MX2010008168A - Biomarcadores p53. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la identificación de perfiles de biomarcadores p53 que predicen la respuesta en pacientes con enfermedad hiperproliferativa, tal como cáncer, a una terapia, y su uso en métodos para tratar tales pacientes con una terapia de gene de enfermedad anti-hiperproliferativa.

Description

BIOMARC ADORES P53 po de la Invención La presente invención se refiere generalment pos de oncología y terapia del cáncer. Más partícul refiere a la evaluación de factores para prono acia de una terapia de la enfermedad erproliferativa. tecedentes de la Invención El cáncer es la causa principal de muerte en l te de los países, y tiene el resultado de billones de los gastos del cuidado de la salud en todo el mund á bien establecido que una variedad de cánce sionados, por lo menos en parte, por anorm éticas que dan como resultado ya sea la sobre-expr genes que ocasionan el cáncer, denominados "onc e la érdida de las mutaciones de función en lo yor parte de los tejidos normales. La p53 de tipo na strado estar involucrada en el control del ciclo rcer, 1992), la regulación de transcripción (Fields 0; Mietz y asociados, 1992), la duplicación del ADN ane, 1991; Bargonettí y asociados, 1991), y la indu apoptosis (Yonish-Rouach y asociados, 1991; ciados, 1992).

Se conocen varios alelos del p53 mutantes en lo ubstitución de una sola base da como resultado la las proteínas que tienen propiedades regulato cimiento bastante diferentes, y finalmente, conduc lignidades (Hollstein y asociados, 1991). De hecho ha sido encontrado como que es el gen más frecuen tado en los cánceres humanos comunes (Holl ciados, 1991; Weinberg, 1991), y la mutación del ticularmente asociada con aquellos cánceres rela fumar cigarrillos (Hollstein y asociados, 1991; Zakut tor viral.

Como resultado de estos descubrimientos, se ha uerzos considerables en la terapia genética inistración retrovira! del p53 en los humanos fue r e algún tiempo (Roth y asociados, 1996). Ahí, u roviral que contenía el gen p53 de tipo natural bajo e un promotor de beta-actina fue utilizado para p nsferencia del p53 de tipo natural en 9 pacientes cánceres del pulmón que no es de célula pequeña nyección directa. No se notaron efectos clínicos imp ieos relacionados con el vector hasta cinco meses tratamiento. La hibridación en el sitio y la rea ena de polimerasa de ADN mostraron las secuen tor p53 en biopsias posteriores al tratamiento. La a erte celular programada) fue más frecuente en teriores al tratamiento que en biopsias pre amiento. Se notó la re resión del tumor en tres aci rúrgico en pacientes con SCCHN avanzado.

Los avances en el entendimiento del rol crític ción anormal del p53 en la proliferación del tu istencia al tratamiento proporcionaron la explicación arrollo de la terapia genética del p53 para el SCCH ceres (Hartwell y Kastan, 1994; Kastan y asociado lman y Nemunaitis, 2003; Ahomadegbe y asociado nly y asociados, 2000; Zhang y asociados, 1995; Cí ciados, 1995; Clayman y asociados, 1998; Cla ciados, 1999; Swisher y asociados, 1999; Nemu ciados, 2000; Peng, 2005). Por ejemplo, la A 5CMY-p53, INGN 201) comprende un vector de ti novirus incompetente a la duplicación que contien mal supresor del tumor p53 como su com péutico.

Sin embargo, a pesar de los éxitos de la terapia g la actualidad todavía no es claro or ué al unos ciados, 1991). Los biomarcadores moleculares h izados más recientemente para predecir el pronós bargo, con respecto al uso de los biomarcadores decir el pronóstico, el campo se caracteriza por flicto con algunos estudios que indican la capacida marcadores p53 para pronosticar los resultados (Re ciados, 1991; Gallo y asociados, 1995; Mulder y as 5; Sarkis y asociados, 1995; Sauter y asociado nmark-Askmalm y asociados, 1995; Matsumura y as 6; McKaig y asociados, 1998; Nemunaitis y asociado ntras otros indican que los biomarcadores nostican resultados del paciente (Kyzas y asociados hecho, uno de los estudios más extensos en los cán eza y cuello, un meta-análisis que combina los resul estudios que comprenden 3,388 pacientes no revel relación estadísticamente importante entre la condi marcador 53 el resultado clínico K zas as porciona un método para pronosticar una r orable a una terapia genética p53 a un sujeto hum e un tumor: (a) determinar si las células de dich prenden por lo menos un alelo p53 de tipo natural; erminar si las células del tumor de dicho tumor exp teína p53 en un nivel que es más alto que el expré células normales que no son de tumor que expresan En ciertos aspectos, los inventores actúal erminado que las células del tumor que (i) compren enos un alelo p53 de tipo natural, y/o (¡i) expresan proteína p53 que no es más alta que la expresad ulas normales que no son de tumor que expresan el expresan un nivel elevado de proteína p53, defini nivel que es más alto que el nivel expresado en las males que no son de tumor que expresan el p53, e ha proteína p53 no inhibe la función del p53 de tipo onces cual uiera del i al iii sería redictivo de resado por las células normales que expresan el p53 tante p53 inhibe la función del p53 de tipo natu mplo, mutantes que comprenden mutaciones sin se punto sin sentido en el dominio de enlace del iones de tetramerización intactas, por lo tanto ellas respuesta pobre de la terapia genética del p53. Otr mutaciones negativas dominantes son conocida nica y otras pueden ser identificadas mediante cionales (Resnick y asociados, 2003). El alto resión determinado por la inmunohistología de taciones dominantes-negativas también indica puesta pobre a la terapia.

La evaluación de los niveles aumentados del p53 s ar a cabo utilizando una variedad de técnicas, inclu dición de los niveles de la proteína p53 por medi ección de anticuerpos del p53 en una célula de tu m lo, ue se uede detectar utilizando un inmunoen a utilizarse con la presente invención, por eje lisis de ELISA, el inmunoensayo, el radioinmun ), el ensayo inmuno-radiométrico, el fluoroinmunoen ayo quimioluminiscente, el ensayo bioluminisce ctroforesis de gel, el análisis Western blot o el en ridación en el sitio.

La presencia del alelo p53 de tipo natural y la es gen mutante puede ser determinada utilizando la hib el sitio, Northern blotting o la protección de nuc izando una variedad de técnicas de genotipificación la hibridación con una pluralidad de muestras, por laboración de secuencias, la adaptación del gen y l gen. Particularmente, las secuencias genómic plificadas en las células de tumor las cuales pue rustadas en parafina.

El tumor puede ser un crecimiento de tumor beni r t ti a beni na leuco lasi faríngéo, un cáncer nasofaríngeo, cáncer renal, ar, cáncer prostético, feocromocitoma, cáncer de c ta pancreática, un tumor Li-Fraumeni, un cáncer de cáncer de paratiroides, tumores pituitarios, turn ndula adrenal, tumores de sarcoma osteogénlco, roendocrinos múltiples tipo I y tipo II, cáncer de cer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cá stata, cáncer del esófago, cáncer de la tráquea, cá ebro, cáncer de la piel, cáncer del hígado, cánc iga, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cá rio, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer te cer de colon, cáncer rectal o cáncer de la piel. Por umor puede ser un carcinoma de célula escamosa ( s específicamente, un SCCHN recurrente.

La respuesta favorable a la terapia puede compr ucción de tamaño o carga del tumor, el boq cimiento del tumor la reducción en el dolor asociad ucciones (PR) parciales en el tamaño de >50 ermedad Estable (SD); TGC = CR + PR + SD) o red el tamaño del tumor de >10%.

En ciertas modalidades, también se proporciona un inido adicionalmente como que comprende los paso erminar si las células del tumor comprenden dos al tipo natural; y de ser así, entonces (b) administrar l ética del p53 a un sujeto. En otra modalidad, el de ser definido como que se comparan los paso erminar si las células del tumor comprenden por lo m lo p53 de tipo natural y si las células del tumor n resan la proteína p53; y de ser así, entonces (b) adi sujeto una terapia genética del p53. En una m cional, el método podría ser definido como que co pasos de (a) determinar si las células del tu tienen un alelo mutante p53; y de ser así, ento inistrar al sujeto una terapia genética del p53. To que no inhibe la función del p53 de tipo natural; , entonces (b) administrar al sujeto una terapia gen . En otra modalidad, el método puede ser cionalmente como que comprende los pasos erminar si las células del tumor sobre-expresan una mutante y dicho mutante p53 inhibe la función del natural; y de ser así, entonces (b) administrar al su pia diferente a la terapia del p53. En una m cional, el método puede ser definido como que co pasos de (a) determinar si las células del tu tienen al menos un alelo p53 de tipo natural; y de onces (b) administrar al sujeto una terapia difere pia del p53. Todavía en otra modalidad, el métod definido como que comprende los pasos de (a) dete células del tumor contienen dos alelos p53 mutant así, entonces (b) administrar al sujeto una terapia rente a la tera ia del 53. La otra tera ia u noclonales, siARN, oligonucleótidos antisentido, ribo pía genética.

La terapia biológica puede ser una terapia gené o una terapia genética supresora del tumor, una ética de proteína de muerte celular, una terapia uiadora del ciclo celular, una terapia genética de terapia genética de toxina, una terapia de inmun terapia de gen suicida, una terapia gené fármacos, una terapia genética de proliferación ant terapia genética de enzimas, o una terapia genéti tor anti-angiogénico.

La terapia supresora del tumor puede ser APC -1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p N, FH IT, Rb, Uteroglobina, Skp2, BRCA-1, BRCA-2 KN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, M EN 1 , MEN2, MT 2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, C, MCC, FUS1, Gen 26 (CACNA2D2), PL6, Beta , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1 3, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, I IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-3 2 IFN-a, IFN-ß, IFN-?, MIP-1a, ???-1ß, TGF-ß , TNF o PDGF. La terapia anti-angiogénica puede ser ang ostaina, avastina o un antisentido, siARN, un antic sola cadena, o un ribozima contra un fact iogénico.

La célula cancerosa puede tener un gen p53 ño estructura de proteína o un gen p53 anormal ructura de proteína. Por ejemplo, el gen p53 puede proteína p53 la cual es idéntica a la proteína p53 ural. En otras modalidades, puede existir una mutac teína p53 (por ejemplo, una truncación, elim stitución, mutación trans-dominante, etc.)- El gen p5 er por lo menos un alelo p53 de tipo natural (por eje motor apropiado, intrones, exones y orientación tor retroviral, un vector adenoviral, un vector asoci no, un vector viral de viruela, un vector viral de poli tor lentiviral, o un vector herpesviral) .

La terapia genética puede ser una terapia genéti ional. La terapia genética loco-regional puede co terapia genética localizada. La terapia genética lo de comprender la inyección directa del tumor, la i la vasculatura del tumor, terapia del gen regi inistración en el bazo o conducto de la linfa asociad or. La administración puede comprender, admin aperitoneal, intrapleural, intravesicular, o intrate pia genética regional puede comprender administr istema de vasculatura de un miembro asociado con e Ciertas modalidades también incluyen un e q u i prende un anticuerpo o muestras del p53 para la d una cantidad de proteína p53 en una muestra de turn ralidad de muestras ara determinar un en 5 proteína p53 de tipo natural o mutante (por ejempl inante, falta de sentido, etc.).

Está contemplado que cualquier método o com í descrito puede ser implementado con respecto a c método o composición aquí descrito.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando es utili junto con el término "que comprende" en las reivindi la descripción puede significar "uno", pero tam sistente con el significado de "uno o más" o "al men término "aproximadamente" significa, en general, nifestado más o menos el 5%. El uso del término "? indicaciones es utilizado y significa "y/o" a menos ique explícitamente que se refiere a alternativas sola lternativa son mutuamente inclusives, aunque la des orta una definición que se refiere a solamente altern ".

Otros ob etos características venta as de la cripción detallada. ve Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la cripción y están incluidos para demostrar además ectos de la presente invención. La invención pu endida mejor haciendo referencia a uno o más ujos en combinación con la descripción detallada dalidades específicas aquí presentadas.

Figura 1 - Mecanismo de Actividad del Advexin® Figura 2 - Espectro de Respuestas Anti-Tum apia de Advexin®.

Figura 3 - Respuesta de Enfermedad Estable/S el Tumor Li-Fraumeni Después de la Terapia de A remisión completa mediante la exploración PET d vico en un paciente del Li-Fraumeni después de la te exin® del tumor inyectado (flecha). Las exploraci secutivas revelaron una enfermedad estable sin r Advexin® del tumor inyectado (flecha).

Figura 5 - Correlación del Control de Crecimi or con Sobrevi encia Aumentada Después oterapia de Advexi n®-Población T301 ITT.

Figura 6 - Correlación del Control de Crecimi or con Sobrevivencia Aumentada Después oterapia de Advexi n®-Población T201 ITT.

Figura 7 - Correlación del Control de Crecimi or con Sobrevivencia Aumentada Después oterapia de Advexi n®-Poblaciones T301 + T201 IT Figura 8 - Correlación de Reducción del Turn con Sobrevivencia Aumentada Después oterapia de Advexin®-Poblaciones T301 + T201 IT Figura 9 - Correlación de Reducción del Turn con la Sobrevivencia Aumentada Después oterapia de Advexin®-Poblaciones T301 + T201 IT de invertir la inhibición del mdm-2/4.

Figura 12 - La Mayor Parte de las Mutaciones de cuentra en el Dominio de Enlace del ADN.

Figura 13 - Las Mutaciones del Dominio de E N Desactivan el p53 Mediante la Formación de Tet no Enlazarán el ADN.

Figura 14 - Nivel Bajo de Expresión del p53 Mu Perfil del Biomarcador del p53 Favorable para la Advexin®.

Figura 15 - Expresión del p53 Mutado de Alto Perfil de Biomarcador de p53 Negativo Do favorable para la Eficacia del Advexin®.

Figura 16 - Poblaciones de Pacientes con Supre or p53 Bloqueada.

Figura 17 - Perfiles de p53 Favorables y Desfa a la Eficacia del Advexin® Pronostican el Bene revivencia del Advexin® en el Cáncer SCCHN Re favorable - alto nivel del p53 mutado.

Figura 19 - Los Perfiles Favorables y Desfavora para la Eficacia del Advexin® no Pronost ultado del Metotrexato en el Cáncer SCCHN Rec orable - alto nivel del p53 de tipo natural; bajo nivel tado; bajo nivel def p53 de tipo natural. Desfavorab el del p53 mutado.

Figura 20 - Los Perfiles Favorables y Desfavora para Pronosticar la Eficacia del Advexin®, el B Sobrevivencia en el Cáncer SCCHN Recurrente orable - alto nivel del p53 de tipo natural; bajo nivel tado; bajo nivel del p53 de tipo natural. Desfavorab el del p53 mutado.

Figura 21 - El Metotrexato es Eficaz en Pacien files del p53 Desfavorables para la Eficacia del A el Cáncer SCCHN Recurrente. Favorable - alto i n tur niv l d l 53 mutado ba o apéuticos tradicionales. Sin embargo, igual que con I te de los tratamientos anti-cáncer, todavía perman esidad substancial de mejorar la identificación laciones de pacientes que se pueden beneficiar m acia de la terapia genética y otros tratamientos.

Las evaluaciones previas de los perfiles del bio son inadecuadas para pronosticar complétam puesta del tratamiento y pronosticar debido a la f ntificar todos los casos que tienen una proteína p5 cional, lo cual es la clave para las determi dictivas y de pronóstico. Las aplicaciones a cartan las enseñanzas de la presente ¡ siderando típicamente la detección de ya sea una elevada de manera normal o las mutaciones del o no contienen una proteína p53 normal funcional, rcador predictivo o de pronóstico. Los in files del biomarcador del p53 para pronosticar de inaria las respuestas del tratamiento y la prognosis.

En este caso, los inventores proporcionan un m de combinaciones del perfil del biomarcador p nosticar la respuesta o grado de beneficio a un pac terapia del cáncer. En una modalidad particular, l cáncer es una terapia genética, por ejemplo, una ética adenoviral del p53, tal como una terapia de Ad El perfil del biomarcador del tumor p53 prono puesta a una terapia genética del p53 Los inventores descubrieron que las si binaciones de biomarcador del tumor gene nostican una eficacia favorable y pronostican los res nivel alto de la proteína p53 normal (por unohistoquímica positiva con la secuencia del p53 ural); (2) nivel bajo de la proteína p53 (inmunoh ativa con detección de or lo menos un alelo no ética del p53 que dará como resultado una e entada del gen p53 normal contribuirá a la apéutica y el resultado de desactivación del p53 por inhibidores como MDM2, DM4 o el nivel bajo de e la proteína p53 mutada dominante-negativa c licará más adelante. La transducción de las célula tor adenoviral deficiente de duplicación solo podría ucir la expresión del p53 de tipo natural a las cél tienen el gen p53 de tipo natural (Mcpake y as 9).

La estructura del gen p53 normal se define c ructura del gen p53 que es idéntica a la de las males que no son de tumor que expresan el p53. Lo de tipo natural tienen la misma secuencia de ellas células normales que no son de tumor p53. vado de proteína p53 o la sobre-expresión de la inida como un nivel ue es más alto ue el ex resad u ral) indican la presencia de altos niveles del p53 chos de estos tumores es conocido que tienen vados de MDM2 o MDM4 que inhiben la actividad lentin-Vega y asociados, 2007). Sin embargo, Valen asociados, (2007) no enseña que esa circunsta relaciona con cualquier beneficio de pronóstico fav l solamente es enseñado en esta invención. La ención indica que cuando estos tumores son expu ntes terapéuticos que inducen respuestas de est ivación adicional de la expresión del p53 o los inistran el p53 adicional de tipo natural similar al A los cuales desactivan los inhibidores del p53 c linas, la supresión es el resultado, y las trayecto resor del tumor entonces son activadas dand ultado una eficacia terapéutica y respuestas terap ejemplo, reducciones en el tamaño del tumor, etc.

