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MX2010008199A - Composiciones y metodos para el tratamiento de tumores de origen hematopoyetico. - Google Patents

Composiciones y metodos para el tratamiento de tumores de origen hematopoyetico.

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MX2010008199A
MX2010008199A MX2010008199A MX2010008199A MX2010008199A MX 2010008199 A MX2010008199 A MX 2010008199A MX 2010008199 A MX2010008199 A MX 2010008199A MX 2010008199 A MX2010008199 A MX 2010008199A MX 2010008199 A MX2010008199 A MX 2010008199A
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MX
Mexico
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seq
antibody
acid sequence
amino acid
group
Prior art date
Application number
MX2010008199A
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Dan L Eaton
Victoria Smith
Jagath Reddy Junutula
Andrew Polson
Bing Zheng
Kristi Elkins
Craig Crowley
Frederic J Desauvage
Allen Ebens Jr
Jo-Anne S Hongo
Sarajane Ross
Richard L Vandlen
Original Assignee
Genentech Inc
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan composiciones de materia útiles para el tratamiento de tumores hematopoyéticos en mamíferos y métodos de uso de esas composiciones de materia para el mismo.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES ORIGEN HEMATOPOYETICO Campo de la invención La presente invención está dirigida a composiciones de materia útiles para el tratamiento de tumores hematopoyéticos en mamíferos y a métodos para usar esas composiciones de materia para los mismos.
Antecedentes de la invención Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de enfermedad cardiaca (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal las cuales proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que eventualmente se diseminan por medio de la sangre al sistema linfático a nodulos linfáticos regionales y a sitios distantes por medio de un proceso llamado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las cuales células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta a sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por tener grados diferentes de invasividad y agresividad. REF.: 212767 Los cánceres que incluyen células generadas durante hematopoyesis, un proceso mediante el cual se generan elementos celulares de la sangre, tales como linfocitos, leucocitos, plaquetas, eritrocitos y células asesinas naturales son conocidos como cánceres hematopoyéticos . Los linfocitos que pueden encontrarse en sangre y tejido linfático y que son críticos para la respuesta inmunitaria se categorizan en dos clases principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) , los cuales median inmunidad humoral y mediada por células, respectivamente .
Las células B maduran dentro de la médula ósea y dejan la médula al expresar un anticuerpo de unión a antígeno sobre su superficie celular. Cuando una célula B naive encuentra primero el antígeno para el cual su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memoria y células efectoras llamadas "células plasmáticas" . Las células B de memoria tienen una expectativa de vida más larga y continúan expresando anticuerpos unidos a membrana con la misma especificidad que la célula progenitora original. Las células plasmáticas no producen anticuerpos unidos a membrana sino que en su lugar producen el anticuerpo en una forma que puede ser secretada. Los anticuerpos secretados son la principal molécula efectora de inmunidad humoral .
Las células T maduran dentro del timo lo cual proporciona un ambiente para la proliferación y diferenciación de células T inmaduras. Durante la maduración de células T, las células T sufren las redisposiciones génicas que producen al receptor de células T y la selección positiva y negativa que ayuda a determinar el fenotipo de superficie celular de la célula T madura. Los marcadores de superficie celular característicos de las células T madura son el complejo de receptor de CD3:células T y uno de los co-receptores, CD4 o CD8.
En intentos por descubrir objetivos celulares efectivos para terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos asociados a transmembrana u otros polipéptidos asociados a membrana que son expresados específicamente sobre la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. Comúnmente, estos polipéptidos asociados a membrana son expresados más abundantemente sobre la superficie de las células cancerosas en comparación con la superficie de las células no cancerosas. La identificación de estos polipéptidos y antígenos de superficie celular asociados a tumor ha dado origen a la capacidad para seleccionar específicamente células objetivo para su destrucción por medio de terapias a base de anticuerpos. A este respecto, se indica que la terapia a base de anticuerpos ha probado ser muy efectiva en ® el tratamiento de ciertos canceres. Por ejemplo, HERCEPTIN y RITUXA ® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que han sido usados exitosamente para tratar cáncer de seno y linfoma no Hodgkin, respectivamente. En forma más específica, HERCEPTIN8 es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del proto-oncogen del receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) . La sobre-expresión de la proteína HER2 se observa en 25-30% de los canceres de seno primarios. RITUXAN es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico manipulado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos. Ambos de estos anticuerpos se producen recombinantemente en células CHO.
En otros intentos por descubrir objetivos celulares efectivos para terapia del cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que sean producidos específicamente por uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas, (2) polipéptidos que se produzcan por células cancerosas a un nivel de expresión que sea significativamente más alto que el de una o más células no cancerosas normales, o (3) polipéptidos cuya expresión esté limitada específicamente sólo a un solo tipo de tejido (o un número muy limitado) de tipos de tejido diferentes en estado tanto canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de próstata normal y de tumor de próstata) . Estos polipéptidos pueden permanecer ubicados intracelularmente o pueden ser secretados por la célula cancerosa. Además, estos polipéptidos pueden ser expresados no por la propia célula cancerosa, sino más bien por células que produzcan y/o secreten polipéptidos que tengan un efecto potenciador o incrementador del crecimiento en células cancerosas. Estos polipéptidos secretados comúnmente son proteínas que proporcionan a las células cancerosas una ventaja de crecimiento sobre células normales e incluyen cosas tales como, por ejemplo, factores angiogénicos , factores de adhesión celular, factores de crecimiento y similares. La identificación de antagonistas de estos polipéptidos no asociados a membrana se esperaría que sirviera como agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de estos cánceres. Además, la identificación del patrón de expresión de estos polipéptidos sería útil para el diagnóstico de cánceres particulares en mamíferos.
A pesar de los avances identificados arriba en la terapia de cáncer en mamíferos, existe una gran necesidad por agentes terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumores en un mamífero y para inhibir de manera efectiva el crecimiento de células neoplásicas, respectivamente. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es identificar polipéptidos, polipéptidos asociados a membrana celular, secretados intracelulares cuya expresión sea limitada específicamente únicamente a un solo tipo de tejido (o sólo a un número muy limitado de tejidos diferentes, tejidos hematopoyéticos , tanto en estado canceroso como no canceroso, y al uso de sus polipéptidos, y sus ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en la detección del tratamiento terapéutico de cáncer hematopoyético en mamíferos .
CD79 es un componente de señalización del receptor de células B que consiste en un heterodímero covalente que contiene CD79a (Iga, mb-1) y CD79b (Ig , B29) . CD79a y CD79b contienen cada una un dominio de inmunoglobulina (Ig) extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio de señalización intracelular, un dominio de motivo de activación a base de tirosina de inmunorreceptor (ITA ) . La expresión de CD79 está restringida a células B y es expresada en células de linfoma No Hodgkin (NHLs) (Cabezudo et al., Hae atologica , 84:413-418 (1999); D'Arena et al., Am. J. Hematol . 64:275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol . Invest . , 35:93-114 (2006)). CD79a y CD9b y slg se requieren todos para la expresión superficial de CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7)). La expresión de superficie promedio de CD79b sobre NHLs es similar a aquella en células B normales, pero con una escala más grande (Matssuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7 (2001)).
Así, es benéfico producir anticuerpos terapéuticos contra el antígeno CD79a y CD79b que creen mínima o ninguna antigenicidad cuando se administren a pacientes, especialmente para tratamiento crónico. La presente invención satisface éstas y otras necesidades. La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD79a y anti-CD79b que superan las limitaciones de las composiciones terapéuticas actuales así como ofrecen ventajas adicionales que serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada.
El uso de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) , es decir, inmunoconjugados , para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir, fármacos para matar o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer Lambert, J. (2005) Curr. Opinión in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005). Nature Biotechology 23 (9) : 1137-1146 ; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278) permite el suministro dirigido de la porción de fármaco a tumores, y acumulación intracelular en los mismos, en donde la administración sistémica de estos agentes de fármaco no conjugados podría traducirse en niveles inaceptables de toxicidad para células normales así como las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al (1986) Lancet pp. (15 de marzo de 1986) : 603-05 ; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monocloanl Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al (eds.), pág. 475-506). Los esfuerzos por mejorar el índice terapéutico, es decir, la eficacia máxima y la toxicidad mínima de ADC se han enfocado en la selectividad de anticuerpos policlonales (Rowland et al (1986) Cáncer Immunol . Immunother, 21:183-87) y anticuerpos monocloanles (mAbs) así como propiedades de enlace a fármacos y de liberación de fármaco (Lambert, J. (2005) Curr. Opinión en Pharmacology 5:543-549). Las porciones de fármaco usadas en conjugados anticuerpo-fármaco incluyen toxinas de proteínas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas de proteínas vegetales tales como resina, moléculas pequeñas tales como auristatinas , geldanamicina (Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cáncer Inst. 92 (19) : 1573-1581 ; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al (1996) Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 93:8618-8623), caliqueamicina (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342), daunomicina, doxorrubíciña, metotrexato y vindesina (Rowland et al (1986) citado arriba) . Las porciones de fármaco pueden afectar mecanismos citotóxicos y citostáticos incluyendo unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a anticuerpos grandes o a ligandos receptores de proteínas.
Los péptidos de auristatina, aristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina (WO 02/088172) , han sido conjugados como porciones de fármaco a: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) ; (ii) cAClO el cual es específico para CD30 en malignidades hematológicas (Klussman, et al (2004) , Bioconjugate Chemistry 15 (4) : 765-773 ; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7) :778-784; Francisco et al (2003) Blood 102 (4) :1458-1465; US 2004/0018194; (iii) anticuerpos anti-CD20 tales como rituxan (WO 04/032828) para el tratamiento de cánceres que expresen CD20 y trastornos inmunitarios ; (iv) anticuerpo anti-EphB2R 2H9 para el tratamiento de cáncer colorrectal (Mao et al (2004) Cáncer Research 64 (3) : 781-788) ; (v) anticuerpo E-selectina (Bhaskar et al (2003) Cáncer Res. 63:6387-6394); (vi) trastuzumab (HERCEPTIN®, US 2005/0238649) y (vi) anticuerpos anti-CD30 (WO 03/043583). Las variantes de auristatina E se describen en US 5767237 y US 6124431.
Monoraetil auristatina E conjugada a anticuerpos monoclonales se describe en Senter et al, Proceedings of the American Associates for Cáncer Research, volumen 45, Abstract Number 623, presentada el 28 de marzo de 2004. Análogos de auristatina MMAE y MMAF han sido conjugados a varios anticuerpos (US 2005/0238649) .
Los medios convencionales de fijación, es decir, enlace a través de enlaces covalentes, de una porción de fármaco a un anticuerpo generalmente llevan a una mezcla heterogénea de moléculas en donde las porciones de fármaco son fijadas a un número de sitios en el anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos típicamente han sido conjugados a anticuerpos a través de los residuos de lisina comúnmente numerosos de un anticuerpo, generando una mezcla de conjugado a anticuerpo-fármaco heterogénea. Dependiendo de las condiciones de reacción, la mezcla heterogénea típicamente contiene una distribución de anticuerpos de 0 a aproximadamente 8, o más, porciones de fármaco unidas. Además, dentro de cada subgrupo de conjugados con una relación de enteros particular de porciones de fármaco a anticuerpo, es una mezcla potencialmente heterogénea en donde la porción de fármaco es unida en varios sitios en el anticuerpo. Los métodos analíticos y preparativos pueden ser inadecuados para separar y caracterizar las moléculas de especies conjugadas a anticuerpo- fármaco dentro de la mezcla heterogénea que resulta de una reacción de conjugación. Los anticuerpos son biomoléculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, comúnmente con muchos grupos funcionales reactivos. Sus reactividades con reactivos enlazadores e intermediarios enlazadores de fármaco dependen de factores tales como pH, concentración, concentración de sal y co-solventes . Además, el proceso de conjugación de varias etapas puede ser no reproducible debido a dificultades para controlar las condiciones de reacción y caracterizar reactivos e intermediarios.
Los tioles de cisteína son reactivos a pH neutro, a diferencia de la mayoría de las salinas las cuales son protonadas y menos nucleófilas cerca de pH 7. Ya que los grupos tiol libre (RSH, sulfhidrilo) son relativamente reactivos, las proteínas con residuos de cisteína comúnmente existen en su forma oxidada como oligómeros enlazados a disulfuro o tienen grupos de disulfuro puenteados internamente. Las proteínas extracelulares generalmente no tienen tioles libres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, página 55) . Los grupos tiol de cisteína de anticuerpos generalmente son más reactivos, es decir, más nucleofílieos , hacia reactivos de conjugación electrofilos que los grupos de amina o hidroxilo de anticuerpos. Los residuos de cisteína han sido introducidos en proteínas mediante técnicas de manipulación genética para formar enlaces covalentes a ligandos o para formar nuevos enlaces de disulfuro intramoleculares (Better et al (1994) J. Biol . Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al (1999) Proc . Nati. Acad. Sci E.U.A. 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechmolgoy, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 98 (15) : 8480-8484 ; US 6248564) . Sin embargo, la manipulación en grupos tiol de cisteína mediante la mutación de varios residuos de aminoácido de una proteína a aminoácidos de cisteína es potencialmente problemática, particularmente en el caso de residuos no apareados (Cys libre) o aquellos que son relativamente accesibles para reacción u oxidación. En soluciones concentradas de la proteína, ya sea en el periplasma de E. coli, sobrenadantes de cultivo, o proteína purificada parcial o completamente, residuos Cys no apareados sobre la superficie de la proteína pueden aparearse y oxidarse para formar disulfuros intermoleculares, y por consiguiente dímeros o multímeros de proteínas. La formación de dímeros de disulfuro hace al nuevo Cys no reactivo para la conjugación en fármaco, ligando u otro marcador. Además, si la proteína forma de manera oxidante un enlace de disulfuro intramolecular entre la Cys recién manipulada y un residuo de Cys existente, ambos grupos tiol de Cys no están disponibles para participación en sitios activos e interacciones. Además, la proteína puede hacerse inactiva o no específica, mediante un doblamiento inadecuado o pérdida de estructura terciaria (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9).
Los anticuerpos manipulados con cisteína han sido diseñados como fragmentos de anticuerpo FAB (tioFab) y expresados como anticuerpos monoclonales de IgG de longitud completa (tioMab) (US 2007/0092940, los contenidos de la cual se incorporan a manera de referencia. Los anticuerpos tio-Fab y tioMab han sido conjugados a través de enlazadores en los tioles de cisteína recién introducidos con reactivos enlazadores que son reactivos con tiol y reactivos enlazadores de fármaco para preparar conjugados anticuerpo fármaco (tio ADC) .
Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan a manera de referencia en su totalidad.
Breve descripción de la invención A. Modalidades En la presente descripción, los solicitantes describen por primera vez la identificación de varios polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos de codificación o fragmentos de los mismos) los cuales son expresados específicamente por células tanto tumorales como normales y un tipo de célula específico, por ejemplo células generadas durante hematopoyesis, es decir, linfocitos, leucocitos, eritrocitos y plaquetas. Todos los polipéptidos anteriores son referidos en la presente como Antígenos Tumorales de polipéptidos de Origen Hematopoyético ("polipéptidos TAHO" ) y se espera que sirvan como objetivos efectivos para terapia de cáncer en mamíferos.
La invención proporciona anticuerpos anti-CD79a y anti-CD79b o fragmentos funcionales de los mismos, y su método de uso en el tratamiento de tumores hematopoyéticos.
En consecuencia, en una modalidad de la presente invención, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno tumoral de polipéptido de origen hematopoyético (un polipéptido TAHO") o fragmento del mismo.
En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, con (a) una molécula de ADN que codifica para un polipéptido TAHO de longitud completa que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAHO que carece del péptido de señal como el descrito en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAHO de longitud completa como la descrita en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, con (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de codificación de un ADNc de polipéptido TAHO de longitud completa como el descrito en la presente, la secuencia de codificación de un polipéptido TAHO que carece de péptido de señal como el descrito en la presente, la secuencia de codificación de un dominio extracelular de un polipéptido TAHO de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TAHO de longitud completa como la descrita en la presente, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
En aspectos adicionales, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa por lo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, con (a) una molécula de ADN que codifica para el mismo polipéptido maduro codificado por la región de codificación de longitud completa de cualquier molécula de ADNc de proteína humana depositada en la ATCC como se describe en la presente, o (b) complemento de la molécula de ADN de (a) .
Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido TAHO el cual es ya sea eliminado del dominio de transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana, o es complementario a esta secuencia de nucleótidos de codificación, en donde los dominios de transmembrana de estos polipéptidos se describen en la presente. Por lo tanto, se contemplan dominios extracelulares solubles de los polipéptidos TAHO descritos en la presente.
En otros aspectos, la presente invención está dirigida a moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido TAHO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAHO que carece del péptido de señal como el descrito en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO de transmembrana, con o sin el péptido de señal como el descrito en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAHO de longitud completa como la descrita en la presente, o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . A este respecto, una modalidad de la presente invención está dirigida a fragmentos de una secuencia de codificación de polipéptido de TAHO de longitud completa, o el complemento de la misma, como la descrita en la presente, que pueden encontrar uso como, por ejemplo, sondas de hibridación útiles como, por ejemplo, sondas de detección, sondas de oligonucleótidos antisentido o para codificar fragmentos de un polipéptido de THO de longitud completa que puedan opcionalmente codificar para un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo de polipéptido anti-TAHO, un oligopéptido de unión a TAHO u otra molécula orgánica pequeña que se una a un polipéptido TAHO. Estos fragmentos de ácido nucleico normalmente tienen alrededor de aproximadamente 5 nucleótidos de largo, como alternativa por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370,380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840,850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ó 1000 nucleótidos de largo, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa que la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos 10% de la longitud referenciada. Se hace notar que los fragmentos nuevos de una secuencia de nucleótidos que codifica para polipéptido TAHO pueden determinarse de una manera rutinaria al alinear la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido TAHO con otras secuencias de nucleótidos conocidas usando cualquiera de un número de programas de alineación de secuencia bien conocidos y determinando qué fragmentos de secuencia de nucleótidos que codifican para polipéptido TAHO son novedosos. Todos estos fragmentos novedosos de secuencias de nucleótidos que codifican para el polipéptido TAHO se contemplan en la presente. También se contemplan los fragmentos de polipéptido TAHO codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, de preferencia 500 fragmentos de polipéptido TAHO que comprendan un sitio de unión para un anticuerpo anti-TAHO, un oligopéptido de unión a TAHO u otra molécula orgánica pequeña que se una a un polipéptido TAHO.
En ciertos aspectos, la invención se refiere a un polipéptido TAHO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa por lo menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos, con un polipéptido TAHO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAHO que carece del péptido de señal como el descrito en la presente, un dominio extracelular de una proteína de polipéptidos TAHO de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAHO de longitud completa como la descrita en la presente .
En un aspecto más, la invención se refiere a un polipéptido TAHO aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las moléculas de ADNc de proteína humana depositadas en la ATCC como las descritas en la presente.
En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido TAHO aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o sin la metionina de inicio y es codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica para esta secuencia de aminoácidos como la descrita anteriormente en la presente. Los procesos para producir los mismos también se describen en la presente, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprenda un vector que comprenda la molécula de ácido nucleico de codificación adecuado bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAHO y recuperar el polipéptido TAHO del cultivo de células.
Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido TAHO aislado el cual es ya sea de dominio de transmembrana eliminado o de dominio de transmembrana inactivado. Procesos para producir los mismos también se describen en la presente, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprenda la molécula de ácido nucleico de codificación adecuada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAHO y recuperar el polipéptido TAHO del cultivo de células.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica para cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. Células hospederas que comprenden cualquiera de estos vectores también son proporcionadas. A manera de ejemplo, las células hospederas pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente se proporciona además y comprende cultivar células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo de células.
En otras modalidades, la invención proporciona polipéptidos quiméricos aislados que comprenden cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos en la presente fusionado a un polipéptido heterólogo (no TAHO) . Ejemplos de estas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos en la presente fusionado a un polipéptido heterólogo tales como, por ejemplo, una secuencia de marcadores de epítopes o una región Fe de una inmunoglobulina .
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se une, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos anteriores o descritos abajo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, incluyendo un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2 y Fv, dicuerpo, anticuerpo de un solo dominio, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de una sola cadena o anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de polipéptido anti-TAHO a su epítope antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente pueden conjugarse a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide , un derivado de dolostatina o una caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los anticuerpos de la presente invención pueden opcionalmente producirse en células CHO o células bacterianas e inducir de preferencia la muerte de una célula a la cual se unan. Para propósitos de detección, los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse en forma detectable, unirse a un soporte sólido o similar.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tales como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti-TAHO comprende: (a) una secuencia de dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 97, 99 6 101; y/o (b) una secuencia de dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 98, 100 ó 102.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti-TAHO comprende: (a) una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10, 33 ó 41; y/o (b) una secuencia de dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12, 35 ó 43.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une al polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un epítope dentro de una región de un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , seleccionados del grupo que comprende : (a) una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4 ; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO:8; o (c) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 13.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un epítope en donde el epítope comprende aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4, en donde el aminoácido en la posición 30, 34 y 36 es Arg. En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un epítope en donde el epítope comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 8, en donde el aminoácido en la posición 35 es Leu.
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un epítope dentro de una región de un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde el epítope tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con : (a) una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO: 8; o (c) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 13.
En una modalidad adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde el anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un epítope en donde el anticuerpo comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4, en donde el aminoácido en la posición 30, 34 y 36 es Arg. En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO, en donde este anticuerpo anti-TAHO se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en donde este anticuerpo anti- TAHO se une a un epítope en donde el epítope comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 8, en donde el aminoácido en la posición 35 es Leu.
En un aspecto, los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos manipulados con cisteína en donde uno o más aminoácidos de un anticuerpo de origen son reemplazados con un aminoácido de cisteína libre como se describe en WO2006/034488 ; US 2007/00992940 (incorporadas en la presente a manera de referencia en su totalidad) . Cualquier forma de anticuerpo anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , también puede manipularse de esta manera es decir, mutarse. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fab de origen puede manipularse para formar un Fab manipulado con cisteína, conocido en la presente como "ThioFab". En forma similar, un anticuerpo monoclonal de origen puede manipularse para formar un "ThioMab" . Se debe notar que un solo sitio de mutación produce un solo residuo de cisteína manipulado en un ThioFab, en donde una sola mutación de sitio produce dos residuos de cisteína manipulados en un ThioMab, debido a la naturaleza dimérica del anticuerpo IgG. Los anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína de la invención, tales como anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAH040) , incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos, y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, polipéptidos de fusión y análogos que de preferencia se unen a polipéptidos TAHO asociados a células, tales como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) . Un anticuerpo manipulado por cisteína puede comprender alternativamente un anticuerpo que comprenda una cisteína en una posición descrita en la presente en el anticuerpo o Fab, que resulte del diseño y/o selección de secuencia del anticuerpo, sin alterar necesariamente un anticuerpo de origen, tal como mediante diseño y selección de anticuerpos por despliegue de fagos o a través de diseño novedoso de secuencias estructurales de la cadena ligera y/o cadena pesada y regiones constantes . Un anticuerpo manipulado por cisteína comprende uno o más aminoácidos de cisteína libres que tienen un valor de reactividad tiol en las escalas de 0.6 a 1.0; 0.7 a 1.0 ó 0.8 a 1.0. Un aminoácido de cisteína libre es un residuo de cisteína que ha sido manipulado en el anticuerpo de origen y no es parte de un puente de disulfuro. Los anticuerpos manipulados por cisteína son útiles para la fijación de compuestos citotóxicos y/o formadores de imágenes en el sitio de la cisteína manipulada a través de, por ejemplo, una maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleófila de la funcionalidad tiol de un residuo Cys a un grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces más alta en comparación con cualquier otra f ncionalidad de aminoácido en una proteína, tal como un grupo amina de residuos de lisina o el grupo amino N-terminal. La funcionalidad específica de tiol en reactivos de yodoacetilo y maleimida puede reaccionar con grupos amina, pero pH más alto (>9.0) y tiempos de reacción más largos se requieren (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London) .
En una modalidad, un anticuerpo anti-TAHO manipulado por cisteína, tal como anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención comprenden una cisteína manipulada en cualquiera de las siguientes posiciones, en donde la posición es numerada de acuerdo con Kabat et al. en la cadena ligera (véase Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, D) y de acuerdo con la numeración EU en la cadena pesada (incluyendo la región Fe) (véase Kabat et al. (1991), citado arriba) , en donde la región constante de la cadena ligera ilustrada al subrayar en la figura 30A, 31A, 35A y 36A empieza en la posición 109 (numeración de Kabat) y la región constante de la cadena pesada ilustrada por subrayado en las figuras 30B, 31B, 35B y 36B empieza en la posición 118 (numeración EU) . La posición también se puede referir por su posición en la numeración secuencial de los aminoácidos de la cadena ligera o cadena pesada de longitud completa mostradas en las figuras 30A-31B y 35A-35B. De acuerdo con una modalidad de la invención, un anticuerpo anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , comprende una cisteína manipulada en LC-V205C (número de Kabat; Val 205; número secuencial 208 en la figura 30A y figura 36A manipulado para ser Cys en esa posición) . La cisteína manipulada en la cadena ligera se muestra en negritas, texto con doble subrayado en la figura 30A y 36A. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , comprende una cisteína manipulada en HC-A118C (número EU: Ala 118; número Kabat 114; número secuencial 118 en la figura 31B o 35B manipulado para ser Cys en esa posición) . La cisteína manipulada en la cadena pesada se muestra en texto subrayado doble y en negritas en la figura 3IB o 35B. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo anti-TAHO tal como anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , comprende una cisteína manipulada en Fc-S400C (número EU: Ser 400; número Kabat 396; número secuencial 400 en la figura 31B o 35B manipulado para ser Cys en esa posición) . En otras modalidades, la cisteína manipulada de la cadena pesada (incluyendo la región Fe) es cualquiera de las siguientes posiciones (de acuerdo con la numeración de Kabat con numeración EU entre paréntesis) : 5, 23, 84, 112, 114 (numeración EU 118), 116 (120 numeración EU) , 275 (279 numeración EU) , 371 (375 numeración EU) o 396 (400 numeración EU) . Así, los cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo anti-TAHO quimérico progenitor, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) , de la invención son: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (A118C numeración EU) , T161C (T120C numeración EU) , V275C (V279C numeración EU) , S371C (S375C numeración EU) o S396C (S400C numeración EU) . De esta manera, los cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo anti-CD79b de macacao (TAHO40) de la invención son: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (A118C numeración EU) , T116C (T120C numeración EU) , V275C (V279C numeración EU) , S371C (S375C numeración EU) o S396C (S400C numeración EU) . En otras palabras, la cisteína manipulada de la cadena ligera está en cualquiera de las siguientes posiciones (de acuerdo a la numeración de Kabat) : 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Así, los cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) quimérico progenitor de la invención son: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C o V205C. De esta manera, cambios en el aminoácido en estas posiciones para un anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) progenitor de la invención son: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C o V205C.
Un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , comprende uno o más aminoácidos de cisteína libres, en donde el anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , y se preparar mediante un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácido de un anticuerpo anti-TAHO progenitor, tal como anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) y/o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , por cisteína en donde el anticuerpo progenitor comprende: (a) una secuencia de dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 97, 99 ó 101; y/o (b) una secuencia de dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 98, 100 ó 102.
Un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , comprende uno o más aminoácidos de cisteína libres en donde el anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , se une a un polipéptido TAHO, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , y se prepara mediante un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácido de un anticuerpo anti-TAHO progenitor, tal como un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , por cisteína, en donde el anticuerpo progenitor comprende: (a) una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10, 33 ó 41; y/o (b) una secuencia de dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12, 35 ó 43.
En cierto aspecto, la invención se refiere a un anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa por lo menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 81%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos, con un anticuerpo manipulado con cisteína que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como la descrita en la presente, o una secuencia de aminoácidos de anticuerpos manipulada por cisteína que carece del péptido de señal como el descrito en la presente.
En un aspecto más, la invención se refiere a un anti-TAHO manipulado con cisteína aislado, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , que comprende una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos que híbrida al complemento de una molécula de ADN que codifica para (a) un anticuerpo manipulado con cisteína que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa como la descrita en la presente, (b) una secuencia de aminoácidos de anticuerpo manipulada con cisteína que carece del péptido de señal como el descrito en la presente, (c) un dominio extracelular de una proteína de anticuerpo manipulada por cisteína de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como la descrita en la presente, (d) una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente o (e) cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo manipulado con cisteína de longitud completa como el descrito en la presente.
En un aspecto específico, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína aislado, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , sin la secuencia de señal N-terminal y/o sin la metionina de inicio y es codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica para esta secuencia de aminoácidos como la descrita en la presente. Procesos para producir los mismos también se describen aquí, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprenda la molécula de ácido nucleico de codificación adecuada bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo manipulado con cisteína y recuperar el anticuerpo manipulado con cisteína del cultivo de células.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína aislado, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , el cual es ya sea suprimido en dominio de transmembrana o inactivado en dominio de transmembrana. Procesos para producir los mismos también se describen en la presente, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprenda la molécula de ácido nucleico de codificación adecuada bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo manipulado con cisteína, y recuperar el anticuerpo manipulado con cisteína del cultivo de células.
En otras modalidades, la invención proporciona anti-TAHO aislado, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , anticuerpos manipulados con cisteína quiméricos que comprenden cualquiera del anticuerpo manipulado con cisteína descrito en la presente fusionado a un polipéptido heterólogo (no TAHO, tal como CD79b no humano (TAH05) o CD79b no de macaco (TAHO40) ) . Ejemplos de estas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los anticuerpos manipulados con cisteína descritos en la presente, fusionados a un polipéptido heterólogo tal como, por ejemplo, una secuencia de marcadores de epítopes o una región Fe de una inmunoglobulina .
El anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , puede ser un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena individual o anticuerpo que inhiba competitivamente la unión de un anticuerpo polipéptido anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , a su epítope antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una auristatina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similares. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas o inhiben de preferencia el crecimiento o proliferación de o inducen la muerte de una célula a la cual se unen. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse de manera detectable, unirse a un soporte sólido o similar.
Los anticuerpos manipulados con cisteína pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer e incluyen anticuerpos específicos para los receptores de superficie celular y transmembrana, y antígenos asociados a tumor (TAA) . Estos anticuerpos pueden usarse como anticuerpos desnudos (no conjugados a una porción de fármaco o marcadora) o como conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) . Los anticuerpos manipulados con cisteína de la invención pueden ser específicamente de sitio o acoplados eficientemente con un reactivo que reaccione con tiol . El reactivo que reacciona con tiol puede ser un reactivo enlazador multif ncional , un reactivo marcador de captura, un reactivo fluoróforo o un intermediario de enlazador a fármaco. El anticuerpo manipulado con cisteína puede ser marcado con un marcador detectable, inmovilizado sobre un soporte de fase sólida y/o conjugado con una porción de fármaco. La reactividad tiol puede generalizarse a cualquier anticuerpo en donde la sustitución de aminoácidos con aminoácidos de cisteína reactivos pueda hacerse dentro de las escalas en la cadena ligera seleccionadas de las escalas de aminoácido: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; y dentro de las escalas en la cadena pesada seleccionadas de las escalas de aminoácido: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121 y en la región Fe dentro de las escalas seleccionadas de H270-H280, H366-H376, H391-401, en donde la numeración de las posiciones de aminoácido empieza en la posición 1 del sistema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) y continúa secuencialmente más adelante como se describe en WO2006034488; US 2007/0092940. La reactividad tiol puede generalizarse también a ciertos dominios de un anticuerpo, tales como el dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los reemplazos de cisteína que resulten en valores de reactividad de tiol de 0.6 y más altos pueden hacerse en los dominios constantes de la cadena pesada a, d, e, ? y µ de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluyendo las subclases de IgG: IgGl , IgG2, IgG3 , IgG4 , IgA e IgA2. Estos anticuerpos y sus usos se describen en O2006/034488; US 2007/009240.
Los anticuerpos manipulados con cisteína de la invención conservan de preferencia la capacidad de unión a antígeno de sus contrapartes de anticuerpo progenitor tipo silvestre. Así, los anticuerpos manipulados con cisteína son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a antígenos. Estos antígenos incluyen, por ejemplo, antígenos asociados a tumor (TAA) , proteínas receptoras de superficie celular y otras moléculas de superficie celular, proteínas de transmembrana, proteínas de señalización, factores reguladores de supervivencia celular, factores reguladores de proliferación celular, moléculas asociadas con (por ejemplo, conocidas o que se sospeche contribuyan funcionalmente a) desarrollo de diferenciación tisular, linfocinas, citocinas, moléculas implicadas en regulación de ciclo celular, moléculas implicadas en vasculogénesis y moléculas asociadas con (por ejemplo, que se conozcan o sospeche contribuyan funcionalmente a) angiogénesis . El antígeno asociado a tumor puede ser un factor de diferenciación en racimo (es decir, una proteína CD, incluyendo pero no limitada a un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40)). Los anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención conservan la capacidad de unión a antígeno de sus contrapartes de anticuerpo anti-TAHO progenitor, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) . Así, anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a antígenos TAHO, tales como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , incluyendo anti-TAHO humano, tales como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , isoformas delta y/o alfa, incluyendo cuando estos antígenos son expresados sobre la superficie de células, incluyendo, sin limitación, células B.
En un aspecto, los anticuerpos de la invención pueden ser conjugados con cualquier porción marcadora que pueda unirse covalentemente al anticuerpo a través de una porción reactiva, una porción inactivada o un grupo tiol de cisteína reactivo (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lañe, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a edición, CRC Press, Boca Ratón, FL) . El marcador unido puede funcionar para (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primero o segundo marcador, por ejemplo, para dar FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) ; (iii) estabilizar interacciones e incrementar afinidad de unión, con antígeno o ligando; (iv) afectar movilidad, por ejemplo, movilidad electroforética o permeabilidad celular, mediante carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos, o (v) proporcionar una porción de captura, para modular la afinidad a ligando, unión a anticuerpo/antígeno o formación de complejos iónicos.
Los anticuerpos manipulados con cisteína marcados pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células, tejidos o suero específicos. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente será marcado con una porción detectable . Numerosos marcadores están disponibles los cuales pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías : Radioisótopos (radionúclidos) , tales como 3H, 1:LC, 14C, 18F 32p; 35S / 64Cu> 68^ 86^ 99^ lllj^ 123^ 124^ 125^ 131^ 13Xe, 177Lu, 211At, o 213Bi . Los anticuerpos marcados con radioisótopos son útiles en experimentos de formación de imágenes dirigidos a receptor. El anticuerpo puede marcarse con reactivos de ligando que se unan, quelen o de otra manera complejen un metal radioisótopo en donde reactivo sea reactivo con el tiol de cisteína manipulado del anticuerpo, usando las técnicas descritas en Current Protocols en Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, Pubs . (1991). Los ligandos quelantes que pueden complejar un ión metálico incluyen DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA (Macrocyclics , Dallas, TX) . Los radionúclidos pueden ser dirigidos por medio de complej ación con los conjugados anticuerpo- fármaco de la invención (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23 (9) : 1137-1146) .
Los reactivos enlazadores tales como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA pueden prepararse mediante la reacción de aminobencil-DOTA con ácido 4 -mealeimidobutírico (Fluka) activado con cloroformiato de isopropilo (Aldrich) , siguiendo el procedimiento de Axworthy et al (2000) Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 97 (4) : 1802-1807) . Los reactivos de DOTA-maleimida reaccionan con los aminoácidos de cisteína libres de los anticuerpos manipulados con cisteína y proporcionan un ligando de complej ación de metales en el anticuerpo (Lewis et al (1998) Bioconj . Chem. 9:72-86). Los reactivos de marcado con enlazador quelante tales como DOTA-NHS (ácido 1,4, 7, 10-tetraazaciclododecan-l,4, 7, 10-tetraacético mono (éster N-hidroxisuccinimida) están disponibles comercialmente (Macrocyclics , Dallas, TX) . La formación de imágenes de objetivos receptores con anticuerpos marcados con radionúclidos pueden proporcionar un marcador de activación de vía mediante la detección y cuantificación de la acumulación progresiva de anticuerpos en tejido tumoral (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett . 8:1207-1210). Los radio-metales conjugados pueden permanecer intracelulares después de la degradación lisosómica.
Los complejos de quelatos de metal adecuados como marcadores de anticuerpo para experimentos de formación de imágenes se describen: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al (1983) J. Immunol . Methods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142-68-78; Mirzadeh et al (1990) bioconjugate Chem. 1:59-56; Meares et al (1990) J. Cáncer 1990, Sup l . 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucí. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucí. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. Nucí. Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucí. Med. 21:640-646; Ruegg et al (1990) Cáncer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucí. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cáncer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003) J. Nucí. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucí. Med. 45:129-137; DeNardo et al (1998) Clinical Cáncer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucí. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. Nucí. Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucí. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
Los marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , tipos de fluoresceína incluyendo FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína ; tipos rodamina incluyendo TAMRA; dansilo; lisamina, cianinas, ficoeritrinas , Rojo Texas y análogos de los mismos. Los marcadores fluorescentes pueden ser conjugados a anticuerpos usando las técnicas descritas en Current Protocols en Immunology, véase arriba, por ejemplo. Los colorantes fluorescentes y reactivos marcadores fluorescentes incluyen aquellos que están disponibles comercialmente de Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL) .
Varios marcadores de substrato enzimático están disponibles o descritos (US 4275149) . La enzima cataliza generalmente una reacción química de un substrato cromogénico que puede medirse usando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, lo cual puede medirse espectrofotométricamente . Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del substrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describen arriba. El substrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado por medio de una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o da una energía a un receptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; US 4737456), luciferina, 2 , 3 -dihidroftalazindionas , malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRP) , fosfatasa alcalina (AP) , ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa , microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay" , in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic Press, Nueva York, 73:147-166.
Ejemplos de combinaciones enzima-substrato incluyen, por ejemplo : (i) Peroxidasa de rábano (HRP) con hidrógeno peroxidasa como un substrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil- -D-galactosidasa) o un substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil- -D-galactosidasa .
Numerosas otras combinaciones enzima-substrato están disponibles para aquellos expertos en la técnica. Para una revisión general, véase US 4275149 y US 4318980.
Un marcador puede conjugarse indirectamente con una cadena lateral de aminoácido, una cadena lateral de aminoácido activado, un anticuerpo manipulado con cisteína y similares. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionados arriba se puede conjugar con avidina, o estreptavidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a estreptavidina y de esta manera, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Como alternativa, para lograr la conjugación indirecta del marcador con la variante de polipéptido, la variante de polipéptido se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados arriba se conjuga con una variante de polipéptido anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina) . Así, la conjugación indirecta de marcador con la variante de polipéptido puede lograrse (Hermanson, G. (1996) en Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego) .
El anticuerpo de la presente invención se puede emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de unión competitiva, ensayos de emparedado directos e indirectos y ensayos de imunoprecipitación (Zola, (1987) Monoclonal Antobidies: A Manual of Techniques, pág. 147-158, CRC Press, Inc . ) .
Un marcador de detección puede ser útil para localizar, visualizar y cuantificar un evento de unión o reconocimiento. Los anticuerpos marcados de la invención pueden detectar receptores de superficie celular. Otro uso para los anticuerpos marcados en forma detectable es un método de inmunocaptura a base de ceras que comprende conjugar una esfera con un anticuerpo marcado fluorescente y detectar una señal de fluorescencia después de la unión de un ligando. Las metodologías de detección de unión similares utilizan el efecto de resonancia de un plasmón en superficie (SPR) para medir y detectar las interacciones de anticuerpo-antígeno .
Los marcadores de detección tales como colorantes fluorescentes y colorantes quimioluminiscentes (Briggs et al (1997) "Synthesis of Functionalised fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids" , J. Chem. Soc . , Perkin-Trans . 1:1051-1058) proporcionan una señal detectable y generalmente son aplicables para marcar anticuerpos, de preferencia con las siguientes propiedades: (i) el anticuerpo marcado debe producir una señal muy alta con bajo fondo de tal manera que cantidades pequeñas de anticuerpos puedan detectarse sensiblemente en ensayos tanto libres de células como a base de células; y (ii) el anticuerpo marcado debe ser fotoestable de tal forma que la señal fluorescente pueda ser observada, monitoreada y grabada sin fotoblanqueo significativo. Para aplicaciones que incluyan una unión en superficie celular de anticuerpo marcado a membranas o superficies celulares, especialmente células vivas, los marcadores de preferencia (iii) tienen adecuada solubilidad en agua para lograr concentración efectiva de conjugado y sensibilidad de detección y (iv) no son tóxicos para las células vivas de tal forma que no interrumpen los procesos metabólicos normales de las células o causan muerte celular prematura .
La cuantificación directa de la intensidad de fluorescencia celular y la enumeración de eventos marcados fluorescentemente, por ejemplo, la unión en superficie celular de conjugados péptidos-colorante pueden llevarse a cabo en un sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, California) que automatice la mezcla y lectura, ensayos no radioactivos con células vivas o esferas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology" , (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204) . Los usos de los anticuerpos marcados también incluyen ensayos de unión a receptores de superficie celular, ensayos de inmunocaptura, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) , corte con caspasa (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 95:618-23; US 6372907), apoptosis (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidilserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol . Methods 184:39-51) y ensayos de citotoxicidad. La tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico puede usarse para identificar la sobre o sub-regulación por una molécula que sea dirigida a la superficie celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology" , (1999) Anal. Biochem. 271:143-51) .
Los anticuerpos marcados de la invención son útiles como biomarcadores de formación de imágenes y sondas por medio de los diferentes métodos y técnicas de formación de imágenes biomédicas y moleculares tales como: (i) MRI (formación de imágenes por resonancia magnética); (ii) MicroCT (tomografía computarizada) ; (iii) SPECT (tomografía computada por emisión de fotones individuales) ; (iv) PET (tomografía de emisión de positrones) Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminiscencia ; (vi) fluorescencia; y (vii) ultrasonido. La inmunoescintigrafía es un procedimiento de formación de imagen en el cual anticuerpos marcados con sustancias radioactivas son administrados a un paciente animal o humano y se toma una foto de los sitios en el cuerpo en donde se ubica el anticuerpo (US 6528624) . Los biomarcadores de formación de imágenes pueden medirse y evaluarse objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Los biomarcadores pueden ser de varios tipos: Tipo 0 son marcadores de historia natural de una enfermedad y se correlacionan longitudinalmente con índices clínicos conocidos, por ejemplo, evaluación de MRI de inflamación sinovial en artritis reumatoide; marcadores de Tipo 1 capturan el efecto de una intervención de acuerdo con un mecanismo de acción, incluso a pesar de que el mecanismo pudiera no estar asociado con el resultado clínico; los marcadores Tipo 2 funcionan como criterios sustitutos en donde el cambio en, o la señal de, el biomarcador predice un beneficio clínico para "validar" la respuesta seleccionada, tales como la erosión ósea medida en artritis reumatoide mediante CT. Los biomarcadores de formación de imágenes pueden entonces proporcionar información terapéutica farmacodinámica (PD) acerca de: (i) expresión de una proteína objetivo; (ii) unión de un terapéutico a la proteína objetivo, es decir, selectividad y (iii) depuración y datos farmacocinéticos de vida media. Las ventajas de los biomarcadores de formación de imágenes in vivo en relación a los biomarcadores a base de laboratorio incluyen: tratamiento no invasivo, evaluación de cuerpo entero cuantificable , dosificación y evaluación repetitivas, es decir, varios puntos de tiempo, y efectos potencialmente transíeribles de resultados preclínicos (animales pequeños) a clínicos (humanos) . Para algunas aplicaciones, la bioformación de imágenes suplanta o minimiza el número de experimentos en animales en estudios preclínicos.
Los métodos de marcación de péptido se conocen bien. Véase Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds . ) American Elsevier Publishing Co., Nueva York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. . (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, volúmenes I y II, CRC Press, Nueva York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modificaton of Proteins" , Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed. , Walter DeGryter, Berlin y Nueva York; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Ratón, Fia) ; De Leon-Rodríguez et al (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Los péptidos y proteínas marcados con dos porciones, un reportero fluorescente y un inactivador en proximidad suficiente sufren transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . Los grupos reporteros típicamente son colorantes fluorescentes que son excitados por luz a cierta longitud de onda y transfieren energía a un receptor, o extintor, y a un grupo receptor, o extintor, con el desplazamiento de estoques adecuado para emisión a brillo máximo. Los colorantes fluorescentes incluyen moléculas con aromaticidad extendida, tales como fluoresceína y rodamina, y sus derivados. El reportero fluorescente puede ser parcial o significativamente extinto por la porción extintora en un péptido intacto. Después del corte del péptido por una peptidasa o proteasa, un incremento detectable en fluorescencia puede medirse (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes" , Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
Los anticuerpos marcados de la invención también se pueden usar como un agente de purificación por afinidad. En este proceso, el anticuerpo marcado se inmoviliza en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contenga el antígeno que será purificado, y posteriormente el soporte se lava con un solvente adecuado que removerá sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno que será purificado, el cual se une a la variante de polipéptido inmovilizada. Finalmente, el soporte es lavado con otro solvente adecuado, tal como regulador de pH de glicina, pH 5.0, que liberará el antígeno de la variante de polipéptido.
Los reactivos de marcado típicamente portan funcionalidad reactiva que puede reaccionar (i) directamente con un tiol de cisteína de un anticuerpo manipulado con cisteína para formar el anticuerpo marcado (ii) con un reactivo enlazador para formar un intermediario enlazador-marcador o (iii) con un anticuerpo enlazador para formar el anticuerpo marcado. La funcionalidad reactiva de los reactivos de marcado incluye: maleimida, haloacetilo, éster yodoacetamida succinimidílico (por ejemplo, NHS, N-hidroxisuccinimida) , isotiocianato, cloruro de sulfonilo, 2 , 6-diclorotriazinilo, éster pentafluorofenílico y fosforoamidita, aunque otros grupos funcionales también pueden ser usados .
Un grupo funcional reactivo ejemplar es éster N-hidroxisuccinimidílico (NHS) de un sustituyente del grupo carboxilo de un marcador detectable, por ejemplo, biotina o un colorante fluorescente. El éster NHS del marcador puede ser preformado, aislado, purificado y/o caracterizado, o puede formarse in situ y hacerse reaccionar con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. Típicamente, la forma carboxilo del marcador se activa al reaccionar con alguna combinación de un reactivo de carbodiimida, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida o un reactivo de uronio, por ejemplo TSTU (tetrafluoroborato de 0- (N-succinimidil ) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio, HBTU (hexafluorofosfato de (O-benzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio) , o HATU (hexafluorofosfato de (0-(7-azabenzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' ,?' -tetrametiluronio) , un activador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y N-hidroxisuccinimida para dar el éster NHS del marcador. En algunos casos, el marcador y el anticuerpo pueden acoplarse mediante activación in situ del marcador y reacción con el anticuerpo para formar el conjugado marcador de un anticuerpo en una etapa. Otros reactivos de activación y acoplamiento incluyen TBTU (hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazo-l-il) -1-1, 3 , 3 -tetrametiluronio) , TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de ?,?' ,N" ,N" ' -tetrametiluronio) , PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidin-fosfonio) , EEDQ (2-etoxi-l-etoxicarbonil-1 , 2-dihidro-quinolina) , DCC (diciclohexilcarbodiimida) ; DIPCDI (diisopropilcarbodiimida) , MSNT (1- (mesitilen-2-sulfonil) -3 -nitro-lH- 1 , 2 , 4 -triazol y haluros de arilsulfonilo, por ejemplo, cloruro de triisopropilbencensulfonilo .
Compuestos péptido-Fab de unión a albúmina de la invención : En un aspecto, el anticuerpo de la invención se fusiona a una proteína de unión a albúmina. La unión plasma-proteína puede ser un medio efectivo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de moléculas de vida corta. La albúmina es la proteína más abundante en plasma. Los péptidos de unión a albúmina de suero (ABP) pueden alterar la farmacodinámica de proteínas de dominio activo fusionadas, incluyendo la alteración de absorción tisular, penetración y difusión. Estos parámetros farmacodinámicos pueden ser modulados por la selección específica de la secuencia de péptidos de unión a albúmina en suero adecuada (US 20040001827) . Una serie de péptidos de unión a albúmina fueron identificados mediante tamizado por despliegue de fagos (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Los compuestos de la invención incluyen secuencias ABP mostradas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en las tablas III y IV, página 35038; (ii) US 20040001827 en
[0076] SEQ IDNOS: 9-22; y (iii) WO 01/45746 en las páginas 12-13, todos los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia. (ABP) -Fabs de unión a albúmina son manipulados al fusionar un péptido de unión a albúmina al C-terminal de la cadena pesada Fab en relación estequiométrica 1:1 (1 ABP/l Fab) . Se demostró que la asociación de estos ABP-Fabs con albúmina incrementaba la vida media del anticuerpo en más de 25 veces en conejos y ratones. Los residuos Cys efectivos descritos arriba pueden por lo tanto ser introducidos en estos ABP-Fabs y usarse para la conjugación específica de sitio con fármacos citotóxicos seguida por estudios con animales in vivo.
Las secuencias de péptidos de unión a albúmina ejemplares incluyen, pero no están limitadas a las secuencias de aminoácidos listadas en SEQ ID NOS: 52-56: CDKTHTGGGSQRL EDICLPR GCLWEDDF SEQ ID NO: 52 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 53 QRLIEDICLPR GCL EDDF SEQ ID NO: 54 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 55 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 56 Conjugados anticuerpo- fármaco En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados , o conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) , que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico. tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . En otro aspecto, la invención proporciona además métodos para usar los inmunoconjugados . En un aspecto, un inmunoconjugado comprende cualquiera de los anticuerpos anti-TAHO anteriores, tal como anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , unidos covalentemente a un agente citotóxico o a un agente detectable .
En una modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) de la invención, se une al mismo epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , al que se une otro anticuerpo TAHO, tal como v otro anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) . En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención se une al mismo epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , al que se une el fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal SN8 generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood 81(l):84-95 (1993), anticuerpo monoclonal que comprende los dominios variables de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 12 (figura 12) o anticuerpo quimérico que comprende el dominio variable de cualquier anticuerpo generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993) y dominios constantes de IgGl, o los dominios variables de anticuerpo monoclonal que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 11 (figura 2) . En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención se une al mismo epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , al que se une otro anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b (es decir, BD3.1 (BD Biosciences catálogo #555678; San José, CA) , AT105-1 (AbD Serotec catálogo #MCA2208; Raleigh, NC) , AT107-2 (AbD Serotec catálogo #MCA2209) , CD79b anti-humano (TAH05) (BD Biosciences Catálogo #557592; San José, CA) ) .
En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAHO5 ) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención se une a un epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , distinto de un epítope al que se une otro anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) . En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) de la invención se une a un epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , distinto de un epítope al que se une el fragmento Fab de anticuerpo monoclonal SN8 generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993), anticuerpo monoclonal que comprende los dominios variables de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 12 (figura 12) , o anticuerpo quimérico que comprende el dominio variable de cualquier anticuerpo generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993) y dominios constantes de IgGl, o los dominios variables de anticuerpo monoclonal que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 12 (figura 12) . En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención se une al mismo epítope en un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , al que se une otro anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b (es decir, CB3.1 (BD Biosciences catálogo #555678; San José, CA) , AT105-1 (AbD Serotec catálogo #MCA2208; Raleigh, NC) , AT107-2 (AbD Serotec catálogo #MCA2209) , anti-CD79b humano (BD Biosciences catálogo #557592; San José, CA) ) .
En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención es distinto de (es decir, no es) un fragmento Fab de, el anticuerpo monoclonal generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993), el anticuerpo monoclonal que comprende los dominios variables de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 12 (figura 12) , o el anticuerpo quimérico que comprende dominio variable de anticuerpo generado a partir de hibridomas obtenido de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993) y dominios constantes de IgGl, o los dominios variables de anticuerpo monoclonal que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 10 (figura 10) y SEQ ID NO: 12 (figura 12) . En otra modalidad, un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) de la invención es distinto de (es decir, no es) , un fragmento Fab de otro anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b ( (es decir, BD3.1 (BD Biosciences catálogo #555678; San José, CA) , AT105-1 (AbD Serotec catálogo #MCA 2208; Raleigh, NC) , AT107-2 (AbD Serotec catálogo #MCA2209) , anticuerpo anti-CD79b humano (BD Biosciences catálogo #557592; San José, CA) ) .
En una modalidad, un anticuerpo de la invención se une específicamente a CD79b de una primera especie animal, y no se une específicamente a CD79b de una segunda especie animal. En una modalidad, la primera especie animal es humano y/o primate (por ejemplo, mono macaco) , y la segunda especie animal es murino (por ejemplo, ratón) y/o canino. En una modalidad, la primera especie animal es humano. En una modalidad, la primera especie animal es primate, por ejemplo macaco. En una modalidad, la segunda especie animal es murino, por ejemplo ratón. En una modalidad, la segunda especie animal es canino.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica para cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente arriba, incluyendo anticuerpos manipulados con cisteína. Células hospederas que comprenden cualquiera de estos vectores también son proporcionados. A manera de ejemplo, las células hospederas pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente se proporciona además y comprende cultivar células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo de células.
En otra modalidad, la invención proporciona oligopéptidos ("oligopéptidos de unión a TAHO", tales como "oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano" u "oligopéptidos de unión a CD79b (TAHO40) de macaco") los cuales se unen, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) . Opcionalmente, los oligopéptidos de unión a TAHO, tales como oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, de la presente invención pueden conjugarse a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide, derivado de dolostatina o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similar. Los oligopéptidos de unión a TAHO, tales como oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAH040) de macaco, de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas y de preferencia inducir la muerte de una célula a la cual se unan. Para propósitos de detección, los oligopéptidos de unión a THO, tales como oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco de la presente invención pueden ser marcados detectablemente , unidos a un soporte sólido o similar.
En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica para cualquiera de los oligopéptidos de unión a TAHO descritos en la presente, tales como oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco. Se proporcionan también células hospederas que comprenden cualquiera de estos vectores. A manera de ejemplo, las células hospederas pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los oligopéptidos de unión a THO descritos en la presente, tales como oligopéptidos de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, y comprende cultivar células hospederas bajo condiciones adecuadas para la expresión del oligopéptido deseado y recuperar el oligopéptido deseado del cultivo de células.
En otra modalidad, la invención proporciona moléculas orgánicas pequeñas ("moléculas orgánicas de unión a TAHO", tales como "moléculas orgánicas de unión a CD79b humano (TAH05 ) " o "moléculas orgánicas de unión a CD79b de macaco (TAHO40)") las cuales se unen, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como polipéptidos CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) . Opcionalmente , las moléculas orgánicas de unión a TAHO, tales como moléculas orgánicas de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAH040) de la presente invención pueden conjugarse a cualquier agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide , derivado de dolastatina o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o similares. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO, tales como moléculas orgánicas de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) de la presente invención, de preferencia induce la muerte de una célula a la cual se unen. Para propósitos de detección, las moléculas orgánicas de unión a TAHO, tales como moléculas orgánicas de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , de la presente invención pueden marcarse detectablemente , fijarse a un soporte sólido o similar.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido TAHO, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, un polipéptido AHO quimérico, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) quimérico, como el descrito en la presente, un anticuerpo anti-TAHO como el descrito en la presente, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , un oligopéptido de unión a TAHO, tal como oligopéptido de unión a CD79b (TAHO5) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, como el descrito en la presente o una molécula orgánica de unión a TAHO, tal como molécula orgánica de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , como la descrita en la presente, en combinación con un portador. Opcionalmente , el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad más, la invención se refiere a un artículo de manufactura que comprende un recipiente y una composición de materia contenida dentro del recipiente, en donde la composición de materia puede comprender un polipéptido TAHO tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, un polipéptido TAHO quimérico, tal como polipéptido CD79b humano (TAHO5) y/o CD79b de macaco (TAHO40) quimérico, como el descrito en la presente, un anticuerpo anti-TAHO como el descrito en la presente, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , un oligopéptido de unión a THO, tal como oligopéptido de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, como el descrito en la presente, o una molécula orgánica de unión a TAHO, tal como una molécula orgánica de unión a TAHO como la descrita en la presente. El artículo puede opcionalmente comprender además un marcador fijado al recipiente, o un inserto de envase incluido dentro del recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico.
En un aspecto, la invención proporciona un kit que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos TAHO, tal como un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención; y un segundo recipiente que comprende un regulador de pH. En una modalidad, el regulador de pH es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una composición que comprende un anticuerpo antagonista comprende además un portador, el cual en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el kit comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto.
Otra modalidad de la presente invención está dirigida al uso de un polipéptido TAHO, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , como el descrito en la presente, un polipéptido TAHO quimérico, tal como polipéptido CD79b humano (TAHO5 ) y/o CD79b de macaco (TAHO40) quimérico, como el descrito en la presente, un anticuerpo polipéptido anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, un oligopéptido de unión a TAHO, tal como oligopéptido de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, como el descrito en la presente o una molécula orgánica de unión a THO, tal como molécula orgánica de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAH040) , como la descrita en la presente, en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una afección que responda al polipéptido THO, tal como polipéptido CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, un polipéptido TAHO quimérico, tal como polipéptido CD79b humano (TAHO5 ) y/o CD79b de macaco (TAHO40) quimérico, como el descrito en la presente, un anticuerpo polipéptido anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, un oligopéptido de unión a TAHO, tal como oligopéptido de unión a CD79b (TAH05) humano o CD79b (TAHO40) de macaco, como el descrito en la presente o una molécula orgánica de unión a THO, tal como molécula orgánica de unión a CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , como la descrita en la presente En un aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión en la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de una célula hospedera de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un kit de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular. En una modalidad, el cáncer, tumor y/o trastorno de proliferación celular se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto .
En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos de TAHO descritos arriba o abajo, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo de la invención de esta manera causando una inhibición del crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tenga un tumor canceroso que comprenda una célula que exprese cualquiera de los polipéptidos de TAHO descritos arriba o abajo, tal como CD79b humano (TAHO5 ) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, de esta manera tratando en forma efectiva el mamífero. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular asociado con una expresión incrementada de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende administrar a un sujeto en necesidad de este tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención, de esta manera tratando o previniendo en forma efectiva el trastorno de proliferación celular. En una modalidad, el trastorno de proliferación celular es cáncer. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de la célula es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador de crecimiento de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, de esta manera inhibiendo el crecimiento de la célula. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es al menos en parte dependiente de un efecto potenciador de crecimiento de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, tratando de esta manera en forma efectiva el tumor. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
Un método para tratar cáncer que comprende administrar a un paciente la formulación farmacéutica que comprende un inmunoconjugado descrito en la presente, diluyente, portador o excipiente aceptable. En una modalidad, el cáncer se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto. En una modalidad, al paciente se le administra un agente citotóxico en combinación con el compuesto conjugado a anticuerpo-fármaco .
Un método para inhibir proliferación de células B que comprende exponer una célula a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención bajo condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado a un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) . En una modalidad, la proliferación de células B se selecciona de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto. En una modalidad, la célula B es un xenoinjerto. En una modalidad, la exposición tiene lugar in vitro. En una modalidad, la exposición tiene lugar in vivo.
Un método para determinar la presencia de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en una muestra que se sospeche contenga cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo de la invención, y determinar la unión del anticuerpo a cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en la muestra en donde la unión del anticuerpo a cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , en la muestra es indicadora de la presencia de la proteína en la muestra. En una modalidad, la muestra es una muestra biológica. En una modalidad más, la muestra biológica comprende células B. En una modalidad, la muestra biológica es de un mamífero que experimenta o se sospeche experimenta un trastorno de células B y/o un trastorno proliferativo celular B incluyendo, pero no limitado a, linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
En un aspecto, se proporciona un método para diagnosticar un trastorno de proliferación celular asociado con un incremento en células, tales como células B, que expresan cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende poner en contacto una célula de prueba en una muestra biológica con cualquiera de los anticuerpos anteriores; determinar el nivel de anticuerpo unido a células de prueba en la muestra al detectar la unión del anticuerpo a un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , y comparar el nivel del anticuerpo unido a células en una muestra de control, en donde el nivel de anticuerpo unido se normaliza al número de células que expresan TAHO, tales como células que expresan CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , en las muestras de prueba y control, y en donde un nivel más alto de anticuerpo unido en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control indica la presencia de un trastorno de proliferación celular asociado con células que expresan cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) .
En un aspecto, se proporciona un método para detectar solubilidad en cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) , en sangre o suero el método comprende poner en contacto una muestra de prueba de sangre o suero de un mamífero que se sospeche experimente un trastorno de proliferación de células B con un anticuerpo anti-TAHO, incluyendo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención y detectar un incremento en solubilidad de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en la muestra de prueba en relación a una muestra de control de sangre o suero de un mamífero normal . En una modalidad, el método para detectar es útil como un método para diagnosticar un trastorno proliferativo celular B asociado con un incremento en soluble cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , en sangre o suero de un mamífero.
Un método para inhibir un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica de la invención a una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo de la invención. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente citotóxico. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
Los métodos de la invención pueden usar para afectar cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la expresión de cualquiera de los polipéptidos TAHO descritos arriba o abajo, tales como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAH040) . En una modalidad, una célula que es seleccionada en un método de la invención es una célula hematopoyética . Por ejemplo, una célula hematopoyética puede ser una selecciona del grupo que consiste en un linfocito, leucocito, plaqueta, eritrocito y célula asesina natural. En una modalidad, una célula que se selecciona en un método de la invención es una célula B o célula T. En una modalidad, una célula que se selecciona en un método de la invención es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser una seleccionada del grupo que consiste en una célula de linfoma, célula de leucemia o célula de mieloma.
Los métodos de la invención pueden comprender además etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un método comprende además una etapa en la que una célula y/o tejido seleccionado (por ejemplo, una célula cancerosa) se expone a tratamiento de radiación por un agente quimioterapéutico .
Como se describe en la presente, CD79b es un componente de señalización del receptor de células B. En consecuencia, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula que es seleccionada (por ejemplo, una célula cancerosa) es una en la cual un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , es expresado en comparación con una célula que no expresa un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) . En una modalidad más, la célula seleccionada es una célula cancerosa en la cual una expresión de un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) , es incrementada en comparación con una célula no cancerosa normal del mismo tipo de tejido. En una modalidad, un método de la invención causa la muerte de una célula seleccionada .
Otra modalidad de la presente invención está dirigida al uso de un anticuerpo polipéptido anti-TAHO, incluyendo anticuerpo anti-CD79b humano (TAHO5) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , como el descrito en la presente, en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una afección que responda al anticuerpo polipéptido anti-TAHO, incluyendo anticuerpo anti-CD79b humano (TAHO5) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) .
Otro aspecto de la invención proporciona un método para usar un anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) o un anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) manipulado con cisteína, o un ADC que comprende un anticuerpo anti-CD79b de macaco o un anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) manipulado con cisteína, como el descrito en la presente, para probar la seguridad de tratar terapéuticamente un mamífero que tenga un tumor canceroso en donde el tratamiento comprende la administración de un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o un anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) tratado con cisteína o un ADC como el descrito en la presente .
Otro aspecto de la invención es una composición que comprende una mezcla de compuestos anticuerpo-fármaco de la fórmula I en donde la carga de fármaco promedio por anticuerpo es de aproximadamente 2 a alrededor de 5, o aproximadamente 3 a alrededor de 4.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que incluye un compuesto ADC de la fórmula 1, una mezcla de compuestos ADC de la fórmula 1 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto proporciona una combinación farmacéutica que comprende un compuesto ADC de la fórmula I y un segundo compuesto que tiene propiedades anticáncer u otros efectos terapéuticos .
Otro aspecto es un método para matar o inhibir la proliferación de células tumorales o células cancerosas, que comprende tratar las células con una cantidad de un conjugado anticuerpo- fármaco de la fórmula 1, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, la cual es efectiva para matar o inhibir la proliferación de las células tumorales o células cancerosas.
Otro aspecto son métodos para tratar cáncer que omprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que incluye un AADC de la fórmula 1.
Otro aspecto incluye artículos de manufactura, es decir, kits, que comprenden un conjugado anticuerpo-fármaco, un recipiente y un inserto de envase o etiqueta que indica un tratamiento .
Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) de un ADNc de TAH04 (PR036248) , en donde SEQ ID NO:l es un clon designado en la presente como "DNA225785" (también referido aquí como "CD79a humano"). La secuencia de nucleótidos codifica para CD79a humano con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayados.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 7 mostrado en la figura 1.
La figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:3) de un ADNc de TA-H05 (PR036249) , en donde SEQ ID NO : 3 es un clon designado aquí como "DNA225786" (también referido aquí como "CD79b humano"). La secuencia de nucleótidos codifica para CD79b humano con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayado.
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 3 mostrada en la figura 3.
La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID N0:5) de un ADNc de TAH039 (PR0283626) , en donde SEQ ID N0:5 es un clon designado en la presente como "DNA548454" (también referido en la presente como "cyno CD79a" o "cyno CD79a") . La secuencia de nucleótidos que codifica para CD79a de macaco con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayados .
La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 6 mostrada en la figura 5.
La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:7) de un ADNc de TAHO40 (PR0283627) , en donde SEQ ID NO:7 es un clon designado como "DNA548455" (también referido en la presente como "cyno CD79b" o "cyno CD79b"). La secuencia de nucleótidos codifica para CD79b de macaco con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayado.
La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO : 7 mostrada en la figura 7.
La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) de la cadena ligera de IgGl de SN8 quimérico (anticuerpo anti-CD79b * humano (TAH05) (chSN8) ) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena ligera de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (chSN8) con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayados.
La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:10), que carece de la primera secuencia de señal de 18 aminoácidos, derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 9 mostrada en la figura 9. Las regiones variables son regiones no subrayadas .
La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) de la cadena pesada de IgGl SN8 quimérico (anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (chSN8) ) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (chSN8) con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayados .
La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:12), que le falta la secuencia de señal de 18 aminoácidos y la última lisina (K) antes del codón de paro, derivada de la secuencia de codificación SEQ ID NO: 11 mostrada en la figura 11. Las regiones variables son regiones no subrayadas.
La figura 13 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de CD79b humano (SEQ ID NO: 4) , macaco (cyno) (SEQ ID N0:8) y ratón (SEQ ID NO: 13). CD79b humano y cyno tienen 85% de identidad de aminoácidos. La secuencia de señal, péptido de prueba (el péptido de 11 aminoácidos descrito en el ejemplo 9) , dominio de transmembrana (TM) y dominio de motivo de activación a base de torisina inmunorreceptora (ITAM) son indicadas. La región en un cuadro es la región de CD79b que está ausente en la variante de empalme de CD79b (descrita en el ejemplo 9) .
Las figuras 14A-14D muestran datos de microdisposición que muestran la expresión de TAH04 en muestras normales y en muestras enfermas, tal como la expresión significativa en muestras de NHL y muestras de mieloma múltiple (MM) , y cerebelo normal y sangre normal . Las abreviaturas usadas en las figuras se designan como sigue: linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma folicular (FL) , nodulos linfáticos normales (NLN) , células B normales (NB) , células de mieloma múltiple (MM) , intestino delgado (intestino d.), hígado fetal (hígado f.), músculo liso (músculo 1.), cerebro fetal (cerebro f.), células asesinas naturales (NK) , neutrófilos (N'phil) , dendrocitos (DC) , células B de memoria (mem B) , células de plasma (PC) , células de plasma de médula ósea (BM PC) .
