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MX2010006070A - Composicion de vacuna contra el cancer. - Google Patents

Composicion de vacuna contra el cancer.

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MX2010006070A
MX2010006070A MX2010006070A MX2010006070A MX2010006070A MX 2010006070 A MX2010006070 A MX 2010006070A MX 2010006070 A MX2010006070 A MX 2010006070A MX 2010006070 A MX2010006070 A MX 2010006070A MX 2010006070 A MX2010006070 A MX 2010006070A
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MX
Mexico
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peptide
hla
wtl
positive
seq
Prior art date
Application number
MX2010006070A
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English (en)
Inventor
Haruo Sugiyama
Original Assignee
Int Inst Cancer Immunology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Int Inst Cancer Immunology Inc filed Critical Int Inst Cancer Immunology Inc
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Abstract

Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al antígeno de leucocito humano (HLA)HLA-A*0206, la cual comprende un producto de proteína del gen de WTI supresor de tumor o un péptido parcial de éste.

Description

Antecedentes de la Invención El gen de tumor de Wilms WTl se aisló como un gen asociado con la tumorigénesis en tumor de Wilms, que es un tumor renal pediátrico (ver la literatura 1 no de patentes).
Este gen codifica para un factor de trascripción de zinc finger asociado con el mecanismo regulador de crecimiento celular y diferenciación, y apoptosis y desarrollo de tejido.
El gen de WTl originalmente fue clasificado como un gen supresor de tumor. Sin embargo, sobre la base de evidencias recientes mostradas en los siguientes incisos (i) a (iii): (i) alta expresión del gen de WTl de tipo salvaje en varios tumores humanos malignos y cánceres sólidos, incluyendo tumores malignos hematopoyéticos tales como la leucemia y síndromes mielodisplásicos (MDS), (ii) inhibición Jdel crecimiento de células de leucemia humana y células de cáncer sólido tratadas mediante ¡oligonucleótidos de anti-sentido de WTl, y (iii) inhibición de la promoción del crecimiento y de la diferenciación de células precursoras mielóides de ratón mediante expresión constitutiva del gen de WT1 de tipo salvaje, se sugiere que el: gen de WT1 de tipo salvaje presenta un efecto oncogénico más que un efecto supresor de tumor en varias enfermedades malignas (ver literatura de patentes 1).
I También existe una alta expresión conocida del gen de WT1 en cánceres sólidos, tales como el cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de célula germinal, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vesícula, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical y cáncer de ovario (ver literatura de patentes 2).
En general, el sistema inmunitario para la eliminación de substancias extrañas comprende la inmunidad humoral, en la cual están involucrados macrófagos, los cuales reconocen un antígeno y sirven como células presentadoras de antígeno, células auxiliadoras T, las cuales reconocen el antígeno presentado por los macrófagos y producen varias linfocinas ¡para activar otras células T, y linfocitos B, los cuales se diferencian en células productoras de anticuerpos a través de las acciones de las linfocinas; así como i inmunidad mediada por célula, en la cual linfocitos citotóxicos T (CTLs), los cuales son producidos a tra és de diferenciación en respuesta a la presentación de antígeno, atacan y destruyen células j blanco.
Actualmente, se ha considerado que la inmunidad al cáncer se basa principalmente en la inmunidad mediada por células en la cual están involucrados los CTLs. En la inmunidad al cáncer basada en CTL, las células T precursoras reconocen un antígeno de cáncer presentado en la forma de un complejo de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y el antígeno de cáncer, y de esta manera se diferencian y crecen a CTLs1, los cuales atacan y destruyen las células del cáncer. En este caso, las células de cáncer| presentan, sobre la superficie celular, un complejo del antígeno de MHC clase I y el cáncer de antígeno, el cual es el blanco de los CTLs (ver literaturas 2 a 5 no relativa a patentes). El MHC es denominado como un antígeno de leucocito humano (HLA) en seres humanos1. i Se considera que el anteriormente mencionado antígeno de cáncer, el cual es presentado por un antígeno de MHC clase I sobre las superficies de las células de cáncer, i esto es, células blanco, es un péptido de aproximadamente 8 a 12 aminoácidos producido a través del procesamiento mediado por proteasa intracelular de una proteína de antígeno i sintetizada en células de cáncer (ver las literaturas no de patentes 2 a 5). Actualmente, está en curso la búsqueda de proteínas de antígeno de varios cánceres, pero solo una cuantas i proteínas han sidp identificadas como un antígeno específico de cáncer.
El presente inventor sintetizó polipéptidos que consisten cada uno en de 7 a 30 clasifican en HLjA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. Cada clase tiene varios tipos de antígenos. El sitio de unión de antígeno de cada HLA tiene polimorfismo genético. Por ejemplo, se sabe que los HLA- A; HLA-B y HLA-C tienen 27 o más, 59 o más, y 10 o más tipos de polimorfismos (alelos), respectivamente.
Por lo tanto, ha existido el deseo de identificar un antígeno de cáncer que se una a otros tipos de HIlAs diferentes de los HLA-A*2402, HLA-A*0201 , HLA-A*3303 y HLA-A* 1 101 y que induzca una respuesta de CTL, y de esta manera aplicar inmunoterapia a un intervalo más amplio de sujetos.
Mientras tanto, los siguientes tres péptidos de WT1 modificados fueron reportados en dos documentos: el péptido WTl i87PlY (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12), el péptido WTl i26PlY (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35) (ver literatura de patente 6 para los dos péptidos anteriormente mencionados), y el péptido WTl i26P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52) (ver la literatura de patente 7).
Además, los siguientes dos péptidos fueron reportados en la argumentación escrita i para el examefi de la patente Europea no. 1 127068: el péptido de WTl i26P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39) y el péptido de WTl i26P2L&P9V (RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 75) (ver la literatura no de patente 7).
Sin embargo, nunca se ha reportado si estos péptidos modificados de WT1 sirven como antígeno d^ cáncer que se una a otros tipos de HLAs diferentes a HLA-A*2402, HLA- A* 0201, HLA-A*3303 y HLA-A* 1101 y que induzcan una respuesta de CTL.
Literatura ¡de Patente 1 : JP-A 9-104629 Literatura ¡de Patente 2 : JP-A 1 1 -035484 Literatura de Patente 3: panfleto WO 00/06602 Literatura jde Patente 4: Solicitud de Patente Japonesa no. 2006-045287 Literatura jde Patente 5: Solicitud de Patente Japonesa no. 2006-355356 Literatura de Patente 6: panfleto WO 2005/053618 Literatura ¡de Patente 7 : panfleto WO 2007/016466 Literatura ho de Patente 1 : Gessler, M. et al., Nature, vol. 343, pp. 774-778, 1990 Literatura no de Patente 2: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 709, 1993 Literatura no de Patente 3: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 719, 1993 Literatura no de Patente 4: Cell, vol. 82, p. 13, 1995 Literatura no de Patente 5: Immunol. Rev., vol. 146, p. 167, 1995 Literatura no de Patente 6: Mol. Cell. Biol., vol. 11, p. 1707, 1991 Literatura' no de Patente 7: El argumento escrito para el examen de la patente Europea no. 1127068.
Objetivos Compendio de la Invención I Problema la ser resuelto por la Invención Un objetivo de la presente invención consiste en aplicar, adicionalmente a personas positivas al HLA|-A*0206, un método para el tratamiento y/o prevención del cáncer para pacientes con tumores malignos, incluyendo leucemia, el método estando basado en un producto de proteína del gen WTl supresor de tumor (proteína de WTl) o un péptido parcial de éste (péptido de WTl).
Medios para resolver el problema El presente inventor llevó a cabo intensos estudios para lograr el objetivo anteriormente señalado. Como resultado, él encontró que el péptido de WTl i87 (SLGEQQYSV) y el péptido de WTl l26 (RMFPNAP YL) ; cada uno derivado de la proteína de WTl humana,j los cuales se sabía que inducen solamente CTLs restringidos por HLA-A*0201, sorprendentemente inducen también CTLs restringidos por HLA-A*0206. Bajo las circunstanciasj en donde solo los péptidos descritos en el panfleto WO 00/06602 eran conocidos como un péptido de WTl que inducía CTLs restringidos por HLA-A*0201, el i presente inventor j encontró que un péptido modificado del péptido de WTl i87 (también referido como un péptido de WTl is7 modificado) y un péptido modificado del péptido WTl (también referido como un péptido modificado de WTl i26) también se unen a una molécula de HLA-A*0201. Sobre la base de estos hallazgos, el presente inventor llevó a cabo intensos estudios adicionales y completó la presente invención.
A saber, laj presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) a (17). (1) Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al antígeno de leucojcito humano HLA-A*0206, la cual comprende un producto de pro teína del gen WTl supr sor de tumor o un péptido parcial de éste. (2) La ¡composición de acuerdo con el punto (1) anterior, en donde el producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor es la proteína de los siguientes (a) o (b): (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 , o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende la deleción, I sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de (a), I cualquiera de las ¡cuales es inmunogénica en personas positivas al HLA-A*0206. (3) La| composición de acuerdo con el punto (1) anterior, en donde el péptido parcial es: j El péptido de WTl ,87: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), El péptido de WTl i26: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), El péptido de WTl 187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), El péptido de WIÍ1 i87P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), El péptido de WTjl i87P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), El péptido de W^l ,26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), El péptido de WTjl ]26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), El péptido de WT )26?3?: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o El péptido de WTl i2óP9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49). (4) La| composición de acuerdo con los puntos (1) a (3) anteriores, la cual además comprende un adyuvante. (5) Uria composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, la ¡cual comprende ADN que codifica para un producto de proteína del gen de WTl supresor ¡de tumor o un péptido parcial de éste. (6) Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al células dendríticas inducidas a partir de esto y las cuales presentan el producto de proteína o un péptido parcial de ésta. (9) uJ método para el diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, el cual cpmprende: i) una etapa de detección o cuantificación de un producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de ésta, un anticuerpo contra éste o CTLs específicos de WTl en una muestra de una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa i de comparación de la cantidad de la proteína o péptido parcial de ésta, un anticuerpo en contra de esto o los CTLs específicos de WTl, con aquella en el caso en donde el cáncer no se desarrolló, o ii) una etapa de administración a un sujeto positivo al HLA-A*0206 CTLs específicos de WTl inducidos por el método mencionado anteriormente en (7) o células dendríticas inducidas por el método mencionado anteriormente en (8), y una etapa de determinar la posición o región de los CTLs o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206. (10) Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HL A- A* 0201, la cual comprende el siguiente péptido: Un péptido modificado de WTl i87: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido de WTl j26: Arg Met Phe Pro Asn Ala! Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201. (11) La composición de acuerdo con el punto (10) anterior en donde el péptido modificado es: El péptido de WTjl I87P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), El péptido de WTjl 187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), El péptido de WTl 187P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), El péptido de WTil i26PlF: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), El péptido de WT|1 i26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), El péptido de WTjl i26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o El péptido de WT¡1 i26P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49). i (12) UrJ método para el tratamiento o prevención del cáncer, el cual comprende la administración a una persona positiva al HLA-A*0206 una composición que comprende un ¡ producto de proteina del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de ésta. i (13) Un producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de ésta para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA- pro ucto e proteína e gen e WTl supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en¡ personas positivas al HLA-A*0201, para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HL A- A* 0201. (16) Uri método para el tratamiento o prevención del cáncer, el cual comprende la introducción de ARN que codifica para un producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste, dentro de células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206.¡ (17) Un ARN que codifica para un producto de proteína del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de ésta para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HL A- A* 0206.
¡ La presente invención también se relaciona con el uso de un producto de proteína del gen de WTl ¡supresor de tumor o un péptido parcial de ésta para la producción de una composición de [vacuna contra el cáncer utilizada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
La presente invención también se refiere al uso del siguiente péptido: Un péptido modificado de WT1187: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido de WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de un producto de pro teína del gen de WT1 supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201, para la producción de una composición de vacuna contra el cáncer usada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HL A-A* 0201.
Como se usa aquí "la composición de vacuna contra el cáncer" se refiere a un medicamento utilizado para la prevención o tratamiento del cáncer por medio de la inoculación o administración a un animal, incluyendo un ser humano. El "tratamiento" se refiere a, además de curar completamente en estado de enfermedad, detener el avance de la enfermedad mediante la inhibición del avance y/o agravamiento de los síntomas en algún grado aún quedándose cortos en la cura completa; o mejorando todo o parte del estado de enfermedad en una dirección hacia la cura. La "prevención" se refiere a prevenir, inhibir o retrasar el desarrollo de la enfermedad.
Los siguientes términos: células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras, CTLs específicos de WT1 , muestras, etc. derivadas de personas positivas al HLA-A*0206 o personas positivas al HLA-A*0201 se refieren a células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras, CTLs específicos de WT1 , muestras biológicas, etc., tales como sangre, las cuales son aisladas o recolectadas de personas positivas al HLA-A*0206 o personas positivas al HLA-A*0201 , respectivamente. Los CTLs específicos de WT1 derivados de personas positivas al HL A- A* 0206 o personas positivas al HLA-A*0201 también incluyen CTLs inducidos a partir de células mononucleares de sangre periférica, células dendríticas inmaduras o muestras biológicas tales como sangré, las cuales son aisladas o recolectadas a partir de personas positivas al HLA-A*0206 o personas positivas al HLA-A*0201.
Efecto de la Invención La presente invención permite la inducción in vivo e in vitro de CTLs específicos de WT1 en sujetos positivos a HLA-A*0206. Aunque los sujetos de inmunoterapia que usan una vacuna que comprende la proteína de WT1 o el péptido de WT1 han estado limitados convencionalmente a pacientes positivos al HLA-A*0201 y pacientes positivos al HLA- A*2404, la presente invención puede ampliar el rango de sujetos a pacientes positivos al HLA-A*0206. El HLA-A2, el cual es un serotipo de antígenos de HLA clase I, es el más frecuente en Caucásicos (aproximadamente 50%), y la gran mayoría tiene HLA-A*201 , en tanto que aproximadamente 4% de los Caucásicos tiene HLA-A*0206. Por otra parte, el HLA-A24 es el serotipo más frecuente en el pueblo Japonés (aproximadamente 58%), y la gran mayoría tiene HLA-A*2402. Aproximadamente 42% del pueblo Japonés tiene HLA-A2. Entre ellos, splo aproximadamente 43% tienen HLA-A*0201, y los otros tienen HLA- j A*0206 o HLA-A*0207. En otras palabras, aproximadamente 18% del pueblo Japonés tiene HLA-A*0201, y aproximadamente 17% del pueblo Japonés tiene HLA-A*0206. Por lo tanto, el hechc de que cuando menos un epitopo de CTL restringido por HLA-A*0206 fuera identificado a partir del pueblo Japonés así como también un epitopo de CTL restringido por HLA-A*0201 es significativamente útil para ampliar los sujetos de inmunoterapia de cáncer a personas positivas al HLA-A*0206. Puesto que el 14% del pueblo Chino y 9% del pueblo de Corea del Sur tienen este alelo, es posible aplicar la composición de j vacuna contra el cáncer de la presente invención para ampliar adicionalmente el| rango de sujetos.
La compojsición de vacuna contra el cáncer de la presente invención es útil para el tratamiento de cánceres que expresan WT1 tales como tumores hematopoyéticos y cánceres i sólidos en personas positivas al HLA-A*0206. La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención también es útil para la prevención del desarrollo del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206.
! I Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i87 inducidos a partir de PBMCs de un donador de sangre sano positivo al HLA-A*0206. La Figura la muestra la actividad citotóxica contra B-LCLs etiquetados con 51Cr. La Figura Ib muestra que la actividad citotóxica contra B-LCLs autólogos etiquetados con 51Cr aumenta en paralelo con la concentración del péptido de WTl i87 usando para pulsar con las PBMCs.
La Figura 2 muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i87 inducidos a partir de PBMCs de un donador de sangre sano positivo al HLA- A*0206. Las Figuras 2a y 2b muestran las respectivas actividades citotóxicas, contra B-LCLs etiquetados] con 51Cr, de CTLs obtenidos separadamente a partir de dos donadores de sangre sanos diferentes al donador de sangre de la Figura 1 a.
La Figura; 3 a muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WT1187 contra B-LCLs transformados con el gen de WT1, o B-LCLs transformados con un vector simulado. ! La Figura 3b muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl J7 contra células 0206K562, células K562, células KH88 o células JY.
La Figura|4 muestra la inhibición de la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WT1 i87 por anticuerpos de HLA clase I y/o clase II.
La Figuraj5 muestra la actividad citotóxica, contra B-LCLs etiquetados con 51Cr, de CTLs específicos de péptido de WT1126 inducidos a partir de PBMCs de un donador de un donador de sangre sano y positivo a HL A-A* 0206. í Las Figuras 6a y 6b muestran las respectivas actividades citotóxicas de CTLs específicos de péptido de WTI 126 separadamente inducidos a partir de dos diferentes donadores, contra células 0206K562, células K562, células KH88 o células JY.
La Figura^ 7 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de CTLs teñidos con el tetrámero de HLA unido al péptido de WTl i26 y el anticuerpo anti-CD8. Los CTLs han sido inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedente del donador 1 positivo al HLA-A*0201 con péptidos modificados.
La Figura 8 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 1 positivo al HLA-A*0201 con el péptido de WT1 [26P1F.
La Figura 9 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 1 positivo al HLA-A*0201 con el péptido de WT1126P2L.
La Figura 10 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de CTLs teñidos con el tetrámero de HLA unido al péptido de WT1126 y el anticuerpo anti-CD8. Los CTLs han sido inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 2 i positivo al HLA- A* 0201 con el péptido WTl i26P2L.
I La Figura 1 1 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 2 con el péptido WT1 ,26P2L.
La Figura 12 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 3 positivo a HLA-A*0206 cori péptidos de WTl i26 modificados.
La Figura^ 13 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 3 positivo a HLA-A*0206 con el péptido de WTl i26P9V.