B l l Gen 53 Normal Pro a y asociados (2007) no enseñan que esta circunst relaciona con cualquier beneficio de pronóstico fav l es solamente enseñado en la presente invención ientes con nivel bajo de los perfiles de expresió teína p53 normal, la administración del p53 de tipo una terapia genética del p53 que tiene como res ivación del p53 de respuestas de estrés o la desa inhibidores del p53 como las nutlinas, aume resión del p53 normal en relación con sus supres ultado de los inhibidores p53 con los efectos supres or terapéuticos resultantes.

El Nivel Bajo del p53 y el Gen p53 Anormal Pro Respuesta Favorable Poeta (2007), Olivier (2006) y Soussi (2006) ense presencia de un gen p53 mutado, el cual puede i ión del p53 normal, es una circunstancia que pr o lo describen Poeta (2007), Olivier (2006) y Soussi ido a que fallan en considerar el nivel de dicha ibitoria que afecta su capacidad para desactivar un lo del p53 normal cuando está presente. Ademá sencia de dichas mutaciones de desactivación o dom ativas, el nivel de su expresión es importan erminar su efecto en el p53 normal. La presente i cribe que la presencia de la desactivación de la p53 no se correlacionó con una respuesta p amiento del p53 si existía un nivel bajo de expresi teína p53.

Trkova y asociados (2003) ha descrito que los p secuencias mutadas del p53 y bajos niveles diante evaluaciones de inmunohistología con fr en un segundo gen p53 normal. Sin embargo, T ciados (2003) no enseña que esa circunsta relaciona con cualquier beneficio de pronóstico fav marcador p53 mediante la combinación de la canti y el análisis de elaboración de secuencias del gen. taciones del p53 son expresadas en alto nivel queando las mutaciones que pueden inhibir la funció p53 aún si está presente el gen p53 de tipo nat mplo, mutaciones dominantes-negativas en el do ace de ADN con dominios intactos de tetrameriza ultán en la capacidad del p53 mutado para enlaz activar el p53 normal, estos casos están más probab ciados con una respuesta pobre a una terapia gen debido a que la función del p53 normal introd ucida por la terapia son bloqueadas por un alto tantes p53 nocivos. Estos tipos de mutaciones com oximadamente el 80% de las mutaciones del p53 (mu sentido en el dominio de enlace del ADN con cap ctas de tetramerización) y estarán asociadas puesta pobre al tratamiento cuando la proteí dén responder favorablemente a la terapia genética En general, comparados con el análisis del p marcador p53 anterior, todos los métodos anteriore luaciones del biomarcador p53 (Kyzas y asociado orge y asociados, 2007; Olivier y asociados, 2006; ciados, 2002; Poeta y asociados, 2007; Soussi y as 6) enseñan solamente el reconocimiento parcial mentos críticos que son requeridos para pronos era uniforme y específica los resultados tera os los métodos que dependen únicamente unohistoquímica (Geisler y asociados, 2002) o úni análisis de elaboración de secuencia del gen ( ciados, 2007, Soussi y asociados, 2006, Olivier y as 6) les falta una información importante con res lquiera la presencia o nivel de la proteína p53 n rmal que es crítico para las decisión nóstico/predictivas correctas. Los estudios que com su aplicación de la inmunohistología del p53 y el an boración de secuencias del p53. Incluyen pacient o niveles de expresión altos como bajos del exon taciones de la proteína p53 en la mejor categ nóstico. Ignoran la importancia del nivel de expré n 5 mutado de la proteína p53 y mantienen ientes con el exon 5 con mutaciones del p53 se co o aquellos con configuraciones normales del gen nóstico pobre de los pacientes con un alto resión del exon 5 mutado de la proteína p53 icipados o pronosticados por las enseñanzas de G ciados (2007) quienes consideran que todos los C n 5 mutado tienen un buen pronóstico independien su nivel de expresión del p53. En los ensayos clín , ninguno de estos niveles altos del exon 5 muta teína p53 que expresan los pacientes tuvo una resp n 5 mutado de alta expresión de la proteína p53 raron significativamente la sobrevivencia promedi po de pronóstico favorable que definieron combinan os casos con un número todavía más grande en p tienen niveles normales de la proteína p53 normal , George y asociados (2007) no enseña la ímportanci files de reconocimiento en donde el p53 normal cional fallando en enseñar la importancia de un alto activación del p53 transdominante-negativa de la de mutaciones del exon 5 que pueden desa teína p53 normal si está presente.

Estas conclusiones no podrían haber sido con ucidas de la combinación de resultados de la l stente como lo evidencia la falla de los estudios pre a utilizar o definir las combinaciones correctas. La ención reveló la expresión correcta y apropiad teína y las combinaciones de elaboración de secue e\ de expresión Determinación de la Estructura del Gen p53 El p53 es uno de los supresores de tumo ocidos, es una f osfoproteína de aproximadame inoácidos, que puede ser subdividida en cinco dom inio de activación-transcripción de la terminal N ( l activa los factores de transcripción; un dominio lina importante para la actividad apoptótica del inio del núcleo central de enlace de ADN (DBD), tiene un átomo de zinc y varios aminoácidos de dificados por los exones del 5 al 8); un dominio d omerización (tetramerización) (OD) - la tetrameriz ncial para la actividad del p53 in vivo una ter lucrada en la desactivación del enlace de ADN del tral.

El p53 está localizado en el núcleo de las células il. Los agentes que dañan el ADN inducen que el o a la célula es severo.

Como se discutió anteriormente, las mutaciones e dén ocasionar que las células se convier ogénicamente transformadas, y los estudios de tran estran que el p53 actúa como un supresor del tu de restaurar algún nivel de crecimiento normal ulas cancerosas in vitro. El p53 es un factor de tran na vez activado, reprime la transcripción de varios g les están involucrados en el estímulo del cre ular, mientras que estimulan la expresión de otro lucrados en el control del ciclo celular.

Las mutaciones que desactivan el p53 en el rren generalmente en el dominio de enlace del yor parte de estas mutaciones de enlace del AD cto el dominio de tetramerización que puede tetr las moléculas del p53 de tipo natural e inhiben la c tetrámero hetero éneo ara enlazarse con sus se En ciertos aspectos, las células que tienen vados del p53 por lo tanto serán aquellas células qu taciones sin sentido del p53, mutaciones trans-domi ancia de mutaciones de función (por ejemplo, de ciados, 2002) que conducen a la sobre-expresi radación disminuida del p53. Los inventores con , particularmente en pacientes con un alto n resión de la proteína p53 mutada que inhiben la fun de tipo natural, tales como el p53 con mutación sin utaciones trans-dominantes en los exones del 5 inio del núcleo de enlace del ADN con domi amerización intactos, una célula determinada qu resa el p53, cuando es transducida con el p53 ad á menos probable que produzca un p53 de tipo iciente para obstaculizar los efectos de una ógena de la sobre-expresión del p53 de la funció lo transdominante or lo tanto los acientes s rente a la terapia del p53, tal como metotrexato.

En algunos otros aspectos, las células que tiene nos el alelo p53 de tipo natural y/o células que no ti nivel de bloqueo o inhibición del p53 mutado proba ponderán a una terapia genética del p53 de rable como lo pronostica el perfil del biomarcador apia genética del p53 para introducir el p53 exógen ural combinado con el efecto del vector adenovir ucción del p53 de tipo natural endógeno, aume ducción del p53 de tipo natural en la célula y supe ectos en esos casos.

Con el objeto de detectar la estructura del gen p do del tumor, es útil aislar y evaluar la muestra d a tomar en cuenta la presencia de células norm dén estar presentes en estos tejidos. Los medi iquecer una preparación de tejido para las células conocidos en la técnica. Por e em lo, el te ido ulas normales, la detección de mutaciones todavía s ra r fácilmente mediante las técnicas de elabora uencia y adaptaciones del chip que emplean la ampl R de la muestra de la secuencia de ácido nucl sencia de células normales en la muestra puede eccíón de los alelos p53 normales en las células d s difícil de distinguir. El desarrollo reciente de sist rodisección basados en la tecnología láser han sol ndemente este problema importante. Las microdis láser son una herramienta poderosa para el aislam laciones de células específicas (o células so ciones teñidas tanto de tejidos fijados en f o rustados en parafina o congelados de cultivos de c ta de un solo cromosoma dentro de una célula de m material resultante es adecuado para un amplio r ayos descendentes tales como estudios de LOH ( erozigostdad) , el análisis de expresión del gen en normales en células del tumor aún en muest tienen una mezcla de células del tumor y n mamoto y asociados, 2007; Ross, y asociados, 2007, sociados, 2007; Flotho y asociados, 2007; Fitzg ciados, 2007; Melcher y asociados, 2007; P ciados, 2007; Kawamata y asociados, 2008; Lin ciados, 2007; van Beers y asociados, 2006).

La detección de las mutaciones de punto pu rada mediante la clonación molecular del alelo p53 ( sentes en el tejido del tumor y la elaboración de se de esos alelos que utilizan técnicas bien conocid . Alternativamente, la reacción de cadena de pol de ser utilizada para amplificar las secuencias del ctamente de una preparación de ADN genómico d tumor. La secuencia de ADN de las secuencias amp onces puede ser determinada. La reacción de ca ni a. inaciones o truncaciones, como son conocidas nica.

Alternativamente, la detección del mal acoplamient utilizada para detectar mutaciones de punto en el g producto de mARN. Aunque estas técnicas son sibles que la elaboración de secuencias, son más si lizar en un número grande de tumores. Un ejemp ociación del mal acoplamiento es el método de pr ase, el cual se describe detalladamente en las publi Winter y asociados (1985); Meyers y asociados (1985 De un modo similar, las muestras de ADN pue izadas para detectar los malos acoplamientos, a trav ociación enzimática o química. Ver las publicaci ton y asociados (1988); Shenk y asociados rnativamente, los malos acoplamientos pued ectados por los cambios en la mobilidad electrofor duplexes mal acoplados en relación con los leico, cada uno de los cuales contiene una región d secuencia de un gen p53 de una mutación conoc mplo, un oligómero puede ser de aproximadam leótidos de longitud, correspondientes a una porci uencia del gen p53. En la posición que cod inoácido 175 del codón del gen p53, el oligómero alanina, en vez de una alanina del codón de tipo diante el uso de una batería de dichas muestras es alelo, los productos de amplificación PCR pue eccionados para identificar la presencia de una ntificada anteriormente en el gen p53. La hibridació estras específicas del alelo con secuencias plificadas puede ser realizada, por ejemplo, en un on. La hibridación a una muestra particular in sencia de la misma mutación en el tejido del tumor q estra específica del alelo.

La identificación de los cambios estructurales e copias de ADN de genoma amplio y los niveles de e a permitir las correlaciones entre las pérdidas, gan plif icaciones en las células del tumor con genes re- o sub-expresados en las mismas muestr ptaciones de expresión del gen que proporcionan e los niveles de mARN en los tumores han origin ptaciones específicas del exon que pueden identif ic niveles de expresión del gen, los eventos de rnativos y las alteraciones del procesamiento del mA ptaciones de oligonucleótidos también están izadas para investigar polimorfismos de un solo nu Ps) en todo el genoma para el enlace y estu ciación y estos han sido adaptados para cuantif rmalidades en el número de copias y la pérdida de heterozigosidad. Finalmente, las adaptación boración de secuencias de ADN permitirán la boración de secuencias de las re iones del cromoso ano. Como los SNPs son altamente conservados a t a la evolución y dentro de una población, el mapa e como un marcador genotípico excelente estigación. Una adaptación de SNP es una herrami a estudiar el genoma completo.

Además, la adaptación SNP puede ser utiliza udiar la Pérdida de Heterozigosidad (LOH). La LOH a de desequilibrio alélico que puede resultar de la pleta de un alelo o de un aumento en el número d un alelo en relación con el otro. Aunque otros ados en el chip (por ejemplo, la hibridación g parativa puede detectar solamente ganan inaciones genómicas), la adaptación SNP tiene la cional de detectar el número de copias neutral LOH disomía unipaternal (UPD). En la UPD, un ale mosoma completo de una célula de origen está duciendo a la nueva duplicación de otro alelo pate udios recientes basados en la tecnología de adaptac mostrado no solamente tumores sólidos (por cer gástrico, cáncer del hígado, etc.) sino tam lignidades hematológicas (ALL, MDS, CML, etc.) ti índice de LOH debido a las eliminaciones genómica anancias genómicas. En la presente invención, utili de la adaptación SNP de alta densidad para det H permite la identificación del patrón del desequilibri a determinar la presencia del alelo p53 de tipo natu sociados, 2005; Lai y asociados, 2007).

Los ejemplos de la secuencia del gen p53 actu ptaciones del polimorfismo de un solo nucleótido inc p del Gen p53 (Affymetrix, Santa Clara, CA), Ro pli-Chip (Roche Molecular Systems, Pleasanto ptaciones de Mapeo del GeneChip (Affymetrix, Sant ), Adaptaciones SNP 6.0 (Affymetrix, Santa Ciar dArrays (.Ilumina, San Diego, CA), etc. de ser determinada utilizando técnicas de elabor uencia de ADN las cuales son bien conocidas en bién se puede elaborar la secuencia del cADN por eacción de cadena de polimerasa (PCR).

Un pánel de anticuerpos monoclonales podr izados en el cual cada uno de los epítopes compren funciones del p53 son representados por un an nocional. La pérdida o perturbación de enlace icuerpo monoclonal en un pánel indicaría la alter tación de la proteína p53 y por lo tanto del gen p53 genes p53 mutantes o los productos del gen dén ser detectados en muestras del cuerpo, tal ro, materias fecales, u otros fluidos corporales, tal a y esputo. Las mismas técnicas explicadas anter a la detección de los genes p53 mutantes o produ en los tejidos pueden ser aplicadas a otras porales. ética p53 adenoviral) como se enseña en la ención .

Las evaluaciones de los niveles aumentados de la pueden ser directas, como en el uso unohistoqu ímica cuantitativa (IHC) u otros ensayos el anticuerpo (Western blot, FIA, un radioinmun A), RIP, ELISA, inmunoensayo, ensayo inmuno-radio fluoroinmunoensayo, un inmunoensayo, un mioluminiscente, un ensayo bioluminiscente ctroforesis de g e I ) , o indirectamente cuantifica scritos para estos genes (hibridación en el sitio, pr nucleasas, Northern blot o PCR, incluyendo RT-PCR) Con respecto a la inmunohistología, las células n resan el p53 en niveles bajos que proporcionan la solamente una tinción débil en un porcentaje peq ulas cuando son vistas por medio de microscopio de ección de la tinción nuclear visible en proporció ula la respuesta apoptotica de las células para la ética. Se ha postulado por los inventores que cuand defecto en alguna unión en la trayectoria dicho elá por él mismo niveles elevados del p53. Por eje ocido que cuando existe un defecto en la prote ma (por ejemplo, resultante en un p53 "m ecíf icamente en el dominio de enlace del ADN, ecto resulta en una proteína p53 disfuncional, la cu amerizar con la proteína p53 normal pero no s azar al ADN, la función de la p53 normal es bloqu ula sobre-expresa la proteína disfuncional en relació ta en las células normales en un intento vano de l el "normal" de función de la proteína p53. Ade ulas de tumor con altos niveles de p53 mutadas qu quear la función de la p53 normal también tend taja selectiva comparada con las células que isler y asociados, 2002); sin embargo, la presente i cribe que los niveles elevados de proteína p53 solo cientes para pronosticar la respuesta a la ter cer. En una modalidad particular, la d unohistoquímica de niveles elevados del p53 com los tejidos que no son de tumor normales que exp , el cual es debido a un nivel alto de proteínas muta dén bloquear la función de la p53 normal de tipo porciona una predicción integrada de una r bablemente más desfavorable a una terapia genética udablemente, está contemplado que dicha correlac dente así como en el caso de la terapia genética dicamentos los cuales con frecuencia inducen respu rés portadas por la p53.

Los inventores actuales también proponen conjunto de tumores con proteína p53 elevada po s probable que respondiera de una manera fa ualmente todas las células somáticas normales teína p53 casi en niveles no detectables (por ectables solamente mediante técnicas extrema sibles, tales como RT-PCR), se ha descubierto conjunto de tumores que se pueden definir qu teína p53 elevada, aunque el alelo p53 de tipo nat ructura del gen p53 normal esté presente. En este ción de la p53 con frecuencia es suprimida med resión elevada de los inhibidores de p53 como las m M2 y MDM4. En dichas células de tumor con prot mal elevada, los tratamientos que estimulan las re estrés de la p53 pueden alterar de manera favo porción de p53 normal a los niveles del inhibidor ultantes en la restauración de la actividad normal d respuesta favorable a la terapia. En los tumores mal alguna o en donde la p53 mutada tiene sdominantes de blo ueo como se describieron un dominio de tetramerización truncado. Esas p tantes no pueden tetramerizar con la proteína p53 ural para interferir con su enlace al ADN de modo q taciones no inhiben la función de la proteína p53 ural. Estos tumores tendrían respuestas favora amiento de p53 cuando está presente un segundo a mal o cuando la p53 normal es administrada exóge umor.