Las figuras 15A-15D muestran datos de microdisposición que muestra la expresión de TAH05 en muestras normales y en muestras enfermas, tales como la expresión significativa en muestras de NHL. Las abreviaturas usadas en las figuras se designan como sigue: linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma folicular (FL) , nodos 1infáticos normales (NLN) , células B normales (NB) , células de mieloma múltiple (M ) , intestino delgado (intestino d.), hígado fetal (hígado f.), músculo liso (músculo 1.), cerebro fetal (cerebro f.), células asesinas naturales (NK) , neutrófilos (N'phil) , dendrocitos (DC) , células B de memoria (mem B) , células de plasma (PC) , células de plasma de médula ósea (BM PC) .
La figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 32) de la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (ch2F2) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena ligera del anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (ch2F2) mostrado en la figura 17.
La figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:33), derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 32 mostrada en la figura 16. Las regiones variables son regiones no subrayadas .
La figura 18 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 34) de la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (ch2F2) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (2F2) mostrada en la figura 19.
La figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID N0:35), sin la última lisina (K) antes del codón de paro derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 34 mostrada en la figura 18. Las regiones variables son regiones no subrayadas .
La figura 20 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 40) de la cadena ligera de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena ligera de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) con los codones de inicio en paro mostrados en negritas y subrayados .
La figura 21 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:41), sin la primera secuencia de señal de 18 aminoácidos, derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 40 mostrada en la figura 20. Las regiones variables son regiones no subrayadas .
La figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 42) de la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAH040) (chlODlO) . La secuencia de nucleótidos codifica para la cadena pesada de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) con los codones de inicio y paro mostrados en negritas y subrayados .
La figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 43), sin la primera secuencia de señal de 18 aminoácidos y la última lisina (K) antes del codón de paro, derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 42 mostrada en la figura 22. Las regiones variables son regiones no subrayadas.
Las figuras 24A-24B muestran la secuencia del plásmido pDRl (SEQ ID NO: 8; 5391 pb) para la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina como se describe en el ejemplo 9. pDRl contiene secuencias que codifican para un anticuerpo irrelevante, la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby et al., J". Exp. Med. , 175:217-225 (1992)), los codones de inicio y paro para los cuales son indicados en negritas y subrayado.¦ Las figuras 25A-25C muestran la secuencia del plásmido pDR2 (SEQ ID NO: 49; 6135 pb) para la expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulina como se describe en el ejemplo 9. pDR2 contiene secuencias que codifican para un anticuerpo irrelevante, la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby et al., citado arriba), los codones de inicio y paro para los cuales se indican en negritas y subrayado .
Las figuras 26A-26B muestran la secuencia del plásmido pRK. LPG3. HumanKapa (SEQ IDNO:50) para la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina como se describe en el ejemplo 9 (Shields et al., J Biol Chem, 276: 6591-6604 (2000)).
Las figuras 27A-27B muestran la secuencia del plásmido pRK.LPG4.HumanHC (SEQ ID NO: 51) para expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulina como se describe en el ejemplo 9 (Shields et al, J. Biol Chem, 276 : 6591-6604 (2000)).
La figura 28 muestra ilustraciones de conjugados de anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína-fármaco (ADC) en donde una porción de fármaco está unida a un grupo de cisteína manipulado en: la cadena ligera (LC-ADC) ; la cadena pesada (HC-ADC) ; y la región Fe (Fc-ADC) .
La figura 29 muestra las etapas de: (i) reducir aductos de disulfuro y cisteína y disulfuros intercadena e intracadena en un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína (ThioMab) con agente reductor TCEP (clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina) ; (ii) oxidación parcial, es decir, reoxidación para reformar disulfuros intercadena e intracadena con dhAA (ácido deshidroascórbico) y (iii) conjugación del anticuerpo reoxidado con un intermediario fármaco-enlazador para formar un conjugado anti-TAHO de cisteína- fármaco (ADC) .
Las figuras 30A-30B muestran (Fig. 30A) la secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 58) y (Fig. 30B) la secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 57) de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) manipulado con cisteína (thio-chSN8-LC-V205C) , una valina en la posición de Kabat 205 (posición secuencial Valina 208) de la cadena ligera fue alterada por una cisteína. Una porción de fármaco puede ser fijada a un grupo de cisteína manipulado en la cadena ligera. En cada figura, el aminoácido alterado se muestra en texto en negritas con doble subrayado. Subrayado individual indica regiones constantes. Las regiones variables son regiones no subrayadas. La región Fe se marca con cursivas. "Thio" se refiere a un anticuerpo manipulado con cisteína.
Las figuras 31A-31B muestran (Fig. 31A) la secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 60) y (Fig. 31B) la secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 59) de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) manipulado con cisteína (thio-chSN8-HC-A118C) , en el cual una alanina en la posición EU 118 (posición secuencial a alanina 118; posición Kabat 114) de la cadena pesada fue alterada por cisteína. Una porción de fármaco puede ser fijada al grupo cisteína manipulada en la cadena pesada. En cada figura, el aminoácido alterado se muestra en texto en negritas con doble subrayado. Subrayado individual indica regiones constantes. Las regiones variables son regiones no subrayadas. La región Fe es marcada con cursivas. "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína.
Las figuras 32A-32B son gráficas FACS que indican que la unión de conjugados CD79b anti-humano (TAH05) thioMAb-fármaco (TDCs) de la invención se unen a CD79b humano (TAH05) expresado sobre la superficie de células de BJAB-luciferasa es similar para variantes (Fig. 32A) LC (V205C) tioMAb conjugadas y variantes (Fig. 32B) HC (A118C) tioMAb de chSN8 con MMAF. La detección fue con MS anti-humano IgG-PE. "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado por cisteína.
Las figuras 33A-33D son gráficas FACS que indican que la unión de conjugado de anti-CD79b de macaco (TAH040) thioMAb-fármaco (TDCs) de la invención se unen a CD79b expresados sobre la superficie de células BJAB que expresan CD79b de macaco (TAH040) es similar para (fig. 33A) variantes HC(A118C) thioMAb desnudas (no conjugadas) de anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) y variantes HC(A118C) thioMAb conjugadas de anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) con los diferentes conjugados de fármaco mostrados (Fig. 33B) MMAE, (Fig. 33C) DM1 y (Fig. 34D) MMAF) ) . La detección fue con MS anti-huIgG-PE . "Thio" se refiere a un anticuerpo manipulado con cisteína.
La figura 34A muestra una gráfica de la inhibición del crecimiento de tumor in vivo en modelo de xenoinjerto Granta-519 (Linfoma de Células de Manto Humano) el cual muestra que la administración de CD79b (TAH05) TDCs anti-humanos variados en posición de la (LC (V205C) o HC (A118C) de cisteína manipulada) y/o diferentes dosis de fármaco a ratones SCID que tienen tumores de células B humanos inhibió significativamente el crecimiento de tumor. Los modelos de xenoinjerto tratados con thiochSN8-HC (A118C) -MC-MMAF, carga de fármaco fue de aproximadamente 1.9 (tabla 21) o thiochSN8-LC (V205C) -MC-MMAF, la carga de fármaco fue de aproximadamente 1.8 (tabla 21) mostraron una inhibición significativa de crecimiento de tumor durante el estudio. Los controles incluyeron hu-anti -HER2 -MC-MMAF y thiohu-anti-HER-HC (A118C) -MC-MMAF y chSN8 -MC-MMAF . La figura 34B es una gráfica de cambio en porcentaje en peso en los ratones del estudio de xenoinjerto Granta-519 (figura 33A y tabla 21) que muestra que no hubo cambio significativo en peso durante los primeros 14 días del estudio. "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína mientras que "hu" se refiere a anticuerpo humanizado.
La figura 35A muestra la secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 62) y la figura 35B muestra una secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 61) de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) manipulado con cisteína (Thio-anti -CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) -HC-A118C) , en el cual una posición alanina EU 118 (alanina de posición secuencial 118; posición Kabat 114) de la cadena pesada fue alterada a una cisteína. El aminoácido D en la posición EU 6 (sombreada en la figura) de la cadena pesada puede como alternativa ser E. Una porción de fármaco puede ser fijada al grupo cisteína manipulado en la cadena pesada. En cada figura, el aminoácido alterado se muestra en texto en negritas con subrayado doble. El subrayado individual indica regiones constantes. Las regiones variables son regiones no subrayadas. La región Fe es marcada en cursivas. "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína .
La figura 36A muestra la secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 96) y la fig. 36B muestra la secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 95) de anticuerpo anti-CD79b de macaco (TAHO40) manipulado con cisteína (Thio-anti -CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) -LC-V205C) , en el cual una valina en la posición Kabat 205 (posición secuencial Valina 208) de la cadena ligera fue alterada a una cisteína. El aminoácido D en la posición EU 6 (sombreada en la figura de la cadena pesada puede como alternativa ser E. Una porción de fármaco puede ser fijada al grupo cisteína manipulado en la cadena pesada. En cada figura, el aminoácido alterado se muestra en texto en negritas con subrayado doble. El subrayado individual indica regiones constantes. Las regiones variables son regiones no subrayadas. La región Fe se marca por cursivas. "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína.
La figura 37 es una gráfica de la inhibición del crecimiento de tumor in vivo en un modelo de xenoinjerto BJAB-CD79b de macaco (células BJAB que expresan CD79b de macaco (TAHO40)) (linfoma de Burkitt) el cual muestra la administración de conjugados anti-CD79b de macaco (TAHO40) TDCs con diferentes porciones enlazadoras de fármaco (BMPEO-DM1, MC-MMAF o MCvcPAB-MMAE) a ratones SCID que tienen tumores de células B humanas, inhibió significativamente crecimiento de tumor. Modelos de xenoinjertos tratados con thio anti-CD79b de macaco (TAH040) (chlODlO) -HC (A118C) -BMPEO-DM1, carga de fármaco fue aproximadamente 1.8 (tabla 22), thio anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) -MC-MMAF, la carga de fármaco fue aproximadamente 1.9 (tabla 22) o thio anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO ) -HC (A118C) - MCvcPAB-MMAE, la carga de fármaco fue aproximadamente 1.86 (tabla 22) , mostraron inhibición significativa de crecimiento de tumor durante el estudio. Los controles incluyeron los controles anti-HER2 (thio hu-anti-HER2 -HC (A118C) -BMPE0-DM1 , thio hu-anti-HER2-HC (A118C) -MCvcPAB-MMAE, tío hu-anti-HER2-HC (A118C) -MC-MMAF) . "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína mientras que "hu" se refiere a anticuerpo humanizado .
La figura 38 es una gráfica de la inhibición del crecimiento de tumor in vivo en modelo de xenoinjerto BJAB-CD79b de macaco (células BJAB que expresan CD79b de macaco (TAHO40)) (linfoma de Burkitt) que muestra que la administración de anti-CD79b de macaco (TAHO40) TDCs con la porción de fármaco enlazador B PEO-DM1 administrada a diferentes dosis como se muestra, a ratones SCID que tienen tumores de células B humanos, inhibió significativamente el crecimiento de tumor. Los modelos de xenoinjerto tratados con thio anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) -BMPEO-DM1, la carga de fármaco fue aproximadamente 1.8 (tabla 23), mostraron inhibición significativa de crecimiento de tumor durante el estudio. Los controles incluyeron controles anti-HER2 (thio hu-anti -HER2 -HC (A118C) -BMPEO-DM1) y anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO) controles (thio anti-CD79b de macaco (TAHO40) (chlODlO ) -HC (A118C) ) . "Thio" se refiere a anticuerpo manipulado con cisteína mientras que "hu" se refiere a un anticuerpo humanizado.
Descripción detallada de la invención I . Definiciones Los términos "polipéptido TAHO" y "TAHO" según se usan en la presente y cuando son seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polipéptidos , en donde la designación completa (es decir, TAHO/número) se refiere a secuencias de polipéptidos específicas como las descritas en la presente. Los términos "TAHO/polipéptido número" y "TAHO/número" en donde el término "número" es provisto como una designación numérica real según se usa en la presente abarcan polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptido y fragmentos de polipéptidos de secuencia nativa y variantes de polipéptido (los cuales se definen más en la presente) . Los polipéptidos TAHO descritos en la presente pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAHO" se refiere a cada polipéptido TAHO/número individual descrito en la presente. Todas las descripciones en esta descripción que se refieran al "polipéptido TAHO" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente así como conjuntamente. Por ejemplo, las descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos para o contra, formación de oligopéptidos de unión a TAHO para o contra, formación de moléculas orgánicas de unión a TAHO para o contra, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., se refieren a cada polipéptido de la invención individualmente.
"TAH04" también se refiere en la presente como "CD79a humano" . "TAH05" se refiere también en la presente como "CD79b humano". "TAH039" también se refiere en la presente como "cyno CD79a" o "CD79a de macaco". "TAHO40" también se refiere en la presente como "cyno CD79b" o "CD79b de macaco" . "Macaco" también se refiere en la presente como "cyno" .
El término "CD79b" , según se usa en la presente, se refiere a cualquier CD79b nativo de cualquier fuente vertebrada, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos, mono macaco (cyno)) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique lo contrario. CD79b humano también se refiere en la presente como "PR036249" (SEQ ID NO: 2) o "TAHO5" y se codifica por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) conocida también en la presente como "DNA225786" . CD79b de macaco también se refiere en la presente como "cyno CD79b" o "PR0283627" (SEQ ID NO: 239) o "TAHO40" y es codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 238) también referida en la presente como "DNA548455" . El término "CD79b" abarca CD79b no procesado de "longitud completa" así como cualquier forma de CD79b que resulte de procesamiento de la célula. El término abarca también variantes de origen natural de CD79b, por ejemplo, variantes de empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos CD79b descritos en la presente pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. Un "polipéptido TAHO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido TAHO correspondiente derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos TAHO de secuencia nativa pueden ser aislados de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAHO de secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido TAHO específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes que ocurren naturalmente (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos TAHO de secuencia nativa descritos en la presente son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa mostradas en las figuras acompañantes. Los codones de inicio y paro (si se indican) se muestran en negritas y subrayados en las figuras. Los residuos de ácido nucleico indicados como "N" en las figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, aunque los polipéptidos TAHO descritos en las figuras acompañantes se muestran como empezando con residuos de metionina designados en la presente como posición de aminoácido 1 en las figuras, es concebible y posible que otros residuos de metionina ubicados ya sea hacia el extremo 5' o extremo 3' de la posición de aminoácido 1 y las figuras pueden emplearse como el residuo de aminoácido de inicio para los polipéptidos TAHO.
Un "marcador de superficie de células B" o "antígeno de superficie de células B" en la presente es un antígeno expresado sobre la superficie de una célula B que puede ser seleccionado con un antagonista que se una al mismo, incluyendo pero no limitado a, anticuerpos para un antígeno de superficie de células B o una forma soluble de un antígeno de superficie de células B capaz de antagonizar la unión de un ligando al antígeno de células B que ocurran naturalmente. Los marcadores de superficie de células B ejemplares incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74 , CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para descripciones, véase The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a edición. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nueva York) .
Otros marcadores de superficie de células B incluyen RP105, FcRH2 , células B CR2 , CCR6 , P2X5, HAL-DOB, CXCR5, FCER2 , BR3 , BAFF, BLyS , Btig, NAG14 , SLGC16270, FcRHl, IRTA2 , AT D578, FcRH3 , IRTA1 , FcRH6 , BCMA y 239287. El marcador de superficie de células B de interés particular se expresa de preferencia en células B en comparación con otros tejidos que no son de células B de un mamífero y pueden expresarse tanto sobre células B precursoras como células B maduras .
El "dominio extracelular" de polipéptido TAHO o "ECD" se refiere a una forma del polipéptido TAHO que está esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico . Ordinariamente, un polipéptido TAHO ECD tendrá menos de 1% de estos dominios de transmembrana y/o citoplásmicos y de preferencia, tendrá menos de 0.5% de estos dominios. Se entenderá que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos TAHO de la presente invención se identifica conforme a los criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio de transmembrana puede variar pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio como se identifica inicialmente en la presente. Por lo tanto, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO puede contener de alrededor de 5 o menos aminoácidos sobre cada lado del límite del dominio de transmembrana/dominio extracelular como se identifica en los ejemplos o descripción y estos polipéptidos , con o sin el pépt do de señal asociado, y ácidos nucleicos que los codifican, se contemplan por la presente invención.
La ubicación aproximada de los "péptidos de señal" de los diferentes polipéptidos TAHO descritos en la presente pueden mostrarse en la presente descripción y/o en las figuras acompañantes. Sin embargo, se indica que en el límite C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos sobre cada lado del límite C-terminal del péptido de señal como se identificó inicialmente en la presente, en donde el límite C-terminal del péptido de señal puede identificarse conforme a criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de elemento de secuencia de aminoácido (por ejemplo Nielsen et al., Prot . Eng . 10:16 (1997) y von Heinje et al., Nucí. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además, se reconoce también que, en algunos casos, el corte de una secuencia de señal a partir de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, dando como resultado más de una especie secretadas. Estos polipéptidos maduros, cuando el péptido de señal es cortado dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido de señal como se identifica en la presente, y los polinucleótidos que los codifican, son contemplados por la presente invención.
"Variante de polipéptido TAHO" significa un polipéptido TAHO, de preferencia un polipéptido TAHO activo, como el definido en la presente, que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de polipéptido TAHO que carece del péptido de señal como la descrita en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAHO de longitud completa como la descrita en la presente (tales como aquellas codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAHO de longitud completa) . Estas variantes de polipépt9ido TAHO incluyen, por ejemplo, polipéptidos TAHO en los que uno o más residuos de aminoácido son añadidos, o suprimidos, en el N-terminal o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Comúnmente, una variante de polipéptido TAHO tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa por lo menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia de polipéptido TAHO de secuencia nativa de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de polipéptido TAHO que carezca del péptido de señal como la descrita en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente y cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de polipéptidos TAHO de longitud completa como la descrita en la presente. Normalmente, los polipéptidos de variante TAHO tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de largo, como alternativa por lo menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de largo, o más. Opcionalmente, los polipéptidos de variante TAHO tendrán no más de una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con la secuencia de polipéptidos TAHO nativa, como alternativa no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 sustituciones de aminoácido conservadoras, en comparación con la secuencia del polipéptido TAHO nativo.
"Identidad de secuencia de aminoácido porcentual (%)" con respecto a las secuencias de polipéptidos TAHO identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptidos TAHO específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentual máxima, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para los propósitos de determinar la identidad de secuencia de aminoácidos porcentual puede lograrse de varias manera que están dentro de la capacidad en la técnica, por ejemplo, usando software de computadora disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTA ) . Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo que se requiera para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. Para los propósitos de la presente, sin embargo, los valores de identidad de secuencia de aminoácidos porcentual se generan usando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código de origen completo del programa LIGN-2 es provisto en la tabla 1 abajo. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, INc . , y el código de origen mostrado en la tabla 1 abajo ha sido presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de E.U.A., Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el No. de registro de derechos de autor en E.U.A. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir del código de origen proporcionado en la tabla 1 abajo. El programa ALIGN-2 debe compilarse para usarse en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, la identidad de secuencia de aminoácidos porcentual de una secuencia de aminoácidos dada a con, por ejemplo, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (la cual puede ser mencionada alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada a que tiene o comprende cierta identidad de secuencia de aminoácidos porcentual con, o contra cierta secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido clasificado como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación de programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A y B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando este método, las tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de Comparación" con la secuencia de aminoácidos designada TAHO, en donde "TAHO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TAHO hipotético de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el cual el polipéptido "TAHO" de interés está siendo comparado y "X" , "Y" y "Z" representan cada uno residuos de aminoácido hipotéticos diferentes. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior, usando el programa de computadora ALIGN-2.
"Polinucleótido de variante TAHO" o "secuencia de ácido nucleico de variante de TAHO" significa una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido TAHO, de preferencia un polipéptido TAHO activo, como el definido en la presente y la cual tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa que carece del péptido de señal como la descrita en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO, con o sin el péptido de señal, como el descrito en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptidos TAHO de longitud completa como la descrita en la presente (tales como aquellas codificadas por un ácido nucleico que representa sólo una porción de la secuencia de codificación completa de un polipéptido TAHO de longitud completa) . Normalmente, un polinucleótido variante TAHO tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, como alternativa al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa como la descrita en la presente, una secuencia de polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa que carezca del péptido de señal como la descrita en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAHO, con o sin la secuencia de señal, como el descrito en la presente o cualquier fragmento de una secuencia de polipéptidos TAHO de longitud completa como la descrita en la presente. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa.
Normalmente, los polinucleótidos variantes TAHO tienen aproximadamente 5 nucleótidos de largo, como alternativa al menos aproximadamente 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 :, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 1 30, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ó 1000 nucleótidos de largo, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos referenciada más o menos 10% de esa longitud referenciada .
"Identidad de secuencia de ácido nucleico porcentual (%)" con respecto a secuencias de ácido nucleico de codificación TAHO identificadas en la presente se definen como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico TAHO de interés, después de alinear la secuencia y de introducir espacios, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentual máxima. Alineación para los propósitos de determinar la identidad de secuencia de ácido nucleico porcentual puede lograrse de varias maneras están dentro de la capacidad en la técnica, por ejemplo, usando software de computadora disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o egalign (DNASTAR) . Sin embargo, para los presentes propósitos, los valores de 5 de identidad de secuencia de ácido nucleico se generan usando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código de origen completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la tabla 1 abajo. En el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 es autoría de Genentech, Inc., y el código de origen mostrado en la tabla 1 abajo ha sido presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de E.U.A., Washington D.C., 20559, en donde se registró con el No. de registro de derechos de autor de E.U.A. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir del código de origen proporcionado en la tabla 1 abajo. El programa ALIGN-2 debe compilarse para usarse en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX digital V4.0D . Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en las que se emplee ALIGN-2 para comparaciones de secuencia de ácido nucleico, la identidad % de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico dada C contra una secuencia de ácido nucleico dada D (la cual como alternativa se puede mencionar como una secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico contra una secuencia de ácido nucleico dada D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótido clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácido nucleico, las tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada "ADN de comparación" a la secuencia de ácido nucleico designada "TAHO-DNA" , en donde "TAHO-DNA" representa una secuencia de ácido nucleico de codificación de TAHO hipotética de interés, "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual se está comparando la molécula de ácido nucleico "TAHO-DNA" de interés, y "N" , "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico usados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa de computadora ALIGN-2.
En otras modalidades, los polinucleótidos variantes TAHO son moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido TAHO y las cuales son capaces de hibridar, de preferencia bajo condiciones de hibridación severa y lavado, las secuencias de nucleótido que codifiquen para un polipéptido TAHO de longitud completa como el descrito en la presente. Los polipéptidos variantes TAHO pueden ser aquellos que sean codificados por un polinucleótido variante TAHO.
El término "región de codificación de longitud completa" cuando se usa en referencia a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido TAHO se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido TAHO de longitud completa de la invención (el cual es comúnmente mostrado entre codones de inicio y paro, inclusive de los mismos, en las figuras acompañantes) . El término "región de codificación de longitud completa" cuando se usa en referencia a un ácido nucleico depositado en la ATCC se refiere a la porción de codificación de polipéptido TAHO del ADNc que es insertado en el vector depositado en la ATCC (la cual se muestra comúnmente entre codones de inicio y paro, inclusive de los mismos, en las figuras acompañantes (codones de inicio y paro están en negritas y subrayados en las figuras) ) .
"Aislado" , cuando se use para describir los diferentes polipéptidos TAHO descritos en la presente, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con los usos terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa centrífuga, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul Coomassie, o de preferencia, tinción con plata. Polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes , toda vez que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido TAHO no estará presente. Sin embargo, comúnmente, un polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación .
Un ácido nucleico que codifica para polipéptido TAHO "aislado" u otro ácido nucleico que codifica para polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada ordinariamente en la fuente natural . del ácido nucleico que codifica para polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido aislado no está en la forma o escenario en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico de codificación de polipéptidos aisladas se distinguen por lo tanto de la molécula de ácido nucleico de codificación de polipéptidos como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de codificación de polipéptidos aislados incluye moléculas de ácido nucleico de codificación de polipéptidos contenidas en células que expresan ordinariamente el polipéptido en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales .
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operablemente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariontes , por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas . Las células eucarióticas se sabe que utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores . El ácido nucleico está "enlazado operablemente" cuando es puesto en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretor está . enlazado operablemente a ADN de un polipéptido si es expresado como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido. Un promotor o potenciador está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la traducción. Generalmente, "entrelazado operablemente" significa que las secuencias de ADN que están siendo enlazadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.
La "severidad" de las reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente, por alguien de capacidad ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para una fijación adecuada, en tanto que las sondas más cortas requieren de temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volverse a fijar cuando hebras complementarias estén presentes en un ambiente debajo de su temperatura de fusión. Entre más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y secuencia hibridable, más alta es la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se concluye que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que temperaturas más bajas hacerlas menos. Para detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995) .
Las "condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", según se define en la presente, pueden identificarse por aquellas que: (1) empleen baja potencia iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/0.1% de dodecilsulfato de sodio a 50EC; (2) empleen durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suero bovino/0.1% de ficol/0.1% de polivinilpirrolidona/50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42EC; o (3) hibridación nocturna en una solución que emplee 50% de formamida, 5 X SSC (0.75 M de NaCl , 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8, 0.1% de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonificado (50 µ9/p?1) , 0.1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42EC, con un lavado de 10 minutos a 42EC en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alta severidad de 10 minutos que consiste en 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 EC.
Las "condiciones moderadamente severas" pueden identificarse como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de condiciones de solución de hibridación de lavado (por ejemplo, temperatura, potencia iónica y % de SDS) menos severas que aquellas descritas arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación nocturna a 37EC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50EC. La persona capacitada reconocerá cómo ajustar la temperatura, potencia iónica, etc., según sea necesario para adaptarse a factores tales como longitud de sonda y similares.
El término "marcado con epítopos" cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido TAHO o un anticuerpo anti-TAHO fusionado a un "polipéptido marcador" . El polipéptido marcador tiene suficientes residuos como para proporcionar un epítope contra el cual puede elaborarse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad del polipéptido al cual se fusione. El polipéptido también de preferencia es muy único por lo que el anticuerpo no reacciona de manera cruzada sustancialmente con otros epítopes. Los polipéptidos marcadores adecuados generalmente tienen al menos 6 residuos de aminoácido y normalmente entre alrededor de 8 y 50 residuos de aminoácido (de preferencia, entre alrededor de 10 y 20 residuos de aminoácido) .
"Activo" o "actividad" para los presentes propósitos se refiere a formas de un polipéptido TAHO que conservan una actividad biológica y/o inmunológica de TAHO nativo o de origen natural, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibitoria o estimuladora) causada por un TAHO nativo o de origen natural que no es la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAHO nativo o de origen natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAHO nativo o de origen natural .
El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o completamente una actividad funcional de un polipéptido TAHO nativo descrito en la presente. De una manera similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido TAHO nativo descrito en la presente. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos TAHO nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de polipéptido TAHO pueden comprender poner en contacto un polipéptido TAHO con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas normalmente con el polipéptido TAHO.
"Purificado" significa que una molécula está presente en una muestra a una concentración de al menos 95% en peso, o por lo menos 98% en peso de la muestra en la cual está contenida.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está separada de al menos alguna otra molécula de ácido nucleico con la cual normalmente está asociada, por ejemplo, en su ambiente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada incluye además una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente a la de su ubicación cromosómica natural.
El término "vector", según se usa en la presente, intenta referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se le haya enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual se refiere a un circuito de ADN de doble hebra circular en el cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden ser integrados en el genoma de una célula hospedera después de la introducción en la célula hospedera, y de esta manera son replicados junto con el genoma huésped.
Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión / de genes a los cuales son enlazados operativamente. Estos vectores son conocidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes" . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante son comunes en forma de plásmidos. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada del vector.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o hacer más lento (reducir) la afección o trastorno patológico seleccionado. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes el trastorno vaya a prevenirse. Un sujeto o mamífero es "tratado" exitosamente para un cáncer que expresa polipéptido TAHO si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAHO, el oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra reducción observable y/o mesurable en o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el número de células cancerosas o ausencia de las células cancerosas; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir, hacer más lenta hasta cierto punto y de preferencia detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos incluyendo la diseminación del cáncer a tejido blando y hueso (es decir, reducir hasta cierto punto y de preferencia detener) metástasis tumoral; inhibición, hasta cierto grado, de crecimiento de tumor y/o alivio hasta cierto punto, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbidez y mortalidad reducidas y mejoran la calidad de los aspectos de vida. En la medida en que el anticuerpo anti-TAHO u oligopéptidos de unión a TAHO puede impedir el crecimiento y/o eliminar células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La reducción de estos signos o síntomas también puede sentirse por el paciente.
Los parámetros anteriores para evaluar un tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad son fácilmente mesurables mediante procedimientos de rutina familiares para un médico. Para terapia de cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, al evaluar el tiempo a progresión de enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR) . La metástasis puede determinarse por pruebas en etapas y mediante escaneo óseo y pruebas para nivel de calcio y otras enzimas para determinar la dispersión al hueso. Los barridos CT también pueden hacerse para buscar la dispersión a la pelvis y nódulos linfáticos en el área. Los rayos X de pecho y la medición de los niveles de enzimas hepáticas mediante métodos conocidos se usan para buscar metástasis al pulmón e hígado, respectivamente. Otros métodos de rutina para monitorear la enfermedad incluyen ultrasonografía transrectal (TRUS) y biopsia con aguja transrectal (TR B) .
Para cáncer de vejiga, el cual es un cáncer más localizado, los métodos para determinar el progreso de la enfermedad incluyen evaluación citológica urinaria por citoscopía, monitoreo de la presencia de sangre en la orina, visualización del tracto urotelial mediante sonografía o un pielograma intravenoso, tomografía computada (CT) y formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) . La presencia de metástasis distantes puede evaluarse mediante CT del abdomen, rayos x de pecho o formación de imágenes por radionúclidos del esqueleto.
Una administración "crónica" se refiere a administración de los agentes en un modo continuo a diferencia de un modo agudo, para de esta manera conservar el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de tiempo extendido. Administración "intermitente" es un tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino que más bien es cíclico en naturaleza.
Un "individuo" es un vertebrado. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas modalidades, un mamífero es un humano.
"Mamífero" para los propósitos del tratamiento de, aliviar los síntomas de, un cáncer se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballo, borrego, cerdos, cabras, conejos, etc. De preferencia, el mamífero es humano.
Administración "en combinación con" uno o más de los agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "portadores" según se usa en la presente incluyen portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o animal que sea expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. Comúnmente el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH regulado. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen reguladores de pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN*, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®.
Mediante "fase sólida" o "soporte sólido" se intenta decir una matriz no acuosa a la cual un anticuerpo, oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO de la presente invención se puede adherir o fijar. Ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado) , polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y silicones. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocilio de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas individuales, tales como aquellas descritas en la patente de E.U.A. No. 4,275,149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos la cual es útil para el suministro de un fármaco (tal como polipéptido TAHO, un anticuerpo contra el mismo o un oligopéptido de unión a TAHO) a un mamífero. Los componentes de liposoma están dispuestos comúnmente en una formación de dos capas, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas .
Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" se define en la presente como teniendo un peso molecular debajo de aproximadamente 500 Daltons.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permita que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva, y la cual no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se le administre la formulación. Esta formulación puede ser estéril .
Una formulación "estéril" es aséptica o está libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido, anticuerpo, oligopéptido de unión a TAHO, molécula orgánica de unión a TAHO o un agonista o antagonista de los mismos como se describe en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente indicado. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y de una manera de rutina, en relación al propósito indicado.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, oligopéptido de unión a TAHO, molécula orgánica de unión a TAHO u otro fármaco efectivo para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, hacer más lento hasta cierto punto y de preferencia detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, hacer más lenta hasta cierto grado y de preferencia detener) metástasis tumoral; inhibir hasta cierto grado, crecimiento de tumor y/o en relación hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición en la presente de "tratar" . En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o matar células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, ya que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una etapa anterior a la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Una "cantidad inhibidora de crecimiento" de un anticuerpo anti-TAHO, polipéptido TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibitoria de crecimiento" de un anticuerpo anti-TAHO, polipéptido TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o una molécula orgánica de unión a TAHO para los propósitos de inhibir crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y de una manera de rutina.
Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAHO, polipéptido TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o una molécula orgánica de unión a TAHO es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAHO, polipéptido TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o una molécula orgánica de unión a TAHO para los propósitos de inhibir crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y de una manera de rutina.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TAHO individuáis (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) , composiciones de anticuerpos anti-TAHO con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos anti-TAHO de una sola cadena, y fragmentos de anticuerpos anti-TAHO (véase abajo) siempre y cuando exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término "inmunoglobulina2 (Ig) se usa indistintamente con anticuerpo en la presente.
El término "SN8" se usa en la presente para referirse a un anticuerpo monoclonal anti-CD79b humano (TAH05) comprado de fuentes comerciales tales como Biomeda (Foster City, CA) , BDbioscience (San Diego, CA) o Ancell (Bayport, M ) , anticuerpo monoclonal generado a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(l):84-95 (1993)) o anticuerpo quimérico (conocido también en la presente como "chSN8") generado usando anticuerpos generados a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1) : 84-95 (1993) ) .
El término "10D10" según se usa en la presente se refiere a anticuerpo monoclonal anti-CD79b de macaco (TAHO40) generado de hibridomas depositados con la ATCC el 11 de julio de 2006 como anti-CD79b de macaco (TAHO40) 10D10 (10D10.3) como PTA-7715 o anticuerpo quimérico (conocido también en la presente como "chlODlO") generado usando anticuerpos generados a partir de hibridomas depositados en la ATCC el 11 de julio de 2006 como anti-CD79b de macaco (TAHO40) 10D10 (10D10.3) como PTA-7715. "ch" Cuando se usa en referencia a un anticuerpo se usa en la presente para referirse específicamente a anticuerpo quimérico . "anti-CD79b de macaco" o "anti-CD79b de macaco" (también "anti-cyno CD79b") se usan en la presente para referirse a anticuerpos que se unen a cyno CD79b (SEQ ID NO: 8 de la figura 8) (como se describió previamente en la solicitud de patente de E.U.A. No. 11/462,336, presentada el 3 de agosto del 2006). "anti-CD79b de macaco (chlODlO) " o "anti-cyno D79b (TAHO40) (chlODlO)" o "chlODlO" se usan en la presente para referirse a anti-CD79b de macaco quimérico (como el descrito previamente en la solicitud de E.U.A. No. 11/462,336, presentada el 3 de agosto de 2006) que se une a cinoDC79b (SEQ ID NO: 239 de la figura 43) . Anti-cynoCD79b (chlODlO) o chlODlO es anticuerpo anti-CD79b de macaco quimérico que comprende la cadena ligera de SEQ ID NO: 41 (figura 21) . Anti-cynoCD79b (chlODlO) o chlODlO comprende además la cadena pesada de SEQ ID NO: 43 (figura 23) .
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y muy preferiblemente más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa centrífuga, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul Coomassie o, de preferencia, tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ con células recombinantes toda vez que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, comúnmente, un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
La unidad de anticuerpo de cuatro cadenas básica es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y por lo tanto contienen 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos igA secretados pueden polimerizarse para formar ensambles polivalentes que comprendan 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con cadena J) . En el caso de IgGs, la unidad de 4 cadenas generalmente tiene alrededor de 150,000 daltons. Cada cadena L está enlazada a una cadena H por un enlace de disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí por uno o más enlaces de disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes de disulfuro entre cadenas separados regularmente. Cada cadena H tiene en el N-terminal, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas y ? y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en el N-terminal, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL está alineado con el VH y el CL está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Los residuos de aminoácido particulares se cree que forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. El apareo de un VH y VL juntos forma un solo sitio de unión a antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Sange, Norwalk, CT, 1994, pág. 71 y capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie vertebrada puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , pueden asignarse inmunoglobulinas a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgE e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las clases ? y a se dividen más en subclases con base en diferencias relativamente menores en secuencia y función de CH, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media la unión a antígeno y define especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de la envergadura de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes llamadas regiones estructurales (FRs) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, que adoptan ampliamente una configuración de lámina ß, conectadas por tres regiones hipervariables, las cuales forman asas que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß . Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat et al . , Sequences of proteins of Immunological Interest , 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, peor exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) .
El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácido de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente 1-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Pubic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o aquellos residuos de una "asa hipervariable" (por ejempo, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VL, y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en la VH; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
El término "anticuerpo monoclonal" según se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pudieran estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son adecuados toda vez que pueden ser sintetizados sin contaminar por sus anticuerpos. El modificador "monoclonal" no se debe considerar como requiriendo la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden elaborar usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucarióticos o vegetales (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden obtener de las bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los presentes anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homologa con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico a u homólogo con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (véase patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. , 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias de región constante humanas.
Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno así como un CL y al menos dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humanos) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. De preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab' )2 y Fv; dicuerpos; anticuerpos lineales (véase patente de E.U.A. No, 5,641,870, ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) . Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a unión a antígeno, es decir, tiene un solo sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un solo fragmento grande F(ab')2 el cual corresponde ampliamente a dos fragmentos Fab enlazados por el sulfuro que tienen diferente actividad de unión a antígeno divalente y aún es capaz de entrelazar antígenos. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el C-terminalarboxi del dominio (¾1 incluyendo una o más cisteínas de la región de pivote de anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en el cual los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab' )2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de pivote entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen.
El fragmento Fe comprende las porciones carboxilo terminal de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, región que es también la parte reconocida por receptores Fe (FcR) encontrados en ciertos tipos de células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de la cadena pesada y una de la ligera en estrecha asociación no covalente . A partir del doblamiento de estos dos dominios emanan seis asas hipervariables (3 asas cada una de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácido para unión a antígeno y confieren la especificidad de unión a antígeno de anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unirse a antígenos, aunque a una afinidad más baja que el sitio de unión completo.
"Fv de cadena individual" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados a una sola cadena de polipéptidos . De preferencia, el polipéptido sFv comprende además un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que hace posible que el sFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994) ; Borrebaeck 1995, citado arriba.
El término "dicuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados al construir fragmentos sFv (véase párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de tal manera que un apareo ínter-cadenas pero no intra-cadenas de los dominios V se logre, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tenga dos sitios de unión a antígeno. Los dicuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv de "cruce" en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas de polipéptidos. Los dicuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 90:6444-6448 (1993).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales toda o sustancialmente todas las regiones y las asas hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992).
Un "anticuerpo dependiente de especie", por ejemplo, un anticuerpo IgE anti -humano de mamífero, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte para un antígeno de una primera especie de mamífero que para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10"7 M, de preferencia no más de aproximadamente lxlO"8 y más preferiblemente no más de alrededor de lxlO"9M) pero tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humana que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos alrededor de 500 veces, o por lo menos aproximadamente 1,000 veces, más débil que su afinidad de unión para antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser de cualquiera de los diferentes tipos de anticuerpos descritos arriba, pero es de preferencia un anticuerpo humanizado o humano.
Un "oligopéptido de unión a TAHO" es un oligopéptido que se une, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Los oligopéptidos de unión a TAHO pueden ser sintetizados químicamente usando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o puede prepararse y purificarse usando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de unión a TAHO normalmente tienen alrededor de aproximadamente 5 aminoácidos de largo, como alternativa por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 aminoácidos de largo o más, en donde estos oligopéptidos que son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Los oligopéptidos de unión a TAHO pueden ser identificados sin experimentación excesiva usando técnicas bien conocidas. A este respecto, se indica que las técnicas para tamizar bibliotecas de oligopéptidos para buscar oligopéptidos que sean capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; publicaciones de PCT Nos. WO 84/03506 y O84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 82:178-18 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al . , J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al . , J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S.E. et al . (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87:6378; Lowman, H.B. et al . (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al . (1991) Nature, 352:624; Marks, J. D. et al . (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al . (1991) Proc. Nati. Acad. Sci., E.U.A., 88:8363 y Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668) .
Una "molécula orgánica de unión a TAHO" es una molécula orgánica que no es una oligopéptido o anticuerpo como el definido en la presente que se une, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO pueden identificarse y sintetizarse químicamente usando metodología conocida (véase, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión a TAHO normalmente tienen menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, como alternativa menos de alrededor de 1500, 750, 500, 250 ó 200 daltons en tamaño, en donde estas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente pueden identificarse sin experimentación inadecuada usando técnicas bien conocidas. A este respecto, se indica que las técnicas para tamizar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que sean capaces de unirse a un objetivo de polipéptido se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, publicación de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) .
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, un objetivo de antígeno de polipéptido asociado a tumor, es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad como para que el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica sea útil como un agente terapéutico para dirigirse a una célula o tejido que exprese el antígeno, y no reaccione en forma cruzada de manera significativa con otras proteínas. En estas modalidades, el grado de unión del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una proteína "no objetivo" será menor que aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a su proteína objetivo particular, según se determina por análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS) radioinmunoprecipitación (RIA) . Con respecto a la unión de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a una molécula objetivo, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítope en un objetivo de polipéptido particular significa unión que es mesurablemente diferente a una interacción no específica. La unión específica puede medirse, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, la cual generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse mediante la competencia con una molécula de control que sea similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no marcado. En este caso, la unión específica se indica si la unión del objetivo marcado a una sonda es inhibida competitivamente por un exceso de objetivo no marcado. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítope en un polipéptido particular objetivo según se usa en la presente puede exhibirse, por ejemplo, por una molécula que tenga un Kd para el objetivo de al menos aproximadamente 10"4M, como alternativa al menos alrededor de 10"5M, alternativamente por lo menos alrededor de 10"6 M, como alternativa al menos aproximadamente 10"7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10~8 M, como alternativa por lo menos aproximadamente 10"9 M, como alternativa al menos alrededor de 10"10 M, alternativamente por lo menos alrededor de 10"11 M, como alternativa por lo menos alrededor de 10"12 M o más. En una modalidad, el término "unión específica" se refiere a unión cuando una molécula se une a un polipéptido o epítope particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítope de polipéptido .
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un polipéptido TAHO" o un anticuerpo "inhibidor de crecimiento", oligopéptido u otra molécula orgánica es una que resulta en inhibición de crecimiento mesurable de células cancerosas que expresan o sobre-expresan el polipéptido TAHO adecuado. El polipéptido TAHO puede ser un polipéptido de transmembrana expresado sobre la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produzca y secrete por una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-TAHO inhibidores de crecimiento que se prefieren, oligopéptidos o moléculas orgánicas inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan TAHO en más de 20%, de preferencia alrededor de 20% a aproximadamente 50%, y aún más preferiblemente en más de alrededor de 50% (por ejemplo, alrededor de 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control adecuado, el control siendo típicamente células tumorales no tratadas con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que se esté probando. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de alrededor de 0.1 a 30 ug/ml o alrededor de 0.5 nM a 200 nM en cultivo de células, en donde la inhibición de crecimiento es determinada 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. La inhibición de crecimiento de células tumorales in vivo puede determinarse de varias maneras tales como se describe en la sección de ejemplos experimentales abajo. El anticuerpo es inhibidor de crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-AHO a alrededor de 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción en tamaño de tumor o proliferación de células tumorales dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses a partir de la primera administración del anticuerpo, de preferencia dentro de alrededor de 5 a 30 días.
Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce apoptosis" es una que induce muerte celular programada como se determina por la unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apotpósicos) . La célula es normalmente una que sobre-expresa un polipéptido TAHO. De preferencia la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula hematopoyética, tal como una célual B, célula T, basófilo, eosinófilo, neutrófilo, monocito, plaqueta o eritrocito. Están disponibles varios métodos para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante unión a anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través de formación de escaleras de ADN y la condensación nuclear/de cromatina junto con fragmentación de ADN pueden evaluarse por un incremento en células hipodiploides . De preferencia, el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que induzca apoptosis es una que resulta en aproximadamente 2 a 20 veces, de preferencia alrededor de 5 a 50 veces, y muy preferiblemente alrededor de 10 a 50 veces, la inducción de unión a anexina en relación a células no tratadas en un ensayo de unión a anexina.
Las "funciones efectoras" de un anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y variar con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complemento; unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) y activación de células B.
La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual Ig secretada unida en receptores Fe (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, Células Asesinas Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) hacen posible que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo portadora de antígenos y maten subsecuentemente la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y se requieren absolutamente para esta eliminación. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, un ensayo ADCC in vitro, tal como aquel descrito en la patente de E.U.A. No. 5,500,362 ó 5,821,337 puede llevarse a cabo. Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y Células Asesinas Naturales (NK) . Como alternativa, o además, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel descrito en Clynes et al. (E.U.A.) 95:652-656 (1998).
"Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR que se prefiere es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR que se prefiere es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición) , los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. El receptor activador o? FcyRIIA contiene un motivo de activación a base de tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El FcyRIIB receptor de inhibición contiene un motivo de inhibición a base de tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase revisión M. en Daéron, Annu . Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs son revisados en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs , incluyendo aquellos que serán identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonato, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J . Immunol . 24 :249 (1994) ) .
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos FcYRIII y llevan a cabo función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; prefiriéndose las PBMCs y células NK. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la vía de complemento clásica es iniciada por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase adecuada) los cuales son unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación de complemento, se puede llevar a cabo un ensayo CDC, por ejemplo, como el descrito en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 2002:163 (1996).
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que es caracterizada típicamente por crecimiento celular desregulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, cánceres hematopoyéticos o cánceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma o malignidades linfoides, pero también cánceres del bazo y cánceres de los nodulos linfáticos. Ejemplos más particulares de estos cánceres asociados con células B incluyen por ejemplo, linfornas de grado alto, intermedio y bajo (incluyendo linfornas de células B tales como, por ejemplo, linfoma de células B de tejido linfoide asociado a mucosa y linfoma no Hodgkin, linfoma de células de manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zonas marginales, linfoma de células macrocítico difuslo, linfoma folicular y linfoma de Hodgkin así como linfomas de células T) y leucemias (incluyendo leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, tal como leucemia de células B (linfocitos B CD5+) , leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide tal como leucemia linfoblástica aguda y mielodisplasia) , mieloma múltiple, tal como malignidad de células plasmáticas y otros cánceres hematológicos y/o asociados con células B o células T. Se incluyen también cánceres de células hematopoyéticas adicionales, incluyendo leucocitos polimorfonucleares , tales como basófilos, eosinófilos, neutrófilos y monocitos, células dendríticas, plaquetas, eritrocitos y células asesinas naturales. Los orígenes de cánceres de células B son los siguientes: orígenes de linfoma de células B de zona marginal en células B de memoria en zona marginal, linfoma folicular y el linfoma de células B grandes difuso se origina en centrocitos en la zona ligera de centros germinales, en mieloma múltiple se originan células plasmáticas, la leucemia linfocítica crónica y leucemia linfocítica pequeña se origina en células B (CD5+) , el linfoma de células de manto se origina en células B naives en la zona de manto y el linfoma de Burkitt se origina en centroblastos en la zona oscura de centros germinales. Los tejidos que incluyen células hematopoyéticas conocidas en la presente como "tejidos de células hematopoyéticas" incluyen tejidos de timo y médula ósea y tejidos linfoides periféricos, tales como bazo, nodulos linfáticos, tejidos linfoides asociados con mucosa, tales como los tejidos linfoides asociados con el intestino, anginas, parches de Peyer y apéndice y tejidos linfoides asociados con otras mucosas, por ejemplo, los revestimientos bronquiales. Ejemplos particulares adicionales de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello .
Una "malignidad de células B" en la presente incluye linforna no Hodgkin (NHL) , incluyendo NHL de bajo grado/folicular, NHL linfocítico pequeño (SL) , NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no cortadas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, linforna de células de manto, linfoma relacionado con SIDA y macroglobulinemia de aldenstrom, linfoma no Hodgkin (NHL) , enfermedad de Hodgkin predominante por linfocitos (LPHD) , linfoma linfocítica pequeña (SLL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , NHL indolente incluyendo NHL indolente en recaída y NHL indolente refractario a rituximab; leucemia, incluyendo leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica; linfoma de células de manto y otras malignidades hematológicas . Estas malignidades pueden ser tratadas con anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie de células B, tales como un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) . Estas enfermedades se contemplan en la presente como tratadas por la administración de un anticuerpo dirigido contra un marcador de superficie de células B, tal como un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) y/o CD79b de macaco (TAHO40) e incluye la administración de un anticuerpo ("desnudo") no conjugado o un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como el descrito en la presente. Estas enfermedades se contemplan también aquí como tratadas por la terapia de combinación que incluye un anticuerpo anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , o conjugado anticuerpo anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) fármaco de la invención en combinación con otro anticuerpo o conjugado de anticuerpo y fármaco, otro agente citotóxico, radiación u otro tratamiento administrado simultáneamente o en serie. En métodos de tratamiento ejemplares de la invención, un anticuerpo anti-TAHO de la invención, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , se administra en combinación con un anticuerpo anti-CD20, i munoglobulina o fragmentos de unión a CD20 del mismo, ya sea juntos o secuencialmente . El anticuerpo anti-CD20 puede ser un anticuerpo desnudo o un conjugado anticuerpo fármaco. En una modalidad de la terapia de combinación, el anticuerpo anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , es un anticuerpo de la presente invención y el anticuerpo anti-CD20 es Rituxan® (rituximab) .
El término "linfoma no Hodgkin" o "NHL", según se usa en la presente, se refiere a un cáncer del sistema linfático que no son linfornas de Hodgkin. Los linfornas de Hodgkin se pueden distinguir generalmente de los linfomas no Hodgkin por la presencia de células de Reed-Stemberg en linfomas de Hodgkin y la ausencia de estas células en linfomas no Hodgkin. Ejemplos de linfomas no Hodgkin abarcados por el término usado en la presente incluyen cualquiera que pudiera ser identificado como tal por alguien de capacidad en la técnica (por ejemplo, un oncólogo o patólogo) de acuerdo con esquemas de clasificación conocidos en la técnica, tales como el esquema Revised European-American Lymphoma (REAL) como el descrito en Color Atlas of Clinical Hematology (3a edición) , A. Víctor Hoffbrand and John E. Pettit (eds) (Harcourt Publishers Ltd. , 2000) . Véase, en particular, las listas en las figuras 11.57, 11.58 y 11.59. Ejemplos más específicos incluyen, pero no están limitados a, NHL en recaída o refractario, NHL de bajo grado de línea frontal, NHL en etapa III/IV, NHL resistente a quimioterapia, leucemia linfoblástica B precursora y/o linfoma, linfoma linfocítico pequeño, leucemia linfocítica crónica de células B y/o leucemia prolinfocítica y/o linfoma linfocítico pequeño, linfoma prolimiocítico de células B, inmunocitoma y/o linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de zonas marginales, linfoma de zonas marginales esplénicas, linfoma MALT de zonas marginales extranodales , linfoma de zonas marginales nodales, leucemia de células pilosas, plasmacitoma y/o mieloma de células plasmáticas, linfoma de bajo grado/folicular, NHL de grado intermedio/folicular, linfoma de células de manto, linfoma de centro folicular (folicular) , NHL difuso de grado intermedio, linfoma de células B grandes difuso, NHL agresivo (incluyendo NHL de línea frontal y agresivo y NHL en recaída agresivo) , NHL que recaiga después o refractario a transplante de células madre autólogas, linfoma de células B grandes mediatinal primario, linfoma de efusión primario, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no cortadas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica granular grande precursora (periférica) , micosis fungoide y/o síndrome de Sezary, linfomas de piel (cutáneos) , linfoma macrocítico anaplásico, linfoma angiocéntrico .
Un "trastorno" es cualquier afección que pudiera beneficiarse del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas afecciones patológicas incluyendo aquellas afecciones patológicas que predispongan al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitativos de trastornos que serán tratados en la presente incluyen afecciones cancerosas tales como tumores malignos y benignos; no leucemias y malignidades linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos y otros glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, inmunitarias y otros relacionados con angiogénesis . Los trastornos incluyen además afecciones cancerosas tales como trastornos proliferativos de células B y/o tumores de células B, por ejemplo, linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítico aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno proliferativo celular es cáncer .
"Tumor", según se usa en la presente, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas y benignas, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
Un anticuerpo, oligopéptido o cualquier otra molécula orgánica que "induzca muerte celular" es uno que causa que una célula viable se vuelva no viable. La célula es una que expresa un polipéptido TAHO y es un tipo de célula que expresa o sobre-expresa específicamente un polipéptido TAHO. La célula puede ser células cancerosas o normales del tipo de célula particular. El polipéptido TAHO puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produzca y se secrete por una célula cancerosa. La célula puede ser una célula cancerosa, por ejemplo, una célula B o célula T. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por citotoxidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para muerte celular puede llevarse a cabo usando suero inactivado con calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica es capas de inducir muerte celular, la pérdida de integridad de membrana evaluada por la absorción de yoduro de propidio (PI) , azul tripan (véase Moore et al. Cytotechnology 17:11 (1995)) o 7AAD puede evaluarse en relación a células no tratadas. Los anticuerpos inductores de muerte celular, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas que se prefieren son aquellos que inducen la absorción de PI y en el ensayo de absorción de PI en células BT474.
Una "célula que expresa TAHO" es una célula que expresa un polipéptido TAHO endógeno o transfectado ya sea sobre la superficie celular o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa THAO" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido TAHO presente sobre la superficie celular o que producen o secretan un polipéptido TAHO. Un "cáncer" que expresa TAHO produce opcionalmente niveles suficientes de polipéptido TAHO sobre la superficie de células del mismo, de tal manera que un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido u otra molécula orgánica puede unirse al mismo y tenga un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer" que expresa TAHO produce y secreta opcionalmente niveles suficientes de polipéptido TAHO, de tal manera que un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido u otro antagonista de molécula orgánica puede unirse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a éste último, el antagonista puede ser un oligonucleótido antisentido que reduzca, inhiba o prevenga la producción y secreción del polipéptido TAHO secretado por células tumorales . Un cáncer que "sobre-expresa" un polipéptido TAHO es uno que tiene niveles significativamente más altos de polipéptido TAHO en la superficie celular del mismo, o produce y secreta, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobre-expresión puede ser causada por una amplificación génica o por transcripción o traducción incrementada. La sobre-expresión de polipéptidos TAHO puede determinarse en un ensayo de detección o prognosis al evaluar niveles incrementados de la proteína TAHO presente sobre la superficie de una célula, o secretado por la célula (por ejemplo, por medio de un ensayo de inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-TAHO preparados contra un polipéptido TAHO aislado que puede prepararse usando tecnología de ADN recorabinante a partir de un ácido nucleico aislado que codifique para el polipéptido TAHO; análisis FACS, etc.). Como alternativa, o además, se pueden medir los niveles de ácido nucleico o ARNm de codificación de polipéptidos TAHO en la célula, por ejemplo, mediante hibridación in sifcu fluorescente usando una sonda a base de ácido nucleico que corresponda a un ácido nucleico de codificación de TAHO o el complemento del mismo; (FISH; véase 098/45479 publicada en octubre de 1998) , Southern blotting, Northern blotting, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , tal como la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobre-expresión de un polipéptido TAHO al medir el antígeno derramado en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo, usando ensayos a base de anticuerpos (véase también, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; patente de E.U.A. 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990) ) . Aparte de los ensayos anteriores, varios ensayos in vivo están disponibles para el practicante capacitado. Por ejemplo, se pueden exponer las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que sea marcado opcionalmente con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo y la unión del anticuerpo a células en el paciente puede ser evaluada, por ejemplo, mediante escaneo externo para radioactividad o al analizar una biopsia tomada de un paciente expuesto previamente al anticuerpo.
Según se usa en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que no es el sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo" ) , y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprenden por lo menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquiera inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
La palabra "marcador" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto detectable o composición que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica para de esta manera generar un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "marcado" . El marcador puede ser detectable en sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de substrato que sea detectable.
El término "agente citotóxico" según se usa. en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa destrucción de células. El término intenta incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, Ar211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos , por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercaladores , enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas , anticuerpos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diferentes agentes antitumor o anticáncer descritos abajo, otros agentes citotóxicos se describen abajo. Un agente tumoricida causa la destrucción de células tumorales.
Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto dañino en el crecimiento o proliferación de una célula .
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer, sin importar el mecanismo de acción. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitadas a: agentes alquilantes, antimetabolitos , alcaloides de plantas venenosas de espinas, anticuerpos citotóxicos/antitumor, inhibidores de topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizadores e inhibidores de cinasa. Los agentes quimioterapéuticos incluyen compuestos usados en "terapia dirigida" y quimioterapia convencional. Ejemplos de agentes ® quimioterapéuticos incluyen: erlotinib (TA CEVA , Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanof -Aventis) , 5-FU (fluorouracilo, 5 - fluorouracilo, CAS NO. 51-21-8) , gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), cisplatino (cis-diamina, dicloroplatino ( II ) , CAS No. 15663-27-1), carboplatino (CAS No. 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) , temozolamida (4-metil-5-oxo-2 , 3,4,6, 8-pentazabiciclo [4.3.0] nona-2 , 7 , 9-trien-9-carboxamida, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough) , tamoxifen ( (Z) -2- [4- (2 , 1-difenilbut-1-enil) fenoxi] -_V,N-dimetil-etanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX® y doxorrubicina (ADRIAMYCIN®) , Akti-l/2, HPPD y rapamicina .
Más ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen: oxaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi) , bortezomib (VELCADE®, illennium Pharm) , sutent (SUNITINIB , SU11248, Pfizer) , letrozol (FEMARA8, Novartis) , mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis) , CL-518 (inhibidor Mek, Exelixis, O 2007/044515) , ARRY-886 (inhibidor de Mek, AZD6244, disponible de BioPharma, Astra Zeneca) , SF-1126 (inhibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals) , BEZ-235 (inhibidor de PI3K, Novartis) , XL-147 (inhibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis) , fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca) , leucovorin (ácido folínico) , rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE0, Wyeth) , lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline) , lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough) , sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer) , tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson) , ABRAXANE™ (libre de Cremophor) , formulaciones en nanopartículas de paclitaxel manipuladas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) , temsirolimus (TORISEL®, Wyeth) , pazopanib (GlaxoSmithKline) , canfosfamida (TELCYTA®, Telik) , tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina ; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina , óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina , caliqueamicina gamma II, caliqueamicina omegall (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos , tales como clodronato; una esperamicina ; así como cromóforo de neocarzinostatina y coromoproteína enediina antibióticos cromóforos relacionados) , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2 -pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina , idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, timetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifl ridina, enocitabina, floxuridina ; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostañolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti-adrenales tales como aminoglutetimida , mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico ; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2 -etilhidrazida ; procarbazina; complejo de polisacárido PSK (JYHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico ; triazicuona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurin A, roridin A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatin y carboplatin; vinblastina; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE*; novantrona; tenopósido; edatrexato; daunomicina ; aminopterina; capecitabina (XELODA*8, Roche) ; ibandronato ; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Se incluyen también en la definición de "agente quimioterapéutico" : (i) agentes anti -hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti -estrogenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivo (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo NOLVADEX*; citrato de tamoxifen), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina) ; (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE (acetato de megestrol) , AROMASI e (exemestano; Pfizer) , formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol) , FEMARA® (letrozol; Novartis) , y ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca) ; (iii) anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolan nucleósido citosina) ; (iv) inhibidores de proteína cinasa tales como inhibidores de MEK (WO 2007/044515) ; (v) inhibidores cinasa de lípidos; (vi) oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en proliferación de células aberrante, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras, tales como oblimersen (GENASENSE , Genta Inc.); (vii) ribozimas tales como inhibidores de expresión de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresión de HER2 ; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® y VAXID®, PROLEUCIN"' rIL-2; inhibidores de topoisomerasa 1 tales como LURTOTECAN*; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes anti-angiogénicos tales como ® bevacizumab (AVASTIN , Genentech) ; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores .
También incluidos en la definición de "agente quimioterapéutico" están los anticuerpos terapéuticos tales ® como alemtuzumab (Campath) , bevacizumab (AVASTIN , ® Genentech) ; cetuximab (ERBITUX , Imclone) ; panitumumab (VECTIBIX®, Amgen) , rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idee), pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN8, Genentech) , tositumomab (Bexxar, Corixia) , y el anticuerpo conjugado a fármaco, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG*, Wyeth) .
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que expresa TAHO, ya sea in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de células que expresen TAHO en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar que no sea la fase S) , tales como agentes que inducen la detención en Gl o la detención en fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubíciña, etopósido y bleomicina. Estos agentes que detienen Gl también se derraman en la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds . , capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. ( B Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE", Rhone-Poulenc Rorer) derivado del tejo europeo, es un análogo ® semisintético de paclitaxel (TAXOL , Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan microtúbulos al prevenir la despolimerización, la cual da como resultado en la inhibición de mitosis en células.
"Doxorrubicina" es un antibiótico de antraciclina . El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)-10- [ (3 -amino-2 , 3 , 6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6 , 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -1-metoxi- 5 , 12 -naftacendiona .
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citocinas son linfocinas, monocinas y las hormonas polipéptidas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroides ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona estimuladora de folículos (FSH) , hormona estimuladora de tiroides (TSH) y hormona lutenizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral (X y ß; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón a, ß y ?,-factores estimuladores de colonia (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF ^(G-CSF) ; interleucinas (lis) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipéptidos incluyendo el ligando LIF y kit (KL) . Según se usa en la presente, el C-terminalitocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El término "inserto de envase" se usa para referirse a instrucciones incluidas comúnmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o alertas que se refieren al uso de estos productos terapéuticos.
El término "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto que resulta de un proceso metabólico o una reacción dentro de una célula o un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) . El proceso o reacción metabólica puede ser un proceso enzimático, tal como corte proteolítico de un enlazador péptido del ADC, o hidrólisis de un grupo funcional tal como una hidrazona, éster o amida. Los metabolitos intracelulares incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos y fármacos libres los cuales han sufrido un corte intracelular después de su entrada, difusión, absorción o transporte en una célula .
Los términos "cortable intracelularmente" y "corte intracelular" se refieren a un proceso o reacción metabólica dentro de una célula en un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) con lo cual la fijación covalente, es decir, enlazador, entre la porción de fármaco (D) y el anticuerpo (Ab) es rota, dando como resultado que el fármaco libre sea disociado del anticuerpo dentro de la célula. Las porciones cortadas del ADC son entonces metabolitos intracelulares.
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad dada de fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (velocidad) como la cantidad total (grado) de fármaco que alcanza la circulación general a partir de una forma de dosis administrada.
El término "actividad citotóxica" se refiere a un efecto de eliminación de células, citostático o inhibidor de crecimiento de un ADC o un metabolito intracelular de un ADC. La actividad citotóxica puede expresarse como el valor IC50, el cual es la concentración (molar o másica) por volumen unitario a la cual sobreviven la mitad de las células.
El término "alquilo" según se usa en la presente se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada y saturado de 1 a 12 átomos de carbono (C1-C12) , en donde el radical alquilo puede ser sustituido opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritos abajo. En otra modalidad, un radical alquilo tiene uno a ocho átomos de carbono (Ci-Ce) o uno a seis átomos de carbono (Ci-C6) . Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no están limitados a, metilo (Me, -CH2) , etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3) , 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, - CH2CH (CH3) 2) , 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH (CH3) CH2CH3) , 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, - CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo ( -CH (CH3) CH (CH3) 2) , 3-metil-l-butilo (1-CH2CH2CH(CH3)2) , 2 -metil-1-butilo ( -CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3 ) , 2-hexilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo ( -CH (CH3) CH (CH3) CH2CH3) , 4-metil-2-pentilo ( -CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3-metil-3-pentilo (-C(CH3) (CH2CH3)2) , 2-metil-3-pentilo ( -CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 2,3-dimetil-2 -butilo ( -C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3 , 3-dimetil-2-butilo (-CH (CH3) C (CH3) 3, 1-heptilo, 1-octilo, y similares.
El término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con por lo menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace carbono-carbono sp2, en donde el radical alquenilo puede ser sustituido opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente, e incluye radicales que tienen orientaciones "cis" o "trans" , o como alternativa, orientaciones "E" y "Z" . Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, etilenilo o vinilo (-CH=CH2) , alquilo (-CH2CH=CH2) , y similares.
El término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a ocho átomos de carbono (C2-C8) con por lo menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace carbono-carbono, sp triple, en donde el radical alquinilo puede ser sustituido opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, etinilo (-C=CH), propinilo (propargilo, -CH2C=CH) , y similares.
Los términos "carbociclo" , carbociclilo" , "anillo carbocíclico" y "cicloalquilo" se refieren a un anillo no aromático, saturado o parcialmente insaturado que tiene 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como un anillo monocíclico o 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen 7 a 12 átomos pueden ser dispuestos, por ejemplo, como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], y los carbociclos bicíclicos que tengan 9 ó 10 átomos de anillo pueden ser dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6], o como sistemas puenteados tales como biciclo [2.2.1] heptano, biciclo [2.2.2] octano y biciclo [3.2.2] nonano . Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen, pero no están limitados a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3 -enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2 -enilo, l-ciclohex-3-enilo, ciclohexandienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo, y similares.
"Arilo" significa un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C2o) derivado de la remoción de un átomo de hidrógeno a partir de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático progenitor. Algunos grupos arilo son representados en las siguientes estructuras ejemplares como "Ar" . Arilo incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático fusionado a un anillo saturado, parcialmente insaturado o anillo carbocíclico aromático. Los grupos arilo típicos incluyen, pero no están limitados a, radicales derivados de benceno (fenilo) , bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, bifenilo, indenilo, indanilo, 1 , 2 -dihidronaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, y similares. Los grupos arilo son sustituidos opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente.
Los términos "heterociclo" , "heterociclilo" y "anillo heterocíclico" se usan indistintamente en la presente y se refieren a un radical carbocíclico saturado o parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más dobles y/o triples enlaces dentro del anillo) de 3 a 20 átomos de anillo en los cuales al menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, los átomos de anillo restantes siendo C, en donde uno o más átomos de anillo es sustituido opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritos abajo. Un heterociclo puede ser un monociclo que tenga 3 a 7 miembros de anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S) o un biciclo que tenga 7 a 10 miembros de anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, Nueva York, 1968) , en particular capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 to present) , en particular volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc . (1960) 82:5566. "Heterociclilo" incluye también radicales en los que radicales heterociclo son fusionados con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo carbocíclico o heterocíclico aromático. Ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero no están limitados a, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3- dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo [3.1.0] hexanilo, 3-azabiciclo [4.1.0] heptanilo, azabiciclo [2.2.2] hexanilo, 3H-indolilquinolizinilo y N-piridil ureas. Las porciones espiro también están incluidas dentro del alcance de esta definición. Ejemplos de un grupo heterocíclico en el que dos átomos de carbono de anillo son sustituidos con porciones oxo (=0) son pirimidinonilo y 1,1-dioxo-tiomorfolinilo . Los grupos heterociclo en la presente son sustituidos opcionalmente en forma independiente con uno o más sustituyentes descritso aquí.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de anillos de 5, 6 ó 7 miembros, e incluye sistemas de anillos fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-20 átomos, que contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (incluyendo, por ejemplo, 2 -hidroxipiridinilo) , imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (incluyendo, por ejemplo, 4 -hidroxipirimidinilo) , pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo . Los grupos heteroarilo son sustituidos opcionalmente de manera independiente con uno o más sustituyentes descritos en la presente.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden ser enlazados por carbono (enlazados por carbono) , o nitrógeno (enlazados por nitrógeno), cuando esto sea posible. A manera de ejemplo y no limitación, los heterociclos o heteroarilos enlazados por carbono son enlazados en la posición 2, 3, 4, 5 ó 6 de una piridina, posición 3, 4, 5 ó 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 ó 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 ó 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 ó 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol , posición 2, 4 ó 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4 ó 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, posición 2 ó 3 de una aziridina, posición 2, 3 ó 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u8 de una isoquinolina .