La Figura! 14 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 4 positivo a HLA-A*0206 con péptidos de WT1 modificados.
La FigurJ 15 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes del donador 4 positivo a HLA-A*0206 con péptidos de WT1 modificados.
La Figura' 16 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes de un donador positivo a HLA-A*0201 con péptidos de WTl i87 modificados.
La Figura 17 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes de un donador positivo a HLA-A*0206 con el péptido de WT1 ,87P1F.
La Figura 18 muestra los resultados de mediciones de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación de PBMCs procedentes de un donador positivo a HLA-A*0206 con el péptido de WT1 i87P2M.
La Figura 19 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i87 modificados sobrje la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 20 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i87 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 21 muestra los resultados de la evaluación de péptidos de WTl i87 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 22 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl is7 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 23 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl j26 i modificados sobré la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 24 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i26 modificados sobré la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 25 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i26 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 26 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i26 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
I La Figura 27 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i26 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 28 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i87 modificados sobr la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 29 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WT1 ]87 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 30 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl i26 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 31 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WTl t26 modificados sobre la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
La Figura 32 muestra resultados de la evaluación de péptidos de WT1126 modificados sobré la actividad de inducción de inmunidad específica mediada por célula.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas de la Invención Mejor Modo de Llevar a la Práctica la Invención De aquí en adelante, la presente invención será ilustrada.
Los siguientes códigos serán utilizados cuando los residuos de aminoácido se abrevian en esta descripción y dibujos.
Ala o A: Residuo alanina Arg o R: Residuo arginina i Asn o N: Residuo asparragina La proteína de WTl de la presente invención puede ser un producto de gen de un factor de trascripción de de tipo zinc finger aislado como un gen causativo del tumor de Wilms, el producto de gen siendo capaz de unirse a una molécula de HLA-A*0206 y servir de esta manera cjomo un antígeno blanco de tumores malignos. Más específicamente, la i proteína de WTl ¡de la presente invención es preferiblemente la proteína de WTl humana que consiste en 44 aminoácidos (Lista de secuencias. SEQ ID NO:l) o una proteína que preferiblemente 8^ a 9 aminoácidos derivados de la proteína de WTl y que se una a una molécula del HLÁ-A*0206 y de esta manera induzca células T citotóxicas. Se prefiere de manera particular, el péptido de WTl i87 (Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val; SEQ ID NO: 2) o el péptido de WT1126 (Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu; SEQ ID NO: 3), ambos descritos en el panfleto WO 00/06602.
Un péptido modificado que comprende la deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos del péptido de WTl también puede ser utilizado como el péptido de ¡ WTl de la presénte invención en tanto éste sea inmunogénico en personas positivas al Í HLA-A*0206. Ejemplos de tal péptido modificado incluyen un péptido de WTl ]g7 modificado y un riéptido de WTl i26 modificado.
El péptido' de WTl i87 modificado es preferiblemente un péptido que comprende los mismos residuos de aminoácido (EQQYS) en las posiciones 4 a 8 de la terminación N como el péptido de WT1 ]8 los tiene en las posiciones correspondientes, y más preferiblemente un péptido que comprenda los mismos residuos de aminoácido (EQQYSV) en las posiciones} 4 a 9 de la terminación N como el péptido de WTl i87 los tiene en las i posiciones correspondientes. Dicho péptido de WT1 ]87 modificado es preferiblemente un I péptido que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:4 a 26 y 5^ a 62.
Péptido de WTl 187P1G (GLGEQQYSV; SEQ ID NO: 4) Péptido de WTl 7P1A (ALGEQQYSV; SEQ ID NO: 5) Péptido de WTl ,¿7P1V (VLGEQQYSV; SEQ ID NO: 6) Péptido de WTl ij¡7PlL (LLGEQQYSV; SEQ ID NO: 7) Péptido de WTl ,87P1I (ILGEQQYSV; SEQ ID NO: 8) Péptido de WTl ife7PlM (MLGEQQYSV; SEQ ID NO: 9) Péptido de WTl ik?Pl W (WLGEQQYSV; SEQ ID NO: 10) Péptido de WTl ikvPlF (FLGEQQYSV; SEQ ID NO: 11) Péptido de WTl ,87P1 Y (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12) Péptido de WTl 187P2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13) Péptido de WTl 187P2Q (SQGEQQYSV; SEQ ID NO: 14) Péptido de WTl ii¡7P2I (SIGEQQYSV; SEQ ID NO: 15) Péptido de WTl ,'87P2M (SMGEQQYSV; SEQ ID NO: 16) Péptido de WTl 187P3L (SLLEQQYSV; SEQ ID NO: 17) Péptido de WTl i87P3A (SLAEQQYSV; SEQ ID NO: 18) Péptido de WTl i8'7P3V (SLVEQQYSV; SEQ ID NO: 19) Péptido de WTl J7P3M (SLMEQQYSV; SEQ ID NO: 20) Péptido de WTl J7P3P (SLPEQQYSV; SEQ ID NO: 21) Péptido de WTl ,¿7P3W (SLWEQQYSV; SEQ ID NO: 22) Péptido de WTl ,87P3F (SLFEQQYSV; SEQ ID NO: 23) Péptido de WTl i8¡7P3Y (SLYEQQYSV; SEQ ID NO: 24) Péptido de WTl i87P3S (SLSEQQYSV; SEQ ID NO: 25) Péptido de WTl i¿7P3I (SLIEQQYSV; SEQ ID NO: 26) Péptido de WTl ,|7P9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53) Péptido de WTl i8! 7PlD (DLGEQQYSV; SEQ ID NO: 54) Péptido de WTl 1I7PIE (ELGEQQYSV; SEQ ID NO: 55) Péptido de WTl 187P1H (HLGEQQYSV; SEQ ID NO: 56) Péptido de WTl 1I7P I K (KLGEQQYSV; SEQ ID NO: 57) j Péptido de WTl 187P IN (NLGEQQYSV; SEQ ID NO: 58) Péptido de WTl 1Í7PIP (PLGEQQYSV; SEQ ID NO: 59) Péptido de WTl 187P1Q (QLGEQQYSV; SEQ ID NO: 60) Péptido de WTl ,|7P1R (RLGEQQYSV; SEQ ID NO: 61) Péptido de WTl 1¿7P1T (TLGEQQYSV; SEQ ID NO: 62) El péptido de WT1 ]26 modificado es preferiblemente un péptido que comprende los i mismos residuos! de aminoácido (PNAPY) en las posiciones 4 a 8 de la terminación N como el péptido ' de WTl i26 los tiene en las posiciones correspondientes. Tal péptido de WTl i26 modificado es preferiblemente un péptido que consiste en cualquiera de las siguientes secuenjcias de aminoácidos de la SEQ ID NO:27 a 52 y 63 a 75.
Péptido de WTl ,j,6PlG (GMFPNAPYL; SEQ ID NO: 27) Péptido de WTl ,j»6Pl A (AMFPNAPYL; SEQ ID NO: 28) Péptido de WTl ,26P1 V (VMFPNAPYL; SEQ ID NO: 29) Péptido de WTl 126P1L (LMFPNAPYL; SEQ ID NO: 30) Péptido de WTl II (IMFPNAPYL; SEQ ID NO: 31) Péptido de WTl ?26?1? (MMFPNAPYL; SEQ ID NO: 32) i Péptido de WTl J6P1W (WMFPNAPYL; SEQ ID NO: 33) Péptido de WTl 12'6P1F (FMFPNAPYL; SEQ ID NO: 34) Péptido de WTl J6P1 Y (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35) Péptido de WTl j^V (RVFPNAPYL; SEQ ID NO: 36) Péptido de WTl ii6P2Q (RQFPNAPYL; SEQ ID NO: 37) Péptido de WTl i26P2A (RAFPNAPYL; SEQ ID NO: 38) Péptido de WTl 126P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39) Péptido de WTl 126P2I (RIFPNAPYL; SEQ ID NO: 40) Péptido de WTl ,|6P3I (RMIPNAPYL; SEQ ID NO: 41) Péptido de WTl ,i6P3L (RMLPNAPYL; SEQ ID NO: 42) Péptido de WTl i6P3G (RMGPNAPYL; SEQ ID NO: 43) Péptido de WTl ¿6P3A (RMAPNAPYL; SEQ ID NO: 44) Péptido de WTl ij>6P3V (RMVPNAPYL; SEQ ID NO: 45) Péptido de WTl i26P3M (RMMPNAPYL; SEQ ID NO: 46) Péptido de WTl ^6P3P (RMPPNAPYL; SEQ ID NO: 47) Péptido de WTl ,26P3W (RMWPNAPYL; SEQ ID NO: 48) i Péptido de WTl Ú6?9V (RMFPNAPYV; SEQ ID NO: 49) Péptido de WTl ,[>6P9A (RMFPNAPYA; SEQ ID NO: 50) Péptido de WT1 ¿6P9I (RMFPNAPYI; SEQ ID NO: 51) Péptido de WTl i26P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52) Péptido de WTl 126P1D (DMFPNAPYL; SEQ ID NO: 63) Péptido de WTl ?26?1? (EMFPNAPYL; SEQ ID NO: 64) Péptido de WTl ¿6P1H (HMFPNAPYL; SEQ ID NO: 65) Péptido de WTl ,!26P1K (KMFPNAPYL; SEQ ID NO: 66) Péptido de WTl ^gPlN (NMFPNAPYL; SEQ ID NO: 67) Péptido de WTl 126P1P (PMFPNAPYL; SEQ ID NO: 68) Péptido de WTl J26P1Q (QMFPNAPYL; SEQ ID NO: 69) Péptido de WTl i^Pl S (SMFPNAPYL; SEQ ID NO: 70) i Péptido de WTl ?26?1? (TMFPNAPYL; SEQ ID NO: 71) Péptido de WTl ¿26P2I&P9I (RIFPNAPYI; SEQ ID NO: 72) Péptido de WTl j26P2I&P9V (RIFPNAPYV; SEQ ID NO: 73) I Péptido de WTl ,26P2L&P9I (RLFPNAPYI; SEQ ID NO: 74) Péptido de WTl , j6P2L&P9V (RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 75) Entre otros, el péptido de WTl i87 modificado es preferiblemente el péptido WTl i87PlF (SEQ ID NO: 11), el péptido WT1 I87P2M (SEQ ID NO: 16) o el péptido WTl i87P3M (SEp ID NO: 20), más preferiblemente el péptido WTl i87PlF o el péptido WTl i87P2M, y todavía más preferiblemente el péptido WTl i87P2M. El péptido WTl i26 modificado es preferiblemente el péptido WTl i26PlF (SEQ ID NO: 34), el péptido WT1 ,26P2L (SEQ ID NO: 39), el péptido WT1 ,26P3M (SEQ ID NO: 46) o el péptido WTl i26P9V (SE( ID NO: 49), más preferiblemente el péptido WT1126P2L, el péptido WTl i26P3M o l péptido WTl i26P9V, y todavía más preferiblemente el péptido WT1 ,26P9V.
El péptido WTl en la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención es preferiblemente el péptido de WTl i87, el péptido de WTl i26, el péptido de WT1 ,87P1F, el péptido de WT1187P2M, el péptido de WT1 ,87P3M, el péptido de WT1 ,26P1F, el péptido de WTl i26P2L, el péptido de WT1 ,26P3M o el péptido de WTl i26P9V. Más preferiblemente es el péptido de WTl i87, el péptido de WT1 ]26, el péptido de WTl ij¡7PlF, el péptido de WTl i87P2M, el péptido de WTl i26P2L, el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WTl i26P9V. Aún más preferido es el péptido de WTl i87, el péptido de WTl i26, el péptido de WT1 ]87P2M o el péptido de WTl i26P9V. De manera particular se prefiere el péptido de WTl j87 o el péptido de WTl i26.
Un derivado del péptido de WTl también puede ser utilizado como el péptido de WTl . Por ejemplo, el derivado del péptido de WTl i87 o WTl i26 puede formarse de una secuencia de aminoácidos de los 9 aminoácidos contiguos anteriormente mencionados y varias sustancias lunidas a las terminaciones N y/o C de ésta. Las varias sustancias pueden ser, por ejemplo, | aminoácidos, péptidos, análogos de estos, etc. Tales sustancias unidas al péptido de WTl i'87, el péptido de WTl i26 o un péptido modificado de estos se somete, por ejemplo, a tratamiento con enzimas in vivo a través de procesamiento intracelular, etc., y finalmente el péptido que consiste en los 9 aminoácidos anteriormente mencionados es producido y presentado como un complejo con una molécula de HLA-A*0206 sobre la superficie celular. Así, puede inducirse una respuesta de CTL específica de WTl en ¡ pacientes con HLA-A*0206.
El péptido de WT1 puede ser preparado mediante un método usualmente empleado en el campo técnico, tal como un método de síntesis de péptido descrito en Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academia Press Inc., New York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzén Co., Ltd. 1985; the Sequel to Development of Pharmaceuticals, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa Publishing Company, 1991 ; etc.
Como un método de tamizado para el péptido de WT1 y un péptido modificado de éste, por ejempló, un método que involucre la realización de la prueba de IFNy bajo estimulación sencilla de, con un péptido, PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) de algunos pacientes que tengan HLA-A*0206, y posteriormente seleccionado un péptido que muestre una buena respuesta, se prefiere por sencillez.
En la presente invención, polinucléotidos, tales como ADN que codifica para la proteína de WT1 ¡anteriormente mencionada o péptido de WT1 inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206, también pueden ser usados como un ingrediente activo de la composición de | vacuna contra el cáncer. A saber, mediante la inserción de un polinucléotido que codifica para la proteína de WT1 o péptido de WT1 dentro de un vector I adecuado, preferiblemente un vector de expresión, y posteriormente administrando el vector dentro de animales, incluyendo el ser humano, puede producirse inmunidad al cáncer en el cuerpo viviente. Ejemplos de los polinucléotidos incluyen ADN, ARN y similares, y ¡ se prefiere al ADN y o ARN. La secuencia base del polinucléotido puede ser determinada sobre la base de ¡la secuencia de aminoácidos de la pro teína de WT1 o péptido de WT1 inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206. El polinucléotido puede ser preparado mediaijite un método conocido de síntesis de ADN o ARN, el método PCR, etc. Tal composición jde vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, que comprende ADN que codifica para la proteína de WT1 o péptido de WT1 también es un aspecto de la presente invención. La proteína de WT1 o péptido de WT1 es preferiblemente i un péptido de WT1 , más preferiblemente el péptido de WTl j87, o el péptido de WTl i26 o i un péptido modificado de estos, y más preferiblemente el péptido de WT1 ]87, o el péptido i de WTl i26. El vector de expresión usado para insertar el ADN anteriormente mencionado i no está limitado j de manera particular. El ARN no tiene que ser insertado dentro de un vector y puede ser usado como se encuentra como un ingrediente activo de la composición.
La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención puede comprender un adyuvante. El adyuvante no está limitado en tanto, después de ser administrado conjuntamente con o de manera separada de la proteína de WT1 o del péptido de WT1 usado como un antígeno, pueda mejorar de manera no específica las respuestas inmunológicas al antígeno. Ejemplos del adyuvante incluyen adyuvantes de tipo de precipitación y adyuvantes aceitosos. Ejemplos de los adyuvantes de tipo de precipitación i incluyen al hidróxido de sodio, hidróxido de aluminio, fosfato de calcio, fosfato de aluminio, alum, PEPES y polímeros de carboxivinilo. Un adyuvante aceitoso preferible es uno que pueda formar micelas de manera que el aceite encierre una solución acuosa de un antígeno. Ejemplos específicos de éstos incluyen parafina líquida, lanolina, Freund, ! Montanide ISA- 63AVG, Montanide ISA-51, Adyuvante de Freund incompleto y adyuvante de Freund completo. Estos adyuvantes también pueden ser utilizados como una mezcla de dos o más tipos de estos, El preferido es un adyuvante aceitoso.
La cantidad de adyuvante en la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención no está limitada de manera particular en tanto que las respuestas i inmunológicas a los antígenos puedan ser mejoradas de manera no específica. La cantidad de estos puede ser seleccionada de manera adecuada dependiendo del tipo del adyuvante, etc. I La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención puede ser I administrada dej forma oral o parenteral (por ejemplo, de manera intraperitoneal, subcutánea, intracutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal, etc.). En el caso de la administración parenteral, un ingrediente activo, esto es, la proteína de WT1 o el péptido de WT1, también puede ser absorbido de manera percutánea mediante la aplicación de la composición de vacuna contra el cáncer a la piel, o mediante su fijación a la piel de un parche que contenga la composición de vacuna. La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención también puede ser administrada vía inhalación, etc. La composición de vacuna es administrada preferiblemente de manera parenteral, y más preferiblemente jde manera intracutánea o subcutánea. La parte corporal para la administración intracutánea o subcutánea es preferiblemente el brazo superior, etc., por ejemplo. I La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención puede estar en varias formas de (dosis dependiendo de su ruta de administración, y las formas ejemplares de dosis de ésta incluyen una preparación sólida y una preparación líquida. La composición de vacuna contra el cáncer puede estar, por ejemplo, en la forma de una preparación sólida o líquida que va á ser usada de manera interna para administración oral, una inyección para administración parenteral, o similares.
Ejemplos ¡de la preparación sólida a ser usada de manera interna para administración oral incluyen tabletas, pildoras, cápsulas, polvos y granulos.