El modo más común y conveniente para detecta eles elevados" de un supresor de tumor tal como l eccionar una técnica que sea lo suficientemente a reflejar o detectar los niveles de proteína gene os en las células de cáncer, aunque todavía icientemente sensibles para detectar aquellos uñes para las células somáticas normales, las téc unohistoqu ímica ("IHC") incluyen una familia de tec detección de ejemplo aplicables que pueden ser e a la práctica en relación con la presente invención e ección IHC de la proteína p53 no discriminará gene re la proteína p53 de tipo natural y mutante o aberr el anticuerpo subyacente puede ser selec ticularmente en el caso de la presente invenció ectar la mayor parte de las proteínas p53 ya sea mu males). En estos casos, la detección concurrente uencias del gen p53 y el número de copias son co a determinar si el paciente tiene un perfil de p53 fav favorable para una respuesta a una terapia genética No obstante, la presente invención por supuesto itada de modo alguno al uso de las técnicas I ntificar y seleccionar pacientes que tienen tumo eles elevados de proteína p53, u otros defectos dan medir en la trayectoria del p53, y que la i templa el uso de cualquier técnica que discrimina células que exhiben la expresión normal y anorm dén ser empleadas para discriminar los niveles de roteína p53. Las células normales y de tumor de eje forma de líneas celulares) que son conocid eralmente tienen niveles normales y elevados de la incluyen células tales como WI-38, CCD 16 y M as de células tales como SCC61 , SCC173 y SCC179 dén obtener de proveedores comunes tales como el s .

La presente invención, como se establece anteri cribe que la terapia de p53, y en particular la noviral de p53, puede funcionar favorablement grupo de pacientes de cáncer con niveles elevados tipo natural y una ausencia de expresión de alto niv taciones de p53 con actividad de bloqueo. En contr ulas de tumor con proteína p53 elevada que blo teína p53 de tipo natural responde de manera defi terapia genética de p53. Esta clasificación que co de tipo natural pueden ser detectadas por la selecci dida de la función de la proteína p53 de tipo natural, as las funciones las cuales posee la proteí udablemente todavía tienen que ser elucidadas, por l funciones de enlace del ADN son conocidas. Por eje teína p53 enlaza al antígeno T grande del SV40 así ígeno del adenovirus E1B u otras secuencias etivo conocidas. Para un experto en la técnica, los vencionales pueden ser utilizados para detectar la capacidad de la proteína p53 para enlazar a cual os de estos antígenos u otro ADN objetivo aú sencia de la proteína p53 de tipo natural, la cual in ración de mutación en la proteína que refleja una al mutación del gen mismo la cual podría bloquear la la p53 de tipo natural probablemente a travé amerización con la p53 de tipo natural y prevenir e el ADN objetivo: ección o apoptosis del ciclo celular; sensibilid peratura; actividades de proteínas mutantes q ependientes y no relacionadas con la proteína ural. Recientemente, los resultados de estos cionales han sido integrados en una Agencia Inter a la Investigación del Cáncer (IARC) en la base d 3 a través de la red mundial en la dirección p53 a base de datos proporciona datos estructu ramientas de análisis para estudiar los patrones de la proteína p53 (Peitjean y asociados, 2007; Resnick 3). Estos métodos pueden ser empleados para id ellas mutaciones de la p53 que tienen la capac rcer efectos de bloqueo dominantes-negativos que i función normal de la p53. Cuando dichas mu sdominantes-negativas de la p53 son expresadas eles o en donde no existe la capacidad para que un rese la p53 normal, por ejemplo, sin alelo de p53 eriormente. Más particularmente, la presente inve ere al tratamiento de enfermedades hiperprolif inistrando una terapia anti-tumor tal como la ética de p53.

Enfermedad Hiperproliferativa Una enfermedad hiperproliferativa es una enf ciada con un crecimiento o multiplicación anó ulas. La enfermedad hiperproliferativa puede ermedad que se manifiesta como lesiones en un suje ÍO un tumor. El tumor puede ser un crecimiento d igno o cáncer.

El tumor de ejemplo para el cual está contem amiento de la presente invención incluye los sig cinoma de célula escamosa, carcinoma de célul noma, adenocarcinoma, linitis plástica, ins cagonoma, gastrinoma, vipoma, colangioca cinoma hepatocelular, carcinoma quístico de ad miosarcoma, mioma, miosarcoma, rabd domiosarcoma, adenoma pleomórfico, nef roblastom Brener, sarcoma sinovial, mesotelioma, disgerminom célula germinal, carcinoma embrionario, tumor del a, teratomas, quistes dermoides, corioca sonefromas, hemangioma, angioma, hemangios iosarcoma, hemangioendotelioma, hemangioendo coma de Kaposi, hemangiopericitoma, linfa angioma quístico, osteoma, osteosarcoma, osteoco stosis cartilaginoso, condroma, condrosarcoma, tu ula gigante, sarcoma de Ewing, tumores odonto entoblastoma, ameloblastoma, craniofari oastrocitomas mezclados con gliomas, epen rocitomas, glioblastomas, oligodendro gliomas, neo roepiteliomatosos, neuroblastoma, retinobl n ingiomas, neurofibroma, neurofibromatosis, neuro ronoma, neuromas, tumor de célula granular, sarcom cosa (linfoma de MALT), linfoma de célula B de rginal nodal, fungoides micosis, síndrome de Sezary, célula T periférica, linfoma de célula T angioinmuno oma de célula T similar a paniculitis subcutánea, lin ula grande anaplástica, linfoma de célula T hepato oma de célula T tipo enteropatía, linfomatoide p oma de célula grande anaplástica cutánea primaria, célula NK/T extranodal, linfoma de célula NK smacitoma, mieloma múltiple, mastocitoma, sarc ula madre, mastocitosis, leucemia de célula tocitosis de célula langerhans, sarcoma histiocítico, célula dendrítica de sarcoma de célula langerhans, célula dendrítica folicular, macroglobuline denstrom, granulomatosis linfomatoide, leucemia cemia linfocítica, leucemia aguda linfoblástica, l da linfocítica, leucemia crónica linfocítica, leucemia la célula T de adultos leucemia de la célula del da, leucemia mieloide aguda, leucemia mielogenosa cemia monocítica, leucemia monocítica y mon da, leucemia megacario blástica aguda, leucemia da y síndrome mielodisplástico, cloroma o sarcoma mielosis aguda con mielof ibrosis, leucemia de célula cemia mielomonocítica juvenil, leucemia de la cé esiva, policitemia vera, enfermedad mieloproli lofibrosis idiopática crónica, trombocitemia cemia neutrofílica crónica, leucemia eos n i c a/ síndrome hipereosinofílico, enf oproliferativa posterior al transplante, enf loproliferativa crónica, enf lodisplástica/mieloproliferativa, leucemia mielomo nica y síndrome mielodisplástico.

La enfermedad o cáncer hiperproliferativo pu ado después de su diagnosis inicial o posteri iant idos nucleicos tera éuticos otras ter cimiento de cáncer o enfermedad hiperprolif erativa r pués de un grado de respuesta clínica para la pia. La respuesta clínica puede ser, pero no está li enfermedad estable, la regresión del tumor, la nec or, ausencia de cáncer que se puede demostrar, r el tamaño o carga del tumor, bloqueo del crecimi or, reducción en el dolor asociado con el tumor, r la patología asociada con el tumor, reducción tomas asociados con el tumor, falta de progreso de rvalo libre de enfermedad aumentado, tiempo au a el progreso, inducción de remisión, reduc ástasis, o sobrevivencia aumentada para el paciente Carcinoma de célula escamosa En particular, el tumor puede ser un carcinoma d arnosa (SCCHN), más particularmente, un urrente. El SCCHN recurrente es uno de los cánce ribles. Estos tumores tienen un índice de mortali decuadas y dan como resultado una toxicidad cons con frecuencia exacerba la morbidez del tumor. L te de los pacientes no responden a terapias están revivencia media es solamente de 4 a 6 meses. T mioterapias utilizadas en el tratamiento (met platino, 5FU, y los taxanos) pueden resultar en muc ies las cuales pueden exacerbar la morbidez de que el anticuerpo monoclonal Erbitux® no omatitis, puede producir erupciones en la piel y aum etos laterales de necrosis por radiación.

Además de los perfiles de seguridad deficientes amientos convencionales, las respuestas son gene corta duración y la necesidad de terapias adicionales versal. De ahí que, el SCCHN recurrente re ramente una condición médica que extrema las nec cumplidas que requieren terapias adi ferentemente con a entes ue no roducen toxicida 17,524; 6,143,290; 6,410,010; y 6,511,847, la Soli ente Norteamericana 2002/0077313 y la Solicitud de rteamericana 2002/0006914 describen cada una a el tratamiento de pacientes con p53, y las cu uentran incorporadas a la presente descripció erencia.

Está contemplada la administración regional, témica (junto con loco-regional) de las construcci resión a pacientes. Está propuesto que el porcionará el beneficio clínico, definido ampliamen lquiera de los siguientes: reducción del tamaño d ario, reducción de la ocurrencia o tamaño de me ucción o detención del crecimiento del tumor, indu remisión, aumento de la duración antes de la rec ucción del dolor asociado con el tumor, inhibició isión de células del tumor, exterminio de las cél or a o tosis inducida en una célula de tumor red go de procesos celulares que conducen a efectos an entendimiento de la naturaleza de estos procesos e a interpretar los tipos de respuestas clínicas ervadas después del tratamiento con Advexin®.

El Advexin® es uno de los primeros agentes ant induce la senectud celular como un mecanismo ión. La inducción de la senectud celular da como r "detención del ciclo celular permanente" y se pués del restauramiento transitorio de la actividad d ores con el p53 desactivado. Clínicamente, la induc esto del ciclo celular permanente estaría asociad abilización del crecimiento del tumor en vez ucciones en el tamaño del tumor. Los modelos de males y ensayos clínicos en humanos han co rámente la activación del arresto/senectud del cicl pués de la terapia con Advexin®. La proteína p53 - tadores moleculares se ilustran en la figura 1.

Generalmente, todas las tres Trayectorias Tera resto del ciclo celular - Apoptosis - Anti- Angiogéne ucidas dentro de un tumor después de la restauraci ividad en la proteína p53. Las células individuales pueden activar ya sea la detención/senectud del cicl rayectorias de apoptosis y los factores que determi ectoria es detonada para una célula particular ualidad no son claros. Dependiendo de cuales d canismos son inducidos predominantemente dentro ulas del tumor se determinará la naturaleza puestas clínicas observadas después de la tera exin®. Como se ha ilustrado en un diagrama en la espectro de respuestas anti-tumor se espera en un r abilización del crecimiento del tumor para comp dicación del tumor, incluyen una enf able/senectud (figura 3) y la reducción del tumor/a puestas relevantes clínicamente asociadas revivencia aumentada (Lara y asociados, 2008). ciados (2008) reportaron recientemente los result s ensayos clínicos aleatorizados, del Grupo Contr cología del Suroeste que comprenden 984 pacie cer de pulmón indicando que el control del crecimi or (TGC) definido por CR, PR o la Enfermedad ron significativamente superiores a las definiciones vencionales en el pronóstico de la sobrevivencia. do similar, Choi y colegas (2007) demostraron ucción del >10% en el tamaño de su tumor por tor putarizada (CT) estaba altamente correlacionado puesta del tumor por medio de tomografía de em itrones (PET) y fue un predictor más sensible del sobrevivencia que los criterios de respuesta estánd ores estromales gastrointestinales tratados con oi, 2007; Benjamín, 2007).

Genes Terapéuticos En ciertas modalidades de la presente inven porciona un método para la administración de una ética de p53 a un paciente, una terapia que no es ética de p53 y una segunda terapia anti-tumor basa fil del biomarcador de p53 del paciente. El métod izar ácidos nucleicos terapéuticos en ciertos aspect ticular el gen p53 en la terapia genética p53. Ácidos Nucleicos Terapéuticos Un "ácido nucleico terapéutico" aquí se define ere a un ácido nucleico el cual puede ser administr eto para el propósito de tratamiento o prevenció ermedad. El ácido nucleico de la presente descri el cual es conocido o se sospecha que es de benefi amiento de una enfermedad hiperproliferativa. El b péutico puede surgir, por ejemplo, como un resulta ración de la expresión de un gen o genes particular mo, que comprende una base de nucleotidos. La leótidos incluye, por ejemplo, una base de midina que ocurre de manera natural encontrada en r ejemplo, una adenina "A" una guanina "G", una timi citocina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, u o una C). El término "ácido nucleico" compre minos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno género del término "ácido nucleico". El gonucleótido" se refiere a una molécula d oximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleotidos longitud. El término "polinucleótido" se refiere a nos una molécula mayor de aproximadamente 100 b leótidos de longitud.

En ciertas modalidades, un "gen" se refiere a leico que es transcrito. En ciertos aspectos, el gen uencias regulatorias comprendidas en la transcri ducción del mensa e. En modalidades articulares leico más pequeños diseñados pueden expresar, o adaptados para expresar proteínas, polipéptidos, polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión, poli antes y/o similares.

"Aislados substancialmente lejos de otras secue ificación" significa que el gen de interés forma part ión de codificación de un segmento de ácido nucleic egmento no contiene porciones grandes de ácidos n codificación que ocurren de manera natural, tale mentos grandes de cromosomas u otros genes funci iones de codificación de cADN. Por supuesto, esto s ácido nucleico como ha sido originalmente aislad luye genes o regiones de codificación agregadas leico por la mano del hombre.

En modalidades particulares, el ácido nucleico ter encuentra en la forma de una "construcción de expré o nucleico. En toda esta solicitud, el término "cons En ciertas modalidades de la presente invención, leico terapéutico codifica un "gen terapéutico". Co endido por aquellos expertos en la técnica, el térm apéutico" incluye secuencias genómicas, secuen N, y segmentos pequeños de gen diseñados que e ueden ser adaptados para expresar proteínas, polip inios, péptidos, proteínas de fusión, y mutantes, t les tienen la capacidad de proporcionar un benefici n paciente que sufre de una enfermedad hiperproli ácido nucleico terapéutico que codifica un gen ter de comprender una secuencia contigua de ácido nuc oximadamente 5 a aproximadamente 20,000 leótidos, nucleósidos, o pares básicos.

Los pacientes con tumores que no son susceptib ección pueden ser tratados de acuerdo con la ención. Como una consecuencia, el tumor puede re año, o la vasculatura del tumor puede cambiar de m ertando un catéter en el sitio de la cirugía.

Purificación y Expresión de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos pueden ser purificados sob poliacrilamida, gradientes de centrifugación de cí io, cromatografía de columna o por cualesquier dios conocidos para los expertos en la técnica mplo, Sambrook y asociados, 2001, ¡ncorporad sente descripción como referencia). En ciertos asp sente invención se refiere a un ácido nucleico qu do nucleico aislado. Como se usa en la presente dés érmino "ácido nucleico aislado" se refiere a una mol do nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN o A sido aislada libre de, o de otra manera libre de, el componentes celulares o en componentes de rea o, y/o el volumen de los ácidos nucleicos genó scritos totales de una o más células. Los mét lamiento de los ácidos nucleicos or e em lo centri joradores/promotores de fuentes virales y/o de mamí ducen la expresión de los genes de interés en las sped. Los elementos diseñados para optimizar la es mensajero de ARN y la capacidad de traducción ulas huésped también pueden ser incluidos. Los ma selección de fármacos pueden ser incorporad ablecer clones permanentes, y de células estables.

Los vectores virales son sistemas de e arióticos seleccionados. Incluidos se encuent novirus, virus asociados con adeno, retrovirus, herp tivirus y virus de viruela incluyendo virus de vacun papiloma incluyendo el SV40. Los vectores virales defectuosos en la duplicación, def dicionalmente o competentes en la duplicación. án contemplados los sistemas de administración luyendo vehículos basados en lípidos.

Vectores Construcciones de Ex resión tro del ácido nucleico de la célula huésped en la uencia no se encuentra de manera regular. Los luyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, males, y virus de plantas), y cromosomas artificia mplo, YACs). Un experto en la técnica estaría bien a construir un vector a través de las técnicas recom ándar (ver, por ejemplo, Sambrook y asociados, ubel y asociados, 1996, ambas incorporadas a la cripción como referencia).

El término "vector de expresión" se refiere a cualq construcción genética que comprende un ácido nucl ifica un ARN con capacidad de ser transcrito. En os, las moléculas de ARN son entonces traducidas d proteína, polipéptido o péptido. Los vectores de e dén contener una variedad de "secuencias de cont les se refieren a secuencias de ácido nucleico ne a la transcri ción osiblemente la traducción tor de expresión. El ácido nucleico apropiado pu ertado en un vector de expresión por medio de téc -clonación estándar. La manipulación de estos vec n conocida en la técnica. Los ejemplos de los sist resión de proteína de fusión son el sistema de gluta nsferasa (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de enlace de maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistem I, New Haven, CT), y el sistema 6xHis (Qiagen, Cha )¦ Todavía en otra modalidad, el sistema de e izado es uno conocido por un promotor de poli ulovirus. El gen que codifica la proteína pu nipulado por técnicas estándar con el objeto de fa nación en el vector de baculovirus. Un vector de bac ticular es el vector pBlueBac (Invitrogen, Sorren vando el vector el gen de interés es transfectado d c l l S odo tera fru i erda Sf9 or rotocolos e tivos de tejido para expresar un número grande d genos así como para un alto nivel de expresión es endógenos. Por ejemplo, el gen de albúmina de h lo ha sido expresado del HSV utilizando un promotor oizman (1983). El gen ¡acZ también ha sido expres variedad de promotores de HSV.

En toda esta solicitud, el término "construcci resión" significa que incluye cualquier tipo de cons ética que contiene un ácido nucleico que cod ducto de gen en el cual parte o todo el ácido nucl ifica la secuencia tiene la capacidad de ser trans scrito puede ser traducido en una proteína, esita serlo. Por lo tanto, en ciertas modalidad resiones incluyen tanto la transcripción de un gen ucción de ARN en el producto del gen. E alidades, la expresión solamente incluye la trans iación de polimerasa del ARN y la expresión del gen.