A manera de ejemplo y no limitación, los heterociclos o heteroarilos enlazados por nitrógeno son enlazados en la posición 1 de un aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina , 2- imidazolina, 3 - imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, lH-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol, o ß -carbolina.
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo saturado, ramificado o de cadena recta o cíclico de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos diferentes átomos de carbono de un alcano progenitor. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero no están limitados a: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3 -propilo ( - CH2CH2CH2 - ) , 1,4-butilo ( - CH2CH2CH2CH2 -) , y similares .
Un "alquileno de ?? - ??? " es un grupo hidrocarburo de cadena recta y saturado de la fórmula - ( CH2 ) i- io - - Ejemplos de un alquileno de C1 - C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, ramificado o de cadena recta o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir de los mismos o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno progenitor. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero no están limitados a: 1,2-etileno (-CH=CH-) .
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, ramificado o de cadena recta o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados mediante la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir del mismo o dos diferentes átomos de carbono de un alquino progenitor. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero no están limitados a: acetileno (-C=C-) , propargilo (-CH2C=C-) y 4-pentinilo ( -CH2CH2CH2C=C- ) .
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras: en las cuales el grupo fenilo puede ser no sustituido o sustituido con hasta cuatro grupos incluyendo, pero no limitados a, alquilo de Ci-C8, -0- (alquilo de Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2-NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2 , -NH(R') , -N(R' )2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, -alquilo y arilo de Ci-C8.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, es reemplazado con un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen pero no están limitados a, bencilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-l-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la porción alquilo, incluyendo grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo, tiene 1 a 6 átomos de carbono y la porción arilo tiene 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, es reemplazado con un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, pero no están limitados a, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la porción alquilo, incluyendo grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y la porción heteroarilo tiene 5 a 14 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S. La porción heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tenga 3 a 7 miembros de anillo (2 a 6 átomos de carbono o un biciclo que tenga 7 a 10 miembros de anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de , 0, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
El término "profármaco" según se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de un compuesto de la invención que puede ser menos citotóxico para células en comparación con el compuesto de origen o fármaco y es capaz de ser enzimática o hidrolíticamente activado o convertido en la forma de origen más activa. Véase, por ejemplo, ilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pág. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida opcionalmente, profármacos que contienen fenilacetamida sustituida opcionalmente, profármacos de 5-fluorocitosina y otros de 5-fluorouridina los cuales pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármaco citotóxicos que pueden derivarse en una forma de profármaco para usarse en esta invención incluyen, pero no están limitados a, compuestos de la invención y agentes quimioterapéuticos tales como los descritos arriba.
Un "metabolito" es un producto producido a través del metabolismo en el cuerpo de un compuesto especificado o sal del mismo. Los metabolitos de un compuesto pueden ser identificados usando técnicas de rutina conocidas en la técnica y sus actividades determinadas usando pruebas tales como aquellas descritas en la presente. Estos productos pueden resultar por ejemplo de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación, corte enzimático y similares, del compuesto administrado. En consecuencia, la invención incluye metabolitos de compuestos de la invención, incluyendo compuestos producidos por un proceso que comprende poner en contacto un compuesto de esta invención con un mamífero durante un periodo de tiempo suficiente para producir un producto metabólico del mismo.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos la cual es útil para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes de liposoma están dispuestos comúnmente en una formación de dos capas, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.
"Enlazador" se refiere a una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que fija covalentemente un anticuerpo a una porción de fármaco. En varias modalidades, los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un radical alquildiilo, un radical arildiilo, un heteroarildiilo, porciones tales como: (CR2) n0 (CR2) n- , unidades repetitivas de alcoxi (por ejemplo, polietilenoxi , PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino, Jeffamine™) ; y ésteres diácidos y amidas incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato y capramida.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no poder ser superpuestas en el socio de imagen idéntica, mientras el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre su socio de imagen idéntica .
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio .
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes idénticas unas de otras. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Mezclas de diastereómeros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía .
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes idénticas que puedan superponerse unos de otros.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en la presente generalmente son de acuerdo con S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary fo Chemical Ter s (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. and Wilen, S., Stereoche istry of Organic Co pounds (1994) John iley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada en plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, se usan los prefijos D y L, o R y S, para indicar la configuración absoluta de la molécula alrededor de sus centros quirales. Los prefijos D y L o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada en plano por el compuesto, con (-) o 1 significando que el compuesto es levogiratorio . Un compuesto con un prefijo de (+) o d es dextrogiratorio . Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que son imágenes idénticas uno del otro. Un estereoisómero específico también se puede referir como un enantiómero, y una mezcla de estos isómeros comúnmente es llamada una mezcla enantiomérica . Una mezcla 50:50 de enantiómeros que se conoce como una mezcla racémica o un racemato, el cual puede ocurrir cuando no haya estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas , libre de actividad óptica.
El término "tautómero" o "forma tautomérica" se refiere a isómeros estructurales de diferentes energías los cuales son interconvertibles por medio de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros de protones (conocidos también como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones por medio de migración de un protón, tales como isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina . Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones mediante reorganización de algunos de los electrones de unión.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable" según se usa en la presente, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de la invención. Las sales ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metansulfonato, "mesilato", etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es decir, 1, 1' -metilen-bis (2-hidroxi-3-naftoato) ) . Una sal farmacéuticamente aceptable puede incluir la inclusión de cualquier otra molécula tal como un ión de acetato, un ion de succinato u otro contra ión. El contra ión puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica que estabilice la carga en el compuesto progenitor. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en esa estructura. Los casos en los que varios átomos cargados son parte de una sal f rmacéuticamente aceptable puede tener varios contra iones. Por consiguiente, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contra iones.
Si el compuesto de la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier método adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metansulfónico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, un ácido piranosidílico, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfa hidroxiácido, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluensulfónico o ácido etansulfónico, o similares .
Si el compuesto de la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria) , un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo, o similares. Ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoniaco, aminas primarias, secundarias y terciarias y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, aluminio y litio.
La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser compatible químicamente y/o toxicológicamente, con los demás agentes que comprenden una formulación, y/o el mamífero que esté siendo tratado con la misma .
Un "solvato" se refiere a una asociación o complejo de una o más moléculas solventes y un compuesto de la invención.
Ejemplos de solventes que forman solvatos incluyen, pero no están limitados a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina. El término "hidrato" se refiere al complejo en donde la molécula solvente es agua.
El término "grupo protector" se refiere a un sustituyente que se emplea comúnmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras se hace reaccionar otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo protector amino" es un sustituyente fijado a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Los grupos protectores amino incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC) , benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) . Similarmente , un "grupo protector hidroxi" se refiere a un sustituyente de un grupo hidroxi que bloquea o protege la funcionalidad hidroxi. Los grupos protectores adecuados incluyen acetilo y sililo. Un "grupo protector carboxi" se refiere a un sustituyente del grupo carboxi que bloquea o protege la funcionalidad carboxi. Los grupos protectores carboxi comunes incluyen fenilsulfoniletilo, cianoetilo, 2- (trimetilsilil) etilo, 2- (trimetilsilil) etoximetilo, 2- (p-toluensulfonil) etilo, 2- (p-nitrofenilsulfenil) etilo, 2- (difenilfosfino) -etilo, nitroetilo y similares. Para una descripción general de grupos protectores y su uso, véase, T.
W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede ser sustituido por otro grupo funcional. Ciertos Grupos salientes se conocen bien en la técnica, y ejemplos incluyen, pero no están limitados a, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro) , metansulfonilo (mesilo) , p-toluensulfonilo (tosilo) , trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato .
Abreviaturas COMPONENTES ENLAZADORES : MC = 6 -maleimidocaproilo Val-Cit o "ve" = valina-citrulina (un dipéptido ejemplar en un enlazador cortable por proteasa) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanoico PAB = p-aminobenciloxicarbonilo (un ejemplo de un componente enlazador "que se auto- inmola" ) Me-Val-Cit = N-metil -valina-citrulina (en donde el enlace de péptido enlazador ha sido modificado para impedir su corte por catepsina B) MC(PEG)6-0H = melimidocaproilo-polietilenglicol (puede ser fijado a cisteínas de anticuerpo) .
FARMACOS CITOTOXICOS: MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el C-terminal del fármaco (PM 731.5) MMAF-DMAEA = MMAF con DMAEA (dimetilaminoetilamina) en un enlace de amida a la fenilalanina C-terminal (PM 801.5) MMAF-TEG = MMAF con tetraetilenglicol esterificado a la fenilalanina MMAF-NtBu = N-t-butilo, unido como una amida al C-terminal de MMAF DM1 = N(2' ) -deacetil- (2 ' ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina MD3 = (2 ' ) -deacetil -N2 - (4 -mercapto- 1-oxopentil ) -maitansina DM4 = N(2' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina Abreviaturas adicionales son las siguientes : AE es auristatina E, Boc es N- ( t-butoxicarbonilo) , cit es citrulina, dap es dolaproina, DCC es 1, 3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es N,N-diisorpopiletilamina, dil es dolaisoleucina, DMA es dimetilacetamida, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es etilenglicol éster dimetílico (o 1, 2-dimetoxietano) , DMF es N, N-dimetilformamida, DMSO es sulfóxido de dimetilo, doe es dolafenina, dov es N,N-dimetilvalina, DTNB es 5 , 5 ' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) , DTPA es ácido dietilentriaminopentaacético, DTT es ditiotreitol , EDCI es clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiiida, EEDQ es 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l, 2-dihidroquinolina, ES- S es espectrometría de masas por aspersión, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N- (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol , HPLC es cromatografía de líquidos de presión alta, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4-anisildifenilmetilo (o 4-metoxitritilo) , ñor es (1S, 2R) - (+) -norefedrina , PBS es solución salina de fosfato regulado con pH (pH 7.4), PEG es propilenglicol , Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6-maleimidocaproilo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo tris-pirrolidin fosfonio, SEC es cromatografía de exclusión de tamaño, Su es succinimida, TFA es ácido trifluoroacético, TLC es cromatografía de capa delgada, UV es ultravioleta y val es valina.
Un "aminoácido de cisteína libre" se refiere a un residuo de aminoácido y cisteína que ha sido manipulado para crear un anticuerpo progenitor, tiene un grupo funcional tiol (-SH), y no es apareado como un puente de disulfuro intramolecular o intermolecular.
El término "valor de reactividad tiol" es una caracterización cuantitativa de la reactividad de los aminoácidos de cisteína libres. El valor de reactividad tiol es el porcentaje de un aminoácido de cisteína libre en un anticuerpo manipulado por cisteína que reacciona con un reactivo que reacciona con tiol, y se convierte a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un aminoácido de cisteína libre en un anticuerpo manipulado con cisteína que reacciones en 100% de rendimiento con un reactivo que reacciona con tiol, tal como un reactivo de biotina-maleimida, para formar un anticuerpo marcado con biotina tiene un valor de reactividad tiol de 1.0. Otro aminoácido de cisteína manipulado en el mismo o diferente anticuerpo progenitor que reaccione en 80% de rendimiento con un reactivo que reacciona con tiol tiene un valor de reactividad tiol de 0.8. Otro aminoácido de cisteína manipulado en el mismo o diferente anticuerpo progenitor que no puede reaccionar totalmente con un reactivo que reacciona con tiol tiene un valor de reactividad tiol de 0. La determinación del valor de reactividad tiol de una cisteína particular puede llevarse a cabo mediante ensayo ELISA, espectroscopia de masas, cromatografía de líquidos, autorradiografía u otras pruebas analíticas cuantitativas.
Un "anticuerpo progenitor" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la cual uno o más residuos de aminoácidos son reemplazados por uno o más residuos de cisteína. El anticuerpo progenitor puede comprender una secuencia nativa o tipo silvestre. El anticuerpo progenitor puede tener modificaciones de secuencia de aminoácidos pre-existentes (tales como adiciones, supresiones y/o sustituciones) en relación a otras formas nativas, tipo silvestre o modificadas de un anticuerpo. Un anticuerpo progenitor puede dirigirse contra un antígeno objetivo de interés, por ejemplo, un polipéptido biológicamente importante. También se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos que no son polipéptidos (tales como antígenos de glicolípidos asociados a tumor; véase US 5091178) .
Tabla 1 /* * C-C increased from 12 to 15 * Z is average of EQ * B is average of ND * match with stop is M; stop-stop = 0; J (joker) match = 0 */ #define _M -8 /* valué of a match with a stop */ int _day[26][26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ l* A *l { 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 0,_ , 1, 0,-2, 1, 1, 0, 0,-6, 0,-3, 0}, /+ B */ { 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_ ,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3, 1 }, /* C */ {-2,-4, 15,-5,-5,-4,-3,-3,-2. 0,-5,-6,-5.-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5), /* D */ { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2}, /* E */ { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3}, /* F */ {-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5), /* G */ { 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-l,-l,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0).
/* H V {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2. 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, 0, 2), /* I?/ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-2,-2,-2,-l, 0, 0, 4,-5, 0,-1,-2), /* J?/ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0), /* K V {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0), /* L?/ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, ,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-l, 0, 2,-2, 0,-1,-2), /* M?/ {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_ ,-2,-l, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1), /* N */ { 0, 2.-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_ ,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1), /* O?/ {_M, M,_M,_M,_M,_M,_M,_ ,_M, M,_M,_M,_M,_M, 0, M, M,_M,_ ,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M), /» P?/ { ?,-??-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3,-2,-1 ~M, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,~5, 0), /* Q */ { 0, 1,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2,-1, 1,_ , 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3), /* R */ {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0), /* S */ { 1, 0, 0, 0, 0,-3, 1,-1,-1, 0, 0,-3,-2, 1,_ , 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0), /* T */ { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1,-1, 0,_M, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0), /* U V { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0), /* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,- 1,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2), /* W */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6), /* X */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_ , 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0), /* Y */ {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-l,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4), /* Z V { 0, 1,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} ); Tabla 1 (cont.) /* */ «include <stdio.h> «¡ncludc <ct pe,h> «define MAX JMP /* max jumps in a diag */ «define MAXGAP /* don't continué to penalize gaps larger than this */ «define JMPS /* max jmps in an path */ «define MX /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp */ #define DMAT 3 /* valué of matching bases */ «define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */ «define DINSO 8 /* penalty for a gap */ «define DINS1 1 /* penalty per base */ «define PINSO 8 /* penalty for a gap */ «define PINS1 4 /* penalty per residue */ structjmp { short n[MAXJMP]; /* size ofjmp (neg for dely) */ unsigned short xfMAXJMP]; /? base no. of jmp in seq x */ }; /* limite seq to 2?16 -1 */ struct diag { int score; /* score at last jmp */ long offset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp índex */ structjmp jp; /* list of jmps */ struct path { int spc; /* number of leading spaces */ short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */ int x[JMPS];/* loc of jmp (last elem before gap) */ char ?ofite; /* output file ñame */ char *namex[2]; /* seq ñames: getseqs() */ char *prog; /* prog ñame for err msgs V char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() */ int dmax; /* best diag: nw() */ int dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx, gapy; /* total gaps in seqs */ int lenO, lenl; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; /* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw() */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonals */ struct path PPPI; /* holds path for seqs */ char ?callocQ, *malloc(), *index(), *strcpy(); char ?getseqQ, *g_calloc(); Tabla 1 (cont.) /* Needleman-Wunsch alipment program * * usage: progs filel fíle2 * where filel and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with ">' or '< are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file "align.out" * * The program may créate a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original versión developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ ftinclude "nw.h" tfinclude "day.h" static _dbval[26] = { 1 , 14,2, 13,0,0,4, 1 1 ,0,0, 12,0,3, 15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0, 10,0 }; static _pbval[26] = { 1, 2|(1«( '-,?'))|(1«(,?'-?'))> 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«1 1, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22, 1«23, 1«24, K^S K^'E'-'A^KK^'Q'-'A1)) }; main(ac, av) int ac; char *av[]; { prog = av[0]; if (ac != 3) { fprintfltstderr^usage: %s filel file2\n", prog); fprintf(stderr,"where filel and file2 are two dna or two protein sequences.Xn"); fprintfl stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintfl[stderr,"Any lines beginning with ';' or '< are ignoredW'); fprintfístderr, ' utput is in the file \"align.out\"\n"); exit(l); } namex[0] = av[l]; namexfl] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqx[l] = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? .dbval : jsbval; endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = "align.out"; /* output file */ nw(); /* fíll in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ print(); /* print stats, alignment */ cleanup(O); /* unlink any tmp files */} Tabla 1 (cont . ) /* do the alignment, return best score: main() * dna: valúes in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 valúes * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer * a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ nw() { char *px, *py; /* seqs and ptrs */ ínt ?ndely, *dely; /* keep track of dely */ int ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; /* for swapping rowO, rowl */ int mis; /* score for each type */ int insO, insl; /* ¡nsertion penalties */ register id; /* diagonal índex */ register ii; /* jmp index */ register ?colO, *coll; /* score for curr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs */ dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", lenO+lenl+1, sizeof(struct diag)); ndely = (int *)g_cal!oc("to get ndely", lenl+1, sizeof[¡nt)); dely = (¡nt *)g_calloc("to get dely", lenl+1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl+1, s¡zeof(int)); coll = (int *)g_calloc("to get coll", lenl+1, sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS1 : PINS1 ; smax = -10000; if (endgaps) { for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= lenl; yy++) { col0[yy] = delyfyy] = col0fy-l] - insl; ndely[y ] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for (yy = 1 ; yy <= lenl; yy++) delyfyy] = -insO; /* fill in match matrix ?/ for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */ if (endgaps) { ¡f (xx = 1) coll [0] = delx = -(insO+insl); else coll [0] = delx = col0[0] - insl; ndelx = xx; } else { coll [0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0; Tabla 1 (cont . ) ...nw seqx[l], yy = 1; yy <= lenl; py++, yy++) { mis = colO[yy-l]; if (dna) mis += (xbm[*px-'A']&xbm[*py-,A'])? DMAT : DMIS; else mis += _day[*px-'A'][*py-,A']; /* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongongdel * ignore MAXGAP if weighting endgaps */ if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) { if (coiofyy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1 ; } else { dely[yy] -= insl; ndely[yy]++; . . > } else { if (colO[yy] - (insO+insl) >= delyfyy]) { dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } else ndely[yy]++; } /? update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps || ndelx < MAXGAP) { if (coll [yy-l] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } else { delx -= insl; ndelx++; } else { if (coll [ y-l] - (insO+insl) >= delx) { delx = col l [yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1 ; } else ndelx++; /* pick the máximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely V id = xx - yy + lenl - 1; if (mis >= delx && mis >= dely[yy]) coll [yy] = mis; Tabla 1 (cont.) else if (delx >= dely[ ]) { col 1 [yy] = delx; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id); ^ ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset; offset -t= sizeof(struct jmp) + sizeof(offset); } } dx[id] jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = delx; } else { coll[yy] = dely[yy]; ij = dx[id].ijmp; 10 if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DI SO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset; offset += sizeof(struct jtnp) + sizeoffaffset); } } dx[id] jp.n[ij] = -ndelyfyy]; dx[id].jp.x[ij] = xx; 15 dx[id].score = delyfyy]; } if (xx = lenO && yy < lenl) { /* last col ?/ if (endgaps) colllyy] -= insO+insl*(lenl-yy); if (coll [yy] > smax) { smax = coll[yy]; dmax = id; } } ^ ?Ow * if (endgaps && xx < lenO) coll [yy-1] -= insO+insl *(lenO-xx); if (coll [yy-l] > smax) { smax = coll [yy-1]; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)col0); (void) free((char *)coü); } 25 Tabla 1 (cont.) /* * print() - only routine visible outside this module * static: * getmatO - trace back best path, count matches: print() * pr_align()— print alignment of described in array pQ: print() * dumpblock() - dump a block of lines with numbers, stars: pr_align() * nums() - put out a number line: dumpblockO * putline()— put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblockQ * stars() - -put a line of stars: dumpblock() * stripnameO - strip any path and prefix lirom a seqname */ flinclude "nw.h" «define SPC #define P_LrNE /* máximum output line */ tfdefme P SPC /* space between name or num and seq V extern _day[26][26]; ¡nt olen; /* set output line length */ FILE •fie; /* output file */ print() print int Ix, ly, firstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) = 0) { fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup(l); ) fprintfl[fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[l], lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl ; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl - 1) { /? leading gap in x */ pp[0].spc = firstgap = lenl - dmax - 1; ly -= pp[0].spc; } else if (dmax > lenl - 1) { /* leading gap in y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl - 1); lx -= pp[l].spc; } if (dmaxO < lenO - 1 ) { /* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO -1 ; lx -= lastgap; else if (dmaxO > lenO - 1 ) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO - 1); ly -= lastgap; } getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr_alignQ; } Tabla 1 (cont.) /* * trace back the best path, count matches */ static getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) getmat int Ix, ly; /* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap */ int nm, ¡0, il, sizO, sizl; char outx[32]; double pct; register nO, ni; register char *pO,*Pl; /* get total matches, score */ iO = il = sizO = sizl =0; pO = seqx[0] + pp[l].spc; pl = seqx[l] + pp[0].spc; nO = ppflj.spc + 1; ni = pp[0].spc + 1; nm = 0; while(*pO&&*pl ){ if(sizO) { pl++; nl++; sizO-; } else ¡f (sizl) { p0++; n0++; sizl- } else { if (xbm[*pO-,A,]&xbm[*pl-'A']) nm++; ¡f(nO++ = pp[0].x[iO]) sizO = pp[0].n[iO++]; if(nl++ = pp[l].x[il]) sizl = pp[l].n[il++]; p0++; pl++; } /* pct homology: * if penalizing endgaps, base is the shorter seq * else, knock off overhangs and take shorter core */ if (endgaps) lx = (lenO<lenl)? Ien0:lenl; else lx = (lx<ly)? ix : ly; pct= 100.*(double)nm/(double)lx; fprintf(fx, "\n"); fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n", nm, (nm= 1)? "" : "es", lx, pct); Tabla 1 (cont.) fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ...getmat if (gapx) { (void) sprintffautx, " (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx = 1)? "":"s"); fprintfl(fx,"%s", outx); fprintf(fx, ", gaps in second sequence: %d", gapy); ¡f (gapy) { (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base":"res¡due", (ngapy = 1)? "":"s"); fprintfifx/Tos", outx); } ¡f (dna) fprinrf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); else fprintf(fx, "\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)\n", smax, PINSO, PINS1); ¡f (endgaps) fprintf(fx, "<endgaps penalized. left endgap: %d %s%s, right endgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna)? "base" : "residue", (firstgap = 1)? "" : "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap = 1)? "" : "s"); else fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n"); } static nm; /* matches in core— for checking */ static lmax; /* lengths of stripped file ñames */ static ij[2]; /* jmp índex for a path */ static nc[2]; /* number at start of current line */ static ni[2]; /* current elem number— for gapping */ static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr to current element */ static char *P°[2]; /* ptr to next output char slot */ static char out[2][P_LINE]; /* output line */ static char star[P_LINE]; /? set by stars() */ /* * print alignment of described in struct path pp[] »/ static pr_align() pr align { int nn; /* char count */ int more; register 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = l ; ni[i] = l; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = seqx[i]; po[i] = out[i]; Tabla 1 (cont . ) for (nn = nm = 0, more = 1 ; more; ) { ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) { /* * do we have more of this sequence? */ ¡f (!*ps[i]) continué; more++; if (pp[i].spc) { /* leading space */ ?po[i]++ = "; pp[i].spc~; } else if (siz[i]) { /* in a gap */ *po[i]-H- = '-'; siz[i]--; } else { /* we're putting a seq element */ *po[i] = *ps[i]; if (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /* * are we at next gap for this seq? ?/ if (ni[i] = pp[i].x[ij[i]]) { /? * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i] = pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i] = pp[i] x[ij[i]]) siz[i] += pp[i].n[¡j[i]++]; } ni[i]++; } } if (++nn = olen [| !more && nn) { dumpblock(); for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i]; nn = 0; } 1 } /* * dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */ static dumpbiocko dumpblock { register i; for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]-- = W; Tabla 1 (cont.) .dumpMock (void) putcC\n', fie); for (i = 0; i < 2; i-H-) { if (*out[¡] && (*out[i] != " II *(po[i]) if(¡— 0) nums(i); if (i = 0 && *out[l]) starsO; putline(i); if(i = 0&& *out[l]) fprintf(fx, star); if(i=l) nums(i); } } } /* * put out a number line: dumpblock() ?/ static nums(ix) numis int ix; /* index in outQ holding seq line */ { char nline[P_LINE]; register i,j; register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) •pn-"; for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py-H-, pn++) { if(*py = "||*py = '-') else { ¡f (¡%10 = 0 II (i = 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i<0)?-i:i; for (px = pn; j; j /= 10, px~) *px=j%10 + '0'; if(i<0) *px = } else *pn- , } } *pn = '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fix); (void) putcCXn', fx); } /* * put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock() */ static putline(ix) puíline int ix; Tabla 1 (cont.) int i; register char *px; for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != px++, i++) (void) putc(*px, fx); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc(' ', fx); I* these count from 1 : * niQ is current element (from ]) * ncfj is number at start of current line ?/ for (px = outfjx]; *px; px++) (void) putc(*px&0x7F, fx); (void) putcC\n', fx); /? * put a line of stars (seqs always in out[0], out[l]): dumpblock() */ static stareO Stars { int i; register char *p0, *pl, ex, *px; if (!*out[0] || (*out[0] = ' ' && »(po[0]) = ") || !»out[l] || (»out[)] = " &.&. »(po[l]) = ' ')) return; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i; ¡~) *px++ = ' '; for (pO = out[0], p] = out[1]; *p0 && *pl; p0++, pl++) { ¦f (isalp a(*pO) && isalpha(*pl)) { if (xbmPpO-'A'J&xbmPp A']) { ex = '*'; nrn-H-; } else if (!dna && _day[»pO-'A,][*pl-'A'] > 0) ex = V; else ex = "; } else ex = "; ?px++ = ex; } *px++ = V; *px = W; } /' * strip path or prefix from pn, return len: pr_alignO ·/ static stripnamc(pn) Stripnamc char *pn; /* file ñame (tnay be path) */ { register char ·??, *py; py = 0; for (px = pn; »px; px++) if(*px = 7) py = px + l ; ¡f (py) (void) slrcpyfpn, py); return(strlen(pn)); Tabla 1 (cont.) /* * cleanupO -- cleanup any tmp file * getseqO - read in seq, set dna, len, maxlen * g_calloc()— calloc() with error checkin * readjmps()— get the good jmps, from tmp file if necessary * writejmps()— write a filled array of jmps to a tmp file: nw() */ tfinclude "nw.h" #¡nclude <sys/file.h> char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */ FILE *fj; int cleanupO; /* cleanup tmp file */ long lseek(); /* * remove any tmp file if we blow ?/ cleanup(i) cleanup int { if (fj) (void) unlink(jname); exit(i); } /* * read, retum ptr to seq, set dna, len, maxlen * skip lines starting with ';', '<', or '>' * seq in upper or lower case ?/ char * getseq(file, len) getseq char *file; /* file ñame */ int *len; /* seq len */ { char line
[1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; if ((fp = fopen(file,"r")) = 0) { fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit(l); } tlen = natgc = 0; while (fgets()ine, 1024, fp)) { if (*line = ';' ||?line = ,<' || *line = *>') continué; for (px = line; *px != W; px++) if (isupper(*px) || islower(*px)) tlen++; } if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) = 0) { fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6, file); exit(l ); } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; Tabla 1 (cont.) ...getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line = ';' || *line = ·<' || *line = '>') continué; for (px = line; *px != '\?'; px++) { if (isupper(*px)) *py++ = *px; else if (islower(*px)) *py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU\*(py-l))) natgc++; } } *py++ = '\0'; *py = '\0'; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen 3); return(pseq+4); } char * g_calloc(msg, nx, sz) char *msg; /* program, calling routine */ int nx, sz; /* number and size of elemente { char *px, *calloc(); if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) = 0) { if (*msg) { fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog, msg, nx, sz); exit(l); } } return(px); * get final jmps from dxQ or tmp file, set pp[], reset dmax: main() */ readjmpsO { int fd = -l ; int siz, ¡0, il ; register i, j, xx; (void) fclose(fj); if ((fd = openGname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup(l); } ) for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { while (1) { for (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] > Tabla 1 (cont.) ...readjmps if 0 < 0 && dx[dmax].offset && fj) { (void) lseek(fd, dx[dmax]. offset, 0); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax], offset, s¡zeof(dx[dmax]. offset)); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-l; } else 5 break; } if(i>=JMPS){ fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignment\n", prog); cleanup(l); } if0>=0){ siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz; if (siz < 0) { /* gap in second seq */ pp[l].n[il] = -siz; xx += siz; ¦|Q /* id = xx-yy + lenl - 1 */ pp[l].x[il] =xx - dmax + lenl - 1; gapy++; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps * siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; il++; } else if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[0].n[i0] = siz; pp[0].x[i0] =xx; gapx++; . _ ngapx += siz; ^ /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; ¡0++; } } else break; } /* reverse the order of jmps */ for 0 = 0, iO»; j < ¡0; j++, i0~) { i = pP[0].n[j]; pp[0].n[j] = PP[0].n[i0]; PP[0].n[i0] = i; i = PP[0].x[j]; PP[0].x[j] = PP[0].x[i0]; Pp[0].x[i0] = i; 20 } for(j = 0,il--;j<il;j++,il-){ i = PP[l].nD]; pp[l].nU] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] = i; i = pp[i].xD]; pp[i]xül = PP[i]x[ii]; ??[1].?[»] = ¡; } if(fd>=0) (void) close(fd); »(fj){ (void) unlink(jname); fj = 0; offset = 0; } } 25 Tabla 1 (cont.) /* * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw() ?/ writejmps(ix) Wlítejmps int ix; { char *mktemp(); ¡f (!f)) { if (mktempfjname) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, jname); cleanup(l); } if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) { fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname); exit(l); } } (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj); (void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj); Tabla 2 TAHO xxxxxxxxxxxxxxx (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de XXXXYYYYYYY (Longitud = 12 comparación aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácido que coinciden en forma idéntica entre las dos secuencias de polipéptidos según se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácido del polipéptido TAHO) = 5 dividido entre 15 = 33.3%.
Tabla 3 TAHO XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 comparación aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácido que coinciden en forma idéntica entre las dos secuencias de polipéptidos según se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácido del polipéptido TAHO) = 5 dividido entre 10 = 50%.
Tabla 4 TAHO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de nucleótidos que coinciden en forma idéntica entre las dos secuencias de ácido nucleico según se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico TAHO-DNA) = 6 dividido entre 14 = 42.9%.
Tabla 5 TAHO-DNA NI n n n FN N N (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de comparación NNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de nucleótidos que coinciden en forma idéntica entre las dos secuencias de ácido nucleico según se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico TAHO-DNA) = 4 dividido entre 12 = 33.3%.
II . Composiciones y Métodos de la invención A. Anticuerpos Anti-TAHO En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAHO que pueden encontrar uso en la presente como agentes terapéuticos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales , humanizados, biespecíficos y heteroconjugados . 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se producen preferiblemente en animales por inyecciones subcutáneas múltiples (se) o intraperitoneales (ip) de antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) a una proteína que es inmunogénica en especies a inmunizarse. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse a hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de fríjol de soya, usando un agente derivador o bifuncional, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilo succinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos , o derivados al combinar, por ejemplo, 100 ig o 5 \ig de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y se inyecta la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después, los animales se estimulan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. Siete a 14 días después, los animales se hacen sangrar y el suero se evalúa para concentración de anticuerpo. Los animales se estimulan hasta el plano de concentración. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También los agentes de agregado tales como alúmina se usan apropiadamente para aumentar la respuesta inmune. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al . , Nature , 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (patente E.U.A. No. 4,816,567).
En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe arriba para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y luego se fusionan con una línea de célula de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) .
Las células de hibridoma de esta manera preparadas se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo apropiada cuyo medio contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras, no fusionadas (también referidas como compañeros de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para las hibridomas típicamente incluyen hipoxantinas, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT .
Las células de mieloma de compañero de fusión preferidas son aquellos que se fusionan eficientemente, producción de alto nivel estable al soporte de anticuerpo por células que producen anticuerpos seleccionadas, y son sensibles al medio selectivo que selecciona contra las células precursoras no fusionadas. Las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponible del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles del American Type Culture Collection, anassas, Virginia, EUA. Las líneas de célula de heteromieloma de ratón-humano y de mieloma humano se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984) y Brodeur et al., Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications , p . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en que las células de hibridoma crecen se evalúa para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, el enlace de especificidad de anticuerpos monoclonales producidos por células se determina por inmunoprecipitación o por ensaio de enlace in vitro, tales como radioinmunoensaio (RIA) o ensaio inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) .
La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980).
Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitantes y hacerse crecer por métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascites en un animal por ejemplo, por inyección i.p. de las células en ratones .
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados apropiadamente de los medios de cultivos, fluidos de ascites, o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o sefarosa-proteína G) o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla y procesa en secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales son luego transfectados en células hospederas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluye Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs . 130:151-188 (1992).
En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las colecciones de fago de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humano, respectivamente, usando colecciones de fago. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por combinado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir colecciones de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hidridoma monoclonal de anticuerpo tradicional para aislar de anticuerpos monoclonales .
El ADN que codifica para el anticuerpo se puede modificar para producir polipéptidos de anticuerpos de fusión o quiméricos, por ejemplo, al sustituir secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera (CH y CL) para las secuencias de murino homologas (patente E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por la fusión de la secuencia de codificación de inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia codificada para un polipéptido sin inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . La secuencia de polipéptido sin inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios de variantes de un sitio que combina el antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina el antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio que combina el antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados Los anticuerpos anti-TAHO de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobuli a o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab' , F(ab' )2 u otras subsecuencias enlazadas al antígeno de anticuerpos) las cuales contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región determinada complementaria (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos los cuales ni se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR correspondientes a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR, son aquellos de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente que de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992)].
Los métodos para anticuerpos no humanos humanizados son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en desde una superficie en la cual no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos a menudo son referidos como residuos "importantes", los cuales se toman típicamente desde un dominio variable "importante" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir los roedores CDR o secuencia CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados son anticuerpos quiméricos (patente E.U.A. No. 4,816,567), en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto se sustituyen por la secuencia correspondiente de una especia no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales los residuos de CDR y posiblemente los residuos de algo de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de dominios variables humanos, ambos ligeros y pesados puede usarse en hacer los anticuerpos humanizados muy importantes para reducir la antigenicidad y respuesta al HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando el anticuerpo se intenta para el uso terapéutico humano. En consecuencia el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se separar por exclusión contra la colección completa de las secuencias de dominio variable humano conocido. La secuencia de dominio V humano la cual es más cercana a la del roedor identificada y la región de estructura humana (FR) dentro de esta se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método usa una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede usarse para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Es además importante que los anticuerpos humanizados con retención de afinidad de enlace alta para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para llevar a cabo esta meta, de conformidad a un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellos de habilidad en la técnica. Los programas de computadora son disponibles los cuales ilustran y exhiben probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del papel similar de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de los residuos que influye en la habilidad de la inmunoglobulina candidata que se enlaza a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias recipientes e importantes de manera que se alcancen la característica del anticuerpo deseada, tal como el incremento de afinidad para los antígenos objetivos. En general, los residuos de la región hipervariable se dirigen y más substancialmente se involucran en el enlace del antígeno influenciado.
Se contemplan diversas formas de un anticuerpo anti-TAHO humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento del anticuerpo, tal como un Fab, el cual es conjugado opcionalmente con uno o más agentes de citotoxicidad con objeto de generar un inmunocon ugado . Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto.
Como una alternativa para la humanización, los anticuerpos humanos pueden generarse. Por ejemplo, esto es posibles ahora para producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, durante la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, esto se describe que la eliminación homocigoto del gen de región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en resultados de ratones mutantes quiméricos y línea reproductora en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la configuración del gen de inmunoglobulina de la línea reproductora humana en tales ratones mutantes de línea reproductora la cual resulta en la producción de anticuerpos humanos durante el intercambio de antígenos. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno . 7:33 (1993); patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807 y O 97/17852.
Alternativamente, la tecnología de despliegue de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553
[1990]) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de las propiedades del gen de dominio (V) variable de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. En consecuencia a esta técnica, los genes de dominio V del anticuerpo se clonan en la forma ya sea un gen de proteína de recubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos del anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpos también resultan en la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe estas propiedades. Así, algunos de los fagos imitan algunas de las propiedades de la célula B. El fago exhibido puede llevarse a cabo en una variedad de formatos, revisadas en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fuentes de los segmentos del gen V pueden usarse para exhibir el fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aisla una configuración diversas de anticuerpos anti-oxazolona de una colección combinatoria aleatoria pequeña de los genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humano no inmunizados pueden construirse y los anticuerpos para una configuración de antígenos (incluyendo los mismo antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J . 12:725-734 (1993). Ver también, patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905.
Como se discute arriba, los anticuerpos humanos pueden también generarse por células B activadas in vitro (ver, patentes de E.U.A. 5,567,610 y 5,229,275). 4. Fragmentos de anticuerpo En ciertas circunstancias hai ventajas para usar fragmentos del anticuerpo, en vez de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una depuración rápida y puede llevar a un acceso mejorado a tumores sólidos.
Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivan por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora producirse directamente por células hospederas recombinantes . Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv puede todos expresarse en y secretarse de E. coli, así se permite la facilidad de producción de cantidades grandes de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las colecciones de fago del anticuerpo discutidas arriba. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden recubrirse directamente de E. coli y químicamente acoplarse para formar los fragmentos F(ab' )2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab' )2 pueden aislarse directamente de cultivo de célula hospedera recombinante . El fragmento Fab y F(ab' )2 con incremento de la vida media in vivo que comprende los residuos de epítope de enlace del receptor de rescate se describe en la patente de E.U.A. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpos deberán ser aparentes por el practicante habilidoso. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; patente de E.U.A. No. 5,571,894 y patente de E.U.A. No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que están libres de regiones constantes; así, estas son adecuadas para la reducción de enlace no específicos durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para producir la función de una proteína efectora en ya sea la terminal amino o carboxi de un sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, citado arriba. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de E.U.A. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos del anticuerpo lineal pueden ser monoespecífieos o biespecíficos . 5. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace por al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazarse a dos epítopes diferentes de una proteína IL-17A/F como se describe en la presente. Otros anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace UL-17A/F con un sitio de enlace por otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-TAHO puede combinarse con un brazo el cual enlaza a una molécula que dispara un leucocito tal como una molécula del receptor de célula T (por ejemplo, CD3) o receptor Fe para IgG (FcyR) , tal como Fc/RI (CD64) , FcyRII (CD32) y FCYRIII (CD16) , de manera que el mecanismo de defensa celular enfocado y localizado a la células expresa el IL-17A/F. Los anticuerpos biespecíficos pueden también usarse para localizar agentes citotóxicos a las células las cuales expresan IL-17A/F. Estoa anticuerpos poseen un brazo enlazado al IL-17A/F y un brazo el cual se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-ot, vinca alcaloide, cadena de ricina A, metotrexato o isótopo de hapteno radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2) .
WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRIII y la patente de E.U.A. No. 5,837,234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRI . Un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fca es conocido en WO98/02463. La patente de E.U.A. No. 5,821,337 enseña un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.
Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena de ligera-pesada de inmunoglobulina, en donde dos cadenas que tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de los cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual se lleva a cabo usualmente etapas de cromatografía de afinidad, es bastante problemática y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., E BO J. 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios combinados del antígeno-anticuerpo) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos una parte de las regiones de pivote, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. El ADN que codifica para las fusiones de la de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se inserta en los vectores de expresión separados y se co-transíectan en una célula hospedera adecuada. Esto proporciona maior flexibilidad en ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas del polipéptido se usan en la construcción proporcionando el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificadas para los dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión sencillo cuando la expresión de al menos dos cadenas del polipéptido en relaciones iguales resulta en rendimientos altos o cuando las relaciones no tienen efecto importante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada.
En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos bisespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una especificidad de enlace primaria en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina (proporcionando una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera de facilitar la separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos , ver Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de E.U.A. No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo pueden producirse por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas de aminoácido pequeñas de la interfaz de la molécula del anticuerpo primera se reemplaza con cadenas laterales grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar para las cadenas laterales grandes se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo por el reemplazo de cadenas laterales de aminoácido con unas más pequeñas (por ejemplo, alanita o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero durante otros productos finales no buscado tal como homodímeros .
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmunitarios a las células indeseables (patente E.U.A. No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse usando cualquier método conveniente de entrelazamiento. Los agentes de entrelazamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de entrelazamiento.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de los fragmentos de anticuerpos también se describen en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando ligadura química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se desdoblan proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab' )2- Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de formación de complejo, arsenita de sodio para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intramolecular. Los fragmentos Fab' generados luego se convierten a derivados de tionitrobenzoato (???) . Uno de los derivados de Fab' -TNB luego se reconvierte al Fab' -tiol por la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmunización selectiva de las enzimas.
Reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de los segmentos Fab' -SH del E. coli, los cuales pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp . Med. 175: 217-225 (1992) describe la producción de la molécula F(ab')2 del anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreta separadamente del E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado es capaz de enlazar a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como la actividad lítica que dispara linfocitos citotóxicos humanos contra objetivo de tumor de mama humana. Las técnicas diversas para hacer y aislar los fragmentos del anticuerpo biespecífico dirigidos de cultivo de célula recombinante también se describen. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se producen usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de gen. Los homodímeros del anticuerpos se reducen ala región finge para formar monómeros y luego se re-oxidizan para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método puede también utilizarse para la producción de homodímeros del anticuerpo. La tecnología de "dicuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) proporciona un mecanismo alternativo para hacer los fragmentos del anticuerpo biespecífico . Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL por una ligadura la cual es muy corta para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios de complementariedad VL y VH de otro fragmento, por ellos forman dos sitios de enlace al antígeno. Otra estrategia para hacer los fragmentos del anticuerpo biespecífieos para el uso de los dímeros de la cadena sencilla Fv (sFv) también se reportan. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Los anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecíficos pueden prepararse. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 6. Anticuerpos heterocon ugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente . Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para dirigir células del sistema inmunitarios objetivo a células no deseadas [patente de E.U.A. 4,676,980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360; O 92/2003737; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de la proteína sintética, incluyendo involucrar agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o por formar un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,676,980. 7. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo divalente por una célula que expresa un antígeno en el cual el anticuerpo se enlaza. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (los cuales son diferentes de las clases IgM) con tres o más sitios de enlace al antígeno (por ejemplo, anticuerpo tetravalentes) , los cuales pueden producirse fácilmente por la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica para la cadenas del polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace del antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo deberá comprende una región Fe y tres o más sitios de enlace al antígeno de terminal amino en la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres o hasta alrededor de ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de enlace al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos cadenas de polipéptido) , en donde las cadenas del polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, las cadenas del polipéptido pueden comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, las cadenas del polipéptido pueden comprender: cadena de región VH-CH1-Fc ligada al VH-CH1-flexible; o cadena de región VH-CH1-VH-CH1-Fc . El anticuerpo multivalente en la presente preferiblemente además comprende al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede, por ejemplo, comprende alrededor de dos hasta alrededor de ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente , además comprenden un dominio CL. 8. Ingeniería de la Función Efectora Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, a fin de aumentar la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede alcanzar al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente , los residuos de cisteína se pueden introducir en la región Fe, lo que permitirá formación de enlace de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una mejor capacidad de internalización y/o aumento de la eliminación celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J . Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con aumento de la actividad anti-tumor se pueden también preparar usando enlaces cruzados heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser de ingeniería la cual tiene regiones Fe dobles y puede por lo tanto tener maior complemento de lisis y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cáncer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar la vida media de suero del anticuerpo, se puede incorporar un receptor de salvamento enlazado al epítope en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describió en la patente de E.U.A. 5,739,277, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término "receptor de salvamento enlazado al epítope" se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi( IgG2/ IgG3, o IgG4) que es responsable del aumento de la vida media de suero in vivo de la molécula IgG. 9. Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados (llamados indistintamente "conjugados anticuerpo-fármaco" o "ADCs" ) que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de bacterias, hongos, planta, u origen animal, o fragmentos del mismo) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) .
En ciertas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos del mismo que se pueden usar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazados de toxina de difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena abrina A, cadena modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos de radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re . Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como propionato de N-succinimidil-3 - (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL) , ésteres activos (tal como suberato de disucinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoilo) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describió en Vitetta et al., Science, 238 : 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como una caliqueamicina, maitansinoides , un tricoteno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente.
Inmunoconjugados ejemplares - conjugados anticuerpo-fármaco Un inmunoconjugados (o "conjugado anticuerpo-fármaco" ( "ADC" ) ) de la invención puede tener la fórmula I, abajo, en donde un anticuerpo es conjugado (es decir, unido covalentemente) a una o más porciones de fármaco (D) a través de un enlazador opcional (L) . Los ADCs pueden incluir conjugados thioMab ( "TDC" ) .
Ab-(L-D)p I En consecuencia, el anticuerpo puede ser conjugado al fármaco ya sea directamente o por medio de un enlazador. En la fórmula I, p es el número promedio de porciones de fármaco por anticuerpo, el cual puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 a alrededor de 20 porciones de fármaco por anticuerpo, y en ciertas modalidades, de 1 a aproximadamente 8 porciones de fármaco por anticuerpo.
La invención incluye una composición que comprende una mezcla de compuestos anticuerpo- fármaco de la fórmula I en donde la carga de fármaco promedio por anticuerpo es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o alrededor de 3 a alrededor de 4. a. Enlazadores ejemplares Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Los componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproilo ( " C" ) , maleimidopropanoilo ( "MP" ) , valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB"), y aquellos que resultan de la conjugación con reactivos enlazadores: 4- (2-piridiltio) entanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano- 1 carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC") y (4-yodo-acetil) aminobenzoato de N-succinimidilo ("SIAB"). Se conocen en la técnica varios componentes enlazadores, algunos de los cuales se describen abajo.
Un enlazador puede ser un "enlazador cortable" , que facilite la liberación de un fármaco en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil a ácido (por ejemplo, hidrazina) , enlazador sensible a proteasa (por ejemplo, sensible a peptidasa) , enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., C ncer Research 52:127-131 (1992); patente de E.U.A. No. 5,208,020) puede ser usado .
En ciertas modalidades, un enlazador es como el mostrado en la siguiente fórmula II: en donde A es una unidad extensora, y a es un entero de 0 a 1 ; es una unidad de aminoácido, y w es un entero de 0 a 12; Y es una unidad separadora, y y es O, l ó 2; y Ab, D y se definen como arriba para la fórmula I. Modalidades ejemplares de estos enlazadores se describen en US 2005-0238649 Al, la cual se incorpora expresamente en la presente a manera de referencia .
En algunas modalidades, un componente enlazador puede comprender una "unidad extensora" que enlace un anticuerpo a otro componente enlazador o a una porción de fármaco. Las unidades extensoras ejemplares se muestran abajo (en donde la línea ondulada indica sitios de fijación covalente a un anticuerpo) : MP En algunas modalidades, un componente enlazador puede incluir una unidad de aminoácidos. En una modalidad tal, la unidad de aminoácidos permite la ruptura del enlazador por una proteasa, lo que facilita la liberación del fármaco del inmunoconjugado después de la exposición a proteasas intracelulares , como las enzimas lisosomales. Véase, por ejemplo, Doronina et al. (2003) Nat . Biotechnol . 21:778-784. Ejemplos de unidades de aminoácidos incluyen, pero no limitado a, un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, y un pentapéptido . Dipéptidos ejemplares son: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) ; fenilalanina-lisina (fk o phe-lys) ; o N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit) . Ejemplar tripéptidos son: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y la glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Una unidad de aminoácidos puede incluir residuos de aminoácidos que ocurran naturalmente, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos no de origen natural, tales como citrulina. Las unidades de aminoácidos puede ser diseñadas y optimizadas en su selectividad para la ruptura enzimática por una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, a catepsina B, C y D, o una plasmina proteasa.
En algunas modalidades, un componente enlazador puede comprender una unidad "separadora" que enlace el anticuerpo a una porción de fármaco, ya sea directamente o a través de una unidad extensora y/o una unidad de aminoácidos. Una unidad separadora puede ser de "auto- inmolación" o "no de autoinmolación" . Una unidad separadora "no de autoinmolación" es una en la que parte o la totalidad de la unidad separadora permanezca unida a la porción de fármaco después del corte enzimático (por ejemplo, proteolítico) del ADC. Ejemplos de unidades separadoras no de autoinmolación incluyen, pero no están limitados a, una unidad separadora de glicina y una unidad separadora de glicina-glicina. Otras combinaciones de separadores peptídicos susceptibles al corte enzimático específico de secuencia también se contemplan. Por ejemplo, el corte enzimático de un ADC que contenga una unidad separadora glicina-glicina por un proteasa asociada a células tumorales daría lugar a la liberación de una porción de fármaco de glicina-glicina del resto del ADC. En una modalidad tal, la porción de fármaco glicina-glicina se somete luego a una fase de hidrólisis separada en la célula tumoral, de esta manera cortando la unidad separadora glicina-glicina a partir de la porción de fármaco.
Una unidad separadora de "auto- inmolación" permite la liberación de la porción de fármaco sin una etapa de hidrólisis separada. En ciertas modalidades, una unidad separadora de un enlazador comprende una unidad p-aminobencilo . En una modalidad tal, un alcohol p-aminobencílico es unido a una unidad de aminoácidos a través de un enlace de amida, y un carbamato, metilcarbamato o carbonato se hace entre el alcohol bencílico y un agente citotóxico. Véase, por ejemplo, Hamann et al., (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. En una modalidad, la unidad separadora es p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) . En ciertas modalidades, la porción fenileno de una unidad p-amino bencilo está sustituida con Qm, donde Q es -alquilo de Ci-C8, -0- (alquilo de Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano, y m es un entero que varía de 0-4. Ejemplos de unidades separadoras de auto-inmolación incluyen además, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares a alcohol p-aminobencílico (véase, por ejemplo, US 2005/0256030 Al), tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hai et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett . 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales . Pueden usarse separadores que sufran varios ciclos después de la hidrólisis de enlaces de amida, tales como amidas de ácido 4 -aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223); sistemas de anillos biciclo [2.2.1] y biciclo [2,2.2] debidamente sustituidos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc . , 1972, 94, 5815), y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867) . La eliminación de fármacos que contienen amina que son sustituidos en la posición a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) son también ejemplos de separadores de auto- inmolación útiles en ADCs .
En una modalidad, una unidad separadora es una unidad bis (hidroximetil) estireno (BHMS) ramificada como la descrita a continuación, que puede ser usada para incorporar y liberar varios f rmacos . corte enzimático 2 fármacos en donde Q es -alquilo de Ci-C8, -O- (alquilo de Ci-C8) , halógeno, -nitro o -ciano m es un entero que varía de 0-4, n es 0 ó 1 y p varía de 1 a aproximadamente 20.
En otra modalidad, el enlazador L puede ser un enlazador tipo dendrítico para la unión covalente de más de una porción de fármaco a través de una porción enlazadora multifuncional y de ramificación a un anticuerpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la proporción molar de fármaco a anticuerpo, es decir, carga, que se relaciona con la potencia del ADC. Así pues, cuando un anticuerpo manipulado con cisteína porta sólo un grupo tiol reactivo con cisteína, una multitud de porciones de fármaco pueden ser unidas a través de un enlazador dendrítico.
Ejemplos de componentes enlazadores y combinaciones de los mismos se muestran a continuación en el contexto de ADCs de la fórmula II: MC-val-cit-PAB Los componentes enlazadores, incluyendo las unidades extensoras, separadoras y de aminoácidos, pueden ser sintetizados mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en US 2005-0238649 Al. b. Porciones de Fármaco Ejemplares (1) Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas maitansinoide. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló primero del arbusto de Africa oriental Maitenus serrata (patente de E.U.A. No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y ásteres C-3 maitansinol (patente de E.U.A. No. 4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
Las porciones de fármaco maitansinoides son porciones de fármaco atractivas en conjugados anticuerpo-fármaco toda vez que son: (i) relativamente accesibles de preparar mediante fermentación o modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) susceptibles de derivación con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de enlazadores no de disulfuro a anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) efectivos contra una variedad de líneas de células tumorales .
Los compuestos de maitansina adecuados para usarse como porciones de fármaco maitansinoides se conocen bien en la técnica, y pueden ser aislados de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o producidos usando técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973) . Maitansinol y análogos de maitansinol pueden ser también preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
Las porciones de fármaco maitansinoides ejemplares incluyen aquellas que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-descloro (patente de E.U.A. No. 4,256,746) (preparado mediante reducción con hidruro de litio aluminio de ansamitocina P2) ; C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) +/-C-19-descloro (patentes de E.U.A. Nos. 4,361,650 y 4,307,016) (preparado mediante desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH) ; y C-20-desmetoxi , C-20-aciloxi (-OCOR) , +/-descloro (patente de E.U.A. No. 4,294,757) (prepardo mediante acilación usando cloruros de acilo) , y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones.
Las porciones de fármaco maitansinoides ejemplares también incluyen aquellas que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (patente de E.U.A. No. 4,424,219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5) ; C-14- alcoximetil (desmetoxi/CH2OR) (US 4,331,598); C-14-hidroximetil o aciloximetil (CH2OH o CH2OAc) (patente de E.U.A. No. 4,450,254) (preparado a partir de Nocardia) ; C-15-hidroxi/aciloxi (US 4,364,866) (preparado mediante ' la conversión de maitansinol por Streptomyces) ; C-15-metoxi (patente de E.U.A. Nos. 4,313,946 y 4,351,929) (aislado de Trewia nudflora) ; C-18-N-desmetil (patente de E.U.A. Nos. 4,362,663 y 4,322,348) (preparado mediante la desmetilación de maitansinol por Streptomyces) y 4,5-desoxi (US 4,371,533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tetracloruro de titanio/LAH) .
Muchas posiciones en compuestos de maitansina se conocen como útiles como la posición de enlace, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, para formar un enlace de éster, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo son todas adecuadas.
Las porciones de fármaco maitansinoides incluyen aquellas que tienen la estructura en donde la línea ondulda indica la fijación covalente del átomo de azufre de la porción de fármaco maitansinoide a un enlazador de un ADC. R puede ser independientemente H o un alquilo de Ci-C6. La cadena alquileno que fija el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2 ó 3 (US 633,410; US 5,208,020; Chari et al (1992) Cáncer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc . Nati. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
Todos los estereoisómeros de la porción de fármaco maitansinoide se contemplan para los compuestos de la invención, es decir, cualquier combinación de configuraciones R y S en los carbonos quirales de D. En una modalidad, la porción de fármaco maitansinoide tendrá la siguiente estereoquímica : Modalidades ejemplares de porciones de fármaco maitansinoides incluyen: DM1 ; DM3 y DM4, que tienen las estructuras : ??? en donde la línea ondulda indica la fijación covalente del átomo de azufre del fármaco a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco . (WO 2005/037992; US 2005/0276812 Al) .
Otros conjugados anticuerpo-f rmaco maitansinoides tienen las siguienets estructuras y abreviaturas (en donde Ab es anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8) : Ab-SMCC-DMl Conjugados anticuerpo-fármaco ejemplares en donde DM1 es enlazado a través de un enlazador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y abreviatura: en donde Ab es anticuerpo; n es O, 1 ó 2; y p es 1, 2, 3 ó 4.
Los maitansinoides , como DM1, son inhibidores mitótoticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulinas. La maitansina fue aislada por primera vez del arbusto del este de África aytenus serrata (patente de E.U.A. No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, como maitansinol y C-3 ésteres de maitansinol (patente de E.U.A. No. 4,151,042). Maitansinol sintético y derivados y sus análogos se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A.
Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663 y 4,371,533, las descripciones de las cuales están expresamente incorporados por referencia.
En un intento por mejorar su índice terapéutico, maitansina y maitansinoides se han conjugado con anticuerpos de unión específica a antígenos de células tumorales . Inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se dan a conocer, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,208,020, 5,416,064 y patente europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales están expresamente incorporados por referencia.
Los conjugados anticuerpo anti-TAHO-maitansinoide se preparan al enlazar químicamente un anticuerpo anti-TAHO a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de cualquiera del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,208,020 (la descripción de la cual se incorpora expresamente a manera de referencia) . Los maitansinoides pueden ser sintetizados por técnicas conocidas o aislados de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones no de patente mencionadas en la presente anteriormente, tales como maitansinoides que son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.
Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para la fabricación de conjugados anticuerpo-maitansinoide , incluyendo, por ejemplo, los que se describen en la patente de E.U.A. No. 5,208,020, o la patente EP 0 425 235 Bl, y Chari et al, Cáncer Research 52:127-131 (1992) y US 2005/016993 Al, las descripciones de las cuales están expresamente incorporados por referencia. Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC se pueden preparar como se revela en US 2005/.0276812 Al, "Conjugados anticuerpo-fármaco y métodos". Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, como se revela en las patentes identificadas arriba. Enlazadores adicionales se describen y ejemplifican en la presente.
Conjugados del anticuerpo y maitansinoide se pueden hacer utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) ropionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (II), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutareldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- ( 2 -piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737
[1978]), sulfosuccinimidil maleimidometil ciclohexano carboxilato (SMCC) y N-succinimidil-4- ( 2 -piridiltio) pentanoato (SPP) para establecer un enlace de disulfuro. Otros enlazadores útiles incluyen cys-MC-vc-PAB (reactivo enlazador de dipéptido de valina-citrulina (ve) que tiene un componente maleimida y un componente de auto- inmolación de para-aminobencilcarbamoilo (PAB) .
El enlazador puede fijarse a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hirdoximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. (2) Auristatinas y dolastatinas En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a dolastatina o un análogo o derivado peptídico de dolastatina, por ejemplo, una auristatina (patentes de E.U.A. Nos. 5635483, 5780588) . Las dolastatinas y auristatinas han demostrado que interfieren con la dinámica de los microtúbulos , la hidrólisis de GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob . Agents and Chemother. 45 (12) : 3580-3584) y tienen actividad anticáncer (patente de E.U.A. No. 5663149) y antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción de fármaco de dolastatina o auristatina puede ser unida al anticuerpo a través de la terminal N (amino) o la terminal C (carboxilo) de la porción de fármaco peptídica (WO 02/088172) .
Modalidades ejemplares de auristatina incluyen las porciones de fármaco de monometilauristatina enlazadas a la terminal N DE y DF, divulgadas en Senter et al, Proceedings of the American Association for Cáncer Research, Volumen 45, Número de Resumen 623, presentada el 28 de marzo de 2004, (US 2005/0238649, cuya divulgación está expresamente incorporada por referencia en su totalidad) .
Una porción de fármaco peptídica puede ser seleccionada de las fórmulas DE y DF a continuación: en donde la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente de un anticuerpo o componente enlazador de anticuerpo, y de manera independiente en cada lugar: R2 se selecciona de H y alquilo de Ci-C8; R3 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil-arilo de Ci-C8, alquilo de Ci-C8- (carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquilo de C!-C8- (heterociclo de C3-C8) ; R4 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil-arilo de Ci-C8, alquilo de Ci-C8- (carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquilo de Ci-C8- (heterociclo de C3-C8) ; R5 se selecciona de H y metilo; o R4 y R5 conjuntamente forman un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente de H, alquilo de Ci-C8 y carbociclo de C3-C8 y n se selecciona de 2 , 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona de H y alquilo de Ci-C8; R7 se selecciona de H, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8, arilo, alquil-arilo de Ci-C8, alquilo de Ci-C8-(carbociclo de C3-C8) , heterociclo de C3-C8 y alquilo de Ci-C8-(heterociclo de C3-C8) ; cada R8 se selecciona independientemente de H, OH, alquilo de Ci-C8, carbociclo de C3-C8 y 0- (alquilo de Ci-C8) ; R9 se selecciona de H y alquilo de C!-C8; R10 se selecciona de arilo o heterociclo de C3-C8; Z es 0, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo de Cx-Cs; R11 se selecciona de H, alquilo de Ci-C2o, arilo, heterociclo de C3-C8, - (R130) m-R14 , o - (R130) m-CH (R15) 2 ; m es un entero quería de 1-1000; R13 es alquilo de C2-C8; R14 es H o alquilo de Cx- Cacada aparición de R15 es independientemente H, COOH, - (CH2)n-N(R16)2, - (CH2)n-S03H o - (CH2) n-S03-alquilo de C!-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo de d-C8 O - (CH2)n-C00H; R18 se selecciona de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2- (heterociclo de C3-C8) y-C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo de C3-C8) ; y n es un entero que varía de 0 a 6.
En una modalidad, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H o metilo. En una modalidad ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
En otra modalidad más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
En otra modalidad más, cada vez que aparezca R8 es -OCH3.
En una modalidad ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En una modalidad, Z es -0- o -NH- .
En una modalidad, R10 es arilo.
En una modalidad ejemplar, R10 es -fenilo.
En una modalidad ejemplar, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En una modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en donde R15 es - (CH2) nN (R16) 2, y R16 es -alquilo de Ci-C8 o - (CH2)n-C00H.
En otra modalidad, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2/ en donde R15 es - (CH2) n-S03H.
Una modalidad ejemplar de auristatina de la fórmula DE es M AE, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo-fármaco: Una modalidad ejemplar de auristatin de la fórmula DF es M AF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente de un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo-fármaco (véase US 2005/0238649 y Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17 : 114-124) : Otras modalidades ejemplares incluyen compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones carboxil de fenilalanina en el extremo C de la fracción de fármaco de auristatina pentapéptida (WO 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de cadena lateral de fenilalanina en la terminal C de la fracción de fármaco de auristatina pentapéptida (WO 2007/008603) .
Otras porciones de fármaco incluyen los siguientes derivados de MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo-fármaco: En un aspecto, los grupos hidrófilos incluyendo pero no limitados a, ésteres trietilenglicólicos (TEG) , como se muestra arriba, se pueden unir a la porción de fármaco en R11. Sin ser limitados por ninguna teoría en particular, los grupos hidrófilos contribuyen a la internalización y no aglomeración de la porción de fármaco.
Modalidades ejemplares de ADCs de la fórmula I que comprenden una auristatina/dolastatina o derivado de las mismas se describen en US 2005-0238649 y Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, la cual es expresamente incorporada aquí por referencia. Modalidades ejemplares de ADCs de la fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde "Ab" es un anticuerpo; p es 1 a aproximadamente 8, "Val-Cit" o "ve" es un dipéptido de valina-citrulina, y "S" es un átomo de azufre: Ab-MC-vc-PAB- MAF Ab-MC-vc-PAB-MMAE Ab-MC-MMAE Ab-MC-MMAF Modalidades ejemplares de ADCs de la fórmula I que comprenden MMAF y varios componentes enlazadores incluyen además Ab-MC-PAB-MMAF y Ab-PAB MMAF. En forma interesante, los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador que no es proteolíticamente divisible han demostrado poseer una actividad comparable a la de los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador proteolíticamente divisible. Véase, Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124. En estos casos, la liberación del fármaco se cree que ha de efectuarse por la degradación de anticuerpos en la célula. Id.
Por lo general, las porciones de fármaco a base de péptidos se pueden preparar mediante la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Estos enlaces peptídicos se puede preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y Lübke K. , "The Peptides" , volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las pociones de fármaco de auristatina/dolastatina pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos de: US 2005-0238649 Al; patente de E.U.A. No. 5635483; patente de E.U.A. No. 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans . 15:859-863; y Doronina (2003) iVat. Biotechnol . 21 (7) : 778-784.
En particular, porciones de fármaco de auristatina/dolastatina de la fórmula DF, tales como MMAF y sus derivados, pueden ser preparadas mediante los métodos descritos en US 2005-0238649 Al y Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Porciones de fármaco de auristatina/dolastatina de la fórmula DE, tales como MMAE y sus derivados, pueden ser preparadas mediante los métodos descritos en Doronina et al. (2003) Nat . Biotech. 21:778-784. Porciones enlazadoras de fármaco MC-MMAF, MC-MMAE, C-vc-PAB-MMAF y C-vc-PAB-M AE pueden ser convenientemente sintetizadas por métodos de rutina, por ejemplo, como se describe en Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, solicitud de patente No. de publicación 2005/0238649 Al, y luego conjugarse a un anticuerpo de interés. (3) Caliqueamicina En otras modalidades el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de antibióticos son capaces de producir bloqueadores ADN de hebra doble en concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, ver patentes de E.U.A 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas a American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, ??1, a2?, ( 31, N-acetil-??1, PSAG y ??? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las antes mencionadas patentes de E.U.A a American Cyanamid). Otros fármacos anti -tumor que el anticuerpo puede conjugar es QFA que es un antifolato. Ambos caliqueamicina y QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruza fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo aumenta sus efectos citotóxicos. c. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumor que se pueden conjugar a los anticuerpos anti-TAHO de la invención incluyen BC U, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descritos en patentes de E.U.A. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de E.U.A. 5,877,296).
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena difteria A, fragmentos activos no enlazados de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, salfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre 1993.
La presente invención además contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa ADN tal como una deoxiribonucleasa; DNasa) .
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos son disponibles para la producción de anticuerpos anti-TAHO radioconjugados . Los ejemplos i , „nc„1luyen S„m,153 , dBiJ212 , -P-.32 , Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para diagnosis, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos , por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta de giro por formación de imagen de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocido como formación de imagen de resonancia magnética nuclear, (RMN) , tal como yodo-123 nuevamente, yodo 131, indio 111, fluoro 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.