Para la formulación de la preparación sólida a ser usada de manera interna, la proteína de WTli o el péptido de WT1 es no tratado, mezclado con un aditivo, o granulado (de acuerdo con, por ejemplo, granulación por agitación, granulación de lecho fluidizado, granulación en seco, granulación de lecho fluidizado con agitación por rodamiento, etc.). y posteriormente se somete a un método usual. Por ejemplo, las cápsulas pueden ser preparadas mediante encapsulado, etc. y las tabletas pueden ser preparadas por tableteo, etc. Uno o dos tipos o más de los aditivos pueden ser incorporados de manera apropiada dentro de la preparacióiji sólida. Ejemplos de los aditivos incluyen excipientes tales como lactosa, manitol, glucosaj, celulosa microcristalina y almidón de maíz; aglutinantes tales como la hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona y aluminometasilicato de magnesio; agentes dispersantes tales como almidón de maíz; desintegradotes tales como carboximetil celulosa de calcio; lubricantes tales como estearato de magnesio; agentes solubilizadores tales como ácido glutámico jy ácido aspártico; estabilizadores; polímeros solubles en agua que incluyen celulosas tales cómo la hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y metilcelulosa, y polímeros sintéticos tales como polietileglicol, polivinilpirrolidona y alcohol de polivinilo; I y edulcorantes tales como azúcar blanca, azúcar en polvo, sacarosa, fructuosa, glucosa, lactosa, jarabe de azúcar de malta reducida (jarabe maltitol), polvo de jarabe de azúcar de malta reducida (polvo de jarabe de maltitol), jarabe de maíz alto en glucosa, jarabe de maíz i alto en fructuosa, miel, sorbitol, maltitol, manitol, xilitol, eritritol, aspartame, sacarina y sacarina sodio, j Los granulos o tabletas pueden ser cubiertos con un agente de recubrimiento, etc., si i fuese necesario,! y pueden ser recubiertos con dos o más capas de este. Ejemplos del agente de recubrimiento incluyen azúcar blanca, gelatina, hidroxipropil celulosa y ftalato de hidroxipropilmeti lcelulosa. Las cápsulas pueden ser preparadas mezclando el ingrediente activo con hidrato de pranlukast y un excipiente apropiadamente seleccionado de los excipientes mencionados anteriormente, opcionalmente granulando la mezcla, y opcionalmente cubriendo los granulos resultantes con un agente de recubrimiento, seguido del relleno de la cápsula. Alternativamente, las cápsulas pueden ser preparadas mediante la adición de glicerol, sorbitol, etc., a una base de cápsula apropiada (gelatina, etc.) para aumentar su plasticidad, y encapsulando el ingrediente activo con la base resultante. A la base de cápsula puede agregársele un colorante o un conservador (dióxido de azufre; y parabenos tales 'como parahidroxibenzoato de metilo, parahidroxibenzoato de etilo y parahidroxibenzoato de propilo) si se requiere. Las cápsulas incluyen cápsulas duras y cápsulas blandas.
Ejemplos de la preparación líquida a ser usada de manera interna para administración oral incluyen aguas, suspensiones/emulsiones, jarabes, preparaciones a ser disueltas antes dé su uso tales como jarabes secos, y elíxires. Para la preparación de la formulación líquiida a ser usada de manera interna, la proteína de WT1 o el péptido de WT1 es disuelto, suspendido o emulsifícado en un diluyente generalmente usado para preparaciones líquidas que van a ser usadas de manera interna. Ejemplos del diluyente incluyen agua purificada, etanol y una mezcla de estos. La preparación líquida puede además contener un agente humectante, un agente de suspensión, un emulsifícante, un edulcorante, un saborizante, una fragancia, un conservador o un agente regulador. Los jarabes secos pueden ser preparados, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo con hidrato de pranlukast y un ingrediente adicional tal como azúcar blanca, azúcar en polvo, sacarosa, fructuosa, glucosa y lactosa. Los jarabes secos también pueden ser hechos en ¡ gránulos en una forma normal.
Ejemplos ¡de la forma de dosis para administración parenteral incluyen inyecciones, ungüentos, geles, cremas, parches, aerosoles y aspersiones. Las preferidas son las inyecciones. Por 'ejemplo, la inyección preferiblemente contiene un portador convencional con la pro teína de WT1 o el péptido de WT1.
La inyección para administración parenteral puede ser una inyección acuosa o una inyección aceitosa. La inyección acuosa puede ser preparada de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, agregando apropiadamente un aditivo farmacéuticamente aceptable I a un disolvente acuoso (agua para inyección, agua purificada, etc.) para preparar una solución, mezclando la proteína de WT1 o el péptido de WT1 con la solución, esterilizando con filtración la mezcla resultante con un filtro, etc, y posteriormente rellenando un contenedor aséptico con el filtrado resultante. Ejemplos del aditivo farmacéuticamente i . . . aceptable incluyen los adyuvantes anteriormente mencionados; agentes de isotonización tales como el cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerol, manitol, sorbitol, ácido bórico, bórax, glucosa y propilen glicol; agentes reguladores tales como una solución reguladora de fosfato, una solución reguladora de acetato, una solución reguladora de borato, una iónicos tales como polisorbato 80, aceite de ricino 50 de polioxietileno hidrogenado, lisolecitina y pol|ioles plurónicos. También, proteínas tales como la albúmina de suero bovino y hemociánina extraída del molusco llamado 'lapa californiana'; polisacáridos tales como aminodextrano; etc. pueden estar contenidos en la inyección. Para la preparación de I la inyección aceitosa, por ejemplo, se utiliza aceite de cártamo o aceite de fríjol de soja como un disolvente aceitoso, y benzoato de bencilo o alcohol de bencilo puede ser mezclado como ¡un agente de solubilización. La inyección preparada es usualmente almacenada en una ampolleta, frasco apropiado, etc. Las preparaciones líquidas, tales como las inyecciones, pueden también estar desprovistas de humedad y conservadas mediante crioconservación o liofilización. Las preparaciones liofilizadas se tornan fácilmente utilizables mediante su re-disolución en agua destilada adicionada para inyección, etc. justo antes de su uso.
Otra forma de dosis de la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención puede ser un liposoma que contiene la proteína de WTl o el péptido de WTl y, si se requiere, polisacáridos y/u otros ingredientes que puedan ser mezclados dentro de la composición de vacuna contra el cáncer.
La dosis de la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención varía con el tipo de la proteína de WTl, péptido de WTl o ADN a ser utilizado, la edad y el peso corporal del paciente, la enfermedad a ser tratada, etc. Por ejemplo, en el caso de la composición de vacuna que comprende el péptido de WTl, por ejemplo el péptido de WTl i87, o el péptido de WT1126, la dosis diaria es preferiblemente de aproximadamente 0.1 µg/kg de peso caporal a 1 mg/kg de peso corporal como la cantidad del péptido de WTl . La dosis del péptido de WTl es usualmente de 0.0001 mg a 1000 mg, preferiblemente 0.01 mg a 1000 mg, yj más preferiblemente 0.1 mg a 10 mg. Esta cantidad es preferiblemente administrada una vez en varios días a varios meses.
La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención es una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA- A* 0206. El tipo de HLA, el cual es una medida para seleccionar personas positivas al HLA-A*0206, puede ser determinado a partir de, por ejemplo, sangre periférica de donadores. Ejemplos del método de determinación del tipo de HLA incluyen métodos conocidos, tales como el método de tipificación de ADN, por ejemplo, el método de SBT (Sequencing Based Typing) o el método SSP, y el método de tipificación de HLA. En el método SBT, la secuencia base de un ADN amplificado por PCR es comparada con información de la secuencia base de alelos conocidos para identificar precisamente el tipo del gen de HLA. En el método SSP, después de la amplificación por PCR usando una variedad de cebadores específicos para alelos de HLA respectivos] se lleva a cabo electroferesis subsiguiente para verificar una banda positiva. De esta forma, el tipo de gen de HLA puede ser identificado.
Cuando la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención ha sido administrada a uña persona positiva al HL A-A* 0206, la proteína de WTl o péptido de WTl restringida de HLA-A*0206 en la composición de vacuna, o la proteína de WTl o el péptido de WTl expresado a partir de ADN o ARN en la composición de vacuna se une a una molécula de HL A- A* 0206 sobre la superficie de una célula (célula dendrítica) que presenta un antígéno de la persona positiva al HLA-A* 0206. Esto induce inmunidad antitumor específica, esto es, CTLs específicos de WTl, los cuales destruyen las células de cáncer en el sujeto (persona positiva al HLA-A*0206). Tal inmunidad anti-tumor puede ser verificada, por ejemplo mediante la respuesta de CTL específico de WTl, la prueba de citotoxicidad contra células de cáncer (por ejemplo, prueba de citotoxicidad de liberación de 51Cr), etc. Por ejemplo, el péptido de WTl i87 restringido de HLA-A*0201 y el péptido de WTl i26 cada uno consistente en 9 aminoácidos derivados de la proteína de WTl , los cuales han sido reportados que son capaces de inducir una respuesta de CTL específico de WTl , pueden inducir una respuesta restringida de HLA-A*0206. Aproximadamente 17% del pueblo japonés es positivo al HLA-A* 0206 en tanto que casi la misma proporción son positivos al HLA-A*0201. En los siguientes ejemplos 1 a 5, se prepararon CTLs específicos de péptido de WTl i¾7 a partir de PBMCs de tres donadores de sangre positivos a HLA-A* 0206. Los CTLs inducidos mostraron el efecto citotóxico sobre células de leucemia positivas a HLA-A*0206 que expresan WTl . Puesto que la actividad de CTL específica de péptido de WTl i87 y de péptido de WTl 126 puede ser inhibida por un anticuerpo anti-HLA clase I, se encontró que la actividad a ser presentada por CTLs restringidos de HLA clase I. La proteína de WTl o el péptido de WTl, incluyendo el péptido de WTl i87 y/o el péptido de WT1126, o un péptido modificado de estos puede ser una vacuna para pacientes de cáncer positivos al HLA-A*0206 así como también pacientes de cáncer positivos al HLA-A*0201. Por lo tanto, la inmunoterapia basada en la proteína de WTl o el péptido de WTl para pacientes con tumores malignos, tales como tumores hematopoyéticos y cánceres sólidos, puede ser aplicada adicionalmente a pacientes de cáncer positivos al HLA-A*0206. El método de tratamiento y/o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206, comprendiendo la administración de la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención a de una persona positiva para HLA-A*0206, es una de las modalidades preferidas de la presente invención.
En personas positivas al HLA-A* 0206, la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención puede ser usada para el tratamiento y/o prevención de cánceres acompañados por la expresión aumentada del gen de WTl : por ejemplo, tumores hematopoyéticos tales como la leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno; jy cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer dé mama, cáncer de célula germinal, cáncer hepático, cáncer de piel, cáncer de vesícula, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical y cáncer de ovario.
Un método de administración ejemplar de la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención es un método que comprende la recolección de PBMCs procedentes de sangre periférica de un paciente positivo a HLA-A*0206, la extracción de células dendríticas de las PBMCs, pulsación de las células dendríticas con un péptido, por ejemplo el péptido de WTl i87 o el péptido de WT1 ]26, o un polinucléotido, por ejemplo ADN o ARN, contenido como un ingrediente activo en la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención, y regresando las células dendríticas al paciente mediante administración por vía subcutánea, etc. Las condiciones para la pulsación de células dendríticas con el péptido de WT1, etc., no están limitadas de manera particular en tanto se logre el efecto de la presente invención, y pueden ser condiciones normales.
En el casó en donde se utiliza ARN que codifica para la proteína de WT1 o el péptido de WT1 para la composición de vacuna contra el cáncer, es preferible que la composición sea administrada de manera que el ARN sea introducido dentro de células dendríticas de uha persona positiva al HLA-A*0206. Un método ejemplar para la introducción del |ARN dentro de la células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206 es un método que comprende la recolección de células dendríticas a partir de una persona positiva al HLA-A*0206 en la misma forma que se mencionó anteriormente, e introduciendo ARN dentro de las células dendríticas con un pulso eléctrico. La proteína de WT1 o el péptido de WT1 expresado a partir del ARN introducido en las células dendríticas se permite que sea presentado sobre la superficie de éstas. Al regresar las células dendríticas pulsadas con el ARN dentro de la persona positiva al HLA-A*0206, pude producirse rápidamente inmunidad contra el cáncer en el cuerpo viviente. Dicho método de tratamiento o prevención del cáncer, que comprende la introducción de ARN que codifica para la proteína de WT1 o el péptido de WT1 dentro de células dendríticas de una persona positiva al HLA-A*0206, es una de las modalidades preferidas de la presente invención. ¡ Otra modálidad de la presente invención se relaciona con un método para inducir CTLs específicos de WT1, mediante el cultivo, en la presencia de la proteína de WT1 o del péptido de WTl j de PBMCs derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener CTLs específicos de WTl inducidos a partir de éstas. El sujeto del cual se derivan las PBMCs no está limitado de manera particular en tanto que dicho sujeto sea positivo a HLA-A*0206. Ejjemplos de la proteína de WTl o del péptido de WTl incluyen al péptido de WT1187, el péptido de WT1126 y un péptido modificado de estos, y preferiblemente el péptido de WTl i87 y el péptido de WTl i26. Por ejemplo, CTLs específicos de WTl pueden ser inducidos a partir de células precursoras de CTL entre PBMCs mediante el cultivo de PBMCs derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206 en la presencia del péptido de WTl 187 (o el péptido de WTl i26). Las condiciones de cultivo para las PBMCs derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206 no están limitadas de manera particular, y pueden ser condiciones normales. Los CTLs obtenidos de esta manera reconocen un complejo del péptido de WTl i87 (o el péptido de WTl i26) y una molécula del HLA-A*0206. Por lo tanto, mediante el uso de CTLs específicos de WTl inducidos de acuerdo con la presente invención, células de tumor que expresan WTl en elevados niveles pueden ser destruidas de manera especifica en una persona positiva al HLA-A*0206, y de esta manera los tumores hematopoyéticos y los cánceres sólidos en el sujeto, esto es, una persona positiva al HLA-A*0206, jpueden ser tratados y/o prevenidos. El método para la administración de tales CTLs específicos de WTl en un sujeto positivo a HLA-A*0206 no está limitado de manera particular y por ejemplo, puede ser el mismo que el método de administración de la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a un kit para inducir CTLs específicos de WTl , el cual comprende la proteína de WTl o el péptido de WTl restringido de HLA-A*0206 como un constituyente esencial. Preferiblemente, el kit es utilizado para el método anteriormente mencionado para la inducción de CTLs específicos de WTl derivados de uná persona positiva al HLA-A*0206. Dicho kit puede comprender, por ejemplo, unos medios para la recolección de PBMCs, un adyuvante y un recipiente de reacción además de la proteína de WTl o el péptido de WTl restringido de HLA-A*0206. Mediante el uso del kit, pueden inducirse de manera eficiente CTLs específicos de WTl que reconocen un complejo de un antígeno de cáncer, tal como el péptido de WTl i87 y el péptido de WTl JÓ, y una molécula de HLA-A*0206.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a un método para la inducción de células dendríticas que presentan la proteína de WTl o el péptido de WTl, mediante el cultivo, en la presencia de la proteína de WTl o del péptido de WTl, de células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de éstas y las cuales presentan la proteína de WTl o el péptido de WT1.| Ejemplos de la proteína de WTl o del péptido de WTl incluyen al (1) la proteín de WTl o el péptido de WTl, CTLs específicos de WTl inducidos mediante el método anteriormente mencionado, o células dendríticas inducidas mediante el método anteriormente mencionado, o (2) un anticuerpo contra lo siguiente: la proteína de WTl o el péptido de WTl, CTLs específicos de WTl inducidos mediante el método anteriormente mencionado, o células dendríticas inducidas mediante el método anteriormente mencionado. i Dicho método de diagnóstico de cáncer también es un aspecto de la presente invención. En e'l punto (1) anterior, el diagnóstico de cáncer es llevado a cabo i preferiblemente jusando CTLs específicos de WTl inducidos mediante el método mencionado anteriormente. Ejemplos de la proteína de WTl o del péptido de WTl incluyen el péptido de WTl i87, el péptido de WTl i26 y un péptido modificado de estos, y preferiblemente el péptido de WTl i87 y el péptido de WTl i26.
De acuerdo con la presente invención, un método ejemplar de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HL A- A* 0206 comprende una etapa de detección o cuantificación i de la proteína de WTl o del péptido de WTl, un anticuerpo en contra de estos o CTLs i específicos de WTl en una muestra procedente de una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa de comparación de la cantidad de proteína o péptido parcial de ésta, un anticuerpo en contra de estos o los CTLs específicos de WTl, con aquella en el caso en donde no se ha desarrollado cáncer.
En una muestra de un paciente con cáncer (por ejemplo sangre), está presente el péptido de WTl y/o la proteína de WTl liberada de las células de cáncer, y se mejora la respuesta inmunólógica contra un antígeno del cáncer. Esto es, la muestra del paciente con cáncer tiene una! cantidad incrementada de un anticuerpo contra el péptido de WTl o la proteína de WTj , CTLs específicos de WTl, etc. Por esta razón, cuando la cantidad del péptido de WTl p de la proteína de WTl , un anticuerpo contra estos o los CTLs específicos de WTl que se encuentran en la muestra, es aumentada en comparación con aquella en el caso en donde no se ha desarrollado cáncer, el cáncer puede haberse desarrollado. La cantidad del anticuerpo puede ser medida mediante el método de ELISA, por ejemplo. Los CTLs pueden ser detectados por un método usando multímeros de WTl ros de MHC descritos con anterioridad.
Alternativamente, el diagnóstico del cáncer también puede ser llevado a cabo mediante la incubación de los CTLs anteriormente mencionados, células déndríticas o i anticuerpo conjuntamente con una muestra de una persona positiva al HLA-A*0206, o administrando los CTLs anteriormente mencionados, células déndríticas o anticuerpo dentro de una persona positiva al HLA-A*0206; y posteriormente determinando la posición, región, cantidad, etc. de los CTLs, células déndríticas o anticuerpo. Puesto que los i CTLs y las células déndríticas tienen una propiedad de reunirse alrededor de células cancerosas, el diagnóstico del cáncer puede realizarse mediante la administración de los i CTLs o células déndríticas al sujeto, y examinando la posición o región de estas. También es un aspecto de la presente invención un método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLAj-A*0206, el cual comprende la etapa de administrar CTLs específicos de WT1 o células déndríticas inducidas mediante el método anteriormente mencionado a una persona positiva al HLA-A*0206, y una etapa de determinar la posición o región de los CTLs o células déndríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206.