El término promotor será utilizado en la cripción para referirnos a un grupo de módulos de c nscripción que son agrupados alrededor del sitio de i olimerasa de ARN II. Muchas de las consideracione como están organizados los promotores se deri lisis de varios promotores vírales, incluyendo aquel unidades de transcripción de la cinasa de timidina V40 temprana. Estos estudios, aumentados por el s reciente, han mostrado que los promotore puestos de módulos funcionales separados con a uno de aproximadamente 7 a 20 bp del teniendo uno o más sitios de reconocimiento ivador de transcripción o las proteínas represoras.

Por lo menos un modulo en cada promotor funci ocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El inicio, aunque un número de promotores han ientemente que contienen elementos funcionales de o de inicio también. La separación entre los eleme motor frecuentemente son flexibles, de modo que la promotor es conservada cuando los element ertidos o movidos en relación entre ellos. En el pro separación entre los elementos del promotor pu entada a 50 bp separada antes de que comience a actividad. Dependiendo del promotor, parece mentos individuales pueden funcionar y perativamente o independientemente para act scripción.

El promotor particular que es empleado para con resión de un ácido nucleico no se considera que es mpre que sea capaz de expresar el ácido nucleic ulas objetivo. Por lo tanto, en donde una célula huma etivo, es particularmente para colocar el ácido nucl ener un alto nivel de expresión de los transgenes. E os promotores del fago bacterial o celular vir mífero los cuales son bien conocidos en la técni rar la expresión de un transgén están contemplados mpre que los niveles de expresión sean suficientes pósito determinado.

Los mejoradores fueron detectados originalmen mentos genéticos que aumentaban la transcripció motor localizado en una posición distante en la lécula de ADN. Esta capacidad para actuar so tancia grande tiene poco precedente en los estudios la regulación de la transcripción procariótica. El secuente mostró que las regiones de ADN con activ entador son organizadas más parecidas a los pro decir, que están compuestas de muchos el ividuales, y cada uno de los cuales se enlaza a un teínas de transcripción. ¡oradores con frecuencia se traslapan y son co eciendo con frecuencia que tienen una organización y similar.

Adicionalmente, cualquier combinación motor/mejorador (tal como la Base de Datos EPD motores Eucarióticos) también podría ser utilizado p operación de un transgén. El uso del sistema de e plásmico T3, T7 o SP6 es otra modalidad posi ulas eucarióticas pueden soportar la trans plásmica de ciertos promotores bacteriales porciona la polimerasa bacterial apropiada, ya s te del complejo de entrega o como una construc resión genética adicional.

Generalmente se debe incluir una señal de poliad a efectuar la poliadenilación correcta o el transc uraleza de la señal de poliadenilación no se consid crucial para la práctica exitosa de la invención, y p Una señal de inicio específica también pu uerida para la traducción eficiente y secuen ificación. Estas señales incluyen el codón de inici uencias adyacentes. Las señales de control de tr gena incluyendo el codón de inicio ATG, pueden proporcionadas. Un experto en la técnica fácilment erminar esto y proporcionar las señales necesarias, ido que el codón de inicio debe estar "en el cuadro dro de lectura de la secuencia de codificación dese gurar la traducción del inserto completo. Las señ trol de traducción exógenas y los codones de inicio ya sea naturales o sintéticos. La eficiencia de e de ser mejorada mediante la inclusión de el oradores de transcripción correctos (Bittner y as 7).

En varias modalidades de la invención, la constru resión puede comprender un virus o una cons tores fueron virus de ADN que incluyen el papovavir simio 40, virus de papiloma bovino, y polioma) (Ri 8; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgewa chwal y Sugden, 1986) y virus asociados con ade ovirus también son vehículos de transferencia ctivos (Nicolás y Rubenstein, 1988; Temin, 1986) los virus de vacuna (Ridgeway, 1988) y el virus adeno (Ridgeway, 1988). Dichos vectores pue izados para (i) transformar las líneas celulares in v propósito de expresar las proteínas de interés sformar las células in vitro o in vivo para ipéptidos terapéuticos en el escenario de terapia gen Vectores Virales Los vectores virales son un tipo de construcci resión que utilizan secuencias virales para introduc leico y posiblemente proteínas en una célula. La c ciertos virus para infectar células o entrar en las cé mplo, un inmuno-regulador o adyuvante para la su didato. Los ejemplos no limitativos de los vectores pueden ser utilizados para administrar el ácido nuc resente invención se describen más adelante.

El adenovirus es un virus de ADN de hilo d oltura. El virión consiste de un núcleo de proteína tro de un cápsido de proteína. Los viriones enlaz eptor celular específico, y son endocitosados, y el excluido de los endosomas y transportado al nú oma es de aproximadamente 36 kB, cod oximadamente 36 genes. En el núcleo, las proteí pranas inmediatas" son expresadas inicialmente, teínas inducen la expresión de las proteínas "de pranas" codificadas por las unidades de transcripci E3, y E4. Los viriones aparecen en el oximadamente un día después de la infección icos repetidos invertidos (ITRs), los cuales son el necesarios para la duplicación del ADN viral y de e regiones tempranas (E) y tardías (L) del genoma c rentes unidades de transcripción que son dividida sentación de la duplicación del ADN viral. La región 1 B) codifica proteínas responsables de la regula nscripción del genoma viral y unos cuantos genes c expresión de la región E2 (E2A y E2B) tiene como r síntesis de las proteínas de la duplicación del A as proteínas están comprendidas en la duplicación expresión tardía del gen y el cierre de células nan, 1990). Los productos de los últimos genes, in mayor parte de las proteínas cápsidas víral resadas solamente después de un procesamiento im un solo transcrito primario emitido por el promoto yor (MLP). El LP (localizado en 16.8 m ticularmente eficiente durante la última fase de la i n las construcciones que emplean el adenovirus como adenovirus recombinante frecuentemente es genera ombinación homologa entre el vector puente y e virus. Debido a la recombinación posible entre dos virales, el adenovirus de tipo natural puede ser gen e proceso. Por lo tanto, es crítico aislar un solo s de una placa individual y examinar su es ómica.

Los virus utilizados en la terapia genética puede competentes en duplicación o deficientes en duplica eración y propagación de los vectores de adenovi deficientes en duplicación dependen de una línea iliar, siendo el prototipo de 293 células, preparado ransformación de las células de riñon embrionario fragmentos de ADN Ad5; esta línea celular stitutivamente las proteínas E1 (Graham y asociados explicó anteriormente, la línea celular auxiliar parti 293.

Racher y asociados (1995) han descrito orados del cultivo de las células 293 y la propaga novirus. En un formato, los agregados naturales de cultivados inoculando células individuales en rios con silicón de 1 litro (Techne, Cambridge, tienen de 100 a 200 mi de medio. Después de agit ocidad de 40 rpm, la viabilidad de la célula es estim l tripano. En otro formato, los microportadores F by Sterlin, Stone, RU) (5 g/l) son empleados de la uiente. Un inoculo de las células, resuspendido en io, es agregado al portador (50 mi) en un nmeyer de 250 mi y se dejan estacionarios, con a sional, durante un período de 1 a 4 horas. Ento io es reemplazado por 50 mi de medio fresco y se ación. Para la producción del virus, se permite spedes in vitro y in vivo. Este grupo de virus pu enido con altos títulos, por ejemplo, 109- 1013 u adoras de placa por mi, y son altamente infecci o de vida del adenovirus no requiere la integració oma de la célula huésped. Los genes inistrados por los vectores de adenovirus son de epi lo tanto, tienen baja genotoxicidad para las sped. No se han reportado efectos secundarios udios de vacunación con el adenovirus de tipo uch y asociados, 1963; Top y asociados, ostrando su seguridad y potencial terapéutic tores de transferencia de gen in vivo.

Los vectores de adenovirus han sido utilizado resión del gen eucariótico (Levrero y asociados ez-Foix y asociados, 1992) y el desarrollo de unhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 99 udios de animales han sugerido que el ad erebro (Le Gal La Salle y asociados, 1993).

Como se manifestó anteriormente, los vectores ados en el Ad recombinante que son ya sea defectu uplicación o competentes en la duplicación. Los vec ectuosos en la duplicación típicos carecen de los ge 1? (colectivamente conocidos como E1), y contiene ar un cassette de expresión que consiste de un pro ales de procesamiento previos al mARN los cuales c expresión de un gen extraño. Estos vectores no itearse debido a que carecen de los genes E1A re a inducir la expresión del gen Ad y la duplicación d más, los genes E3 pueden ser eliminados debido a esenciales para la duplicación del virus en ivadas. Se ha reconocido una técnica en la que los defectuosos en la duplicación tienen varias caract los hacen sub-óptimos para el uso en la tera m lo la roducción de vectores defectuosos de du u ral del ciclo de vida del vector. Una ventaja de los competentes en duplicación ocurre cuando el v eñado para codificar y expresar una proteína extr eraría que dichos vectores amplificaran de ortante la síntesis de la proteína codificada in vivo c duplica el vector. Para utilizarse como agentes anti vectores virales competentes en duplicación icamente provechosos ya que duplicarían y se espa és del tumor, no justamente en las células in ialmente como en el caso con los vectores defectuos licación.

Todavía otro método es crear virus que son com la duplicación condicionalmente. Los p macéuticos Onyx recientemente reportaron un vir cer basado en adenovirus los cuales son deficie licación en células no neoplásticas, pero los cuales fenotipo de duplicación en células neoplásticas que e por lo menos dos funciones independientes: se activa la proteína supresora de tumor p53, y se a el transporte eficiente del mARN de Ad del núcleo. jue estas proteínas virales E1B y E1A están comp a forzar las células dentro de la fase-S, que se requi duplicación de un ADN de adenovirus, y debido a greso del ciclo celular del bloqueo de las proteína , los vectores de adenovirus recombinante descr x se duplicarían en células defectuosas en p53 y/o l es el caso de muchas células cancerosas, per ulas con p53 y/o pRB de tipo natural.

Otros vectores de adenovirus competentes en du en el gen para el E1B-55K reemplazado con el sa de timidina del virus de herpes simplex ( ciados, 1999a). El grupo que construyó este vector la combinación del vector más ganciclovir mostró u éutico en un cáncer de colon humano en un mo duplicación o duplicadores condicionalmente. siones de los adenovirus diseñados incluyen la capa rrupción de E1A para enlazar el p300 y/o los miembr ilia Rb, o los vectores Ad que carecen de la expr lo menos una proteína E3 seleccionada del sistente de 6.7K, gp19K, RID (también conocid 4K); RID (también conocido como 14.5K) y 14.7K. las proteínas E3 de tipo natural inhiben la infl tada por el sistema inmune y/o la apoptosis de ctadas por Ad, un adenovirus recombinante que ca o más de estas proteínas E3 puede estimular la inf células inflamatorias e inmunes dentro del tumor trat novirus y que esta respuesta inmune del huésped la destrucción del tumor así como tumores que han ástasis. Una mutación en la región E3 dañaría su ural, haciéndolas células infectadas virales susc a atacar el sistema inmune del hués ed. Estos vi tores en la presente invención. Los virus oncolíti inidos en la presente invención como que se eralmente a virus que matan tumores o células ca s frecuentemente que lo que matan las células norm s oncolíticos de ejemplo incluyen adenovirus qu resan el ADP. Estos virus se explican con detall icitud de Patente Norteamericana No. 20040213 icitud de Patente Norteamericana No. 200200287 icitud de Patente Norteamericana Serie No. 09/ a una de las cuales está incorporada específ icamen lidad a la presente descripción en esta secció icitud y en todas las otras secciones de la solici s oncolíticos de ejemplo se explican en alguna otra presente descripción. Un experto en la técnica iliarizado con otros virus oncolíticos que pue eados en las composiciones farmacéuticas y métod sente invención. ciados, 1986; Lebkowski y asociados, 1988; McLa ciados, 1988). Los detalles con respecto a la gene de los vectores rAAV se describen en las teamericanas Nos. 5,139,941 y 4,797,368, cada un les está incorporada a la presente descripció rencia.

Los retrovirus tienen promesa como vectores tera ido a su capacidad para integrar sus genes en el sped, transfiriendo una gran cantidad de material raño, infectando un amplio espectro de especies ulares y de ser empacados en líneas celulares es ller, 1992).

Con el objeto de construir un vector retroviral, leico es insertado en el genoma viral en el lugar d uencias virales para producir un virus que es defect duplicación. Con el objeto de producir los virio colas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y as 3). Los medios que contienen los retrovirus recom entonces recolectados, concentrados opcional izados para la transferencia del gen. Los rovirales pueden infectar una amplia variedad de ulas. Sin embargo, la integración y la expresión uiere la división de las células huésped (Pa ciados, 1975).

Los lentivirus son retrovirus complejos, los más de los genes retrovirales comunes gag, pol, tíenen otros genes con función regulatoria o estruct tores lentivirales son bien conocidos en la técnica ( mplo, Naldini y asociados, 1996; Zufferey y asociado mer y asociados, 1997; Patentes Norteamerican 13,516 y 5,994,136).

Los vectores lentivirales recombinantes tie acidad de infectar células ue no se dividen u rencia. Se puede tener como objetivo un virus reco a el enlace de la proteína de envoltura dentro icuerpo o un ligando particular para hacer blanc eptor de un tipo celular particular. Insertando una s luyendo una región regulatoria) de interés en el vec to con otro gen el cual codifica el ligando para un re célula objetivo específica, por ejemplo, el vector ecífico del objetivo.

El virus de herpes simplex (HSV) ha generado un siderable en el tratamiento de enfermedades del vioso debido a su tropismo para las células neuronal e vector también puede ser explotado para otros ido a su amplio rango de huéspedes. Otro factor q vector atractivo el HSV es el tamaño y la organiza oma. Debido a que el HSV es grande, la incorpor es múltiples y cassettes de expresión es inistración es menos problemática, pero en térm * úmenes necesita lograr suficiente MOI y en una n minuida para repetir las dosificaciones. Para una re i como un vector de terapia genética, cons licación de Glorioso y asociados (1995).

El HSV, designado con los subtipos 1 y 2, s ueltos que se encuentran entre los agentes infeccio uñes encontrados por los humanos, infectando mill etos humanos a nivel mundial. El genoma de ADN plejo y de dos hilos codifica docenas de di ductos genéticos, algunos de los cuales se deriva scritos empalmados. Además de los comp ructurales del virión y la envoltura, el virus codifi erosas proteínas incluyendo una proteasa, una re ribonucleótidos, una polimerasa de ADN, una prot ace ssADN, una helicasa/primasa, un ATPase, un d endiente del ADN, y otros. uiere productos funcionales de gen, más nota 4, el cual es codificado por el gen a4 (DeLuca y as 5). Los genes ?, es un grupo heterogéneo de ge ifican proteínas estructurales largamente del vir uieren la presentación de la síntesis de ADN viral resión óptima (Holland y asociados, 1980).

En línea con la complejidad del genoma, el ciclo HSV está bastante comprometido. Además del ciclo l da como resultado la síntesis de partículas del ntualmente, la muerte celular, el virus tiene la capa rar a una condición latente en la cual el gen ntenido en los ganglios neurales hasta que algo de avía no definida detone la recurrencia del ciclo lít iantes avirulentas del HSV han sido desarrollada ilmente disponibles para utilizarse en los conte pia genética (Patente Norteamericana No. 5,672,344 pearse dentro de la región central, lo cual es en su s de viruela altamente conservados. Los marcos de erta estimados en los virus de vaccinia número de 15 que ambos hilos son de codificación, el traslape ext cuadros de lectura no es común.

Al menos 25 kb pueden ser insertados en un ge s de vaccinia (Smith y Moss, 1983). Los vect cinia prototípicos contienen transgenes insertados gen de cinasa de timidina viral por medio ombinación homologa. Los vectores son seleccion e de un fenotipo-tk. La inclusión de la secuencia l ucir del virus de encefalomiocarditis, el nivel de e más alto que el de los vectores convencionales, acu los transgenes en un 10% o más de la proteína de l ctada en 24 horas (Elroy-Stein y asociados, 1989).

Un ácido nucleico para ser administrado puede ser tro de un virus infeccioso que ha sido diseña atocitos por medio de los receptores de sialoglicopro Otro método para enviar al objetivo r ombinantes fue diseñado en el cual, se u icuerpos biotinilados contra una proteína de e oviral y contra un receptor de la célula específ icuerpos fueron acoplados por medio de compone tina utilizando estreptavidina (Roux y asociados, 1 de los anticuerpos contra el complejo princ tocompatibilidad de los antígenos de la clase I y ostraron la infección de una variedad de células son portadoras de esos antígenos de superficie s ecotropico in vitro (Roux y asociados, 1989).

Administración No Viral Las formulaciones no virales basadas en porcionan una alternativa a las terapias del ge que muchos estudios de cultivo celular han docu la transferencia del en no viral basado en lí abilidad del liposoma en presencia o ausencia de p suero. La interacción entre los liposomas y las prot ro tiene un impacto dramático en las característ abilidad de los liposomas (Yang y Huang, 199 somas catiónicos atraen y se enlazan negativamen teínas de suero cargadas. Los liposomas recubie teínas de suero son ya sea disueltos o asimilados crófagos conduciendo a su remoción de la circula iente in vivo de los métodos de administración de li izan la aerosol ización , la inyección sub adérmica, intratumoral, o intracraneal para e icidad y los problemas de estabilidad asociados dos catiónicos en la circulación. La interacción somas y proteínas de plasma es grandemente resp la disparidad entre la eficiencia de la transferencia itro (Feigner y asociados, 1987) e in vivo (Zhu y as 3; Phili asociados, 1993; Solodin asociado TAP) y colesterol mejora de manera consider sferencia sistémica del gen in vivo, aproximadame es. Se dice que la formulación de DOTAP.Ií esterol forma una estructura única denominada un " paredado". Esta formulación reporta que e paredado" entre una estructura de bicapa o aginada. Las características benéficas de estos li luyen una carga positiva y negativa o p, estab oidal del colesterol, estabilidad del suero aumenta paque de ADN bi-dimensional.