Las radioetiquetas u otras etiquetas se pueden incorporar en el conjugado en medios conocidos. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis de aminoácido química usando precursores de aminoácido adecuados que implican, por ejemplo, flúor 19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tal como tc99m ó I123, Re186, Re188 y In111 se puede enlazar por medio de un residuo de cisterna en el péptido. El itrio 90 se puede enlazar por medio residuo de lisina. El método IODOGEN (Franker et al (1978) Biochem. Biophys . Res. Común. 80: 49-57 se puede usar para incorporar yodo 123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
En ciertas modalidades, un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo conjugado con una enzima de activación de profármaco que convierta un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO 81/01145) en un fármaco activo, tal como un fármaco anticáncer. Estos inmunoconjugados son útiles en terapia de profármaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpos ("ADEPT" ) . Las enzimas que pueden ser conjugadas con un anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasas alcalinas, que son útiles para la conversión de profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas , que son útiles para la conversión profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa, que es útil para la conversión 5-fluorocitosina no tóxica en el medicamento contra el cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para la conversión de profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , que son útiles para la conversión de profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos ; enzimas de corte de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para la conversión de profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, que es útil para la conversión de fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres, y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, que son útiles para la conversión de las fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas pueden ser enlazadas covalentemente a anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Wature 312:604-608 (1984). d. Carga de Fármacos La carga de fármacos es representada por p, el número promedio de porciones de fármaco por anticuerpo en una molécula de la Fórmula I. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 porciones de fármaco (D) por anticuerpo. ADCs de la Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una gama de porciones de fármaco, de 1 a 20. El número promedio de porciones de fármaco por anticuerpo en preparaciones de ADC de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales como la espectroscopia de masas, análisis de ELISA, y HPLC. La distribución cuantitativa de ADC en términos de p también puede ser determinada. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogénea donde p es un valor determinado de ADC con otras cargas de fármaco se puede lograr por medios tales como HPLC en fase reversa y electroforesis . Las formulaciones farmacéuticas de la Fórmula I conjugados anticuerpo-fármaco por lo tanto pueden ser una mezcla heterogénea de estos conjugados con anticuerpos unidos a l, 2, 3, 4, o más porciones de fármaco.
Para algunos conjugados anticuerpo- fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión del anticuerpo. Por ejemplo, si la fijación es un tiol de cisteína, como en las anteriores modalidades ejemplares, un anticuerpo puede tener sólo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener sólo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales pueda ser unido un enlazador. En ciertas modalidades, una carga más elevada de fármaco, por ejemplo, p >5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad, o la pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados anticuerpo-fármaco. En ciertas modalidades, la carga de fármaco para un ADC de la invención varía de 1 a alrededor de 8; de aproximadamente 2 a cerca de 6 , o de alrededor de 3 a cerca de 5. De hecho, se ha demostrado que para algunos ADCs, la relación óptima de porciones de fármaco por anticuerpo puede ser inferior a 8, y puede ser de aproximadamente 2 a alrededor de 5. Véase US 2005-0238649 Al.
En ciertas modalidades, menos que el máximo teórico de porciones de fármaco se conjugan para un anticuerpo en una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionen con el intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador, como se discute a continuación. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan ser enlazados a una porción de fármaco; en realidad la mayoría de los residuos tiol de cisteína en anticuerpos existen como puentes de disulfuro. En ciertas modalidades, un anticuerpo puede ser reducido con un agente reductor tal como ditiotreitol DTT o tricarboniletilfosfina (TCEP) , bajo condiciones de reducción parcial o total, para generar los grupos tiol de cisteína reactivos. En ciertas modalidades, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar los grupos nucleófilo reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de diferentes maneras, por ejemplo, al: (i) limitar el exceso molar de intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador en relación al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o temperatura de la reacción de conjugación, y (iii) parcializar o limitar las condiciones reductoras para la modificación de tioles de cisteína.
Debe entenderse que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un intermediario fármaco-enlazador o reactivo enlazador seguido por reactivos de porción de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de una o más porciones de fármaco unidas a un anticuerpo. El número medio de fármacos por anticuerpo puede ser calculado a partir de la mezcla por un análisis de anticuerpos de ELISA doble, que sea específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Moléculas ADC individuales pueden ser identificadas en la mezcla por espectroscopia de masas y separadas por HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba (véase, por ejemplo, McDonagh et al (2006) Prot . Engr. Design & Selection 19 (7) :299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate", Resumen No. 624, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, Marzo 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, Marzo 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Resumen No. 627, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, Marzo 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, Marzo 2004). En ciertas modalidades, un ADC homogénea con un valor de carga único se puede aislar de la mezcla de conjugación por electroforesis o cromatografía. e. Ciertos métodos de preparación de inmunconj gados Un ADC de la Fórmula I puede prepararse por varias rutas empleando las reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la materia, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofilo de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente para formar Ab-L a través de un enlace covalente, seguida por una reacción con una porción de fármaco D, y (2) reacción de un grupo nucleofilo de una porción de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con un grupo nucleofilo de un anticuerpo. Métodos ejemplares para la preparación de un ADC de la Fórmula I a través de esta última vía se describen en US 2005-0238649 Al, expresamente incorporada aquí por referencia.
Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina N-terminales , (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos de amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ásteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos , y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas, (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , de manera que el anticuerpo sea total o parcialmente reducido. Cada puente de cisteína constituirá, por tanto, en teoría, dos nucleófilos tiol reactivos. Grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos mediante la modificación de los residuos de lisina, por ejemplo, mediante la reacción de los residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en un anticuerpo mediante la introducción de una, dos, tres, cuatro, o más residuos de cisteína (por ejemplo, mediante la preparación de anticuerpos variantes que comprendan uno o más residuos de aminoácido de cisteína no nativos) .
Los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención también pueden ser producidos por la reacción entre un grupo electrófilo en un anticuerpo, tal como un grupo carbonilo aldehido o cetona, con un grupo nucleófilo sobre un reactivo enlazador o el medicamento. Grupos nucleófilos de interés en un reactivo enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, aminoácidos, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y arilhidrazida . En una modalidad, un anticuerpo se modifica para introducir porciones electrófilas que sean capaces de reaccionar con sustituyentes nucleófilos sobre el reactivo enlazador o el medicamento. En otra modalidad, los azúcares de anticuerpos glucosilados pueden ser oxidados, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que puedan reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o porciones de fármaco. Los grupos de base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces con amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con cualquiera de galactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede dar grupos carbonilb (aldehido y cetona) en el anticuerpo que pueden reaccionar con los grupos pertinentes en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, los anticuerpos que contiene residuos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, lo que resulta en la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Tal aldehido puede reaccionar con una porción de fármaco o nucleófilo enlazador.
Los grupos nucleófilos en una porción de fármaco incluyen, pero no se limitan a: aminas, tioles, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y grupos arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ásteres activos tales como ásteres NHS, ásteres HOBt, haloformiatos , y haluros de ácido, (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas , (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida.
Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con los siguientes reactivos entrelazadores : BMPS, E CS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, el CCPA, PEMB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo PEMB, y SVSB ( succinimidil - (4 -vinilsulfona) benzoato) , que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. , E.U.A. ; véanse páginas 467-498, 2003-2004 Manual de Aplicaciones y Catálogo.
Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionales (tales como adipimidato de dimetil HCL) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutareldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede ser preparada como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótios al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador cortable" que facilite la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador ácido-lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente de E.U.A. No. 5208020).
Por otra parte, una proteína de fusión que comprenda el anticuerpo anti-TAHO y agente citotóxico puede hacerse, por ejemplo, mediante técnicas de recombinación o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifiquen para las dos porciones del conjugado bien adyacentes entre sí o separadas por una región que codifique para un péptido enlazador que no destruya las propiedades deseadas del conjugado.
En otra modalidad más, el anticuerpo puede ser conjugado con un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en pre-selección de tumor en la que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación con un agente depurador y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que sea conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) .
Inmunocongugados Ejemplares - Conjugados Tio-Anticuerpo Fármaco a. Preparación de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína ADN que codifica para una variante de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como CD79b anti-humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) , y los anticuerpos anti-TAHO progenitores de la invención, tales como CD79b anti-humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) , se prepara una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) , preparación por mutagénesis dirigida a sitio (o mediada por oligonucleótidos) (Cárter (1985) et al., Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst . ) 77:51-59; Kunkel et al (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:488; Liu et al (1998) J. Biol . Chem. 273:20252-20260), mutagénesis por PCR (Higuchi, (1990) en PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132, y Vallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), y mutagénesis de cásete (Wells et al (1985) Gene 34:315-323) de un ADN preparado anteriormente que codifique para el polipéptido. Los protocolos, kits y reactivos de mutagénesis están disponibles comercialmente , por ejemplo, QuikChangeE Multi Site-Direct Mutagénesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) . Mutaciones individuales son también generados por mutagénesis dirigida mediante oligonucleótidos usando ADN plasmídico de doble cadena como plantilla por mutagénesis a base de PCR (Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición; Zoller et al (1983) Methods Enzymol . 100:468-500; Zoller, M.J. y Smith, M. (1982) Nucí. Acids Res. 10:6487-6500). Variantes de anticuerpos recombinantes pueden ser construidas también por la manipulación de los fragmentos de restricción o PCR de extensión por superposición con oligonucleótidos sintéticos. Cebadores mutágenos codifican para los reemplazos de codones de cisteína. Técnicas de mutagénesis normales puede ser empleadas para generar mutantes de ADN que codifiquen para esos anticuerpos manipulados con cisteína mutantes (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience , Nueva York, NY, 1993).
Tecnología de despliegue de bacteriófagos (McCafferty et al (1990) Nature 348:552-553) se puede utilizar para producir anticuerpos anti-TAHO humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio V de anticuerpo se clonan en cuadro ya sea en un gen de proteína de cápside mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula de fago. Puesto que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales de los anticuerpos también resultan en la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B (Johnson et al (1993) Current Opinión in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol . 222:581-597; Griffith et al (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275) .
Los anticuerpos anti-TAHO, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , pueden ser químicamente sintetizados utilizando la metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o pueden ser preparados y purificados mediante tecnología recombinante . La secuencia de aminoácidos adecuada, o partes de ella, puede ser producida por la síntesis de péptidos directa, utilizando técnicas en fase sólida (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154) . La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar mediante técnicas manuales o por automatización. La síntesis en fase sólida automatizada puede lograrse, por ejemplo, empleando aminoácidos protegidos con t-BOC o Fmoc y usando de un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, CA) con las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpos anti-TAHO, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAH040) , o polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , pueden ser sintetizadas químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAHO deseado, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , o polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40 ) .
Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (Morimoto et al (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-1 17, y Brennan et al (1985) Science, 229:81), o producidos directamente por células hospederas recombinantes . Los fragmentos de anticuerpo anti-TAHO Fab, Fv y scFv pueden todos ser expresados y secretados por E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de bibliotecas de fagos de anticuerpo aquí mencionadas. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al (1992) Bio/Technology 10:163-167), o aislarse directamente del cultivo de células hospederas recombinantes. El anticuerpo anti-TAHO, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , puede ser un fragmento Fv de cadena única (scFv) (WO 93/16185, US 5,571,894; US 5587458). El fragmento de anticuerpo anti-TAHO, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , también puede ser un "anticuerpo lineal" (US 5641870) . Estos fragmentos de anticuerpos lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos .
La descripción a continuación se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAHO, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica para anticuerpos anti-TAHO, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) . ADN que codifica para anticuerpos anti-TAHO se puede obtener de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se crea posea el ARNm de anticuerpo anti-TAHO y que lo exprese a un nivel detectable . En consecuencia, el ADN del anticuerpo anti-TAHO humano o polipéptido TAHO puede ser convenientemente obtenido a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica par el anticuerpo anti-TAHO también se puede obtener de una biblioteca genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, la síntesis automatizada de ácidos nucleicos) .
Los métodos de diseño, selección y preparación de la invención hacen posible anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , los cuales reaccionan con funcionalidad electrófila. Estos métodos hacen posible además compuestos conjugados de anticuerpos tales como compuestos conjugados anticuerpo- fármaco (ADC) con moléculas de fármaco en sitios selectivos designados y diseñados. Los residuos de cisteína reactivos sobre una superficie de anticuerpo permiten conjugar específicamente una porción de fármaco a través de un grupo reactivo con tiol tal como maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleofílica de la funcionalidad tiol de un residuo Cys a un grupo maleimida es unas 1000 veces superior en comparación con cualquier otra funcionalidad de aminoácido en una proteína, tal como el grupo amino de los residuos de lisina o el grupo amino N-terminal. La funcionalidad tiol específica en los reactivos de yodoacetilo y maleimida puede reaccionar con grupos amina, pero un pH mayor (>9.0) y mayores tiempos de reacción se requieren (Garman, 1997, Non-Radiactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres) . La cantidad de tiol libre en una proteína se puede estimar mediante el ensayo de Ellman estándar. Inmunoglobulina M es un ejemplo de un pentámero enlazado por disulfuro, mientras que la inmunoglobulina G es un ejemplo de una proteína con puentes de disulfuro internos que unen juntas las subunidades. En las proteínas de este tipo, la reducción de los enlaces de disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) o selenol (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-156) es necesaria para generar el tiol libre reactivo. Este enfoque puede resultar en la pérdida de la estructura terciaria del anticuerpo y la especificidad de unión al antígeno.
El ensayo PHESELECTOR (ELISA de fagos para la selección de tioles reactivos) permite la detección de los grupos cisteína reactivos en anticuerpos en un formato de fagos de ELISA ayudando así en el diseño de los anticuerpos manipulados con cisteína (WO 2006/034488, US 2007/0092940) . El anticuerpo manipulado con cisteína es recubierto en superficies de pocilio, seguido de incubación con partículas de fago, la adición de anticuerpo secundario marcado con HRP, y la detección de absorbancia. Las proteínas mutantes desplegadas en fagos pueden ser tamizadas de una manera rápida, robusta y de alto rendimiento. Bibliotecas de anticuerpos manipulados con cisteína pueden ser producidas y sometidas a la selección vinculante con el mismo enfoque para identificar sitios adecuadamente reactivos de incorporación de Cys libre a partir de bibliotecas de proteínas-fagos aleatorias de anticuerpos y otras proteínas. Esta técnica incluye hacer reaccionar proteínas mutantes de cisteína desplegadas en fagos con un reactivo de afinidad o grupo reportero que también sea reactivo con tiol.
El ensayo PHESELECTOR permite la detección de los grupos tiol reactivos en anticuerpos. La identificación de la variante A118C por este método es ejemplar. La molécula de Fab completa puede ser analizada en forma efectiva para identificar más variantes ThioFab con grupos tiol reactivos. Un parámetro, la accesibilidad en superficie fraccional, se utilizó para identificar y cuantificar la accesibilidad de solvente a los residuos de aminoácido en un polipéptido. La accesibilidad en superficie se puede expresar como el área superficial (Á2) que puede ser contactada por una molécula de solvente, por ejemplo, agua. El espacio ocupado de agua se aproxima como una esfera con un radio de 1.4 Á. El software es de libre disposición o permisible (Secretary to CCP4 , Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (+44) 1925 603825, o por internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html ) como la Suite CCP4 de los programas de cristalografía que emplean algoritmos para calcular la accesibilidad superficial de cada aminoácido de una proteína con coordenadas derivadas por cristalografía de rayos X conocidas ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst . D50 : 760-763) . Dos módulos de software ejemplares que realizan cálculos de accesibilidad en superficie son "AREAIMOL" y "SURFACE" , con base en los algoritmos de B. Lee y F.M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400. AREAIMOL define la superficie accesible por solventes de una proteína como el lugar del centro de una esfera de la sonda (que representa una molécula de solvente) a medida que rueda sobre la superficie de Van der Waals de la proteína. AREAIMOL calcula el área superficial accesible por solventes mediante la generación de puntos superficiales en una esfera extendida sobre cada átomo (a una distancia del centro del átomo igual a la suma de los radios del átomo y de la sonda) , y eliminando aquellos que se encuentran dentro de las esferas equivalentes asociadas con los átomos vecinos . AREAIMOL encuentra el área accesible por solventes de los átomos en un archivo de coordenadas PDB, y resume el área accesible por residuo, por cadena y para toda la molécula. Las áreas accesibles (o diferencias de área) para átomos individuales se puede escribir en un archivo de salida pseudo-AP. AREAIMOL asume un radio único para cada elemento, y sólo reconoce un número limitado de elementos diferentes .
AREAIMOL y SURFACE reportan accesibilidades absolutas, es decir, el número de Angstroms cuadrados (Á) . La accesibilidad de superficie fraccional se calcula en función a un estado estándar relevante para un aminoácido dentro de un polipéptido. El estado de referencia es tripéptido Gly-Gly-X, donde X es el aminoácido de interés, y el estado de referencia debe ser una conformación 'extendida' , es decir, como aquellas en las hebras beta. La conformación extendida maximiza la accesibilidad de X. Un área accesible calculada se divide entre el área de fácil acceso en un estado de referencia de tripéptido Gly-X-Gly y reporta el cociente, que es la accesibilidad fraccional. La accesibilidad porcentual es la accesibilidad fraccional multiplicada por 100. Otro algoritmo ejemplar de cálculo de la accesibilidad de superficie se basa en el módulo SOLV del programa xsae (Broger, C, F. Hoffman-La Roche, Basilea) , que calcula la accesibilidad fraccional de un residuo de aminoácido a una esfera de agua con base en las coordenadas de rayos X del polipéptido. La accesibilidad de superficie fraccional para cada aminoácido en un anticuerpo puede ser calculada utilizando la información de estructura cristalina disponible (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995).
ADN que codifica para anticuerpos manipulados con cisteína es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente de este ADN. Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión, que luego se transfectan en células hospederas, tales como células de E. coli, células COS simianas, células de ovario de hámster chino (CHO) , u otras células hospederas de mamífero, tales como células de mieloma (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que de otra forma no produzcan la proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes .
Después del diseño y selección, los anticuerpos manipulados con cisteína, por ejemplo, ThioFabs, con los residuos de Cys no apareados altamente reactivos y manipulados, "aminoácidos de cisteína libres", se puede producir mediante: (i) expresión en un sistema bacteriano, por ejemplo, de E. coli (Skerra et al (1993) Curr. Opinión in Immunol. 5:256-262; Plückthun (1992) Immunol . Revs . 130:151-188) o un sistema de cultivo de células de mamífero (WO 01/00245) , por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) , y (ii) purificación utilizando las técnicas comunes de purificación de proteínas (Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266 (17) : 10982-10988) .
Los grupos tiol de Cys manipulados reaccionan con reactivos enlazadores electrófilos e intermedios fármaco-enlazador para formar conjugados anticuerpo fármaco manipulados con cisteína y otros anticuerpos manipulados con cisteína marcados. Los residuos Cys de anticuerpos manipulados con cisteína y presentes en los anticuerpos progenitores, que están vinculados y forman enlaces de disulfuro intercatenarios e intracatenarios no tienen ningún grupo tiol reactivo (a menos que sean tratados con un agente reductor) y no reaccionan con reactivos enlazadores electrófilos o intermediarios fármaco-enlazador . El residuo de Cys recién diseñado puede permanecer sin pareja, y capaz de reaccionar con, es decir, conjugarse a, un reactivo enlazador electrofilo o intermediario fármaco-enlazador, tal como un fármaco-maleimida. Los intermediarios fármaco-enlazador ejemplares incluyen: C-MMAE, MC MMAF, MC-vc-PAB MMAE, y MC-vc-PAB-MMAF . Las posiciones estructurales de los residuos de Cys manipulados de las cadenas pesadas y ligeras están numeradas de acuerdo con un sistema de numeración secuencial. Este sistema de numeración secuencial se correlaciona con el sistema de numeración Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) iniciando en el extremo N, difiere del esquema de numeración Kabat (fila inferior) por las inserciones señaladas por a, b, c. Usando el sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos que correspondan a un acortamiento de, o inserción en, un FR o CDR del dominio variable. Los sitios variantes de la cadena pesada manipulados con cisteína se identifican por la numeración secuencial y esquemas de numeración de Kabat.
En una modalidad, el anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , se prepara por un procedimiento que comprende: (a) sustitución de uno o varios residuos de aminoácidos de un anticuerpo anti-TAHO progenitor por cisteína, y (b) la determinación de la reactividad del tiol del anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína por reacción del anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo que reaccione con tiol.
El anticuerpo manipulado con cisteína puede ser más reactivo que el anticuerpo progenitor con el reactivo reactivo con tiol.
Los residuos de aminoácido de cisteína libres pueden estar situados en las cadenas pesadas o ligeras, o en los dominios constante o variable. Fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, Fab, también pueden ser diseñados con uno o más aminoácidos cisteína que reemplacen los aminoácidos del fragmento de anticuerpo, para formar fragmentos de anticuerpos manipulados con cisteína.
Otra modalidad de la invención proporciona un método de preparación (elaboración) un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , que comprende: (a) la introducción de uno o más aminoácidos cisteína en un anticuerpo anti-TAHO progenitor con el fin de generar el anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, y (b) la determinación de la reactividad tiol del anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo que reaccione con tiol; en donde el anticuerpo manipulado con cisteína es más reactivo que el anticuerpo progenitor con el reactivo que reacciona con tiol.
El paso (a) del método de preparación de un anticuerpo manipulado con cisteína puede comprender: (i) mutagenizar una secuencia de ácido nucleico que codifique para el anticuerpo manipulado con cisteína; (ii) expresar el anticuerpo manipulado con cisteína, y (iii) aislar y purificar el anticuerpo manipulado con cisteína .
El paso (b) del método de preparación de un anticuerpo manipulado con cisteína puede comprender expresar el anticuerpo manipulado con cisteína en una partícula viral seleccionada de una partícula de fago o fagémido.
El paso (b) del método de preparación de un anticuerpo manipulado con cisteína también puede incluir: (i) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo de afinidad a reactivos de tiol para generar un anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad, y (ii) medir la unión del anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad a un medio de captura.
Otra modalidad de la invención es un método de detección de anticuerpos manipulados con cisteína con aminoácidos de cisteína no apareados y altamente reactivos para reactividad tiol que comprende: (a) la introducción de uno o más aminoácidos cisteína en un anticuerpo progenitor a fin de generar un anticuerpo manipulado con cisteína; (b) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo de afinidad a reactivos de tiol para generar un anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad, y (c) la medición de la unión del anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad a un medio de captura, y (d) la determinación de la reactividad tiol del anticuerpo manipulado con cisteína el reactivo que reacciona con tiol.
El paso (a) del método de detección de anticuerpos manipulados con cisteína puede comprender: (i) mutagenizar una secuencia de ácido nucleico que codifique para el anticuerpo manipulado con cisteína, (ii) expresar el anticuerpo manipulado con cisteína, y (iii) aislar y purificar el anticuerpo manipulado con cisteína .
El paso (b) del método de detección de anticuerpos manipulados con cisteína puede comprender expresar el anticuerpo manipulado con cisteína en una partícula viral seleccionada de una partícula de fago o fagémido.
El paso (b) del método de detección de anticuerpos manipulados con cisteína también puede comprender: (i) hacer reaccionar el anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo de afinidad a reactivo con tiol para generar un anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad, y (ii) medir la unión del anticuerpo manipulado con cisteína marcado por afinidad a un medio de captura. b. Manipulación con Cisteína de Variantes IgG Anti-TAHO Se introdujo cisteína en el sitio de cadena pesada 118 (numeración EU) (equivalente a la posición de la cadena pesada 118, numeración secuencial) en los anticuerpos anti-TAHO monoclonales progenitores quiméricos de longitud completa, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAH040) , o en el sitio de cadena ligera 205 (numeración de Kabat) (equivalente a la posición de la cadena ligera 208, numeración secuencial) en los anticuerpos anti-TAHO monoclonales progenitores quiméricos de longitud completa, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , por los métodos de manipulación con cisteína descritos en la presente.
Los anticuerpos manipulados con cisteína con una cisteína en la cadena pesada 118 (numeración EU) generados fueron: (a) thio-chSN8-HC (A118C) con una secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 54) y una secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 55), Figura 31, y (b) thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) con una secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 56) y secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 57) , Figura 35.
Los anticuerpos manipulados con cisteína con una cisteína en la cadena ligera 205 (numeración de Kabat) generados fueron: (a) thio-chSN8-LC (V205C) con una secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 52) y una secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 53), figura 30, y (b) thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -LC (V205C) con una secuencia de la cadena pesada (SEQ ID NO: 95) y una secuencia de la cadena ligera (SEQ ID NO: 96), Figura 36.
Estos anticuerpos monoclonales manipulados con cisteína se expresaron en células CHO (ovario de hámster chino) mediante fermentación transitoria en medios que contenían 1 mM de cisteína.
Según una modalidad, los anticuerpos CD79b (TAH05) antihumanos manipulados con cisteína SN8 quiméricos comprenden una o más de las siguientes secuencias de la cadena pesada con un aminoácido cisteina libre (SEQ ID NOs : 63-71, tabla 6).
Tabla 6 Comparación de la numeración secuencial, Kabat y Eu de la cadena pesada para variantes de anticuerpos CD79b (TAHQ5) anti-humanos manipulados con cisteína SN8 SECUENCIA NUMERACIÓN NUMERACIÓN NUMERACIÓN SEQ ID NO: SECUENCIAL DE KABAT DE EU EVQLCQSGAE Q5C Q5C 63 VKISCCATGYT K23C K23C 64 LSSLTCEDSAV S88C S84C 65 TSVTVCSASTK S116C S112C 66 VTVSSCSTKGP A118C A114C A1 18C 67 VSSASCKGPSV T120C T1 16C T120C 68 K.FN WYCDG VEV V279C V275C V279C 69 KGFYPCDIAVE S375C S371C S375C 70 PPVLDCDGSFF S400C S396C S400C 71 Según una modalidad, los anticuerpos anti-cynoCD79b (TAHO40) manipulados con cisteína anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) comprenden una o más de las siguientes secuencias de la cadena pesada con un aminoácido cisteína libre (SEQ ID NOs: 72-80, Tabla 7 ) .
Tabla 7 Comparación de la numeración secuencial, Kabat y Eu de la cadena pesada para variantes de anticuerpos anti-cynoCD79b (TAHO40) manipulados con cisteína anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) De acuerdo con una modalidad, anticuerpos CD79b antihumanos (TAH05) manipulados con cisteína SN8 quiméricos comprenden una o más de las siguientes secuencias de la cadena ligera con un aminoácido cisteína libre (SEQ ID NOs : 81-87, tabla 8) .
Tabla 8 Comparación de la numeración secuencial y Kabat de la cadena ligera para variantes de anticuerpos CD79b (TAH05) antihumanos manipulados con cisteína quiméricos SN8 Según una modalidad, los anticuerpos anti-cynoCD79b (TAHO40) manipulados con cisteína anti -cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) comprenden una o más de las siguientes secuencias de la cadena ligera con un aminoácido cisteína libre (SEQ ID NOs: 88-94, Tabla 9) .
Tabla 9 Comparación de la numeración secuencial y Kabat de la cadena ligera para variantes de anticuerpos anti-cynoCD79b (TAHO40) manipulados con cisteína anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) c. Anticuerpos Anti-TAHO Manipulados con Cisteína Marcados Anticuerpos anti -TAHO manipulados con cisteína, tales como CD79b anti -humano (TAH05 ) o anti -cyno CD79b (TAHO40 ) , pueden ser acoplados específ icamente y ef icientemente en sitio con un reactivo que reacciona con tiol . El reactivo que reacciona con tiol puede ser un reactivo enlazador multifuncional , un reactivo marcado de captura , es decir de af inidad, (por ej emplo , un reactivo de enlazador de biotina) , un marcador de detección (por ej emplo , un reactivo fluoróforo) , un reactivo de inmovilización en fase sólida (por ejemplo, SEPHAROSE™, poliestireno o vidrio) o intermediario farmaco-enlazador . Un ejemplo de un reactivo que reacciona con tiol es N-etil maleimida (NE ) . En un ejemplo de modalidad, la reacción de un ThioFab con un reactivo de enlazador de biotina proporciona un ThioFab biotinilado por el cual la presencia y la reactividad del residuo manipulado con cisteína se puede detectar y medir. La reacción de un ThioFab con un reactivo enlazador multifuncional proporciona un ThioFab con un enlazador funcionarizado que puede ser además hecho reaccionar con un reactivo de porción de fármacos u otro marcador. La reacción de un ThioFab con un intermediario fármaco-enlazador proporciona un conjugado de fármaco ThioFab.
Los métodos ejemplares descritos aquí pueden ser de aplicación general a la identificación y producción de anticuerpos y, más generalmente, a otras proteínas mediante la aplicación de las etapas de diseño y selección descritas en este documento.
Este enfoque puede aplicarse a la conjugación de otros reactivos que reaccionan con tiol en los cuales el grupo reactivo sea, por ejemplo, una maleimida, una yodoacetamida, un piridil disulfuro, u otro socio de conjugación reactivo con tiol (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). El reactivo que reacciona con tiol puede ser una porción de fármaco, un fluoróforo tal como un tinte fluorescente como fluoresceína o rodamina, un agente quelante para un metal de formación de imágenes o de radioterapia, un marcador de peptidilo o no de peptidilo o marcador de detección, o un agente modificador de depuración tal como varios isómeros de polietilenglicol , un péptido que se una a un tercer componente, u otro agente de carbohidrato o lipofílico. d. Usos de los Anticuerpos Anti-TAHO Manipulados con Cisteína Los anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , y conjugados de los mismos pueden encontrar uso como agentes terapéuticos y/o de diagnostico. La presente invención proporciona además métodos para prevenir, manejar, tratar o reducir uno o más síntomas asociados con un trastorno relacionado con células B. En particular, la presente invención proporciona métodos para prevenir, manejar, tratar o reducir uno o más síntomas asociados con un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer, por ejemplo, linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente o refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto. La presente invención proporciona también además métodos para diagnosticar un trastorno relacionado con CD79b o predisposición a desarrollar este trastorno, así como métodos para identificar anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, que de preferencia se unen a polipéptidos CD9b asociados a células B.
Otra modalidad de la presente invención está dirigida al uso de un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una afección que responda a un trastorno relacionado con células B. e. Conjugados Anticuerpo Manipulado con Cisteína Fármaco (Conjugados Tio-Anticuerpo Fármaco (TDCs) ) Otro aspecto de la invención es un compuesto conjugado anticuerpo- fármaco que comprende un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína (Ab) , tal como CD79b anti -humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , y una porción de fármaco de auristatina (D) , en donde el anticuerpo manipulado con cisteína está unido a través de uno o más aminoácidos de cisteína libres por una porción enlazadora (L) a D; el compuesto tiene la fórmula I : Ab-(L-D)p I en donde p es 1, 2, 3 ó 4 ; y en donde el anticuerpo manipulado con cisteína se prepara mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar uno o más residuos de aminoácido de un anticuerpo anti-TAHO progenitor, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , mediante uno o más aminoácidos de cisteína libres.
Otro aspecto de la invención es una composición que comprende una mezcla de compuestos anticuerpo-fármaco de la fórmula I, en donde la carga de fármaco promedio por anticuerpo es aproximadamente 2 a alrededor de 5, o aproximadamente 3 a alrededor de 4.
Las figuras 30-31 y 35-36 muestran modalidades de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , conjugados de fármaco (ADC) en donde una porción de fármaco de auristatina está unida a un grupo de cisteína manipulado en: la cadena ligera (LC-ADC) o la cadena pesada (HC-ADC) .
Las ventajas potenciales del anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , conjugado de fármaco, incluyen seguridad mejorada (índice terapéutico más amplio) , parámetros PK mejorados, los enlaces disulfuro e inter-cadenas del anicuerpo se conservan lo cual puede estabilizar al conjugado y mantener su conformación de unión activa, los sitios de conjugación de fármaco son definidos y la preparación de los conjugados anticuerpo manipulado con cisteina a fármaco a partir de la conjugación de anticuerpos manipulados con cisteina a reactivos enlazadores de fármaco da como resultado un producto más homogéneo.
Enlazadores : "Enlazador", "unidad enlazadora" o "enlace" significa una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que unen covalentemente un anticuerpo a una porción de fármaco. En varias modalidades, un enlazador es especificado como L. Un "enlazador" (L) es una porción bifuncional o multifuncional que se puede usar para enlazar una o más porciones de fármaco (D) y una unidad de anticuerpo (Ab) para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la fórmula 1. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) pueden prepararse covalentemente usando un enlazador que tenga una funcionalidad reactiva para unirse al fármaco y al anticuerpo. Un tiol de cisteina de un anticuerpo manipulado consiste en (Ab) puede formar con un enlace un grupo funcional electrófilo de un reactivo enlazador, una porción de fármaco o intermediario fármaco-enlazador .
En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo con una cisteína nucleofila presente en un anticuerpo. El tiol de cisteína del anticuerpo es reactivo con un grupo electrófilo en un enlazador y forma un enlace covalente a un enlazador. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero no están limitados a, grupos maleimida y halocetamida .
Los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un alquildiilo, porciones arileno y heteroarileno tales como: - (CR2) n0 (CR2) m- unidades de repetición de alquiloxi (por ejemplo, polietilenoxi , PEG, polimetilenoxi ) y alquilamino (por ejemplo, polietilenaminao, Jeffamine™) ; y ásteres y amidas diácidas incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.
Los anticuerpos manipulados con cisteína reaccionan con reactivos enlazadores o intermediarios fármaco-enlazador, con grupos funcionales electrófilos tales como maleimida o a-halocarbonilo, de acuerdo con el método de conjugación en la página 766 de Klussman, et al (2004) , Bioconjugate Chemistry 15(4) : 765-773, y de acuerdo con el protocolo del ejemplo 18.
El enlazador puede estar compuesto de uno o más componentes enlazadores. Los componentes enlazadores ejemplares incluyen 6 -maleimidocaproilo ( "MC" ) , maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe" o "af"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), 4- (2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo ("SPP"), 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de N-succinimidilo ("SMCC"), (4-yodo-acetil) aminobenzoato de succinimidilo ("SIAB"), etilenoxi -CH2CH2-0- como una o más unidades de repetición ("EO" o "PEO"). Los componentes enlazadores adicionales se conocen en la técnica y algunos se describen en la presente.
En una modalidad, el enlazador L de un ADC tiene la fórmula : -Aa—ww—Yy-en donde : -A- es una unidad extensora unida covalentemente a un tiol de cisteína del anticuerpo (Ab) ; a es 0 ó 1 ; cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido; w es independientemente un entero que varía de 0 a 12; -Y- es una unidad separadora unida covalentemente a la porción de fármaco; y y es 0 , 1 ó 2.
Unidad extensora La unidad extensora (-A-), cuando está presente, es capaz de enlazar una unidad de anticuerpo a una unidad de aminoácido (-W-) . A este respecto, un anticuerpo (Ab) tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de un extensor. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un anticuerpo, ya sea naturalmente o por medio de manipulación química incluyen, pero no están limitados a, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato, y carboxilo. En un aspecto, los grupos funcionales con anticuerpos son sulfhidrilo o amino. Los grupos sulfhidrilo pueden generarse mediante la reducción de un enlace de disulfuro intramolecular de un anticuerpo. Como alternativa, los grupos sulfhidrilo pueden generarse mediante la reacción de un grupo amino de una porción de lisina de un anticuerpo usando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo generador de sulfhidrilo. En una modalidad, un anticuerpo (Ab) tiene un grupo tiol de cisteína libre que puede formar un enlace con un grupo funcional electrófilo de una unidad extensora. Las unidades extensoras ejemplares en los conjugados de la fórmula I se ilustran por las fórmulas II y III, en donde Ab-, -W- , -Y-, -D, w y y son como se definió arriba, y R17 es un radical divalente seleccionado de (CH2)r, carbociclilo de C3-C8, 0-(CH2)r, arileno, (CH2) r-arileno, -arileno- (CH2) r- / (CH2)r- (carbociclilo de C3-C8) , (carbociclilo de C3-C8) - (CH2) r, heterociclilo de C3-C8, (CH2) r- (heterociclilo de C3-C8) , (heterociclilo de C3-C8) - (CH2) r- , - (CH2) rC (0) NRb (CH2) r- , (CH2CH20)r-, - (CH2CH20)r-CH2-, - (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r- , (CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r- , (CH2CH20)RC(0)NR (CH2CH20)r-CH2- y - (CH2CH20) rC (0) NR (CH2) r- ; en donde Rb es H, alquilo de Ci-C6, fenilo o bencilo; y r es independientemente un entero que varía de 1-10.
Arileno incluye radicales hidrocarburo aromáticos divalentes de 6-20 átomos de carbono derivados por la remoción de dos átomos de hidrógeno a partir del sistema de anillo aromático. Los grupos arileno típicos incluyen, pero no están limitados a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo, y similares.
Los grupos heterociclilo incluyen un sistema de anillo en el cual uno o más átomos de anillo es un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende 1 a 20 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tenga 3 a 7 miembros de anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S) o un biciclo que tenga 7 a 10 miembros de anillo (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, 0, P y S) , por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] . Heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamín, Nueva York, 1968), particularmente capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 en la presente), en particular volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc . (1960) 82:5566.
Ejemplos de heterociclos incluyen a manera de ejemplo y no de limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo) , tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado de sulfuro, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahdropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H, 6H-1, 5, 2-diatiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4Ah-carbazolilo, carbazolilo, ß-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazoldiinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxiindolilo, benzoxazolinilo e isatinolilo.
Los grupos carbociclilo incluyen un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monociclos tienen 3 a 6 átomos de anillo, todavía más típicamente 5 ó 6 átomos de anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen 7 a 12 átomos de anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] o 9 ó 10 átomos de anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3 -enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3 -enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
Debe entenderse a partir de todas las modalidades ejemplares de la fórmula I ADC tal como II-VI, que incluso cuando no se indique expresamente, de 1 a 4 porciones de fármaco son enlazadas a un anticuerpo (p = 1-4) , dependiendo del número de residuos de cisteína manipulados.
Ab—S—hCH2-CONH-R17-C(0)—Ww-Yy-D Una unidad extensora de la fórmula II ilustrativa se deriva de maleimido-caproilo (MC) en donde R17 es -(CH2)5- : Una unidad extensora ilustrativa de la fórmula II y se deriva de maleimido-propanoilo (MP) en donde R17 es -(CH2)2-: Otra unidad extensora ilustrativa de la fórmula II en donde R17 es -(CH2CH20)r- y r es 2: Otra unidad extensora ilustrativa de la fórmula II en donde R17 es - (CH2) rC (0) NR (CH2CH20) r-CH2- en donde Rb es H y cada r es 2 : MPEG Una unidad extensora ilustrativa de la fórmula III en donde R17 es -(CH2)5-: En otra modalidad, la unidad extensora está enlazada al anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , por medio de un enlace de disulfuro entre el átomo de azufre de cisteína manipulado del anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad extensora. Una unidad extensora representativa de esta modalidad es ilustrada por la fórmula IV, en donde R17, Ab- , -W-, -Y-, -D, w y y son como se definió arriba.
En otra modalidad más, el grupo reactivo del Extensor contiene un grupo funcional reactivo con tiol que puede formar un enlace con un tiol de cisteína libre de un anticuerpo. Ejemplos de grupos funcionales de reacción con tiol incluyen, pero no están limitados a, maleimida, a-haloacetilo, esteres activados tales como esteres de succinimida, ésteres 4-nitrofenilo, ésteres pentafluorofenilo, ésteres tetrafluorofenílicos , anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos . Las unidades extensoras representativas de esta modalidad son ilustradas por las fórmulas Va y Vb, en donde -R17-, Ab- , -W- , -Y-, -D, w y y son como se definió arriba .
En otra modalidad, el enlazador puede ser un enlazador tipo dendrítico para la fijación covalente de más de una porción de fármaco a través de una ramificación, porción enlazadora multifuncional a un anticuerpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Los enlazadores dendríticos pueden incrementar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir carga, cuando estén relacionados con la potencia del ADC. Así, cuando un anticuerpo manipulado con cisteína aporta sólo un grupo tiol de cisteína reactivo, una multitud de porciones de fármaco pueden ser fijadas a través de un enlazador dendrítico.
Unidad de aminoácido El enlazador puede comprender residuos de aminoácido. La Unidad Aminoácido (- w-), cuando está presente, enlaza el anticuerpo (Ab) a la porción de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo manipulado con cisteína- fármaco (ADC) de la invención. - w- es una unidad dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Los residuos de aminoácidos que comprenden la unidad de aminoácido incluyen aquellos que ocurren naturalmente, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácido de origen natural . Cada unidad -W- independientemente tiene la fórmula indicada bajo en los corchetes, y w es un entero que varía de 0 a 12: en donde R es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2 , -CH2CH2COOH, (CH2) 3NHC(=NH) H2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3 HCOCH3, - (CH2) 3NHCHO, (CH2) 4 HC (= H) NH2, - (CH2) 4NH2 , - (CH2) 4NHCOCH3, - (CH2) 4NHCHO, (CH2) 3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH (OH) CH2NH2 , 2-piridilmetilo- , 3-piridilmetilo- , 4-piridilmetilo- , fenilo, ciclohexilo, Cuando R19 no es hidrógeno, el átomo de carbono al cual R19 está unido es quiral . Cada átomo de carbono al cual está unido R19 está independientemente en la configuración (S) o (R) , o una mezcla racémica. Las unidades de aminoácido pueden ser entonces enantioméricamente puras, racémicas o diastereoméricas .
Las unidades de aminoácido -Ww- ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina- fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácido que comprenden un componente enlazador de aminoácidos incluyen aquellos de origen natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácido que no son de origen natural, tales como citrulina.
La unidad de aminoácido puede ser cortada enzimáticamente por una o más enzimas, incluyendo una proteasa asociada a tumor, para liberar la porción de fármaco (-D), la cual en una modalidad es protonada in vivo después de la liberación para proporcionar un fármaco (D) . Los componentes enlazadores de aminoácidos pueden ser diseñados y optimizados en su selectividad para corte enzimático por enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Unidad separadora La unidad separadora (-Yy-), cuando está presente (y = 1 ó 2), enlaza una unidad de aminoácido (- w-) a la porción de fármaco (D) cuando una unidad de aminoácido está presente (w=l-12). Como alternativa, la unidad separadora enlaza la unidad extensora a la porción de fármaco cuando la unidad de aminoácido está ausente. La unidad separadora enlaza también la porción de fármaco a la unidad de anticuerpo cuando tanto la unidad de aminoácido como la unidad extensora están ausentes ( , y = 0) . Las unidades separadoras son de doce tipos generales. De auto- inmolación y no de auto- inmolación. Una unidad separadora de no auto-inmolación es una en la cual parte o toda la unidad separadora permanece unida a la porción de fármaco después del corte, particularmente enzimático, de una unidad de aminoácido de conjugado anticuerpo- fármaco o la porción Enlazadora de fármaco. Cuando el ADC que contiene una unidad separadora de glicina-glicina o una unidad separadora de glicina sufre corte enzimático por medio de una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos, una porción de glicina-glicina-fármaco o una porción de glicina-fármaco es cortada de Ab-Aa-Ww- . En una modalidad, una reacción de hidrólisis independiente tiene lugar dentro de la célula objetivo, cortando la porción glicina-fármaco unida y liberando el fármaco.
En otra modalidad, -Yy- es una unidad p-aminobencilcarbamoilo (PAB) cuya porción fenileno es sustituida con Qm en donde Q es alquilo de ^-Ce o -O- (alquilo de Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un entero que varía de 0 a 4.
Las modalidades ejemplares de una unidad separadora no de auto- inmolación (-Y-) son: -Gly-Gly- ; -Gly- ; -Ala-Phe-; -Val-Cit- .
En una modalidad, una porción de fármaco-enlazador o un ADC es provisto en el cual la unidad separadora está ausente (y=0) , o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo .
Como alternativa, un ADC que contiene una unidad separadora de auto- inmolación puede liberar -D. En una modalidad, -Y- es un grupo PAB que está enlazado a -Ww- por medio del átomo de nitrógeno de amino del grupo PAB, y conectado directamente a -D por medio de un carbonato, carbamato o grupo éter, en donde el ADC tiene la estructura ejemplar: en donde Q es -alquilo de Ci-C8, -0- (alquilo de Ci-C8) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que varía de 0-4; y p varía de 1 a 4.
Otros ejemplos de separadores de auto-inmolación incluyen, pero no están limitados a, compuestos aromáticos que pueden ser electrónicamente similares a PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), análogos de PAB heterocíclicos (US 2005/0256030) , beta-glucurónido (WO 2007/011968) y orto o para-aminobencilacetales . Los separadores pueden usarse que sufren ciclización después de hidrólisis unida a amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas o no sustituidas (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] sustituidos adecuadamente (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc . 94:5815) y amidas de ácido 2 -aminofenilpropiónico (Amsberry, et al (1990) J. Org.
Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que son sustituidos en glicina (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447) son también ejemplos de un separador de auto-inmolación útil en ADCs.
Las unidades separadoras ejemplares (-Yy-) son representadas por las fórmulas X-XII: -HN—CH2—CO— XI NHCH2C(0)-NHCH2C(0) XII Enlazadores dendríticos En otra modalidad, el enlazador L puede ser un enlazador tipo dendrítico para fijación covalente de más de una porción de fármaco a través de una ramificación, porción enlazadora multifuncional a un anticuerpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden incrementar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir, carga, la cual está relacionada con la potencia del ADC. Así, cuando un anticuerpo manipulado con cisteína porta sólo un grupo tiol de cisteína reactivo, una multitud de porciones de fármaco pueden ser fijadas a través de un enlazador dendrítico. Las modalidades ejemplares de enlazadores dendríticos ramificados incluyen unidades dendriméricas de 2 , 6 -bis (hidroximetil ) -p-cresol y 2, 4 , 6-tris (hidroximetil) -fenol (WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem.Soc. 125:15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc . 126:1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
En una modalidad, la unidad separadora es un bis (hidroximetil) estireno (BHMS) ramificado, el cual puede ser usado para incorporar y liberar varios fármacos, que tiene la estructura: que comprende una unidad dendrimérica 2- (4-aminobenciliden) propan- 1, 3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), en donde Q es -alquilo de Ci-C8, -0- (alquilo de Cx-Cs) , -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que varía de 0-4; n es 0 ó 1, y p varía de 1 a 4.
Las modalidades ejemplares de los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco de la fórmula I incluyen XlIIa (MC) , XHIb (val-cit) , XIIIc (MC-val-cit) y XHId (MC-val-cit-PAB) : Otras modalidades ejemplares de los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco de la fórmula la incluyen XIVa-e: Y es: y R es independientemente H o alquilo de C!-C6; y n es 1 a 12.
En otra modalidad, un enlazador tiene un grupo funcional reactivo el cual tiene un grupo nucleófilo que es reactivo a un grupo electrofilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, grupos aldehido y cetona carbonilo. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un enlazador incluyen, pero no están limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida . El grupo electrofilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para su fijación a un enlazador.
Típicamente, los enlazadores de tipo péptido pueden prepararse al formar un enlace péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Estos enlaces de péptido pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (E. Schroder and K. Lübke (1965) "The Peptides", volumen 1, pág. 76-136, Academic Press) el cual se conoce bien en el campo de la química de péptidos. Los intermediarios enlazadores pueden ensamblarse con cualquier combinación o secuencia de reacciones incluyendo unidades separadoras, extensoras y Aminoácidos. Las unidades separadoras, extensoras y Aminoácidos pueden emplear grupos funcionales reactivos que sean electrófilos , nucleófilos o de radicales libres en naturaleza. Los grupos funcionales reactivos incluyen, pero no están limitados a carboxilos, hidroxilos, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato y grupos salientes, tales como O-mesilo, 0-tosilo, -Cl, -Br, -I; o maleimida.
Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (-SO3") o amonio, puede incrementar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo enlazador con el anticuerpo o la porción de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermediario anticuerpo-enlazador) con D o D-L (intermediario fármaco-enlazador) con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC.
Reactivos enlazadores Los conjugados del anticuerpo y auristatina pueden elaborarse usando una variedad de reactivos enlazadores bifuncionales tales como propionato de N-uccinimidil-3- (2-piridiltio) (SPDP) , ciclohexan- 1-carboxilato de succinimidil -4- (N-maleimidometilo) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HC1) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6 -diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4 -dinitribenceno) .
Los conjugados de anticuerpo y fármaco también se pueden preparar con reactivos enlazadores: MBPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4 -vinilsulfona) benzoato) e incluyendo reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-bis-maleimidodietilenglicol (BM(PE0)2) y 1,11-bis-maleimidotrietilenglicol (BM(PEO)3), los cuales están disponibles comercialmente de Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL y otros proveedores de reactivos. Los reactivos de bis-maleimida permiten la fijación del grupo tiol de un anticuerpo manipulado con cisteína a una porción de fármaco que contiene tiol, marcador o intermediario enlazador, de una forma secuencial o concurrente. Otros grupos funcionales aparte de maleimida, los cuales son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo manipulado con cisteína, porción de fármaco, marcador o intermediario enlazador incluye yodoacetamida , bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, piridil disulfuro, isocianato e isotiocianato.
BM(PEO)2 BM(PEO)3 Los reactivos enlazadores útiles también se pueden obtener por medio de otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) , o sintetizarse de acuerdo con procedimientos descritos en Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60 : 5352-5355 ; Frisen et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743 ; WO 03/026577; WO 03/043583 y WO 04/032828.
Los extensores de la fórmula (Illa) pueden ser introducidos en un Enlazador al hacer reaccionar los siguientes reactivos enlazadores con el N-terminal de una unidad de aminoácido: en donde n es un entero que varía de 1-10 y T es -H o - S03Na ; en donde n es un entero que varía de 0-3; Las unidades extensoras pueden ser introducidas en un enlazador al hacer reaccionar los siguientes reactivos bifuncionales con el N-terminal de una unidad de aminoácido: en donde X es Br o I .
Las unidades extensoras de la fórmula también se pueden introducir en un enlazador al hacer reaccionar los siguientes reactivos bifuncionales con el N-terminal de una unidad de aminoácido: Un reactivo enlazador de dipéptido de valina-citrulina (val-cit o ve) ejemplar que tiene un Extensor de maleimida y un separador de auto- inmolación de para-aminobencilcarbamoilo (PAB) tiene la estructura: Un reactivo enlazador de dipéptido de phe-lys (Mtr, mono-4 -metoxitritilo) que tiene una unidad extensora de maleimida y una unidad separadora de auto- inmolación PAB puede prepararse de acuerdo con Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, y tiene la estructura: Los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco ejemplares de la invención incluyen: •MC-vc-PAB-MMAE Ab-MC-MMAF en donde Val es valina; Cit es citrulina; ve es valina citrulina; p es 1, 2, 3 ó ; y Ab es un anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) .
Preparación de conjugados de anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína-fármaco El ADC de la fórmula I se puede preparar mediante varias rutas, empleando reacciones de química orgánica, condiciones de reactivos conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo: (1) reacción de un grupo cisteína de un anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo enlazador, para formar un intermediario anticuerpo-enlazador Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido por la reacción con una porción de fármaco activada D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de una porción de fármaco con un reactivo enlazador, para formar el intermediario fármaco-enlazador D-L, por medio de un enlace covalente, seguido por la reacción con un grupo de cisteína de un anticuerpo manipulado con cisteína. Los métodos de conjugación (1) y (2) pueden emplearse con una variedad de anticuerpos manipulados con cisteína, porciones de fármaco y enlazadores para preparar los conjugados anticuerpo- fármaco de la fórmula I.
Los grupos tiol de cisteína de anticuerpos son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en reactivos enlazadores e intermediarios fármaco-enlazador incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida; y (iv) disulfuros, incluyendo piridildisulfuros , mediante intercambio de sulfuro. Los grupos nucleófilos en una porción de fármaco incluyen, pero no están limitados a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores.
Los anticuerpos manipulados con cisteína pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (r-reactivo de Cleland, ditiotreitol ) o TCEP (clorhidrato de (tris (2-carboxietil) fosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol . 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) , seguido por reoxidación para reformar enlaces de disulfuro intercadena e intracadena (ejemplo 17) . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales manipulados con cisteína de longitud completa (ThioMabs) expresados en células CHO son reducidos con aproximadamente un exceso molar de 50 veces de TCEP durante 3 horas a 37°C para reducir enlaces de disulfuro en aductos de cisteína que pudieran formarse entre los residuos de cisteína recién introducidos y la cisteína presente en el medio de cultivo. El tioMab reducido es diluido y cargado en una columna HiTrap S en 10 mM de acetato de sodio, pH 5 , y se diluye con PBS que contiene cloruro de sodio 0.3 . Los enlaces de disulfuro fueron reestablecidos entre los residuos de cisteína presentes en el Mab progenitor con sulfato de cobre acuoso diluido (200 nm) (CuS04) a temperatura ambiente, durante la noche. Como alternativa, ácido deshidroascórbico (DHAA) es un oxidante efectivo para restablecer los grupos disulfuro intracadena del anticuerpo manipulado con cisteína después del corte reductor de los aductos de cisteína. Otros oxidantes, es decir, agentes oxidantes, y condiciones de oxidación, que se conocen bien en la técnica pueden ser usados. La oxidación con aire ambiente también es efectiva. Esta etapa de reoxidación leve y parcial forma disulfuros intracadena de manera eficiente con alta fidelidad y conserva los grupos tiol de los residuos de cisteína recién introducidos. Un exceso de aproximadamente 10 veces del intermediario fármaco-enlazador, por ejemplo, MC-vc-PAB-MMAE , fue añadido, mezclado y dejado reposar durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente para llevar a cabo la conjugación y formar el conjugado anticuerpo- fármaco, tal como CD79b anti-humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) . La mezcla de conjugación se filtró en gel y se cargó y se diluyó a través de una columna HiTrap S para remover el exceso de intermediario fármaco-enlazador y otras impurezas .
La figura 29 muestra el proceso general para preparar un anticuerpo manipulado con cisteína expresado a partir de cultivo celular para conjugación. Cuando el medio de cultivo de células contiene cisteína, los aductos de disulfuro pueden formarse entre el aminoácido de cisteína recién introducido y la cisteína del medio. Estos aductos de cisteína, ilustrados como un círculo en el ThioMab (izquierda) ejemplar en la figura 29, deben ser reducidos para generar anticuerpos manipulados con cisteína reactivos para conjugación. Los aductos de cisteína, presuntamente junto con varios enlaces de disulfuro intercatenarios , son cortados de manera reductora para dar una forma reducida del anticuerpo con agentes reductores tales como TCEP. Estos enlaces de disulfuro intercatenarios entre residuos de cisteína apareados son reformados bajo condiciones de oxidación parcial con sulfato de cobre, DHAA, o exposición a oxígeno ambiente. Los residuos de cisteína recién introducidos, manipulados y no apareados permanecen disponibles para su reacción con reactivos enlazadores o intermediarios fármaco-enlazador para formar los conjugados de anticuerpo de la invención. Los ThioMabs expresados en líneas de células de mamífero se traducen en un aducto de Cys conjugado externamente a un Cys manipulado a través de la formación de enlaces -S-S-. Por consiguiente, los ThioMabs purificados son tratados con los procedimientos de reducción y reoxidación como los descritos en el ejemplo 17 para producir ThioMabs reactivos. Estos reactivos se usan para conjugarse con fármacos citotóxicos que contienen maleimida, fluoróforos y otros marcadores. 10. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-TAHO descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas. Una "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agente tensioactivo que es útil para suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes de liposoma son dispuestos comúnmente en una formación de dos capas, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. , 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 77:4030 (1980); patentes de E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y 097/38731 publicadas el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación incrementado se describen en la patente de E.U.A. No. 5,013,556.
Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol . Chem. , 257:286-288 (1982) Un agente quimioterapéutico está contenid opcionalmente dentro del liposomas. Véase Gabizon et al., J. National Cáncer Inst . 81(19): 1484 (1989). 7 B. Oligopéptidos de unión a TAHO Los oligopéptidos de unión a TAHO de la presente invención son oligopéptidos que se unen, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Los oligopéptidos de unión a TAHO pueden ser químicamente sintetizados usando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o se pueden preparar y purificar usando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de unión a TAHO normalmente tienen al menos alrededor de 5 aminoácidos de largo, como alternativa por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 75, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100 aminoácidos de largo o más, en donde estos oligopéptidos que son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Los oligopéptidos de unión a TAHO pueden identificarse sin experimentación excesiva usando técnicas bien conocidas. A este respecto, se hace notar que las técnicas para tamizar bibliotecas de oligopéptidos para oligopéptidos que sean capaces de unirse específicamente a un objetivo de polipéptido se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos, 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; publicaciones de PCT No. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. , 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol . Meth. , 102:259-274 (1987); SchQOfs et al., J . Immunol . , I40:6ii-6i6 (1988) , C irla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87:6378;. Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 88:8363; y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
A este respecto, el despliegue de bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite a alguien tamizar grandes bibliotecas de oligopéptidos para identificar miembros de esas bibliotecas que sean capaces de unirse específicamente a un objetivo de polipéptido. El despliegue de fagos es una técnica mediante la cual polipéptidos variantes son desplegados de proteínas de fusión a la proteína de cápside sobre la superficie de las partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science, 249:386). La utilidad del despliegue de fagos se basa en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o moléculas de ADNc clonadas aleatoriamente) pueden ser rápida y eficientemente clasificadas para esas secuencias que se unan a una molécula objetivo con alta afinidad. Bibliotecas de despliegue de péptidos (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 87:6378) o proteínas (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) ature, 352:624; Marks , J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 88:8363) en fagos han sido usadas para tamizar millones de polipéptidos u oligopéptidos para aquellos con propiedades de unión específica (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). La clasificación de bibliotecas de fagos de mutantes aleatoriios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para purificación por afinidad usando el receptor objetivo, y un medio para evaluar los resultados de enriquecimientos de unión. Las patentes de E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5 , 571 , 689 y 5 , 663 , 143.
Aunque la mayoría de los métodos de despliegue de fagos han usado fagos filamentosos, los sistemas de despliegue de fagos lambdoides (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de despliegue de fagos T4 ( en et al., Gene, 215:439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58 (15) : 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65 (11) :4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci . , 5:1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10:173 (1995)) y sistemas de despliegue de fagos T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257 (1993); U.S. 5,766,905) también se conocen .
Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de despliegue de fagos básicos han sido ahora desarrolladas. Estas mejoras incrementan la capacidad de los sistemas de despliegue para tamizar bibliotecas de péptidos para unirse a moléculas objetivo seleccionadas y para desplegar proteínas funcionales con el potencial de tamizar estas proteínas para las propiedades deseadas. Dispositivos de combinación combinatorios para reacciones de despliegue de fagos han sido desarrollados (WO 98/14277) y bibliotecas de despliegue de fagos han sido usadas para analizar y controlar interacciones biomoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue de fagos se pone en contacto con una solución en la cual el ligando se unirá a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se unirá a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de unión. WO 97/46251 describe un método para bioanalizar una bilblioteca de despliegue de fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislar el fago de unión, seguido por un proceso de microtamizado usando pocilios de microplaca para aislar fagos de unión de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphylococcus aureus como un marcador de afinidad también ha sido reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech. , 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de substratos para distinguir especificidades de enzima usando una biblioteca combinatoria la cual puede ser una biblioteca de despliegue de fagos. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para usarse en detergentes usando despliegue de fagos se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de unión específicas se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,498, 5,432,018 y WO 98/15833.
Los métodos para generar bibliotecas de péptidos y tamizar estas bibliotecas se describen también en las patentes de E.U.A. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 y 5,723,323.
C . Moléculas orgánicas de unión a TAHO Las moléculas orgánicas de unión a TAHO son moléculas orgánicas que no son oligopéptidos o anticuerpos como los definidos en la presente y que se unen, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente. Las moléculas orgánicas de unión a TAHO pueden identificarse y sintetizarse químicamente usando metodología conocida (véase, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y O00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión a TAHO normalmente tienen menos de aproximadamente 2,000 daltons en tamaño, como alternativa menos de alrededor de 1,500, 750, 500, 250 ó 200 daltons en tamaño, en donde estas moléculas orgánicas que son capaces de unirse, de preferencia específicamente, a un polipéptido TAHO como el descrito en la presente se pueden identificar sin experimentación excesiva usando técnica bien conocidas. A este respecto, se indica que las técnicas para tamizar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que sean capaces de unirse a un objetivo de polipéptido se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. O00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de unión a TAHO pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas , carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidracinas N-sustituidas , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres , disulfuros , ácidos carboxílicos , ásteres, amidas, ureas, carbamatos , carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, arilsulfonatos , haluros de alquilo, alquilsulfonatos , compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos , anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes , oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas , tiazolinas, enaminas , sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazoicos, cloruros de ácido, o similares.
D . Tamizado para anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO y moléculas orgánicas de unión a TAHO con las propiedades deseadas Las técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas que se unen a polipéptidos TAHO han sido descritas arriba. Alguien puede seleccionar además anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee.
Los efectos inhibidores de crecimiento de un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención pueden evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando células que expresen un polipéptido TAHO ya sea endógenamente o después de transfección con el gen TAHO. Por ejemplo, líneas de células tumorales adecuadas y células transfectadas con TAHO pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal anti-TAHO, oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención a varias concentraciones durante pocos días (por ejemplo, 2-7) días y teñirse con violeta de cristal "?' MTT o analizarse durante algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir la proliferación sería comparar la absorción de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO de la invención. Después de tratamiento, las células son cosechadas y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN se cuantifica en un contador por centelleo. Los controles positivos adecuados incluyen tratamiento de una línea de células seleccionada con un anticuerpo inhibidor de crecimiento que se sepa inhiba el crecimiento de esa línea de células. La inhibición de crecimiento de células tumorales in vivo puede determinarse en varias formas conocidas en la técnica. La célula tumoral puede ser una que sobre-exprese un polipéptido TAHO. El anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO inhibirá la proliferación celular de una célula tumoral que exprese TAHO in vitro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con la célula tumoral no tratada, muy preferiblemente en alrededor de 30-100% y todavía más preferiblemente en alrededor de 50-100% o 70- 100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de alrededor de 0.5 a 30 ug/ml. La inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 ug/ml o alrededor de 0.5 nM a 200 n en cultivo de células, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo se cultiva inhibidor in vivo si la administración del anticuerpo an i-TAHO a aproximadamente 1 yg/kg a alrededor de 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción en el tamaño del tumor o la reducción de una proliferación de células tumorales dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses a partir de la primera administración del anticuerpo, de preferencia dentro de alrededor de 5 a 30 días.
Para seleccionar un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO que induzca muerte celular, la pérdida de integridad de membrana como se indica por, por ejemplo, absorción de yoduro de propidio (PI) , azul tripano o 7AAD puede evaluarse en relación de un control. Un ensayo de absorción de PI puede llevarse a cabo en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan polipéptidos TAHO son incubadas con medio solo o medio que contiene el anticuerpo anti-TAHO adecuado (por ejemplo, a aproximadamente 10 µg/ml) , oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO. Las células son incubadas durante un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células son lavadas y se hacen alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con restrictor de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la remoción de racimos de células. Lso tubos reciben después PI (10 ug/ml) . Las muestras pueden analizarse usando citómetro de flujo FACSCAN® y software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO o moléculas orgánicas de unión a TAHO que induzcan niveles estadísticamente significativos de muerte celular como se determina por la absorción de PI pueden seleccionarse como anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO o moléculas orgánicas de unión a TAHO inductoras de muerte celular.
Para tamizar anticuerpos, oligopéptidos y otras moléculas orgánicas que se unan a un epítope en un polipéptido TAHO unido por un anticuerpo de interés, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) , puede ser llevado a cabo. Este ensayo se puede usar para determinar si un anticuerpo de prueba como oligopéptido u otra molécula orgánica se une al mismo sitio o epítope que un anticuerpo anti-TAHO conocido. Como alternativa, o además, el mapeo de epítopes puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpos puede ser mutagenizada tal como por escaneo con alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante es probado inicialmente para su unión con anticuerpo policlonal para asegurar un doblamiento adecuado. En un método diferente, péptidos que corresponden a diferentes regiones de un polipéptido TAHO pueden usarse en ensayos de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido.
E . Terapia con profármaco mediada por enzima dependiente de anticuerpos (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en ADEPT al conjugar el anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO81/01145) en un fármaco anticáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y patente de E.U.A. No. 4,975,278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma más activa y citotóxica.
Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en grupos libres; citocina desaminasa útil para convertir 5 - fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticáncer 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas de corte de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Como alternativa, los anticuerpos con actividad enzimática, conocidos también en la técnica como "abzimas" , pueden usarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987) ) . Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para el suministro de la abzima a una población de células tumorales.
Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-TAHO mediante técnicas bien conocidas en la técnica tales como el uso de reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales descritos arriba. Como alternativa, proteínas de fusión que comprendan al menos una región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención enlazado a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) .
F . Polipéptidos TAHO de longitud completa La presente invención proporciona también secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican para polipéptidos mencionados en la presente solicitud como polipéptidos TAHO. En particular, moléculas de ADNc (parciales y de longitud completa) que codifican para varios polipéptidos TAHO han sido identificadas y aisladas, como se describe en más detalle en los ejemplos abajo.
Como se describe en los ejemplos abajo, varios clones de ADNc han sido depositados en la ATCC. La secuencia de nucleótidos real de esos clones puede determinarse fácilmente por la persona capacitada al secuenciar el clon depositado usando métodos de rutina en la técnica. La secuencia de aminoácidos predicha puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos usando capacidad de rutina. Para los polipéptidos TAHO y ácidos nucleicos de codificación descritos en la presente, en algunos casos, los solicitantes han identificado lo que se cree es el marco de lectura mejor identificable con la información de secuencia disponible en el momento.
G. Anticuerpo anti-TAHO y variantes de polipéptidos TAHO Además de los anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente, se contempla que el anticuerpo anti-TAHO y variantes de polipéptido TAHO pueden prepararse. Anticuerpo anti-TAHO y variantes de polipéptido TAHO pueden prepararse al introducir cambios de nucleótidos adecuados en el ADN de codificación, y/o mediante síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácido pueden alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje a membrana .
Las variaciones en los anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO descritos en la presente pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y lineamientos para las mutaciones conservadoras y no conservadoras mostradas, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifiquen para el anticuerpo o polipéptido que se traduzca en un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo de secuencia nativa o polipéptido. Opcionalmente es la variación es mediante la sustitución de por lo menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO. La guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden ser insertados como sustituidos o suprimidos sin afectar adversamente la actividad deseada puede encontrarse al comparar la secuencia del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO con aquella de moléculas de proteína conocidas homologas y minimizando el número de cambios en secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácido conservadores. Las inserciones o supresiones opcionalmente pueden ser en la escala de alrededor de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse al hacer sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes para actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud completa o madura.
Un anticuerpo anti-TAHO y fragmentos de polipéptido TAHO son provistos en la presente. Estos fragmentos pueden ser truncados en el N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un anticuerpo o proteína nativo de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO.
El anticuerpo anti-TAHO y fragmentos de polipéptido TAHO pueden prepararse mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo incluye generar fragmentos de anticuerpos o polipéptidos a partir de digestión enzimática, por ejemplo, al tratar la proteína con una enzima que se sepa corte proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácido particulares, o al digerir el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislar el fragmento deseado. Otra técnica adecuada incluye aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifique para un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen los términos deseados de fragmento de ADN son empleados en los cebadores 5' y 3' en la PCR. De preferencia, anticuerpo anti-TAHO y fragmentos de polipéptido TAHO comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-TAHO nativo o polipéptido TAHO descrito en la presente.
En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés son mostradas en la tabla 10 bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si estas sustituciones se traducen en un cambio en actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados ejemplarmente sustituciones en la tabla 6, o como se describe más abajo en referencia de clases de aminoácidos, se introducen y los productos se tamizan.
Tabla 10 Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina; leu Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina; leu Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO se logran al seleccionar sustituciones que difieran significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura de base de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el grueso de la cadena lateral. Residuos de origen natural se dividen en grupos a base de propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, tyhr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influencias la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe .
Las sustituciones no conservadoras implicarán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservadores o, más preferiblemente, en los sitios (no conservados) restantes.