El diagnóstico de cáncer también puede ser realizado mediante la incubación de CTLs o células déndríticas conjuntamente con una muestra procedente de una persona positiva al HLA-A*0206, permitiendo que reaccionen, adicionando un anticuerpo contra los CTLs o células déndríticas, continuando con la incubación y detectando o cuantificando un complejo unido a anticuerpo de la célula de cáncer y los CTLs, células déndríticas unidas al anticuerpo, etc. vía una etiqueta, etc. unida al anticuerpo. Cuando la cantidad del i complejo unido al anticuerpo de la célula de cáncer y CTLs o las células déndríticas unidas al anticuerpo aumenta en comparación con aquella en el caso en donde no se ha desarrollado cáncer, el cáncer puede haberse estado desarrollando. Los CTLs, células déndríticas o anticuerpo anteriormente mencionados pueden ser marcados. El marcado permite que el diagnóstico sea realizado de manera eficiente. Ejemplos de la muestra procedente de la persona positiva al HLA-A*0206 incluyen especímenes biológicos obtenidos a partir de personas positivas al HLA-A*0206, tales como orina, sangre, fluido extraídos de tejidos, saliva, lágrimas y otros fluidos corporales, y la que más se prefiere es la sangre.
Ejemplos ! del método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLA- A*0206 usando la proteína de WT1 o el péptido de WT1 anteriormente mencionados incluyen la prueba del tetrámero de MHC, la prueba del pentámero de MHC y la prueba del i dextrámero de MHC, cada una de las cuales utiliza al péptido de WTl como un antígeno. Por ejemplo, en ía prueba del tetrámero de MHC o en la prueba del pentámero de MHC usando el péptido de WTl i87, el péptido de WTl i26 como un péptido de antígeno, pueden detectarse CTLs específicos de WTl en personas positivas al HLA-A*0206 mediante el uso I de un complejo de MHC/péptido de WTl jg7 o un complejo de MHC/péptido de WTl i26 i como una sonda. Puesto que los pacientes con cáncer muestran elevada expresión de CTLs específicos de VfTl , el cáncer puede ser diagnosticado mediante la medición de la expresión de CTLs específicos de WTl en personas positivas al HLA-A*0206. Puesto que los pacientes de cáncer manifiestan una respuesta inmunológica mejorada contra antígenos de cáncer, el cáncer puede ser diagnosticado también mediante el examen de la respuesta inmunológica contra la proteína de WTl o el péptido de WTl en personas positivas al HLA-A*0206. Ejemplos del método de examen de la respuesta inmunológica incluyen un método que involucra la medición de. anticuerpo en contra de la proteína de WTl o del péptido de WTl mediante ELISA. También es un aspecto de la presente invención tal método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 usando un producto de protéína del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste. La prueba del tetrámero de MHC y la prueba del pentámero de MHC pueden ser llevadas a cabo mediante un método conocido usando un kit que se encuentra comercialmente disponible, por ejemplo, "WTl Tetramer" (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.).
El diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLA-A*0206 también puede ser realizado mediante un método que comprende una etapa de hacer reaccionar una muestra procedente de una persona positiva al HLA-A*0206 con un anticuerpo contra lo siguiente: la proteína de WTl o el péptido de WTl , CTLs específicos de WTl inducidos mediante el i método anteriormente mencionado o células dendríticas inducidas por el método anteriormente mencionado, y una etapa de detección o cuantificación de un complejo del I anticuerpo con la proteína de WTl o el péptido de WTl, o un complejo del anticuerpo con I CTLs específicosj de WTl o células dendríticas. Cuando la cantidad del complejo del anticuerpo con laiproteína de WTl o el péptido de WTl, o el complejo del anticuerpo con CTLs específicos de WTl o células dendríticas está aumentado en comparación con aquella en el caso en donde no se ha desarrollado cáncer, entonces puede estarse desarrollando i cáncer. i i Ejemplos ¡del anticuerpo contra células dendríticas incluyen un anticuerpo que reconoce un complejo de péptido de WT1/HLA-A*0206. Puesto que tal anticuerpo puede reconocer el péptido de WTl y una molécula de HL A- A* 0206, el anticuerpo puede reconocer células jdendríticas que tienen el péptido de WTl presentado vía HLA Clase I.
Un anticuerpo que reconoce un complejo de péptido de WT1/HLA-A*0206/TCR (receptor de antígeno de célula T) o CTLs también puede ser usado como el anticuerpo contra células dendríticas. Dicho anticuerpo puede reconocer un complejo de una célula dendrítica y un CTL, y un complejo de una célula de cáncer y un CTL.
El diagnóstico de cáncer puede ser realizado mediante la incubación de tal anticuerpo conjuntamente con una muestra procedente de una persona positiva al HLA- A*0206 para permitirles formar un complejo, y detectando o cuantificando un complejo j unido a anticuerpo de la célula de cáncer y CTLs, células dendríticas unidas a anticuerpo y 1 presentando el péptido de WTl, o similares vía la florescencia emitida por el anticuerpo. Cuando la cantidad del complejo unido a anticuerpo de la célula de cáncer y CTLs, las células dendríticás unidas a anticuerpo y presentando el péptido de WTl , o similares está aumentada en comparación con el caso en donde no se ha desarrollado cáncer, entonces el cáncer puede haberse estado desarrollando.
También es un aspecto de la presente invención un método de tratamiento o prevención de cáncer, el cual comprende la administración de una composición que i contiene la proteína de WTl o el péptido de WTl a una persona positiva al HLA-A*0206. i La composición que comprende la proteína de WTl o el péptido de WTl y modalidades i preferidas de estas son las mismas que las descritas con relación a la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada. í También es un aspecto de la presente invención el uso de la pro teína de WTl o del péptido de WTl para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA- ¡ A*0206, y el uso de estos para la producción de una composición de vacuna contra el i cáncer a ser utilizada para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0206. La proteína de WTl o el péptido de WTl y las modalidades preferidas de estos son las mismas que las descritas con relación a la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada.
También es un aspecto de la presente invención una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 , la cual comprende un péptido modificado del péptido de WT1187 (SEQ ID NO: 2) o del péptido de WT1126 (SEQ ID NO: 3), cualquiera dej los cuales es un péptido parcial de un producto de proteína del gen de WT1 supresor de¡ tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201. ¡ Ejemplos de un péptido de WTl i87 modificado o un péptido de WTl i26 modificado incluyen péptido que comprenden la deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos de los anteriormente mencionados péptido de WT1187 o péptido de WT1 i26. El péptido de WT1 i'87 modificado es preferiblemente un péptido que comprende los mismos residuos de aminoácido en las posiciones 4 a 8 de la terminación N que el péptido de WTl ig7 tiene en las posiciones correspondientes. Como tal péptido modificado, los preferidos son los péptidos anteriormente mencionados de las SEQ ID NOS: 4 a 12, 15 y 16, 18 a 20 y 22 a 25. También se prefiere al péptido WT1187P9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53). El péptido de WTl i26 modificado es preferiblemente un péptido que comprende i los mismos residuos de aminoácido en las posiciones 4 a 8 de la terminación N que el péptido de WTl i tiene en las posiciones correspondientes. Por ejemplo, se prefieren los péptidos anteriormente mencionados de las SEQ ID NOS: 27 a 37 y 39 a 52. i En todavía otra modalidad preferible de la presente invención, los péptidos anteriormente mencionados de las SEQ ID NOS: 4 a 26 y 53 a 62 pueden ser usados como un péptido de WTl i87 modificado, y los péptidos anteriormente mencionados de las SEQ ID NOS: 27 a 52 y 63 a 75 pueden ser usados como un péptido de WTl i 6 modificado. Entre los péptidos modificados de las SEQ ID NOS: 4 a 75, los péptidos excepto el péptido de WTl i87PlD, ¡el péptido de WT1 ,87P1E, el péptido de WTl i87PlH, el péptido de WT1 ,87P1P y elj péptido de WT1 )87P2Q; y el péptido de WT1126P1D, el péptido de WT1 ,26P1E, el péptido de WT1 ,26P1P, el péptido de WTl i26P2A y el péptido de WT1 i26P2Q son los preferidos.
Entre otro is, el péptido de WT1 [87 modificado es preferiblemente el péptido de WTl i87PlF, el péptido de WTl i87P2M o el péptido de WTl i87P3M, y más preferiblemente el péptido de WTjl I 87P1F o el péptido de WTl i87P2M. El péptido modificado de WTl i26 es preferiblemente el péptido de WTl i26PlF, el péptido de WTl i26P2L, el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WTl i2óP9V, y más preferiblemente el péptido de WTl i26PlF o el péptido de WTl i26P2L.
La cantidad para usarse del péptido de WTl i87 modificado o el péptido de WT1 ]26 que es inmunogenico en personas positivas al HLA-A*0201 es el mismo que aquel del péptido de WTl en la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada i para personas positivas al HLA-A*0206. Los otros ingredientes de la composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HL A- A* 0201 y las modalidades I preferidas de estos son los mismos de la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada para personas positivas al HLA-A*0206.
ADN o ARN que codifica para los anteriormente mencionados péptidos modificados de WTl i87 o WT1 )2 que son inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 también ¡puede usarse como un ingrediente activo de la composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201. También es un aspecto de la presente invención tal composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201. i I Los otros ingredientes diferentes del ADN y ARN anteriormente mencionados en la composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201 y las modalidades preferidas de estos son los mismos que aquellos de la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada para personas positivas al HLA-A*0206.
CTLs específicos de WTl pueden ser inducidos a partir de PBMCs inducidos a partir de una persona positiva al HLA-A*0201 mediante el cultivo de PBMCs en la I presencia del pépjido de WTl i87 modificado o péptido de WTl i26 que es inmunogénico en la persona positiva al HLA-A*0201 anteriormente mencionada. Tal método de inducción de CTLs específicos de WTl también es un aspecto de la presente invención.
Ejemplos preferidos del péptido de WTl i 7 modificado o péptido de WTl i26 modificado que son inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 son los mismos que los usados en la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada para personas positivas al HLA-A*0201.
Células dendríticas que presentan el péptido de WTl i87 modificado o péptido de WTl i26 pueden ser inducidas a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HLA-A*0201 mediante el cultivo de las células dendríticas inmaduras en la presencia del péptido modificado que es inmunogénico en la persona positiva al HLA-A* 0201 anteriormente mencionada. También es un aspecto de la presente invención tal método para la inducción de células dendríticas que presentan el péptido de WTl i87 modificado o el péptido de WTl i26. Ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos usados para la anteriormente mencionada composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201.
Los cánceres en personas positivas al HLA-A*0201 pueden ser diagnosticados mediante el uso dje los anteriormente mencionados péptido de WT1 m modificado o péptido i de WTl i26 modificado que son inmunogénicos en personas positivas al HLA-A*0201 , un anticuerpo en contra de estos, CTLs específicos de WT1 inducidos por el péptido ! modificado o células dendríticas inducidas por el péptido modificado. También es un aspecto de la presente invención tal método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLA A*0201. El método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HL A- A* 0201 y las modalidades preferibles de este son las mismas que las del método I anteriormente mencionado para el diagnóstico de cáncer en personas positivas al HLA-A*0206 y las modalidades preferidas de éste.
Ejemplos del método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLA- A*0201 incluyen |la prueba del tetrámero de MHC, la prueba del pentámero de MHC y la prueba del dextrámero de MHC, cada una de las cuales utiliza al péptido de WTl i87 i modificado o el péptido de WTl i26 modificado inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201 como un antígeno. Los ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que los utilizados para la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionados para' personas positivas al HLA-A*0201.
Los cánceres en personas positivas al HL A- A* 0201 pueden ser diagnosticados mediante el uso de un anticuerpo contra uno de los siguientes: el anteriormente mencionado péptido de WTl i87 modificado o péptido de WTl i26 modificado que es inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201, CTLs específicos de WT1 inducidos por el péptido modificado o células dendríticas inducidas por el péptido modificado. También es un aspecto de la presente invención tal método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLAj-A*0201. Los ejemplos preferidos del péptido modificado son los mismos que los usados para la composición de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionada para personas positivas al HLA-A*0201. El método de diagnóstico de cáncer para personas positivas al HLAj-A*0201 y las modalidades preferidas de éste son los mismos que los del método de diagnóstico de cáncer anteriormente mencionado para personas positivas de esta son las mismas que se describieron con relación a la anteriormente mencionada composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplos j De aquí eri adelante, la presente invención será ilustrada con mayor detalle a manera de ejemplos, pero sin limitarla a estos. Las abreviaturas en los ejemplos indican los siguientes significados. Los péptidos sintéticos fueron adquiridos de SIGMA GENOSYS JAPAN.
DCs: Células dendríticas PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica CD: Agrupación de Diferenciación (antígeno de diferenciación de leucocito) GM-CSF: Factor de estimulación de la colonia de monocito granulocito IL: Interleucina j TNFoc: Factor a d je necrosis de tumor PGE: Prostaglandina Gy: Gray \ i B-LCLs: Línea celular linfoblastoide B I Virus EB: Virus de Epstein-Barr tBu: t-butilo J Trt: Trifenilmetiló Fmoc: 9-fiuorenilnietiloxicarbonilo Ejemplo 1 (Predicción de moléculas de HLA capaces de unirse con el péptido de ' WTl) Se pronosticaron moléculas de HLA capaces de unirse con el péptido de WTl i87 (SEQ ID NO: 2) usando el programa NetMHC2.0 Server-prediction.
Como resultado, el péptido de WT1187 restringido de HLA-A*0201 capaz de inducir CTLs específicos! de WTl fue clasificado alto en términos de afinidad de unión a una molécula de HLA-A*0206 en el programa NetMHC2.0 Server-prediction i (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/) Ejemplo 2 (Preparación de CTLs específicos de péptido de WTl i87 a partir de PBMCs de donadores de sangre saludables y positivos a HLA- A*0206, y prueba de citotoxicidad de los CTLs). (1) Separación de PBMCs de donadores de sangre saludables y positivos a HLA-A*0206, y preparación de DCs.
Primero, sje aislaron PBMCs a partir de sangre periférica de cada donador de sangre saludable y positivo a HLA-A*0206 (tres personas) mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Posteriormente, se seleccionaron células positivas a CD14 a partir de las PBMCs usando Partículas Magnéticas-DM anti-CD14 humanos (fabricadas por Becton Dickinson and Company (ND)). En este caso, se consideró que un gran número de células positivas a CD14 están presentes en la población de monocito. Las células positivas a CD1 seleccionadas fueron cultivadas en un medio X-VIV015 (fabricado por BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con suero AB humana 1 v/v%, 800 IU/mL de GM-CSF (fab icado por Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ) y 1000 IU/mL de IL-4 (fabricada por Pepro Tech Inc.) para preparar DCs. (2) Inducción de DCs maduras y autólogas Las DCs preparadas en el punto (1) anterior fueron cultivadas a 37 °C por 1 día, y posteriormente un cóctel de citosina de maduración conteniendo 10 ng/mL de TNFa (factor a de necrosis de tumor; Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ), 10 ng/mL de IL-ß, 1000 IU/mL de IL-6 y 1 µg/mL de PGE2 se agregó a pozos de cultivo conteniendo las DCs. Después de 24 horas de cultivo a 37 °C se obtuvieron DCs maduras y autólogas. (3) Inducción de CTLs específicos de péptido de WT1187 Las DCs maduras y antologas fueron pulsadas con el péptido de WTl i87, se irradiaron con 30Gy de radiación, y se co-cultivaron con PBMCs enriquecidas en células T y positivas as CD8, que se obtuvieron a partir del donador de sangre saludable y positivo a HLA-A*0206. El pulsado de las DCs con el péptido de WT1187 se llevó a cabo mediante el cultivo de las DCs en la presencia de 10 µg/mL del péptido de WT1187 a 37 °C durante 30 minutos. Las células T positivas a CD8 fueron enriquecidas a partir de PBMCs del donador de sangre saludable y positivo al HLA-A*0206 usando MicroBeads de CD8 y columna MS (fabricados por Miltenyi Biotec GmbH).
De la segunda estimulación, PBMCs autólogas que habían sido pulsadas con el péptido y posteriormente irradiadas con radiación fueron usadas como células estimuladoras selectivas. Dos días después de la segunda estimulación, IL-2 recombinante (proveída por Shionogi & Co., Ltd.) e IL-7 (fabricada por Pepro Tech Inc.) fueron agregadas al medio de cultivo a las concentraciones de 10 IU/mL y 10 ng/mL, respectivamente. Después de la cuarta estimulación, las células fueron cultivadas durante 10 días a 37 °G y posteriormente las células resultantes (CTLs) fueron recolectadas mediante centrifugación usando una centrífuga. Se examinó la actividad citotóxica de estas células (CTLs) contra células blanco mediante una prueba de citotoxicidad de liberación de 51 Cr. (4) Prueba de citotoxicidad La prueba) de citotoxicidad se realizó mediante una prueba de citotoxicidad liberada I por 51Cr. La prueba de citotoxicidad liberada por 51Cr fue realizada como sigue. Primero, células blanco (1x10 células/mL) fueron incubadas en la presencia de 100 de Cr (actividad específica: 1 mCi/ml) en RPMI1640 (fabricado por NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.) suplementado con 10% de suero fetal bovino a 37 °C durante 1.5 horas para marcar las células blanco con 51Cr. Posteriormente, las células blanco marcadas j con 51Cr fueron agregadas a pozos de placas de 96 pozos y con fondo redondeado que | contenían varias cantidades de los CTLs obtenidos en la etapa (3) (suspendidas en i 00 del medio de prueba), se mezclaron con los CTLs y posteriormente se incubó a 37 C durante 4 horas. Estas células fueron mezcladas de manera que la proporción E/T relación del número de células) fue de 1 : 1, 5: 1 , 20: 1 o 25: 1 ; con la condición de que los CTLs y las células blanco marcadas con Cr sean expresadas como "E" y "T," respectivamente. Después de completar la incubación, se recolectaron de cada pozo 100 del sobrenadante. La cantidad de liberación de 51Cr procedente de las células marcadas fue determinada, y la lisis específica (%) sobre la base de la liberación de 51 Cr fue calculada. Se calculó la lisis específica (%) en la siguiente forma. Lísis específica (%) = (liberada de la muestra de prueba-liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea) x 100.
