los nucleótidos que codifican el polipéptido precursor de isoforma FVII humano de 466 aminoácidos (P08709; establecidos en SEQ ID N0:1) se clonaron en el vector de expresión de mamífero, pCMV Script ( Stratagene ; SEQ ID NO: 99) , que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV) . Brevemente, el CBO-125 (SEQ ID NO: 100) y oligonucleótidos CBO-126 (SEQ ID NO: 101) se usaron como cebadores delanteros e inversos, respectivamente, para amplificar la secuencia FVII por PCR usando cADN FVII humano (Invitrogen) como la plantilla. El cebador CBO-125 contenido en un sitio de restricción BamHI (en negrita) , una secuencia Kozak (subrayado doble), seguido por 18 nucleótidos con homología al extremo 5' de la secuencia de cADN FVII (subrayado), que incluye el codón de inicio ATG. El' cabador CBO-126 ' contenido en un sitio de restricción EcoRI (en negrita), un cocón de detención (subrayado doble) y 21 nucleótidos con homología al extremo 3' de la secuencia de cADN FVII (subrayado).
cebador delantero CBO-125
5' catcatqacqtqacggatccqccaccatqqtctcccaggccctc 3'
cebador inverso CBO-126
5' gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3'
La reacción PCR estándar y condiciones de termociclado se usaron en conjunto con el kit KoD HiFi PCR (EMD Biosciences ) , como se recomendó por el fabricante. El producto PCR se digirió con enzimas de restricción BamH I y EcoR I y ligó en los sitios de restricción BamH I. y EcoR I de vector pCMV Script usando técnicas moleculares estándar. El vector se transformó luego en Escherichia coli. Las colonias seleccionadas se cultivaron y células bacterianas cosechadas para purificación del plásmido usando técnicas de biología molecular de rutina.
B. Generación de Variantes FVII
Las variantes FVII se generaron usando el kit de utagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, con oligonucleótidos específicamente diseñados que sirven como cebadores que incorporan una mutación particular en ADN nuevamente sintetizado. El método QuikChange implica amplificación lineal de ADN de plantilla por la polimerasa de ADN de alta fidelidad PfuUltra. Los cebadores complementarios que incluyen la mutación deseada se extendieron durante el ciclo usando vector pCMV Script superenrollado de hebra doble, purificado que contenía la secuencia de cADN FVII clonada como
una plantilla. La extensión de los cebadores resultó en la incorporación de la mutación de interés en las hebras nuevamente sintetizadas, y resultó en un plásmido mutado con puntos críticos escalonados. Después de la amplificación, el ácido nucleico se trató con Dpn I, que digiere las hebras parentales dam-metiladas del vector pCMV Script derivado de E. coli. Esto resultó en "selección" de los plasmidos mutados nuevamente sintetizados, que no se metilaron. El ADN del vector que contiene las mutaciones deseadas se transformaron en células de E. coli ultracompetentes XLIO-Gold, donde la ligasa bacteriana reparó los bastoncillos y permitió que se produjera replicación normal .
La Tabla 13 abajo establece las variantes FVII que se generaron. En algunas instancias, las variantes FVII se generaron en las cuales una secuencia de enlace para integrina de plaqueta a?¾ß3 se insertó en varias regiones del polipéptido FVII. Una de las tres diferentes secuencias de enlace de integrina cmbp3 se insertaron: SFGRGDIRNV (SEQ ID NO: 110); CSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 111); o GGGSCSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 112) . Las secuencias de enlace de integrina a¾ß3 se insertaron en la terminal C del polipéptido FVII después del residuo de aminoácido P406 al numerar FVII maduro, o insertar por eliminación y reemplazo de residuos de aminoácido FVII S103 a Slll, H115 a S126 o T127 a P134 al numerar FVII maduro. Otras
variantes FVII en las cuales una secuencia de enlace de albúmina de suero se insertó también se generaron. Estas variantes FVII contenían una de siete diferentes secuencias de enlace de albúmina de suero:
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 103), IEDICLPRWGCLWE (SEQ ID NO: 104), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 105), IEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 106), GGGSIEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 107), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 108), o GGGSDICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 109). Las secuencias de enlace de albúmina de suero se insertaron en la terminal C del polipéptido FVII después del residuo de aminoácido P406 al numerar FVII maduro, o insertar por eliminación y reemplazo de residuos de aminoácido FVII S103 a Slll, H115 a S126 o T128 a P134 al numerar FVII maduro. Las variantes FVII "Gla Intercambio FIX" (esto es, un polipéptido FVII en el cual el dominio Gla endógeno se ha reemplazado con el dominio Gla de FIX) contienen residuos de aminoácido Yl a Y45 de SEQ ID NO: 83 en la terminal N. En algunos ejemplos, las variantes "Gla Intercambio FIX" contienen una o más sustituciones de aminoácido en la porción de dominio Gla FIX. Las mutaciones que están en la porción de dominio Gla FIX se encierran en llaves y se hace referencia usando posiciones de aminoácido que corresponden a las posiciones de aminoácido de un polipéptido FIX tipo silvestre maduro, o el dominio FIX Gla tipo silvestre establecido en SEQ. ID NO:83. Por ejemplo, {Gla
Intercambio FIX/M19K} significa que el polipéptido FVII modificado contiene un dominio Gla FIX heterologo en el cual la metionina en la posición 19 del dominio Gla FIX establecido en SEQ ID NO: 83 se reemplaza con una lisina. En la Tabla 13 abajo, los residuos de aminoácido en los cuales la integrina de plaqueta a¾ß3 o secuencia de enlace de albúmina de suero se inserta en el polipéptido FVII, y la secuencia de aminoácido de la secuencia de enlace, se representan ambos. Por ejemplo, H115S126delinsQRLMEDICLPR GCL EDDF indica que los residuos de aminoácido H115 thru S126 se han eliminado y reemplazado con una secuencia de enlace de albúmina de suero con la secuencia de aminoácido QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 103).
Tabla 13. Variantes de Factor VII
Variante Vanante SEQ ID NO (numeración de FVII maduro (Numeración de quimotripsina) de poli- péptido FVII
T128N/P129A T[1281N P[1291A 222
Q66N Y68S Q[66]N/Y[68]S 223
S52N/P54S/A122N/G124S E394N/ S[52]N/P[54]S/A[122]N/G[124]S
P395A/R396S E245N/P246A/R247S 224
K109N/A292N/A294S [K109N1 /A150N/A152S 225
K109N/A175S [K109N] /A39S 226
V 158T/L287T/M298K V21T/L144T/MI 56K 256
V158D L287T M298K V21D/L144T/M156K 257
S103S11 1 delinsQRLMEDICLPRW S[103]S[11 l]delinsQRLMEDICLP
GCLWEDDF RWGCLWEDDF 227
Hl 15S126delinsQRLMEDICLPRW H[l 15]S[126]delinsQRLMEDICL
GCLWEDDF PRWGCLWEDDF 228
T 128P 134delinsQRLMEDICLPRW T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP
GCLWEDDF RWGCLWEDDF 229
S 103 S 11 1 delinsIEDICLPRWGCL S[103]S[1 1 l ]del¡nsEEDICLPRWG
WE CLWE 230
Hl 15S 126delinsIEDICLPRWGCL H[l 15]S[126]delinsIEDICLPRWG
WE CLWE 231
T 128P 134delinsIEDICLPRWGCL T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG
WE CLWE 232
SI 03 SI 1 IdelinsDICLPRWGCLWE S[103]S[1 1 l]delinsDICLPRWGC
D LWED 233
H115S126delinsDICLPRWGCLWE H[l 15]S[126]delinsDICLPRWGC
D LWED 234
T 128P 134delinsDICLPRWGCLWE T[l 28]P[ 134]delinsDICLPRWGC
D LWED 235
P406insIEDICLPRWGCLW P257insIEDICLPRWGCLW 236
P406insGGGSIEDICLPRWGCLW P257insGGGSffiDICLPRWGCL
W 237
P406insDICLPRWGCLWED P257insDICLPRWGCLWED 238
P406insGGGSDICLPRWGCLWED P257insGGGSDICLPRWGCLWE
D 239
S 103S1 1 1 delinsSFGRGDIRNV S[103]S[1 1 l]delinsSFGRGDIRNV
240
H115S126delinsSFGRGDIRNV H[l 15]S[126]delinsSFGRGDIRN
V 241
T 127P 134delinsSFGRGDIRNV T[ 128]P[ 134]delinsSFGRGDIRNV
242
P406insCSFGRGDIRNVC P257insCSFGRGDIRNVC 243
P406insGGGSCSFGRGDIRNVC P257insGGGSCSFGRGDrRNVC 244
Gla Intercambio de FIX S222A Gla Intercambio de FIX/S82A 245
Gla Intercambio de FIX/H257A Gla Intercambio de FIX/H117A 246
Gla Intercambio de FIX/S222A/H257A Gla Intercambio de FIX/S82A/H117A 247
S222A/M298Q S82A/M156Q 248
H257A/M298Q H1 17A/M156Q 249
S222A/H257A/M298Q S82A/H1 17A/M1560 250
S222A/A292N/A294S/Q366V S82A/A150N/A152S/Q217V 251
A175S/S222A/Q366V A39S/S82A/Q217V 252
C. Expresión de polipéptidos FVII
Para análisis de expresión inicial por ELISA y técnica
Western blot, los polipéptidos FVII se expresaron en células BH -21. Para ensayos bioquímicos, tal como aquellas descritas abajo, los polipéptidos FVII se expresaron en células Freestyle™ 293-F (Invitrogen) .
El polipéptido Factor VII tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) y polipéptidos FVII variantes se expresaron inicialmente en la linea de célula de riñon de hámster bebe BHK-21 (ATCC CRL 1632). Las células BHK-21 se cultivaron en Eagle ' s medio esencial mínimo (EMEM, Invitrogen) con 10% de suero de bovino
fetal (FCS) en placas de cultivo lOOmm a 37°C y C02 al 5%. Después del crecimiento a aproximadamente 90% de confluencia, las células se transíectaron con 24 pg de ADN de plásmido FVII usando el kit de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El medio se reemplazó 6 horas después de la transfección con EMEM sin suero que contiene vitamina Kl 1 vg/ml (Sigma) y las células se incubaron durante 72 horas adicionales. La expresión de FVII en el medio de cultivo celular se probó por ELISA o Manchado Western.
Para análisis posterior usando ensayos bioquímicos, el polipéptido Factor VII tipo silvestre (SEQ ID NO: 3) y polipéptidos FVII variantes se expresaron en células Freestyle™ 293-F (Invitrogen). Las células se cultivaron en medio Freestyle™- 293 (Invitrogen) a 37°C y C02 al 8% en matraces Erlenmeyer con tapas de ventilación. Las células se transíectaron usando el. protocolo sugerido por el fabricante. Brevemente, después del crecimiento a 1 x 10 células/ml, las células se centrifugaron y el medio se intercambio. Las células luego se transíectaron con 240 pg de ADN de plásmido FVII para cada 240 mi de células usando 293 fectina (Invitrogen). Además, 50 µ? de una solución de reserva 1 mg/ml de Vitamina K) (Sigma) en etanol se agregó para cada 240 mi de células. Las células se cultivaron durante 5 días
luego el sobrenadante de cultivo se cosechó. La expresión de FVII en el medio de cultivo celular se probó por ELISA.
En algunos ejemplos, polipéptidos FVII variantes y tipo silvestre se expresaron en células CHO-Express (CHOX) (Excellgene) . Las células CHO Express (CHOX) se mantuvieron en medio Completo DM202 (SAFC BioSciences) y usaron para inocular cultivos de producción de semilla. Los cultivos de semilla se cultivaron a 5 x 106 células viables/mL y aproximadamente 60 mL se usó para inocular aproximadamente Medio completo 0.6 L DM202 (densidad de inoculación es 0.4 x 106 vc/mL) para generar un cultivo de producción. Este cultivo de producción se cultivó durante 4 dias para alcanzar 8-12 x 106 vc/mL en el día de la transíección . Un complejo de transfección se formó usando ADN plásmido Factor VII (6 mg) y 23.1 mg de Polietilenimina (PEI). El complejo de transfección se diluyó luego en 0.5 L de medio de transfección Opti-MEM libre de suero ( Invitrogen ) , que se agregó al cultivo de producción 0.6 L. Después de 5 horas de transfección el cultivo se diluyó además con medio ProCH05 ~1 L (Lonza) complementado con 8 mM L-glutamina y 4 mg/L Vitamina Kl . El cultivo en el matraz de agitación 2.2L se permitió expresar durante 5 - 7 dias antes de cosechar el Factor VII crudo. Los sobrenadantes de cultivo se cosecharon luego por filtración y FVII se purificó.
La expresión de una de las variantes FVII (Q286R/M298Q) se realizó en una linea celular estable. Esta linea- se generó en Excellgene (Monthey, Valais, Switzerland) por la transfección de células CHOX. Brevemente, las células se cultivaron en la presencia de metotrexato, luego se fijaron en places por limitación de dilución en 1 célula por pozo en placas de 96 pozos. Los clones que producen los niveles más altos de variante FVII se determinaron por ELISA. Un clon (clon 52) se sub-clonó por una segunda dilución de limitación y se fijo en placas en placas de 96 pozos. Las colonias se cultivaron en 37°C en medio D 204A (SAFC BioSciences ) , complementado con 8 mM L-glutamina, cisteina 1 mM, vitamina Kll mg/L. Veinticuatro clones se encontraron que tienen mayores niveles de expresión Q286R/M298Q, por análisis ELISA, que el clon original 52. Estos 24 clones se expandieron además en placas de 6 pozos durante 6 días de crecimiento, seguido por crecimiento en matraces de agitación 40 mL durante cuatro días. Cada etapa de crecimiento se hizo a 3 °C en medio D 204A, complementado como arriba. Después de los cuatro días de crecimiento, clones se congelaron en 1 x 107 células viables/mL. Los niveles de Q286R/ 298Q producidos por cada clon se determinaron por ELISA. El clon 5F7 fue el mayor productor, típicamente generando 25 - 35 mg/L Q286R/M298Q.
1. ELISA
Se usó un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de FVII humano y FVIIa en una muestra. Los anticuerpos policlonales para FVII humano se usaron para capturar y detectar la proteasa en la solución. El inmunoensayo se puede usar para determinar concentración de proteina de medio condicionado o una solución de reserva purificada o para determinar la concentración de FVII en otra muestra, por ejemplo, una muestra de plasma de ratón o humano'. La concentración de linea base de FVII en sangre humana es aproximadamente 50 nM y la forma enzimáticamente activa, FVIIa, es aproximadamente 1 nM.
Para determinar la cantidad de FVII humano o proteina FVIIa en las muestras se realizó un ELISA tipo sandwich. Inmuno placas Maxisorp de fondo plano de noventa y seis pozos (Nunc) se recubrieron con 100 µ?/???? de 5 ng/µ? avidina (NeutrAvidin, Pierce Biotech. ) . Las placas se cubrieron e incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) después de enjuagar cuatro veces en PBS con 0.01% Tween-20 (PBST) . Las placas se bloquearon durante un mínimo de 1 hora a TA con agitación por incubación con albúmina de suero de bovino 1% (BSA) (p/v) en PBS agregado a cada pozo en 200 µ?/????. Las placas bloqueadas se almacenaron luego a 4°C hasta su uso (hasta 2 semanas) .
Antes de usar, las placas se lavaron cuatro veces en PBST para remover el BSA, y 100 µ?/???? de una solución 1 ng/µ? de anticuerpo anti-Factor VII biotinilado (R&D Systems) se agregó a cada pozo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos con agitación para permitir la formación de complejos con la avidina recubierta. El exceso de anticuerpo no enlazado se removió al lavar la placa con PBST (cuatro veces) .
Diluciones dobles en serie de un FVII estándar (American Diagnostica; diluido en PBST), varían desde 50 ng/µ? hasta 0.8 ng/µ?, se agregaron a la placa en 100 µ?/placa. Una placa que contiene PBST sin ningún FVII también se incluyó- como una solución amortiguadora solamente de control. Para muestras purificadas de ensayo (antes y después de la activación, ver Ejemplo 3) de FVII o FVIIa, la muestra se diluyó primero 1:25 en PBST, y luego se hicieron diluciones 2 veces en serie de modo que se probaron diluciones de 25 veces, 50 veces, 100 veces y 200 veces. Las muestras diluidas se agregaron a los pozos en duplicado en 100 µ?/????. Para muestras de plasma de ensayo que contienen FVII o FVIIa, la muestra de plasma se diluyó 1:100 y 1:400 en PBST y se agregó a los pozos en duplicado en 100 µ?/????. Una muestra de plasma sin FVII o FVIIa también se incluyó para determinar niveles de base. Las placas se incubaron luego durante 30 minutos a TA con agitación para permitir cualquier FVII o FVIIa en la muestra a complejo con el
anticuerpo anti-FVII.
Después de la incubación con muestra, las placas se lavaron 4 veces con PBST. Un anticuerpo secundario, FVII antihumano de Equino o FVII anti-humano monoclonal de Murino (American Diagnostica), se diluyó 1:5000 en PBST y se agregó a cada pozo en un volumen de 100 µ?. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación para permitir al anticuerpo agregado enlazar a los complejos FVII o FVII en la placa. Para remover el exceso, las placas se lavaron con PBST (4 veces) . Para detectar el anticuerpo secundario de enlace, 100 µ? de conjugado HRP anti-equino de cabra en una dilución 1:5000 en PBST, o 100 µ? de conjugado HRP anti-ratón de cabra en una dilución .1 : 20 , 000 en PBST se agregó a cada pozo. Después de la incubación ¦ durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación, las placas se lavaron cuatro veces con PBST y 100 µ?/???? de una solución que contiene una mezcla 1:1 de sustrato TMB y se agregó solución de peróxido de hidrógeno (Pierce Biotech.). Las placas se agitaron durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente antes de la adición de 100 µ?/???? de H2S04 2M para detener la reacción. La densidad óptica en 450 nm se midió usando un lector de Placa 5 de Dispositivo Molecular y el valor de base para la placa (medido con PBST solamente) se restó del valor medido de cada pozo. Una curva estándar se generó al trazar la concentración de
los estándares FVII contra la absorbancia. Un rango de curva estándar de alrededor de 0.2 - 50 ng/ml se generó típicamente bajo las condiciones ELISA anteriores. La concentración de cada muestra se determinó luego usando la curva estándar y multiplicando por el factor de dilución, y se reportó una desviación estándar promedio.
2. Manchado Western
La expresión de FVII en medios de cultivo celular también se probó por manchado Western. Las alícuotas que contienen la muestra no diluida, o dos diluciones 2 veces en serie en PBS, del medio de cultivo celular de células transfectadas FVII (BHK-21 o células CHOX) se etiquetaron Conc. 1 (no diluido), Conc. 2 (dilución 2 veces) y Conc. 3 (dilución 4 veces). Las muestras se cargaron en un gel de SDS page junto a 10, 25, y 50 nanogramos de plasma de control purificado rFVII (American Diagnostica) . La proteína FVII producida por células BHK-21 o CHOX se detectó por manchado Western usando un anticuerpo anti-FVII de equino policlonal primario (American Diagnostica; usado en la concentración sugerida por el fabricante) y un anticuerpo secundario IgG anti-equino conjugado HRP (una dilución 1:2000 de solución 1 mg/ml de Zymed Laboratories) . En algunos ejemplos, el FVII se detectó por manchado Wester usando un anticuerpo Factor Vlla anti-humano de conejo primario (Hematologic Technologies) y un anticuerpo secundario IgG anti-conejó conjugado HRP
(Invitrogen) . La comparasion de niveles de expresión se hizo con el plasma de control purificado rFVII. Los resultados muestran que las concentraciones varían desde alrededor de 20 ng hasta más de 50 ng de FVH se presentó en las alícuotas de cultivo celular.
Ejemplo 2
Purificación y activación de polipéptidos FVII
Los polipéptidos FVII se purificaron usando un Flujo Rápido de Sefarosa Q, o columna CaptoQ (GE Healthcare) , a cuyos polipéptidos FVII con dominios Gla funcionales adsorberá, seguido por una etapa de elución de calcio. Típicamente, el sobrenadante de cultivo de lo transfectado se diluyó 2 veces con una solución que contiene 20 mM Tris pH 8.0 y 0.01% Tween 20, y luego 500 mM EDTA pH '8.0 se agregó a la muestra diluida a una concentración final de 1.5 mM. Las muestras se filtraron antes de que se caragaran sobre el Flujo Rápido de Sefarosa Q o columna CaptoQ, que se ha pre-equilibrado primero con Solución amortiguadora B (20 mM Tris pH 8.0, NaCl 1 M, 0.01% Tween 20), luego Solución amortiguadora A (20 mM Tris pH 8.0, NaCl 0.15 M, 0.01% Tween 20) . Después de que se cargó, la columna se lavó con Solución amortiguadora A hasta que la absorbancia del flujo a través de 280 nm alcanzó una línea base. La Solución amortiguadora A se reemplazó con Solución amortiguadora C (20 mM Tris pH 8.0, NaCl 0.15 M, 0.01% Tween 20, 5 mM CaCl2) y se
realizó un lavado de bomba para reemplazar completamente la solución amortiguadora en las lineas. Una vez finalizado el lavado de bomba, se aplicó Solución amortiguadora C a la columna en 8 ml/min para eluir los polipéptidos FVII, que se colectaron en fracciones. Después de la elución, la columna se lavó con Solución amortiguadora B mientras todavía se colectaron las fracciones, hasta que el- pigmento rosa (de los medios de cultivo) se lavó completamente de la columna. La columna se lavó luego con Solución amortiguadora A para re-equilibrar esto para re-usar.
Las fracciones eluidas se purificaron además usando una columna Mono Q o QHiTrap (GE Healthcare) , que se pre-equilibró inicialmente con Solución amortiguadora B, y luego con Solución amortiguadora A. Las fracciones colectadas con solución amortiguadora C anteriores, que contienen FVII, se agruparon y diluyeron 2 veces con Solución amortiguadora A, antes de EDTA, pH 8.0 se agregó a una concentración final de 40 mM. Pequeñas alícuotas (por ejemplo, ???µ?) se tomaron opcionalmente en este punto para análisis, tal como por ELISA. La muestra combinada se cargó sobre la columna Mono Q (o QHiTrap) , luego se lavó con Solución amortiguadora A. Para eluir los polipéptidos FVII de enlace, un ¦ gradiente de 0% hasta 30% de la Solución amortiguadora B se corrió a través de la columna y las fracciones se colectaron. La columna se lavó luego con Solución
amortiguadora B seguido por Solución amortiguadora A para re-equilibrar para re-usar.
En algunos ejemplos, después de la primera columna Capto Q, las fracciones agrupadas fueron solución amortiguadora intercambiada por diafiltración a Solución amortiguadora D (20 mM MES, pH 6.0, CaC12 10 mM, NaCl 0.1 M, 0.01% Tween 20) luego cargadas sobre una columna SP-HP que se ha pre-equilibrado con Solución amortiguadora D. Después de lavar con Solución amortiguadora D, un gradiente de NaCl 0.1 M hasta NaCl 1.0M se aplicó a la columna y las fracciones se colectaron. Las Fracciones que contienen FVII se ajustaron luego a pH 8.0 y diluyeron 2 veces en Solución amortiguadora E (20 mM Tris, pH 8.0, CaC12 10 mM, 0.01% Tween 20) y aplicaron a una columna Q H-HP que se ha pre-equilibrado con Solución amortiguadora E. Esta columna se lavó luego con Solución amortiguadora E y el FVII se eluyó por un gradiente de NaCl 0 - 1M en Solución amortiguadora E .
Los polipéptidos FVII purificados se activaron a FVIIa usando Factor Xa biotinilado del kit de Remoción y Escisión de Factor Xa de Proteasa de Restricción (Roche) . Típicamente, 7 fracciones de la purificación Mono Q se agruparon en un tubo cónico 15 mi y se agregaron 388 µ? de CaCl2 500 mM, 38.9 µ? de BSA 10% en agua destilada, y 3.2 µg de Factor Xa biotinilado. Después de la incubación durante 14-16 hrs a 37 °C, 250 µ? de
Avidina Inmovilizada (Pierce) se agregó y la muestra se mezcló a 4°C durante 30 minutos. La solución resultante se filtró luego a través de una columna Econo-pak (Bio-Rad) , y el filtrado se mezcló con otro 250 µ? de Avidina Inmovilizada durante 30 minutos adicionales. La solución se filtró nuevamente y el filtrado se concentró a aproximadamente 300-500 µ? usando un filtro Amicon Ultra-4 lOkDa filtro centrifugo (Millipore.) . La concentración FVIIa se analizó luego por ELISA (como se describió en el Ejemplo l.C.l) y el nivel de la activación del Factor VII se vigiló por manchado Western. El manchado Western se realizó esencialmente como se describió en el Ejemplo 1.C.2, sino que por el contrario usando anticuerpo de Factor Vlla antihumano de conejo (Haematologic Technologies, Inc.) en 1:2000 durante 1 hr como el anticuerpo primario, seguido por IgG Anti-Conejo de Cabra HRP (H+L) (Invitrogen) en 1:5000 durante 30 minutos.
Ejemplo 3
Determinación de la concentración de Proteasa Catalíticamente
Viable en una Solución
La concentración de FVIIa catalíticamente viable en una solución de reserva se ' determinó al triturar un complejo de Factor Vlla y Factor de Tejido soluble (sTF) con un inhibidor de péptido irreversible de FVIIa, Phe-Phe-Arg-Clorometilcetona
(FFR- CMK) . El inhibidor se enlaza a FVIIa pero no a FVII. La incubación extendida en una alta concentración de FVIIa (50 nM) asegura titulación completa de la proteasa. La actividad residual del complejo FVIIa/TF después de la incubación con FFR-CMK se midió para determinar la concentración de FVIIa catalíticamente viable en la solución de reserva original.
La placa de ensayo de la mitad de área clara de 96 pozos (Nunc) se pre-trató al agregar 150 µ?/???? de 1 x solución amortiguadora de placa (100 mM Tris pH 8.4, NaCl 100 mM, BSA 0.01%, Tween-20 0.01%) a cada pozo e incubar la placa a 37°C durante 1 mínimo de 1 hora. La solución amortiguadora se removió completamente por manchado en una toalla de papel y se centrifugó la placa al revés para remover cualquier solución amortiguadora restante,, y la placa se secó al aire durante 1 hora y almacenó cubierta a temperatura ambiente (TA) .
. Para preparar la mezcla de reacción FVIIa/sTF/FFR-CMK, una solución de reserva FVIIa (American Diagnostica; diluida a 5 µ? en glicerol al 50% (v/v) y almacenada fría en alícuotas a -20°C) o una variante FVIIa se diluyó primero a 500 nM en solución amortiguadora de ensayo . directo 1 x (100 mM Tris pH 8.4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0.01%). La mezcla FVIIa/sTF se hizó luego al mezclar 90 µ? de agua destilada con 36 µ? solución amortiguadora de ensayo directo 5 x, 18 µ? FVIIa 500 nM, y 18 µ? sTF 5 µp? (Factor III de Coagulación humano recombinante/factor
de tejido soluble; R&D Systems; la solución de reserva usada fue 19.6 µ? en glicerol al- 50% y se diluyó a 5 µ? en solución amortiguadora de ensayo directo 1 x y almacenó hasta dos semanas a 4°C). Los componentes se permitieron luego para complejo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Una solución de reserva de 10 mM FFR-CMK (BaChem) en DMSO (almacenada a -20°C) se diluyó en agua a 3.5 µ?. Usando una fila de una placa de almacenamiento opaca de polipropileno (Costar) , diluciones dobles en serie en agua del FFR-CMK se hicieron a través de 11 pozos de una placa opaca.de 96 pozos, con el último pozo de la fila que contiene solamente agua como un control. Esto es la solución en serie de inhibidor 10x FFR-CMK. En cada pozo de una fila de la placa de ensayo de la mitad de área clara de 96 pozos pre-tratada, 10.8 µ? de la mezcla FVIIa/sTF se agregó, seguido por 1.2 µ? de las series de inhibidor lOx FFR-CMK. Las soluciones se mezclaron bien y la placa se centrifugó a <3000 rpm durante 5 minutos para remover las gotas en los pozos. La placa se cubrió e incubó durante 8 horas a 37 °C.
Para el análisis de la actividad residual del complejo FVIIa/TF, una mezcla del sustrato de Espectrozima FVIIa (American Diagnostica, #217L; solución de reserva reconstituida de vial 50 µ?t???? en 5 mL de agua destilada a 10 mM y almacenada a 4°C) y solución amortiguadora directa 5X (500 mM Tris pH 8.4,' NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM y BSA 0.05%) primero se preparó al
mezclar 360 µ? solución amortiguadora de ensayo directo 5 x con 180 µ? de una solución 10 mM de FVIIa Espectrozima y 1080 µ? de agua. A cada pozo de la placa de ensayo, 108 µ? de la solución de sustrato preparada se agregó. Los pozos se mezclaron y la placa se incubó a 37 °C. El incrementó en absorbencia a 405 nm se midió cada 30 segundos durante una hora a 37 °C en un lector de placa Spectramax Gemini M5 de Dispositivos Moleculares.
Usando software SoftMax Pro (Dispositivos Moleculares), las velocidades de absorbancia se midieron y la . actividad fraccional de proteasas incubadas con un inhibidor se determinó al dividir la velocidad medida por la velocidad de la proteasa no inhibida. La actividad fraccional se gráfico contra la concentración de FFR-CMK, y los puntos que fueron >90% o <10% de la actividad no inhibida se descartaron. Una linea luego se dibujaron a través de los puntos restantes para determinar la intercepción x, que representa la concentración de proteasa activa en la solución. El valor de ensayos múltiples se midió y promedió y la desviación estándar se determinó.
Ejemplo 4
Determinación de la actividad catalítica de FYIIa para su sustrato, Factor X
La actividad catalítica de las variantes FVIIa para su sustrato, Factor X (FX) , se evaluó indirectamente en un ensayo
fluorogénico al evaluar la actividad de FXa, generado sobre la activación por FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa. A. Actividad catalítica dependiente de TF de FVIIa tipo silvestre para su sustrato, Factor X
La actividad catalítica dependiente de TF de FVIIa tipo silvestre se evaluó en un ensayo fluorogénico en el cual una forma lipidada de factor de tejido perificado (TF) se incluyó para proporcionar actividad óptima de FVHa . La actividad de enzima de FXa para Spectrafluor FXa (CH3S02-D-CHA-Gly-ATg-AMC.AcOH) se determinó, al medir el incrementó en absorbancia del fluoroforo libre generado, AMC (7-amino-4-metilcoumarina) , como una función de tiempo.
Brevemente, el polipéptido FVIIa tipo silvestre se diluyó inicialmente a 0.5 µ? en solución amortiguadora de ensayo 1 x (100 mM Tris pH 8.4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 m , y BSA 0.01%), entonces se diluyó además a 0.1 nM en solución amortiguadora de ensayo. La longitud completa lipidada TF (Innovin; Dade Behring) se reconstituyó en agua 20 mL para hacer una solución 3 nM y diluyó a 0.2 nM en solución amortiguadora de ensayo 1 x. Cuatrocientos µ? de FVIIa 0.1 nM se mezcló con 400 µ? TF 0.2 nM e incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución se diluyó además por dos, diluciones 2 veces en solución amortiguadora de ensayo 1 x que contiene TF 0.2 nM para obtener un total de tres
diluciones FVIIa de 0.05 nM, 0.025 nM, o FVIIa 0.0125 nM cada uno que contiene TF 0.2 nM (soluciones FVIIa/TF) .
El sustrato, Factor X (FX; American Diagnostica; 80 pg) se reconstituyó en agua destilada 135.6 µ? para dar una solución de reserva 10 µ? y almacenó en alícuotas a -80°C. En alícuotas no se congelaron y descongelaron más de una vez. La solución de reserva FX se diluyó a 800 nM en solución amortiguadora de ensayo directo, luego se diluyó en serie 2 veces para obtener soluciones FX que varían desde 800 nM hasta 50 nM.
El Spectrofluor Xa (American Diagnostica; 10 pmoles) se reconstituyó en agua destilada a 5 mM y almacenó a 4°C. A una placa de ensayo de la mitad de área negra de 96 pozos (Costar) , 5 µ? Spectrofluor Xa (American Diagnostica) se agregó a cada pozo. Entonces, 25 µ? de la solución FX se agregó a cada pozo. A la última fila de pozos de la placa, un control negativo en el cual no se agregó FX también se incluyó en el ensayo. Por duplicado, las tres concentraciones de las soluciones TF/FVIIa se agregaron en 20 µ? a pozos de columnas respectivas de la placa de modo que cada dilución TF/FVIIa se probó contra cada dilución FX, con un' conjunto de columnas que no contiene TF/FVIIa agregado (esto es, solo FX) . Las placas se mezclaron al agitar. La fluorescencia se midió durante un plazo con un espectrofluorometro establecido
para leer cada 30 segundos durante 1 hora a 37°C (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, De corte: 435 nm) , y el tiempo se reportó en unidades de tiempo al cuadrado. Después del ensayo, una curva estándar de fluorescencia AMC en el mismo lector de placa se generó para cubrir de unidades de fluorescencia a sustrato uM liberado en el ensayo. Un AMC 1 mM en DMSO (Invitrogen) se diluyó a 0.02 mM en solución amortiguadora de ensayo lx. Seis, diluciones en serie dos veces del AMC se hicieron que varían desde 20 nM hasta 0.625 nM en solución amortiguadora de ensayo 1 x. La fluorescencia del AMC se midió usando las mismas condiciones de ensayo como se describió anteriormente y una gráfica de fluorescencia contra concentración de AMC se trazó. La pendiente de la línea se calculó, lo cual sirvió como el factor de conversión para RFU a µ? en cálculos siguientes.