La producción de formulaciones lípidas con frecu ra mediante la sonicación o extrusión en serie zclas de liposoma después de (I) la evaporación ersa (II) deshidratación-rehidratación (III) diáli ergente y (IV) hidratación de película delgada. nufacturado, las estructuras lípidas pueden ser u a enca sular com uestos ue son tóxicos (com erproliferativas.

Los liposomas son estructuras vesicular caract una bicapa de lípidos y un medio acuoso inter somas multilamelares tienen múltiples capas de aradas por medio acuoso. Se forman espontán ndo son suspendidos los lípidos en un exceso de osa. Los componentes lípidos pasan por el auto-re es de la formación de estructuras que atrapan ubles disueltos entre las bicapas de lípidos ( hhawat, 1991). Las moléculas Mpofílicas o moléc iones Mpofílicas también pueden disolverse en o a la bicapa de lípidos.

Los liposomas tienen la capacidad de llevar leicos activos biológicamente, de modo que los leicos son secuestrados completamente. El Mposom tener uno o más ácidos nucleicos y es administra oximadamente 1 :6, de aproximadamente 5 :1 oximadamente 1:5, de aproximadamente 4 :1 oximadamente 1:4, de aproximadamente 3 :1 oximadamente 1 :3, de aproximadamente 2 :1 oximadamente 1 :2, y de 1:1 . En modalidades adicion centraciones de DOTAP y/o colesterol S oximadamente 1 mM , 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM , I, 8 mM, 9 mM , 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 , 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM, 0 concentración de DOTAP y/o Colesterol pueden s oximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 m hasta aproximadamente 18 mM, de 1 mM oximadamente 16 mM, de aproximadamente 1 ml oximadamente 14 mM, de aproximadamente 1 oximadamente 12 mM, de aproximadamente 1 oximadamente 10 mM, de 1 mM a 8 mM, de 2 mM a 7 M a 6 mM de 4 mM a 5 mM. Los derivados de c mbrana o filtro, y esto puede ser llevado a cab es. Dichas técnicas son bien conocidas para los exp arte, por ejemplo, en Martin (1990). La extrusión s ar a cabo para homogeneizar la formulación o lir año. El método contemplado para la prepara somas en ciertas modalidades es el calent icación y extrusión consecutiva de los lípidos a X T os de tamaños de poro en disminución, dand ultado la formación de estructuras de liposomas peq ables. Esta preparación produce los liposomas elab complejos de liposomas solamente de un tamaño apr forme, los cuales son estructuralmente estables y p ctividad máxima.

Por ejemplo, está contemplado en ciertas modalid resente invención, que los liposomas de DOTAP:C preparados mediante los métodos de Temp ciados, 1997; (incorporado a la presente descripci o de agua a una temperatura de 50°C durante 45 mi go a una temperatura de 35°C durante 10 cionales y se deja en reposo durante la noche a tem biente. Al día siguiente, la mezcla es sonicada d utos a una temperatura de 50°C. La mezcla soni nsferida a un tubo y calentada durante 10 minuto peratura de 50°C. Esta mezcla es extruida consecuti avés de filtros de jeringa de tamaños de poro más p disminución (1 µ??, 0.45 µ??, 0.2 µ?t?, 0.1 µ???).

También está contemplado que se pueden combin ulaciones de liposoma y métodos de preparaci artir las características deseadas del liposo TAP:Colesterol. Los métodos alternos de prepara ulaciones basadas en lípidos para la administra dos nucleicos lo describen Saravolac y as cumento WO 99/18933). Los métodos están detallado paración de liposoma por los expertos en la técni ener una formulación deseada de liposoma en la ención .

Otras formulaciones para la administración de g ores conocidas para los expertos en la técnica dén ser utilizadas en la presente invención. La ención también incluye formulaciones de lipos opartículas para la administración tópica strucción de expresión de ácido nucleico. Por eje ulación de liposoma puede comprender DOTAP y co ejemplo de dicha formulación contiene una constru resión de ácido nucleico como se muestra más adela El lípido catiónico (DOTAP) puede ser mezcl esterol lípido neutral (Choi) en concentraciones equi anti Lipids). Los lípidos pulverizados mezclados pu ueltos en cloroformo de grado HPLC (Malli sterfield M . en un matraz de fondo redondo rimos como 20 mM de DOTAP:Colesterol. La pelícu ratada puede ser girada en un baño de agua peratura de 50°C durante 45 minutos y luego a 35°C minutos. Entonces se puede permitir que la mezcl el matraz cubierto con la parapelícula a tem biente durante la noche, seguida por sonicación uencia (Lab-Line, TranSonic 820/H) durante 5 minut peratura de 50°C. Después de la sonicación, la de ser transferida a un tubo y calentada durante 10 una temperatura de 50°C, seguida por la e secutiva a través de los filtros Whatman (Kent, año creciente: 1.0 pm, 0.45 m, 0.2 µ?t? y 0.1 µ?t? u ngas. Se pueden utilizar los filtros Whatman Anotop y 0.1 pm. Al momento de la extrusión, los liposomas almacenados bajo un gas de argón a una temper onces ser agregada rápidamente a la superfici ución de liposoma utilizando una punta de pipeta Pi mezcla de ADNkliposoma entonces puede ser idamente hacia arriba y hacia abajo dos veces en pipeta para formar complejos de construcción de e DOTAP.ácido nucleico-Colesterol .

Utilizando las enseñanzas de la presente descrip ocimiento de los expertos en la técnica, se pueden ebas para determinar el tamaño de partícula plejos de expresión de DOTAP:ácido nucleico-Co ejemplo, el tamaño de partícula del complejo strucción de expresión de DOTAP:ácido nucleico-C de ser determinada utilizando un analizador de ta tícula N4-Coulter (Beckman-Coulter) . Para erminación, se deben diluir 5 µ? de un complejo p ientemente en 1 mi de agua antes de la determina año de partícula. Adicionalmente, una ctos secundarios debido a la sobrecarga po acelular, dichas partículas ultrafinas (con tama dedor de 0.1 µ??) deben ser diseñadas utilizando p pueden ser degradados in vivo. Las nanop degradables de polialquil-cianoacrilato que cump os requerimientos están contempladas para utilizar sente invención, y dichas partículas pueden ser he era fácil. Los métodos que pertenecen al opartículas que pueden ser utilizadas en los mé posiciones de la presente invención incluyen la teamericana No. 6,555,376, la Patente NorteameriC 97,704, la Solicitud de Patente Norteamerica 50143336, la Solicitud de Patente Norteaméric 50196343 y la Solicitud de Patente Norteaméric 50260276, cada una de las cuales está incorpora sente descripción específicamente en su totalida rencia. La Publicación de Patente Norteaméric leico para la transformación de una organela, una c do o un organismo para utilizarse con la invención a sidera que incluyen virtualmente cualquier método p cual puede ser introducido un ácido nucleico (por N) en una organela, una célula, un tejido o un or o aquí se describe y sería conocido para un exper nica. Dichos métodos incluyen, pero no están limita inistración directa de ADN tal como por medi sfección ex vivo (Wilson y asociados, 1989; I ciados, 1989), por inyección (Patentes Nortéam . 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5, 02,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859, ca orporada a la presente descripción como ref uyendo micro-inyección (Harland y Weintraub, 1 ente Norteamericana No. 5,789,215, incorporad sente descripción como referencia); por electro tente Norteamericana No. 5,384,253, incorporad ciados, 1980; Kaneda y asociados, 1989; Kato y as 1) y la transfeccion portada por el receptor (Wu y W y Wu, 1988); mediante bombardeo de micropr cumentos WO 94/09699 y WO 95/06128; teamericanas Nos. 5,610,042; 5,322,783, 5, 50,318, 5,538,877 y 5,538,880, cada una incorpor sente descripción como referencia); mediante agita as de carburo de silicón (Kaeppler y asociados entes Norteamericanas Nos. 5,302,523 y 5,464, 76 incorporada a la presente descripción como refer lquier combinación de dichos métodos.

Sistemas de Expresión Existen numerosos sistemas de expresión que com lo menos parte o todas las composiciones d eriormente. Los sistemas basados en procari arióte pueden ser empleados para utilizarse en la ención ara roducir secuencias de ácido nucleic XBAC® 2.0 de INVITROGEN® y BACPACK™ Sist resión del Baculovirus de CLONTECH®.

Otros ejemplos de sistemas de expresión ATAGENE®'s COMPLETE CONTROL™ los Siste resión Inducibles de Mamíferos, los cuales compre eptor inducible de ecdisona sintética, o su Sist resión pET, un sistema de expresión de E. co mplo de un sistema de expresión que se puede in sigue en INVITROGEN®, el cual es el portador del EX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sis resión de mamífero que se puede inducir que ut motor de CMV de longitud completa. INVITROGEN® porciona un sistema de expresión de levadura den tema de Expresión de Pichia methanolica , el c ñado para la producción de alto nivel de p ombinantes en la levadura metilotrófica de hanolica . Un experto en la técnica conocería la f teína. Sin embargo, están contemplados métodos s ctos, por ejemplo, aquellos que comprenden el SDS inción de proteína o western blotting, seguido por el ntitativo, tal como la exploración densitométrica d ncha resultante. Un aumento específico en el niv teína recombinante, polipéptido o péptido en com el nivel en las células naturales es indicadora d resión, como lo es una abundancia relativa de la ecífica, polipéptidos o péptidos en relación co teínas producidas por la célula huésped, por ¡bles en un gel.

En algunas modalidades, la secuencia pro resada forma un cuerpo de inclusión en la célula h células huésped son Usadas, por ejemplo, med rrupción de un homogeneizador de células, lava trifugadas para separar los cuerpos de inclusión den m mbran célula del m onente de célula ucción, tales como ß-mercaptoetanol o DTT (ditiotr vuelven a multiplicar en una conformación más d o sería conocido para los expertos en la técnica.

Las secuencias de nucleótidos y proteínas para l péuticos han sido descritas anteriormente, y pue ontradas en bases de datos computarizadas conoci expertos en la técnica. Una de dichas bases de dat tro Nacional para la Información de Biotecnolo nbank y las bases de datos w. ncbi. nlm. nih . qov/) . Las regiones de codificaci os genes conocidos pueden ser amplificadas y/o ex izando las técnicas aquí descritas o por medio de c nica que sería conocida para los expertos en cionalmente, las secuencias de péptidos pue tetizadas por métodos conocidos para los experto nica, tales como la síntesis de péptidos utilizando Para matar las células cancerosas, dismi liferación, o lograr cualesquiera puntos finales licados anteriormente, se puede hacer contacto con cáncer o tumor con la terapia genética p53 pri binación con una segunda terapia anti-cáncer. E dalidades son proporcionadas en una cantidad binada para matar o inhibir la proliferación de las cerosas, o para lograr el punto final clínico luyendo el aumento de la sobrevivencia del pacien ceso puede comprender poner en contacto las cé cer o tumor con ambas modalidades al mismo tiem de ser logrado poniendo en contacto las células de or con una sola composición o formulación farma incluye ambos agentes, o poniendo en contacto las cáncer o tumor con dos composiciones difer ulaciones, al mismo tiempo, en donde una com iu e la tera ia enética rimaria la otra inclu e l rcer un efecto combinado de manera provechosa ula de cáncer o tumor. En dichos casos, está cont se pondría en contacto la célula con ambas mod tro de aproximadamente un período de 12 a 24 hor s, y más particularmente, en un perío oximadamente 6 a 12 horas entre ellas, con un ti ora de solamente aproximadamente 12 horas siend ticular. En algunas situaciones, puede ser deseable eríodo de tiempo para el tratamiento de manera im embargo, en donde transcurre un lapso de varios dí , 6, ó 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) inistraciones respectivas.

También es concebible que será deseada más inistración de cada modalidad. Varias combi dén ser empleadas, en donde la terapia genética pri y la terapia secundaria es "B": A B A B A B A B A A A B A B B B A A B/B/B/A término "terapia genética" dentro de esta solicitud p inido como la administración de un gen terapéutic do nucleico terapéutico a un paciente que necesita amiento de una enfermedad hiperproliferativa o amiento de un padecimiento el cual, si se deja si de dar como resultado una enfermedad hiperproli prendido dentro de la definición de "gen terapéu uentra un gen terapéutico "funcional equ lógicamente". Por consiguiente, las secuencias qu homología de aproximadamente el 70% a aproxima 99% de aminoácidos que son idénticas o equi cionales entre los aminoácidos del gen terapéutic uencias que son equivalentes funcionales biológi porcionando la actividad biológica de la proteína ntenida. Las clases de agentes terapéuticos incluye resores de tumor, reguladores del ciclo celular, ge ptóticos, citocinas, toxinas, factores anti-angiogé F, G-CSF, cinasa de timidina, mda7, fus, interf rferon ß, interferon ?, ADP, p53, ABL1, BLC1 , BLC6, L, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS 1 , ETS2, ETV X, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM , MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1 , P L, RE 1 , TCL3, YES, MADH4, RB1 , TP53, WT1 , TNF, BDN F, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAI 1A, desaminasa de citocina, Fab, ScFv, BRCA2, za -1 , DPC-4, FHIT, PTEN , ING1, NOEY1, NOEY2, DR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zacl, DBCCR-1 , rks-3, COX-S, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, , E1A, p300, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, G Otros ejemplos de genes terapéuticos incluyen ge ifican enzimas. Los ejemplos incluyen, pero n itados a, desaturasa ACP, una hidroxidasa A - tínesterasa , una peroxidase, una fosfotasa, una fos fosforilasa, una poligalacturonasa, una proteína tidasa, una pulanasa, una recombinasa, una trans ersa, una topoisomerasa, una xilanasa, un gen re interleucina, o una citoclna.

Los ejemplos adicionales de genes terapéuticos genes que codifican la sintetasa de carba scarbamilasa de ornitina, sintetasa de arginosu a de arginosuccinato, arginasa, fumarilacet rolasa, hidrolasa de fenilalanina, antitripsina alfa-1, sfatasa, un receptor de lipoproteína de baja d minasa porf obilinógeno, factor VIII, factor IX, ß-sin ationa, descarboxilasa de cetoácido de cadena ra úmina, deshidrogenasa de isovaleril-CoA, carboxi piontl CoA, mutasa de metil malonil CoA, deshidroge taril CoA, insulina, ß-glucosidasa, piruvato de car forilasa he ática cinasa fosforilasa descarboxilasa Los genes terapéuticos también incluyen gen ifican hormonas. Los ejemplos incluyen, pero n itados a, genes que codifican la hormona de crec lactina, lactógeno de la placenta, hormona lutei mona estimulante de folículos, gonadotropina c mona estimulante de la tiroides, enocorticotropina, angiotensina I, angiotensina orfina, hormona estimulante de ß-mela ecistoquinina, endotelina I, galanina, péptido i n trico, glucagon, insulina, lipotropinas, neur atostatina, calcitonina, péptido relacionado con el citonina, péptido relacionado con el gen de ß-cal ercalcemia del factor de malignidad, proteína reí la hormona paratiroides, péptido similar al gl creastatina, péptido pancreático, péptido YY, retina, péptido intestinal vasoactivo, oxitocina, vaso m t rfin mida do. Las terapias inmunes anti-cáncer son bien cono écnica, por ejemplo, y con mayor detalle en la Solici umentos WO0333029, WO0208436, WO02311 0285287, cada uno de los cuales está inc ecíf icamente en su totalidad a la presente descripci rencia.

Todavía otros genes terapéuticos son aquell ifican moléculas inhibitorias, tales como anti isentido, ribozimas, siARN y anticuerpos de una sola has moléculas pueden ser utilizadas provechosame ibir los genes hiperproliferativos, tales como on uctores de proliferación celular, y factores pro-angio Ácidos Nucleicos que Codifican Supresores de Un "supresor de tumor" se refiere a un polipépti ndo está presente en una célula, reduce la tumorege lignidad, y fenotipo hiperproliferativo de la célu uencias de ácido nucleico ue codifican las secue sped específica.