En la fórmula, la cantidad de liberación espontánea se refiere a la cantidad de i fluorescencia del sobrenadante del cultivo en los pozos que contienen células blanco solamente, y la liberación máxima se refiere a la cantidad de fluorescencia del medio de cultivo en el que j las células blanco han sido completamente Usadas mediante tratamiento con 1% masa de Tritón X-100.
Las células blanco a ser usadas fueron B-LCLs, células K562, células JY y células KH88, lo cual será descrito con detalle más adelante. Las células KH88 son las mismas células KH880F8 usadas en el siguiente Ejemplo 9.
Las célulás B-LCLs, las cuales fueron estabilizadas mediante transformación mediada por virus de EB de linfocitos B de sangre periférica obtenidos a partir de un donador de sangré positivo al HLA-A*0206, no expresan WT1.
Las célulás K562, las cuales fueron establecidas a partir de un paciente con leucemia mielógena crónica en crisis blástica, son una línea celular que no expresa HLA clase I, y que expresa WT1. El presente inventor no pudo obtener una línea celular de leucemia de tipo salvaje y positiva a HLA-A*0206, que expresara WT1. Por esta razón también se usaron las células 0206K562, las cuales fueron preparadas mediante la transformación de células K562 con genes de HLA-A*0206, El análisis FACS usando un anticuerpo anti-HLA-A2 (clona BB7.2; fabricada por BD Biosciences Pharmingen) con 10 v/v % dé suero fetal bovino inactivado por calor, 50 IU/mL de penicilina y 50 mg/mL de estreptomicina. (5) Anticuerpo y análisis de citometría de flujo Se adquirieron en BD mAbs anti-CD14, CD86, CD80, CD83 y HLA-D de humano. La concentración y maduración de las CDs se confirmaron mediante análisis de I antígenos de superficie celular usando los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la lista mencionada anteriormente. Se analizaron muestras con un citómetro de flujo (FACS Calibur; fabricado por BD) usando el programa de computación CellQest. (6) Resultados Se examinó si CTLs específicos del péptido de WT1 ]87 pueden prepararse a partir de PBMCs de donadores de sangre positivos a HLA-A*0206. Se examinó la actividad citotóxica específica de péptido de WTl i87 usando los CTLs obtenidos mediante la estimulación repetida de PBMCs enriquecidas con células T positivas a CD8 procedentes del donador de sangre saludable y positivo a HLA-A*0206, con DCs o PBMCs autólogas pulsadas de péptido de WTl i87. Las CTLs mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WTl i87 que contra células B-LCL I no pulsadas de péptido de WT1 ] 87 (Figura la). En la Figura la, el eje vertical representa la i actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de CTLs obtenidos I mediante estimulación del péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (relación E/T). El triángulo cerrado representa las células pulsadas con 10 µ^ p?^ del péptido de WT1 J87, y el cuadrado cerrado representa las células no pulsadas con el péptido de WTl i87. La misma actividad citotóxica que la anterior fue mostrada también por los CTLs preparados de manera similar a partir de las PBMCs aisladas procedentes de dos diferentes donadbres sanos de sangre positivos a HLA-A*0206 (Figuras 2a y 2b). En la Figura 2, el triángulo cerrado representa las células pulsadas con 10 µg/mL del péptido de i WT1187, y el cualdrado cerrado representa las células no pulsadas con el péptido de WT1187. Estos resultados j muestran que cada actividad citotóxica es específica para el péptido de WTl i87. ! La actividad citotóxica de los CTLs aumentó en paralelo con la concentración del ¡ péptido de WTl i87 usado para pulsar las CDs o PBMCs, y alcanzó la meseta a la concentración de péptido de 0.1 µg/mL (Figura Ib). La concentración máxima media del péptido de WTl i87, para lisis específica (valor de lisis máxima media) fue de aproximadamente 5x10"5 µg/mL. Esto muestra que la afinidad de TCRs (receptores de antígeno de células T) de los CTLs para un complejo de péptido de WTl i87/ HLA-A*0206 era relativamente alta. Este resultado sugiere de manera poderosa que los CTLs inducidos con el péptido de WT1187 pueden reconocer el péptido de WT1187.
En la misma forma que lo anterior, se examinó la actividad citotóxica contra varias células blanco que expresan de manera endógena WTl , usando los CTLs obtenidos mediante la estimulación de las PBMCs enriquecidas con células T positiva a CD8 procedentes de un donador sano positivo a HLA-A*0206 con DCs o PBMCs pulsadas con péptido de WTl j87. Los resultados se muestran en las Figuras 3a y 3b. Las respectivas actividades citotóxicas para las células blanco mostradas en las Figura 3a y 3b se determinaron al mismo tiempo. La Figura 3a muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i87 contra B-LCLs transformadas con el gen de WTl (que expresa WTl, positivo a HLA-A*0206; triángulo cerrado), o B-LCLs transformadas con un vector fingido (que no expresa WTl, positivo a HLA-A*0206; cuadrado cerrado). La j Figura 3b muestra que la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i87 contra células 0206K562 (que expresan WTl, positivas a HLA-A*0206; cuadrado cerrado), células K562 (qüe expresan WTl, negativas a HLA-A*0206; cuadrado abierto), células KH88 (que expresan WTl, negativas a HLA-A*0206; circulo cerrado), o células JY (que no expresan WTl , negativas a HLA-A*0206; triángulo cerrado).
Los CTLs mostraron una actividad citotóxica más fuerte en contra de las B-LCLs transformadas con WTl (que expresa WTl, positivo a HLA- A* 0206) que contra las B-LCLs transformadas con un vector fingido (que no expresan WTl , positivas a HLA-A*0206) (Figura 3a). Además, como se muestra en la Figura 3b, los CTLs mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 transformadas con HLA- A*0206 (que expresan WTl , positivas a HLA-A*0206) que contra células K562 (que expresan WTl , negativas a HLA-A*0206), las células KH88 (que expresan WTl, negativas a HLA-A*0206)', o las células JY (que no expresan WTl, negativas a HLA-A*0206). En otras palabras, lós CTLs mostraron una actividad citotóxica importante contra células de leucemia blancoj positivas a HLA-A*0206 y que expresaban WTl , pero ninguna actividad citotóxica contra células que no expresaban WTl y/o negativas a HLA-A*0206. Este resultado demuestra que los CTLs específicos de péptido de WTl i87 preparados in vitro muestran la actividad citotóxica contra células de tumor que expresan de manera endógena WTl como células de leucemia y siendo positivas a HLA-A*0206. El resultado en la Figura 3b sugiere de manera poderosa que la actividad citotóxica de los CTLs específicos de péptido de \^Tl j87 era restringida por HLA- A clase I. Esto está basado en el hecho de que se observó una actividad citotóxica más fuerte contra células 0206K562 que contra células 562.
Los resultados anteriores demuestran que los CTLs cultivados que se mencionaron anteriormente son CTLs específicos de péptido de WT1 187.
Los resultados de cada figura son datos típicos, y básicamente susceptibles de reproducción conj alguna variación.
Ejemplo 3 (Confirmación de la clase de HLA por medio de la cual son ! restingidos CTLs específicos de péptido de WT1 j 87) Se examinó si la actividad citotóxica de los CTLs específicos de péptido de WT1 1 87 i obtenidos en el Ejemplo 2 era restringida por HLA clase I. Se llevó a cabo la prueba de citotoxicidad por! liberación de 51Cr en la presencia o ausencia de mAbs en contra de HLA clase I o HLA cíase II. Se utilizaron B-LCLs antologas como una célula blanco. En este experimento, la proporción E/T era de 5: 1.
Los resultados se muestran en la Figura 4. La Figura 4a muestra los resultados de la ! prueba que se llevó a cabo usando B-LCLs (que no expresan WTl i87, positivas a HLA- A*0206) como una célula blanco en la ausencia de mAbs contra HLA clase I (mAbs anti- i HLA clase I) y mAbs contra HLA clase II (mAbs anti-HLA clase II). La Figura 4b muestra los resultados de la prueba que fue realizada usando B-LCLs pulsadas de péptido de WTl i87 (que expresan WT11 87, positivas a HLA- A* 0206) como una célula blanco en la ausencia de mAbs anti-HLA clase I y en la presencia de mAbs anti-HLA clase II. La Figura 4c muestra los resultados de la prueba que fue realizada usando B-LCLs pulsadas de péptido de WTl i87 (que expresan WTl i87, positivas a HLA-A*0206) como una célula blanco en la presencia de mAbs anti-HLA clase I y en la ausencia de mAbs anti-HLA clase II. La Figura 4d muestra los resultados de la prueba que fue realizada usando B-LCLs pulsadas de péptido de WT1 187 (que expresan WT1 187, positivas a HLA- A* 0206) como una célula blanco en la ausencia de mAbs anti-HLA clase I y en mAbs anti-HLA clase II.
Como se ¡muestra en la Figura 4, la actividad citotóxica de los CTLs específicos de i péptido de WTl j87 fue completamente inhibida mediante la adición de un anticuerpo anti-HLA clase I, no1 un anticuerpo anti-HLA clase II. El resultado muestra que la actividad citotóxica de CTljs específicos de péptido de WTl i87 fue restringida por HLA clase I como se esperaba. j j Ejemplo 4 (Prueba de citotoxicidad contra células de tumor) La pruebaj de citotoxicidad contra células de tumor que expresan WT1 y positivas a HLA- A* 0206 se ¡llevó a acabo in vi tro usando los CTLs específicos de péptido de WT1 Ejemplo 2 (3) excepto porque se utilizó el péptido de WTl i26 (SEQ ID NO: 3) en lugar del péptido de ??1 ?87. La prueba de citotoxicidad se llevó a cabo usando estos CTLs en la misma forma que en el Ejemplo 2, para determinar la actividad citotóxica específica del péptido de WTl|i26. La Figura 5 muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTJ i26 inducidos a partir de PBMCs del mismo donador sano de sangre positivo a HLA-A*0206 como en la Figura 2b. En la Figura 5, el triángulo cerrado representa células pulsadas con 10 µg mL del péptido de WTl i26, y el cuadrado cerrado representa células no pulsadas con el péptido de WTl i26. Los CTLs mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WT1 ]26 que contra las células B-LCL no pulsadas de péptido de WT1 ]26. Este resultado muestra que la actividad citotóxica de los CTLs es específica para el péptido de WT1126.
En la misma forma que en el Ejemplo 2, se examinó la actividad citotóxica contra varias células blanco que expresan de manera endógena WT1 , usando los CTLs preparados mediante la estimulación de las PBMCs enriquecidas con células T positiva a CD8 procedentes de ¡los donadores de sangre positivos a HLA- A* 0206 con DCs o PBMCs pulsadas con péptido de WT1126. La actividad citotóxica en contra de cada célula blanco se muestra en las ¡Figuras 6a y 6b. Las células blanco en las Figura 6a y 6b son células 0206K562 (que expresan WTl , positivas a HLA-A*0206; cuadrado cerrado), células K562 (que expresan WfTl, negativas a HLA-A*0206; cuadrado abierto), células KH88 (que i expresan WTl , negativas a HLA-A*0206; circulo cerrado), y células JY (que no expresan WTl , negativas a HLA-A*0206; triángulo cerrado). La Figura 6a muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i26 inducidos a partir de PBMCs del mismo donador sano de sangre y positivo a HL A-A* 0206 como en la Figura 2a. La Figura 6b muestra la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WT1 inducidos a partir de PBMcJ del mismo donador sano de sangre y positivo a HLA-A*0206 como en la Figura 2b. I Como los CTLs específicos de péptido de WTl i87, los CTLs específicos de péptido de WTl i26 mostraron una actividad citotóxica importante contra células de leucemia i blanco, positivas a HL A- A* 0206 y que expresaban WTl , pero ninguna actividad citotóxica contra células que no expresaban WTl y/o negativas a HLA-A*0206. Este resultado demuestra que los CTLs específicos de péptido de WTl i26 preparados in vi tro muestran la actividad citotóxica contra células de tumor que expresan de manera endógena WTl como células de leucemia y siendo positivas a HLA-A*0206. Los resultados de las Figuras 6a y 6b sugieren de manera poderosa que la actividad citotóxica de CTLs específicos de péptido de WTl i26 era ¡restringida por HLA-A clase I. Esto está basado en el hecho de que se observó una actividad citotóxica más fuerte contra células 0206K562 que contra células K562. ! Los resultados anteriores demuestran que los CTLs obtenidos son CTLs específicos de péptido de WTl i26.
Los resultados de cada figura son datos típicos, y básicamente susceptibles de reproducción cón alguna variación. j Ejemplo 6 (Preparación de composiciones de vacuna) Se prepararon las siguientes composiciones de vacuna 1 a 8 contra el cáncer. Estos son solamente, ejemplos de la composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención. i Composición 1 de vacuna contra el cáncer Péptido de WTl i87 3 mg Montanidé IS A-51 400 mg ! Glucosa aí 5% en agua 400 mg ? Se mezclaron los ingredientes anteriormente mencionados y la mezcla se denominó ! composición 1 de¡ vacuna contra el cáncer.
I Composición 2 de vacuna contra el cáncer Péptido de WT1 ]87 1 mg Montanidé IS A-51 400 mg Glucosa al 5% en agua 400 mg Se mezclaron los ingredientes anteriormente mencionados y la mezcla se denominó composición 2 de vacuna contra el cáncer.
Composición 3 de vacuna contra el cáncer Péptido de WT1 ,87 0.001 mg ¡ Montanidé IS A-51 400 mg Glucosa al 5% en agua 400 mg Se mezclaron los ingredientes anteriormente mencionados y la mezcla se denominó composición 3 dé vacuna contra el cáncer.
Composición 4 de vacuna contra el cáncer Péptido de WTl i87 lO mg Montanidé IS A-51 400 mg Glucosa ál 5% en agua 400 mg Se mezclaron los ingredientes anteriormente mencionados y la mezcla se denominó composición 4 de vacuna contra el cáncer.
Composiciones 5 a 8 de vacuna contra el cáncer i Se prepararon las composiciones 5 a 8 de vacuna contra el cáncer en la misma forma que en las composiciones 1 a 4 de vacuna contra el cáncer anteriormente mencionadas, excepto que se utilizó el péptido de WTl i26 en lugar del péptido de WT1 ]87.
Ejemplo 7: (afinidad de péptidos modificados a moléculas de HLA-A*0206) Mediante el uso del programa de computadora NetMHC2.0 Server-prediction se analizó la afinidad a moléculas de HLA-A*0206 para el péptido de WT1 ]87, el péptido de WTl i26, y péptidos modificados que comprendían la sustitución de un residuo aminoácido en la posición 1,¡2, 3 o 9 de la terminación N del péptido de WTli87 o del péptido de WTli26. En las Tablas 1 y 2, respectivamente se muestran los resultados del análisis de I péptidos de WTl|g7 modificados y péptidos de WTlj26 modificados. El valor más pequeño j (el péptido tiene una capacidad de unión a una concentración más baja) indica la afinidad más alta. ! Tabla 1 Secuencia de Puntaje Afinidad Péptido aminoácidos SEQ ID NO Fuerza de Unión Pronosticado (nM) Fuerte Tli87 SIÍGEQQYSV 2 0.776 11 Unión (FU) WTli87PlG GÉGEQQYSV 4 0.756 13 FU WTli87PlA ALGEQQYSV 5 0.812 7 FU Tli87PlV VLGEQQYSV 6 0.755 14 FU WTlisvPIL LLGEQQYSV 7 0.810 7 FU WTI187PII ILGEQQYSV 8 0.782 10 FU WT1187P1M MLGEQQYSV 9 0.877 3 FU T1187P1W WLGEQQYSV 10 0.876 3 FU WTli87PlF FLGEQQYSV 11 0.926 2 FU WT1187P1Y YLGEQQYSV 12 0.896 3 FU WTli87P2V SVGEQQYSV 13 0.722 20 FU WTli87P2Q SQGEQQYSV 14 0.824 6 FU WTli87P2I SIGEQQYSV 15 0.734 17 FU WTli87P2 SMGEQQYSV 16 0.798 8 FU WTli87P3L SLLEQQYSV 17 0.865 4 FU WTli87P3A SLAEQQYSV 18 0.844 5 FU Tli87P3V SLVEQQYSV 19 0.869 4 FU WTli87P3M SLMEQQYSV 20 0.896 3 FU WTli87P3P SLPEQQYSV 21 0.791 9 FU WT1187P3 SLWEQQYSV 22 0.883 3 FU WTli87P3F S¡LFEQQYSV 23 0.864 4 FU Tli87P3Y S;LYEQQYSV 24 0.857 4 FU WTli87P3S SLSEQQYSV 25 0.801 8 FU WT1187P3I SLIEQQYSV 26 0.880 3 FU Unión WTli87P9L SLGEQQYSL 53 0.586 88 Débil Tabla 2 Ejemploj 8: (afinidad de péptidos modificados a moléculas de HLA-A*0201) Mediante el uso del programa de computadora NetMHC2.0 Server-prediction se analizó la afinidad a moléculas de HLA-A*0201 para el péptido de WTl i87, el péptido de WT1126, y péptidos modificados que comprendían la sustitución de un residuo aminoácido en la posición 1, 2, 3 o 9 de la terminación N del péptido de WT1 ]87 o del péptido de WTl i26. En lasI Tablas 3 y 4, respectivamente se muestran los resultados del análisis de péptidos de WTl ¡87 modificados y péptidos de WT1 [26 modificados. El valor más pequeño indica la afinidad 'más alta.