Las constantes cinéticas para activación FVIIa. de FX se calcularon al realizar análisis de regresión lineal en el inverso de la concentración sustrato contra el inverso de la velocidad de escisión de sustrato (en unidades de segundos2) , con Vmax; Fvna . calculado como el inverso de la intercepción y, Km, Fvna como la pendiente en la intercepción y, y Vmax / K
E-viia como el inverso de la pendiente. El valor kcat se derivó luego usando la ecuación;
kcat/ m, . rviia = Vmax/Km, rviia x 1/(0.5 x k2 x [FVIIa en µ?]
x (RFU/µ? factor de conversión) )
donde; k2 = ( [S] x kcat, Fxa)/( m, FXa + [S]), donde kcat, FXa y Km, Fxa son las constantes para escisión de FXa de EspectrofluorXa determinado experimentalmente usando estándares FXa como kca , FXa = 117 seg"1, y Km, FXa = 164 µ?.
Usando las condiciones de ensayo anteriores, la constante cinética k2 se determinó para ser 88.1 seg"1.
El Kra y kcat para cada una de las variantes FVIIa se determinó para evaluar la actividad catalítica, kcat/Kra (M~ 1seg"1) de cada uno para su sustrato, FX (Tabla 14) . La proteasa FVIIa tipo silvestre se evaluó y se encontró para exhibir una actividad de 1.8 x 107 "1 seg"1. La activación del Factor Vlla de Factor X, como se midió por Krishnaswamy, et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273:8 4378-86) es 2.9 X 107 M_1seg~
B. Análisis de la actividad catalítica de variantes FVIIa para el sustrato, Factor X
La actividad catalítica de las variantes FVIIa para el sustrato, Factor X (FX), se evaluó indirectamente en dos tipos de ensayos cromogénicos al evaluar la actividad de FXa, generado sobre la activación por FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa. Los dos ensayos se realizaron ya sea en la presencia o la ausencia de factor de tejido lipidado, para evaluar tanto la actividad dependiente TF como
la independiente TF. Las variantes FVII se expresaron, purificaron y activaron a FVIIa como se describió anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Aunque la mayoría de las variantes FVII se expresaron solamente en células Freestyle™ 293-F, también algunas se expresaron en células BH -21.
Factor de tejido lipidado-ensayo indirecto dependiente La actividad catalítica de las variantes FVIIa en la presencia de factor de tejido se evaluó usando el ensayo descrito en la sección A del Ejemplo 4, anterior, con menores modificaciones. Tal modificación fue el uso de una protease de sustrato de Factor X que se ha tratado con ERG-CMK y FFR-CMK para reducir la actividad de fondo (Molecular Innovations) . Dos tipos de análisis de datos se realizaron usando dos ensayos separados; un ensayo de análisis de rango lineal y un ensayo de análisis de rango hiperbólico. El ensayo de análisis de rango lineal usa un rango de concentraciones de Factor X entre 0 y 150 nM para asegurar medición exacta de las constantes cinéticas en el rango lineal de la curva de .dosis. En contraste, el ensayo de análisis de rango hiperbólico usa un rango de concentraciones de Factor X entre 0 y 1.44 µ? para asegurar medición exacta de las constantes cinéticas con una curva de dosis (hiperbólica) de saturación .
El ensayo indirecto de factor de tejido lipidado con análisis de datos de rango lineal se realizó esencialmente como
se describió en la sección A del Ejemplo 4, anterior, con las siguientes modificaciones. La variante FVIIa/soluciones TF se prepararon como soluciones FVIIa 0.1 nM/TF 0.4 nM e incubaron durante 30 minutos antes de que se diluya dos veces en TF 0.4 nM abajo a una solución que contiene 1.5625 pM FVIIa/TF 0.4 nM. Veinticinco µ?, de la solución FVIIa/TF se mezcló con 25 yL de una solución de sustrato que contenia 1.0 mM Spectrofluor FXa (American Diagnostica) y uno de 300 nM, 200 nM, 133.3 nM, 88.9 nM, 59.3, 39.5 nM, 36.3 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) . Asi, las concentraciones finales para el ensayo fueron FVIIa 0.8 pM, TF 0.2 nM, 0.5 mM Spectrofluor FXa y 150 nM, 100 nM, 66.7 nM, 44.4 nM, 29.6 nM, 19.8 nM, 13.2 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) en 50 yL/pozo. La curva estándar AMC, que sirve como el factor de conversión para RFU hasta µ? en cálculos posteriores, se amplió para incluir un rango de dosis que cubrió desde 0 µ? hasta 100 µ? AMC.
El ensayo indirecto de factor de tejido lipidado con análisis de datos de rango hiperbólico se realizó esencialmente como se describió en la sección A del Ejemplo 4, arriba, con las siguientes modificaciones. La variante FVIIa/soluciones TF se prepararon como soluciones FVIIa 0.1 nM/TF 0.4 nM e incubaron durante 30 minutos antes de que se diluya dos veces en TF 0.4 nM de hasta 1.5625 pM (o 0.78 pM para proteasas esperadas para tener actividad alta) FVIIa/TF 0.4 nM. Veinticinco pL de la
solución FVIIa/TF se mezcló con 25 \i de una solución de sustrato que contenia 1.0 mM Spectrofluor FXa (American Diagnostica) y uno de 1440 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22.5 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) . Asi, las concentraciones finales para el ensayo fueron 0.8 (o 0.39) pM FVIIa, 0.2 nM TF, 0.5 mM Spectrofluor FXa y 7 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22.5 nM, 11.25 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) en 50 L/pozo. Los parámetros kcat y Km se calcularon usando la ecuación hiperbólica Michaelis Mentón de la forma (Vmax/ ( 1+ (Km/x) ) ) . La curva estándar AMC, que sirve como el factor de conversión para RFU hasta µ? en cálculos posteriores, se amplió para incluir un rango de dosis que cubrió desde 0 µ? hasta 100 µ? AMC.
Para determinar las constantes de velocidad cinética para la activación de variante FVIIa o FVIIa de FX, datos en bruto colectados con la aplicación SoftMax Pro (Dispositivos moleculares) se exportaron como archivos .XML. Además análisis lineal o no lineal de datos se realizaron con XLfit4, un paquete de software para análisis estadístico y de ajuste de curva automático dentro del entorno de la hoja de cálculo Microsoft Excel (IDBS Software) .
Para la recolección de datos usando ensayo de rango lineal, las constantes cinéticas kcat/Km (M^seg-1) se calcularon directamente de la pendiente de análisis de regresión lineal de
la concentración FX contra la velocidad de escisión de sustrato fluorogénico (en µ?/seg2) donde kcat/Km = pendiente/ [FVIIa] xG.5*k2. El factor de corrección k2 se determinó para ser 45 usando el método descrito en la sección A del Ejemplo 4 y constantes cinéticas para escisión de FXa de Spectofluor FXa de kCat,Fxa =- 56 seg-1 y Km, rxa = 126 nM, determinado experimentalmente con FX activado (FXa) que fue el sitio previamente activo titulado con AT-III/heparina . Excluyendo puntos de datos que resultan en valores 2 menores que 0.98 aseguran la linealidad de los conjuntos de datos usados en la rutina de prueba. ¦' ¦
Análisis de datos colectados usando el ensayo de rango hiperbólico se calcularon de análisis de regresión no lineal de la concentración FX contra la velocidad de escisión de sustrato fluorogénico (en µ?/seg2) . Los parámetros individuales kcat y m se calcularon como parámetros de ajuste usando la ecuación hiperbólica Michaelis Mentón de la forma (Vmax/ ( 1+ (Km/x) ) ) donde kcat = Vmax/ [FVIIa] *0.5xk2. La constante cinética, kcat/KM se calculó de los parámetros ajustados kcat y Km individuales.
Ensayo indirecto independiente de factor de tejido
La actividad catalítica de las variantes FVIIa en la presencia de factor de tejido se evaluó en un ensayo indirecto similar al descrito anteriormente, excepto que el factor de tejido no se incluyó en el ensayo. Así, el ensayo para evaluar
actividad independiente TF se realizó esencialmente como se describió anteriormente, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante FVIIa se diluyeron a 50 nM (o 5 nM para variantes esperadas para tener alta actividad independiente TF) . Veinticinco pL de cada solución FVIIa se mezcló con 25 pL de una solución de sustrato que contenia 1.0 mM Spectrofluor FXa (American Diagnostica) y uno de 1050 nM, 700 nM, 466.7 nM, 311.1 nM, 207.4 nM, 138.3 nM, 92.2. nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron 25 nM FVIIa (o 2.5 nM para variantes de actividad alta), 0.5 mM Spectrofluor FXa y 525 nM, 350 nM, 233.3 nM, 155.6 nM, 103.7 nM, 69.1 nM, 46.1 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) en 50 yL/pozo. Los análisis de datos se realizaron como se describió para el ensayo de rango lineal, anterior sin modificaciones.
La Tabla 14 proporciona la actividad catalítica de variantes FVIIa como se midió en un Ensayo Indirecto dependiente de TF usando polipéptidos FVIIa expresados de células 293-F y células BHK-21, y la actividad catalítica como se midió en un Ensayo Indirecto independiente de TF usando polipéptidos FVIIa expresados de células 293-F y/o células BHK-21. Los resultados se presentan como la constante cinética para actividad catalítica, kcat/Km (M~1seg"1) , y también expresado como un porcentaje de la actividad del FVIIa tipo
silvestre, en donde la actividad es actividad catalítica,
kcat/ m (M_1 seg"1) de cada variante FVIIa para su sustrato, FX. El uso del análisis de datos de rango lineal o hiperbólico también se indica para los valores presentados en las tablas. No todas las variantes FVIIa se evaluaron en cada ensayo. Distintas variantes FVIIa exhibidas incrementan actividad catalítica comparada on la molécula FVIIa tipo silvestre. Por ejemplo, el polipéptido FVIIa que contiene justo la mutación Q286R (Q286R-FVIIa) , tiene una actividad catalítica de entre 2 y 3 veces que de FVIIa tipo silvestre, y el polipéptido FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q (Q286R/M298Q-FVIIa ) , tiene una actividad catalítica de sobre 3 veces que de FVIIa tipo silvestre.
Tabla 14. Actividad catalítica de variantes FVIIa
Ensayo Indirecto Dependiente de TF con polipéptidos FVIIa de células 293-F
Mutación Mutación Formato de
(numeración de FVII maduro) (numeración de quimotripsina) Ensayo <MV) (% en TN)
Q286N QI43N hiperbólico 4.88 x 10' 100
Q286E QI43E hiperbólico 1.14 x 10' 23
Q2860 Q143D hiperbólico 6.04 x 10' 12
Q286S Q143S hiperbólico 4.64 x 10' 95
Q286T Q143T hiperbólico 2.44 x I07 50
Q286R Q143R lineal 1.1 1 x 10' 323
Q286K Q143 hiperbólico 5.44 x 10' 1 12
Q286A Q143A hiperbólico 8.55 x 107 175
Q286V Q143V hiperbólico 1.65 x 107 34
H216S H76S lineal 4.74 x 10' 138
H2I6A H76A lineal 5.98 x 107 175
H216 H76K hiperbólico 6.51 x 107 133
H216R H76R hiperbólico 9.44 x 107 193
S222A S82A lineal 5.73 x 10' 167
S222 S82K lineal 8.02 x 107 234
H257A H117A lineal 3.90 x 107 114
H257S H117S lineal 5.90 x 107 172
K16IS 24S hiperbólico 5.99 x 10' 123 I61A 24A lineal 4.22 x 107 123 161V K24V hiperbólico 5.45 x 107 112
H373D H224D lineal 1.79 x 10' 52
H373E H224E lineal 2.79 x 107 81
H373S H224S lineal 2.75 x 107 80
H373F H224F lineal 5.11 x 107 149
H373A H224A lineal 3.11 x I07 91
S52A S[52]A lineal 4.66 x I07 136
S60A S[60]A lineal 5.15 x 107 150
Q366D Q217D lineal 1.88 x I07 55
Q366E Q217E lineal 4.77 x I07 139
Q366N Q217N lineal 5.64 x 10' 165
Q366T Q 17T lineal 3.42 x 107 100
Q366S Q217S lineal 2.70 x 107 79
Q366V Q217V lineal 6.59 x 107 192
E394N/P395A/R396S E245N/P246A/R247S lineal 5.32 x 107 155
R202S R62S lineal 2.57 x 107 75
A292N/A294S AI50N/A152S lineal 0 0
G3I8N G170fN lineal 5.50 x 107 161
A17SS A39S lineal 3.32 x 10' 97
K.109N [I09]N lineal 5.97 x 107 174
A122N/G124S A[122]N/G[124]S lineal 5.27 x 107 154
T130N/E132S T[I30]N/E[132]S lineal 6.3S 107 185
AI22N/G124S/ A[ 122]N/G[ 124]S/E245N/P246
lineal 4.88 x 107 142 E394N/P395A/R396S A/R247S
V158T/L287T/M298K V21T/L144T/MI56 lineal 4.50 x 106 13
VI58D/L287TM298 V2ID/L1 4T/M1S6 lineal 4.48 x 10" 13
S[l03]S[lll]del¡nsSFGRGDIR
SI03SI lldelinsSFGRGDIRNV lineal 4.83 x I07 141
NV
P406¡nsCSFGRGDIR VC P257insCSFGRGDIRNVC lineal 6.16 x 10' 180
P406insGGGSCSFGRGDIR V P257insGGGSCSFGRGDlRN
lineal 7.47 x I07 218 C ve
T128N/PI29A T[128]N/P[I29]A lineal 5.96 x 107 174
S222A/ Gla intercambio de FIX S82A/Gla intercambio de FIX lineal 6.55 x 107 189
H257A/ Gla intercambio de FIX H 117A/Gla intercambio de FIX lineal 6.45 x 107 186
S222A/H257A/Glalntercambiode FIX S82 A/H 117A/intercambio de FIX lineal 5.77 x I07 168
Q286R Gla intercambio de FIX Ql 43R/Gla intercambio de FIX lineal 1.11 x 10" 323
Q286R H257A QI43R/HII7A lineal 1.27 x I08 371
Q286R/S222A Q143RS82A lineal 1.42 x 10" 415
Q286RS222A/H257A Q143R/S82A/HI I7A lineal 9.51 x I07 278
Q286R/S222A/Gla intercambio de FIX Q 1 3 R/S82 A/GlaMercambio de FIX lineal 1.61 x 10* 470
Q286R/H257A/Gla intercambio de FIX Q143F!/H117AGlaintercambio de FIX lineal 8.09 x I07 234
Q286R/S222A/H257A/Gla Q143R/S82A/H117A/Gla intercambio
lineal 7.75 x 107 226 intercambio de FIX de FIX
Q286R/M298Q 34IQ Q143R/M156Q/KI 2Q lineal 3.93 x 107 115
Q286R/M298QK199E QI43R/M156Q/ 60cE lineal 7.74 x 10' 226
T239S T99S lineal 1.74 x 107 51
T239Q T99Q lineal 1.74 107 51
T239V T99V lineal 9.57 x I07 279
T239L T99L lineal 3.77 x 107 110
T239H T99H lineal 9.90 x 10" 29
T2391 T99I lineal 3.50 x 107 102
S222A/H257A/ 298Q S82A/H117A/ I56Q lineal 7.75 x I07 224
S222A/H257A/Q286R/M298Q S82A/H117A/Q143R/MI56Q lineal 2.00 x 108 583
S222A/H257A S82A/H117A lineal 5.02 x I07 147
A175S/Q286R/Q366V A39S/QI43 /Q217V lineal 8.08 x 10' 236
A175S/S222A/Q366V A39S/S82A/Q217V lineal 3.78 x 10' 109
KI09N/A175S K[I09]N/A39S lineal 3.67 x 107 107
S222AQ286R/Q366V S82A/Q143R/Q217V lineal 1.27 x 10" 369
Q286M QI43M lineal 5.25 x 107 153
Q286L Q143L lineal 2.02 x 10' 59
Q286Y QI43Y lineal 1.61 x 10' 47
Q366I Q2I71 lineal 9.37 x 10' 274
Q366L Q217L lineal 6.87 x 107 201
Q366M Q2I7 lineal 6.61 x 10' 193
S222V S82V lineal 6.04 x 10' 176
S222D S82D lineal 5.34 x 10' 156
S222N S82N lineal 6.82 x 107 199
S222E S82E lineal 5.48 x 10' 160
H216A/H257A H76A/H117A lineal 6.62 x 107 193
H2I6A/S222A H76AS82A lineal 5.46 x 10' 159
H257S/Q286R HI17S/Q143R lineal 3.93 x I07 115
H257S/Q366V HI17S/Q217V lineal 6.71 x I07 194
H257S/Q286R/Q366V HI17S/QI43R/Q2I7V lineal 1.58 x 10" 457
S222A/H257A/Q286RQ366V S82A/H1I7A/QI43R/Q217V lineal 1.86 x 10" 538
Q366WH373V Q217V/H224V lineal 1.84 x 107 53
Q366V/H373L Q2I7V/H224L lineal 3.07 x 107 89
Q286R/H373A QI43R/H224A lineal 5.89 x 107 172
S222AH373A S82A/H224A lineal 3.64 x 107 106
Q286RM298Q 341D QI43RMI56Q/KI92D lineal 1.18 x 107 34
Q286RK34ID QI43R/K192D lineal 1.11 x 107 32
Q286R/Q366D QI43R/Q2I7D lineal 1.53 x 107 45
Q286R/Q366N QI43R/Q2I7N lineal 5.42 x 107 158
Q286R 298Q/Q366D QI43R/MI56Q/Q217D lineal 1.91 x 107 56
Q286R 298Q/Q366N QI43R/MI56Q/Q2I7N lineal 1.04 x 10" 305
Q286RH373F Q143RH224F lineal 9.08 x 10' 265
Q286R/ 298Q/H373F QI43R I56Q/H224F lineal 1.51 x 10s 440
M298Q/H373F MI56Q/H224F lineal 8.49 x 107 248
S119N/L121S/A175S S[119]N/L[121]S/A39S lineal 2.92 x 107 85
TI28N/P129A/A175S T(128]N/P[129]AA39S lineal 2.98 x 107 87
AI22N/GI24S/A175S A[I22]N/G[124]S/A39S lineal 2.79 x lO7 81 298Q M156Q lineal 1.4 x 10s 409
Ensayo Indirecto Dependiente de TF con polipéptidos FVIIa de células BHK-21
Mutación Mutación Formato de
(numeración de FVII maduro) (numeración de quimotripsina) Ensayo (ivrV) (% en TN)
P P lineal 5.42 x 107 100
Q286R Q143R lineal 1.01 x 10s 187
H216A H76A lineal 5.98 x 107 110
S222A S82A lineal 6.42 x I07 118
H257A H1I7A lineal 4.96 x I07 91
H257S H117S lineal 7.65 x I07 141
H373F H224F lineal 4.82 x 10' 89
S52A S[52]A lineal 3.50 x I07 65
S60A S[60]A lineal 3.22 x I07 59
Q366D Q217D lineal 9.80 x 10" 18
Q366N Q2I7N lineal 3.44 x 107 63
Q366V Q217V lineal 1.86 x 10s 342
G3I8N GI70fM lineal 5.46 x 107 101
AI75S A39S lineal 2.12 x 10' 39
AI22N/G124S A[I22]N/G[I24]S lineal 8.05 x 10' 148
A5IN A[51]N lineal 1.02 x 10" 188
S52A/S60A S[52]A/S[60]A lineal 1.05 x 10* 193
P406insGGGSCSFGRGDIRNV P257insGGGSCSFGRGDIRN
lineal 9.54 x 107 176 C ve
SII9N/L12IS S[l 19]WL[121]S lineal 5.75 x 10' 106
T128N/ 129A T[128]N/P[129]A lineal 8.76 x 107 161
Q286R/S222A QI43R/S82A lineal 1.24 x 108 229
Q286R/S222A/H257A QI43R/S82A/H117A lineal 1.06 x 10* 196
Q286R/S222AGla Intercambio de FIX Q143R/S82A/Gla intercambio FIX lineal 8.52 x I07 157
Q286R/ 298Q QI43R/MI56Q lineal 1.85 x 10* 341
Q286R/M298Q/K34IQ QI43R/M156Q/ 192Q lineal 3.11 x I07 57
Q286R/M298Q/KI99E QI43R/ I56QK60cE lineal 9.18 x 107 169
P32I P170ÍK lineal 3.43 x 107 63
P32IE P170ÍE lineal 5.59 x 107 103
P32IY P170ÍY lineal 4.48 x 10' 83
P321S PI70ÍS lineal 5.53 x 107 102
T239N T99N lineal 1.64 x 107 30
T239Q T99Q lineal 1.70 x 107 31
T239V T99V lineal 9.81 x I07 181
T239L T99L lineal 5.24 x I07 97
T239H T99H lineal 1.25 x 107 23
T239I T99I lineal 4.67 x I07 86
S222A/M298Q S82A 156Q lineal 7.13 x I07 131
H257AyM298Q HH7A/ 156Q lineal 1.28 x 10* 236
S222A/H257A/Q286R/M298Q S82A/HI 17A/Q143R/M1 6Q lineal 1.94 x 10* 358
Q286R/M298Q/Gla Intercambio de FIX Q143R/ 156QGla Intercambio de FIX lineal 2.64 x 10s 487
Q286R;Q366V OJ43R/Q2I7V lineal 7.92 x I07 146
A175S/Q286R/Q366V A39S/QI43R/Q2I7V lineal 7.63 x 107 141 I09N/A175S K[I09]N/A39S lineal 2.45 x I07 45
S222A/Q286R/Q366V S82A/QI43 /Q2I7V lineal 1.44 x 108 265
Q286R/M298Q/K34ID Q143R/M156Q/ I92D lineal 1.35 x 10' 25
Q286R/H373F OJ43R/H224F lineal 1.18 x 10* 218
Q286R/M298Q/H373F QI43R/M156Q/H224F lineal 2.01 x I08 371
M298Q/H373F M156Q/H224F lineal 8.69 x 10' 160
A122N/GI24S/AI75S A[122)N/G[124]S/A39S lineal 1.93 x 10' 36
M298Q MI56Q lineal 9.34 x 107 172
Ensayo Indirecto Independiente de TF
En un conjunto adicional de experimentos, la actividad catalítica de polipéptidos FVIIa producidos en células BHK-21 se analizó usando los ensayos indirectos dependiente de TF e independiente de TF descritos anteriormente con menores modificaciones. Las distintas variantes se produjeron en células CHOX además de células BHK-21 o exclusivamente en células CHOX. Las variantes se evaluaron bajo condiciones idénticas independientemente de la línea celular usada. Para el ensayo catalítico dependiente de TF (usando análisis lineal) , los polipéptidos FVIIa primero se titularon al sitio activo con p ' -guanidinobenzoato de 4-metilumbelliferilo
(MUGB) para determinar la concentración FVIIa, como se describió en el Ejemplo 12, abajo. Para maximizar el número de puntos de datos en el rango lineal, la concentración máxima de FX en el ensayo fue establecido a 25 nM (esto es, 0-25 nM en lugar de 0-150 nM) . El FX usado en el ensayo se activó (esto es, FXa) y tituló con fluoresceina-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB), como se describió en el Ejemplo 15, abajo. Las constantes cinéticas para escisión de sustrato Spectrafluor FXa se determinaron en este sitio activo titulado FXa y demostraron ser: de 190.2 uM y un de 340 s"1. La diferencia primaria que está en kcat y sobre todo debido a las determinaciones de sitio activo mejoradas. Estos parámetros dan un valor de factor de corrección k? revisado de 246.4 que se usa en el análisis lineal para determinar la actividad catalítica de los polipéptidos FVIIa en la presencia de TF.
Para el ensayo catalítico independiente de TF, los polipéptidos FVIIa primero se titularon al sitio activo con p' -guanidinobenzoato de 4-metilumbelliferilo (MUGB) para determinar la concentración FVIIa, como se describió en el Ejemplo 12, abajo. El FX usado en el ensayo se activó (esto es, FXa) y tituló con fluoresceina-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB), como se describió en el Ejemplo 15. Las constantes cinéticas para escisión de sustrato Spectrafluor FXa se determinaron en este sitio activo titulado FXa y demostraron ser: Km de 190.2 uM y un de 340 s"1. Estos parámetros dan un valor de factor de corrección k2 revisado de 246.4 que se usa en el análisis para determinar la actividad catalítica de los polipéptidos EVIIa en
la ausencia de TF.
La Tabla 15 establece la actividad catalítica de cada uno de los polipéptidos de variante FVIIa probados. Los resultados se presentan como la constante cinética para actividad catalítica, kcat/f (M"1 seg" 1) , y también se expresan como un porcentaje de la actividad del FVIIa tipo silvestre, en donde la actividad es actividad catalítica, kcat/Km (M"1 seg"1) de cada variante FVIIa para su sustrato, FX. La desviación estándar (SD) , coeficiente de variación (como un porcentaje; %CV) y el número de ensayos realizados (n) también se proporcionan.- Algunas de las variantes desplegadas claramente incrementan la actividad catalítica comparada con el polipéptido FVII tipo silvestre. Por ejemplo, la variante Gla Intercambio FIX/Q286R/M298Q exhibe una actividad catalítica dependiente de TF sobre 6 veces que del polipéptido FVII tipo silvestre. La actividad catalítica incrementada de las variantes FVIIa fue más pronunciada en el ensayo independiente TF. Por ejemplo, las variantes Gla Intercambio FIX/Q366V tuvó sobre 9 veces más actividad catalítica que FVIIa tipo silvestre, las variantes Gla Intercambio FIX/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio
FIX/E40LJ/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/K43I } /Q286R/ 298Q, y {Gla Intercambio FIX/Q44S}/Q286R/M298Q tuvieron sobre 70-80 veces más actividad catalítica que FVIIa tipo silvestre, y la variante S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q tuvo sobre 220 veces más actividad catalítica que FVIIa tipo silvestre.
Tabla 15. Actividad Catalítica de variantes FVIIa
Ensayo Indirecto Dependiente de TF
Mutación Mutación
(numeración de FVII (numeración de SD %CV n maduro) quimotripsina) (M 's-') (% en TNP)
TN (NovoSeven®) TN (NovoSeven®) 3.98E+07 1.02 E+07 26% 106% 30
TN (NovoSeven- T®) TN (NovoSeven- RT®) 3.48E+07 8.33E+06 24% 93% 10
TN TN 3.75 E+07 5.44E+06 15% 100% 13
TN † TN † 3.76E+07 7.09 E+06 19% 100% 10
T128N P129A T[128]N/P[I29]A 4.65 E+07 I.09E+07 23% 124% 5
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX 5.38E+07 9.08E+05 2% 144% 2
K109N [109]N 5.54E+07 8.57E+06 15% 148% 2
A122N/G124S A[122]N/G[I24]S 3.87 E+07 4.96E+06 13% 103% 2
S52A/S60A S[52]A/S[60]A 3.56E+07 4.63E+06 13% 95% 2 298Q M156Q 6.76E+07 7.38E+06 11% 180% 6
M298Q† M156Q† 7.46E+07 9.42 E+06 13% 198% 4
T1 8N/P129A/M298Q† T[ 128]N/P[ 129] A/M 156Q† 6.29E+07 1.28 E+07 20% 167% 4
VI58D/E296V/M298Q V21D/EI54V/MI56Q 1.8IE+08 4.43 E+07 25% 482% 8
V158D/E296V/ 298Q† V2ID/E154VM156Q† I.65E+08 4.08E+07 25% 441% 10
T128N/P129A/VI58D/E29 T[ 128]NP[ 129] A/V21DEI5
2.0IE+08 1.54 E+07 8% 537% 4 6VM298Q 4VMI56Q
SS2A/S60AV 158D/E296V/ S[52] A/S[60] A/V21 D/E 154/
2.00E+08 4.31E+05 0% 532% 2 M 1298Q MI56Q
Q286R Q143R 8.06E+07 1.43 E+07 18% 215% 5
TI28N/P129A/Q286R T[128]N/P[I29]A/QI43R 8.45E+07 1.90 E+07 22% 226% 6
T128N/PI29A/Q286R† T[I28]N/P[129]A/Q143R† 6.20E+07 165% 1
S52A/S60A/Q286R S[52]AS[60]A/Q143R 4.10E+07 6.71 E+06 16% 109% 4
S222A S82A 4.07E+07 1.17E+07 29% 109% 4
T128N/P129A/S222A T[128]N/P[129]A/S82A 6.25 E+07 6.78E+06 11% 167% 4
S52A/S60A/S222A S[52]A/S[60]A/S82A 3.91E+07 8.75E+06 22% 104% 3
H257S Hl 17S l;18E+08 2.02E+O7 17% 316% 2
H373F H224F 5.58E+07 2.05E+07 37% 149% 2
Q366V Q217V 5.48E+07 2.69E+06 5% 146% 2
Gla Intercambio de FIXQ366V Gla Intercambio de FIXQ217V 9.11 E+07 2.50E+07 27% 243% 3
AI75S A39S 2.11 E+07 6.I0E+06 29% 56% 3
K109N/AI75S K[l09]N/A39S 1.74 E+07 4.29E+06 25% 46% 5
S119N/L121S/AI75S S[I I9]N/L[12I]S/A39S 1.73 E+07 1.28E+06 7% 46% 2
TI28N/PI29A/AI75S T[I28]N/P[I29]A/A39S 8.59E+06 I.82E+06 21% 23% 2
A122N/G124S/A175S A[I22)N/G[I24]S/A39S I.05E+07 1.12 E+06 11% 28% 2
Q286R/H257A Q143R/H117A 9.91 E+07 1.74E+07 18% 264% 2
Q286 /H257A† Q143R/HI17A† 3.08E+07 1.52E+07 49% 82% 4
Q286R/S222A Q143R/S82A 1.11 E+08 3.21 E+07 29% 296% 4
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
TI28N/P129A/ T[I28]N/P[129]A/ I.47E+08 2.53 E+07 17% 393% 3 S222A/Q286R S82A/Q143R
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
T128N/P129A/ T[I28]N/P[129]A/ I.43E+08 1.63 E+07 11% 379% 2 S222A/Q286R† S82A/Q143R†
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
7.24E+07 2.36E+06 3% 193% 2 S52A/S60A/S222A/Q286R S[52] AS[60]A/S82 A/Q 1 3 R
Q286R/S222A/H257A QI43RS82AH117A 6.98E+07 I.64E+07 23% 186% 3
Q286R/M298Q QI43RM156Q 1.66E+08 3.86E+07 23% 442% 14
Q286R/M298Q † QI43R/M156Q † 1.34E+08 2.37E+07 18% 356% 15
Q286R/M298Q § QI43R/M156Q § 1.54E+08 3.86E+07 25% 408% 6
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
2.55 E+08 6.16E+07 24% 680% 6 Q286R/M298Q QI43RM156Q
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
2.30E+08 5.10E+07 22% 613% 4 Q286R/M298Q† QI43R/M156Q†
TI28N/PI29A/Q286R/ T[128]N/P[I29]A/Q143R/
1.86E+08 2.64E+07 14% 497% 6 298Q I56Q
TI28N/P129A/Q286R/ T[I28]N/P[I29]A/QI43R/
I.50E+08 4.I6E+07 28% 398% 4 M298Q† M156Q†
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
T128N/PI29A/Q286R /T[I28]N/P[129]A/Q143R 2.11 E+08 4.41 E+07 21% 562% 3 M298Q M156Q
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
/T128N/PI29A/Q286R/ /T[128]N/P[129]A/QI43R 1.99E+08 6.79E+07 34% 529% 5 298Q† I56Q†
{Gla Intercambio de FIX/E40L} {Gla Intercambio de FIX/E40L)/
2.08 E+08 4.39E+07 21% 556% 4 Q286R/M298Q QI43R/MI56Q
{Gla Intercambio de FIX/K[431}/ {Gla Intercambio de FIX/K[43]I}/
2.73 E+08 5.21 E+07 19% 727% 5 Q286R/M298Q QI43R/MIS6Q
{Gla Intercambio de FIX/K[43iy {Gla Intercambo de FIX/K[43]I}/
2.91 E+08 4.30E+07 15% 774% 5 Q286R/M298Q† QI43IVMI56Q†
{Gla Intercambio de FIXQ44S}/ {Gla Intercambio de FIX/Q[44]S)/
1.98 E+08 2.75E+07 14% 529% 3 0286RM298Q QI43R/MI56Q
{Gla Intercambio de FIX/M19K) {Gla Intercambio de FIX/M[19]K}/
1.41 E+08 5.22 E+06 4% 375% 2 Q286R/M298Q Q143R/M156Q
S52A/S60A S[52]A/S[60]AQ143R/M1S6
1.25 E+08 I.14E+07 9% 333% 4 Q286R/M298Q Q
Gla Intercambio de FIX
3la Intercambio de FIX/S52A/S60A
/S[52]A/S[60]AQ143 /MI5 I.80E+08 1.81 E+07 10% 480% 3 Q286R/M298Q†
6Q†
{Gla Intercambio de {Gla Intercambio de
FIX/M 19 /E40L/ 43I/Q44 FIX/M[19] /E[40]L/K[43]1/ 1.21 E+08 7.07E+06 6% 322% 2 S}/Q286R/M298Q Q[44]}/Q286R/M298Q
{Gla Intercambio de {Gla Intercambio de
FIX/K43I>T128N/P129A/ FIX/ [43]1 }T128N/P129 A/ 2.71E+08 6.41 E+07 24% 720% 5 Q286RM298Q† Q143R/M156Q†
T239V T99V 4.64E+07 8.38E+06 18% 124% 2
T239I T99I 2.62E+07 6.51E+06 25% 70% 2
H257A/M298Q Hl I7A/Q143R/MI56Q 1.67E+07 4.27E+06 26% 45% 5
S222A/H257A/Q286R/
S82A/H 117A/Q 143R/ 156Q .65?+08 1.76E+07 11% 440% 4 298Q
T128N/P129A/S222A/ T[]28]N/P[129]A/S82A/H11
1.55E+08 5.77E+07 37% 414% 9 H257A/Q286R/M298Q 7A/Q143R/MI56Q
T128N/PI29A/S222A/ T[I28]N/P[129]A/S82A/H11
173E+08 1.41 E+07 8% 461% 2 H257A/Q286R/M298Q† 7A/Q143R/ I56Q†
S52A/S60A/S222A/H257A/ S[52]A/S[60]A/S82A/H117A
2.49E+08 8.78E+06 4% 665% 3 ' Q286R 298Q /QI43R/M156Q
H257S/Q286R/Q366V Hl 17S/Q143R/Q217V 7.10E+07 3.16E+07 44% 1 9% 11
S222A/H257AQ286R
S82A/HI 17A/Q143R/Q2I7V 1.00E+08 1.03E+07 10% 268% 4 Q366V
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q2I7N I.I7E+08 3.05E+07 26% 312% 7 .