Los "genes supresores de tumor" generalmente inen y se refieren a secuencias de ácido nucle ucen la tumoregenicidad , malignidad, y erproliferativo de las células. Por lo tanto, la a tación o interrupción de la expresión normal del gen tumor en una célula de otra manera sana au babilidad de, o da como resultado, que la célula \o dición neoplástica. Por el contrario, cuando un gen roteína supresora de tumor funcional está presente ula, su presencia suprime la tumoregenicidad, mali otipo hiperproliferati vo de la célula huésped. Los los ácidos nucleicos supresores de tumor dentro inición incluyen, pero no están limitados a, APC, CY KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73 Uteroglobina, Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, C, DPC4, MADR2/JV18, FH IT, M EN 1 , MEN2, MTS presente descripción como referencia. Esta base d á específicamente incorporada en la presente des o referencia dentro de ésta y todas las otras secci presente solicitud. Los ácidos nucleicos que codif es supresores de tumor, como se explicaron anteri uyen genes supresores de tumor, o ácidos n ivados de los mismos (por ejemplo, cADNs, cARNs, subsecuencias de los mismos que codifican fra ivos de las secuencias de aminoácidos supresoras pectivas), así como vectores que comprende uencias. Un experto en la técnica estaría familiariz genes supresores de tumor que pueden ser aplicad sente invención. Ácidos Nucleicos que Codifican Anticuerpos a Cadena En ciertas modalidades de la presente invención, leico de las composiciones farmacéuticas y aparat re otras células como portadores intercelulare cuencia de aminoácidos de citocinas" se refier ipéptido que, cuando está presente en una célula, o o todo de la función de la citocina. Las secuen o nucleico que codifican las secuencias de aminoá cina incluyen tanto secuencias de ácido nucleico de pleta de la citocina, así como secuencias que no gitud completa de cualquier longitud derivada uencias de longitud completa. Deberá quedar e cionalmente, como se explicó en párrafos anteriores uencia incluye los codones de degeneración de la s ural o secuencias que pueden ser introducidas para referencia del codón en una célula huésped específi Los ejemplos de dichas citocinas son lin ocinas, factores de crecimiento y hormonas de poli icionales. Incluidas entre las citocinas se encuen monas de crecimiento tales como hormona de cre necrosis de tumor; substancia inhibidora de m tido asociados con gonadotropina de ratón; i ivina; factor de crecimiento del endotelio vascular; i bopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervi o NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; fac cimiento de transformación (TGFs) tales como TGF- factores de crecimiento I y II similares a i ropoyetina (EPO); factores osteoinductores; inte s como interferon-a, -ß, y -?; factores estimula onia (CSFs) tales como CSF-macrófagos ( nulocito-macróf ago-CSF (GM-CSF); y granulocito-F); interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-1a, IL-2, IL , IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, I IL-16, IL-17, IL-18, IL-24 (MDA-7), LIF, G-CSF, GM-F, EPO, ligando de equipo o FLT-3. Ácidos Nucleicos que Codifican Genes ora la sobrevivencia celular en respuesta a ímulos apoptóticos (Bakhshi y asociados, 1985; ar, 1985; Cleary y asociados, 1986; Tsujimoto y as 5; Tsujimoto y Croce, 1986). La proteína Bcl-2 con lucionariamente ahora es reconocida de su miembro ilia de proteínas relacionadas, las cuales pue egorizadas como agonistas de la muerte o antagonist rte.

Después de su descubrimiento, se ha mostrado teína Bcl-2 actúa para suprimir la muerte celular d una variedad de estímulos. También, ahora se apr ste una familia de proteínas reguladoras de la muert -2 las cuales comparten en común homologías estru e secuencia. Estos miembros diferentes de la fam trado que ya sea poseen funciones similares a la -2 (por ejemplo, BclXL, Bclw, Bcls, Mcl-1, A1, Bfl-1) o - iliarizado con los genes pro-apoptóticos, y otros d es no específicamente aquí establecidos que pue icados en los métodos y composiciones de la ención .

Los ácidos nucleicos que codifican las secuen inoácidos de genes pro-apoptóticos incluyen gen ptóticos, o ácidos nucleicos derivados de los mis mplo, cADNs, cARNs, mARNs, y subsecuencias mos que codifican fragmentos activos de la secu inoácidos pro-apoptótica respectiva), así como vect prenden estas secuencias. Una "secuencia de ami gen pro-apoptótico" se refiere a un polipéptído que, á presente en una célula, induce o promueve la apop Ácidos Nucleicos que Codifican los Inhibid iogénesis Los inhibidores de angiogénesis incluyen angios inoácidos. Es un dominio globular encontrado en la t del colágeno Tipo XVIII (Mulder y asociados, 19 ágeno encontrado en los vasos sanguíneos, el cor lécula paterna.

Los inhibidores de la angiogénesis también ibidores o factores pro-angiogénicos, tales como anti zimas, siARNs y anticuerpos de una sola cadena, lo describen en cualquier otra parte de este docume ulas del epitelio expresan proteínas transmembran erficie, denominadas integrinas, por medio de las c lan ellas mismas a la matriz extracelular. Esto re los nuevos vasos sanguíneos de los tumores expre grina vascular, designada como a?/ß3, que no se e los vasos sanguíneos viejos de los tejidos norm xin®, un anticuerpo monoclonal dirigido contra la i cular a?/ß3, encoge los tumores de los ratones sin d ensa os clínicos de la Fase II en los humanos, G F , el oncógeno sis, es un factor de crecimiento se oncógenos rara vez se originan de genes que c tores de crecimiento, y en la actualidad, el sis es tor de crecimiento oncogénico que ocurre de manera ocido.

Las proteínas FMS, ErbA, ErbB y neu son recept tor de crecimiento. Las mutaciones para estos re como resultado la pérdida de función que se puede ejemplo, una mutación en el punto que afecta el smembrana de la proteína receptora Neu da como r oncógeno neu. El oncógeno erbA es derivado del acelular de la hormona de la tiroides. El recept ogénico modificado se considera que compite eptor de hormona de la tiroides endógeno ocasion cimiento descontrolado.

La clase más grande de oncógenos incluye las p transducción de señal (por ejemplo, Src, Abl y Las proteínas Jun, Fos y Myc son proteínas que ctamente sus efectos en las funciones nucleare ores de transcripción.

La metodología antisentido aprovecha el hecho de os nucleicos tienden a aparearse con se mplementarias". Complementario significa qu inucleótidos son aquellos los cuales tienen la capa rearse con bases de acuerdo con las reg plementariedad de Watson-Crick estándar. Es de iñas más grandes se aparearán con bases con piri pequeñas para formar combinaciones de guanina a citocina (G:C) y adenina apareada con cualquiera d ) en el caso del ADN, o adenina apareada con uraci el caso de ARN. La inclusión de bases menos común o inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxa s en las secuencias de hibridación no interfieren reamiento.

N antisentido, pueden ser empleados para in nscripción o traducción del gen o ambos dentro de sped, ya sea in vitro o in vivo, tal como dentro de u sped, incluyendo un sujeto humano. En otra modalid sente invención, está contemplado que el siARN, ri terapias de anticuerpos de una sola cadena diri uctores particulares de proliferación celular pue izadas para prevenir la expresión del indu liferación celular, y de ahí producir beneficios clíni íente de cáncer Terapias Adicionales Basadas en Ácido Nucleic Las construcciones antisentido pueden ser diseña azarse al promotor y otras regiones de control, oñes o hasta límites de exon-intrón de un ge templado que las construcciones antisentido más luirán regiones complementarias a las uniones de intr n x n. P r l n u una m demasiados exones simplemente proband strucciones in vitro para determinar si es afectada ción celular normal o si la expresión de los cionados que tienen secuencias complementar ctadas.

Como se manifestó anteriormente, "complemen tisentido" significan secuencias de polinucleótidos Stancialmente complementarias en su longitud total pocos malos acoplamientos básicos. Por ejem uencias de quince bases de longitud pued ominadas complementarias cuando ellas tienen nuc plementarios en las posiciones trece y uralmente, las secuencias que son comple iplementarias serán secuencias las cuale pletamente complementarias a través de su longitu tienen malos acoplamientos de bases. Están conte s secuencias con grados más bajos de homolo strucciones específicas. Por ejemplo, en donde se d ón en la construcción final, el clon genómico neces do. El cADN o un polinucleótido sintetizado puede os de restricción más convenientes para la porción la construcción y, por lo tanto serían utilizados para las secuencias.

En ciertas modalidades de la presente invención, leico de las composiciones farmacéuticas y aparat ablecidos es una ribozima. Aunque las p icionalmente han sido utilizadas para catalizar lo leicos, otra clase de macromoléculas han emergi es en este esfuerzo. Las ribozimas son compl teína-ARN que disocian los ácidos nucleicos en u ecífico del sitio. Las ribozimas tienen dominios ca ecíficos que poseen actividad de endonucleasa (Kim 7; Gerlach y asociados, 1987; Forster y Symons, 19 mplo, un número grande de ribozimas acele mica.

La catálisis de la ribozima ha sido ob cipalmente como parte de reacciones de disociación ecíficas de la secuencia que comprende los ácidos n yce, 1989; Cook y asociados, 1981). Por ejemplo, la teamericana No. 5,354,855 reporta que ciertas r i dén actuar como endonucleasas con una especificid uencia mayor que en la de ribonucleasas conocidas rca a las enzimas de restricción de ADN. Por to t ibición portada por la ribozima específica de la secu xpresión del gen puede ser particularmente adecú aplicaciones terapéuticas (Scanlon y asociados ver y asociados, 1990). Recientemente, se reportó zimas promovieron cambios genéticos en algunas lí ulas a las cuales fueron aplicadas; y los genes a uyeron oncógenos H-ras, c-fos y genes de HIV. L te de este trabajo comprendió la modificación de doble hilo (dsARN) es el portador de la reducción, el proceso de pasos múltiples. Los mecanismos de v la expresión del gen posterior a la transcripción RN que parece funcionar para defender las célul cción del virus y la actividad de transposon ciados, 1998; Grishok y asociados, 2000; K ciados, 1999; Lin y Avery y asociados, 1999; Montg ciados, 1998; Sharp y Zamore, 2000; Tabara y as 9). La activación de estos mecanismos tiene como ARN complementario de dsARN maduro para la dest RNi ofrece ventajas experimentales mayores para el la función del gen. Estas ventajas incluyen una espe y alta, facilidad de movimiento en las membranas c esactivación prolongada del gen objetivo (Fire y as 8; Grishok y asociados, 2000; Ketting y asociados, 1 very y asociados, 1999; Montgomery y asociado rp y asociados, 1999; Sharp y Zamore, 2000; T lear se pueden poner como objetivos (Bosher y La 0).

La Dicer endo-ribonucleasa es conocida porque tipos de ARNs regulatorios pequeños que reg resión del gen: los ARNs pequeños de inter RNs) y los microARNs (miARNs) (Bernstein y as 1; Grishok y asociados, 2001; Hutvgner y asociado ting y asociados, 2001; Caballero y Bass, 2001) males, el siARNs disocia el mARN del objetivo bashir y asociados, 2001), mientras que la traduc RN tiene por objetivo el bloque de miARNs (Lee y as 3; Reinhart y asociados, 2000; Brennecke y as 3; Xu y asociados, 2003). Los datos recientes sugi bos el siARNs y el miARNs se incorporan tal plejos de proteínas similares casi idénticos, y erminante crítico de la destrucción del mARN c ulación de traducción es el rado de com lementand ecíficos y efectivos para suprimir la expresión de l interés. Los métodos de selección de las se etivo, por ejemplo, aquellas secuencias presentes e enes de interés a las cuales guiarán los siARN quinaria de degradación, son dirigidas para evitar se puedan interferir con la función de guía de los ntras se incluyen las secuencias que son específica o genes. Generalmente, las secuencias objetivo d aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de longitud s efectivas. Esta longitud refleja las longitudes ductos de digestión resultantes del procesamiento s largos tal y como se describió anteriormente (Mon sociados, 1998).

La elaboración de los siARNs ha sido principal és de la síntesis química directa, a través cesamiento de ARN de doble hilo más largos, a trav ersos. Los ejemplos no limitativos se proporcionan entes Norteamericanas Nos. 5,889,136, 4,415, 58,066, incorporadas expresamente a la cripción como referencia, y en la publicación de ciados (1995).

Varias modificaciones adicionales a las secuen RN han sido sugeridas con el objeto de alterar su est ejorar su efectividad. Se ha sugerido que los ARN r sintéticos complementarios tienen colgantes ieótidos (por ejemplo, 19 nucleótidos complementar eros no-complementarios) pueden producir el nt nde de supresión. Estos protocolos principalmente secuencia de dos nucleótidos de timidina (2'-deso colgantes de di-nucleótidos. Estos colgantes ieótidos con frecuencia se escriben como dT inguiríos de los nucleótidos típicos incorporados en literatura ha indicado que el uso de los colgante mica o esquemáticamente. Ambos de estos texto orporados a la presente descripción en su totalid rencia. La síntesis enzimática contemplada e rencias es por una polimerasa de ARN celular imerasa de ARN de bacteriófago (por ejemplo, T3, medio del uso y producción de la construcción de e o es conocido en la técnica. Por ejemplo, cons ente Norteamericana No. 5,795,715. Las constr templadas proporcionan plantillas que producen A tienen secuencias de nucleotidos idénticas a una po objetivo. La longitud de las secuencias \ porcionadas por estas referencias es de por lo m es, y puede ser de tantas como 400 o más b gitud. Un aspecto importante de esta referencia es ores contemplen dirigir los dsARNs más largos a Io 21 a 25mer con el complejo de nucleasa endóg vierte los dsARNs largos en siARNs in vivo. imáticamente o por medio de la síntesis cial/total. Particularmente, el ARN de un solo etizado enzimáticamente de los productos PCR ntilla de ADN particularmente de una plantilla d nada y el producto ARN es un transcrito completo d ual puede comprender cientos de nucleotidos. El do 01/36646, incorporado a la presente descripció rencia, no pone limitaciones en la manera en la etizado el siARN, siempre que el ARN pueda ser sin vitro o in vivo, utilizando procedimientos manu omáticos. Esta referencia también prevee que en la itro puede ser química o enzimática, por ejemplo, u imerasa de ARN clonada (por ejemplo, T3, T7, SP6) scripción de la plantilla de ADN endógeno (o cADN cla de ambos. Nuevamente, no se hizo distinción piedades deseables para el uso de la interferencia re el siARN sintetizado química o enzimáticamente. la polimerasa de ARN, los fragmentos de dsARN res dén ser utilizados para detectar y/o ensayar se etivo de ácido nucleico.

La Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005 orta un método que regula la expresión del gen a tr nterferencia de ARN incorporando un siARN o una s RN en una secuencia de codificación ARN de tras RN). La tARN que contiene la secuencia siARN o de ser incorporada en la construcción de expresión leico de modo que esta secuencia es empalmada d resado. La secuencia siARN o miARN puede ser tro de un intrón asociado con un transcrito de t cesado, o puede ser colocada en cualquier extr scrito de tARN.

El ácido nucleico se puede hacer por medio de una ocida para los expertos en el arte, tal como, por tesis química, producción enzimática o pr ciados (1986) y la Patente Norteamericana No. 5, a una incorporada a la presente descripció rencia. Se pueden utilizar varios mecanismos de sin onucleótidos, tales como aquellos métodos descrito entes Norteamericanas Nos. 4,659,774; 4, 41,813; 5,264,566; 4,959,463; 5,428,148; 5, 74,146; 5,602,244 cada una de las cuales está incor resente descripción como referencia.

Un ejemplo no limitativo de un ácido nucleico p imáticamente incluye ácidos nucleicos produci imas en las reacciones de amplificación tales com r, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4, ,682,195, cada una incorporada a la presente des o referencia), o la síntesis de un oligonucleótido de Patente Norteamericana No. 5,645,897, incorpora sente descripción como referencia. Un ejemplo no M un ácido nucleico producido biológicamente incluye ventiva, de diagnóstico o de establecimiento de ativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamient cáncer que puede ser utilizado en conjunto c apias, tales como el tratamiento de la presente in mioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia g unoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la cua te del tejido canceroso es removido, cortado y/o d camente. La resección del tumor se refiere a la r ca de por lo menos una parte del tumor. Ademá ección del tumor, el tratamiento por medio de cirugí irugía láser, criocirugía, electrocirugía, y cirugía co roscópicamente (cirugía de Mohs). Además, templado que la presente invención puede ser utili junto con la remoción de cánceres, pre-cánc tidades incidentales de tejido normal superfici ecciones intratumorales antes de la ciru ía al mo iables también.

Quim ioterapia Una amplia variedad de agentes quimiotera den ser utilizados de acuerdo con la presente inve ino "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos amiento del cáncer. Un "agente quimioterapéuti izado para connotar un compuesto o composición inistrado en el tratamiento del cáncer. Estos ag acos son categorizados por su modo de actividad d célula, por ejemplo, si y en que etapa afectan lar. Alternativamente, se puede caracterizar un ado en su capacidad para reticular el ADN direct a intercalarlo en el ADN, o para inducir aberraci mosomas o mitóticas afectando la síntesis de leico. La mayor parte de los agentes quimioterapéu uentran dentro de las siguientes categorías: age u ilación , antimetabolitos, antibióticos antitumor, inh a tratar la leucemia crónica, el linfoma que no gkin, la enfermedad de Hodgkin, mieloma mú ceres particulares del pecho, pulmón y ovari uyen: busulfan, clorambucil, cisplatino, ciclof oxan), dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina ( staza), y melfalan. La troglitazaona puede ser utiliz ar el cáncer en combinación con cualquiera o más ntes de alquilación, algunos de los cuales se explica lante.

Antimetabolitos Los antimetabolitos interrumpen la síntesis de . A diferencia de los agentes de alquilación, ellos ecíf icamente en el ciclo celular durante la fase S. E dos para combatir las leucemias crónicas, ademá ores del pecho, el ovario y el aparato gastrointest imetabolitos incluyen: 5-f luorouracilo (5-FU), citarabi fludarabine, gemcitabina, y metotrexato. eto del 5-FU es crear una deficiencia de timid duce a la muerte de la célula. Por lo tanto, el efect se ha encontrado en las células que se dividen rápid característica de los cánceres metastáticos.

Antibióticos Antitumor Los antibióticos antitumor tienen tanta imicrobial como citotóxica. Estos fármacos rfieren con el ADN por medio de enzimas que micamente y mitosis o la alteración de me ulares. Estos agentes no son específicos de la fase funcionan en todas las fases del ciclo celular. Por ampliamente utilizados para una variedad de cánce mpíos de los antibióticos antitumor incluyen ble tinomicina, dauno-rubicina, doxo-rubicina (Adriami -rubicina, algunos de los cuales están ilustrados co alle más adelante. Ampliamente utilizados ablecimiento clínico para el tratamiento de neoplasm ante una fase específica durante el ciclo de la cé ibidores mitóticos comprenden docetaxel, etopósido litaxel, taxol, taxotero, vinblastina, vincristina y vino Nitrosoureas Las nitrosoureas, los agentes de alquilación, inh teínas de reparación del ADN. Son utilizadas par omas que no son de Hodgkin, mieloma múltiple, m ligno, además de tumores del cerebro. Los ejemplos mustina y lomustina.