Las variaciones pueden hacerse usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a sitio) , tamizado con alanina y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida a sitio [Cárter et al., Nucí . Acids Res . , 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de cásete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo en el ADN clonado para producir el anticuerpo anti-TAHO o ADN de variante de polipéptido TAHO.
El escaneo de análisis de aminoácidos también se puede llevar a cabo para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo que se prefieren son los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de escaneo preferido entre este grupo toda vez que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también preferida típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto oculta como expuesta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chotia, J . Mol . Biol . , 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isostérico.
Cualquier ácido de cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO también puede ser sustituido, generalmente, con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula y prevenir entrelazamiento aberrante. De manera inversa, enlaces de cisteína pueden ser añadidos al anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) .
Un tipo particularmente preferido de variante sustancial incluye sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo progenitor del cual se generan. Una forma conveniente de generar estas variantes sustitucionales incluye la maduración por afinidad usando despliegue de fagos. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas entonces son desplegadas en una forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como funciones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas en fago son después tamizadas para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. Para identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, mutagénesis de escaneo por alanina puede llevarse a cabo para identificar residuos de región hipervariable que contribuyan significativamente la unión a antígeno. Como alternativa, o además, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y polipéptido TAHO humano. Estos residuos de contacto y residuos adyacentes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que estas variantes se generen, el panel de variantes es sujeto a tamizado como se describe en la presente y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para desarrollo adicional.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TAHO se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-TAHO.
H. Modificaciones de anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO Las modificaciones covalentes de anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido seleccionados de un anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO con un agente de derivación orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C-terminales del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para el entrelazamiento de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO a una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para usarse en el método para purificar anticuerpos anti-TAHO, y viceversa. Los agentes de entrelazamiento usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida , por ejemplo, ásteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales , incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3 , 3 ' -ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1 , 8-octano y agentes tales como metil-3 - [ (p-azidofeni ) ditio] propioimidato .
Otras modificaciones incluyen desaminación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina [T.E. Creighton, proteins: Structure and Molecular Properties , .H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar al patrón de glicosilación activo del anticuerpo o polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se intenta para los presentes propósitos que significa eliminar una o más porciones de carbohidrato encontradas en anticuerpo anti-TAHO de secuencia nativa o polipéptido TAHO (ya sea al remover el sitio de glicosilación subyacente o al eliminar la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos) , y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, incluyendo un cambio en la naturaleza y proporciones de las diferentes porciones de carbohidrato presentes.
La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos típicamente es ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la fijación de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tres péptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque 5 -hidroxiprolina o 5 -hidroxilisina también pueden usarse.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO se logra convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contengan una o más de las secuencias de tres péptidos descritas arriba (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO original (para sitios de glicosilación O-enlazada) . La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO puede ser opcionalmente alterada a través de cambios a nivel de ADN, particularmente al mutar el ADN que codifique para el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO en bases preseleccionadas de tal manera que se generen codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados.
Otros medios para incrementar el número de porciones de carbohidrato en el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO es mediante el acoplamiento química o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC. Crit. Rev. Biochem. , pág. 259-306 (1981) .
La remoción de las porciones de carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO pueden lograrse químicamente o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifiquen para residuos de aminoácido que sirvan como objetivos de glicosilación . Las técnicas de desglicosilación química se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys . , 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal . Biochem., 118:131 (1981). El corte enzimático de las porciones de carbohidrato y polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como las descritas por Thotakura et al., Meth. Enzymol . , 138:350 (1987) .
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO comprende enlazar el anticuerpo o polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera mostrada en las patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed. , (1980).
El anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO de la presente invención también puede ser modificado de una manera que forme moléculas quiméricas que comprendan un anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos.
En una modalidad, esta molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO con un polipéptido marcador que proporciona un epítope al cual se pueda unir selectivamente un anticuerpo anti-marcador . El marcador epítope se pone generalmente en el término amino o carboxilo del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO. La presencia de estas formas marcadas con epítope del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido marcador. Asimismo, la provisión del marcador epítope hace posible al anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO ser fácilmente purificado mediante purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-marcador u otro tipo de matriz de afinidad que se una al marcador epítope. Varios polipéptidos marcadores y sus anticuerpos respectivos se conocen bien en la técnica. Ejemplos incluyen marcadores de poly-histidina (poly-his) o poly-histidina-glicina (poly-his-gly) ; el polipéptido marcador flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol . Cell . Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; el marcador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 contra los mismos [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y el marcador de glicoproteína D (gD) de virus del herpes simple y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos marcadores incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6 : 1204-1210 (1988) ] : el péptido del epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido de epítope de a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266 : 15163-15166 (1991)]; y el marcador de péptido de proteína 10 de gen T7 [Lutz-Freymuth et al., Proc . Nati. Acad. Sci., E.U.A., 87:6393-6397 (1990)].
En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO con una inmunoglobulina de una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (conocida también como una "inmunoadhesina" ) , esta fusión sería a la región Fe de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen de preferencia la sustitución de una forma soluble (de dominio de transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de pivote, CH2 y CH3, o las regiones de pivote, CHX, CH2 y CH3 de una molécula de IgGl. Para la producción de las fusiones de inmunoglobulina véase también la patente de E.U.A. No. 5,428,130 expedida el 27 de junio de 1995.
I . Preparación de anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contenga ácido nucleico que codifique para anticuerpo anti-THO y polipéptido TAHO. Por supuesto, se contempla que métodos alternativos, los cuales se conocen bien en la técnica, pueden emplearse para preparar anticuerpos anti-TAHO y polipéptidos TAHO. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adecuada, o porciones de la misma, pueden producirse mediante síntesis de péptidos directa usando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis , W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc . , 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede llevarse a cabo usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática puede lograrse, por ejemplo, usando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO pueden ser sintetizadas químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO deseado. 1. Aislamiento de ADN que codifica para anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO ADN que codifica para el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se crea posea el ARNm del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO, y expresarla a un nivel detectable. En consecuencia, el ADN del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO humano puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada de un tejido humano. El gen que codifica para anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácido nucleico automática) .
Las bibliotecas pueden tamizarse con sondas (tales como oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El tamizado de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo usando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO que codifica para genes es usando la metodología de PC [Sambrook et al., citado arriba, Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)] .
Las técnicas para tamizar una biblioteca de ADNc se conocen bien en la técnica. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionados como sondas deben ser de suficiente longitud y lo suficientemente inambiguas como para que se minimicen los falsos positivos. El oligonucleótido es marcado de preferencia de tal forma que pueda ser detectado luego de su hibridación a ADN en la bilbioteca que esté siendo tamizada. Los métodos de marcado se conocen en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcadores tales como ATP marcada con 32P, biotinilación o marcado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo severidad moderada y alta severidad, se proporcionan en Sambrook et al., citado arriba .
Las secuencias identificadas en estos métodos de tamizado de bibliotecas pueden compararse y alinearse a otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (ya sea a nivel aminoácido o nucleótido) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa se puede determinar usando métodos bien conocidos en la técnica y como se describe en la presente.
Acido nucleico que tenga una secuencia de codificación de proteínas puede obtenerse al tamizar bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente por primera vez, y, si es necesario, usando procedimientos de extensión de cebador convencionales como los descritos en Sambrook et al., citado arriba, para detectar precursores e intermediarios de procesamiento de ARNm que pudieran no haber sido transcritos en forma inversa en ADNc . 2. Selección y transformación de células hospederas Células hospederas se transfectan o transforman con los vectores de expresión a clonación descritos en la presente para la producción de anticuerpos anti-TAHO o polipéptidos TAHO y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifiquen para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden seleccionarse por la persona capacitada sin experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos de células pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al, citado arriba .
Los métodos de transfección de células eucarióticas y transformación de células procarióticas se conocen por la persona capacitada ordinariamente, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediado por liposomas y electroporacion. Dependiendo de la célula hospedera usada, la transformación se lleva a cabo usando técnicas estándares adecuadas para estas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., citado arriba, o electroporacion se usa generalmente para procariontes . La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin estas paredes celulares, el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) puede ser empleado. Los aspectos generales de las transfecciones en sistemas hospederos de células de mamífero han sido descritos en la patente de E.U.A. No. 4,399,216. Las transformaciones de levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact . , 130 : 946 (1977) y Hsiao et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (E.U.A. ), 76:3829 (1979) . Sin embargo, otros métodos para introducir ADN en células, tales como mediante inyección nuclear, electroporación, fusión a protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes , por ejemplo, polibreno, poliornitina, pueden ser usadas. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336 : 348-352 (1988) .
Las células hospederas adecuadas para la clonación y expresión del ADN en los vectores de la presente incluyen procariontes, células de levadura u otras células eucariónticas superiores. Los procariontes adecuados incluyen pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos , por ejemplo, enterobacteriáceas tales como E. coli. Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células hospederas procarióticas adecuadas incluyen las Enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. La cepa W3110 es un hospedero u hospedero progenitor que se prefiere particularmente toda vez que es una cepa hospedera común para las fermentaciones de productos de ADN recombinantes . De preferencia, la célula hospedera secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para llevar a cabo una mutación genética en los genes que codifiquen para proteínas endógenas para el hospedero, con ejemplos de estos hospederos incluyendo la cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo tonA completo; la cepa 9E4 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), la cual tiene el genotipo completo tonA phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kar ; cepa 37D6 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es la cepa 37D6 con una mutación de supresión de degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tenga una proteasa periplásmica mutante descrita en la patente de E.U.A. No. 4,946,783 expedida el 7 de agosto de 1990. Como alternativa, son adecuados métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico .
Anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fe no se requieran, tal como cuando el anticuerpo terapéutico sea conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) , y el propio inmunoconjugado muestre efectividad en destrucción de células tumorales . Anticuerpos de longitud completa tienen vida media en circulación más grande. La producción de E. coli es más rápida y más eficiente en costos. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, U.S. 5,648,237 (Cárter et . Al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.) y U.S. 5,840,523 (Simmons et al.) que describen las regiones de inicio de traducción (TIR) y secuencias de señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes se incorporan en la presente a manera de referencia. Después de la expresión, el anticuerpo es aislado de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de manera similar al proceso para purificar anticuerpo expresado por ejemplo, en células CHO.
Además de los procariontes , microbios eucariónticos tales como hongos filamentosos o levadura son adecuados como hospederos de clonación o expresión para vectores de codificación de anticuerpos anti-TAHO o polipéptidos TAHO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedero eucariótico inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccaromyces pombe (Beach y Nurse, Nature , 290:140
[1981]; EP 139,383 publicada el 2 de mayo de 1985); Kluyveromyces hosts (patente de E.U.A. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (M 98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2 ): 737-742
[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol . , 28:265-278
[1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces tales como Schawnniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de octubre de 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991) , y hospederos de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem . Biophys. Res. Commun. , 112:284-289
[1983]; tilburn et al., Gene, 26:205-221
[1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. , 81: 1470-1474
[1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, E BO J . , 4:475-479
[1985]). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no están limitadas a, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionada de los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloechera, Pichia, Saecharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) .
Las células hospederas adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales, tales como cultivos celulares de almidón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco. Numerosas células baculovirales y variantes y células hospederas de insecto permisivas correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori han sido identificadas. Una variedad de cepas virales para transfeccion están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa califórnica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden usarse como el virus de la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfeccion de células de Spodoptera frugiperda .
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la preparación en células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/ -DHFR (CHO, Uralub et al., Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, TATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 759; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci: 383:44-68 (1982)); células RC 5; células FS4 ; y línea de hepatoma humano (Hep G2) .
Las células hospederas son transformadas con los vectores de expresión a clonación descritos arriba para la producción de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifiquen para las secuencias deseadas. 3. Selección y uso de un vector replicable El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica para anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO puede ser insertado en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico adecuada puede ser insertada en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, ADN es insertado en un sitio de endonucleasa de restricción adecuado usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándares las cuales se conocen por la persona capacitada.
El TAHO puede producirse recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, lo cual puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifique para anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO que sea insertado en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina II estables en calor. Para secreción de levadura la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de levadura invertasa, un líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente de E.U.A. No. 5,010,182), o un líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma o especie relacionada, así como líderes secretores virales.
Los vectores tanto de expresión como clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. Estas secuencias son conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de replicacion de plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen plásmido 2µ es adecuado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que hacen posible la identificación de células competentes para adoptar el ácido nucleico de codificación de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO, tales como DHFR o timidina cinasa. Una célula hospedera adecuada cuando se emplean DHFR tipo silvestre es la línea de células CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usarse en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977) ] .
Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un promotor enlazado operablemente a la secuencia de ácido nucleico de codificación de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para usarse con hospederos procarióticos incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 80:21-25 (1983)]. Los promotores para usarse en sistemas bacterianos también contendrá una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operablemente al ADN que codifique para el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO .
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usarse con hospederos de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J . Biol . Chem . , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa , hexocinasa, piruvato descarboxilasa , fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglicosa isomerasa y glucocinasa.
Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocroma C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para usarse en expresión de levaduras se describen además en EP 73,657.
La transcripción de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO a partir de vectores en células hospederas de mamífero es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela (UK 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviario, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus Simiano 40 (SV40) , de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de los promotores de choque térmico, siempre y cuando estos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospederas .
La transcripción de un ADN que codifica para el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO por eucariontes superiores puede ser incrementada al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de acción cis de ADN, normalmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a- fetoproteína e insulina) . Sin embargo, típicamente se usará un potenciador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío de origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado final del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de codificación del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO, pero de preferencia se ubica en un sitio 5' desde el promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospederas eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas o enucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el AR m. Estas secuencias están disponibles comúnmente de las regiones no traducidas del extremo 5' y ocasionalmente 3' de moléculas de ADN o ADNc eucarióticas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO.
En otros métodos más, vectores y células hospederas adecuadas para la adaptación a la síntesis de anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO en cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al . , ature, 293:620-625 (1981); antei et al. Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Cultivo de las células hospederas Las células hospederas usadas para producir el anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham' s FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle Modificado por Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al . , Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,479; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de E.U.A. Re. 30,985 puede ser usado como un medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede ser complementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , reguladores de pH (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como fármaco GENTAMYCIN™) , elementos residuales (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en la escala micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir a concentraciones adecuadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas usadas previamente con la célula hospedera seleccionada para expresión, y serán aparentes para la persona ordinariamente capacitada. 5. Detección de la amplificación/expresión génica La amplificación y/o expresión génica pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante Southern blotting convencional, Northern blotting para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A., 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada adecuadamente, con base en las secuencias proporcionadas aquí. Como alternativa, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el ensayo se puede llevar a cabo cuando el dúplex se una a una superficie, de tal manera que después de la formación del dúplex sobre la superficie, se pueda detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica, como alternativa, se puede medir mediante métodos inmunitarias , tales como tinción inmunohistoquímica de céllas o secciones de tejido y ensayo del cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluido se muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales , y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido TAHO de secuencia nativa o contra un péptido sintético a base de las secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra secuencias exógenas fusionadas a ADN de TAHO y que codifiquen para un epítope de anticuerpo específico. 6. Purificación de anticuerpo anti-TAHO y polipéptido TAHO Formas de anticuerpo anti-TAHO y polipéptido TAHO pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisado de células hospederas. Si están unidas a membrana, pueden ser liberadas de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las células empleadas en la expresión del anticuerpo anti-TAHO y polipéptido TAHO pueden ser interrumpidas mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación- descongelación, sonificación, ruptura mecánica o agentes de lisis de células.
Puede desearse purificar el anticuerpo anti-TAHO y polipéptido TAHO a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionado en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para unir formas marcadas con epítopes del anticuerpo anti-TAHO y polipéptido TAHO. Varios métodos de purificación de proteínas pueden emplearse y estos métodos se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification; Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del anticuerpo anti-TAHO o polipéptido TAHO particular producido.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como una primera etapa, los restos de partículas, ya sean células hospederas o fragmentos lisados, son removidos, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Techology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular es descongelada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden ser removidos por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Fellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir proteólisis y se pueden incluir anticuerpos para evitar el crecimiento de contaminantes advenedisos.
La composición de anticuerpos preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, la técnica de purificación preferida siendo cromatografía de afinidad. Lo adecuado de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basen en cadenas pesadas ??, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J . 5:15671575 (1986)) . La matriz a la cual se fija el ligando de afinidad comúnmente es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poly (estirendivinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionado en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía SEPHAROSE™ en una resina de intercambio aniónico catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque , SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que será recuperado.
Después de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede ser sujeta a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un regulador de pH de elución a un pH de entre alrededor de 2.5-4.5, llevado a cabo de preferencia a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, alrededor de 0.0.25M de sal) .
J . Formulaciones Farmacéuticas Los conjugados anticuerpo- fármaco (ADC) de la invención pueden administrarse mediante cualquier ruta adecuada para la afección que se tratará. El ADC típicamente se administrará parenteralmente, es decir, por infusión, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intradérmico, intratecal y epidural .
Para tratar estos cánceres, en una modalidad, el conjugado anticuerpo- fármaco se administra mediante infusión intravenosa. La dosis administrada por medio de infusión está en la escala de alrededor de 1 ]ig/m2 a aproximadamente 10,000 g/m2 por dosis, generalmente una dosis a la semana para un total de una, dos, tres o cuatro dosis. Como alternativa, la escala de dosis es de aproximadamente 1 ug/m2 a alrededor de 1,000 g/m2, aproximadamente 1 ]ig/m2 a alrededor de 800 \xg/m2, aproximadamente 1 g/m2 a alrededor de 600 g/m2 , aproximadamente 1 Ug/m2 a alrededor de 400 g/m2 , aproximadamente 10 pg/m2 a alrededor de 500 ug/m2 , aproximadamente 10 g/m2 a alrededor de 300 , aproximadamente 10 ug/m2 a alrededor de : 200 \xg/m2, y aproximadamente 1 ]ig/m2 a alrededor de 200 vg/m2. La dosis puede administrarse una vez al día, una vez por semana, varias veces a la semana, pero menos de una vez al día, varias veces al mes pero menos de una vez al mes, varias veces al mes pero menos de una vez por semana, una vez al mes o intermitentemente para aliviar o eliminar síntomas de la enfermedad. La administración puede continuar en cualquiera de los intervalos descritos hasta la remisión del tumor o síntomas del linfoma, leucemia que esté siendo tratada. La administración puede continuar después de que se logre la remisión o el alivio de los síntomas cuando esta remisión o alivio se prolongue por tal administración continua.
La invención proporciona también un método para aliviar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un paciente que sufra de la enfermedad autoinmune, una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado anticuerpo anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , -fármaco de cualquiera de las modalidades anteriores. En modalidades preferidas el anticuerpo se administra intravenosamente o subcutáneamente. El conjugado anticuerpo- fármaco se administra intravenosamente a una dosis en la escala de alrededor de 1 g/m2 a aproximadamente 100 mg/m2 por dosis en una modalidad específica, la dosis es 1 µg/m2 a alrededor de 500 pg/m2. La dosis se puede administrar una vez al día, una vez por semana, varias veces a la semana, pero menos de una vez al día, varias veces al mes pero menos de una vez al día, varias veces al mes pero menos de una vez por semana, una vez al mes o intermitentemente para liberar o aliviar síntomas de la enfermedad. La administración puede continuar a cualquiera de los intervalos descritos hasta que se logre la liberación de o el alivio de los síntomas de la enfermedad autoinmune. La administración puede continuar después de que se logre el alivio de los síntomas cuando este alivio sea prolongado por la administración continua.
La invención proporciona también un método para tratar un trastorno de células B que comprende administrar a un paciente que sufra de un trastorno de células B, tal como un trastorno proliferativo celular B (incluyendo sin limitación linfoma y leucemia) o una enfermedad autoinmune, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo SN8 de cualquiera de las modalidades anteriores, anticuerpo que no es conjugado a una molécula citotóxica o a una molécula detectable. El anticuerpo típicamente se administrará en una escala de dosis de alrededor de 1 ug/m2 a aproximadamente 1,000 mg/m2.
En un aspecto, la invención proporciona además formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención y/o por lo menos un inmunoconjugado del mismo y/o al menos un conjugado anticuerpo anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , -fármaco de la invención. En algunas modalidades, una formulación farmacéutica comprende (1) un anticuerpo de la invención y/o un inmunoconjugado del mismo, y (2) un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, una formulación farmacéutica comprende (1) un anticuerpo de la invención y/o un inmunoconjugado del mismo, y opcionalmente (2) al menos un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos abajo, el ADC típicamente se administrará parenteralmente , es decir, infusión, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intradérmica, intratecal y epidural .
Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO, moléculas orgánicas de unión a TAHO y/o polipéptidos TAHO usados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica que tenga el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones deseadas, e incluyen reguladores de pH tales como acetato, tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextriñas; agentes quelantes tales como EDTA; sonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa y sorbitol; agentes tensioactivos tales como polisorbato ; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo comprende de preferencia el anticuerpo a una concentración de entre 5-200 mg/ml , de preferencia entre 10-100 mg/ml.
Las formulaciones de la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afecten adversamente unas a otras. Por ejemplo, además de un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido de unión a TAHO o molécula orgánica de unión a TAHO, puede ser deseable incluir en una formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAHO que se una a un epítope diferente en el polipéptido TAHO, o un anticuerpo para algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecte el crecimiento del cáncer particular. Como alternativa, o además, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector . Estas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito deseado.
Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa y gelatina y microcápsulas de metacrilato de polimetilo, respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Preparaciones de liberación prolongada pueden prepararse. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poly (2-hidroxietil-metacrilato) o poly(alcohol vinílico) ) , polilacturos (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT* (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poly-D- (-) -3-hidroxibutírico.
Las formulaciones que se usarán para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración usando membranas de filtración estériles.
K. Tratamiento con anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos de unión a TAHO y moléculas orgánicas de unión a TAHO Para determinar la expresión de TAHO en el cáncer, están disponibles varios ensayos de detección. En una modalidad, la sobre-expresión del polipéptido TAHO puede analizarse mediante inmunohistoquímica (IHC) . Secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor pueden ser sujetas al ensayo IHC y asignárseles un criterio de intensidad de tinción de proteína como sigue: Puntuación 0 - no se observa tinción o la tinción de la membrana se observa en menos de 10% de células tumorales.
Puntuación 1+ - se detecta una tinción de membrana desvanecida/difícilmente perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células sólo son teñidas en parte de su membrana .
Puntuación 2+ - se observa una tinción de membrana débil a moderada completa en más de 10% de las células tumorales.
Puntuación 3+ - se observa tinción de membrana moderada a fuerte completa en más de 10% de las células tumorales.
Los tumores con puntuaciones 0 ó 1+ para expresión de polipéptido TAHO pueden caracterizarse como no sobre-expresión de TAHO, mientras que aquellos tumores con puntuaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse como sobre-expresando TAHO.
Como alternativa, o además, ensayos FISH tales como el INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o TAPTHVISIO 8 (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo en tejido de tumor incrustado en parafina y fijado con formalina para determinar el grado (si lo hay) de sobre-expresión de TAHO en el tumor.
La sobre-expresión o amplificación de TAHO puede evaluarse usando un ensayo de detección in vivo, al administrar una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica) que una la molécula que será detectada y sea marcado con un marcador detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o un marcador fluorescente) y escaneando exactamente al paciente para ubicar el marcador.
Como se describió arriba, los anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención pueden ser útiles para formación en etapas de cánceres que expresen polipéptido TAHO, (por ejemplo, en radioformación de imágenes). Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas también son útiles para la purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAHO de células, para detección y cuantificación de polipéptidos TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot, para matar y eliminar células que expresen TAHO de una población de células mixtas como una etapa en la purificación de otras células.
Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento del cáncer incluye una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para remover el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. La terapia con el anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica puede ser especialmente deseable en pacientes ancianos quienes no toleren la toxicidad y efectos secundarios de quimioterapia bien y en la enfermedad metastática en donde la terapia de radiación tenga utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos y moléculas orgánicas que se dirigen a tumor de la presente invención son útiles para aliviar cánceres que expresen TAHO después del diagnóstico inicial de la enfermedad o durante recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica puede usarse solo, o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiógenos o compuestos marcados radioactivamente, o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. Un tratamiento con anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica se puede administrar en conjunto con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, antes o después de la terapia convencional. Los fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel) , TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se usan en el tratamiento de cáncer, en particular, en pacientes con buen riego. En el presente método de la invención para tratar o aliviar cáncer, el paciente de cáncer se le puede administrar anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica en conjunto con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos anteriores. En particular, se contempla la terapia de combinación con paclitaxel y derivados modificados (véase, por ejemplo, (EP0600517) . El anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica se administrará con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico .
En otra modalidad, el anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica se administra en conjunto con quimioterapia para incrementar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. El Phisicians' Desk Reference (PDR) describe dosis de estos agentes que han sido usadas en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y las dosis de estos fármacos quimioterapéuticos mencionados arriba que son terapéuticamente efectivas dependerá del cáncer particular que se esté tratando, del grado de la enfermedad y de otros factores familiares para el médico de capacidad en la técnica y se puede determinar por el médico.
En una modalidad particular, un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica conjugado con un agente citotóxico se administra al paciente. De preferencia, el inmunoconjugado unido a la proteína TAHO se interna por la célula, dando como resultado eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado para matar en la célula cancerosa a la cual se una. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Ejemplos de estos agentes citotóxicos se describen arriba . e incluyen matiansinoides, caliquiamicinas , ribonuclesas y endonucleasas de ADN.
Los anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos , moléculas orgánicas o conjugados de toxinas de los mismos se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se prefiere.
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. De preferencia esta terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinérgico.
Puede ser también deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos a moléculas orgánicas, con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno de tumor asociado con el cáncer particular.
En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención incluyen la administración combinada de un anticuerpo anti-TAHO (o anticuerpos) , oligopéptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo la co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea y taxanos de hidroxiurea (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . La preparación y programas de dosificación para estos agentes quimioterapéuticos pueden usarse de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes o según se determine empíricamente por el médico capacitado. La preparación y programas de dosificación para esta terapia se describen también en Chemotherapy Service Ed., .C. Perry, Williams & Silkins, Baltimore, MD (1992) .
El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica puede combinarse con un compuesto anti-hormonal , por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti-progesterona tal como onapristona (véase, EP 616 812) ; o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para estas moléculas. Cuando el cáncer que vaya a ser tratado sea cáncer independiente de andrógenos, el paciente puede haber sido previamente sujeto a terapia anti-andrógenos y, después de que el cáncer se vuelva independiente de andrógenos, el anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica y (y opcionalmente otros agentes como los descritos en la presente) puede ser administrado al paciente.
Algunas veces, puede ser benéfico también co-administrar un cardioprotector (para impedir o reducir disfunción miocardíaca asociada con la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sujeto a la remoción quirúrgica de las células cancerosas y/o a terapia de radiación, antes, simultáneamente con o después de la terapia con el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellas actualmente usadas y pueden ser bajadas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis y modo de administración se seleccionará por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis adecuada de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad que se esté tratando, como se definió arriba, la severidad y curso de la enfermedad, de si se está administrando el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica, y a la discreción del médico que atienda. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra adecuadamente al paciente en cualquier momento o durante una serie de tratamientos. De preferencia, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra mediante infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a alrededor de 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, alrededor de 0.1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por medio de una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAHO. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosis diaria típica puede variar de alrededor de 1 ug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se prolonga hasta que ocurra una supresión deseada de síntomas de enfermedad. El progreso de esta terapia se puede monitorear fácilmente mediante métodos y ensayos convencionales y con base a criterios conocidos por el médico u otras personas de capacidad en la técnica.
Aparte de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia génica. Esta administración de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo es abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Véase, por ejemplo, O96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996 que se refiere al uso de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares .
Existen dos enfoques principales para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células de pacientes; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo el ácido nucleico es inyectado directamente en el paciente, normalmente en el sitio en donde el anticuerpo se requiere. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas con membranas porosas las cuales son implantadas en el paciente (véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral .
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del Herpes simple 1 o virus adeno-asociado) y sistemas a base de lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y CD-Chol, por ejemplo) . Para una revisión de los protocolos de terapia génica y de marcación génica conocidos actualmente véase Anderson et al., Science , 256:808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas ahí.
Los anticuerpos anti-TAHO de la invención pueden estar en diferentes formas abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. Así, los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos se secuencia nativa o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusión una secuencia de anticuerpos es fusionada a una secuencia de polipéptido heteróloga. Los anticuerpos pueden ser modificados en la región Fe para proporcionar funciones efectoras deseadas. Como se describe en más detalle en las secciones de la presente, con las regiones Fe adecuadas, el anticuerpo desnudo unido sobre la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por medio de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o al reclutar complemento en citotoxicidad dependiente de complemento, o algún otro mecanismo. Como alternativa, cuando sea deseable eliminar o reducir la función efectora, para de esta manera minimizar efectos secundarios o complicaciones terapéuticas, pueden usarse ciertas otras regiones Fe .
En una modalidad, el anticuerpo compite para unión o se une sustancialmente al mismo epítope que los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos anti-TAHO de la invención también se contemplan, específicamente incluyendo la dirección a tumor in vivo y cualquier inhibición de proliferación celular o características citotóxicas.
Los métodos para producir los anticuerpos anteriores se describen en detalle en la presente.
Los presentes anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos y moléculas orgánicas son útiles para tratar un cáncer que exprese TAHO o para aliviar uno o más síntomas de cáncer en un mamífero. Este cáncer incluye, pero no está limitado a, cánceres hematopoyéticos o cánceres relacionados con la sangre, tales como linfoma, leucemia, mieloma y malignidads linfoides, pero también cánceres del bazo y cánceres de los nodulos linfáticos. Ejemplos más particulares de estos cánceres asociados a células incluyen, por ejemplo, linfornas de alto, intermedio y bajo grado (incluyendo linfornas de células B tales como, por ejemplo, un linfoma de células B de tejido linfoide asociado a mucosa y linfoma no Hodgkin, linfoma de células de manto, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células grandes difusas, linfoma folicular y linfoma de Hodgkin y linfornas de células T) y leucemias (incluyendo leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, tal como leucemia de células B (linfocitos B CD5+) , leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfoblástica aguda y mielodisplasia) , mieloma múltiple, tal como malignidad de células plasmáticas, y otros cánceres hematológicos y/o asociados con células B o células T. Los cánceres abarcan cánceres metastásicos de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es capaz de unirse a por lo menos una porción de las células cancerosas que expresan polipéptido TAHO en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es efectivo para destruir o matar células de tumor que expresen TAHO o inhibir el crecimiento de estas células tumorales, in vitro o in vivo, luego de unirse al polipéptido TAHO en la célula. Este anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAHO desnudo (no conjugado a ningún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades citotóxicas o de inhibición de crecimiento celular pueden equiparse más con un agente citotóxico para hacerlos todavía más potentes en la destrucción de células tumorales. Las propiedades citotóxicas pueden conferirse a un anticuerpo anti-TAHO mediante, por ejemplo, conjugación del anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como el descrito en la presente. El agente citotóxico o un agente de inhibidor de crecimiento es de preferencia una molécula pequeña. Toxinas tales como caliquiamicina o un maitansinoide y análogos o derivados de los mismos son preferibles .
La invención proporciona además una composición que comprende un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica de la invención, y un portador. Para los propósitos de tratar cáncer, se pueden administrar composiciones a un paciente que requiera de este tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAHO presentes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad más, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o inhibidores de crecimiento, incluyendo agentes quimioterapéuticos . La invención proporciona también formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica de la invención, y un portador. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es ácidos nucleicos aislados que codifican para los anticuerpos anti-TAHO. Los ácidos nucleicos que codifican tanto para las cadenas H como L y especialmente los residuos de la región hipervariable , cadenas que codifican para el anticuerpo de secuencia nativa así como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo, son abarcados.
La invención proporciona también métodos útiles para tratar un cáncer que exprese polipéptido TAHO o aliviar uno o más síntomas de cáncer en un mamífero, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden ser administradas en corto plazo (agudo) o crónico, o intermitente como lo indique el médico. Se proporcionan también métodos para inhibir el crecimiento y matar una célula que exprese polipéptido TAHO.
La invención proporciona también kits y artículos de manufactura que comprenden al menos un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica. Los kits que contienen anticuerpos anti-TAHO, oligopéptidos o moléculas orgánicas encuentran uso, por ejemplo, para ensayos de eliminación de células TAHO, para purificación o inmunoprecipitación de anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica acoplado a esferas (por ejemplo, esferas de sefarosa) . Los kits pueden ser provistos los cuales contengan los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot . Este anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica útil para la detección puede ser provisto con un marcador tal como un marcador fluorescente o radioactivo.
L. Tratamientos con conjugado anticuerpo-fármaco Se contempla que los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente invención pueden usarse para tratar varias enfermedades o trastornos, por ejemplo, caracterizados por la sobre-expresión de un antígeno tumoral . Las condiciones ejemplares o trastornos hiperproliferativos incluyen tumores benignos o malignos; leucemia y malignidades linfoides. Otros incluyen trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos, glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales, blastocélicos , inflamatorios, angiogénicos e inmunitarias , incluyendo autoinmunitarios .
Los compuestos ADC que se identifican en los modelos animales y ensayos a base de células pueden probarse más en primates superiores portadores de tumor y pruebas clínicas en humanos. Pruebas clínicas en humanos pueden diseñarse para probar la eficacia del anticuerpo monoclonal anti-TAHO, tal como anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , o inmunoconjugado de la invención en pacientes que presenten un trastorno proliferativo celular B incluyendo sin limitación linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células de manto. La prueba clínica puede diseñarse para evaluar la eficacia de un ADC en combinaciones con regímenes terapéuticos conocidos, tales como radiación y/o quimioterapia incluyendo agentes quimioterapéuticos y/o citotóxicos.
Generalmente, el trastorno de enfermedad que será tratado es una enfermedad hiperproliferativa tal como un trastorno proliferativo celular B y/o un cáncer de células B. Ejemplos de cáncer que será tratado en la presente incluyen, pero no están limitados a, trastornos proliferativos de células B seleccionados de linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células de manto.
El cáncer puede comprender células que expresen TAHO, tales como células que expresen CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , de tal forma que el ADC de la presente invención sea capaz de unirse a las células cancerosas. Para determinar la expresión del polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , en el cáncer, varios ensayos de diagnóstico/prognóstico están disponibles. En una modalidad, la sobre-expresión del polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , puede analizarse mediante IHC. Secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor pueden ser sujetas al ensayo IHC y asignárseles un criterio de intensidad de tinción de proteína TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) , con respecto al grado de tinción y qué proporción de células tumorales sea examinada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada de un ADC dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, como se definió arriba, la severidad y curso de la enfermedad, si la molécula es administrada para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, así como la discreción del médico que atienda. La molécula se administra adecuadamente al paciente para una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo de severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de molécula es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea que, por ejemplo, mediante cualquiera de una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Una dosis ejemplar de ADC que se administrará a un paciente está en la escala de alrededor de 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente.
Para administración repetida durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento es prolongado hasta que ocurra una supresión de los síntomas de la enfermedad deseada. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 2 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2. Otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
M. Terapia de combinación Un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención puede combinarse en una formulación de combinación farmacéutica, o régimen de dosificación como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tenga propiedades anticáncer. El segundo compuesto de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene de preferencia actividades complementarias para el ADC de la combinación de tal manera que no afecte adversamente unos a otros .
El segundo compuesto puede ser un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente hormonal y/o cardioprotector . Estas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito deseado. Una composición farmacéutica que contenga un ADC de la invención puede tener también una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente quimioterapéutico tal como un inhibidor de formación de tubulina, un inhibidor de topoisomerasa o un aglutinante de ADN.
En un aspecto, el primer compuesto es ADC anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) , de la invención y el segundo compuesto es un (anticuerpo desnudo o un ADC) . En una modalidad el segundo compuesto es un anticuerpo anti-CD20 rituximab (Rtiuxan o 2H7 (Genentech, Inc. South San Francisco, CA) . Otros anticuerpos útiles para inmunoterapia combinada con ADCs anti-CD79b de la invención incluyen sin limitación anti-VEGF ® (por ejemplo, Avastin ) .
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración de un agente anticáncer identificado de acuerdo con esta invención, incluyendo sin limitación terapia de radiación y/o transplantes de médula ósea y sangre periférica, y/o un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento. En una de estas modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tales como, por ejemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™) , prednisolona, CHOP, CVP o COP, o inmunoterapéuticos tales como anti-CD20 (por ® ® ejemplo, Rituxan ) o anti-VEGF (por ejemplo, Avastin ) .
La terapia de combinación se puede administrar como un régimen simultáneo o secuencial . Cuando se administra secuencialmente, la combinación puede administrarse en dos o más administraciones. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo entre ambos agentes activos (o todos) ejerzan simultáneamente sus actividades biológicas.
En una modalidad, el tratamiento con ADC incluye la administración combinada de un agente anticáncer identificado en la presente, y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos . Los agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . La preparación y programas de dosificación para estos agentes quimioterapéuticos pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según se determine empíricamente por el practicante capacitado. La preparación y programas de dosificación para esta quimioterapia también se describen en "Chemotherapy Service", (1992) Ed. , M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD.
Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son aquellas actualmente usadas y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente recién identificado y otros agentes quimioterapéuticos o tratamientos.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y probar ser "sinérgica", es decir, el efecto logrado cuando los ingredientes activos usados juntos es mayor que la suma de los efectos que resulta de usar los compuestos por separado. Un efecto sinérgico puede lograrse cuando los ingredientes activos son: (1) co- formulados y administrados o suministrados simultáneamente en una formulación de dosis única y combinada; (2) suministrados por alternación o en paralelo con formulaciones separadas; o (3) mediante algún otro régimen. Cuando se suministran en terapia de alternación, un efecto sinérgico puede lograrse cuando los compuestos se administren o suministren secuencialmente, por ejemplo, mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternación, una dosis efectiva de cada ingrediente activo se administra secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en la terapia de combinación, dosis efectivas de dos o más ingredientes activos son administradas juntas.
N . Artículos de manufactura y kits Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de un cáncer que exprese anti-TAHO. El artículo de manufactura comprende una recipiente-etiqueta o inserto de base sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la afección cancerosa y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial que tenga un tapón que pueda perforarse por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. La etiqueta o inserto de envase indica que la composición se usa para ^tratar cáncer. La etiqueta o inderto de envase comprenderá además instrucciones para administrar el anticuerpo, oligopéptido o composición de molécula orgánica al paciente de cáncer. Además, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina de pH regulado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas .
Se proporcionan también kits que son útiles para varios propósitos, por ejemplo, para ensayos de eliminación en células que expresan TAHO, para purificación o inmunoprecipitación de polipéptido TAHO de células. Para el aislamiento y purificación de polipéptido TAHO, el kit puede contener un anticuerpo anti-TAHÓ, oligopéptido o molécula orgánica acoplado a esferas (por ejemplo, esferas de sepharose) . Se pueden proporcionar kits que contengan los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación del polipéptido TAHO in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot. Al igual que con el artículo de manufactura, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de envase sobre o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-TAHO, oligopéptido o molécula orgánica de la invención. Recipientes adicionales pueden incluirse que contengan, por ejemplo, diluyentes y reguladores de pH, anticuerpos de control. La etiqueta o inserto de envase puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso in vitro o de detección deseado.
O . Usos para los polipéptidos TAHO y ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos TAHO Secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican para polipéptidos TAHO tienen varias aplicaciones en la técnica de biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de sondas de AR y ADN antisentido. Acido nucleico de codificación de TAHO también será útil para la preparación de polipéptidos TAHO mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente, en donde esos polipéptidos TAHO pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos anti-TAHO como la descrita en la presente .
El gen TAHO de secuencia nativa de longitud completa, o porciones del mismo, se puede usar como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADN de TAHO de longitud completa o para aislar aún otras moléculas de ADNc (por ejemplo, aquellas que codifiquen para variantes de origen natural de TAHO o TAHO de otras especies) las cuales tengan una identidad de secuencia deseada con la secuencia de TAHO nativa descrita en la presente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a alrededor de 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de al menos regiones parcialmente novedosas de las secuencias de nucleótidos nativa de longitud completa en donde esas regiones pueden determinarse sin experimentación excesiva o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos potenciadores e introñes de TAHO de secuencia nativa. A manera de ejemplo, un método de tamizado comprenderá aislar la región de codificación del gen TAHO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas por una variedad de marcadores, incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35S, o marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda por medio de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina . Las sondas marcadas que tengan una secuencia complementaria a aquella del gen TAHO de la presente invención pueden usarse para tamizar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o AR m para determinar a qué miembros de estas bibliotecas híbrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle en los ejemplos abajo. Cualquier secuencia EST descrita en la presente solicitud similarmente puede emplearse como sondas, usando los métodos descritos en la presente.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de codificación de TAHO incluyen oligonucleotidos antisentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse a ARNm de TAHO objetivo (sentido) o a secuencias (antisentido) de ADN de TAHO. Los oligonucleotidos antisentido o de sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de ADN de TAHO. Este fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, de preferencia alrededor de 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o de sentido, con base en la codificación de secuencia de ADNc para una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques . 6:958, 1988).
La unión de oligonucleotidos de antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico objetivo resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno de varios medios, incluyendo degradación incrementada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Estos métodos son abarcados por la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido pueden entonces ser usados para bloquear la expresión de proteína TAHO, en donde estas proteínas TAHO pueden jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos. Los oligonucleótidos antisentido o de sentido comprenden además oligoncleótidos que tienen estructuras de base de fosfodiéster-azúcar modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde estos enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Estos oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero conservan la especificidad de secuencia para poder unirse a secuencias de nucleótidos objetivo.
Los sitios intragénicos que se prefieren para la unión antisentido incluyen la región que incorpora el codón de inicio/detención de traducción ( 5 ' -AUG/5 ' -ATG) o codón de terminación/paro (5'-UAA, 5'-UAG y 5-UGA/5 ' -TAA, 5'-TAG y 5'-TGA) del marco de lectura abierta (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del ARNm o gen que abarca alrededor de 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de inicio o terminación de traducción. Otras regiones preferidas para unión antisentido incluyen: intrones; exones; uniones intrón-exón; el marco de lectura abierta (ORF) o "región de codificación", el cual es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción. La tapa 5' de un ARNm que comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del ARNm por medio de un enlace de trifosfato 5' -5' e incluye la propia estructura de tapa 5' así como los primeros 50 nucleotidos adyacentes a la tapa. La región no traducida 5' (5'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 5' a partir del codón de inicio de traducción, y de esta manera incluyendo nucleotidos entre el sitio de tapa 5' y el codón de inicio de traducción de un ARNm o nucleotidos correspondientes en el gen; y la región no traducida 3' (3'-UTR), la porción de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de traducción, y de esta manera incluyendo nucleotidos entre el codón de terminación de traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleotidos correspondientes en el gen.
Ejemplos específicos de compuestos antisentido que se prefieren y útiles para inhibir la expresión de proteína TAHO incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras de base modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los oligonucleótidos que tienen estructuras de base modificadas incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en la estructura de base y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura de base. Para los propósitos de esta descripción, y como algunas veces se referencia en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tengan un átomo de fósforo en su estructura de base internucleósidos también se pueden considerar como oligonucleósidos . Las estructuras de base de oligonucleótidos modificadas que se prefieren incluyen, por ejemplo, fosforotioatos , fosforotioatos quirales, fosforoditioatos , fosfotriésteres , ésteres aminoalquilfosfotriésteres , fosfonatos de metilo y otros de alquilo incluyendo fosfonatos de 3 ' -alquileno, fosfonatos de 5' -alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluendo 3 ' -aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos , tionofosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres , selenofosfatos y borano-fosfatos que tengan enlaces 3' -5' normales, análogos 2' -5' enlazados de éstos, y aquellos que tengan polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleótidos sea un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un solo enlace 3' a 3' en el enlace internucleótido más 3' es decir, un residuo de nucleósido invertido individual el cual puede ser abásico (la nucleobase esté ausente o tenga un grupo hidroxilo en lugar de la misma) . Varias sales, sales mixtas y formas de ácido libre (3 también se incluyen. Patentes de Estados Unidos representativas que diseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no están limitadas a, patentes de E.U.A. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,63,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia.
Las estructuras de base de oligonucleótidos modificadas que se prefieren que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras de base que se forman por enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósidos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras de base de siloxano; estructuras de base de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de base de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de base de formacetilo y tioformacetilo metileno; estructuras de base de riboacetilo; estructuras de base que contienen alqueno; estructuras de base de sulfamato; estructuras de base de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de base de sulfonato y sulfonamida ; estructuras de base de amida y otros que tengan partes de componentes N, 0, S y CH.2 mixtas. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de estos oligonucleótidos incluyen, pero no están limitadas a, patente de E.U.A. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia.
En otros oligonucleótidos antisentido que se prefieren, tanto el enlace de azúcar como internucleósidos , es decir, la estructura de base, de las unidades de nucleótido son reemplazados con grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico adecuado. Uno de estos compuestos oligoméricos , un mimético de oligonucleótido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se conoce como un ácido nucleico péptido (PNA) . En compuestos PNA, la estructura de base de azúcar de un oligonucleótido es reemplazada con una estructura de base que contiene amida, en particular una estructura de base de aminoetilglicina . Las nucleobases se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura de base. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos PNA incluyen, pero no están limitadas a, patentes de E.U.A. Nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia. Enseñanza adicional de compuestos PNA puede encontrarse en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Los oligonucleótidos antisentido que se prefieren incorporan estructuras de base de fosforotioato y/o estructuras de base de heteroátomos , y en particular -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3) -0-CH2- [conocido como una estructura de base de metileno (metilenimino) o MMI] , -CH20-N (CH3) -CH2- , -CH2-N(CH3) -N(CH3) -CH2- y -0-N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura de base de fosfodiéster nativa es representada como -0-P-0-CH2-] descrita en la patente de E.U.A. No. 5,489,677 referenciada arriba, y las estructuras de base de amida de la patente de E.U.A. No. 5,602,240 referenciada arriba. Se prefieren también los oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras de base morfolino de la patente de E.U.A. No. 5,034,506 mencionada arriba.
Los oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar sustituidas. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; O-alquilo, S-alquilo o N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo; u O-alquilo-0-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de Ci a Ci0 o alquenilo y alquinilo de C2 a Cío sustituidos o no sustituidos. Se prefieren particularmente 0 [ (CH2) n0] mCH3 , 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3í 0(CH2)nONH2, y 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2, en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido que se prefieren comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : alquilo de Ci a Ci0 inferior, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo u 0-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl , Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02, CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo , heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de corte de AR , un grupo reportero, un intercalador , un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación que se prefiere incluyen 2 ' metoxietoxi (2 ' -0-CH2CH20CH3 , también conocida como 2'-0-(2-metoxietilo) o 2'-M0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta. 1995, 78, 486-504) , es decir, un grupo alcoxialcoxi . Una modificación preferida más incluye 2 ' -dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo 0 (CH2) 20N (CH3) 2 , también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos en la presente abajo, y 2 ' -dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2 ' -O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAE0E), es decir, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2) .
Una modificación preferida más incluye ácidos nucleicos asegurados (LNAs) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está enlazado al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando así una porción de azúcar bicíclica. El enlace es de preferencia un grupo metileno (-CH2-)n que puentea el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 ó 2. Los LNAs y preparaciones de los mismos se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2 ' -metoxi (2'- 0-CH3) , 2 ' aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2NH2) , 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2) , 2'-0-alilo (2 ' -0-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación 2' puede ser en la posición arabino (superior) o posición ribo (inferior). Una modificación 2' -arabino es 2'-F. Modificaciones similares también pueden hacerse en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en oligonucleótidos 2' -5' enlazados y la posición 5' de nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como porciones ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo . Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de estas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitadas a, patentes de E.U.A. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales incorporada en la presente a manera de referencia en su totalidad.
Los oligonucleótidos también pueden incluir nucleobases (conocidas comúnmente en la técnica simplemente como "base") modificaciones o sustituciones. Según se usa en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracilo y citosina y otros derivados alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8 -sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina . Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como feoxazina citidina (lH-pirimido [4 , 5-b] [1 , 4] benzoxazin-2 (3H) -ona) , fenotiazina citidina ( lH-pirimido [5 , 4 -b] [1, 4] benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9- (2-aminoetoxi) -H-pirimido [5, 4-b] [1 , ] benzoxazin-2 (3H) -ona) , citidina carbazol (2H-pirimido [4 , 5-b] indol-2-ona) , citidina piridoindol (H-pirido [3 ' , 2 ' : 4 , 5] pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-2-ona) . Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base de purina o pirimidina sea reemplazada con otros heterociclos , por ejemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en la patente de E.U.A. No. 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapiridimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado incrementar estabilidad de dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2 grados centígrados (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, boca Ratón, 1993, pág. 276-278) y son las sustituciones de base que se prefieren, todavía más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2 ' -O-metoxietilo . Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no están limitadas a: patente de E.U.A. No. 3,687,808, así como las patentes de E.U.A. Nos: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia.
Otras modificaciones de oligonucleótidos antisentido que enlazan químicamente al oligonucleótido una o más porciones o conjugados que incrementan la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucléotido . Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles , poliéteres, grupos que incrementan las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que incrementan las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos catiónicos, fosfolípidos , fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas , rodaminas, coumarinas y colorantes. Los grupos que incrementan las propiedades farmacodinámicas , en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómeros, incrementan la resistencia de oligómeros a degradación y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con ARN. Los grupos que incrementan las propiedades farmacocinéticas , en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción de oligómeros. Las porciones conjugadas incluyen pero no están limitadas a porciones lípidas tales como una porción colesterol (Letsinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico ( anoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let . , 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y.
Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al . , Bioorg. Med. Chem. Let . , 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al . , Nucí. Acids. Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-tglicerol o 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al.. Nucí. Acids. Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta. 1995, 1264, 229-237), o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil -oxicolesterol . Los oligonucleótidos de la invención también pueden ser conjugados a sustancias de fármaco activas, por ejempo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, quetoprofeno, (S) - (+) -pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2 , 3 , 5 -triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folinico, una benzotiadiazida, clorotiadiazida , una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Los conjugados oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la solicitud de patente de E . U.A. No . de serie 09/334, 130 (presentada el 15 de junio de 1999) y patentes de Estados Unidos Nos 4,828,979; 4,948,882; 5, 218, 105; 5,525,465; 5,541, 313; 5, 545, 730; 5, 552, 538; 5, 578, 717, 5, 580, 731; 5,580,731; 5,591,584; 5, 109, 124; 5, 118, 802; 5, 138, 045; 5,414, 077 ; 5,486, 603; 5, 512,439; 5, 578, 718; 5, 608, 046; 4, 587, 044 ; 4,605, 735; 4, 667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941 ; 4,835,263; 4, 876, 335; 4, 904, 582; 4, 958, 013; 5, 082, 830; 5, 112, 963,· 5, 214, 136; 5, 082 , 830; 5, 112 , 963 ; 5,214, 136; 5, 245, 022; 5,254,469; 5, 258, 506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5, 317, 098; 5, 371, 241, 5, 391, 723 ; 5,416, 203 ; 5,451,463; 5, 510, 475; 5, 512, 667; 5,514,785; 5,565,552; 5, 567, 810; 5, 574, 142; 5, 585, 481; 5, 587, 371; 5,595,726; 5,597,696; ! 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia .
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado sean modificadas uniformemente, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas arriba puede incorporarse4 en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención incluye también compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras" , en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos , que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida de al menos una unidad monomérica, es decir un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido . Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en la que el oligonucleótido es modificado para de esta manera conferir en el oligonucleótido resistencia incrementada a degradación por nucleasa, absorción celular incrementada y/o afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucléotido puede servir como un substrato para enzimas capaces de cortar híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A manera de ejemplo, R asa H es una endonucleasa celular que corta la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de RNasa H, por lo tanto, se traduce en el corte del objetivo de ARN, de esta manera incrementando ampliamente la eficacia de inhibición de oligonucleótidos de la expresión génica. En consecuencia, resultados comparables pueden comúnmente obtenerse con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con los desoxioligonucleótidos de fósforotioato que hibridan a la misma región objetivo. Compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótido como los descritos arriba. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos que se prefieren incorporan al menos un azúcar 2' modificado (de preferencia 2 ' -0- (CH2) 2-0-CH3) en la terminal 3' para conferir resistencia nucleasa y una región con al menos 4 azúcares 2'-H contiguos para conferir actividad RNasa H. Estos compuestos también han sido referidos en la técnica como híbridos o espaciómeros . Los espaciómeros que se prefieren tienen una región de azúcares modificados 2' (de preferencia 2 ' -0- (CH2) 2-0-CH3) en la terminal 3' y en la terminal 5' separadas por al menos una región que tiene al menos 4 azúcares 2'-H contiguos y de preferencia incorporan enlaces de estructura de base de fósforotioato . Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de estas estructuras híbridas incluyen, pero no están limitadas a, patentes de E.U.A. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 y 5,700,922, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad.
Los compuestos antisentido usados de acuerdo con esta invención pueden hacerse convenientemente y rutinariamente a través de la bien conocida técnica de síntesis en fase sólida. Equipo para esta síntesis es vendido por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, California) . Cualquier otro medio para esta síntesis conocida en la técnica puede emplearse además o alternativamente. Se conoce bien el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fósforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden ser mezclados, encapsulados , conjugados o de otra manera asociados con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos tales como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la absorción, distribución y/o captación. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de estas formulaciones de ayuda de captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no están limitadas a, patentes de E .U .A. Nos 5,108,921; 5, 354, 844 ; 5,416, 016; 5,459, 127; 5, 521, 291; 5,543, 158; 5, 547, 932; 5, 583, 020; 5,591, 721; 4,426, 330; 4,534, 899; 5, 013, 556; 5, 108, 921; 5,213, 804; 5,227, 170; 5,264,221; 5, 356, 633; 5, 395, 619; 5,416, 016; 5,417, 978; 5,462, 854; 5,469, 854; 5, 512, 295; 5, 527, 528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales incorporada en la presente a manera de referencia .
Otros ejemplos de oligonucléotidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que son enlazados covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquellos descritos en WO 90/1048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tales como poli- (L-lisina) . Además, agentes de intercalación, tales como elipticina,- y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden ser fijados a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido de antisentido o sentido para la secuencia de nucleótidos objetivo.
Los oligonucleótidos antisentido o de sentido pueden ser introducidos en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaP04, electroporación o mediante el uso de vectores de transferencia génica tales como virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o de sentido es insertado en un vector retroviral adecuado. Una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641) .
Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden ser introducidos en una célula que contenga la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como la descrita en WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unan a receptores de superficie celular. De preferencia, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.
Como alternativa, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contenga la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como el descrito en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido de sentido o antisentido se disocia de preferencia dentro de la célula por una lipasa endógena.
Moléculas de ARN o ADN antisentido o de sentido generalmente tienen aproximadamente 5 nucleótidos de largo, como alternativa por lo menos alrededor de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 5340, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 890, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ó 1000 de nucleótidos de largo, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia más o menos 10% de esa longitud referenciada .
Las sondas también pueden emplearse en técnicas de PCR para generar un fondo de secuencias para identificación de secuencias de codificación de TAHO estrechamente emparentadas.
Secuencias de nucleótidos que codifican para un TAHO también pueden usarse para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifique para el TAHO y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente pueden ser mapeadas a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos y tamizado de hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias de codificación para TAHO codifican para una proteína que se una a otra proteína (ejemplo, cuando el TAHO es un receptor) , el TAHO puede ser usado en ensayos para identificar las demás proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante estos métodos, los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando pueden ser identificados. Las proteínas implicadas en estas interacciones de unión también se pueden usar para tamizar inhibidores de moléculas peptidasa pequeñas o agonistas de la interacción de unión. Asimismo, el TAHO receptor puede usarse para aislar ligandos correlativos. Ensayos de tamizado pueden diseñarse para encontrar compuestos líderes que imiten la actividad biológica de un TAHO nativo o un receptor para TAHO. Estos ensayos de tamizado incluirán ensayos viables para el tamizado de alta emisión de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos de fármaco de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de tamizado bioquímico, inmunoensayos y ensayos a base de células, los cuales son bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican para TAHO o sus formas modificadas también se pueden usar para generar ya sea animales transgénicos o animales con gen suprimido los cuales, a su vez, sean útiles en el desarrollo y tamiz de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que contiene células que contienen un transgén, transgén que fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgén es un ADN que es integrado en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, ADNc que codifica para TAHO puede usarse para clonar ADN genómico que codifique para TAHO de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas usarse para generar animales transgénicos que contengan células que expresen ADN que codifique para TAHO. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares serían dirigidas hacia la incorporación de transgénes TAHO con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica para TAHO introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden usarse para examinar el efecto de expresión incrementada de ADN que codifique para TAHO. Estos animales pueden usarse como animales de prueba para reactivos aunque para conferir protección de, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobre-expresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal es tratado con el reactivo y la incidencia reducida de la afección patológica, en comparación con animales no tratados que porten el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial para la afección patológica.
Como alternativa, los homólogos no humanos de TAHO pueden usarse para construir un animal con gen suprimido TAHO el cual tenga un gen defectuoso o alterado que codifique para TAHO como resultado de recombinación homologa entre el gen endógeno que codifique para TAHO y el ADN genómico alterado que codifique para TAHO introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, ADNc que codifique para TAHO puede usarse para clonar ADN genómico que codifique para TAHO de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifique para TAHO puede ser suprimida o reemplazada con otro gen, tal como un gen que codifique para un marcador seleccionable que pueda usarse para monitorear la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN de flanqueo no alterado (tanto en los extremos 5' como 3') son incluidas en el vector [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi , Cell . 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos] . El vector es introducido en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado homologamente con el ADN endógeno son seleccionadas [véase, por ejemplo, Li et al'., Cell , 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas son después inyectadas en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pág. 113-152] . Un embrión quimérico puede ser después implantado en un animal sustituto hembra seudo-preñado adecuado y el embrión llevarse a término para crear un animal con gen suprimido. La progenie que porte el ADN recombinado homologamente y sus células germinales puede ser identificada mediante técnicas estándares y usada para criar animales en los cuales todas las células del animal contengan el ADN recombinado homologamente . Los animales con gen suprimido pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia de polipéptido TAHO.
Acido nucleico que codifique para los polipéptidos TAHO también puede usarse en terapia génica. En aplicaciones de terapia génica, se introducen genes en células para lograr síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para el reemplazo de un gen defectuoso.
"Terapia génica" incluye terapia génica tanto convencional en la que un efecto duradero se logra por un solo tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, que incluye la administración a tiempo o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Las moléculas de ARN y ADN antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que oligonucleótidos antisentido cortos pueden ser importados en células en donde actúen como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su absorción restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A.. 83:4143-4146 (
[1986] ) . Los oligonucleótidos pueden ser modificados para incrementar su absorción, por ejemplo, al sustituir sus grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados .
Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia génica in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por liposomas de proteína de cápside viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210
[1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o una célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden usarse para dirigir y/o para facilitar la absorción, por ejemplo, proteínas de cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufran internalización en ciclización, proteínas que dirijan la ubicación intercelular y que incrementen la vida media intracelular . La técnica de endocitosis mediada por receptores se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol . Chem. 262, 4429-4432 (1987); y agner et al., Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión de protocolos de marcado génico y terapia génica véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) .
Las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos TAHO o fragmentos de los mismos descritos en la presente son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe una continua necesidad por identificar nuevos marcadores de cromosomas, toda vez que relativamente pocos reactivos de marcado de cromosomas, con base en datos de secuencia reales son actualmente disponibles. Cada molécula de ácido nucleico TAHO de la presente invención puede ser usada como un marcador de cromosomas .
Los polipéptidos TAHO y moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden usar en forma de diagnóstico para tipificación tisular, en donde los polipéptidos TAHO de la presente invención pueden ser expresados diferencialmente en un tejido en comparación con otro, de preferencia en un tejido enfermo en comparación con un te ido normal del mismo tipo de tejido. Moléculas de ácido nucleico TAHO encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western.
Esta invención abarca métodos para tamizar compuestos para identificar aquellos que imiten al polipéptido TAHO (agonistas) o prevengan el efecto de del polipéptido TAHO (antagonistas) . Los ensayos de tamizado para candidatos de fármaco antagonistas son diseñados para identificar compuestos que se unan o acomplejen con los polipéptidos TAHO codificados por los genes identificados en la presente, o interfieran de otra manera con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, incluyendo por ejemplo, inhibir la expresión de polipéptido TAHO de células. Estos ensayos de tamizado incluirán ensayos propensos a tamizado de alta emisión de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de molécula pequeña.
Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de tamizado bioquímico, inmunoensayos y ensayos a base de células, los cuales son bien caracterizados en la técnica .
Todos los ensayos para antagonistas son comunes toda vez que llevan al contacto del candidato a fármaco con un polipéptido TAHO codificado por un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido TAHO codificado por el gen identificado en la presente o el candidato a fármaco es inmovilizado sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa de microtitulación, mediante fijaciones covalentes o no covalentes. La fijación no covalente generalmente se logra al recubrir la superficie sólida con una solución del polipéptido TAHO y secar. Como alternativa, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido TAHO que será inmovilizado se puede usar para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo al añadir el componente no inmovilizado, el cual puede ser marcado por un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contenga el componente anclado. Cuando la reacción está completa, los componentes que no reaccionaron son retirados, por ejemplo, por lavado y los complejos anclados sobre la superficie sólida son detectados. Cuando el componente no inmovilizado originalmente porta un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado sobre la superficie indica que ha ocurrido la formación del complejo. Cuando el componente no inmovilizado originalmente no porta un marcador, se puede detectar la formación del complejo, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo marcado que se una específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interactúa pero no se une a un polipéptido TAHO particular codificado por un gen identificado en la presente, su interacción con ese polipéptido puede ser ensayada mediante métodos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Estos ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, entrelazamiento, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, interacciones proteína-proteína pueden ser monitoreadas usando un sistema genético a base de levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres) , 340:245-246(1989); Chien et al., Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A., 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. E ,U.A. , 89:5789-5793 (1991). Muchos activadores de transcripción, tales como levadura GAL4, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión a ADN, el otro funcionando como el dominio de activación de transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (conocido generalmente como el "sistema de dos híbridos") saca ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo es fusionada al dominio de unión a ADN de GAL4 , y otra, en la cual las proteínas de activación candidatas son fusionadas al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 mediante interacción proteína-proteína. Las colonias que contengan polipéptidos de interacción son detectadas con un substrato cromogénico para ß-galactosidasa . Un kit completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de dos híbridos está disponible comercialmente de Clontech. Este sistema también puede ser extendido para mapear dominios de proteínas implicados en interacciones de proteínas específicas así como para identificar residuos de aminoácido que sean cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica para un polipéptido TAHO identificado en la presente y otros componentes intra- o extracelulares pueden ser probados como sigue: normalmente una mezcla de reacción se prepara que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permitan la interacción de unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se ejecuta en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, un placebo puede añadirse a una tercera mezcla de reacción, para servir como un control positivo. La unión (formación de complejo) entre un compuesto de prueba y el componente intra-extracelular presente en la mezcla se monitorea como se describe en la presente arriba. La formación de un complejo en las reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indican que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción.
Para ensayar antagonistas, el polipéptido TAHO puede ser añadido a una célula junto con el compuesto que será tamizado para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido TAHO indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido TAHO. Como alternativa, los antagonistas pueden ser detectados al combinar el polipéptido TAHO y un antagonista potencial con receptores de polipéptidos TAHO unidos a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones adecuadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido TAHO puede ser marcado, tal como mediante radioactividad, de tal manera que el número de moléculas de polipéptidos TAHO unidas al receptor pueda usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifique para el receptor puede ser identificado mediante numerosos métodos conocidos por aquellos de capacidad en la técnica, por ejemplo, pareo de ligandos y clasificación FACS . Coligan et al., Current Protocols in Immun . 1(2) : capítulo 5 (1991) . De preferencia, clonación de expresión se emplea en donde ARN poliadenilado es preparada a partir de una célula que responde al polipéptido TAHO y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en fondos y se usa para transfectar células COS u otras células que no sean sensibles al polipéptido TAHO. Las células transíectadas que son cultivadas en portaobjetos de vidrio son expuestas a polipéptido TAHO marcado. El polipéptido TAHO puede ser marcado mediante una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica de sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico . Los fondos positivos se identifican y se preparan sub-fondos y se re-transfectan usando un proceso de sub-creación de fondos y retamizado interactivo, eventualmente produciendo un solo clon que codifica para el receptor putativo.
Como un enfoque alternativo para la identificación de receptores, polipéptido TAHO marcado puede ser enlazado por fotoafinidad con membrana celular o preparaciones de extracto que expresen a la molécula receptora. El material entrelazado es resuelto mediante PAGE y expuesto a película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede ser extirpado, resuelto en fragmentos de péptido y sujeto a micro-secuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la micro-secuenciación sería usada para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degeneradas para tamizar una biblioteca de ADNc para identificar al gen que codifique para el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, células de mamífero o preparación de membrana que exprese el receptor podría ser incubada con polipéptido TAHO marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para incrementar el bloqueo de esta interacción sería después medida .
Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con polipéptido TAHO, y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos anti-idiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Como alternativa, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente emparentada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido TAHO que reconozca al receptor pero no imparta efectos, de esta manera inhibiendo competitivamente la acción del polipéptido TAHO.
Otro antagonista de polipéptido TAHO potencial es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm al hibridar a ARNm seleccionado y prevenir la traducción de la proteína. Tecnología antisentido puede ser usada para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos de los cuales métodos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótido, la cual codifica para los polipéptidos TAHO maduros de la presente, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de largo. Un oligonucleótido de ADN es diseñado para ser complementario a una región del gen implicada en transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí . Acids . Res . , 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), evitando de esta manera la transcripción y la producción del polipéptido TAHO. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido TAHO (antisentido - Okano, Neurochem ., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos descritos arriba también se pueden suministrar a células de tal manera que el ARN o ADN antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción del polipéptido TAHO. Cuando se usa ADN antisentido, oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo son preferidos.
Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, al sitio de unión a receptor o factor de crecimiento u otro sitio no relevante del polipéptido TAHO, de esta manera bloqueando la actividad biológica normal del polipéptido TAHO. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, péptidos pequeños o moléculas tipo péptido, de preferencia péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidilo sintéticos.
Los ribosomas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el corte específico de ARN. Los ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguida por el corte endoenucleolítico . Los sitios de corte de ribozima específicos dentro de un objetivo de ARN potencial pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997) .
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de una sola hebra y compuestas de desoxinucleótidos . La composición básica de estos nucleótidos se diseña de tal manera que promueva la formación de triples hélices mediante reglas de apareamiento a base de Hoogsteen, las cuales requieren generalmente tramos configurables de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, publicación de PCT No. WO 97/33551, citada anteriormente .
Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas mediante cualquiera o más de los ensayos de tamizado descritos en la presente arriba y/o mediante cualquier otra técnica de tamizado bien conocida para aquellos capacitados en la técnica.
Acido nucleico que codifica para polipéptido TAHO aislado puede usarse en la presente para producir recombinantemente polipéptido TAHO usando técnicas bien conocidas en la técnica y como se describen en la presente. A su vez, los polipéptidos TAHO producidos pueden ser empleados para generar anticuerpos anti-TAHO usando técnicas bien conocidas en la técnica y como se describen en la presente.