TI 28N/P 129A/Q286R/M29 T[ 129]NP[ 129] A/Q 1 3R/M 1
1.42E+08 4.17 E+07 29% 377% 3 8Q/Q366N† 56Q/Q2I7N†
{Gla Intercambio de {Gla Intercambio de
FIXK43IJ/Q286R/ 298Q/ F1X/ 43I}/QI43R/M 156Q/Q 1.69E+08 3.89E+07 23% 450% 5 Q366N† 2I7N†
{Gla Intercambio de {Gla Intercambio de
FIX/K43I}/TI28N/PI29A/ F1X/K431}/T[128]N/P[129]A 2.52E+08 1.36E+07 5% 669% 2 Q286R/M298Q/Q366N† /Q143R/ I56Q/Q2I7N†
Q286R/H373F Q143R/H224F 9.01 E+07 7.73E+06 9% 240% 2
T128WP129A/ T[ 128]NP[ 129]AQ 1 3R/H2
6.91 E+07 2.15 E+07 31% 184% 12 Q286 /H373F 24 F
S[52]A/S[60)A/Q 143R/H224
S52AS60A/ Q286R/H373F 9.44E+07 1.43 E+07 15% 252% 3
F
Q286R/M298Q/H373F Q143 /M156Q/H224F 1.36E+08 1.92 E+07 14% 364% 5
TI28N/PI29A/Q286R/M29 T[I28]N/P(129]A/Q1 3 /MI
1.33 E+08 4.77E+07 36% 354% 17 8Q/H373F 56Q/H224F
S52A/S60A/Q286R/M298Q S[52] A/S[60] A/Q 143R/M156 1.77E+08 3.63 E+07 21% 472% 3
/H373F Q/H224F
M298Q/H373F M156Q/H224F 7.21E+07 I.76E+07 24% 192% 4
T 128?? 129A/M298Q/H37 T[ 128]N/P[ 129]A/M156Q/H
6.07E+07 I.29E+07 21% 161% 2 3F† 224F†
V158D/Q286R/E296VM29 V2ID/Q143R/E154V/M156
I.49E+08 3.59E+07 24% 397% 11 8Q Q
S222A/T239V S82A/T99V 7.49E+07 2.57E+06 3% 200% 3
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
2.03E+08 3.16E+07 16% 541% 3 /S222A/T239V/Q286R /S82A/T99V/Q143R
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
9.94E+07 1.83E+07 18% 264% 3 /S222A/T239V/Q286R† /S82A/T99V/QI43 †
T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143RMI56Q 1.72E+08 4.92E+07 29% 459% 5
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
2.53 E+08 4.78E+07 19% 675% 3 T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
1.79E+08 3.81 E+07 21% 477% 4 T239V/Q286R/M298Q† T99V/Q143R/ I56Q†
TI 28N/P 129A/T239V/Q28 T[ 128]N/P[ 129JA/T99V/Q14
I.04E+08 2.43 E+07 23% 276% 4 6R/M298Q† 3R/M156Q†
S222A/T239V/H257A/ S82A/T99V/HI 17A/Q143 /
2.14E+08 4.48E+07 21% 571% 5 Q286R/M298Q MI56Q
T 128N/P 129A/S222 A/T239
T[ 128]N/P[ 129] A/S82 A/T99
V/H257A/ 1.21 E+08 5.58E+06 5% 323% 3
V/HU7A/Q143R/M156Q†
Q286R/M298Q†
T239V/Q286R/H373F T99V/Q143RH224F 1.06E+08 1.34E+07 13% 283% 2
T239V/Q286RM298Q/H37
T99V/Q 143R/ 156Q/H224F 1.70E+08 1.I3E+07 7% 454% 2 3F
TI28NP129AT239V/Q28 T[ 128]N/P[ 129] A/T99V/Q 14
2.36E+08 2.77E+07 12% 627% 3 6R/ 298Q/H373F† 3R/M156Q/H224F†
V158DT239I/E296V/ 298
V2ID/T99I/E154V/ I56Q 1.45 E+08 1.18E+07 8% 387% 4 Q
T2391/Q286R T99I/Q143R 5.79E+07 1.39E+07 24% 155% 3
S222A/T239I S82AT99I 3.05E+07 9.26E+06 30% 81% 4
Gla Intercambio de Gla Intercambio de FIX
6.77E+07 4.44 E+06 7%
FIX/S222AfT239l/Q286R 181% 2
/S82A/T99I/QI43R
T239I/Q286R/M298Q T99I/Q143 / I56Q I.13E+08 3.68E+06 3% 301% 2
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
1.25 E+08 2.13E+07 17% 334% 2 T239I/Q286R/ 298Q /T99I/Q143R/ 156Q
T128N/P129A/T239I/Q286 T[128]N/P[I29]AT99I/Q143
8.17E+07 8.I7E+06 10% 21 % 3 R/M298Q† RM156Q†
S222A/T239I/H257A/Q286 S82A/T99I/H117A/QI43R/M 1.14E+08 2.22E+07 19% 304% 3
R/M298Q I56Q
T239I/Q286R/H373F T99I/Q143R/H224F 6.18E+07 9.27E+06 15% 165% 3
VI 58D/T239V/E296WM29
V21 DT99V/E 154VM 156Q 2.22E+08 1.39E+07 6% 591% 2 8Q
V 158DT239 V/E296VM 29 V21 D/T99V/E 154VM 156Q
1.65E+08 2.12E+06 1% 438% 2 8Q† t
T239V/Q286R T99V/Q143R 8.84E+07 7.16E+05 1% 236% 2
T239I/Q286R/M298Q/
T99I/Q 143R/M 156Q/H224F I.08E+08 2.32E+07 21% 289% 7 H237F
TI 28NP 129A/T2391/Q286 T[ 128]N/P[ 129] A/T99I/Q 143
1.30E+08 2.51 E+07 19% 345% 5 R/M298Q/ H237F† R/M156Q/H224F†
H257S/Q286R/M298Q HII7S/Q143R/MI56Q I.40E+08 8.97E+06 6% 372% 4
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
8.53E+07 1.66E+07 20% 227% 3 /Q286R/S222A H257S /Q143R/S82A/HI17S
S222A/H257S/Q286R/
S82AH1I7S/QI43R/MI56Q 1.58E+08 1.76E+07 11% 420% 2 M298Q
H257S/Q286R/ 298Q/ HU7S/Q143R/M156Q/H224
I.52E+08 3.35E+07 22% 407% 7 H373F F
S222A/Q286RM298Q/
S82A/Q 143R/M 156Q/H224F 1.48E+08 2.23E+06 2% 395% 2 H373F
Gla Intercambio de FIXS222A/ Gla Intercambio de FIX
2.84E+08 4.85E+07 17% 758% 3 Q286R/ 298Q/H373F S82A/Q143R/M156Q/H224F
S222A/Q286R/M298Q S82A/QI43R/ I56Q I.29E+08 I.86E+07 14% 343% 3
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX
2.10E+08 4.28 E+07 20% 559% 5 S222A/Q286R/M298Q S82AQI43R/ 156Q
T128N/P129A/AI75S/ T[ 128]N/P[ 129] AA39S/Q21
3.38E+07 3.06E+06 9% 90% 2 Q366V 7V
AI22N/G124S/AI75S/ A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/Q21
3.02E+07 7.05 E+06 23% 80% 5 Q366V 7V
TI28N/P129A/A175S/ T[128]N/P[129]A/A39S/S82
1.72E+07 3.18E+06 18% 46% 3 S222A A
A122N/G124S/AI75S/ A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82
2.08 E+07 5.05 E+06 24% 56% 5 S222A A
TI28N/PI29A/AI75S/ T[128]N/P[129]A/A39S/Q14
3.33E+07 I.46E+06 4% 89% 3 Q286R 3R
A122N/GI24S/AI75S/ A[I22]N/G[I24]S/A39S/QI4
4.11 E+07 5.27E+06 13% 110% 5 Q286R 3R
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
I.22E+08 3.I7E+07 26% 327% 8 S222A/Q286R/H373F S82A/QI43R/H224F
V158D/E296V/ 298Q/
V21 D/E 154V/M 156Q/H224F 1.51 E+08 8.39E+06 6% 402% 3 H373F
H257Á/Q286RM298Q H117A/Q143R/MI56Q 1.I3E+08 I.55E+07 14% 301% 3
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX/
T128N/P129A/A175S/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/S82 3.88E+07 2.74E+06 7% 104% 3
S222A/Q286R AQI43R
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
AI22N/GI24S/A175S/ A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82 4.13E+07 8.99E+06 22% 110% 6 S222A/Q286R A/Q143R
T128N/PI29A/A175S/ T[ 128]NP[ 129] A A39S/Q 14
7.21E+07 I.14E+07 16% 192% 3 Q286RM298Q 3R/M156Q
A122N/G124S/AI75S/ A[122]N/G[124]S/A39S/Q1
7.43 E+07 I.10E+07 15% 198% 3 Q286R/M298Q 3R/M156Q
T128NPI29A/AI75S/
T[ 128]N/P[ 129]A/A39S/S82
S222A H257A/Q286R/ 6.89E+07 3.36E+06 5% 184% 3
A/HI17A/QI43R/M156Q
M298Q
A122N/G124S/A175S/
A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/S82
S222A/H257A/Q286R/ 8.40E+07 5.72E+06 7% 224% 3
A/Hl I7A/Q143R/MI56Q
298Q
T128N/PI29A/A175S/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/Q 14
5.72E+07 3.36E+06 6% 153% 3 Q286R/ 298Q/H373F 3R/M156Q/H224F
AI22N/GI24S/A175S/ A[122]N/G[I24]S/A39S/Q14
8.39E+07 9.99E+06 12% 224% 3 Q286R/ 298Q/H373F 3R/M156Q/H224F
V 158D/Q286R/E296V/M29 V21D/Q143R/E154V/M156
2.39E+08 3.82E+07 16% 638% 5 8Q/H373F Q/H224F
298Q/Q366N H373F† MI56Q/Q217N/H224F† 7.05 E+07 1.78 E+07 25% 188% 3
T239VM298Q/H373F† T99V M156Q/H224F† 4.43 E+07 I.10E+07 25% 118% 3
T239I M298Q/H373F† T991/ I56Q/H224F† 3.47E+07 4.57E+06 13% 92% 3
T128N/PI29A/Q286R/M29 ?[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 R/M 1
1:33 E+08 1.81 E+07 14% 355% 2 8Q/Q366N/H373F† 56Q/Q2I N/H224F†
T239V/Q286R/ 298Q/Q36 T99 V/Q 143 R/M 156Q/Q217
1.85E+08 5.96E+07 32% 491% 4 6N† N†
T239I/Q286R/M298Q/Q36 T991/Q 143 R/M 156Q/Q217N
7.40E+07 1.40E+07 19% 197% 4 6N† †
Ensayo Indirecto Dependiente de TF
Mutación Mutación
(numeración de FVII maduro) (numeración de quimotripsina) SD %cv n
( "V) (% en TN)
TN (NovoSeven®) TN (NovoSeven®) 9.8 3.0 30% 88% 14
TN (NovoSeven-RT®) TN (NovoSeven- T®) 12.4 4.3 35% 112% 12
TN TN 11.1 2.7 25% 100% 5
TN † TN † 6.9 2.2 31% 100% 7
T128N/P129A T[128]N/P[I29]A 17.0 5.2 31% 153% 3
Qa Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/ 41.3 3.0 7% 373% 2
AI22N/G124S Afl22]N/G[!24]S 3.4 0.6 16% 31% 2
S52A/S60A S[52]A/S[60]A 3.8 34% 1
M298Q† M156Q† 69.9 49.4 71% 1013% 3
TI28N/PI29A/ 156Q† TT128]N/P[129]A/M156Q† 90.8 70.8 78% 1316% 5 I58DE296V/M298Q V21D/E154V/M156Q 1221.7 307.0 25% 11025% 4
V158D/E296V/M298Q† V21D/EI54VM156Q† 984.5 308.4 31% 14265% 2
T 128N 129A/V 158D/E29 T[ 1 8]NP[ 129]A/V21 D/El 5
1375.8 140.3 10% 12415% 3 6V/M298Q 4V 156Q
S52A/S60A/V 158D/E296V/ S[52]A/S[60]A/V21D/E154
1760.1 575.0 33% 15883% 3 M1298Q M156Q
Q286R QI43R 10.3 0.7 7% 93% 3
TI28N/P129A/Q286R T[128]N/P[129]A/Q143R 8.7 4.3 50% 78% 5
T128NPI29A/Q286R† T[128]N/P[129]A/Q143R† 10.5 5.6 53% 152% 6
S52A/S60A/S82A S[52]A/S[60]A/S82A 10.2 4.7 47% 92% 3
T128NPI29A/S222A T[128]N/P[129]A/S82A 4.8 43% 1
S52A/S60A/S222A S[52]A/S[60]A/S82A 19.6 177% 1
H257S H117S 3.1 1.1 35% 28% 7
Q366V Q217V 4.3 0.6 14% 39% 2
Gla Intercambio de FIXQ366V Gla Intercambio de FIX/Q217V 90.0 17.7 20% 812% 2
Q286R/H257A Q143R/H117A 4.3 2.1 49% 39% 3
Q286RH257A† Q143R/HI I7A† 2.5 0.0 0% 36% 2
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX/
TI28N/P129A/ T[I28]N/P[129]A/ 15.5 2.9 18% 140% 4 S222AyQ286R S82A/Q143R
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
T128N/P129A T[I28]N/P[129]A/ 21.3 6.5 31% 309% 5 S222A/Q286R† S82A/Q143R†
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
2.9 26% 1 S52A/S60AS222A/Q286R S[52]A/S[60]A/S82A/QI43R
Q286R/S222A;H257A Q143R/S82A/HI17A 21.3 6.5 31% 193% 5
Q286R/ 298Q QI43R/MI56Q 79.9 18.9 24% 721% 5
Q286R/ 298Q† Q143R/MI56Q† 162.4 79.9 49% 2353% 12
Q286RM298Q § Q143R/MI56Q5 135.1 7.3 5% 1957% 2
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
672.7 79.1 12% 6070% 4 Q286R/M298Q Q143RMI56Q
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
678.2 249.0 37% 9826% II Q286R/ 298Q† QI43R/MI56Q†
TI28N/P129A/Q286R/ T[128]N/P[129]A/QI43R/ 81.6 13.4 16% 736% 4
298Q M156Q
TI28N/PI29A/Q286 / T[128]N/P[129]A/QI43R/
212.5 135.4 64% 3079% 10 M298Q† MI56Q†
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
/TI28NPI29A/Q286R/ /T[I28]N/P[I29]A/QI43 / 83.8 35.3 42% 756% 6
M298Q M156Q
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
/T128N P12 A/Q286R/ /T[I28]N/P[129]A/QI43R/ 751.9 305.3 41% 10895% 6 M298Q† M156Q†
(Gla Intercambio de FIXE40L}/ {Gla Intercambio de FIX/E[40]L)
814.1 89.0 11% 7346% 2 Q286R/M298Q QI43R/M156Q
{Gla Intercambio de FIXK43I}/ {Gla Intercambio de FIX/ [43]I}/
902.4 360.6 40% 8144% 11 Q286 /M298Q QI43 /M156Q
{Gla Intercambio de FIXK43I) {Gla Intercambio de FIX/K[43]I}/
794.2 178.7 23% 11508% 6 Q286R/ 298Q† QI43R/M156Q†
{Gla Intercambio de FIXK44S) {Gla Intercambio de FIX/Q[44]Sy
729.0 4.5 1% 6578% 2 Q286 /M298Q Q143 /M156Q
{Gla Intercambio de FIX/ 19K}/ {Gla Intercambio de FIX/M[19]K}/
512.0 51.4 10% 4620% 2 Q286R/ 298Q Q143R/MI56Q
S52A S60A/ S[52]A/S[60]A/Q143R/MI56
216.8 1.6 1% 1956% 2 Q286R/M298Q Q
Gla Intercambio de FIX/S52A/S60A Gla Intercambio de FIX/S[52]A/
988.7 207.5 21% 14327% 2 Q286R/M298Q S[60]A/QI43 /M156Q
{Gla Intercambio de FIX/K43I} {Gla Intercambio de FIXK[43]I}/
/T128N/P 129A/Q286R/M2 T[I28]N/P[129]A/ 389.4 34.3 9% 5642% 2 98Q† Q143R/ 1S6Q†
S222A/H257AQ286R/
S82A/H117A/Q143R/MI56Q 345.3 99.9 29% 3116% 3 M298Q
TI28N/PI29A/S222A/ T[128]N/P[129]A/S82A/HII
24.8 17.2 69% 224% 4 H257A/Q286R/M298Q 7A/Q143R/MI56Q
T128N/PI29AS222A/ T[I28]N/P[129]A/S82AHI1
82.6 40.2 49% 1196% 3 H257AQ286 M298Q† 7AQ143RM156Q†
S52A/S60A/S222A/H257A/ S[52]AyS[60]A/S82A/H 117A
115.6 62.9 54% 1043% 2 Q286R/M298Q /Q143R/M156Q
H257S/Q286R/Q366V HII7S/QI43R/Q217V 7.7 1.8 23% 69% 2
S222A/H257A/Q286R/Q36
S82A/HI17A/Q143R/Q217V 12.5 2.8 23% 113% 2 6V
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 65.9 33.4 51% 595% 5
T 129N/ 129AQ286R/M29 T[ 129]N/P[ 129JA/Q 143 /M 1
64.6 28.7 44% 936% 4 8Q/Q366N† 56Q/Q2I7N†
(Gla Intercambio de FIX/K43I} {Gla Intercambio de FIXK[43]I} 84.9 76.5 90% 1230% 4
/Q286R/M298Q/Q2I7N† /Q143R/MI56Q/Q2I7N†
{Gla Intercambio de FIXK43I} {Gla Intercambio de FIX/K[43]I}
G? 128NP 129A/Q286R/M2 /TI 128]NP[ 129] A/Q 1 3 R/M 218.5 137.8 63% 3166% 3 98Q/Q366N† I56Q/Q217N†
Q286R/H373F Q143 /H224F 81.6 123.7 152% 736% . 9
T128N/PI29A/ T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143R/H2
6.6 0.9 13% 59% 2 Q286 /H373F 24F
S[52] AS[60]A/Q 1 3 R/H224
S52A/S60A/Q286R/H373F 30.1 272% 1
F
Q286 /M298Q/H373F QI43 /MI56Q/H224F 114.8 24.7 22% 1036% 5
TI 28N/P 129AQ286R/M29 T[ 128]N/P[129] AQ 1 3 R/M 1
30.7 8.9 29% 277% 4 8Q/H373F† 56Q/H224F†
S52AyS60A/Q286RM298Q S[52]A/S[60]A/Q 143R/M 156
63.3 10.8 17% 571% 3 /H373F Q/H224F
M298Q/H373F M1S6Q/H224F 96.4 47.0 49% 870% 5
T128N/P 129A 298Q/H37 T[ 128]N/P[129]A/M 156Q/H
91.6 48.0 52% 1327% 3 3F 224F
V 158 D/Q286 R/E296 V/M 29 V21D/QI43R/EI5 V/ 156
1023.9 339.3 33% 9240% 5 8Q Q
S222AT239V S82AT99V 3.0 27% 1
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX .
17.4 2.2 13% 157% 3 /S222AT239V/Q286R /S82AT99V/Q143R
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
87.9 61.7 70% 1274% 4 /S222AT239V/Q286R† /S82A/T99V/Q143R†
T239V/Q286R/M298Q T9 V/Q143R/ 156Q 29.3 6.2 21% 264% 4
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX/
277.7 64.2 23% 2506% 3 T239V/Q286R/M298Q T99V/QI43RM156Q
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX/
902.4 323.5 36% 13076% 6 T239V/Q286R/ 298Q† T99V/QI43R/ I56Q†
T128N/P129A/ T[128]N/P[I29]A/
229.7 134.1 58% 3329% 5 T239V/Q286R/M298Q† T99V/Q143R/MI56Q†
S222A/T239V/H257A S82AT99V/H117A/QI43R/
143.0 93.1 65% 1290% 10 Q286R 298Q 156Q
TI28N/P129A/ T[I28]N/P[I29]A/
S222AT239V/H257A/ S82AT99V/HII7AQ143R/ 179.0 80.5 45% 2593% 5
Q286R 298Q I56Q
T239V/Q286R/H373F T99V/Q143R/H224F 12.2 110% 1
T239V/Q286R/ 298Q/H37
T99 V/Q 143 R/M 156Q/H224 F 40.7 5.2 13% 367% 2 3F
TI28N/PI29A/T99V/Q143 T[ 128 N]/P 129] A/T99 V/Q 143
290.0 72.9 25% 4203% 4 R/M 1 S6Q/H224F R/M156Q/H224F
VI58DT239I/E296VM298
V2ID/T99I/E154V/M156Q 216.3 32.5 15% 1951% 2 Q
T239I/Q286R T99I/Q143R 4.6 1.3 28% 41% 4
S222A/T239I S82A/T99I 1.7 15% 1
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
20.3 184% 1 /S222A/T239I/Q286R /S82A/T99I/Q143R
T239I/Q286RM298Q T99I/Q143R/ I56Q 11.3 4.0 35% 102% 4
Gla Intercambio de FIX/ Gla Intercambio de FIX
244.0 9.6 4% 2202% 2 T239I/Q286RM298Q 99I/Q143R/MI56Q
TI 28NP 129A/T239I/Q286 T[ 128N]/P 129] AT99I/Q 143
77.8 40.3 52% 1128% 5 R/M298Q R/M156Q
S222A/T2391H257A/Q286 S82A/T99I/H117A/Q143R/M
51.6 5.7 11% 466% 2 RM298Q 156Q
V 158D/T239VE296V 29
V21D/T99V/E15 V/ 156Q 1864.3 374.0 20% 16823% 2 8Q
VI58D/T239V/E296V 29 V21 DT99V/E 154V/M 156Q
4231.6 913.4 22% 61315% 4 8Q† t
T239V/Q286R T99V/Q143R 11.8 4.1 35% 106% 4
T239I/Q286R/M298Q/H37
T99I/Q 143R/M 156Q/H224F 13.1 3.8 29% 118% 3 3F
T128NPI29A/T239I/Q286 T[ 128]N/P[ 129] A/T99I/Q 143
113.3 43.7 39% 1 42% 5 R/M298Q/H373F† R/ 156Q/H224F†
H257S/Q286R/M298Q Hl I7S/Q143R/M156Q 27.4 4.1 15% 247% 4
Gla Intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX
20.5 3.6 18% 185% 2 /S8222A/H257S/QI43R /S82AH117S/Q143R
S222A/Q286RM298Q/
S82A/Q 143R/ 156Q/H224F 41.7 9.1 22% 376% 4 H373F
H257S/Q286R/ 298Q/H37 H117S/Q143R/ I56Q/H224
30.4 9.1 30% 274% 3 3F F
S82A/Q 143 R/M 156Q/H224
S82 A/Q 143 RM 156Q/H224F 430.2 126.8 29% 3883% 3 F
Gla intercambio de FIXS222A/ Gla intercambio de FIX/
192.1 36.8 19% 1733% 2 Q286R/ 298Q/H373F S82 AQ 143 RM 156Q/H224F
S222A/Q286RM298Q S82A/Q143R/M156Q 252.9 7.4 3% 2282% 2
Gla intercambio de FIX/ Gla intercambio de FIX/
414.7 81.3 20% 3742% 2 S222A/Q286R/M298Q S82A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/A175S/ T[ 128]NP[ 129]A/A39S/Q21
3.4 1.0 29% 30% 2 Q366V 7V
A122N/G124S/A17SS/ A[122]N/G[124]S/A39S/Q2I
3.0 0.8 26% 27% 4 Q366V 7V
TI28N/P129A/A17SS/ T[ 128]NP[ 129] A/A39S/S82
1.9 0.5 26% 17% 2 S222A A
T128NP129A/AI75S/ T[I28]N/P[I29]AA39S/Q14
3.3 1.2 37% 29% 4 Q286R 3R
A122N/GI24S/AI75S/ A( 122]N/G[ 124JS/A39S/Q 14
3.0 0.7 23% 27% 2 Q286R 3R
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX/
81.2 66.7 82% 732% 2 S222A/Q286R/H373F S82A/Q143R/H224F
V 158D/E296V/ 298Q/H37
V21 D/E 154 VM 156Q/H224F 1297.2 486.1 37% 11706% 4 3F
H257A/Q286R/ 298Q H117A/Q143R/M156Q 61.5 43.8 71% 555% 2
Gla intercambio de FIX/ Gla intercambio de FIX/
TI28N/P129AyA175S/S222 T[ 128]?/?[ 129] AA39S/S82 30.5 276% 1 A/Q286R A/Q143R
T128N/P129A/A175S/
?[ 128]??[ 129] A/A39S/S82
S222A/H257A/Q286R/M29 20.3 3.8 19% 183% 2
A/HI17A/QI43R/ 156Q
8Q
V 158D/Q286R/E296V/ 29 V21D/Q143R/E154V/ 156
573.6 100.4 18% 5176% 6 8Q/H373F Q/H224F
M298Q/Q366N/H373F† 156Q/Q217N/H224F† 125.9 75.2 60% 1825% 4
T239VM298Q/H373F† T99VMI56Q/H224F† 319.5 125.0 39% 4629% 6
T239I/M298Q/H373F† T99I/M156Q/H224F† 138.2 101.9 74% 2003% 7
T128N/P129A/Q286R/M29 ?[ 128]?/?[ 129]A/Q 143R/M 1
160.9 43.3 27% 2331% 4 8Q/Q366N/H373F† 56Q/Q2I7N/H224F†
T239V/Q286R/M298Q/Q36 T99V/Q143 MI 56Q/Q217
64.2 36.3 57% 931 3 6N† N†
T239I/Q286R/M298Q/Q36 T99I/Q 143 R/M 156Q/Q217?
88.8 23.5 26% 1287% 5 6N† †
† producido en células CHOX
§ producido en clon 52-5F7 de linea celular estable CHOX
Ejemplo 5
Determinación de la Inhibición de FVIIa/TF o FVIIa por AT- Ill/heparina
La potencia de la interacción entre el complejo de AT-III/heparina y FVIIa en la presencia o ausencia de factor de
tejido soluble (sTF) , esto es, dependiente de TF o independiente de TF, se evaluó al medir el nivel de inhibición de varias concentraciones de AT-III en la actividad catalítica de FVIIa/sTF hacia un sustrato, Mesil-FPR-ACC . El valor K0.5 se determinó para cada variante FVIIa probada, que corresponde a la concentración molar de AT-III que se requirió para inhibición al 50% (IC50) de la variante FVIIa en un ensayo de 30 minuto a temperatura ambiente (~25°)'. Dos ensayos separados se prepararon, uno con sTF y uno sin sTF. Una solución 2µ? de AT-III/heparina (heparina 5 µ? final) se preparó al mezclar 26.4 pL de 151.7 µ? AT-III (plasma AT-III humano purificado; Molecular Innovations) con 50 pL de 0.2 mM LMW heparina (CalBiochem) , 400 pL de solución amortiguadora de ensayo 5? (Hepes 100 mM, NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0..05%, PEG 8000 0.5%, pH 7.4) y 1.523 mL de agua de grado reactivo. Esta solución fue para usar como la concentración mayor en el ensayo dependiente TF. Una solución que contiene 4 µ? AT-III/heparina (heparina 5 pM final) se preparó para usar en el ensayo independiente TF al mezclar 52.8 pL de 151.7 pM AT-III (Molecular Innovations) con 50 pL de heparina 0.2 ' mM LMW (CalBiochem), 400 pL de solución amortiguadora de ensayo 5* y 1.497 mL de agua de grado reactivo. Las soluciones AT-III/heparina se incubaron durante 5-10 minutos a temperatura ambiente y luego diluyó dos veces en una placa de polipropileno de 96 pozos profundos con un volumen final de 1 mL
que contiene heparina 5 pM, que resulta en diluciones de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 y 0 nM, o 4000, 2000, .1000, 500, 250, 125, 62.5, y 0 nM. Las variantes FVIIa y FVIIa tipo silvestre se diluyeron a 250 nM en solución amortiguadora de ensayo 1* (20 mM Hepes, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0.01%, PEG 8000 0.1%, pH 7.4). Para el ensayo dependiente TF, complejos 5 nM FVIIa/50 nM sTF se formaron al mezclar 20 pL de FVIIa con 10 pL de 5 µ? sTF (R&D Systems Human Coagulation Factor III: #2339-??) , 200 pL de solución amortiguadora de ensayo 5? y 770 pL de agua de grado reactivo e incubaron las soluciones durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Para el ensayo independiente TF, 100 pL de FVIIa se mezcló con 200 pL de solución amortiguadora de ensayo 5? y 700 pL de agua de grado reactivo para producir 25 nM soluciones de FVIIa. Para comenzar el ensayo, 25 pL de la FVIIa/TF o FVIIa solamente las soluciones se mezclaron por separado con 25 pL de cada dilución de AT-III/heparina en pozos de una placa de ensayo de la mitad de área negra de 96 pozos (Nunc) . Las condiciones de ensayo final para el ensayo dependiente TF fueron 2.5 nM FVIIa/25 nM sTF y las concentraciones AT-III/heparina varían desde 1000 nM hasta 0 nM. Para el ensayo independiente TF, las concentraciones FVIIa fueron 12.5 nM FVIIa y las concentraciones AT-III/heparina varían desde 2000 nM hasta 0 nM. Las placas se incubaron durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente (~25°C) .
Una solución de reserva de sustrato FVIIa (Mesil-FPR-ACC) se preparó al disolver el sustrato en DMSO a 20 mM luego preparando una solución de trabajo de 0.5 mM en solución amortiguadora de ensayo 1*. Después de la incubación de la placa de ensayo de arriba, 50 µ? del sustrato FVIIa se agregó a cada pozo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la actividad residual de FVIIa se evaluó siguiendo las velocidades iniciales de escisión de sustrato durante 15 minutos en un lector de fluorescencia establecido a 30°C.