Otros Agentes Otros agentes que pueden ser utilizados acizumab (nombre de la marca Avastin®), ssa®), trastuzumab (Herceptin®) , cetuximab (Er itumumab (Vectibix®), bortezomib (Velcade evec. Además, los inhibidores de factor de crecimie ibidores de cinasa de molécula pequeña tienen utilid sente invención también. Todas las tera ias descrit léculas para tener el objetivo de destruir las cerosas. El efectuador inmune puede ser, por eje icuerpo específico de algún marcador en la superfici ula de tumor. El anticuerpo solo puede servir c ctuador de terapia o puede reclutar otras célul ímente efectuar el exterminio de las células. El an bién puede estar conjugado a una droga o imioterapéutica, radionúclido, cadena de ricina A, t era, toxina de tos ferina, etc.) y sirven únicamen ntes objetivo. Alternativamente, el efectuador pued ocito portador de una molécula de superficie que int sea directa o indirectamente, con un objetivo de c or. Varias células efectuadoras incluyen las cé tóxicas y las células NK.

La inmunoterapia, por lo tanto, podría ser utiliza te de una terapia combinada, en conjunto con la ética p53. El método general para la terapia combi ígeno asociado con tumor urinario, antígeno fetal, ti 7), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialilo de Lewis cB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminin 155. Además, el p53 mismo puede ser un obj unoterapia. Consultar la Publicación Norteaméric 5/0171045, incorporada a la presente descripció rencia.

El Factor de Necrosis del Tumor es una glicoprot ermina ciertos tipos de células de cáncer, a ducción de citocinas, activa los macrófagos y las cé otelio, promueve la producción de colágeno y cola un portador inflamatorio y también un portador de tico, y promueve el catabolismo, fiebre y sueño. ntes infecciosos ocasionan el progreso del tumor estímulo de la producción de TNF. El TNF pu tante tóxico cuando es utilizado solo en dosis efect do que los regímenes óptimos probablemente lo US cer específico, este uso de las hormonas tiene b respecto a los cánceres de pecho, próstata y en ubrimiento del útero). Los ejemplos de estas hormo régenos, anti-estrógenos, progesterona y andrógenos Las hormonas corticoesteroides son útiles amiento de algunos tipos de cáncer (linfoma, leu loma múltiple). Las hormonas corticoesteroides entar la efectividad de otros agentes de quimiote consiguiente, son utilizados frecuentemente en trat combinación. La prednisona y la dexametasona son las hormonas corticoesteroides.

Radioterapia La radioterapia, también llamada terapia de radia ratamiento del cáncer y otras enfermedades con radi ización. La radiación de ionización deposita la ene iona o destruye las células en el área que está ada dañando su material genético, y haciendo impos ático, respectivamente).

La terapia de radiación utilizada de acuerdo sente invención puede incluir, pero no está limitada rayos-?, rayos-X, y/o administración dirigida d topos a las células de tumor. También están conte s factores que dañan otras formas del ADN tal roondas e irradiación UV. Lo más probable es qu os factores efectúen un amplio rango de daño en el cursores de ADN, en la duplicación y reparación de el ensamble y mantenimiento de cromosomas. Los ra ificacion para rayos-X son en un rango de dosis di a 200 roentgens para períodos prolongados de tiemp anas), para dosis simples de 2000 a 6000 roentg gos de dosificación para los radioisótopos pijamente, y dependen de la vida media del isó istencia y tipo de la radiación emitida, y la asimilació ulas neo lásticas. ecíficos del tumor. Se pueden hacer cantidades gra os anticuerpos en el laboratorio y enlazarlos a sub iactivas (un proceso conocido como radioetiquetaci inyectados en el cuerpo, los anticuerpos ivamente las células cancerosas, las cuales son de la acción exterminadora de las células (citotóxic iación. Este método puede minimizar el riesgo de lo radiación a las células sanas.

La radioterapia de conformación utiliza la misma radioterapia, un acelerador lineal, el tratami ioterapia normal, pero los bloques de metal son c la trayectoria de los rayos-x para alterar su forma ncida con la del cáncer. Esto asegura que se admini is de radiación más alta al tumor. Las células sa lo rodean y las estructuras cercanas reciben una d a de radiación, de modo que la posibilidad de los ef sitio es reducida. Un aparato denominado un colim na máquina de exploración especial puede ser utiliz sar la posición de sus órganos internos al inicio amiento.

La radioterapia modulada de intensidad de alta re bién utiliza un colimador de hoja múltiple. Dura amiento las capas del colimador de hojas múltip idas mientras el tratamiento está siendo administra odo es probable que logre todavía una forma a cisa de los rayos del tratamiento y permite que la ioterapia sea constante en toda el área del tratamien Aunque los estudios de investigación han mostrad pia de conformación y la radioterapia de in dulada pueden reducir los efectos secundar amiento de radioterapia, es posible que formando el amiento de una manera tan precisa se podrían dét ulas microscópicas de cáncer justamente fuera del amiento que está siendo destruida. Esto significa etivo de manera precisa, y que la cabeza del pac tenida todavía en un marco hecho especialmente ibe la radioterapia. Se administran varias dosis.

La radio-cirugía estereotáctica (cuchillo gama) ebro y otros tumores no utiliza un cuchillo, sino ra ntan de una manera muy precisa de la radioterapi de cientos de ángulos diferentes. Se necesita solam ión de radioterapia, que toma de aproximadament as. Para este tratamiento usted tendrá un marco d ho especialmente adherido a su cabeza. Entonces, S abo varias exploraciones y rayos-x para encontrar cisa en donde es necesario el tratamiento. Dur ioterapia para los tumores del cerebro, el paciente y cabeza en un casco grande, el cual tiene cie foraciones en el mismo para permitir que la radi e a través de él. Los métodos relacionados perr cación ara el tratamiento de tumores en otras á bién está siendo estudiado por su efectivida sibilizar el tejido para la radiación.

Ejemplos Los siguientes ejemplos están incluidos para ios aspectos de la presente invención. Aquellos exp técnica podrán apreciar que las técnicas descritas mpíos siguientes representan técnicas y/o compo cubiertas por el inventor para que funcionen bie ctica de la presente invención, y por lo tanto pue sideradas que constituyen las modalidades preferid práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la erán, a la luz de la presente descripción, apreciar dén hacer muchos cambios en las modalidades esp cuales se describen y todavía obtener un resultado ilar sin salirse del espíritu y alcance de la nción. mplo 1 - El Tratamiento de Advexin® se Com ado en las radiaciones anteriores y se consideran q dén resectar, la quimioterapia es aceptada como un tratamiento estándar. La meta principal del tratami or recurrente es la paliación de los síntomas.

Varias quimioterapias y regímenes de mon ecular enfocados al sitio han sido utilizados en el ándar del SCCHN recurrente con resultados resum paración con el Advexin® en la tabla siguien revivencias generales medias para el Advexin® y el terapias de cuidado son similares (aproximadament meses) y exceden los índices promedio histor revivencia sin tratamiento (aproximadamente de ses). (Tarceva® Etiqueta de Producto de los Estado América, Erbitux® Etiqueta de Producto de los dos de América, 2007). la 1: Sobrevivencia General Promedio en Estu noterapía en SCCHN (Población ITT) Sobrevivencia Ge ármaco Dosis/Ciclo Promedio (me totrexato 40 - 60 mgnr IV 4.2-5.6 splatin/5FU 60- 100 mg/nr /600 - 1000 mg/nr IV 5.6-6.4 rboplatin/5FU 300 - 400 mg/nr /600 - 1000 mg/nr 5.0 IV cetaxel 100 mg/nr TV 6.6 clitaxel 135 - 175 mg/nr IV 4.4 tuximab 400 mg/nr inicialmente IV 5.8 250 mg/nr semanalmente IV loti ib 150 mg p.o. 5.8 sayos de Pivote >2xlOu - >2xlO vp/día IT 5.A: e Advexin® sayos de Pivote >2xlOu -=2x10 vp/día IT 8.5 e Advexin® iles de Biomarcador 3 Favorables De manera importante, la sobrevivencia promedio es de los pacientes tratados con Advexin® con los biomarcador p53 predictivos de la eficacia del Adv paran favorablemente con la sobrevivencia genera amientos convencionales a roximadamente de mplo 2 - El Advexin® Tiene un Perfil de Se erior Comparado con las Terapias Estándar Los datos de seguridad recopilados de mi inistraciones en más de 400 pacientes demuestra exin® es un tratamiento anti-cáncer muy bien toler yor parte de los eventos adversos son de naturale auto-limitación, y/o tiene sensibilidad para el tratam dado de soporte. El perfil de efectos secunda rente del de las quimioterapias sistémicas y los trat anticuerpo monoclonal para los cuales los eventos frecuencia pueden ser limitantes de la dosis y arrollarse potencialmente en secuelas más amenaza vida que la local, y con frecuencia, los eventos itación observados con la terapia de Advexin®. El A probado que era seguro tanto en hombres como en lo ancho de un amplio rango de edades de dosis de xi t n diferencias clínicamente im ort %) y fiebre (4.9%). Los eventos de Grado 3 ó 4 re mayor frecuencia para los pacientes de SCCHN amiento de Advexin®, independientemente de la cau dolor en el sitio de la inyección y dolor genera udio de Fase III, los eventos de Advexin® de Grad uvieron relacionados generalmente con la admini al de la inyección de Advexin® (dolor en el siti ección), y estos eventos con frecuencia fuero itantes y/o sensibles para la infiltración anestési f ¡láctica en el sitio antes de la inyección, así como e dicamentos anti-inflamatorios no esteroidales y ana se consiguen en la farmacia. La incidencia de los laboratorio del Grado 3 ó 4 para los pacientes trata exin® también fueron bajos. Un total de 49 p .9%) tratados en todos los estudios de SCCHN trata exin® reportaron un cambio de laboratorio del Gra de la línea de base. exin®. Además, como se esperaba para los pacie totrexato tratados en el estudio de SCCHN Fase ervó una incidencia más alta de eventos de labora do 3 ó 4 (39.5%) que para los pacientes trata exin® en el mismo estudio (19.2%). Estos luyeron leucopenia (12.1% de pacientes de meto tropenia (12.1%) y linfopenia (25.6%). Para los paci otrexato del estudio de la Fase III, se ob idencias más altas de estomatitis, náusea, ne estesia, leucopenia y neutropenia en relación exin®. Los grados más altos de estomatitis y ciados con la terapia de metotrexato puede rbideces compuestas del tumor que conducen milación nutricional más deficiente para estos paci s pérdida de peso corporal se observó con el paso de a los pacientes de metotrexato que para los pacie exin® tratados en el estudio de SCCHN Fase III.

HN recurrente Fase III, una muerte debida a leu atribuida al metotrexato. Además, los pacientes en metotrexato de este estudio se les permitió reducir la toxicidad, lo cual probablemente evitó una inciden de eventos adversos serios individuales para los p metotrexato.

El Advexin® administrado IT no exacerbó las toxi los agentes de quimioterapia administrados gene cetaxel, doxo-rubicina o cisplatino) o terapia de r ndo fue administrada concomitantemente para el trat "otros" tipos de tumor, incluyendo el tumor de pecho próstata, cáncer colo-rectal (CRC) localmente avanz cer de pulmón de célula no pequeña avanzado (NSC os de seguridad proporcionados para los pacien ibieron radio- o quimioterapia concurrentemente exin® demostraron que el Advexin® podría ser co n urrente o refractario. Los eventos adversos del A ron con frecuencia auto-limitantes y/o sensibles amiento anestésico local profiláctico, así como el dicamentos anti-inflamatorios no esteroidales y ana se consiguen en la farmacia. Este perfil de seguri rado contrasta con los eventos adversos si ocidos que están asociados con las terapias sisté CHN recurrente convencional que pueden de encialmente más secuelas amenazantes de la vida ntos locales, y con frecuencia auto-limitantes obs el tratamiento de Advexin®. mplo 3 - Pacientes que Responden al Advexin® Sobrevivencia Aumentada Significante Estadísti los Pacientes de SCCHN Recurrente Refractarios tamientos Aprobados La Respuesta de Control del Crecimiento del á Correlacionada con el aumento en la Sobre s terapias.

En el tratamiento de Advexin® del ensayo de pivot 1, existió un aumento significante estadísticament revivencia de los pacientes con respuestas TGC com los que no respondieron (pacientes con respuesta revivencia media de 7.6 meses contra 2.9 meses de respondieron, p = 0.0002). Estos resultados están il el análisis de Kaplan-Meier en la figura 5.

Los resultados similares fueron observados en el pivote de Advexin® T201 que fue también un nificante estadísticamente en la sobrevivencia de p respuestas al TGC comparados con los que no resp que respondieron al TGC una sobrevivencia prorn meses contra 3.6 meses de los que no respondie 269). Estos resultados se muestran en el análisis de ier en la figura 6. análisis similar de los ensa os clínicos de ivote La tabla 2 resume los resultados de estos a porciona los datos correspondientes para los p ados con metotrexato en el estudio T301 de pivote os pacientes tratados con metotrexato también most entó en la sobrevivencia en promedio para l ponden al TGC (7.5 meses) comparados con los ponden (3.8 meses) pero la diferencia no fue im adísticamente de acuerdo con el análisis de clasific istro (p = 0.1560). Estos datos indican cláram eficio de sobrevivencia significativa estad ísticame ientes quienes lograron una respuesta después de l Advexin®. Este resultado de eficacia importa ostrado con una importancia estadística alta ayos independientes, controlados aleatorios de la te exin® en la última etapa, los pacientes de urrente con opciones de tratamiento alternativas limit la 2: Correlación del Control de Crecimiento de El análisis de la correlación de la sobre entada con las respuestas del tumor definido erios Choi (2007) (reducción en el tamaño del tu %) también demostró un aumento altamente sign adístico en la sobrevivencia para los que resp parado con los que no respondieron en los ensayos pivote T301 y T201 combinados de la combina ientes ITT que comprendía 185 pacientes trata exin® (los que respondieron tienen una sobre medio de >10% de reducción del tumor 11.2 mese que no respondieron 5.1 meses, p = 0.0010) cubrimientos se muestran en el análisis de Kaplan-igura 8.

Las definiciones convencionales para la respu or (>50% reducción en el tamaño del tumor) ostraron un aumento altamente sign ucciones del tumor de >10% y >50% también ervadas para la población de ITT tratada con metotr centaje de pacientes con respuestas TGC fue sími bas poblaciones tratadas con Advexin® y met vexin® = 60.0% contra metotrexato = 53.3%). C eraba de sus mecanismos conocidos de acci porción más alta de los que respondieron al TG lación de Advexin® tuvieron la detección d ular/respuesta de senectud mientras la pobla totrexato tuvo una proporción más alta de re ptóticas con reducciones en el tamaño del tumor. De resante, los pacientes tratados con Advexi puestas apoptóticas del tumor con un resultado de ucción en el tamaño del tumor tuvieron una sobre medio notable de 41.0 meses comparados con 14. a los pacientes tratados con metotrexato con red la 3: Correlación de Repuesta del Tumo revivencia en SCCHN Recurrente - Población ITT En general, estos datos proporcionan e stancial de la eficacia tanto de Advexin® co otrexato en pacientes con SCCHN recurrent ortantes, demostrados por Lara y asociados (2007) ciados (2007), las respuestas del tumor para estos inidas por el control de crecimiento del tumor o red el tamaño del tumor >10% fueron predictores más s la sobrevivencia aumentada comparada con los crit ucción de tamaño del tumor convencionales de >50% Es importante darse cuenta de que con respect esidades médicas no cubiertas de los pacientes de úrrente, identificar agentes adicionales con efic ico ya que la falla del tratamiento con las sientes es casi universal. Las comparaciones de la tiva entre estos agentes es un tema secundario qu actar la secuencia en la cual esos agent inistrados. Los factores adicionales importantes ección de los agentes para la terapia son las tox enciales y ha sido claramente demostrado el p ri d ue el Advexin® tiene venta as com aradas licaciones importantes para guiar el tratamiento del ividual con Advexín® y metotrexato. mplo 4 - Biomarcadores Basados en el Mecani ión del Advexín® Pronostican la Eficacia del Adv ntifican que los Pacientes que es más Probable eficien del Tratamiento con Advexín® con Resp brevivencias del Tumor Aumentadas, Pero no Pro ficacia de Otros Tratamientos La Iniciativa de Ruta Crítica de la FDA y el Depa los Estados Unidos de América de Salud y Calific marcadores de Oncología de Servicios Human iado la identificación de novedosos bioma leculares y clínicos que pronostican la eficacia ter a guiar la eficacia más apropiada de nuevas te ilitar las aprobaciones de los fármacos. La insiste as iniciativas ha resultado en la identificación de los Biomarcador p53 que Pronostican la Eficacia del A exin® Fase 1 en los pacientes de SCCHN reali ortados por Clayman y asociados. (1998) y orporados posteriormente en los protocolos de ensay pivote y los planes de análisis estadístico. Los pe que predicen la eficacia del Advexin® son consiste mecanismos conocidos de la desactivación del tum ctividad del Advexin® como se describirá más adela La figura 9 ilustra dos mecanismos princip activación del tumor p53 y la elaboración de secue p53 y perfiles inmunohistoquímicos asociados c s diferentes de anormalidades de p53. La desactiva por medio de la mutación del gen está asociada uencia mutada del gen p53 que tiene como result teína p53 anormal que puede ser expresada en cualq niveles alto o bajo según sea determinado unohistoquímica (figura 10, pánel iz rnativamente, cuando es desactivado el p53 y la a ivación de los Inhibidores del p53 mdm-2 y/o lentin-Vega y asociados., 2007). Estos descubrimie o confirmados para los pacientes con SCCHN recur ensayos de pivote de Advexin®, con un 93% (p luados 27/29) que tienen secuencias del gen p53 ural que tienen también activación en cualquiera m-2 y/o mdm-4. Los perfiles del biomarcador uencias del p53 de tipo natural se encontraron q orables para la eficacia del Advexin® por Cla ciados (1998). Tal y como está ilustrado en la figu binación del p53 normal administrada por Advexin® tipo natural endógeno producido por el tumor es s a superar la inhibición de mdm-2/mdm-4.