Tabla 4 Secuencia de Puntaje Afinidad Péptido aminoácidos SEQ ID NO Fuerza de Unión Pronosticado (nM) Tli26PlG GMFPNAPYL 27 0.80 9 FU Tli26PlA A FPNAPYL 28 0.81 7 FU WTI126PIV VMFPNAPYL 29 0.81 8 FU Tli26PlL LMFPNAPYL 30 0.82 7 FU WTli26PlI IMFPNAPYL 31 0.81 8 FU Tli26PlM MFPNAPYL 32 0.85 4 FU Tli26PlW WMFPNAPYL 33 0.80 8 FU WT1126P1F FMFPNAPYL 34 0.91 2 FU Secuencia de Puntaje Afinidad Péptido aminoácidos SEQ ID NO Fuerza de Unión Pronosticado (n ) WTli26PlY YMFPNAPYL 35 0.90 2 FU Tli26P2V RVFPNAPYL 36 0.55 127 FU WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 0.49 262 FU WTli26P2L RLFPNAPYL 39 0.78 10 FU WTli26P2I RXFPNAPYL 40 0.64 48 FU WTli26P3I R IPNAPYL 41 0.74 16 FU Tli26P3L R LPNAPYL 42 0.78 10 FU WTli26P3G RMGPNAPYL 43 0.60 73 FU WTli26P3A RMAPNAPYL 44 0.73 17 FU WTli26P3V RMVPNAPYL 45 0.68 31 FU WTli26P3M RMMPNAPYL 46 0.83 6 FU WT1126P3P R PPNAPYL 47 0.61 66 FU WTli26P3W R PNAPYL 48 0.83 6 FU WTli26P9V RMFPNAPYV 49 0.84 5 FU WT1126P9A RMFPNAPYA 50 0.73 18 FU WT1126P9I RMFPNAPYI 51 0.79 9 FU WTli26P9M RMFPNAPYM 52 0.69 29 FU Ejemplo 9: (comparación de CTLs restringidos de HLA-A*0201 inducidos mediante varios péptidos de WT1126 modificados) (1) Propósito En vista de los resultados del Ejemplo 8, el péptido de WTl i26PlF (SEQ ID NO: 34), el péptido de WT1126P2L (SEQ ID NO: 39), el péptido de WT1 ,26P3M (SEQ ID NO: 46) y el péptido de WTl i26P9V (SEQ ID NO: 49) fueron seleccionados como péptidos de WT1 )26 modificados a ser probados, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para tamizar en cuanto a péptidos de WTl i26 modificados capaces de inducir CTLs que tienen una elevada actividad citotóxica. Los reactivos, medio, métodos experimentales, etc., utilizados en los Ejemplos 9 a 12 fueron los mismos que los del Ejemplo 1, a menos que se especifique de otra manera. En los Ejemplos 9 a 12, el cultivo se llevó a 37 °C, a menos que se indique dé otra manera. (2) Materiales y Métodos A partir de un donador humano sano que mostraba expresión de moléculas de HLA-A*0201 (donador de sangre sano y positivo a HL A- A* 0201), se aislaron PBMCs, y se separaron células positivas a CD14 de las PBMCs mediante el uso de Partículas Magnéticas-DM ¡de anti-CD14 humanas. Se preparó un medio de cultivo mediante la adición de 800 I(U/mL de GM-CSF y 1000 IU/mL de IL-4 a un medio de X-VIV015 suplementado con 1% v/v de suero de AB humana, y las células positivas a CD14 se cultivaron en el medio de cultivo durante 1 día.
Al medio' de cultivo anterior, se agregó un cóctel de citosina de maduración que contenía 10 ng/mL de TNFoc, 10 ng/mL de IL-ß, 1000 IU/mL de IL-6 y 1 µg/mL de PGE2. Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron DCs maduras y autólogas.
Las DCs maduras y autólogas fueron pulsadas con 10 µg/mL de un péptido de WTI 126 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido de WTl i26PlF, el péptido de WT1126P2L, el péptido de WT1126P3M o el péptido de WT1126P9V), se cultivaron durante 4 horas, y se irrajliaron con 35Gy de radiación. Las células así obtenidas se utilizaron como células estimulantes para la inducción de CTL.
Las PBMCs (2X1 O6 células/pozo) que servían como respondedoras y las DCs anteriormente mencionadas (2x105 células/pozo) fueron co-cultivadas en una placa de 24 pozos. Una semana después, se proporcionó re-estimulación mediante la adición de células T2 que habían siko pulsadas con el péptido y se irradiaron con 75 Gy de radiación. Tres días después de la ré-estimulación, se agregaron 20 IU/mL de IL-2. Se repitió la misma reestimulación otras tres veces mediante la adición de las células T2 irradiadas y pulsadas con péptido, y posteriormente células positivas a CD8 en las células respondedoras fueron í enriquecidas. 1 Por cuanto toca a las células T positivas a CD8, la reactividad en un tetrámero de HLA-A*0201 uñido al péptido de WTl i26 fue analizada mediante un citómetro de flujo, y se examinó la actividad citotóxica en contra de varias células blanco.
Las células blanco a ser usadas fueron células K562, células 0206K562, células JY, células KH880^8, células TF-1 y células THP-1 , las cuales son mostradas en la Tabla 5. Las características de estas células se muestran en la Tabla 5. También se usaron como una célula blanco una línea de células B-linfoblastoides (B-LCL) establecida mediante infección viral de EB a partir de sangre de un donado positivo a HLA-A*0201.
Tabla 5 (3) Resultados La Figura 7 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de PBMCs procedentes del donador 1 positivo a HLA-A*0201 que fueron estimuladas con diferentes péptidos de WTl i26 modificados y posteriormente teñidas con tetrámero de HLA-A*0201 marcado con F'E (picoeritrin) unido al péptido de WTl i26 (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.), y un anticuerpo anti-CD8 marcado con APC-Cy7 (APC-Cy7: Aloficocianin-cianina-7). Cuando las PBMCs son teñidas con el tetrámero anteriormente mencionado y el anticuerpo anti-CD8, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido modificado se unen al tetrámero y el anticuerpo anti-CD8, y de esta manera, la fluorescencia emitida por el tetrámero y la fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD8 pueden ser detectadas, respectivamente. En las Figuras 7a a 7e, el eje vertical representa la intensidad de la¡ fluorescencia emitida por el tetrámero de HLA-A*0201, y el eje horizontal representa la intensidad de la fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD8. Cada casilla en las Figuras 7a a 7e muestra la frecuencia (%) de CTLs restringidos de HLA-A*0201 e inducidos, capaces de reconocer el péptido de WT1 ]2 . La Figura 7a muestra el resultado I del análisis dé PBMCs que no fueron estimuladas con ningún péptido de WTl i26 i modificado y tañidas con el tetrámero anteriormente mencionado y anticuerpo anti-CD8 i (fondo). La Figura 7b muestra el resultado del análisis de PBMCs que fueron estimuladas con el péptido ¡de WTl i26PlF y teñidas. La Figura 7c muestra el resultado del análisis de PBMCs que fueron estimuladas con el péptido de WTl i26P2L y teñidas. La Figura 7d muestra el resultado del análisis de PBMCs que fueron estimuladas con el péptido de WT1 i26P M y teñidas. La Figura 7e muestra el resultado del análisis de PBMCs que fueron estimuladas con el péptido de WT1 i26P9V y teñidas. i La frecuencia de los CTLs anteriormente mencionados e inducidos mediante estimulación de ¡PBMCs con el péptido de WTl i26PlF fue de 0.14% (Figura 7b). La i frecuencia de los CTLs anteriormente mencionados e inducidos mediante estimulación de PBMCs con el pjéptido de WTl i26P2L fue de 0.37% (Figura 7c). Los CTLs inducidos de manera separadalcon estos péptidos fueron positivos al tetrámero de HLA, positivos a CD8 y capaces de unirse al tetrámero de HLA-A*0201 unido al péptido de WTl i26. Estos resultados muestran que la estimulación de PBMCs con el péptido de WTl ^e modificado inducía CTLS que podrían reconocer el péptido de tipo salvaje (péptido de WT1126).
I La Figura 8 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 1 con el péptido de í WTl i26PlF. En¡ la Figura 8, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de ¡péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). El diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células JY como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células JY pulsadas con I el péptido de WT1 i26PlF fueron utilizadas como una célula blanco.
Las células JY son positivas a HL A-A* 0201 y negativas a WT1. Los CTLs I mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas de WT1126P1F que contra células JY no pulsadas con péptido de WTl i26PlF. Este resultado muestra que se indujeron CTLs que son específicos para el péptido usado para la estimulación anteriormente mencionada y restringidos por HLA-A*0201.
La Figura 9 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 1 con el péptido de WT1 )26P2L. En la Figura 9, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje contra las células TF-1 y las células THP-1, ambas de las cuales son positivas a HLA-A*0201 y positivas a WTl, que contra las células KH880F8, las cuales son negativas a HLA- A* 0201 y positivas a WTl, y las células B-LCL, las cuales son positivas a HLA-A*0201 y negativas a WTl (Figura 9b). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con péptido de WTl i26P2L son restringidas por HLA- A* 0201, y j capaces de destruir células de cáncer que expresan de manera endógena WTl . j i La Figura 10 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de PBMCs procedentes del donador 2 positivo a HLA-A*0201 que fueron estimuladas con el péptido de WTl i26P2L y ¡posteriormente teñidas con el tetrámero de HLA-A*0201 marcado con PE I y unido al péptidjo de WTl )26, y el anticuerpo anti-CD8 marcado con APC-Cy7. A saber, la Figura 10 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de CTLs inducidos que fueron teñidos con el tetrámero de HLA unido al péptido de WTl i26, y el anticuerpo anti-CD8. El eje vertical representa la intensidad de la fluorescencia emitida por el tetrámero de i HLA-A*0201, yjel eje horizontal representa la intensidad de la fluorescencia emitida por el anticuerpo anti-CD8.
Las células en área derecha superior de la Figura 10 son CTLs inducidos que están restringidos porj HLA-A*0201 y pueden reconocer el péptido de WTl i26. 5.43% de linfocitos de las PBMCs estimuladas con el péptido de WTl i26P2L fueron positivas al tetrámero de HLA, CTLs positivos a CD8 que eran capaces de unirse al tetrámero de HLA- A*0201 unido al péptido de WTl i26. Este resultado muestra que la estimulación de PBMCs i con el péptido modificado indujo CTLs positivos a CD8 que pueden reconocer el péptido de tipo salvaje.
La Figura' 11 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de los CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 2 con el péptido de WTl i26P2L. En las Figuras l ia y 11b, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). En la Figura 1 la, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células JY como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células JY pulsadas con el péptido de WTl i26 fueron utilizadas como una célula blanco. En la Figura 11b, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células ¡JY como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células JY pulsadas con el péptido de WTl i26P2L fueron utilizadas como una célula blanco.
Los CTLs inducidos mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas de péptido de WTl i26 que contra las células JY no pulsadas con péptido de WTl i26 (Figura ljla). Los CTLs inducidos también mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células JY pulsadas de péptido de WTl i2óP2L que contra las células JY no pulsadas de péptido de WTl i26P2L (Figura 1 1b). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 [26P2L pueden reconocer tanto al de péptido de WTl j26P2L como al péptido de WTl i26 tipo salvaje. j i Ejemplo 10: (comparación de los CTLs restringidos de HLA-A*0206 inducidos i mediante varios péptidos de WTl j26 modificados) (1) Própósito En vista de los resultados del Ejemplo 7, el péptido de WTl i26PlF, el péptido de WTl i26P2L, el péptido de WTl i26P3M y el péptido de WTl i26P9V fueron seleccionados i como péptidos de WT1 ]26 modificados para ser probados, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para tamizar en cuanto a péptidos de WTl i modificados capaces de inducir CTLs que tienen una elevada actividad citotóxica. (2) Materiales y Métodos A partir de un donador humano sano que mostraba expresión de moléculas de HLA- i A*0206 (donador de sangre sano y positivo a HLA-A*0206), se aislaron PBMCs, y se separaron células positivas a CD14 de las PBMCs mediante el uso de Partículas Magnéticas-DM jde anti-CD14 humanas. Se preparó un medio de cultivo mediante la adición de 800 ÍU/mL de GM-CSF y 1000 IU/mL de IL-4 a un medio de X-VIV015 suplementado con 1% v/v de suero de AB humana, y las células positivas a CD14 se cultivaron en el medio de cultivo durante 1 día. j Al medió de cultivo anterior, se agregó un cóctel de citosina de maduración que contenía 10 ng/mL de TNFa, 10 ng/mL de IL-ß, 1000 IU/mL de IL-6 y 1 µg/mL de PGE2. í Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron DCs maduras y autólogas.
Las DCs maduras y autólogas fueron pulsadas con 10 µg/mL de un péptido de WTl i26 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido de WTl i26PlF, el péptido de WTl i26P2L, el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WTl i26P9V), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35Gy de radiación. Las células así obtenidas se utilizaron como i células estimulántes para la inducción de CTL. ! 6 Las PBMCs (2x10 células/pozo) enriquecidas en células T y positivas a CD8 y las DCs anteriormente mencionadas (l l 05 células/pozo) fueron co-cultivadas en una placa de 24 pozos. Diez días después, se proporcionó re-estimulación mediante la adición de PBMCs que habían sido pulsadas con el péptido y se irradiaron con 35Gy de radiación. Dos días después de la re-estimulación, se agregaron 10 IU/mL de IL-2 y 10 ng/mL de IL-7.
Después de que la misma re-estimulación se repitió otras cuatro veces, las células T positivas a CD8 se enriquecieron. Las células T positivas a CD8 se examinaron en cuanto a actividad citotóxica en contra de varias células blanco. í Las células blanco a ser utilizadas fueron B-LCLs establecidas mediante infección ¡ viral de EB aj partir de la sangre de un donador positivo a HLA-A*0206, células K562 y células 0206BÍ562. j (3) j Resultados La Figura 12 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 3 positivo a HLA-A*0206 con ¡diferentes péptidos. La Figura 12a muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P2L. La Figura 12b muestra la actividad citotókica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de i WTl i26P3M. La ¡Figura 12c muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con¡ el péptido de WTl i2óP V. En las Figuras 12a a 12c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 'obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a i células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). El diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células B-LCL autólogas como una célula blanco, y el cuadrado cerrado ¡ representa el grupo en el cual células B-LCL autólogas pulsadas con el mismo péptido de I WTl i26 modificado que se utilizó para la estimulación anteriormente mencionada fueron utilizadas como una célula blanco.
Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 i26P2L mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido i de WTl i26P L, las cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las ? células B-LCL autólogas no pulsadas con péptido de WTl i26P2L (Figura 12a). Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P3M mostraron una actividad citotóxica más ¡fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de I WTl i26P3M, las; cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas de péptido de WTl i26P3M (Figura 12b). Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 ]26P9V mostraron una actividad citotóxica más ¡ fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WT1 ,26P9V, las cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL ¡autólogas no pulsadas de péptido de WTl i26P9V (Figura 12c). Estos resultados muestran que se indujeron CTLs que son específicos para el péptido usado para la estimulación anteriormente mencionada y restringidos por HLA-A*0206.
La Figura 13 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs i inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 3 positivo a HLA- A*0206 con el ¡ péptido de WTl i26P9V. En la Figura 13, el eje vertical representa la I actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Pr porción E/T). El diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células B-LCL autólogas como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL autólogas transfectadas del gen de WT1 fueron utilizadas como una célula blanco.
En la Figura 13, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P9V mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas preparadas para ser positivas a WT1 mediante transfección del gen de WT1 en células B-LCL, las cuales eran originalmente positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL autólogas no transfectadas del gen de WT1 (Figura 12c). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido dé WTl i2 P9V son restringidos por HLA-A*0206, y muestran la actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WT1126 de tipo salvaje presentado de manera endógena.
La FigurJ 14 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 4 positivo a HLA-A* 0206 con diferentes péptidos. La Figura 14a muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P2L. La Figura 14b muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P3M. La Figura 14c muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 |26P9V. En las Figuras 14a a 14c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8¡ obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a I células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). El diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células B-LCL autólogas como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL autólogas pulsadas con el mismo péptido de WTl i26 modificádo que se utilizó para la estimulación anteriormente mencionada fueron utilizadas como una célula blanco.
Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 i26P2L mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WTl i26P2L, las cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas con péptido de WTl i26P2L (Figura 14a). Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P3M mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WTl i26P3M, las cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1, que contra las células B-LCL autólogas no pulsadas de péptido de WTl i26P3M (Figura 14b). Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P9V mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células B-LCL autólogas pulsadas de péptido de WTl i26P9V, las ¡cuales son positivas a HLA-A*0206 y negativas a WT1 , que contra las células B-LCL áutólogas no pulsadas de péptido de WTl i26P9V (Figura 14c). Estos resultados muestran que se indujeron CTLs que son específicos para el péptido usado para la estimulación anteriormente mencionada y restringidos por HLA-A*0206.
La Figura 15 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador 4 positivo a HLA-A*0206 con diferentes péptidos. Las células blanco para ser usadas fueron células K562 negativas a HL A- A* 0206, positivas a WT1 , y células K562 hechas para presentar de i manera endógena péptidos de antígeno de WT1 mediante transfección del gen de HLA-A*0206 allí deniro (células 0206K562). La Figura 15a muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P2L. La Figura 15b muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26P3M. La| Figura 15c muestra la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante I estimulación con el péptido de WTl i26P9V. En las Figuras 15a a 15c, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8¡ obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). El diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células K562 como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cualj células 0206 562, esto es, células 562 hechas para presentar de manera endógena péptidos de antígeno de WT1 mediante transfección del gen de HLA-A*0206 allí dentro, fueron utilizadas como una célula blanco. i En las Figuras 15a a 15c, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 ,26P2L, ¡ el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WT1 ,26P9V mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células 562, en cada caso. Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con cualquiera de estos péptidos modificados son restringidos por HLA- A*0206, y muestran la actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WT1126 de tipo salvaje presentado de manera endógena.