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido TAHO identificado en la presente, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de tamizado descritos anteriormente aquí, pueden administrarse para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo cáncer, en forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido TAHO es intracelular y anticuerpos enteros son usados como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización . Sin embargo, lipofecciones o liposomas también se pueden usar para suministrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, a las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo es preferido. Por ejemplo, con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas de péptido pueden diseñarse que conserven la capacidad para unirse a la secuencia de proteínas objetivo. Estos péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante . Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A., 90: 7889-7893 (1993).
La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afecten adversamente unos a otros. Como alternativa, o además, la composición puede comprender un agente que incremente su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor de crecimiento. Estas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que sean efectivas para el propósito deseado.
P . Derivados de anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención se pueden modificar más para contener porciones no proteináceas adicionales que se conozcan en la técnica y estén fácilmente disponibles. De preferencia, las porciones adecuadas para derivación del anticuerpo son polímeros hidrosolubles . Ejemplos no limitativos de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirroldidona, poly-1, 3-dioxolano, poly-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhidrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poly(n-vinilpirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglciol , copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. Polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación gracias a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar, y si se fija más el polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivación puede determinarse con base en consideraciones que incluyen, pero no están limitadas a, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo que será mejorado, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.
Q . Método de tamizado Otra modalidad más de la presente invención está dirigida a un método para determinar la presencia de un polipéptido TAHO en una muestra que se sospeche contenga el polipéptido TAHO, en donde el método comprende exponer la muestra a un conjugado anticuerpo-fármaco del mismo, que se una al polipéptido TAHO y determinar la unión del conjugado fármaco anticuerpo del mismo, al polipéptido TAHO en la muestra, en donde la presencia de esta unión es indicadora de la presencia del polipéptido TAHO en la muestra. Opcionalmente , la muestra puede contener células (las cuales pueden ser células cancerosas) sospechosas de expresar al polipéptido TAHO. El conjugado anticuerpo- fármaco del mismo, empleado en el método puede opcionalmente ser marcado de manera detectable, unido a un soporte sólido o similar.
Otra modalidad de la presente invención está dirigida a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprenda células tisulares obtenidas del mamífero con un conjugado anticuerpo fármaco del mismo, que se una a un polipéptido TAHO y (b) detectar la formación de un complejo entre el conjugado anticuerpo fármaco del mismo, y el polipéptido TAHO en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicadora de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente, el conjugado anticuerpo fármaco del mismo, se marca en forma detectable, se fija a un soporte sólido o similar y/o la muestra de prueba de células tisulares se obtiene de un individuo que se sospeche tenga un tumor canceroso.
IV. Métodos adicionales para usar anticuerpos anti-TAHO e inmunoconjugados A. Métodos de diagnóstico y métodos de detección En un aspecto, los anticuerpos anti-TAHO e inmunoconjugados de la invención son útiles para detectar la presencia de un polipéptido TAHO en una muestra biológica. El término "detectar" según se usa en la presente abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido. En ciertas modalidades, estos tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerosos que expresen un polipéptido TAHO a niveles más altos en relación a otros tejidos, por ejemplo, células B y/o tejidos asociados a células B.
En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de un polipéptido TAHO en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-TAHO bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-TAHO a un polipéptido TAHO, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-TAHO y un polipéptido TAHO.
En un aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar un trastorno asociado con la expresión incrementada de un polipéptido TAHO. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula de prueba con un anticuerpo anti-TAHO; determinar el nivel de expresión (ya sea cuantitativamente o cualitativamente) de un polipéptido TAHO por la célula de prueba al detectar la unión del anticuerpo anti-TAHO a un polipéptido TAHO; y comparar el nivel de expresión de un polipéptido TAHO por la célula de prueba con el nivel de expresión de un polipéptido TAHO por una célula de control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que el de la célula de prueba o una célula que expresa un polipéptido TAHO a niveles comparables a los de esta célula normal) , en donde un nivel más alto de expresión de un polipéptido TAHO por la célula de prueba en comparación con la célula de control indica la presencia de un trastorno asociado con la expresión incrementada de un polipéptido TAHO. En ciertas modalidades, la célula de prueba se obtiene de un individuo que se sospeche tenga un trastorno asociado con la expresión incrementada de un polipéptido TAHO. En ciertas modalidades, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.
Los trastornos proliferativos de células ejemplares que pueden diagnosticarse usando un anticuerpo de la invención incluyen un trastorno de células B y/o un trastorno proliferativo celular B incluyendo, pero no limitado a, linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células de manto.
En ciertas modalidades, un método de diagnóstico o detección, tal como aquellos descritos arriba, comprende detectar la unión de un anticuerpo anti-TAHO a un polipéptido TAHO expresado sobre la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que exprese un polipéptido TAHO sobre su superficie. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-TAHO bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-TAHO a un polipéptido TAHO, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-TAHO y un polipéptido TAHO sobre la superficie celular. Un ensayo ejemplar para detectar la unión de un anticuerpo anti-TAHO a un polipéptido TAHO expresado sobre la superficie de una célula es un ensayo "FACS" .
Ciertos otros métodos pueden usarse para detectar la unión de anticuerpos anti-TAHO a un polipéptido TAHO. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, ensayos a base de antígenos que se conocen bien en la técnica, tales como Western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) , en inmunoensayos de "emparedado", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescente, inmunoensayos de proteína A e inmunohistoquímica (IHC).
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-TAHO son marcados. Los marcadores incluyen, pero no están limitados a, marcadores o porciones que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos en electrones, quimioluminiscentes y radioactivos), así como porciones, tales como enzimas o ligandos, que son detectadas indirectamente, por ejemplo a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, lucierasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3 -dihidroftalazindionas , peroxidasa de rábano (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-e-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acoplada con una enzima que emplee peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa , biotina/avidina, marcadores centrífugos, marcadores bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-TAHO son inmovilizados sobre una matriz insoluble . Inmovilización implica separar el anticuerpo anti-TAHO de cualquiera de un polipéptido TAHO que permanezca libre de solución. Esto se logra convencionalmente ya sea al insolubilizar el anticuerpo anti-TAHO antes del procedimiento a ensayo, tal como mediante absorción a una matriz insoluble en agua o superficie (Bennich et al., U.S. 3,720,760), o mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrelazamiento con glutaraldehído) o al insolubilizar el anticuerpo anti-TAHO después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-TAHO y un polipéptido TAHO, por ejemplo, mediante inmunoprecipitacion .
Cualquiera de las modalidades anteriores de diagnóstico o detección se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-TAHO .
B . Métodos terapéuticos Un anticuerpo o inmunoco jugado de la invención puede usarse en, por ejemplo, métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. En un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir crecimiento o proliferación celular, ya sea in vivo o in vitro, el método comprende exponer una célula a un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado del mismo o condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado a un polipéptido TAHO. "Inhibir crecimiento de proliferación celular" significa reducir el crecimiento o profliferación de una célula en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100%, e incluye inducir muerte celular. En ciertas modalidades, la célula es una célula tumoral . En ciertas modalidades, la célula es una célula B. En ciertas modalidades, la célula es un xenoinjerto, por ejemplo, como el ejemplificado en la presente.
En un aspecto, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se usa para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular B. En ciertas modaidades, el trastorno proliferativo celular está asociado con expresión y/o incrementado a un polipéptido TAHO. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el trastorno proliferativo celular B está asociado con expresión incrementada de un polipéptido TAHO sobre la superficie de una célula B. En ciertas modalidades, el trastorno proliferativo celular B es un tumor o un cáncer. Ejemplos de trastornos proliferativos de células B que se tratarán por los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención incluyen, pero no están limitados a, linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de„ células de manto.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno proliferativo celular B que comprenden administrar a un individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado del mismo. En ciertas modalidades, un método para tratar un trastorno proliferativo celular b comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado anti-TAHO y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico adicional, tal como aquellos proporcionados abajo. En ciertas modalidades, un método para tratar un trastorno proliferativo celular comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de una formulación farmacéutica que comprende 1) un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-TAHO y un agente citotóxico y opcionalmente 2) por lo menos un agente terapéutico adicional, tal como aquellos proporcionados abaj o .
En un aspecto, por lo menos algunos de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden unirse a un polipéptido TAHO de especies que no sean la humana. En consecuencia, los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse para unirse a un polipéptido TAHO, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga un polipéptido TAHO, en humanos, o en otros mamíferos que tengan un polipéptido TAHO con el cual reaccione de manera cruzada un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (por ejemplo, chimpancé, babuino, marmota, macaco y monos Rhesus, cerdo o ratón) . En una modalidad, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado se puede usar para dirigir un polipéptido TAHO sobre células B al poner en contacto el anticuerpo o inmunoconjugado con un polipéptido TAHO para formar un complejo anticuerpo o inmunoconjugado-antígeno de tal manera que una citotoxina conjugada del inmunoco jugado acceda al interior de la célula. En una modalidad, el polipéptido TAHO es un polipéptido TAHO humano.
En una modalidad, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado se puede usar en un método para la unión de un polipéptido TAHO en un individuo que sufra de un trastorno asociado con expresión y/o actividad de polipéptido TAHO incrementada, el método comprende administrar al individuo el anticuerpo o inmunoconjugado de tal manera que un polipéptido TAHO en el individuo sea unido. En una modalidad, el anticuerpo o inmunocon ugado unido es internalizado en la célula B que expresa un polipéptido TAHO. En una modalidad, el polipéptido TAHO es un polipéptido TAHO humano, y el individuo es un individuo humano. Como alternativa, el individuo puede ser un mamífero que expresa un polipéptido TAHO al cual se le una un anticuerpo anti-TAHO. Además, el individuo puede ser un mamífero en el cual haya sido introducido un polipépito TAHO (por ejemplo, mediante administración de un polipéptido TAHO o mediante expresión de un transgén que codifique para un polipéptido TAHO) .
Un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado puede ser administrado a un humano para propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado se puede administrar a un mamífero no humano que exprese un polipéptido TAHO con el cual reaccione en forma cruzada un anticuerpo (por ejemplo, un primate, cerdo, rata o ratón) para propósitos o veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a éste último, los modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos o inmunoconjugados de la invención (por ejemplo, probar las dosis y cursos de tiempo de administración) .
Anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se pueden usar ya sea solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede ser co-administrado con por lo menos un agente terapéutico y/o adyuvante adicional. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento. En una de estas modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tal como, por ejemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™) , prednisolona , CHOP, CVP o CDP, o inmunoterapéuticos tales como anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan ) o anti-VEGF (por ejemplo, Avastin ) , en donde la terapia de combinación se usa en el tratamiento de cánceres y/o trastornos de células B tales como trastornos proliferativos de células B incluyendo linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de células de manto.
Estas terapias de combinación indicadas arriba abarcan la administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos son incluidos en la misma o separadas formulaciones) , y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede ocurrir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional. Anticuerpos inmunoconjugados de la invención también se pueden usar en combinación con terapia de radiación.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico o adyuvante adicional) puede ser administrado mediante cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal, y, si se desea, para tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis cada vez más bajas del anticuerpo o inmunoconjugado . La dosificación puede ser mediante cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es leve o crónica.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención serían formulados, dosificados y administrados en una forma consistente con práctica médica adecuada. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que esté siendo tratado, el mamífero particular que esté siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos. El anticuerpo o inmunoconjugado no tiene que ser, pero es opcionalmente formulado con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconj gado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores descritos arriba. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con rutas de administración como las descritas en la presente, o alrededor de 1 a 99% de las dosis descritas aquí, o cualquier dosis y mediante cualquier ruta que sea empíricamente/clínicamente adecuada como adecuada .
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales, tal como agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad que será tratada, el tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, la severidad y curso de enfermedad, de si el anticuerpo o inmunoconjugado se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo o inmunoconjugado, y la discreción del médico que atienda. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg (por ejemplo, 0.1 mg/kg-20 mg/kg) o inmunoconjugado puede ser una dosis candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento generalmente será prolongado hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo o inmunoconjugado estaría en la escala de aproximadamente 0.05 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg. De esta manera, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) de anticuerpo inmunoconjugado puede ser administrada al paciente. Estas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba alrededor de 2 a aproximadamente 20, o por ejemplo aproximadamente 6 dosis del anticuerpo o inmunoconjugado) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .
C . Ensayos de actividad Los anticuerpos anti-TAHO e inmunoconjugados de la invención pueden ser caracterizados por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica. 1. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-TAHO o inmunoconjugados de los mismos que tengan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad para inhibir el crecimiento de proliferación celular (por ejemplo, actividad de "eliminación de células")/ o la capacidad para inducir muerte celular, incluyendo muerte celular programada (apoptosis) . También se proporcionan anticuerpos o inmunoconjugados que tienen esta actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-TAHO o inmunconjugado del mismo se prueba para verificar su capacidad para inhibir crecimiento y proliferación celular in vitro. Los ensayos para la inhibición de crecimiento o proliferación celular se conocen bien en la técnica. Ciertos ensayos para proliferación celular, ejemplificados por los ensayos de "eliminación celular" descritos en la presente, miden la viabilidad celular. Uno de estos ensayos es el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo™, el cual está disponible comercialmente de Promega (Madison, WI) . Este ensayo determina el número de células viables en cultivo a base de cuantificación de ATP presente, lo cual es una indicación de células metabólicamente activas. Véase Crouch et al (1993) J. Immunol . Meth. 160:81-88, patente de E.U.A. No. 6602677. El ensayo se puede llevar a cabo en formato de 96 ó 384 pocilios, haciendo entonces posible un tamizado de alta emisión automatizado (HTS) . Véase Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo incluye añadir un solo reactivo (reactivo CellTiter-Glo1") directamente a células cultivadas. Esto da como resultado lisis celular y generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, la cual es directamente proporcional al número de células viables presentes en cultivo. Los datos pueden registrarse mediante luminómetro o dispositivo de formación de imágenes por cámara CCD. La salida de luminiscencia es expresada como unidades de luz relativa (RLU) .
Otro ensayo para proliferación celular es el ensayo "MTT" , un ensayo colorimétrico que mide la oxidación de bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio a formazan mediante reductasa mitocondrial . Al igual que el ensayo CellTiter-Glo™, este ensayo indica el número de células metabólicamente activas presentes en un cultivo celular. Véase, por ejemplo, osmann (1983) J. Immunol. Meth. 63:55-63, y Zhang et al. (2005) Cáncer Res. 65:3877-3882.
En un aspecto, un anticuerpo anti-TAHO se prueba para su capacidad para inducir muerte celular in vitro. Los ensayos para la inducción de muerte celular se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, estos ensayos miden, por ejemplo, pérdida de integridad de membrana como se indica por absorción de yoduro de propidio (PI) , azul tripano (véase Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), o 7AAD. En un ensayo de absorción de PI ejemplar, las células se cultivan en medio Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM) -Ham' s F-12 (50:50) complementado con 10% de FBS inactivado con calor (Hyclone) y 2 mM de L-glutamina. De esta manera, el ensayo se lleva a cabo en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células son sembradas a una densidad de 3 x 106 por caja en cajas de 100 x 20 mm y se les deja fijarse durante la noche. El medio se retira y se reemplaza con medio fresco solo o medio que contiene varias concentraciones del anticuerpo o inmunoconjugado . Las células son incubadas durante un periodo de tiempo de 3 días. Después del tratamiento, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas por tripsinización. Las células son después centrifugadas a 1,200 rpm durante 5 minutos a 4°C, el sedimento se resuspende en 3 mi de regulador de pH de unión a Ca2+ frío (10 mM de Hepes, pH 7.4, 140 mM de NaCl, 2.5 mM de CaCl2) y se hacen alícuotas en tubos de 12 x 75 mm con tapa de restricción de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la remoción de los racimos celulares. Los tubos reciben después PI (10 µ9/p?1) . Las muestras son analizadas usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson) . Los anticuerpos o inmunoconjugados que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular determinada por absorción de PI son entonces identificados.
En un aspecto, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado es probado para verificar su capacidad para inducir apoptosis (muerte celular programada) in vi ro. Un ensayo ejemplar para anticuerpos o inmunoconjugados que induce apoptosis es un ensayo de unión a anexina. En un ensayo de unión a anexina ejemplar, las células son cultivadas y sembradas en cajas como se describió en el párrafo precedente. El medio es retirado y reemplazado con medio fresco solo o medio que contiene 0.001 a 10 µg/ml del anticuerpo o inmunoconjugado . Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas por tripsinización . Las células son después centrifugadas, resuspendidas en regulador de pH de unión de Ca2+ y se hacen alícuotas en tubos como se describió en el párrafo anterior. Los tubos después reciben la anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FITC) (1 ug/ml) . Las muestras se analizan usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (BD Bioscience) . Los anticuerpos o inmunoconjugados que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina en relación al control son entonces identificados. Otro ensayo ejemplar para anticuerpos o inmunoconjugados que inducen apoptosis es un ensayo colorimétrico de ELISA de ADN de histona, para detectar degradación internucleosómica de ADN genómico. Este ensayo se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, el kit ELISA de Detección de Muerte Celular (Roche, Palo Alto, CA) .
Las células para usarse en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores incluyen células o líneas de células que expresan naturalmente un polipéptido TAHO o que han sido manipuladas para expresar un polipéptido TAHO. Estas células incluyen células tumorales que sobre-expresan un polipéptido TAHO en relación a células normales del mismo origen tisular. Estas células incluyen también líneas de células (incluyendo líneas de células tumorales) que expresan un polipéptido TAHO y líneas de células que no expresan normalmente un polipéptido TAHO pero que han sido transíectadas con ácido nucleico que codifica para un polipéptido TAHO.
En un aspecto, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoconjugado del mismo es probado para su capacidad para inhibir crecimiento o proliferación celular in vivo. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-TAHO o inmunoco jugado del mismo es probado para verificar su capacidad para inhibir crecimiento tumoral in vivo. Sistemas modelo in vivo, tales como modelos de xenoinjerto, pueden usarse para estas pruebas. En un sistema de xenoinjerto ejemplar, células tumorales humanas son introducidas en un animal no humano inmunocomprometido adecuadamente, por ejemplo, un ratón SCID. Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se administra al animal. La capacidad del anticuerpo o inmunoconjugado para inhibir o reducir el crecimiento del tumor es medida. En ciertas modalidades del sistema de xenoinjerto anterior, las células tumorales humanas son células tumorales de un paciente humano. Estas células útiles para preparar modelos de xenoinjerto incluyen líneas de células de leucemia y linfoma humanas, las cuales incluyen sin limitación las células BJAB-luc (una línea de células de linfoma de Burkitt EBV-negativa transfectada con el gen reportero de luciferasa, células Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923) , células SuDHL-4(DSMZ, Braunschweig, Alemania, AAC 495), células DoHH2 (véase Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 5:221-224 (1991), y Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8:1385-1391 (1994)), células Granta-519 (véase Jadayel, D.M. et al, Leukemia ll(l):64-72 (1997)). En ciertas modalidades, las células tumorales humanas son introducidas en un animal no humano inmunocomprometido adecuadamente mediante inyección subcutánea o por transplante en un sitio adecuado, tal como una almohadilla adiposa mamaria. 2. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo anti-TAHO se prueba para su actividad de unión a antígeno. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un anticuerpo anti-TAHO se prueba para su capacidad para unirse a un polipéptido TAHO expresado sobre la superficie de una célula. Un ensayo FACS puede ser usado para estas pruebas.
En un aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo monoclonal que compita con anticuerpo SN8 de murino para unirse a un polipéptido TAHO. En ciertas modalidades, este anticuerpo de competencia se une al mismo epítope (por ejemplo, un epítope lineal o uno de conformación) al que se une el anticuerpo SN8 de murino. Los ensayos de competencia ejemplares incluyen, pero no están limitados a, ensayos de rutina tales como aquellos provistos en Harlow y Lañe (1988) Antobodies : A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Métodos ejemplares detallados para el mapeo de un epítope al cual se le une un anticuerpo son proporcionados en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" , en Methods in Molecular Biology vol . 66 (Humana Press, Totwa, NJ) . Dos anticuerpos se dice que se unen al mismo epítope si cada uno bloque la unión del otro en 50% más.
En un ensayo de competencia ejemplar, polipéptido TAHO inmovilizado es incubado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se una a un polipéptido TAHO (por ejemplo, anticuerpo SN8 de murino) y un segundo anticuerpo no marcado que está siendo probado para su capacidad para competir con el primer anticuerpo para unirse a un polipéptido TAHO. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como un control, polipéptido TAHO inmovilizado es incubado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo no marcado. Después de incubación bajo condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a un polipéptido TAHO, el anticuerpo no unido en exceso es removido, y la cantidad de marcador asociada con polipéptido TAHO inmovilizado es medida. Si la cantidad de marcador asociada con el polipéptido TAHO inmovilizado es reducida sustancialmente en la muestra de prueba en relación a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para unirse a un polipéptido TAHO. En ciertas modalidades, el polipéptido TAHO inmovilizado está presente sobre la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que exprese un polipéptido TAHO sobre su superficie.
En un aspecto anticuerpos anti-TAHO purificados pueden ser caracterizados además por una serie de ensayos que incluyen, pero no están limitados a, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) por exclusión de tamaño no desnaturalizante, espectrometría de masas, y cromatografía' de intercambio iónico y digestión con papaína.
En una modalidad, la invención contempla un anticuerpo alterado que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, las cuales lo hacen un candidato deseable para muchas aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. En ciertas modalidades, las actividades Fe del anticuerpo se miden para asegurar que sólo se mantengan las propiedades deseadas. Ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo puede llevarse a cabo para confirmar la reducción/depleción de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión a receptor Fe (FcR) puede llevarse a cabo para asegurar que el anticuerpo carezca de unión a Fc/R (por consiguiente que carezca probablemente de actividad ADCC) , pero conserve la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fe (RUI únicamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fe (RUI. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet , Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en la patente de E.U.A. No. 5,500,362 ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Como alternativa o además, la actividad ADCC de la molécula de interés puede ensayarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquél descrito en Clynes et al. PNAS (E.U.A.) 95:652-646 (1998). Ensayos de unión a Clq pueden llevarse a cabo también para confirmar que el anticuerpo sea incapaz de unirse a Clq y por consiguiente carezca de actividad CDC. Para evaluar la activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo, como el descrito en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), puede llevarse a cabo. La unión a FcRn y las determinaciones de depuración in vivo/vida media también se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos se ofrecen por propósitos ilustrativos únicamente, y no están diseñados para limitar el alcance de la invención de ninguna manera.
Toda la patente y referencias de literatura citadas en la presente descripción se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad.
Ej emplos Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos usados en los ejemplos son anticuerpos disponibles comercialmente e incluyen, pero no están limitados a, anti-CD180 (eBioscience MRH73-11, BD Pharmingen G28-8) y Serotec MHR73 ) , anti-CD20 (Ancell 2H7 y BD Pharmingen 2H7) , anti-CD72 (BD Pharmingen 14-117) , anti-XCR5 (R&D Systems 51505), anti-CD22 (Ancell RFB4 , DAKO Tol5, Diatec 157, Sigma HIB-22 y Monosan BL-BC34), anti-CD22 (Leinco RFB-4 y NeoMarkers 22C04) , anti-CD21 (ATCC HB-135 y ATCC HB5) , anti-HLA-DOB (BD Pharmingen DOB.l), CD79a antihumano (ZL7-4 (de Caltag o Serotec) , CD79b anti-humano (anticuerpo SN8 generado de hibridomas obtenidos de Biomedia (Foster City, CA) o BDbioscience (San Diego, CA) o Ancell (Bayport, MN) , o anticuerpo SN8 generado usando anticuerpos generados a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993)) o anticuerpos quiméricos SN8 generados usando anticuerpos generados a partir de hibridomas obtenidos de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993)) y CB3-1 de BD Pharmingen), anti-CD19 (Biomeda CB-19) , anti-FCER2 (Ancell BU38 y Serotec D3.6 y BD Pharmingen M-L233) . La fuente de estas células identificadas en los siguientes ejemplos y a lo largo de la descripción, por números de registro ATCC es la Colección Americana de Tipos de Cultivos, anassas, VA.
Ejemplo 1 Análisis de datos de microdisposición de la expresión de TAHO Los datos de microdisposición incluyen el análisis de la expresión de TAHO por el rendimiento de análisis de microdisposición de ADN sobre una amplia variedad de muestras de ARN de tejidos y células cultivadas. Las muestras incluyen tejido humano normal y canceroso y varios tipos de células inmunes purificadas tanto en descanso como después de estimulación externa. Estas muestras de ARN pueden ser analizadas de acuerdo con protocolos de microdispodisposicón regulares en microensayos Agilent.
En este experimento, ARN fue aislado de células y sondas de ARNc marcadas con cianina-3 y cianina-5 fueron generadas mediante transcripción in vitro usando el Kit de Amplificación Lineal Fluorescente de ARN de baja entrada Agilent (Agilent) . Cianina-5 se usó para marcar las muestras que iban a ser probadas para expresión en polipéptido PRO, por ejemplo, las células de mieloma en plasma, y cianina-3 se usó para marcar la referencia universal (el fondo de línea celular Stratagene) con el cual la expresión de las muestras de prueba fueron comparadas. 0.1 g-0.2 g de sonda de ARNc marcada con cianina-3 y cianina-5 fue hibridada a chips de disposición de oligonucleótidos de 60 meros Agilent usando el Situ Hybridization Kit Plus (Agilent) . Estas sondas fueron hibridadas a microdisposiciones . Para análisis de mieloma múltiple, las sondas fueron hibridadas a microdisposiciones de oligonucleótidos de genoma humano entero Agilent usando las condiciones y reguladores de pH recomendados por Agilent (Agilent) .
Las sondas de ARNc son hibridadas a las microdisposiciones a 60 °C durante 17 horas en un conjunto giratorio de hibridación a 4 RPM. Después del lavado, las microdisposiciones son escaneadas con el escáncer de microdisposición Agilent que es capaz de excitar y detectar la fluorescencia proveniente de las moléculas fluorescentes de cianina-3 y cianina-5 (líneas láser de 532 y 633 nm) . Los datos para cada gen en la disposición de oligonucleótidos de 60 meros fueron extraídos de la imagen de microdisposición escaneada usando software de extracción de características Agilent que compensa el reconocimiento de características, resta de fondo y normalización y los datos resultantes fueron cargados en el paquete de software conocido como el Rosetta Resolver Gene Expression Data Analysis System (Rosetta Inpharmatics , Inc.). Rosetta Resolver incluye una base de datos de relaciones y numerosas herramientas analíticas para almacenar, recuperar y analizar grandes cantidades de datos de expresión génica por intensidad o relación.
En este ejemplo, células B y células T (control) fueron obtenidas para análisis de microdisposición. Para aislamiento de células B naives y de memoria y células plasmáticas, células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) fueron separadas de cada leucoempaque provisto por cuatro donadores macho saludables o de sangre entera de varios donadores normales. Células plasmáticas CD138+ fueron aisladas de PBMC usando el sistema de clasificación de células magnético MACS (Miltenyl Biotec) y esferas anti-CD138. Como alternativa, células B CD19+ totales fueron seleccionadas con esferas anti-CD19 y clasificación MACS. Después del enriquecimiento de CD19+ (pureza alrededor de 90%) , se llevó a cabo clasificación FACS (Moflo) para separar células B naives y de memoria. Las células clasificadas fueron recogidas al someter las muestras a centrifugación. Las células clasificadas fueron inmediatamente lisads en regulador de pH LTR y homogeneizadas con una columna centrífuga QIAshredder (Qiagen) seguidas por un mini kit RNeasy para purificación de ARN. El rendimiento de ARN fue variable de 0.4-10 ]ig y dependió de los números de células.
Como un control, las células T fueron aisladas para análisis de microdisposición . Células CD8 de sangre periférica fueron aisladas de leucoempaques mediante selección negativa usando el kit de Aislamiento de Células CD8 (Rosette Separation) y purificadas más mediante el sistema de clasificación de células magnético MACS usando el kit de aislamiento de células CD8 y microesferas CD45R0 fueron añadidas para remover células CD45RO (Miltenyi biotec) . Las células T CD8 fueron divididas en tres muestras con cada muestra sometida a la estimulación como sigue: (1) anti-CD3 y anti-CD28, más IL-12 y anticuerpo anti-IL4, (2) anti-CD3 y anti-CD29 sin añadir citocinas o anticuerpos neutralizantes y (3) anti-CD3 y anti-CD28, más IL-4, anticuerpo anti-IL12 y anticuerpo anti-IFN-?. 48 Horas después de la estimulación, se recogió el ARN. Después de 72 horas, las células fueron expandidas al añadir dilución 8 veces con medio fresco. 7 Días después de que se recogiera el ARN, las células CD8 fueron recogidas, lavadas y re-estimuladas por anti-CD3 y anti-CD28. 16 Horas más tarde se llevó a cabo una segunda recolección de ARN. 48 Horas después de la re-estimulación, se hizo una tercera recolección de ARN. El ARN fue recolectado usando Qiagen Midi preps según las instrucciones en el manual con la adición de una digestión con DNAsa I en columna después de la primera etapa de lavado con RW1. El ARN fue eluido en agua libre de ARNsa y subsecuentemente concentrado mediante precipitación con etanol . El ARN precipitado se recogió en agua libre de nucleasa hasta una concentración mínima final Microdisposiciones de control adicionales fueron llevadas a cabo en ARN aislados de células T auxiliares CD4+, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos (N'phil), CD14+, CD16+ y CD16 -monocitos y células dendríticas (DC) .
Microdisposiciones adicionales se llevaron a cabo en ARN aislado de tejido canceroso, tal como linfoma no Hodgkin (NHL) , linfoma folicular (FL) y mieloma múltiple (MM) . Microdisposiciones adicionales se llevaron a cabo en ARN aislado de células normales, tal como nodulos linfáticos normales (NLN) , células B normales, tales como células B de centroblastos , centrocitos y manto folicular, células B de memoria y células plasmáticas normales (PC) , las cuales provienen del linaje de células B y son contrapartes normales de la célula de mieloma, tales como células plasmáticas de anginas, células plasmáticas de médula ósea (BM PC) , células plasmáticas CD19+ (CD19+PC) , células plasmáticas CD19- (CD19-PC) . Microdisposiciones adicionales se llevaron a cabo en tejido normal, tal como cerebelo, corazón, próstata, adrenal, vejiga, intestino delgado (intestino s.), colon, hígado fetal, útero, riñon, placenta, pulmón, páncreas, músculo, cerebro, salivar, médula ósea (médula), sangre, timo, anginas, bazo, testículos y glándulas mamarias.
Las moléculas listadas abajo han sido identificadas como siendo significativamente expresadas en células B en comparación con células no B. Específicamente, las moléculas son expresadas diferencialmente en células B naives, células B de memoria que son ya sea IgGA+ o IgM+ y células plasmáticas ya sea de PBMC o médula ósea, en comparación con células no B, por ejemplo, células T. En consecuencia, estas moléculas representan excelentes objetivos para la terapia de tumor en mamíferos .
Molécula Expresión específica en comparación en: con : DNA225785 (TAH04) células B células no B DNA225786 (TAH05) células B células no B Sumario En las figuras 14A-15D, una expresión de ARNm significativa se indicó generalmente como un valor de relación de más de 2 (eje vertical de las figuras 14A-15D) . En las figuras 14A-15D, cualquier expresión aparente en células no B, tal como en próstata, bazo, etc., puede representar un artefacto, infiltración de tejido normal por linfocitos o pérdida de integridad de muestra por el vendedor . (1) TAH04 (también referido en la presente como CD79a) fue expresado significativamente en muestras de linfoma no Hodgkin (NHL) , mieloma múltiple (MM) y cerebelo normal y sangre normal . TAH04 adicional fue expresado significativamente en cerebelo, sangre y bazo (figuras 14A-14B) . Sin embargo, como se indicó arriba, cualquier expresión aparente en células no B, tal como en próstata, bazo, sangre, etc., puede representar un artefacto, infiltración de tejido normal por linfocitos o pérdida de integridad de muestra por el vendedor. (2) TAH05 (también referido en la presente como CD79b humano) fue expresado significativamente de linfoma no hodgkin (NHL) (figuras 15A-15D) .
Ya que TAH04 y TAH05 han sido identificados como siendo expresados significativamente en células B y en muestras de enfermedades asociadas con células B, tales como linfoma no Hodgkin, linfoma folicular y mieloma múltiple en comparación con células no B como las detectadas mediante análisis de microdisposición, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados con células B, tales como linfomas, leucemias, mielomas y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 2 Análisis cuantitativo de la expresión de ARNm de TAHO En este ensayo, un ensayo de 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) y PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, Mx3000P™ Real-Time PCR System (Stratagene, La Jolla, CA) ) , fueron usados para encontrar genes que eran sobre-expresados significativamente en un tipo de tejido específico, tal como células B, en comparación con un tipo de célula diferente, tal como otros tipos de glóbulos blancos primarios, y los cuales además pueden ser sobre-expresados en células cancerosas del tipo de tejido específico en comparación con células no cancerosas del tipo de tejido específico. La reacción del ensayo de 5' nucleasa es una técnica a base de PCR fluorescente que hace uso de la actividad 5' exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para monitorear la expresión génica en tiempo real. Dos cebadores de oligonucleótidos (cuyas secuencias se basan en el gen o secuencia EST de interés) se usa para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible mediante la enzima Taq ADN polimerasa, y es marcada con un colorante fluorescente reportero y un colorante fluorescente de extinción. Cualquier emisión inducida por láser a partir del colorante reportero es extinta por el colorante de extinción cuando los dos colorantes se ubican cerca unos de otros al igual que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación por PCR, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de una manera dependiente de plantilla. Los fragmentos de sonda resultante se disocian en solución, y la señal proveniente del colorante reportero liberada está libre del efecto extintor del segundo fluoróforo. Una molécula de colorante reportero es liberada de cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no extinto proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.
El procedimiento de 5' nucleasa se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como Mx3000™ Real-Time PCR System. El sistema consiste en un termociclizador, una lámpara de cuarzo-tungsteno, un tubo fotomultiplicador (PMT) para detección y una computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocilios en un termociclizador. Durante amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recogida en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 96 pocilios, y se detecta en la PMT. El sistema incluye software para ejecutar el instrumento y para analizar los datos.
El material de partida para el tamiz fue AR m (50 ng/pocillo ejecutado en duplicado) aislado de una variedad de diferentes tipos de glóbulos blancos (neutrófilos (Neutr) , células asesinas naturales ( K) , células dendríticas (Dend.), monocitos (Mono) , células T (subconjuntos CD4+ y CD8+) , células madre (CD34+) así como 20 donadores de células B separados (Ids de donador 310, 330, 357, 362, 597, 635, 816, 1012, 1013, 1020, 1072, 1074, 1075, 1076, 1077, 1086, 1096, 1098, 1109, 1112) para probar la variabilidad de donador. Todo el ARN se compró comercialmente (AllCells, LLC, Berkeley, CA) y la concentración de cada uno se midió de manera precisa después de la recepción. El ARNm se cuantifica de manera precisa, por ejemplo, fluorométricamente .
Los datos del ensayo de 5' nucleasa son expresados inicialmente como Ct o en ciclo umbral. Esto se define como el ciclo en el cual la señal reportera se acumula antes del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores ACt se usan como medición cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia objetivo paticular en una muestra de ácido nucleico. Ya que una unidad Ct corresponde a un ciclo de PCR o aproximadamente un incremento relativo de dos veces en relación a lo normal, dos unidades corresponden a un incremento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponde a un incremento relativo de 8 veces y así sucesivamente, se puede medir cuantitativamente el incremento por veces relativo en la expresión de AR m entre dos o más tejidos diferentes. Entre más bajo sea el valor Ct en una muestra, más alto el número de copias de partida de ese gen particular. Si se incluye una curva estándar en el ensayo, la cantidad relativa de cada objetivo puede ser extrapolada y facilita la observación de los datos ya que números de copias más altos también tienen cantidades relativas (a diferencia de números de copias más altos que tienen valores Ct más bajos) y corrige también cualquier variación del ICt generalizado igual a una regla incrementada 2 veces. Usando esta técnica, las moléculas listadas abajo han sido identificadas como siendo sobre-expresadas significativamente (es decir, al menos 2 veces) en un solo (o número limitado) de tejido específico o tipos de células en comparación con un tejido o tipo de célula diferente (de tanto el mismo como de diferentes donadores de tejido) con alguno también siendo identificado como siendo sobre-expresado significativamente (es decir, al menos 2 veces) en células cancerosas cuando se compara con células normales del tejido o tipo de célula particular, y de esta manera, representan excelentes objetivos polipéptidos para la terapia de cáncer en mamíferos.
Molécula Expresión especifica En comparación en: con: DNA225785 (TAH04) células B células no B DNA225786 (TAH05) células B/células CD34+ células no B Sumario Los niveles de expresión de TAH04 o TAH5 en ARN tratado aislado de células B purificadas o de células B de 20 donadores de células B (310-1112) (AllCells) y promediados (Avg.B) fueron significativamente más altos que los niveles de expresión de TAH04 y TAH05 respectivos en ARN total aislado de varios tipos de glóbulos blancos, neutrófilos (Neutr) , células asesinas naturales (NK) (un subconjunto de células T) , células dendríticas (Dend) , monocitos (Mono) , células T CD4+, células T CD8+, células madre CD34+ (datos no mostrados) .
En consecuencia, ya que TAH04 y TAH05 son expresados significativamente en células B en comparación con células no B como se detecta por el análisis TaqMan, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados con células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemialinfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 3 Hibridación in si tu La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de células o tejidos. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución tisular de transcripción, identificar y ubicar infección viral, después de cambios en la síntesis de ARNm específica y ayudar en el mapeo de cromosomas .
La hibridación in situ se llevó a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), usando ribosondas marcadas con 33P generadas por PCR. Brevemente, tejidos humanos e incrustados en parafina y fijados en formalina fueron seccionados, desparafinizados , desproteinados en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37EC, y procesadas más para hibridación in situ como se describe por Lu y Gillett, citado arriba. Una ribosonda antisentido marcada con [33-P]UTP- fue generada a partir de un producto de PCR e hibridada a 55EC durante la noche. Los portaobjetos fueron sumergidos en emulsión de rastreo nuclear NTB2 Kodak y expuestos durante 4 semanas .
Síntesis de 33P-ribosonda 6.0 µ? (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmoles) fueron secados al vacío rápidamente. A cada tubo que contenía 33P-UTP seca, se le añadieron los siguientes ingredientes : 2.0 µ? de regulador de pH de transcripción 5x 1.0 µ? de DTT (100 mM) 2.0 µ? de NTP mix (2.5 mM: 10µ; cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP+ 10 µ? de H20) . 1.0 µ? de UTP 850 µ?) 1.0 µ? de Rnasin 1.0 µ? de plantilla (1 ]ig) 1.0 µ? de H20 1.0 µ? de polimerasa ARN (para productos PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente) Los tubos fueron incubados a 37EC durante 1 hora. 1.0 µ? de RQ1 DNasa fueron añadidos, seguidos por incubación a 37EC durante 15 minutos. Se añadieron 90 µ? de TE (10 mM de Tris pH 7.6/1 mM de EDTA pH 8.0), y la mezcla se pipeteó sobre un papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50 y se centrifugó usando el programa 10 (6 minutos) : La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó usando programa 2 (3 minutos). Después de la centrifugación de recuperación final, se añadieron 100 µ? de TE . 1 µ? del producto final se pipetearon en papel DE81 y se contaron en 6 mi de Bioflúor II .
La sonda se ejecutó en un gel e TBE/urea. 1-3 µ? de la sonda o 5 µ? de ARN Mrk III fueron añadidos a 3 µ? de regulador de pH de carga. Después de calentar sobre un bloque de calor a 95EC durante tres minutos, la sonda fue inmediatamente puesta en hielo. Los pocilios de gel fueron enjuagados, la muestra cargada y ejecutada a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel fue envuelto en envoltura de sarán y expuesto a película XAR con una pantalla de intensificación en congelador a -70EC una hora durante la noche.
Hibridación a 33P A. Pre-tratamiento de secciones congeladas Los portaobjetos fueron retirados del congelador, puestos sobre bandejas . de aluminio y descongelados a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se pusieron en una incubadora a 55EC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos fueron fijados durante 10 minutos en 4% de paraformaldehído sobre hielo en la cabina de ahumado, y lavados en 0.5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 mi 20 x SSC + 975 mi de SQ H2) . Despés de la desproteinización en 0.5 ug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37EC (12.5 µ? de 10 mg/ml de abastecimiento en 250 mi de regulador de pH de RNAsa libre de RNasa precalentado) , las secciones fueron lavadas en 0.5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron deshidratadas en 70%, 95%, 100% de etanol, 2 minutos cada una .
B. Pre-tratamiento de secciones incrustadas en parafina Los portaobjetos fueron desparafinizados , puestos en SQ H20 y enjuagados dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones fueron desproteinadas en 20 ug/ml de proteinasa K (500 µ? de 10 mg/ml en 250 1 de regulador de pH de RNasa libre de RNasa; 37EC, 15 minutos) - embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 µ? en 250 mi de regulador de pH de RNasa, 37EC, 30 minutos) -tejidos de formalina. El enjuague subsecuente en 0.5 x SSC y deshidratación se llevaron a cabo como se describió arriba.
C . Prehibridacion Los portaobjetos fueron colocados en una caja de plástico revestida con regulador de pH de caja (4 x SSC, 50% de formamida) - papel filtro saturado.
D . Hibridación 1.0 x 106 cpm de sonda y 1.0 µ? de ARNt (solución de 50 mg/ml por portaobjetos) fueron calentados a 95EC durante 3 minutos. Los portaobjetos fueron enfriados en hielo, y se añadieron por portaobjeto 48 µ? de regulador de pH de hibridación. Después de someter a vórtice, se añadieron 50 µ? de mezcla 33P a 50 µ? de prehibridacion en portaobjetos. Los portaobjetos fueron incubados durante la noche a 55EC.
E . Lavados El lavado se llevó a cabo 2 x 10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 mi 20 x SSC + 16 mi 0.25M de EDTA, Vf=4L) , seguido por tratamiento con RNasaA a 37EC durante 30 minutos (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de regulador de pH de Rnasa = 20 ug/ml) . Los portaobjetos fueron lavados 2 x 10 minutso con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. La condiciones de lavado de severidad fueron como sigue: 2 horas a 55EC, 0.1 x SSC, EDTA (20 mi 20 x SSC + 16 mi de EDTA, Vf=4L) .
F . Oligonucleótidos Se llevó a cabo análisis in situ en una variedad de secuencias de ADN descritas en la presente. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis fueron obtenidos para que fueran complementarios con los ácidos nucleicos (o los complementos de los mismos) como se muestra en las figuras acompañantes. (1) DNA225785 (TAH04) pl 5 ' GGGCACCAAGAACCGAATCAT-3 ' (SEQ ID NO: 14) p2 5 ' -CCTAGAGGCAGCGATTAAGGG-3' (SEQ ID NO: 15) G . Resultados Se llevó a cabo un análisis in situ en una variedad de secuencias de ADN descritas en la presente. Los resultados de estos análisis son los siguientes. (1) DNA225785 (TAH04) La expresión se observó en células linfoides. Específicamente, en tejidos normales, la expresión se observó en bazo y nodulos linfáticos y coincide con áreas de células B, tales como centros germinales, manto y zonas marginales. La expresión significativa se observó también en secciones de tejido de una variedad de linfornas malignos, incluyendo linfoma de Hodgkin, linfoma folicular, linfoma macrocítico difuso, linfoma linfocítico pequeño y linfoma no Hodgkin. Estos datos concuerdan con el papel potencial de esta molécula en tumores hematopoyéticos , específicamente tumores de células B.
Ejemplo 4 Uso de TAHO como una sonda de hibridación El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para TAHO como una sonda de hibridación para, es decir, detección de la presencia de TAHO en un mamífero.
ADN que comprende la secuencia de codificación de TAHO de longitud completa o maduro como el descrito en la presente también se puede emplear como una sonda para tamizar moléculas de ADN homologas (tales como aquellas que codifican para variantes de origen natural de TAHO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano .
La hibridación y lavado de los filtros que contenían ya sea moléculas de ADN de biblioteca se lleva a cabo usando las siguientes condiciones de alta severidad. La hibridación de una sonda derivada de TAHO marcada radioactivamente a los filtros se lleva a cabo en una solución de 50% de formamida, 5xSSC, 0.1% de SDS, 0.1% de pirofosfato de sodio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8 2x de solución de Denhardt, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C durante 20 horas. El lavado de los filtros se lleva a cabo en una solución acuosa de 0.1 x SSC y 0.1% de SDS a 42°C.
Las moléculas de ADN que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica para el TAHO de secuencia nativa de longitud completa pueden ser luego identificadas usando técnicas estándares conocidas en la técnica.
Ejemplo 5 Expresión de TAHO en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TAHO mediante expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica para TAHO es amplificada inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzima de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Una variedad de vectores de expresión pueden ser empleados. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina . El vector es digerido con enzimas de restricción y desfosforilado . Las secuencias amplificadas por PCR son después ligadas en el vector. El vector incluirá de preferencia secuencias que codifiquen para un gen de resistencia a antibióticos, un promotor TRP, un líder de polyhis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polyhis y sitio de corte con enterocinasa) , la región de codificación de TAHO, terminador de transcripción lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa después para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los métodos descritos en Sambrook et al., citado ariba. Los transformantes son identificados por su capacidad para crecer en placas LB y colonias resistentes a antibiótico son después seleccionadas. ADN plasmídico puede ser aislado y confirmado mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados pueden crecer durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo nocturno puede ser subsecuentemente usado para inocular un cultivo a mayor escala. Las células son después cultivadas hasta una densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células pueden ser cosechadas por centrifugación. El sedimento celular obtenido por la centrifugación puede ser diluido usando varios agentes conocidos en la técnica, y la proteína TAHO diluida puede ser después purificada usando una columna de quelación de metales bajo condiciones que permitan la unión estrecha de la proteína.
TAHO puede ser expresado en E. coli en una forma marcada con poly-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica para TAHO es inicialmente amplificado usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionen un inicio de traducción eficiente y confiable, rápida purificación en una columna de quelación con metal y remoción proteolítica con enterocinasa . Las secuencias marcadas con poly-His amplificadas por PCR son luego ligadas en un vector de expresión, el cual se usa para transformar huésped de E. coli a base de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Lon galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq) . Los transformantes se cultivan primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30EC con agitación hasta que se alcance una O.D. 600 de 3-5. Los cultivos son después diluidos 5-100 veces en medio CRAP (preparado al mezclar 3.57 g de (NH4)2S04; 0.71 g de citrato de sodio»2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Sheffield hycasa SF en 500 mL de agua, así como 110 mM de MPOS, pH 7.3, 0.55% (p/v) de glucosa y 7 mM de gS04) y se cultivan durante aproximadamente 20-30 horas a 30EC con agitación. Las muestras se retiran para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo total se centrifuga para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelan hasta la purificación y redoblamiento.
Pasta de E. coli de fermentaciones de 0.5 a 1 L (6-10 g de sedimentos) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 , 20 mM de Tris, pH 8 regulador de pH. Sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio se añaden para hacer concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4EC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización . La solución se centrifuga a 40,000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de regulador de pH de columna de quelatos de metal (guanidina 6 M, 20 mM de Tris, pH 7.4) y se filtra a través de filtros de 0.22 mieras para clarificar. El extracto aclarado se carga en una columna de quelato metálico Ni-NTA Qiagen de 5 mi equilibrada en el regulador de pH de columna de quelatos metálicos. La columna se lava con regulador de pH adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol) , pH 7.4. La proteína es eluida con regulador de pH que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína deseada son agrupadas y almacenadas a 4EC. La concentración de proteínas es estimada por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas son redobladas al diluir la muestra lentamente en regulador de pH de redoblamiento recién preparado que consiste en: 20 mM de Tris, pH 8.6, 0.3 M de NaCl , 2.5 M de urea, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de redoblamiento son seleccionados de tal manera que la concentración final de proteínas sea de entre 50 a 100 microgramos/ml . La solución de redoblamiento se agita suavemente a 4EC durante 12-36 horas. La reacción de redoblamiento es terminada por la adición de TFA hasta una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 mieras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína redoblada es cromatografiada en una columna de fase inversa Rl/H Poros usando un regulador de pH móvil de 0.1% de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alícuotas de fracciones con absorbancia A280 son analizadas en geles de poliacrilamida SDS y fracciones que contienen proteína redoblada homogénea son agrupadas. Generalmente, las especies adecuadamente redobladas de la mayoría de las proteínas son eluidas a las concentraciones más bajas de acetonitrilo toda vez que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrófobos protegidos contra la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas son normalmente eluidas a concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas mal dobladas de proteínas a partir de la forma deseada, la etapa de fase inversa también remueve endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido TAHO doblado deseado son agrupadas y el acetonitrilo es removido usando una suave corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM de Hepes, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 y 4% de manitol por diálisis o mediante filtración en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el regulador de pH de formulación y filtradas estérilmente .
Ciertos de los polipéptidos TAHO descritos en la presente han sido expresados y purificados exitosamente usando esta técnica.
Ejemplo 6 Expresión de TAHO en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de TAHO mediante expresión recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (véase EP 307,247, publicada el 15 de marzo de 1989) , se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de TAHO es ligado en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de TAHO usando métodos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., citado arriba. El vector resultante es llamado pRK5-TAHO .
En una modalidad, las células hospederas seleccionadas pueden ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se crecen hasta confluencia en placas de cultivo de tejidos en medio tal como DMEM complementado con suero de becerro fetal y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 ig de ADN de pRK5 -TAHO se mezclan con alrededor de 1 g de ADN que codifica para el gen VA RNA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 µ? de 1 mM de Tris-HCl, 0.1 mM de EDTA, 0.227 M de CaCl2. A esta mezcla se le añade, por goteo, 500 µ? de HEPES 50 mM pH 7.35), 280 mM de NaCl, 1.5 mM de NaP04, y un precipitado se deja formar durante 10 minutos a 25 °C. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja sedimentar durante aproximadamente 4 horas a 37°C. El medio de cultivo es aspirado y 2 mi de glicerol al 20% en PBS se añaden durante 30 segundos. Las células 293 son después lavadas con medio libre de suero, el medio fresco se añade y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones , el medio de cultivo se retira y se reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 µ??/p?? de 35S-cisteína y 200 yCi/ml de 35S-metionina . Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado es recogido, concentrado en un filtro centrífugo y cargado en un gel SDS al 15% . El gel procesado puede ser secado y expuesto a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido TAHO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, TAHO puede ser introducido en células 293 transitoriamente usando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , 12:7575 (1981). Las células 293 son cultivadas hasta la densidad máxima en un matraz centrífugo y 700 ug de ADN de pRK5-TAH0 son añadidos. Las células se concentran primero del matraz giratorio por centrifugación y se lava con PBS . El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el sedimento celular durante cuatro horas. Las células son tratadas con 20% de glicerol durante 90 segundos, lavadas con medio de cultivo de tejidos, y re- introducidas en el matraz centrífugo que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 µg/ml de insulina bobina y 0.1 ug/ml de transferrina bobina. Después de aproximadamente 4 días, los medios acondicionados se centrifugan y se filtran para remover células y restos. La muestra que contiene TAHO expresado puede ser después concentrada y purificada mediante cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra modalidad, TAHO puede ser expresado en células CHO. El pRK5-TAH0 puede ser transíectado en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaP04 o DEAE-dextrano . Como se describió arriba, los cultivos de células pueden ser incubados, y el medio reemplazado con medio de cultivo (solo) o medio que contenga un radiomarcador tal como 35S-metionina . Después de determinar la presencia de polipéptido TAHO, el medio de cultivo puede ser reemplazado con medio libre de suero. De preferencia, los cultivos se incuban durante alrededor de 6 días, y luego el medio acondicionado es cosechado. El medio que contiene TAHO expresado puede ser después concentrado y purificado mediante cualquier método seleccionado .
TAHO marcado con epítope también puede ser expresado en células CHO hospederos. El TAHO puede ser subclonado del vector pR 5. El inserto del subclon puede ser sometido a PCR para fusionarlo en cuadro don un marcador epítope seleccionado tal como un marcador poly-His en un vector de expresión de baculovirus. El inserto de TAHO marcado con poly-his puede ser después subclonado en un vector conducido por SV40 que contenga un marcador de selección tal como DHFR para selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden ser transfectadas (como se describió arriba) con el vector conducido por SV40. La marcación puede llevarse a cabo, como se describe arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el TAHO marcado con poly-His es expresado puede ser después concentrado y purificado mediante cualquier método seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad a quelatos de Ni2+.
TAHO también puede ser expresado en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se lleva a cabo usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción de IgG ( inmunoadhesina) , en la cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de la región constante de IgGl que contiene los dominios de pivote, CH2 y CH2 y/o es una forma marcada con poly-His.
Después de la amplificación por PCR, las moléculas de ADN respectivas son subclonadas en un vector de expresión de CHO usando técnicas estándares como las descritas en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Bilogy, unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997) . Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir la reclasificación conveniente de las moléculas de ADN. El vector usó expresión en células CHO y es como se describe en Lucas et al., Nucí. Acids. Res., 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor temprano de SV40/potenciador para conducir la expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión con DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transíección .
Doce microgramos del ADN plasmídico deseado se introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO usando reactivos de transfección disponibles comercialmente ® ® ® Superfect (Quiagen) , Dosper o Fugene (Boehringer Mannheim) . Las células se cultivan como se describe en Lucas et al., citado ariba. Aproximadamente 3 x 107 células se congelan en una muestra para crecimiento y producción adicionales como se describe abajo.
Las ampolletas que contienen el ADN plasmídico son descongeladas al ponerlas en un baño de agua y mezcladas por vortexeo. Los contenidos son pipeteados en un tubo centrífugo que contiene 10 mL de medio y se centrifugan a 1,000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante es aspirado y las células son resuspendidas en 10 mL de medio selectivo (0.2 de PS20 filtrado con 5% de 0.2 f?? de suero bovino fetal diafiltrado) . Las células se hacen después alícuotas en un centrifugador de 100 mL que contiene 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células son transferidas a un centrifugador de 250 mL relleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37°C. Después de 2-3 días, centrifugadores 250 mL, 500 mL y 2,000mL son sembrados con 3 x 105 células/mL. Los medios de células son intercambiados con medio fresco por centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque cualquier medio CHO adecuado puede ser empleado, un medio de producción descrito en la patente de E.U.A. No. 5,122,469, expedida el 16 de junio de 1992 puede realmente ser usado. Un centrifugador de producción de 3 L es sembrado a 1.2 x 106 célula/mL. El día 0, el pH del número de célula se determina. El día 1, el centrifugador es muestreado y el burbujeo con aire filtrado es iniciado. El día 2, el centrifugador es muestreado, la temperatura se desplaza a 33°C y 30 mL de 500 g/L de glucosa y 0.6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) son tomados. A lo largo de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo a alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad caiga debajo de 70%, el cultivo de células se cosecha por centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0.22 fp?. El filtrado es ya sea almacenado a 4°C o cargado inmediatamente sobre columnas para purificación.
Para las construcciones marcadas con poly-His, las proteínas se purifican usando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una columna Ni-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM de Hepes, pH 7.4, regulador de pH que contiene NaCl 0.3 M y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4°C. Después de la carga, la columna se lava con regulador de pH de equilibrio adicional y la proteína es eluida con regulador de pH de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada es posteriormente desalada en un regulador de pH de almacenamiento que contiene 10 mM de hepes, NaCl 0.14 M y 4% de manitol, pH 6.8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 mi y se almacenan a -80°C.
Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fe) se purifican a partir de los medios acondicionados como sigue. El medio acondicionado se bombea en una columna de proteína A de 5 mL (Pharmacia) la cual había sido equilibrada en 20 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, pH 6.8. Después de la carga, la columna se lava extensamente con regulador de pH de equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3.5. La proteína eluida es inmediatamente neutralizada al recoger fracciones de 1 mi en tubos que contienen 275 <|)L de regulador de pH Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada es posteriormente desalada en regulador de pH de almacenamiento como se describió arriba para las proteínas marcadas con poly-His. La homogeneidad se evalúa mediante geles de SDS de poliacrilamida y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales por degradación de Edman .
Ciertos de los polipéptidos TAHO descritos en la presente han sido expresados y purificados exitosamente usando esta técnica.
Ejemplo 7 Expresión de TAHO en levadura El siguiente método describe la expresión recombinante de TAHO en levadura.
Primero, se construyen vectores de expresión de levadura para producción intracelular o secreción de TAHO a partir del promotor ADH2/GAPDH. ADN que codifica para TAHO y el promotor es insertado en sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAHO. Para secreción, ADN que codifica para TAHO puede ser clonado en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifique para el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal TAHO nativo u otro péptido de señal de mamífero o, por ejemplo, una secuencia de señal secretora/líder de factor alfa de levadura o invertasa, y secuencias enlazadoras (si se requiere) para la expresión de TAHO.
Células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden ser después transformadas con los plásmidos de expresión descritos arriba y cultivadas en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden ser analizados por precipitación con 10% de ácido trifluoroacético y separación mediante SDS-PAGE, seguida por la tinción de los genes con tinción de Azul de Coomassie .
TAHO recombinante puede ser subsecuentemente aislado y purificado al remover las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y luego concentrando el medio usando filtros de cartuchos seleccionados. El concentrado que contiene TAHO puede purificarse más usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Ciertos de los polipéptidos TAHO descritos en la presente han sido expresados y purificados exitosamente usando estas técnicas.
Ejemplo 8 Expresión de TAHO en células de insecto infectadas con baculovirus El siguiente método describe la expresión recombinante de TAHO en células de insecto infectadas con baculovirus. La codificación de secuencia para TAHO es fusionada hacia el extremo 5' de un marcador epítope contenido dentro del vector de expresión de baculovirus. Estos marcadores de epítope incluyen los marcadores poly-his y marcadores de inmunoglobulina (tales como regiones Fe de IgG) . Una variedad de plásmidos pueden ser empleados, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica para TAHO o la porción deseada de la secuencia de codificación de TAHO tal como la secuencia que codifica para un dominio extracelular de una proteína de transmembrana o la secuencia que codifica para la proteína madura si la proteína es extracelular se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3' . El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo (seleccionados) . El producto es luego digerido con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonado en el vector de expresión.
Baculovirus recombinante se genera al co-transfectar el plásmido anterior y ADN de virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28°C, los virus liberados son cosechados y usados para amplificaciones adicionales. La infección viral y expresión de proteínas se llevan a cabo como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors : A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) .
TAHO marcado con poly-his expresado puede ser luego purificado, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad a quelatos de Ni2+ como sigue. Se preparan extractos a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf son lavadas, resuspendidas en regulador de pH de sonificación (25 L de Hepes, pH 7.9; 12.5 mM de MgCl2; 0.1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 0.1% de NP-40; KC1 0.4 ) , y sonificadas dos veces durante 20 segundos en hielo. Los productos de sonificación son depurados por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en regulador de pH de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 7.8) y se filtran a través de un filtro de 0.45 (|)m. Una columna de Ni2+-NTA agarosa (disponible comercialmente de Quiagen) se preparar con un volumen de lecho de 5 mL, se lava con 25 mL de agua y se equilibra con 25 mL de regulador de pH de carga. El extracto celular filtrado se carga sobre la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se lava hasta A2eo de línea de base con regulador de pH de carga, punto en el cual se inicia la recolección de las fracciones. Luego, la columna se lava con un regulador de pH de lavado secundario (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 6.0), el cual eluye proteína unida no específicamente. Después de alcanzar la línea de base A280 de nuevo, la columna es revelada con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el regulador de pH de lavado secundario. Fracciones de 1 mL se recogen y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o Western blot con Ni2+-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que contienen el TAHO marcado con Hisio eluido son agrupadas y dializadas contra regulador de pH de carga.
Como alternativa, la purificación de TAHO marcado con IgG (o marcado con Fe) se puede llevar a cabo usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía en columna de proteína o proteína G.
Ciertos de los polipéptidos TAHO descritos en la presente han sido expresados y purificados exitosamente usando estas técnicas.
Ejemplo 9 Preparación de anticuerpos que se unen a TAHO Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a TAHO. Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, véase arriba. Los inmunógenos que pueden ser empleados incluyen TAHO purificado, proteínas de fusión que contienen TAHO y células que expresan TAHO recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunógeno puede hacerse por la persona capacitada sin experimentación excesiva.
Ratones, tales como Balb/c, son inmunizados con el inmunógeno TAHO emulsionado en adyuvante de Freund completo e inyectado subcutáneamente e intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Como alternativa, el inmunógeno es emulsionado con adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e inyectado en las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados son después reforzados 10 a 12 días más tarde con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Posteriormente, durante varias semanas, los ratones también pueden ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones mediante sangrado retro-orbital para pruebas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-TAHO .
Después de que se ha detectado un título de anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos pueden ser inyectados con una inyección intravenosa final de inmunógeno. Tres a cuatro días más tarde, los ratones son sacrificados y las células esplénicas son cosechadas. Las células esplénicas son luego fusionadas (usando 35% de polietilenglicol) a una línea de células de mieloma de murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden ser después puestas en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios que contengan medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células esplénicas .
Las células de hibridoma serán tamizadas en un ELISA para reactividad contra inmunógenos . La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra inmunógenos está dentro de la capacidad en la técnica.
Las células de hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente en ratones Balb/c singeneicos para producir ascites que contengan los anticuerpos monoclonales anti-inmunógeno . Como alternativa, las células de hibridoma pueden ser cultivadas en matraces de cultivo de tejidos o botellas rodantes. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites se puede lograr usando precipitación con sulfato de amonio, seguida por cromatografía de exclusión en gel . Como alternativa, cromatografía de afinidad a base de la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G puede ser empleada.
Los anticuerpos dirigidos contra ciertos de los polipéptidos TAHO descritos en la presente pueden producirse exitosamente usando estas técnicas. Más específicamente, anticuerpos monoclonales funcionales que sean capaces de reconocer y unirse a proteína TAHO, incluyendo formas humanas y de macaco de proteínas TAHO (como se mide por ELISA estándar, análisis de clasificación FACS y/o análisis de inmunohistoquímica) pueden generarse exitosamente contra las siguientes proteínas TAHO, incluyendo formas humanas y de macaco de proteínas TAHO, como las descritas en la presente: TAH04 (CD79a humano) (DNA225785) , TAHO5 (CD79b humano) (DNA225786) , TAH039 (cyno CD79a) (DNA548454) y TAHO40 (cyno CD79b) (DNA548455) .
Además de la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos TAHO, incluyendo formas humanas y de macaco de polipéptidos TAHO, como las descritas en la presente, muchos de los anticuerpos monoclonales pueden conjugarse exitosamente a una toxina celular para usarse en dirigir la toxina celular a una célula (o tejido) que exprese un polipéptido TAHO, incluyendo formas humanas y de macaco de polipéptidos TAHO de interés (tanto in vitro como in vivo) . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales derivados por toxina (por ejemplo, DM1) pueden ser generados exitosamente en los siguientes polipéptidos TAHO, incluyendo formas humanas y de macaco de proteínas TAHO, como las descritas en la presente: TAH04 (CD79a humano) (DNA225785) , TAH05 (CD79b humano) (DNA225786) , TAH039 (cyno CD79a) (DNA548454) y TAHO40 (cyno CD79b) (DNA548455) .
Generación de anticuerpos monoclonales contra CD79a/CD79b (TAH04, TAH05) Las proteínas para inmunización de ratones fueron generadas mediante la transfección transitoria de vectores que expresan dominios extracelulares marcados con Fe o marcados con His (EGDs) de CD79a humano, CD79b humano o CD79b de mono macaco en células CHO. Las proteínas fueron purificadas a partir de los sobrenadantes de células transíectadas en columnas de proteína A y la identidad de la proteína se confirmó mediante secuenciación N-terminal.
Para anticuerpos CD79a (humanos) , diez ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) fueron hiperinmunizados con el ECD marcado con Fe recombinante de CD79a humano. Para los anticuerpos CD79b (humanos) diez ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) fueron hiperinmunizados con ECD marcado con Fe o marcado con His recombinante de CD79b humano. Para anticuerpos CD79b (mono macaco) , diez ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Hollister, CA) fueron hiperinmunizados con el ECD marcado con Fe recombinante de la proteína CD79b de mono macaco, en adyuvante Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO) .
Para los anticuerpos CD79a humanos, células B de ratones que demostraban altos títulos de anticuerpo contra el inmunógeno CD79a humano mediante ELISA directa, y la unión específica a células Ramos (línea de células B CD79 positivas) contra células Raj i (línea de células B CD79 negativa) , fueron fusionadas con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653 ; American Type Cultire Collection, Rockville, MD) como se describió previamente (Hongo, J.S. et al., Hybrido a, 14:253-260 (1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497 (1975); Freund Y.R. et al., J. Immunol . 129:826-2830 (1982)). Para los anticuerpos CD79b humanos, células B de ratones que demostraban altos títulos de anticuerpo contra el inmunógeno CD79b humano mediante ELISA directo, y unión específica a células Ramos, fueron fusionados con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653 ; American Type Culture Collection, Rockville, MD) como se describió previamente (Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260 (1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497 (1975); Freund, Y.R. et al., J. Immunol. 129:2826-2830 (1982)). Para los anticuerpos CD79b de mono macaco, células B de ratón que demostraban altos títulos de anticuerpo contra el inmunógeno CD79b de mono mediante ELISA directo, y unión específica a la población de células B de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de mono macaco, se fusionaron con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653 ; American Type Culture Collection, Rockville, MD) como se describió previamente (Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260 (1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497 (1975); Freund, Y.R. et al., J". Immunol., 129 :2826-2830 (1982) ) .
Para anticuerpos CD79a humano, CD79b humano y CD79b de mono macaco, después de 10 a 12 días, los sobrenadantes fueron cosechados y tamizados para producción de anticuerpos y unión mediante ELISA directo y FACS como se indicó arriba. Los clones positivos, que mostraban la inmunounión más alta después de la segunda ronda de subclonación por dilución limitadora, se expandieron y cultivaron para caracterización adicional, incluyendo la especificidad y reactividad cruzada de CD79a humano, CD79b humano o CD79b de mono macaco. Los sobrenadantes cosechados de cada linaje de hibridomas fueron purificados mediante cromatografía de afinidad (cromatografía de líquidos de proteína rápida Farmacia (FPLC) ; Pharmacia, Uppsala, Suecia) como se describió anteriormente (Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260 (1995) ; Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497 (1975) ; Freund, Y. R. et al., J. Immunol., 129:2826-2830 (1982)) . Las preparaciones de anticuerpo purificadas fueron luego filtradas estérilmente (tamaño de poro 0.2-ft?; Nalgene, Rochester NY) y almacenadas a 4EC en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) .