Para determinar el grado de inhibición por AT-III/heparina para variantes FVIIa o FVIIa, datos^ en bruto colectados con la aplicación SoftMax Pro (Molecular Devices) se exportaron como archivos .XML. Además se realizaron análisis de datos no lineales con XLfit4, un paquete de software para análisis estadístico y de ajuste de curva automático dentro del entorno de hoja de cálculo Microsoft Excel (Software IDBS) . La plantilla de hoja de cálculo se usó para calcular la dilución AT-III en serie, relación de AT-III hasta FVIIa, y las relaciones Vi/Vo para cada replicado FVIIa en cada concentración AT-III experimental. El análisis de regresión no lineal de actividad FVIIa residual (expresado como Vi/Vo) contra concentración AT-III se procesó usando XLfit4 y una ecuación de inhibición hiperbólica de la forma ((C+(Amp*(l-(X/ (K0.5+X) ) ) ) ) ; donde C = el desplazamiento (fijado en 0 para permitir extrapolación de conjunto de datos que no alcanzan 100%
de. inhibición durante el curso del ensayo) , Amp = la amplitud del ajuste y K0.5 , que corresponde a la concentración de AT-III requerida para la inhibición media máxima bajo las condiciones de ensayo. Para distintas variantes FVIIa, AT-III inhibido menos que 20-25% de la actividad de proteasa total en la concentración probada más alta de AT-III, que representa un limite superior de detección para el ensayo. Las variantes con menos que inhibición máxima 20-25% por consiguiente se les asignaron un valor K0.5 de limite inferior (5 µ? para dependiente de TF y 10 µ? para independiente TF) y en más casos se esperan que tengan resistencias AT-III mayores que el valor reportado.
Las Tablas 16 y 17 proporcionan los resultados de los ensayos que se realizaron usando variantes FVIIa expresadas en células 293-F Freestyle T y/o células BHK-21, en la presencia y ausencia de TF, respectivamente. Los resultados se presentan ambos como el parámetro K0.5 ajustado y como una representación del grado de Resistencia AT-III para cada variante comparada con el FVIIa tipo silvestre expresado como una relación de sus valores K0 . 5 ajustados (variante Ko.s/tipo silvestre 0. 5 ) · Las distintas variantes FVIIa exhibidas incrementan Resistencia a AT-III comparadas con FVIIa tipo silvestre. Por ejemplo, Q286R-FVIIa (esto es, FVIIa que contiene la mutación Q286R) , Q286R/S222A-FVIIa, Q286R/S222A/Gla Intercambio FIX-FVIIa, A175S/Q286R/Q366V-FVIIa, Q286M-FVIIa, Q286L-FVIIa y Q286Y-FVIIa están entre el
grupo que exhibe resistencia a AT-III en la ausencia de TF que fue sobre 4 veces mayor que de FVIIa tipo silvestre.
Tabla 16. Inhibición de variantes FVIIa por AT-III/hepar
en la presencia de TF
Ensayo de Resistencia ATIII Dependiente de TF
Mutación Células 293-F Células BHK-2193-F
Mutación
(numeración de
(numeración de FVII
quimotripsina)
maduro)
Ko (nM) Ko / o Ko.s (nM) Ko |/Ko
TN TN 72.3 1.0 56.0 1.0
V158D/E296V/M298Q V2ID/E154 / 156Q 75.1 1.0 79.0 1.4
Q286R QI43R 60.6 0.8 59.1 1.1
S222A S82A 47.6 0.7 43.9 0.8
H257S H117S 50.6 0.7 52.9 0.9
H373D H224D 423.6 5.9
H373E H224E 152.1 2.1
H373S H224S 64.2 0.9
H373F H224F 38.7 0.5
H373A H224A 76.9 l.l
Q366D Q2I7D 2239.2 31.0
Q366E Q217E 116.2 1.6
Q366N Q217N 75.3 1.0
Q366T Q217T 57.5 0.8
Q366S Q217S 107.2 1.5
Q366V Q217V 25.8 0.4 20.0 0.4
AI75S A39S 112.4 1.6
A122N/G124S A[122]N/G[124]S 48.2 0.7
Q286R/S222A QI43RS82A 53.3 1.0
Q286R/S222A/ Gla Q143 /S82A/Gla
83.7 1.2
Intercambio de FIX Intercambio de FIX
Q286R/M298Q Q143R/MI56Q 74.2 1.3
Q286R/M298Q/K.34IQ QI43R/M156Q/KI92Q 21.8 0.4
Q286RM298QK199E QI43R/ !56QK60cE 101.1 1.8
P32I PI70ÍK 97.5 1.7
P321E PI70ÍE 66.0 1.2
Ensayo de Resistencia ATIII Dependiente de TF
Mutación Mutación Células 293-F Células BHK-2193-F
(numeración de
(numeración de FVII
maduro) quimotripsina)
K„.5 (nM) K«.5mi]/ o.5tn ?^(??) Ko.5mut o.5tn
P32IY PI70ÍY 49.5 0.9
P321S P170ÍS 60.7 l.l
T239S T99S 254.6 3.5
T239Q T99Q II 7.2 2.1
T239V T99V 42.5 0.8
T239L T99L 8I.1 I.4
T239H T99H 52.0 0.9
T239I T99I 125.3 2.2
H257A/ 298Q HU7AM156Q 89.1 I.6
S222A/H257A/Q286R/ S82AHII7A/QI43 M1
66.6 0.9
M298Q 56Q
Q286R/Q366V Q143R/Q217V 62.0 1.1
A175S/Q286 /Q366V A39S/QI43R/Q217V 72.0 1.3
S222A/Q286R/Q366V S82A/QI43R/Q2I7V 38.5 0.7
Q286M Q143M 53.1 0.7
Q286L QI43L 114.4 1.6
Q286Y QI43Y 131.3 1.8
Q366I Q217I 23.2 0.3
Q366L Q217L 23.0 0.3
Q366M Q2I7M 35.4 0.5
Tabla 17. Inhihirrinn de variantes EVIIa por .KlVIIl/heparina en la au-senráa de TF
Un conjunto adicional de experimentos se realizaron para evaluar la inhibición de variantes FVIIa por AT-I I I/heparina en la ausencia de TF usando
el mismo ensayo como se describió anteriormente con menores modificaciones. La heparina no dividida ( Ca Ibiochem) , de longitud completa, se usó en lugar de heparina de bajo peso molecular ( LMW-heparina ) para incrementar la velocidad de la reacción de inhibición (ver por ejemplo, Olson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5) , 929-939) . El tiempo de incubación del ensayo se incrementó a 60 minutos, y la concentración del sustrato de mesil- FPR-ACC usado para determinar actividad residual se incrementó a una concentración final, de 0.5 raM.
La Tabla 18 proporciona los resultados de los ensayos que se realizaron en la ausencia de TF usando variantes FVIIa expresadas en células BHK-21 y células CHOX. Los resultados se presentan ambos como el parámetro k0.5 ajustado y como una representación del grado de resistencia AT-III para cada variante comparada con el FVIIa tipo silvestre expresado como una relación de sus valores K0. 5 ajustados (mutante 0 . 5/tipo silvestre K0. 5 ) . La desviación estándar (SD) y número de ensayos (n) también se muestran.
Tabla 18. Inhibición de variantes FVIIa por AT-
III/heparina en la ausencia de TF
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de Ko.s
maduro) quimotripsina) SD %CV n
(nM) Ko
TN (NovoSeven®) TN (NovoSeven®) 3
424.3 70.9 17% 1.08
3
TN (NovoSeven-RT®) TN (NovoSevenRT®) 424.2 60.5 14% 1.08 5
TN TN
393.8 67.8 17% 1.00 4
TN † TN † 503.0 120.0 24% 1.00 4
T128N/P129A T[128]N/P[I29]A 465.3 28.1 6% 1.18 2
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX 298.9 0.76 1 109N K.[109]N 330.1 72.3 22% 0.84 2
AI22N/GI24S A[I22]N/G[124]S 372.5 28.6 8% 0.95 2
S52AS60A S[52]A/S[60]A 360.6 0.92 1
M298Q I56Q 120.1 14.1 12% 0.31 5
M298Q† MI56Q† 130.0 14.3 11% 0.26 2
TI28N/PI29A/ 298Q† T[128]N/P[129]A/ 156Q† 143.9 14.5 10% 0.29 2
V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/ I56Q 2
75.5 10.1 13% 0.19
7
V158D/E296V/ 298Q† V21D/E154V/M156Q† 77.4 18.0 23% 0.15 7
T 128N/P 129 A/V 158 D/E296V/ T[ 128]N/P[ 129] A/V21 D/E 154
81.6 3.8 5% 0.21 .2 M298Q V/MI56Q
S52A/S60A/V 158D/E296V/ S[52]A/S[60]A/V21D/E154V/
78.8 2.9 4% 0.20 2 1298Q MI56Q
Q286 Q143R 2
1085.1 320.0 29% 2.76
0
TI28N/P129A/Q286R T[I28]N/P[129]A/QI43R 1645.2 440.2 27% 4.18 9
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de K .s Ko maduro) quimotripsina) SD %CV n
(nM)
T128NP129A/Q286R† T[I28]N/P[129]AQ143R† 1739.2 467.0 27% 3.46 5
S52A/S60A/Q143R S[52]A/S[60]A/Q143R 1318.0 376.8 29% 3.35 2
S222A S82A 383.5 84.4 22% 0.97 3
T128N/P129A/S222A T[128]N/P[l29]A/S82A 401.0 1.02 1
H257S H1I7S 722.8 1.84 1
Q366V Q217V 101.1 24.7 24% 0.26 3
Gla intercambio de FIXQ366V Gla intercambio de FIX/Q217V 108.2 5.8 5% 0.27 2
AI7SS A39S 1328.0 96.2 7% 3.37 3 109N/AI75S K[109]N/A39S 2031.8 401.2 20% 5.16 2
S119N/L121S/AI75S S[ll9]N/L[l2l]S/A39S 1637.2 171.3 10% 4.16 .2
T128N/P129A/AI75S T[128]N/P[129]A/A39S 1392.7 295.3 21% 3.54 2
AI22N/G124S/A175S A[122]N/G[124]S/A39S 1345.8 241.1 18% 3.42 2
Q286R/H257A QI43R H117A 2398.7 551.2 23% 6.09 9
Q286R/H257A† Q143R/HI17A† 2800.8 938.4 34% 5.57 5
Q286R/S222A QI43R/S82A 1203.0 191.2 16% 3.05 2
Gla intercambio de FIX/
Gla intercambio de FIXm28N/P129A/
T[128]N/P[l29]A/ 1703.2 145.2 9% 4.32 2 S222AQ286R
S82AQI43R
Q286R/S222AH257A Q143R/S82A/HII7A 2592.0 806.5 31% 6.58 4
Q286R/M298Q QI43R/ 156Q 299.3 62.9 21% 0.76 7
Q286R/M298Q† Q143R/M156Q† 2
287.3 26.6 9% 0.57
0
Q286R/M298Q § Q143RMl56Q§ 395.1 56.4 14% 0.79 3
Gla intercambio de FIX/Q286RM298Q Gla intercambio de FIX/Q143R/M156Q 281.6 43.2 15% 0.72 3
Gla intercambto de FIX/Q286R/M298Q Gla intercambto de FIX/Q143R/M156Q
238.2 21.6 9% 0.47 3 † t
T[ 128]NP[ 129] A/Q 143 R/ 15
T128N/PI29A/Q286R/ M298Q 1
283.7 49.4 17% 0.72 6Q 3
TI28N/PI29A/Q286R 298Q T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 RM 15
283.7 77.6 27% 0.56 3 † 6Q†
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX
/T128N/PI29A/Q286R/ /T[I28]N/P[I29]A/QI43R/ 508.2 197.0 39% 1.29 3
M298Q M156Q
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX
/T128N/PI29A/Q286R/ T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 R/M 1 325.2 82.2 25% 0.65 2
M298Q† 56Q†
{Gla intercambio de FIXE40L}/ {Gla intercambio de FIX/E[40]L}/
286.7 2.4 1% 0.73 2 Q286R/ 298Q Q143RMI56Q
{Gla intercambio de FIX/ 43I}/ {Gla intercambio de FIX/K[43]I>/ 244.3 29.8 12% 0.62 5
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de Ko
maduro) quimotripsina) SD %CV n
(nM) Ko
Q286RM298Q Q143 / IS6Q
{Gla intercambio de FIX/K43I}/ {Gla intercambio de FIX/ [43]I}/
219.3 13.7 6% 0.44 2 Q286R/M298Q† Q143R/M156Q†
{Gla intercambio de FIXQ44S) {Gla intercambio de FIX/Q[44]S}
271.4 12.4 5% 0.69 2 Q286R/ 298Q Q143R/MI56Q
{Gla intercambio de FIX/ 19 ) {Gla intercambio de FIX/M[19]K)
309.6 0.79 1 Q286R/M298Q Q143R/MI56Q
Gla swap FIX
Gla swap FIX /S52A S60A/
/S[52]AS[60] A/Q 143R/ 156 253.6 0.50 1 Q286R/ 298Q†
Q†
{Gla intercambio de {Gla intercambio de FIX/M[19]K/
FIX/M 19K/E40LK43I/Q44S}/ E[40]L/K[43]I/Q[44]S) 339.3 100.8 30% 0.86 2 Q286R/ 298Q /QI43R/M156Q
{Gla intercambio de {Gla intercambio de FIX [43]I}/
FIX/ 431}/TI28N Pl29A/ T[ 128]NP[ 129]A/Q 143R/M 15 222.5 10.7 5% 0.44 2 Q286R/ 298Q† 6Q†
S222A/H257A/Q286R
S82A/H 117A/QI 43RM 156Q 313.9 0.80 1 M298Q
T128N/P129A/S222A T[I28]NP[129]A/S82A/HII7
653.0 127.9 20% 1.66 4 H257A/Q286R/M298Q A/QI43R/MI56Q
TI28NPI29A/S222A/ T[ 128]N/P[ 129]A/S82A/H 117
327.7 23.2 7% 0.65 2 H257A/Q286R/M298Q† A/Q143 /M156Q†
S52A/S60A/S222A/H257A/Q2 S[52]A/S[60]A/S82AHl 17A/
447.6 117.6 26% 1.14 3 86 / 298Q Q143R/ I56Q
Q286R 298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 324.1 77.9 24% 0.82 3
TI 28N/P 129A/Q286R/M298Q/ T[ 129] N/P[ 129] AQ 143 R/ 15
345.8 24.2 7% 0.69 3 Q366N† 6Q/Q217N†
{Gla intercambio de {Gla intercambio de
FIX/ 43I}/Q286R/ 298Q/Q3 FIX/ [43]I }/Q 143 R/M 156/Q2 404.4 48.0 12% 0.80 3 66N† 17N†
{Gla intercambio de FIX/K43I} {Gla intercambio de FIX/K[43]I}/
/T[ 128]N/P[ 129]A/Q286R/M2 T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 R/M 15 319.1 71.8 22% 0.63 2 98Q/Q366N† 6Q/Q2I7N†
Q286R H373F QI43R H224F 620.8 133.4 3% 1.58 2
T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143R/H22
T128N/P129A/ Q286R/H373F 590.4 104.2 18% 1.50 4
4F
Q286R 298Q/H373F Q143R/MI56Q/H224F 152.1 7.2 5% 0.39 3
T128N/PI 29A/Q286R/M298Q/ T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 R/M 15
182.6 43.2 24% 0.46 5 H373F 6Q/H224F
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de Ko K maduro) quimotripsina) SD %CV n
(nM) o
M298Q/H373F 156QH224F 81.7 10.5 13% 0.21 2
T 128N/P I29A /MI 56Q/H224F T[]28]N/P[129]A
89.1 3.8 4% 0.18 2 t /M156Q/H224F†
V21 D/Q 143 R/E 154VM 156Q V21 D/Q 1 3R/E 154 V/ 156Q 1
85.0 14.7 17% 0.22
3
S222A/T239V S82AT99V 967.3 282.6 29% 2.46 5
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX
2438.4 269.4 11% 6.19 2 /S222A/T239V/Q286R /S82AT99V/Q143R
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX
1343.5 507.1 38% 2.67 3 /S222A/T239V/Q286R† /S82AT99V/Q143R†
T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q 3626.9 1465.9 40% 9.21 4
Gla intercambio de FIX/ Gla intercambio de FIX/
483.7 65.6 14% 1.23 2 T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX/
314.3 0.62 1 T239V/Q286R/M298Q† T99V/QI43 / 156Q†
TI 8N/P129A/ T[I28]N/P[129]A/
266.4 52.1 20% 0.53 2 T239V/Q286R/M298Q† T99V/Q143R/M156Q†
S222AT239V/H257A/ S82A/T99V/HI 17AQI43R/M
469.3 133.2 28% 1.19 6 Q286R/M298Q I56Q
T128N/PI29A T[128]N/P[129]A/
S222A/T239V/H257A/ S82 A/T99 V/H 117 AQ 1 3R/M 326.5 55.3 17% 0.65 2 Q286R/M298Q† 156Q†
T239V/Q286R/H373F T99V/Q143 /H224F 630.6 194.0 31% 1.60 3
T128N/P129A/T239V/Q286R/ T[ 128N]/P 129] A/T99V/Q 143R
121.2 25.8 21% 0.24 4 M298Q/H373F† /MI56Q/H224F†
VI58D/T239I/E296V /M298Q V21D/T99I/E154V/M156Q 179.5 50.5 28% 0.46 5
T239I/Q286R T991/Q143R 5823.0 2185.5 38% 14.79 9
S222A/T239I S82A/T991 1149.8 12.8 1% 2.92 2
Glalntercambb de FIX/S222A/T239I/Q2 G¡a intercambio de FIX
3313.1 130.3 4% 8.41 2 86R /S82A T99I/Q143R
T239I/Q286R/M298Q T991/Q143R/ 156Q 1611.4 185.9 12% 4.09 2
Gla intercambio de FIX/ Gla intercam io de FIX
1171.3 104.5 9% 2.97 2 T239I/Q286R/M298Q /T99I/QI43R/ 156Q
TI28N/P129A T[128N]/P129]A
917.0 60.5 7% 1.82 3 T239I/Q286R/M298Q† T99I/QI 3R/ I56Q†
S222AT239I/H257A/Q286R/ S82A/T99I/H117AQ143R/ I
1223.6 18.9 2% 3.11 2 M298Q 56Q
T239I/Q286R/H373F T99I/Q143R/H224F 1007.6 29.8 3% 2.56 2
V 158DT239V/E296V/M298Q V2ID/T99V/E154V/M156Q 67.7 16.6 24% 0.17 4
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de Ko maduro) quimotripsina) SD %CV n
(nM) o
V158D/T239V/E296W 298Q
V21 DT99V/E 154V/M 156Q† 67.1 0.13 1 t
T239V/Q286 T99V/Q143R 1787.9 106.3 6% 4.54 2
T239I/Q286R/M298Q/ H237F T99I/Q 143 RM 156Q/H224F 370.4 3.0 1% 0.94 2
TI28N/P 129AT239I/Q286R/M T[ 128]N/P[129)AT99I/QI43R/
316.6 24.7 8% 0.63 2 298Q H237F† M156Q/H224F†
S222A/H257S/Q286R/ M298Q S82A/HI 17S/Q143R/M156Q 526.7 1.34 1
S222A/Q286R/M298Q/ H373F S82 A/Ql 43 R/M 156Q/H224F 163.2 46.9 29% 0.41 4
Gla intercambio de FIX/S222A Gla intercambio de FIX
163.5 58.2 36% 0.42 4 Q286R/M298Q/H373F S82 A/Q 143 R/M 156Q/H224F
S222A/Q286RM298Q S82A/QI43R/M156Q 308.4 119.9 39% 0.78 4
Gla intercambio de FIX/ Gla intercambio de FIX
266.3 104.2 39% 0.68 4 S222A/Q286R/M298Q S82AQ143R/MI56Q
T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/Q217
T 128NP 129AA 175S/Q366 V 332.6 56.2 17% 0.84 3
V
A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/Q217
A 122N/G 124S/A 175S/Q366V 336.1 11.0 3% 0.85 3
V
T128N/PI 29A/A 17SS/S222A T[ 128]NP[ 129] AA39S/S82 A 1913.4 4.86 1
A 122N/G 124S/A 17SS/S222A A[ 122]N/G[ 1 4]S/A39S/S82 A 1548.6 394.1 25% 3.93 2
T[ 128]NP[ 129JAA39S/Q143
T128N/PI 29AA 175S/Q286R 9545.5 2797.3 29% 24.24 2
R
A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/Q 143
A 122N/G 124S/A 175S/Q286R 6923.3 17.58 1
R
Gla intercambio de FIX Gla Intercambio de FIX/
587.3 5.1 1% 1.49 2 S222A/Q286R/H373F S82AQ143RH224F
H257AQ286R/M298Q HI17AQI43R/ I56Q 390.8 0.99 1
Gla intercambio de FIX Gla intercambio de FIX/
T128N/PI29AAI75S/ T[ 128]NP[ 129] A/A39S/S82A/ 6486.4 148.2 2% 16.47 2
S222A/Q286R QI43R
Gla intercambio de FIX/ Gla intercambio de FIX/
AI22N/GI24S/A175S/ A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82A/ 5524.0 1434.1 26% 14.03 2
S222A/Q286R QI43R
TI28N/PI29A/AI75S/ T[ 128]N/P[ 129JAA39S/Q143
2311.8 520.7 23% 5.87 2 Q286R/ 298Q R/M156Q
AI22N/G124S/AI75S/ A[I22]N/G[I24]S/A39S/Q143
1954.2 450.7 23% 4.96 2 Q286R/ 298Q RMI56Q
TI28N/P129A/A175S/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/S82A/
3212.9 1140.7 36% 8.16 2 S222A/H257A/Q286R/M298Q H117A/QI43R/M156Q
A122N/G124S/AI75S/ A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82 A/ 2972.8 751.2 25% 7.55 2
Mutación (numeración de FVII Mutación (numeración de Ko
maduro) quimotripsina) SD %cv n
(nM) Ko
S222A/H257A/Q286R/M298Q H 1 17A/QI 43R/ 156Q
TI 28N/P129A/AI 75S/ T[ 128]N/P[ i 29] A/A39S/Q 143
1 132.4 441.3 39% 2.88 2 Q286R/ 298Q/H373F R/M I56Q/H224F
A122N/G124S/A175S/ A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/Q 143
1000.1 184.3 18% 2.54 2 Q286R M298Q/H373F R I 56Q/H224F
V I58D/Q286R/E296V/ 298Q V21 D/Q 143 R/E 154 V M 156Q/
1
62.1 10.5 17% 0.16
/H373F H224F 1 298Q/Q366N/H373F† I 56Q/Q2I 7N/H224F 90.8 4.8 5% 0.18 2
T239V/M298Q/H373F† T99V M 156Q/H224F 46.6 7.9 17% 0.09 2
T239I/M298Q/H373F† T99I/M I56Q/H224F 178.7 29.7 17% 0.36 2
TI 28N P 129A/Q286R/M298Q/ ? 128]N P[ 129] A/Q 143R/M 15
148.3 12.9 9% 0.29 2 Q366N/H373F† 6Q/Q2I 7N/H224F
T239V/Q286R/ 298Q/Q366N
Q143R/ 156Q/Q217N/T99V 252.2 40.9 16% 0.50 2 †
T239I/Q286R/M298Q/Q366N
T99I/Q143R/M 156Q/Q217N 813.2 105.1 13% 1.62 2 †
T producido en células CHOX
§ producido en clon 52-5F7 de linea celular estable CHOX
Ejemplo 6
Evaluación in vivo de actividad pro-coagulante de polipeptido
FVIIa
Los modelos de ratón de hemofilia A se establecieron para evaluar la actividad pro-coagulante de polipéptidos FVIIa. La Hemofilia A fue inducida en ratones CD-1 por administración intraperitoneal dé anticuerpos anti-FVIII, seguido por remoción quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado. Ratones deficientes en FVIII (ratones FVIII_ ") también se usaron, pero no se trataron con
anticuerpos anti-FVIII. Los ratones se trataron luego con polipéptido FVIIa y la cantidad de pérdida de sangre en 20 minutos se midió para determinar la actividad pro-coagulante de los polipéptidos FVIIa.
A. Evaluación in vivo de actividad pro-coagulante FVIIa tipo silvestre
Un modelo de ratón de hemofilia A se estableció para evaluar la actividad pro-coagulante de polipéptidos FVIIa. La hemofilia A fue inducida en ratones CD-1 por administración de anticuerpos anti-FVIII, seguido por remoción quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado. Los ratones se trataron luego con polipéptido FVIIa y el tiempo necesario para detener el sangrado, y la cantidad de pérdida de sangre durante este tiempo, se midió para determinar la actividad pro-coagulante de los polipéptidos FVIIa.
Los ratones CD-1 machos se anestesiaron por administración intraperitoneal de tanto sodio de tiobarbital en 100 mg/kg, como eetamina en 100 mg/kg. La lidocaina se administró por inyección subcutánea en el cuello ventral para reducir la sensibilidad. La tráquea y arteria carótida se canularon a través de una pequeña incisión en el cuello para facilitar la respiración sin
restricción y la administración de anticuerpo anti-Factor VIII, Factor Vlla humano recombinante (rhFVIIa) y/o polipéptidos FVII modificados.
A los ratones canulados se les administraron 3.76 mg de anticuerpo anti-humano-FVI II de cabra . (Affinity Biologicals, lote IG129R4, ratón 612 BU/mi) en 40 µ?_. Esta dosis se determinó al conducir un experimento de respuesta de dosis inicial con el anticuerpo (usando 0.376, 0.94, 1.88 y 3.76 mg de anti-humano-FVIII ) , y evaluación de pérdida de sangre y tiempo de sangrado. Después de 20 minutos, las colas de los ratones se colocaron en placas en tubos 15 mL que contienen solución salina amortiguada con fosfato 39°C (PBS) durante un periodo de 10 minutos. En 30 minutos, las colas se removieron brevemente de la solución PBS y los últimos 5 mm de las colas se cortaron para iniciar el sangrado. Se observó el tiempo en el que comenzó el sangrado. Las colas se regresaron luego al tubo que contiene PBS 39°C y se permitió sangrar durante 5 minutos (pre-sangrado) para asegurar que los ratones han respondido al anticuerpo anti-FVIII. Después del pre-sangrado, a los ratones se les administraron polipéptidos FVIIa o el vehículo en el cual las proteínas FVIIa se prepararon y liberaron. Los polipéptidos FVIIa se diluyeron en cualquier PBS o una solución amortiguadora compuesta de cloruro de
sodio 52 mM, 10.2 mM cloruro de sodio deshidratado, 9.84 mM glicilglicina, polisorbato 80. 0.01% y manitol 165 mM. Las preparaciones FVIIa se administ aron en ya sea 1, 3 o 10 mg/kg, en un volumen equivalente a 3 ml/kg, por medio de las cánulas de la carótida y las colas se colocaron en placas en tubos nuevos que contienen PBS 39°C. El sangrado se vigiló durante un periodo de 20 minutos y los tiempos en los cuales el sangrado se detuvo se observaron. El tiempo de sangrado total se calculó como la suma de la duración de sangrado durante el pre-sangrado, y la duración de sangrado después de la administración de polipéptidos FVIIa, o PBS o solución amortiguadora.
Para determinar la cantidad de pérdida de sangre durante los episodios de sangrado, los contenidos de los tubos 15mL se evaluaron para el contenido de la hemoglobina. El Tritón X-100 se diluyó 1 en 4 en agua estéril y 100 se agregó a 1 mL de las muestras para causar hemolisis. La absorbancia de la muestras se midió luego en una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de pérdida de sangre, la absorbancia se leyó contra una curva estándar generada al medir la absorbancia en 546 nm de volúmenes conocidos de sangre de murino, diluida en PBS y hemolizada como arriba con Tritón X 100.
Un experimento se llevó a cabo comparando rhFVIIa
generado como se describió anteriormente con el FVIIa humano recombinante comercialmente disponible (NovoSeven®, Novo Nordisk) y la pérdida de la sangre se evaluó después de la administración de una dosis 3 mg/kg de cada proteina. La pérdida de la sangre en el grupo de vehículo (solución amortiguadora, n- = 15) fue 671.9 ± 57.89 µ? durante el periodo de 20 minutos. Esto se redujo por el rhFVIIa producido por Catalyst Biosciences a 264.1 ± 56.59 µ? y por NovoSeven® a 273.7 ± 53.93 µ? (n = 14). Este experimento demostró equivalencia entre las dos proteínas.
B. Análisis de la actividad coagulante de variantes FVIIa en ratones CD-1 con hemofilia A inducida
Los experimentos iniciales se llevaron a cabo para determinar la dosis requerida y tiempo y duración de efecto de anticuerpos anti-humano-FVIII cuando se da por la vía int raperitoneal para inducir hemofilia en ratones CD-1. Para el primer lote de anti-FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), este se basó inicialmente en la dosis usada para los experimentos de canulación, descritos anteriormente. La dosis determinada para causar un estado hemofílico (sangrado incontrolable durante un periodo de ensayo de 20 minutos) fue 7.54 mg/ratón (80 µ? de una solución de reserva 94.25 mg/ml) . Este lote tuvo
una actividad neutralizante de. 612 ratón BU/ml. Para el segundo lote de FVIII anti-humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, actividad neutralizante de 474 ratón BU/ml) la dosis usada fue 11.98 mg/ratón (120 µ? de una solución de reserva 99.8 mg/ml) y se administró en 6 horas antes de cortar la cola.
Para inducir hemofilia, los ratones CD-1 machos (25-35 g) se dosificaron intraperitonealmente con lote 1 o lote 2 de anti-FVIII antes del experimento. Los ratones CD-1 machos y FVIII~/_ se anestesiaron por administración intraperitoneal de un coctel de cetamina/xilacina¦ (45 mg/mL y 3.6 mg/mL, respectivamente, en solución salina) y colocó en una plataforma calentada (39°C) para asegurar que no hubo disminución en la temperatura corporal. El cuarto de procedimientos se mantuvo en una temperatura de 27.7°C (82°F) . Diez minutos antes de cortar la cola la cola se sumergió en 10 mis de PBS pre-entibiado (tubo centrifugo 15 mi; 39°C). Ocho hasta diez ratones se inyectaron con FVIIa humano recombinante (Novoseven®, Novo Nordisk) o polipéptidos FVII modificados diluidos en una solución amortiguadora compuesta de cloruro de sodio 52 mM, cloruro de sodio deshidratado 10.2 mM, glicina de glicilo 9.84 mM, polisorbato 80 0;01% y manitol 165 mM por medio de la vena de la cola en una inyección sencilla. El vehículo solo también se inyectó
en un grupo de ratones como un control. Si la inyección se perdió, el animal se excluyó, del estudio. La inyección con polipéptido FVIIa o vehículo se hizo 5 minutos antes de cortar la cola. Un corte de cola se hizo usando una navaja de afeitar 5 mm del extremo de la cola y la sangre se colectó en PBS durante un periodo de 20 minutos. Al final del periodo de colección, la pérdida de sangre total se evaluó. Los tubos de colección se mezclaron y una alícuota 1 mi de cada muestra se tomó y analizó para el contenido de la hemoglobina. El Tritón X-100 se diluyó 1 en 4 en agua estéril y 100 pL se agregó a las muestras 1 mL para causar hemolisis. La absorbancia de las muestras se midió luego .en una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de pérdida de sangre, la absorbancia se leyó contra una curva estándar generada al medir la absorbancia en 546 nm de volúmenes conocidos de sangre de murino, diluida en PBS y hemolizada como arriba con Tritón X 100.
1. Estudio de respuesta de dosis que evalúa la actividad coagulante FVIIa de tipo silvestre
También se realizó un estudio de respuesta de dosis en el cual 0.3, 1 ó 3 mg/kg de FVIIa de tipo silvestre se evaluó. Los ratones que reciben el vehículo pierden 1002.3 ± 60.71 L en el ensayo de 20 minutos. Esto . se redujo
significativamente en ratones que se administraron 3 mg/kg de FVIIa de tipo silvestre, hasta 415.5 ± 90.85 pL (p < 0.05 usando ruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reducir la dosis hasta 1 mg/kg resulta en pérdida sanguínea de 679.57 ± 83.95 pL y una dosis inferior de 0.3 mg/kg resulta en pérdida sanguínea de 852.42 ± 94.46 pL.
2. Análisis inicial de actividad coagulante de variante
FVIIa
La inyección solo de vehículo se usó como un control. Los ratones que reciben el vehículo solamente pierden 915.2 ± 105.6 pL en el ensayo de 20 minutos, que se redujo hasta 352 ± 99.86pL (media ± S. E. M) si los ratones se administraron con FVIIa humano recombinante . La cantidad de sangre perdida se redujo aún además hasta 165.8 + 48.41 pL si los ratones se administraron Q286R-FVIIa (esto es FVIIa que contiene la mutación Q286R) , hasta 141.3 ± 43.77 pL con Q286R/M298Q-FVIIa o hasta 129.5 ± 36.64 pL con V158D/E296V/M298Q-FVIIa . Los ratones administrados con S222A-FVIIa también muestran pérdida sanguínea reducida (hasta 225.7 ± 62.75 pL) comparados con ratones administrados con FVIIa de tipo silvestre. La administración de Gla Intercambio FIX-FVIIa, Q366V-FVIIa o A122N/G124S-FVIIa resulta en aproximadamente la misma cantidad de pérdida sanguínea como aquella observada en ratones que se
les da FVIIa humano recombinante (334.6 + 54.95pL, 321.7 ± 102.6 pL y 329.8 ± 83.91 pL respectivamente), mientras que los ratones que se administraron con H257A-FVIIa, S222A/Q286R-FVIIa, o H257A-FVIIa aparecen para tener pérdida sanguínea ligeramente mayor (390 ± 107 pL, 447.3 ± 127.7 pL y 443.7 ± 139.5 pL respectivamente).