Ejemplo íl: (comparación de CTLs restringidos de HLA-A*0201 inducidos mediante varios péptidos de WT1 i87 modificados) (1) Propósito En vista de los resultados del Ejemplo 8, el péptido de WTl i87PlF (SEQ ID NO: 1 1), el péptido de WT1 i87P2M (SEQ ID NO: 16) y el péptido de WT1 ,87P3M (SEQ ID NO: 20) fueron seleccionados como péptidos de WTl j 7 modificados para ser probados, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para tamizar en cuanto a péptidos de WTl j87 modificados capaces de inducir CTLs que tienen una elevada actividad citotóxica. í (2) Materiales y Métodos A partir de un donador humano sano que mostraba expresión de moléculas de HLA- A* 0201 (donador de sangre sano y positivo a HL A- A* 0201), se aislaron PBMCs, y se ? separaron células positivas a CD14 de las PBMCs mediante el uso de Partículas Magnéticas-DM de anti-CD14 humanas. Se preparó un medio de cultivo mediante la adición de 800 ÍU/mL de GM-CSF y 1000 IU/mL de IL-4 a un medio de X-VIV015 suplementado con 1% v/v de suero de AB humana, y las células positivas a CD14 se cultivaron en el medio de cultivo durante 1 día.
Al medio de cultivo anterior, se agregó un cóctel de citosina de maduración que contenía 10 ng/mL de TNFoc, 10 ng/mL de IL-ß, 1000 IU/mL de IL-6 y 1 µg/mL de PGE2.
I Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron DCs maduras y autólogas.
Las DCs¡ maduras y autólogas fueron pulsadas con 10 µg/mL de un péptido de WTl i87 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido de WTl i87PlF, el péptido de WT1 i87P2M o el péptido de WT1 i87P3M), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35Gy de radiación. Las células así obtenidas se utilizaron como células estimulantes para la inducción de CTL.
Las PBMCs (2x106 células/pozo) que servían como respondedoras y las DCs anteriormente mencionadas (2x105 células/pozo) fueron co-cultivadas en una placa de 24 pozos. Una semana después, se proporcionó re-estimulación mediante la adición de células T2 que habían sido pulsadas con el péptido y se irradiaron con 75Gy de radiación. Tres días después de la reiestimulación, se agregaron 20 IU/mL de IL-2. Se repitió la misma reestimulación otras tres veces mediante la adición de las células T2 irradiadas y pulsadas con péptido, y posteriormente células positivas a CD8 en las células respondedoras fueron enriquecidas. Las células T positivas a CD8 fueron examinadas en cuanto a actividad citotóxica en contra de células blanco, esto es, células JY aquí. (3) Resultados La Figura1 16 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador positivo a HLA-A*0201 con el péptido de WT1187P1F (Figura 16a) o el péptido de WT1 ,87P2M (Figura 16b). En las Figuras 16a y 16b, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Proporción E/T). El diamantje cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células JY como una célula blanco, y el triángulo cerrado representa el grupo en el cual células JY pulsadas con el péptido de Tl i87 fueron utilizadas como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células JY pulsadas con el péptido de WTl i87 modificado (WTl i87PlF) que fue usado para la estimulación anteriormente mencionada, fueron usadas ? como una célula ¡blanco. Las células JY son positivas a HLA-A*0201 y negativas a WT1. i Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT1 i87PlF mostraron una actividad citotóxica igual contra las células JY pulsadas de péptido de WTl i87 y las células JY pulsadas con péptido de WTl i87PlF, y la actividad fue más fuerte que aquella contra las célula's JY no pulsadas de péptido (Figura 16a). Los CTLs inducidos mediante estimulación cori el péptido de WT1 ig P2M mostraron una actividad citotóxica igual contra las células JY pulsadas de péptido de WT1 )87 y las células JY pulsadas con péptido de WT1187P2M, y la actividad fue más fuerte que aquella contra las células JY no pulsadas de péptido (Figura 16b). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos i mediante estimulación con el péptido modificado pueden reconocer tanto al péptido modificado como al péptido de WT1187 de tipo salvaje.
Ejemplo 12: (comparación de CTLs restringidos de HLA-A*0206 inducidos mediante varios péptidos de WTl i87 modificados) (1) Propósito i En vista de los resultados del Ejemplo 7, el péptido de WT1 ] 87P1F, el péptido de WTl i87P2M y elj péptido de WTl i87P3M fueron seleccionados como péptidos de WTl i87 modificados pará ser probados, y se llevaron a cabo los siguientes experimentos para tamizar en cuanto a péptidos de WT1 187 modificados capaces de inducir CTLs que tienen una elevada actividad citotóxica. 1 (2) Materiales y Métodos i A partir dé un donador humano sano que mostraba expresión de moléculas de HLA- A*0206 (donador de sangre sano y positivo a HLA-A*0206), se aislaron PBMCs, y se separaron células positivas a CD14 de las PBMCs mediante el uso de Partículas Magnéticas-DM jde anti-CD14 humanas. Se preparó un medio de cultivo mediante la adición de 800 IU/mL de GM-CSF y 1000 IU/mL de IL-4 a un medio de X-VIV015 suplementado con 1% v/v de suero de AB humana, y las células positivas a CD14 se cultivaron en el medio de cultivo durante 1 día.
Al medio! de cultivo anterior, se agregó un cóctel de citosina de maduración que contenía 10 ng/rriL de TNFa, 10 ng/mL de IL-ß, 1000 IU/mL de IL-6 y 1 µg/mL de PGE2. Después de un día adicional de cultivo, se obtuvieron DCs maduras y autólogas.
Las DCs maduras y autólogas fueron pulsadas con un péptido de WTl i87 modificado obtenido en el Ejemplo 13 (el péptido de WT1 )87P1 F, el péptido de WT1 i87P2M o el péptido de WT1 i87P3M), se cultivaron durante 4 horas, y se irradiaron con 35Gy de radiación. Las células así obtenidas se utilizaron como células estimulantes para la ? inducción de CTL.
Las PBMCs (2x106 células/pozo) enriquecidas con células T positivas a CD8 y las DCs anteriormente mencionadas (lxl 05 células/pozo) fueron co-cultivadas en una placa de 24 pozos. Diez ¡ días después, se proporcionó re-estimulación mediante la adición de PBMCs que habían sido pulsadas con el péptido y se irradiaron con 35Gy de radiación. Dos días después de la re-estimulación, se agregaron 10 IU/mL de IL-2 y 10 ng/mL de IL-7. Después de que se repitió la misma re-estimulación otras cuatro veces, se enriquecieron con La Figura 17 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador positivo a HLA-A*0206 con el j péptido de WT1187P1F. En la Figura 17, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco I (blanco: T) (Proporción E/T). En la Figura 17a, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células B-LCL como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL pulsadas con el péptido de WTl i87 fueron utilizadas como una célula blanco, y el triángulo cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL pulsadas con el péptido de WTl i87PlF fueron usadas como una célula blanco. En la Figura 17b, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células K562 como una célula blanco, y el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual i células 0206K562, esto es, células K562 hechas para presentar de manera endógena péptidos de antígenos de WTl mediante transfección del gen de HLA-A*0206, fueron utilizadas como una célula blanco.
Los CTL† inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i87PlF mostraron una actividad citotóxica igual contra las células B-LCL pulsadas de péptido de WTl i87 y las células B-LCL pulsadas con péptido de WTl i87PlF, y la actividad fue más fuerte que aquella contra las células B-LCL no pulsadas de péptido (Figura 17a). Cuando se usaron como una célula blanco células K562 positivas a WTl y negativas a HLA-A*0206, y células K562 hechas para presentar de manera endógena péptidos de antígeno de WTl mediante transfección del gen de HLA-A*0206 (células 0206K562), los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i87PlF mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células K562 (Figura 17b). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido WTl i87PlF pueden reconocer tanto al péptido de WTI 187P I F como al péptido de WTI 187 de tipo salvaje. De manera similar, se encontró que los CTLs eran restringidos por HLA-A*0206, y mostraban actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WT1187 de tipo salvaje presentado de manera endógena.
La Figura 18 muestra los resultados de medición de la actividad citotóxica de CTLs inducidos mediante la estimulación de PBMCs procedentes del donador positivo a HLA-A*0206 con el péptido de WTl is7P2M. En la Figura 18, el eje vertical representa la actividad citotóxica, y el eje horizontal representa la proporción de células T positivas a CD8 obtenidas mediante estimulación de péptido (efector: E) con relación a células blanco (blanco: T) (Propjorción E/T). En la Figura 18a, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células B-LCL como una célula blanco, el cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL pulsadas con el péptido de WT1 |87 fueron utilizadas ! como una célula blanco, y el triángulo cerrado representa el grupo en el cual células B-LCL pulsadas con el péptido de WT1 i g7P2M fueron usadas como una célula blanco. En la Figura 18b, el diamante cerrado representa el grupo en el cual se utilizaron células K562 como una célula blanco, y él cuadrado cerrado representa el grupo en el cual células 0206K562, esto es, células K562 hechas para presentar de manera endógena péptidos de antígenos de WT1 mediante transfección del gen de HLA-A*0206, fueron utilizadas como una célula blanco.
I Los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i87P2M mostraron una actividad citotóxica igual contra las células B-LCL pulsadas de péptido de WTI 187 y las células B-LCL pulsadas con péptido de WTI 187P2M, y la actividad fue más fuerte que aquellá contra las células B-LCL no pulsadas de péptido (Figura 18a). Cuando se usaron como una célula blanco, células K562 positivas a WT1 y negativas a HLA-A*0206, y células K562 hechas para presentar de manera endógena péptidos de antígeno de WT1 mediante transfección del gen de HLA-A*0206 (células 0206K562), los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTI 187P2M mostraron una actividad citotóxica más fuerte contra las células 0206K562 que contra las células K562 (Figura 18b). Como resulta claro a partir de los resultados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTI 187P2M pueden reconocer tanto al péptido de WTI 187P2M como al péptido ¡ de WTI 187 de tipo salvaje. De manera similar, se encontró que los CTLs eran restringidos por HLA-A*0206, y mostraban actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WT1187 de tipo salvaje presentado de manera endógena.
Como resulta claro a partir de los Ejemplos 9 a 12, los CTLs inducidos mediante estimulación co el péptido de WT1126 modificado, esto es, el péptido de WT1 ]26P1F, el péptido de WTÍ ,26P2L, el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WTl i26P9V, son restringidos por HLA-A*0206, y muestran la actividad citotóxica mediante el I reconocimiento del péptido de WTl i26 de tipo salvaje presentado de manera endógena. Entre otros, el jpéptido de WT1 )26P9V, el péptido de WTl i26P2L y el péptido de WT1 i26P3M fueron altamente efectivos. j Como resulta claro a partir de los resultados anteriormente mencionados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WT g7 modificado, esto es, el péptido j de WT1187P I F, el péptido de WT1 i87P2M o el péptido de WT1 ]87P3M, son restringidos por HLA-A*0206, y J muestran la actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WTl i87 de tipo salvaje presentado de manera endógena. Entre otros, el péptido de WT 1187P2M y el péptido de WT 1187P 1 F fueron altamente efectivos.
Por lo tanto se ha demostrado que estos péptidos modificados son efectivos en el tratamiento y prevención de cánceres acompañados por la expresión aumentada del gen de WT1 en personas positivas al HLA-A*0206.
Como resulta claro a partir de los resultados anteriormente mencionados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i26 modificado, esto es, el péptido de WTl i26PlF, |el péptido de WT1126P2L, el péptido de WTl i26P3M o el péptido de WTl i26P9V, son restringidos por HLA-A*0201, y muestran la actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WTl i26 de tipo salvaje presentado de manera endógena. EntrJ otros, el péptido de WTl i26PlF y el péptido de WTl i26P2L fueron . I altamente efectivos.
Como resulta claro a partir de los resultados anteriormente mencionados, los CTLs inducidos mediante estimulación con el péptido de WTl i87 modificado, esto es, el péptido de WT1187P IF, él péptido de WT1 i 87P2M o el péptido de WT1187P3M, son restringidos por HLA-A*0201 , y muestran la actividad citotóxica mediante el reconocimiento del péptido de WTl i87 de tipo salvaje presentado de manera endógena. Entre otros, el péptido de WTl i87P2M y el péptido de WTl i87PlF fueron altamente efectivos. Por lo tanto se ha demostrado que estos péptidos modificados son efectivos en el tratamiento y prevención de cánceres acompañados por la expresión aumentada del gen de WT1 en personas positivas al HLA-A*0201.
Ejemplo Í3 Síntesis del péptido WT1187P2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH) 1. Síntesis de resina de péptido protegido (H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin) 0.4 g de una Fmoc-Val-Alko-resina (Alko es alcohol de p-alcoxibencilo) (fabricado por Watanabe Chemical Industries, Ltd.; 0.80 mmol/g) se colocaron dentro de un recipiente de reacción del sintetizador de fase sólida ACT496 fabricado por Advanced ChemTech, lavado con DMF (?,?'-dimetilformamida) (Etapa 1), se trataron con una solución al 25% de piperidina en DMF (5 minutos x 1 vez, y 30 minutos x 1 vez) para retirar el grupo Fmoc (Etapa 2), y se lavó una vez más con DMF (etapa 3) para dar una H-Val-Alko-resina. A este recipiente de reacción se agregaron 0.7 mL de NMP (N-metilpirrolidinona) y una solución de 121 mg (0.96 mmol) de DIPCI (?,?'-diisopropilcarbodiimida) en 0.9 mL de NMP, y posteriormente una solución de 368 mg (0.96 mmol) de Fmoc-Ser(tBu)-OH y 147 mg (0.96 mmol) de monohidrato de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) en 1.8 mL de NMP. Se llevó a cabo la reacción de acoplamiento a temperatura ambiente durante 60 minutos (Etapa í 4). Se llevó a cabo reacción de acoplamiento adicional usando las mismas cantidades de Fmoc-Ser(tBu)-OH, monohidrato de HOBT y DIPCI que las que anteriormente se mencionaron (Etapa 5). La resina resultante se lavó con DMF (etapa 6), se desprotegió (Etapa 7) y se lavó otra vez (Etapa 8) para dar una H-Ser(tBu)-Val-Alko-resina. Posteriormente, se llevaron a cabo acoplamientos sucesivos mediante la repetición de las Etapas 4 a 8 usando Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, ^moc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH y Fmoc-Ser(tBu)-OH. La resina de péptido resultante se recolectó del recipiente de reacción, se lavó con éter y posteriormente se secó al vacío para dar 980 mg de una H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-resina. En la Tabla 6 se muestra un resumen del proceso de síntesis anteriormente mencionado.
Tabla 6 2. Desprotección de la resina de péptido protegida A 980 mg de la H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)- Ser(tBu)-Val-Alko-resina se agregaron 5 mL de una solución mezclada de ácido trifluoroacético/agua/triisopropilsilano (95/2.5/2.5 (proporción volumen)). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 horas. La resina se filtró y el filtrado resultante se agregó a éter dietilo enfriado con hielo. El precipitado resultante se recolectó con un filtro de vidrio. El residuo se lavó con éter dietilo y se secó al vacío para dar 268 mg de un péptido crudo. 3. Purificación del péptido crudo 268 mg del péptido crudo obtenido se disolvieron en una solución acuosa de ácido acético al 20%, y se purificaron mediante cromatografía líquida de fase inversa.
Bomba: Shimadzu LC-8A Columna: YlllC-Pack Pro C18 ASI2S11-2530WT 3cméx25cm Eluyente l : H2O/0.1% TFA Eluyente 2 (el segundo eluyente): CH3CN/0.1 % TFA Tasa de flujo: 10 mL/min Detección: UV220nm Después cié equilibrar con el segundo eluyente a una concentración de 1%, la columna se cargó con la solución de péptido crudo. Después de eso, la concentración del segundo eluyente se dejo aumentar a 8% sobre 30 minutos y subsecuentemente a 14% en 120 minutos. Se recolectaron fracciones que contenían el compuesto objetivo, se evaporó el acetonitrilo al vicio y posteriormente el residuo se seco mediante congelación. De esta manera, se obtuvieron 105 mg del péptido de WT1187P2V objetivo (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Set-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH).
Las condiciones utilizadas para el análisis por HPLC y espectrometría de masa del péptido purificadb son las siguientes: Análisis HPLC (Shimadzu LC- 10 Avp) Columna: YMC-Pack Pro C18 AS-302 4.6mméxl50mm Eluyente 1 : Hjo/0.1% TFA Eluyente 2 : CH3CN/0.1 % TFA Gradiente: Se dejo aumentar la concentración del eluyente 2 de 10% a 40% en 30 minutos.
Tasa de flujo: 1 mL/min Detección: U 220nm Pureza: 97-4%, Tiempo de retención: 1 1.22 minutos Análisis de aminoácido (Hitachi L-8500 Amino acid analyzer) Hidrólisis: l °/o fenol/6N solución de ácido clorhídrico acuosa, 110 °C, 24 h Método de análisis: Método Ninhydrin Ser: 1.78(2) Glx 3.26(3) * Gly:(l) Val:2.04(2) Tyr: 1.06(1) *) Gly = aminoácido estándar, el número entre paréntesis es un valor teórico.
Espectrometría de masa (Applied Biosystem API 150EX Mass spectrometer) m/z = 996.9 [M+l]+ (valor teórico = 996.5) Análisis de la secuencia de aminoácidos (Applied Biosystem 491 Protein sequencer).
Se verificó la secuencia de aminoácidos de manera secuencial a partir del Ser de la terminación N al Val de la terminación C.
I I Los péptidos mostrados en las Tablas 7 y 8 fueron sintetizados en la misma forma que se mencionó! anteriormente.
Tabla 7 Tabla 8 Los péptidos mostrados en las Tablas 9 a 12 fueron sintetizados de manera similar, pero las condiciones usadas para el análisis por HPLC y espectrometría de masa de los péptidos purificados son las siguientes.