Los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer y unirse a proteína TAHO (según se mide por ELISA estándar, análisis de clasoficiación FACS (para especificidad de células B) y/o análisis de inmunohistoquímia) han sido generados exitosamente contra el (CD79a) TAH04 humano y han sido diseñadas como anti-CD79a-8H9 humano (referida en la presente como "8H9" u "8H9.1.1") y depositadas en la ATCC el 11 de julio de 2006 como TCC No. PTA-7719 (anticuerpo monoclonal de murino anti-CD79a humano 8H9.1.1), como CD79a-5C3 anti-humano (en adelante referido como W5C3" o "5C3.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7718 (anticuerpo monoclonal de murino anti-CD79a humano 5C3.1.1), como CD79a-7H7 anti-humano (en la presente referido como "7H7" o "7H7.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7717 (anticuerpo monoclonal de murino anti-CD79a humano 7H7.1.1), como CD79a-8Dll anti-humano (en la presente referido como W8D11" u "8D11.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7722 (anticuerpo monoclonal de murino anti-CD79a humano 8D11.1.1), como CD79a-15E4 anti-humano (en la presente referido como "15E4" o "15E4.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7721 (anticuerpo monoclonal de murino anti-D791 humano 15E4.1.1) y como CD79a-16C11 anti-humano (referido en la presente como "16C11" o "16C11.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7720 (anticuerpo monoclonal de murino anti-CD79a humano 16C11.1.1).
Los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer y unirse a proteína TAHO (según se mide por ELISA estándar, análisis de clasificación FACS (para especificidad de células B) y/o análisis de inmunohistoquímica) se han generado exitosamente contra el TAHO5 (CD79b humano) y han sido designados como CD79b-2F2 anti-humano (referido en la presente como "2F2" o "2F2.20.1"), y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7712 (anti-CD79b humano 2F2.20.1) .
Los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer y unirse a una proteína TAHO (según se mide por ELISA estándar, análisis de clasificación FACS ( para especificidad de células B) y/o análisis de inmunohistoquímica) han sido generados exitosamente contra el cyno-TAH040 (CD79b) y han sido asignados como anti-cyno-CD79b-3H3 (en adelante referido como "3H3" o "3H3.1.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATC No. PTA-7714 (anti-cyno CD79b 3H3.1.1), anti-cyno-CD79b-8D3 (en la presente referido como "8D3" u "8D3.7.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7716 (anti-cyno CD79b 8D3.7.1), anti-cyno-CD79b-9Hll (en adelante referido como "9H11" o "9H11.3.1") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC NO. PTA-7713 (anti-cyno CD79b 9H11.3.1), anti-cyno-CD79b-10D10 (en la presente referido como "10D10" o "10D10.3") y depositado en la ATCC el 11 de julio de 2006 como ATCC No. PTA-7715 (anti-cyno CD79b 10D10.3) .
Construcción y secuenciación de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) quimérico (chSN8) Para la construcción de IgGl SN8 quimérico, ARN total se extrajo de células de hibridoma SN8 (obtenidas de Roswell Park Cáncer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(l):84-95 (1993)) usando un kit Qiagen RNeasy Mini (Cat #74104) y el protocolo sugerido por el fabricante. Usando las secuencias de aminoácidos N-terminales obtenidas para las cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal SN8, cebadores de PCR específicos para cada cadena fueron diseñados. Cebadores inversos para RT-PCR fueron diseñados para coincidir con la estructura 4 de la familia génica que correspondía a la secuencia N-terminal. También se diseñaron cebadores para añadir sitios de restricción deseados para clonación. Para la cadena ligera, éstos fueron Eco RV en el N-terminal, y RsrII en el extremo 3' de la estructura 4. Para la cadena pesada, los sitios añadidos fueron PvuII en el N-terminal, y Apal ligeramente hacia el extremo 3' de la unión VH-CH1. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: CA1807. SNlight (cebador hacia adelante de la cadena ligera SN8) : 5 ' -GGAGTACATTCAGATATCGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCT-3 ' (SEQ ID NO: 28) CA1808. SNlightrev (cebador inverso de la cadena ligera SN8) : 5 ' GGTGCAGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACC-3 ' (SEQ ID NO: 29) CA1755.HF (cebador hacia adelante de la cadena pesada SN8) : 5 ' -GCAACTGGAGTACATTCACAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGC-3 ' (SEQ ID NO: 30) CA1756.HR (cebador hacia atrás de la cadena pesada de SN8) : 5 ' -GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC- 3 ' (SEQ ID NO: 31) Las reacciones de RT-PCR para las cadenas pesada y ligera se llevaron a cabo usando un kit Qiagen One-step RT-PCR (Cat # 210210) y las mezclas y condiciones de reacción sugeridas. Vectores pRK para expresión de células de mamífero de IgGs han sido descritos previamente (Gorman et al., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990) . El vector para clonar el dominio variable de la cadena ligera SN8 quimérico es un derivado de pDRl (Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175 (l) :217-225 (1992); Véase también figura 24A-24B) en el cual un sitio RsrII había sido introducido mediante mutagénesis dirigida a sitio, y contiene el dominio constante kappa humano. Los productos de RT-PCR de la cadena ligera fueron digeridos con EcoRV y RsrII, purificados en gel y clonados en los sitios EcoRV/RsrII de este vector.
De manera similar, para la clonación del dominio variable de la cadena pesdada SN8 quimérico, los productos de RT-PCR de la cadena pesada fueron digeridos con PvuII y Apal y clonados en los sitios PvuII-Apal del vector pDR2 (Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175 (1) : 217-225 (1992); véase también figuras 25A-25B) . Este vector pDR2 contiene los dominios CHl, pivote, CD2 y CH3 de IgGl humana.
La secuencia de ADN se obtuvo para la región de codificación completa de las cadenas ligera (figura 9) y pesada (figura 11) quiméricas humanas murino resultantes para anti-CD79b humano (chSN8) . El polipéptido codificado para las cadenas ligera y pesada quiméricas murino-humano codificado por las moléculas de ADN se muestra en las figuras 10 y 12, respectivamente. Después de la secuenciación de ADN, se analizaron la expresión de los plásmidos .
Los plásmidos fueron transfectados transitoriamente en línea de células 293 (una línea de células de riñon embrionario humano transformada con adenovirus (Graham et al., J". Gen. Virol . , 36:59-74 (1977)) como se describió arriba para células CHO. Específicamente, células 293 fueron divididas el día anterior a la transfección, y puestas en medio que contenía suero. Al día siguiente, ADN de doble hebra preparado como un precipitado en fosfato de calcio fue añadido, seguido por pAdVAntage™ ADN (Promega, Madison, I) , y las células fueron incubadas durante la noche a 37°C. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero y cosechadas después de 4 días. Las proteínas de anticuerpo fueron purificadas a partir de los sobrenadantes de células transfectadas en columnas de proteína A y el regulador de pH se cambió después por succinato de sodio 10 mM, 140 mM de NaCl, pH 6.0, y se concentró usando un Centricon-10 (Amicon) . La identidad de las proteínas se confirmó mediante secuenciación N-terminal. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis de aminoácido cuantitativo. Los anticuerpos fueron probados para unirse a CD79b humano (TAH05) mediante FACS en células BJAB o RAMOS como se describió arriba.
Construcción y secuenciación de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (ch2F2) Para la construcción de IgGl 2F2 quimérico, AR total se extrajo de células de hibridoma 2F2 usando un kit Qiagen R easy Mini (cat # 74104) y el protocolo sugerido por el fabricante. Usando las secuencias de aminoácidos N-terminales obtenidas para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal 2F2, cebadores de PCR específicos para cada cadena fueron diseñados. Los cebadores inversos para RT-PCR fueron digeridos para coincidir con la estructura 4 de la familia génica que corresponde a la secuencia N-terminal. Los cebadores también fueron diseñados para añadir sitios de restricción deseados para clonación. Para la cadena ligera estos fueron EcoRV en el N-terminal, y Kpnl en el extremo 3' de la estructura 4. Para la cadena pesada, los sitios añadidos fueron BsiWI en el N-terminal, y Apal ligeramente hacia el extremo 3' de la unión VH-CH1. Las secuencias de cebadores son las siguientes: 9C10LCF.EcoRV (cebador hacia adelante de la cadena ligera 2F2) : 5 ' -GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT-3' (SEQ ID NO:36) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C) C7F7LCR.KpnI (cebador hacia atrás de la cadena ligera 2F2) : 5 ' -TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3 ' (SEQ ID NO : 37) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C) 13G5HCF.BsiWI (cebador hacia adelante de la cadena pesada 2F2) : 5 ' GATCGACGTACGCTCAGGTYCARCTSCAGCARCCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 38) ( (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T . S=G/C, H=A/T/C) C7F7HCR.ApaI (cebador hacia atrás de la cadena pesada 2F2) : 5 ' -ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3 ' (SEQ ID NO: 39) (B=G/T/C, K=G/T, Y=C/T, M=A/C, R=A/G, D=G/A/T. S=G/C, H=A/T/C) Las reacciones RT-PCR para las cadenas ligera y pesada se llevaron a cabo usando un kit Qiagen One-step RT-PCR (Cat #210210) y las mezclas y condiciones de reacción sugeridas.
Vectores pRK para expresión de células de mamífero de IgGs han sido descritos previamente (Gorman et al., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990). Los vectores han sido modificados y tienen incorporados ciertos sitios de reconocimiento de enzima de restricción endonucleasa para facilitar clonación y expresión (Shields et al., J Biol Chem 2000; 276:6591-6604). VL amplificado se clonó en un vector de expresión de células de mamífero pRK que contenía el dominio constante kappa humano (pRK. LPG3.Human Kappa; figuras 26A-26B) usando los sitios EcoRv y Kpnl . VH amplificado se insertó en un vector de expresión de célula de mamífero pRK que codificaba para el dominio constante IgGl humano de longitud completa (pRK. LPG4. Human HC; figurarS 27A-27B) usando los sitios Bsi I y Apal .
La secuencia de ADN se obtuvo para la región de codificación completa de las cadenas ligera (figura 16) y pesada (figura 18) quiméricas murino-humanas resultantes para anti-CD79b humano (2F2) . El polipéptido codificado para las cadenas ligera y pesada quiméricas murino-humano codificadas por las moléculas de ADN se muestran en las figuras 17 y 19, respectivamente. Después de la secuenciación de ADN, se analizaron las expresiones de los plásmidos.
Los plásmidos fueron transíectados transitoriamente en células 293 (línea de células de riñon embrionario humano transformadas por adenovirus (Graham et al., J. Gen. Virol . , 36:59-74 (1977)) como se describió arriba o células CHO. Las proteínas de anticuerpo fueron purificadas de los sobrenadantes de células transíectados en columnas de proteína A y la identidad de las proteínas se confirmó mediante secuenciación N-terminal. Los anticuerpos fueron probados para unión a CD 9b humano (TAH05) mediante FACS en células BJAB o RAMOS como se describió arriba.
Construcción y secuenciación de anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (chlODlO) Para la construcción de IgGl anti-cyno CD79b (TAHO40) (chlODlO) quimérica, ARN total se extrajo de células de hibridoma 10D10 usando un kit Qiagen RNeasy Mini (Cat #74104) y el protocolo sugerido por el fabricante. Usando las secuencias de aminoácidos N-terminales obtenidas para las cadenas ligera y pesada de 10D10 Mab, cebadores de PCR específicos para cada cadena fueron diseñados. Cebadores hacia atrás para RT-PCR fueron diseñados para coincidir con la estructura 4 de la familia génica que correspondía a la secuencia N-terminal. También se diseñaron cebadores para añadir sitios de restricción deseados para clonación. Para la cadena ligera éstos fueron Eco RV en el N-terminal y RsrII en el extremo 3' de la estructura 4. Para la cadena pesada, los sitios añadidos fueron PvuII en el N-terminal y Apal ligeramente hacia el extremo 3' de la unión VH-CH1. Las secuencias de cebadores son mostradas como sigue: Hacia adelante de la cadena ligera: CA1836 5 ' -GGAGTACATTCAGATATCGTGCTGACCCCATCTCCACCCTCTTTGGC-3 ' (SEQ ID O: 44) Hacia atrás de la cadena ligera: CA1808 5' -GGTGCAGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACC-3 ' (SEQ ID O: 45) Hacia adelante de la cadena pesada: CA1834: 5 ' -GGAGTACATTCAGATGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTG-3 ' (SEQ ID NO: 46) Hacia atrás de la cadena pesada: CA1835 5 ' -GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC-3 ' (SEQ ID NO: 47) Las reacciones de RT-PCR para la cadena ligera se llevaron a cabo usando un kit Qiagen One-step RT-PCR (cat # 210210) y las mezclas y condiciones de reacción sugeridas. Para la cadena pesada, Superscript III First Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen cat # 18080-51 se usó seguido por amplificación con Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen) . Las reacciones y condiciones fueron como se recomienda por el fabricante. Vectores pRK para expresión de células de mamífero de IgGs han sido descritos previamente (Gorman et al., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990). El vector para clonar el dominio variable de la cadena ligera de 10D10 quimérico es un derivado de pDRl (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175 (1) : 217-225 (1992); véase también figura 24) en el cual un sitio RsrII había sido introducido mediante mutagénesis dirigida a sitio, y contiene el dominio constante kappa humano. Los productos de RT-PCR de la cadena ligera fueron digeridos con EcoRV y RsrII, purificados en gel y clonados en los sitios EcoRV/RsrII de este vector.
En forma similar, para la clonación del dominio variable de la cadena pesada de 10D10 quimérico, los productos de RT-PCR de la cadena pesada fueron digeridos con PvuII-Apal y clonados en los sitios PvuII-Apal del vector pDR2 (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175 (1) :217-225 (1992); véase también figura 22) . Este vector pDR2 contiene los dominios de CH1, pivote, CH2 y CH3 de IgGl humana.
La secuencia de ADN se obtuvo para la región de codificación completa de las cadenas ligera (figura 20) y pesada (figura 22) quiméricas murino-humano resultantes para anti-cyno CD79b (chlODlO) . El polipéptido codificado para las cadenas ligera y pesada quiméricas murino-humano codificadas por las moléculas de ADN que muestran las figuras 21 y 23, respectivamente. Después de la secuenciación de ADN, se analizó la expresión de los plásmidos.
Los plásmidos fueron transfectados transitoriamente en línea de células 293 (una línea de células de riñon embrionario humano transformadas con adenovirus (Graham et al., J. Gen. Virol . , 36:59-74 (1977)) como se describe arriba para células CHO. Específicamente, las células 293 fueron divididas el día antes de la transfección, y puestas en medio que contenía suero. Al día siguiente, ADN de doble hebra preparado como un precipitado en fosfato de calcio fue añadido, seguido por pAdVAntage™ DNA (Promega, Madison, WI) , y las células se incubaron durante la noche a 37°C. Las células se cultivaron en medio libre de suero y se cosecharon después de 4 días. Las proteínas de anticuerpo fueron purificadas a partir de los sobrenadantes de células transfectados en columnas de proteína A y después se intercambió el regulador de pH por 10 mM de succinato de sodio, 140 mM de NaCl, pH 6.0, y se concentró usando un Centricon-10 (Amicon) . La identidad de las proteínas se confirmó mediante secuenciación N-terminal. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis de aminoácidos cuantitativo. Los anticuerpos fueron probados para unión a cyno CD79b (TAH040) mediante FACS en células BJAB-cyno CD79b (una línea de células BJAB que expresa cyno CD79b (TAHO40) , descrita abajo.
Caracterización de anticuerpos CD79b El epítope al cual se unen los anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno-CD79b (TAHO40) fue determinado. Para la determinación del epítope, el gen CD79b de monos tanto macacos como Rhesus fue clonado, usando los cebadores que flanquean la región de no codificación del gen CD79b, el cual es muy conservador entre el CD79b humano y de ratón, sugiriendo que también debe ser conservador en primates .
Como alternativa, formas empalmadas de CD79b humano (TAH05) , una forma de longitud completa y una truncada que carece de el dominio tipo Ig extracelular completo (el dominio tipo Ig extracelular que no está presente en la forma truncada empalmada de CD79b está encerrado en un cuadro en la figura 13) , han sido descritas en células B normales y malignas (Hashimoto, S. et al., Mol. Immunol . , 32 (9):651-9 (1995); Alfarano et al., Blood, 93 (7) : 2327-35 (1999)). Anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) comerciales, incluyendo CB3-1 (BD Pharmingen; Co ley, Reino Unido) y SN8 (Ancell; Bayport , M and Biomeda) reconocieron ambas formas de CD79b humano (TAH05) , sugiriendo que el epítope para anticuerpos anti-CD79b humano se ubica en la región péptida extracelular distal al dominio de transmembrana y presente tanto en las formas CD79b humanas de longitud completa como truncadas (Cragg, Blood, 100 (9) : 3068-76 (2002)). Además, los anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) comerciales (CB3-1 y SN8) y anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) descritos arriba (2F2) no reconocen células B de mono macaco o Rhesus (datos no mostrados) .
La región de péptido extracelular distal al dominio de transmembrana y presente en las formas de CD79b humanas tanto en longitud completa como truncadas se comparó con la misma región en CD79b de macaco y rhesus. La única diferencia en esta región aparte de las secuencias de péptidos de señal, entre CD79b humano (TAH05) y CD79b de macaco (TAHO40) o Rhesus, es una región de 11 aminoácidos con sólo tres diferencias de aminoácido, ARSEDRYRNPK (humano) (SEQ ID NO: 16) y AKSEDLYPNPK (macaco y Rhesus) (SEQ ID NO: 17). La región de 11 aminoácidos en CD79b humano, macaco y murino se muestra en la figura 13 y se marca como "péptido de prueba" (referido también en la presente como "limero").
Para determinar si los péptidos con la región de 11 aminoácidos eran capaces de competir para unión a anticuerpos, células BJAB fueron usadas en un ensayo de competencia. Los péptidos de 21 meros que comprendían la región de 11 aminoácidos fueron generados para CD79b humano (TAH05) y cyno CD79b (TAH040) , y las secuencias de SEQ ID NO: 26 (ARSEDRYRNPKGSACSRIWQS) y SEQ ID NO: 27 (AKSEDLYPNPKGSACSRIWQS) , respectivamente. Los anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) o anti-CD79b de macaco (TAHO40) fueron incubados primero con la porción ECD de la proteína CD79b humana (TAH05) o CD79b de macaco (TAHO40) (en una relación de anticuerpo :proteína de 1:3) o los péptidos humanos o cyno de 21 meros (en una relación de anticuerpo :proteína de 1:10) que cubrían la región que es diferente entre CD79b humano (TAH05) y CD79b de macaco (TAHO40) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la etapa de pre- incubación, los anticuerpos fueron añadidos a las células BJAB y se procedió con la tinción regular y etapas de FACS, con un anticuerpo IgGl-PE anti-ratón de rata (BD Bioscience, clon G18-145) usado como un anticuerpo secundario.
El péptido CD79b humano (TAH05) de 21 meros inhibió la unión de anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) , incluyendo BD3-1 (BDbioscience, San Diego, CA) SN8 (Biomeda, Foster City, CA o BDbioscience, San Diego, CA) , AT105 (Abcam, Cambridge, MA) y 2F2 (descritos arriba) ) y no inhibió la unión de anticuerpos anti-cyno CD79b (TAHO40) de control (3H3, 8D3, 9H11 o 10D10) ni anticuerpos anti-CD79a humanos (TAH04) (ZL7-4; Caltag o Serotec (Raleigh, NC) ) (Zhang, L. et al., Ther. I unol . , 2:191-202 (1997)). Los péptidos cyno CD79b (TAHO40) de 20 meros inhibieron la unión de anticuerpos anti-cyno CD79b (TAHO40) , incluyendo 3H3, 8D3 , 9H11 y 10D10 (descritos arriba) y no inhibieron la unión de anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) de control (CB3-1, SN8 , AT105, 2F2) ni anticuerpos anti-CD79a humanos (TAH04) (ZL7-4) . Como un control, la ECD de CD79b humano (TAH05) inhibió la unión de anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) , incluyendo CB3-1 (BDbioscience, San Diego, CA) SN8 (Biomeda, Foster City, CA o BDbioscience, San Diego, CA) , AT105 (Abcam, Cambridge, MA) y 2F2 (descritos arriba) ) y no inhibió la unión de anticuerpos anti-CD79a humanos (TAH04) de control (ZL7-4; Caltag o Serotec (Raleigh, NC) ) (Zhang, L . et al., Ther. Immunol., 2 :191-202 (1997) ) .
Para determinar más la unión a epítopes de los anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) , tres péptidos de 11 meros del péptido CD79b humano de 11 meros (N-terminal-ARSEDRYRNPK-C-terminal) (SEQ ID NO: 16) fueron generados como mutaciones de un solo aminoácido de los tres residuos Arg en el péptido CD79b humano mutado a los aminoácidos en las mismas posiciones respectivas en el péptido cyno CD79,y designadas en la presente como mutaciones de péptido 1-3. La mutación de péptido 1 (N-terminal - AKSEDRYR PK- C-terminal; SEQ ID NO: 18) incluyó una mutación del residuo Arg en la posición 2 de SEQ ID NO: 16. La mutación de péptido 2 (N-terminal -ARSEDLYRNPK-C-terminal; SEQ ID NO: 19) incluyó una mutación del residuo Arg en la posición 6 de SEQ ID NO: 16. La mutación de péptido 3 (N-terminal -ARSEDRYPNPK- C-terminal; SEQ ID NO: 20) incluyó una mutación del residuo Arg en la posición 8 de SEQ ID NO: 16. Los ensayos de competencia se llevaron a cabo como se describió arriba. Los ensayos de competencia demostraron además que los tres residuos Arg (en la posición 2, 6 y 8 en SEQ ID NO: 16) en el péptido CD79b humano de 11 meros fueron críticos para la unión de anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) , pero sólo el residuo Arg medio (en la posición 6 en SEQ ID NO: 16) en el péptido CD79b humano de 11 meros fue crítica para la unión de la unión del anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (2F2) .
Para determinar más la unión a epítopes de los anticuerpos anti-cyno CD79b (TAHO40) , un péptido de 11 meros del péptido CD79b cyno de 11 meros (N-terminal -AKSEDLYPNPK- C- terminal; SEQ ID NO: 17) fue generado con una sola mutación de aminoácido del residuo Leu en el péptido cyno CD79b y designada como "mutación de péptido 4" . La mutación de péptido 4 (N-terminal -AKSEDRYPNPK- C-terminal; SEQ ID NO: 25) incluyó un residuo Arg en lugar de el residuo de Leu en la posición 6 de SEQ ID NO: 17. Los ensayos de competencia se llevaron a cabo como se describió arriba. Los ensayos de competencia demostraron además que el residuo Leu (en la posición 6 en SEQ ID NO: 17) en el péptido cyno CD79b de 11 meros fue crítico para la unión del anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) .
El análisis de Kd Scatchard en células BJAB-cyno CD79b (una línea de células BJAB que expresaba CD79b cyno (TAHO40) descrito en el ejemplo 11) para anticuerpos CD9b anti-humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) mostraron valores kD similares. anti-CD79b humano (SN8) se unió a las células con una kD de 0.5 nM en tanto que cyno CD79b (10D10) se unió a las células con una Kd de 1.0 nM . Anti-cyno CD79b (3H3) se unió a las células con una Kd de 2.0 nM. Anti-cyno CD79b (8D3) se unió a las células con una Kd de 2.5 nM. Anti-cyno CD79b (9H11) se unió a las células con una Kd de 2.6 nM .
Generación de conjugados anticuerpo- fármaco (ADCs) con anticuerpos contra CD79a humano (TAH04) , CD79b humano (TAH05) y cyno CD79b (TAHO40) Los fármacos usados para la generación de conjugados anticuerpo-fármaco (ADCs) para anti-CD79b humano (TAH04) , anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) incluyeron derivados maitansinoide DM1 y dolastatina 10 monometilauristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF) . (US 2005/0276812; US 2005/0238649; Doronina et al . , Bioconjug. C em. , 17:114-123 (2006); Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003); Erickson et al., Cáncer Res., 66:4426-4433 (2006), todos los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad) . MMAF, a diferencia de MMAE y DM1, es relativamente impermeable en membrana a pH neutro, por lo que tiene una actividad relativamente baja como un fármaco libre, aunque es muy potente una vez dentro de la célula. (Doronina et al., Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006)), DM1, MMAE y MMAF son inhibidores mitóticos que son al menos 100 veces más citotóxicos que los inhibidores mitóticos vinca alcaloides usados en tratamientos quimioterapéuticos de Hls (Doronina et al., Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006);; Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21:778-784 (2003); Erickson et al., Cáncer Res., 66:4426-4433 (2006)). Los enlazadores usados para la generación de los ADCs fueron SPP o SMCC para DM1 y MC o MC-vc-PAB para MMAE y MMAF. Para DM1, los anticuerpos son enlazados a grupo tio de DM1 y a través del grupo e-amina de lisina usando el reactivo enlazador SMCDF. Como alternativa, para DM1, los anticuerpos fueron enlazados a DM1 a través del grupo e-aminao de lisina usando el enlazador SPP. SPP (4 - (2 ' -piridilditio) pentanoato de N-succinimidilo) reacciona con el grupo amino épsilon de lisinas para dejar un enlazador de disulfuro 2-piridilo reactivo en la proteína. Con enlazadores SPP, después de la reacción con un sulfhidrilo libre (por ejemplo, DM1) , el grupo piridilo es desplazado, dejando al DM1 fijado por medio de un enlace de disulfuro reducible. DM1 fijado por medio de un enlazador SPP se vuelve a liberar bajo condiciones reductoras (es decir, por ejemplo, dentro de células) mientras que DM1 unido por medio del enlazador SMCC es resistente al corte en condiciones reductoras. Además, los ADCs SMCC-DM1 inducen toxicidad celular si el ADC es internalizado y dirigido al lisosoma causando la liberación de lisina-IS -DMl , el cual es un agente anti-mitótico efectivo dentro de la célula, y cuando es liberado de la célula, lisina-l^-DMl no es tóxico (Erickson et al., Cáncer. .Res. 66:4426-4433 (2006)). Para MMAE y MMAF, los anticuerpos fueron enlazados a MMAE o MMAF a través de la cisteína por medio de maleeimidocaproilo-valina-citrulina (ve) -p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB) . Para MMAF, los anticuerpos fueron enlazados alternativamente a MMAF a través de la cisteína mediante un enlazador de maleeimidocaproilo (MC) . El enlazador MC-vc-PAB puede ser cortado por proteasas intercelulares tales como catepsina B y cuando sea cortado, libera fármaco libre (Doronina et al., Nat. Biotechnol . , 21:778-784 (2003)) mientras que el enlazador MC puede ser resistente al corte por proteasas intracelulares .
Los conjugados anticuerpo- fármaco (ADCs) para anti-CD79a humano (TAH04) , anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) , usando SMCC y DM1, fueron generados de manera similar al procedimiento descrito en US 2005/0276812. Los anticuerpos purificados anti-CD79a humano (TAH04) , anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) fueron intercambiados en regulador de pH por una solución que contenía 50 mM de fosfato de potasio y 2 mM de EDTA, pH 7.0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) fue disuelto en dimetilacetamida (DMA) y añadido a la solución de anticuerpos para hacer una relación molar SMCC/Ab final de 10:1. La reacción se dejó proceder durante tres horas a temperatura ambiente con mezclado. El anticuerpo modificado con SMCC fue purificado subsecuentemente en una columna de desalación GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada en 35 mM de citrato de sodio con 150 mM de NaCl y 2 mM de EDTA, pH 6.0. DM1, disuelto en DMA, se añadió a la preparación de anticuerpos SMCC para dar una relación molar de DM1 a anticuerpo de 10:1. La reacción se dejó proceder durante 4-20 horas a temperatura ambiente con mezclado. La solución de anticuerpo modificado con DM1 fue diafiltrada con 20 volúmenes de PBS para remover DM1 no reaccionado, se filtró estéril y se almaceno a 4°C. Típicamente, un rendimiento de anticuerpo de 40-60% se logró a través de este proceso. La preparación fue normalmente >95% monomérica según se evalúa por filtración en gel y dispersión de luz láser. Ya que DM1 tiene una absorción máxima a 252 nm, la cantidad de fármaco unida al anticuerpo puede determinarse mediante mediciones de absorción diferencial a 252 y 280 nm. Típicamente, la relación fármaco a anticuerpo fue de 3 a 4.
Los conjugados anticuerpo- fármaco (ADCs) para anti-CD79a humano (TAH04), anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) , usando enlazadores SPP-DM1 fueron generados de manera similar al procedimiento descrito en US 2005/0276812. Anticuerpos purificados anti-CD79a humano (TAH04), anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) fueron intercambiados en regulador de pH por una solución que contenía 50 mM de fosfato de potasio y 2 mM de EDTA, pH 7.0 de SPP (Imunogen) fue disuelto en DMA y se añadió a la solución de anticuerpos para hacer una relación molar SPP/Ab final de aproximadamente 10:1, la relación exacta dependiendo de la carga de fármaco deseada del anticuerpo. Una relación 10:1 normalmente dará como resultado una relación fármaco anticuerpo de aproximadamente 3-4. El SPP se dejó reaccionar durante 3-4 horas a temperatura ambiente con mezclado. El anticuerpo modificado con SPP fue purificado subsecuentemente en una columna de desalación GE Healthcare HiTrap (G-25) equilibrada en 35 mM de citrato de sodio con 150 mM de NaCl y 2 mM de EDTA, pH 6.0 o solución salina de pH regulada con fosfato, pH 7.4. DM1 fue disuelto en DMA y se añadió a la preparación de anticuerpo SPP para dar una relación molar de DM1 a anticuerpo de 10:1, lo cual se traduce en un exceso molar de 3-4 veces sobre los enlazadores SPP disponibles en el anticuerpo. La reacción con DM1 se dejó proceder durante 4-20 horas a temperatura ambiente con mezclado. La solución de anticuerpo modificado con DM1 se diafiltró con 20 volúmenes de PBS para remover DM1 no reaccionado, se filtró estéril y se almacenó a 4°C. Típicamente, rendimientos de anticuerpo de 40-60% o más se lograron con este proceso. El conjugado anticuerpo- fármaco normalmente fue >95% monomérico según se evalúa mediante filtración en gel y dispersión de luz láser. La cantidad de fármaco unido se determina por mediciones de absorción diferencial a 252 y 280 nm como se describe para la preparación de conjugados SMCC-DMl (descrita arriba) .
Conjugados de anticuerpo- fármaco (ADC) para anti-CD79a humano (TAH04), anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) usando enlazadores de fármaco MC-MMAF, MC-MMAE, MC-val-cit (ve) -PAB-MMAE o MC-val-cit (ve) -PAB-MMAF se generaron de manera similar al procedimiento descrito en US 2005/0238649. Anticuerpos anti-CD79a humano (TAH04), anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) purificados fueron disueltos en 500 mM de borato de sodio y 500 m de cloruro de sodio a pH 8.0 y tratados además con un exceso de 100 MM de ditiotreitol (DTT) . Después de la incubación a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, se cambió el regulador de pH por elución sobre resinas Sephadex G25 y fue eluido con PBS con 1 mM de DTPA. El valor tiol/Ab fue verificado al determinar la concentración de anticuerpos reducida partir de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS fue enfriado en hielo. El enlazador de fármaco por ejemplo, MC-val-cit (ve) -PAB-MMAE en DMSO, fue disuelto en acetonitrilo y agua, y añadido al anticuerpo reducido y enfriado en PBS . Después de una hora de incubación, se añadió un exceso de maleimida para enfriar rápidamente la reacción y tapar cualquier grupo tiol de anticuerpo no reaccionado. La mezcla de reacción se concentró mediante ultracentrifugación centrífuga y el conjugado anticuerpo- fármaco se purificó y se desaló mediante elución a través de una resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0.2 m bajo condiciones estériles y se congeló para almacenamiento.
Ejemplo 10 Purificación de polipéptidos TAHO usando anticuerpos específicos Polipéptidos TAHO nativos o recombinantes pueden ser purificados mediante una variedad de técnicas estándares en la técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, polipéptido pro-TAHO, polipéptido TAHO maduro o polipéptido pre-TAHO se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido TAHO de interés. En general, la columna de inmunoafinidad es construida al acoplar covalentemente el anticuerpo de polipéptido anti-TAHO a una resina cromatográfica activada.
Se prepararon inmunoglobulinas policlonales a partir de sueros inmunes ya sea por precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Asimismo, se prepararon anticuerpos monoclonales a partir de fluido de ascites de ratón o mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo es acoplado a la resina, la resina es bloqueada y la resina derivada es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Esta columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptidos TAHO al preparar una fracción de células que contiene polipéptido TAHO en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula entera o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o por medio de otros métodos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, un polipéptido TAHO soluble que contiene una secuencia de señal se puede secretar en cantidad útil en el medio en el cual las células sean cultivadas.
Una preparación que contiene polipéptido TAHO soluble es pasada sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permitan la absorbancia preferencial de polipéptido TAHO (es decir, reguladores de pH de alta fuerza iónica en presencia de detergente) . Después, la columna es eluida bajo condiciones que rompan la unión anticuerpo-polipéptido/TAHO (por ejemplo, un regulador de bajo pH tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caotropo tal como urea o ión de tiocianato) , y el polipéptido TAHO se recoge.
Ejemplo 11 Ensayo de eliminación de células tumorales in vi tro Células de mamífero que expresan el polipéptido TAHO de interés pueden obtenerse usando técnicas estándares de clonación y de vectores de expresión. Como alternativa, muchas líneas de células tumorales que expresan polipéptidos TAHO de interés están disponibles públicamente, por ejemplo, a través de la ATCC y pueden identificarse rutinariamente usando análisis ELISA o FACS estándares. Anticuerpos monoclonales polipéptidos anti-TAHO (disponibles comercialmente y derivados conjugados a toxinas de los mismos) pueden entonces emplearse en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para eliminar células que expresan polipéptido TAHO in vi ro.
Por ejemplo, células que expresan el polipéptido TAHO de interés fueron obtenidas como se describió arriba y colocadas en cajas de 96 pocilios. En un análisis, el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) fue incluido a lo largo de la incubación de células durante un periodo de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células fueron incubadas durante 1 hora con el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y luego lavadas e incubadas en ausencia de conjugado anticuerpo/toxina durante un periodo de 4 días. La viabilidad celular se midió después usando CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay de Promega (Cat# G7571) . Las células no tratadas sirvieron como un control negativo.
Para el análisis de anticuerpos anti-CD79a humano (TAH04) , anti-CD79b humano (TAH05) , líneas de células (ARH-77, BJAB, Daudi, DOHH-2, Su-DHL-4, Raj i y Ramos) fueron preparadas a 5000 células/pocilio en placas tratadas para cultivo de tejidos de 96 pocilios de fondo redondo y estériles (Cellstar 650 185) . Las células fueron cultivadas en medio de ensayo (RPMI 1460, 1% de L-glutamina, 10% de suero bovino fetal (FBS ; de Hyclone) y 10 mM de HEPES) . Las células fueron inmediatamente puestas en una incubadora a 37 °C durante la noche.
Para el análisis de anticuerpos anti-cyno CD79b (TAHO40) , cyno CD79b (TAHO40) , una línea de células BJAB transgénica (en la presente referida como "BJAB-cyno CD79b" o "BJAB . cynoCD79b" o "BJAB cynoCD79b") fue generada. Una línea de células BJAB (línea de células de linfoma de Burkitt que contiene la translocación t(2;8) (pll2;q24) (IGK-MYC) , un gen p53 mutado y que es negativa para virus Epstein-Barr (EBV) ) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001) fue transfectada con un vector de expresión que contenía cyno CD79b (TAHO40) (referida en la presente como "pRK. C F . PD . cynoCD79b" ) mediante protocolo de nucleofección AMAXA normal (Solución T, Programa T-16) (AMAXA Inc., Gaithersburg, MD) . Para pRK.CMF.PD.cynoCD79b, se clonó CD79b de macaco (TAHO40) . Para la clonación de CD79a de macaco (TAH039) y CD79b (TAHO40) , las secuencias de ADN de ratón y humano para cyno CD79a (TAH039) y cyno CD79b (TAHO40) fueron alineadas. Los cebadores para secuencias conservadas que flanquearon el marco de lectura abierta se generaron como sigue: cebador hacia adelante de cynoCD79a (TAH039) : 5'-TCAAACTAACCAACCCACTGGGAG-3 ' (SEQ ID NO : 21) cebador hacia atrás de cynoCD79a (TAH039) : 5'-CAGCGATTAAGGGCTCATTACCC-3 ' (SEQ ID NO : 22) cebador hacia adelante de cynoCD79b (TAHO40) : 5'-TCGGGGACAGAGCAGTGACC-3 ' (SEQ ID NO: 23) cebador hacia atrás de cynoCD79b (TAHO40) : 5'-CAAGAGCTGGGGACCAGGGG-3 ' (SEQ ID NOS: 24) Usando los cebadores cyno CD79a (TAH039) y CD79b (TAHO40) , los genes para CD79a (TAH039) de macaco y CD79b (TAHO40) fueron amplificados a partir de una biblioteca de ADN de bazo de macaco. Los productos de PCR se clonaron en el vector TA (Invitrogen) y se secuenciaron . Los ORFs de CD79a de macaco y CD79b de macaco fueron subclonados en un vector de expresión excitado por el promotor de CMV y que contenía un gen de resistencia a puromicina) (en adelante referido como "pRK.CMV.PD") .
Después de la transfección de pRK.CMF.PD.cynoCD79b en las células BJAB y selección con puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) , las células que sobrevivieron fueron autoclonadas por FACAS para los que más expresaban el 5% con anticuerpos anti-cyno CD79b (3H3) . La línea de células BJAB de mejor expresión expresó cyno CD79b (TAHO40) y fue seleccionada por análisis FACS . Las células BJAB transfectadas que expresaban cyno CD79b (TAHO40) expresan también CD79a (TAH04) humana y CD79b (TAH05) humana. Como un control, células B BJAB no transfectadas que expresan CD79a (TAH04) humana y CD79b (TAH05) humana fueron usadas.
Conjugados anticuerpo-fármaco (usando anti-CD79a humano (TAH04) disponible comercialmente , tal como ZL7-4, y anti-CD79b humano (TAH05) , tal como SN8 , o anti-CD79a humano (TAH04) , anti-CD79b humano (TAH05) o anticuerpos anti-cyno CD79b (TAH040) descritos en el ejemplo 9) fueron diluidos a 2 x 10 ug/ml en medio de ensayo. Los conjugados fueron enlazados con entrelazadores SMCC o enlazador de disulfuro SPP a toxina maitansinoide DM1 (véase ejemplo 9 y solicitud de E.U.A. Nos. 11/141,344, presentada el 31 de mayo de 2005 y solicitud de E.U.A. No. 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004) . Además, los conjugados pueden ser enlazados con MC-valina-citrulina (ve) -PAB o MC a derivados de dolastatina 10, monometilauristatina E (MMAE) toxina o toxina de monometilauristatina F (MMAF) (véase ejemplo 9 solicitud de E.U.A. No. 11/141,344, presentada el 31 de mayo de 2005 y solicitud de E.U.A. No. 10/983,340, presentada el 5 de noviembre de 2004) . Los controles negativos incluyeron conjugados a base de HERCEPTIN^ (trastuzumab) (SMCC-DM1 o SPP-DM1 o MC-vc-MMAE o MC-vc-MMAF) . Los controles positivos incluyeron el L-DMl libre equivalente a la dosis de carga de conjugado. Las muestras se sometieron a vórtice para asegurar una mezcla homogénea antes de la dilución. Los conjugados anticuerpo-fármaco se diluyeron más en serie 1:3. Las líneas celulares fueron cargadas 50 µ? de cada muestra por hilera usando un sistema de automatización Rapidplate"5 96/384 Zymark. Cuando la placa completa fue cargada, las placas fueron preincubadas durante 3 días para permitir que las toxinas surtieran efecto. Las reacciones fueron detenidas al aplicar 100 µ?/pocillo de Cell Glo (Promega, Cat # G7671/2/3) a todos los pocilios durante 10 minutos. Los 100 µ? del pocilio detenido fueron transferidos a placas tratadas para cultivo de tejido blancas de 96 pocilios, fondo transparente (Costar 3610) y la luminiscencia se leyó y se reportó como unidades de luz relativas (RLU) . Los anticuerpos TAHO para este experimento incluyeron anticuerpos disponibles comercialmente , incluyendo anti-CD79a humano (TAH04) (ZL7-4) y anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) .
Sumario a. anti-CD79a humano (TAH04) El anticuerpo anti-CD79a humano (TAH04) (ZL7-4) conjugado a toxina DM1 (anti-CD79a humano (ZL7-4) -SMCC-DM1) mostró eliminación de células tumorales significativa cuando se comparó con anticuerpo anti-CD79a humano (TAH04) (ZL7-4) solo o control negativo anti-HER2 conjugado a toxina DM1 (anti-HER2-SMCC-DMl) en células RAMOS (datos no mostrados) . b-1. anti-CD79b humano (TAH05) Anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado a toxina DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1) mostró eliminación de células tumorales significativa cuando se comparó con el anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) solo o el control negativo anti-HER2 conjugado a toxina DM1 (anti-HER2-SMCC-DMl) en células RAMOS. b-2. anti-cyno CD79b (TAHO40) (1) DMI ADCs (a) células BJAB-cyno CD79b Anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) conjugado con DM1 (anti-cyno CD79b (10D10) -SMCC-DM1) mostró eliminación de tumor significativa en células BJAB-cyno CD79b. La eliminación se comparó con controles negativos, anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) solo, anticuerpo HERCEPTIN* (trastuzumab) conjugado con DM1 (HERCEPTIN® (trastuzumab) -SMCC-DM1) (control negativo) y ningún anticuerpo lo cual no mostró eliminación de células de tumor significativa en células BJAB-cyno CD79b. Como controles positivos, dímero DM-1 solo, y anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1) también se comparó y mostró eliminación dé células tumorales significativa en células BJAB-cyno CD79b.
Anti-cyno CD79b (10D10) -SMCC-DM1 con una IC50 de 0.33 nM mostró mayor eliminación de células BJAB-cyno CD79b que anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 con una IC50 de 1.2 nM o HERCEPTIN (trastuzumab) -SMCC-MD1 con una IC50 de 26 nM lo cual no mostró eliminación de tumor significativa en células BJAB-cyno CD79b. (b) Células BJAB Como un control, anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) conjugado con DM1 (anti-cyno CD79b (10D10) -SMCC-DM1) fue analizado en células BJAB (no transíectadas) y no mostró eliminación de tumor significativa en células BJAB. Controles negativos, anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) solo, anticuerpo HERCEPTIN® (trastuzumab) conjugado con DM1 (HERCEPTIN® (trastuzumab) -SMCC-DM1) y ningún anticuerpo, tampoco mostró ninguna eliminación de células tumorales significativa en células BJAB. Como controles positivos, dímero DM-1 solo, y anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1) también se comparó y mostró eliminación de células de tumor significativa en células BJAB.
Anti-cyno CD79b (10D10) -SMCC-DM1 con una IC50 de 10 nM y HERCEPTIN® (trastuzumab) -SMCC-DM1 con una IC50 de 30 nM no mostró eliminación significativa en células BJAB en tanto que anti-CD79b humano (SN8 ) -SMCC-DM1 con una IC50 de 0.4 nM mostró eliminación significativa de células BJAB. (2) MMAF ADCs (a) Células BJAB-cyno CD79b Anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) conjugado con MMAF (anti-cyno CD79b (10D10) -MC-MMAF) mostró eliminación de células de tumor significativa en células BJAB-cyno CD79b en comparación con controles negativos, anticuerpo anti-byno CD79b (TAHO40) (10D10) , anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) , anticuerpo HERCEPTIN® (trastuzumab) y HERCEPTIN® (trastuzumab) conjugado con MMAF (HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-MMAF) el cual no mostró eliminación de células de tumor significativa en células BJAB-cyno CD79b. Un control positivo, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con MMAF (anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF) se comparó también y mostró eliminación de células tumorales significativa en células BJAB-cyno CD79b.
Anti-cyno CD79b (10D10) -MC-MMAF con una IC50 de 0.07 nM mostró mayor eliminación de células BJAB-cyno CD79b que anti-CD79b humano (SN8 ) -MC-MMAF con una IC50 de 0.6 nM. (b) Células BJAB Como un control, anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10) conjugado con MMAF (anti-cyno CD79b ( 10D10) -MC-MMAF) se analizó en células BJAB y no mostró eliminación de células tumorales significativa en células BJAB. Controles negativos, anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (10D10, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) , anticuerpo HERCEPTIN0 (trastuzumab) y HERCEPTI 8 (trastuzumab) conjugado con MMAF (HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-MMAF) tampoco mostró una eliminación de células tumorales significativa en células BJAB. Un control humano, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con M AF (anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF) también se comparó y mostró eliminación de células tumorales significativa en células BJAB.
Anti-cyno CD79b ( 10D10 ) -MC-MMAF con una IC50 de 694 nM no mostró eliminación de células tumorales significativa en células BJAB en tanto que anti-CD79b humano (SN8 ) -MC-MMAF con una IC50 de 0.2 nM mostró eliminación de células tumorales significativa en células BJAB.
En vista de la capacidad de los anticuerpos anti-TAHO para mostrar eliminación de células tumorales significativa, las moléculas TAHO pueden ser excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados con células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas . Los anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAHO son útiles para reducir crecimiento de tumor in vi tro de tumores, incluyendo cánceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas. Específicamente, dadas las similitudes en epítope, afinidad y eficacia in vitro de los anticuerpos anti-cyno CD79b (TAHO40) con los anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) , anticuerpos anti-cyno CD79b (TAH040) pueden ser4 excelentes sustitutos en estudios de toxicología y estudios de eficacia en mono macaco para el anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) .
Ejemplo 12 Ensayo de eliminación de células tumorales in vivo 1. Xenoinjertos Para probar la eficacia de los anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAHO conjugados o no conjugados, el efecto de anticuerpo anti-TAHO en tumores en ratones fue analizado. Específicamente, la capacidad de los anticuerpos para regresar tumores en modelos de xenoinjerto múltiples, incluyendo células RAJI, células RAMOS, células BJAB (línea de células de linfoma de Burkitt que contienen la translocación t(2 8) (pll2 q24) (IGK-MYC) ; un gen p53 mutado y que son negativas para virus de Epstein-Barr (EBV) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), células Granta 519 (línea de células de linfoma de células de manto que contiene la translocación t ( 11 ; 14 ) (ql3 ,-q32 ) (BCL1-IGH) que se traduce en sobre-expresión de ciclina DI (BCL1) , contiene las supresiones P161NK4B y P16INK4A y son EBV positivas) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Factas Book, San Diego: Academic Press, 2001)), células U698M (línea de células de linfosarcoma B linfoblástico (Drexler, H.G. , The Leukemia-Lymphoma Cell Line Pactas Book, San Diego: Academic Press, 2001) y células DoHH2 (línea de células de linfoma folicular que contiene la característica de translocación de linfoma folicular t (14 ; 18) (q32 ;q21) que resulta en la sobre-expresión de Bcl-2 excitado por la cadena pesada de Ig, contiene la supresión P16INK4A, contiene la translocación t (8;14) (q24;q32) (IGH- YC) y son EBV negativas) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), fueron examinadas.
Para el análisis de la eficacia de anticuerpos anti-CD79a humanos o anti-CD79b humanos, ratones CB17 ICR SCID hembra (6-8 semanas de edad de Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) fueron inoculados subcutáneamente con 5 X 106 células RAJI , 5 X 106 células RAMOS, 2 X 107 células de BJAB-luciferasa, 2 X 107 células Granta 519, 5 X 106 células U698M o 2 X 107 células DoHH2. Los tumores de xenoinjerto se dejaron crecer hasta un promedio de 200 ram2. Día 0 se refiere al día en que los tumores tenían un promedio de 200 mm2 y cuando la primera o única dosis de tratamiento fue administrada, a menos que se indique específicamente abajo. El volumen del tumor se calculó con base en dos dimensiones, medidas usando calibres, y se expresó en mm3 de acuerdo con la fórmula: V=0.5aXb2, en donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. Los datos recolectados de cada grupo experimental fueron expresados como media ± SE . Los ratones fueron separados en grupos de 8-10 ratones con un volumen de tumor medio de entre 100-200 mm3, punto en el cual empezó el tratamiento intravenoso (i.v.). La dosificación de anticuerpo o ADC fue una dosis individual de entre 2-10 mg/kg de ratón que correspondía a una concentración de fármaco de entre 200-500 ug/m2 o varias dosis con cada dosis entre 3-10 mg/kg de ratón y una concentración de fármaco de entre 200-500 ug/m2 semanalmente durante dos o tres semanas. El anticuerpo fue ya sea un ADC o un anticuerpo no conjugado como un control . Los tumores se midieron ya sea una o dos veces a la semana a lo largo del experimento. Los ratones se sometieron a eutanasia antes de que los volúmenes de tumor alcanzaran 3,000 mm3 o cuando los tumores mostraran signos de ulceración incapacitante. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) .
Los enlazadores entre el anticuerpo y la txoina que se usaron fueron el enlazador de disulfuro SPP o el entreenlazador de tioéter SMCC para reactivo enlazador de dipéptidos DM1 o MC o MC-valina-citrulina (ve) -PAB o (valina-citrulina (ve) ) que tenía un componente de maleimida y un componente de auto- inmolación de para-aminobencilcarbamoilo (PAB) para monometilauristatina E (MMAE) o nomometilauristatina F (MMAF) . Las toxinas usadas fueron DM1, MMAE o MMAF. Los anticuerpos TAHO para este experimento incluyeron anticuerpos disponibles comercialmente , incluyendo anticuerpos disponibles comercialmente, anti-CD79a humano (TAH04) (ZAL7-4) y anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) , y anticuerpos descritos en el ejemplo 9 incluyendo anticuerpos anti-CD79b humano (TAH05) (2F2) y anti-CD79a humano (TAH04) (8H9, 5C3, 7H7, 8D11, 15E4 y 16C11) . Anti-cyno CD79b (TAHO40) (3H3, 8D3, 9H11 y 10D10) se describe en el ejemplo 9 y también pueden usarse.
Los controles negativos incluyeron pero no estuvieron limitados a conjugados a base de HERCEP IN* (trastuzumab) (SMCC-DM1 o SPP-DM1 o MC-MMAF o MC-vc-PAB-MMAF o MC-vc-PAB-MMAE) . Lo controles positivos incluyeron pero no estuvieron limitados a L-DM1 libre equivalente a la dosis de carga de conjugado.
Sumario (1) anti-CD79a humano (TAH04) (a) Xenoinjertos Ramos En un curso de tiempo de 18 días, anticuerpo anti-CD79a humano (TAH04) conjugado con DM1 (CD79a-SMCC-DMl anti-humano) mostró la inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores RAMOS en comparación con control negativo, anti-herceptina-SMCC-DMl . ADC se administró como una sola dosis el día 0. (b) Xenoinjertos BJAB En un curso de tiempo de 18 días, anticuerpo anti-CD79a (TAH04) , incluyendo los anticuerpos 5C3 , 7H7, 8D11, 15E4 y 16C11, conjugado con DM1 (anti-CD79a humano (5C3, 7H7, 8D11, 15E4 o 16C11) -SMCC-DMl) con una sola dosis (como se indica en la tabla 8) administrado el día 0 mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores de BJAB-luciferasa en comparación con el control negativo, HERCEPTIN* (trastuzumab) -SMCC-DMl . ADCs fueron administrados en una sola dosis (como se indica en la tabla 11) el día 0 para todos los ADC y controles. Específicamente, el anti-CD79a humano (5C3, 7H7, 8D11, 15E4 o 16C11) -SMCC-DMl y anti-CD79b humano (2F2 o SN8) -SMCC-DMl inhibieron significativamente la duplicación de tumor (datos no mostrados) . Además, en la tabla 8, el número de ratones del número total probado que mostraba PR=Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier tiempo después de la administración cayó a menos de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) son indicados.
Tabla 11 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco anti-CD79a humano (5C3)-SMCC-DM1 2/9 2/9 7.03 192 HERCEPTIN® (trastuzumab)-SMCC-DMI 0/9 0/9 4.07 192 anti-CD79b humano (2F2)-SMCC-DM1 3/9 3/9 4.07 192 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-CM1 3/9 5/9 2.96 192 (c) Xenoinjertos BJAB En un curso de tiempo de 14 días, anticuerpo anti-CD79a humano (TAH04), incluyendo anticuerpos 8H9, y anticuerpo anti-CD79b humano (SN8) , conjugado con DM1 (anti-CD79a humano (8H) -SMCC-DM1 y anti-CD79b humano (SN8 ) -SMCC-DM1, respectivamente) con una sola dosis (como se indica en la tabla 12), mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores de BJAB- luciferasa en comparación con control negativo, PBS, anti-glicoproteína-120 (mencionado en la presente como "gpl20"), anti-CD79b humano (SN8) , anti-CD79a humano (8H9) y anti-gpl20 conjugado con DM1 (anti-gpl20-SMCC-DMl) . Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 9) el día 0 para todos los ADCs y controles. Específicamente, el anti-CD79a humano ( 8H9 ) -SMCC-DM1 y anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 inhibieron significativamente duplicación del tumor (datos no mostrados) . Además en la tabla 9 se muestra el número total de los ratones de el número total probado que mostrada PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a menos de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 12 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79a humano (8H)-SMCC-DM1 3/8 2/8 4.0 200 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 2/8 5/8 3.1 200 PBS 0/8 0/8 NA NA anti-gp120 0/8 0/8 3.2 NA anti-CD79b humano (SN8) 0/8 0/8 3.1 NA anti-CD79a humano (8H9) 0/8 0/8 4.0 ant¡-gp120-SMCC-DM1 0/8 0/8 3.2 200 (2A) anti-CD79b humano (TAH05) Anti-CD79b humano (TAH05) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano SMCC-DM1) mostró regresión parcial (PI) o remisión completa (CR) en xenoinjertos RAMOS con una sola dosis del conjugado del fármaco. Además, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) conjugado con DM1 o MMAF (anti-CD79b humano-SMCC-DM1 o anti-CD79b humano-MC-MMAF) mostró regresión parcial (PI) o remisión completa (CR) en xenoinjertos BJAB, Granta 519 y DoHH2 con una sola dosis del conjugado de fármaco. (a) Xenoinjertos Ramos En un curso de tiempo de 18 días, anticuerpo CD79 anti-humano (TAH05) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano-SMCC-DM1) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores RAMOS en comparación con control negativo, anti-herceptin-SMCC-DM1. ADC se administró como una sola dosis el día 0. (b) Xenoinjertos BJAB.
En un curso de tiempo de 14 días, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano-SMCC-DM1) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores de BJAB- lucíferasa en comparación con control negativo, anti-herceptin-SMCC-DMl o anticuerpo anti-herceptin. El nivel de inhibición por anticuerpos anti-CD79b humano-SMCC-DM1 fue similar al nivel de inhibición por los anticuerpos anti-CD20. Específicamente el día 15, uno de los 10 ratones tratados con anti-CD79b humano-SMCC-DM1 mostró regresión parcial de tumores y 9 de los 10 ratones tratados con anti-CD79b humano-SMCC-DM1 mostró regresión completa de tumores. El día 15, 10 de los 10 ratones tratados con anti-herceptin-SMCC-DMl, anticuerpo anti-herceptin mostraron incidencia de tumor. El día 15, 5 de los 10 ratones tratados con anticuerpos anti-CD20 mostraron regresión parcial de tumores. ADCs fueron administrados en varias dosis (con cada dosis de la concentración indicada en la tabla 13) el día 0 y día 5 para todos los ADCs y controles. Un tratamiento adicional de anti-CD79b humano-SMCC-DM1 se administró el día 14. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 y anti-CD20 inhibieron significativamente duplicación del tumor (datos no mostrados) . Además, en la tabla 13, el número de ratones del número total de pruebas que mostraron PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) son indicados.
Tabla 13 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-D 1 1/10 9/10 5.26 236 Controles: HERCEPTIN 9 (trastuzumab)-SMCC-DMI 0/10 0/10 5 236 HERCEPTINC ¾ (trastuzumab) 0/10 0/10 10 NA Anti-CD20 5/10 0/10 10 NA (c) Xenoinjertos BJAB (MMAE, MMAF, DM1) En un curso de tiempo de 80 días , anticuerpo anti-C humano (TAH05) (SN8) conjugado con MMAF (anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF o anti-CD79b humano (SN8 ) -MC-vc-PAB-MMAF) , DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1) o con MMAE (anti-CD79b humano (SN8) -MC-vc-PAB-MMAE) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores BJAB-luciferasa (linfoma de Burkitt) en comparación con control negativo, HERCEPTIN0 (trastuzumab) conjugado a MMAE o MMAF HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-MMAF) , HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-vc-PAB-MAE y HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-vc-PAB-MMAF) . ADCs fueron administrados en una sola dosis (como se indica en la tabla 14) en el día 0 para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF, anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-D 1 y anti-CD79b (SN8) -MC-vc-PAB- MAF inhibieron significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados) . El control HERCEPTIN* (trastuzumab) ADC y anti-CD79b humano (SN8) ADC conjugado con MC-vc-PAB-MMAE (HERCEPTIN® (trastuzumab) -MC-vc-PAB-MMAE y anti-CD79b humano (SN8) -MC-vc-PAB-MMAE) inhibieron significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados) . Además, en la tabla 11, indica el número de ratones del número total probado que mostraba PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo del 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen. de tumor después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 14 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 ant¡-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 0/8 8/8 4.16 322 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 0/8 8/8 5 324 anti-CD79b humano (SN8)-MC-vc-PAB-MMAE 0/8 8/8 3.94 317 anti-CD79b humano (SN8)-MC-vc-PAB- MAF 5/8 0/8 3.86 322 Controles: HERCEPTIN® (trastuzumab)-MC-MMAF 0/8 0/8 4.59 322 HERCEPTIN® (trastuzumab)-MC-vc-PAB-MMAE 2/8 5/8 4.17 317 HERCEPTIN® (trastuzumab)-MM-vc-PAB-MMAF 0/8 0/8 3.73 322 (d) Xenoinjertos BJAB Además, en un curso de tiempo de 30 días, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con MMAF (anti-CD79b humano (SN8) MC-MMAF) o DM1 (anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores BJAB- luciferasa (linfoma de Burkitt) en comparación con anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) de control negativo (SN8) , anti-gpl20 solo, anti-gpl20 conjugado con MMAF (anti-gpl20-MC-MMAF) o anti-gpl20 conjugado con DM1 (anti-gpl20-SMCC-DMl) . Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 15) el día 0 para todos los ADCs de controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8 ) -MC-MMAF y anti-CD79b humano (SN8 ) -SMCC-DMl inhibieron significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados) a ambas concentraciones 50 ug/m2 y 150 ug/m2. Además, en la tabla 12, se indica el número de ratones del número total probado que mostraron PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier tiempo después de la administración cayó debajo del 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 15 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 0/8 8/8 3.4 150 anti-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 1/8 2/8 1.1 50 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 0/8 8/8 3.1 150 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 0/8 0/8 1 50 Controles: anti-gp120 0/8 0/8 3.4 NA anti-gp120-SMCC-DM1 0/8 0/8 2.6 150 anti-gp120-SMCC-DM1 0/8 0/8 3.3 150 ant¡-CD79b humano (SN8) 0/8 0/8 3.4 NA (e) Xenoinjertos BJAB Además, en un curso de tiempo de 20 días, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con MMAF (SN8-MC-MMAF) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores de BJAB-luciferasa (linfoma de Burkitt) en comparación con control negativo, anti-gpl20 conjugado con MMAF (anti-gpl20-MC-MMAF, anti-gpl20-MC-vc-PAB-MMAF) o MMAE (anti-gpl20-MC-MMAE) . El control positivo, anti-CD22, conjugado con MMAE o MMAF también fue comparado. Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 16) el día O para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF y anti-CD79b humano (SN8) -MC-vc-PAB-MMAF y controles positivos descritos arriba inhibieron significativamente la duplicación de tumor (datos no mostrados) . Tanto el anti-gp-120-ADC como el anti-CD79b humano (SN8) ADC de control con MC-vc-PAB-MMAE (anti-gp-120-MC-vc-PAB-MMAE y anti-CD79b humano (SN8) -MC-vc-PAB-MMAE) inhibieron significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados). Además, en la tabla 13, se indica el número de ratones del número total probado que mostraba PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (cuando el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 16 Tratamiento PR CR Ab ma/ka Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 4/9 2/9 2.6 200 anti-CD79b humano (SN8)-MC-vc-PAB- MAF 0/9 0/9 2.4 200 anti-CD79b humano (SN8)-MC-vc-PAB-MMAE 0/9 9/9 2.5 200 Controles: anti-gp120-MC- MAF 0/9 0/9 5.9 405 anti-gp120-MC-vc-PAB-MMAF 0/9 0/9 5.8 406 anti-gp120-MC-vc-PAB-MMAE 0/9 9/9 6 405 anti-CD22- C-MMAF 4/9 4/9 6.9 405 anti-CD22-MC-vc-PAB-MMAF 4/9 2/9 6.6 405 anti-CD22- C-vc-PAB-MMAE 0/9 9/9 6.3 405 (f) Xenoinjertos Granta En un curso de tiempo de 21 días, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05 ) (SN8) conjugado con MMAF (SN8-MC-MMAF) o DM-1 (SN8-SMCC-DM1) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores Granta-519 (linfoma de células de manto) en comparación con anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) de control negativo, anti-gpl20 o anti-gpl220 conjugado con MMAF o DM1 (anti-gpl20-MC-MMAF o anti-gpl20-SMCC-DM1) . Un control positivo, anticuerpo anti-CD22 (10F4v3) conjugado con MMAF ( 10F4v3 -MC-MMAF) también fue comparado. Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 17) el día 0 para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8 ) -SMCC-DM1 y anti-CD79b humano (SN8) -MC-MMAF y controles positivos descritos arriba inhibieron significativamente la duplicación de tumor a ambas concentraciones de fármaco de 100 ug/m2 y 300 g/m2 (datos no mostrados) . Además, en la tabla 14, se indica el número de ratones del número total probado que muestra PR = Regresión Parcial (cuando el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo del 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (cuando el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 17 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 1/8 1/8 2.1 100 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 2/8 6/8 6.2 300 anti-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 1/8 0/8 2.3 100 ant¡-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 6/8 0/8 6.8 300 Controles: anti-gp120-MC-SMCC-D 1 0/8 0/8 5.2 300 anti-gp120-MC-MMAF 0/8 0/8 6.6 300 anti-gp120 0/8 0/8 6.8 NA ant¡-CD79b humano (SN8) 0/8 0/8 6.8 NA ant¡-CD22 (10F4v3)-MC-MMAF 2/8 0/8 6.8 300 (g) Xenoinjertos DoHH2 En un curso de tiempo de 21 días, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con AF o DM1 (SN8 -MC-MMAF o SN8-MC-DM1) , o anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) mostraron inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores DoHH2 (linfoma folicular) en comparación con control negativo, anti-gpl20 o anti-gpl220 conjugado con MMAF o DM1 (anti-gpl20-MC-MMAF o anti-gpl20-SMCC-DMl) . Control positivo, anti-CD22 (10F4v3) conjugado a MMAF (anti-CD22 (10F4v3-MC- MAF) también fue comparado. Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 18) el día 0 para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DMI, anti-CD79b humano (SN8) -MC-M AF inhibieron significativamente la duplicación de tumor a ambas concentraciones de fármaco de 100 g/m2 y 300 pg/m2 (datos no mostrados) . Además, en la tabla 15, se indica el número de ratones del número total probado que muestra PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo de 50% del volumen de tumor medio el día 0) o CR = Remisión Completa (cuando el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 18 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco ua/m2 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 2/8 0/8 2.1 100 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-D 1 0/8 8/8 6.2 300 anti-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 0/8 0/8 2.3 100 ant¡-CD79b humano (SN8)-MC-MMAF 1/8 6/8 6.8 300 anti-CD79b humano (SN8 ) 0/8 1/8 6.8 NA Controles: anti-gp120-MC-SMCC-DM1 0/8 0/8 5.2 300 anti-gp120-MC-MMAF 0/8 0/8 6.6 300 (h) Xenoinjertos U698M En un curso de tiempo de 21 días, anticuero anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado con DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SPP-DM1) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores U698M (células B de linfosarcoma linfoblástico) en comparación con control negativo, HERCEPTIN® (trastuzumab) conjugado con DM1 (HERCEPTIN* (trastuzumab) -SPP-DM1) . Se administraron ADCs en dosis múltiples (como se indica en la tabla 19) el día 2, día 8 y día 15 para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8) -SPP-DM1 inhibió significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados) . Además, en la tabla 16 se indica el número de ratones del número total probado que mostró PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 19 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-SPP-DM1 0/10 10/10 4.59 242.72 Controles: HERCEPTIN® (trastuzumab)-SPP-DMI 074 0/4 5.9 239.86 (2B) Anti-cyno CD79b (TAHO40) Para probar la eficacia de anticuerpos monoclonales anti-cyno CD79b (TAHO40) conjugados o no conjugados, de puede analizar el efecto de anticuerpo anti-TAHO en tumores de ratones como se describió arriba. Específicamente, la capacidad de los anticuerpos para regresar tumores en varios modelos de xenoinjerto, incluyendo células RAJI, células BJAB (línea de células de linfoma de Burkitt que contienen la translocación t (2 ; 8 ) (pll2 ; q24 ) (IGF-MYC), un gen p53 mutado y que son negativas a virus de Epstein-Barr (EBV) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001) ) , células Granta 519 (línea de células de linfoma de células de manto que contiene la translocación t (11; 14) (ql3 ;q32) (BCL1-IGH) que se traduce en la sobre-expresión de ciclina DI (BCL1) , contiene supresiones P16INK4B y P16INK4A y son positivas para EBV) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)) y células DoHH2 (línea de células de linfoma folicular que contiene la característica de translocación de linfoma folicular t(14;18) (q32;q21) que se traduce en la sobre-expresión de Bcl-2 impulsada por la cadena pesada de Ig, contiene la supresión P16INK4A, contiene la translocación t (8; 14) (q24 ;q32) (IGH-MYC) y son EBV negativas) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego, Academic Press, 2001)), pueden ser examinadas. 2. Xenoinjertos diseminados Para probar más la eficacia de anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAHO conjugados o no conjugados, se analizó el efecto de anticuerpo anti-TAHO en tumores diseminados en ratones.
Células BJAB que expresaban establemente luciferasa fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones SCID. Se usó formación de imágenes por bioluminiscencia para monitorear la progresión del tumor. El día 10, después de la inyección de células, los ratones fueron agrupados con base en la señal de luminiscencia y tratados con ADC. Los ratones fueron tratados dos veces (el día 7 y día 14 después de la inyección) ya sea con control de ADC HERCEPTIN* (trastuzumab) -SMCC-DM1 (7 ratones) o con anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) conjugado a DM1 (anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1) (8 ratones) a una dosis de anticuerpo de 5 mg/kg.
Los ratones del grupo de control fueron sometidos a eutanasia como sigue: 2 de los 7 ratones el día 21 y los 5 ratones restantes el día 5, debido a parálisis de las patas traseras. 1 De los 8 ratones que fueron tratados con anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 mostró signos de tumor cuando se formaron imágenes el día 70 y se sometió a eutanasia el día 81, pero 7 de los 8 ratones tratados con anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 estaban saludables y no mostraban signos de tumor para el día 152. De esta manera, dos dosis de anti-CD79b humano (SN8) -SMCC-DM1 a una dosis de anticuerpo de 5 mg/kg eliminaron tumores BJAB diseminados en 87% de los animales probados. 3. Internalización del receptor de células B Para determinar el efecto de tratamiento de tumores con ADCs, la expresión superficial del receptor de células B fue analizada en xenoinjertos BJAB de tumor.