Otro mecanismo principal de la desactivación d es a través de la mutación del gen p53 resultan dida de la función del p53. Como se muestra en la fi vasta ma oría de mutaciones del 53 >80% ocur N no será funcional ya que estos tetrámeros no azarse al ADN.

El perfil del biomarcador p53 con la secuencia p53 n bajo nivel de expresión de la proteína p53 med unohistoquímica (<50% células positivas del tu cubrió que era favorable para la eficacia del Advexin o se ilustró en la figura 14 siguiente, cuando los en un nivel bajo de expresión del p53 mutado, el A de proporcionar suficiente p53 normal para for ámeros funcionales y restaurar la supresión del tumo Perfiles del Biomarcador p53 Desfavorables cacia de Advexin®. En contraste, los perfi marcador p53 con la secuencia p53 mutada y alto resión de proteína p53 de acuerdo unohistoquímica (>50% células positivas del tum favorables para la eficacia del Advexin®. Esta obs eto "negativo-dominante" de las mutaciones del p5 I i n i o de enlace de ADN cuando son expresadas eles (>50% células de tumor positivas de acuerdo unohistoquímica).

De ahí, que el p53 normal administrado por el Adv ibido en tumores con alto nivel de expresión de la mutada en el dominio de enlace de ADN. Estos per marcador p53 "negativo-dominante" caracterizad aciones en la secuencia p53 en el dominio de en N y altos niveles de proteína p53 de acuerdo unohistología se espera que sean desfavorables acia del Advexin®.

En resumen, la presencia de configuraciones del tipo natural y la ausencia de la expresión de prot nivel de las mutaciones p53 negativas-domina era que sean predictivas de la eficacia del Advexin files del biomarcador 53 favorables desfavorab uentran en ia lista. la 4: Características de Perfiles del Biomarca orables y Desfavorables para la Eficacia del Adve Perfiles de Biomarcador p53 Tipo de Nivel de Me Proteína Proteína de p53 p53 Eficacia del Secuencia Inmunohistología Advexin de p53 de p53 Favorable Tipo Natural Negativa Normal Bajo El A invi Favorable Tipo Natural Positiva Normal Alto inhi p53 (md Favorable utada Negativa Anormal Bajo El rest fun p53 mut Desfavorable Mutada Positiva Anormal Alto El A inhi los neg do figuracion del gen p53 mediante el análisis de sec nivel de expresión de proteína determina unohistoquímica. La presencia de configuraciones de tipo natural y la ausencia de la expresión de p alto nivel de las mutaciones p53 negativas-do dijeron la eficacia del Advexin®. La figura 16 ilust files de p53 favorables y desfavorables basado uencia p53 y las evaluaciones de inmunohistoquímic Aproximadamente el 75% de los pacientes de úrrente tienen perfiles del biomarcador p53 favorab eficacia del Advexin®, mientras que el 25% tienen favorables. Tal y como se describió anteriormente asociación importante estadísticamente de la respu or con la sobrevivencia aumentada en pacientes Advexin®. Basados en los mecanismos conocido activación del tumor p53 y la eficacia del A ervada anteriormente, los inventores podrían esp pronosticaron resultados después de la ter totrexato indicando que no eran marcadores única nóstico para cualquier forma de tratamiento. Ade files moleculares de los pacientes que se benefi exin® y la terapia de metotrexato fueron enc rentes y complementarios teniendo impli ortantes para la guía de la terapia de los pacie CHN recurrente con estos agentes.

Perfiles del Biomarcador p53 para la Efica vexin® Pronostican un Control de Crecimiento de el SCCHN Recurrente. Como se muestra en la stió una correlación altamente importante estadísti re los perfiles de p53 favorables para la efic exin®, y las respuestas de TGC después del tratam exin®. Una proporción muy alta de los pacientes Advexin® con perfiles p53 favorables para la efi exin® tuvieron respuestas TGC (79%) com la 5: Perfiles de de Biomarcador p53 pa Eficacia del Advexin® en el Control de or en el Cáncer SCCHN Recurrente Los Pacientes Tratados con Advexin INT-002, T201 y T301 con Datos de Perfi Análisis Preliminar Perfil p53 Control de Crecimiento del Tu Favorable 45/57 (79%) Desfavorable 2/8 (25%) El valor p del texto exacto de Fisher = 0.004 La comparación de las condiciones de mutación d pacientes que responden al TGC para el tratam exin® y metotrexato revelaron diferencias acterísticas moleculares indicando efectos benéf rentes poblaciones de pacientes de SCCHN rec o se muestra en la Tabla 6, los pacientes que resp de metotrexato fueron asociados con el p53 ntr u los o ue tos fuer n observados ara los la 6: El Control de Crecimiento del Tumor Oc erentes Poblaciones de Pacientes Despu tamiento de Advexin® y Metotrexato (MTX) Pacientes Tratados con Advexin T301A N = 31 Condición del Gen p53 Control del Crecimiento del Tum Tipo Natural 12/14(86%) Mutado 9/17(53%) Valor p del texto exacto de Fisher— 0.0580 Pacientes Tratados con Metotrexato T301B Condición del Gen p53 Control del Crecimiento del Tur Tipo Natural 11/20 (55%) Mutado 13/15 (87%) Valor p del texto exacto de Fisher = 0.0493 Perfiles de p53 Favorables y Desfavorables cacia del Advexin® Pronostican el Benefi revivencia del Advexin® en el SCCHN Recurrente nostican la Eficacia del Metotrexato. Tal como S marcadores de datos de sobrevivencia de los ens ote T201 y T301 fueron combinados como se muest ra 18. Los análisis del biomarcador p53 de ensayo d 1 y T201 combinados revelaron una sobre entada importante estadísticamente después de la Advexin® para pacientes con perfiles p53 favorable acia de Advexin® comparados con aquellos con favorables (sobrevivencia media 8.5 contra 2.8 eba de clasificación de registro p = 0.001 cubrimientos indican que estos perfiles del biomarc dén pronosticar a los pacientes que es más probabl eficien de la terapia de Advexin®. Estos perf marcador p53 favorables y desfavorables son con los mecanismos de acción conocidos del Advexi activación del tumor p53 anteriormente descrita.

De manera importante, estos perfiles del biomarc ronostican la eficacia del metotrexato en el ensa o Advexin®.

Implicaciones de los Perfiles del Biomarcador Administración de Pacientes con SCCHN Recurre apias de Advexin® y metotrexato. Los resultados lisis del biomarcador p53 tienen implicaciones imp a la administración de pacientes con SCCHN recurr exin® y metotrexato quienes son refractarios a cis anos. Como se muestra en la figura 20, exis rencia importante estadísticamente en los result revivencia de acuerdo con el análisis de clasific i str o (p = 0.0003) para pacientes tratados con Adv totrexato basados en perfiles que fueron favor favorables para la eficacia de Advexin®.

Las sobrevivencias promedio para estas poblaci ontraron en un rango de 7.2 meses para pacien files predictivos de la eficacia de Advexin® los cuale v l m 2.7 me en totrexato sobre los perfiles p53 predictivos de la efi exin®. De ahí que, la eficacia y seguridad de I sados anteriormente soportan el uso del Advexin® tamiento de pacientes de SCCHN recurrente con per rables para la eficacia del Advexin® quien ractarios al cisplatino y taxanos. Los pacientes de úrrente con respuestas TGC después del tratami exin® tienen una sobrevivencia aumentada estadísti ortante y el perfil del biomarcador p53 predictiv acia del Advexin® están asociados con las respues alta significancia estadística. Además, los pacie files del biomarcador p53 favorables para la efi exin® tienen una sobrevivencia aumentada im adísticamente comparada con los perfiles p53 desfa respuesta al tratamiento Advexin®. Estos biomarca nostican la eficacia del metotrexato e indican exin® el metotrexato roducen el TGC una sobre a la eficacia del Advexin® muy probablem eficiarán del tratamiento de Advexin® y que de siderada una terapia alternativa para estos pacie ra 21 indica que el metotrexato es eficaz en pacie files del biomarcador p53 desfavorables para la efic exin® con una sobrevivencia aumentada im adísticamente después del metotrexato comparado apia de Advexin® para pacientes con perfil favorables para el Advexin® (sobrevivencia prom ses contra 2.7 meses; prueba de clasificación de reg 112).

Este resultado es consistente con las diferencia files moleculares p53 de los que responden al TGC exin® y el metotrexato descritos anteriormente indi pacientes que responden al metotrexato estaban a los perfiles p53 mutados y los que responden al genotipos p53 de tipo natural. En general, la respu indicados se pueden hacer y ejecutar sin experim ebida a la luz de la presente descripción. Aun posiciónes y métodos de la presente invención h critos en términos de modalidades particulares, los la técnica podrán apreciar que pueden ser a ¡aciones a las composiciones y/o métodos en los pa ecuencia de pasos del método aquí descrito sin sa cepto, espíritu y alcance de la presente invenci ecíf icamente , se podrá apreciar que ciertos agen án relacionados tanto química como fisiológicamente substituidos por agentes aquí descritos mien rarían resultados iguales o similares. Todos stitutos similares y modificaciones aparentes p ertos en la técnica se consideran dentro del anee y concepto de la presente invención definida indicaciones siguientes. ente Norteamericana No. 4 ,682,195 ente Norteamericana No. 4 ,683,202 ente Norteamericana No. 4 ,797,368 ente Norteamericana No. 4 ,816,571 ente Norteamericana No. 4 ,879,236 ente Norteamericana No. 4 ,946,778 ente Norteamericana No. 4 959,463 ente Norteamericana No. 5 139,941 ente Norteamericana No. 5 141 ,813 ente Norteamericana No. 5 264,566 ente Norteamericana No. 5 302,523 ente Norteamericana No. 5 322,783 ente Norteamericana No. 5 354,855 ente Norteamericana No. 5 384,253 ente Norteamericana No. 5, 428,148 ente Norteamericana No. 5, 464,765 ente Norteamericana No. 5, 538,877 ente Norteamericana No. 5,610,042 ente Norteamericana No. 5 645 897 ente Norteamericana No. 5 656 610 ente Norteamericana No. 5 670 488 ente Norteamericana No. 5 672 344 ente Norteamericana No. 5 677 178 ente Norteamericana No. 5 702 932 ente Norteamericana No. 5 705 629 ente Norteamericana No. 5 736 524 ente Norteamericana No. 5 747 469 ente Norteamericana No. 5 747 869 ente Norteamericana No. 5 780 448 ente Norteamericana No. 5 789 215 ente Norteamericana No. 5 795 715 ente Norteamericana No. 5 871 986 ente Norteamericana No. 5 879 703 ente Norteamericana No. 6,017,524 ente Norteamericana No. 6,069,134 ente Norteamericana No. 6,136,594 ente Norteamericana No. 6,143,290 ente Norteamericana No. 6,210,939 ente Norteamericana No. 6,296,845 ente Norteamericana No. 6,410,010 ente Norteamericana No. 6,511 ,184 ente Norteamericana No. 6,511 ,847 ente Norteamericana No. 6,555,376 ente Norteamericana No. 6,627,190 ente Norteamericana No. 6,797,704 icitud de Patente Norteamericana No. 2005/0171045 icitud de Patente Norteamericana No. 2004/0213764 icitud de Patente Norteamericana No. 2002/0077313 icitud de Patente Norteamericana No. 2002/0028785 icitud de Patente Norteamericana No. 2002/0006914 122, 1996. iris y asociados, Cáncer, 101 (10): páginas 2222 4. ubel y asociados, En: "Protocolos Actuales en lecular" (Current Protocols in Molecular Biology), Joh ons, Inc, New York, 1996. chwal y Sugden, En: "Transferencia Genética" sfer), Kucherlapati (Ed.), NY, Plenum Press, págin , 1986. hshi y asociados, Cell, 41 (3): páginas 899 a 906, 19 gonetti y asociados, Cell, 65(6): páginas 1083 a 109 terson y Roizman, J. 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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para pronosticar una respuesta f terapia genética p53 para un sujeto humano que or: (a) determinar si las células del tumor de dich iprende por lo menos un alelo p53 de tipo natural; y/ (b) determinar si las células de tumor de dich resan la proteína p53 en un nivel que es más alt resado en las células normales que no son de tu resan la proteína p53; en donde si en dichas células se encuentra que i) comprenden por lo menos un alelo p53 ural, y/o i¡) expresan un nivel de proteína p53 que no es el expresado en células normales que no son de tu resan la proteína p53, y/o iii) expresan un nivel elevado de proteína p53, caracterizado porque en dichas células del tu uentra que a) no contienen al menos un alelo p53 ural, y/o b) contienen dos alelos p53 mutantes, resan una proteína p53 mutante en niveles más altos resados por las células normales que expresan la , y dicha p53 mutante inhibe la función de la p53 ural, entonces esto es indicativo de una respuesta ha terapia. 3. El método tal y como se describe indicaciones 1 y 2, caracterizado porque dicha otra metotrexato. 4. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el paso (a) comprende una d anticuerpo de la proteína p53. 5. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el paso (a) co unohistoquímica. caracterizado porque el paso (a) comprende la ampl transcrito p53. 8. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la amplificación comprende PC R. 9. El método tal y como se describe en la reívin aracterizado porque el paso (a) comprende hibridaci o, Northern blotting o protección de nucleasa. 10. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el paso (b) comprende la ela secuencia, adaptación del gen o chips del gen. 11. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque las secuencias genómic plificadas en las células de tumor de dicho tumor. 12. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque las células de tumor son inc parafina. 16. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el crecimiento de tumor be hiperplasia prostética benigna, leucoplaquia oral, u colon, un crecimiento pre-canceroso del esófag ión benigna. 17. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado porque el tumor es cáncer. 18. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el cáncer es cáncer oral, faríngeo, cáncer nasofaríngeo, cáncer respiratorio, genital, cáncer gastrointestinal, cáncer del tejido del vioso central o periférico, un cáncer endo roendocrino o cáncer hematopoyético, glioma, s cinoma, linfoma, melanoma, fibroma, meningioma, c ebro, cáncer orofaríngeo, cáncer nasofaríngeo, cánc cer biliar, feocromocitoma, cáncer de célula d creática, tumores de Li-Fraumeni, cáncer de tiroides I . 19. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el cáncer es un carcinoma d amosa (SCCHN). 20. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque comprende además una pia anti-tumor. 21. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la segunda terapia anti-tumor pia genética. 22. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la segunda terapia anti-t mioterapia. 23. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la segunda terapia anti-t ioterapia. 24. El método tal y como se describe en la reivin 27. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el vector no viral está atrapa ículo lípido. 28. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el vehículo lípido es un liposo 29. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el vehículo es una nanopartícu 30. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado porque la terapia genética p53 es admi medio del vector viral. 31. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque el vector viral es un vector re vector adenoviral, un vector viral asociado con ad tor viral de viruela, un vector viral de polioma, u tiviral o un vector herpesiviral. 32. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado porque la terapia genética p53 es una caracterizado porque la terapia genética lo prende la inyección de la vasculatura del tumor. 36. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la terapia genética loco- prende la terapia genética regional. 37. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la terapia genética prende la administración en una cavidad o conduc a asociada con el tumor. 38. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la administración comprende aperitoneal, intrapleural, intravesicular, o intratecal. 39. El método tal y como se describe en la reivin caracterizado porque la terapia genética prende la administración en el sistema de vasculatu mbro asociado con el tumor. 40. El método tal y como se describe en la reivin revivencia aumentada del paciente. 41. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado además porque comprende los pasos de (a) determinar si las células del tumor compren los p53 de tipo natural; y de ser así, entonces (b) administrar la terapia genética p53 al sujeto. 42. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado además porque comprende los pasos d (a) determinar si las células del tumor comprende os un alelo p53 de tipo natural y si las células del t re-expresan la proteína p53; y de ser así, entonces (b) administrar al sujeto una terapia genética p53 43. El método tal y como se describe en la reivin efinido además porque comprende los pasos de: (a) determinar si las células del tumor no conti lo p53 mutante; y de ser así, entonces (b) administrar al sujeto una terapia genética p53 (a) determinar si las células del tumor sobre-exp teína p53 que no inhiben la función de la p53 de tipo e ser así, entonces (b) administrar al sujeto una terapia genética p53 46. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado además porque comprende los pasos d (a) determinar si las células del tumor sobre-e proteína p53 mutante y dicha proteína p53 muíant unción de la p53 de íipo natural; y de ser así, entonc (b) administrar al sujeto una terapia que no pia p53. 47. El método tal y como se describe en la reivin aracterizado porque comprende además los pasos d (a) deíerminar si las células del lumor no coníie enos un alelo p53 de tipo natural; y de ser así, ento (b) administrar al sujeío una terapia diferen pia p53. íente una muestra biológica que comprende las cé or. 50. Un equipo que comprende: (a) un anticuerpo o muestra p53 para detec tidad de proteína p53 en una muestra del tumor; (b) una pluralidad de muestras para determinar o una estructura del transcrito.