3. Respuesta de dosis que evalúa la actividad coagulante de variante FVIIa
Un estudio de respuesta de dosis en el cual 0.1, 0.3,
1 ó 3 mg/kg de Q286R-FVIIa, S222 A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa o V158D/E296V/M298Q-FVIIa se administraron a los ratones. Los ratones que reciben el vehículo solamente pierden 915.2 ± 105.6 pL de sangre en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo significativamente en ratones que se administraron con 3 mg/kg de cualquiera de Q286R-FVIIa (141.3 ± 43.77 pL) , S222A-FVIIa (225.7 ± 62.75pL) o Q286R/M298Q-FVI la (129.5 ± 36.54 pL) (p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reduciendo la dosis hasta 1 mg/kg resulta en pérdida sanguínea de 641 ± 96.48 pL en ratones que reciben Q286R-FVIIa y 487.92 ± 92.07pL en ratones que reciben S222A-FVIIa. Las dosis inferiores de esta variante FVIIa resultan en aproximadamente la misma pérdida sanguínea (817.71 ± 107.94 pL y 900.34 ± 115.77 pL
para Q286R-FVIIa y S222 A-FVIIa respectivamente) como se observa en ratones que reciben el control de vehículo. En contraste, los ratones que reciben 1 mg/kg de Q286R/M298Q-FVIIa tienen significativamente pérdida sanguínea reducida (69.36 + 15.55 yL) comparados con los ratones de control solamente con vehículo. En dosis inferiores de 0.3 mg/kg y 0.1 mg/kg, la pérdida sanguínea fue 538.3 ± 94.04 yL y 664 ± 121.6 yL, respectivamente. Los ratones que reciben 0.3, 1 y 3 mg/kg de V158D/E296V/M298Q-FVIIa tienen pérdida sanguínea de 754.49 ± 121.6 yL, 481.95 ± 114.22 yL y 133.25 ± 50.09 yL respectivamente.
Los estudios de respuesta, de dosis adicionales se llevaron a cabo para Q286R-FVIIa, Q286R/M298Q-FVI la y V158D/E296V/M298Q-FVIIa y los datos combinados con aquellos de arriba. En los experimentos que evalúan el efecto de Q286R-FVIIa, el grupo que recibe el vehículo pierde 833.61 ± 73.95 yL de sangre. Esto se redujo significativamente hasta 196.71 ± 49.18 yL en ratones que se trataron con 3 mg/kg de Q286R-FVIIa. Reducir la dosis hasta 1 mg/kg resulta en pérdida sanguínea de 577.78 ± 66.29 yL. Cuando los ratones se dosificaron con 0.1 y 0.3 mg/kg de Q286R-FVIIa la pérdida sanguínea producida fue similar al valor del control de vehículo (739.58 ± 104.28 yL y 806.63 ± 65.17 yL, respectivamente). En los experimentos que evalúan
el efecto de Q286R/M298Q-FVIIa, el grupo de vehículo produce pérdida sanguínea de 902.42 ± 88.04 yL, que se redujo significativamente por el tratamiento con tanto 1 como 3 mg/kg de Q286R/M298Q-FVIIa hasta 145.17 ± 38.89 yL y 140.76 ± 33.36 yL de pérdida sanguínea. Reducir la dosis hasta 0.1 y 0.3 mg/kg resulta en valores de pérdida sanguínea de 664.03 ± 121.62 yL y 551.94 ± 67.60 yL respectivamente. En los experimentos que evalúan V158D/E296V/M298Q-FVIIa él grupo de control de vehículo demuestra pérdida sanguínea de 966.64 ± 57.97 yL, que se redujo significativamente por el tratamiento con V158D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg hasta 128.19 ± 27.73 yL. Reducir la dosis hasta 1 mg/kg lleva a pérdida sanguínea de 565.50 ± 65.78 yL y reducir la dosis además hasta 0.3 y 0.1 mg/kg produce pérdida sanguínea que fue similar al grupo de control (811.16 ± 71.87 yL y 893.62 ± 106.73 yL) . Se hizo el análisis estadístico por Kruskal Wallis seguido por prueba posterior de Dunn y importancia se aceptó cuando p < 0.05.
4. Actividad coagulante de H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa en una dosis de 3 mg/kg.
Un conjunto de experimentos probados H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa en una dosis de 3 mg/kg. La
inyección solo de vehículo se usó como un control. Los ratones que reciben el vehículo pierden 915.2 ± 105.6 yL en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo aún además hasta 211.1 ± 67.70pL si los ratones se trataron con H373F-FVIIa. La pérdida sanguínea se afectó menos durante el tratamiento con H216A-FVIIa, Q366D-FVIIa y Q366N-FVIIa, con valores de 558.6 ± 66.22, 577.1 ± 151.4 y 477.1 ± 112.6\iL respectivamente.
4. Actividad coagulante de intercambio Q286R/M298Q/Gla
FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa ,
Q286R/M298Q/K341D-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa en una dosis de 3 mg/kg.
La actividad coagulante de intercambio Q286R/M298Q/Gla FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa,
Q286R/M298Q/K341D-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVI la en una dosis de 3 mg/kg se evaluó en el modelo de ratón de hemofilia CD-1. La inyección solo de vehículo se usó como un control. Los ratones que reciben el vehículo pierden 803 ± 92.18 yL en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo por el tratamiento con S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa hasta 118.6 ± 63.27 L. El tratamiento con intercambio Q286R/M298Q/Gla FIX-FVIIa en 3 mg/kg reduce la pérdida sanguínea comparado con el grupo de vehículo desde 888.89 ±
104.76 µ?, hasta 171.83 ± 62.06pL. En los experimentos que evalúan Q286R/M298Q/K34 ID-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVIIa la pérdida sanguínea del grupo de vehículo fue 813.1 ± 82.66 L. Esto se redujo hasta 39.42 ± 5.53 pL .de pérdida sanguínea siguiendo el tratamiento con Q286R/M298Q/H373F-FVIIa. El Q286R/ 298Q/K34 ID-FVIIa aparece para ser menos efectivo en el ensayo, resultando en pérdida sanguínea de 636.7 + 121.6 µ?,.
5. Estudio de respuesta de dosis para evaluar la actividad coagulante de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa y Q286R/M298Q/H373F-FVHa
Se evaluó la respuesta de dosis para S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa en 0.3, 0.5, 1 y 3 mg/kg. Los ratones que reciben el vehículo pierden 832.48 ± 71.70 µ?? en el ensayo de 20 minutos. Esto se redujo significativamente en ratones que se administraron con 3 mg/kg de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa, hasta 118.63 ± 63.27 µ?, (p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reducir la dosis hasta 1 y 0.5 mg/kg resultan en una reducción importante en pérdida sanguínea (202.69 ± 77.60 µ?, y 366.52 ± 106.21 ih) y una dosis inferior de 0.3 mg/kg resultan en pérdida sanguínea que se compara más hasta niveles de vehículo (742.04 ± 112 µ?,) . Una respuesta de dosis
hasta Q286R/M298Q/H373F-FVIIa en 0.1, 0.3, 1 y. 3 mg/kg también se evaluó y en este experimento los ratones que reciben el vehículo tienen pérdida sanguínea de 813.15 ± 82.66 pL. Esto se redujo significativamente en ratones que se trataron con 3 mg/kg de Q286R/ 298Q/H373F-FVIIa, hasta 39.42 ± 5.52 pL (p < 0.05 usando ruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reducir la dosis hasta 1 y 0.3 mg/kg lleva a valores de pérdida sanguínea de 208.10 ± 105.12 y 508.9 ± 155.8 pL respectivamente. La dosis más baja probada de 0.1 mg/kg produce pérdida sanguínea que se aproximó a los niveles de control de vehículo (733.5 ± 152.88 pL) . .
C. Análisis de actividad coagulante FVIIa en ratones FVIII"/_
Un modelo de ratón de hemofilia A usando ratones deficientes en FVIII (ratones FVIII" _) también se usó para evaluar la actividad coagulante de polipéptidos FVIIa, usando los mismos protocolos como se describe arriba excepto que los ratones no se trataron con anticuerpos anti-FVIII .
1. Estudio de respuesta de dosis que evalúa la actividad coagulante FVIIa tipo silvestre
Se realizaron estudios de respuesta de dosis para evaluar la actividad coagulante de NovoSeven® y rhFVIIa de
tipo silvestre en ratones FVIII_ " en 0.3, 1, 3 y 6 mg/kg. En el experimento NovoSeven®, la pérdida sanguínea en el grupo de vehículo fue 912.79 ± 3.8.32pL, que se redujo significativamente por tratamiento NovoSeven® en 6 y 3 mg/kg (hasta 361.74 ± 55.28 pL y 586.98 ± 60.56 pL; p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reducir la dosis hasta 1 mg/kg resulta en pérdida sanguínea de 674.84 ± 46.88 pL y en la dosis más baja probada el valor fue 801.08 + 41.39 pL. En el experimento rhFVIIa de tipo silvestre> el grupo de control de vehículo produce pérdida sanguínea de 904.08 ± 15.38pL. Esto se redujo significativamente (p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) por rhFVIIa de tipo silvestre en 6 mg/kg hasta 451.04 ± 74.17 pL. Reducir la dosis hasta 3 mg/kg produce un valor de pérdida sanguínea de 695.75 + 60.50 pL mientras que reducir la dosis adicional hasta 1 y 0.3 mg/kg resulta en valores de pérdida sanguínea cercanos y en niveles de control de vehículo (846.08 + -34.17 pL y 936.43 ± 31.39 pL, respectivamente) .
2. Respuesta de dosis que evalúa la actividad coagulante Q143R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa y
V158D/E296V/M298Q-FVIIa
El primer conjunto de experimentos prueba FVIIa humano
recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) , . V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q286R-FVIIa y S222A-FVIIa en 3 mg/kg. La inyección solo de vehículo se usó como un control. Los ratones que reciben solo vehículo, tienen pérdida sanguínea de 942.9 ± 27.37 pL en el ensayo de 20 minutos. El tratamiento con NovoSeven® FVII, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q143R-FVIIa y S222A-FVIIa reduce la pérdida sanguínea hasta 468 ± 55.9 pL , 302.38 ± 73.12 pL , 697.26 ± 92.22 pL y 675.07 ± 35.29 pL respectivamente. Q143R-FVIIa, cuando se prueba de nuevo en ratones FVIII_ " en 3 mg/kg, demuestra una pérdida sanguínea reducida de 754.84 ± 60.96 pL comparado con el grupo de control de vehículo (935.54 ± 51.96 pL ) . Cuando se evalúan en 5 mg/kg, Q143R-FVIIa produce una reducción adicional en pérdida, sanguínea hasta 445.87 ± 79.62 pL comparado con el grupo de control de vehículo (960.42 ± 24.5pL) .
El segundo conjunto de experimentos fueron estudios de respuesta de dosis en los cuales V158D/E296V/M298Q-FVIIa y Q286R/M298Q-FVIIa se evaluaron en 0.3, 1 y 3 mg/kg. El tratamiento con V158D/E296V/M298Q-FVIIa en 3 mg/kg resulta en reducción importante en pérdida sanguínea (375.62 + 74.22 pL ) comparado con el control de vehículo (960.42 ± 24.5 pL ; p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . Reducir la dosis hasta 1 y 0.3 mg/kg
lleva a valores de pérdida sanguínea más cercanos a los valores de control, de 834.76 ± 54.38 pL y 841.62 ± 68.99 pL respectivamente. Un segundo experimento que evalúa un lote diferente de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produce un valor de pérdida sanguínea del control de vehículo de 912.79 ± 38.32 pL, que se inhibió significativamente en 3 y 1 mg/kg (247.24 ± 35.17 pL y 628.30 ± '37.36 pL; p < 0.05 usando Kruskal-Wallis seguido por prueba posterior de Dunn) . El tratamiento con una dosis inferior de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produce pérdida sanguínea que se aproximó a los valores de control (841.85 ± 19.32 pL) . En el experimento que evalúa el efecto de Q286R/ 298Q-FVIIa en ratones FVIII" _, el grupo de vehículo produce pérdida sanguínea de 941.39 ± 35.18 pL. Esto se inhibió significativamente en una dosis de 3 mg/kg, resultando en pérdida sanguínea de 258.92 ± 59.82 pL. En dosis inferiores de 1 y 0.3 mg/kg los niveles de pérdida sanguínea producidos fueron 616.82 + 78.43pL y 924.9 ± 38.01 pL, respectivamente.
D. Análisis de la actividad coagulante de variantes FVIIa adicionales al usar el Modelo de Hemofilia Inducido
La actividad coagulante de diversas variantes FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducido (IHM, por sus siglas en inglés) con ratones CD-1 descritos en el Ejemplo
ß.?, de arriba. El protocolo fue el mismo como se describe arriba, excepto para la evaluación de la variante Tl28N/P129A-FVIIa y la variante 156Q/H224F-FVIIa, en el cual se usaron diferentes lotes (tercero y cuarto, respectivamente) de anti-FVIII humano. Para el tercer lote de FVIII anti-humano (lote 3; Affinity Biologicals, lote IG1603R1, que neutraliza la actividad de 418 ratón BU/ml) la dosis usada fue 12.17 mg/ratón (120 µ? de una solución madre 101.4 mg/ml), que se administró en 18 horas antes de cortar la cola. Para el cuarto lote de FVIII anti-humano (lote 4; Affinity Biologicals, lote IG1639R1, que neutraliza la actividad de 875 ratón BU/ml) la dosis usada fue 8.04 mg/ratón (80 µ? de una solución madre 100.45 mg/ml. La pérdida sanguínea se midió como se describe arriba, y se presenta a continuación en la Tabla 19 como el porcentaje de inhibición (calculado usando los valores promedio para la variante de interés y dividiendo por el grupo de vehículo) , y el valor ED50 (determinado usando análisis de regresión no lineal- (usando software GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), limitando la parte superior e inferior de la curva de respuesta con la pérdida sanguínea observada con animales de control normales y tratados con vehículo, respectivamente.
Tabla 19.
Pérdida n Pérdida n sanguínea 1 HM; sanguínea 1HM;
Mutación Mutación
% de inhibición ED50 (mg/kg)
(numeración FVII maduro) (numeración quimotripsina)
(1.5 mg/kg)
T128N/P I 29A/Q286R/
TI I 28]N P[ 129]A/QI43R/H2
70 1
H373F 24F/
† polipéptido FVIIa producido de células CHOX
E. Análisis de la actividad coagulante de variantes FVIIa adicionales al usar el Modelo de Hemofilia Inducido
La actividad coagulante de diversas variantes FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducido (IHM) con ratones CD-1 descritos en el Ejemplo 6.B, de arriba. El protocolo fue el mismo como se describe arriba, excepto que para estos lotes' de experimentos 4 hasta 6 de anti-FVIII se usaron. Los detalles para estos lotes fueron como sigue: lote 4 (detallado arriba), para el quinto lote (lote 5; Affinity Biologicals, lote IG1593R2, que neutraliza la actividad de 255 ratón BU/ml) la dosis usada fue 12.25mg/ratón (120 µ? de una solución madre 102.1 mg/ml), que se administró en 6 horas antes de cortar la cola. Para el sexto lote (lote 6; Affinity Biologicals, lote IG1703R2, que neutraliza la actividad de 685 ratón BU/ml) la dosis usada fue 8.02 mg/ratón (80 µ? de una solución madre 100.2 mg/ml), que se administró a las 4pm en el día previo al experimento. La pérdida sanguínea se
midió como se . describe arriba, y se presenta a continuación en la Tabla 20 como el porcentaje de inhibición (calculado usando los valores promedio para la variante de interés y dividido por el grupo de vehículo) , en cada caso todas las dosis se muestran con los valores de inhibición correspondientes a continuación, y el valor ED50 (determinado usando análisis de regresión no lineal (usando software GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), limitando la parte superior e inferior de la curva de respuesta con la pérdida sanguínea observada con animales de control normales y tratados con vehículo, respectivamente.. El n/grupo' se refiere a la cantidad de ratones por grupo mientras que la n' en referencia al cálculo ED50 se refiere a, la cantidad de experimentos realizados con la variante.
Tabla 20.
Pérdida n/grupo Pérdida n sanguínea 1 HM; sanguíne
Mutación Mutación % de inhibición a 1 HM;
(numeración FVII maduro) (numeración quimotripsina) en cada dosis ED50
(mg/kg) (mg/kg)
Dosis (mg/kg)
0.1 03 1
T239V/ 298Q/H373F T99V/M 156Q/H224F 50 68 84 7-9 0.07 1
Sdo
vehículo:
n=16
T239I/M298Q/H373F T99I M 156Q/H224F 56 74 96 9-10 0.07 1
T128N P129A/Q286R/ T[ 128]N/P[ 129] A/Q 143 R/M 156 51 87 92 7-9 0.1 1 M298Q/Q366N H373F Q/ Q217N/H224F
T239V/Q286R/ 298Q/Q366N T99V/Q143R/M 156Q/Q217N 45 62 80 7-9 0.08 1
T239I/Q286R/M298Q/Q366N T991/Q 143R/ 156Q/Q217N 8 34 79 8-9 0.34 1
† la dosis fue 0.6 mg/kg
Ejemplo 7
Determinación constante de la cinética Michaelis Menten de la
actividad amidolitica de FVIIa en un sustrato de molécula
pequeña
La actividad amidolitica de las variantes FVII puede
evaluarse al medir la constante de los cinéticos Michaelis Menten del polipéptido FVIIa en el sustrato peptidilo Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA . AcOH ) . Tal
ensayo puede realizarse como sigue.
El factor de tejido purificado humano lipidado
(Innovin, Dade Behring, V R Cat# 68100-390 ) se incluye en el
ensayo para proporcionar la actividad óptima de FVIIa. El
complejo TF-FVIIa escinde a Spectrozyme FVIIa como un sustrato cromogénico altamente especifico que libera un paranitroanilina-cromóforo (pNA) , que puede vigilarse al medir la absorción en 405 nm. La actividad de enzima se determina al vigilar la absorbancia en 405 nm del pNA libre generado como una función de tiempo.
Las reacciones se realizan en tres concentraciones de enzima diferentes. Para la reacción, las variantes FVIIa se diluyen primero hasta 40 nM en 1 x solución amortiguadora de ensayo directa (Tris 100 mM pH 8.4, NaCl 100 m , CaCl2 5 mM, BSA al 0.01%) en un tubo 1.7 mL (tubos microcentrifugos de. baja adhesión de ISC Bioexpress) . La FVIIa se diluye además en la presencia de TF (Innovin, Dade Behring), al diluir hasta 2 nM en un reservorio de polipropileno de 12 pozos (Axygen) como sigue: 720 µ? 5? solución amortiguadora directa (Tris 500 mM pH 8.4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA al 0.05%), 180 µ? FVIIa 40 nM, y 2700 µ? 2><TF .(solución madre 6 nM reconstituida en 10 mL de agua) . La proteasa diluida se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. La solución madre 2 nM de FVIIa se diluye además en diluciones en serie 2 veces para dar una solución madre 1 nM y 0.5 nM de proteasa, respectivamente, también en la presencia de TF. Las reacción de dilución en serie son como sigue: primero, 1800 µ? de solución madre 2 nM de FVIIa/TF
de arriba diluido en 360 µ? 5 X solución amortiguadora directa, 900 µ? 2?, y 540 µ? de agua. Esta solución amortiguadora madre diluida se diluye de nuevo 1:1 en 1800 µ? 1*TF en solución amortiguadora directa.
Se hace una placa de dilución del sustrato Spectrozyme
FVIIa (American Diagnostica) . La solución madre de Spectrozyme FVIIa se hace por reconstitución del vial 50 µ????ee en agua destilada hasta 10 mM y almacena a 4°C. Dieciocho µ? (Spectrozyme FVIIa 10 mM) y 60 µ? + 20 µ? de agua (Spectrozyme FVIIa 7.5 mM) del Spectrozyme FVIIa 10 mM se agregan a paredes en dos columnas adyacentes de una placa de ensayo de polipropileno de 96 pozos (Costar) . Los dos pozos se diluyen en serie 2 veces bajando cada uno de los 8 pozos de la columna respectiva para hacer una serie de concentraciones de sustrato 10* en el intervalo desde 10 mM hasta 78 µ? de sustrato bajando los pozos de la primera columna y desde 7.5 mM hasta 58.6 µ? hacia los pozos de la segunda columna.
Cinco µ? de cada dilución de sustrato de Spectrozyme FVIIa se agrega a una placa de ensayo de área media clara de 96 pozos (Costar) . Cuarenta y cinco µ? de cada una de las tres diluciones FVIIa/TF se agregan a tres grupos de columnas de las diluciones en serie del sustrato. Durante esta etapa, se tiene cuidado para evitar introducir burbujas en los pozos
del ensayo. Si las burbujas se introducen, pueden removerse al pinchar con una aguja limpia antes de iniciar cada ensayo. Las placas luego se mezclan por agitación. Antes del inicio del ensayo, la longitud de la trayectoria de los pozos de ensayo se mide usando un espectrofotómetro lector de placa Spectramax Gemini. M5 (Molecular Devices) al tomar una lectura de punto final y usando la característica Pathcheck del software SoftMax Pro (Molecular Devices). El incremento en la absorbancia en 405 nm se mide cada 30 segundos durante una hora a 37°C.
El software SoftMax Pro se usa para convertir la velocidad de absorbancia (miliunidades/s g) a la concentración de pNA liberado (µ?/seg) al usar la longitud de trayectoria y el coeficiente de extinción del grupo de partida pNA en 405 nm, 9600 M"1 cm"1. La ecuación de conversión es como sigue: Velocidad ? (1/60 ? 1000) * (1/9600 ? longitud de trayectoria) * 100000. Los resultados para cada concentración de proteasa se grafican usando software Graph Pad Prism con la concentración de sustrato en el eje X y las velocidades µ?/seg determinadas en el eje Y. Usando software Graph Pad Prism 4 Km y Ymax se determina al fijar los datos a una ecuación Michaelis Menten como sigue:
Y - ( (kcatKm/1000000) ? X x [E])/(1+(X + Km)
donde; X es la concentración de sustrato (µ?)
Y es la actividad de enzima (µ?/seg)
kcatKm es la constante de especificidad (M 1 seg 1)
Km es la constante Michaelis. (µ?)
E es la concentración de enzima (µ?)
.Se establecieron los valores iniciales de E= 1, Km = X en 0.5 * Y max y kcatKm = 1000.
Ejemplo 8
Evaluación de la potencia de la interacción entre variantes
FVIIa y TFPI
La potencia de la interacción entre polipéptidos FVIIa, tal como aquellos proporcionados en la presente, y TFPI, puede evaluarse usando uno o más- ensayos. En un ejemplo, la potencia de la interacción, entre TFPI y un complejo FVIIa/TF se evalúa al medir el nivel de inhibición de varias concentraciones de TFPI en la actividad catalítica de un FVIIa/TF hacia un sustrato, Spectrazyme Vila. En otro ejemplo, puede usarse un ensayo de resonancia de plasmón de superficie de alto desempeño (SPR, por sus siglas en inglés).
A. Determinación del IC50 para Inhibición TFPI de FVIIa/TF
La potencia de la interacción entre TFPI y el complejo FVIIa/TF se evaluó al medir el nivel de inhibición de varias concentraciones de TFPI en la actividad catalítica de un
FVIIa/TF hacia un sustrato, Spectrazyme Vila. La concentración de TFPI que se requirió para inhibición al 50% (IC50) se calculó para cada variante FVII, y un estándar FVIIa.
Una placa de ensayo de área media clara de 96 pozos
(Nunc) se pretrató al agregar 150 µ?/???? de 1 ? solución amortiguadora de placa (Tris 100 mM pH 8.4, NaCl 100 mM, BSA al 0.01%, Tween-20 al 0.01%) a cada pozo e incubar la placa a 37 °C durante un mínimo de 1 hora. La solución amortiguadora se removió completamente al agitar y aplicar tinción a la placa y centrifugar la placa al revés para remover la solución amortiguadora restante. La placa se secó con aire durante 1 hora, y almacenó a temperatura ambiente (TA) .
En un tubo microcentrífugo de 1.7 mi (tubo microcentrífugo de baja adhesión de ISC Bioexpress), una mezcla de FVIIa/TF se preparó en un volumen total de 450 µ? al mezclar 9 µ? de FVIIa 250 nM (American Diagnostica, FVIIa de tipo silvestre o una variante respectiva para probarse) se mezcló con 337.5 µ? de 2* TF (Innovin; Dade Behring; producto liofilizado resuspendido en agua destilada 10 mL para generar 2X TF, que aproximadamente iguala 7 nM de TF lipidado) , 90 µ? 5* solución amortiguadora de ensayo (Tris 500 mM pH 8.4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA al 0.05%) y 13.5 µ? de agua, resultando en una solución que contiene FVIIa 5 nM y TF 5.2
nM. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que los componentes se formen en complejo. A cada pozo de 2 columnas en la placa de ensayo de área media clara de 96 pozos pretratadas, 25 µ? de la mezcla FVIIa/sTF respectiva se agregó y la placa se cubrió para prevenir la evaporación.
TFPI Recombinante Humano (R&D Systems) se disolvió inicialmente en 33 µ? glicerol al 50% (v/v) para hacer una solución madre 10 µ? para almacenamiento a -20°C. La solución madre TFPI se diluyó además hasta 1.5 µ? en una^ solución amortiguadora final 1* (Tris 100 mM pH 8.4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.01%) en una placa de almacenamiento de polipropileno como sigue: para cada proteasa probada, 87.5 µ? de una solución 1.5 µ? de TFPI se hizo al mezclar 1.3.1 µ? 10 µ? TFPI con 17.5 µ? 5* de solución amortiguadora de ensayo y 56.9 µ? de agua destilada. Se hicieron diluciones en serie 3 veces de la solución TFPI en 1* solución amortiguadora de ensayo al mezclar 27.5 µ? TFPI en 55 µ? 1* de solución amortiguadora de ensayo, de manera que las soluciones que contienen 750 nM, 250 nM, 83.3 nM, 27.8 nM, 9.26 nM, 3.1 nM, y 1.03 nM de TFPI se generaron. El pozo final de las series contiene solamente 1* de solución amortiguadora como un control .
Veinticinco µ? de cada dilución de TFPI se agregó a 2
pozos (esto es en duplicado) de 2 columnas de la placa de ensayo de área media clara de 96 pozos que contienen la mezcla FVIIa/TF, de manera que la mezcla de proteasa se procesó por ensayo en duplicado con cada dilución TFPI . Una solución de 1* de solución amortiguadora de ensayo sin TFPI también se agregó a 2 pozos que contienen la mezcla FVIIa/TF como un control negativo. La placa se agitó brevemente y luego centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos antes de la incubación a 37 °C durante 1.5 horas.
Una solución ' madre de Spectrazyme Vila (American
Diagnostica) se preparó al reconstituir 50 pmoles en 5 mi de agua destilada hasta 10 mM y almacenar a 4°C hasta su uso. Inmediatamente antes de su uso, la solución se diluyó hasta 600 µ? en agua destilada. Después de la incubación de la placa de ensayo de arriba, 10 µ? del Spectrazyme Vila diluido se agregó a cada pozo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la placa se incubó a 37 °C. El incremento en absorbancia a 405 nm se midió cada 30 segundos durante una hora a 37°C, y la velocidad de absorbancia se calcularon usando software SoftMax Pro (Molecular Devices) .
Para determinar el grado de inhibición por TFPI, las velocidades de absorbancia de las reacciones de proteasa que contienen TFPI se dividieron primero por la velocidad de absorbancia de reacciones que no contienen TFPI (la muestra
de control) para obtener la actividad fraccional, y el logio de cada concentración TFPI se determinó. Usando Software GraphPad Prism, el logio [TFPI] se gráfico contra la actividad fraccional para cada proteasa, y una curva de respuesta de dosis se generó con un ajuste de curva que asume la parte superior e inferior de los datos de la actividad se fijan en 1 y 0, respectivamente. El software se usó para determinar la inhibición TFPI como tanto el valor log IC50 (pIC50) , y el IC50 absoluto (inhibición TFPI en nM) para cada proteasa, y se determinó su promedio y desviación estándar.
El nivel de inhibición de TFPI de cada una de las variantes FVIIa en complejo con TF lipidado (Innovin; Dade Behring) se determinó y expresó como el incremento en veces de resistencia TFPI comparado con FVIIa de tipo silvestre (Tabla 21) .
Tabla 21. Inhibición de variantes FVIIa por TFPI
Al 22N/G 124S E394N/P395A R396S A[ 122]N/G[ 124] S/E245N P246A/ 1.0
R247S
B. Separación por exclusión de resonancia de plasmón de superficie (SPR) de variantes FVIIa para resistencia a TFPI La resistencia relativa de varias variantes FVIIa para la inhibición por TFPI soluble recombinante humano se evaluó usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie de alto desempeño (SPR) con el instrumento Biacore T100. La resistencia relativa de variantes FVIIa para la inhibición por TFPI se evaluó por la medición de la cantidad relativa de variante FVIIa enlazada a TFPI soluble inmovilizado en un chip de sensor Biacore CM5 comparado con la cantidad de FVIIa de tipo silvestre enlazado posterior a un tiempo de inyección estandarizado y concentración de proteasa.
Para cada experimento, el TFPI soluble (R&D Systems) se inmovilizó a un chip de sensor Biacore CM5 Series S de 4 células de flujo nuevo (GE Healthcare) usando el protocolo de acoplamiento de amina disponible dentro del Software de control Biacore T-100 (GE Healthcare) y los reactivos proporcionados con el Kit de Acoplamiento de Amina (GE Healthcare) . Todas las cuatro células de flujo disponibles se utilizaron para inmovilización de dos densidades diferentes de TFPI y albúmina de suero de bovino (BSA, por sus siglas en inglés) , que sirven como un agente de bloqueo en las células de referencia. BSA se
diluyó hasta 5 pg/mL en acetato de sodio (pH 4.0) e inmovilizó en 1 y 3 células de flujo en 1000 y 2000 unidades de respuesta (RU) , respectivamente. Para inmovilización TFPI, TFPI soluble liofilizado (10 pg) se volvió a suspender en 100 pL de 1? de solución amortiguadora de acoplamiento (Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 raM, Tween-20 al 0.01 %, pH 7.4) a una concentración de 0.1 mg/mL. Un total de 20 pL de 0.1 mg/mL TFPI como se diluye hasta 10 pg/mL en acetato de sodio pH 4.0 para inmovilización hasta 2 y 4 células de flujo en 1000 y 2000 RU, respectivamente. La solución amortiguadora de acoplamiento se usó como la solución amortiguadora de corrida durante las etapas de inmovilización. Cada muestra de FVIIa se preparó en una concentración final de 320 nM en 1? solución amortiguadora de corrida (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 al 0.1%, BSA al 0.1%, Tween-20 al 0.01%, pH 7.4) que contiene sTF 620 nM (Factor de Coagulación Humano III; R&D Systems) . Generalmente, cada variante FVIIa se diluyó 10 veces en 1* de Solución amortiguadora de Corrida antes de la dilución final de 320 nM. Los complejos FVIIa/sTF se prepararon en un volumen final de 120 pL en duplicado permitiendo hasta 48 variantes FVIIa únicas para cargarse en una placa de almacenamiento de 96 pozos y evaluarse con inyecciones en duplicado en una corrida sencilla. El complejo FVIIa/sTF se incubó a TA durante 10-15 min antes del inicio de la primera inyección de muestra.
Un método de análisis de enlace estandarizado se creó dentro del Software de Control Biacore (GE Healthcare) en el cual cada replicado FVIIa se inyecctó durante 180 segundos de tiempo de asociación seguido por un tiempo corto de 60 segundos de disociación en una .velocidad de flujo de 10 L/min. La regeneración del chip de sensor seguido de la fase de disociación durante 30 segundos con glicina 10 mM, NaCl 500 mM, pH 3.0 y luego un periodo de estabilización de 60 segundos con IX de Solución amortiguadora de Corrida en la misma velocidad de flujo 10 pL/min. Dos puntos de referencia del ensayo se registran para cada corrida y análisis de datos posteriores, unos 5 segundos antes de la conclusión de la fase de asociación (enlace) y un segundo reporte 5 segundos antes de la conclusión de la fase de disociación (disociación) . Antes de iniciar un ensayo completo, él chip de sensor se probó con una inyección sencilla de 320 nM de FVIIa/sTF de tipo silvestre durante' 180 segundos, que deberá dar una respuesta de aproximadamente 400-450 RU y 750-850 RU para enlazar a células de flujo 2 (1000 RU) y 4 (200 RU) , respectivamente.