Para el análisis de la expresión superficial del receptor de células B, se inició un estudio de xenoinjerto BJAB con curso de tiempo de 13 días como se describió arriba, con las siguientes diferencias. Los tumores BJAB se dejaron crecer hasta 500 mm2 en el tiempo 0, se trataron en una sola dosis (como se indica en la tabla 19) con anti-CD79b humano (TAH05) (SN8 o 2F2) conjugado a DM1 (anti-CD79b humano-SMCC-DM1) o anticuerpos de control, anti-CD79b humano (TAH05) solo (SN8 o 2F2) o anti-gpl20 o anti-gpl20 conjugado con DM1 (anti-gpl20-SMCC-DMl) . Dos días después de tratamiento con anticuerpos, dos de los tumores fueron removidos para cada grupo de tratamiento y la expresión superficial del receptor de células B se examinó par citometría de flujo.
Los tumores restantes no seleccionados para análisis de citometría de flujo fueron seguidos durante el resto del curso de tiempo de 13 días. Anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8 o 2F2) conjugado con DM1 (SN8-SCC-DM1 o 2F2- S CC-DMl) mostró inhibición de crecimiento de tumor en ratones SCID con tumores BJAB-luciferasa en comparación con control negativo, anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) (SN8) , anti-CD79b humano (TAH05) (2F2) , anti-gpl20 o anti-gpl220 conjugado con DM1 (anti-gpl20-SMCC-DMl) . Se administraron ADCs en una sola dosis (como se indica en la tabla 17) el día 0 para todos los ADCs y controles. Específicamente, anti-CD79b humano (SN8 o 2F2 ) -SMCC-DMl inhibió significativamente duplicación de tumor (datos no mostrados) . Además, en la tabla 20, se indica el número de ratones del número total probado que mostraban PR = Regresión Parcial (cuando el volumen de tumor en cualquier tiempo después de la administración cayó debajo del 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (cuando el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) .
Tabla 20 Tratamiento PR CR Ab mq/kq Fármaco uq/m2 anti-CD79b humano (SN8)-SMCC-DM1 2/8 0/8 4.1 200 anti-CD79b humano (2F2)-SMCC-DM1 2/8 0/8 4.5 200 Controles: ant¡-CD79b humano (SN8) 0/8 0/8 4.5 NA anti-CD79b humano (2F2) 0/8 0/8 4.5 NA anti-gp120 0/8 0/8 4.5 NA ant¡-gp120-MC-SMCC-DM1 0/8 0/8 3.5 200 Resumen para el análisis FACS A partir del análisis FACS, la expresión superficial de CD79a, CD79b e IgM fue sustancialmente más baja en tumores tratados con anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) (SN8 o 2F2) o anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) conjugados con DM1 (anti-CD79b humano-SMCC-DM1) que en tumores tratados con anti-gpl20 o anti-gpl20 conjugado con DM1 (anti-gpl20-SMCC-DM1) . La expresión superficial de CD22 no fue afectada por tratamiento con anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) (SN8 o 2F) o anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) conjugados con DM1 (anti-CD79b humano-SMCC-DM1) .
En vista de la capacidad de los anticuerpos anti-TAHO para inhibir significativamente duplicación de tumor en xenoinjertos y xenoinjertos diseminados, las moléculas TAHO pueden ser excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados con células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (s decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas . Además, anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAHO son útiles para reducir crecimiento de tumor in vivo de tumores, incluyendo cánceres asociados con células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Todavía más, la eficacia (en estudios de xenoinjerto descritos arriba) de ADCs anti-CD79a humano (TAH04) y anti-CD79b humano (TAH05) no se correlacionó con los niveles de expresión superficial de los objetivos de proteína ni la sensibilidad al fármaco libre. En consecuencia, anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAHO pueden ser útiles para reducir crecimiento de tumor in vivo de tumores con bajos niveles de expresión de polipéptido TAHO.
Ejemplo 13 Inmunohistoquímica Para determinar la expresión tisular de polipéptido TAHO y para confirmar los resultados de microdisposición a partir del ejemplo 1, la detección inmunohistoquímica de la expresión del polipéptido TAHO puede ser examinada en tejidos linfoides congelados rápidamente incrustados en parafina y fijos en formalina (FFPE) , incluyendo amígdala faríngea, bazo, nodulos linfáticos y parches de Peyer del Banco de Tejidos Humanos de Genentech.
La prevalencia de la expresión de objetivos TAHO se evalúa en microdisposiciones de tejido de linfoma FFPE (Cybrdi) y un panel de 24 especímenes de linfoma humano congelados. Especímenes de tejido congelado son cortados a 5 µp?, secados al aire y fijados en acetona durante 5 minutos antes de la inmunotinción . Los tejidos incrustados en parafina son seccionados a 5 y montados sobre portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus (VWR) .
Para secciones congeladas, los portaobjetos se ponen en TBST, 1% de BSA y 10% de suero de caballo normal que contiene 0.05% de azida de sodio durante 30 minutos, luego se incuban con reactivos del kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector) antes de la adición de anticuerpo primario. Anticuerpos primarios monoclonales de ratón (disponibles comercialmente ) se detectan con IgG anti-ratón de caballo biotinilado (vector) , seguidos por incubación con complejo de avidina-biotina peroxidasa (ABC Elite, vector) , y tetracloruro de diaminobencidina incrementado con metal (DAB, Pierce) . Las secciones de control son incubadas con anticuerpo monoclonal de ratón irrelevante igualado en isotipo (Pharmingen) a concentración equivalente. Después de la aplicación del reactivo ABC-HRP, las secciones se incuban con biotinilo-tiramida (Perkin Elmer) en diluyente de amplificación durante 5-10 minutos, se lavan y se incuban de nuevo con reactivo ABC-HRP. La detección usa DAB como se describió arriba.
Secciones de tejido humano FFPE son desparafinizadas en agua destilada, tratadas con solución de retiro de objetivo (Dako) en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos, seguidas por un periodo de enfriamiento de 20 minutos. La actividad de peroxidasa endógena residual se bloquea usando solución de bloqueo IX (KPL) durante 4 minutos. Se incuban las secciones con reactivos de bloqueo de avidina/biotina y regulador de pH de bloqueo que contiene 10% de suero de caballo normal antes de la adición de los anticuerpos monoclonales, diluidos a 0.5-5.0 ug/ml en regulador de pH de bloqueo. Las secciones son después incubadas secuencialmente con anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado, seguidas por ABC-HRP y detección cromogénica con DAB . La Amplificación de Señal de Tiramida, descrita arriba, se usa para incrementar la sensibilidad de tinción para un número de objetivos TAHO (CD21, CD22, HAL-DOB) .
Las moléculas TAHO pueden ser excelentes objetivos para terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 14 Citometría de flujo Para determinar la expresión de moléculas TAHO, se llevó a cabo análisis FACS usando una variedad de células, incluyendo células normales, y células enfermas, tales como células de leucemia linfocítica crónica (CLL) .
A. Células normales: TAH04 (CD79a humano) y TAH05 (CD79b humano) Para los subtipos de células B de amígdalas, la agina fresca fue molida en HBSS frío y pasada a través de un restrictor de células de 70 um. Las células fueron lavadas una vez y contadas. Células B CD19+ son enriquecidas usando el AutoMACS (Miltenyi) . Brevemente, las células de amígdala fueron bloqueadas con IgG humana, incubadas con microesferas anti-CD19, y lavadas antes de la selección positiva sobre los AutoMACS. Una fracción de células B CD19+ se guarda para el análisis citométrico de flujo de células plasmáticas. Las células CD19+ restantes son teñidas con FITC-CD77 , PE-IgD y APC-CD38 para clasificación de las subpoblaciones de células B. El enriquecimiento de CD19+ fue analizando usando PE-Cy5-CD19, y la pureza varió de 94-98% de CD19+. Subpoblaciones de amígdala B fueron clasificadas en el MoFlo mediante Michael Hamilton a una velocidad de flujo de 18,000-20,000 células/segundo. Las células de manto foliculares fueron recogidas como la fracción IgD+/CD38-, las células B de memoria fueron IgD-/CD38-, los centrocitos fueron IgD-/CD38+/CD77- , y los centroblastos fueron IgD-/CD38+/CD77+ . Las células fueron ya sea almacenadas en 50% de suero durante la noche, o teñidas y fijadas con 2% de paraformaldehído . Para el análisis de células plasmáticas, células B de amígdala totales fueron teñidas con CD138-PE, CD20-FITC, y anticuerpo biotinilado para el objetivo de interés detectado con estreptavidina-PE-Cy5. Las subpoblaciones B de amígdala fueron teñidas con anticuerpo biotinilado para el objetivo de interés, detectadas con estreptavidina-PE-Cy5. El análisis de flujo se llevó a cabo en el BD FACSCaliber, y los datos se analizaron más usando software FlowJo v 4.5.2 (TreeStar) . Anticuerpos conjugados a biotina los cuales estuvieron disponibles comercialmente tales como anti-CD79a humano (TAH04) (ZL7-4) y anti-CD79b humano (TAH05) (CB-3) se usaron en la citometría de flujo.
Sumario de TAH04 (CD79a humano) y TAH05 (CD79b humano) en células normales El patrón de expresión en subtipos de amígdala B clasificado se llevó a cabo usando anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido TAHO de interés. TAH04 (CD79a humano) (usando anti-CD79a humano) y TAHO5 (CD79b humano) (usando anti-CD79b humano) mostraron la expresión significativa en células B de memoria, células de manto folicular, centroblastos y centrocitos (datos no mostrados) .
El patrón de expresión en células plasmáticas de amígdala se llevó a cabo usando anticuerpos monoclonales específicos para el polipéptido TAHO de interés. TAH04 (CD79a) (usando anti-CD79a humano (TAH04 ) ) y TAHO5 (CD79b) (usando anti-CD79b humano (TAH05) ) mostraron expresión significativa en células plasmáticas (datos no mostrados) .
En consecuencia, en vista de patrón de expresión TAH04 y TAH05 en subtipos de amígdala B como se evalúa por FACS, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
B. Células CLL : TAH04 (CD79a humano) y TAH05 (CD79b humano) Los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromas o purificados fueron usados para citometría de flujo de muestras de CLL: CD5-PE, CD19-PerCP Cy5.5, CD20-FITC, CD20-APC (disponible comercialmente de BD Pharmingen) . Además, anticuerpos biotinilados disponibles comercialmente contra CD22 (RFB4 de Ancell) , CD23 (M-L233 de BD Pharmingen) , CD79a (ZAL7-4 de Serotec o Caltag) , CD79b (CB-3 de BD Pharmingen) , CD180 (MHR73-11 de eBioscience) , CXCR5 (51505 de R&D Systems) fueron usados para la citometría de flujo. Los anticuerpos CD5, CD19 y CD20 se usaron para regular células CLL y tinción de PI se llevó a cabo para verificar la viabilidad celular.
Células (105 células en 100 1 de volumen) fueron incubadas primero con 1 g de cada uno de los anticuerpos CD5, CD19 y CD20 y 10 g cada uno de gama globulina humana y de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) para bloquear la unión no específica, luego se incubaron con concentraciones óptimas de mAbs durante 30 minutos en la oscuridad a 4°C. Cuando se usaron anticuerpos biotinilados , estreptavidina-PE o estreptavidina-APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) fueron después añadidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La citometría de flujo se llevó a cabo en un FACS calibur (BD Biosciences, San José, CA) . Las señales de dispersión hacia adelante (FSC) y dispersión hacia los lados (SSC) fueron registradas en modo lineal, las señales de fluorescencia en modo logarítmico. Las células muertas y restos son eliminados usando las propiedades de dispersión de las células. Los datos se analizaron usando software CellQuest Pro (BD Bioscience) y FlowJo (Tree Star Inc.) .
Sumario de TAH04 (CD79a humano) y TAH05 (CD79b humano) en muestras de CLL El patrón de expresión en muestras de CLL se llevó a cabo usando anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido TAHO de interés. TAH04 (CD79a humano) y TAH05 (CD79b humano) mostraron expresión significativa en muestras de CLL (datos no mostrados) .
En consecuencia, en vista del patrón de expresión de TAH04 y TAH05 en muestras de leucemia linfocítica crónica (CLL) según se evaluó por FACS, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados a células, B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 15 Internalización de TAHO La internalización de los anticuerpos TAHO en líneas de células B fue evaluada en líneas de células B Raji, Ramos, Daudi y otras, incluyendo líneas de células ARH77, SuDHL4 , U698M, huB y BJAB.
Una caja de 15 cm lista para división de células B (~ 50 x 106 células) con células para usarse en hasta 20 reacciones fue usada. Las células estuvieron debajo del pasaje 25 (menos de 8 semanas de edad) y crecían saludablemente sin ningún micoplasma.
En un tubo Falcon de 15 mi de tapa holgada se añaden 1 ug/ml de anticuerpo anti-TAHO de ratón a 2.5 x 106 células en 2 mi de medio de crecimiento normal (por ejemplo, RPMI/10% de FBS/1% de glutamina) que contiene 1:10 de bloque FcR (kit MACS, dializado para remover azida) , 1% de pen/strep, 5 u de pepstatina A, 10 µg/ml de leupeptina (inhibidores de proteasa lisosómica) y 25 ug/ml de Alexa488-transíerrina (la cual marcó la vía de reciclaje e indicó qué células estaban vivas; alternativamente un marcador en fase fluida de Ax488 dextrano se usó para marcar todas las vías. Durante 24 horas en una incubadora de C02 al 5% a 37°C. Para anticuerpos de rápida internalización, los puntos de tiempo cada 5 minutos fueron tomados. Para puntos de tiempo tomados menos de una hora, 1 mi de medio libre de carbonato completo (Gibco 18045-088 + 10% de FBS, 1% de glutamina, 1% de pen/strep, 10 m de Hepes, pH 7.4) fue usado y las reacciones se llevaron a cabo en un baño de agua a 37°C en lugar de la incubadora de C02.
Después de la conclusión del curso de tiempo, las células fueron recogidas por centrifugación (1,500 rpm a 4°C durante 5 minutos en G6-SR o 2,500 rpm 3 minutos en centrífuga eppendorf de 4°C) , lavados una vez en 1.5 mi libre medio de carbonato (en Eppendorfs) o 10 mi de medio para tubos Falcon de 15 mi. Las células fueron sujetas a una segunda centrifugación y resuspendidas en 0.5 mi de paraformaldehído al 3% (EMS) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la fijación de las células .
Las siguientes etapas fueron seguidas por una colección de las células mediante centrifugación. Las células fueron lavadas en PBS y luego enfriadas rápidamente durante 10 minutos en 0.5 mi de NH4C1 50 mM (Sigma) en PBS y se permeabilizaron con 0.5 mi de Triton-X-100 al 10.5% en PBS durante 4 minutos durante un giro de centrifugación de 4 min. Las células fueron lavadas en PBS y sujetas a centrifugación. 1 ug/ml de Cy3 anti-ratón (o anticuerpo anti-especie Io) se añadieron para detectar la absorción del anticuerpo en 200 µ? de medio libre de carbonato completo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas dos veces en medio libre de carbonato y resuspendidas en 20 µ? de medio libre de carbonato y las células se dejaron sedimentar como una gota sobre un pocilio de un portaobjetos LabtekII de ocho pocilios recubierto con polilisina durante al menos 1 hora (o durante la noche en el congelador) . Cualquier célula no unida fue aspirada y los portaobjetos fueron montados con una gota por pocilio de Vectashield que contenía DAPI bajo una tapa de 50x24 mm. Las células fueron examinadas bajo una lente de lOOx para la internalización de los anticuerpos.
Sumario (1) TAH04/CD79a (detectado usando anticuerpo anti-CD79a humano (TAH04) Serotec ZL7-4 o Caltag ZL7-4) fue internalizado en 1 hora en células Ramos, enl hora en células Daudi y en 1 hora en células SuDHL4 , y se suministró a lisiomas en 3 horas. (2) TAH05/CD79b (detectado usando anticuerpo anti-CD79b humano (TAH05) Ancell SN8) se internaliza en 20 minutos en células Ramos, Daudi y Su-DHL4 y es suministrado a los lisosomas en 1 hora.
En consecuencia, en vista de la internalización de TAH04 y TAH05 en líneas de células B como se evalúa por inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-TAHO respectivos, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia en tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados a células B, tales como linfomas (es decir, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 16 Colocalización de TAHO Para determinar si los anticuerpos anti-TAHO son suministrados después de su internalización en la célula, estudios de colcoalización de los anticuerpos TAHO internalizados en líneas de células B fueron evaluados en líneas de células Ramos. LAMP-1 es un marcador para endosomas y lisosomas tardíos (Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology. 139) 3) : 639-649 (1997) Hunziker et al., Bioessays, 18:379-389 (1996); Mellman et al., Annu. Rev. Dev. Biology, 12:575-625 (1996)), incluyendo compartimentos de MHC clase II (MIICs) , el cual es un compartimento tipo endosoma/lisoma tardío. HLA-DM es un marcador para MIICs.
Células Ramos fueron incubadas durante 3 horas a 37°C con lug/ml de anticuerpo anti-CD79b humano (SN8) , bloque FcR (Miltenyl) y 25 pg/ml de Alexa647 -Tranferrina (Molecular Probes) en medio libre de carbonato completo (Gibco) con presencia de 10 pg/ml de leupeptina (Roche) y 5 µ? de pepstatina (Roche) para inhibir la degradación lisosómica.
Las células fueron después lavadas dos veces, fijadas con 3% de paraformaldehído (Electron Microscopy Sciences) durante 20 minutos a temperatura ambiente, enfriadas rápidamente con 50 mM. de NH4C1 (Sigma) , permeabilizadas con 0.4% de saponina/2% de FBS/1% de BSA durante 20 minutos y luego incubadas con 1 g/ml de Cy3 anti-ratón (Jackson Immunoresearch) durante 20 minutos. La reacción se bloqueó después durante 20 minutos con IgG de ratón (Molecular Probes) , seguida por una incubación de 30 minutos con Image-iT FX Signal Enhancer (Molecular Probes) . Las células fueron finalmente incubadas con anti-LAMPl de ratón marcado con ratón Zenon Alexa488 (BD Pharmingen) , un marcador para tanto lisosomas como para MIIC (un compartimento tipo lisosoma que es parte de la vía MHC clase II) , durante 20 minutos y después se fijaron con 3% de PFA. Las células fueron resuspendidas en 20 µ? de regulador de pH de saponina y se les dejó adherir a portaobjetos recubiertos con polilisina (Sigma) antes de montar una cubierta con un VectaShield (Vector Laboratories) que contenía DAPI . Para inmunofluorescencia del MIIC o lisosomas, las células fueron fijadas, permeabilizadas y potenciadas como arriba, luego co-teñidas con Alexa555-HLA-DM (BD Pharmingen) marcado con Zenon y Alexa488 -Lampl en presencia de IgG de ratón en exceso según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes) .
Sumario Anticuerpos anti-CD79b humanos (TAH05) (SN8) colocalizados con LAMP1 entre 1 y 3 horas de absorción y mostró una colocalización significativamente menor con el marcador de reciclaje transíerrina .
En consecuencia, en vista de la internalización de anti-CD79b humano (TAH05) en MIIC o lisosomas de líneas de células B según se evalúa por. inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-TAHO respectivos, las moléculas son excelentes objetivos para la terapia de tumores en mamíferos, incluyendo cánceres asociados a células B, tales como linfornas (por ejemplo, linfoma no Hodgkin) , leucemias (es decir, leucemia linfocítica crónica) , mielomas (es decir, mieloma múltiple) y otros cánceres de células hematopoyéticas .
Ejemplo 17 Preparación de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína La preparación de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína, tales como anti-CD79b humano (TAH05) y anti-cyno CD79b (TAHO40) se llevó a cabo como se describe en la presente.
ADN que codificaba para el anticuerpo chSN8 (cadena ligera, SEQ ID NO: 10, figura 10; y cadena pesada, SEQ ID NO: 12, figura 12), fue mutagenizado mediante métodos descritos en la presente para modificar la cadena ligera y cadena pesada. ADN que codificaba para el anticuerpo chSN8 (cadena pesada, SEQ ID NO: 12, figura 12) también puede ser mutagenizado mediante métodos descritos en la presente para modificar la región Fe de la cadena pesada.
ADN que codificaba para anticuerpo CD79b anti-cyno (TAHO40) (chlODlO) (cadena ligera, SEQ ID NO: 41, figura 21, y cadena pesada, SEQ ID NO: 43, figura 23), fue mutagenizado mediante métodos descritos en la presente para modificar la cadena ligera y la cadena pesada. ADN que codificaba para el anticuerpo anti-cyno CD79b (TAHO40) (chlODlO) (cadena pesada, SEQ ID NO: 43, figura 23), también puede ser mutagenizado mediante métodos descritos en la presente para modificar la región Fe de la cadena pesada.
En la preparación de los anticuerpos anti-CD79b manipulados con cisteína, ADN que codifica para la cadena ligera fue mutagenizado para sustituir cisteína por valina en la posición de Kabat 205 en la cadena ligera (posición de la secuencia 208) como se muestra en las figuras 30A-30B (cadena ligera, SEQ ID NO. 58 de chSN8 Thio ab) y figura 36 (cadena ligera SEQ ID NO: 96 de ThioMab anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) ) . ADN que codificaba para la cadena pesada se mutagenizó para sustituir con cisteína la alanina en la posición EU 118 en la cadena pesada (posición secuencial 118; número de Kabat 114) como se muestra en la figura 35 (cadena pesada SEQ ID NO: 61 de ThioMab anti -cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) anticuerpo) y figura 31 (cadena pesada SEQ ID NO: 60 de chSN8 ThioMab) . La región Fe de los anticuerpos anti- CD79b puede ser mutagenizada para sustituir con cisteína la serina en la posición EU 400 en la región Fe de la cadena pesada (posición secuencial 400; número de Kabat 396) como se muestra en la tabla 6-7.
A. Preparación de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína para conjugación por reducción y reoxidación Anti-TAHO manipulado con cisteína de longitud completa, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , anticuerpos monoclonales (ThioMabs) expresados en células CHO y purificados en una cromatografía de afinidad a proteína A seguida por una cromatografía de exclusión de tamaño. Los anticuerpos purificados son reconstituidos en 500 mM de borato de sodio y 500 mM de cloruro de sodio a un pH de alrededor de 8.0 y reducidos con un exceso molar de aproximadamente 50-100 veces de 1 mM de TCEP clorhidrato de (tris (2-carboxietil) fosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante alrededor de 1-2 horas a 37°C. El ThioMab reducido es diluido y cargado en una columna HiTrap S en 10 mM de acetto de sodio, pH 5, y eluido con PBS que contiene cloruro de sodio 0.3 M. El ThioMab reducido y eluido se trata con 2 mM de ácido deshidroascórbico (dhAA) a pH 7 durante 3 horas, o 2 mM de sulfato de cobre acuoso (CuS04) a temperatura ambiente durante la noche. La oxidación con aire ambiental también puede ser efectiva. Se cambia el regulador de pH mediante elución sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con 1 mM de DTPA. El valor tiol/Ab se estima al determinar la concentración de anticuerpo reducida a partir de la observancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol mediante reacción con DTNB (Aldrich, Mil aukee, I) y determinación de la absorbancia a 412 nm.
Ejemplo 18 Preparación de conjugados anticuerpo anti-TAHO- fármaco manipulados con cisteína mediante conjugación de anticuerpos anti-TAHO manipulados con cisteína e intermediarios f rmaco- enlazador Después de los procedimientos de reducción y reoxidación del ejemplo 17, el anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anti-CD79b humano. (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , es reconstituido en regulador de pH PBS (solución salina de pH regulado con fosfato) y enfriado sobre hielo. Aproximadamente 1.5 equivalentes molares en relación a cisteínas manipuladas por anticuerpo de un intermediario enlazador de fármaco de auristatina, tal como MC-MMAE (maleimidocaproil-monometil auristatina E) , MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE, o MC-val -cit -PAB-MMAF, con un grupo funcional reactivo con tiol tal como maleimido, se disuelven en D SO, se diluyen en acetonitrilo y agua, y se añaden a el anticuerpo reducido y enfriado y reoxidado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añade un exceso de maleimida para inactivar la reacción y tapar cualquier grupo tiol de anticuerpos no reaccionado. La mezcla de reacción se concentra mediante ultrafiltración centrífuga y el conjugado anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) -fármaco, es purificado y desalado mediante elución a través de resina G25 en PBS, filtrada a través de filtros de 0.2 bajo condiciones estériles y congelada para almacenamiento.
La preparación de anti-chSN8-HC (A118C) thioMAb-BMPEO-DM1 se llevó a cabo como sigue. La cisteína libre en anti-chSN8-HC (A118C) thioMAb se modificó mediante el reactivo de bis-maleimido BM(PE0)3 (Pierce Chemical), dejando un grupo maleimido no reaccionado en la superficie del anticuerpo. Esto se logró al disolver BM(PEO)3 en una mezcla de etanol/agua 50% hasta una concentración de 10 mM y al añadir un exceso molar de 10 veces de BM(PEO)3 a una solución que contenía anti-chSN8-HC (A118C) thioMAb en solución salina de pH regulador de pH regulado con fosfato a una concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolar) y dejando que reaccione durante 1 hora. Se removió el exceso de BM(PEO)3 mediante filtración en gel (columna HiTrap, Pharmacia) en 30 mM de citrato, pH 6 con 150 mM de regulador de pH NaCl . Un exceso molar de aproximadamente 10 veces de DM1 disuelto en dimetilacetamida (DMA) se añadió al intermediario anti-chSN8-HC (A118C) thioMAb-BMPEO . También se puede emplear dimetilformamida (DMF) para disolver el reactivo de la porción de fármaco. La mezcla de reacción se dejó reaccionar durante la noche antes de la filtración en gel o diálisis en PBS para remover fármaco que no reaccionó. La filtración en gel sobre columnas S200 en PBS se usó para remover agregados de alto peso molecular y producir anti-chSN8-HC (A118C) thioMAb-BMPEO-DMl purificado.
Mediante los mismos protocolos, hu-anti -HER2 -HC (A118C) -BMPEO-DMl, thio de control, hu-anti -HER2 -HC (A118C) -MC-MMAF thio de control y hu-anti -HER2 -HC (A118C) -MCvcPAB-MMAE thio de control fueron generados .
Mediante los procedimientos anteriores, se prepararon y probaron los siguientes conjugados anticuerpo anti-TAHO manipulado con cisteína- fármaco (TDCs) : 1. thio anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) -MC- MMAF mediante conjugación de thio A118C anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) y MC-MMAF; 2. thio anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO ) -HC (A118C) -BMPEO-DMl mediante conjugación de thio A118C anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) y BMPEO-DMl; 3. thio anti-cynoCD79b (TAH040) (chlODlO) -HC (A118C) -MCvcPAB-MMAE mediante conjugación de thio A118C anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) y MC-val-cit-PAB-MMAE; 4. thio chSN8-HC (A118C) -MC-MMAF mediante conjugación de thio chSN8-HC(A118C) y MC-MMAF; y 5. thio chSN8-LC/V205C) -MC-MMAF mediante conjugación de thio chSN8-LC(V205C) y MC-MMAF.
Ejemplo 19 Caracterización de la afinidad de unión de conjugados de thioAb manipulados con cisteína- fármaco a antígenos de superficie celular La afinidad de unión de conjugados de fármaco anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , a un polipéptido TAHO, tal como CD79b humano (TAH05) o cynoCD79b (TAHO40) , expresados sobre células de BJAB-luciferasa se determinó mediante análisis FACS. Además, la afinidad de unión de conjugados de fármaco anti-cynoCD79b thio (TAHO40) (chlODlO) a CD79b expresados en células BJAB que expresaban cynoCD79b (TAHO40) se determinó mediante análisis FACS.
Brevemente, alrededor de lxlO6 células en 100 µ? fueron puestos en contacto con cantidades variables (1.0 ug, 01. ug o 0.01 ]ig de Ab por millón de células de células BJAB-luciferasa o células BJAB que expresaban cynoCD79b (por anti-cynoCD79b thioMAbs) ) de uno de los siguientes conjugados anti-CD79b thioMAb-fármaco o desnudos (Ab no conjugado como un control) : (1) chSN8-LC/V205C) -MC-MMAF thio o (2) chSN8-HC (A118C) -MC-MMAF thio (figuras 32A-32B, respectivamente); o (3) anti-cynoCD79b thio (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -MCvcPAB-MMAE, (4) anti-cynoCD79b thio (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -BMPEO-DM1 o (5) anti-cynoCD79b thio (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -MC-MMAF (véase figuras 33B-33D, respectivamente) . Ig anti-humana de ratón conjugada a PE se usó como el anticuerpo de detección secundario (BD cat#555787) .
El anticuerpo anti-CD79b unido a la superficie celular se detectó usando Ig anti-humano de ratón conjugada a PE. Las gráficas de las figuras 32A-33B indican que la unión a antígeno fue aproximadamente igual para todos los conjugados thioMAb-fármaco probados.
Ejemplo 20 Ensayo para la reducción de proliferación celular in vitro por conjugados anti-TAHO thioMAb- fármaco La potencia in vitro de anti-TAHO, tal como anti-CD79b humano (TAH05) o anti-cyno CD79b (TAHO40) , conjugados de fármaco ThioMAb, se pueden medir mediante un ensayo de proliferación celular. El Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente está disponible comercialmente (Promega Corp., adison, WI) , un método de ensayo homogéneo a base de la expresión recombinante de luciferasa de coleópteros (US 5583024; US 5674713; US 5700670). Este ensayo de proliferación celular determina el número de células viables en cultivo con base en la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas (Crouch et al., J. Immunol. Metho, 160:81-88 (1993); US 6602677). El ensayo CellTiter-Gloa> se lleva a cabo en un formato de 96 pocilios, haciendo posible el tamizado de alta emisión automático (HTS) (Cree et al., AntiCancer Drugs, 6:398-404 (1995)). El procedimiento de ensayo homogéneo incluye añadir el reactivo individual (The CellTiter-Glo8 Reagent) directamente a las células cultivadas en medio complementado con suero.
El formato de "añadir-mezclar-medir" homogéneo se traduce en lisis de células y generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. El substrato, luciferina de escarabajo, es descarboxilado oxidantemente mediante luciferasa de luciérnaga recombinante con conversión concomitante de ATP en AMP y generación de fotones. Las células viables son reflejadas en unidades de luminiscencia relativas (RLU) . Los datos pueden registrarse por luminómetro o un dispositivo de formación de imágenes de cámara CCD. La salida de luminiscencia se presenta como RLU, medida con el tiempo. %RLU es el porcentaje normalizado en comparación con un control que "no es conjugado de fármaco". Como alternativa, los fotones de la luminiscencia pueden contarse en un contador de centelleo en presencia de un centellante. Las unidades de luz pueden ser representadas luego como CPS (conteos por segundo) .
La eficacia de los conjugados ThioMAb-fármaco se mide con un ensayo de proliferación celular empleando el siguiente protocolo, adaptado del CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza et al., Cáncer Res., 62:5485-5488 (2002)): 1. Una alícuota de 40 µ? de cultivo de células que contiene aproximadamente 3000 células BJAB, Granta-519 o WSU-DLCL2 en medio se depositó en cada pocilio de una placa de paredes opacas de 384 pocilios. 2. TDC (conjugado ThioMab-fármaco) (10 µ?) se añade para cuadruplicar los pocilios experimentales hasta una concentración final de 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 13.7, 4.6 ó 1.5 ng/mL, con los pocilios de control de "conjugado no de fármaco" recibiendo medio únicamente e incubados durante 3 días. 3. Las placas son equilibradas a temperatura ambiente durante alrededor de 30 minutos. 4. Se añade reactivo CellTiter-Glo (50 µ?) . 5. Los contenidos se mezclan durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir lisis celular. 6. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para establecer la señal de luminiscencia. 7. La luminiscencia se registra y se reporta en gráficas como datos %RLU (unidades de luminiscencia relativa) de las células incubadas con medio libre de fármaco-conjugado y se grafican a 0.51 ng/ml.
Medio: células BJAB, Granta-519 y WSU-DLCL2 cultivadas en RPM11640/10% de FBS/2 mM de glutamina.
Ejemplo 21 Ensayo para la inhibición de crecimiento de tumor in vivo por conjugados thioMftb anti-TAHO-fármaco A. Granta-519 (Linfoma de Células de Manto Humano) En un estudio similar, usando el mismo protocolo de estudio de xenoinjertoque el descrito en el ejemplo 12 (véase arriba) , las dosis variables de conjugados de fármaco son administradas, la eficacia de los conjugados thioMAb-fármaco en xenoinjertos Granta-519 (Linfoma de Células de Manto Humano) en ratones SCID CB17 fue estudiada. Los conjugados de fármaco y dosis (administrados el día 0 para todos los ADCs y controles) se muestran en la tabla 21 abajo.
El Ab de control fue hu-anti-HER2-MC-MMAF o chSN8-MC-MMAF. El HC(A118C) thioMAb de control fue hu-anti-HER2-HC (A118C) -MMAF thioMAb thio. Los resultados se muestran en la tabla 21 y las figuras 34A-34B.
La figura 34A es una gráfica que gráfica los cambios en volumen de tumor medio con el tiempo en el xenoinjerto Granta-519 en ratones SCID CB17 tratados con los TDCs A118C de la cadena pesada o V205C de la cadena ligera, a dosis como las mostradas en la tabla 21. Específicamente, la administración de chSN8-HC (A118C) -MC-MMAF thio y chSN8-LC (V205C) -MC-MMAF thio mostró inhibición de crecimiento tumoral cuando se comparó con los controles negativos (anti-hu-HER2-MC-MMAF y thio-hu-anti-HER2-HC (A118C) -MC-MMAF. Otros controles incluyeron chSN8-MC-MMAF.
Además, en el mismo estudio, el cambio en el peso corporal porcentual en los primeros 14 días fue determinado en cada grupo de dosis. Los resultados (figura 34B) indicaron administración de estos conjugados thioMAb-fármaco no dio como resultado una reducción significativa en el peso corporal porcentual o pérdida de peso durante este tiempo.
Además, en la tabla 21, el número de ratones del número total probado que mostraban PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo del 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) se indican y NA = no aplicable. (DAR = Relación Fármaco Anticuerpo) .
Tabla 21 Reducción de volumen de tumor in vivo, administración de conjugado chSN8-HC (A118C) -thio o chSN8-HC (A118C) MMAF thio en xenoinjertos Granta-519 en ratones CB17 SCID Anticuerpo administrado PR CR Dosis Dosis DAR MMAF Ab (fár- (Ug/m2 (mg/kg maco/Ab ) ) ) Control hu-anti-HER2-MC- 0/8 0/8 413 6.8 4.0 MMAF Thio hu-anti-HER2- 0/9 0/9 191 6.8 1.85 HC(A118C) -MC-MMAF de control chSN8 -MC-MMAF de control 1/8 0/8 100 2.3 3.0 chSN8 -MC-MMAF de control 8/9 1/9 300 6.8 3.0 chSN8-HC(A118C) -MC-MMAF 0/8 0/8 63 2.3 1.9 thio chSN8-LC(V205C) -MC-MMAF 0/8 0/8 60 2.3 1.8 thio chSN8-LC (V205C) -MC-MMAF 5/9 4/9 180 6.8 1.8 thio B. XenoinjertoB BJAB-cynoCD79b (TAHO40) En un estudio similar, usando el mismo protocolo de estudios de xenoinjertos que el descrit en el ejemplo 12 (véase arriba) , variando los conjugados de fármaco y dosis administradas, la eficacia de los conjugados thioMAb-fármaco en células BJAB (linfoma de Burkitt) que expresaban xenoinjertos cynoCD79b (TAHO40) (BJAB-cynoCD79b) en CB17 SCID fue estudiada. Los conjugados de fármaco y dosis (administrados el día 0 para todos los ADCs y controles) se muestran en la siguiente tabla 22.
El Ab de control fue vehículo (regulador de pH únicamente) . Los thio MAbs de control fueron thioMAbs de anticuerpos thio-hu-anti-HER2-HC (A118C) -BMPEO-DM1, thio-hu-anti-HER2-HC (A118C) -MC-MMAF y thio-hu-anti-HER2-HC (A118C) -MCvcPAB-MMAE. Los resultados se muestran en la tabla 22 y figura 37.
La figura 37 es una gráfica que gráfica la inhibición de crecimiento de tumor con el tiempo en el xenoinjerto BJAB-cynoCD79b en ratones CB17 SCID tratados con los A118C anti-CD79b TDCs de la cadena pesada, a dosis como las mostradas en la tabla 22. Específicamente, la administración de thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -BMPE0-DM1, thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -MCvcPAB-MMAE y thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) -MC-MMAF mostró la inhibición del crecimiento de tumor cuando se comparó con los controles negativos (thio-anti-HER2-HC (A118C) -BMPEO-DM1, thio-anti-HER2-HC (A118C) -MCvcPAB-MMAE y thio-anti-HER2-HC(A118C) -MC-MMAF y A-vehículo) .
Más aún, en la tabla 22, se indica el número de ratones del número total probado que muestran PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó debajo de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) y NA = no aplicable. (DAR = Relación Fármaco Anticuerpo) .
Tabla 22 Reducción de volumen de tumor in vivo, administración de conjugado anti-cyno CD79b thio (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) DM1, MMAF o MMAE en xenoinjertos BJAB-cynoCD79b (TAHO40) en ratones CB17 SCID Anticuerpo administrado PR CR Dosis Dosis DAR MMAF, Ab (fármaco MMAE O (mg/kg) /Ab) DM1 ( g/m2) Vehículo de control 0/9 0/9 NA NA NA Thio hu-anti-HER2-HC (A118C) - 0/9 0/9 57 2 1.86 BMPEO-DM1 de control Thio hu-anti-HER2-HC (A118C) - 0/9 0/9 23 1 1.55 CvcPAB-MMAE de control Thio hu-anti-HER2-HC (A118C) - 0/9 0/9 29 1 1.9 MC-MMAF de control Anti-cynoCD79b (TAHO40) thio 3/8 1/8 53 2 1.8 (chlODlO) -HC (A118C) -BMPEO-DM1 Anti-cynoCD79b (TAHO40) thio 1/9 2/9 27 1 1.86 (chlODlO) -HC (A118C) -MCvcPAB- MMAE Anti-cynoCD79b (TAHO40) 0/9 1/9 28 1 1.9 thio (chlODlO) -HC(A118C) - MC-MMAF C. Xenoinjertoa BJAB-cynoCD79b (TAHO40) En un estudio similar, usando el mismo protocolo de estudio de xenoinjertos que el descrito en el ejemplo 12 (véase arriba) , variando los conjugados de fármaco y dosis administradas, se estudió la eficacia de los conjugados thioMAb fármaco en xenoinjerto cynoCD79b (TAHO40) (BJAB cynoCD79b) que expresaba BJAB (linfoma de Burkitt) en ratones CB17 SCID. Los conjugados de fármaco y dosis (administrados el día 0 para todos los ADCs y controles) se muestran en la tabla 23 abajo.
Los thio MAbs de control fueron thio-hu-anti-HER2-HC(A118C) -BMPEO-DMl y thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) anticuerpos thioMAbs . Los resultados se muestran en la tabla 23 y figura 38.
La figura 38 es una gráfica que gráfica la inhibición del crecimiento de tumor con el tiempo en el xenoinjerto BJAB-cynoCD79b en ratones CB17 SCID tratados con los A118C anti-CD79b TDCs de la cadena pesada, a dosis como las mostradas en la tabla 23. Específicamente, la administración de thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC (A118C) -BMPEO-DMl hizo más lenta la inhibición del crecimiento de tumor cuando se comparó con los controles negativos (thio-anti-HER2-HC (A118C) -BMPEO-DMl . Otros controles incluyeron thio-anti-cynoCD79b (TAHO40) (chlODlO) -HC(A118C) .
Los resultados se muestran en la tabla 23 abajo. En la tabla 23 se indica el número de ratones del número total probado que muestra PR = Regresión Parcial (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a menos de 50% del volumen de tumor medido el día 0) o CR = Remisión Completa (en donde el volumen de tumor en cualquier momento después de la administración cayó a 0 mm3) y NA = no aplicable. (DAR = Relación Fármaco Anticuerpo) .
Tabla 23 Reducción de volumen de tumor in vivo, administración de conjugado anti-cyno CD79b (TAHO40) thio (chlODlO) -HC (A118C) DM1 en xenoinjertos BJAB-cynoCD79b (TAHO40) en ratones CB17 SCID Anticuerpo administrado PR CR Dosis Dosis DAR MMAF, Ab (fárma- MMAE o (mg/kg co/Ab) DM1 ) ( g/m2) Thio hu-anti-HER2- o/i o/i 57 2 1.86 HC (A118C) -BMPE0-DM1 de 0 0 control Thio anti-cynoCD79b o/i o/i NA 2 NA (TAHO40) de control 0 0 (chlODlO) -HC(A118C) Thio anti-cynoCD79b o/i o/i 27 1 1.8 (TAHO40) (ChlODlO) - 0 0 HC (A118C) -BMPE0-DM1 Thio anti-cynoCD79b 0/1 1/1 53 2 1.8 (TAHO40) (chlODlO)- 0 0 HC (A118C) -BMPEO-DM1 Depósito de material Los siguientes materiales han sido depositados en la Colección Americana de Tipos de Cultivos, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, E.U.A. (ATCC) : Tabla 24 Material ATCC Dep. Fecha de No. depósito CD79a-8H9 anti-humano PTA-7719 11 de julio de (8H9.1.1) 2006 CD79a-5C3 anti -humano PTA-7718 11 de julio de (5C3.1.1) 2006 CD79a-7H7 anti -humano PTA-7717 11 de julio de (7H7.1.1) 2006 CD79a-8Dll anti -humano PTA-7722 11 de julio de (8D11.1.1) 2006 CD79a-15E4 anti-humano PTA-7721 11 de julio de (15E4.1.1) 2006 CD79a-16Cll anti-humano PTA7720 11 de julio de (16C11.1.1) 2006 CD79b-2F2 anti-humano PTA-7712 11 de julio de (2F2.20.1) 2006 CD79b-3H3 anti-cyno PTA-7714 11 de julio de (3H3.1.1) 2006 CD79b-8D3 anti-cyno PTA-7716 11 de julio de (8D3.7.1) 2006 CD79b-9Hll anti-cyno PTA-7713 11 de julio de (9H11.3.1) 2006 CD79b-10D10 anti-cyno PTA-7715 11 de julio de (10D10.3) 2006 Estos depósitos se hicieron de acuerdo a los lineamientos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimientos de Patente y las Regulaciones del mismo (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los depósitos se pondrán a disposición por la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, el cual asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público después de la emisión de la patente de E.U.A. pertinente o después de la apertura al público de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, cualesquiera sea el primero, y aseguran la disponibilidad de la progenie a alguien determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas de Estados Unidos como con derecho a la misma de acuerdo con 35 USC § 122 y las reglas del Comisionado conforme al mismo (incluyendo 37 CFR § 1.14 con referencia particular a 886 OG 638) .
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si el cultivo de los materiales bajo depósito muriese o se perdiera o fuera destruido cuando se cultive bajo condiciones adecuadas, los materiales serán rápidamente reemplazados después de una notificación del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para practicar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
La anterior descripción escrita se considera que es suficiente para hacer posible que los expertos en la técnica practiquen la invención. La presente invención no debe limitarse al alcance por la construcción depositada, toda vez que la modalidad depositada está diseñada como una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. El depósito del material en la presente no constituye una admisión de que la presente descripción escrita contenida sea inadecuada para hacer posible la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni tampoco se debe considerar como limitando el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente se harán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (427)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Ácido nucleico aislado caracterizado porque tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad secuencia de ácido nucleico con: (a) una molécula de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6), y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) una molécula de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6), y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) una molécula de ADN que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene el aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) una molécula de ADN que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene el aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; (f) la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f ) .
2. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene el aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene el aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; (f) la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y la figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) .
3. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque híbrida a: (a) un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un ácido nucleico que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) un ácido nucleico que codifica para un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4) , figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); (f) la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) .
4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la hibridación se produce bajo condiciones severas.
5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque tiene por lo menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud.
6. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3.
7. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico es enlazado operablemente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector.
8. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.
9. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura.
10. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende el cultivo de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido del cultivo de células.
11. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
12. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8); (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su secuencia de péptidos de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
13. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 ó 12 fusionado a un polipéptido heterólogo.
14. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es una secuencia marcadora de epítopes o un región Fe de una inmunoglobulina .
15. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se une a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8) ; (b) el polipéptido seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado ; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
16. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se une a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8); (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su secuencia de péptidos de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .
18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.
19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o humanizado.
20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque está conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque está conjugado a un agente citotóxico.
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide . , derivados de dolastatina y caliqueamicina.
25. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque se produce en bacterias .
27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque se produce en células CHO.
28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque induce la muerte de una célula a la que se une.
29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque es marcado en forma detectable .
30. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque una secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334 a 338 ó 339-347.
31. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 30 enlazado operablemente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector.
32. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31.
33. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura.
34. Un proceso para producir un anticuerpo, caracterizado porque comprende el cultivo de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y la recuperación del anticuerpo del cultivo celular.
35. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque se une a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado,- (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
36. Un oligopéptido aislado, caracterizado porque se une a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8); (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su secuencia de péptidos de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleotidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleotidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
37. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque está conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
38. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque está conjugado a un agente citotóxico .
39. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
40. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
41. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide, derivados de dolastatina y caliqueamicina .
42. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
43. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque induce la muerte de una célula a la que se une .
44. El oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque se marca detectablemente .
45. Una molécula orgánica de unión a TAHO, caracterizada porque se une a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
46. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque se une a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada de la grupo formado por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
47. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque está conjugada a un agente inhibidor de crecimiento.
48. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque está conjugada a un agente citotóxico.
49. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
50. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el agente citotóxico es una toxina.
51. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide , derivados de dolastatina y caliqueamicina.
52. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la toxina es un maitansinoide .
53. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque que induce la muerte de una célula a la que se une.
54. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizada porque se marca detectablemente .
55. Una composición de materia caracterizada porque comprende : (a) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 11; (b) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12; (c) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15; (d) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16; (e) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 332; (f) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 333; (g) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 334; (h) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 335; (i) el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 336; (j) el oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35; (k) el oligopéptido de conformidad con la reivindicación 36; (1) la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 45, o (m) la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 46, en combinación con un portador.
56. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
57. Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende : (a) un recipiente, y (b) la composición de materia de conformidad con la reivindicación 55 contenida en el recipiente.
58. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque comprende además un marcador fijado al recipiente, o un inserto de envase incluido en el recipiente, con referencia al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico de o la detección de diagnóstico de un cáncer.
59. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7), el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se una a la proteína, con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugada a un agente citotóxico que se una a la proteína, o con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugada con un agente inhibidor de crecimiento que se una a la proteína, en donde la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugada con un agente citotóxico o el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugada con un agente inhibidor de crecimiento a la proteína causa de esta manera una inhibición del crecimiento de la célula.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
64. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
65. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
66. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
67. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
68. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
69. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide , derivados de dolastatina y caliqueamicina .
71. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide .
72. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
73. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
74. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la célula es una célula hematopoyética .
75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la célula hematopoyética se selecciona del grupo que consiste en un linfocito, leucocito, plaqueta, eritrocito y célula asesina natural.
76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el linfocito es una célula B o célula T.
77. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el linfocito es una célula cancerosa.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la célula cancerosa es expuesta además a tratamiento con radiación o a un agente quimioterapéutico .
79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en una célula de linfoma, una célula de mieloma y una célula de leucemia.
80. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por la célula hematopoyética en comparación con una célula no hematopoyética.
81. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la inhibición se traduce en la muerte de la célula.
82. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
83. Un método de tratamiento terapéutico de un mamífero con un tumor canceroso que comprende células que expresan una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) , el método está caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se une a la proteína, un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugada con un agente citotóxico que se une a la proteína, o un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado con un agente inhibidor de crecimiento que se une a la proteína, en donde la unión trata de esta manera en forma efectiva al mamífero.
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
87. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
88. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
89. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
90. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
91. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
92. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
93. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide , derivados de dolastatina y caliqueamicina .
95. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
96. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
97. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
98. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el tumor es expuesto además a tratamiento con radiación o a un agente quimioterapéutico .
99. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el tumor es un linfoma, leucemia o tumor de mieloma.
100. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por una célula hematopoyética en comparación con una célula no hematopoyética del tumor.
101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por células hematopoyéticas cancerosas del tumor, en comparación con las células hematopoyéticas normales del tumor .
102. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
103. Un método para determinar la presencia de una proteína en una muestra sospechosa de contener la proteína, en donde la proteína tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7), el método se caracteriza porque comprende exponer la muestra a un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se una a la proteína, y determinar la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína en la muestra, en donde la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína es indicativa de la presencia de la proteína en la muestra.
104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la muestra comprende una célula sospechosa de expresar la proteína.
105. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la célula es una célula cancerosa.
106. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se marca detectablemente.
107. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
108. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
109. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
110. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
111. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
112. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
113. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
114. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
115. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
116. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
117. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por una célula hematopoyética en comparación con una célula no hematopoyética del tumor.
118. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por células hematopoyéticas cancerosas del tumor, en comparación con células hematopoyéticas normales del tumor .
119. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8); (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
120. Un método para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular asociado con incremento en la expresión o la actividad de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) , el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de la proteína, de esta manera tratando o previniendo en forma efectiva el trastorno de proliferación celular.
121. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el trastorno de proliferación celular es cáncer .
122. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo anti-polipéptido TAHO, oligopéptido de unión a TAHO, molécula orgánica de unión a TAHO u oligonucleótido antisentido.
123. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el anticuerpo anti-polipéptido TAHO es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
124. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
125. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID" NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
126. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el anticuerpo anti-polipéptido TAHO es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
127. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el anticuerpo anti-polipéptido TAHO se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
128. Un método para unir un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) , el método se caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica, un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente citotóxico o un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente inhibidor de crecimiento que se une a la proteína permitiendo que ocurra la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente citotóxico o el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente inhibidor de crecimiento para que la proteína se una a la célula .
129. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
130. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
131. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
132. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
133. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
134. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
135. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
136. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
137. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
138. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
139. El método de conformidad con la reivindicación 138, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide, derivados de dolastatina y caliqueamicina .
140. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
141. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
142. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
143. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque la célula es una célula hematopoyética .
144. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque la célula hematopoyética se selecciona del grupo que consiste en un linfocito, leucocito, plaqueta, eritrocito y célula asesina natural.
145. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque el linfocito es una célula B o una célula T.
146. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque el linfocito es una célula cancerosa.
147. El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado porque la célula cancerosa es expuesta además a tratamiento con radiación o a un agente quimioterapéutico.
148. El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado porque la célula cancerosa se selecciona del grupo consistente en una célula de leucemia, una célula de linfoma y una célula de mieloma.
149. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque la proteína es más abundantemente expresada por la célula hematopoyética en comparación con una célula no hematopoyética.
150. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque causa la muerte de la célula.
151. Uso del ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 30, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
152. Uso del ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 30, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
153. Uso del ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
154. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
155. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en la preparación del medicamento para el tratamiento de un tumor.
156. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
157. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
158. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
159. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
160. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
161. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
162. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
163. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
164. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
165. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, 16, 334-338 ó 339-347, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
166. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
167. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
168. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
169. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
170. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
171. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con las reivindicaciones 45 ó 46, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
172. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
173. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
174. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
175. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 57, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
176. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
177. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
178. Un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de la célula depende al menos en parte de un efecto potenciador de crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO : 8 ) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7), el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la proteína con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que se una a la proteína, un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente citotóxico que se una a la proteína, o un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente inhibidor de crecimiento, inhibiendo de esta manera el crecimiento de la célula.
179. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la célula es una célula hematopoyética .
180. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la proteína se expresa por la célula.
181. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína antagoniza una actividad potenciadora de crecimiento celular de la proteína.
182. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína induce la muerte de la célula .
183. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
184. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
185. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado .
186. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
187. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
188. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
189. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
190. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
191. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
192. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
193. El método de conformidad con la reivindicación 192, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide , derivados de dolastatina y caliqueamicin .
194. El método de conformidad con la reivindicación 192, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
195. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
196. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
197. El método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) , figura 3 (SEQ ID NO: 3) , figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
198. Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor depende al menos en parte de un efecto potenciador de crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) , el método está caracterizado porque comprende poner en contacto la proteína con un anticuerpo, un oligopéptido o molécula orgánica que se una a la proteína, un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a una toxina citotóxica o un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica conjugado a un agente inhibidor de crecimiento, de esta manera tratando en forma efectiva el tumor.
199. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque la proteína se expresa por células del tumor .
200. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína antagoniza una actividad potenciadora de crecimiento celular de la proteína.
201. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
202. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo .
203. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.
204. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
205. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
206. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado que comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
207. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo aislado depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
208. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
209. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en toxinas, antibióticos, isótopos radiactivos y enzimas nucleolíticas .
210. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
211. El método de conformidad con la reivindicación 210, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide, derivados de dolastatina y caliqueamicina .
212. El método de conformidad con la reivindicación 210, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide.
213. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias.
214. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO.
215. El método de conformidad con la reivindicación 198, caracterizado porque la proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8) ; (b) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2) , figura 4 (SEQ ID NO: 4) , figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 2), figura 4 (SEQ ID NO: 4), figura 6 (SEQ ID NO: 6) y figura 8 (SEQ ID NO: 8), sin su secuencia de péptidos de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud completa de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1), figura 3 (SEQ ID NO: 3), figura 5 (SEQ ID NO: 5) y figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
216. Una composición de materia caracterizada porque comprende el polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 13.
217. Uso del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 30, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
218. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
219. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
220. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
221. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
222. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
223. Uso del vector de expresión de conformidad con la reivindicación 31, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
224. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
225. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
226. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
227. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
228. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
229. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
230. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
231. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
232. Uso de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
233. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
234. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
235. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
236. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
237. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
238. Uso del polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
239. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
240. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
241. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
242. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
243. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
244. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
245. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
246. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
247. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
248. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
249. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
250. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
251. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 29, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
252. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
253. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
254. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
255. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
256. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
257. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
258. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
259. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
260. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor .
261. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
262. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
263. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
264. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 29, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
265. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
266. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
267. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
268. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
269. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
270. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
271. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
272. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
273. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
274. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celula .
275. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
276. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
277. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
278. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
279. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 29, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
280. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 37, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
281. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
282. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 39, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
283. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
284. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 41, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
285. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 42, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
286. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 43, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
287. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 44, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer .
288. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 37, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
289. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
290. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 39, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
291. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
292. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 41, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
293. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 42, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
294. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 43, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
295. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 44, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
296. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 37, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
297. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 38, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
298. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 39, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
299. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 40, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
300. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 41, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
301. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 42, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
302. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 43, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular .
303. Uso del oligopéptido de conformidad con la reivindicación 44, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
304. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 47, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
305. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 48, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
306. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 49, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
307. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 50, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
308. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 51, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
309. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 52, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
310. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 53, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
311. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 54, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
312. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 47, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
313. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 48, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
314. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 49, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
315. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 50, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
316. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 51, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
317. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 52, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
318. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 53, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
319. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 54, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
320. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 47, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo ceular.
321. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 48, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
322. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 49, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
323. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 50, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
324. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 51, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
325. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 52, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
326. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 53, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
327. Uso de la molécula orgánica de unión a TAHO de conformidad con la reivindicación 54, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
328. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 56, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
329. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 56, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
330. Uso de la composición de materia de conformidad con la reivindicación 56, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
331. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer.
332. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.
333. Uso del artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno proliferativo celular.
334. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9.
335. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.
336. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40.
337. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque es depositado con cualquier número de registro ATCC mostrado en la tabla 24.
338. Un anticuerpo aislado, caracterizado porque se une a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
339. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 98.
340. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 97.
341. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 98 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 97.
342. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 100.
343. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 99.
344. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 100 y una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 99.
345. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 102.
346. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 101.
347. Un anticuerpo que se une a CD79b, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 102 y una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 101.
348. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo manipulado con cisteína que comprende uno o más aminoácidos de cisteína libres, en donde el anticuerpo manipulado con cisteína se prepara por un proceso que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácido de un anticuerpo progenitor por un aminoácido de cisteína libre.
349. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el uno o más aminoácidos de cisteína libre tienen un valor de reactividad con tiol en la escala de 0.6 a 1.0.
350. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el anticuerpo manipulado con cisteína es más reactivo que el anticuerpo progenitor con un reactivo que reacciona con tío.
351. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el proceso comprende además la determinación de la reactividad tiol del anticuerpo manipulado con cisteína por reacción del anticuerpo manipulado con cisteína con un reactivo que reacciona con tiol; en donde el anticuerpo manipulado con cisteína es más reactivo que el anticuerpo progenitor con el reactivo que reacciona con tiol.
352. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el uno o más residuos de aminoácido de cisteína libre se encuentran en una cadena ligera.
353. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el anticuerpo es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo manipulado con cisteína unido covalentemente a un agente citotóxico.
354. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 353, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona de una toxina, un agente quimioterapéutico, una fracción de fármaco, un antibiótico, un isótopo radiactivo, y una enzima nucleolítica .
355. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 348, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de captura, un marcador de detección, o un soporte sólido.
356. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 355, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de captura de biotina.
357. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 355, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de detección de colorante fluorescente.
358. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 357, caracterizado porque el colorante fluorescente se selecciona de un tipo de fluoresceína, un tipo de rodamina, dansilo, lisamina, un cianina, una ficoeritrina, Texas Red, y un análogo de los mismos .
359. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 355, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de detección de radionúclido seleccionado de 3H, ^C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, "Te, ^in, 123I, 124I, 1251 , 131I, 133Xe, 177Lu, 211At y 213Bi.
360. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 355, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador de detección por un ligando quelante.
361. El anticuerpo manipulado con cisteína de conformidad con la reivindicación 360, caracterizado porque el ligando quelante se selecciona de DOTA, DOTP, DOT A, DTPA y TETAT.
362. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque comprende un péptido de unión a albúmina.
363. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 361, caracterizado porque el péptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NOs : 246-250.
364. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque el anticuerpo comprende además un aminoácido de cisteína libre en una o más posiciones seleccionadas de 15, 43, 110, 144, 168 y 205 de la cadena ligera de acuerdo con la convención de numeración Kabat y 41, 88, 115, 118, 120, 171, 172, 282, 375 y 400 de la cadena pesada de acuerdo con la convención de numeración EU.
365. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque una cisteína está en la posición 205 de la cadena ligera.
366. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque una cisteína está en la posición 118 de la cadena pesada.
367. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque una cisteína está en la posición 400 de la cadena pesada.
368. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado.
369. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.
370. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 369, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
371. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque se selecciona entre un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, o un anticuerpo humanizado.
372. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque se produce en bacterias.
373. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque se produce en células CHO.
374. Un método para determinar la presencia de una proteína CD79b en una muestra sospechosa de contener la proteína, el método se caracteriza porque comprende exponer la muestra al anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364 y determinar la unión del anticuerpo a la proteína CD79b en la muestra, en donde la unión del anticuerpo a la proteína es indicativa de la presencia de la proteína en la muestra.
375. El método de conformidad con la reivindicación 374, caracterizado porque la muestra comprende una célula sospechosa de expresar la proteína CD79b.
376. El método de conformidad con la reivindicación 374, caracterizado porque la célula es una célula B.
377. El método de conformidad con la reivindicación 374, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a un marcador seleccionado de un colorante fluorescente, un radioisótopo, biotina, o un ligando que forma complejos metálicos .
378. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo anti-CD79b de conformidad con la reivindicación 364, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
379. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque el anticuerpo se une covalentemente a una porción de fármaco de auristatina o maitansinoide con lo cual se forma el conjugado anticuerpo- fármaco.
380. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, caracterizado porque comprende un anticuerpo (Ab) , y una porción de fármaco de auristatina o maitansinoide (D) , en donde el anticuerpo manipulado con cisteína se fija a través de uno o más aminoácidos de cisteína libres por una porción enlazadora (L) a D; el compuesto tiene fórmula I : Ab-(L-D)p I en donde p es 1, 2, 3 ó 4.
381. El compuesto conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque p es 2.
382. El compuesto conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque L tiene la fórmula: -Aa—ww—Yy- en donde : A es una unidad extensora unida covalentemente a un tiol de cisteína del anticuerpo manipulado con cisteína (Ab) ; a es 0 ó 1 ; cada es independientemente una unidad de aminoácido; w es un entero que varía de 0 a 12; Y es una unidad separadora unida covalentemente a la porción de fármaco; y y es 0 , 1 6 2.
383. El compuesto conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 382, caracterizado porque tiene la fórmula: en donde PAB es para-aminobencilcarbamoilo, y R es un radical divalente seleccionado de (CH2)r/ carbociclilo de C3-C8, 0-(CH2)r/ arileno, (CH2) r-arileno, -arileno- (CH2) r- , (CH2)r-(carbociclilo de C3-C8) , (carbociclilo de C3-C3) - (CH2) r , heterociclilo de C3-C8, (CH2) r_ (heterociclilo de C3-C8) , (heterociclilo de C3-C8) - (CH2) r- , - (CH2) rC (0) NRb (CH2) r- , (CH2CH20)r-, - (CH2CH20)r-CH2-, - (CH2) rC (O) NRb (CH2CH20) r- , (CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-, - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r- , (CH2CH20)RC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2- y - (CH2CH20) rC (O) NRb (CH2) r- ; en donde Rb es H, alquilo de Ci-C6, fenilo o bencilo; y r es independientemente un entero que varía de 1-10.
384. El compuesto conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 382, caracterizado porque w es valina-citrulina .
385. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 382, caracterizado porque R17 es (CH2)5 o (CH2)2.
386. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 382, caracterizado porque tiene la fórmula:
387. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 386, caracterizado porque R17 es (CH2)5 o (CH2)2.
388. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 382, caracterizado porque tiene la fórmula:
389. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque L es SMCC, SPP o BMPEO.
390. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque D es MMAE, que tiene la estructura: en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
391. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque D es MMAF, que tiene la estructura: en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
392. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque D es DM1, que tiene la estructura: en donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.
393. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un fragmento de anticuerpo.
394. El compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
395. Un compuesto conjugado anticuerpo-fármaco, caracterizado porque se selecciona de las estructuras: Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab-MC-MMAE Ab-MC-MMAF Ab-BMPEO-DM 1 en donde Val es valina, Cit es citrulina, es l, 2, 3 ó 4, y Ab es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364.
396. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, caracterizado porque la auristatina es MMAE o MMAF.
397. El conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 380, caracterizado porque L es MC-val-cit-PAB o MC.
398. Un ensayo para la detección de células B, caracterizado porque comprende: (a) exponer células al compuesto conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, y (b) determinar el grado de unión del compuesto conjugado anticuerpo- fármaco a las células.
399. Un método para inhibir proliferación celular, caracterizado porque comprende tratar células B cancerosas de mamífero en un medio de cultivo celular con el compuesto conjugado anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 379, con lo cual se inhibe la proliferación de las células B cancerosas.
400. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 379, y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
401. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente la formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 400.
402. El método de conformidad con la reivindicación 401, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto.
403. El método de conformidad con la reivindicación 401, caracterizado porque se administra al paciente un agente citotóxico en combinación con el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco .
404. Un artículo de manufactura caracterizado porque comprende la formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 400; un recipiente; y un inserto de envase o etiqueta que indica que el compuesto puede usarse para tratar cáncer que se caracteriza por la sobreexpresión de un polipéptido CD79b.
405. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 404, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, linfoma no Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo en recaída, NHL indolente en recaída, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de células pilosas (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) y linfoma de células de manto .
406. Un método para la elaboración de un compuesto conjugado anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo anti-CD79b (Ab) de conformidad con la reivindicación 364, y una porción de fármaco de auristatina o maitansinoide (D) en donde el anticuerpo se une a través del uno o más anticuerpos manipulados con cisteína por una porción enlazadora (L) a D; el compuesto tiene la fórmula I : Ab-(L-D)p I en donde p es 1, 2, 3 ó 4, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: (a) hacer reaccionar un grupo de cisteína manipulado del anticuerpo con un reactivo enlazador para formar un intermediario anticuerpo-enlazador Ab-L, y (b) hacer reaccionar Ab-L con una porción de fármaco D activada, con lo cual se forma el conjugado anticuerpo-fármaco; o comprende las etapas de: (c) hacer reaccionar un grupo nucleófilo de una porción de fármaco con un reactivo enlazador para formar un intermediario anticuerpo-enlazador D-L, y (d) hacer reaccionar D-L con un grupo cisteína maniuplado del anticuerpo; con lo cual se forma el conjugado anticuerpo- fármaco .
407. El método de conformidad con la reivindicación 406, caracterizado porque comprende además la etapa de expresar el anticuerpo en células de ovario de hámster chino (CHO) .
408. El método de conformidad con la reivindicación 407, caracterizado porque comprende además la etapa de tratar el anticuerpo expresado con un agente reductor.
409. El método de conformidad con la reivindicación 408, caracterizado porque el agente reductor se selecciona de TCEP y DTT.
410. El método de conformidad con la reivindicación 409, caracterizado porque comprende además la etapa de tratar el anticuerpo expresado con un agente oxidante, después del tratamiento con el agente reductor.
411. El método de conformidad con la reivindicación 410, caracterizado porque el agente oxidante se selecciona de sulfato de cobre, ácido deshidroascórbico y aire.
412. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOs : 12 ó 59.
413. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOs: 10 ó 58.
414. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
415. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 y una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
416. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionadas de cualquiera de SEQ ID NOs : 43 ó 61.
417. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionadas de cualquiera de SEQ ID NOs : 41 ó 96.
418. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.
419. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 364, caracterizado porque comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuenciá de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.
420. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque se une a un epítopo dentro de una región de CD79b seleccionada del grupo que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO: 8; o (c) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 13.
421. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 420, caracterizado porque se une a un epítope dentro de una región de CD79b a partir de los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4, en donde el aminoácido en la posición 30, 34 y 36 es Arg.
422. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 420, caracterizado porque se une a un epítope dentro de una región de CD79b partir de los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO: 8, en donde el aminoácido en la posición 35 es Leu.
423. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque se une a un epítope dentro de una región de CD79b, en donde el epítope tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO : 8, o (c) una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 13.
424. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 423, caracterizado porque se une a un epítope dentro de una región de CD79b partir de los aminoácidos 29-39 de SEQ ID NO: 4, en donde el aminoácido en la posición 30, 34 y 36 es Arg.
425. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 423, caracterizado porque se une a un epítope dentro de una región de CD79b partir de los aminoácidos 30-40 de SEQ ID NO: 8, en donde el aminoácido en la posición 35 es Leu.
426. Un anticuerpo caracterizado porque compite con el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-347 y/o un anticuerpo que comprende la cadena pesada o ligera del anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-347.
427. El método de utilización del anticuerpo anti-CD79b de macaco o un ADC que comprende un anti-CD79b de macaco, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-347, caracterizado porque es para probar la seguridad del tratamiento terapéutico de un mamífero que tenga un tumor canceroso, en donde el tratamiento comprende la administración de un anticuerpo anti-CD79b humano o un ADC que comprende el anticuerpo anti-CD79b humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-16, 334-338 ó 339-
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