Análisis HPLC (Ágilent HP1 100 o Thermo Fisher Scientific Surveyor) Columna: Thjermo Fisher Scientific BioBasic-18 3mm<j)x250mm Eluyente l : H2b/0.1% TFA Eluyente 2 : CH3CN/0.1 % TFA Gradiente: Se ¡dejo aumentar la concentración del eluyente 2 para cambiar a la concentración mostrada en la tabla en 20 minutos. i Tasa de flujo: 0.4 mL/min Detección: 215 nm Espectrometría dé masa Thermo Bioanalysis Dynamo Mass spectrometer (MALDI-TOF) Tabla 12 Ejemplo 14 (Evaluación de péptidos modificados sobre la actividad de inducción de células inmunes específicas usando ratones transgénicos que expresan HL A- A* 0201, y confirmación de la reactividad cruzada de células inmunes específicas inducidas para el péptido de tipo salvaje) Métodos I (1) Candidatos de péptido modificado En cuantoj al péptido de WTl i87, el péptido de WTl i26 y péptidos modificados de estos (péptidos que comprenden la sustitución de uno o dos residuos aminoácido en las posiciones 1 , 2, 3 y/o 9 de la terminación N del péptido de WTl i87 o del péptido de ! WTl i26), se analizó la afinidad contra moléculas de HLA-A*0201 usando el método conocido en el campo técnico, esto es, el método mediado por las siguientes cuatro bases de datos de computadora: BIMAS (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html), SYFPEITHI j(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html), RANLPEP (http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), y NetMHC3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/). En las Tablas 13 a 16 y 21 se muestran los resultados del análisis del péptido de WTl i87 y sus péptidos modificados. En las Tablas 17 1 a 20 y 22 y 23 se muestran los resultados del análisis del péptido de WTl i26 y sus péptidos modificados. La afinidad pronosticada se muestra en puntajes.
Tabla 13 Tabla 14 Tabla 15 Péptido Secuencia de SEQ Puntaje de unión de HLA-A*0201 aminoácidos ID NO BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721 WT1187P3A SLAEQQYSV 18 285 29 110/73.83% 0.811 WT1 i87P3F SLFEQQYSV 23 1055 28 114/76.51 % 0.852 WT1187P3I SLIEQQYSV 26 285 29 115/77.18% 0.817 WT1 i87P3L SLLEQQYSV 17 1055 29 116/77.85% 0.839 WT1 i87P3M SLMEQQYSV 20 1055 28 114/76.51% 0.876 WT1 i87P3P SLPEQQYSV 21 285 27 95/63.76% 0.748 WT1 i87P3S SLSEQQYSV 25 285 27 110/73.83% 0.793 WT1 i87P3V SLVEQQYSV 19 285 27 113/75.84% 0.766 WT1 i87P3W SL EQQYSV 22 2367 28 98/65.77% 0.863 WT1 i87P3Y SLYEQQYSV 24 913 28 111/74.50% 0.854 Tabla 16 Péptido Secuencia de SEQ Puntaje de unión de HLA-A*0201 aminoácidos ID NO BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1 187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721 WT1 i87P9L SLGEQQYSL 53 88 27 89/59.73% 0.640 Tabla 17 Tabla 18 Tabla 19 Péptido Secuencia de SEQ Puntaje de unión de HLA-A*0 201 aminoácidos ID NO BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802 WT1126P3A RMAPNAPYL 44 85 23 66/44.30% 0.734 WT1 i26P3G RMGPNAPYL 43 85 21 52/34.90% 0.602 WT1 i26P3l RMI PNAPYL 41 85 23 71/47.65% 0.741 WT1 i26P3L RMLPNAPYL 42 314 23 72/48.32% 0.781 WT1 i26P3M RMMPNAPYL 46 314 22 70/46.98% 0.834 Péptido Secuencia de SEQ Puntaje de unión de HLA-A*0201 aminoácidos ID NO BIMAS SYFPEITHI RANKPEP | NetMHC3.0 WT1i26P3P RMPPNAPYL 47 85 21 51/34.23% 0.613 WT1i2eP3V RMVPNAPYL 45 85 21 69/46.31% 0.680 WT1i26P3W R WPNAPYL 48 2293 22 61/40.94% 0.867 Tabla 20 Tabla 21 Tabla 22 Péptido Secuencia de SEQ 3untaje de unión de HLA-A*C 201 aminoácidos ID NO BIMAS | SYFPEITHI | RANKPEP NetMHC3.0 WTI126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802 WTI126PID DMFPNAPYL 63 24 21 63/42.28% 0.353 WT1i26P1E EMFPNAPYL 64 24 19 67/44.97% 0.501 Péptido Secuencia de SEQ 3untaje de unión de HLA-A*0201 aminoácidos ID NO BI AS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0 WT1 i26P1 H HMFPNAPYL 65 11 22 65/43.62% 0.747 WT1 i26P1 K KI¾FPNAPYL 66 1099 23 71/47.65% 0.841 WT1 i26P1 N NMFPNAPYL 67 314 22 72/48.32% 0.734 WT1 i2eP1 P PífIFPNAPYL 68 7 19 60/40.27% 0.802 WTI 126PI Q Q FPNAPYL 69 314 22 69/46.31 % 0.757 WT1 i26P1S SMFPNAPYL 70 314 24 78/52.35% 0.819 WT1 i26P1T Tl^FPNAPYL 71 314 22 75/50.34% 0.779 Tabla 23 Un péptido modificado que se pronosticó que tendría una afinidad igual o mayor en comparación con) el péptido de tipo salvaje (el péptido de WTl i87 o el péptido de WTl i26) en cuando menos juna de las bases de datos se seleccionó como muestra para ser probada en los que se señala en los puntos (2) a (4) siguientes, además de péptidos de tipo salvaje. (2) Preparación y administración de preparaciones de péptido.
Se preparó un péptido sintetizado y secado por congelación en el Ejemplo 13 a la concentración de |40 mg/mL en DMSO (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.). Después de eso, 32.5 µ?, de la solución de DMSO preparada del péptido se mezclaron con 540 µ?, de agua destilada para inyección (fabricada por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). En seguida, 550 µ?, de la mixtura se mezcló con 700 µ?, de adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA-51) usando una jeringa de vidrio para preparar una emulsión agua en I aceite. Se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A*0201 (nombre de raza: HLA-A2+HLA-D.R1+/Iap° ß2??, EMMA ID número EM: 01783) por administración subcutánea de 300 µ?^ de la preparación (emulsión agua en aceite) en la base de la cola. La i evaluación de cada péptido se realizó usando 2 o 3 ratones. (3) Preparación de células esplénicas Se aisló el bazo 7 días después de la inmunización. El bazo fue machacado frotándolo contra la parte espumada de un portaobjetos de vidrio y posteriormente sometiéndolo a tratamiento de hemolisis con ACK Lysing Buffer (fabricado por Lonza Co.) para preparar células esplénicas. En este experimento, medio CTM (Complete T-Cell Médium; RPMl|l640, fabricado por Invitrogen Corporation) complementado mediante 10% FEBS, 10 friM HEPES, 20 mM L-glutamina, 1 raM piruvato de sodio, 1 mM de aminoácido MEl no esencial, 1% vitamina MEM y 55 µ? de 2-mercaptoetanol con la condición de quje estas concentraciones fueran todas concentraciones finales) se utilizó como el medio para las células esplénicas, y la suspensión de células se preparó a la concentración dej5xl06 células/mL. (4) Método Elispot Se examinó si el péptido administrado tenía la actividad de inducción de células inmunes específicas de WT1 mediante el método ELISPOT usando IFNy como un índice. El método se realizó de acuerdo con el manual anexo. Después de que se había agregado el CTM en un volumen de 50 µ?/???? dentro de placas para ELISPOT (fabricadas por BD Japan, No. de catálogo 551083), la suspensión de células esplénicas se colocó en placa en un volumen de 100 µ?, (5x106 células/pozo). Posteriormente, el péptido administrado o el péptido de tipo salvaje fue agregado a esto en un volumen de 50 µ?/???? (concentración de péptido final: 2 ug/mL). Este método de prueba es conocido como uno de los métodos sustitutos que permiten la predicción de actividad citotóxica (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54^.
Resultados Los resultados de la evaluación de la actividad de inducción de inmunidad mediada 1 respondidas bajo ninguna estimulación con péptidos de antígeno. La barra gris representa el i número de las células inmunes específicas respondidas a la estimulación con el péptido de tipo salvaje. LJ barra negra representa el número de las células inmunes específicas respondidas a la {estimulación con el péptido administrado (modificado). i Las Figuras 19 a 32 muestran actividades respectivas de inducción de inmunidad j mediada por célula específica con relación a los siguientes péptidos. i Figura 19 a: péptido de WTl i87PlA, b: péptido de WTl i87PlF, c: péptido de WTl i87PlG, d: péptido de WT1187P1I, e: péptido de WT1187P1L, f: péptido de WT1 ?87?1?.
Figura 20 a: péptido de WT1 ?87?1 V, b: péptido de WT1 ,87P1 W, c: péptido de WT1187P2I, d: péptido de WT1 i'87P2M, e: péptido de WT1 i87P2Q, f: péptido de WT1 i87P2V.
Figura 21 a: péptido de WT1 ! 87P3A, b: péptido de WT1 i87P3F, c: péptido de WT1 i87P3I, d: péptido de WT1 ,87P3L, e: péptido de WT1 i87P3M, f: péptido de WT1 i87P3P.
Figura 22 a: péptido de WTl i87P3S, b: péptido de WT1 ,87P3V, c: péptido de WTl i87P3W, d: péptido de WT1 ) 87P3Y, e: péptido de WT1 i87P9L.
Figura 23 a: péptido de WT1 ?26?1?, b: péptido de WT1 ,26P1F, c: péptido de WT1 )26P1G, d: péptido de WT1 ij>6PlI, e: péptido de WT1 i26PlL, f: péptido de WT1 ?26?1?.
Figura 24 a: péptido de WTl i26PlV, b: péptido de WTl i26PlW, c: péptido de WT1 ,26P2A, d: péptido de W 1126P2I, e: péptido de WT1 i26P2L, f: péptido de WT1 ]26P2Q.
Figura 25 a: péptido de WT1126P2V, b: péptido de WT1 )26P3A, c: péptido de WT1 ,26P3G, d: péptido de WTjl ?2d?3?, e: péptido de WT1 i26P3L, f: péptido de WT1 i26P3M.
Figura 26 a: péptido de WT1126P3P, b: péptido de WTl i26P3V, c: péptido de WT1 ]26P3W, d: péptido de WTjl ,26P9A, e: péptido de WT1 ,26P9I, f: péptido de WT1 i 26P9M.
I Figura 27: péptido de WT1 i26P9V.
Figura 28 a: pépt'ido de WT1 ]87P1D, b: péptido de WT1187P1E, c: péptido de WTl i87PlH, d: péptido de WT1 ,87P1K.
Figura 29 a: péptido de WTl i87PlN, b: péptido de WTl i87PlP, c: péptido de WTl i87PlQ, d: péptido de WTjl i87PlR, e: péptido de WT1 ?87?1?.
Figura 30 a: péptido de WT1126P1D, b: péptido de WTl i26PlE, c: péptido de WT1126P1H, d: péptido de WTjl ?26?1?, e: péptido de WT1 ?26?1?, f: péptido de WT1 ?26?1?.
Figura 31 a: péptido de WT1 i26PlQ, b: péptido de WT1 i26PlS, c: péptido de WT1 ,26P1T, d: péptido de WT11:]6?2?&?9?, e: péptido de WTl i26P2I&P9V, f: péptido de WTl i26P2L&P9I.
Figura 32: péptido de WT1 i26P2L&P9V.
Como se muestra en estos resultados, cuando los péptidos modificados, excepto el péptido de WT1 J7P1D, el péptido de WT1 ?87?1?, el péptido de WT1 ?87?1?, el péptido de WTl i87PlP y eí péptido de WTl i87P2Q; el péptido de WT1 ]26P1D, el péptido de WT1 ,26P1E, el péptido de WT1 ,26P1P, el péptido de WT1 ,26P2A y el péptido de WTl i26P2Q fuer Ion administrados a ratones, células inmunes específicas fueron notablemente inducidas en una forma eficiente.
En seguida, células inmunes específicas inducidas mediante estimulación de los péptidos modificados fueron analizadas en cuanto a reactividad cruzada al péptido de tipo salvaje (Tablas 24 y 25). Los resultados muestran que particularmente el péptido de WTI 187P I A, el péptido de WTl i87PlI, el péptido de WTl i87PlL, el péptido de WT1 ,87P1M, el péptido de WT1 ,87P1N, el péptido de WT1 ,87P1Q, el péptido de WT1 ,87P1T, el jpéptido de WT1187P1V, el péptido de WT1 ,87P2V, el péptido de WT1 ,87P2M, el j péptido de WT1187P2I, el péptido de WT1 187P3A, el péptido de WT1 i87P3F, el péptido de WT1187P3P, el péptido de WT1 ]87P3S, el péptido de WT1 i87P3V y el péptido de |VTl i87P9L entre los péptidos de WTl i87 modificados; y el péptido de WT1 i26PlS, el péptido de WT1 |26P2I, el péptido de WT1 i26P2L, el péptido de WT1 ,26P2V, el péptido de WT1 ,26P3W, el péptido de WT1126P9I, el péptido de WT1 ,26P9M y el péptido de WTl i26P9V entre los péptidos modificados de WTl i26, pueden inducir células inmunes específicas que pueden reconocer de manera eficiente tanto el péptido modificado como el péptido de tipo salvaje.
Tabla 24 I I Aplicación Industrial La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invención es útil como un medicamento usado para el tratamiento y prevención de cánceres que expresan WTl en personas positivas al HLA-A*0206. La composición de vacuna contra el cáncer de la presente invencijón también es útil como un medicamento usado para el tratamiento y prevención de canceres que expresan WTl en personas positivas al HLA-A*0201.

Claims (1)

  1. Reivindicaciones 1. Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al antígeno de leucocito humano (HLA)-HLA-A*0206, la cual comprende una proteína que es un producto de gen de un gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste. 2. LJ composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde la proteína que es un producto de gen del gen de WTl supresor de tumor es la proteína de las siguientes (a) o (b): (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende la deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de (a), cualquiera de los cuales es inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0206. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido parcial es: el péptido de WTl 187: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), eell p pééppttiiddoo ddee WWTT|j1l 126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), el péptido de WTjl 187P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido de WTjl ,87P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido de WTjl i87P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido de WTjl 126P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido de WTjl i26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido de WTjl i26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido de WTl 126P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49). 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, la cual además comprende un adyuvante. 5. Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, la cual comprende ADN que codifica para un producto de gen del gen de WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste. 6. Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, laj cual comprende ARN que codifica para una proteína que es un producto de gen del gen de! WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste. 7. Un método para inducir CTLs específicos de WTl, el cual comprende el cultivar, en la presencia de una proteína que es un producto de gen del gen de WTl cual comprende ¡el cultivar, en la presencia de la proteína o un péptido parcial de ésta, células dendríticas inmaduras derivadas de una persona positiva al HL A-A* 0206, para obtener células dendríticas inducidas a partir de esto y las cuales presentan la proteína o un péptido parcial de ésta. 9. Un método para el diagnóstico del cáncer para personas positivas al HLA-A*0206, el cual comprende: i) una etapa de detección o cuantificación de una proteína que es un producto de gen del gen dé WTl supresor de tumor o un péptido parcial de éste, un anticuerpo contra CTLs específicos de WTl en una muestra de una muestra procedente de una persona positiva al HLA†A*0206, y una etapa de comparar la cantidad de la proteína o péptido parcial de ésta, un anticuerpo en contra de los CTLs específicos de WTl, con aquella en el caso en donde el cáncer no se desarrolló, o ii) una etapa de administración a un sujeto positivo al HLA-A*0206 CTLs específicos de WTl inducidos por el método reivindicado en la reivindicación 7 o células dendríticas inducidas por el método reivindicado en la reivindicación 8, y una etapa de determinar la posición o región de los CTLs o células dendríticas en el sujeto positivo al HLA-A*0206. j 10. Una composición de vacuna contra el cáncer para personas positivas al HL A- A* 0201, la ¡cual comprende el siguiente péptido: un péptido modificado del péptido de WTl i87: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido de WTl 126: Arg Met Phe Pro^ Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de una proteína que es un producto de gen del gen de WTl supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201. 11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el péptido modificado es: el péptido de WT1 ]87P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11), el péptido de WT1187P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16), el péptido de i87P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20), el péptido de WT1 I26P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34), el péptido de WT1 i26P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39), el péptido de Wljl !26P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) o el péptido de WT1 i26P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49). 12. Un método para el tratamiento o prevención del cáncer, el cual comprende la i administración aj una persona positiva al HL A- A* 0206 una composición que comprende una proteína que| es un producto de gen del gen de WT1 supresor de tumor o un péptido parcial de éste, j 13. Una proteína la cual es un producto de gen del gen de WT1 supresor de i tumor o un péptido parcial de éste para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA|A*0206. 14. Uii método para el tratamiento o prevención del cáncer, el cual comprende la administración aluna persona positiva al HLA-A*0201 una composición que contiene el siguiente péptido un péptido modificado de WT1187: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) jo el péptido de WT1126: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de una proteína que es un producto de gen del gen de WT1 supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201. 15. El Liguiente péptido: un péptido modificado del péptido de WTl i87: Ser Leu Gly Glu Gln Glnj Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2) o el péptido de WTl i26: Arg Met Phe Pro i Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), cualquiera de los cuales es un péptido parcial de una proteína que es un producto de gen del gen de WT1 supresor de tumor, el péptido modificado siendo inmunogénico en personas positivas al HLA-A*0201, para el tratamiento o prevención del cáncer en personas positivas al HLA-A*0201. !
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