El análisis de datos se realizó primero con el Software de
Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare) para inspeccionar los parámetros de validación del ensayo, que incluye verificar que el enlace a la célula de referencia sea mínimo, desviación de la línea base y el enlace de inyecciones blancas de control
(solución amortiguadora de corrida) . Las tablas de datos se generaron dentro de esta solicitud que indican la cantidad de enlace variante FVIIa (en RU) en tanto el punto de reporte de enlace y el punto de reporte de disociación. Las tablas de datos se exportaron posteriormente para análisis adicional dentro del ambiente de la hoja de cálculo de Microsoft Excel. Los puntos de datos naturales (enlace de RU) se corrigieron para enlace de control para el chip de sensor y luego una relación de la cantidad de enlace FVIIa de tipo silvestre (en RU) a la cantidad de enlace variante FVIIa (en RU) se tomó para cada parámetro y reportó como Enlace (p/ ariante) y Disociación (p/variante) . La Tabla 22 presenta los resultados del estudio. La resistencia a la inhibición TFPI se refleja como un incremento en la relación para uno o ambos de los parámetros evaluados. Por ejemplo, un valor de Enlace (p/variante) o Disociación (p/variante) de 20 para una variante FVIIa particular indica que tal variante es 20 veces más resistente a . la inhibición TFPI que FVIIa de tipo silvestre. Diversas variantes muestran resistencia incrementada para la inhibición TFPI. Por ejemplo, las variantes que contienen la mutación K341D (numeración de FVII maduro) tal como Q286R/M298Q/K341D-FVIIa, Q286R/K34 ID-FVIIa y M298Q/K34 ID-FVIIa, tienen relaciones que indican resistencia importante a TFPI (mayor que 40-150 veces) . En algunos casos, la velocidad de disociación se afectó más que la velocidad de asociación.
Tabla 22. Resistencia de variantes FVIIa para la inhibición por TFPI
Ejemplo 9
Análisis farmacocinético de polipéptidos FVIIa
Las propiedades farmacocinéticas de los polipéptidos FVIIa se evaluaron al medir la cantidad de Factor Vlla humano
en plasma de ratón. Dos ensayos pueden usarse para cuantificar FVIIa. en plasma. Un ELISA puede usarse para cuantificar la proteína FVIIa total en plasma de ratón y un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa ( FVIIa :C) usado para cuantificar la actividad coagulante de los polipéptidos FVIIa en plasma.
?. Administración de polipéptidos FVIIa para ratones
Los polipéptidos FVIIa modificados y la proteína FVIIa humano recombinante no modificado (rhFVIIa) (NovoSeven®, Novo Nordisk) se evaluaron en estudios farmacocinéticos . Para cada estudio, 18 ratones CD-1 machos se inyectaron con una dosis de bolo intravenosa (0.1-3.0 mg/kg, dependiendo del estudio) de rFVIIa. En 5, 15, 30, 60, 120, y 240 minutos después de la inyección, tres ratones de cada protocolo de inyección se les aplicaron la. eutanasia usando asfixia CO2 y aproximadamente 1.0 mL de sangre se retiró en un jeringa de 1.0 mL por medio de una punción cardiaca percutánea. Cada jeringa se pre-cargó con suficiente citrato de sodio para alcanzar una concentración final de 3.2% en 1 mL de sangre. Las muestras de sangre luego se centrifugaron a 9000 rpm durante 8 min a 4°C. El plasma se removió en tubos de 1.5 mi individuales etiquetados (Eppendorf) , congelado inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenado a -80°C. Adicionalmente , un
ratón por experimento se inyectó con solo vehículo (simulado) y el plasma de este ratón se usó para determinación de actividad FVIIa de respaldo.
B. Ensayo ELISA
Un kit comercialmente disponible, ELISA . Factor VII IMUBIND® (American Diagnostica) se usó para detectar proteína FVII en suero por ELISA. Este kit emplea una placa pre-cubierta con un anticuerpo anti-FVII/FVIIa para capturar la proteína, y un anticuerpo anti-FVII biotinilado para detección a través de una peroxidasa de raíz de rábano etiquetada con estreptavidina . El kit se usó de acuerdo con la dirección de los fabricantes con las siguientes excepciones: primero, la curva estándar se ha reducido para asegurar un intervalo lineal sobre el intervalo de concentración completo y espaciando las concentraciones de 0.88 ng/ml hasta 10 ng/ml; segundo, la variante FVIIa purificada por sí misma se usó para la curva estándar. en vez de el estándar FVII proporcionado con el kit debido a las diferencias en la afinidad de anticuerpo. Los experimentos indican que el complejo de FVIIa con anti-trombina III (ATIII), un inhibidor de plasma potencial de FVIIa, se detecta en 75% del nivel de la proteasa libre, asegurando que el. ensayo puede detectar el FVIIa total en la muestra de
plasma en tanto las formas . activas como inactivas. Brevemente, las muestras de plasma se congelaron a temperatura ambiente y diluyeron 10 veces en solución amortiguadora de muestra (PBS + Tritón X-100 al 0.1% + BSA al 1.0%) luego se diluyeron en serie 5.5 veces durante cuatro diluciones. Las cuatro muestras diluidas se diluyeron 2 veces en la placa ELISA para diluciones de muestra finales de 20, 110, 605 y 3327.5 veces. Estas cuatro diluciones de plasma de ratón cubren un intervalo de concentraciones de proteasa de 33,000 ng/ml hasta 20 ng/ml. Cada muestra se midió en dos placas de ensayos separados, y aquellas mediciones dentro del intervalo de la curva estándar se usaron para calcular la concentración de la variante FVIIa en la muestra de plasma
C. Ensayo de Coagulación
Un kit comercialmente disponible (STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) se usó como el ensayo de coagulación. Para determinar la actividad coagulante de los polipéptidos FVIIa activos, las muestras de plasma se procesaron por ensayo usando un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVIIarC). El ensayo se realizó usando reactivos e instrucciones proporcionadas en un kit comercial y el tiempo de coagulación se mide usando un instrumento de detección de coagulación electromecánico (STArt4, Diagnostica
Stago, Parsippany, NJ) . El kit se usó de acuerdo a la dirécción de los fabricantes con las siguientes excepciones: primero, la variante FVIIa purificada por si misma se usó para la curva estándar en vez de el estándar rhFVIIa proporcionado con el kit; segundo, los siguientes reactivos comerciales de volumen se usaron para estudios de separación por exclusión farmacocinéticos y dan resultados comparables con los reactivos del kit: factor de tejido soluble (CalBioChem, La Jolla, Ca) y mezcla de fosfolipido sintético (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) , solución amortiguadora TBSA (Tris-NaCl, pH 7.5 con BSA al 1%; DiaPharma, West Chester, Ohio) , y solución . de cloruro de calcio 25 µ? (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) .
El ensayo de coagulación se realizó como sigue. Las muestras de plasma congeladas se descongelaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min y luego se diluyeron 1:5000 en solución amortiguadora. Cincuenta µ? del plasma diluido se combina con 50· \iL de plasma humano deficiente del Factor VII y 50 µ?, del factor de tejido relipidado y preincubado durante 180 segundos. Después de la preincubación, 50 pL de solución de cloruro de calcio (25 µ?) se agregó para iniciar la coagulación. El tiempo de coagulación se determinó usando detección de coagulación electromecánico. Cada muestra de plasma se procesó por ensayo
en duplicado. El sistema se calibró al construir una curva estándar usando el tiempo de coagulación de diluciones en serie de la solución amortiguadora que contiene una cantidad conocida de la variante FVIIa especifica que se procesa por ensayo. Las concentraciones FVIIa en muestras de plasma de ratón se calcularon de la porción lineal de la curva estándar de tiempo de coagulación log FVIIa contra Log. La capacidad de las muestras de plasma para inducir coagulación en plasma deficiente de Factor VII se reportó como ng FVIIa/mL de plasma de ratón después de la sustracción de respaldo de FVIIa de tipo silvestre endógeno en plasma de ratones tratados simulados.
La vida media de cada proteina FVII se determinó de forma rutinaria al hacer un ajuste convencional del · log natural de la actividad para una linea recta, y medir el tiempo tomado para la actividad de proteínas FVIIa para reducirse por la mitad. Para proteínas FVII con descomposición exponencial múltiple, la vida media se determinó de la porción terminal del plasma log VS perfil de tiempo. Los parámetros farmacocinéticos adicionales se calcularon como sigue: Plasma AUCo-inf/Dosis (calculado como [AUC(o-t) + Ct/ (ln2/Ti 2) ] , donde t es el último punto de tiempo con concentración de plasma medible del polipéptido FVIIa dividido por la dosis IV (mg/kg) ) ; vida media (la vida
media del polipéptido FVIIa durante la fase terminal de concentración FVIIa de plasma contra perfil de tiempo; Ti/2 se calcula como -ln2 dividido por la inclinación negativa durante la fase terminal del grupo lineal log de la concentración FVIIa de plasma contra curva de tiempo) ; MRT0-úitimo (tiempo medio del polipéptido FVIIa reside en el cuerpo; calculado como AUMC o-üitimo/AUC o-úitimo, donde AUMC0-úitimo es el área total bajo la primera curva del momento contra tiempo (concentración ' tiempo contra curva de tiempo) , y se calcula por la regla de trapezoide lineal); Cl (depuración sistémica; calculada como Dosis/AUC o-inf) ; y V d (volumen de distribución con base en la constante de eliminación terminal e (ß); calculado como [Cl/ ( ln2/Ti/2) ] ) .
D. Propiedades farmacocinéticas de variantes FVIIa
Usando el protocolo FVIIa :C descrito arriba, las propiedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo silvestre y variantes FVIIa se evaluaron con base en la activada de coagulación en el plasma. Los resultados se establecen en la Tabla 23. Diversas variantes FVIIa muestran parámetros farmacocinéticos mejorados comparados con FVIIa de tipo silvestre .
Tabla 23. Parámetros Farmacocinéticos de Ratón de Variantes
FVIIa
Plasma
Vida
Mutación (numeración de Dosis IV MRTO Cl Vd
AUCO-inf
media
FVII maduro) (mg/kg) -último (mL/m (mL N
(ug.min/mL)
/Dosis (min) (min) in/kg) /kg)
T239V/Q286R/M298Q/H373F 0.1 950 36 61 1.1 55 1
.T239V/Q286R/M298Q H373F 0.1 806 32 56 1.3 57 2
T239V/Q286R/M298Q/H373F 0.1 663 27 52 1.5 59 1
T239V/Q286R/M298Q/H373F 0.1 1350 53 62 0.7 57 1
S222A/H257S/Q286R/M298Q 0.1 814 33 31 1.2 59 1
H257S/Q286R/M298Q H373F 0.1 297 34 34 3.4 163 1
S222A/Q286R/M298Q/H373F 0.1 106 35 23 9.4 478 1
Gla intercambio FIX /S222A/ 9.1(a), 17
Q286R/M298Q H373F 0.1 104 (? 13 9.7 242
S222A/Q286R/M298Q 0.1 347 24 26 2.9 102 1
Gla intercambio FIX /S222A/
0286R/M298Q 0.1 263 1 1 13 3.8 62 !
52(á),
T128N/P129A/A175S/Q366V 0.1 2196 85(a) 78 0.5 56 ,
A122N/G124S/A175S/Q366V 0.1 2148 92 81 0.5 62 1
T128N P129A/A175S/S222A 0.1 4248 122 88 0.2 41 1
A 122N/G 124S/A 175S/S222 A 0.1 3316 102 83 0.3 44 1
T 128N P129A A175S/Q286R 0.1 6160 151 94 0.2 35 1
A122N/G124S/A175S/Q286R 0.1 4097 139 93 0.2 49 1
Gla intercambio FIX
/S222A/Q286R/H373F 0.1 480 26 30 2.1 79 ,
8.7(á),
V258D/E296V/M298Q H373F 0.1 90 20(a) 14 1 1.1 321 !
H257A/Q286R/M298Q 0.1 1029 42 48 1.0 59 1
Gla intercambio FIX ??28?/ 38(á),
P 129A/A 175S/S222 A/Q286R 0.1 2787 134(a) 88 0.4 69
Gla intercambio FIX /A122N/
G 124S/A 175S/S222 A/Q286R 0.1 3492 148 95 0.3 61
T I 28N P129A/A175S/Q286R/
M298Q 0.1 5120 171 96 0.2 48
A122N/G124S/
A175S/Q286R/M298Q 0.1 3681 154 92 0.3 61
T128N/P129A/A175S/S222A/
H257A/Q286R/M298Q 0.1 3140 113 87 0.3 52
A122N/G124S/A175S/S222A 37.(á),13
/H257A/Q286R M298Q 0.1 2659 0(á) 85 0.4 70
T128N P129A/A175S/Q286R
M298Q H373F 0.1 3580 118 88 0.3 48 i
A122N/G124S/A175S/Q286R/
M298Q H373F 0.1 3148 105 84 0.3 48 !
V 158D/Q286R E296V/M298
Q/H373F 0.1 124 20 17 8.1 237 !
M298Q/H373F/Q366N 0.1 169 . 8 8.2 5.9 69 1
T239V/M298Q/H373F 0.1 1 10 18 16 9.1 235 1
T239I M298Q H373F 0.1 562 26 28 1.8 66 1
T128N/P129A/Q286R M298Q
/Q366N/H373F 0.1 607 29 30 1.6 69 ,
T239V/Q286R/M298Q/
Q366N 0.1 729 29 30 1.4 57 J
T239I/Q286R/M298Q/Q366N 0.1 1548 72 73 0.6 67 1 vida media alfa, medición de la vida media
distribución
ß = vida media beta, medición de la vida media de eliminación
La Tabla 24 establece los resultados del estudio usando los siguientes parámetros farmacocinéticos : % de recuperación (in vivo) (la concentración de plasma medida de FVIIa en 5 minutos después de la dosis (primer punto de tiempo) dividido por la concentración de plasma FVIIa máxima teórica (con base en la masa FVIIa administrada y volumen de sangre total teórica) veces 100%); % de recuperación (in vitro) (la concentración FVIIa medida en plasma inoculado con una cantidad conocida de FVIIa dividido por la concentración de plasma FVIIa teórica (con base en la cantidad de masa FVIIa inoculada en un volumen de plasma conocido) veces 100%); Actividad/Dosis AUC* (Dependiente de TF) (el plasma AUC/Dosis multiplicado por la Actividad Indirecta Dependiente de TF (ver Tabla 15, de arriba); Mejora en la Exposición de la Actividad sobre NovoSeven® FVIIa (Dependiente de TF) (calculado por Actividad/Dosis AUC* (Dependiente de TF) Novose en®
Fvna/Actividad/Dosis AUC* (Dependiente de TF)raia mutante) ' Actividad/Dosis AUC* (Independiente de TF) (el plasma AUC/Dosis multiplicado por la Actividad Indirecta
Independiente de TF (ver Tabla 15, de arriba); Mejora en la Exposición de la Actividad sobre NovoSeven® FVIIa (Independiente de TF) (calculado por Actividad/Dosis AUC* (Independiente de TF) Novoseven® Fvi i a/Actividad/Dosis AUC* (Independiente de TF) FVIIa Mutante ) ·
Tabla 24.
Ejemplo 10 Determinación del Factor Vlla enlazado a Factor de
Tejido Soluble
La capacidad de las variantes FVIIa expresadas de células HEK 293 o BHK para enlazar el factor de tejido soluble (sTF) se evaluó usando resonancia de plasmón de superficie Biacore. Las variantes FVIIa se evalúan a través de la medición del perfil de enlace en tres concentraciones de proteasa en dos experimentos en duplicado, usando dos niveles diferentes de sTF enlazado a un chip Biacore CM5.
Un nuevo chip de sensor CM5 de Serie S (GE Healthcare Cat
#BR 1006-68) se acopló con albúmina de suero de bovino y factor de tejido soluble usando un instrumento Biacore T100. El acoplamiento se llevo a cabo usando una Solución amortiguadora de Acoplamiento Biacore (Na 30 mM Hepes pH 7.4, NaC1135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0.01%) con un kit de acoplamiento de Amina (GE Healthcare Cat # BR-1000-50) y el protocolo asistente en el software Biacore T100. Para la inmovilización, las cuatro células del chip se usaron. Las células 1 y 3 se acoplaron con 500 unidades de respuesta (RU) de proteina de referencia de albúmina de suero de bovino diluida en solución amortiguadora de acetato, pH 4.0 y las células 2 y 4 se acoplaron con 500 y 250 RU de sTF (R&D Systems) diluidas en solución amortiguadora de acetato, pH 4.5.
Cada variante FVIIa, y la proteasa FVIIa de tipo silvestre, se probó en tres concentraciones y en duplicado. Las proteasas se diluyeron hasta 60 nM, 30 nM y 15 nM en .100 yL de solución amortiguadora de ensayo Biacore (Na 20 mM Hepes, pH 7.4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 al 0.1%, BSA al 0.1%, Tween-20 al 0.01%) en una placa de ensayo de 96 pozos. Cada muestra se procesó por ensayo en el instrumento Biacore T100 usando 120 segundos de tiempo de contacto seguido por 180 segundos de tiempo de disociación en una velocidad de flujo 10 pL/min. Un blanco de solución amortiguadora también se procesó por ensayo. El chip se regeneró con EDTA 50 mM, pH 7.0 durante 60 segundos luego 30 segundos. El ensayo para medir el enlace de FVIIa. de tipo silvestre a sTF deberá proporcionar tres conjuntos de curvas que dan un Ka de aproximadamente 8 nM.
El software de Evaluación Biacore T100 se usó para analizar los datos. Específicamente, el análisis de enlace de cinéticos/afinidad 1:1, que ajusta los datos para el isoterma Langmuir, se utilizó y los datos se fijaron individualmente durante dos replicados de cada variante en dos acoplamientos de unidad de respuesta. Los cuatro valores Kd ajustados se promediaron y se presentan en la Tabla 25. Las variantes FVIIa que contienen la mutación M298Q tienen a mostrar resultados Kd inferiores y de esta manera enlazar más herméticamente a sTF.
Tabla 25. Enlace de variantes FVIIa a TF soluble
Afinidad
Mutación (numeración de
Mutación (numeración de
FVII maduro) quimotripsina)
células
células
BHL
293-F
Q286Y Q143Y 7.5
Q366I Q2171 6.7
Q366L Q217L 5.2
Q366M Q217M 4.7
H216A/H257A H76A/H117A 6.0
Q286R/ 341D Q143R/K192D 3.5
298Q/K34ÍD Q143R/Q217D 7.9
Q286R/Q366N Q143R/Q217N 8.0
Q286R/M298Q/Q366D Q143R/M156Q/Q217D 4.6
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 3.8
Un conjunto adicional de experimentos se realizó para
evaluar el enlace de variantes FVIIa a TF soluble usando el mismo ensayo como se describe arriba, pero con una modificación
de la dosis FVIIa en el intervalo hasta 30 nM, 15 nM y .5 nM y el análisis de datos de manera que un modelo de dos estados se
usó para fijar los datos SPR. Este análisis del modelo de dos estados se proporcionó en el software de Evaluación Biacore T100 privado y reproducido a continuación. Los resultados se
proporcionan en la Tabla 26, a continuación.
Interacción de enlace 1 :1
dependiente de concentración
r ^-V) ^ s"1) ^
FVIIa + sTF <i=£ FVIIa-sTF FVIIa sTF*
*.i ( *.2 (s-1)
1 er orden reversible de cambio
conformacional
Tabla 26. Enlace de variantes FVIIa para TF soluble
Afinidad
Mutación (numeración de Mutación (numeración de Afinidad
FVII maduro) quimotripsina) SD %CV d n
?? (nM)
TN (NovoSeven®) TN (NovoSeven®) 6.5 1.2 1 % 1.2 19
TN (NovoSeven- T®) TN (NovoSeven-RT®) 6.3 85% 13% 1.2 4
TN TN 7.6 1.9 24% 1.0 6
TN † TN † 3.9 0.6 15% 1.0 6
T128N/P129A Tfl28]N/P[129]A 6.8 1.2 18% 1.1 7
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX 36.0 2.6 7% 0.2 3
KI09N [109]N 10.8 0.2 2% 0.7 2
S52AS60A S[S2]A/S[60]A 23.2 4.0 17% 0.3 2 298Q M156Q 5.9 0.7 11% 1.3 4 298Q† M156Q† 1.9 0.1 7% 2.0 2
T128NPI29A/M298Q† T[ 128]N/P[ 129]A/M 156Q† 2.4 0.4 16% 1.6 2
V158D/E296V/ 298Q V21D/E154VM156Q 2.0 0.5 26% 3.9 10
VI58D/E296V/ 298Q† V21D/E154V/MI56Q† 1.8 0.5 30% 2.2 4
T 128N/ 129AV 158DE296 T[ 128 JN/P[ 129] A/V21 D/E 15
2.0 0.1 4% 3.9 2 V/ 298Q 4VM156Q
S52A/S60A/V 158D/E296V/ S[52]AS[60] AV21 D/E 154V
14.6 1.3 9% 0.5 2 I298Q / 156Q
Q286R QI43R 6.7 0.4 5% 1.1 2
T128N/P129A/Q286R T[128]N/P[I29]A/QI43R 11.1 4.3 39% 0.7 6
T128N/P129A/Q286R† T[128]N/P[129]A/Q143R† 10.0 1.6 16% 0.4 4
SS2A/S60A/Q286R S[52]A/S[60]A/QI43Rt 51.6 18.4 36% 0.1 5
S222A S82A 2.6 0.1 4% 3.0 2
TI28NP1 9A/S222A T[128]NP[129]AS82A 3.6 0.2 7% 2.1 2
S52A/S60A/S222A S[52]A/S[60]A/S82A 17.2 2.4 14% 0.4 2
H257S HI17S 6.6 1.5 23% 1.2 2
Gla intercambio FIX0366V Gla intercambio FIX/Q217V 56.0 15.1 27% 0.1 3
A175S A39S 12.3 0.1 1% 0.6 2
KI09N/A175S K[109]N/A39S 9.0 0.0 0% 0.8 2
SII9N/LI2IS/A175S S[I19]N/L[I2I]S/A39S 6.6 0.1 1% 1.1 2
TI28N/P129A/A175S T[I28]N/P[I29]A/A39S 10.0 0.1 1% 0.8 2
A122N/G124S/AI75S A[I22]N/G[I24]S/A39S 12.1 2.2 18% 0.6 2
Q286R/H257A QI43R/HII7A 7.2 1.0 13% 1.1 2
Q286R/H257A† Q143R HU7A† 5.5 0.1 2% 0.7 2
Q286RS222A Q143R/S82A 3.4 0.2 6% 2.3 2
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX/
TI28N/P12 A/ Ttl28]N/P[l29]A/ 21.3 5.6 26% 0.4 6
S222A/Q286R S82A/QI43R
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
24.6 6.4 26% 0.2 6 ??28??129?/ Ttl28]N/P[129]A/
Afinidad
Mutación (numeración de Mutación (numeración de Afinidad
FVII maduro) quimotripsina) SD %CV n
K„ (n!M)
S222A/Q286R† S82A/Q143R†
Glaintercambio FIX/ Gía intercambio FIX/
56.9 8.5 15% 0.1 2 S52A/S60A/S222AQ286R S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R
Q286R/S222A/H257A Q143RS82A/HII7A 6.0 0.5 '8% 1.3 2
Q286R/ 298Q Q143R/ I56Q 4.1 0.5 11% 1.9 9
Q286RM298Q QI43R/MI56Q† 3.6 1.1 29% l.l 13
Q286R/M298Q Q143R/M156Q§ 3.2 0.2 7% 1.2 4
Glaintercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
30.4 5.4 18% 0.3 3 Q286R/M298Q Q143RMI56Q
Glaintercambio FIX/ Glaintercambio FIX/
22.1 1.5 7% 0.2 8 Q286R/M298Q† QI43R/MI56Q†
T128N/PI29AQ286R/ T[I28]N/P[I29]A/Q143R/
4.7 1.2 26% 1.6 5 298Q 156Q
T128NPI29A/Q286R/ T[128]N/P[129]A/Q143R
3.9 0.4 11% 1.0 8 298Q† M156Q†
Gla Intercambio FIX Glaintercambio FIX
T128 /PI29A/Q286R/ ÍT[ 128)N/P[ 129] A/Q 143R/ 20.8 1.4 7% 0.4 5
M298Q MI56Q
Glaintercambio FIX Glaintercambio FIX
T128N/PI29AQ286R T[128]N/P[I29)AQI43R/ 37.5 12.3 33% 0.1 8 M298Q† 156Q†
(Gla Intercambio FIX/E40L}/ {Gla intercambio FIX/E[40]LV
38.5 7.4 19% 0.2 2 Q286R/M298Q QI43RMI56Q
{Gla intercambio FIX/K43I}/ {Gla Intercambio FIX/K[43]I}/
35.3 3.4 10% 0.2 2 Q286RM298Q QI43R/ 156Q
{Gla Intercambio FIX/ 43I}/ {Gla intercambio FIXK|43]I}/
23.7 3.6 15% 0.2 2 Q286R/M298Q† QI43R/M156Q†
{Gla Intercambio FIX/Q44S}/ {Gla Intercambio FIX/Q[44]S}/
40.8 6.4 1 % 0.2 3 Q286R/M298Q QI43R I56Q
{Gla intercambio FIX/M19K}/ {Gla Intercambio FIX/M[19]K}/
16.7 2.4 14% 0.5 2 Q286R/M298Q QI43R/M156Q
S[52] A/S[60] A/Q 143RM 156
S52A/S60A/ Q286R/ 298Q 25.1 1.7 7% 0.3 3
Q
Gla intercambio FIX Gla Intercambio FIX/
/S52A/S60AQ286R M298Q S[52]A/S[60]A/QI43R/M 156 6.0 0.1 1% 0.6 2
† Q†
{Gla Intercambio FIX/ {Gla Intercambio FIX/
4.9 0.1 1% 1.6 2 1 E40LK43I/Q44S} M[ 19] /E[40]U [43]1/Q[44]
Afinidad
Mutación (numeración de Mutación (numeración de Afinidad
FVII maduro) quimotripsina) SD %CV n
?? (nM)
/Q286R/M298Q S}
/QI43RM156Q
{Gla intercambio FIX/K43I} {Gla intercambio FIX/K[43]I}
??28?/??29?/ ?\ 128JN/PI 129] A/Q 143R/ 10.5 1.3 13% 0.4 2 Q286R/M298Q† 156Q†
T239V T99V 5.2 1.5 1
T239I T99I 6.2 1.2 1
TI28NP129A/S222A/ T[ 128]NP[ 129JA/S82 A/H 11
2.6 0.3 11% 3.0 2 H257A/Q286R/M298Q 7A/Q143R/M156Q
TI28NPI29A/S222A/ T[ 128]N/P[ 129] AS82 A/H 11
4.0 0.2 4% 1.0 2 H257A/Q286R/M298Q† 7A/Q143R/ 156Q†
S52A/S60A/S222A/H257A/Q S[52] AS[60]A/S82AH 117A
II.1 2.7 24% 0.7 2 286RM298Q /Q143R/M156Q
T128NP 129A/Q286R/M298 T[ 129]NP[ 129]A/Q 143R/M 1
3.2 0.6 18% 1.2 2 Q/Q366N† 56Q/Q2I7N†
{Gla intercambio
{Gla intercambio FIX/K[43]I}
FIX/K43I}/Q286R/ 298Q/Q 13.0 0.7 5% 0.3 2
/Q143R/M156Q/Q217N †
366N†
{Gla intercambio {Gla intercambio FIX/K[43]I}
FIX/ 43I }/T[ 128]N/P[ 129]A ÍT[ 128]N/P[ 129]A/Q 1 3R/M 13.1 0.3 2% 0.3 2
/Q286R/M298Q/Q366N† I56Q/Q217N†
T[ 128]N/P[ 129]A/Q 1 3R/H2
T128NP 129A/Q286 /H373F 6.8 0.0 0% l.l 2
24F
TI28N/P129A/Q286 298 T[128]N/P[129]A/QI43R/M1
3.1 0.1 4% 2.4 2 Q/H373F 56Q/H224F
S52A/S60A/Q286R/M298Q/ S[52]A/S[60]A/Q I43R/M 156
23.4 7.5 32% 0.3 3 H373F Q/H224F
TI 28N I29A/M298Q/H373 ?[ 128]NP[ 129]A/M 156Q/H2
1.3 0.5 1% 3.1 2 F† 24F†
V21D/Q143REI54V/MI56Q V21 D/Q 143 R/E 154 VM 156Q 2.2 0.2 8% 3.5 2
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
19.1 7.7 40% 0.4 7 /S222A/T239V/Q286R /S82AT99V/QI43R
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
14.9 0.4 3% 0.3 2 /S222A/T239V/Q286 † /S82A/T99V/QI43R†
T239V/Q286R/ 298Q T99V/Q143RM156Q 2.5 0.1 4% 3.1 2
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
22.7 6.8 30% 0.3 6 T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/ I56Q
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX/ 25.7 9.2 36% 0.2 6
Afinidad
Mutación (numeración de Mutación (numeración de Afinidad
FVII maduro) quimotrlpsina) SD %cv n
Ka (nM)
T239V/Q286R/ 298Q† T99V/QI43RMI56Q†
T128N/P 129A/T239V/Q286R TÍJ28]NP[129]A/
7.8 0.6 8% 0.5 2 298Q† T99V/QI43R/MI56Q†
S222AT239V/H257A/ S82A/T99V/H 11 AQ143R
2.2 0.0 2% 3.4 2 Q286R/M298Q M156Q
Tl 28N/P 129AS222A/T239V [Tl 28]N/P[ 129A]/S82A/T99
3.6 0.7 18% 1.1 2 H257AQ286R/M298Q† V/H1I7A/Q143R/M156Q†
Tl 28N/P 129AT239V/Q286R T[ 128NJ/P 129] A/T99V/Q 143
3.9 0.1 3% 1.0 2 M298Q/H373F† R/ 156Q/H224F†
T239I/Q286R T99IQ143R 8.0 0.2 3% 1.0 2
Gla intercambio FIX/5222/VT239I/Q Gla intercambio FIX
39.6 1.2 3% 0.2 2 286R /S82A/T991/Q143R
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
13.1 2.1 16% 0.6 2 T239I/Q286RM298Q T99I/QI43R/MI56Q
Tl 28N/P 129A/T239I/Q286R [T128]N/P[I29A]/
5.1 0.9 18% 0.8 2 298Q† T99I/Q143R/ 156Q†
T239I/Q286RH373F T99I/Q143R/H224F 7.8 0.1 1% 1.0 2
V 158D/T239VE296V/M298
V21 D/T99V/E154VM 156Q 1.7 0.6 32% 4.4 4 Q
VI 58DT239V/E296VM298 V21 D/T99V/E 154VM 156Q
1.9 0.7 36% 2.1 4 Q† T
T239V/Q286R T99V/Q143R 2.3 0.0 1% 1.7 2
T128N/P129A/T239I/ T[128]N/P[I29]A/T99I/
3.4 0.0 0% 1.2 2 Q286RAM298Q/ H237F† Q1 3R/MI56Q/H224F†
Gla intercambio FIX/ Gla Intercambio FIX/
34.3 9.1 27% 0.2 3 Q286R/S222A/H257S Q143RS82AH117S
S222A/Q286R/M298Q/
S82A/Q143 RM 156Q/H224F 2.1 0.1 6% 3.7 2 H373F
Gla intercambio FIX/S222A Gla intercambio FIX
9.5 0.9 9% 0.8 2 Q286R 298Q/H373F S82AQI 3 RM 156Q/H224F
TI28N/P129A/AI SS/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/Q21
6.5 12.0 184% 1.2 2 Q366V 7V
A122N/G124S/A175S/ A[ 122]N/G[124]S/A39S/Q21
13.0 0.6 5% 0.6 2 Q366V 7V
TI28N/PI29A/AI75S/ ? 128]N/P[ 129] A/A39S/S82
4.5 0.3 7% 1.7 2 S222A A
A122N/G124S/A175S? A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82
7.0 0.6 9% 1.1 2 S222A A
Afinidad
Mutación (numeración de Mutación (numeración de Afinidad
K<I-T / FVII maduro) quimotripslna) SD ¼CV n
Td(nM)
TI28NPI29A/AI7SS/ T[l 28]N/P[ 129]A/A39S/Q14
8.6 0.1 1% 0.9 2 Q286R 3R
A122N/G124S/A175S/ A[I22]N/G[124]S/A39S/Q14
8.6 0.0 0% 0.9 2 Q286R 3R
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX/
40.9 7.5 18% 0.2 3 S222A/Q286R/H373F S82A/QI43R/H224F
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX/
AI22N/G124S/AI75S/ A[ 122]N/G[124]S/A39S/S82 43.7 14.0 32% 0.2 2
S222A/Q286R A/QI43R
TI28N/PI29A/A175S/ T[ 128]??[ 129]A/A39S/Q 14
5.5 0.0 0% 1.4 2 Q286R/ 298Q 3R/MI56Q
A122N/G124S/AI7SS/ A[I22]N/G[I24]S/A39S/QI
5.3 0.1 2% 1.4 2 Q286R/M298Q 3RM156Q
T128N/PI29A/A175S/
T( 128]N/P[ 129]A A39S/S82
S222A/H257AQ286R 6.7 0.8 11% 1.1 2
A/H1I7A/Q143R/ 156Q
M298Q
AI22N/G124S/A175S/
A[ 122]N/G[ 124JS/A39S/S82
S222A H257A/Q286R/ 7.7 0.6 8% 1.0 2
AH117A/QI43R/MI56Q
M298Q
TI28N/PI29A/AI75S/ T[ 128)N/P[ l 29JA/A39S/Q 1
7.4 3.2 43% 1.0 2 Q286R/ 298Q/H373F 3R/ 156Q/H224F
A122N/G124S/AI75S/ A[ 122]N/G[ 124]S/A39S/Q14
5.0 0.1 3% 1.5 2 Q286R/M298Q/H373F 3 /MI56Q/H224F
V 158D/Q286R E296V/M298 V21 D/Q143R/E 154V/M 156Q
1.7 0.5 27% 4.5 3 Q/H373F /H224F
298Q/Q366N/H373F† M156Q/Q2I7N/H224F† 1.6 0.9 60% 2.5 4
T239V/M298Q/H373F† T99V/M156Q/H224F† 3.5 0.4 11% 1.1 2
T239I 298Q/H373F† T99I/MI56Q/H224F 2.3 0.6 24% 1.7 4
TI28N/P129AQ286R T[I28]N/P[I29]A/QI43R/
2.6 0.6 23% 1.5 2 298Q/Q366N/H373F† MI56Q/Q2I7N/H224F†
T239V/Q286RM298Q T99V/Q143R/ I56Q
4.1 0.3 8% 0.9 2 /Q366N† /Q217N†
T239I/Q286RM298Q/Q366 T991/Q I43R/M156Q/Q217N
2.4 0.6 27% 1.6 2 N† †
t producido en células CHOX
§ producido en línea celular estable CHOX clon 52-5F7
Ejemplo 11
Inhibición de variantes FVIIa por Zn2+
Las variantes FVIIa, expresadas de células HEK 293 o BHK, se procesaron por ensayo para resistencia de la inhibición por Zn2+ tanto en la presencia o ausencia de factor de tejido soluble. Brevemente, ZnCl2 (Aldrich) se diluyó hasta 20 mM en dH20 luego hasta 4 mM en 1 x solución amortiguadora de ensayo (Na 50 mM Hepes, pH 7.5, NaCl 100 mM, CaCl2 1.5 mM, Tween-20 al 0.01% y PEG-8000 0.01%). Se hicieron diluciones 2 veces en serie para generar once concentraciones de zinc, bajando hasta 3.9µ?, a través de una placa de 96 pozos. El último pozo en la fila contiene solución amortiguadora sin zinc para medir la actividad proteolitica FVIIa no inhibida. Las variantes FVIIa, y la proteasa de tipo silvestre, se diluyó hasta 500 nM luego de nuevo 10 veces hasta 50 nM. Esta solución madre 50 nM se usó para ensayos realizados sin el factor de tejido soluble (sTF, R&D Systems). Para ensayos con el factor de tejido soluble, la proteasa se diluyó de nuevo en IX solución amortiguadora de ensayo con sTF hasta concentraciones finales de 12.5 nM y 125 nM, respectivamente. Las soluciones se preincubaron durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
Para iniciar la reacción de inhibición, 20 pL de la solucion- FVIIa/ sTF o FVIIa se mezcló con 60 uL de la serie de zinc a cada fila para diez concentraciones. Para las reacciones
de inhibición con solo FVIIa, las mezclas se iniciaron usando ZnCl22 mM, y para FVIIa/sTF, se iniciaron usando ZnCl2 4 mM. La placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para ensayo la inhibición Zn2+, 20 L de sustrato FVIIa (Mesyl-dFPR-ACC, disuelto hasta 20 mM en DMSO y diluido en solución amortiguadora de ensayo) se agregó a los pozos a una concentración final de 90 µ?. Las concentraciones de sTF y zinc se mantuvieron en el ensayo al agregarlas como sea apropiado a la solución de sustrato. El incremento de fluorescencia (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) se midió durante 60 minutos a 30°C en un lector de placa Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). La actividad proteolitica de residuo se calculó en cada concentración de zinc al dividir la velocidad inhibida por la velocidad de proteasa no inhibida. La concentración Zn2+ necesaria para inhibir la mitad de la actividad proteolitica (K0.5) se calculó al graficar la concentración de zinc contra la actividad de residuo, y ajustó con una ecuación hiperbólica usando software XLFit4 (IDBS) . Cada proteasa se procesó por ensayo dos veces en dos ocasiones separadas para obtener un valor promedio para el K0.5.
Los resultados se proporcionan en la Tabla 27. Las mutaciones H257 y H216 incrementan la resistencia por aproximadamente 3 veces. Las mutaciones M268Q también incrementan la resistencia a zinc por 3 veces. En todos los
casos, el efecto se mantuvo para diferir los grados cuando se combinan con mutaciones adicionales. Las variantes más resistentes fueron combinaciones de las mutaciones de arriba: H216A/H257A-FVIIa y H257A/M298Q-FVIIa .
Tabla 27 . Inhibición de variantes FVI Ia por Zn
H257S/Q286R H117S/Q143R 316.5
S222A/H373A S82A/H224A 94.0
Ejemplo 12
Determinación de la concentración de Proteasa Catalíticamente Activa usando la Titulación del Sitio Activo de p' - guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo (MUGB)
En algunos casos, la concentración de FVIIa catalíticamente activo en una solución madre se determinó al titular un FVIIa complejo y factor de tejido soluble (sTF) con p' -guanidinobenzoato de 4 -metilumbeli ferilo (MUGB), un sustrato de éster fluorogénico desarrollado como un sitio activo para serina proteasas tipo tripsina. El ensayo se llevo a cabo esencialmente como se describe por Payne et al. ( Biochemistry (1996) 35:7100-7106) con unas pocas modificaciones menores. MUGB fácilmente reacciona con FVIIa, pero no FVII o proteasa inactiva, para formar un intermediario de enzima acilo efectivamente estable bajo condiciones en las cuales la concentración de MUGB está saturada y la desacilación es especialmente lenta y limita la velocidad para la catálisis. Bajo estas condiciones, la proteasa FVIIa experimenta una vuelta catalítica sencilla para liberar el fluoróforo de 4-metilumbeliferona (4-MU). Cuando el estallido inicial de fluorescencia se calibra a una curva estándar de concent ación externa de fluorescencia 4-
MU, la concentración de sitios activos puede calcularse.
Los ensayos se realizaron con un volumen de reacción de 1 mL o 2 mL en unas cubetas de cuarzo de 0.4 cm x 1 cm o 1 cm x 1 cm, respectivamente, bajo agitación continua. Cada reacción contiene sTF 0.5 µ? (R&D Systems Human) en una solución amortiguadora de ensayo que contiene Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y PEG 8000 al 0.1%, pH 7.6. La solución estándar 4-MU se preparó frescamente en una concentración madre de 0.5 M en DMSO y la concentración se confirma por espectroscopia de absorbancia en 360 nm usando un coeficiente de extinción de 19, 000 M"1 cm"1 en solución amortiguadora .de Tris 50 mM, pH 9.0. El MUGB se preparó en una concentración madre de 0.04 M en DMSO con base en el peso seco. Los ensayos se iniciaron al agregar 4 pL de MUGB 4 mM (para la reacción de 2.0 mL) o MUGB 2 mM (para la reacción de 1.0 mL) (en cada caso una concentración final 8 µ? ) para una solución de sTF 0.5 µ? (20.2 pL o 10.1 pL de sTF 49.4 µ?) en lx solución amortiguadora de ensayo y primero medir la hidrólisis de respaldo de MUGB para ~150-200 segundos antes de la adición de FVIIa o variante FVIIa a una concentración final de -100-200 nM con base en el ELISA inicial (Ejemplo IC.l) o la titulación de sitio activo con FFR-CM (Ejemplo 3). La liberación de fluorescencia 4-MU en la fase de estallido de la reacción fue seguido por unos 1000-1200
segundos adicionales. Una curva estándar de 4-MU libre se preparó por titulación de la 4-MU calibrada de absorbancia en lx solución amortiguadora de ensayo que contiene sTF 0.5 µ? en etapas 20 nM para una concentración final de 260-300 nM.
Para el análisis de datos, los rastros de la reacción se importaron en el paquete de software Graphpad Prism y la contribución de hidrólisis de respaldo se sustrajo de la curva por extrapolación de la velocidad medida inicial de hidrólisis MUGB espontanea, que típicamente fue menor que 5% del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se fijó a una ecuación exponencial sencilla con un componente lineal (conteo para la velocidad lenta de desacilacion) de la forma AFluorescencia = Amp(l-e )+Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido bajo las condiciones de ensayo saturadas resumidas arriba, k es la constante de velocidad de primer orden observada para la formación de la enzima acilo y B es una constante de velocidad de volumen asociada con vuelta completa de MUGB. La concentración de proteasa FVIIa activa se calcula por comparación del parámetro fijo para la amplitud para la curva estándar 4-MU. Los valores de ensayos múltiples se midieron, promediaron y la desviación estándar se determina.
Ejemplo 13
Actividad especifica de polipéptidos variantes FVIIa para
Mesil-dFPR-ACC
Para evaluar la actividad de variantes FVIIa, se determinó la actividad (actividad/mol) de polipéptidos FVIIa para escisión de un sustrato ACC de tripéptido (Mesil-dFPR-ACC) bajo un conjunto de condiciones de ensayo estandarizado. En ensayo involucra una preincubación de polipéptidos FVIIa con una cantidad saturada de sTF antes de la dilución en el sustrato mesil-dFPR-ACC . Las velocidades iniciales de la escisión del sustrato luego se siguieron al evaluar el incremento en fluorescencia ACC. Las velocidades iniciales de liberación de fluorescencia se normalizaron para una curva estándar ACC interna y los datos se reportaron como pmol/seg/pmol FVIIa.
Para preparar las reacciones, cada muestra FVIIa a probarse se diluyó en una placa de almacenamiento de polipropileno hasta 200 nM en 1 x solución amortiguadora de ensayo (-Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0.1%, PEG-8000 al 0.1%, pH 7.5). Donde sea necesario, una dilución 1:10 de la solución madre FVIIa se preparó de manera que el volumen pipetado mínimo fue 5 yL. Una dilución de factor de tejido soluble madre (sTF) (R&D Systems) se preparó para una concentración final de 1.0 µ? con un volumen apropiado de IX
solución amortiguadora de ensayo necesario para conteo para la separación por exclusión de 8 hasta 32 proteasas/placa . Por ejemplo, cuando se procesa por ensayo 8 proteasas, 1.0 mL de 1.0 µ? sTF se requirió/placa, mientras que para procesar el ensayo 32 proteasas, 2.5 mL de sTF se requirió/placa. Las muestras FVIIa se hicieron en complejo con sTF a una concentración final de FVIIa 100 nM/sTF 500 nM en un volumen de ensayo 50 yL al mezclar 25 yL de variante FVIIa 200 nM con 25 yL de 1.0 µ? sTF en la placa de almacenamiento de polipropileno. Las reacción de complejo FVIIa/sTF luego se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para buscar el equilibrio. Después del periodo de equilibrio, 10 yL de cada reacción de complejo FVIIa/sTF se dispensó en la fila correspondiente de una placa de ensayo negra de área media de 96 pozos (Costar). Las variantes FVIIa y controles se procesaron por ensayo en triplicado. El sustrato mesil-dFPR-ACC se preparó hasta 1. IX la concentración final de 0.09 mM para conteo para la dilución 1:10 del polipéptido FVIIa en el sustrato. Para una placa de área media de 96 pozos, 20 mL de sustrato mesil-dFPR-ACC 0.1 mM se preparó en IX solución amortiguadora de ensayo por dilución del sustrato madre almacenado en DMSO seco.
El ensayo se corrió en una estación de trabajo automatizado BioMek® FX (Beckman Coulter) equipada con una
cabeza de 96 puntas (MBP BioRobotix ART® 130 yL puntas). La placa de ensayo (prescindida con 10 yL de las reacciones FVIIa/sTF) se colocó en cubierta de la estación de trabajo con un reservorio de canal sencillo rellenado con la solución 1.1X mesil-dFPR-ACC . La temperatura del lector de placa se ajustó hasta 37°C. La estación de trabajo BioMek® FX inicia el ensayo al transferir 90 yL del reservorio de canal sencillo rellenado con 1. IX sustrato mesil-dFPR-ACC en cada pozo de la placa de ensayo negra que contiene 10 yL de FVIIa/sTF. Las concentraciones finales de las variantes FVIIa, sTF y concentración Mesil-dFPR-ACC en el ensayo fueron 10 nM, 50 nM y 0.09 mM, respectivamente. La estación de trabajo luego se mezcla 70 yL de la muestra 100 yL dos veces. La placa de ensayo negra se transfirió en un lector de placa SpectraMax Gemini (Molecular Devices) y las velocidades de reacción inicial se siguieron durante 10 min a 37°C.
Después de la terminación del ensayo, una placa que contiene una curva estándar de ACC libre (100 yL/pozo) se leyó en el mismo lector de placa SpectraMax Gemini y usó para proporcionar una conversión exacta de RFU/seg hasta yM/seg. La placa estándar se preparó como sigue. En todos los pozos "aún enumerados" (esto es cada segundo pozo) de la fila superior de una placa de ensayo de área media negra de 96 pozos, la muestra ACC 1 mM se diluyó hasta 25 nM en IX
solución amortiguadora de ensayo hasta un volumen final 200 pL (5 pL ACC 1 mM en 195 pL lx Solución amortiguadora de ensayo). Cien pL de lx Solución amortiguadora de ensayo se pipeteó en todos de los pozos restantes de las columnas "aún enumeradas". El sustrato ACC se diluyó en serie 1:1 bajando las aún columnas para generar 6 más concentraciones ACC. La última fila se dejó con solamente 100 pL lx Solución amortiguadora de ensayo (esto es sin ACC). La fluorescencia se midió usando una versión de lectura de punto final de las condiciones de ensayo y una gráfica de fluorescencia contra concentración de ACC se gráfico. El alcance de la linea a través de estos puntos da el factor de conversión de RFU hasta pM.
El software SoftMax Pro (Molecular Devices) se usó para analizar los datos para el lector de placa asi como la curva estándar. La clasificación que contiene los datos se guardó y exportó como una clasificación de texto ASCII, que se importó en el programa Microsoft Excel, procesó y analizó usando una plantilla creada en Microsoft Excel. Durante la importación los datos en la plantilla de Microsoft Excel, la conversión RFU/pM promedio se calculó del alcance de la curva estándar ACC y usó para proporcionar un factor de conversión que cambia los datos de la placa de RFU/seg para la medición de la actividad en pM/seg. Todos los valores en triplicado se
evaluaron para valores extremos, que se excluyeron si es necesario. La actividad especifica de cada variante FVIIa y controles de tipo silvestre se expresaron en las unidades de ymol/seg/ymol , y calcularon por las siguientes expresiones: datos promedio (RFU/seg) * factor de conversión (RFU/µ?) = Actividad (en µ?/seg) actividad especifica (en pmol/seg/pmol ) [(µ?/seg)* (100 pL) * (1/1000000) ]/[ (10 nM)*(100 pL)* (1/1000000)* (1/1000)]
La Tabla 28 establece la actividad específica de las variantes FVIIa que se procesaron por ensayo, incluyendo la actividad relativa al FVIIa de tipo silvestre. También se incluyen la desviación estándar (SD) y coeficiente de variación (como un porcentaje; %CV) . Diversas variantes FVIIa muestran actividad específica incrementada para escisión de Mesil-dFPR-ACC comparado con el polipéptido FVIIa de tipo silvestre. Por ejemplo, Q366V-FVIIa muestra actividad específica para escisión de Mesil-dFPR-ACC que fue 4 veces mayor que aquel observado con la variante FVIIa de tipo silvestre. Las variantes FVIIa que contienen la mutación H373F también tienden a mostrar actividad específica incrementada para escisión de Mesil-dFPR-ACC comparado con el polipéptido FVIIa de tipo silvestre.
Tabla 28. Actividad especifica de polipéptidos FVIIa para
mesil-dFPR-ACC
Mutación Mutación Actividad SD % Actividad n (nu meración de (numeración de (pmol/ (% TN)
CV FVII maduro) quimotripsina) seg/µ????)
TN (NovoSeven®) TN (NovoSeven®) 2.31 0.34 0.15 100% 3
TN TN ' 2.40 0.15 0.06 104% 4
T128N/P129A T[128]N/P[129]A 2.50 108% 1
Gla intercambio F|X Gla intercambio FIX 1.63 71% 1
A122N/G 124S A[122]N/G[124]S 2.24 97% 1
S52A/S60A S[52]A/S[60]A 1.95 85% 1
V 158D/E296V M298Q V21D/E154V/M156Q 3.28 142% 1
T128N/T 129A/V158D/ T[128]N/P[129]A/V21D/
3.26 142% E296V M298Q E154V/M156Q
S52A/S60A/V 158D/ S[52]A/S[60]A/V21D/
2.56 1 1 1% E296V/M 1298Q E154V/M156Q
Q286R Q143R 1.24 54% 1
T128N/P129A/Q286R T[128]N/P[129]A/Q143R 1.21 52% 1
S52A S60A/Q286R S[52]A/S[60]A Q143R 0.44 0.1 1 0.25 19%
S222A S82A 2.35 102% 1
T128N/P 129A/S222A T[ 128]N/P[129]A/S82A 2.70 1 17% 1
S52A S60A S222A S[52]A/S[60]A/S82A 1.22 53% 1
H257S H 1 17S 2.64 1 15% 1
H373F H224F 1.17 51% 1
Q366V Q217V 9.29 403% 1
Gla intercambio FIX/Q366V Gla intercambio FIX/Q217V 2.82 122% 1 109N/A175S K[ 109]N/A39S 3.38 147% 1
Q286R/H257A Q143R/H1 17A 1.96 85% 1
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
T128N/P 129A/ T[128]N/P[129]A/ 0.53 23% 1
S222A/Q286R S82A/Q143R
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX/ 0.44 0.42 0.96 19% 2
Mutación Mutación Actividad SD % Actividad n (nu meración de (numeración de (µ?t???/ (% TN)
CV FVII maduro) quimotripsina) seg/pmol)
S52A/S60A/S222A/ S[52)A/S[60]A S82A/
Q286R Q143R
Q286R/M298Q Q143R/M156Q 1.91 0.1 1 0.06 83% 5
Gla intercambio FIX Glaintercambio FIX
1.53 66% 1 Q286R/M298Q Q143R/M156Q
T128N/P129A/Q286R/ T[128]N P[129]A/Q143R/
1.80 78% 1 M298Q M156Q
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
T128N/P129A/Q286R/ /T[128]N/P[129]A/Q143R 0.78 34% 1
M298Q M156Q
{Gla intercambio FIX/E40L}/ {Gla intermcabio FIX/E[40]L}/
1.16 50% 1 Q286R/M298Q Q143R/M156Q
{Gla intercambio FIX K43I}/ {Gla intercambio FIX/K[43]I}/
1.20 52% 1 Q286R/M298Q Q143R/M156Q
{Gla intercambio FIX/Q44S}/ {Gla swap FIX/Q[44]S}/
1.1 1 48% 1 Q286R/M298Q Q143R/M156Q
{Gla intercambio FIX/M19K}/ {Gla intercambio FIX/ [19]K}/
1.26 55% 1 Q286R/M298Q Q143R M156Q
S52A S60A/ S[52]A/S(60]A/Q143R/
1.08 0.17 0.15 47% 2 Q286R/M298Q M156Q
T128N/P129A/S222A/ T[128]N/P[129]A/S82A/
1.66 72% 1 H257A Q286R/M298Q H 1 17A/Q143R/ 156Q
S52A/S60A/S222A/ S[52] A S[60]A/S82A/H 117
0.98 42% 1 H257A Q286R/ 298Q A/Q143R/M156Q
H257S/Q286R/Q366V H U 7S/Q143R/Q217V 2.00 0.17 0.08 87% 2
S222A/H257A/Q286R/ S82A/H 1 17A/Q143R/
2.43 105% 1 Q366V Q217V
Q286R/M298Q/Q366N Q143R/M156Q/Q217N 2.35 102% 1
Q286R/H373F Q143R/H224F 0.78 34% 1
T128N/P129A/ T[128]N/P[129]A/Q143R/
2.31 100% 1 Q286R/H373F H224F
S52A/S60A/ S[52]A/S[60]A/Q143R
3.14 136% 1 Q286R/H373F H224F
Q286R/M298Q/H373F Q143R/M 156Q/H224F 4.59 199% 1
Mutación Mutación Actividad SD % Actividad n (nu meración de (numeración de (pmol/ (% TN)
CV FVII maduro) quimotripsina) seg/ mol)
T128N/P129A/Q286R/M2 T[128]N/P[129]A/Q143R/
2.83 123% 98Q/H373F M156Q H224F
S52A/S60A/Q286R/M298 S[52]A/S[60]A/Q143R/
5.02 218% Q H373F M156Q H224F
M298Q/H373F M156Q/H224F 4.00 174% 1
V21D/Q143R/E15 V/M1 V21D/Q143R/E154V/
1.83 79% 56Q M156Q '
S222A/T239V S82A T99V 1.91 83% 1
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
0.66 28% /S222AAT239V/Q286R /S82A/T99V/Q143R •
T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q 1.74 75% 1
Gla intercambio FIX Gla intercambio FIX
1.13 49% T239V/Q286R/M298Q T99V/Q143R/M156Q
S222A/T239V H257A/ S82A T99V H1 17A/Q143R
1.66 72% Q286R/ 298Q M156Q
T239V/Q286R H373F T99V/Q143R/H224F 1.53 66% 1
T239V/Q286R M298Q H T99V/Q143R/M156Q/
3.07 133% 373F H224F
V 158D/T239I/E296V M2
V21D T99I/E 154V/M 156Q 2.24 97% 98Q
T239I/Q286R T99I/Q143R 0.88 38% 1
S222A/T2391 S82A T99I 1.36 59% 1
Gla intercambio FÍX/S222A/T239 Gla intercambio FIX
0.25 1 1% I Q286R /S82A/T99yQ143R
T239I/Q286R/M298Q T99I/Q143R/M 156Q 1.37 60% l
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX
0.67 29% T239I/Q286R/M298Q /T99I/Q143R/M156Q
S222A/T239I/H257A/Q28 S82A/T99I/H 1 17A/Q143R/
1.41 61% 6R/M298Q M 156Q
T239I/Q286R/H373F T99I/Q143R/H224F 1.24 54% 1
V 158D/T239V/E296V/M2 V21D/T99V/E154V/
2.19 0.15 0.07 95% 98Q M 156Q 3
T239V/Q286R T99V/Q143R 1.26 0.14 0.1 1 55% 2
T2391/Q286R/M298Q/ T991/Q143R/ 156Q/ 1.59 0.21 0.13 69% 3
Mutación Mutación Actividad SD % Actividad n (numeración de (numeración de ( mol/ (% TN)
CV FVII maduro) quimotripsina) seg/ mol)
H237F H224F
H257S/Q286RM298Q H117S/Q143R/M156Q 1.85 0.23 0.13 80% 2
GlaintercambioFIX Gla intercambio FIX
0.49 0.04 0.09 21% 2 /Q286R/S222A/H257S /Q143R/S82A/H117S
S222A/H257S/Q286R/ S82A/HU7S/Q143R7
1.77 0.23 0.13 77% 2 298Q M156Q
H257S/Q286R/M298Q/ H117S/Q143R/M156Q/
2.32 0.41 0.18 101% 3 H373F H224F
S222A/Q286R/M298Q/ S82A/Q143R/M156Q/
2.79 0.39 0.14 121% 2 H373F H224F
Gla intercambio FIX/S222A/ Gla intercambio FIX/S82A/
1.92 83% 1 Q286 /M298QH373F Q143R/M156QH224F
S222A/Q286R/M298Q S82AQ143R/M156Q 1.90 82% 1
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX
1.12 49% 1 S222AQ286R/M298Q S82A/Q143R/M156Q
T128N/P129A/A175S/ T[128]NP[129]A/A39S/
3.40 148% 1 Q366V Q217V
A122N/G124S/A175S/ A[122]N/G[124]S/A39S/
2.34 0.22 0.09 101% 2 Q366V Q217V
T128N/P129A/A175S/ T[128]N/P[129]A/A39S/
3.19 138% 1 S222A S82A
A122N/G124S/A175S/ A[122]N/G[124]S/A39S/
2.68 0.30 0.11 116% 2 S222A S82A
T128NP129A/A175S/ T[128]N/P[129]AA39S/
1.88 81% 1 Q286R Q143R
A122N/G124S/A175S/ A[122]N/G[124]S/A39S/
2.16 0.42 0.20 94% 2 Q286R Q143R
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
1.37 0.26 0.19 60% 2 S222A/Q286R/H373F S82A/Q143R/H224F
V158D/E296V/M298Q/ V21D/E154VM156Q/
5.60 243% 1 H373F H224F
H257A/Q286R/M298Q H117AQ143R/M156Q 2.18 95% 1
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio
0.75 32% 1 T128N/P129AA175S/ HX/T[128JN/P[129]A/
Mutación Mutación Actividad SD % Actividad n (nu meración de (numeración de (µp???/ (% TN) FVII maduro) quimotripsina) seg/ mol) CV
S222A/Q286R A39S/S82A Q143R
Gla intercambio FIX/ Gla intercambio FIX/
A122N/G 124S/A175S/ A[ 122]N/G[124]S/A39S/S8 0.89 38% 1
S222A Q286R 2A Q143R
T128N P129A/A175S/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/Q 1
2.02 88% 1 Q286R/M298Q 43R/M156Q
A122N/G 124S/A175S/ A[122]N/G[124]S/A39S/Q1
3.03 131% 1 Q286R/M298Q 43R/M156Q
T128N P129A/A175S/
T[128]N/P[129]A/A39S/S8
S222A/H257A/Q286R/ 2.18 95% 1
2A/H117A/Q 143R/M 156Q
M298Q
A 122N/G124S/A175S/
A[122]N/G[ 124]S/A39S/S8
S222A/H257A Q286R/ 1.99 86% 1
2A/H1 17A/Q143R/M156Q
M298Q
T128N/P129A A175S/ T[ 128]N/P[ 129] A/A39S/Q1
2.78 121 % 1 Q286R/M298Q/H373F 43R/M156Q/H224F
A122N/G124S/A175S/ A[l 22]N/G[ 124JS/A39S/Q1
2.71 1 18% 1 Q286R/M298Q H373F 43R/ 156Q H224F
V 158D/Q286R/E296V/M V21 D/Q 143R/E 154 V M 156
1.89 82% 1 298Q H373F Q/H224F
Ejemplo 15
Activación de FX y Determinación de la concentración de Proteasa Catalíticamente Activa usando el Fluoresceína-mono- p' -guanidinobenzoato de Titulació de Sitio Activo (FMGB)
La concentración de Factor X (FX), que es capaz de volverse catalíticamente activo, en una solución madre del cimógeno se determinó por activación de muestras FX con veneno de víbora Russell (RW-asa) seguido por titulación del
Factor X activo ( FXa ) con fluoresceí na-mono-p' -guanidinobenzoato (F GB),. un sustrato de éster fluorogénico desarrollado como una titulación de sitio activo para serina proteasas tipo tripsina. Después de la activación, el ensayo de titulación del sitio activo se llevo a cabo esencialmente como se describe por Bock et al. (Archives of Biochemistry y Biophysics (1989) 273:375-388) con unas pocas modificaciones menores. FMGB fácilmente reacciona con FXa, pero no FX o proteasa inactiva, para formar un intermediario de enzima acilo efectivamente estable bajo condiciones en las cuales la concentración de' FMGB se satura y la desacilación es especialmente lenta y limita la velocidad para catálisis. Bajos estas condiciones, la proteasa FXa experimenta una vuelta catalítica sencilla para liberar el fluoróforo de fluoresceína . Cuando el estallido inicial de fluorescencia se calibra para una curva estándar de concentración externa de fluorescencia de fluoresceína , la concentración de sitios activos puede calcularse.
Las reacciones de activación FXa se prepararon en una concentración final de FX 10 µ? (con base en la absorbancia A28o y un coeficiente de extinción de 1.16) en un volumen final de 50-100 L en una solución amortiguadora de reacción que contiene Tris 100 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 al 0.1%, pH 8.1. La activación se inició por la adición de RW-
asa a una concentración final de 5 yg/mL (5 yL de una dilución 98 yg/mL por 100 yL de reacción o 2.5 yL por 50 yL de reacción) a 37°C durante 45-60 min de tiempo de activación (previamente determinado para representar la activación completa al recolectar muestras cada 15 min y probar el incremento en la escisión de sustrato fluorogénico Spectrafluor FXa ) . Las reacciones se apagaron con 1/10 volumen de solución amortiguadora apagada que contiene Tris 100 mM, NaCl 50 mM, 5 mM, EDTA 100 mM, PEG 8000 al 0.1%, pH 8.1.
Los ensayos se realizaron con un volumen de reacción de 1 mL en una cubeta de cuarzo de 0.4 cm x 1 cm bajo agitación continua. Las reacciones contienen 100-400 nM del FXa activado frescamente y FMGB 5 yM en una solución amortiguadora de ensayo que contiene Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM y PEG 8000 al 0.1%, pH 7.4. La solución estándar de fluoresceína se preparó frescamente a una concentración madre de 70 mM en DMF y la concentración confirmada por espectroscopia de absorbancia bajo condiciones estándares en 496 nm usando un coeficiente de extinción de 89, 125 M"1 cm"1 en NaOH 0.1 N. FMGB se preparó en una concentración madre de 0.01 M en DMF con base en el peso seco y la concentración confirmada por espectroscopia de absorbancia en 452 nm usando, un coeficiente de extinción de
19,498 en solución amortiguadora salina de fosfato (PBS), pH 7.2. Los ensayos se iniciaron al agregar 5 pL de FMGB 1 mM (5 µ? concentración final) hasta 1 x solución amortiguadora de ensayo y midiendo primero la hidrólisis de respaldo de FMGB durante -150-200 segundos antes de la adición de FXa a una concentración final de -100-400 nM con base en la concentración inicial determinada por la absorbancia antes de la activación por RW-asa (ver arriba). La liberación de fluorescencia de fluoresceina en la fase de estallido de la reacción se siguió durante unos 3600 segundos adicionales. Una curva estándar de fluoresceina libre se preparó por titulación del estándar de fluoresceina · que calibra la absorbancia en lx solución amortiguadora de ensayo en etapas 20 nM a una concentración final de 260-300 nM.
Para análisis de datos, los rastros de la reacción se importaron en el paquete de software Graphpad Prism y la contribución de la hidrólisis de respaldo se sustrajo de la curva por extrapolación de la velocidad medida inicial de hidrólisis FMGB espontanea, que fue típicamente menor que 5% del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se fijo a una ecuación exponencial sencilla con un componente lineal (para conteo para la velocidad lenta de desacilación ) de la forma AFluorescencia = Amp ( l-e"kt) +Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido bajo las condiciones de
ensayo saturadas resumidas arriba, k es la constante de velocidad de primer orden observado para la formación de la enzima acilo - y B es una constante de velocidad de volumen asociada con vuelta completa de FMGB. La concentración de proteasa FXa activa se calculó por comparación del parámetro fijo para amplitud para la curva estándar de fluoresceina . Los valores de ensayos múltiples se midieron, promediaron y la desviación estándar se determina. La cantidad de FXa activo en la preparación por lo tanto representa directamente la concentración de FX en una preparación madre, que puede activarse por FVIIa. Este valor titulado del sitio activo se emplea cuando se calcula la concentración de FX a usarse en un ensayo indirecto tal como los ensayos dependientes de TF e independientes de TF descritos en el Ejemplo 4.
Ya que las modificaciones serán aparentes para aquellos de experiencia en la técnica, se pretende que esta invención se limite solamente por el alcance de las reivindicaciones anexas .
Claims (172)
1. Un polipéptido modificado con el factor VII (FVII), que comprende modificaciones en un polipéptido FVII, caracterizado porque las modificaciones están en las posiciones que corresponden a la posición 286 y la posición 298 en un polipéptido FVII que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en las posiciones correspondientes en un polipéptido FVII, y la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con arginina (Arg, R) ; la modificación en la posición 298 es un reemplazo de aminoácido con glutamina (Gln, Q) ; y el polipéptido FVII modificado muestra actividad coagulante creciente en comparación con el polipéptido FVII que no tiene las modificaciones en las posiciones 286 y 298.
2. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación en la posición 286 es el reemplazo de Gln (Q) con Arg (R) .
3. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación en la posición 298 es el reemplazo de Met (M) con Gln(Q).
4. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las modificaciones Q286R y M298Q.
5. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el polipéptido FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74 , 98, 158 o 343-353, o es una variante alélica o de especie de la misma, o una variante que tiene al menos 60% de identidad de secuencias con el FVII de cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74, 98, 158 o 343-353, o es un fragmento activo de un polipéptido FVII que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74, 98,158 o 343-353.
6. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido FVII.
7. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque una modificación adicional es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 286, 287, 290 292, 294, 296, 298, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 y 396.
8. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de la reivindicación 6, caracterizado porque una modificación adicional de aminoácidos se selecciona de entre D196 , D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, 197Y, K197A, K197E, 197D, 197L, 197M, Kl 971, l 97V, K197F, 197W, 199 A, 199D, 199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290 , R290M, R290V, 341E, K341R, K341Q, K341N, 341M, 341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197ins , D196 197insR, D196K197insY, D196 197insW, D196 197insA, D196 197insM, 197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, 197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, . T239H, T239I, L287T, M298Q, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, 161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Intercambio FIX , {Gla Intercambio FIX/E40L}, {Gla Intercambio FIX/K43I}, {Gla Intercambio FIX/Q44S}, {Gla Intercambio FIX/M19K}, {Gla Intercambio FIX/M19K/E40L/ 43I/Q44S} , Gla Intercambio FX, Gla Intercambio Prot C, Gla Intercambio Prot S, Gla Intercambio Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, 109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, SI 19N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P13 delinsQRLMEDICLPR GCL EDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPR GCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406ÍnsGGGSDICLPRWGCLWED, S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, y E296V.
9. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque comprende modificaciones seleccionadas de entre Q286R/M298Q/ 341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Intercambio FIX, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/M2 8Q/H373F, {Gla Intercambio FIX/E40L}/Q286R/ 298Q, {Gla Intercambio FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/Q44S} /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/ 19 }/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257 S/Q286R/M2 8Q, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/ 298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/ P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, {Gla Intercambio FIX / 43I} /T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX / 43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX / 43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/ P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q y T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.
10. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 6-1, caracterizado porque comprende modificaciones seleccionadas de entre T128N/P129A/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T239V/Q286R/M298Q/Q366N/, T128N/P129A/Q286R/M2 8Q/Q366N/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, ' A122N/G124S/A175S/Q286R/ 298Q/H373F, T128N/P129A/A175S Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/ P129A/A175S/Q286R/M298Q, H257A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX7S222A/Q286R/M298Q, S222A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/H275S/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/H373F, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/ P129A/T239V/Q286R/M298Q, Gla IntercambioFIX/T239V/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, TI 28N/ P129A/Q286R/ 298Q/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Intercambio FIX/ K[43] D/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX/ [43] I }/Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/M298Q/Q366N, S52A/.S60A/S222A/H257A/Q28R/M2986Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M2986Q, S222A/H257A/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/K[43] IJ/T128N/P129A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/M [ 19] } /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/Q[44] SJ/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/K[43] IJ/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/E [40] LJ/Q286R7M298Q, {Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q y Ql 43R/M286Q/Gla Intercambio FIX.
11. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 118, 138-141, 150, 154, 155, 157, 274-278, 280, 282, 286-288, 293-295, 297, 302-304, 306, 311-313, 317, 318, 321, 322, 324-326, 328, 337-342, 355-358, 360 o 364-371.
12. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque está activo o activado.
13. Un polipéptido modificado del factor FVII (FVII), caracterizado porque: el polipéptido FVII tiene 2, 3, 4, 5, 6, o 7 reemplazos de aminoácidos; un reemplazo de aminoácidos está en una posición que corresponde a la posición 286 en un polipéptido FVII que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en una posición correspondiente en un polipéptido FVII; y el reemplazo en la posición 286 es el reemplazo por una arginina (Arg, R) que resulta en un polipéptido modificado FVII que muestra una actividad coagulante aumentada en comparación con el polipéptido FVII que no tiene la modificación en la posición 286; y los reemplazos de aminoácidos están en un polipéptido FVII de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en la variante de especies o alélica de la misma; o los reemplazos de aminoácidos están en un polipéptido FVII que contiene un dominio heterólogo Gla.
14. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el reemplazo de aminoácidos en la posición 286 es el eemplazo de Gln(Q) con Arg. (R) .
15. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido FVII no modificado comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de las SEQ ID N0S:l-3 o 18-74, o es una variante alélica o de especie de las mismas, o es un fragmento activo de un polipéptido FVII que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 1-3 o 18-74.
16. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado es un fragmento activo que contiene un reemplazo en una posición que corresponde a la posición 286 en un polipéptido FVII.
17. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque un reemplazo de aminoácidos está en una posición que corresponde con una posición seleccionada de entre 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 286, 287, 290, 292, 294, 296, 298, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 y 396.
18. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado porque comprende un reemplazo de aminoácidos seleccionado de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K19 Y, K197A, K197E, K197D, K197L, 197M, ?197G, K197V, 19 F, K197W, K199A, 199D, 199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290 , R290M, R290V, K341E', K341R, 341Q, 341N, K341M, 341D, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, M298Q, P321 , P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S, 161A, K161V, H216S, H216A, H216 , H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, S52A, S60A , E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, 109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, SI 19N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, V158T, V158D, L287T, E296V, M298K y M298Q.
19. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende reemplazos de aminoácidos seleccionados de entre Q286R/M298Q, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Gla Intercambio FIX, Q286R/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/S222A/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/M298Q/ 341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Intercambio FIX, Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A29 S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V, S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/ H373A, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D, Q286R/Q366N, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/H373F, Q286R/M298Q/H373F, TI 28N/ Pl 29A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/ P129A/Q286R/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q, TI28N/ P129A/ S222A/ H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/H373F/, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/H373F, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/H373F, T239I/Q286R/M298Q/H373F, VI 58D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R, A122N/G12 S/A175S/Q286R, T128N/ Pl 29A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Intercambio FIX/K43I } /Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/ 298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/ P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q y T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.
20. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizado porque comprende reemplazos de aminoácidos Q286R/M298Q.
21. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende reemplazos de aminoácidos seleccionados de entre T128N/P129A/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T239V/Q286R/ 298Q/Q366N/, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, A122N/G12 S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G12 S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G12 S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, H257A/Q286R/M298Q, S222A/Q286R/M298Q, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/H275S/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/H373F, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q, T128?/' P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, TI 28?/ P129A/T239V/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, ' T128?/ P129A/Q286R/M298Q/H373F, Q286R/M298Q/H373F, Q286R/M298Q/Q366N, S52A/S60A/S222A/H257A/Q28R/M2986Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M2986Q, S222A/H257A/Q286R/M298Q.
22. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 118, 138-141, 150, 154, 155, 157, 274-278, 280, 282, 286-288, 293-295, 297, 302-304, 306, 311-313, 317, 318, 321, 322, 324-326, 328, 337-342, 355-358, 360 o 364-371.
23. El ' polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13-22, caracterizado porque está activo o activado.
24. Un polipéptido FVII modificado, que comprende una modificación en un polipéptido FVII, caracterizado porque la modificación está en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre 54, 66, 121, 122, 129 y 132 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3, o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII.
25. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la modificación se selecciona de entre P54S, Q66N, L121S, A122N, P129A y E132S.
26. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 24 o la reivindicación 25, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido FVII.
27. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la modificación adicional es un reemplazo, inserción o eliminación de aminoácidos .
28. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, caracterizado porque una o las modificaciones adicionales se seleccionan de entre P54S, S52N, Y58S, S119N, G124S, T128N, T130N, V158D, A175S, S222A, G241S, E296V, M298Q, E394N, P395A, R396S, G318N y Q366V.
29. El polipéptido FYII modificado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende las modificaciones seleccionadas de entre S119N/L121S, T128N/P129A, A122N/G124S, A122N/G124S/A175S, A122N/G124S/E39 N/P395A/R396S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N, A122N/G12 S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S, S119N/L121S/A175S, T128N/P129A/A175S, T130N/E132S, Q66N/Y68S, T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q, T128N/ P129A/ S222A, T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V, T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G124S/A175S/S222A, T128N/P129A/M298Q y T128N/ P129A/M298Q/ H373F .
30. Un polipéptido FVII modificado, que comprende una modificación en un polipéptido FVII, caracterizado porque la modificación corresponde a una modificación seleccionada de entre T239S, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, P321 , P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366N, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, 161S, 161V, H216S, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E y H247S en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII.
31. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido EVII .
• 32. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque una de las modificaciones adicionales es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 286, 287, 290 292, 294, 296, 298, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 y 396.
33. El polipéptido EVII modificado de conformidad con la reivindicación 31 o la reivindicación 32, caracterizado porque una de las modificaciones adicionales de aminoácidos se selecciona de entre Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y, D196 , D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, 197A, 197E, 197D, 197L, 197M, l 971, l 97V, K197F, K197W, 199A, 199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290 , R290M, R290V, 341E, K341R, 341Q, K341N, 341M, 341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196 197insK, D196 197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196 197insA, D196K197insM, K197I198insE, 197I198insY, 197I198insAf 197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321 , P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, 161S, 161A, 161V, H216S, H216A, H216 , H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Intercambio FIX , Gla Intercambio FX , Gla Intercambio Prot C, Gla Intercambio Prot S, Gla Intercambio Trombina, Gla Intercambio FIX, {Gla Intercambio FIX/E40L}, {Gla Intercambio FIX/ 43I}, {Gla Intercambio FIX/Q44S}, {Gla Intercambio FIX/M19K}, {Gla ^Intercambio FIX/M19K/E40L/ 43I/Q44S} , S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, 109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S 103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF, TI 28 P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPR GCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T12 134delinsSFGRGDIRNV, P 06insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, M298 y M298Q.
34. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende las modificaciones seleccionadas de entre Q366D/H373E, Q366V/H373V, Q366V/H373L, Q366V/H373I, S222 /H257A, H216A/S222A, S222S/Gla Intercambio FIX, S222A/H257A/Gla Intercambio FIX, S222A/M298Q, S222A/H257A/M2 8Q, S222A/A292N/A294S/Q366V, Al75S/ S222A/Q366V, S222A/Q366V, H257S/Q366V, S222A/H373A, M298Q/H373F, S52A/ S60A/S222A, S222A/T239V, V158D/T239V/E296V/M298Q, S222A/T239I, V158D/E296V/M298Q/H373F, Gla Intercambio FIX/Q366V, M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F y T239I/M298Q/H373F.
35. Un polipéptido FVII modificado, que comprende dos o más modificaciones en un polipéptido FVII, variante alélica o de especie de la misma o fraqmentos activos del mismo, caracterizado porque: las dos o más modificaciones de aminoácidos son seleccionadas de entre modificaciones de aminoácidos que corresponden a H216A, H257A,- E394N, P395A, R396S, K109N, A292N, A175S, H257A y Gla Intercambio FIX.
36. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende modificaciones seleccionadas de entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S y K109N/A175S.
37. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 35 o la reivindicación 36, caracterizado porque comprende además una modificación que corresponde a M298Q o A294S.
38. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende modificaciones seleccionadas de entre H257A/M298Q, y 109N/A292N/A294S.
39'. Un polipéptido FVII modificado, caracterizado porque comprende modificaciones en un polipéptido FVII, variante de especies y alélicas del mismo o fragmentos activos del mismo que corresponden a S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q o V158D/T239I/E296V/M298Q.
40. Un polipéptido FVII modificado, caracterizado porque comprende una secuencia de enlace a la albúmina de suero en un polipéptido FVII, variante de especies y alélica del mismo o fragmentos activos del mismo.
41. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la secuencia de enlace a la albúmina de suero tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 103-109, o una porción suficiente dé las mismas para efectuar el enlace de albúmina de suero.
42. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 40 o la reivindicación 41, caracterizado porque la secuencia de enlace a la albúmina de suero reemplaza una secuencia contigua de residuos de aminoácidos del polipéptido FVII no modificado.
43. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37-39, caracterizado porque comprende una modificación seleccionada de entre S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF, Hl 15S12 SdelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPR GCLWE , T128P134delinsIEDICLPRWGCL E, S103SllldelinsDICLPRWGCL ED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCL , P406insDICLPRWGCLWED y P 06insGGGSDICLPRWGCL ED .
44. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 40-43 caracterizado porque muestra afinidad incrementada para o enlace a un enlace de albúmina de suero en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
45. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad incrementada para o enlace a enlace de albúmina de suero.
46. Un polipéptido FVII modificado, caracterizado porque comprende una secuencia de enlace a integrina de plaquetas an 3 en un polipéptido FVII, variante de especies y alélica del mismo o fragmentos activos del mismo.
47. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la secuencia de enlace a la integrina de plaquetas a?¾ß3 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 110-112, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a la integrina de plaquetas anbP3.
48. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 46 p la reivindicación 47, caracterizado porque la secuencia de enlace a la integrina de plaquetas c<iibP3 reemplaza una secuencia contigua de residuos de aminoácidos del polipéptido FVII no modificado.
49. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 46-48, caracterizado porque comprende una- modificación seleccionada de entre S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC y P406insGGGSCSFGRGDIRNVC.
50. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 43-46 caracterizado porque muestra afinidad incrementada para o enlace a integrina de plaquetas 0??¾ß3 en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
51. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad incrementada para o enlace al enlace de integrina de plaquetas anbP3.
52. El polipéptido modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 40-51, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales en otra posición en el polipéptido FVII.
53. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la modificación adicional es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición G237V.
54. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque comprende una modificación seleccionada de entre S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED/G237V, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCL EDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsQRLMEDICLPR GCL EDDF/G237V y T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V.
55. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones · 1-4 , 24-27, 29-36 o 49, caracterizado porque comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más modificaciones .
56. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-55, caracterizado porque comprende ' un dominio heterólogo Gla, o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace a fosfolipidos .
57. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el dominio heterólogo Gla se selecciona de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina , proteína de matriz Gla, proteína 6 específica de la suspensión del crecimiento (Gas6) y proteína Z.
58. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 56 o la reivindicación 57, caracterizado porque el dominio heterólogo Gla tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 83-91, 93 y 94, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a fosfolípidos .
59. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 56-58, caracterizado porque todo o una porción contigua del dominio nativo FVII Gla se remueve y se reemplaza con el dominio heterólogo Gla, o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace a fosfolípidos .
60. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el dominio nativo FVII Gla incluye los aminoácidos 1-45 en un polipéptido FVII que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3, o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII .
61. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 56-60, caracterizado porque el dominio heterólogo Gla contiene una modificación en comparación con la forma de tipo silvestre del dominio heterólogo Gla.
62. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque: el dominio heterólogo Gla es un dominio FIX Gla; y la modificación es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre las posiciones 19, 40, 43 y 44 del dominio FIX Gla establecido en SEQ ID NO: 83.
63. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la modificación se selecciona de entre M19K, E40L, 43I y Q44S.
64. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones .56-63, ca acterizado porque el dominio heterólogo Gla contiene una modificación adicional .
65. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque: el dominio heterólogo Gla es un dominio FIX Gla; y la modificación adicional es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre las posiciones 19, 40, 43 y 44 del dominio FIX Gla establecido en SEQ ID NO: 83.
66. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 64 o la reivindicación 65, caracterizado porque la modificación adicional se selecciona de entre M19 , E40L, 43I y Q44S.
67. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 64-66, caracterizado porque la modificación es MI 9 /E40L/K43I/Q44S .
68. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 56-67, caracterizado porque comprende modificaciones seleccionadas de entre Q286R/Gla Intercambio FIX, Q286R/S222A/Gla Intercambio FIX, Q286R/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/S222A/H257A/Gla Intercambio FIX, Q286R/M298Q/Gla Intercambio FIX, {Gla Intercambio FIX/E40L} /Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/Q44SJ/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/M19 }/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R, Gla Intercambio FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/T239V/Q286R, Gla Intercambio FIX/T239V/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/T239I/Q286R, Gla Intercambio FIX/T239I/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/H373F, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Intercambio FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, Gla ' Intercambio FIX/S222A/H257S/Q286R/, Gla Intercambio FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R, Gla Intercambio ' FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R, {Gla Intercambio FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, {Gla Intercambio FIX / 43I } /Q286R/M298Q/Q366N, y {Gla Intercambio FIX / 43IJT128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N.
69. Un polipéptido FVII modificado, caracterizado porque comprende un dominio eterólogo Gla o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace a fosfolípidos, en donde el dominio heterólogo Gla comprende una modificación, por lo que el enlace a o afinidad para plaquetas se incrementa en comparación con un polipéptido FVII con un dominio heterólogo Gla no modificado, o el dominio heterólogo Gla contiene una o modificaciones en comparación con la forma de tipo silvestre que, corresponde del dominio heterólogo Gla.
70. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el dominio heterólogo Gla se selecciona de entre un dominio Gla em el Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteina C,' proteina S, osteocalcina , proteina Gla de matriz, proteina 6 especifica de la supresión del crecimiento (Gas6) y proteina Z.
71. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 69 o la reivindicación 70, caracterizado porque el dominio heterologo Gla no modificado o de tipo silvestre tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 83-91, 93 y 94, o una porción suficiente de las mismas para efectuar el enlace a fosfolipidos .
72. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 68-71, caracterizado porque se retira todo o una porción contigua del dominio nativo FVII Gla y se reemplaza con el dominio heterologo Gla, o una porción suficiente del mismo para efectuar el enlace a fosfolipidos .
73. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el dominio nativo FVII Gla incluye aminoácidos 1-45 en un polipéptido FVII. que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3, o en los residuos correspondientes en un polipéptido FVII.
74. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 65-69, caracterizado porque : el dominio heterologo Gla es un dominio FIX Gla; y la modificación es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre las posiciones 19, 40, 43 y 44 del dominio FIX Gla establecido en SEQ ID NO: 83.
75. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 69-74, caracterizado porque la modificación se selecciona de entre M19 , E40L, 43I y Q44S.
76. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 69-75, caracterizado porque- el dominio heterologo Gla contiene una modificación adicional .
77. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque: el dominio heterologo Gla es un dominio FIX Gla, y la modificación adicional es un reemplazo de aminoácidos en una posición que corresponde a una posición seleccionada de entre las posiciones 19, 40, 43 y 44 del dominio FIX Gla establecido en SEQ ID NO: 83.
78. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la modificación adicional se selecciona de entre M19 , E40L, 43I y Q44S.
79. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 77 o la reivindicación 78, caracterizado porque la modificación es MI 9K/ E40L/ 43I/Q44 S .
80. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 56-79 caracterizado porque muestra afinidad incrementada para o enlace a los fosfolipidos en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
81. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más afinidad incrementada para o enlace a fosfolipidos.
82. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-81 caracterizado porque muestra resistencia incrementada a antitrombina III en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
83. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistencia incrementada a antitrombina III en comparación con el polipéptido FVII no modi ficado .
84. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-83 caracterizado porque muestra actividad catalítica creciente en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
85. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la actividad catalítica del polipéptido FVII modificado es al menos alrededor de o es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más mayor que la catalítica de un polipéptido FVII no modificado.
86. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-85 caracterizado porque muestra resistencia incrementada a TFPI en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
87. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más resistencia superior al TFPI en comparación con un polipéptido FVII no modificado.
88. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-87 caracterizado porque muestra resistencia incrementada a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con el polipéptido FVII no modificado .
89. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el polipéptido FVII modificado muestra al menos o alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o mayor resistencia a los efectos inhibidores de Zn2+ en comparación con un polipéptido FVII no modi ficado .
90. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicacións 6, 13, 31, 35 o 52, caracterizado porque comprende una o más modificaciones que introduce y/o elimina uno o más sitios de glicosilación ¦ en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
91. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque dr introducen 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más sitios de glicosilación.
92. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque se eliminan 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más sitios de glicosilación.
93. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 91 o la reivindicación 92, caracterizado porque el sitio de glicosilación es un sitio de N-glicosilación .
94. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 91 o la reivindicación 92, caracterizado porque el sitio de glicosilación es un sitio de 0-glicosilación .
95. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-94, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales de aminoácidos que incrementan la resistencia a antitrombina-III, incrementan el enlace y/o afinidad a fosfolipidos, incrementan la afinidad para el factor de tejido, incrementa la actividad intrínseca, incrementa la actividad dependiente de TF, incrementa la actividad coagulante, altera la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, incrementa la actividad catalítica o coagulante al cambiar el equilibrio entre conformaciones FVIIa altamente activas y menos activas a favor de las conformaciones altamente activas^, incrementa la resistencia a las proteasas, disminuye la glicosilación, incrementa la glicosilación, reduce la inmunogenicidad, incrementa la estabilidad, y/o facilita la ligadura de grupo químico.
96. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque la zimogenicidad alterada confiere una forma más de tipo zimógeno o una forma tipo menos zimógeno.
97. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-96, caracterizado porque comprende una o más modificaciones adicionales de aminoácidos seleccionados de entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserción de una tirosina en la posición 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, PION, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, 32D, K32Q, K32E, K32G, 32H, 32T, 32C, K32A, 32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34 , ?34?, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, 38C, K38E, 38T, 38D, 38L, K38G, 38A, K38S, K38N, 38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42 , S43Q, S43N, Y44 , Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, 62E, 62R, 62D, K62N, 62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83 , N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, 109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, 143C, K143D, 143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145 , N145H, N145Q, N145E, N145R, N145 , N145D, N145C, 157V, 157L, 157I, ?157?,· K157F, K157W, K157P, K157G, 157S, K157T, K157C 157Y, 157N K157E K157R, 157H, 157D, K157Q, V158L V158I, V158M V158F V158W, V158P, V158G, V158S, V158T V158C, V158Y V158N V158E, V158R, V158K, V158H, V158D V158Q, A175S A175T G179N, I186S, I186T, V188N, R202S R202T, I205S I205T D212N, E220N, I230N, P231N, P236N G237N, Q250C V253N E265N, T267N, E270N, A274M, A274L A274 , A274R A274D A274V, A274I, A274.F, A274W, A274P A274G, A274T A274C A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S' A274Q, F275H R277N F278S, F278A. F278N, F278Q, F278G L280N, L288 L288C L288D, D289C, D289K, L288E, R290C R290G, R290A R290S R290T, R290K, R290D, R290E, G291E G291D, G291C G291N G291 , A292C, A292K, A292D, A292E T293K, E296V E296L E296I, E296M, E296F, E296W, E296P E296G, E296S E296T E296C, E296Y, ?296?, E296K, E296R E296H, E296D E296Q M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F M298W, M298P M298G M298S, ?298?, M298C, M298Y, M298N M298K, M298R M298H ?298?, M298D, P303S, P303T, R304Y R304F, R304L R304M R304G, R304Tr R304A, R304S, R304N L305V, L305Y L305I L305F, L305Af L305M, L305W, L305P L305G, L305S L305T L305C, L305N, L305E, L305K, L305R L305H, L305D L305Q M306D,- M306N, D309S, D309T, Q312N Q313K, Q313D Q313E S314A, S314V, S314I, S314M, S314F S314W, S314P S314G S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N S314E, S314 S314R S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322 , N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334 , D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336 , S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336 , S336R, S336H, S336D, S336Q, 337L, 337V, K337I, K337M, 337F, 337W, 337P, 337G, 337S, 337T, K337C, 337Y, K337N, 337E, 337R, K337H, 337D, 337Q, 341E, K341Q, K341G, 341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, ' F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374 , F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390 , L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393 , S393E, E394 , P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400 , L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403 , A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, 32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/ 32S, A34N/R36S, A34N/R36T, 38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41 S, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, ¦?42?/?44?, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, 143N/ N145S, K143N/ N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/ 143S, L141N/ 143T, I140N/E142S, I1 0N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ 316S, S314N/ 316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, 316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/D343T, S339N/ 341S, S339N/ 341T, D343N/G345S, ' D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, 389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N./F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.
98. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-96, caracterizado porque comprende sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312, o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, o sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o . 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
99. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-98, caracterizado porque el polipéptido FVII no modificado tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3.
100. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 99 caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualesquiera de SEQ ID NOS: 113-157 o 159-342.
101. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-100, caracterizado porque el polipéptido FVII no modificado es una variante alélica o de especie del polipéptido establecido en SEQ ID NO: 3.
102. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la variante alélica o de especie tiene 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencias con el polipéptido establecido en SEQ ID NO: 3, excluyendo las modificaciones de aminoácidos.
103. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-102 caracterizado porque es un polipéptido humano.
104. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-102 caracterizado porque es un polipéptido no humano.
105. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-104 caracterizado porque es un polipéptido maduro.
106. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-105, caracterizado porque solamente se modifica la secuencia primaria.
107. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-105, caracterizado porque comprende además una modificación química o una modificación post-traduccional .
108. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-107, caracterizado porque el polipéptido FVII está glicosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado, o conjugado a una porción de polietilenglicol (PEG).
109. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-108, caracterizado porque es un polipéptido de cadena sencilla.
110. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-108, caracterizado porque es un polipéptido de dos cadenas.
111. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-108 caracterizado porque está activo o activado.
112. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque la activación se efectúa por la escisión proteolitica por autoactivación, escisión por Factor IX (FlXa), escisión por Factor X ( FXa ) , escisión por Factor XII (FXIIa), o escisión'por trombina.
113. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-112 caracterizado porque retiene una o más actividades del polipéptido FVII no modificado.
114. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-112, caracterizado porque comprende modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos con tal de que el polipéptido conserve al menos una actividad FVII del polipéptido FVII no modificado.
115. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 113 o la reivindicación 114, caracterizado porque el polipéptido modificado conserva al menos alrededor de o 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más de una actividad del polipéptido FVII no modificado.
116. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 113-115, caracterizado porque . la una o más actividades son seleccionadas de entre enlace al factor de tejido (TF) , activación del. factor X (FX), activación del Factor IX (FIX), enlace a fosfolipidos, y actividad de coagulación.
117. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 113-115, caracterizado porque las actividades que se retienen se incrementan en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
118. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 113-115, caracterizado porque las actividades que se retienen se disminuyen en comparación con el polipéptido FVII no modificado.
119. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-118, caracterizado porque la actividad de coagulación del polipéptido FVII modificado es al menos alrededor de, o es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de la actividad de coagulación del polipéptido FVII no modificado.
120. El polipéptido modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 109- 115, caracterizado porque la actividad se mide in vitro, ex vivo o in vivo.
121. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-120.
122. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 121.
123. El vector de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el vector es un vector procariótico, un vector viral, o un vector eucariótico.
124. El vector de conformidad con la reivindicación 122 o 123, caracterizado porque el vector es un vector mamifero.
125. El vector de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque el vector viral se selecciona de entre un adenovirus, un virus asociado con adeno, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un virus de viruela y un citomegalovirus .
126. Una célula, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 122-125.
127. La célula de conformidad con la reivindicación 126, caracterizada porque es una célula eucariótica.
128. La célula de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de mamífero.
129. La célula de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque la célula de mamífero se selecciona de entre células de riñon de hámster recién nacido (BH -21) o células 293 o células CHO.
130. La célula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 127-129, caracterizada porque la célula expresa el polipéptido FVII modificado.
131. Un polipéptido FVII modificado que se produce por la célula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 126-130.
132. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una concentración o cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-120 o 131, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 121 o un vector de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 122-125 o una célula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 126-130, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
133. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 132 caracterizada porque se formula para administración local, sistémica, o tópica.
134. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 132 o la reivindicación 133, caracterizada porque se formula para administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica , subcutánea, intraduodenal , enteral, parenteral, intravenosa, o intramuscular.
135. La composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 132-134 caracterizada porque se formula para liberación controlada.
136. La composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 132-134, caracterizada porque se formula para administración por dosificación sencilla .
137. Un método, que comprende tratar a un sujeto al administrar la composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 132-136, caracterizado porque el sujeto tiene una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.
138. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque la enfermedad o afección se trata por la administración de FVII activo (FVIIa).
139. El método de conformidad con la reivindicación 137 o la reivindicación 138, caracterizado porque el tratamiento con la composición farmacéutica aminora o alivia los síntomas asociados con la enfermedad o afección.
140. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 137-139, caracterizado porque comprende además monitorear al sujeto para cambios en los síntomas asociados con la enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.
141. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 137-140, caracterizado porque la enfermedad o afección a tratarse se selecciona de entre trastornos de coagulación sanguínea, trastornos hematológicos , trastornos de sangrado, hemofilias, deficiencia de factor VII y trastornos de sangrado.
142. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque la enfermedad o afección es hemofilia y la hemofilia es hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C.
143. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la hemofilia es congénita.
144. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque la hemofilia es adquirida.
145. El método de conformidad con la reivindicación 137- 140, caracterizado porque la enfermedad o afección se debe a una complicación de sangrado debida a cirugía o trauma.
146. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el sangrado se manifiesta como hemartrosis agudas, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales, o hemorragia cerebral.
147. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el sangrado es debido a una extracción dental.
148. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque la cirugía es cirugía del corazón, angioplastia , cirugía de pulmón, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental, o cirugía para transplante de órganos.
149. El método de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque la cirugía de transplante se selecciona de entre transplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas, e hígado.
150. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 137-149, caracterizado porque el sujeto tiene autoanticuerpos para el factor VIII o factor IX.
151. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 137-150, caracterizado porque comprende además administrar uno o más factores de coagulación adicionales.
152. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque el uno o más factores de coagulación adicionales son seleccionados de entre factores de coagulación purificados en plasma o recombinantes , procoagulantes, tal como vitamina , derivado de vitamina K e inhibidores de proteina C, plasma, plaquetas, células de glóbulos rojos y corticosteroides .
153. Un polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de conformidad con las reivindicaciones 1-120, para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un pro-coagulante.
154. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 132-136 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un pro-coagulante.
155. El polipéptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 153 o el uso de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque la enfermedad o afección se trata' por la administración de un zimógeno o una forma activa de FVII.
156. El polipeptido FVII modificado de conformidad con la reivindicación 153 o la reivindicación 155, o el uso de conformidad con la reivindicación 154 o la reivindicación 155, caracterizado porque el tratamiento con la composición farmacéutica aminora ' o alivia los síntomas asociados con la enfermedad o afección.
157. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 153, o 155 o 156, o el uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 151- 153, caracterizado porque comprende además monitorear al sujeto para camios en los síntomas asociados con la enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII u otra terapia pro-coagulante.
158. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 153, o 155-157, o el uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 154-157, caracterizado porque la enfermedad o afección a tratarse se selecciona de entre trastornos de coagulación sanguínea, trastornos hematológicos , trastornos de sangrado, hemofilias, deficiencia del factor VII, trastornos de sangrado, sangrado quirúrgico, o sangrado que resulta del trauma.
159. El polipéptido FVII modificado o uso de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque la enfermedad o afección es hemofilia y la hemofilia es hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C.
160. El polipéptido FVII modificado o uso de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la hemofilia es congénita.
161. El polipéptido FVII modificado o el uso de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la hemofilia es adquirida.
162. El polipéptido FVII modificado o el uso de la reivindicación 159, caracterizado porque la enfermedad o afección se debe a una complicación por sangrado debida a cirugía o trauma.
163. El polipéptido FVII modificado o uso de la reivindicación 162, caracterizado porque el sangrado se manifiesta como hemartrosis agudas, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales, o hemorragia cerebral.
164. El polipéptido FVII modificado o uso de la reivindicación 162, caracterizado porque el sangrado se debe a una extracción dental.
165. El polipéptido FVII modificado o uso de la reivindicación 162, caracterizado porque la cirugía es cirugía del corazón, angioplastia , cirugía de pulmón, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental, o cirugía para transplante de órganos .
166. El polipéptido FVII modificado o uso de la reivindicación 165, caracterizado porque la cirugía de transplante se selecciona de entre transplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas, e hígado.
167. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 153, o 155-166 o el uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 154- 166, caracterizado porque el sujeto tiene autoanticuerpos para el factor VIII o factor IX.
168. El polipéptido FVII modificado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 153, o 155-167, o el uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 154- 167, caracterizado porque comprende además administrar uno o más factores de coagulación adicionales.
169. El polipéptido FVII modificado o uso de la reivindicación 168, caracterizado porque el uno o más factores de coagulación adicionales son seleccionados de entre factores de coagulación recombinantes o purificados por plasma, procoagulantes, tal como vitamina , derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, células de glóbulos rojos y corticosteroides .
170. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende material de empaque y la composición farmacéutica de cualesquiera de las reivindicaciones .132-136 contenido dentro del material de empaque.
171. El articulo .de manufactura de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque: el polipéptido FVII modificado es efectivo para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediada por FVII, y el material de empaque incluye una etiqueta que indica que el polipéptido FVII modificado se usa para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por FVII.
172. Un kit, caracterizado porque comprende la composición farmacéutica de cualesquiera de las reivindicaciones 132-136, un dispositivo para la administración de la composición y, opcionalmente instrucciones para la administración.
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